KR20150072458A - 상처 치유를 위한 개선 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20150072458A
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wound healing
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콜린 알. 그린
브래드포드 제이. 듀프트
데이비드 엘. 벡커
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코다 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 상처 치유 및/또는 조직 복구를 증진 및/또는 개선시키는 데에 유용한 하나 이상의 기타 작용제의 병용물을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

상처 치유를 위한 개선 방법 및 조성물 {Improved methods and compositions for wound healing}
관련 출원
본 출원은 2006년 11월 15일자로 출원된 미국 가특허원 제60/859,437호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)의 이권을 청구하고 있다.
본 분야는 상처 치유 및 조직 복구, 및 커넥신 (connexin), 커넥신 헤미채널 (hemichannel) 및 갭 연접부, 예를 들어 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 수반하는 조성물, 이러한 조성물을 함유하는 제품 및 키트 및 전달 장치, 및 상기 조성물을 포함하는 제형 뿐만 아니라 전적으로 또는 부분적으로 급성, 지연 또는 불완전한 상처 치유를 특징으로 하거나 개선된 조직 복구 또는 치유로부터 이득이 되는 질병, 장애 또는 질환, 및 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다음은 본 발명을 이해하는 데에 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 모든 정보가 본원에 기재되거나 청구된 발명에 대한 선행 기술이거나 이와 관련되는 것으로 허용되지 않거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 인용되는 모든 공보 또는 문헌이 선행 기술이라는 사실도 허용되지 않는다.
인간 및 기타 포유류에서는 상처 손상이 세포성 및 생화학적 사건의 조직적 복합 케스케이드를 촉발시켜 대부분의 경우에 상처가 치유될 것이다. 이상적인 상처 치유는 세포성, 조직, 기관 및 유기체 수준에서 정상적인 해부학적 구조, 기능 및 외관으로 복원시키는 것이다. 상처가 외상 (trauma), 미생물 또는 외래 물질에 의해 개시되는지의 여부에 상관없이 상처 치유는 염증, 상피화, 혈관형성 (angiogenesis) 및 매트릭스 침착을 포함한 수 많은 중복기를 포괄하는 복잡한 과정을 통하여 진행된다. 정상적으로는, 이들 과정으로 인해 상처가 곪게 되고 특정 정도의 반흔이 형성된다. 염증과 복구가 대개는 예정된 추세에 따라서 일어나긴 하지만, 해당 과정의 민감도는 조절성 사이토킨과 성장 인자의 네트워크를 포함한 각종 상처 치유 분자의 밸런스에 좌우된다.
갭 연접부는 직접적인 세포-세포 소통을 촉진시키는 세포막 구조물이다. 갭 연접부 채널은 각각 6개의 커넥신 소단위체로 구성된 2개의 커넥손 (connexon) (헤미채널)로 형성된다. 각 육량체성 커넥손은 반대 막 내의 커넥손과 도킹하여 단일 갭 연접부를 형성한다. 갭 연접부 채널은 신체 전반에 걸쳐 발견되는 것으로 보고된다. 각막 상피와 같은 조직은, 예를 들어 6개 내지 8개 세포 층을 갖고 있지만, 상이한 층에 상이한 갭 연접부 채널을 발현하는데, 기저 층에 커넥신 43과 기저에서부터 중앙 익면 (wing) 세포층까지 커넥신 26을 수반한다. 일반적으로, 커넥신은 그의 분자량에 따라서 통상적으로 명명되거나 또는 계통발생학적 기준에 따라서 알파, 베타 및 감마 아부류로 분류되는 단백질 계열이다. 적어도 20개의 인간 이소형과 19개의 뮤린 이소형이 확인되었다. 상이한 조직과 세포 유형이 특징적 패턴의 커넥신 단백질 발현을 나타내는 것으로 보고되고, 조직은 손상 또는 이식 후의 커넥신 단백질 발현 패턴을 변경시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Qui, C. et al., (2003) Current Biology, 13:1967-1703; Brander et al, (2004), J. Invest Dermatol. 122:1310-20].
바이러스성, 진균성 및 대사 질환에 밀접한 영향을 미치는 유전자에 대한 발현을 조정하기 위한 안티센스 기술이 제안되었다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,166,195호 (HIV의 올리고뉴클레오티드 억제제) 및 미국 특허 제5,004,810호 (단순 포진 바이러스 Vmw65 mRNA와 혼성화하고 복제를 억제하기 위한 올리고머); 및 또한, 미국 특허 제7,098,190호 (Becker and Green) ("커넥신에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 제형")]. 갭 연접부와 헤미채널의 펩티드 억제제가 또한 보고되었다 [참고: 예를 들어, Berthoud, V.M. et al., Am J. Physiol . Lung Cell Mol. Physiol. 279: L619 - L622 (2000); Evans, W.H. and Boitano, S. Biochem . Soc. Trans. 29: 606 - 612, and De Vriese A.S., et al. Kidney Int. 61: 177 - 185 (2001); Becker and Green PCT/US06/04131 ("항-커넥신 화합물 및 그의 용도")].
각종 사이토킨 및 성장 인자를 대상으로 하여, 상처 치유에 있어서의 치료적 간섭으로서의 그의 잠재력을 연구 조사하였다. 그러나, 레그라넥스 (Regranex®) 중의 활성 성분인 혈소판 유래 성장 인자를 제외하고는 어느 것도 미국에서 판매용으로 승인되지 못하였다. 그리고, 상처 치유 과정의 기초가 되는 원리를 이해하는 데에 있어서의 진보에도 불구하고, 상처 보호를 위한 적합한 치료 선택권과 지연되거나 기능저하된 상처 치유, 예를 들어 만성적 상처 치유를 포함한 상처 치유의 개선 및/또는 증진에 대해 상당히 채워지지 않은 욕구가 존재하고 있을 뿐만 아니라 급성 및 아급성 상처를 포함한 상처와 연관된 종창, 염증 및 반흔 형성을 치료하고자 하는 욕구가 여전히 존재하고 있다.
요약
본원에 기재되고 청구된 발명은 본 요약에 제시되거나 기재되거나 참고된 양태와 특징을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 많은 양태와 특징을 갖고 있다. 모두 포괄적인 것은 아니고, 본원에 기재되고 청구된 발명은 본 요약에서 확인된 양태 또는 특징으로 제한되지 않으며, 이는 단지 예시 목적으로 제한하려는 것이 아니다.
본 발명은 일반적으로, 급성, 아급성, 지연 치유 및 만성적 상처를 포함한 상처를 치료하기 위한, 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용한 하나 이상의 항커넥신제 (예를 들어, 커넥신 억제제, 예를 들면 알파-1 커넥신 올리고데옥시뉴클레오티드 및 알파-1 항커넥신 펩티드 또는 펩티드 모방제)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 사용을 통하여 상처 치유 속도, 정도 및/또는 질에 있어서의 증가를 제공해준다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용해서 사용하는 것은 상처 치유를 증진시키는 데에 있어서 부가적, 상승적 또는 초부가적 효과를 가져다 준다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용해서 사용하면, 이러한 작용제를 단독으로 투여한 경우에 유효할 수 있는 용량(들)과 비교해서 감소된 용량의 상기 작용제를 사용할 수 있게 된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용해서 사용하면, 이러한 작용제를 단독으로 사용한 경우의 투여 횟수와 비교해서 감소된 투여 횟수가 요구될 수 있게 된다.
항커넥신제를 기타 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 사용하는 본 발명의 조성물 및 방법이 본원에 기재되고 청구된다.
본 발명에는 (a) 치료적 유효량의 항커넥신제, 및 (b) 상처를 치료하거나 상처 치유를 증진시키는 데에 유용한, 치료적 유효량의 또 다른 치료제를 포함하는 제약 조성물이 포함된다. 본 발명에는 (a) 치료적 유효량의 항커넥신제, 및 (b) 치료적 유효량의 갭 연접부 변성제를 포함하는 제약 조성물이 포함된다. 바람직하게, 이러한 제약 조성물은 제약상 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함한다.
병용, 동시, 별개의 순차적 또는 지속 투여를 위한 제약 조성물이 제공된다. 한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 조성물은 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 동시에 또는 대략 동시에 투여한다.
제약 조성물은 조합 제제의 형태, 예를 들어 하나 이상의 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 하나 이상의 기타 작용제, 예를 들면 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유효한 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 (예: FGF2), 혈관 내피 성장 인자, 및 전환 성장 인자 β3, 및/또는 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유효한 사이토킨, 예를 들면 IL-7 및 IL-10, 및/또는 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유효한 기타 작용제, 예를 들어 IGF (예: IGF-1) 및 IGFBP (예: IGFBP-2)의 혼합물로서 제공되기도 한다.
용어 "조합 제제"에는 상기 정의된 바와 같은 병용 파트너가 독립적으로 투여될 수 있거나 또는 두드러진 양의 병용 파트너 (a)와 (b)를 수반한 상이한 고정 조성물을 사용함으로써 투여, 즉 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다는 의미에서 "키트"가 포함된다. 이때, 키트의 성분들은, 예를 들어 동시에 또는 연대순으로 엇갈리게 투여할 수 있는데, 이는 상이한 시점에 키트의 모든 성분에 대해 동등하거나 상이한 시간 간격 하에 이루어진다.
바람직한 양태에서, 조합 제제를 투여하면 그 결과로서, 투여 시점이 보다 적어지고/지거나 투여 사이의 시간 간격이 보다 길어지게 될 것이다.
한 국면에서, 본 발명에는 제약상 허용 가능한 담체와 치료적 유효량의 항커넥신제 및 본원에 기재된 하나 이상의 작용제를 포함하는, 국소 전달 형태 및 제형을 포함한 제약 조성물이 포함된다. 항커넥신제의 예에는 항커넥신 올리고데옥시뉴클레오티드 ("ODN"), 예를 들어 안티센스 (변형된 및 변형되지 않은 주쇄 안티센스 포함), RNAi, 및 siRNA 뿐만 아니라 항커넥신 펩티드 및 펩티드 모방제가 포함된다. 적합한 항커넥신제에는, 예를 들어 커넥신 43, 26, 37, 30, 및 31.1 및 32에 대항한 안티센스 ODN, 펩티드 및 펩티드 모방제가 포함된다. 특정 양태에서, 적합한 조성물에는, 예를 들어 커넥신 43, 26, 30 및 31.1을 포함한 다수의 항커넥신제를 병용해서 상처 치유 및/또는 조직 복구에 유용한 하나 이상의 기타 작용제와 함께 포함한다. 바람직한 항커넥신제는 커넥신 43에 대항하여 유도된다. 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 상처 치유에 사용하기 위한 바람직한 작용제에는 특정의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 알파, 섬유아세포 성장 인자 베타, 혈관 내피 성장 인자, 및 전환 성장 인자 β3 뿐만 아니라 인슐린 유사 성장 인자가 포함된다. 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 상처 치유에 사용하기 위한 기타 바람직한 작용제에는 특정의 사이토킨, 예를 들어 IL-7 및 IL-10이 포함된다. 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 상처 치유에 사용하기 위한 기타 바람직한 작용제에는 티모신 (thymosin) 베타-4, 분비성 백혈구 프로테아제 억제제, 베타 아드레날린 작동성 길항제 [예: 티모프틱 (timoptic)], 인터루킨-1 수용체 길항제 [예; 아나킨라 (anakinra)], 자유 라디칼 스캐빈저 (예: N-아세틸시스테인), 및 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유용한 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 유전자 요법 벡터 (예: 혈소판 유래 성장 인자-B를 암호화하는 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터)가 포함된다. 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 투여되는 바람직한 치료제에는, 예를 들어 소염제, 항미생물제 [예; 트리메토프림 (trimethoprim)], 국소 및 국부 마취제, 및 국부 아편양 제제 (예: 모르핀, 히드로모르핀 및 펜타닐)가 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 지연 방출 제제, 서방출 제제, 연장 방출 제제, 제어 방출 제제 및/또는 반복 작용 제제 중에 제형화된, 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를, 전적으로 또는 부분적으로 지연되거나 불완전한 상처 치유를 특징으로 하는 상처를 포함한 상처가 있는 대상체에게 투여하는 방법이 포함된다.
특정의 기타 국면에서, 본 발명은 또한, 급성 및 아급성 상처, 및 지연된 치유 또는 만성적 상처를 포함한 상처와 연관된 각종 질병, 장애 및 질환으로 인해 고통받고 있거나 이러한 질병, 장애 및 질환에 걸릴 위험에 노출된 대상체를 치료하기 위하여, 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 전적으로 또는 부분적으로 상처 또는 복구할 필요가 있는 조직을 특징으로 하는 모든 질병, 장애 및/또는 질환에 걸렸거나, 걸린 것으로 추정되거나, 이러한 질병에 대한 소인이 있거나 걸릴 위험에 노출된 대상체를 치료하는 방법이 포함된다. 이러한 조성물에는, 예를 들어 국소 전달 형태 및 제형이 포함된다.
바람직한 방법에는 하나 이상의 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제를 순차적 또는 동시에 투여하는 것이 포함되는데, 이들 작용제 중의 어느 하나 또는 둘 다는 물리적으로 또는 상처 치료 과정시 단독으로 투여된 경우, 즉 병용해서 투여되지 않은 경우에 사용된 용량 또는 양 보다 더 적은 용량 또는 양으로 제공된다. 이와 같이 투여되는 작용제의 보다 적은 양은 전형적으로, 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/12 내지 약 1/10이고, 이는 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/8, 약 1/6, 약 1/5, 약 1/4, 약 1/3 및 약 1/2일 수 있다. 바람직하게, 투여는 순차적이다. 바람직하게, 작용제는 서로 적어도 약 30분 이내에 순차적으로 투여한다. 작용제는 또한, 서로 약 1시간 내에, 서로 약 1일 내지 약 1주 내에, 또는 기타 적당한 바 대로 투여할 수 있다. 바람직하게, 항커넥신제를 먼저 투여한다. 바람직하게, 하나 이상의 항커넥신제를 사용하는 경우에는, 항커넥신 펩티드 또는 항커넥신 펩티드 모방제, 예를 들어 헤미채널 개방을 차단 또는 저하시킬 수 있는 항커넥신제를 투여한 후에, 예를 들어 커넥신 단백질 발현을 하향 조절함으로써 헤미채널 또는 갭 연접부의 형성 또는 커넥신 발현을 차단 또는 저하시키는 항커넥신제를 투여한다. 바람직하게, 항커넥신제(들)는 항커넥신 43 작용제(들)이다.
추가의 국면에서, 본 발명에는 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 부가의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 대상체에게 전달할 수 있는, 대상체의 피부에 부착될 수 있거나 이와 연합될 수 있는 경피 패치, 드레싱, 패드, 랩, 매트릭스 및 붕대가 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 상처 치유를 증진시키기 위한 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제를 함유하는 용기, 및 대상체를 치료하기 위해 사용한다는 것을 포함한 사용 설명서를 포함하는 제조품이 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 상처 치유를 증진시키기 위한 상처 치유에 유용한 하나 이상의 제약상 허용 가능한 작용제를 함유하는 용기, 및 대상체를 치료하기 위해 사용한다는 것을 포함한 사용 설명서를 포함하는 제조품이 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 갭 연접부 변성제를 함유하는 용기, 및 대상체를 치료하기 위해 사용한다는 것을 포함한 사용 설명서를 포함하는 제조품이 포함된다.
본 발명에는 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 함유하는 하나 이상의 투여 형태를 함유하는 패키징 물질을 포함하는 제조품이 포함되는데, 이러한 패키징 물질은 해당 투여 형태가 본원에 기재되거나 참조된 모든 질병, 장애 및/또는 질환, 예를 들어 전적으로 또는 부분적으로, 급성, 손상된, 지연된 또는 만성적 상처 치유를 특징으로 하는 질병, 장애 및/또는 질환에 걸렸거나, 걸린 것으로 추정되거나 또는 그에 대한 소인이 있는 대상체를 위해 사용할 수 있다는 것을 표시하고 있는 표지를 갖고 있다. 이러한 투여 형태에는, 예를 들어 국소 전달 형태 및 제형이 포함된다.
본 발명에는 대상체에게서 상처 치유 또는 조직 복구를 증진시키는 데에 유효한 양의, 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 제약상 허용 가능한 작용제를 포함하는 제형이 포함된다. 본 발명에는 대상체에게서 상처 치유를 증진시키는 데에 유효한 양의, 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 제약상 허용 가능한 치료제를 포함하는 제형이 포함된다. 본 발명에는 대상체에게서 상처 치유를 증진시키는 데에 유효한 양의, 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 제약상 허용 가능한 갭 연접부 변성제를 포함하는 제형이 포함된다. 이러한 제형에는, 예를 들어 국소 전달 형태 및 제형이 포함된다. 바람직한 제형은 하나 이상의 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제를 포함하는데, 이들 작용제 중의 어느 하나 또는 둘 다는 물리적으로 또는 상처 치료 과정시 작용제(들)를 단독으로 투여한 경우, 즉 작용제를 병용해서 투여하지 않은 경우에 사용된 용량 또는 양 보다 더 적은 용량 또는 양으로 제공된다. 이와 같이 병용해서 투여되거나 제공되는 작용제의 보다 적은 양은 전형적으로, 단독으로 투여되는 경우의 양의 약 1/12 내지 약 1/10이고, 이는 단독으로 투여되는 경우의 양의 약 1/8, 약 1/6, 약 1/5, 약 1/4, 약 1/3 및 약 1/2일 수 있다.
본 발명에는 약물을 제조하는 데에 있어서의, 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 치료적 유효량의 조성물의 사용 방법이 포함된다. 이러한 약물에는, 예를 들어 국소 전달 형태 및 제형이 포함된다. 이러한 약물에는 본원에 기재된 바와 같은 대상체를 치료하기 위한 것이 포함된다. 상기 약물은 바람직하게, 본원에 인지된 바와 같이, 감소된 양의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함한다.
본 발명에는 투여 형태를 제조하는 데에 있어서의, 치료적 유효량의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 사용 방법이 포함된다. 이러한 투여 형태에는, 예를 들어 국소 전달 형태 및 제형이 포함된다. 이러한 투여 형태에는 본원에 기재된 바와 같은 대상체를 치료하기 위한 것이 포함된다. 상기 투여 형태는 바람직하게, 본원에 인지된 바와 같이, 감소된 양의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상처, 예를 들어 급성, 아급성, 지연된 및 만성적 상처를 치료하는 데에 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상처 치유를 증진시키기 위한 의약품을 필요로 하는 환자에게서, 이러한 의약품을 제조하는 데에 있어서의 항커넥신제 (예: 항-알파-1 ODN, 펩티드 또는 펩티드 모방제)와 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 용도를 제공한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상처 치유 또는 치료를 증진 또는 증강시키거나 또는 섬유증 또는 기타 섬유성 질환을 예방 또는 회복시키기 위한 방법을 제공한다.
특정의 기타 국면에서, 본 발명은 (i) 상처 치유를 증진시키기 위하여 (예를 들어, 치유 시간을 단축하거나 보다 우수한 상처 결과를 수득하기 위하여) 항커넥신제를 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 사용한다는 사용 설명서와 함께 포함하는 패키지; (ii) 상처 치유를 증진시키기 위하여 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 사용한다는 사용 설명서와 함께 포함하는 패키지, 및 (iii) 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를, 상처 치유를 증진시키거나 상처 관련 섬유증을 저하시키는 데에 사용한다는 사용 설명서와 함께 포함하는 패키지를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 의약품은 상처 드레싱 또는 상처 치유 증진성 매트릭스와 병용해서 제공된다. 적합하게는, 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제가 고체 기질 상에 또는 내부에 분산된 고체 기질 형태를 포함한 상처 드레싱 또는 매트릭스가 제공된다.
항커넥신제와 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 동일한 조성물 내에 투여하거나 별개의 조성물로써 투여할 수 있다. 바람직하게, 상기 작용제는 본원에 인지된 바와 같이, 감소된 양의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제로 투여된다.
항커넥신제와 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 환자에게 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여할 수 있다. 별개로 투여하는 경우, 바람직하게 항커넥신제와 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 순차적으로 투여한다. 바람직하게, 상기 작용제는 서로 적어도 약 30분 이내에 순차적으로 투여한다. 작용제는 또한, 서로 약 1시간 내에, 서로 약 1일 내지 약 1주 내에, 또는 기타 적당한 바 대로 투여할 수 있다. 바람직하게, 항커넥신제를 먼저 투여한다. 바람직하게, 하나 이상의 항커넥신제를 사용하는 경우에는, 항커넥신 펩티드 또는 항커넥신 펩티드 모방제, 예를 들어 헤미채널 개방을 차단 또는 저하시킬 수 있는 항커넥신제를 투여한 후에, 예를 들어 커넥신 단백질 발현을 하향 조절함으로써 헤미채널 또는 갭 연접부의 형성 또는 커넥신 발현을 차단 또는 저하시키는 항커넥신제를 투여한다. 바람직하게, 항커넥신제(들)는 항커넥신 43 작용제(들)이다.
본 발명의 상기 및 기타 국면은 본 요약 내의 정보에 의해 제한되지 않고 다음에 제공된다.
도 1A 내지 도 1I는 상처 부위에서의 Cx43의 발현을 도시한 것이다. 도 1A는 상처 부위에서의 Cx43의 유전자 발현을 실시간 PCR로 분석하여 도시한 것이다. 도 1A는 대조군 sODN (n=4; 흰색 막대) 및 Cx43 asODN (n=4; 검은색 막대)으로 처리된 상처에서 1일 및 7일째에 GAPDH에 대한 Cx43의 상대적 발현 수준을 도시한 것이고; 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05. 도 1B 내지 1F는 Cx43 asODN (도 1B: 1일, 도 1D: 2일 및 도 1F: 7일) 또는 대조군 (도 1C: 1일, 도 1E: 2일 및 도 1G: 7일)으로 처리된 상처의 비스-벤즈이미드 핵 염색 (블루)을 수반한 Cx43 염색 (그린)을 도시한 것이다. 도 1H 및 1I는 상처 가장자리에서 영상화한 부위을 예시하여 도시한 것이다. (도 1H) 영상 B-E. (도 1I) 영상 F 및 G.
도 2A 내지 도 2H는 상처 형성 후의 세포 증식을 도시한 것이다. 도 2A 내지 2D는 대조군 ODN (도 2A: 2일 및 도 2C: 7일) 및 Cx43 asODN (도 2B: 2일 및 도 2D: 7일)에서 항-BrdU 모노클로날 항체를 이용한 면역조직화학적 염색에 의한 상처 부위에서의 세포 증식의 분석을 도시한 것이다. 화살촉과 화살표는 상처 주변과 앞쪽 가장자리를 각각 표시한다. 도 2E 내지 2H는 BrdU-염색된 세포를 도시한 것이다; (i) 표피 (도 2E: n=5) 및 신생 표피 (도 2F: n=5) 내에서의 상처 주변 시야당 BrdU-양성 세포의 수; (ii) 피부 상처 가장자리 (도 2G: n=5) 및 형성성 육아 (granulation) 조직 (도 2H: n=5)에서의 BrdU-양성 세포의 수. 계수치는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05. 눈금 막대는 200 ㎛을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3C는 상처 부위 내로의 호중구 동원을 도시한 것이다. 도 3A 및 도 3B는 1일째에 항-MPO 항체를 사용하여 분석한, 대조군 sODN (도 3A) 및 Cx43 asODN (도 3B)로 처리된 피부 상처 내로의 호중구 동원을 도시한 것이다. 도 3C는 대조군 sODN (흰색 막대: 1일째 n=4; 2일째 n=5) 및 Cx43 asODN (검은색 막대; 1일째 n=3; 2일째 n=4)로 처리한 후 상처 부위에서의 MPO 양성 세포의 수를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05. 눈금 막대는 50 ㎛을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4C는 상처 부위 내로의 대식세포 동원을 도시한 것이다. 도 4A 및 도 4B는 7일째에 항-F4/80 항체를 사용하여 분석한, 대조군 sODN (도 4A) 및 Cx43 asODN (도 4B)로 처리된 피부 상처 내로의 대식세포 동원을 도시한 것이다. 도 4C는 대조군 sODN (흰색 막대: 2일째 n=4; 7일째 n=7) 및 Cx43 asODN (검은색 막대; 2일째 n=4; 7일째 n=6)로 처리한 후 2일 및 7일째 상처 부위 내로의 대식세포 동원을 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.01. 눈금 막대는 50 ㎛을 나타낸다.
도 5A 내지 도 5B는 상처 부위에서의 Ccl2 및 TNF-α의 발현을 도시한 것이다. 도 5A 및 도 5B는 상처 부위에서 Ccl2 및 TNF-α의 유전자 발현을 실시간 PCR 분석하여 도시한 것이다. 대조군 sODN (흰색 막대) 또는 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리한 후 1, 2 및 7일째에 (각각에 대해 n=5) GAPDH에 대한 Ccl2 (도 5A) 및 TNF-α (도 5B)의 상대적 발현 수준을 정량화한다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05.
도 6A 내지 도 6K는 TGF-β1의 발현을 도시한 것이다. 도 6A 내지 6J는 대조군 sODN (도 6A-6E) 및 Cx43 asODN (도 6F-6J)으로 처리된 상처 부위에서 TGF-β1에 대한 면역조직화학을 도시한 것이다. 눈금 막대는 200 ㎛ (도 6A 및 6F) 및 50 ㎛ (도 6B-6E, 및 6G-6J)을 나타낸다. 블랙 화살표는 표피의 신생 가장자리를 나타낸다. TGF-β1 염색은 대조군 sODN 처리된 상처 (도 6D 및 6E)와 비교해서 Cx43 asODN 처리된 상처 (도 6I 및 6J)의 표피에서 상당히 더 강력하다. 레드 및 블랙 화살촉은 각각 대표적인 TGF-β1 신장된 섬유아세포-유사 세포 및 환형 추정적 백혈구를 나타낸다. 도 6K는 대조군 sODN (흰색 막대) 또는 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리된 상처 부위에서 TGF-β1에 대한 mRNA의 1, 2 및 7일째 (각각에 대해 n=5)의 발현을 실시간 PCR 분석하여 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05.
도 7A 내지 도 7F는 육아 조직 형성 및 섬유아세포 이동을 도시한 것이다. 도 7A 및 7B는 2일째에 TRITC-팔로이딘 (Phalloidin) 및 DAPI 핵 염색을 이용하여 분석된, 대조군 sODN (도 7A) 및 Cx43 asODN (도 7B)로 처리된 피부 상처 내로의 섬유아세포-유사 세포 동원을 도시한 것이다. 도 7C는 대조군 sODN (흰색 막대: n=5) 또는 Cx43 asODN (검은색 막대: n=5)로 처리된 상처에 대한 시야당 각 상처 부위에서 섬유아세포-유사 세포의 수를 도시한 것이다. 도 7D는 섬유아세포 이동의 상처-치유 검정 결과를 도시한 것인데, 이는 이러한 이동이 Cx43 asODN로 처리한 후에 상당히 더 신속하다는 것을 나타낸다. 도 7E 및 7F는 상처 형성시 (도 7E) 및 상처 형성된지 4시간 후 (도 7F), 섬유아세포 배양물 중의 상처의 영상을 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.02 **P < 0.01. 눈금 막대는 50 ㎛을 나타낸다.
도 8A 내지 도 8B는 상처 부위에서의 콜라겐 발현을 도시한 것이다. 도 8A는 대조군 sODN (흰색 막대) 및 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리된 상처 부위에서의 상처 형성 후 7, 10 및 14일째 및 손상되지 않은 피부에서 히드록시프롤린 (HP) 함량을 정량적으로 측정함으로써 평가된 콜라겐 함량을 도시한 것이다 (n=5). 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. P < 0.05. 도 8B는 대조군 sODN (흰색 막대) 및 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리된 상처 부위에서 Col1α1에 대한 1, 2 및 7일째에 (각각에 대해 n=5) mRNA의 발현을 실시간 PCR 분석하여 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. *P < 0.05.
도 9A 내지 도 9C는 육아 조직 수축을 도시한 것이다. 도 9A 및 9B는 대조군 sODN 처리된 상처 (도 9A) 및 asODN 처리된 상처 (도 9B)에서 14일간 상처 육아 조직의 H&E 염색을 도시한 것이다. 도 9C는 5일 (대조군; n=7, asODN; n=6), 7일 (대조군; n=5, asODN; n=5), 10일 (대조군; n=5, asODN; n=6), 및 14일 (대조군; n=5, asODN; n=6)째에 분석한, 대조군 sODN (흰색 막대) 또는 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리한 후의 육아 조직 면적을 도시한 것이다. 5일째에 측정한 육아 조직 면적은 asODN로 처리한 후에 약간 더 작은 것으로 이미 나타났지만, 7, 10 및 14일째에는 이러한 감소가 상당히 더 커졌다 (*P < 0.05. **P < 0.01). 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. 눈금 막대는 1 mm를 나타낸다.
도 1OA 내지 도 1OC는 상처 부위에서의 세포소멸을 도시한 것이다. 도 1OA 및 1OB는 7일째에 대조군 sODN 처리된 상처 (도 10A) 및 Cx43 asODN 처리된 상처 (도 10B)에서 육아 조직의 TUNEL 염색을 도시한 것이다. 세포소멸성 세포는 연녹색 반점으로서 나타났는데, 그중 일부는 화살촉으로 강조하였다. 눈금 막대는 50 ㎛을 나타낸다. 도 1OC는 대조군 sODN (흰색 막대) 및 Cx43 asODN (검은색 막대)로 처리된 상처 부위에서 5, 7 및 10일째에 (각각에 대해 n=5) 시야당 세포소멸성 세포의 수를 도시한 것이다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. 눈금 막대는 50 ㎛을 나타낸다.
도 11A 내지 도 11F는 상처 부위에서의 근섬유아세포 성숙을 도시한 것이다. 도 11A 및 11D는 7일째 상처에서의 육아 조직 가장자리 (도 11A 및 11B) 및 10일째 상처에서의 육아 조직의 중앙 (도 11C 및 11D)의 비스-벤즈이미드 핵 염색 (블루)을 수반한 항-α 평활근 악틴 (SMA) 염색 (그린)을 도시한 것이다. 도 11E는 7일째에 대조군 보다 Cx43 asODN 처리된 상처에서 보다 상당한 SMA 염색이 이루어졌다는 것을 나타낸 염색 수준의 정량화 (P=0.004)를 도시한 것인데, 이는 보다 이른 성숙과 근섬유아세포의 분화를 표시한다. 이와 같이 보다 진행된 성숙은, 대부분의 SMA 염색과 근섬유아세포가 Cx43 asODN-처리된 상처에서 상실되었지만 대조군 상처에서는 염색이 여전히 매우 강력한 10일째에도 여전히 존재하였다 (P=0.000002). 도 11F는 육아 조직에서 영상화한 부위를 예시하여 도시한 것이다: 영역 I (도 11A 및 11B) 및 영역 II (도 11C 및 11D). 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. 눈금 막대는 25 ㎛을 나타낸다.
도 12A 내지 도 12H는 상처 부위에서의 혈관형성을 도시한 것이다. 도 12A 내지 12F는 상처 형성 후 7일 (도 12A 및 12B), 10일 (도 12C 및 12D) 및 14일 (도 12E 및 12F) 째에 비스-벤즈이미드 핵 염색 (블루)을 수반한 육아 조직 신생 혈관의 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 염색 (그린)을 도시한 것이다. 안티센스-처리된 상처에서는 (도 12A, 12C 및 12E) 혈관이 초기 시점 (7일 도 12A 및 12B 및 10일 도 12C 및 12D)에 보다 잘 퍼지지만, 대조군 ODN으로 처리된 것 (도 12B, 12D, 및 12F) 보다 상당히 더 미세하여, 대조군과 비교해서 염색히 상당히 감소하였다 (7일 *P=0.0019; 10일 **P=0.015). 14일까지는 혈관 크기가 asODN 군에서 증가하였고, 이는 대조군과 유사한 크기였다 (도 12G). 도 12H는 육아 조직에서 영상화한 부위를 예시하여 도시한 것이다: 영역 I (도 12A 및 12B) 및 영역 II (도 12C내지 12E). 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다. 눈금 막대는 25 ㎛을 나타낸다.
도 13A 내지 도 13B는 대조군 처리와 비교해서 As ODN 처리를 수행한 후 상처 치유의 현미경 영상 (도 13A) 및 상처 면적 상의 상대적 변화 (도 13B)를 도시한 것이다.
도 14는 인간 윤부 테두리 - 박피된 돼지 간질 매트릭스 키메라를 도시한 것이다.
도 15는 120개 상이한 성장 인자 및 사이토킨에 대한 단백질 수준을 탐지하기 위해 사용된 항체 어레이와 결합하는 성장 인자 및 사이토킨의 예를 도시한 것이다. 2가지 어레이 막 각각에 대해 (반복 서열과 양성 및 음성 대조군을 수반한 막당 60개 성장 인자/사이토킨) 4개 샘플을 수행하였다.
