KR100249871B1 - 항생 물질 GE 2270 인자 C2a - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항생 물질 GE 2270 인자 C2a로 명명된 항생 물질, 그의 부가염, 그의 제약 조성물 및 특히 이 물질에 감성인 미생물을 포함하는 감염성 질환의 치료에 있어서 의약으로서의 용도 및 동물 성장 촉진제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

항생 물질 GE 2270 인자 C2a
제1도는 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도면.
본 발명은 항생 물질 GE 2270 인자 C2a로 명명된 신규의 항생 물질, 그의 부가염, 그의 제약 조성물 및 특히 이 물질에 감성인 미생물에 의한 감염성 질환의 치료에 있어서 의약으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 또한 가금, 돼지, 반추 동물 등과 같은 동물에 있어서 성장 촉진제로서도 유효하다.
본 발명의 화합물은 인자 C2a를 생성할 수 있는 플라노비스포라 로제아(Planobispora rosea) ATCC 53773, 또는 항생 물질 GE 2270 생산 변이주 또는 그의 돌연 변이주의 배양액으로부터 분리된다. 특히, 그것은 균사체 및 배양된 미생물의 발효 브로쓰에서 발견된다.
플라노비스포라 로제아 ATCC 53773은 토양 시료로부터 단리되었으며, 부다페스트 조약의 규정에 의해 미합중국 20852 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 [American Type Culture Collection(ATCC]에 1988년 6월 14일자로 기탁되었다. 이 균주는 기탁 번호 ATCC 53773을 부여받았다. 이 균주는 항생 물질 GE 2270 인자 A로 명명된 신규의 항생 물질의 제조에 관련된 유럽 특허 출원 공개 제359062호에 이미 기재되어 있다.
본 발명의 화합물은, 정상적으로는 가장 많은 비율인 항생 물질 2270 인자 A, 및 우선권 주장일이 각각 1990년 3월 8일과 1990년 10월 22일인 유럽 특허 출원 번호 제90104409.9호 및 제90120214.3호를 복합 우선권 주장하는 미합중국 특허 출원 제856,857호에 대응하는 유럽 특허 출원 공개 제451486호에 기재된 항생 물질 GE 2270 인자 B1, B2, C1, C2, D1, D2, E 및 T와 함께 상기 명명된 미생물 균주에 의해 생성된다.
동화원인 탄소, 질소 및 무기염을 함유하는 수용성 영양 배지 내에서 호기성 조건하에 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 생성할 수 있는 플라노비스포라 균주, 즉, 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773, 또는 항생 물질 GE 2270을 생성하는 그의 변이주 또는 돌연변이주를 배양함으로써 항생 물질 GE 2270 인자 C2a가 생성된다. 발효업계에서 통상적으로 사용되는 많은 영양 배지가 사용될 수 있으나, 특정 배지가 바람직하다. 탄소원으로는 글루코스, 만노스, 갈락토스, 전분, 옥수수분 등이 바람직하다. 질소원으로는 암모니아, 질산염, 대두분, 펩톤, 육류 엑스, 효모 엑스, 트립톤, 아미노산 등이 바람직하다. 배양액 중에 혼입될 수 있는 무기염 중에는 나트륨, 칼륨, 철, 아연, 코발트, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 탄산염, 황산염, 인산염, 질산염 및 기타 이온을 생성할 수 있는 통상의 가용성 염류가 있다.
통상적으로, 항생 물질 생성 균주는 교반 플라스크 내에서 전배양시키고 이어서 이 배양액은 실질적인 양의 항생 물질을 생성하기 위해 항아리형 배양기에 접종하는데 사용된다. 전배양에 사용되는 배지는 대규모 발효에 사용되는 배지와 동일할 수 있으나, 다른 배지 역시 사용될 수 있다. 항생 물질 GE 2270 생성 균주는 20 내지 40℃, 바람직하게는 24 내지 35℃에서 자랄 수 있다.
발효 동안, 브로쓰 또는 균사체 추출물 시료의 항생 물질 활성 시험, 예를 들어 생물 검사 또는 TLC 또는 HPLC 방법에 의해 항생 물질 생성을 검사할 수 있다.
고초균(Bacillus subtilis) 및 황색 포도상구균(S. aureus)와 같이 항생 물질 GE 2270 인자 C2a에 감성인 미생물이 시험용 미생물로 사용될 수 있다. 생물 검사는 아가 플레이트 상에서 아가 확산 방법에 의해 편리하게 수행된다. 항생 물질 활성의 최대 생성은 일반적으로 발효 2일 내지 8일째에 일어난다.
항생 물질 GE 2270 인자 C2a는 인자 C2a를 생성할 수 있는 균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773, 또는 항생 물질 GE 2270을 생성하는 그의 돌연 변이주 또는 변이주를 배양함으로써 생성되고, 특정량의 생성물이 발효 브로쓰로부터 단리될 수 있으나, 주로 균사체에서 발견된다.
균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 형태학적, 생리학적 및 화학 계통학적 특징은 상기 유럽 특허 출원 공개 제359062호에 기재되어 있다.
다른 미생물과 마찬가지로, 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 생성하는 균주의 특징은 변이될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 균주의 인위적 변이주 및 돌연 변이주는 각종 공지의 돌연 변이 유발제, 예를 들어 자외선, X-선, 고주파선, 방사선, 및 아질산, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니딘 등과 같은 화학 물질로 처리하여 얻을 수 있다. 플라노비스포라 속에 속하고 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 생성하는 모든 천연 및 인위적 변이주 및 돌연 변이주는 본 발명의 목적을 위한 균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773과 동등한 것으로 간주한다.
상기한 바와 같이, 항생 물질 GE 2270 인자 C2a는 일반적으로는 주로 생성 균주의 균사체에서 발견되나, 소량은 또한 발효 브로쓰에서도 발견된다.
