KR0165684B1

KR0165684B1 - 항생물질 ge 2270 인자 b1, b2, c1, c2, d1, d2, e 및 t

Info

Publication number: KR0165684B1
Application number: KR1019910003811A
Authority: KR
Inventors: 셀바 엔리코; 타베크치아 파올로; 레스텔리 에르메네길도; 페르라리 피에트로; 데나로 마우리지오
Original assignee: 레나토 스가르비; 그루포 레페티트 에스.피.에이.
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1991-03-07
Publication date: 1999-01-15
Also published as: ES2071143T3; ATE121459T1; CA2037779C; KR910016938A; CA2037779A1; DE69108972D1; EP0451486B1; IE910754A1; IE67973B1; DK0451486T3; DE69108972T2; JPH04217988A; EP0451486A1; GR3015899T3; US5747295A; JP3107584B2; US5843890A

Abstract

본 발명은 항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T라는 명칭의 신규 항생 물질, 그의 부가염, 그의 제약 조성물, 특히 이들 화합물에 감수성인 미생물과 관련된 감염성 질병 치료에 있어서 그의 약제로서의 용도 및 가축 성장 촉진제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

항생물질 GE 2270 인자 B1, B2, C1, C2, D1, D2, E 및 T

제1도는 항생물질 GE 2270 인자 E의¹H-N.M.R. 스펙트럼.

제2도는 항생물질 GE 2270 인자 T의¹H-N.M.R. 스펙트럼.

본 발명은 항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T로 명명된 신규 항생물질, 그의 부가염, 그의 제약 조성물 및 특히 이 물질에 감수성인 미생물과 관련된 감염성 질환의 치료에 있어서 이들 물질의 의약품으로서의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 화합물은 가금, 돼지, 반추동물 등과 같은 동물에 있어서 성장 촉진제로서 활성이 있다.

본 발명의 화합물은 플라노비스포라 로제아(Planobispora rosea) ATCC 53773 배양물 또는 그의 항생물질 GE 2270 생성 변이주 또는 돌연변이주로부터 단리된다. 구체적으로, 본 발명의 화합물은 균체 및(또는) 미생물 배양시킨 발효 브로쓰에서 발견된다.

플라노비스포라 로제아 ATCC 53773은 토양 시료로부터 분리되었으며, 이는 1988년 6월 14일자로 부다페스트 조약의 규정하에 미합중국 20852 메릴랜드주 로크빌 카프론 드라이브 12301에 소재하는 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되었다.

이 균주는 기탁 번호 ATCC 53773을 부여받았다.

이 균주는 항생물질 GE 2270 인자 A라는 명칭의 신규 항생물질의 제조의 관련하여 유럽 특허 출원 공개 공보 제359062호(미합중국 특허 출원 제401,278호에 상응함)에 이미 기재되어 있다.

본 발명의 화합물은 통상적으로 가장 풍부한 분류물인 항생물질 GE 2270 인자 A와 함께 상기한 미생물 균주에 의해 생성된다.

항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T의 생성은 이를 생성할 수 있는 플라노비스포라 균주 즉, 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773 또는 그의 항생물질 GE 2270 생성 변이주 또는 돌연변이주를 호기성 조건하에 탄소, 질소 및 무기염의 동화원을 함유하는 영양 배지 수용액 중에서 배양시키므로서 성취된다. 발효 업계에서 통상적으로 사용하는 여러 가지 영양 배지를 사용할 수 있으나, 일부 배지만이 바람직하다. 적합한 탄소원은 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 전분, 옥수수 가루 등이다. 적합한 질소원은 암모니아, 질산염, 대두분, 펩톤, 육추출물, 효모 추출물, 트립톤, 아미노산 등이다. 배양 배지에 혼입될 수 있는 무기염으로는 나트륨, 칼륨, 철, 아연, 코발트, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 탄산염, 황산염, 인산염, 질산염 및 기타 이온을 생성할 수 있는 통상의 가용성 염이 있다.

통상적으로는, 항생물질 생성 균주는 교반 플라스크 내에서 전배양되며, 이어서 이 배양물은 대량의 항생물질 생성을 위해 항아리형 발효기에 접종하는데 사용한다. 전배양에 사용되는 배지는 대규모 발효에 사용하는 것과 동일하나 다른 배지를 사용할 수도 있다. 항생물질 GE 2270 생성 균주는 20-40℃, 적합하기로는 24 내지 35℃의 온도에서 성장시킬 수 있다.

발효시키는 동안 항생물질의 생성은 예를 들면 생물학적 시험법이나 TLC 또는 HPLC 방법에 의해 브로쓰 또는 균체 추출물 시료의 항생물질 활성을 시험함으로써 모니터링될 수 있다.

고초균(Bacillus subtilis) 및 황색 포도상 구균(S. aureus)과 같은 항생물질 GE 2270에 대해 감성인 미생물이 시험 미생물로서 사용될 수 있다. 생물학적 시험은 아가(agar) 평판 상에서 평판 확산법에 의해 편리하게 실시할 수 있다. 항생물질의 최대 활성 생성은 일반적으로 발효 2일 내지 8일째에 발생한다.

항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T는 균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773 또는 그의 항생물질 GE 2270 생성 돌연변이주 또는 변이주를 배양시키므로써 생성되며, 생성물 중 소정량이 발효 브로쓰로부터 단리될 수 있으나 대부분은 균체에서 발견된다.

[플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 형태학적 특성]

플라노비스포라 로제아 ATCC 53773는 대부분의 표준 배지에서 잘 자란다. 영양 균체는 아가를 투과하며, 그의 표면에서 밀착된 성장체를 형성하는 길고 불규칙한 가지를 가진 섬유소(0.5 내지 1.0㎛)를 형성한다. 균체는 액체 또는 고체 배지 어디에서 자라든지 간에 절편화되지 않고 남아있다. 그의 색은 대부분의 시험 배지 상에서 밝은 산호빛 내지 연분홍 산호빛에 걸쳐 있다. 호기성 균체는 측지가 거의 없는 길고, 기복있고 가느다란 균사로 이루어져 있으며, 아가 표면에 대해 실질적으로 평행하게 공기중으로 자란다.

호기성 균체는 연분홍 색을 가진다. 포자낭들은 호기성 균체의 균사를 따라 단독으로 또는 무리로 형성되며, 약 6.0 내지 0.8미크론의 길이와 1.0 내지 1.2미크론의 너비를 갖는다. 이들은 짧은 포자낭병(1.0 내지 2.0㎛의 길이)에 의해 균사에 붙어 있다. 종방향의 방추상 연직 포자 쌍(3.0 내지 3.5×1.0 내지 1.2㎛)이 각각의 포자낭에서 형성된다. 포자낭에 있어서, 포자는 횡중격 격막에 의해 분리된다. 포자낭의 막으로부터 방출후, 포자들은 돌출한 편모에 의해 운동성을 갖게 된다.

[플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 배양 특성]

배양 특성을 시험하기 위해 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773을 왁스만(Waksman, S.A., 1961년-The Actinomycetes-The Williams and Wilkins Co. Baltimore; 제2권, 328-334페이지)에 의해 권장된 몇가지 배지를 첨가하여 셔링 및 고틀리에(Shirling E.B. 및 Gottlieb D., 1966년, Method for characterization of Streptomyces species-Int. J. Syst. Bacteriol, 제16권, 313-340페이지)에 의해 제안된 여러 가지 표준 배지 상에서 배양시켰다.

색 측정은, 필요시, 매르즈와 폴(Maerz A.와 M. Rea Paul, 1950년-A Dictionary of Color-2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York)의 방법에 의해 행하였다.

이 미생물의 상이한 탄소원을 이용하는 능력은 셔링과 고틀리에가 기재한 방법으로 검사하였다.

배양 및 생리학적 특성 및 탄소원 이용을 다음 표 (1), (2), (3)에 기재하였다.

표(1)에 있어서, 판독은 28℃에서 2주 배양후 행하였다.

문자 및 숫자는 매르즈와 폴(상기함)에 의해 측정된 색을 나타낸다.

[플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 생리학적 특성]

+ 적절한 성장

+/-드문 성장

-비성장

이 시험을 위하여 8번 배지를 사용하고, 그 결과는 28-30℃에서 2주 배양후 측정하였다.

[온도에 대한 감성]

최적 성장 온도는 28℃ 내지 37℃의 범위이다. 15℃ 및 50℃에서는 성장하지 않았으며, 20℃에서는 적절하게 성장하였다.

[화학분류학적 특성]

[세포벽 분석:]

세포벽에 존재하는 아미노산의 분석은 문헌[벡커(Becker) 등, Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by papber chromatography of whole cell hydrolyzates, Appl. Microbiol., 제12권, 421-423페이지, 1964년]이 기재한 방법에 의해 행하였다.

전체 세포 가수분해물에 대한 분석에 의해 메조-디아미노 피멜산의 존재가 밝혀졌다.