도 16은 2주간 배양 후 키메라의 윤부 테두리 영역과 비교한 키메라 간질에서의 성장 인자 수준을 분석하여 도시한 것이다. 이는 대조군 각막이다 (안티센스 처리되지 않음). 2개의 성장 인자가 특히 흥미롭다 (화살표). 이들은 키메라 간질에서 극히 고 수준의 IGFBP-2이고 윤부 테두리에서 보다 고 수준의 IGF-1이다. 전자는 세포성 이동을 증진시키는 데에 중요한 것으로 보고되었고 (이는 간질성 각막세포가 윤부 테두리로부터 간질을 재증식시키는 데에 중요할 수 있다), 후자는 세포 증식을 증진시키는 데에 중요한 것으로 보고되었다 (이는 간질을 재증식시키는 세포의 공급원을 제공하는 윤부 테두리에 중요할 수 있다).
도 17은 2주간 배양 후 키메라의 윤부 테두리 영역과 비교한 키메라 간질에서의 성장 인자 수준을 분석하여 도시한 것이다 (Cx43 As ODN 처리된 각막으로부터의 데이터에 기초한다). 2개의 성장 인자가 특히 흥미롭다 (화살표). 이들은 처리되지 않은 대조군과 비교해서 안티센스 처리된 키메라 간질에서 고 수준의 IGF-7이고, 처리되지 않은 대조군, 특히 대조군 윤부 테두리과 비교해서 윤부 테두리와 간질 둘 다에서 보다 고 수준의 IGFBP-2이다. 전자는 상피 성장을 증진시키는 데에 중요한 것으로 보고되었고 (이는 안티센스 처리된 키메라에서 관찰된 증가된 재상피화와 일치한다), 후자는 세포 이동을 증진시키는 데에 중요한 것으로 보고되었다 (이는 안티센스 처리한 윤부 테두리로부터의 증가된 상피 재증식과 일치한다).
도 18은 저 염증성 상처 모델과 비교해서 염증에서의 증가된 발현 수준에 근거하여 확인된 대표적인 사이토킨 군을 예시한 것이다. 이들 대표적인 사이토킨은 상처 치유를 조정하기 위한 적합한 표적으로서 제공될 수 있다.
도 19는 염증성 모델과 비교해서 저 염증성 상처 모델에서의 증가된 발현 수준에 근거하여 확인된 대표적인 사이토킨 군을 예시한 것이다. 이들 대표적인 사이토킨은 상처 치유를 조정하기 위한 적합한 표적으로서 제공될 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 "장애"는 상처 치유를 증진시키고/시키거나 종창, 염증 및/또는 반흔 형성을 저하시키는 작용제로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 장애, 질병 또는 질환이다. 예를 들어, 수술 또는 외상으로부터 비롯된 상처, 및 신경병성, 허혈성, 미소혈관성 병리상태, 골 부위 [꼬리뼈 (천골), 둔부 (대퇴돌기), 엉덩이 (좌골) 또는 다리의 발뒤꿈치] 상의 압박, 재관류 손상, 및 판막 역류 병인및 질환과 연관된 상처 관련 이상이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 모든 포유류, 예를 들어 인간, 가축 및 농장용 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예를 들면 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 암소 등을 지칭한다. 본원에서 바람직한 동물은 성인, 어린이 및 노인을 포함한 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은 "예방하는"이란 전적으로 또는 부분적으로 예방하거나, 회복 또는 제어시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 화합물 또는 조성물과 관련한 "치료적 유효량"은 목적하는 생물학적, 제약 또는 치료적 효과를 유도시키기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 결과는 질병, 장애 또는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 경감일 수 있거나, 또는 생물학적 시스템의 기타 목적하는 변경일 수 있다. 본 발명에서는, 상기 결과가 상처 치유을 증진시키는 것과, 종창, 염증 및/또는 반흔 형성을 전적으로 또는 부분적으로 저하시키는 것을 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"이란 치료적 처치와 예방적 조처 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 상처 또는 기타 관련 장애가 이미 있는 대상체 뿐만 아니라 상처 또는 관련 장애에 걸리기 쉽거나 이러한 장애가 있는 것으로 진단된 대상체, 또는 장애를 예방시켜야 하는 대상체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항커넥신제"는 커넥신, 커넥신 헤미채널 (커넥손) 또는 갭 연접부의 활성, 발현 또는 형성에 영향을 미치거나 이를 조정하는 화합물이다. 항커넥신제에는 안티센스 화합물 (예: 안티센스 폴리뉴클레오티드), RNAi 및 siRNA 화합물, 항체 및 그의 결합성 단편, 및 펩티드 및 폴리펩티드 ("펩티드 모방제"를 포함한다), 및 펩티드 유사체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 항커넥신제는 항커넥신 43 작용제이다. 예시되는 항커넥신제는 본원에 추가로 상세히 논의되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"이란 치료적 처치와 예방적 조처 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 장애가 이미 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 장애에 걸리기 쉽거나 장애가 있는 것으로 진단된 대상체, 또는 장애를 예방시켜야 하는 대상체가 포함된다.
용어 "펩티드 모방제" 및 "모방제"에는 이들이 모방하는 단백질 영역의 실질적으로 동일한 구조적 및 기능적 특징을 지닐 수 있는 천연 발생적 및 합성 화학 화합물이 포함된다. 커넥신의 경우, 이는, 예를 들어 커넥손-커넥손 도킹 및 세포-세포 채널 형성에 관여한 반대 커넥신의 세포외 루프를 모방할 수 있다.
"펩티드 유사체"는 주형 펩티드와 유사한 특성을 지니고 비펩티드 약물일 수 있는 화합물을 지칭한다. 펩티드계 화합물을 포함하는 "펩티드 모방제" ("모방성 펩티드"로서 공지되기도 함)에는 또한, 상기 비펩티드계 화합물, 예를 들어 펩티드 유사체가 포함된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조상 유사한 펩티드 모방제를 사용하여 등가의 또는 증강된 치료적 또는 예방적 효과를 야기시킬 수 있다. 일반적으로, 펩티드 모방제는 범례 (paradigm) 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약리학적 기능 또는 활성을 지닌 폴리펩티드)와 구조상 동일하거나 유사하지만, 예를 들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-로 이루어진 군 중에서 선택된 연쇄로써 임의로 대체된 하나 이상의 펩티드 연쇄를 가질 수도 있다. 모방제는 전적으로 천연 아미노산 또는 아미노산의 비천연 유사체로 구성되거나, 또는 부분적 천연 펩티드 아미노산과 아미노산의 부분적 비천연 유사체의 키메라 분자일 수 있다. 모방제는 또한, 어떠한 양의 천연 아미노산 보존적 치환물도 포함할 수 있는데, 단 이러한 치환물은 모방 활성을 실질적으로 변경시키지 않아야 한다. 예를 들어, 모방 조성물은 이것이 커넥신 단백질 또는 커넥손의 생물학적 작용 또는 활성을 하향 조절할 수 있는 경우, 예를 들어 갭-연접부-매개된 세포-세포 소통을 형성시키기 위해 커넥손의 도킹을 방지시키거나 또는 세포 세포질을 세포외 환경에 노출시키기 위해 커넥손 개방을 방지시킬 수 있는 경우에 항커넥신제로서 유용할 수 있다. 펩티드 모방제, 모방 펩티드, 및 커넥신 조정성 펩티드는 공지되지 않았든지 나중에 개발되든지 간에, 당해 분야에 공지될 수 있는 것 뿐만 아니라 본원에 제시되고 기재된 펩티드 모방제, 모방 펩티드, 및 커넥신 조정성 펩티드를 포괄한다.
각종 형태로 본원에 사용된 바와 같은, 커넥신 활성의 "조정제" 및 "조정"은 커넥신 또는 커넥신 헤미채널의 발현 또는 작용 또는 활성을 전적으로 또는 부분적으로 억제하는 것을 지칭하고, 항커넥신제로서 기능할 수 있다.
일반적으로, 용어 "단백질"은 하나의 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 알파-탄소와 결합된 카복실산기의 카복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 알파-탄소와 결합된 아미노기의 아미노 질소 원자와 공유적으로 결합되는 경우에 발생되는 바와 같이, 펩티드 결합을 통하여 연결된 2개 이상의 개별적 아미노산 (천연 발생적이든 그렇치 않든 간에)의 모든 중합체를 지칭한다. 이들 펩티드 결합 연쇄, 및 이를 구성하는 원자 [즉, 알파-탄소 원자, 카복실 탄소 원자 (및 그의 치환체 산소 원자), 및 아미노 질소 원자 (및 그의 치환체 수소 원자)]가 단백질의 "폴리펩티드 주쇄"를 형성한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"에는 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" (종종, 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다)가 포함된다. 유사하게, 단백질 단편, 유사체, 유도체 및 변이체가 본원에서 "단백질"로서 지칭될 수 있고, 달리 표시되지 않는 한 "단백질"인 것으로 간주될 것이다. 단백질의 "단편"은 이러한 단백질의 아미노산 잔기 전부 보다 몇개 적은 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질의 "도메인"이 또한 단편이고, 이는 종종 활성 또는 기능을 부여하는 데에 요구되는 단백질의 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "동시에"는 본 발명의 하나 이상의 작용제를 동시에 투여하는 것을 의미하기 위해 사용하는 반면, 용어 "병용해서"는 동시에 또는 물리적 병용이 아닐 경우에는, 이들 작용제 둘 다가 치료적으로 작용하도록 이용 가능한 시간의 틀 내에서 "순차적"으로 투여하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, "순차적" 투여는 하나의 작용제를 다른 작용제를 투여한 후 수 분 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30분) 또는 수 시간, 수 일, 수 주 또는 수 개월 이내에 투여할 수 있도록 하는데, 단 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제 모두는 동시에 유효량으로 존재해야 한다. 성분들의 투여 시간 간격은 성분들의 정확한 특성, 이들 간의 상호 작용 및 그들 각각의 반감기에 따라서 다양할 것이다.
"상처"는, 예를 들어 급성, 아급성, 치유 지연 또는 치유 곤란 상처, 및 만성적 상처를 포함한 모든 조직에 대한 손상을 의미한다. 상처의 예에는 개방성 상처와 폐쇄성 상처 둘 다가 포함될 수 있다. 상처에는, 예를 들어 화상, 절개상, 절제상, 열상, 찰과상, 자창 또는 관통상, 외과적 상처, 타박상, 혈종, 압착 손상, 및 궤양이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 치유 지연 또는 치유 곤란 상처에는, 예를 들어 적어도 부분적으로 1) 연장된 염증기, 2) 서서히 형성되는 세포외 매트릭스 (ECM), 및 3) 지체되거나 감소된 상피화 속도 중의 한 가지 이상을 특징으로 하는 상처가 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 만성적 상처는, 예를 들어 적어도 부분적으로 1) 만성적 자가-영속성 상태의 상처 염증, 2) 결핍되고 결함있는 상처 ECM, 3) ECM 생성을 제한하는, 불충분하게 반응하는 (노화) 상처 세포, 특히 섬유아세포, 및 4) 부분적으로 필수 ECM 조정의 결여 및 이동을 위한 스캐폴드 (scaffold)의 결여에 기인한 재상피화의 실패 중의 한 가지 이상을 특징으로 하는 상처를 지칭할 수 있다. 만성적 상처에는 정맥성 궤양, 동맥성 궤양, 압박성 궤양, 혈관염성 궤양 및 당뇨병성 궤양이 포함된다.
용어 "드레싱"은 상처에 대한 국소 적용을 위한 드레싱을 지칭하고, 전신 투여에 적합한 조성물은 제외된다. 예를 들어, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 상처 치유에 유용한 작용제, 치료제 및/또는 갭 연접부 변성제는 상처와 접촉하는 물질 (예: 직포 또는 부직포 물질)의 고체 시트 내에 또는 시트 상에 분산될 수 있거나, 또는 폴리우레탄 발포체와 같은 발포체의 층, 또는 히드로젤, 예를 들어 폴리우레탄 히드로젤, 폴리아크릴레이트 히드로젤, 젤라틴, 카복시메틸 셀룰로스, 펙틴, 알지네이트, 및/또는 히알루론산 히드로젤, 예를 들어 젤 또는 연고 내에 분산될 수 있다. 특정 양태에서, 항커넥신제 및/또는 상기 하나 이상의 상처 치유에 유용한 작용제, 치료제 및/또는 갭 연접부 변성제는 활성 성분을 상처 내로 지속적으로 방출시켜 주는 생분해성 시트 물질, 예를 들어 동결 건조된 콜라겐, 동결 건조된 콜라겐/알지네이트 혼합물 (Johnson & Johnson Medical Limited로부터 FIBRACOL이란 등록 상표명으로 시판중임) 또는 동결 건조된 콜라겐/산화 재생 셀룰로스 (Johnson & Johnson Medical Limited로부터 PROMOGRAN이란 등록 상표명으로 시판중임)의 시트 내에 또는 시트 상에 분산된다.
본원에 사용된 바와 같은 "매트릭스"에는, 예를 들어 콜라겐, 아세포성 매트릭스, 가교결합된 생물학적 스캐폴드 분자, 조직에 의거한 생물공학 처리시킨 구조적 골격, 생물 제작된 생보철물, 및 기타 이식 구조물, 예를 들면 상처 치유를 증진시키는 데에 유용한 세포 침윤과 증식에 적합한 혈관성 이식편 등의 매트릭스가포함된다. 부가의 적합한 바이오매트릭스 물질에는 항원성 및 면역원성을 저하시키기 위한 화학적으로 변형된 콜라겐성 조직이 포함될 수 있다. 기타 적합한 예에는 상처 드레싱용 콜라겐 시트, 항원 무함유 또는 항원 감소된 아세포성 매트릭스 [참고: Wilson et al., Trans Am Soc Artif Intern 1990; 36:340-343] 또는 이종이식편 물질에 대한 항원성 반응을 저하시키기 위해 공학 처리시킨 기타 바이오매트릭스가 포함된다. 상처 치유를 증진시키는 데에 유용한 기타 매트릭스에는, 예를 들어 불용성 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 가공된 소 심장막 단백질 [참고: Courtman et al., J Biomed Mater Res 1994; 28:655-666] 및 조직 재생을 가속시키기 위해 숙주 세포 이동에 대한 천연 미소환경을 제공하는 데에 유용할 수 있는 기타 아세포성 조직 [참고: Malone et al., J Vase Surg 1984; 1:181-91]이 포함될 수 있다. 특정 양태에서, 매트릭스 물질에 상처 치유에 유용한 작용제, 예를 들어 성장 인자 또는 부위 특이적 방출을 위한 기타 상처 치유 증진성 작용제, 치료제 및/또는 갭 연접부 변성제를 보충시킬 수 있다.
상처 및 상처 분류
앞서 제공된 정의 이외에도, 용어 "상처"에는, 예를 들어 상이한 방식으로 개시되고 (예를 들어, 장기간 요양으로부터의 욕창 및 외상에 의해 유도된 상처) 다양한 특징을 지닌, 피부 및 피하 조직에 대한 손상이 포함될 수도 있다. 상처는 상처의 깊이에 따라서 4가지 등급 중의 하나로 분류될 수 있다: i) 등급 I: 상피로제한된 상처; ii) 등급 II: 진피 내로 연장된 상처; iii) 등급 III: 피하 조직 내로 연장된 상처; 및 iv) 등급 IV (또는 전층 피부 상처): 뼈 (예를 들어, 보다 큰 대퇴돌기 또는 천골 등의 골 압박점)가 노출되는 상처. 용어 "부분층 피부 상처"는 등급 I 내지 III을 포괄하는 상처를 지칭하고; 부분층 피부 상처의 예에는 화상, 욕창, 정맥울혈 궤양, 및 당뇨병성 궤양이 포함된다. 용어 "심부 상처"는 등급 III과 등급 IV 상처 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 심부 상처 및 만성적 상처를 포함한 모든 상처 유형을 치료하는 것을 고려한다. 용어 "만성적 상처"는 치유되지 않은 상처를 지칭한다. 바람직하게, 이는 정맥성 궤양, 욕창, 혈관염성 궤양, 당뇨병성 궤양 및 욕창성 궤양으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 만성적 피부 상처에는, 예를 들어 압박성 궤양, 당뇨병성 궤양, 정맥성 궤양, 혈관염성 궤양, 동맥성 궤양 및 혼합 궤양이 포함된다. 만성적 상처는 완전한 또는 부분적 동맥 봉쇄로부터 비롯되는 궤양 형성을 포함하는 동맥성 궤양일 수 있다. 만성적 상처는 정맥 판막의 기능장애 및 이와 연관된 혈관 질환으로부터 비롯되는 궤양 형성을 포함하는 정맥 울혈 궤양일 수 있다. 만성적 상처는 외상 유도된 궤양, 당뇨병성 궤양, 또는 혈관염성 궤양일 수 있다.
압박성 궤양: 압박성 궤양은 AHCPR (Agency for Health Care Policy and Research, U.S. Department of Health and Human Services) 지침에 근거하여 4가지 병기로 분류할 수 있다: 병기 1: 병기 I 압박성 궤양은 본래 피부의 관찰 가능한 압박 관련 변경인데, 그의 지표에는 신체 상의 인접 부위 또는 반대 부위와 비교해서 다음 중의 하나 이상의 변화가 포함될 수 있다: 피부 온도 (온기 또는 냉기), 조직 조도 (단단하거나 축축한 느낌) 및/또는 감각 (통증, 가려움증). 이 궤양은 약하게 착색된 피부에서 규정된 부위의 영속적 홍조로서 나타나는 반면, 보다 어두운 피부 톤에서는 궤양이 영속적 적색, 청색 또는 자주색 색조로 나타날 수 있다. 병기 1 궤양 형성에는 본래 피부의 표백될 수 없는 홍반 및 피부 궤양 형성의 예고된 병변이 포함될 수 있다. 피부색이 어두운 개체에서는, 피부의 변색, 온기, 부종, 경화 또는 경도가 병기 1 궤양 형성의 지표일 수 있다. 병기 2: 병기 2 궤양 형성은 표피, 진피 또는 둘 다와 관련된 부분층 피부 상실을 특징으로 할 수 있다. 이 궤양은 표재성이고 임상적으로 찰과상, 물집 또는 얕은 함몰부로서 제시된다. 병기 3: 병기 3 궤양 형성은 하층 근막 아래로 연장될 수는 있지만, 이를 관통하지는 않는 피하 조직의 괴사 또는 이 조직에 대한 손상과 관련된 전층 피부 상실을 특징으로 할 수 있다. 궤양은 임상적으로, 인접한 조직의 잠식을 수반하거나 수반하지 않는 심부 함몰로서 제시된다. 병기 4: 병기 4 궤양 형성은 근육, 뼈 또는 지지 구조물 (예: 힘줄, 관절 낭)에 대한 손상, 광범위한 파괴, 또는 조직 괴사를 수반한 전층 피부 상실을 특징으로 할 수 있다. 특정 양태에서는, 만성적 상처가 압박성 궤양 형성의 다음 AHCPR 병기 중의 하나 이상을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다: 병기 1, 병기 2, 병기 3 및/또는 병기 4.
욕창성 궤양: 욕창성 궤양은 허혈증을 유발시키는 골 융기 상의 장기간의 누그러지지 않는 압박에 따른 결과로서 발생할 수 있다. 이러한 상처는 꽉 눌린 체중으로 인해 스스로 위치를 바꿀 수 없는 환자, 예를 들어 마비되거나, 의식이 없거나, 또는 중증의 쇠약 환자에게서 발생하는 경향이 있다. 다음 기관 (U.S. Department of Health and Human Services)에 의해 규정된 바와 같이, 주요 예방적 조치는 고 위험 환자를 확인하고; 자주 평가하며; 주기적으로 위치를 바꿔주며, 적당한 압박-구제 침구, 수분 장벽 및 적절한 영양 상태와 같은 예방적 조처를 취하는 것이다. 치료 선택권에는, 예를 들어 압박 구제, 외과적 및 효소적 괴사조직 제거술, 축축한 상처 보호 및 세균 부하 제어가 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 허혈증을 유발시키는 골 융기 상의 장기간의 누그러지지 않는 압박으로부터 발생하는 욕창성 궤양 또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
동맥성 궤양: 동맥성 궤양은 조직 괴사 및/또는 궤양 형성을 유발시킬 수 있는 완전한 또는 부분적 동맥 봉쇄를 특징으로 할 수 있다. 동맥성 궤양의 징후에는, 예를 들어 팔다리의 무맥박성; 통증있는 궤양 형성; 통상적으로 잘 외접되는 작은 반점이 있는 궤양; 차거나 냉기 있는 피부; 지연된 모세혈관 회복 시간 (발가락 끝 상의 간단한 푸쉬 및 자극에 대해, 약 3초 이내에 발가락이 정상적인 색상으로 회복되어야 한다); 위축성 발현 세포 (예를 들어, 광택이 있거나, 얇거나 건조한 피부); 및 원위성 및 발의 모발 상실이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 완전한 또는 부분적 동맥 봉쇄에 기인한 동맥성 궤양 또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
정맥성 궤양: 정맥성 궤양은 다리에 영향을 미치는 가장 흔한 유형의 궤양이고, 정맥 판막의 기능장애를 특징으로 할 수 있다. 정상적인 정맥은 혈관의 역류를 방지시키는 판막을 갖고 있다. 이들 판막이 부적격하게 되면, 정맥혈의 역류로 인해 정맥 울혈이 유발된다. 적혈구로부터 헤모글로빈이 탈출하여 혈관외 공간 내로 유출되어, 흔히 갈색의 변색이 야기된다. 정맥성 궤양을 둘러싸고 있는 피부의 경피 산소 압력이 감소하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 해당 부위의 정상적인 혈관분포 상태를 폐쇄시키는 힘이 존재한다는 것을 제안한다. 림프관 배수와 유동이 이들 궤양에서 일정 역할을 하기도 한다. 정맥성 궤양은 내측 복사 근처에서 나타날 수 있고, 통상적으로 부종이 있고 경화된 다리와 병용해서 발생하는데; 이는 통증이 너무 많지 않고 얕을 수 있고, 환부로부터 스며나오는 정도로 방출될 수 있다. 특정의 양태에서, 정맥 판막의 기능장애 및 관련 혈관 질환에 기인한 정맥성 궤양 또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
정맥 울혈 궤양: 정맥 울혈 궤양은 국소적 저산소증을 유발시키는 다리의 만성적 수동 정맥 울혈을 특징으로 할 수 있다. 이들 상처의 한 가지 가능한 발병 기전에는 두꺼운 혈관주위 피브린 커프스를 가로 지르는 조직 내로의 산소 확산의 장애가 포함된다. 또 다른 기전은 거대분자가 혈관주위 조직 내로 유출되어 피부 완전성을 유지하는 데에 필요한 성장 인자가 포착된다는 것이다. 부가적으로, 큰 백혈구의 흐름이 느려지는데, 이는 정맥 울혈, 폐쇄 모세혈관, 활성화됨, 및 혈관 내피 손상으로 인해 궤양 형성에 대한 소인이 생기는 것 때문이다. 따라서, 특정의 양태에서, 하지의 만성적 수동 정맥 울혈 및/또는 이로써 발생하는 국소적 저산소증에 기인하는 정맥 울혈 궤양 또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
당뇨병성 궤양: 당뇨병 환자는 신경학적 합병증과 혈관성 합병증 둘 다로 인해 발에 궤양이 형성되기 쉽고 기타 궤양 형성에 잘 걸린다. 말초 신경병증은 발 및/또는 다리에 있어서의 변경되거나 완전한 감각 상실을 유발시킬 수 있다. 진행성 신경병증을 나타내는 당뇨병 환자는 예리함과 무딤을 식별할 수 있는 모든 능력을 상실한다. 신경병증 환자는 발에 대한 절단이나 외상을 수 일 또는 수 주 동안 전혀 인지하지 못할 수 있다. 진행성 신경병증 환자는 지속적인 압박 상해를 감지할 수 있는 능력을 상실하게 되고, 그 결과 조직 허혈증과 괴사가 발생하여, 예를 들어 발바닥 궤양 형성이 야기될 수 있다. 미소혈관 질환은 궤양 형성을 유발시킬 수도 있는 당뇨병의 심각한 합병증 중의 하나이다. 특정의 양태에서, 당뇨병의 신경학적 및/또는 혈관성 합병증에 기인한 당뇨병성 발 궤양 및/또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
외상성 궤양: 외상성 궤양의 형성은 신체에 대한 외상성 손상의 결과로서 발생할 수 있다. 이들 손상에는, 예를 들어 동맥, 정맥 또는 림프계에 대한 손상; 골격의 골 구조에 대한 변화; 조직 층 - 표피, 진피, 피하 연질 조직, 근육 또는 뼈의 상실; 신체 부분 또는 기관에 대한 손상; 및 신체 부분 또는 기관의 상실이 포함된다. 특정의 양태에서, 신체에 대한 외상성 손상과 연관된 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
화상 궤양: 궤양 형성은 1도 화상 (즉, 피부의 표재적, 홍조 부위); 2도 화상 (광택이 나는 유체를 제거한 후에 자발적으로 치유될 수 있는 광택이 나는 손상 부위); 3도 화상 (전체 피부에 걸친 화상이고, 상처 치유를 위해서는 통상적으로 외과적 수술이 요구된다); 탕상 (scalding) (끓는 온수, 기름 또는 라디에이터 유체로부터 발생할 수 있다); 열 화상 (화염으로부터 발생할 수 있으며, 통상적으로 심부 화상이다); 화학적 화상 (산 및 알칼리로부터 발생할 수 있으면, 통상적으로 심부 화상이다); 전기적 화상 (집 주변의 낮은 전압이나 작업장의 고 전압); 폭발 섬광 (통상적으로 표재성 손상임); 및 접촉성 화상 (통상적으로 심부 화상이고 머플러 미부 파이프, 뜨거운 철 및 스토브로부터 발생할 수 있다)를 포함한 화상 손상의 결과로서 발생할 수도 있다. 특정의 양태에서, 신체에 대한 화상 손상과 연관된 궤양 형성을 특징으로 하는 만성적 상처를 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다.
항커넥신제
본원에 기재된 본 발명의 항커넥신제는 분자를 세포 내로 수송하고 세포로부터 수송하는 것을 조정하거나 이에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 차단 또는 억제 또는 하향 조절할 수 있다). 따라서, 본원에 기재된 특정의 항커넥신제는 세포 소통 (예를 들어, 세포 대 세포)을 조정한다. 특정의 항커넥신제는 세포 세포질과 주변세포질 또는 세포외 공간 사이로 분자를 전달할 수 있거나 이러한 전달을 조정한다. 이러한 항커넥신제는 일반적으로, 커넥신 및/또는 커넥신 헤미채널 (커넥손)을 표적으로 한다. 커넥신을 포함하는 헤미채널 및 이로써 생성되는 갭 연접부는 독립적으로, 개방 헤미채널의 경우에는 세포 세포질과 세포외 공간 또는 조직 간의 소분자의 교환 또는 방출에 관여하고, 개방 갭 연접부의 경우에는 인접한 세포의 세포질 간의 소분자의 교환 또는 방출에 관여한다. 따라서, 본원에 제공된 항커넥신제는 세포들 간의 커플링과 소통을 직접 또는 간접적으로 저하시키거나, 또는 세포와 세포외 공간 또는 조직 간의 소통 (또는 분자의 전달)을 저하 또는 차단시킬 수 있고, 분자를 세포로부터 세포외 공간 또는 조직 내로 (또는 세포외 공간 또는 조직으로부터 세포 내로) 수송하거나 인접한 세포들 간에 수송하는 것을 조정하는 것도 본 발명의 항커넥신제 및 양태의 범위 내에 있다.
갭 연접부 또는 커넥신 헤미채널을 통한 분자의 통과 (예: 수송)의 목적하는 억제를 유도시킬 수 있는 모든 항커넥신제가 본 발명의 양태에 사용될 수 있다. 갭 연접부 또는 커넥신 헤미채널을 통하여 분자의 통과를 조정하는 모든 항커넥신제 (예를 들어, 분자를 세포 세포질로부터 세포외 공간 또는 인접한 세포 세포질 내로 통과시키는 것을 조정하거나, 차단시키거나 또는 저하시키는 항커넥신제)가 또한 특별한 양태에 제공된다. 이러한 항커넥신제는 갭 연접부 연합해제 (갭 연접부를 통한 분자의 수송 차단)을 수반하거나 수반하지 않으면서 갭 연접부 또는 커넥신 헤미채널을 통한 분자의 통과를 조정할 수 있다. 이러한 화합물에는, 예를 들어 단백질 및 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 기타 유기 화합물이 포함되고, 이들은, 예를 들어 갭 연접부 또는 헤미채널의 기능 또는 발현을 전적으로 또는 부분적으로 차단시킬 수 있거나, 또는 커넥신의 생성을 전적으로 또는 부분적으로 하향 조절할 수 있다. 특정의 갭 연접부 억제제가 다음 문헌에 열거되어 있다 [참고: Evans, W.H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29: 606-612 (2001)].
특정의 항커넥신제는 커넥신 발현의 하향 조절을 제공하거나 (예를 들어, mRNA 전사 또는 해독의 하향 조절에 의해 이루어짐) 또는 커넥신 단백질, 커넥신 헤미채널 또는 갭 연접부의 활성을 저하 또는 억제시킨다. 하향 조절의 경우, 이는 커넥신 발현이 하향 조절되는 부위에서, 헤미채널에 의한 세포 세포질의 세포외 공간에 대한 노출, 또는 갭 연접부에 의한 직접적인 세포-세포 소통을 저하시키는 효과를 나타낼 것이다.
항커넥신제의 예에는 커넥신 mRNA 및/또는 단백질의 발현 또는 기능을 저하 또는 억제시키는 작용제, 또는 커넥신, 커넥신 헤미채널 또는 갭 연접부의 활성, 발현 또는 형성을 저하시키는 작용제가 포함된다. 항커넥신제에는 항커넥신 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 기타 폴리뉴클레오티드 (예: siRNA 또는 리보자임 기능성을 지닌 폴리뉴클레오티드) 뿐만 아니라 항체 및 그의 결합성 단편, 및 펩티드 및 폴리펩티드, 예를 들어 헤미채널 또는 갭 연접부 활성 또는 기능을 조정하는 펩티드 모방제 및 펩티드 유사체가 포함된다.
항커넥신 폴리뉴클레오티드
항커넥신 폴리뉴클레오티드에는 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 커넥신 발현을 하향 조절할 수 있게 하는 기능성을 지닌 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 기타 적합한 항커넥신 폴리뉴클레오티드에는 RNAi 폴리뉴클레오티드 및 siRNA 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
안티센스 폴리뉴클레오티드 및 기타 항커넥신 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 RNAi, siRNA, 및 리보자임 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 변형된 및 혼합된 주쇄를 갖는 폴리뉴클레오티드의 합성은 당업자에게 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Stein CA. and Krieg A.M. (eds), Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 1998 (Wiley-Liss)]. 항체 및 결합성 단편 뿐만 아니라 펩티드 및 폴리펩티드, 예를 들어 펩티드 모방제 및 펩티드 유사체를 합성하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Lihu Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 1; 95(18): 10836-10841 (Sept 1 1998); Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manuel" Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) "Using Antibodies" A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Publications, New York].
한 국면에 따르면, 커넥신 발현의 하향 조절은 일반적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드 (예: DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드)를 사용하는 안티센스 접근 방식에 기초할 수 있고, 보다 특히 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)의 사용에 기초할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드 (예: ODN)는 커넥신 단백질(들)이 하향 조절되도록 표적화한다. 전형적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 커넥신의 전사 및/또는 해독을 억제할 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 커넥신 유전자 또는 mRNA로부터의 전사 및/또는 해독의 특이적 억제제이고, 기타 유전자 또는 mRNA로부터의 전사 및/또는 해독은 억제하지 않는다. 생성물은 (i) 암호화 서열에 대해 5', 및/또는 (ii) 암호화 서열에 대해, 및/또는 (iii) 암호화 서열에 대해 3'에서 커넥신 유전자 또는 mRNA와 결합할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 커넥신 mRNA에 대해 안티센스이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA와 혼성화할 수 있으므로, 전사, mRNA 프로세싱, 핵으로부터의 mRNA 수송, 해독 또는 mRNA 분해를 포함한 커넥신 mRNA 대사의 한 가지 이상 국면을 간섭함으로써 커넥신의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 커넥신 mRNA와 혼성화하여, mRNA의 해독 및/또는 탈안정화의 직접적인 억제를 유발시킬 수 있는 이중체를 형성한다. 이러한 이중체는 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 감수성일 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA의 전부 또는 일부와 혼성화할 수 있다. 전형적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA의 암호화 영역 또는 리보솜 결합 영역과 혼성화한다. 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA의 전부 또는 특정 영역에 대해 상보적일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA의 전부 또는 일부의 정확한 보체일 수 있다. 그러나, 절대 상보성이 요구되지는 않으며, 생리적 조건 하에 약 20℃, 30℃ 또는 40℃ 이상의 융점을 지닌 이중체를 형성시키기에 충분한 상보성을 지닌 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 사용하기 특히 적합하다.
