CN101486975B

CN101486975B - 一种链霉菌、用其产生他克莫司的方法及其应用

Info

Publication number: CN101486975B
Application number: CN2008100010690A
Authority: CN
Inventors: 詹佩君; 胡建红; 潘丹; 叶美丽; 马海霞; 林剑秋; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: CN101486975A

Abstract

本发明公开了一种新的链霉菌、通过培养它制备他克莫司的方法及其应用。本发明的链霉菌Streptomyces sp.T300(CGMCC1779)是一个全新的菌种，且在发酵过程中不产生有毒的H₂S气体。其在含有可同化的碳和氮源的营养培养基里并在通氧的条件下通过发酵培养下制得他克莫司，并可应用于制备含有他克莫司的药物组合物。

Description

一种链霉菌、用其产生他克莫司的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的链霉菌、通过培养该菌产生他克莫司的方法及其应用。

背景技术

1983年，环孢霉素A通过了美国FDA的认证。该药是一种能有效抗排斥的、由真菌产生的药物，从而给器官移植和自体免疫疾病的治疗带来了巨大的变革。环孢霉素A通过抑制依靠钙激活的途径从而在激活T细胞的早期阶段发挥抑制作用。环孢霉素A可以有效地提高移植病人的存活率。但是，环孢霉素A由于高剂量的使用而引起不少的副作用，例如：肾毒性、神经毒性、肝毒性、高血压、肠胃痉挛、血钾过多、多毛症、牙龈肿大等。

作为更有效的、低副作用的免疫抑制剂药物，日本的Fujisawa在美国专利4,894,366中公开了一种新的大环内脂的免疫抑制剂：他克莫司。他克莫司比环孢霉素A的药效高100倍。这种大环内脂化合物由链霉菌属菌Streptomyces tsukubaensis发酵产生。和环孢霉素A的作用机制相似，他克莫司的免疫抑制作用是通过抑制依靠钙激活的途径从而在激活T细胞的早期阶段发挥抑制作用。他克莫司的第一次在人的治疗功效表现在肝脏的移植手术中。现在，他克莫司已被广泛应用，尤其是针对那些对环孢霉素A耐受性低的病人。他克莫司的结构式如下：

此外，美国专利4,894,366公开了两种他克莫司产生菌种Streptomyces tsukubaensis No.9993和Streptomyces hydroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238。美国专利5,116,756和5,194,378公开了另一个属于链霉菌属的他克莫司产生菌种Streptomyces sp.ATCC No.55098。

目前，寻找能够产生免除或降低环孢霉素A的副作用的免疫抑制剂他克莫司和其相关的自发的类似物的新的微生物的工作仍然正在继续进行中。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的能产生他克莫司或其相关的自发的类似物的微生物。

根据本发明的一方面，提供了一种新的链霉菌T300(CGMCC1779)(Streptomyces sp.T300)，其可以应用于产生他克莫司或其类似物，或者应用于产生含有他克莫司的药物组合物。

根据本发明的另一方面，提供了一种采用链霉菌T300(CGMCC1779)制备他克莫司或其类似物的方法。该方法包括采用链霉菌T300(CGMCC1779)在含有可同化的碳、氮源的营养培养基里，有氧发酵的步骤。

在一个实施方案中，所述可同化的碳源可以是葡萄糖、淀粉、甘油、木糖、木聚糖、糊精、麦芽糖、海藻糖、肌醇、菊糖、水杨苷，或上述物质的组合。

在一个实施方案中，所述可同化的氮源可以是棉籽饼粉、酵母抽提粉、蛋白胨、谷蛋白、黄豆粉、玉米浆、花生粉、小麦粉、干酵母、尿素氨基酸、硝酸盐，或上述物质的组合。也可以选择其它的无机氮源和有机氮源。

在一个实施方案中，所述营养培养基可以是营养琼脂培养基、国际链霉菌计划培养基1(ISP1)、国际链霉菌计划培养基2(ISP2)或查氏培养基等，优选营养琼脂培养基。

在一个实施方案中，尤其是在泡沫严重的时候，在培养基中加入消泡剂，该消泡剂可以是植物油、液体石蜡、脂肪油、矿物油或硅油，或它们的组合。

在一个实施方案中，所述发酵培养的温度为20℃-40℃，优选25℃-37℃，pH为6.5-7.5之间，优选7左右，培养时间为120-240小时。氧通量为0.5-1.0VVM。