가와모토 등의 문헌[Kawamoto I., O. Tetsuo, 및 N. Takashi, Cell wall composition of Micromonospora olivoasterosporia, Micromonospora sagamiensis and related organism, J. of Bacteriol, 제146권, 527-534페이지, 1981년]의 방법에 의해 얻은 순수 세포벽 제제의 분석에서는 글리신이 발견되지 않았다.

[전체 세포의 당 유형:]

전체 세포 가수분해물의 당 함량 분석은 에틸아세테이트-피리딘-물(100:35:25(v/v))의 용매계를 사용하는 문헌[Staneck J.L. 및 G.D. Roberts, Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography, Appl. Microbiol., 제28권, 226-231페이지, 1974년]에 기재된 바와 같은 박막 크로마토그라피 셀룰로오스 시트를 사용하여 문헌[Lechevalier M.P., Identification of aerobe actinomycetes of clinical importance, J. Lab. Clin. Med., 제71권, 934-944페이지, 1968년]의 방법에 의해 행하였다.

얻은 결과는 마두로오스(3-O-메틸-D-갈락토오스)의 존재 및 아라비노오스와 갈락토오스의 부재를 나타냈다.

[균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 동정]

이 균주는 다음의 형태학적 및 화학적 특성 때문에 플라노비스포라 속으로 지정되며, 플라노비스포라 로제아로서 분류되었다.

a) 세포벽 중 메조-디아미노피멜산의 존재 및 글리신의 부재(세포벽의 화학유형 III):

b) 전체 세포 가수분해물 중 마두로오스의 존재(전체 세포의 당 유형 B);

c) 호기성 균체 상에서 한쌍의 운동성 포자를 함유하는 긴 원통형의 포자낭의 형성; 및

d) 연분홍색의 영양 균체.

상기한 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 형태학적 특성은 문헌[J. E. Thieman 등, The Actinomycetales, The Jena Intern. Symp. on Taxon., 1968년 9월, ed. H. Prauser, Jena]에 의해 기재된 플라노비스포라 로제아 균주의 특성과 실질적으로는 다르지 않다. 이는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었으며, 기탁 번호 제23866번을 받았다. 이 균주의 항생물질 생성은 기재되지 않았다.

다른 미생물과 마찬가지로, GE 2270 생성 균주의 특성은 변화될 수 있다. 예컨데, 이 균주의 인공 변이주 및 돌연변이주는 여러 공지된 돌연변이유발제(예, UV선, X-선, 고주파선, 방사선) 및 화합물(예, 아질산, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 및 기타등등)로 처리하여 얻을 수 있다. 플라노비스포라속에 속하고 항생물질 GE 2270을 생성하는 모든 천연 및 인공 변이주 및 돌연변이주는 본 발명의 목적을 위한 균주 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773과 대등하게 간주하며, 본 발명의 범위내에 있는 것으로 고려된다.

상기 언급한 바와 같이, 항생물질 GE 2270 인자 B, B, C, C, D, D, E 및 T는 일반적으로 균주를 생성하는 균체 중에서 주로 발견되나 발효 브로쓰에서도 역시 소량 발견된다.

[본 발명의 항생물질의 회수 및 단리]

미생물을 생성하는 균체 또는 발효 브로쓰로부터 항생물질 GE 2270 B, B, C, C, D, D, E 및 T의 회수는 용매로 추출시키고, 비용매를 첨가하거나 또는 용액의 pH를 변화시켜 침전시키고, 분배 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 역상 분배 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 분자 배제 크로마토그래피 등과 같은 본질적으로 공지된 기술에 따라서 행해진다.

균체로부터 본 발명의 항생물질을 회수하는 바람직한 방법은 수혼화성 유기 용매로 여과시키거나 또는 원심분리시킨 균체를 추출하고, 추출물을 농축시키고, 임의로 침전체를 첨가하여 침전시키거나, 수불혼화성 유기 용매로 수용성 잔류물을 추출시키거나, 흡착 크로마토그래피에 이어서 흡착 매트릭스로부터 목적하는 생성물을 용출시킴으로서 조 항생물질을 회수하는 것을 포함한다.

발효 브로쓰로부터 본 발명의 항생물질을 회수하는 바람직한 방법은 수불혼화성 유기 용매로 추출시키고, 이어서 농축 추출물로부터 가능하게는 침전제를 첨가하여 침전시키거나 또는 수불혼화성 용매로 수용성 잔류물을 추가로 추출하는 것을 포함한다. 별법으로는, 발효 브로쓰를 흡착 매트릭스와 접촉시킨 후 극성 혼합 용출제로 용출시킴으로서 행해진다. 이러한 크로마토그라피 방법은 브로쓰 자체 대신에 발효 브로쓰로부터 얻은 농축 추출물에도 역시 적용시킬 수 있다.

본 명세서에 사용된 수혼화성 용매는 당업계에서 현재 통용되는 의미를 가지며, 사용시 상당히 넓은 농도 범위에 걸쳐서 수혼화성을 갖는 용매를 의미한다.

균체 매스로부터 본 발명의 항생물질을 추출하는데 사용될 수 있는 수혼화성 유기 용매의 예로서는 저급 알칸올류, 예를 들면 C-C알칸올류(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올), 페닐, C-C알카놀류(예, 벤질 알콜), 저급 케톤류, 예를 들면 C-C케톤류(예, 아세톤 및 에틸메틸케톤), 시클릭 에테르(예, 디옥산, 테트라히드로푸란), 글리콜 및 그의 부분 에스테르화 생성물(예, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 및 모노메틸 에테르), 저급 아미드(예, 디메틸포름아미드 및 디에틸포름아미드) 및 디메틸술폭시드 등을 들 수 있다.

본 명세서에 사용된 수불화성 용매는 당업계에 현재 통용되는 의미를 가지며, 사용시 목적하는 용도에 적합한, 상당히 넓은 농도 범위에서 물과 약한 혼화성이거나 또는 실질적으로 불혼화성인 용매를 말한다.

발효 브로쓰로부터 본 발명의 항생물질의 추출에 사용될 수 있는 수불혼화성 유기 용매의 예로서는 선형, 분지쇄형 또는 시클릭의 통상적인 탄화수소 용매(예, 헥산, 시클로헥산), 할로겐화 탄화수소(예, 클로로포름, 사염화 탄소, 이염화에탄, 플루오로브로모에탄, 디브로모에탄, 트리클로로프로판, 클로로트리플루오로옥탄 등), 방향족 탄화수소(예, 벤젠, 톨루엔, 키실렌 등), 탄소 원자수 4 이상의 에스테르(예, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 부티레이트 등), 선형 분지쇄형 또는 시클릭일 수 있는 탄소 원자수 4 이상의 알칸올류(예, 부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 2,2-디메틸-3-펜탄올, 2,4-디메틸-3-펜탄올, 4,4-디메틸-2-펜탄올, 5-메틸-2-헥산올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 5-메틸-1-헥산올, 2-에틸-1-헥산올, 2-메틸-3-헥산올, 1-옥탄올, 2-옥탄올, 시클로펜탄올, 2-시클로펜틸에탄올, 3-시클로펜틸-1-프로판올, 시클로헥산올, 시클로헵탄올, 시클로옥탄올, 2,3-디메틸시클로헥산올, 4-에틸시클로헥산올, 시클로옥틸메탄올, 6-메틸-5-헵텐-2-올, 1-노난올, 2-노난올, 1-데칸올, 2-데칸올 및 3-데칸올), 직쇄 또는 분지쇄 알킬 에스테르 및 이들의 혼합물(예, 에틸 에테르, 프로필 에테르, 부틸 에테르 등) 및 이들의 혼합물 또는 관능성 유도체 등을 들 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이 생성물의 추출은 염 형성 또는 추출 용매에 가용성인 항생물질과 이온쌍을 형성하는 적절한 유기염기의 첨가에 의해 향상될 수 있다.

추출 후 회수되는 수성상이 다량의 유기 용매를 함유하고 있을 경우, 추출액으로부터 물을 공비 증류시키는 것이 편리할 수 있다. 통상적으로, 상기 공비 증류는 물로 최소한도의 공비 혼합물을 형성할 수 있는 용매를 첨가하는 것이 필요하며, 필요에 따라서, 목적 산물을 침전시키기 위하여 침전제를 첨가한다. 물과 최소한도의 공비 혼합물을 형성할 수 있는 유기 용매의 대표적인 예로는 n-부탄올, 벤젠, 톨루엔, 부틸 에테르, 사염화 탄소, 클로로포름, 시클로헥산, 2,5-디메틸푸란, 헥산 및 m-크실렌이 있으며, 더 바람직한 용매는 n-부탄올이다.

침전제의 예로는 석유 에테르와, 에틸 에테르, 프로필 에테르 및 부틸 에테르 등과 같은 저급 알킬 에테르류와, 아세톤과 같은 저급 알킬 케톤류가 있다.