따라서, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, mRNA에 대해 상보적인 서열의 상동체이다. 폴리뉴클레오티드는 중간 수준 내지 고 수준의 엄격도 조건 하에, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 60℃에서 0.03 M 염화나트륨 및 0.03 M 나트륨 시트레이트 하에 커넥신 mRNA와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
특정 국면에서, 적합한 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 길이가 약 6 내지 40개 뉴클레오티드이다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 12 내지 약 35개 뉴클레오티드, 또는 또 다른 한편 길이가 약 12 내지 약 20개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게 길이가 약 18 내지 약 32개 뉴클레오티드일 수 있다. 대체 국면에 따르면, 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 40개 이상, 예를 들어 약 60개 이상 또는 약 80개 이상 뉴클레오티드, 및 약 100개, 약 200개, 약 300개, 약 400개, 약 500개, 약 1000개, 약 2000개 또는 약 3000개 이상 뉴클레오티드일 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 의해 표적화된 커넥신 단백질(들)은 하향 조절을 수행하는 부위에 좌우될 것이다. 이는 커넥신 소단위체 조성의 측면에서 신체 전반에 걸쳐 상이한 부위에 갭 연접부(들)의 균일하지 않은 구성을 반영하고 있다. 커넥신은 한 국면에서는 인간 또는 동물에게서 천연적으로 발생되거나 또는 커넥신 발현 또는 활성을 저하시켜야 하는 조직에서 천연적으로 발생되는 커넥신이다. 커넥신 유전자 (암호화 서열 포함)는 일반적으로, 본원에서 언급된 하나 이상의 특이적 커넥신의 암호화 서열과의 상동성을 지니는데, 예를 들어 표 8에 제시된 커넥신 43 암호화 서열과 상동성을 지닌다. 커넥신은 전형적으로, α 또는 β 커넥신이다. 바람직하게, 커넥신은 α 커넥신이고 치료하고자 하는 조직에서 발현된다.
그러나, 몇몇 커넥신 단백질은 조직 내에서의 분포 측면에서 다른 것 보다 더 편재되어 있다. 가장 광범위한 것 중의 하나가 커넥신 43이다. 커넥신 43을 표적으로 한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 사용하기 특히 적합하다. 기타 국면에서는 기타 커넥신을 표적화한다.
항커넥신 폴리뉴클레오티드에는 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 커넥신 발현을 하향 조절할 수 있게 하는 기능성을 지닌 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 기타 적합한 항커넥신 폴리뉴클레오티드에는 RNAi 폴리뉴클레오티드 및 SiRNA 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
한 가지 바람직한 국면에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 하나의 커넥신 단백질 만의 mRNA를 표적으로 한다. 가장 바람직하게, 이러한 커넥신 단백질은 커넥신 43이다. 또 다른 국면에서, 커넥신 단백질은 커넥신 26, 30, 31.1, 32, 36, 37, 40, 또는 45이다. 기타 국면에서, 커넥신 단백질은 커넥신 30.3, 31, 40.1, 또는 46.6이다.
또한, 폴리뉴클레오티드가 병용해서 사용될 별개의 커넥신 단백질을 표적으로 하는 것이 고려된다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 상이한 커넥신을 표적화할 수 있다). 예를 들어, 커넥신 43, 및 커넥신 계열 중의 한 가지 이상의 기타 구성원 (예를 들어, 커넥신 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45, 및 46.6)을 표적으로 한 폴리뉴클레오티드를 병용해서 사용할 수 있다.
또 다른 한편, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 커넥신 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 조성물의 일부일 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드를 유도시키는 커넥신 단백질 중의 하나가 커넥신 43이다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 유도시키는 기타 커넥신 단백질에는, 예를 들어 커넥신 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45, 및 46.6이 포함될 수 있다. 각종 커넥신에 대해 유도된 적합한 예시되는 폴리뉴클레오티드 (및 ODN)가 표 1에 제시된다.
개별적 안티센스 폴리뉴클레오티드는 특별한 커넥신에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 1, 2, 3개 이상의 상이한 커넥신을 표적으로 할 수 있다. 특이적 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 커넥신들 간에 보존되지 않는 커넥신 유전자 또는 mRNA 내의 서열을 표적으로 할 것인 반면, 비특이적 폴리뉴클레오티드는 각종 커넥신에 대해 보존된 서열을 표적으로 할 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 적합하게, 변형되지 않은 포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 이러한 올리고데옥시뉴클레오티드는 길이가 다양할 수 있다. 30량체 폴리뉴클레오티드가 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 많은 국면은 올리고데옥시뉴클레오티드를 참고하여 기재된다. 그러나, 기타 적합한 폴리뉴클레오티드 (예: RNA 폴리뉴클레오티드)도 이들 국면에 사용할 수 있다는 것을 인지해야 한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이는 뉴클레아제에 대한 그의 저항성을 증강시킬 수 있고, 세포를 유입시킬 수 있는 능력을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 기타 데옥시뉴클레오티드 유사체에는 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'P5'-포스포르아미데이트 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트 및 그의 2'-O-알킬 유사체 및 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트가 포함된다. 또 다른 한편, 혼합 주쇄 올리고뉴클레오티드 ("MBO")를 사용할 수 있다. MBO는 포스포티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드의 절편 및 변형된 올리고데옥시- 또는 올리고리보뉴클레오티드의 적당하게 위치된 절편을 함유한다. MBO는 포스포로티오에이트 연쇄의 절편, 및 비이온성이고 뉴클레아제 또는 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드에 대해 극히 저항성인 기타 변형된 올리고뉴클레오티드의 기타 절편, 예를 들어 메틸포스포네이트를 갖고 있다. 변형된 주쇄 및 혼합 주쇄 올리고뉴클레오티드의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 사용되는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 정확한 서열은 표적 커넥신 단백질에 좌우될 것이다. 한 양태에서, 적합한 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제시된 다음 서열 중에서 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드 등의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다:
Figure pat00001
본원에 기재된 조합 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하는 데에 적합한 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어 상기 표 1에 기재된 바와 같은, 커넥신 Cx43에 대한 폴리뉴클레오티드 및 커넥신 26, 30, 31.1, 32 및 37에 대한 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명에 사용되는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 정확한 서열은 표적 커넥신 단백질에 좌우될 것이지만, 커넥신 43의 경우에는 다음 서열을 갖는 안티센스 폴리뉴클레오티드가 특히 적합한 것으로 밝혀졌다:
GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (서열 1);
GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (서열 2); 및
GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (서열 3).
예를 들어, 커넥신 26, 31.1 및 32에 대한 적합한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 다음 서열을 갖는다:
5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (커넥신 26) (서열 4);
5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (커넥신 31.1) (서열 9); 및
5' TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (커넥신 32) (서열 12).
본 발명의 방법에 따라서 유용한 기타 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열에는 다음이 포함된다:
Figure pat00002
커넥신 단백질에 대해 유도된 폴리뉴클레오티드 (ODN 포함)는 편리하고 통상적인 모든 접근 방식에 의해 그들의 뉴클레오티드 서열 측면에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 프로그램 맥벡터 (MacVector) 및 올리고테크 (OligoTech) (공급처: Oligos etc. Eugene, Oregon, USA)를 사용할 수 있다. 일단 선택되면, DNA 합성기를 사용하여 ODN을 합성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 상동체
상동성 (상동률) 및 상동체가 본원에서 논의된다 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 커넥신 mRNA 내의 서열에 대한 보체의 상동체일 수 있다). 이러한 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 예를 들어 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 40개 이상, 약 100개 이상의 연속되는 뉴클레오티드 (상동성 서열의 뉴클레오티드) 영역 전반에 걸쳐, 관련 서열과의 상동률이 약 70% 이상, 바람직하게 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상 또는 약 99% 이상이다.
상동률은 당해 분야에서의 모든 방법에 기초하여 계산할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동률을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (예를 들어, 그의 데폴트 세팅을 기준으로 하여 사용된다) [참고: Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]. PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여, 예를 들어 문헌 [참고: Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10]에 기재된 바와 같이, 상동률 또는 한줄로 늘어선 서열을 계산할 수 있다 (전형적으로, 그들의 데폴트 세팅을 기준으로 한다).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 공급처 [the National Center for Biotechnology Information]로부터 공개적으로 입수 가능하다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이러한 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우에 몇몇 양성값 역치 스코어 T와 매칭되거나 이를 만족시키는 조회 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 고 스코어링 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃하는 워드 스코어 역치로서 지칭된다 [Altschul et al, 상기 참고]. 이들 개시 이웃 워드 표적물은 이를 함유하는 HSP를 발견하기 위한 조사를 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이러한 워드 표적물은 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한은 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각 방향에서 워드 표적물에 대한 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성값으로부터 양 X 정도 감소되는 경우; 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 제로 또는 그 이하로 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하는 경우에 중지된다.
BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정해준다. BLAST 프로그램은 데폴트로서 워드 길이 (W), BLOSUM62 스코어링 매트릭스 [참고: Henikoff and Henikoff (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 10915-10919] 정렬 (B) 50, 예상치 (E) 10, M=5, N=4, 및 양 가닥의 비교를 이용한다.
BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사율의 통계적 분석을 수행한다 [참고: 예를 들어, Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5787]. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사율의 한 가지 측정치는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수 있는 확률의 지표를 제공해 주는 가장 작은 합 확률 [P(N)]이다. 예를 들어, 제2 서열에 대한 제1 서열의 비교에서 가장 작은 합 확률이 약 1 미만, 바람직하게 약 0.1 미만, 보다 바람직하게 약 0.01 미만, 가장 바람직하게 약 0.001 미만인 경우에, 특정 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상동성 서열은 전형적으로, 약 2, 5, 10, 15, 20개 이상의 돌연변이 (이는 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다)로써 관련 서열과 상이하다. 이들 돌연변이는 상동률 계산과 관련하여 상기 언급된 영역 전반에 걸쳐 측정할 수 있다.
상동성 서열은 전형적으로, 배경 보다 상당히 높은 수준으로 본래의 서열과 선택적으로 혼성화한다. 선택적 혼성화는 전형적으로, 중간 수준 내지 고 수준의 엄격도 조건 (예를 들어, 약 50℃ 내지 약 60℃에서 0.03 M 염화나트륨 및 0.03 M 나트륨 시트레이트)을 사용하여 달성된다. 그러나, 이러한 혼성화는 당해 분야에 공지된 적합한 모든 조건 하에 수행할 수 있다 [참고: Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual]. 예를 들어, 고도의 엄격도가 요구되는 경우에 적합한 조건에는 60℃에서의 0.2 x SSC이 포함된다. 보다 낮은 수준의 엄격도가 요구되는 경우에 적합한 조건에는 60℃에서의 2 x SSC이 포함된다.
펩티드 및 폴리펩티드 항커넥신제
펩티드, 펩티드 모방제, 항체, 항체 단편 등을 포함한 결합성 단백질이 또한, 갭 연접부 및 헤미채널의 적합한 조정제이다.
결합성 단백질에는, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들면, Fab, F(ab')2 및 Fv 단편 포함); 단일 쇄 항체; 단일 쇄 Fv; 및 단일 쇄 결합성 분자, 예를 들면 결합성 도메인, 힌지 (hinge), CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 분자; 재조합 항체; 및 특별한 항체 또는 기타 결합성 분자와 접촉하게 만드는 항원 결정기 (즉, 일반적으로 에피토프로서 지칭되는 분자의 일부)와 결합할 수 있는 항체 단편이 포함된다. 이들 결합성 단백질 (항체, 항체 단편 등을 포함함)은 키메라 또는 인간화일 수 있거나 또는 이들이 투여되는 대상체에서 덜 면역원성이 되도록 할 수 있고, 이는 합성할 수 있거나, 재조합적으로 생성할 수 있거나 또는 발현 라이브러리에서 생성시킬 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있거나 나중에 개발된 모든 결합성 분자, 예를 들어 본원에 참고되고/되거나 당해 분야에 보다 상세히 기재된 결합성 분자가 고려된다. 예를 들어, 결합성 단백질에는 항체 뿐만 아니라 리간드, 수용체, 펩티드 모방제, 또는 표적 (예: 커넥신, 헤미채널, 또는 관련 분자)과 결합하는 기타 결합성 단편 또는 분자 [예를 들어, 파아지 디스플레이 (phage display)에 의해 생성됨]가 포함된다.
결합성 분자는 일반적으로, 목적하는 특이성 (이에는 결합 특이성이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다), 및 목적하는 친화도를 지닐 것이다. 친화도는, 예를 들어 약 104 M-1 이상, 약 106 M-1 이상, 약 107 M-1 이상, 약 108 M-1 이상의 Ka일 수 있다. 심지어 약 108 M-1 초과의 친화도, 예를 들어 약 109 M-1 이상, 약 1010 M-1 이상, 약 1011 M-1 이상 및 약 1012 M-1 이상의 친화도가 적합하다. 본 발명에 따르는 결합성 단백질의 친화도는 통상적인 기술, 예를 들어 문헌 [참고: Scatchard et al., 1949 Ann. N.Y . Acad . Sci . 51: 660]에 기재된 기술을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.
수치료법 플롯으로부터 수득된 데이터를 사용함으로써, 커넥신이 4개의 막관통 전반에 걸친 영역과 2개의 짧은 세포외 루프를 함유하는 것으로 제안되었다. 커넥신의 제1 및 제2 세포외 영역의 위치 설정은 분열 갭 연접부 상의 상응하는 에피토프의 면역국재를 위해 사용된 항펩티드 항체의 보고된 생성을 추가의 특징으로 하였다 [참고: Goodenough D. A. J Cell Biol 107: 1817-1824 (1988); Meyer R. A., J Cell Biol 119: 179-189 (1992)].
2개의 인접한 세포에 의해 기여된 헤미채널의 세포외 도메인은 서로 "도킹"하여 완전한 갭 연접부 채널을 형성한다. 이들 세포외 도메인의 상호 작용을 방해하는 시약은 세포-대-세포 소통에 손상을 가할 수 있다. 갭 연접부 및 헤미채널의 펩티드 억제제가 보고되었다 [참고: 예를 들어, Berthoud, V.M. et al., Am J. Physiol. Lung Cell Mol . Physiol. 279: L619 - L622 (2000); Evans, W.H. and Boitano, S. Biochem . Soc . Trans. 29: 606 - 612, and De Vriese A. S., et al. Kidney Int. 61: 177 - 185 (2001)]. 커넥신의 세포외 루프 내의 서열에 상응하는 소형 펩티드가 세포간 소통을 억제하는 것으로 보고되었다 [참고: Boitano S. and Evans W. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L623-L630 (2000)]. 쌍을 이룬 제노푸스 (Xenopus) 난모세포에서 발현된 커넥신 (Cx) 32에 의해 생성된 세포-세포 채널 형성 억제제로서 펩티드를 사용하는 것이 또한 보고되었다 [참고: Dahl G, et al., Biophys J 67: 1816-1822 (1994). Berthoud, V.M. and Seul, K.H., summarized some of these results. Am J, Physiol . Lung Cell Mol . Physiol. 279: L619 - L622 (2000)].
항커넥신제에는 커넥신 (예를 들어, 커넥신 45, 43, 26, 30, 31.1, 및 37)의 막관통 영역 (예를 들어, 제1 내지 제4)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 포함된다. 항커넥신제는 커넥신 45의 막관통 영역의 일부에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다. 항커넥신제에는 서열 13의 약 5개 내지 20개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 13의 약 8개 내지 15개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 13의 약 11개 내지 13개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 포함된다. 기타 양태는 서열 13의 약 5개 이상, 약 6개 이상, 약 7개 이상, 약 8개 이상, 약 9개 이상, 약 10개 이상, 약 11개 이상, 약 12개 이상, 약 13개 이상, 약 14개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 항커넥신제에 관한 것이다. 본원에 제공된 특정의 항커넥신제에서는, 서열 13의 위치 46-75 및 199-228에서의 아미노산에 상응하는 커넥신 45의 세포외 도메인을 사용하여 특별한 펩티드 서열을 발생시킬 수 있다. 본원에 기재된 특정의 펩티드는 서열 13의 위치 46-75 및 199-228에서의 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이들 펩티드는 서열 13의 일부와 반드시 동일한 아미노산 서열을 가질 필요는 없고, 펩티드가 결합 활성 또는 기능적 활성을 보유하도록 한 보존적 아미노산 변화가 이루어질 수 있다. 또 다른 한편, 세포외 도메인 이외의 커넥신 단백질의 영역 (예를 들어, 위치 46-75 및 199-228에 상응하지 않는 서열 13의 일부)을 표적으로 할 수 있다.
또한, 적합한 항커넥신제는 커넥신 43의 막관통 영역의 일부에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 항커넥신제에는 서열 14의 약 5개 내지 20개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 서열 14의 약 8개 내지 15개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 서열 14의 약 11개 내지 13개 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 포함된다. 기타 항커넥신제에는 서열 14의 약 5개 이상, 약 6개 이상, 약 7개 이상, 약 8개 이상, 약 9개 이상, 약 10개 이상, 약 11개 이상, 약 12개 이상, 약 13개 이상, 약 14개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 또는 약 30개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 포함된다. 기타 항커넥신제는 서열 14의 위치 37-76 및 178-208에서의 아미노산에 상응하는 커넥신 43의 세포외 도메인을 포함한다. 항커넥신제에는 서열 14의 위치 37-76 및 178-208에서의 영역에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 본원에 기재된 펩티드가 포함된다. 이들 펩티드는 서열 14의 일부와 반드시 동일한 아미노산 서열을 가질 필요는 없고, 펩티드가 결합 활성 또는 기능적 활성을 보유하도록 한 보존적 아미노산 변화가 이루어질 수 있다. 또 다른 한편, 세포외 도메인 이외의 커넥신 단백질의 영역 (예를 들어, 위치 37-76 및 178-208에 상응하지 않는 서열 14의 일부)을 표적으로 할 수 있다.
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
항커넥신 펩티드는 이러한 펩티드가 기능적으로 활성인 항커넥신제가 되도록 하는 보존적 아미노산 치환을 수반한 커넥신 세포외 도메인의 일부에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 예시되는 보존적 아미노산 치환에는, 예를 들어 비극성 아미노산을 또 다른 비극성 아미노산으로 치환시키는 것, 방향족 아미노산을 또 다른 방향족 아미노산으로 치환시키는 것, 지방적 아미노산을 또 다른 지방족 아미노산으로 치환시키는 것, 극성 아미노산을 또 다른 극성 아미노산으로 치환시키는 것, 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로 치환시키는 것, 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로 치환시키는 것, 및 이온화 아미노산을 또 다른 이온화 아미노산으로 치환시키는 것이 포함된다.
커넥신 43을 표적으로 하는 것으로 예시되는 펩티드는 다음 표 2에 제시된다. M1, 2, 3 및 4는 커넥신 43 단백질의 제1 내지 제4 막관통 영역 각각을 지칭한다. E1 및 E2는 제1 및 제2 세포외 루프를 각각 지칭한다.
Figure pat00007
표 3은 헤미채널 또는 갭 연접부 기능을 억제하는 데에 사용된 부가의 예시되는 커넥신 펩티드를 제공한다. 기타 양태에서는, 보존적 아미노산 변화가 펩티드 또는 그의 단편에 대해 이루어진다.
Figure pat00008
표 4는 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 펩티드 억제제를 개발하기 위해 사용되는 커넥신 계열 구성원에 대한 세포외 루프를 제공한다. 표 4에 제공된 펩티드 및 그의 단편이 특정의 비제한적 양태에서 펩티드 억제제로서 사용된다. 기타 비제한적 양태에서, 표 4 중의 펩티드의 약 8개 내지 약 15개, 또는 약 11개 내지 약 13개의 연속되는 아미노산을 포함하는 펩티드가 펩티드 억제제이다. 보존적 아미노산 변화가 이러한 펩티드 또는 그의 단편에 대해 이루어질 수 있다.
Figure pat00009
Figure pat00010
표 5는 펩티드 항커넥신제를 개발하기 위해 사용될 수 있는 커넥신 계열 구성원에 대한 세포외 도메인을 제공한다. 표 5에 제공된 펩티드 및 그의 단편이 펩티드 항커넥신제로서 사용될 수도 있다. 이러한 펩티드는 표 5 중의 펩티드 서열의 약 8개 내지 약 15개, 또는 약 11개 내지 약 13개의 연속되는 아미노산을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 변화가 이러한 펩티드 또는 그의 단편에 대해 이루어질 수 있다.
Figure pat00011
표 6은 커넥신 40의 세포외 루프 (E1 및 E2)를 참고로 하여 제시된 커넥신 40의 펩티드 억제제를 제공한다. 진하게 표시된 아미노산은 커넥신 40의 막관통 영역에 관한 것이다.
Figure pat00012
표 7은 커넥신 45의 세포외 루프 (E1 및 E2)를 참고로 하여 제시된 커넥신 45의 펩티드 억제제를 제공한다. 진하게 표시된 아미노산은 커넥신 45의 막관통 영역에 관한 것이다.
Figure pat00013
특정 양태에서는, 특정의 펩티드 억제제가 기존의 갭 연접부는 붕괴시키지 않으면서 헤미채널을 차단시키는 것이 바람직하다. 특별한 이론이나 기전에 얽매이는 것은 아니지만, 특정의 펩티드 모방제 [예: VCYDKSFPISHVR (서열 23)]가 보다 낮은 용량에서 갭 연접부의 연합해제를 유발시키지 않으면서 헤미채널을 차단시키는 것으로 또한 여겨진다 [참고: Leybeart et al., Cell Commun . Adhes. 10: 251-257 (2003)]. 펩티드 SRPTEKTIFII (서열 19)를 또한 사용하여, 예를 들어 갭 연접부를 연합해제하지 않으면서 헤미채널을 차단시킬 수 있다. 펩티드 SRGGEKNVFIV (서열 107)을 대조군 서열로서 사용할 수 있다 [참고: DeVriese et al., Kidney Internal. 61: 177-185 (2002)]. 커넥신 45에 대한 펩티드 억제제의 예에는 다음이 포함된다:
Figure pat00014
Figure pat00015
펩티드는 길이가 단지 3개 아미노산, 예를 들어 SRL, PCH, LCP, CHP, IYY, SKF, QPC, VCY, APL, HVR일 수 있거나, 이 보다 더 길 수 있는데, 예를 들어 LIQYFLYGFQVHPF (서열 129), VHPFYCSRLPCHP (서열 130), VGGESIYYDEQSKFVCNTEQPG (서열 131), TEQPGCENVCYDAFAPLSHVRF (서열 132), AFAPLSHVRFWVFQ (서열 133)이다.
[표 8A]
Figure pat00016
[표 8B]
Figure pat00017
치료제
치료제에는 현재 존재하고 공지되어 있든지 아니면 나중에 개발되든지 간에, 상처를 치료하거나 상처 치유를 증진시키는 데에 유용한 제약상 허용 가능한 작용제가 포함된다. 치료제에는, 예를 들어 항감염제, 마취제, 진통제, 항생제, 마약, 및 스테로이드계 및 비스테로이드계 소염제가 포함된다. 바람직한 치료제에는 국소 스테로이드계 소염제, 항미생물제, 국소 및 국부 마취제, 및 국부 아편양제제가 포함된다. 특정 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6가지 치료제를 병용해서 사용할 수 있다.
상처 치유에 유용한 작용제
본원에 사용된 바와 같은, 상처 치유에 유용한 작용제에는 1) 천연 상처 치유 과정을 증진 또는 가속시키거나, 또는 2) 부적절하거나 지연된 상처 치유와 연관된 효과, 예를 들어 불리한 염증, 상피화, 혈관형성 및 매트릭스 침착, 및 반흔 형성 및 섬유증을 저하시키는 상처 치유 케스케이드의 자극제, 증강제 또는 양성 매개제가 포함된다.
양성 매개제, 증강제 및 자극제에는, 예를 들어 상처 치유 또는 급성 상처 치유 과정, 또는 상처 부위에서의 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨의 양, 질 또는 효능, 또는 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨 수용체의 활성화를 자극, 증강, 촉진 또는 가속 (즉, 작동)시킬 수 있는 작용제가 포함된다. 이러한 작용제에는, 예를 들어 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨, 또는 부분적으로 변형된 형태의 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨이 포함될 수 있다. 부분적으로 변형된 형태의 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨은, 예를 들어 천연 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨 보다 더 긴 반감기를 갖고 있다. 또 다른 한편, 이는 상처 치유 관련 성장 인자 또는 사이토킨 대사 억제제일 수 있다.
이러한 작용제의 부분적 변형은 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해서일 수 있다. 치환은, 예를 들어 보존적 치환일 수 있다. 따라서, 부분적으로 변형된 분자는 이것이 유래된 분자의 상동체일 수 있다. 이는 이것이 유래된 분자와의 상동률이 약 40% 이상, 예를 들어 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 상처 치유에 유용한 작용제에는, 예를 들어 현재 당해 분야에 공지되어 있거나 나중에 개발될 상처 치료 양식을 위한 상처 치유 증진성 또는 반흔 저하성 작용제; 상처 치유를 증진시키는 것으로 예시되는, 천연 또는 합성 성장 인자, 사이토킨 또는 그의 조정제를 포함한 인자, 작용제 또는 양식; 상처 치유 증진성 생물공학 처리된 매트릭스, 드레싱, 붕대 등이 포함될 수 있다. 적합한 예에는 1) 국소 또는 드레싱 및 관련 요법 및 괴사조직 제거제 [예: 산틸 (Santyl®) 콜라게나제] 및 요오도소르브 (Iodosorb®) (카덱소머 요오드); 2) 항미생물제, 예를 들어 전신 또는 국소 크림 또는 젤, 예를 들면 은 함유 작용제, 예를 들어 SAG (은 항미생물 젤), (CollaGUARD™, Innocoll, Inc) (정제된 유형-I 콜라겐 단백질에 의거한 드레싱), CollaGUARD Ag (감염된 상처 또는 감염 위험에 노출된 상처에 대해 은 함침된 콜라겐에 의거한 생활성 드레싱), DermaSIL™ (심부 및 중증으로 삼출되는 상처에 대한 콜라겐-합성 발포체 조합 드레싱); 3) 세포 요법 또는 생물공학 처리시킨 피부, 피부 대체물, 및 피부 등가물, 예를 들어 더모그래프트 (Dermograft) (사이토킨과 성장 인자를 분비하는 인간 섬유아세포의 3차원적 매트릭스 배양), 아프리그래프 (Apligraf®) (인간 각질 세포 및 섬유아세포), 그래프트스킨 (Graftskin®) (정상 피부와 조직학적으로 유사하고, 정상 피부에 의해 생성된 것과 유사한 성장 인자를 생성시키는 표피 세포와 섬유아세포의 이층), 트랜스사이트 (TransCyte) (인간 섬유아세포 유래된 일시적 피부 대체물) 및 오아시스 (Oasis®) (성장 인자와 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어 콜라겐, 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸을 포함하는 활성 생체물질); 4) 상처 치유를 증진시키기 위해 상처에 도입된 사이토킨, 성장 인자 또는 호르몬 (천연 및 합성 둘 다 포함), 예를 들어 NGF, NT3, BDGF, 인테그린 (integrin), 플라스민, 세마포링 (semaphoring), 혈액 유래 성장 인자, 각질 세포 성장 인자, 조직 성장 인자, TGF-알파, TGF-베타, PDGF (3가지 아유형, 즉 AA, AB, 및 B 중의 하나 이상을 사용할 수 있다), PDGF-BB, TGF-베타 3, TGFβ3, TGFβ1 및 TGFβ2의 상대적 수준을 조정하는 인자 (예: 만노스-6-포스페이트), 성 스테로이드, 예를 들어 에스트로겐, 에스트라디올, 또는 에스트로겐 수용체 작동제 (이는 에티닐로에스트라디올, 디에노에스트롤, 메스트라놀, 에스트라디올, 에스트리올, 접합된 에스트로겐, 피페라진 에스트론 설페이트, 스틸보에스트롤, 포스페스테롤 사나트륨, 폴리에스트라디올 포스페이트, 티볼론, 피토에스트로겐, 17-베타-에스트라디올로 이루어진 군 중에서 선택된다); 흉선 호르몬, 예를 들어 티모신-베타-4, EGF, HB-EGF, 섬유아세포 성장 인자 (예: FGF1, FGF2, FGF7), 각질 세포 성장 인자, TNF, 인터루킨 계열의 염증성 반응 조정제, 예를 들어 IL-1O, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, 및 IL-1O 및 그의 조정제; INF (INF-알파, -베타, 및 -델타); 악티빈 또는 인히빈의 자극제, 및 인터페론 감마 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 억제제 및 아데노신 3',5'-사이클릭 모노포스페이트 (cAMP) 경로의 매개인자의 억제제; 아데노신 A1 작동제, 아데노신 A2 작동제 또는 5) 상처 치유에 유용한 기타 작용제, 예를 들어 VEGF, VEGFA, IGF, IGF-1, 프로-염증성 사이토킨, GM-CSF, 및 렙틴의 천연 또는 합성 상동체, 작동제 및 길항제; 및 6) IGF-1 및 KGF cDNA, 자기 유래의 혈소판 젤, 차아염소산 (Sterilox® 리포산), 산화질소 합성효소3, 매트릭스 메탈로프로테이나제 9 (MMP-9), CCT-ETA, 알파브베타6 인테그린, 성장 인자-프라이밍된 섬유아세포 및 데코린 (Decorin), 은 함유 상처 드레싱, 제나덤 (Xenaderm™), 파파인 상처 괴사조직 제거제, 락토페린, 물질 P, 콜라겐, 및 은-ORC, 태반 알칼리성 포스파타제 또는 태반 성장 인자, 고슴도치 신호 전달의 조정제, 콜레스테롤 합성 경로의 조정제, 및 APC (활성화 단백질 C), 각질 세포 성장 인자, TNF, 트롬복산 A2, NGF, BMP 골 형태발생 단백질, CTGF (결합 조직 성장 인자), 상처 치유 케모카인, 데코린, 락테이트 유도된 신생혈관증식의 조정제, 간유, 태반 알칼리성 포스파타제 또는 태반 성장 인자, 및 티모신 베타 4가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6가지의 상처 치유에 유용한 작용제를 병용해서 사용할 수 있다.
상기 상처 치유에 유용한 작용제 (예를 들어, 성장 인자 및 사이토킨 포함)는 모든 천연 발생적 다형성 (예를 들어, 성장 인자 또는 사이토킨의 다형성)을 포괄한다는 것을 인지해야 한다. 또한, 기능성 단편, 상처 치유에 유용한 상기 작용제 중의 하나를 포함하는 키메라 단백질 또는 그의 기능성 단편, 상처 치유 작용제의 하나 이상의 아미노산의 유사 치환에 의해 수득된 상동체, 및 종 상동체가 포괄된다. 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제는 재조합 DNA 기술의 생성물일 수 있고, 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제는 트랜스제닉 (transgenic) 기술의 생성물일 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자는 재조합 PDGF, 또는 PDGF에 대한 암호화 서열을 포함하는 유전자 요법 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
특정 단편 또는 그의 부분적으로 변형된 형태는 해당 인자의 생물학적 또는 상처 치유 기능성을 보유하고 있는 상처 치유 작용제의 단편 또는 부분적으로 변형된 형태를 지칭하지만, 이것이 물론 부가의 기능성을 가질 수도 있다. 부분적 변형은, 예를 들어 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해서일 수 있다. 예를 들어, 치환은 보존적 치환일 수 있다. 따라서, 부분적으로 변형된 분자는 상처 치유 작용제의 상동체일 수 있다. 이는, 예를 들어 상기 인자와의 상동률이 약 40% 이상일 수 있다. 이는, 예를 들어 상기 인자와의 상동률이 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상일 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서 IL-10 또는 그의 단편 또는 부분적으로 변형된 형태는 약 1 μM 내지 약 10 μM의 농도로 투여할 수 있다. 이는 약 2.5 μM 내지 약 5 μM의 농도로 투여할 수 있다. 특정의 기타 양태에서, IL-10 또는 그의 단편 또는 부분적으로 변형된 형태는 상처 치유 직전에 투여할 수 있지만, 상처 형성 후 약 7일 이내에 투여하는 것이 유효할 수 있다. 이는 2회 이상 투여할 수 있다.
갭 연접부 변성제
본원에 사용된 바와 같은, "갭 연접부 변성제"에는 광범위하게, 헤미채널 또는 갭 연접부의 활성, 기능 또는 형성을 전적으로 또는 부분적으로 방지, 저하 또는 조정하는 작용제 또는 화합물이 포함될 수 있다.