본 발명의 항생제의 회수 및 분리
생성 균주의 균사체 또는 발효 브로쓰로부터 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 회수는 공지의 기술, 예를 들어 용매로 추출, 비용매의 첨가 또는 용액의 pH의 변화에 의한 침전, 분배 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 역상 분배 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분자 배제 크로마토그래피 등에 의해 실행된다.
균사체로부터 본 발명의 항생 물질을 회수하는 바람직한 방법에는 수혼화성 유기 용매로 여과 또는 원심분리된 균사체를 추출, 추출물을 농축, 및 선택적으로는 침전제를 첨가하는 침전, 수혼화성 유기 용매로 수용성 잔류물을 추출 또는 흡착 크로마토그래피에 이어 흡착 매트릭스로부터 목적 생성물을 용출시킴으로써 조항생 물질을 회수하는 방법이 포함된다.
발효 브로쓰로부터 본 발명의 항생 물질을 회수하는 바람직한 방법에는 수혼화성 유기 용매로 추출시키고 나서 침전제를 첨가하여 농축된 추출물로부터 침전시키거나, 또는 수혼화성 용매로 그의 수용성 잔류물을 추가로 추출시키는 방법이 포함된다. 별법으로는, 발효 브로쓰를 흡착매트릭스와 접촉시키고 나서 극성 용출 혼합물로 용출시킬 수 있다. 이 크로마토그래피 방법은 또한 브로쓰 자체 대신에 발효 브로쓰로부터 얻은 농축 추출물에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "수혼화성 용매"는 이 용어에 대해 당 기술 분야에서 통용되는 의미이고, 사용 조건에서 상당히 넓은 농도 범위내에서 물과 혼화될 수 있는 용매를 칭한다.
균사체 덩어리로부터 본 발명의 항생 물질의 추출에 사용될 수 있는 수혼화성 유기 용매의 예로는 저급 알칸올, 예를 들어 메탄올, 에탄올 및 프로판올과 같은 (C1-C3)알칸올; 저급 케톤, 예를 들어 아세톤 및 에틸메틸케톤과 같은 (C3-C4)케톤; 디옥산 및 테트라히드로푸란과 같은 시클릭 에테르; 글리콜, 및 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르와 같은 부분 에테르화 생성물; 디메틸포름아미드, 디에틸포름아미드와 같은 저급 아미드; 및 디메틸술폭시드가 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "수불혼화성 용매"는 이 용어에 대한 당 기술 분야에서 통용되는 의미이고, 사용 조건에서 목적하는 용도에 적합한 합리적인 범위내의 농도에서 물과 약간 혼화할 수 있거나 실제적으로 혼화되지 않는 용매를 칭한다.
발효 브로쓰로부터 본 발명의 항생 물질의 추출에 사용될 수 있는 수불혼화성 유기 용매의 예로는 선형, 분지쇄 또는 환식일 수 있는 통상의 탄화수소 용매, 예를 들어 헥산 또는 시클로헥산; 할로겐화 탄화수소, 예를 들어 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 플루오로브로모에탄, 디브로모에탄, 트리클로로프로판, 클로트리플루오로옥탄 등; 방향족 탄화수소, 예를 들어 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등; 탄소수가 적어도 4개인 에스테르, 예를 들어 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 부티레이트 등; 선형 분지쇄 또는 환식일 수 있는 탄소수가 적어도 4개인 알칸올, 예를 들어 부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 2,2-디메틸-3-펜탄올, 2,4-디메틸-3-펜탄올, 4,4-디메틸-2-펜탄올, 5-메틸-2-헥산올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 5-메틸-1-헥산올, 2-에틸-1-헥산올, 2-메틸-3-헥산올, 1-옥탄올, 2-옥탄올, 시클로펜탄올, 2-시클로펜틸에탄올, 3-시클로펜틸-1-프로판올, 시클로헥산올, 시클로헵탄올, 시클로옥탄올, 2,3-디메틸시클로헥산올, 4-에틸시클로헥산올, 시클로옥틸메탄올, 6-메틸-5-헵텐-2-올, 1-노난올, 2-노난올, 1-데칸올, 2-데칸올 및 3-데칸올; 직쇄 또는 분지쇄 알킬 에테르 및 그의 혼합물, 예를 들어 에틸 에테르, 프로필 에테르, 부틸 에테르 등; 및 그의 혼합물 또는 관능성 유도체를 들 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 생성물 추출은 상기 생성물을 함유하는 수성 상을 가염함으로써 개선될 수도 있다.
추출 조작을 하여, 실질적 양의 유기 용매를 함유하는 수성 상을 회수할 때, 그로부터 물을 공비 증류시키는 것이 편리할 수 있다. 일반적으로, 물과 함께 최소의 공비성 혼합물을 생성시킬 수 있는 용매를 첨가하고, 필요에 따라서, 침전제를 첨가하여 목적 생성물을 침전시키는 것이 필요하다. 물과 최소의 공비 혼합물을 형성할 수 있는 유기 용매의 대표적인 예로는 n-부탄올, 벤젠, 톨루엔, 부틸 에테르, 사염화탄소, 클로로포름, 시클로헥산, 2,5-디메틸푸란, 헥산 및 m-크실렌을 들 수 있고, 바람직한 용매는 n-부탄올이다.
침전제의 예로는 석유 에테르, 에틸 에테르, 프로필 에테르 및 부틸 에테르와 같은 저급 알킬 에테르, 및 아세톤과 같은 저급 알킬 케톤을 들 수 있다.