상기에서와 같이 조 혼합물을 회수한 후, 조 혼합물을 더 정제/농축시키고, 이어서 본 발명의 단일 항생물질을 분리하는 것이 필요할 수 있다. 이런 경우에, 크로마토그라피 과정이 우선되어야 한다.

상기에서와 같이, 본 발명의 항생물질 인자는 통상적으로 항생물질 GE 2270 인자 A와 함께 공동 생성되며 이와 비교하여 소량인 분류물이 나타난다. 그러므로, 통상적으로 남아있는 항균적 활성의 분류물로부터 인자 A를 분리하는 것과 본 발명의 단일 항생물질을 소량 회수하기 위하여 분리전에 상기 소량의 분류물을 농축시키는 것이 필요하다.

상기의 단계에서 편리하게 사용되는 크로마토그라피 시스템의 예로는 폴리스티렌 또는 혼합형 폴리스티렌-디비벤젠 수지[예, 앰버리트(Amberlite) XAD2 또는 XAD4(Rohm and Hass), 도웩스(Dowex) S112(Dow Chemical Co.) 및 디아이온(Diaion) HP 20(Mitsubishi)], 아크릴 수지[예, XAD7 또는 XAD8(Rohm and Hass)], 폴리아미드[예, 폴리캐프로락탐, 나일론 및 폴리아미드-CC 6, 폴리아미드-SC 6, 폴리아미드-CC 6.6, 폴리아미드-CC 6AC 및 폴리아미드-SC 6AC(Macherey-Nagel Co., 서독)와 같은 교차 결합된 폴리비닐피롤리돈(통상적으로, 공극 부피는 1 내지 5ml/g, 표면적은 1 내지 100m/g, 겉보기 밀도는 0.15 내지 0.50g/ml, 평균 공극 직경은 100 내지 3000Å이고, 입자 크기의 40% 이상이 300㎛ 보다 작은 입자 크기 분포를 가짐)]. 폴리비닐피롤리돈 수지 PVP-CL(Aldrich Chemie GmbH Co., KCT, 서독), 폴리아미드 수지 PA 400(M. Woelm AG, 서독) 및 탄소가 있다.

폴리스티렌 또는 아크릴 수지의 경우에 있어서, 바람직한 용출제는 상기에서와 같은 수혼화성 용매의 극성 용매 혼합물이고, 폴리아미드 수지의 경우에 있어서의 용출제는 상기 용매와 같은 수혼화성 용매의 수성 혼합물이 더 바람직한 반면에, 탄소의 경우에 있어서 바람직한 용출제는 아세톤과 같은 저급 케톤 또는 메탄올과 같은 저급 알콜이다.

상기 단계에서 편리하게 사용할 수 있는 또 다른 크로마토그라피의 방법에는 실리카겔, 알루미나, 규조토 등과 같은 정지상에서 할로겐화 탄화수소, 저급 알칸올류, 에테르류, 및 상기 타입의 고급 케톤류, 및 이들의 혼합물을 포함한 용매로 제조된 유기 용출상을 사용하는 크로마토그래피도 역시 포함된다.

편리하게는, 소위 입체 배제 크로마토그라피를 사용하여 역시 양호한 정제 결과를 얻을 수 있다. 구체적으로, 이런 경우에는 히드록실기의 대부분이 알킬화된 조절 공극 교차 결합된 덱스트란[예, 세파덱스(Sephadex) LH-20(Pharmacia Fine Chemicals, Ab)]이 유용하게 사용된다.

상기의 통상적 과정에 의하면, 통상적으로 본 발명의 화합물 보다도 항생물질 GE 2270 인자 A를 더 적은 양 함유할 수도 있는 정제된 혼합물을 얻는다.

정제된 혼합물로부터의 항생물질 GE 2270 인자 B, B, C, C, D, D, E 및 T의 분리는 당업계에서 공지된 임의의 방법으로 행할 수 있다.

상기와 같은 크로마토그라피 기술은 분리 목적에 특히 바람직하지만, 역상 크로마토그라피가 더 바람직한 분리 기술이라 생각되어진다. 통상의 역상 컬럼 크로마토그래피 이외에, 역상 컬럼을 이용하는 정제용 HPLC도 역시 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 크로마토그래피 기술에서 정지상은, 여러 가지 관능성 유도체를 갖고 상기 종류의 수혼화성 용매의 수성 혼합물로 용출시키는 실란화된 실리카겔과 같은 통상적으로 사용하는 것이 있다.

관능화시킨 실란화 실리카겔류의 예로는 옥타데실실란 또는 옥틸실란 잔기에 의해 관능성을 나타내는, C-C알킬기, 또는 시클로헥산, 페닐 및 유사 관능기를 함유하는 것이 있다. 이러한 수지류는 시판되고 있고, 본 발명의 방법에 유용하게 사용할 수 있는 유사하거나 더욱 개선된 특성을 갖는 신규 첨가제가 정식으로 등록되어 있다.

특히 바람직한 정제용 HPLC 기술은 옥타데실기로 관능화된 실리카겔과 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 및 포름산 암모늄 수용액을 함유하는 용출 혼합물을 사용한다.

특히 바람직한 용출법은 A상과 B상이 약 25:75인 혼합액을 사용하는 용출이며, 여기에서 A상은 아세토니트릴 대 테트라히드로푸란 대 40mM 포름산 암모늄의 비가 40:40:20인 혼합물이고, B상은 동일 조성물의 비율이 10:10:80인 혼합물이다.

분류물은 예를 들면 통상적인 U.V. 검출기로 245nm에서 용출 프로필을 측정한 후, 그들의 함량에 따라 모으며, 이어서, 본질적으로 공지의 기술(예, 감압하의 증류, 동결 건조 등)에 따라 용매를 제거하고, 임의로 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올과 같은 저급 알칸올류로부터 결정화시켜 본 발명의 순수한 항생물질 인자를 단리시킨다.

당업계에서 통상적으로, 회수와 정제 단계 뿐만 아니라 생성은 감수성 미생물 상에서의 종이 디스크(disc) 또는 아가 확산 분석 실험과 같은 생물학적 시험법, TLC 또는 HPLC 방법을 포함한 여러 가지 분석법에 의해 모니터링될 수 있다.

더 바람직한 HPLC 분석 기술은 실란화시킨 실리카겔의 다공성 입자와 구면입자[예, 균일한 직경(5㎛, Bakerbond

C8, Baker Research Products, 미합중국)을 갖는 C₈알킬기로 관능화시킨 실리카겔]를 채운 컬럼 및 극성을 증가시키는 구배로 상기에서와 같은 수혼화성 극성 용매의 선형 구배 혼합물을 용출제로 사용하는 역상 HPLC이다.

이 경우에 더 바람직한 용출 혼합액은 하기와 같다.

상 A: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(40:40:20)

상 B: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(10:10:80)

반면에 더 바람직한 용출법은 약 20분 동안에 약 1.8ml/분의 유속과 254nm의 UV 측정으로, 상 B내에서의 상 A의 20% 내지 30%의 선형 구배로 용출시키는 것이다.

[항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T의 물리-화학적 특성]

A) 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 모델 320 스펙트로메터로 기록된 자외선 흡수 스펙트럼은 다음의 흡수 최대치를 나타내었다.

B) 뉴졸 멀(Nujol mull)중에서 적외선 흡수 스펙트럼(항생물질 GE 2270 인자 D, D, E 및 T)은 다음의 흡수 최대치 υ(cm)을 나타냈다:

[인자 D:]

3700-3100; 3020-2750(뉴졸); 1645; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1305; 1260-1100; 1100-870; 840; 800; 760; 720(뉴졸); 700

[인자 D:]

[인자 E:]

3700-3100; 3020-2750(뉴졸); 1645; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1305; 1260; 1250-1070; 1015; 985-900; 840; 800; 760; 720(뉴졸); 700

[인자 T:]

3700-3120; 3100; 3020-2720(뉴졸); 1655; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1410; 1200; 1240; 1200-1000; 980; 930; 890; 840; 805; 765; 745; 720(뉴졸); 700

C)H-NMR 스펙트럼(항생물질 GE 2270 인자 D, D, E 및 T)은 내부 표준 물질로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여 DMSO-d(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 브루커(Bruker) 분광계로 측정한 결과 다음 신호군을 나타내었다[δ, ppm, m](s=단일선, br, s=넓은 단일선, d=이중선, dd=이중선쌍, t=삼중선, m=다중선, py=피리딘, Tz=티아졸).