기타 양태에서, 갭 연접부 변성제는 헤미채널 또는 갭 연접부의 형성 또는 활성을 전적으로 또는 부분적으로 방지 또는 저하시킨다.
특정의 양태에서, 갭 연접부 변성제는 전적으로 또는 부분적으로 헤미채널 또는 갭 연접부의 폐쇄를 유도시킨다. 기타 양태에서, 갭 연접부 변성제는 전적으로 또는 부분적으로 헤미채널 또는 갭 연접부를 차단시킨다. 특정의 양태에서, 갭 연접부 변성제는 전적으로 또는 부분적으로 헤미채널 또는 갭 연접부의 개방을 저하 또는 방지시킨다.
특정의 양태에서, 갭 연접부 변성제에 의한 갭 연접부 또는 헤미채널의 차단 또는 폐쇄는 개방 채널을 통하여 소분자를 세포외 또는 주변세포질 공간으로 유동시키는 것과 세포외 또는 주변세포질 공간으로부터 유동시키는 것을 방지 또는 저하시킴으로써 세포외 헤미채널 소통을 저하 또는 억제시킬 수 있다.
특정의 양태에서, 갭 연접부 변성제는 커넥신, 헤미채널 또는 갭 연접부의 활성 또는 기능을 방지, 저하 또는 변경시킨다. 본원에 사용된 바와 같은, 갭 연접부 활성 또는 기능의 변형에는 갭 연접부의 개방 또는 폐쇄, 커넥손 헤미채널의 개방 또는 폐쇄, 및/또는 갭 연접부를 통한 분자 또는 이온의 통과가 포함될 수 있다.
특정의 또 다른 국면에서, 갭 연접부 변성제에는, 예를 들어 지방족 알코올; 옥탄올; 헵탄올; 마취제 (예: 할로탄), 에트란, 플루오탄, 프로포폴 및 티오펜탈; 아난다미드; 아릴아미노벤조에이트 (FFA: 플루페남산 및 친지성인 유사한 유도체); 카벤옥솔론; 칼콘 (Chalcone): (2',5'-디히드록시칼콘); CHF (클로로히드록시푸라논); CMCF (3-클로로-4-(클로로메틸)-5-히드록시-2(5H)-푸라논); 덱사메타손; 독소루비신 (및 기타 안트라퀴논 유도체); 에이코사노이드 트롬복산 A(2) (TXA(2)) 모방제; NO (산화질소); 지방산 (예: 아라키돈산, 올레산 및 리폭시게나제 대사물); 페나메이트 [플루페남산 (FFA), 니플룸산 (NFA) 및 메클로페남산 (MFA)]; 제니스테인 (Genistein); 글리시레틴산 (GA): 18α-글리시레틴산 및 18-베타-글리시레틴산, 및 그의 유도체; 린단; 라이소포스패티드산; 메플로퀸; 메나디온; 2-메틸-1,4-나프토퀴논, 비타민 K(3); 나페노핀 (nafenopin); 오카다산; 올레아미드; 올레산; PH, 세포내 산성화, 예를 들어 산성화제에 의한 통문; 다중 불포화 지방산; 지방산 GJIC 억제제 (예: 올레산 및 아라키돈산); 퀴니딘; 퀴닌; 모든 트랜스-레티노산; 및 타목시펜 (tamoxifen)이 포함될 수 있다.
갭 연접부 기능을 변경시키기 위해 사용되는 것으로 예시되는 화합물 (예: 갭 연접부 차단제, 갭 연접부 단백질 인산화제 및 탈인산화제)가 이미 보고되었다 [참고: Jensen et al., 미국 특허 제7,153,822호, Larsen et al., 미국 특허 제7,250,397호, Gourdie et al., WO2006069181, 및 Tudor et al, WO2003032964, 및 기타 조합되고 공개된 특허 출원].
본원에 사용된 바와 같은, "갭 연접부 인산화제" 또는 "갭 연접부 탈인산화제"에는 커넥신 잔기 상에서 인산화 또는 탈인산화를 유도시킬 수 있는 작용제 또는 화합물이 포함될 수 있다. 예시되는 인산화 또는 탈인산화 부위에는 커넥신 단백질 상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기 중의 하나 이상이 포함된다. 특정의 양태에서, 인산화의 조정은 하나 이상의 커넥신 단백질 상의 하나 이상의 잔기 상에서 일어날 수 있다. 예시되는 갭 연접부 인산화제 또는 탈인산화제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, c-Src 티로신 키나제 또는 기타 G 단백질-커플링된 수용체 작동제가 포함될 수 있다 [참고: Giepmans B, J. Biol . Chem ., Vol. 276, Issue 11, 8544-8549, March 16, 2001]. 한 양태에서, 이들 잔기 중의 하나 이상에 대한 인산화의 조정은 특히 헤미채널을 폐쇄시킴으로써 헤미채널 기능에 강한 영향력을 미친다. 또 다른 양태에서, 이들 잔기 중의 하나 이상에 대한 인산화의 조정은 특히 갭 연접부를 폐쇄시킴으로써 갭 연접부 기능에 강한 영향력을 미친다.
투여 형태 및 제형 및 투여
병용 파트너 각각 (예를 들어, 항커넥신제 및 상처 치유 작용제)의 치료적 유효량은 동시에, 별개로 또는 순차적으로 어떠한 순서로든 투여할 수 있다. 상기 작용제는 별개로 또는 고정 병용물로서 투여할 수 있다. 고정 병용물로서 투여하지 않는 경우에 바람직한 방법에는 하나 이상의 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제를 순차적으로 투여하는 것이 포함되는데, 이들 작용제 중의 어느 하나 또는 둘 다는 물리적으로 또는 상처 치료 과정시 단독으로 투여된 경우, 즉 병용해서 투여되지 않은 경우에 사용된 용량 또는 양 보다 더 적은 용량 또는 양으로 제공된다. 이와 같이 투여되는 작용제의 보다 적은 양은 전형적으로, 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/12 내지 약 1/10이고, 이는 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/8, 약 1/6, 약 1/5, 약 1/4, 약 1/3 및 약 1/2일 수 있다. 바람직하게, 작용제는 서로 적어도 약 30분 이내에 순차적으로 투여한다. 작용제는 또한, 서로 약 1시간 내에, 서로 약 1일 내지 약 1주 내에, 또는 기타 적당한 바 대로 투여할 수 있다. 바람직하게, 항커넥신제를 먼저 투여한다. 바람직하게, 하나 이상의 항커넥신제를 사용하는 경우에는, 항커넥신 펩티드 또는 항커넥신 펩티드 모방제, 예를 들어 헤미채널 개방을 차단 또는 저하시킬 수 있는 항커넥신제를 투여한 후에, 예를 들어 커넥신 단백질 발현을 하향 조절함으로써 헤미채널 또는 갭 연접부의 형성 또는 커넥신 발현을 차단 또는 저하시키는 항커넥신제를 투여한다. 바람직하게, 항커넥신제(들)는 항커넥신 43 작용제(들)이다.
본 발명의 작용제는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 본원에 언급된 모든 질병 또는 질환에 걸린 대상체에게 투여할 수 있다. 이로써 대상체의 질환이 개선될 수 있다. 따라서, 항커넥신제와 병용 파트너를 요법에 의해 대상체의 신체를 치료하는 데에 사용할 수 있다. 이들은 본원에 언급된 모든 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는 데에 사용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따라서, 세포-세포 소통이 일시적 및 부위 특이적 방식으로 하향 조절될 수 있는 제형이 제공된다.
항커넥신제는 실질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있다. 생성물을 이러한 생성물의 의도한 목적을 방해하지 않고 실질적으로 단리된 것으로 간주될 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 본 발명의 생성물은 실질적으로 정제된 형태일 수도 있는데, 이러한 경우에는 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 (또는 기타 항커넥신제) 또는 제제의 무수 중량을 기준으로 하여 약 90%, 예를 들어 약 95% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상을 차지한다.
의도한 투여 경로에 따라서, 본 발명의 제약 생성물, 제약 조성물, 조합 제제 및 약물은 용제, 현탁제, 점적주입제, 연고, 크림, 젤, 발포제, 연고, 에멀션, 로션, 페인트, 지속 방출 제형, 또는 산제 형태를 취할 수 있고, 전형적으로 약 0.1% 내지 95%, 바람직하게 약 0.2% 내지 70%의 활성 성분을 함유할 수 있다. 기타 적합한 제형에는 플루로닉 (pluronic) 젤에 근거한 제형, 카복시메틸셀룰로스 (CMC)에 근거한 제형, 및 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC)에 근거한 제형이 포함된다. 기타 유용한 제형에는 서 방출 또는 지연 방출 제제가 포함된다.
젤 또는 젤리는 적합한 젤화제, 예를 들어 젤라틴, 트라가칸드 또는 셀룰로스 유도체를 사용하여 생성시킬 수 있고, 이는 보습제, 연화제 및 방부제로서 글리세롤을 포함할 수 있다. 연고는 지방성, 왁스상 또는 합성 기제 내로 혼입된 활성 성분으로 이루어진 반고형 제제이다. 적합한 크림의 예에는 유중수 및 수중유 에멀션이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 유중수 크림은 지방 알코올, 예를 들어 세틸 알코올 또는 세토스테아릴 알코올 및 유화 왁스 등과 유사한 특성을 지닌 적합한 유화제를 사용함으로써 제형화할 수 있다. 수중유 크림은 세토매크로졸 유화 왁스 등의 유화제를 사용함으로써 제형화할 수 있다. 적합한 특성에는 에멀션의 점도를 변형시킬 수 있는 능력, 및 광범위한 pH에 걸친 물리적 및 화학적 안정성이 포함된다. 수용성 또는 수 혼화성 크림 기제는 방부 시스템을 함유할 수 있고, 허용 가능한 생리학적 pH를 유지하도록 완충시킬 수도 있다.
발포 제제는 불활성 추진체를 사용하여 적합한 투약기를 통하여 가압 에어로솔 소형용기로부터 전달되도록 제형화할 수 있다. 발포 기제의 제형화에 적합한 부형제에는 프로필렌 글리콜, 유화 왁스, 세틸 알코올 및 글리세릴 스테아레이트가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 잠재적 방부제에는 메틸파라벤 및 프로필파라벤이 포함된다.
바람직하게, 본 발명의 작용제는 제약상 허용 가능한 담체 또는 희석제와 합하여 제약 조성물을 생성시킨다. 적합한 담체 및 희석제에는 등장성 식염수, 예를 들어 인산염 완충 식염수가 포함된다. 적합한 희석제 및 부형제에는 또한, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등, 및 그의 조합물이 포함된다. 또한, 필요에 따라 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제가 존재할 수도 있다.
용어 "제약상 허용 가능한 담체"는 그 자체로는 해당 조성물이 투여된 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도시키지 않고 과도한 독성없이도 투여할 수 있는 모든 제약 담체를 지칭한다. 적합한 담체는 느리게 대사되는 큰 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 및 아미노산 공중합체일 수 있다.
제약상 허용 가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 제시될 수도 있다.
적합한 담체 물질에는 국소 투여용 크림, 로션, 젤, 에멀션, 로션 또는 페인트에 대한 기제로서 흔히 사용되고 있는 모든 담체 또는 비히클이 포함된다. 그의 예에는 유화제, 불활성 담체, 예를 들어 탄화수소 기제, 유화성 기제, 비독성 용매 또는 수용성 기제가 포함된다. 특히 적합한 예에는 플루로닉스, HPMC, CMC 및 기타 셀룰로스계 성분, 라놀린, 경질 파라핀, 액상 파라핀, 연질 황색 파라핀 또는 연질 백색 파라핀, 백색 밀랍, 황색 밀랍, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 디메티콘, 유화 왁스, 이소프로필 미리스테이트, 미세결정성 왁스, 올레일 알코올 및 스테아릴 알코올이 포함된다.
바람직하게, 제약상 허용 가능한 담체 또는 비히클은 젤, 적합하게 비이온성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 젤, 예를 들어 플루로닉 젤, 바람직하게 플루로닉 F-127 (공급처: BASF Corp.)이다. 이러한 젤이 특히 바람직한데, 이는 저온에서는 액체 상태지만, 생리적 온도 하에서는 신속하게 경화되어, 작용제가 적용 부위 또는 적용 부위 바로 근처로 방출될 수 있게 해주기 때문이다.
보조제, 예를 들어 카세인, 젤라틴, 알부민, 아교, 나트륨 알지네이트, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스 또는 폴리비닐 알코올이 본 발명의 제형에 포함될 수도 있다.
기타 적합한 제형에는 플루로닉 젤에 근거한 제형, 카복시메틸셀룰로스 (CMC)에 근거한 제형, 및 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC)에 근거한 제형이 포함된다. 조성물은 국소, 점적주입, 비경구, 근육내, 피하 또는 경피 투여를 포함한 목적하는 모든 전달 형태용으로 제형화할 수 있다. 기타 유용한 제형에는 서방출 또는 지연 방출 제제가 포함된다.
항커넥신제가 핵산, 예를 들어 폴리뉴클레오티드인 경우, 포유류 세포에 의한 핵산의 흡수는, 예를 들어 형질감염제의 사용을 포함한 공지된 몇 가지 형질감염 기술에 의해 증강된다. 이러한 기술은 폴리뉴클레오티드를 포함한 특정의 항커넥신제를 사용할 수 있다. 투여되는 제형은 이러한 형질감염제를 함유할 수 있다. 이들 작용제의 예에는 양이온성 작용제 (예: 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙탄트 (lipofectant)[예: lipofectam™ 및 transfectam™], 및 계면활성제가 포함된다.
항커넥신제가 폴리뉴클레오티드을 포함하는 경우, 편리하게 제형은 폴리뉴클레오티드 세포 침투를 도와주기 위한 계면활성제를 추가로 포함하거나 또는 제형은 적합한 모든 부하제를 함유할 수 있다. 적합한 모든 비독성 계면활성제, 예를 들어 DMSO가 포함될 수 있다. 또 다른 한편, 경피 침투제, 예를 들어 우레아가 포함될 수 있다.
소정의 대상체 또는 질환에 대한 유효 용량은 통상적인 실험 또는 당해 분야에 공지되거나 나중에 개발된 기타 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 특정 범위의 투여량 값을 표준화하기 위해, 세포 배양 검정과 동물 연구를 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게, 집단의 50% 이상에 대해 치료적으로 유효하고 이 수준에서 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 용량 내에 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 이용된 항커넥신제 각각의 유효 투여량은 수 많은 요인, 예를 들어 이용된 특별한 항커넥신제(들), 병용 파트너, 투여 방식, 투여 횟수, 치료받고자 하는 질환, 치료받고자 하는 질환의 중증도, 투여 경로, 치료받고자 하는 환자 아집단의 요구 또는 개개 환자의 요구 (상이한 요구는 연령, 성별, 체중, 환자에 대해 특이적인 관련 의학 상태에 기인할 수 있다)에 따라서 다양할 수 있다.
환자에게 투여되는 항커넥신제의 용량은 각종 요인, 예를 들어 환자의 연령, 체중 및 일반적 상태, 치료하고자 하는 질환, 및 투여되는 특별한 항커넥신제에 좌우될 것이다.
적합한 용량은 약 0.001 내지 약 100 mg/체중 kg, 예를 들어 약 0.01 내지 약 40 mg/체중 kg일 수 있다. 그러나, 적합한 용량은 약 0.001 내지 약 0.1 mg/체중 kg, 예를 들어 약 0.01 내지 약 0.050 mg/체중 kg일 수 있다. 약 1 내지 100, 200, 300, 400, 및 500 마이크로그램의 용량이 적당하다.
예를 들어, 특정 양태에서 항커넥신제 조성물은 치료 부위 및/또는 인접한 치료 부위에 약 0.01 마이크로몰 (μM) 또는 0.05 μM 내지 약 200 μM의 최종 농도로 적용될 수 있다. 바람직하게, 안티센스 폴리뉴클레오티드 조성물은 0.05 μM 내지 100 μM의 최종 농도로 적용되고, 보다 바람직하게 항커넥신제 조성물은 약 1.0 μM 내지 약 50 μM의 최종 농도로 적용되며, 보다 바람직하게 항커넥신제 조성물은 약 5-10 μM 내지 약 30-50 μM의 최종 농도로 적용된다. 부가적으로, 조합 항커넥신제 조성물은 약 8 μM 내지 약 20 μM의 최종 농도로 적용되고, 또 다른 한편 항커넥신제 조성물은 약 10 μM 내지 약 20 μM의 최종 농도, 또는 약 10 μM 내지 약 15 μM의 최종 농도로 적용된다. 특정의 기타 양태에서, 항커넥신제는 약 10 μM의 최종 농도로 적용된다. 또 다른 양태에서, 항커넥신제 조성물은 약 1-15 μM의 최종 농도로 적용된다. 항커넥신제 용량에는, 예를 들어 약 0.1-1, 1-2, 2-3, 3-4, 또는 4-5 마이크로그램 (㎍), 약 5 내지 약 10 ㎍, 약 10 내지 약 15 ㎍, 약 15 내지 약 20 ㎍, 약 20 내지 약 30 ㎍, 약 30 내지 약 40 ㎍, 약 40 내지 약 50 ㎍, 약 50 내지 약 75 ㎍, 약 75 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 250 ㎍ 및 250 ㎍ 내지 약 500 ㎍이 포함된다. 상기 인지된 바와 같이, 0.5 내지 약 1.0 밀리그램 이상의 용량이 또한 제공된다. 용량 용적은 치료하고자 하는 부위의 크기에 좌우될 것이고, 예를 들어 약 25-100 ㎕ 내지 약 100-200 ㎕, 약 200-500 ㎕ 내지 약 500-1000 ㎕의 범위일 수 있다. 밀리리터 용량은 보다 큰 치료 부위에 적당하다.
기타 투여량 수준은 1일당 본원에 기재된 작용제 각각 약 1 나노그램 (ng)/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg이다. 특정 양태에서, 대상 화합물 각각의 투여량은 일반적으로, 약 1 ng 내지 약 1 마이크로그램/체중 kg, 약 1 ng 내지 약 0.1 마이크로그램/체중 kg, 약 1 ng 내지 약 10 ng/체중 kg, 약 10 ng 내지 약 0.1 마이크로그램/체중 kg, 약 0.1 마이크로그램 내지 약 1 마이크로그램/체중 kg, 약 20 ng 내지 약 100 ng/체중 kg, 약 0.001 mg 내지 약 100 mg/체중 kg, 약 0.01 mg 내지 약 10 mg/체중 kg, 또는 약 0.1 mg 내지 약 1 mg/체중 kg의 범위일 것이다. 특정 양태에서, 대상 화합물 각각의 투여량은 일반적으로, 약 0.001 mg 내지 약 0.01 mg/체중 kg, 약 0.01 mg 내지 약 0.1 mg/체중 kg, 약 0.1 mg 내지 약 1 mg/체중 kg, 약 1 mg 내지 약 10 mg/체중 kg, 또는 약 10 mg 내지 약 100 mg/체중 kg의 범위일 것이다. 하나 이상의 항커넥신제를 사용하는 경우, 각 항커넥신제의 투여량이 반드시 다른 것과 동일한 범위일 필요는 없다. 예를 들어, 하나의 항커넥신제의 투여량은 약 0.01 mg 내지 약 10 mg/체중 kg일 수 있고, 또 다른 항커넥신제의 투여량은 약 0.1 mg 내지 약 1 mg/체중 kg일 수 있다. 기타 양이 당업자에게 공지될 것이고 용이하게 결정될 것이다.
편리하게, 항커넥신제는 투여 후 약 0.5 내지 1시간 이상, 약 1 내지 2시간 이상, 약 2 내지 4시간 이상, 약 4 내지 6시간 이상, 약 6 내지 8시간 이상, 약 8 내지 10시간 이상, 약 12시간 이상, 또는 약 24시간 이상 동안 갭 연접부 형성 또는 커넥손 개방을 조정하거나 또는 커넥신 단백질의 발현을 하향 조절하기에 충분한 양으로 투여한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 항커넥신제 각각의 투여량은 그것이 적용될 부위의 크기, 길이, 폭, 면적 또는 용적을 기준으로 한 조성물의 농도를 참고로 하여 결정할 수도 있다. 예를 들어, 특정의 국소 및 기타 적용, 예를 들어 점적주입에서 제약 조성물의 투약은 적용 부위의 길이, 폭, 면적 또는 용적당 제약 조성물 중의 농도 (예: ㎍/㎕) 또는 질량 (예: 마이크로그램)에 기초하여 계산할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제에 적합한, 상처 치유에 유용한 작용제는 당해 분야에 공지된 바와 같은 방법을 사용하여 제조 및 투여할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제7,098,190호, 제6,319,907호, 제6,331,298호, 제6,387,364호, 제6,455,569호, 제6,566,339호, 제6,696,433호, 제6,855,505호, 제6,900,181호, 제7,052,684호 및 EP1100529 Bl]. 항커넥신제와 상처 치유에 유용한 작용제 각각의 농도가 반드시 다른 것과 동일한 범위일 필요는 없다. 기타 양이 당업자에게 공지될 것이고 용이하게 결정될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 각종 국면 및 양태에 따르는 적합한 병용 투여량 및 제형은 다음 문헌에 기재된 바와 같은 투여 섭생에 따라서 투여할 수 있다 [참고: US6903078 to Lewis entitled "Combination PDGF, KGF, IGF, and IGFBP for wound healing"].
투여된 초기 투여량 및 모든 후속 투여량은 환자의 연령, 체중, 상태, 및 치료하고자 하는 질병, 상처, 장애 또는 생물학적 상태에 좌우될 것이다. 상처 치유제에 따라서, 투여를 위한 프로토콜 및 투여량은 다양할 것이고, 투여량은 또한, 선택된 투여 방법, 예를 들어 국소 또는 전신 투여에 좌우될 것이다.
상처 치유제는 내적 또는 외적으로 적용할 수 있고, 상처를 나타내는 모든 조직에 대해서 지정될 수 있다. IGF를 국소 투여하는 경우에는, 예를 들어 문헌 [참고: Tarnow et al, Scand J. Plast Reconstr Hand Surg . 28: 255-259 (1994)]에 기재된 바와 같이 IGF의 국소 생성을 유도시키는 산화아연 제형을 적용할 수 있다. PDGF의 유효 용량은 미국 특허 제4,861,757호에 기재된 바와 같이 국소적으로 적용되는 경우에는 5 ng/㎟ 이상인 것으로 보고되었고, PDGF의 이소형 (예를 들어, PDGF-AA, PDGF-BB, 또는 PDGF-AB)의 국소 농도는 1 ng/ml 이상이며, 문헌 [참고: Lepisto et al., Biochem Biophys Res. Comm 209: 393-399 (1995)]에 기재된 바와 같이 섬유아세포 집단에 적용되는 경우의 국소 농도는 약 30 ng/ml 이하이다. PDGF는 카복시메틸셀롤로스 젤 제형 중에서 젤 1 gm 당 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 젤 1 gm 당 약 20 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 및 젤 1 gm 당 약 30 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 최적으로는 젤 1 gm 당 약 100 ㎍의 농도로 투여될 수 있다. PDGF의 효능은 투여된 용액 1 ml 당 약 3 ㎍ 내지 약 300 ㎍의 범위 내에서 달성되었다.
약 5 ㎍/ml 농도의 약 50 ㎍의 KGF가 문헌 [참고: Sotozono et al, Invest. Opthal. Vis. Science 36: 1524-29 (1995)]에 기재된 바와 같이 상피 조직으로의 국소 적용에 의한 상처 치유에 유효할 수 있다. 미국 특허 제4,861,757에 기재된 바와 같이, PDGF와 공동-투여되는 경우의 IGF의 유효량은 2.5 ng/㎟ 내지 약 5 ng/㎟의 범위 내이고, PDGF 대 IGF의 비는 약 1:10 내지 약 25:1 중량 대 중량이며, PDGF 대 IGF의 가장 유효한 비는 약 1:1 내지 약 2:1 중량 대 중량이다. IGF와 병용해서 투여된 IGFBP는 문헌 [참고: Jyung et al, Surgery 115:233-239 (1994)]에 기재된 바와 같이, 약 11:1 IGF:IGFBP의 몰 비에서 약 5 ㎍의 IGF를 약 1.5 ㎍의 인산화 IGFBP와 병용한 용량 수준에서 상처 치유를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
폴리펩티드 치료제, 예를 들어 PDGF, KGF, IGF 및 IGFBP 폴리펩티드를 투여하는 경우, 투여량은 적용되는 조직 1 kg당 약 5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 또한 조직 1 kg당 약 50 ㎍ 내지 약 5 mg, 또한 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 200 내지 250 ㎍의 범위일 수 있다. 조직 표적화 투여를 위해, 환자에게서의 폴리뉴클레오티드의 발현 강도에 따라서, 예를 들어 유전자 요법 투여 프로토콜에서의 폴리뉴클레오티드 치료제에 대해서는, PDGF, KGF, IGF, 및 IGFBP 암호화 서열을 포함한 발현성 구조물을 함유하는 벡터가 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여하는 경우에는 DNA 약 100 ng 내지 약 200 mg의 범위로 투여될 수 있고, 또한 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여 동안에는 DNA 약 500 ng 내지 약 50 mg, 또한 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, DNA 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 DNA 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 범위로 투여될 수 있으며, 주사 또는 투여당 약 250 ㎍일 수 있다. 따라서, 작용 방법과 형질전환 및 발현의 효능과 같은 요인이 DNA 치료제의 투여에 대한 궁극적인 효능에 요구되는 투여량에 영향을 미치는 것으로 간주된다. 보다 큰 조직 부위 전반에 걸쳐 보다 큰 발현이 요망되는 경우에, 긍정적 치료 결과를 얻기 위해서는, 예를 들어 상처 부위의 상이한 인접 또는 근접 조직 부분에 대한 수 회 투여, 또는 후속 투여 프로토콜에서 재투여된 동일한 양 또는 보다 다량의 DNA가 요구될 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제조에 적합한 치료제 및 갭 연접부 변성제는 당해 분야에 공지된 바와 같은 방법을 사용하여 제형화 및 투여할 수 있다. 투여된 초기 투여량 및 모든 후속 투여량은 환자의 연령, 체중, 상태, 및 치료하고자 하는 질병, 상처, 장애 또는 생물학적 상태에 좌우될 것이다. 치료제에 따라서, 투여를 위한 프로토콜 및 투여량은 다양할 것이고, 투여량은 또한, 선택된 투여 방법, 예를 들어 국소 또는 전신 투여에 좌우될 것이다.
본원에서 인지된 바와 같이, 항커넥신제 또는 병용 투여된 또 다른 작용제의 용량은 단독으로 제공된 경우의 투여 용량 보다 하향 조정될 수 있다.
몇 가지 작용제를 병용 사용하는 것이 개별 작용제에 대해 요구되는 투여량을 감소시킬 수 있는데, 이는 상이한 작용제의 효과 개시 및 기간이 상보적일 수 있기 때문이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용 사용하는 것이 부가적, 상승적 또는 초부가적 효과를 가져다 준다.
몇몇 경우에는, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제 및/또는 하나 이상의 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 하나 이상의 갭 연접부 변성제를 병용하는 것이 부가적 효과를 가져다 준다. 기타 경우에는, 상기 병용이 부가적 효과 보다 더 큰 효과를 가져다 준다. 이러한 효과는 본원에서 "초부가적" 효과로서 지칭되는데, 이는 상승적 또는 증강된 상호 작용에 기인할 수 있다.
용어 "상처 치유의 초부가적 증진"은 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용 투여함으로써 유발된 평균 상처 치유가 어느 한 작용제를 단독으로 개별 투여함으로써 유발된 상처 치유의 합 보다 통계상 유의적으로 더 크다는 것을 지칭한다. 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 병용 투여에 의해 유발된 활성이 개별 화합물의 예상되는 부가치 보다 "통계상 유의적으로 더 큰"지의 여부는 본원에 기재되고/되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 각종 통계적 방법에 의해 결정할 수 있다. 용어 "상승적"은 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제 둘 다가 개별적으로, 상처 치유를 증강시키거나 섬유증 및 반흔 형성을 저하시킬 수 있는 능력을 지니고 있는 초부가적 억제의 유형을 지칭한다. 용어 "증강된"이란 항커넥신제 또는 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제 중의 하나가 개별적으로, 상처 치유를 증진시킬 수 있는 증가된 능력을 지니고 있는 초부가적 효과의 유형을 지칭한다.
일반적으로, 증강은 병용 치료로 인해, 그의 치료군 각각의 개별적 치료에 의해 야기된 평균 상처 치유 증가의 합과 비교해서 통계상 유의적으로 초부가적인 치료군에서의 평균 상처 치유 증가가 이루어지는지를 결정함으로써 평가할 수 있다. 평균 상처 치유 증가는 대조군 평균 상처 치유와 치료군 상처 치유 간의 차이로서 계산할 수 있다. 상처 치유에 있어서의 분별 증가, 즉 "침범된 분획" (Fa)은 치료군 평균 상처 치유 증가를 대조군 평균 상처 치유로 나눔으로써 계산할 수 있다. 통계상 유의적 증강을 시험하기 위해서는, 각 치료군에 대한 Fa를 계산해야 한다. 병용 치료에 대한 예상된 부가적 Fa는 병용 요법의 어느 한 요소를 투여한 군으로부터의 평균 Fa의 합일 수 있다. 예를 들어, 양측 원-샘플 T-시험을 사용하여 본 실험에 의해 수득된 결과가 thep-값으로써 측정된 바와 같이, 단독 기회에 기인한다는 것을 어떻게 예상하는 지를 평가할 수 있다. 0.5 미만의 Ap-값이 통계상 유의적인 것으로 간주되는데, 즉 단독 기회에 기인되는 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 병용 치료군에 대한 Fa는 단일 요소 치료군에 대한 예상된 부가적 Fa 보다 통계상 유의적으로 더 커야만 하는데, 이로써 병용 치료군은 증강된 초부가적 효과를 가져다 주는 것으로 추정된다.
상승적 효과가 병용 치료로부터 비롯되는 지의 여부는 중간-효과/병용-지수 아이소볼로그램 (isobologram) 방법에 의해 평가할 수 있다 [참고: Chou, T., and Talalay, P. (1984) Ad. Enzyme Reg. 22:27-55]. 이 방법에서는, 항커넥신제 단독, 상처 치유에 유용한 하나 이상의 작용제 단독, 및 고정 몰 비로 존재하는 이 둘의 병용물의 중간 효과 플롯으로부터 유래되는 파라미터를 기준으로 한 상이한 용량-효과 수준에 대한 병용 지수 (CI) 값을 계산한다. CI 값; 1은 상승 작용을 표시하고, CI-1은 부가적 효과를 표시하며, CP1은 길항적 효과를 표시한다. 이러한 분석은 컴퓨터 소프트웨어 도구 [예를 들어, CalcuSyn, Windows Software for Dose Effect Analysis (Biosoft(D, Cambridge UK)]를 사용하여 수행할 수 있다.
병용 요법에 대한 초부가적 효과가 존재하는 지를 분석하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있거나 나중에 개발된 모든 방법이 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 사용하는 데에 적합한 항커넥신제를 스크리닝하는 데에 사용하는 것으로 고려된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제를 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 사용하면, 이러한 작용제를 단독으로 투여한 경우의 유효 용량과 비교해서 상기 작용제 모두의 유효 용량이 감소된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 사용하는 경우의 상기 작용제의 유효 용량은 단독으로 사용한 경우의 작용제의 용량의 약 1/15 내지 약 1/2, 약 1/10 내지 약 1/3, 약 1/8 내지 약 1/6, 약 1/5, 약 1/4, 약 1/3 또는 약 1/2이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 병용해서 사용하면, 이러한 작용제를 단독으로 투여한 경우의 투여 횟수와 비교해서 상기 작용제를 투여하는 횟수가 감소된다. 따라서, 이러한 병용 요법으로 인해, 기존에 목적하는 치료 목표를 달성하는 데에 요구되는 것 보다 각 작용제의 용량이 더 낮아지고/지고 줄어들 수 있다.
투여 용량은 1회분으로 또는 수 회분으로 나누어 투여할 수 있다. 용량은 한 번에 투여할 수 있거나 반복 투여할 수 있다.
하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여할 수 있다. 본 발명의 각종 작용제는 치료 과정 동안 상이한 시간에 별개로 투여할 수 있거나, 또는 분할되거나 단일 조합 형태로 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 한 국면에서, 항커넥신제는 제1 조성물 중에 투여되고, 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 제2 조성물 중에 투여된다. 한 양태에서는, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 제1 조성물을 투여한 후에, 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 제2 조성물을 투여한다. 한 양태에서는, 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 제2 조성물을 투여한 후에, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 제1 조성물을 투여한다. 한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 제1 조성물은 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 제2 조성물을 투여하기 전 및 후에 투여한다. 한 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 제1 조성물은 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 제2 조성물과 대략 동시에 투여한다.