상기한 바와 같은 조 혼합물의 회수 후, 본 발명의 단일 항생 물질을 분리하기 전에 추가의 정제 및 농축 단계를 행하는 것이 필요할 수 있다. 크로마토그래피 방법이 이 경우에 첫번째로 선택된다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 항생 물질 GE 2270 인자 C2a는 정상적으로는 항생 물질 GE 2270 인자 A, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E 및 T와 동시에 생성된다. 그러므로, 일반적으로 주 인자(즉, 인자 A) 및 기타 소량 생성되는 인자(즉, 인자 B1, B2, C1, C2, D1, D2, E 및 T)로부터 인자 C2a를 분리하는 것이 필요하다.
일반적으로, 발효액으로부터 회수되는 조 혼합물을 정제시켜 소량의 다른 인자와 함께 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 함유하는 정제 혼합물을 얻는다. 이어서, 이 물질을 추가로 정제시켜 본 발명의 순수한 물질을 얻는다.
상기한 첫번째 정제 단계에서 편리하게 사용될 수 있는 크로마토그래피의 예로는 폴리스티렌 또는 혼합 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지, 예를 들어 Amberlite XAD2 또는 XAD4[롬 앤드 하스(Rohm and Haas)사 제품], Dowex S112[다우 케미칼 컴퍼니(Dow Chemical Co.) 제품] 및 Diaion HP20[미쓰비시(Mitsubishi)사 제품]; 아크릴산 수지, 예를 들어 XAD7 또는 XAD8(롬 앤드 하스사 제품); 1 내지 5 ml/g의 공극 용적, 1 내지 100 ㎡/g의 표면적, 0.15 내지 0.50 g/ml의 비중, 100 내지 3000 Å의 평균 공극 직경 및 입자 크기 40% 이상이 300㎛ 보다 작은 입자 크기 분포를 갖는 폴리카프로락탐, 나일론 및 가교 결합된 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리아미드, 예를 들어 폴리아미드-CC 6, 폴리아미드 SC 6, 폴리아미드-CC 6.6, 폴리아미드-CC 6AC 및 폴리아미드-SC 6AC[마헤리-니겔 ＆ 코.(Macherey-Nagel ＆ Co.)사 제품, 서독], 폴리비닐피롤리돈 수지 PVP-CL[알드리히 케미 게엠베하 ＆ 코.(Aldrich Chemie GmbH ＆ Co.)사 제품, KG, 서독], 폴리아미드 수지 PA 400[엠. 볼름 아게(M. Woelm AG)사 제품, 서독]; 및 탄소가 있다.
폴리스티렌 또는 아크릴산 수지의 경우에 바람직한 용출액은 상기한 바와 같은 수혼화성 용매의 극성 용매 혼합물이고; 폴리아미드 수지의 경우에는 용출액이 상기한 바와 같은 수혼화성 용매의 수용성 혼합물이 바람직하나, 탄소인 경우에 바람직한 용출액은 아세톤과 같은 저급 케톤 또는 메탄올과 같은 저급 알콜이다.
상기 단계에서 편리하게 사용될 수 있는 다른 크로마토그래피 방법에는 또한 할로겐화 저급 탄화수소, 저급 알칸올, 에테르, 상기한 고급 케톤 및 그의 혼합물을 함유하는 용매로부터 제조된 유기 용출상으로 실리카겔, 알루미나, 규조토 등과 같은 고정상에서의 크로마토그래피가 포함된다.
편리하게는, 또한 소위 입체 배제 크로마토그래피를 사용하여 양호한 정제 결과를 얻을 수 있다. 구체적으로는, 대부분의 히드록실기가 알킬화되어 있는, 조절된 공극 가교 결합된 덱스트란, 예를 들어 세파덱스(Sephadex) LH-20[파마시아 파인 케미칼스(Pharmacia Fine Chemicals)사 제품, Ab]가 이 경우에 유용하게 사용된다.
필요에 따라서, 상기 방법을 반복하고(하거나) 결합시킬 수 있다.
상기한 통상적인 방법에 따라, 본 발명의 화합물 이외에 소량의 항생 물질 GE 2270 인자 A, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E 및 T를 함유할 수 있는 정제 혼합물을 통상적으로 얻는다.
정제 혼합물로부터 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 분리는 상기한 바와 같은 크로마토그래피 기술 중에서 일반적으로 선택된 방법에 의해 행해질 수 있다. 그러나, 역상 크로마토그래피가 바람직한 분리 기술인 것 같다. 통상적인 역상 컬럼 크로마토그래피 이외에 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC가 통상적으로 사용된다.
이 크로마토그래피 기술에 있어서 고정상은, 예를 들면 여러 관능성 유도체를 갖는 실란화 실리카겔일 수 있고, 용출액은 상기한 여러 종류의 수혼화성 용매의 수용성 혼합물일 수 있다.
관능성 실란화 실리카겔의 예로는, 관능기가, 예를 들어 옥타데실실란 또는 옥틸실란 잔기, 또는 시클로헥산, 페닐 및 유사 관능기로 대표되는 (C8-C22)알킬기를 갖는 것이다. 이들 수지는 시판되고 있고, 본 발명의 방법에 유용하게 사용될 수 있는 유사한 또는 개선된 성질을 갖는 새로운 수지가 정식으로 추가 등록되어 있다.
특히 바람직한 예비 HPLC 기술에는 옥타데실 관능성 실리카겔, 및 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 및 수용성 포름산 암모늄을 함유하는 용출 혼합물이 사용된다.
특히 바람직한 용출 방법은 상 A가 아세토니트릴:테트라히드로푸란:40 mM 포름산암모늄(40:40:20)의 혼합물이고 상 B가 아세토니트릴:테트라히드로푸란:40 mM 포름산암모늄(10:10:80)의 혼합물이고 상 A가 약 40%로부터 약 50%까지인 상 A 및 상 B의 선형 구배를 사용한 용출로 표시된다.