[인자 D(5000MHZ에서 측정됨):]

8.88, d, (NH); 8.70, d, (2NH); 8.57, s, 8.50, s, 8.25, s, 8.21, s 및 7.35, s,(5개 티아졸의 CH); 8.40, m, (글리신의 NH); 8.28-8.21, m, (피리딘의 CH); 7.32-7.20, m, (방향족의 CH 및 1급 아미드의 NH); 7.00, s, 6.64, s, 6.53, s, (1급 아미드의 NH); 5.95, d, (H); 5.29-5.15, m, (αCH); 5.04, m, (페닐세린의 βCH); 4.81, m 및 4.56, m, (옥사졸린의 CH); 4.30-3.80, m, (글리신의 CH및 프롤린아미드의 CH); 2.72, m, 및 1.43, m, (아스파라긴의 CH); 2.60, s, (CH); 2.21-1.91, (m), (이소프로필의 CH 및 프롤린아미드의 CH); 0.90(d) 및 0.86(d), (발린의 CH)

[인자 D(5000MHZ에서 측정됨):]

9.00, d, (NH); 8.69, br s(2NH); 8.59, s, 8.53, s, 8.29, s 및 7.35, s, (티아졸의 CH); 8.38, m, (글리신의 NH); 8.40 및 8.26(m), (피리딘의 CH); 7.37-.718, m, (방향족의 CH 1급 아미드의 NH); 6.97, s, (1급 아미드의 NH); 6.03, d 및 t, (20H); 5.28-5.16, m, (αCH); 5.03, m, (βCH); 4.97, m, [CH(OH)]; 4.79 및 4.55, m, (옥사졸린의 CH); 3.97-3.76, m, (글리신의 CH및 프롤린아미드의 CH); 2.71, m 및 1.28, m, (N-메틸아스파라긴의 CH); 2.18-1.89, m, (이소프로필의 CH 및 프롤린아미드의 CH); 0.88, d 및 0.84, d, (발린의 CH)

[인자 E(500MH에서 측정됨)]

8.95, d, (NH); 8.73, d, (NH); 8.60, s, (티아졸의 CH); 8.57, d, (NH); 8.53, s, (티아졸의 CH); 8.42, m, (피리딘의 CH); 8.31, m, (NH); 8.28, m, (피리딘의 CH); 8.24, s, (티아졸의 CH); 7.33, s, (티아졸의 CH); 7.31-7.20, m, (방향족의 CH, 1급 아미드의 NH); 6.98, s, 6.91, s, 6.62, s, (1급 아미드의 NH); 6.04, d, (OH); 5.95, t, (OH); 5.28-5.14, m, (αCH). 5.03, m, (βCH); 4.99, m, [CH(OH)]; 4.81, dd 및 4.57, dd, (옥사졸린의 CH); 4.26(m) 및 3.79(m), (글리신의 CH); 4.25, m, 3.98, m, 3.82, m, (프롤린아미드의 CH); 2.77, m, 및 1.25, m, (아스파라긴의 CH); 2.60, s, (CH); 2.20, m, 및 1.89, m, (발린의 βCH 및 프롤린아미드의 CH); 9.90, d, 0.84, d, (발린의 CH)

[인자 T(250MHZ에서 측정됨):]

8.95, d, (NH); 8.70, d, (2NH); 8.66, s, 8.65, s, 8.60, s, 8.30, s, 및 7.38, s, (4개의 티아졸과 1개의 옥사졸의 CH); 7.35-.724, m, (방향족의 CH 및 1급 아미드의 NH); 6.68(1급 아미드의 NH); 5.96, d, (OH); 5.34-5.18, m, (αCH); 5.05, m, (βCH); 5.03, s, [CH(OCH)]; 4.32, m 및 3.82, m, (글리신의 CH); 4.48, m, 4.04, m 및 3.63, m, (프롤린아미드의 CH); 3.40, s, (OCH); 2.73, m 및 1.41, m, (N-메틸아스파라긴의 CH); 2.60, s, (CH); 2.49, d, (N-메틸아스파라긴의 CH); 2.27-1.88, m, (이소프로필의 CH 및 프롤린 아미드의 CH); 0.89, d, (발린의 CH)

제1도와 제2도는 각각 항생물질 GE 2270 인자 E와 인자 T의H-NMR 스펙트럼을 보여준다.

D) 다음의 역상 HPLC 시스템에서의 체류 시간(Rt)(항생물질 GE 2270 인자 B, B, C, C, D, D, E 및 T) 및 그 데이타:컬럼:(Bakerbond

C8 5㎛) 4.6×250mm(베이커본드는 미합중국 08865 뉴저지주 필리스버그 소재의 J. T. Baker Research Product사 제품인 역상 옥틸실릴 실리카겔 HPLC 컬럼의 상표명임)

유속:1.8ml/분

상 A: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(40:40:20)

상 B: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(10:10:80)

용출:20분 내에 상 A의 20% 내지 30%의 선형 구배

측정:UV 25nm

E) FAB-MS 주요 피크[6KV 전압과 1mA 전류에서, 8KV 가속 전압 및 Xe 가스를 이용한 새들 영역 원자총(소스 이온 게이지상으로 2×10torr 압력)을 사용하여 2중 촛점형 크레이토스(Kratos) MS-50 질량 스펙트로메터 상에서 얻음, 시료는 0.1M 아세트산 함유 티오글리세롤 매트릭스와 혼합시킴] 데이타, 그 수치는 대부분 양성자화된 분자 이온의 가장 낮은 동위 원소와 가깝게 일치한다:

상기에 기재된 물리-화학적 데이타에 기초하여, 하기 구조식을 항생물질 GE 2270 인자 D, D, E 및 T에 부여할 수 있다.

본 발명의 화합물의 항균 활성은 시험관내에서 일련의 표준 시험에 의해서 입증될 수 있다.

최소 억제 농도(MIC)는 미량 브로쓰 희석 방법에 의해 측정되었다. 접종재료는 10⁴-10⁵CFU/ml이었다. 모든 미생물은 37℃에서 배양시켰다. MIC는 나이제리아 고노르호에아(Neissria gonorrhoeae), 바실러스 프라질리스(B. fragilis) 및 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes)에 대해서는 48시간에서 읽고, 그 이외는 18-24시간에서 읽었다. 나이제리아 고노르호에아는 5% CO₂대기중에서 배양했다. 혐기성균은 혐기성 가스 혼합물내에서 배양했다. 배지는 포도상구균, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 대장균, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대해서는 옥소이드 이소-민감성 시험 브로쓰를, 다른 스트렙토코커스(Streptococcus)에는 디프코 토드-휴이트(Difco Todd-Hewitt) 브로쓰를, 나이제리아 고노르호에아에는 1% BBL 이소비탈렉스(IsoVitalex)를 첨가한 디프코 GC 기본 브로쓰를, 프로피오니박테리움 아크네스와 바실러스 프라질리스에는 디프코 윌킨스-샬그렌(Wilkins-Chalgren) 브로쓰(10⁵CFU/ml)를 사용했다.

이상의 특성에서 볼 때, 본 발명의 화합물은 사람 또는 동물 치료용 약제 제조에 있어서 활성 성분으로서 사용될 수 있다.

구체적으로, 항생물질 GE 2270 인자 B, B, C, C, D, D, E 또는 T는 그람 음성 혐기성균 뿐만 아니라 그람 양성 세균과 그람 양성 혐기성균에 대해 주로 활성이 있는 항균제이다. 메틸실린, 아미노글리코시드 또는 글리코펩티드 항생물질과의 교차-내성이 없이 스타필로코커스균에 의한 심내막염에서도 역시 매우 활성이 있는 것으로 나타난다.

따라서, 본 발명의 항생물질의 치료학적인 주된 목적은 이 물질 감성인 미생물의 존재로 유발된 감염의 치료에 있다.

치료는 예방, 치료 및 회복을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 치료는 받는 환자는 영장류를 포함하여 이러한 치료를 필요로 하는 모든 동물, 구체적으로 사람과, 말, 소, 돼지, 양, 통상의 가금 및 애완 동물과 같은 기타 포유동물이다.

본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 제약상 허용되는 담체와의 혼합물로 투여될 수 있으며, 또한, 페니실린, 세팔로스포린, 아미노글리코시드 및 글리코펩티드와 같은 다른 항균제와 연계하여 투여될 수도 있다. 따라서, 연계 치료는 후속물질이 투여될 때 첫번 투여된 것의 치료학적 효과가 전적으로는 사라지지 않는 방식으로 활성 화합물을 연속적으로, 동시에 및 분리해서 투여하는 것을 포함한다.

바람직한 제약 제형은 무손상 피부 또는 손상된 피부 또는 점막 상에 국소 도포하는데 적합한 제형이다. 이러한 제형의 예로는 분말제, 연고제, 크림제 및 로션제가 있다. 이와 같은 제형에 있어서 부형제는 유성 연고 기계(예, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브유, 파라핀, 스페르마세티, 전분 글리세리트), 흡수성 연고 기제(예, 무수 라놀린, 친수성 와셀린), 유제 연고 기제(예, 세틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린, 스테아르산), 수용성 연고 기제(예, 글리콜 에테르류와 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(옥시-1,2-에탄디일)-알파-히드로-오메가-히드록시-옥타데카노에이트, 폴리소르베이트 및 모노스테아르산 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 그의 유도체)와 같은 통상의 제약상 허용하는 부형제이다.