바람직하게, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 국소 투여 (부위에 대한 직접 또는 말초적 투여), 예를 들어 고체 지지체 (예: 드레싱 및 기타 매트릭스) 및 의료 제형 (예: 젤, 혼합물, 현탁제 및 연고)를 사용하는 국소 투여 등에 의해 전달된다. 한 양태에서, 고체 지지체는 생분해성 막 또는 치료 부위 내로의 삽입물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 고체 지지체는 드레싱 또는 매트릭스를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 고체 지지체 조성물은 서방출 고체 지지체 조성물일 수 있는데, 여기서는 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제가 서방출 고형 매트릭스, 예를 들어 알지네이트, 콜라겐 또는 합성 생흡수성 중합체의 매트릭스에 분산된다. 바람직하게, 고체 지지체 조성물은 멸균성이거나 생-부하량이 낮다. 한 양태에서는, 하나 이상의 항커넥신제를 포함하는 세척 용액을 사용할 수 있다.
제형의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 일정 기간에 걸쳐, 몇몇 경우에는 약 1 내지 2시간, 약 2 내지 4시간, 약 4 내지 6시간, 약 6 내지 8시간, 또는 약 24시간 이상에 걸쳐 전달하는 것이 보다 중증의 손상이나 질환에 특히 유리할 수 있다. 몇몇 경우에는, 세포 상실이 처치 부위를 넘어 주변 세포로 확대될 수 있다. 이러한 상실은 처음 처치한지 24시간 내에 일어날 수 있고, 갭 연접부 세포-세포 소통에 의해 매개된다. 따라서 예를 들어, 커넥신 발현을 하향 조절하거나 커넥손 개방을 차단하기 위해 항커넥신제(들)를 투여하는 것이 세포 간의 소통을 조정하거나, 커넥손 조절의 경우에는 세포외 공간 내로의 상실을 조정하고, 부가의 세포 상실 또는 손상 또는 손상 결과를 최소화할 것이다.
전달 기간이 하향 조절을 유도시켜야 하는 부위와 목적하는 치료 효과 둘 다에 의해 좌우될 것이지만, 약 1 내지 2시간, 약 2 내지 4시간, 약 4 내지 6시간, 약 6 내지 8시간, 또는 약 24시간 이상 동안의 연속적 또는 서방출 전달이 제공된다. 본 발명에 따르면, 이는 항커넥신제 및/또는 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 제약상 허용 가능한 담체 또는 비히클과 함께 제형, 특히 연속적 또는 서방출 투여를 위한 형태의 제형에 봉입시킴으로써 달성된다.
인지된 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 작용제는 상처 형성 전, 동안, 직후, 또는 예를 들어 상처 형성 후 약 180일, 약 120일, 약 90일, 약 60일 또는 약 30일 이내, 바람직하게 약 10일, 약 9일, 약 8일, 약 7일, 약 6일, 약 5일, 약 4일, 약 3일 또는 약 2일 이하 내에, 가장 바람직하게 약 24시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 60분, 약 45분, 약 30분, 약 15분, 약 10분, 약 5분, 약 4분, 약 3분, 약 2분, 약 1분 이내에 투여할 수 있다.
본원에 기재된 투여 경로 및 투여량은 단지 한 지침으로서 의도된 것인데, 이는 당업자가 특별한 모든 환자와 상태에 대한 최적의 투여 경로와 투여량을 결정할 것이기 때문이다.
본원에 기재되거나 참고된 질병, 장애 및/또는 질환에 걸렸거나, 걸린 것으로 추정되거나, 걸릴 소인이 있거나, 또는 걸릴 위험에 노출된 대상체를 치료하는 어떠한 방법도 본원에 기재된 모든 용량, 투여 형태, 제형 및/또는 조성물의 투여를 활용할 수 있다.
드레싱 및 매트릭스
한 국면에서, 하나 이상의 항커넥신제, 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제가 드레싱 또는 매트릭스의 형태에 제공된다. 특정 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 작용제는 직접 적용하기 위한 액상, 반고형 또는 고형 조성물의 형태로 제공되거나, 또는 조성물은 고형 접촉층, 예를 들어 드레싱 거즈 또는 매트릭스 내로 혼입되거나 그의 표면에 적용된다. 드레싱 조성물은, 예를 들어 유체 또는 젤 형태로 제공될 수 있다. 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 국소 적용에 통상적인 제약 부형제와 병용해서 제공될 수 있다. 적합한 담체에는 플루로닉스 젤, 폴락사머 젤; 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 및 그의 혼합물을 포함한 셀룰로스 유도체를 함유하는 히드로젤; 및 폴리아크릴산을 함유하는 히드로젤 (카보폴)이 포함된다. 적합한 담체에는 또한, 국소 제약 제제에 사용되고 있는 크림/연고, 예를 들어 세토마크로졸 유화 연고에 기초한 크림이 포하된다. 상기 담체에는 알지네이트 (점증제 또는 자극제로서), 방부제, 예를 들어 벤질 알코올, pH를 제어하기 위한 완충제, 예를 들어 인산수소 이나트륨/인산이수소 나트륨, 삼투압을 조정하기 위한 작용제, 예를 들어 염화나트륨, 및 안정화제, 예를 들어 EDTA가 포함될 수 있다.
적합한 드레싱 또는 매트릭스에는, 예를 들어 하나 이상의 항커넥신제가 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 함께 포함될 수 있다.
1) 흡수제: 적합한 흡수제에는, 예를 들어 고도로 흡수성인 섬유 층, 예를 들면 셀룰로스, 면 또는 레이온과 합한, 반-부착성 또는 비-부착성 층을 제공할 수 있는 흡수성 드레싱이 포함될 수 있다. 또 다른 한편, 흡수제는 일차 또는 이차 드레싱으로서 사용될 수 있다.
2) 알지네이트: 적합한 알지네이트에는, 예를 들어 해초로부터 유래된 제로젤 (xerogel) 또는 천연 다당류 섬유로 구성된 부직의 비-부착성 패드 및 리본인 드레싱이 포함된다. 적합한 알지네이트 드레싱은, 예를 들어 삼출물과의 접촉시 이온 교환 과정을 통하여 습윤 젤을 형성할 수 있다. 특정의 양태에서, 알지네이트 드레싱은 부드럽고 편안하며, 불규칙한 형태 부위 전반에 걸쳐 패킹하거나, 덮거나 또는 적용하기에 용이하도록 설계한다. 특정 양태에서는, 알지네이트 드레싱으로 제2 드레싱과 함께 사용할 수 있다.
3) 항미생물 드레싱: 적합한 항미생물 드레싱에는, 예를 들어 생체 활성제, 예를 들어 은 및 폴리헥사메틸렌 비구아니드 (PHMB)의 전달을 촉진시켜, 이것이 요구되거나 요망되는 경우에 감염증에 대항항 효능을 유지시킬 수 있는 드레싱이 포함될 수 있다. 특정 양태에서, 적합한 항미생물 드레싱은, 예를 들어 스폰지, 함침된 직포 거즈, 필름 드레싱, 흡수 제품, 아일랜드 드레싱, 나일린 직물, 비-부착성 장벽, 또는 복합 재료로서 입수 가능할 수 있다.
4) 생물학적 & 생합성: 적합한 생물학적 드레싱 또는 생합성 드레싱에는, 예를 들어 천연 공급원으로부터의 젤, 용액 또는 반-투과성 시트가 포함될 수 있다. 특정 양태에서는, 젤 또는 용액을 치료 부위에 적용하고 장벽 보호를 위해 드레싱으로 덮는다. 또 다른 양태에서는, 시트를 계내에 놓아두는데, 이는 막으로서 작용할 수 있고, 단일 적용 후에는 원위치에 남아있다.
5) 콜라겐: 적합한 콜라겐 드레싱에는, 예를 들어 소, 돼지 또는 조류 공급원 또는 기타 천연 공급원 또는 공여자로부터 유래된 젤, 패드, 입자, 페이스트, 분말, 시트 또는 용액이 포함될 수 있다. 특정 양태에서, 콜라겐 드레싱은 치료 부위 삼출물과 상호 작용하여 젤을 형성할 수 있다. 특정 양태에서는, 콜라겐 드레싱을 이차 드레싱과 병용해서 사용할 수 있다.
6) 복합물: 적합한 복합 드레싱에는, 예를 들어 물리적으로 별개의 성분을 단일 생성물로 합하여 여러 가지 기능, 예를 들어 세균성 장벽, 흡수 및 부착을 제공해 주는 드레싱이 포함될 수 있다. 특정 양태에서, 복합 드레싱은, 예를 들어 다수의 층으로 구성되고 반-부착성 또는 비-부착성 패드가 혼입된다. 특정 양태에서, 복합물에는, 예를 들어 부직포 테이프 또는 투명 필름의 부착성 경계가 포함될 수 있다. 특정의 기타 양태에서는, 복합 드레싱이 예를 들어, 일차 또는 이차 드레싱으로서 기능할 수 있고, 또 다른 양태에서는 드레싱을 국소 제약 조성물과 병용해서 사용할 수 있다.
7) 접촉층: 적합한 접촉층 드레싱에는, 예를 들어 치료 부위에 적용된 기타 작용제 또는 드레싱과 직접적인 접촉으로부터 조직을 보호하기 위해 부위 상에 놓아둔 비-부착성 박막 시트가 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 접촉층은 치료 부위의 외형에 맞도록 배치시킬 수 있고, 덮고 있는 이차 드레싱에 의한 흡수를 위해 삼출물을 통과시킬 수 있도록 다공성이다. 또 다른 양태에서, 접촉층 드레싱은 국소 제약 조성물과 병용해서 사용할 수 있다.
8) 탄성 붕대: 적합한 탄성 붕대에는, 예를 들어 신체 윤곽에 맞도록 신장되는 드레싱이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 직물 조성에는, 예를 들어 면, 폴리에스테르, 레이온 또는 나일론이 포함될 수 있다. 특정의 기타 양태에서, 탄성 붕대는, 예를 들어 제2 층 또는 드레싱으로서의 흡수를 제공하여 커버를 제위치에 유지시켜 주거나, 압력을 적용시켜 주거나 또는 치료 부위에 쿠션을 제공해줄 수 있다.
9) 발포체: 적합한 발포성 드레싱에는, 예를 들어 유체를 유지시킬 수 있는 소형의 개방 셀을 수반한 발포성 중합체 용액 (폴리우레탄 포함)의 시트 및 기타 형태가 포함될 수 있다. 예시되는 발포체에는, 예를 들어 기타 재료와 함께 함침되거나 층을 형성할 수 있다. 특정의 양태에서, 흡수 능력은 발포체의 두께와 조성에 근거하여 조정할 수 있다. 특정의 기타 양태에서, 치료 부위와 접촉하고 있는 부위는 용이하게 제거하기 위해 비-부착성일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 발포체를 흡수성 경계 및/또는 항감염성 장벽으로서 제공될 수 있는 투명 필름 코팅과 병용해서 사용할 수 있다.
10) 거즈 및 부직 드레싱: 적합한 거즈 드레싱 및 직물 드레싱에는, 예를 들어 흡수도가 다양한 건조 직물 또는 부직 스폰지 및 랩이 포함될 수 있다. 예시되는 직물 조성에는, 예를 들어 면, 폴리에스테르 또는 레이온이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 거즈 및 부직 드레싱은 벌크상 입수 가능한 멸균성 또는 비멸균성일 수 있고 부착성 경계를 수반하거나 수반하지 않는다. 예시되는 거즈 드레싱 및 직물 드레싱은 각종 치료 부위를 클린싱, 패킹 및 커버하기 위해 사용할 수 있다.
11) 히드록콜로이드: 적합한 히드로콜로이드 드레싱에는, 예를 들어 젤라틴, 펙틴 또는 카복시메틸셀룰로스로 구성된 웨이퍼, 분말 또는 페이스트가 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 웨이퍼는 자가-부착성이고, 부착성 경계를 수반하거나 수반하지 않고 광범위한 형태와 크기로 입수 가능하다. 예시되는 히드로콜로이드는 윤곽 형성을 요구하는 부위에 유용하다. 특정의 양태에서는, 분말 및 페이스트 히드로콜로이드를 이차 드레싱과 병용해서 사용할 수 있다.
12) 히드로젤 (무정형): 적합한 무정형 히드로젤 드레싱에는, 예를 들어 수분을 제공하고 습윤 치유 환경을 유지하고/하거나 치료 부위를 재수화시키도록 설계된, 물, 중합체 및 형태가 없는 기타 성분의 제형이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서는, 히드로젤을 이차 드레싱 커버와 병용해서 사용할 수 있다.
13) 히드로젤: 함침형 드레싱: 적합한 함침형 히드로젤 드레싱에는, 예를 들어 무정형 히드로젤로 포화된 거즈 및 부직 스폰지, 로프 및 스트립이 포함될 수 있다. 무정형 히드로젤에는, 예를 들어 건조 치료 부위에 수분을 제공하고 습윤 치유 환경을 유지하도록 설계된, 물, 중합체 및 형태가 없는 기타 성분의 제형이 포함될 수 있다.
14) 히드로젤 시트: 적합한 히드로젤 시트에는, 예를 들어 물에 불용성이고 팽윤에 의해 수용액과 상호 작용하는 가교 결합된 친수성 중합체의 3차원적 네트워크가 포함될 수 있다. 예시되는 히드로젤은 고도로 적합하고 투과성이며, 그의 조성에 따라서 다양한 양의 배농을 흡수할 수 있다. 특정의 양태에서, 히드로젤은 치료 부위에 대항하여 비-부착성이거나 용이한 제거를 위해 처리된다.
15) 함침형 드레싱: 적합한 함침형 드레싱에는, 예를 들어 용액, 에멀션, 오일, 젤 또는 몇몇 기타 제약상 활성 화합물 또는 담체, 예를 들면 식염수, 오일, 아연 염, 광유, 제로형 (xeroform) 및 스칼렛 레드 뿐만 아닐 본원에 기재된 화합물로 포화된 거즈 및 부직 스폰지, 로프 및 스트립이 포함될 수 있다.
16) 실리콘 젤 시트: 적합한 실리콘 젤 시트 드레싱에는, 예를 들어 메쉬 또는 직물과 결합되거나 이로 강화된 가교 결합된 중합체로 구성된 연질 커버가 포함될 수 있다.
17) 용제: 적합한 액상 드레싱에는, 예를 들어 다단백질 물질의 혼합물 및 세포외 매트릭에서 발견된 기타 요소가 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 예시되는 용제는 괴사조직을 제거하고 클린싱한 후에 치료 부위에 적용한 다음, 흡수성 드레싱 또는 비-부착성 패드로 덮을 수 있다.
18) 투명 필름: 적합한 투명 필름 드레싱에는 흡착제가 있는 한 측면 상에 피복된 다양한 두께의 중합체 막이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 투명 필름은 액체, 물 및 세균에 대해서는 비투과성이지만, 습윤 증기 및 대기 기체에 대해서는 투과성이다. 특정의 양태에서, 투명도는 치료 부위를 가시화시켜 줄 수 있다.
19) 충전제: 적합한 충전제 드레싱에는, 예를 들어 비드, 크림, 발포체, 젤, 연고, 패드, 페이스트, 베개, 분말, 스트랜드 또는 기타 제형이 포함될 수 있다. 특정의 양태에서, 충전제는 비-부착성이고 시간 방출형 항미생물제를 포함할 수 있다. 예시되는 충전제는 습윤 환경을 유지시키고, 삼출물을 관리하며, 예를 들어 패킹을 요구하는 부분층 및 전층 피부 상처, 감염 상처, 배농 상처 및 심부 상처를 치료하는 데에 유용할 수 있다.
병용 상처 치료
일반적 국면
본 발명은 치료적 유효량의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 제약 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 상처 치유를 증강 또는 증진시키는 데에 유용하고, 이러한 상처에는 통상적인 상처 치료 또는 상처 치유 증진 요법에 대해서 치료하기가 어렵거나 치유 속도가 느릴 수 있는 상처가 포함된다.
동등하게, 기타 조직 손상 (특히 상처)의 경우에 본 발명의 방법 및 조성물은 상처 치유 과정을 증진시키고, 종창과 염증을 저하시키며 반흔 형성을 최소화하는 데에 유효하다. 제형은 만성적 상처 뿐만 아니라 외적 외상 (화상 포함), 내적 외상, 또는 외과적 시술의 결과에 상관없이 상처를 치료하는 데에 명백하게 유익하다.
조성물
따라서 한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 및/또는 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는, 치료적 처치에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이러한 조성물은 제약상 허용 가능한 담체 또는 비히클을 추가로 포함한다.
한 가지 바람직한 형태에서, 조성물은 하나의 커넥신 단백질 만의 mRNA에 대한 하나 이상의 안티센스 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 바람직한 형태에서, 조성물은 하나 이상의 항커넥신 펩티드 또는 펩티드 모방제를 포함한다. 가장 바람직하게, 이러한 커넥신 단백질은 커넥신 43이다.
조성물은 하나 이상의 커넥신 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드 또는 항커넥신 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 또는 항커넥신 펩티드를 유도시키는 커넥신 단백질 중의 하나는 커넥신 43이다. 폴리뉴클레오티드 또는 항커넥신 펩티드를 유도시키는 기타 커넥신에는, 예를 들어 커넥신 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 44.6, 45 및 46이 포함될 수 있다. 각종 커넥신에 대해 유도된 적합한 예시되는 폴리뉴클레오티드 (및 ODN)가 표 1에 제시되어 있다. 적합한 항커넥신 펩티드가 또한 본원에 제공된다.
예시되는 병용물
본 발명의 조성물 및 방법에 따르는 항커넥신제와 상처 치유제의 예시되는 병용물에는 다음이 포함된다:
(a) 다음 항커넥신제 중의 하나:
커넥신 43 안티센스 폴리뉴클레오티드;
커넥신 43 안티센스 ODN;
서열 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열 2를 포함하는 ODN;
서열 1을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
서열 1을 포함하는 ODN;
커넥신 43 RNAi 폴리뉴클레오티드; 또는
커넥신 43 siRNA 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 상처 치유에 유용한 다음 작용제 중의 하나:
악티빈 (Activin);
FGF-2 또는 섬유아세포 성장 인자 2;
FGF-1 또는 섬유아세포 성장 인자-1;
VEGF 또는 혈관 내피 성장 인자;
GM-SF 또는 과립구 단구 자극 인자;
혈소판 인자 4;
EGF 또는 표피 성장 인자;
TGF 또는 전환 성장 인자 베타 (예: TGF-1,2,3);
TNF 알파 또는 종양 괴사 인자 알파;
IL-1 인터루킨-1;
IL-4 인터루킨-4;
IL-7 인터루킨-7;
IL-8 인터루킨-8;
IL-1O 인터루킨-10;
GMCSF 또는 과립구-대식 세포/집락 자극 인자;
CTGF 또는 결합 조직 성장 인자;
티모신 베타 4;
IGF-1 또는 인슐린-유사 성장 인자-1;
PDGF 또는 혈소판 유래 성장 인자;
PDGF-BB 또는 혈소판 유래 성장 인자 BB;
만노스-6-포스페이트;
(aFGF) 산성 섬유아세포 성장 인자;
(bFGF) 염기성 섬유아세포 성장 인자;
(HB-EGF) 헤파린 결합성 표피 성장 인자;
(hGH) 인간 성장 호르몬;
(KGF) 각질 세포 성장 인자;
(KGF-2) 각질 세포 성장 인자-2;
(MMP) 매트릭스 메탈로프로테이나제;
(PDECGF) 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자;
(PDEGF) 혈소판 유래 표피 성장 인자;
(rbbFGF) 재조합 소 염기성 섬유아세포 성장 인자;
(rhbFGF) 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자;
(rhPDGF-BB) 재조합 인간 혈소판 유래 성장 인자 (BB-이량체);
(TGF-알파) 전환 성장 인자-알파;
(TGF-베타) 전환 성장 인자-베타;
(TIMP) 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 억제제;
(VEGF) 혈관 내피 성장 인자;
(IGFBP) 인슐린-유사 성장 인자 결합성 단백질 (예: IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4); 및
(FGF) 또는 섬유아세포 성장 인자 (예: FGF-1, FGF-2).
상기 병용물 목록은 사실상 예시적이다. 본원에 기재된 치료제와 항커넥신제의 기타 병용물이 또한 포함된다. 본원에 기재된 상처 치유에 유용한 작용제와 항커넥신제의 기타 병용물이 또한 포함된다. 본원에 기재된 갭 연접부 변성제와 항커넥신제의 기타 병용물이 또한 포함된다.
키트, 약물 및 제조품
임의로, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 상처 치유에 유용한 작용제, 치료제 및/또는 갭 연접부 변성제 (예: 펩티드, 단백질 분해적 억제제, 세포외 매트릭스 성분, 단편 및 펩티드, 스테로이드, 사이토킨, 산소 공여체 또는 비타민)이 약물 제조에 사용될 수도 있다.
한 국면에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 조성물 또는 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 키트는 유효량의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 조성물 또는 제형을 함유하는 용기와, 대상체의 치료에 관한 사용 설명서를 포함하는 제조품이 또한 제공된다. 예를 들어 또 다른 국면에서, 본 발명에는 치료적 유효량의 하나 이상의 제약상 허용 가능한 항커넥신제와 하나 이상의 제약상 허용 가능한, 상처 치유를 증진 또는 개선시키기 위한 치료제를 함유하는 용기와, 대상체의 치료에 관한 사용을 포함한 사용 설명서를 포함하는 제조품이 포함된다.
치료
본 발명의 조성물 및 제형은 상처 치유를 증진시키거나 종창, 염증 및/또는 반흔 형성을 저하시키기 위한 조성물과 연계해서 또는 병용해서 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 제형은 또한, 급성 또는 만성적 상처의 치유를 증진 및/또는 개선시키기 위한 조성물과 연계해서 또는 병용해서 사용할 수 있다. 한 국면에서, 상처는 수술 또는 외상의 결과일 것이다.
상처를 치료하기 위해 하나 이상의 항커넥신제와 병용해서 사용되는 데에 적합한 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제는 본원에 기재되어 있다. 한 국면에서, 항커넥신제는 상처 치유에 유용한 작용제, 예를 들어 케모카인, 사이토킨, 성장 인자 또는 그의 조합물과 병용해서 투여할 수 있다. 한 양태에서, 케모카인은 케모카인 리간드 2 (Ccl2) 길항제이다. 또 다른 양태에서, 사이토킨은 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 길항제이다. 또 다른 양태에서, 사이토킨은 IL-1O이다. 한 양태에서, 성장 인자는 TGF-베타-3이다. 또 다른 양태에 따르면, 상처 치유제는 티모신 β4이다. 또 다른 양태에서, 항커넥신제는 상처 치유 증진을 위해 히드록시프롤린 및 콜라겐 유형 1α1 합성을 증가시키기 위한 IGFBP-2, IGF-7, IGF-1 또는 그의 조정제 중의 하나 이상과 병용해서 투여할 수 있다.
상처 치유에 유용한 작용제, 치료제 또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 사용하는 데에 적합한 항커넥신제는 본원에 기재되어 있고, 이에는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 ODN, 차단제 또는 기타 커넥신 결합제, 예를 들면 수용체 모방성 펩티드; 활성을 제거하기 위한 흡수제, 예를 들어 합성적으로 발현된 수용체 분자 또는 모방제; 또는 항체 뿐만 아니라, 예를 들어 갭 연접부 폐쇄/개방을 조정하는 데에 유용한 기타 작용제, 예를 들어 갭 연접부를 인산화 또는 탈인산화시키는 화합물이 포함될 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제 또는 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유용한 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법에 관한 것이다. 특정의 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 투여는 염증을 저하시키거나, 상처 내로의 호중구 및/또는 대식 세포 침윤을 저하시키거나, 육아 조직 침착을 저하시키거나, 상처 폐쇄와 치유를 가속시키기 위해 세포 이동을 증진시키거나, 화상의 경우에 상피 성장, 조직 공학처리 및 표면 회복을 촉진시키거나, 이들을 조합해서 나타내는 데에 유효하다. 특정의 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 투여는 반흔 형성을 저하시키거나 예방하는 데에 유효하다. 반흔 형성을 증진 또는 개선시키는 방법에서는, 항커넥신제를 TGF-베타-3 또는 IL-1O 또는 만노스-6-포스페이트의 투여와 병용해서, 또는 투여한 후 또는 이전에 투여하는 것이 바람직하다.
한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상피 기저 세포 분할 및 성장을 조절하는 데에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 항커넥신제는 상피 기저 세포 분할 및 성장을 조절하는 데에 유효한 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 한 양태에서, 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드는 커넥신 26 안티센스 폴리뉴클레오티드, 커넥신 43 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 혼합물이다.
한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 외층 케라틴 분비를 조절하는 데에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 항커넥신제는 외층 케라틴 분비를 조절하는 데에 유효한 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 한 양태에서, 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드는 커넥신 43 안티센스 폴리뉴클레오티드, 커넥신 31.1 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 혼합물이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상처, 예를 들어 외과적 상처 (예를 들어, 미용 및 기타 수술에서의 상처)에 투여하여 이러한 상처 부위 및 이와 바로 인접한 부위에서 하나 이상의 커넥신 단백질(들)의 발현을 하향 조절하는 단계를 포함하는, 상기 상처로 인해 고통받고 있는 환자에게서 반흔 형성을 저하시키고/시키거나 반흔 모양을 개선시키는 방법을 제공한다. 또한, 상처는 외상 또는 수술의 결과일 수 있는데, 제형은 외과적 복구 및/또는 그의 폐쇄 직전에 상처에 적용한다. 본원에서 인지된 바와 같이, 반흔 형성 또는 모양을 저하 또는 개선시키는 방법에서는, 항커넥신제를 적합한 양의 TGF-베타-3 또는 IL-1O 또는 만노스-6-포스페이트의 투여와 병용해서, 또는 투여 후 또는 이전에 투여하는 것이 바람직하다.
한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 조직 손상을 저하, 예방 또는 회복시키는 방법에 관한 것이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 상기 규정된 바와 같은 항커넥신 조성물 또는 제형과 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 물리적 외상이 가해진 상처 또는 조직에 투여하거나 이와 근접하게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 물리적 외상이 가해진 상처 및/또는 조직을 치료하는 일부로서 종창 및/또는 염증을 저하시키는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 상처는 뇌, 척수 또는 시신경, 또는 피부 또는 눈 등의 신경조직을 포함한 조직에 대한 물리적 외상의 결과이다.
한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제의 지속 투여에 관한 것이다. 한 양태에서, 항커넥신제는 약 1 내지 24시간 동안, 약 2시간 동안, 약 3시간 동안, 약 4시간 동안, 약 5시간 동안, 약 6시간 동안, 약 7시간 동안, 약 8시간 동안, 약 9시간 동안, 약 10시간 동안, 약 11시간 동안, 약 12시간 동안 또는 약 24시간 동안 투여한다. 한 양태에서, 커넥신 발현은 지속 기간 동안 하향 조절된다. 바람직하게, 커넥신 43 발현은 지속 기간 동안 하향 조절된다. 편리하게, 커넥신 43 발현은 약 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 24시간 동안 하향 조절된다. 한 양태에 따르면, 상처는 만성적 상처이다. 적합한 대상체에는 당뇨병 대상체가 포함된다.
한 국면에서, 본 발명은 유효량의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상처에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 상처가 있는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 추가의 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상처에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 추가의 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상처에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 종창 및/또는 염증을 저하, 예방 또는 회복시키는 방법을 제공한다. 추가의 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 상처에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게서 반흔 형성을 저하, 예방 또는 회복시키는 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 국면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항커넥신 조성물 또는 제형과 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를, 상처 부위에서의 재상피화 속도를 증가시키는 데에 유효한 양으로 상처 부위에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 상처가 있는 대상체에게서 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 커넥신 43 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 커넥신 31.1 안티센스 폴리뉴클레오티드와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 지속적으로 투여하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 상기 조성물(들)은 지속 방출 제형으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 조성물(들)은 지속 기간 동안 투여된다. 편리하게, 조성물은 커넥신 43 및/또는 31.1 수준 또는 활성 (예: 헤미채널 갭 연접부 활성)을 약 24시간 이상 동안 저하시키는 데에 유효하다. 한 양태에 따르면, 상처는 만성적 상처이다. 치료될 수 있는 대상체에는 당뇨병 대상체가 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 항커넥신 조성물 또는 제형과 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를, 상피 기저 세포 분할 및 성장을 조절하는 데에 유효하고/하거나 외층 케라틴 분비를 조절하는 데에 유효한 양으로 상처 부위에 지속적으로 투여하는 것을 포함하는, 상처가 있는 대상체에게서 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 조성물은 상피 기저 세포 분할 또는 성장을 조절하는 데에 유효한 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드, 바람직하게 커넥신 26 안티센스 폴리뉴클레오티드, 커넥신 43 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 혼합물을 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 외층 케라틴화를 조절하는 데에 유효한 커넥신 안티센스 폴리뉴클레오티드, 바람직하게 커넥신 31.1 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 양태에서, 상기 조성물(들)은 지속 방출 제형으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 조성물(들)은 지속 기간 동안 투여된다. 편리하게, 조성물은 커넥신 43, 26 및/또는 31.1 수준을 약 24시간 이상 동안 저하시키는 데에 유효하다. 한 양태에 따르면, 상처는 만성적 상처이다. 치료될 수 있는 대상체에는 당뇨병 대상체가 포함된다.
또 다른 국면에서, 만성적 상처가 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 커넥신 또는 커넥신 헤미채널의 발현, 형성 또는 활성을 억제할 수 있는 항커넥신제를 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 국면에서, 본 발명은 만성적 상처 또는 이러한 만성적 상처와 연관된 조직에 투여된 유효량의 항커넥신제를 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제와 병용해서, 이를 필요로 하는 대상체게 투여하는 것을 포함하는, 만성적 상처의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 만성적 상처는 만성적 피부 상처이고, 본 발명의 조성물은 유효한 기간 동안 이러한 대상체의 피부 또는 피부와 연관된 조직에 투여한다. 치료에 적합한 만성적 피부 상처는, 예를 들어 압박성 궤양, 당뇨병성 궤양, 정맥성 궤양, 동맥성 궤양, 혈관염성 궤양 및 혼합 궤양으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 만성적 상처는 완전 또는 부분적 동맥 차단으로부터 비롯되는 궤양 형성을 포함하는 동맥성 궤양일 수 있다. 만성적 궤양은 정맥 판막의 기능장애 및 관련 혈관 질환으로부터 비롯된 궤양 형성을 포함하는 정맥 울혈 궤양일 수 있다. 만성적 궤양은 외상 유도된 궤양일 수 있다.
한 양태에서, 항커넥신제는 성장 인자와 병용해서 투여한다. 바람직하게, 성장 인자는 PDGF, EGF, 또는 FGF (예: FGF-2)이다.
고정 병용물로서 투여하지 않는 경우에 바람직한 방법에는 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 성장 인자를 순차적으로 투여하는 것이 포함된다. 바람직하게, 작용제는 서로 적어도 약 30분 이내에 순차적으로 투여한다. 작용제는 또한, 서로 약 1시간 내에, 서로 약 1일 내지 약 1주 내에, 또는 기타 적당한 바 대로 투여할 수 있다. 바람직하게, 항커넥신제를 먼저 투여한다. 바람직하게, 하나 이상의 항커넥신제를 사용하는 경우에는, 항커넥신 펩티드 또는 항커넥신 펩티드 모방제, 예를 들어 헤미채널 개방을 차단 또는 저하시킬 수 있는 항커넥신제를 투여한 후에, 예를 들어 커넥신 단백질 발현을 하향 조절함으로써 헤미채널 또는 갭 연접부의 형성 또는 커넥신 발현을 차단 또는 저하시키는 항커넥신제를 투여한다. 바람직하게, 항커넥신제(들)는 항커넥신 43 작용제(들)이다.
만성적 상처를 포함한 상처를 치료하기 위한 또 다른 양태에서, 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 성장 인자 중의 어느 하나 또는 둘 다는 이러한 작용제(들)를 물리적으로 또는 상처 치료 과정시 단독으로 투여한 경우, 즉 병용해서 투여하지 않은 경우에 사용된 용량 또는 양 보다 더 적은 용량 또는 양으로 제공된다. 이와 같이 투여되는 작용제의 보다 적은 양은 전형적으로, 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/12 내지 약 1/10이고, 이는 단독으로 투여되는 경우의 작용제 양의 약 1/8, 약 1/6, 약 1/5, 약 1/4, 약 1/3 및 약 1/2일 수 있다.