분액은 그의 함량에 따라 통상적으로, 예를 들어 254 nm에서 통상적인 U.V. 검출기를 사용하는 용출 프로파일을 따라 수집하고, 이어서 용매를 공지 기술(예를들어 감압하 증류, 동결 건조 등)에 따라 제거하여 본 발명의 순수한 항생 물질을 단리하는데, 선택적으로는 예를 들어 폴리스티렌 또는 혼합 폴리스티렌-디비닐벤젠수지 상에서 흡수한 후 증류수로 염을 세척하고 수혼합성 용매로 항생 물질을 용출시킴으로써 용출상에 존재하는 염으로부터 추가로 정제하고(하거나) 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올과 같은 저급 알칸올로부터 결정화시킬 수 있다.
당 기술 분야에서 통상적인 것으로, 회수 및 정제 단계 뿐만 아니라 생성 단계는 UV 또는 미생물 검출 단계를 수반할 수 있고 감성 미생물 상에서 페이퍼 디스크 또는 아가 확산 분석과 같은 생물 검사, TLC 또는 HPLC 방법을 포함하는 각종 분석 방법에 의해 검사될 수 있다.
바람직한 HPLC 분석 기술은, 실란화 실리카겔, 예를 들어 C-8 알킬기로 관능화된 실리카겔의 공극 및 구형 입자를 갖고 균일한 직경[예를 들어 5㎛ 베이커 본드(Bakerbond ) C8, 베이커 리서치 프로덕츠(Baker Research Products)사 제품, 미합중국]을 갖는 컬럼, 및 증가하는 극성 구배를 갖는 상기한 바와 같은 수혼화성 극성 용매의 선형 구배 혼합물인 용출액을 사용하는 역상 HPLC로 표시된다.
이 경우에, 바람직한 용출 혼합액은 상 A가 CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(40:40:20)이고 상 B가 CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(10:10:80)이고, 바람직한 용출 방법은 약 1.8 ml/min의 유속 및 254 nm에서 UV 검출을 하는 약 20분내에 상 B 중에 상 A가 20% 내지 30%인 선형 구배로 표시된다.
항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 생리 화학적 특성
A) 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 모델 320 분광계로 기록된 자외선 흡수 스펙트럼은 하기 흡수 최대치를 나타낸다 :
B) 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의1H-NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) 분광계로 250 MHz에서 측정되었다.1H-NMR 스펙트럼의 내부 표준(0.00 ppm)으로서 TMS를 사용한 DMSO-d6(헥사듀테로디메틸술폭시드)에서 항생 물질의 스펙트럼은 하기 시그날을 나타낸다[δ, ppm, m](s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, m = 다중선, Py = 피리딘, Tz = 티아졸).
9.03, d, (NH); 8.70, d, (2NH's); 8.60, s, 8.54, s, 8.29, s, 및 7.38, s, (Tz CH's); 8.48, m, (글리신 NH); 8.43, d, 및 8.27, d, (Py CH's); 7.35-7.20, m, (방향족 CH's 및 1급 아미드 NH); 6.98, s, (1급 아미드 NH); 6.04, d, (OH); 5.80, t, (OH); 5.35-5.15, m, (αCH's); 5.04, m, (페닐세린 βCH); 4.98, s, [CH2(OCH3)]; 4.87, d, [CH2(OH)]; 4.81, m, 및 4.56, m, (옥사졸린 CH2); 4.35-3.75, m, (글리신의 CH2및 프롤린아미드 CH's); 3.39, s, (OCH3); 2,71, m, 및 1.30, m, (아스파라긴의 CH2); 2.48, d, (N-메틸아스파라긴의 NCH3); 2.22-1.80, m, (이소프로필 CH 및 롤린릴아미드 CH's); 0.88 및 0.84, d, (발린 CH3's)
C) 하기의 역상 HPLC계로 분석했을 때, 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 체류 시간(Rt)은 12.6분이고 항생 물질 GE 2270 인자 A(Rt= 16.6분)에 대한 체류 시간비는 0.76임을 나타낸다 :
컬럼 : BakerbondC8 (5 ㎛) 4.6 × 250 mm(Bakerbond는 미합중국 08865 뉴저지주 필리스버그에 소재하고 있는 J. T. Baker Research Product사에서 공급되는 역상 옥틸실릴 실리카겔 HPLC 컬럼의 상표명임)
유속 : 1.8 ml/min
상 A : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(40:40:20)
상 B : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(10:10:80)
용출 : 20분내에 상 A의 20% 내지 30%의 선형 구배
검출 : UV 254 nm
D) 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 주된 FAB-MS 피크는 1306 달톤이다. 이는 양성자화 분자 이온의 최저 동위 원소에 가장 일치한다. 분석은 8 kV 가속 전압 및 6 kV 전압과 1 mA 전류에서 Xe 가스를 갖는 안장 영역 원자총(소스 이온 게이지 상에서 표시된 압력이 2 × 10-5torr임)을 사용하는 Kratos MS-50 이중 촛점 질량 분광계 상에서 수행되었다. FAB-MS 분석용 항생 물질은 0.1 M 아세트산을 함유하는 티오글리세롤 매트릭스와 혼합되었다.
상기에 보고된 물리 화학적 데이타에 기초하여 하기 구조식이 항생 물질 GE 2270 인자 C2a로 시험적으로 지정될 수 있다.
상기 식으로부터 알 수 있듯이, 항생 물질 GE 2270 인자 C2a는 무기 및 유기산과 같은 산과의 부가염을 형성시킬 수 있는 몇몇 헤테로시클릭 염기 부위를 함유한다. 특히, 제약적으로 허용 가능한 산과의 염이 바람직하다.
항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 항미생물 활성은 일련의 시험관내 표준 시험으로써 입증될 수 있다.