상기 제형은 방부제와 같은 기타 공지된 부형제를 함유할 수 있고, 당업계에서 공지되고, 문헌[Remington's Pharmaceutical Siences, 제7판, 1985년, 맥(Mack) 출판사]와 같은 참고 문헌에 기재된 방법에 의해 제조된다.

본 발명의 화합물은 당업계에 본질적으로 공지된 방법과 상기 참고 문헌에 기재된 방법에 의하여 비경구적 투여에 적합한 제제화될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 화합물은 폴리프로필렌 글리콜 또는 디메틸아세트아미드와 같은 가용화제 및 모노-올레산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 또는 주사용 무균수중의 폴리에톡실화시킨 피마자유와 같은 계면 활성제와 함께 제제화된다.

전형적인 비경구 투여용 제형에는 최종 제제 1ml에 대해 항생물질 GE 2270 인자 B, B, C, C, D, D, E 또는 T 10mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 또는 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 피마자유 유도체와 같은 계면 활성제 10-20%, 및 프로필렌 글리콜, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 3급-부틸-N-히드록시카르바메이트, 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-부탄디올, 올레산 에틸, 테트라히드로푸르푸릴-폴리에틸렌-글리콜 200, 디메틸 이소소르비드, 벤질 알콜 등과 같은 가용화제 0-20%, 바람직하게는 10-20%가 함유된다. 더 바람직한 가용화제는 프로필렌 글리콜이다.

폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 시판되고 있고, 일부는 트윈(Tweel)이라는 상표명으로 판매되고 있다. 이들은 역시 폴리소르베이트라는 비전매의 이름으로도 공지되어 있다. 그들의 예로는 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 61, 65, 89, 81 및 85가 있다. 본 발명의 제형에서는 폴리소브레이트 80(소르비탄 모노-9-옥타데세노에이트, 폴리(옥시-1,2-에탄디일)유도체)를 사용하는 것이 바람직하다.

폴리옥시에틸렌 피마자유와 폴리옥시에틸렌 수소첨가된 피마자유도 역시 시판되고 있다. 이중 일부는 크레모포아(Cremophor)라는 상표명으로 판매되고 있다. 이러한 화합물의 예로는 크레모포아 EL(폴리에톡실화된 피마자유), 크레모포아 RH 40(폴리에톡실화되고 수소첨가된 피마자유), 크레모포아 RH 60(PEG 60 수소첨가된 피마자유) 또는 에멀포아(Emulphor) EL-719(폴리옥시에틸화된 식물유)로서 공지된 화합물이 있다.

바람직하게는, 주사용 제형은 7±0.5의 범위의 pH를 가져야 한다. 필요에 따라서, 적합한 완충제를 이용하여 제제의 pH를 조정할 수 있다. 편리하게는, 트리스(TRIS)(즉, 트리히드록시메틸아미노메탄) 또는 포스페이트를 완충제로서 사용할 수 있다.

비경구적 투여에 바람직한 제형은 하기 부형제를 함유한다:크레모포아

EL (폴리옥실 35 피마자유 USP/NF) 20% 및 프로필렌 글리콜 5-20%, 바람직하게는 10-20%. 통상적으로, 이러한 제형은 활성 성분을 유기 용매에 용해시킨 후, 계면 활성 성분을 첨가하고, 마지막으로 주사용 무균수로 목적하는 부피까지 희석시킴으로써 제조할 수 있다.

기타 부형제로서, 방부제 또는 안정화제를 당업계 공지된 바와 같이 첨가할 수 있다.

비경구적 제조물의 조성의 예를 다음에 기재하였다:

상기 제조물에서, 항생물질 GE 2270 인자 T 10mg 대신에 항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₂, D₁, D₂또는 E 10mg을 사용할 수 있다.

별법으로, 활성 성분을 사용전에 재구성용 동결건조된 분말로 제조할 수도 있다.

동결건조된 물질이 활성 성분과 폴리에틸렌 글리콜 60으로 수소첨가시킨 피마자유와 같은 계면 활성제를 함유하는 혼합물을 출발 물질로 하여 제조되는 경우, 유기 용매의 첨가없이 수성 매질만으로 간편하게 재구성시킬 수 있다.

필요에 따라서, 분말 형태의 동결건조된 물질을 얻기 위하여 통상의 동결 건조물을 첨가시킬 수 있다.

바람직하게는, 이러한 모든 제형은 본 발명의 항생물질에 감성인 미생물과 관련된 임의의 감염 치료에서 정맥 내 투여용으로 사용할 수 있다.

위막 대장염 또는 위장관내의 혐기성균의 존재로 인한 다른 질병의 치료에서, 본 발명의 화합물의 효과적인 투여 용량은 캡슐제, 정제 또는 수성 현탁액과 같은 적절한 제약 형태로 경구적으로 투여될 수 있다.

활성 성분의 투여량은 투약 환자의 유형, 나이 및 상태, 투여에 선택된 특정 활성 성분과 제형, 투여 일정 등을 포함한 여러 요인에 따라 좌우된다.

통상적으로, 단일 단위 투여 제형 당 유효 항균 투여량을 사용한다.

반복되는 도포/투여(예, 2 내지 6회/일)가 통상적으로 더 바람직하다. 유효 투여량은 통상적으로 0.5-50mg/kg(체중)/일의 범위내에 있다.

더 바람직한 국소용 제제는 본 발명의 화합물을 1% 내지 10% 함유하는 연고이다.

어쨌든, 처방하는 의사는 주어진 상황에서 주어진 환제에 대한 최적 투여 용량을 결정할 수 있을 것이다.

인간 및 가축 치료에 있어서의 의약품으로서의 용도 이외에, 본 발명의 화합물은 동물 성장 촉진제로서도 사용될 수도 있다.

이러한 목적을 위해, 본 발명의 화합물은 적합한 사료에 첨가하여 경구 투여할 수 있다. 정상량의 사료가 소비될 경우, 성장 촉진 유효량의 활성제를 제공하는데 필요한 정확한 농도가 사용된다.

본 발명의 활성 화합물의 동물 사료에의 첨가는 활성 화합물 유효량을 함하는한 적절한 사료 프리믹스를 제조한 후, 이 프리믹스를 완전한 정량에 혼입시킴으로써 바람직하게 이루어진다.

별법으로, 활성 성분을 함유하는 중간 농축물 또는 사료 첨가물을 사료에 혼합시킬 수 있다. 이와 같은 사료 프리믹스 및 완전한 정량을 제조하고 투여하는 방식은 인용 문헌에 기재되어 있다[(E. W. Crampton 등, Applied Animal Nutrition, W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969) 또는 (D. C. Church, Livestock Feeds and Feeding, O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) 참조].

다음의 실시예는 본 발명을 더 설명하며, 어떤 의미로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

[실시예 1]

[항생물질 GE 2270의 생성]

플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 배양물을 오트밀 아가 슬랜트(slant)상에서 28-30℃로 2주 성장시킨 후, 하기 조성물로 된 종자 배지(seed medium) 100ml를 함유하는 500ml 플라스크에 접종시켰다.

이 플라스크를 회전 진탕기(200rpm) 상에서 28-30℃로 92시간 인큐베이션시켰다. 얻어진 배양물을 사용하여 동일한 배지 4ℓ를 함유하는 발효 자아(jar fermenter)에 접종시키고, 배양물을 교반(약 900rpm) 및 통기(공기 약 1표준 리터/부피/분)시키면서 28-30℃에서 48시간 인큐베이션시켰다.

얻어진 브로쓰를 다음의 생성 배지 50ℓ를 함유하는 발효기로 옮기고 28-30℃에서 약 72시간 인큐베이션하였다.

항생물질 생성은 최소 데이비스 배지(minimum Davis medium)에서 자란 고초균(B. subtilis) ATCC 6633을 사용한 종이 디스크 아가 분석에 의해 모니터링하였다. 억제 규역은 35℃에서 하룻밤 인큐베이션 후 측정하였다.

[실시예 2]

a) 조 항생물질 GE 2270의 회수

상기에서 얻어진 발효 매스 50ℓ를 수확하고, 필터 보조기(Clarcell사 제품)상에서 여과시켰다.