한 양태에서, 만성적 상처의 치료 또는 예방 방법은 하나 이상의 항커넥신제와 하나 이상의 치료제, 상처 치유에 유용한 작용제 및/또는 갭 연접부 변성제를 지속적으로 투여하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 조성물(들)은 지속 방출 제형으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 조성물(들)은 지속 기간 동안 투여된다. 편리하게, 조성물은 약 1 내지 2시간 이상, 약 2 내지 4시간 이상, 약 4 내지 6시간 이상, 약 4 내지 8시간 이상, 약 12시간 이상, 약 18시간 이상 또는 약 24시간 이상 동안 커넥신 43 수준을 저하시키거나, 또는 커넥신 43 헤미채널 개방을 차단 또는 저하시키는 데에 유효하다. 치료될 수 있는 대상체에는 당뇨병 대상체, 및 기타 궤양 (이에는 정맥성 궤양 및 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 기타 궤양이 포함된다)이 있는 환자가 포함된다.
다음 실시예는 단지 예시를 통하여 제공되며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것을 인지해야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1
상처 치유는 8주생 마우스 상에 1.6 mm 직경 전층 절제 상처가 있는 모델을 사용하여 평가하였다. 면역조직화학 및 조직학에 이어 유전자 발현을 RT-PCR 분석하였다.
피부 상처는 재상피화 작용과 결합 조직 수축에 이은, 상처 육아 조직에서 혈관의 조밀한 네트워크를 유발시키는 혈관형성 반응의 조합에 의해 복구된다 [참고: Grose, R. and Werner, S. (2004). Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol Biotechnol 28, 147-66]. 모든 조직 손상 직후에 강력한 염증 반응이 시작된다. 이는 상처를 미생물 감염으로부터 보호해주고 상처 부위에서 숙주 세포에 대해 작용하는 많은 종류의 생체 활성 물질을 생성시켜 준다. 각종 염증성 세포가 몇 가지 상이한 기능을 이행하는 상처 내로 이동한다. 가장 초기에 상처에 동원되는 백혈구는 호중구이고, 이의 주요 작용은 미생물에 의해 침입으로부터 숙주를 방어하는 것인데, 이는 독성 무함유 산소 라디칼을 방출하고 프로-염증성 사이토킨을 분비함으로써 수행된다. 연속해서, 대식 세포는 상처 부위에 있는 호중구와 기타 세포 및 세포외 매트릭스 부스러기를 깨끗이 소모하였다. 대식 세포는 또한, 복구 반응의 후속 세포 및 조직 이동을 지시하는 사이토킨, 케모카인 및 성장 인자의 주요 생성인자이다. 염증 및 조직 복구 과정을 조절하는 수 많은 신호가 명백히 확산 가능하고 긴 거리에 걸쳐 작동하긴 하지만, 세포 부착 분자 및 세포-세포 연접부를 통한 국소적 세포-세포 소통이 또한, 상당한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
상당한 조절 역할을 할 수 있는 세포들 간의 한 가지 연접부 연결은 커넥신 계열로부터의 단백질로 형성된 6량체성 채널인 갭 연접부이다. 갭 연접부는 신체 내의 거의 모든 세포에 의해 발현되는 것으로 보고되었고 [참고: Wei, C. J., Xu, X. and Lo, C. W. (2004). Annu Rev Cell Dev Biol 20, 811-38], 세포 이동 상의 변화를 매개하는 것으로 보고되었다.
표피 상처 가장자리에서의 커넥신 43 (Cx43) 단백질의 수준은 24 내지 48시간에 걸쳐 자연적으로 감소하는 것으로 보고되었다. 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (asODN)를 피부 상처 부위와 화상 손상 부위에 적용함으로써 Cx43 단백질 수준을 하향 조절하면 대조군 센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (sODN) 처리된 상처와 비교해서 치유가 상당히 촉진된 것으로 보고되었다 [참고: Qiu, C, Coutinho, P., Frank, S., Franke, S., Law, L.Y., Martin, P., Green, CR. and Becker, D. L. (2003). Targeting connexin 43 expression accelerates the rate of wound repair. Curr Biol 13, 1697-703; Coutinho, P., Qiu, C, Frank, S., Wang, C.M., Brown, T., Green, C.R. and Becker, D.L. (2005). Limiting burn extension by transient inhibition of connexin 43 expression at the site of injury. Br J Plast Surg 58, 658-67].
실험 결과, 상처 부위의 Cx43 단백질을 급속 하향 조절하면 각질 세포 증식과 이동이 증가되었고, 섬유아세포가 상처 내로 이동하는 속도가 증가하였으며 콜라겐 매트릭스가 아래에 놓여지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 호중구 침윤 상의 감소와, 이와 수반되는 케모카인 리간드 2 (Ccl2) 및 사이토킨 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) mRNA 상의 감소를 인지하였다. 연속해서, 본 발명자들은 결과적으로 발생하는 상처 치유 과정에 대한 하류 효과를 지닌 것으로 공지되어 있는 초기 염증 반응을 저하시킨 결과일 수 있는 대식 세포의 동원 감소를 또한 인지하였다. 이들 변형된 반응이 함께 작용하여 상당히 개선된 상처 치유가 일어났다.
상처 모델 및 ODN 처리
8주생 숫컷 ICR 마우스를 다음 실험에 사용하였다. 모든 마우스는 런던 대학에 있는 환경상 제어식 클린 룸 내의 특이적 병원체 무함유 조건 하에 유지시키고, 모든 실험을 영국 홈 오피스 규제 하에 수행하였다. 할로탄을 흡입시켜 마우스를 마취시켰다. 직경이 6 mm인 4개의 전층 절제 상처를 6 mm 생검 펀치 (공급처: Kai Industries)를 이용하여 등쪽 정중선의 어느 한 측면 상의 면도된 이면 상에서 만들었다. 각 쌍의 상처에 대해, 하나의 상처에는 얼음 상에 냉각시킨 30% 플루로닉 F-127 젤 (공급처: Sigma-Aldrich) 중의 50 ㎕의 1 μM Cx43 as ODN (서열 2) (공급처: Sigma-Genosys)을 단일 국소 적용하였고, 다른 상처에는 1 μM 센스 대조군 sODN을 동일하게 적용하였다. Cx43 asODN을 적용하면 2시간 내에 전달 부위에서 Cx43 단백질이 상당히 녹다운되었다 (knockdown) [참고: Becker, D.L., McGonnell, I., Makarenkova, H.P., Patel, K., Tickle, C, Lorimer, J. and Green, C. R. (1999). Roles for alpha 1 connexin in morphogenesis of chick embryos revealed using a novel antisense approach. Dev Genet 24, 33-42; McGonnell, I.M., Green, C.R., Tickle, C. and Becker, D.L. (2001). Connexin 43 gap junction protein plays an essential role in morphogenesis of the embryonic chick face. Dev Dyn 222, 420-38; Qiu, C, Coutinho, P., Frank, S., Franke, S., Law, L.Y., Martin, P., Green, C.R. and Becker, D. L. (2003). Targeting connexin 43 expression accelerates the rate of wound repair. Curr Biol 13, 1697-703]. 각 상처 영역은 표시된 시간 간격으로 디지털 사진을 찍고, 상처 면적을 계산하였다. 모든 상처 면적은 초기 상처 면적의 비율로서 표현하였다. 일련의 몇몇 실험에서는, 클로로포름의 과다 용량을 투여하여 마우스를 사멸시킨 후 표시된 시간 간격으로 8 mm 생검 펀치 (공급처: Kai Industries)를 이용하여 상처 및 그의 주변 부위 (상처 딱지 및 상피 주변 포함)를 수거하였다. 조사된 각 시점에 대해 최소 8마리 마우스를 사용하였다.
조직학 및 면역염색
상처 조직을 PBS로 완충시킨 4% 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 박편 (6 ㎛ 두께)을 대상으로 하여 헤마톡실신 및 에오신 염색 또는 면역염색을 수행하였다. H&E에서의 육아 조직 면적 측정은 임프로비젼 오픈랩 (Improvision Openlab™) 4.0.2 소프트웨어 (공급처; Improvision)를 사용하여 수행하였다. 면역조직화학의 경우, 탈파라핀화 박편을 실온 하에 각각 20분 및 6분 동안 내인성 퍼옥시다제 차단 시약 (공급처: Dako Cytomation A/S) 및 프로테이나제 K (공급처: Dako Cytomation A/S)로 처리하였다. 이어서, 이들을 실온에서 1시간 동안 15% 탈지유로 차단시킨 후 4℃ 하에 밤새, 1:200으로 희석시킨 토끼 항-미엘로퍼옥시다제 (MPO) 폴리클로날 항체 (공급처: NeoMarkers), 1:400으로 희석시킨 랫트 항-마우스 F4/80 모노클로날 항체 (mAb) (공급처: Abcom Limited), 1:200으로 희석시킨 랫트 항-마우스 CD31 (혈소판 내피 세포 부착 분자 1, PECAM-1) mAb (공급처: PharMingen) 또는 1:200으로 희석시킨 토끼 항-마우스 TGF-β1 폴리클로날 항체 (공급처: Santa Cruz Biotechnology, Inc)와 함께 항온 배양하였다. 또한, 몇몇 박편을 실온에서 1시간 동안 1:500으로 희석시킨 팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트 (공급처: Sigma-Aldrich)와 반응시켰다. 항체를 배경 감소 성분을 수반한 항체 희석제 (공급처: Dako Cytomation A/S) 중에서 적당히 희석시켰다. 항-MPO 항체 및 항 TGF-β1 항체와 반응한 박편을 제조업자의 지시에 따라서 EnVision+™ (공급처: Dako Cytomation A/S)으로 염색하여 신호를 증강시켰다. 항-F4/80 및 항-CD31 항체와 반응한 박편을 37℃ 하에 1시간 동안 1:200으로 희석시킨 바이오티닐화 토끼 항-랫트 면역글로불린 (공급처: Dako Cytomation A/S)과 함께 항온 배양하였다. 이어서, 제조업자의 지시에 따라서 촉매된 신호 증폭 시스템 (Catalyzed Signal Amplification System®) (공급처: Dako Cytomation A/S)을 사용하여 신호를 증강시켰다. 그 후, 메틸 그린 (공급처: Dako Cytomation A/S)에 이어 MPO, TGF-β1, F4/80, 및 CD31 염색 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)에 이어 팔로이딘 염색을 이용하여 반대염색을 수행하였다.
커넥신 43, 혈관 또는 α 평활근 악틴에 대한 면역염색을 냉동상태의 상처 박편 상에서 수행하였다. 박편을 45분 동안 차단시키기에 앞서 5분 동안 4℃ 하에 아세톤에 고정시켰다. 일차 항체에서의 항온 배양은 실온에서 다음 희석율 하에 1시간 동안 수행하였다: 토끼 항-Cx43 (공급처: Sigma) 1:3,000; 이소렉틴 B_FITC 1:2000; 폰 빌레브란트 인자 (공급처: rabbit Dako) 1:400; 항-α 평활근 악틴 (공급처; Sigma) 1:400. 실온에서 1:200으로 희석시킨 항-토끼-FITC 이차 항체 (공급처: Dako)에서 1시간 동안 항온 배양하기 전에, 박편을 PBS에서 3 x 5분 동안 세척하였다. 몇몇 경우에는 핵 반대염색으로서 제1 세척액 중의 1 μM 비스-벤즈이미드 (공급처: Sigma)를 이용하여 PBS에서 3 x 5분 동안 세척하고, 시티플루오르 (Citifluor) (공급처: Citifluor, London, UK)에 올려놓았다. 디지털 영상을 직접 비교할 수 있도록 모든 파라미터를 일정하게 유지시킨 공촛점 현미경에 의해 박편을 영상화하였다.
TUNEL 염색
상처 조직을 PBS로 완충시킨 4% 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀에 포매시키며 박편으로 만들었다. 탈파라핀화 박편을 실온 하에 5분 동안 프로테이나제 K (공급처: Dako Cytomation A/S)로 처리하였다. 이어서, 이들을 제조업자의 지시에 따라서 계내 세포 사멸 탐지 키트 (공급처: Roche)를 사용하여 염색하였다. 그 후, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 이용하여 반대염색을 수행하였다. TUNEL 염색된 박편을 영상화하고, 양성 세포를 각 상처의 3개 무작위 시야, 2개 측면 및 중앙 (각 시야는 0.332 ㎟이었다)에 있는 육아 조직에서 계수하였다.
5'- 브로모 -2'- 데옥시 우리딘 ( BrdU ) 으로 표지화함으로써 증식성 세포를 탐지함
또 다른 실험에서는, 상처 입은 마우스에게 PBS 용액 중의 1 ml의 BrdU (공급처: Sigma) (1 mg/ml)을 2시간 동안 복강내 주사한 후, 1, 2, 및 7일째에 수거하였다. 상처 조직을 PBS로 완충시킨 4% 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 탈파라핀화 박편 (6 ㎛ 두께)을 제조업자의 지시에 따라서 히스토마우스 (HistoMouse™)-플러스 키트 (공급처: ZYMED Laboratories, Inc)로 처리하여 배경 신호를 감소시켰다. 박편을 제조업자의 지시에 따라서 BrdU 탐지 키트 (공급처: BD Bioscience Pharmingen)로 염색시켰다. 그 후, 메틸 그린 (공급처: Dako Cytomation A/S)을 이용하여 반대염색을 수행하였다.
호중구, 대식 세포, 섬유아세포, BrdU-양성 세포, 및 혈관형성의 측정
치료 내용을 모르는 관찰자는 0.332 ㎟의 3개 무작위 고배율 시야의 상처 층 (상처입지 않은 피부, 근막, 재생 표피 및 딱지에 의해 둘러싸인 부위로서 규정됨) 내의 MPO-양성 호중구 및 F4/80-양성 대식 세포를 계수하였다. 면역조직화학적으로 염색된 각 박편의 신생 표피 영역과 상처 주변 내의 BrdU-양성 세포를 기존에 보고된 바와 같이 계수하고 표피 100 ㎛당 세포수로 표현하였다 [참고: Mori, R., Kondo, T., Nishie, T., Ohshima, T. and Asano, M. (2004). Impairment of skin wound healing in beta-1,4-galactosyltransferase-deficient mice with reduced leukocyte recruitment. Am J Pathol 164, 1303-14]. 상처 주변에 있는 섬유아세포 유사 세포 (스핀들-외형 체를 나타내는 팔로이딘-양성 세포) 수를 고배율 시야 (각 시야는 0.332 ㎟였다)에서 또한 계수하였다. 상처 형성 후 5, 7, 10 및 14일째에 내피 세포의 폰 빌레브란트 인자 형광성 염색을 이용하여 신생혈관증식을 추적하였다. 항-α 평활근 악틴 염색에 의해 근섬유아세포를 확인하였다. 양 형광성 염색물을 정량화하기 위해, 공촛점 현미경을 사용하여 각 시점당 최대 6마리 동물로부터의 비교 영역으로부터 단일 박편 영상을 취하였다. 영상을 획득하기 위한 모든 파라미터를 일정하게 유지시켜 비교할 수 있게 하였다. 영상을 표준 역치에서 2원으로 만들고, 영상 J (NIH 영상)을 이용하여 양성 픽셀을 계수하였다.
히드록시프롤린 분석
콜라겐의 주요 성분인 히드록시프롤린 (HP)의 양을 결정함으로써 상처 부위의 콜라겐 함량을 평가하였다. 샘플을 홀트 (Halt™) 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA-무함유 (공급처: PIERCE Biotechnology Inc.)를 포함한 1 ml의 T-PER® 조직 단백질 추출 시약 (공급처: PIERCE Biotechnology Inc.)에서 균질화시키고, 4℃ 하에 20분 동안 15,000 rpm으로 원심분리시켜 부스러기를 제거하였다. BCA™ 단백질 검정 키트 (공급처: PIERCE Biotechnology Inc.)를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 시르콜 (Sircol™) 가용성 콜라겐 검정 키트 (공급처: Biocolor Ltd.)를 사용하여 HP의 양을 결정하였다. 데이터는 각 샘플에 대한 총 단백질 1 ㎍당 HP의 양 (ng/㎍)으로서 표현하였다.
세포 배양
스위스 3T3 섬유아세포를 37℃ 하에 5% CO2 항온 배양기 중에서 10% 태아 송아지 혈청 (공급처: Labtech) 및 1% 페니실린스트렙토마이신 용액 (공급처: Sigma, Poole)으로 보충시킨 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM; 공급처: Gibco)에서 성장시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 세포를 대부분의 실험에 대해 상기 배지에서 유지시켰다. 세포를 트립신 처리함으로써 계대접종시키고, 약 90%의 밀집도 하에 계대접종 6-10에서 사용하였다. 세포를 1 ml 배지를 함유하는 웰당 4 내지 5 x 105개 세포를 수반하는 24-웰 디쉬 (Nunc)에서 13 mm 유리 커버슬립 상에 도말하였다. 세포는 72시간 후에 밀집도에 도달하였고, 이어서 이를 실험에 사용하였다.
상처 형성에 의한 세포 이동 검정
섬유아세포 검정은 섬유아세포의 융합성 단층에 "상처"를 창출시키는 것을 포함하였다. 이러한 광범위하게 사용되는 시험관내 기술은 생체 내에서 이동하는 세포의 거동을 모방하고 있다 [참고: Lampugnani, M. G. (1999) Cell Migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol 96: 177-182]. 커버슬립을 가로질로 미세전극을 끌어당겨 표준 폭의 병변을 생성시킴으로써 상처 형성을 수행하였다. 37℃ 및 5% CO2 하의 항온 배양 챔버를 수반하여 짜이스 (Zeiss) 도립 현미경 상의 5배 대물렌즈를 이용하여 조영 영상을 획득하였다. 커버 슬립의 가장자리에 있는 한정 부위의 영상을 상처 형성 직후에 찍고, 4시간 후에 동일한 부위에 대한 추가 영상을 찍었는데, 이때는 이동이 일어났다는 것이 명백히 관찰되었다 (도 7E, 7F). 대조군과 처리군 각각에서 최소 8개 커버 슬립을 영상화하였다. 영상 J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 상처 부위 상의 변화 (픽셀)를 측정하는 영상 분석에 의해 이동을 정량화하였다.
섬유아세포에서의 Cx43 발현을 녹다운시키기 위해, 배지를 20 μM asODN 또는 20 μM 대조군 sODN를 함유하는 혈청 무함유 DMEM으로 대체시켰다. 이를 혈청 함유 DMEM으로 대체시키기 전에 2시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 상처 형성 검정을 상기와 같이 수행하였다. 기존의 실험 결과, Cx43 단백질의 상당한 녹다운을 달성시키기 위해서는 2시간이면 충분한 것으로 밝혀졌고 [참고: Qiu, C., Coutinho, P., Frank, S., Franke, S., Law, L. Y., Martin, P., Green, C.R. and Becker, D. L. (2003). Targeting connexin 43 expression accelerates the rate of wound repair. Curr Biol 13, 1697-703], 이러한 녹다운 과정은 상처 이동 검정 동안에 지속되는 것으로 또한 밝혀졌다.
실시간 PCR을 이용한 정량적 유전자 발현 수준 및 RNA의 분리
제조업자의 지시에 따라서 트리졸 (TRIzol) 시약 (공급처: Invitrogen)을 사용하여 피부 상처 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. 10 마이크로그램의 총 RNA를, RT-PCR하기 위한 슈퍼스크립 제1 가닥 합성 시스템 (공급처: Invitrogen)을 사용하여 cDNA 내로 역전사하였다.
Cx43, Ccl2, Colα1, TNFα 및 TGFβ1에 대한 TaqMan® 유전자 발현 검정 (공급처: Applied Biosystems)으로서 유전자 특이적 프라이머 및 프로브를 수득하였다. 효소 및 완충제 시스템을 TaqMan® 유니버설 PCR 마스터 믹스 (공급처; Applied Biosystemes)로서 구입하였다. 각 샘플을 두 번 되풀이 하여 분석하였다. 증폭 및 실시간 탐지는 DNA 엔진 옵티콘2 (Engine Opticon®2) (공급처: MJ Research Inc.)에서 수행하였다. 표적 유전자의 발현을 GAPDH 발현과 비교하였다.
통계적 분석
쌍을 이루지 않은 스튜던츠 (Student's) t 시험 또는 맨 휘트니 (Mann Whitney) U 시험을 적당히 사용하여 통계적 차이를 결정하였다. 모든 데이터는 평균 ± s.e.m으로서 제시된다. 개별 시험에 대한 기준 수준이 결과에 제공된다.
Cx43 asODN를 이용한 상처 부위에서의 Cx43의 하향 조절
Cx43은 표피의 하부 및 중앙 가시 세포 (spinous cell) 층, 및 본래 피부의 섬유아세포, 혈관 및 피부 부속기에서 주로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 손상된지 6시간 후, Cx43는 과증식성 표피에서 발현되었지만, 선도 가장자리 각질 세포에서 하향 조절되기 시작하였다. 손상 시점부터 Cx43 asODN를 전달하면 처리한지 2시간 내에 표피 및 진피에서 Cx43의 단백질 수준이 현저하게 감소되었다. 이러한 신속한 녹다운은 Cx43 단백질이 신속하게, 종종 1.5 내지 2시간 내에 전환되기 때문에 가능하다. Cx43 단백질 및 mRNA 녹다운 정도와 asODN 처리 후의 회복을 보다 정확하게 정량화하기 위해, 본 발명자들은 실시간 PCR (RT-PCR; 도 1)을 이용하여 처리된 상처 부위 대 처리되지 않은 상처 부위에서 Cx43 mRNA의 발현 수준을 비교하였다. 손상 후 1일째, Cx43 asODN 처리된 상처에서의 Cx43 mRNA의 발현은 대조군 sODN-처리된 상처와 비교하여 상당히 저하되었다 (각각 2.95 대 4.7 단위, 37% 저하; P<0.05). 그러나 손상된지 7일째까지는, 발현 수준이 두 상처 섭생에서 유사하였다 (asODN 및 대조군 sODN-처리된 경우에 각각 4.6 대 5.2 단위이다). 상처 형성된지 1일, 2일 및 7일째에 Cx43에 대한 상처의 면역염색 결과, 대조군과 비교해서 1일째에 Cx43 asODN-처리된 상처 가장자리의 표피 및 진피에서 Cx43 단백질 수준이 극히 낮은 것으로 밝혀졌다 (도 1). 2일까지는 몇몇 Cx43 염색이 Cx43 asODN-처리된 상처의 진피로 되돌아왔지만, 그 수준은 표피에서 여전히 극히 낮았다. 7일까지는 RT-PCR 발견과 일치하게, 처리군과 처리되지 않은 군 간에는 Cx43 염색 상의 명백한 차이가 없었다. 이들 결과는 이러한 Cx43 asODN을 플루로닉 젤에 의해 전달한 경우에 실제로, 상처 형성 후 초기 시점에서 Cx43 mRNA의 발현이 억제된다는 사실을 확증시켜 준다.
Cx43 asODN 처리된 상처에서의 증가된 증식 및 가속된 폐쇄
상처를 동일하게 육안으로 사진찍고 그의 면적을 디지털로 측정하였다. 본 발명자들이 기존에 보고한 바와 같이 [참고: Qiu, C., Coutinho, P., Frank, S., Franke, S., Law, L.Y., Martin, P., Green, C.R. and Becker, D. L. (2003). Targeting connexin 43 expression accelerates the rate of wound repair. Curr Biol 13, 1697-703], Cx43 asODN-처리된 상처는 1 및 2일째에 대조군 상처 보다 상당히 더 작고, 더 건조하며, 덜 염증성이며 더 신속하게 폐쇄되었다. 7일까지는 상처에 딱지가 앉았기 때문에 상처 폐쇄를 정확히 측정하는 것이 불가능하였다. 박피된 부위를 덮기 위해 손상 후 즉시 상처 가장자리로부터 재상피화가 개시되었다. 절제 상처와 절개 상처 둘 다를 Cx43 asODN 처리하면 상처는 대조군 ODN 처리된 상처 보다 더 신속하게 재상피화된다. 따라서, 본 발명자들은 이것이 부분적으로는, Cx43 asODN 처리된 상처의 피부를 치유하는 데에 있어서 각질 세포 및 섬유아세포의 증강된 증식에 기인하는 지의 여부를 조사하였다 (도 2A 내지 2H). 표피 상처 주변에서 대조군과 처리군 간의 각질 세포 증식 상의 차이가 거의 없긴 하였지만 (도 2E), 본 발명자들은 2일 및 7일 후 둘 다에서 Cx43 asODN-처리된 상처의 신생 표피에서 BrdU-양성 세포 수가 상당히 증가한다는 사실을 밝혀내었다 (도 2F). 유사하게, 피부 상처 주변에서의 BrdU-양성 세포를 계수한 결과, asODN 처리 후에 세포가 약간 더 많았으며 1일 및 2일째에 육아 조직에서 상당히 더 많은 것으로 나타났다 (도 2G 및 2H). 이들 결과는 본 발명자들의 총체적인 현미경 관찰 결과와 일치하였고, 이는 상처 부위에서 Cx43를 급속 하향 조절하면 상처-가장자리 각질 세포가 급격하게 증식하고, 이는 이들 세포가 상처를 재상피화함에 따라 지속적으로 이루어진다. 이러한 증강된 증식은 asODN 처리된 상처에서의 가속화된 재상피화와 증강된 육아 조직 성숙에 일조할 수 있다.
Cx43 asODN -처리된 상처에서 염증성 세포의 유입 감소 - 호중구 및 대식 세포
몇 가지 백혈구 계통은 조직 손상에 대한 염증 반응 동안의 다양한 시간 과정에 따라 상처 부위에 침윤된다. 2가지 주요 세포 계통은 호중구와 대식 세포인데, 이들 둘 다는 복구 과정의 각종 국면에 대한 심오한 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명자들은 앞서 Cx43 asODN-처리된 상처에서의 호중구 유입량을 평가하였고, 본 연구에서 항-MPO 항체를 사용하여 호중구 수가 대조군 처리된 상처에서 피크인 병기에서 1일 및 2일째에 그의 수가 상당히 감소하였다는 것을 확인하였다 (도 3). 상처 부위에서의 대식 세포 유입량은 재상피화 속도와 상처 부위에서의 궁극적 반흔 형성 정도와 연관될 수 있다는 명백한 증거가 있기 때문에, 본 발명자들은 F4/80 면역조직화학을 이용하여 대식 세포 수를 연구 조사하였다 (도 4A 내지 4C). 본 발명자들은 Cx43 asODN 처리된 상처 부위에서의 대식 세포 수가 대조군 sODN 처리된 상처와 비교해서 손상 후 2일 및 7일째에 상당히 감소하였는데, 이는 2일째에 33% 감소하였고 7일째에 32% 감소하였다는 사실을 밝혀내었다 (도 4C). 이들 데이터는 상처 형성 시점에 Cx43을 급속히 녹다운시키면 초기 호중구 및 후기, 대식 세포 및 염증 상 모두에서 현저한 후속 감소가 유발되었다는 명백한 지표이다.
Cx43 asODN-처리된 상처에서 Ccl2 및 TNF-α의 발현 저하
상처 부위에서 호중구 및 대식 세포는 이러한 부위 내의 세포 (각질 세포, 섬유아세포 및 내피 세포)에 대해 직접적으로 작용하고 상처 염증 반응을 증폭시키는 각종 프로-염증성 사이토킨 및 케모카인을 방출시킨다. Cx43 녹다운 후 감소된 염증성 세포 유입량이 이들 신호 수준에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 대표적인 케모카인 및 사이토킨으로서 각각 Ccl2 및 TNF-α를 분석하였다. Ccl2 및 TNF-α의 발현 수준을 정량화하기 위하여, 본 발명자들은 1일, 2일 및 7일째에 상처 조직에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다 (도 5A 및 5B). 양 mRNA는 1일째에 대조군 sODN-처리된 상처 부위에서 상당히 상향 조절되었고, 둘 다는 2일째에 발현 수준이 피크였고, 그 후에는 이들의 수준이 감소하였다. 비교하면, Cx43 asODN 처리된 상처에서 Ccl2 및 TNF-α의 발현 수준은 2일 (Ccl2) 및 7일 (TNF-α)째에 상당히 감소되었다 (P<0.05). 이들 결과는 Cx43 asODN 처리된 상처에서 호중구 및 대식 세포의 동원 감소는 실제로, 기타 세포 유형에 의한 상쇄없이 이들 신호 전달 분자의 발현 감소를 수반하였다는 지표이다.
Ccl2 및 TNF-α의 발현 수준을 정량화하기 위하여, 1일, 2일 및 7일째에 상처 조직에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다. 양 mRNA는 1일째에 대조군 sODN-처리된 상처 부위에서 상당히 상향 조절되었고, 둘 다는 2일째에 발현 수준이 피크였고, 그 후에는 이들의 수준이 감소하였다. 비교하면, Cx43 asODN 처리된 상처에서 Ccl2 및 TNF-α의 발현 수준은 2일 (Ccl2) 및 7일 (TNF-α)째에 상당히 감소되었다 (P<0.05). 이들 결과는 Cx43 asODN 처리된 상처에서 호중구 및 대식 세포의 동원 감소는 실제로, 기타 세포 유형에 의한 상쇄없이 이들 신호 전달 분자의 발현 감소를 수반하였다는 지표이다.
Cx43 asODN-처리된 상처 부위에서의 TGF-β1 발현 증가
상처 관련 성장 인자인 TGF-β1는 상처 치유 과정의 많은 단계에서 광범위한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 따라서, 본 발명자들은 상처 형성 후 1일, 2일 및 7일째에 RT-PCR을 이용하여 대조군 sODN 및 Cx43 asODN 처리된 상처 부위에서 TGF-β1의 발현 수준을 분석하였다 (도 6). TGF-β1는 1일 및 7일째에 저 수준이었는데, 대조군 상처와 처리된 상처 간에는 차이가 없었다. 그러나, 손상 후 2일째에는 asODN-처리된 상처에서의 TGF-β1의 발현이 대조군 sODN-처리된 상처와 비교해서 상당히 증가하였다 (P<0.05). 2일째 TGF-β1에 대한 면역염색 결과, 상처 부위와 인접한 조직 둘 다의 진피에서 TGF-β1 양성 세포가 나타났다. 대부분의 세포는 환형이고 백혈구 모양이다. 그러나, Cx43 asODN-처리된 조직에서는 부가의 TGF-β1 양성 세포 유형이 상처의 피부 주변에 다수 관찰될 수 있었다. 이들 세포는 신장되었고 형태 측면에서 섬유아세포와 보다 유사한 것으로 여겨졌다. 흥미롭게도, Cx43 asODN 처리된 상처의 표피에서는 TGF-β1이 대조군 상처 표피에서 보다 훨씬 더 강력하게 염색되는 것으로 나타났다 (도 6). 이들 결과는 TGF-β1의 발현 증가가 Cx43 asODN 처리 후 상처 치유에 있어서 본 발명자들이 발견한 몇몇 변화의 원인이 될 수도 있다는 가능성을 야기시킨다.
육아 조직 형성 및 성숙
결합 조직 상처 수축이 피부 복구 과정의 주요 요소인 것으로 보고되었다. 이러한 단계는 섬유아세포가 상처 층 내로 이동하고 수축성 근섬유아세포로 분화한 다음 상실되는 것과 밀접한 연관이 있다 [참고: Martin, P. (1997). Science 276, 75-81]. 로다민 팔로이딘을 DAPI 핵 반대염색과 조합하여 사용하여, 본 발명자들은 대조군 상처와 비교하여 2일째 Cx43 asODN-처리된 상처의 주변에서 신장된 섬유아세포 유사 세포의 수가 상당히 증가한 것을 발견하였다 (대조군에서는 평균 39.4이고, asODN에서는 평균 99.2이다; P<0.01) (도 7A 및 B). 이들 데이터는 상처 육아 조직을 형성하기 위한 섬유아세포의 유입이 Cx43 단백질이 감소한 시기의 상처에서 증강된다는 사실을 제안하고 있다. 이는 본 발명자들이 asODN-처리된 상처의 육아 조직에서 관찰한 증강된 이동과 상당히 더 많은 세포 증식 둘 다에 기인할 수 있다.
섬유아세포 이동 속도 증강이 Cx43 단백질 발현 상의 감소에 기인하였는 지를 연구 조사하기 위하여, 본 발명자들은 섬유아세포 상처 치유 검정을 사용하였다. 이러한 검정에서 본 발명자들은 스크라페 상처 검정을 수행하기 2시간 전에 Cx43 asODN을 섬유아세포의 융합성 배양물에 적용함으로써 Cx43 단백질을 녹다운시켰다. Cx43 단백질은 신속하게 전환되기 때문에 (반감기는 1.5 내지 2시간 정도로 짧다), 상기 단백질을 95% 녹다운시키기에는 2시간이면 충분하고, 이는 세포 유형에 따라서 8시간 내지 48시간 지속될 수 있다. Cx43 asODN로 처리시킨 섬유아세포 배양물은 대조군과 비교해서 상당히 증가된 상처 폐쇄 속도를 나타내었는데 (P=0.02), 이는 본 발명자들의 생체내 발견과 전적으로 일치한다. 이는 Cx43 단백질을 녹다운시키는 것이 시험관내와 생체내 둘 다에서 섬유아세포의 이동 속도를 증강시키고, 이로써 육아 조직 형성 속도를 증진시킨다는 사실을 강력하게 제안하고 있다.