在一个实施方案中，所述发酵方式包括：固体发酵和液体发酵，优选为深层液体发酵。

在一个实施方案中，所采用的他克莫司产生菌还可以为链霉菌T300(CGMCC1779)自发的突变株或通过常规的诱变得到突变株。

链霉菌T300(CGMCC1779)的微生物菌种于2006年8月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(现地址：北京朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC1779，并登记入册，证明存活。

本发明描述了Streptomyces sp.T300的形态学、生理生化和分子水平上的特征，经过和已知的他克莫司产生菌进行形态学、生理生化的比较，可以认定Streptomyces sp.T300属于链霉菌属，但它不同于已知的他克莫司产生菌Streptomyces hydroscopicus，S.tsukubaensis、Streptomyces sp.StrainMA6858和Streptomyces sp.ATCC No.55098，而是一个全新的菌种；并且本发明的Streptomyces sp.T300在发酵过程中不产生有毒的H₂S气体。

他克莫司和其相关的自发的类似物主要存在于培养的菌丝体中，菌丝体可以通过离心或过滤所得。然后按照US 4,894,366实施例1详细的分离纯化方法。通过减压浓缩、冷冻干燥、有机溶剂抽提、调节pH、树脂交换、解吸、结晶、重结晶等一系列过程可得他克莫司和其相关的类似物。

本领域技术人员在阅读本说明书后可以理解，本发明链霉菌T300(CGMCC1779)(Streptomyces sp.T300)，不仅可以生产他克莫司，还可以产生他克莫司类似物，这些类似物具有本发明他克莫司的类似性质并可以实现本发明目的。此外，根据本发明的生产他克莫司的方法不仅可以生产他克莫司，还可以产生他克莫司类似物，这些类似物具有本发明他克莫司的类似性质并可以实现本发明目的。

本发明人已经通过大量实验证实，由Streptomyces sp.T300(CGMCC1779)产生的他克莫司具有所需的性质，包括免疫抑制活性。

具体实施方式

实施例1：菌株来源

Streptomyces sp.T300从中国西部的云南省的土壤中分离得到，并通过诱变选育得到生产菌株。将在ISP2 30℃培养8天成熟后的斜面孢子，用0.85％NaCl的无菌生理盐水洗下，悬浮于装有玻璃珠的无菌小三角瓶中，经旋转式摇床振荡30分钟，使孢子均匀分散，然后用四层无菌纱布过滤，以除去菌丝体及孢子团，即得孢子悬浮液，供诱变处理使用。

称取NTG(亚硝基胍)晶体10mg，溶解在10ml的无菌Tris缓冲液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml孢子悬浮液，而置于28℃培养室中的旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。将处理过的抱子悬浮液，经适当稀释后涂布在ISP2平板上。未作诱变处理的孢子悬浮液，亦经适当稀释涂布于ISP2平板上作为对照。30℃培养8天后，检查菌落数，并计致死率。

挑选其中经过NTG诱变后的菌落351株，进行摇瓶发酵，评估产生FK506(他克莫司)的能力。结果发现有6株能够产生较好水平的菌株，为Streptomyces sp.T300的突变株。

实施例2：Streptomyces sp.T300的形态学和培养学特征

实验方法参照Shirling和Gottlieb(Shirling E.B.and Gottlieb D.1966.Methods for characterization of Streptomyces species.Int.J.Systematic Bacteriol.，16，313-340)。通过对在麦芽-酵母琼脂培养基上30℃培养8天的培养物光学和扫描电镜的观察，孢子椭圆形，大小为0.65-0.99μm×1.01-1.23μm，成孢子链；孢子链上有大于20个孢子，未成熟时成明显的结状。

实验方法参照上述的Shirling和Gottlieb。采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4等十种培养基，30℃培养14天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。结果见表1。在ISP3、ISP4、ISP6和营养琼脂培养基的生长菌落属于灰白色系列。

表1T300培养物的表观特征

培养基	生长情况	菌落背部色素	气丝颜色	可溶性色素
					ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP6 ISP7 PDA 营养琼脂	3 4 3 4 2 4 3 1 4	米白色橙红色粉红色灰褐色粉白色褐黄色蛋黄色白色灰褐色	米白色深灰色灰白色灰白色粉白色灰白色蛋黄色无灰白色	无无无无无无暗黄色无无