균체를 메탄올 20ℓ로 2회 추출하여 수집한 추출물을 감압 농축시켜 수성 잔류물을 얻고, 이것을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 농축 유기상에 석유 에테르를 첨가하여 조 항생물질 GE 2270 6.06g을 침전시켰다.

b) 항생물질 GE 2270 인자의 조 혼합물 단리

상기 방법에 따라 균체로부터 얻은 조 생성물 3g을 테트라히드로푸란 중에 용해시키고, 실리카겔(230-400메쉬)의 존재하에서 감압 농축시켰다. 얻어진 고상 잔류물을 수집하여, 염화메틸렌(CH₂Cl₂)에서 제조한 실리카겔(230-400메쉬) 300g을 함유하는 크로마토그라피 컬럼에 적용시켰다. 컬럼을 먼저 염화메틸렌 2ℓ로 전개시킨 후, 이어서 염화메틸렌과 메탄올의 혼합물 1.5ℓ를 다음의 혼합비로 연속적으로 전개시켰다:98/2, 96/4, 92/8, 90/10 및 88/12(v/v).

분류물을 합하고, TLC, HPLC 또는 고초균에 대한 미생물학적 방법에 의해 분석하고 이들의 항생물질 함량에 따라 모았다.

항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₁, C₂, D₁, D₂및 E가 풍부하게 존재하고, 또한 특정량의 항생물질 GE 2270 인자 A를 함유하는 수집 분류물을 감압 농축시켜 유상 잔류물을 얻고, 이로부터 석유 에테르를 사용하여 상기한 항생물질 인자들의 혼합물 1.15g을 석출하였다.

c) 항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂및 E의 분리 및 단리

상 A: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(40:40:20)과 상 B: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(10:10:80)의 혼합물을 사용하고, 뉴클레오실(Nucleosil

) C18(옥타데실실란기로 관능화된 실리카겔)(5㎛)이 충전된 250×20mm 컬럼을 사용하여, 정제용 HPLC에 의해 용출시켜서 전 단계에서 얻어진 조 혼합물로부터 항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂및 E를 분리·정제하였다. 이 항생물질 혼합물 6mg을 상 B 3ml 및 상 A 1ml중에 용해하여 HPLC컬럼에 주입한 후, 상 A와 상 B의 26:74의 혼합물로 유속 14ml/분에서 용출시켰다. 용출된 분류물을 254nm에서 UV 흡착 프로필에 따라 수거하였다. 균일한 함량을 갖는 연속 크로마토그래피 작동의 분류물을 모으고, 감압 농축시켜서 CH₃CN을 제거하였다. 잔류액은 종이 디스크 분석법에 의해서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Tour L165에 대한 항균 작용을 나타내었다. 이들 용액을 3회 이상 동결 건조하여, HPLC 상으로부터 HCOONH₄완충 잔류물이 완전히 제거되었다.

수득량은 다음과 같다:항생물질 GE 2270 인자 E 11mg, 항생물질 GE 2270 인자 D₁12mg, 항생물질 GE 2270 인자 D₂10mg, 항생물질 GE 2270 인자 C₁2mg, 항생물질 GE 2270 인자 C₂3mg, 항생물질 GE 2270 인자 B₁2mg, 항생물질 GE 2270 인자 B₂2mg.

[실시예 3]

[항생물질 GE 2270 인자 T의 생성]

a) 균주 발효

오트밀 아가 슬랜트 상에서 성장시킨 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 배양물을 종자 배지(전분 2%, 폴레펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.3%, 쇠고기 추출물 0.2%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%, 멸균준에 pH 7.0으로 조정함) 100ml를 함유하는 500ml의 에를렌마이어 플라스크 2개에 접종시켰다. 종자 배지의 500ml 에를렌마이어 플라스크 3개를 회전 진탕기(200rpm) 상에서 28℃로 96시간 인큐베이션시킨 배양물로 접종시켰다(5% 접종물).

이 배양물을 회전 진탕기(200rpm) 상에서 28℃로 72시간 인큐베이션한 후, 종자 배지 6ℓ를 함유하는 10ℓ의 항아리형 발효기에 접종시켰다. 28℃에서 공기 유량 1ℓ/V/분 및 교반 속도 900rpm으로 72시간 인큐베이션시킨 후, 배양물을 생산 배지(전분 2%, 펩톤 0.25%, 가수분해된 카제인 0.25%, 효모 추출물 0.3%, 쇠고기 추출물 0.2%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%, 멸균전에 pH 7.0으로 조정함) 200ℓ를 함유하는 발효 자아에 접종시켰다.

[항생물질 GE 2270 인자 T의 단리]

126시간 발효 후, 브로쓰를 수확하고, 하이플로(Hyflo) 필터 보조기로 여과하여 균체를 수집하였다. 이 균체 케이크를 아세톤 60 및 20ℓ로 차례로 추출하여 모은 추출물을 감압 농축시켰다. 조 항생물질 복합체를 액-고상 분리기에서 원심 분리에 의해 물 잔류물로부터 분리하였다. 이 습윤 물질을 2-프로판올에 용해하고, 얻어진 용액을 감압 농축하여 물을 제거하였다. 조 항생물질 복합체 50g을 농축된 잔류물로부터 석출하였다. 이 조 복합체는 항생물질 GE 2270 인자 T와 함께 항생물질 GE 2270 인자 A를 다량으로 함유하고, 기타 상기 인자들은 소량으로 함유하였다.

상기 조 복합체의 기타 성분들에서 인자 T의 분리를 위해, 6회 반복 발효한 제조물을 모아서 CH₂Cl₂:메탄올(93:7) 12ℓ중에 용해하였다. 불용물을 여과하여 제거하고, 항생 복합체를 함유하는 용액을 용출제로서 CH₂Cl₂:메탄올(93:7)을 사용하여 13kg의 (230-400 메쉬) 실리카겔 컬럼에 도포하였다. 항생물질 GE 2270 인자 T는 CH₂Cl₂:메탄올(93:7)로 용출시키므로써 컬럼에서 용출되었다. 항생물질 GE 2270 인자 T를 함유하는 분류물(HPLC 분석)을 모으고, 감압 농축한 후, 건조하여 미량의 불순물과 함께 항생물질 GE 2270 인자 T 8g을 얻었다.

이 조 물질 15mg을 디메틸포름아미드:CH₂CN:물(50:25:25) 0.2ml에 용해하여, 7㎛ 크기의 리크로소르브(Lichrosorb

)C18(옥타데실 실란화 실리카겔)이 충전된 250×10mm 하이바르(Hibar) 컬럼(E. Merck사 제품, 서독 담스타트 소재)을 가진 HPLC 시스템에 주입하고, CH₂CN:H₂O(60:40)으로 유속 4.5ml/분에서 용출시킨 후, 이들 항생물질 GE 2270 인자 T(254nm에서 U.V. 검색)를 함유하는 분류물을 수집하였다.

15회의 연속 크로마토그래피 작동으로부터 생성된 이와 같은 유형의 분류물을 모으고, 감압 농축한 후, 건조하여 정제된 항생물질 GE 2270 인자 T 150mg을 얻었다.

[분석용 HPLC 표준 화합물의 제조]

a) 항생물질 GE 2270의 생성

플라노비스포라 로제아 ATCC 53773의 배양물을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 성장시켰다.

b) 항생물질 GE 2270의 회수

전 단계(a)에서 얻어진 발효매스 50ℓ를 수확하고, 필터 보조기(Clarcell사 제품)의 존재하에서 여과시켰다.

항생물질 GE 2270은 그의 특정량이 여액으로부터 회수될 수 있으나, 주로 균체에서 발견되었다.

a) 여액을 pH 약 7.0으로 조정하고, 에틸 아세테이트 50ℓ로 추출하였다. 유기상을 원심분리에 의해 분리하고, 감압하에 소량으로 농축시켰다. 이어서, 얻어진 유상 잔류물을 석유 에테르로 처리하여 조 항생물질 GE 2270을 침전시키고, 여과하여 수집한 후, 건조한 바, 항생물질 GE 2270 복합체 415mg이 얻어졌다.

b) 균체를 메탄올 20ℓ로 2회 추출하고, 합한 추출물을 감압 농축시켜 수성 잔류물을 얻고, 이것을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 농축 유기상으로부터 석유 에테르의 첨가에 의해 조 항생물질 GE 2270 6.06g을 침전시켰다.

c) 항생물질 GE 2270 인자 A의 정제

상기 방법에 따라 균체에서 얻어진 조 생성물 3g을 테트라히드로푸란 중에 용해하고, 실리카겔(230-400메쉬)의 존재하에서 감압 농축시켰다. 얻어진 고상 잔류물을 수집하여 염화메틸렌(CH₂Cl₂)에서 제조한 실리카겔(230-400메쉬) 300g을 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 적용시켰다. 컬럼을 염화메틸렌 2ℓ로 먼저 전개하고, 이어서 염화 메틸렌과 메탄올의 혼합물 1.5ℓ를 다음의 혼합비로 연속적으로 전개시켰다:98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10 및 88/12(v/v).

분류물을 합하고, TLC, HPLC 또는 고초균에 대한 미생물학적 방법에 의해 분석하고 이들을 항생제 함량에 따라 모았다.