육아 조직 면적을 측정하는 경우, 본 발명자들은 처리된 조직이 5일째에 처리되지 않은 조직 보다 약간 더 작았다는 사실을 발견하였지만, 그 차이는 유의적이지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 상처 형성 후 7일, 10일 및 14일째에 Cx43 asODN 처리된 상처가 대조군 sODN 처리된 상처 보다 육아 조직 면적이 상당히 (*P<0.05; **P<0.01) 더 작게 나타났다는 사실을 발견하였다.
육아 조직 면적을 측정하는 경우, 본 발명자들은 처리된 조직이 5일째에 처리되지 않은 조직 보다 약간 더 작았다는 사실을 발견하였지만, 그 차이는 유의적이지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 상처 형성 후 7일, 10일 및 14일째에 Cx43 asODN 처리된 상처가 대조군 sODN 처리된 상처 보다 육아 조직 면적이 상당히 (*P<0.05; **P<0.01) 더 작게 나타났다는 사실을 발견하였다 (도 9). 육아 조직의 보다 신속한 수축이 어떻게 발생하였는 지를 연구 조사하기 위하여, 본 발명자들은 세포소멸성 세포 사멸을 알아보기 위하여 TUNEL 표지화 키트를 이용하거나, 또는 근섬유아세포의 마커로서 항-평활근 악틴 (SMA)를 이용하여 박편을 염색하였다. 처리된 육아 조직에서는 세포소멸성 세포 수가 항상 약간 더 적긴 하였지만, 본 발명자들은 상처 형성 후 5일, 7일 및 10일째에 대조군 동물과 처리된 동물 간의 TUNEL 양성 세포 수에는 상당히 차이가 없다는 사실을 밝혀내었다 (도 10). 그러나, 본 발명자들은 SMA 염색의 발현에 있어서는 이들 시점 모두에서 두 군 간에 고도의 상당한 차이를 관찰하였다 (도 11). 5일째에 SMA에 대한 염색이 Cx43 asODN-처리된 상처의 육아 조직 가장자리에서 탐지될 수 있었지만, 대조군 상처에서는 염색이 전혀 관찰될 수 없었다. 7일까지는 SMA에 대한 염색이 대조군 상처의 육아 조직 가장자리와 Cx43 asODN-처리된 상처의 육아 조직 전반에 걸쳐 탐지될 수 있었다 (도 11A 및 11B). 육아 조직 가장자리에서의 염색을 정량화한 결과, Cx43 asODN-처리된 상처에서 상당히 더 높은 것으로 나타났다 ((P=0.004) (도 11E). 상처 형성 후 10일째에는 SMA에 대한 대부분의 염색이 Cx43 asODN 처리된 상처의 육아 조직 가장자리로부터 사라졌고, 단지 상처 중앙에만 약간 남아있었다. 이는 육아 조직 전반에 걸쳐 강력한 SMA 발현을 나타낸 대조군 상처와는 상당한 차이가 있었다 ((P=O.000002) (도 11C 및 11D). 이들 발견은 섬유아세포가 근섬유아세포로 분화되는 것은 Cx43 asODN 처리된 상처에서 초기에 발생하고, 이들 세포는 상처를 수축하기 시작하여 대조군 상처에서 보다 훨씬 더 신속하게 상실된다는 것을 암시한다. Cx43 asODN 처리된 상처는 그들의 육아 조직 성숙에 있어서 대조군 보다 2 내지 3일 정도 더 진행되는 것으로 여겨질 수 있다.
혈관형성
섬유아세포의 유입 이외에도, 상처 육아 조직의 기타 주요 세포성 성분은 신규 혈관의 내피 세포이다. 따라서, 본 발명자들은 상처 형성 후 5일, 7일, 10일 및 14일째에 처리된 상처 부위에서의 혈관형성을 평가하기 위하여 항-CD31 및 폰 빌레브란트 인자 항체 또는 이소렉틴B-FITC를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행하였다 (도 12A 내지 12H). 5일째에는 혈관 염색이 대조군 상처의 육아 조직에서는 관찰되지 않은 반면, Cx43 asODN 처리된 모든 상처의 육아 조직 가장자리에서는 염색이 관찰되었다. 7일째에는 Cx43 asODN 처리된 상처 6개 중에서 5개에서 전체 육아 조직 전반에 걸쳐 미세한 혈관이 발견되었지만, 이는 대조군의 육아 조직 가장자리 내로 막 유입되기 시작하였다. 그러나, asODN 처리된 상처의 혈관이 더 잘 스며들긴 하였지만, 이는 상기 시점에서 대조군 보다 상당히 더 적거나 더 얇은 것으로 여겨졌다 (도 12A). 이는 혈관 염색을 7일 및 10일째에 정량화한 경우에, 혈관이 더 큰 대조군에서 상당히 더 많은 염색이 있었다는 것을 의미한다 (7일 P= 0.0019; 10일 P=0.015). 14일째에는 혈관 크기와 염색 정도가 처리군과 대조군 둘 다에서 극히 유사하였다 (도 12E, 12F). 이러한 발견은 혈관형성이 Cx43 asODN 처리 후에는 훨씬 더 초기에 일어난다는 것을 제안하고 있다. 육아 조직 성숙과 관계된 본 발명자들의 기타 발견과 취합해 보면, 상기 처리가 상처 성숙 속도를 2 내지 3일 정도 증강시키는 것으로 볼 수 있다.
상기 결과에 나타난 바와 같이, 플루로닉 F-127 서방출 젤로부터 전달된 Cx43 asODN을 사용하여 피부 상처 치유 부위에서 Cx43을 급속히 하향 조절한 것의 병리학적 및 생물학적 결과 예시가 본원에 제시된다. 이러한 처리는 24시간 이상 동안 상처 부위 표피 및 진피에서 Cx43 단백질을 신속하게 하향 조절시켜 주는데, 48시간까지는 몇몇 피부 발현으로 돌아왔고 7일 후부터는 군 간의 명백한 차이가 없었다. 본 발명자들은 Cx43 asODN 처리가 백혈구 침윤 저하, 사이토킨 저하, 재상피화 증가 및 상처 수축 증강과 동시에 피부 상처 치유를 현저하게 가속시켰다는 사실을 밝혀내었다
염증
상처 형성에 대한 초기 반응은 전형적으로, 염증성 세포를 호중구의 형태에 이어 대식 세포의 형태로 상처 부위 내로 침윤시키는 것을 촉발시키는 프로-염증성 신호를 국소 손상 조직과 함께 방출시키는 혈병 (blood clot)이 형성되는 것이다. 이들 신호 및 침입되는 염증성 세포로부터의 신호는 상처의 재상피화와 결합 조직 수축 둘 다에 영향을 미친다 [참고: Martin, P. (1997). Science 276, 75-81]. 염증성 세포의 상처 내로의 이동 및 침윤은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용과 연관이 있고 상처에 근접한 혈관의 혈관확장과 연관이 있다. 최근에는, Cx43이 활성화 백혈구에서 발현되고, 염증성 상태 하에서 그의 혈관외유출 동안에는 백혈구-백혈구 및 백혈구-내피 세포 접촉 부위에서 발현된다는 사실과, 기능적 Cx43 채널이 사이토킨 및 면역글로불린의 방출에 관여한다는 사실이 보고되었다 [참고: Oviedo-Orta, E. and Evans, W.H. (2004). Biochim Biophys Acta 1662, 102-12]. 이에 보고된 결과는 호중구와 대식 세포 둘 다의 수가 Cx43 asODN-처리된 상처에서는 상당히 감소한 것으로 나타났는데, 이는 호중구 혈관외유출을 위한 Cx43 발현과 프로-염증성 사이토킨의 방출에 대한 요구 사항과 일치한다. 또한, 결과는 호중구 및 단구/대식 세포에 대한 화학유인물질인 것으로 보고되는 케모카인 Ccl2 및 사이토킨 TNF-α [참고: Rossi, D. and Zlotnik, A. (2000). Annu Rev Immunol 18, 217-42]은 둘 다 2일 및 7일째에 각각 Cx43 asODN 처리 후에 감소한 것으로 나타났다. 명백하게, 상처 부위에서의 이들 및 기타 성장 인자, 케모카인 및 사이토킨의 수준 감소는 상처 치유에 유용한 이들 작용제가 호중구와 기타 염증성 세포의 유입 감소의 중요한 매개제 (상류 및 하류 둘 다)라는 지표이다.
최근의 몇 가지 보고서는 정상적인 염증 반응이 피부 상처 치유에 필수적이지 않다고 주장하였다 [참고: Martin, P. and Leibovich, S.J. (2005). Trends Cell Biol.]. 유전적으로 호중구와 대식 세포가 결여된 PU.1 기능없는 (null) 마우스는 그의 야생형 형제와 유사한 속도 또는 더 신속하게 반흔 형성없이 피부 병변을 복구시키는 것으로 보고되었다 [참고: Martin, P., D'Souza, D., Martin, J., Grose, R., Cooper, L., Maki, R. and McKercher, S. R. (2003). Curr Biol 13, 1122-8]. 유사하게, 항호중구 혈청을 투여함으로써 상처 부위에서의 호중구의 수를 감소시키는 것이 더 신속한 재상피화를 유발시키는 것으로 보고되었다 [참고: Dovi, J. V., He, L.K. and DiPietro, L.A. (2003). J Leukoc Biol 73, 448-55]. 표피 이동 및 증식 능력 상의 증가와, 선도-가장자리 각질 세포 및 섬유아세포에서 Cx43 녹다운의 가능한 역할 및 염증 반응 감소 간의 상관 관계. 더우기, Cx43 녹다운은 백혈구 유입을 감소시킬 수 있다. Cx43 asODN 작용에 대한 표적 조직에는 내피 세포 또는 백혈구가 포함될 수 있는데, 이들 둘 다는 유효한 혈관외유출과 강력한 염증 반응을 위해 Cx43 발현을 요구하는 것으로 보고되었다 [참고: Oviedo-Orta, E., Hoy, T. and Evans, W.H. (2000). Immunology 99, 578-90; Oviedo-Orta, E., Gasque, P. and Evans, W.H. (2001). FASEB J 15, 768-74]. 이들 결과에 근거하여, 내피 세포 또는 백혈구에서의 Cx43 단백질 발현을 변경시키면 염증 반응이 조절될 수도 있다.
TGF-β1
Cx43 asODN 처리된 상처에서 본 발명자들은 TGF-β1에 대한 mRNA가 대조군과 비교해서 2일째에 상당히 증가하지만, 1일 및 7일째에는 처리된 상처와 대조군 상처 둘 다에서 비교적 저 수준으로 발견된다는 사실을 밝혀내었다. TGF-β1의 발현은 상처 치유 과정에 있어서 많은 주요 사건과 연관이 있는 것으로 보고되었다. 그의 보고된 활성에는 면역 억제성, 섬유아세포 이동 및 증식 증진, 상처 수축 증강, 육아 조직 형성 증강, 콜라겐 합성 및 침착 증강, 혈관형성 자극 및 재상피화 증진 활성이 포함된다. 상처에 대한 TGF-β1의 효과는 투여량과 상처 형성 모델에 다소 의존적인 것으로 보고되었다. 유전적으로 변형된 것을 사용한 실험 및 TGF-β1 신호 전달 경로의 상이한 부분의 변동에 근거한 각종 결과가 또한 보고되었다. 예를 들어, T 세포 및 B 세포가 결핍된 TGF-β1 녹아웃 마우스 (Scid -/- 마우스)에서는 상처 치유가 지연되었다 [참고: Crowe, M.J., Doetschman, T. and Greenhalgh, D.G. (2000) J. Invest. Dermatol 115:3-11]. 그러나, Smad3 녹아웃 마우스에서와 같이 TGF-β1 신호 전달 경로가 붕괴되면, 상처 치유가 촉진되었다 [참고: Ashcroft, G.S., Yang, X, Glick, A.B., Weinstein, M., Letterio, J.L., Mizel, D.E., Anzano, M., Greenwell-Wild, T., Wahl, S.M., Deng, C. and Roberts, A.B. (1999) Nat Cell Biol. 1:260-6]. 유사하게, 각질 세포에서 우점적-음성 유형 II TGF-β 수용체가 발현되면 재상피화가 다시 촉진되었다. TGF-β1의 과발현을 나타내는 트랜스제닉 마우스는 반흔 형성을 감소시키면서 보다 양질의 상처 치유를 나타내었다 [참고: Shah, M., Revis, D., Herrick, S., Baillie, R., Thorgeirson, S., Ferguson, M. and Roberts, A. (1999) Am. J. Pathol. 154:1115-24]. 유사하게, 베타 3-인테그린이 결여된 트랜스제닉 마우스는 상승 수준의 TGF-β1를 나타냈는데, 이는 치유 증강과 상처 내로의 더 신속한 섬유아세포 이동과 연관이 있다 [참고: Reynolds, L.E., Conti, F.J., Lucas, M., Grose, R., Robinson, S., Stone, M., Saunders, G., Dickson, C, Hynes, R.O., Lacy-Hulbert, A. and Hodivala-Dilke, K. (2005) Nat. Med. 11:167-74]. CD18 녹아웃 마우스는 저하된 TGF-β1 발현을 나타내고 상처 치유가 지연되었는데, 이는 TGF-β1을 상처 주변에 주사함으로써 구제될 수 있다 [참고: Peters, T., Sindrilaru, A., Hinz, B., Hinrichs, R., Menke, A., Al-Azzeh, E.A., Holzwarth, K., Oreshkova, T., Wang, H., Kess, D., Walzog, B., Sulyok, S., Sunderkotter, C, Friedrich, W., Wlaschek, M., Krieg, T. and Scharffetter-Kochanek, K. (2005) EMBO J. 24:3400-10].
본 발명자들이 2일째에 관찰한 상승 수준의 TGF-β1 염색은 상처 가장자리에 있는 신장된 섬유아세포-유사 세포와 상처 가장자리에 있는 각질 세포에서 크게 나타났다. 이는 증식과 이동 증강에 대한 기존에 보고된 TGF-β1 효과와 일치하는데 [참고: Postlethwaite, A.E., Keski-Oja, J., Moses, H.L. and Kang, A.H. (1987) J Exp Med 165:251-6], 이들 둘 다는 조직 복구의 초기 단계에서 관찰된다. 실제로, TGF-β1 상승은 이들 조건 하에서, 본 발명자들이 초기 시점에 관찰한 섬유아세포의 증식 및 이동 속도 증가와 콜라겐 합성 속도 증강 측면에서 치유를 증진시키는 데에 일조하는 요인들 중의 하나일 수 있다.
Cx43 단백질의 급속 하향 조절과 상처 관련 성장 인자 TGF-β1의 작용 둘 다가 Col1α1 발현을 활성화시키는 것으로 보고되었다 [참고: Cutroneo, K. R. (2003). How is Type I procollagen synthesis regulated at the gene level during tissue fibrosis. J Cell Biochem 90, 1-5; Waggett, A.D., Benjamin, M. and Ralphs, J.R. (2006) Eur J Cell Biol 2006 JuI 19; (Epub ahead of print)]. 처리 후 본 발명자들이 관찰한 Col1α1 발현과 콜라겐 침착 증강은 2일째에 TGF-β1의 발현 증가, 또는 Cx43 단백질 하향 조절, 또는 둘 다와 관계될 수 있다.
상처 관련 성장 인자인 TGF-β1는 상처 치유 과정의 많은 단계에서 광범위한 역할을 한다. TGF-β1는 1일 및 7일째에 저 수준이었는데, 대조군 상처와 처리된 상처 간에는 차이가 없었다. 그러나, 손상 후 2일째에는 asODN-처리된 상처에서의 TGF-β1의 발현이 대조군 sODN-처리된 상처와 비교해서 상당히 증가하였다 (P<0.05). 2일째 TGF-β1에 대한 면역염색 결과, 상처 부위와 인접한 조직 둘 다의 진피에서 TGF-β1 양성 세포가 나타났다. 대부분의 세포는 환형이고 백혈구 모양이다. 그러나, Cx43 asODN-처리된 조직에서는 부가의 TGF-β1 양성 세포 유형이 상처의 피부 주변에 다수 관찰될 수 있었다. 이들 세포는 신장되었고 형태 측면에서 섬유아세포와 보다 유사한 것으로 여겨졌다. 흥미롭게도, Cx43 asODN 처리된 상처의 표피에서는 TGF-β1이 대조군 상처 표피에서 보다 훨씬 더 강력하게 염색되는 것으로 나타났다 (도 6). 이들 결과는 TGF-β1의 발현 증가가 Cx43 asODN 처리 후 상처 치유에 있어서 본 발명자들이 발견한 몇몇 변화의 원인이 될 수도 있다는 가능성을 야기시킨다.
TGF-β1이 염증을 억제하는 것으로 제안되긴 하였지만, 본 발명자들이 관찰한 염증 저하를 선도하는 주요 인자인 것으로 예상되지 않는데, 이는 TGF-β1이 상승되기 1일 전에 이미 명백하게 나타났기 때문이다. 유사하게, TGF-β1이 상처 치유 과정의 후기 단계에서 혈관형성과 육아 조직 성숙을 증진시키는 것으로 밝혀지긴 하였지만, 본 발명자들은 이들 후기 시점에서 TGF-β1의 상승을 전혀 관찰하지 못하였고, 오히려 이는 대조군과 유사한 저 수준이었다. 따라서, 기타 요인들이 처리 후 본 발명자들이 관찰한 육아 조직의 성숙 증강을 증진시켜야만 한다.
이들 실험은 TGF-β1이 염증을 억제하고, 상처 치유 과정의 육아 조직 성숙과 혈관형성을 증진시키는 데에 밀접한 영향을 미친다는 것을 뒷받침 해주고, TGF-β1을 기타 상처 치료법과 병용하여 조정하는 것이 상처 치유 과정을 증진시키는 데에 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
이동 및 증식
섬유아세포 및 각질 세포의 이동과 증식은 상처 수축과 상처 폐쇄 둘 다에 기여하는 피부 상처 치유에 없어서는 안 되는 것이다. 본 연구에서 본 발명자들은 Cx43 asODN 처리 후 상처 부위 내로의 섬유아세포의 증강된 이동과 보다 신속한 재상피화를 나타내었다. 이들 결과는 Cx43이 세포 이동을 조정하는 데에 있어서 중요한 역할을 할 수도 있다는 것을 표시한다. 세포 이동에 있어서의 Cx43의 역할에 대한 모순되는 결과가 다른 사람에 의해 보고되었는데, 이들은 배아 발생에서는 Cx43-결핍성 프로-심외막 세포가 Cx43을 발현하는 것 보다 더 신속하게 이동하였다고 보고하였다 [참고: Li, W.E., Waldo, K., Linask, K.L., Chen, T., Wessels, A., Parmacek, M.S., Kirby, M.L. and Lo, CW. (2002). Development 129, 2031-42]. 그러나, 동일 군은 또한 기존에, Cx43 결핍성 신경 능선 세포가 감소된 이동 속도를 나타내었다고 보고하였다 [참고: Huang, G.Y., Cooper, E.S., Waldo, K., Kirby, M.L., Gilula, N.B. and Lo, CW. (1998). J Cell Biol 143, 1725-34]. 이러한 후자 발견은 소통 교란되었거나 Cx43 발현 감소된 망막 신경상피 세포의 느린 이동 속도와 일치한다 [참고: Pearson R., Luneborg, N., Becker, D.L. and Mobbs P. (2005) J. Neurosci 25 (46), 10803-10814]. 이러한 이동에 대한 소통 효과 상의 차이는 아마도, 관여한 상이한 세포 유형을 반영할 수 있고, 세포가 독립적으로 이동하는지 아니면 소통하는 군으로 이동하는지를 반영할 수 있다.
보다 신속한 재상피화와 육아 조직 형성 속도 증강은 asODN-처리군에서의 증식 증강에 기인할 수도 있는데, 이러한 처리군에서 본 발명자들은 상처 형성 후 2일 및 7일째 둘 다에서 신생 표피와 육아 조직을 발견하였다. 이동 속도와 같이, Cx43 발현과 증식에 관한 혼합 보고서가 있다. Cx43-결핍성 프로-심막외 세포 증식이 증가하였지만, 증식이 저하되는 Cx43 asODN로 처리된 발생하는 신경 망막 또는 Cx43-결핍성 심장 신경 능성 세포에서는 관찰되지 않았다 [참고: Huang, G.Y., Cooper, E. S., Waldo, K., Kirby, M. L., Gilula, N.B. and Lo, CW. (1998). J Cell Biol 143, 1725-34; Becker, D.L. and Mobbs, P. (1999) Exp . Neurology, 156, 326-332; Li, W.E., Waldo, K., Linask, K.L., Chen, T., Wessels, A., Parmacek, M.S., Kirby, M.L. and Lo, CW. (2002). Development 129, 2031-42]. 프로-심막외 세포에 대한 Cx43 감소 효과가 증식과 이동 둘 다를 증진시키는 반면, 신경 능성 세포와 망막 신경상피 세포의 효과는 증식과 이동을 교란시킨다는 사실이 흥미롭다. 본 발명자들의 실험 결과, 섬유아세포 상처 치유 검정에서 asODN을 이용하여 Cx43 발현을 저하시키는 것은 그의 이동 속도를 상당히 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, Cx43 단백질 하향 조절은 본 발명자들이 관찰한 보다 신속한 재상피화와 육아 조직 내로의 섬유아세포 이동을 도와줄 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 영향력은 세포 증식을 증강시키고 섬유아세포 이동 속도를 증가시키는 것으로 제안되었거나 [참고: Mustoe, T.A., Pierce, G.F., Thomason, A., Gramates, P., Sporn, M.B. and Deuel, T.F. (1987). Science 237, 1333-6: Postlethwaite, A.E., Keski-Oja, J., Moses, H.L. and Kang, A.H. (1987) J Exp Med 165:251-6] 또는 아마도 이 둘을 병용하는 것으로 제안된, 본 발명자들이 Cx43 asODN 처리된 상처에서 2일째에 관찰한 상승 수준의 TGF-β1로부터 유래될 수 있다.
혈관형성
혈관형성은 침입, 확장 및 재형성을 포함하는, 육아조직 형성과 성숙의 또 다른 중요한 특징이다. 이러한 연구에서는 Cx43 asODN 처리된 상처 육아 조직 내로 성장하는 혈관이 대조군 보다 훨씬 더 앞으로 진행되었다. 5일째에는 처리된 모든 상처의 육아 조직 내로 유입되는 미세한 혈관이 관찰되었지만, 모든 대조군 육아 조직에서는 혈관이 전혀 관찰되지 않았다. 7일까지 대다수의 처리된 상처 내의 육아 조직 전반에 걸쳐 미세한 혈관이 관찰될 수 있었지만, 대조군 상처의 경우에는 그 가장자리에서만 관찰되었다. 흥미롭게도, 대조군 상처에서의 혈관이 이들 초기 단계에서는 더 두꺼운 것으로 보이기 때문에, 7일 및 10일째에 염색 면적이 상당히 더 크다. 14일까지는 처리된 상처에서의 혈관이 더 큰 크기로 발생하였고 이는 대조군과 극히 유사한 것으로 여겨졌다. Cx43은 관상 혈관생성과 혈관형성에 관여하는 것으로 공지되어 있다 [참고: Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L. and Lo, C. W. (2005). Dev Biol 284, 479-98]. 그러나, 손상 후 7일까지는 Cx43 단백질 수준이 대조군 상처와 처리된 상처에서 유사하였다는 관찰 결과는 이러한 단계에서 Cx43 asODN 처리된 상처에서의 혈관형성이 본 발명자들이 초기 단계에서 관찰한 안티센스-매개된 변화에 의해 간접적으로 영향을 받은 것으로 예상된다는 것을 제안하고 있다. 혈관형성이 TGF-β1의 초기 상승에 의해 증진되는 것이 가능한데, 이는 이러한 성장 인자가 혈관형성을 증진시킨다고 보고되었기 때문이지만 [참고: Roberts, A.B., Sporn, M.B., Assoian, R.K., Smith, J.M., Roche, N.S., Wakefield, L.M., Heine, U.I., Liotta, L.A., Falanga, V., Kehrl, J.H. et al. (1986). Proc Natl Acad Sci U S A 83, 4167-71], 이를 위한 시간의 틀은 매칭되지 않는다.
육아 조직 성숙, 수축 및 세포 사멸
Cx43 asODN 처리 후 육아 조직 면적은 시종일관 대조군 상처의 면적 보다 더 작았다. 이는 몇 가지 요인에 기인하는 것으로 예상된다. 염증 반응 저하는 치유 과정의 후속 단계에 대한 몇 가지 녹-온 (knock-on) 효과를 갖는다. 호중구 침입이 감소하면 주변 조직 손상이 저하될 것이며, 대부분의 절제 상처는 염증 과정이 작동함에 따라 치유 처음 몇 일간은 크기가 확장되는 반면, 처리된 상처는 동일한 기간 내에 현저하게 수축된다. 따라서, 염증이 감소하면 섬유아세포가 채워야 하는 면적이 상당히 적어질 것으로 예상된다. 본 발명자들이 관찰한 기타 주요 효과 중의 하나가 섬유아세포 증식과 이동의 증강이기 때문에, 보다 작은 상처는 훨씬 더 신속하게 채워질 수 있고 육아 조직은 상당히 더 신속하게 성숙하기 시작한다.
요약하면, 이들 연구는 본 발명자들의 처음 데이터로 인해 상처 부위에서 Cx43 단백질 감소의 세포 생물학 하류의 기초가 되는 기전을 분석할 수 있게 되었다고 보고하였다. 국소적 하향 조절은 상처 치유의 극히 초기 사건에 강력한 영향을 미친다. 특히, 이는 염증 반응 정도를 제한하고 재상피화 개시 및 속도와 육아 조직 형성 수준 및 속도를 촉진시킨다. 이때, 육아 조직은 채워야할 면적이 보다 작고 이를 보다 신속하게 하기 때문에, 상처 수축과 성숙이 보다 빨리 유발된다. 이러한 접근 방식은 각종 임상 상황 하에서 상처 치유를 개선시키기 위한 새로운 요법에 대한 가능성을 명백히 부여해준다.
이들 연구에 기초하면, 피부 상처 부위에서 커넥신 43 발현을 실험적으로 하향 조절하면 치유 속도와 질이 현저하게 개선된다. 복구 과정의 생리학적 및 세포 생물학적 국면을 예시되는 항커넥신제 - 커넥신 43 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 이용하는 처리 및 이용하지 않은 처리에서 비교하였다. 처리된 상처는 피부 치유가 촉진되었는데, 상당히 증가된 각질 세포와 섬유아세포 증식 및 이동을 수반하였다. 섬유아세포 상처-치유 모델에서 커넥신 43을 시험관내 녹다운시키면 치유가 상당히 신속하게 이루어졌는데, 이는 상처 부위에서 콜라겐 알파1 및 일반적 콜라겐 함량, 및 전환 성장 인자 1에 대한 증가된 mRNA와 연관이 있다. 처리된 상처는 증강된 육아 조직 형성 및 성숙을 나타냈는데, 보다 신속한 혈관형성, 근섬유아세포 분화 및 상처 수축이 외견상 2 내지 3일 정도 앞서 진행되었다. 처리된 상처 내에서는 호중구와 대식 세포 둘 다의 동원이 현저하게 감소하였는데, 백혈구 침윤 저하를 수반하였다. 궁극적으로, 처리된 상처에서는 케모카인 리간드 2 및 종양 괴사 인자 알파의 mRNA 수준이 감소하였다. 이들 데이터는 이들 조건 하에, 피부 치유 과정 초기에 상처 부위에서 커넥신 43-특이적 안티센스를 이용하여 커넥신 43 단백질을 감소시키면 적어도 부분적으로는, 세포 이동과 증식을 촉진시키고 염증과 이를 유발시키는 부가의 손상을 약화시킴으로써 복구를 증강시킨다는 사실을 나타낸다.
상처 부위에서 Cx43 단백질을 급속히 하향 조절시키면 각질 세포 증식과 이동이 증가되고 섬유아세포가 상처 내로 이동하는 속도와 콜라겐 매트릭스를 내려 놓는 속도가 증가하게 된다. 이는 호중구 침윤 저하와 상관이 있고, 이와 동시에 케모카인 리간드 2 (Ccl2) 및 사이토킨 종양 괴사 인자 (TNF-α) mRNA의 감소와 상관이 있었다. 연속해서, 초기 염증 반응 저하에 따른 결과로서 추정되는 대식 세포의 동원 감소가 관찰되었다. 이와는 달리, 증가된 히드록시프롤린 및 콜라겐 유형 1α1을 수반한 TGF-β1의 발현 증가가 Cx43 AsODN 처리된 상처에서 관찰되었다. 이들 변형 반응을 취합하면 상처 치유가 상당히 개선되었다.
실시예 2
박피 세포 돼지 간질 키메라를 2주 동안 배양한 다음, 성장 인자/사이토킨 항체 어레이를 이용하여 평가하였다 (120가지 상이한 성장 인자/사이토킨의 단백질 수준을 측정한다).
각막이식술 (이식)을 위해 중앙 각막을 절개한 후 수술로부터 회복한 인간 윤부 테두리를 공기 액체 계면 기관형 배양 하에 놓아두고, 박피된 돼지 간질성 세포외 매트릭스를 중앙 영역 내로 삽입하였다 (도 14). 돼지 간질성 매트릭스를 액상 질소에서 동결-해동시킴으로써 박피시켰다 (세포를 제거함).
키메라를 2주 정도 성장시켰는데, 이때 인간 윤부 상피 세포가 재상피화되었고, 정상적인 5 내지 7개 세포 층을 지닌 돼지 간질이 상피를 완전히 분화시켰다. 또한, 인간 윤부 간질성 각질 세포가 증식되었고 윤부 테두리를 가로질러 이동하였다 (돼지 간질성 매트릭스를 인간 각질 세포와 재증식시키기 위한 간질성 삽입물).
추가의 실험에서는, 키메라를 1일째에 커넥신 43 특이적 안티센스 ODN으로 처리하였다. 이로써, 재상피화 속도가 상당히 증가하였는데, 3일 이내에 돼지 간질의 상피가 완전히 덮힌 반면, 대조군의 경우에는 7 내지 14일이 소요되었다.
배양한지 2주 후에 키메라를 반으로 절단시켰는데; 하나의 절반은 조직학적 분석용이고, 다른 절반은 성장 인자 및 사이토킨 어레이 분석용이다. 성장 인자 및 사이토킨 분석의 경우에는, 중앙 간질 영역 (인간 상피 세포로 완전히 덮혀짐) 및 부분적으로 재증식된 간질 (인간 각질 세포)를 제거하고, 줄기 세포 집단을 함유하는 인간 윤부 테두리로부터 별개로 균질화시켰다. 이러한 균질화물을 성장 인자/사이토킨 어레이 상에서 수행하고 (도 15), 어레이 막의 밀도측정 분석을 이용하여 성장 인자 수준 분석을 수행하였다. 주요 성장 인자를 분석한 결과, 흥미로운 수가 밝혀졌다 (도 16 및 도 17).
2주 동안 배양한 후 키메라의 윤부 테두리 영역과 비교하여 키메라 간질 중의 성장 인자 수준을 분석한 결과 (대조군 각막 - 안티센스 처리하지 않음), 특히 흥미로운 2개의 성장 인자를 밝혀내었다 (도 16). 이들은 키메라 간질 중의 극히 고 수준의 IGFBP-2 및 윤부 테두리 내의 보다 고 수준의 IGF-1이었다. 전자는 세포성 이동을 증진시키는 것으로 보고되었고 (간질성 각막 세포가 윤부 테두리로부터 간질을 재증식시키는 데에 필요하다), 후자는 세포 증식을 증진시키는 것으로 보고되었다 (간질을 재증식시키는 세포의 공급원을 제공하기 위해 윤부 테두리에 필요하다).
2주 동안 배양한 후 Cx43 AsODN 처리된 키메라의 윤부 테두리 영역과 비교하여 키메라 간질 중의 성장 인자 수준을 분석한 결과, 특히 흥미로운 2개의 성장 인자를 밝혀내었다 (도 17). 이들은 처리되지 않은 대조군과 비교해서 안티센스 처리된 키메라 간질 중의 극히 고 수준의 IGF-7, 및 처리되지 않은 대조군, 특히 대조군 윤부 테두리와 비교해서 윤부 테두리와 간질 둘 다에서 보다 고 수준의 IGFBP-2였다. 전자는 상피 성장을 증진시키는 것으로 보고되었고 (이는 안티센스 처리된 키메라에서 관찰된 재상피화 증가와 일치한다), 후자는 세포 이동을 증진시키는 것으로 보고되었다 (이는 안티센스 처리를 이용하여 윤부 테두리로부터 증가된 상피 증식과 일치한다).