최소 억제 농도(MIC)는 미량 브로쓰 희석법으로 결정하였다. 접종물은 ml 당 104-105CFU이었다. 모든 미생물을 37℃에서 배양하였다. 임균(Neisseria gonorrhoeae), 박테로이드 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 프로피오니박테리움 악슨스(Propionibacterium acnes)(48 시간)를 제외하고 MIC를 18-24 시간에서 읽었다. 임균(N. gonorrhoeae)을 5% CO2대기 중에서 배양시키고; 혐기성 균은 혐기성 가스 혼합물 중에서 배양시켰다. 사용된 배지는 옥소이드 이소-센시테스트(Oxoid Iso-Sensitest) 브로쓰[연쇄상구균(Staphylococci), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 대장균(Escherichia coli), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)]; Difco Todd-Hewitt 브로쓰[스트렙토코쿠스(Streptococci)]; 1% BBL IsoVitalex를 갖는 Difco GC 기재 브로쓰[임균(N. gonorrhoeae)]; Difco Wilkins-Chalgren 브로쓰(혐기성 균)이었다.
항생 물질의 최소 억제 농도(MIC, ㎍/ml)는 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
특성에 있어서, 본 발명의 화합물은 인체 또는 동물 치료용 의약 제조시 활성성분으로서 사용할 수 있다.
구체적으로는, 항생 물질 GE 2270 인자 C2a는 그람 양성 균과 그람 양성 및 그람 음성 혐기균에 대하여 주로 효과가 있는 항미생물제이다. 이것은 메티실린, 아미노글리코시드 또는 글리코펩티드 항생 물질과의 교차 저항성이 없다.
본 발명의 항생 물질은 이것에 민감한 미생물의 존재에 관련된 감염증을 치료하는데 주로 사용된다.
용어 "치료"는 예방, 치료 및 치유를 포괄한다.
따라서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자로서는 영장류, 구체적으로는 사람, 및 말, 소, 돼지 및 양과 같은 기타 포유 동물류; 및 일반적으로 가금 및 애완 동물을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 그 자체로 또는 제약적으로 허용 가능한 담체와의 혼합물로서 투여할 수 있으며, 또한 페니실린, 세팔로스포린, 아미노글리코시드 및 글리코펩티드와 같은 기타 항생 물질과 결합하여 투여될 수 있다. 따라서, 혼합 치료는, 첫번째 투여된 활성 화합물의 치료상의 효과가 다음의 약이 투여됨에 따라서 완전히 소멸되지 않는 방식으로 활성 화합물의 연속적, 동시적, 및 개별 투여를 포함한다.
바람직한 제약 제형은 온전하거나 손상된 피부 또는 점막 상의 국소 도포에 적합한 제형이다. 상기 제형의 예로는 분말, 연고, 크림 및 로숀이 있다. 상기 제형에 있어서 부형제는 통상의 제약적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면 유성연고 기재(예, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브유, 파라핀, 스페르마세티, 글리세린 전분), 흡수성 연고 기재(예, 무수 라놀린, 친수성 와세린), 에멀젼 연고 기재(예, 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린, 스테아르산), 수용성 연고 기재(예, 글리콜 에테르, 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(옥시-1,2-에탄디일)-알파-히드로-오메가-히드록시-옥타데카노에이트, 폴리솔베이트 및 폴리에틸렌 글리콜모노스테아레이트를 함유하는 그의 유도체)가 있다.
이들 제제는 기타 공지된 부형제, 예를 들어 방부제를 함유할 수 있고, 당 기술 분야에 공지되고 참고 문헌, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences[제17판, 1985년, 매크(Mack) 출판사 발행]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 당 기술 분야에 공지되고, 상기 기재한 바와 같은 참고서에 기술된 방법에 따라서 비경구 투여용에 적합한 조성물로 제형화시킬 수 있따.
예를 들면, 본 발명의 화합물은 폴리프로필렌 글리콜 또는 디메틸아세트아미드와 같은 용해제 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레이트 또는 주사용 무균수중의 폴리에톡실화 피마자유와 같은 계면활성제를 사용하여 제형화시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 대표적인 제형은 최종 제제물 1ml에 대해 항생 물질 GE 2270 인자 C2a10mg, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 또는 폴리옥시에틸렌 수소 첨가 피마자유 유도체일 수 있는 계면활성제 10-20% 및 프로필렌 글리콜, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, ter-부틸-N-히드록시카르바메이트, 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-부탄디올, 에틸 올레이트, 테트라히드로푸르푸릴-폴리에틸렌-글리콜 200, 디메틸-이소솔비드, 벤질 알콜 등과 같은 용해제 0 내지 20%, 바람직하게는 10-20%를 함유할 수 있다. 바람직한 용해제는 프로필렌 글리콜이다.
폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르는 시판되고 있으며, 이들 중 몇몇은 "트윈(Tween)"이라는 상표명으로 시판되고 있다. 또한, 이들은 "폴리솔베이트(Polysorbates)"의 비특허명으로 공지되어 있다. 이들의 예로는 폴리솔베이트 20, 21, 40, 60, 61, 65, 65, 80, 81 및 85가 있다. 본 발명의 제형에서 사용되는 바람직한 것은 폴리솔베이트 80[솔비탄 모노-9-옥타데케노에이트, 폴리(옥시-1,2-에탄디일)유도체]이다.
폴리옥시에틸렌 피마자유 및 폴리옥시에틸렌 수소 첨가 피마자유도 시판되고 있다. 이들 중 몇몇은 "크레모포어(Cremophor )"의 상표명으로 시판된다. 이 화합물들의 예로는 크레모포어 EL(폴리에톡실화 피마자유), 크레모포어 RH 40(폴리에톡실화 수소 첨가 피마자유), 크레모포어 RH 60(PEG 60 수소 첨가 피마자유) 또는 에멀포어(Emulphor ) EL-719(폴리옥시에틸화 식물유)로 공지된 것이 있다.