순수 항생물질 GE 2270 인자 A를 함유하는 수집 분류물(HPLC 체류 시간 14.9분, 하기 물리화학적 데이타의 포인트 E 참조)을 감압 농축시켜 유상 잔류물을 얻고, 이를 테트라히드로푸란으로 용해시켰다. 이 용액으로부터, 석유 에테르 첨가에 의해 항생물질 GE 2270 인자 A 600mg을 석출하였다.

항생물질 GE 2270 인자 A의 또다른 수확물을 상기한 크로마토그래피 시스템에 의해 분리한 다른 분류물로부터 얻었으나, 항생물질을 불순한 형태로 함유하였다(HPLC). 이들 분류물 역시 수집, 농축, 처리한 바 상기한 바와 같은 고상물이 얻어졌다. 이 항생물질 GE 2270 인자 A의 조 제조물은 다음의 방법에 의해 HPLC로 정제하였다.

이 침전물의 일부(6mg)를 아세토니트릴:물 1:1(v/v)중에 용해하여, 실란화 실리카겔 컬럼(리크로소르브 RP 18, 7μM, 250×10mm, Merck사 제품, Darmstadt 소재)을 장치한 HPLC 크로마토그래피 시스템에 주입하였다.

용출은 50% 내지 85%의 용액 B중에 용액 A의 혼합물의 선형 구배로 20분 동안 4ml/분의 유속으로 행하였다. 용액 A는 pH 6으로 조정한 아세토니트릴 및 18mM 인산나트륨 완충액 70/30(v/v) 혼합물인 반면, 용액 B는 pH 6으로 조정한 아세토니트릴 및 18mM 인산염 완충액 10/90(v/v)의 혼합물이었다.

컬럼은 퍼킨 엘머 LC85 UV 검출기에 330nm에서 접속시켰다. 균질한 함량을 갖는 11개의 연속적인 크로마토그래피 이동 분류물을 모으고, 감압 농축시켜 아세토니트릴을 제거함으로서 항생물질 GE 2270 인자 A를 함유하는 분리된 잔류액을 얻었다. 이들 용액을 동량의 에틸 아세테이트로 2회 세척하고, 석유 에테르를 가하여 농축 유기상으로부터 침전시킴으로써 항생 생성물이 얻어졌다. 여과 및 건조에 의해 회수한 바, 항생물질 GE 2270 인자 A 27mg이 얻어졌다.

[항생물질 GE 2270 인자 A의 물리화학적 성상:]

A) 자외선 흡수 스펙트럼은 다음의 흡수 최대치를 나타냈다.

B) 뉴졸 멀 중에서의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음의 흡수 최대치(cm^-1)를 나타냈다:

3700-3060; 3060-2660(뉴졸); 1650; 1590-1490; 1490-1420(뉴졸); 1375(뉴졸); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720(뉴졸); 700

이 스펙트럼의 주요 관능기의 I. R. 흡수 밴드는 다음과 같다.

C) 내부 표준 물질로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여 DMSO-d(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500MHz로 측정된H-NMR 스펙트럼은 다음의 신호군(ppm)을 나타냈으며, 각 신호에 대한 양자수는 괄호에 나타냈다.

9.02(1); 8.68(1); 8.70(1); 8.57(1); 8.50(1); 8.43(1); 8.37(1); 8.26(1); 8.25(1); 7.4-7.20(9); 6.96(2); 6.02(1); 5.30-5.18(3); 5.01(1); 4.97(2); 4.80(1); 4.56(1); 4.30(1); 4.26(1); 3.98(1); 3.81(1); 3.79(1); 3.38(3); 2.72(1); 2.58(3); 2.48(3); 2.16(1); 2.13(1); 1.96(2); 1.88(1); 1.34(1); 0.87(3); 0.84(3)

(D) 내부 표준으로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여 DMSO-d중에서 125MHz로 측정된C-NMR 스펙트럼은 다음의 신호군(ppm)을 나타냈으며, Q는 4급 탄소 원자 또는 C=O기를 의미한다:

173.69, Q; 171.10, Q; 169.83, Q; 169.51, Q; 168.45, Q; 168.26, Q; 167.84, Q; 165.68, Q; 164.75, Q; 161.40, Q; 161.23, Q; 160.46, 1Q; 160.29, Q; 159.35, Q; 153.42, Q; 150.31, Q; 150.11, Q; 149.41, Q; 146.93, Q; 144.73, Q; 143.75, Q; 142.10, Q; 141.78, Q; 141.33, CH; 140.97, Q; 139.53, Q; 128.68, CH; 127.99, 2[CH]; 127.67, Q; 127.67, CH; 126.88, CH; 126.76, 2[CH]; 123.17, CH; 118.66, CH; 116.42, CH; 73.81, CH; 69.41, CH; 67.97, CH; 67.36, CH; 60.12, CH; 58.63, CH; 58.24, CH; 55.41, CH; 48.15, CH; 47.03, CH; 41.19, CH; 37.60, CH; 34.06, CH; 29.76, CH; 25.85, CH; 24.28, CH; 18.49, CH; 17.98, CH; 11.99, CH

E) 다음의 조건하에서 역상 HPLC로 분석했을 경우 체류 시간(Rt)는 14.9분이었다.

컬럼:초구경 ODS(Ultrasphere ODS)(역상 실란화 실리카겔:5마이크로미터), Altex(Beckman사 제품), 4.6mm(i.d.)×250mm

예비 컬럼(pre-columm):브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔:5마이크로미터)

용출제 A:아세토니트릴:18mM 인산나트륨 70:30(v/v), pH 7.0으로 조정함.

용출제 B:아세토니트릴:18mM 인산나트륨 10:90(v/v), pH 7.0으로 조정함.

용출 방법:20분 내에 용출제 B 중 용출제 A의 45% 내지 70%의 선형 구배로 용출시킴.

유속:1.8ml/분

U.V. 검출기:254nm

내부 표준:클로람페니콜(Rt=3.7분)

본 발명의 화합물의 특성에 관하여 상기 D)에 기재한 조건에서 체류 시간을 측정했을 때, 체류 시간은 16.6분이었다.

F) 불활성 분위기 하에 약 140℃에서 미리 건조시킨 샘플을 원소 분석한 결과 탄소, 수소, 질소, 황으로 구성되어 있음을 나타냈다.

G) 다음의 크로마토그래피 시스템[디클로로메탄:메탄올 9:1(v/v), 실리카겔 플레이트(실리카겔 60F, Me가 Co.사 제품)를 사용]; 가시화 장치[254nm에서 U.V 광, 데이비스 최소 배지 상에서 고초균 ATCC 6633을 사용하는 바이오오토그라피(Bioautography) 또는 요오드 증기를 갖는 황색 반점]; 및 내부 표준[클로람페니콜(Rf 0.56)]을 사용한 경우, Rf값은 0.37이었다.

H) FAB-MS 분석은 m/z 1290, 3±0.1 달톤에서 양성화된 분자 이온의 최저 질량 동위 원소를 나타낸다. 스펙트럼 중의 800m/z 질량 단위(동위 원소 피크를 카운팅하지 않음) 이상의 모든 기타 피크는 다음의 실험 조건[6Kv에서의 Xe 빠른 원자 충격:글리세롤 매트릭스; 양성 이온화 방식]하에서 크래토스(Kratos) MS-50이중 촛점 질량 분광계로 분석시 분자 이온의 20% 이하였다.

I) 염산 가수분해물의 아미노산 분석은 다음의 천연 아미노산 즉, 글리신, (L) 프롤린 및 (L)세린을 나타내며, 다음의 실험 조건하에서 행하였다.

시료는 1% 페놀을 함유하는 6N HCl의 존재하에 105℃에서 20시간 가수분해시켰으며, 이어서 다음의 두 단계로 유도하였다.

a) 무수 프로나폴(90℃, 1h)중에서 2M HCl로 카르복실산 관능기의 n-프로필 에스테르를 형성한 후, 질소하에서 건조시킴.

b) 유리 아미노기를 펜타플루오로프로피온 무수물/무수 디클로로메탄, 1/9(v/v)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 아미드로 전환시킨 후, 질소하에 건조시킴. 이렇게 하여 얻은 유도체 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해하고, 다음 조건하에서 HP5985B계를 사용하여 GC-MS로 분석하였다.

컬럼:키랄성 n-프로피오닐-L-발린 t-부틸아미드 폴리실록산으로 도포시킨 융합 실리카 모세관 컬럼(25mm×0.2mm i.d.; C.G.C. ANALYTIC), 온도 계획, 80℃에서 4분이어서 4℃/분.

L) 이온화 연구는 메틸셀로솔브/물 중의 0.1N HCl과 0.1N NaOH로 적정한 결과 이온성 관능기를 전혀 나타내지 않았으며, 약 염기성 관능기는 비수성 매질(아세트산)중의 0.1N HClO로 적정함으로서 나타냈다.

M) 비선광도[α]=+140.8[순수 에탄올 중 약 5g/ℓ 농도로 측정함].