실시예 3
2도 화상을 항커넥신제, 10 ㎍/ml의 KGF, 30 ng/ml의 PDGF 이소형, 10 ng/ml IGF-1, 및 30 ng/ml의 IGFBP-1을 포함하는 스프레이 제형으로 처리하였다. 이러한 스프레이는 공기 중에서 건조될 수 있다. 2 내지 3시간 마다 다시 적용하도록 제안되었다.
실시예 4
봉합선 상처를 폐쇄하고, 항커넥신제, 10% KGF 및/또는 5% PDGF로 구성된 국소용 연고를 봉합선에 바른 다음, 붕대를 감았다. 상처 치유를 촉진 또는 개선시키기 위해 필요에 따라 상기 연고를 다시 바를 수도 있는데, 예를 들어 약 4 내지 7일 동안 1일 2 내지 3회 정도, 또는 적당히 수행할 수 있다.
실시예 5
항커넥신제와 5% KGF, 2.5% PDGF, 10% IGFBP 중의 하나 이상을 함유하는 20% 산화아연 제형을 보다 신속한 치유를 위해 경미한 찰과상, 일광화상 및 피부마찰에 적용하였다.
실시예 6
항커넥신제와 하나 이상의 활성 항생제 성분, 예를 들어 바시트라신, 네오마이신, 및 폴리믹신 중의 하나 이상을 함유하는 제형을 제조하였다. 이러한 하나의 제형에서, 각 그램은 폴리믹신 B 설페이트 (5,000 단위), 바시트라신 아연 (400 단위) 및/또는 네오마이신 (3.5 mg)을 함유하였다. 제형의 불활성 성분에는 목적 량의 코코아 버터, 면실유, 올리브유, 나트륨 피루베이트, 토코페릴 아세테이트, 및 백색 광유가 포함될 수 있다. 바람직하게, 항커넥신제는 항커넥신 43 작용제이다. 이러한 제형은, 예를 들어 보다 신속하고/개선된 치유를 위해 경미한 절제상, 찰과상, 일광화상 및 피부마찰에 적용하였다.
실시예 7
실시예 6에 제공된 바와 같은 항커넥신제를 함유하는 제형이 또한 국소 마취제 [예: 파라목신 (paramoxine)]를 함유하도록 제조하였다.
실시예 8
실시예 6 또는 실시예 7에 제공된 바와 같은 항커넥신제를 함유하는 제형이 그라미시딘 (gramicidin)을 함유하도록 제조하였다.
실시예 9
항커넥신제와 하나 이상의 활성 항진균 성분, 예를 들어 미코나졸 니트레이를 함유하는 제형을 제조하였다. 이러한 한 가지 제형은 2% 미코나졸 니트레이트를 함유하였다. 불활성 성분에는 프로필렌 글리콜 300, 폴리솔베이트 20, 및 SD 알코올 4B가 포함될 수 있다. 생성물은 크림, 젤, 스프레이 또는 액상물로서 제형화할 수 있다. 스프레이 제형에 적합한 추진체에는 디메틸 에테르가 포함된다. 바람직하게, 항커넥신제는 항커넥신 43 작용제이다. 이러한 제형은, 예를 들어 무좀 (athlete's foot), 기수소양증 (jock itch), 및 버짐 (ringworm)을 치료하기 위해 적용하였다.
실시예 10
본 실시예는 각막 모델을 이용하여 상처를 치료하는 데에 유용한 잠재적 사이토킨을 확인하는 방법을 입증해준다. 각막은 손상에 반응하여 활성화되는, 랑게르한스 (Langerhans) 세포로서 공지된 수지상 세포를 함유하고 있다. 이때, 부가의 염증성 세포가 윤부에 있는 혈관으로부터 동원된다. 본 발명자들의 모델 각막은 혈액 공급원으로부터 단리시켜 배양하므로, 대식 세포, T-세포 및 다형핵 세포의 동원이 불가능하다.
모델 각막을 사용하여 랑게르한스 세포의 존재가 염증 반응을 유도해 내기에 충분한지의 여부와 이러한 반응이 치유 반응과 구별될 수 있는지의 여부를 결정하였다. 상이한 기술을 이용하여 2개의 매칭된 인간 각막에 상처를 내었다. 하나의 각막은 극히 저 수준의 염증을 자극하는 기술인 엑시머 레이저 광요법 각막절개 제거를 이용하여 7 mm 직경 전반에 걸쳐 폭 80 ㎛가 되도록 절개하였다. 다른 각막은 염증을 유도시키는 것으로 공지된 기술인, 1분 동안 나트륨 NaOH에 담근 7 mm 환의 필터지를 이용하여 상처를 내었다. 24시간 동안 배양한 후, 각막을 반으로 나누었다 (하나는 면역조직화학용이고, 다른 하나는 사이토킨 분석용이다). 사이토킨 어레이 분석을 위한 프로세싱 전에, 각막을 치유 영역 내의 부분과 치유 영역 밖의 부분으로 추가로 나누었다.
양 각막에서 염증 반응을 확인하였지만, 이는 알칼리 화상 내에서 증강되었다. 알칼리 화상 샘플 내에서의 보다 큰 염증에 기인하고, 그리고 괴사성 조직을 덜 제거함에 따라 레이저를 투시한 각막에서 치유가 더 신속하게 개시되기 때문에 두 군 간의 사이토킨 프로파일이 요구된다. 도 18은 양 상처에서 증가되긴 하였지만, 염증성 상처 모델에서는 훨씬 더 많이 증가된 사이토킨 군을 나타낸 것이다. 이 군에는 인터루킨이 포함되었다. 도 19는 양 모델에서 증가되긴 하였지만, 저 염증 모델에서도 마찬가지로 많이 증가되므로, 치유 개선을 표적으로 하는 사이토킨을 나타내는 사이토킨 세트를 도시한 것이다.
상처 치유 모델에서 각종 사이토킨의 효능은 상처 치유 모델에서 사이토킨 증가 효과를 평가함으로써 결정하였다. 또한, 상처 치유 속도를 증가시키고 치유 질을 개선시킬 수 있는 흥미로운 각종 사이토킨의 능력을 평가하였다.
실시예 11
본 실시예는 치료 용도용 사이토킨을 결정하는 방법을 입증하고 있다. 사이토킨은 Cx43 AsODN 처리에 의해 유도된 바와 같은 그의 변경된 수준에 근거하여 본원에 사용하도록 선택될 수 있다. 이들 사이토킨은, 예를 들어 이를 상처 치유의 각막이식술 모델에 외적으로 투여하는 경우에 각막 상처 치유에 효과를 나타낼 수 있다.
모델: 돼지 간질성 이식물이 삽입된 쌍을 이룬 인간 윤부 테두리를 대상으로 하여, 사이토킨 수준 상의 변경을 알아보기 위해 배양된 각막이식술 모델에서 시험하였다. 부가된 사이토킨의 조직 수준은 어레이 데이터에 의해 판단하였다. 일시적 연구를 위해서는, 사이토킨을 치유 과정 개시시 부가하였다. 최적의 처리 기간은 필요한 경우 부가의 데이터 지점을 이용하여 결정하였다. 치유가 Cx43 AsODN 모델과 동일한 시간 추세를 따르는 경우에는, 배양 시간을 3일 및 7일 동안 평가하였다. 치유 시간 추세는 암시야 현미경을 사용하여 결정하고, 필요에 따라 조정하였다.
기술: 사이토킨당 윤부 테두리 5개 쌍을 단계적 상승 용량으로 사용하여 용량 반응 곡선을 확립하였다.
각막 상처 치유를 연구조사하기 위한 동일한 방법을 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 사용하였는데, 단 봉합선 처리하지 않은 각막 상처 치유에서 형성되는 상피 플러그를 사용하여 간질성 상처 치유로부터 상피 상처 치유를 단리시켜야 한다. 상피 회복에 영향을 미치는 인자를 간질 세포의 영향과는 독립적으로 평가하였다. 몇몇 경우에는, 장벽 보호를 유지시키기 위해 각막 상피 상처 치유를 증가시키는 것이 바람직할 수 있으나, 연무를 유도시킬 수도 있는 간질성 상처 치유를 증가시키는 것은 그렇치 못하다.
각막 상처 치유에 관심있는 사이토킨을 확인하였다. 후보에는, 예를 들어 정상 조직 연구로부터의 IGF 및 IGFBP2와 안티센스 연구로부터의 FGF-7이 포함된다.
본원에 참고되고 언급된 모든 특허, 공개공보, 과학지, 웹 사이트, 및 기타 문헌 및 물질은 본 발명이 속하는 분야의 전문가의 기술 수준의 지표이고, 이러한 각각의 참고 문헌 및 물질은 이것이 완전히 개별적으로 참고로써 도입되거나 그의 전문이 본원에 참고로 제시되는 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로써 도입된다. 본 출원인은 이러한 모든 특허, 공개공보, 과학지, 웹 사이트, 전자적으로 입수 가능한 정보, 및 기타 참고 물질 또는 문헌으로부터의 모든 물질 및 정보를 본 명세서 내로 물리적으로 도입할 권리를 갖고 있다.
본원에 기재된 구체적 방법 및 조성물은 대표적인 바람직한 양태이고 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 기타 목적, 국면 및 양태들이 본 명세서를 고려하여 당업자에게 일어날 것이며, 이는 청구의 범위로써 규정된 바와 같은 본 발명의 요지 내에 포괄된다. 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않고서도 다양한 치환 및 변형이 본원에 기재된 발명에 대해 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 본원에 적합하고도 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 필수적인 것으로서 구체적으로 기재되지 않은 모든 요소(들), 또는 제한 사항(들)의 부재 하에서 실시할 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원의 각 경우, 본 발명의 양태 또는 실시예에서, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진", 및 "으로 이루어진"은 본 명세서 내의 기타 두 용어 중의 어느 하나로 대체될 수 있다. 또한 용어 "포함하는", "포함한", "함유하는" 등은 제한없이 광범위하게 판독되어야 한다. 본원에 적합하고도 예시적으로 기재된 방법 및 과정은 상이한 순서의 단계로 실시할 수 있고, 본원 또는 청구의 범위에 표시된 단계 순서로 반드시 제한되지는 않는다. 또한, 본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태에는 달리 명백히 표시하지 않는 한은 복수 형태가 포함된다. 어떠한 상황 하에서도, 본 특허가 본원에 구체적으로 기재된 구체적 실시예 또는 양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석되지 말아야 한다. 어떠한 상황 하에서도, 본 특허가 모든 조사자 또는 특허상표청의 기타 모든 관리 또는 고용인에 의해 작성된 설명서가 구체적이고도 무조건적으로 출원인에 의해 작성된 답변서에 명백히 채택되지 않는 한은, 이러한 설명서에 의해 제한되지 않아야 한다.
이용된 용어 및 표현은 기재하기 위해 사용된 것이며 제한하기 위한 것이 아니며, 이러한 용어 및 표현이 본원에 제시되고 기재된 특징의 모든 등가 또는 그의 일부를 배제하기 위해 사용되는 것이 아니지만, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 각종 변형이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 양태 및 임의의 특징으로써 구체적으로 기재되긴 하였지만, 본원에 기재된 개념의 변형 및 변동이 당업자에게 호소될 수 있고, 이러한 변형 및 변동은 첨부된 청구의 범위로써 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명은 본원에 광범위하고도 총체적으로 기재되었다. 총체적 설명에 속하는 보다 협소한 종 및 아부류 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이에는 절개된 물질이 본원에 구체적으로 인용되든지 아니든지 간에 상관없이, 해당 부류으로부터 모든 사항을 제거하는 단서 또는 소극적 제한을 둔 본 발명의 총체적 기재 내용이 포함된다.
기타 양태가 다음 청구의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 국면이 마르쿠쉬 (Markush) 군 측면에서 기재되는 경우, 당업자는 본 발명이 마르쿠쉬 군의 모든 개별적 구성원 또는 구성원의 아군 측면에서 또한 기재된다는 것을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CODA THERAPEUTICS, INC. <120> IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONS FOR WOUND HEALING <130> E3697-00095 <140> PCT/US2007/24085 <141> 2007-11-15 <150> 60/859,437 <151> 2006-11-15 <160> 135 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gtaattgcgg caagaagaat tgtttctgtc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggcaagagac accaaagaca ctaccagcat 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 tcctgagcaa tacctaacga acaaata 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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<210> 49 <211> 35 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 49 Glu Asp Val Trp Gly Asp Glu Gln Ser Asp Phe Thr Cys Asn Thr Gln 1 5 10 15 Gln Pro Gly Cys Asx Asn Val Cys Tyr Asx Arg Ala Phe Pro Ile Ser 20 25 30 His Ile Arg 35 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 50 Glu Ala Ile Tyr Ser Asp Glu Gln Ala Lys Phe Thr Cys Asn Thr Arg 1 5 10 15 Gln Pro Gly Cys Asp Asn Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu Ser 20 25 30 His Val Arg 35 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 51 Glu Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gln Ala Asp Phe Arg Cys Asp Thr Ile 1 5 10 15 Gln Pro Gly Cys Gln Asn Val Cys Thr Asp Gln Ala Phe Pro Ile Ser 20 25 30 His Ile Arg 35 <210> 52 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 52 Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser Lys Phe Val Cys Asn Thr 1 5 10 15 Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu 20 25 30 Ser His Val Arg 35 <210> 53 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 53 Met Tyr Val Phe Tyr Val Met Tyr Asp Gly Phe Ser Met Gln Arg Leu 1 5 10 15 Val Lys Cys Asn Ala Trp Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Val 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 35 <210> 54 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 54 Met Tyr Val Phe Tyr Phe Leu Tyr Asn Gly Tyr His Leu Pro Trp Val 1 5 10 15 Leu Lys Cys Gly Ile Asp Pro Cys Pro Asn Leu Val Asp Cys Phe Ile 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 35 <210> 55 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 55 Leu Tyr Ile Phe His Arg Leu Tyr Lys Asp Tyr Asp Met Pro Arg Val 1 5 10 15 Val Ala Cys Ser Val Glu Pro Cys Pro His Thr Val Asp Cys Tyr Ile 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Lys 35 <210> 56 <211> 40 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 56 Leu Tyr Leu Leu His Thr Leu Trp His Gly Phe Asn Met Pro Arg Leu 1 5 10 15 Val Gln Cys Ala Asn Val Ala Pro Cys Pro Asn Ile Val Asp Cys Tyr 20 25 30 Ile Ala Arg Pro Thr Glu Lys Lys 35 40 <210> 57 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 57 Leu Tyr Val Phe His Ser Phe Tyr Pro Lys Tyr Ile Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Val Lys Cys His Ala Asp Pro Cys Pro Asn Ile Val Asp Cys Phe Ile 20 25 30 Ser Lys Pro Ser Glu Lys Asn 35 <210> 58 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 58 Met Tyr Val Phe Tyr Leu Leu Tyr Pro Gly Tyr Ala Met Val Arg Leu 1 5 10 15 Val Lys Cys Asp Val Tyr Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Val 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 35 <210> 59 <211> 32 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 59 Leu Tyr Gly Trp Thr Met Glu Pro Val Phe Val Cys Gln Arg Ala Pro 1 5 10 15 Cys Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 60 <211> 32 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 60 Leu Tyr Gly Trp Thr Met Glu Pro Val Phe Val Cys Gln Arg Ala Pro 1 5 10 15 Cys Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 61 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 61 Gly Ala Leu His Tyr Phe Leu Phe Gly Phe Leu Ala Pro Lys Lys Phe 1 5 10 15 Pro Cys Thr Arg Pro Pro Cys Thr Gly Val Val Asp Cys Tyr Val Ser 20 25 30 Arg 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Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 65 Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe Leu Thr Thr Leu His 1 5 10 15 Val Cys Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val Asn Cys Tyr Val Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Asn 35 <210> 66 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 66 Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln Val His Pro Phe Tyr 1 5 10 15 Val Cys Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile Asp Cys Phe Ile Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr 35 <210> 67 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 67 Leu Leu Ile Gln Trp Tyr Ile Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Ala Val Tyr 1 5 10 15 Thr Cys Lys Arg Asp Pro Cys Pro His Gln Val Asp Cys Phe Leu Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Ile 35 40 <210> 68 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 68 Met Tyr Val Phe Tyr Val Met Tyr Asp Gly Phe Ser Met Gln Arg Leu 1 5 10 15 Val Lys Cys Asn Ala Trp Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Val 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Thr Val 35 40 <210> 69 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 69 Tyr Val Phe Tyr Phe Leu Tyr Asn Gly Tyr His Leu Pro Trp Val Leu 1 5 10 15 Lys Cys Gly Ile Asp Pro Cys Pro Asn Leu Val Asp Cys Phe Ile Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Thr Ile 35 40 <210> 70 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 70 Leu Tyr Ile Phe His Arg Leu Tyr Lys Asp Tyr Asp Met Pro Arg Val 1 5 10 15 Val Ala Cys Ser Val Glu Pro Cys Pro His Thr Val Asp Cys Tyr Ile 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Lys Val Phe Thr Tyr 35 40 <210> 71 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 71 Leu Tyr Leu Leu His Thr Leu Trp His Gly Phe Asn Met Pro Arg Leu 1 5 10 15 Val Gln Cys Ala Asn Val Ala Pro Cys Pro Asn Ile Val Asp Cys Tyr 20 25 30 Ile Ala Arg Pro Thr Glu Lys Lys Thr Tyr 35 40 <210> 72 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 72 Leu Tyr Val Phe His Ser Phe Tyr Pro Lys Tyr Ile Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Val Lys Cys His Ala Asp Pro Cys Pro Asn Ile Val Asp Cys Phe Ile 20 25 30 Ser Lys Pro Ser Glu Lys Asn Ile Phe Thr Leu 35 40 <210> 73 <211> 43 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 73 Met Tyr Val Phe Tyr Leu Leu Tyr Pro Gly Tyr Ala Met Val Arg Leu 1 5 10 15 Val Lys Cys Asp Val Tyr Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Val 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Thr Val 35 40 <210> 74 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 74 Leu Tyr Gly Trp Thr Met Glu Pro Val Phe Val Cys Gln Arg Ala Pro 1 5 10 15 Cys Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 20 25 30 Ile Phe Ile Ile 35 <210> 75 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 75 Leu Tyr Gly Trp Thr Met Glu Pro Val Phe Val Cys Gln Arg Ala Pro 1 5 10 15 Cys Pro Tyr Leu Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 20 25 30 Ile Phe Ile Ile 35 <210> 76 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 76 Gly Ala Leu His Tyr Phe Leu Phe Gly Phe Leu Ala Pro Lys Lys Phe 1 5 10 15 Pro Cys Thr Arg Pro Pro Cys Thr Gly Val Val Asp Cys Tyr Val Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Ser Leu Leu Met Leu 35 40 <210> 77 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 77 Ile Ala Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Glu Leu Lys Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Arg Cys Asp Arg Trp Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Ile Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ile Ile 35 40 <210> 78 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 78 Leu Val Gly Gln Tyr Leu Leu Tyr Gly Phe Glu Val Arg Pro Phe Phe 1 5 10 15 Pro Cys Ser Arg Gln Pro Cys Pro His Val Val Asp Cys Phe Val Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Leu Leu 35 40 <210> 79 <211> 41 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 79 Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe Leu Thr Thr Leu His 1 5 10 15 Val Cys Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val Asn Cys Tyr Ser Arg 20 25 30 Pro Thr Glu Lys Asn Val Phe Ile Val 35 40 <210> 80 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 80 Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln Val His Pro Phe Tyr 1 5 10 15 Val Cys Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile Asp Cys Phe Ile Ser 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Leu Leu 35 40 <210> 81 <211> 45 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 81 Leu Gly Thr Ala Ala Glu Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gln Ala Asp Phe 1 5 10 15 Arg Cys Asp Thr Ile Gln Pro Gly Cys Gln Asn Val Cys Thr Asp Gln 20 25 30 Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg Phe Trp Val Leu Gln 35 40 45 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 82 Leu Gly Thr Ala Ala Glu Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gln Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 83 Asp Glu Gln Ala Asp Phe Arg Cys Asp Thr Ile Gln Pro 1 5 10 <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 84 Thr Ile Gln Pro Gly Cys Gln Asn Val Cys Thr Asp Gln 1 5 10 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 85 Val Cys Thr Asp Gln Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 86 Ala Phe Pro Ile Ser His Ile Arg Phe Trp Val Leu Gln 1 5 10 <210> 87 <211> 47 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 87 Met Glu Val Gly Phe Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu His Val Cys Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val 20 25 30 Asn Cys Tyr Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Asn Val Phe Ile Val 35 40 45 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 88 Met Glu Val Gly Phe Ile Val Gly Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 89 Ile Val Gly Gln Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Phe Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 90 Gly Ile Phe Leu Thr Thr Leu His Val Cys Arg Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 91 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 91 Arg Arg Ser Pro Cys Pro His Pro Val Asn Cys Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 92 Val Asn Cys Tyr Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 93 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Asn Val Phe Ile Val 1 5 10 <210> 94 <211> 46 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 94 Leu Thr Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser Lys 1 5 10 15 Phe Val Cys Asn Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp 20 25 30 Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 35 40 45 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 95 Leu Thr Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser 1 5 10 15 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 96 Asp Glu Gln Ser Lys Phe Val Cys Asn Thr Glu Gln Pro 1 5 10 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 97 Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 98 Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 99 Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 1 5 10 <210> 100 <211> 47 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 100 Phe Glu Val Gly Phe Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln 1 5 10 15 Val His Pro Phe Tyr Val Cys Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile 20 25 30 Asp Cys Phe Ile Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Leu Leu 35 40 45 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 101 Phe Glu Val Gly Phe Leu Ile Gly Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 102 Leu Ile Gly Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln Val 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 103 Gly Phe Gln Val His Pro Phe Tyr Val Cys Ser Arg Leu Pro 1 5 10 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 104 Ser Arg Leu Pro Cys His Pro Lys Ile Asp Cys Phe 1 5 10 <210> 105 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 105 Ile Asp Cys Phe Ile Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 106 Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Phe Leu 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12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 112 Gly Phe Gln Val His Pro Phe Tyr Val Cys Ser Arg 1 5 10 <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 113 Ala Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln 1 5 10 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 114 Tyr Asp Glu Gln Ser Lys Phe Val Cys Asn Thr Glu 1 5 10 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 115 Asn Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 116 Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg 1 5 10 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 117 Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe 1 5 10 <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 118 Leu Ile Gly Gln Tyr 1 5 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 119 Gln Val His Pro Phe 1 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 120 Tyr Val Cys Ser Arg 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 121 Ser Arg Leu Pro Cys 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 122 Leu Pro Cys His Pro 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 123 Gly Glu Ser Ile Tyr 1 5 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 124 Tyr Asp Glu Gln Ser Lys 1 5 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 125 Ser Lys Phe Val Cys Asn 1 5 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 126 Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn 1 5 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 127 Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro 1 5 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 128 Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 1 5 10 <210> 129 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 129 Leu Ile Gln Tyr Phe Leu Tyr Gly Phe Gln Val His Pro Phe 1 5 10 <210> 130 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 130 Val His Pro Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Pro Cys His Pro 1 5 10 <210> 131 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 131 Val Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Tyr Asp Glu Gln Ser Lys Phe Val Cys 1 5 10 15 Asn Thr Glu Gln Pro Gly 20 <210> 132 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 132 Thr Glu Gln Pro Gly Cys Glu Asn Val Cys Tyr Asp Ala Phe Ala Pro 1 5 10 15 Leu Ser His Val Arg Phe 20 <210> 133 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown exemplary connexin peptide <400> 133 Ala Phe Ala Pro Leu Ser His Val Arg Phe Trp Val Phe Gln 1 5 10 <210> 134 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 ggcttttagc gtgaggaaag taccaaacag cagcggagtt ttaaacttta aatagacagg 60 tctgagtgcc tgaacttgcc ttttcatttt acttcatcct ccaaggagtt caatcacttg 120 gcgtgacttc actactttta agcaaaagag tggtgcccag gcaacatggg tgactggagc 180 gccttaggca aactccttga caaggttcaa gcctactcaa ctgctggagg gaaggtgtgg 240 ctgtcagtac ttttcatttt ccgaatcctg ctgctgggga cagcggttga gtcagcctgg 300 ggagatgagc agtctgcctt tcgttgtaac actcagcaac ctggttgtga aaatgtctgc 360 tatgacaagt ctttcccaat ctctcatgtg cgcttctggg tcctgcagat catatttgtg 420 tctgtaccca cactcttgta cctggctcat gtgttctatg tgatgcgaaa ggaagagaaa 480 ctgaacaaga aagaggaaga actcaaggtt gcccaaactg atggtgtcaa tgtggacatg 540 cacttgaagc agattgagat aaagaagttc aagtacggta ttgaagagca tggtaaggtg 600 aaaatgcgag gggggttgct gcgaacctac atcatcagta tcctcttcaa gtctatcttt 660 gaggtggcct tcttgctgat ccagtggtac atctatggat tcagcttgag tgctgtttac 720 acttgcaaaa gagatccctg cccacatcag gtggactgtt tcctctctcg ccccacggag 780 aaaaccatct tcatcatctt catgctggtg gtgtccttgg tgtccctggc cttgaatatc 840 attgaactct tctatgtttt cttcaagggc gttaaggatc gggttaaggg aaagagcgac 900 ccttaccatg cgaccagtgg tgcgctgagc cctgccaaag actgtgggtc tcaaaaatat 960 gcttatttca atggctgctc ctcaccaacc gctcccctct cgcctatgtc tcctcctggg 1020 tacaagctgg ttactggcga cagaaacaat tcttcttgcc gcaattacaa caagcaagca 1080 agtgagcaaa actgggctaa ttacagtgca gaacaaaatc gaatggggca ggcgggaagc 1140 accatctcta actcccatgc acagcctttt gatttccccg atgataacca gaattctaaa 1200 aaactagctg ctggacatga attacagcca ctagccattg tggaccagcg accttcaagc 1260 agagccagca gtcgtgccag cagcagacct cggcctgatg acctggagat ctag 1314 <210> 135 <211> 1149 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 atgggtgact ggagcgcctt aggcaaactc cttgacaagg ttcaagccta ctcaactgct 60 ggagggaagg tgtggctgtc agtacttttc attttccgaa tcctgctgct ggggacagcg 120 gttgagtcag cctggggaga tgagcagtct gcctttcgtt gtaacactca gcaacctggt 180 tgtgaaaatg tctgctatga caagtctttc ccaatctctc atgtgcgctt ctgggtcctg 240 cagatcatat ttgtgtctgt acccacactc ttgtacctgg ctcatgtgtt ctatgtgatg 300 cgaaaggaag agaaactgaa caagaaagag gaagaactca aggttgccca aactgatggt 360 gtcaatgtgg acatgcactt gaagcagatt gagataaaga agttcaagta cggtattgaa 420 gagcatggta aggtgaaaat gcgagggggg ttgctgcgaa cctacatcat cagtatcctc 480 ttcaagtcta tctttgaggt ggccttcttg ctgatccagt ggtacatcta tggattcagc 540 ttgagtgctg tttacacttg caaaagagat ccctgcccac atcaggtgga ctgtttcctc 600 tctcgcccca cggagaaaac catcttcatc atcttcatgc tggtggtgtc cttggtgtcc 660 ctggccttga atatcattga actcttctat gttttcttca agggcgttaa ggatcgggtt 720 aagggaaaga gcgaccctta ccatgcgacc agtggtgcgc tgagccctgc caaagactgt 780 gggtctcaaa aatatgctta tttcaatggc tgctcctcac caaccgctcc cctctcgcct 840 atgtctcctc ctgggtacaa gctggttact ggcgacagaa acaattcttc ttgccgcaat 900 tacaacaagc aagcaagtga gcaaaactgg gctaattaca gtgcagaaca aaatcgaatg 960 gggcaggcgg gaagcaccat ctctaactcc catgcacagc cttttgattt ccccgatgat 1020 aaccagaatt ctaaaaaact agctgctgga catgaattac agccactagc cattgtggac 1080 cagcgacctt caagcagagc cagcagtcgt gccagcagca gacctcggcc tgatgacctg 1140 gagatctag 1149

Claims (34)

  1. 항커넥신 43 폴리뉴클레오티드 또는 항커넥신 43 펩티드 또는 펩티드 모방제인 항커넥신 43 작용제를 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 유효한 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 대상체에게 투여하는, 시신경 또는 눈 조직의 치유를 증진 또는 개선시키는 방법에서 사용하기 위한 항커넥신 43 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드인 항커넥신 43 작용제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가 서열 1 내지 12 중에서 선택된 서열을 포함하는 것인 항커넥신 43 작용제.
  4. 제2항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가
    GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (서열 1);
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (서열 2); 및
    GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (서열 3)
    중에서 선택되는 것인 항커넥신 43 작용제.
  5. 제2항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가 15개 내지 35개 뉴클레오티드를 가지고, 생리적 조건 하에 20℃ 초과의 융점을 지닌 이중체를 형성시키도록 충분히 커넥신 43 mRNA에 대해 상보적인 항커넥신 43 작용제.
  6. 제2항에 있어서, 안티센스 폴리뉴클레오티드가 15개 내지 35개 뉴클레오티드를 가지고, 커넥신 43 mRNA의 안티센스 서열과의 상동률이 70% 이상인 항커넥신 43 작용제.
  7. 제1항에 있어서, 항커넥신 43 작용제의 양이 0.1 내지 1000 마이크로그램인, 항커넥신 43 작용제.
  8. 제1항에 있어서, 0.01 내지 100 밀리그램의 항커넥신 43 펩티드 또는 항커넥신 43 펩티드 모방제를 포함하는 항커넥신 43 작용제.
  9. 제1항에 있어서, RNAi 또는 siRNA 폴리뉴클레오티드인 항커넥신 43 작용제.
  10. 제1항에 있어서, 대상체가 포유류인 항커넥신 43 작용제.
  11. 제10항에 있어서, 포유류가 인간인 항커넥신 43 작용제.
  12. 제10항에 있어서, 포유류가 가축 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완용 동물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 항커넥신 43 작용제.
  13. 제12항에 있어서, 동물이 말인 항커넥신 43 작용제.
  14. 제12항에 있어서, 동물이 개 또는 고양이인 항커넥신 43 작용제.
  15. 시신경 또는 눈 조직의 치유를 증진 또는 개선시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항에 따르는 항커넥신 43 작용제의 성분을 포함하는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 항커넥신 43 작용제가 펩티드 또는 펩티드 모방제인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 조성물이 0.01 내지 100 밀리그램의 항커넥신 펩티드 또는 항커넥신 펩티드 모방제를 포함하는 제약 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 항커넥신 43 작용제가 폴리뉴클레오티드인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가 서열 1 내지 12 중에서 선택된 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가
    GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (서열 1);
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (서열 2); 및
    GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (서열 3)
    중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드가 15개 내지 35개 뉴클레오티드를 가지고, 생리적 조건 하에 20℃ 초과의 융점을 지닌 이중체를 형성시키도록 충분히 커넥신 43 mRNA에 대해 상보적인 제약 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 안티센스 폴리뉴클레오티드가 15개 내지 35개 뉴클레오티드를 가지고, 커넥신 43 mRNA의 안티센스 서열과의 상동률이 70% 이상인 제약 조성물.
  24. 제15항에 있어서, 조성물이 0.1 내지 1000 마이크로그램의 항커넥신 작용제를 포함하고, 항커넥신 작용제가 안티센스 폴리뉴클레오티드인 제약 조성물.
  25. 제15항에 있어서, 항커넥신 작용제가 RNAi 또는 siRNA 폴리뉴클레오티드인 제약 조성물.
  26. 치료적 유효량의 항커넥신 43 폴리뉴클레오티드 또는 항커넥신 43 펩티드 또는 펩티드 모방제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 포함하는, 시신경 또는 눈 조직의 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 데에 사용하기 위한 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 젤로서 제형화되는 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 젤이 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 기재 젤 또는 카복시메틸셀룰로스 기재 젤인 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 젤이 플루로닉(pluronic) 젤인 제약 조성물.
  30. 치료적 유효량의 제26항에 따르는 제약 조성물을 포함하는, 만성적 상처를 치료하기 위한 제약 조성물.
  31. 제15항에 있어서, 지속 방출용으로 제형화되는 것인 제약 조성물.
  32. 시신경 또는 눈에서의 신경 조직에 대한 상처를 치료하는데 사용하기 위한 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따르는 제약 조성물을 함유하는 패키지 물질을, 상처 치유 또는 조직 복구를 증진 또는 개선시키기 위하여 대상체 내에서 또는 대상체 상에서 사용한다는 사용 설명서와 함께 포함하는 제조품.
  33. 제1항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드 모방제가 서열 18의 펩티드 유사체를 포함하는 항커넥신 43 작용제.
  34. 제1항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드 모방제가 서열 19를 포함하는 항커넥신 43 작용제.
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