查氏培养基

1

无色

无

实施例3：细胞壁组分分析和生理生化特征

采用Hasegawa，T.(1983)等与王平(1986)改进的快速薄层层析法(TLC)进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型的分析。菌株细胞壁化学组分分析：菌株T-300细胞含有L，L-DAP和甘氨酸，胞壁类型为I型；无特征性糖(糖型为C)。

14℃到37℃均能够生长，最适合温度为28℃。pH4.5-7.5均能够生长，最适合pH为6.5-7.0之间。≤4％NaCl能够生长。其他的见表2-表4。

表2菌株-T-300的碳源和氮源的利用情况

碳源	生长情况	碳源	生长情况	无机氮源	生长情况
						D-葡萄糖 D-棉子糖 D-木糖 D-山梨醇 L-阿拉伯糖甘油麦芽糖 D-果糖 D-蔗糖糊精	+ - + - - - + - - +	水杨苷 D-乳糖半乳糖肌醇甘露醇甘氨酸木聚糖菊粉鼠李糖	- - + + - - + - -	硫酸铵硝酸钾	- +

表3菌株T-300的降解试验结果

降解物	降解物浓度	结果^*	降解物	降解物浓度	结果
						腺嘌呤鸟嘌呤	0.5％ 0.5％	+ -	酪蛋白酪氨酸	1.0％ 1.0％	- -

黄嘌呤次黄嘌呤

0.4％ 0.4％

+ +

Tween-40 Tween-80

1.0％ 1.0％

+ +

表4菌株T-300主要的生理生化特征

试验项目	结果	试验项目	结果	试验项目	结果
						明胶液化淀粉水解牛奶凝固 M.R实验	+ + + +	牛奶胨化硝酸盐还原硫化氢产生 V.P实验	+ + - -	纤维素利用氧化酶过氧化氢酶黑色素产生	- + -

实施例4：16SrDNA序列分析以及与已知的他克莫司产生菌的比较

收集待测菌株的新鲜菌体，采用溶液菌酶法改进的Pitcher法(Pitcher等，198提取总DNA模板，采用通用引物(27F和1495R)进行16S rRNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，TA克隆后进行序列测定，测序由上海生工生物工程技术有限公司进行。所测的16SrDNA序列经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。与GenBank中相关序列进行BLAST比较的结果见表5(表中只列出同源性较高的菌株)。

表5菌株T-300和相关菌株的同源性

种名	GenBank No.	碱基差异数	同源性(％)
				Streptomyces sp.NRRL 30562 Streptomyces padanus Streptomyces sp.TP-A0274 Streptomyces griseofuscus Streptomyces sp.NRRL 5799 Streptomyces sp.19504 Streptomyces sp.40003	AY127079 AF455813 AB088069 AY207605 AJ391814 AJ315072 AY177662	36 36 36 40 42 45 47	97.4 97.4 97.4 97.2 97.0 96.8 96.7

结果发现：T300#的16sDNA测序结果比较发现和Streptomyces sp.NRRL 30562、Streptomyces padanus和Streptomyces sp.TP-A0274的同源性达到了97.4％。

T-300和已知的他克莫司产生菌的比较

T-300菌落属于灰色群，≤4％NaCl能够生长。14℃到37℃均能够生长，最适合温度为28℃。明胶液化，淀粉水解，牛奶凝固且胨化，硝酸盐还原，纤维素利用，M.R实验和过氧化氢酶均为阳性。能够利用葡萄糖、木糖、麦芽糖、糊精、肌醇和木聚糖，部分利用半乳糖。可以利用硝酸钾为唯一无机氮源。

T-300菌落属于灰色群，不产生H₂S；Streptomyces sp.Strain MA6858属于黄色群，产生H₂S。Streptomyces sp.ATCC No.55098属于黄色群，产生H₂S。

T-300能够利用麦芽糖、肌醇和木糖，不能利用果糖，乳糖；Streptomyces sp.Strain MA 6858不能利用麦芽糖、肌醇和木糖，能够利用果糖。T-300最适合温度为28℃，在37℃能够生长；Streptomycessp.Strain MA 6858最适合温度为27℃，在37℃不能生长。Streptomyceshydroscopicus No.7238可以利用乳糖。Streptomyces sp.ATCC No.55098不能利用麦芽糖，能够利用果糖，乳糖。

T-300可以使淀粉水解，牛奶凝固，硝酸盐还原；S.tsukubaensis不能。T-300能够利用肌醇、木糖和部分利用半乳糖，不利用甘氨酸；S.tsukubaensis不能利用肌醇、木糖和半乳糖，利用甘氨酸。Streptomyces hydroscopicus No.7238不能使牛奶凝固，硝酸盐还原。