바람직하게는, 주사용 제형은 7±0.5 범위의 pH를 가져야 한다. 필요에 따라, 적당한 완충제를 사용하여 제제물의 pH를 조정하는 것이 바람직하다. 편리하게는, TRIS(즉, 트리히드록시메틸아미노메탄) 또는 인산염이 완충제로서 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 바람직한 제형은 다음의 부형제를 함유한다 : 크레모포어 EL(폴리옥실 35 피마자유 USP/NF) 20%, 프로필렌 글리콜 5 내지 20%, 바람직하게는 10 내지 20%.
일반적으로, 이들 제형은 활성 성분을 유기 용매에 용해시키고, 이어서 계면활성제를 첨가하고 마지막으로 주사용 살균수로 목적하는 용적까지 희석시킴으로써 제조될 수 있다.
방부제 또는 안정화제와 같은 기타 부형제는 당업계에 공지된 바와 같이 첨가시킬 수 있다.
비경구용 제형의 예는 다음과 같다:
항생 물질 GE 2270 인자 C2a10 mg
PEG 40 피마자유(크레모포어EL) 0.2ml
프로필렌 글리콜 0.2ml
메틸 파라히드록시벤조에이트 0.5mg
프로필 파라히드록시벤조에이트 0.05mg
충분량의 주사용수 1 ml
별법으로, 활성 성분은 사용전에 재구성을 위한 동결 건조 분말로서 제조될 수 있다.
동결 건조된 물질이 활성 성분 및 폴리에틸렌 글리콜 60 수소 첨가 피마자유와 같은 계면활성제를 함유한 혼합물로부터 출발하여 제조될 경우, 이는 편리하게는 유기 용매의 첨가없이 수용성 매질만으로 재구성시킬 수 있다.
선택적으로는, 분말 형태의 동결 건조된 물질을 얻기 위해, 필요시 통상의 동결 건조 보조제를 첨가시킬 수 있다.
바람직하게는, 모든 이러한 제형은 본 발명의 항생 물질에 감성인 미생물에 의한 임의의 감염증의 치료에 있어서 정맥내 투여용으로 사용된다.
위장관의 혐기성 균의 존재에 기인한 위막성 대장염 또는 기타 질병의 치료에 있어서, 본 발명의 화합물의 유효 투여량은 캡슐제, 정제 또는 수용성 현탁액과 같은 적합한 제약형으로 경구 투여될 수 있다.
활성 성분의 투여량은 환자의 유형, 연령 및 상태, 투여에 선택되는 특정 활성 성분 및 제형, 투여 계획 등을 포함하는 많은 인자에 따라 다르다.
일반적으로, 유효한 항세균제 투여량은 단일 단위 투여 형태로 사용된다.
반복 복용/투여, 예를 들어 1일 2회 내지 6회가 일반적으로 바람직하다. 유효 투여량은 일반적으로 0.5 내지 50 mg/kg 체중/일의 범위내이다.
바람직한 통상의 제제는 본 발명의 화합물을 1 내지 10%까지 함유한 연고이다.
어쨌든, 처방의는 주어진 상황에서 주어진 환자에게 최적의 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
인체 및 가축 치료에 있어서 의약으로서의 이들의 용도 이외에, 본 발명의 화합물은 동물 성장 촉진제로서도 역시 사용될 수 있다.
이러한 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 적합한 사료 중에 경구 투여시킬 수 있다. 사용할 정확한 농도는 정상의 사료량이 소비될 때 활성 화합물을 성장 촉진제의 유효량으로 제공하는데 필요한 농도이다.
본 발명의 활성 화합물의 동물 사료에의 첨가는 활성 화합물 유효량을 함유한 적절한 사료 예비 혼합물을 제조하고 이 예비 혼합물을 완전한 정량으로 혼합시킴으로써 바람직하게 수행된다.
별법으로, 활성 성분을 함유한 중간 농축물 또는 사료 첨가물을 사료에 혼합시킬 수 있다. 이러한 사료 예비 혼합물 및 완전한 정량을 제조하고 투여하는 방식은 인용 문헌에 기재되어 있다[이. 더블유. 크램프톤(Crampton)의 "Applied Animal Nutrition"(W. H. Freedman and Co., S. Franciso, USA, 1969) 또는 디. 씨. 쳐치(Church)의 "Livestock Feeds and Feeding"(O and books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) 참조].
다음의 실시예는 본 발명을 더욱 설명하며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
발효에 의한 항생 물질 GE 2270 인자의 생성
아가 슬랜트 상에서 자란 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 배양물을 종자 배지(전분 2%, 폴리펩톤 0.5%, 효모 엑스 0.3%, 쇠고기 엑스 0.2%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%로 구성되고 살균 전에 pH 7.0으로 조정함) 100ml를 함유하는 2개의 500ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 접종시켰다. 종자 배지를 함유한 500ml 에를렌마이어 플라스크 3개에, 28℃에서 96시간 동안 회전식 교반기(200rpm)상서 배양시킨 배양물을 접종시켰다(5% 접종).
3개의 에를렌마이어 플라스크의 배양물을 28℃에서 72시간 동안 회전식 교반기(200 rpm)상에서 배양시키고 나서 종자 배지 6 리터를 함유하는 10 리터 항아리 형 발효기내로 접종시켰다. 900 rpm에서 교반 및 통기(1 용적 및 1분당 약 1표준 리터의 공기)시키면서 28℃에서 72시간 동안 배양시킨 후, 배양물을 생성 배지(전분 2%, 펩톤 0.25%, 가수분해된 카제인 0.25%, 효모 엑스 0.3%, 쇠고기 엑스 0.2%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%로 조성되고 살균 전 pH를 7.4로 조정함) 200 리터를 함유하는 항아리형 발효기를 접종시켰다.