Claims

하기 특성을 갖는 항생물질 GE 2270 인자 B₁, 항생물질 GE 2270 인자 B₂, 항생물질 GE 2270 인자 C₁, 항생물질 GE 2270 인자 C₂, 항생물질 GE 2270 인자 D₁, 항생물질 GE 2270 인자 D₂, 항생물질 GE 2270 인자 E 및 항생물질 GE 2270 인자 T중에서 선택된 화합물.

A) 다음의 흡수 최대치를 나타내는 자외선 흡수 스펙트럼:

B) 뉴졸 멀(Nujol mull)중에서 흡수 최대치 υ(cm^-1)를 나타내는 적외선 흡수 스펙트럼(항생물질 GE 2270 D₁, D₂, E 및 T):

[인자 D₁:]

3700-3100; 3020-2750(뉴졸); 1645; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1305; 1260-1100; 1100-870; 840; 800; 760; 720(뉴졸); 700

[인자 D₂:]

3700-3100; 3020-2750(뉴졸); 1645; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1305; 1260-1100; 1100-870; 840; 800; 760; 720(뉴졸); 700

[인자 E:]

3700-3100; 3020-2750(뉴졸); 1645; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1305; 1260; 1250-1070; 1015; 985-900; 840; 800; 760; 720(뉴졸); 700

[인자 T:]

3700-3120; 3100; 3020-2720(뉴졸); 1655; 1570-1490; 1460 및 1375(뉴졸); 1410; 1300; 1240; 1200-1000; 980; 930; 890; 840; 805; 765; 745; 720(뉴졸); 700

C) 내부 표준 물질로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여 DMSO-d₆(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 다음 신호군을 나타내는¹H-NMR 스펙트럼(항생물질 GE 2270 인자 D₁, D₂, E 및 T)[δ, ppm, m](s=단일선, br, s=넓은 단일선, d=이중선, dd=이중선쌍, t=삼중선, m=다중선, py=피리딘, Tz=티아졸).

[인자 D₁(5000MHZ에서 측정됨):]

8.88, d, (NH); 8.70, d, (2NH); 8.57, s, 8.50, s, 8.25, s, 8.21, s 및 7.35, s,(5개 티아졸의 CH); 8.40, m, (글리신의 NH); 8.28-8.21, m, (피리딘의 CH); 7.32-7.20, m, (방향족 화합물의 CH 및 1급 아미드의 NH); 7.00, s, 6.64, s, 6.53, s, (1급 아미드의 NH); 5.95, d, (OH); 5.29-5.15, m, (αCH); 5.04, m, (페닐세린의 βCH); 4.81, m 및 4.56, m, (옥사졸린의 CH₂); 4.30-3.80, m, (글리신의 CH₂및 프롤린아미드의 CH); 2.72, m, 및 1.43, m, (아스파라긴의 CH₂); 2.60, s, (CH₃); 2.21-1.91, (m), (이소프로필의 CH 및 프롤린아미드의 CH); 0.90(d) 및 0.86(d), (발린의 CH₃)

[인자 D₂(5000MHZ에서 측정됨):]

9.00, d, (NH); 8.69, br s(2NH); 8.59, s, 8.53, s, 8.29, s 및 7.35, s, (티아졸의 CH); 8.38, m, (글리신의 NH); 8.40 및 8.26(m), (피리딘의 CH); 7.37-.718, m, (방향족 화합물의 CH 1급 아미드의 NH); 6.97, s, (1급 아미드의 NH); 6.03, d 및 t, (20H); 5.28-5.16, m, (αCH); 5.03, m, (βCH); 4.97, m, [CH₂(OH)]; 4.79 및 4.55, m, (옥사졸린의 CH₂); 3.97-3.76, m, (글리신의 CH₂및 프롤린아미드의 CH); 2.71, m 및 1.28, m, (N-메틸아스파라긴의 CH₂); 2.18-1.89, m, (이소프로필의 CH 및 프롤린아미드의 CH₂); 0.88, d 및 0.84, d, (발린의 CH₃)

[인자 E(500MH₂에서 측정됨)]

8.95, d, (NH); 8.73, d, (NH); 8.60, s, (티아졸의 CH); 8.57, d, (NH); 8.53, s, (티아졸의 CH); 8.42, m, (피리딘의 CH); 8.31, m, (NH); 8.28, m, (피리딘의 CH); 8.24, s, (티아졸의 CH); 7.33, s, (티아졸의 CH); 7.31-7.20, m, (방향족 화합물의 CH, 1급 아미드의 NH); 6.98, s, 6.91, s, 6.62, s, (1급 아미드의 NH); 6.04, d, (OH); 5.95, t, (OH); 5.28-5.14, m, (αCH). 5.03, m, (βCH); 4.99, m, [CH₂(OH)]; 4.81, dd 및 4.57, dd, (옥사졸린의 CH₂); 4.26(m) 및 3.79(m), (글리신의 CH₂); 4.25, m, 3.98, m, 3.82, m, (프롤린아미드의 CH); 2.77, m, 및 1.25, m, (아스파라긴의 CH₂); 2.60, s, (CH₃); 2.20, m, 및 1.89, m, (발린의 βCH 및 프롤린아미드의 CH₂); 0.90, d, 0.84, d, (발린의 CH₃)

[인자 T(250MHZ에서 측정됨):]

8.95, d, (NH); 8.70, d, (2NH); 8.66, s, 8.65, s, 8.60, s, 8.30, s, 및 7.38, s, (4개의 티아졸 및 1개 옥사졸의 CH); 7.35-.724, m, (방향족의 CH 및 1급 아미드의 NH); 6.68(1급 아미드의 NH); 5.96, d, (OH); 5.34-5.18, m, (αCH); 5.05, m, (βCH); 5.03, s, [CH₂(OCH₃)]; 4.32, m 및 3.82, m, (글리신의 CH₂); 4.48, m, 4.04, m 및 3.63, m, (프롤린아미드의 CH); 3.40, s, (OCH₃); 2.73, m 및 1.41, m, (N-메틸아스파라긴의 CH₂); 2.60, s, (CH₃); 2.49, d, (N-메틸아스파라긴의 CH₃); 2.27-1.88, m, (이소프로필의 CH 및 프롤린 아미드의 CH₂); 0.89, d, (발린의 CH₃)

D) 다음 역상 HPLC 시스템에서의 체류 시간(Rt)(항생물질 GE 2270 인자 B₁, B₂, C₁, C₂, D₁, D₂, E 및 T) 및 그 데이타.

컬럼:베이커본드(Bakerbond
) C8 (5㎛) 4.6×250mm(베이커본드는 미합중국 08865 뉴저지주 필리스버그 소재의 J. T. Baker Research Product사 제품인 역상 옥틸실릴 실리카겔 HPLC 컬럼의 상표명임)

유속:1.8ml/분

상 A: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(40:40:20)

상 B: CH₃CN:테트라히드로푸란:40mM HCOONH₄(10:10:80)

용출:20분 내에 상 A의 20% 내지 30%의 선형 구배

측정:UV 254nm

E) FAB-MS 주요 피크[6KV 전압과 1mA 전류에서, 8KV 가속 전압 및 Xe 가스를 이용한 새들 영역 원자총(소스 이온 게이지상으로 2×10^-5torr 압력)을 사용하여 2중 촛점형 크레이토스(Kratos) MS-50 질량 스펙트로메터 상에서 얻음, 시료는 0.1M 아세트산 함유 티오글리세롤 매트릭스와 혼합시킴] 데이타.
플라노비스포라 로제아(Planobispora rosea) ATCC 53773 또는 그의 GE 2270 생성 변이주 또는 돌연변이주의 침지 호기성 조건하의 발효물로부터 얻은 항생물질 혼합물을 크로마토그라피로 분리시키는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 항생물질 GE 2270 인자 B₁, 항생물질 GE 2270 인자 B₂, 항생물질 GE 2270 인자 C₁, 항생물질 GE 2270 인자 C₂, 항생물질 GE 2270 인자 D₁, 항생물질 GE 2270 인자 D₂, 항생물질 GE 2270 인자 E 및 항생물질 GE 2270 인자 T중에서 선택된 화합물의 제조 방법.
제2항에 있어서, 분리가 역상 크로마토그라피에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 분리가 HPLC 역상 크로마토그라피에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 역상 크로마토그라피의 정지상이 C₈-C₂₂알킬 관능기 또는 시클로헥실 또는 페닐 관능기를 함유하는 관능화된 실리카겔인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 있어서, 분리 단계를 수행할 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773 또는 그의 GE 2270 생성 변이주 또는 돌연변이주의 발효물로부터 얻은 항생물질 혼합물이 수혼화성 용매를 사용하여 균체로부터 추출된 후, 임의로 수불혼화성 유기 용매 추출에 의한 농축된 수성 추출물로부터 회수되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 기재된 화합물을 제약상 허용되는 담체와 혼합시킨 항균 조성물.