综上所述，T-300属于链霉菌属，但它不同于已知的他克莫司产生菌Streptomyces hydroscopicus，S.tsukubaensis、Streptomyces sp.Strain MA 6858和Streptomyces sp.ATCC No.55098。T-300是一个全新的菌种。

实施例5：

种子培养基(葡萄糖1.5％、酵母抽提粉0.3％、黄豆粉1％、CaCO₃ 0.2％，pH为6.7)，装量为25ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min。从T-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25℃培养2天。然后1.25ml的种子培养液接入发酵培养基(糊精6.0％，葡萄糖0.5％，酵母抽提粉1.0％，花生粉2.0％，NaCl 0.35％，K₂HPO₄0.5％，pH为7.3，装量为25ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min)，置于摇床上25℃培养6天。他克莫司通过有机溶剂从发酵液中萃取所得，(去除多余空格)HPLC测定。其含量为250μg/ml。取发酵液32L，发酵液过滤得湿菌丝。用4倍重量的丙酮萃取。萃取液加水至丙酮含量为50％(注明各百分比是质量百分比还是体积百分比)，上HP20大孔吸附树脂，再用75％丙酮洗脱，得洗脱液1L。浓缩去丙酮后再加乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液600ml。再上硅胶柱。用正已烷∶乙酸乙酯＝1∶2展层。收集纯组份洗脱液800ml，浓缩干。再用乙腈溶解，降温至4℃，结晶48小时。过滤得FK506湿品。烘干后得3.5克FK506成品。结构鉴定：红外IR：3457.51，2935.75，1741.37，1694.07，1640.71，1450.83，1384.07，1193.91，1090.64cm-1；紫外UV：λmax 203.40nm；高分辨质谱HRMS：826.4702(C44H69NO12)，M+Na。

实施例6：

种子培养基(淀粉1.5％、干酵母1.2％、大豆蛋白胨1％、CaCO₃0.3％，pH为7.0)，装量为20ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min。从T-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25℃培养42hr。然后1.50ml的种子培养液接入发酵培养基(淀粉7.0％，葡萄糖1.0％，棉籽饼粉1.0％，花生粉2.5％，NaCl0.50％，K₂HPO40.5％，pH为7.0，装量为25ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min)，置于摇床上25℃培养7天。HPLC测定。其含量为300μg/ml。分离纯化按照实施例5进行。

实施例7：

种子培养基(淀粉1.5％、干酵母1.2％、牛肉浸出粉1.2％、CaCO₃ 0.3％，pH为7.0)，装量为25ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min。从 T-300的斜面挖一块接入种子培养基，置于摇床上25℃℃培养42hr。然后1.25ml的种子培养液接入发酵培养基(淀粉6.5％，乳糖1.0％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆2.5％，KH₂PO40.5％，K₂HPO40.5％，pH为7.0，装量为25ml/250ml摇瓶，120℃灭菌30min)，置于摇床上25℃培养6天。他克莫司通过有机溶剂从发酵液中萃取所得，HPLC测定。其含量为175μg/ml。分离纯化按照实施例5进行。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以对其作出各种变化和修改，因此所有等同的技术方案也应落在本发明的范围内。本发明的专利保护范围应由所附的权利要求书限定。

Claims

1.一种保藏号为CGMCC1779的链霉菌T300，其具有产生他克莫司的能力。

2.根据权利要求1所述的保藏号为CGMCC1779的链霉菌T300在制备他克莫司中的应用。

3.一种制备他克莫司的方法，其特征在于：包括采用保藏号为CGMCC1779的链霉菌T300在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基里，有氧发酵的步骤。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自葡萄糖、淀粉、木糖、木聚糖、糊精、麦芽糖、肌醇、菊糖，或上述物质的组合。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述可同化的氮源为选自棉籽饼粉、酵母抽提粉、蛋白胨、黄豆粉、玉米浆、花生粉、干酵母、硝酸盐，或上述物质的组合。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述培养基中还包括消泡剂，该消泡剂选自植物油、液体石蜡、脂肪油、矿物油、硅油，或上述物质的组合。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为20℃-40℃，pH为6.0-8.0，培养时间为120-240小时。

8.根据权利要求3～7任一项所述的制备方法在制备含有他克莫司的药物组合物中的应用。