180 rpm에서 교반 및 통기(1 용적 및 1분당 약 0.5 표준 리터의 공기)하면서 28℃에서 126시간 동안 발효시킨 후, 수거된 브로쓰는 다른 GE 2270 인자와 함께 본 발명의 항생 물질을 함유했다.
[실시예 2]
a) 조 GE 2270 인자의 회수
하이플로(Hyflo) 여과 보조기로 여과시켜 수확된 브로쓰로부터 균사체를 수집하였다. 균사체 덩어리를 아세톤 60 리터에 이어 20 리터로 추출하고, 모인 추출액을 감압하에서 농축시켰다. 조 항생 물질 복합체를 액체-고체 분리기 중에서 원심분리하여 수잔류물로부터 분리시켰다. 습윤 물질을 2-프로판올로 용해시키고 그 용액을 감압하에서 농축시켜 물을 제거했다. 조 항생 물질 복합체 50g을 농출된 잔류물로부터 침전시켰다. 이 조 복합체는 항생 물질 GE 2270 인자 C2a및 상기한 다른 소량 인자와 함께 다량의 항생 물질 GE 2270 인자 A를 함유하고 있다.
b) 다른 GE 2270 인자와 혼합되어 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 함유하는 정제 혼합물의 단리
발효를 6회 반복하여 수거한 조 GE 2270 인자의 제조물을 모아 CH2Cl2:메탄올(93:7) 12 리터로 교반시켰다. 불용성 물질을 여과시켜 제거하고 항생 물질 복합체를 함유하는 용액을, CH2Cl2:메탄올(93:7) 중에 평형 상태에 이른 실리카겔 컬럼(230-400 메쉬) 13kg에 도포시켰다. CH2Cl2:메탄올(93:7)로 용출시킴으로써 항생물질 GE 2270 인자 C2a를 컬럼으로부터 용출시켰다. 본 발명의 항생 물질을 함유하는 분액(HPLC 분석)을 모아서 감압하에 농축시키고 건조하여 다른 소량 인자들과 혼합하여 항생 물질 GE 2270 인자 C2a23.5g을 수득하였다.
이 제조물의 일부인 5.5g을 다시 염화메틸렌(CH2Cl2) 중에 평형 상태에 이른 실리카겔(230-400 메쉬) 400g을 함유하는 컬럼 상에 플래쉬 크로마토그래피시켜 정제하였다. 먼저 염화메틸렌 1 리터에 이어 하기 비율(v/v), 즉, 96/4(3 리터); 94/6(1 리터); 92/8(2 리터); 90/10(6 리터) 및 88/12(4 리터)인 일련의 염화메틸렌/메탄올의 혼합물로 컬럼을 전재시켰다.
주로 GE 2270 인자 C2a를 함유하는 분액(HPLC 분석)을 모아 농축시켰다. 석유 에테르를 첨가하여 항생 물질 제조물 646mg을 침전시켰다.
[실시예 3]
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 C2a의 단리
주로 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 함유하는 정제 혼합물을 상기한 제조물로 부터 예비 HPLC로 추가로 정제시켰다.
항생 물질의 상기 제조물 중 10mg을 상 A [CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(40:40:20)] 1ml 및 상 B [CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(10:10:80)] 1ml 중에 용해시키고, 상 A 40%와 상 B 60%의 혼합물로 평형 상태에 이른 7㎛ 뉴클레오실(Nucleosil) C18(옥타데실실란기로 관능화된 실리카겔)로 충전된 HPLC 250 × 20 mm Hibar 컬럼(독일연방공화국 다름스타트에 있는 E. Merck사 제품)에 주입하였다. 그 컬럼을 상 A가 40% 내지 50%인 22분 선형 구배로 15ml/min 유속에서 용출시켰다. 254 nm에서 UV 검출을 했다. 본 발명의 순수한 항생 물질을 함유하는, 후속적으로 10회 크로마토그래피시킨 분액을 모아 감압하에서 농축시켜 CH3CN을 제거하였다. 항생 물질 GE 2270 인자 C2a를 물로부터 침전시켰다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 증류수로 2회 세척하였고, 진공하에서 건조시켜 순수한 항생 물질 66mg을 수득했다.

Claims (5)

  1. (2회 정정) 하기 특성을 갖는 항생 물질 GE 2270 인자 C2a및 그의 부가염.
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 하기의 흡수 최대치를 나타냄 :
    B)1H-NMR 스펙트럼은 내부 표준(0.00 ppm)으로서 TMS를 사용한 DMSO-d6(헥사듀테로디메틸술폭시드)에서 하기 시그날을 나타냄[δ, ppm, m](s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, m = 다중선, Py = 피리딘, Tz = 티아졸) :
    9.03, d, (NH); 8.70, d, (2NH's); 8.60, s, 8.54, s, 8.29, s, 및 7.38, s, (Tz CH's); 8.48, m, (글리신 NH); 8.43, d, 및 8.27, d, (Py CH's); 7.35-7.20, m, (방향족 CH's 및 1급 아미드 NH); 6.98, s, (1급 아미드 NH); 6.04, d, (OH); 5.80, t, (OH); 5.35-5.15, m, (αCH's); 5.04, m, (페닐세린 βCH); 4.98, s, [CH2(OCH3)]; 4.87, d, [CH2(OH)]; 4.81, m, 및 4.56, m, (옥사졸린 CH2); 4.35-3.75, m, (글리신의 CH2및 프롤린아미드 CH's); 3.39, s, (OCH3); 2,71, m, 및 1.30, m, (아스파라긴의 CH2); 2.48, d, (N-메틸아스파라긴의 NCH3); 2.22-1.80, m, (이소프로필 CH 및 프로릴아미드 CH's); 0.88 및 0.84, d, (발린 CH3's)
    C) 하기의 역상 HPLC계에 있어서, 체류 시간(Rt)은 12.6분이고 항생 물질 GE 2270 인자 A(Rt= 16.6분)에 대한 체류 시간비는 0.76임 : 및
    컬럼 : 베이커본드 (Bakerbond) C8 (5 ㎛) 4.6 × 250 mm
    유속 : 1.8 ml/min
    상 A : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(40:40:20)
    상 B : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(10:10:80)
    용출 : 20분내에 상 A의 20% 내지 30%의 선형 구배
    검출 : UV 254 nm
    D) 양성자화 분자 이온의 최저 동위 원소에 일치하는 주 FAB-MS 피크는 8 kV 가속 전압을 사용하고 6 kV 전압 및 1mA 전류에서 Xe 가스(소스 이온 게이지 상에서 표시된 압력이 2 × 10-5torr임)를 갖는 안장 영역 원자총(saddle field atom gun)을 사용하는 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광계로 구할 경우 1306 달톤 값을 나타냄(시료는 0.1M 아세트산을 함유하는 티오글리세롤 매트릭스와 혼합됨).
  2. (2회 정정) 심부 호기성 조건하에서의 플라노비스포라 로제아(Planobispora rosea) ATCC 53773 또는 그의 GE 2270 인자 C2a생산 돌연 변이주 또는 변이주의 발효에 의해 얻는 항생 물질 혼합물을 크로마토그래피 기술을 이용하여 분리하는 것을 포함하는, 하기 특성을 갖는 항생 물질 GE 2270 인자 C2a및 그의 부가염의 제조 방법.
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 하기의 흡수 최대치를 나타냄 :
    B)1H-NMR 스펙트럼은 내부 표준(0.00 ppm)으로서 TMS를 사용한 DMSO-d6(헥사듀테로디메틸술폭시드)에서 하기 시그날을 나타냄[δ, ppm, m](s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, m = 다중선, Py = 피리딘, Tz = 티아졸) :
    9.03, d, (NH); 8.70, d, (2NH's); 8.60, s, 8.54, s, 8.29, s, 및 7.38, s, (Tz CH's); 8.48, m, (글리신 NH); 8.43, d, 및 8.27, d, (Py CH's); 7.35-7.20, m, (방향족 CH's 및 1급 아미드 NH); 6.98, s, (1급 아미드 NH); 6.04, d, (OH); 5.80, t, (OH); 5.35-5.15, m, (αCH's); 5.04, m, (페닐세린 βCH); 4.98, s, [CH2(OCH3)]; 4.87, d, [CH2(OH)]; 4.81, m, 및 4.56, m, (옥사졸린 CH2); 4.35-3.75, m, (글리신의 CH2및 프롤린아미드 CH's); 3.39, s, (OCH3); 2,71, m, 및 1.30, m, (아스파라긴의 CH2); 2.48, d, (N-메틸아스파라긴의 NCH3); 2.22-1.80, m, (이소프로필 CH 및 프롤린아미드 CH's); 0.88 및 0.84, d, (발린 CH3's)
    C) 하기의 역상 HPLC계에 있어서, 체류 시간(Rt)은 12.6분이고 항생 물질 GE 2270 인자 A(Rt= 16.6분)에 대한 체류 시간비는 0.76임 : 및
    컬럼 : 베이커본드 (Bakerbond) C8 (5 ㎛) 4.6 × 250 mm
    유속 : 1.8 ml/min
    상 A : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(40:40:20)
    상 B : CH3CN:테트라히드로푸란:40 mM HCOONH4(10:10:80)
    용출 : 20분내에 상 A 20% 내지 30%의 선형 구배
    검출 : UV 254 nm
    D) 양성자화 분자 이온의 최저 동위 원소에 일치하는 주 FAB-MS 피크는 8 kV 가속 전압을 사용하고 6 kV 전압 및 1mA 전류에서 Xe 가스(소스 이온 게이지 상에서 표시된 압력이 2 × 10-5torr임)를 갖는 안장 영역 원자총을 사용하는 크라토스 MS-50 이중 촛점 질량 분광계로 구할 경우 1306 달톤 값을 나타냄(시료는 0.1M 아세트산을 함유하는 티오글리세롤 매트릭스와 혼합됨).
  3. 제2항에 있어서, 크로마토그래피 기술이, 고정상이 C8-C22알킬 관능기 또는 시클로헥실 또는 페닐 관능기를 갖는 관능성 실리카겔인 역상 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  4. (2회 정정) 제2항 또는 제3항에 있어서, 분리 단계를 거친 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773 또는 그의 GE 2270 인자 C2a생산 돌연 변이주 또는 변이주의 발효에 의해 얻은 항생 물질 혼합물이, 수혼화성 용매로 균사체를 추출한 후 농축된 수성 추출물로부터 조 항생 물질 혼합물을 회수함으로써 얻어지고, 얻어지는 조 GE 2270 인자 혼합물을 HPLC 역상 크로마토그래피시키기 전에 고정상으로서 실리카겔 및 용출상으로서 할로겐화 저급 탄화수소, 저급 알칸올, 또는 그의 혼합물을 사용하여 수행되는 중간 크로마토그래피 정제 단계를 수행하는 방법.
  5. (2회 정정) 제3항 또는 6항에 있어서, 분리 단계를 거친 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773 또는 그의 GE 2270 인자 C2a생산 돌연 변이주 또는 변이주의 발효에 의해 얻은 항생 물질 혼합물이, 수혼화성 용매로 균사체를 추출한 후 물을 공비적으로 제거하고 농축된 용액에 침전제를 첨가함으로써 농축된 수성 추출물로부터 조 항생 물질 혼합물을 회수함으로써 얻어지고, 얻어지는 조 GE 2270 인자 혼합물을 HPLC 역상 크로마토그래피시키기 전에 중간 크로마토그래피 정제 단계를 수행하는 방법.
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