KR20220061972A - 간장 송달용 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트 및 제조 방법 - Google Patents

간장 송달용 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트 및 제조 방법 Download PDF

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미츠히로 이와모토
유키코 세키구치
겐타로 이토
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Abstract

본 발명은, 간 실질 세포에 있어서 약리 효과가 기대되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 2 분기 GalNAc 유닛의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염, 그것을 유효 성분으로서 함유하는 의약 등을 제공한다.

Description

간장 송달용 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트 및 제조 방법
본 발명은, 2 분기형 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc) 리간드-올리고뉴클레오티드 콘주게이트, 및 해당 콘주게이트체의 제조 방법에 관한 것이다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합 가능한 리간드로서 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc) 등을 공유 결합으로 결합한 핵산 의약 (안티센스나 siRNA 등) 과의 콘주게이트체가, 간장의 간 실질 세포에 올리고뉴클레오티드를 송달시키는 방법으로서 보고되어 있다 (비특허문헌 1 및 특허문헌 1 ∼ 9). 1 개의 올리고뉴클레오티드에 1 내지 3 개의 GalNAc 가 결합하고 있다. 또, GalNAc 가 2 개 결합하고 있는 예로는, 비특허문헌 2 에 기재가 있다.
올리고뉴클레오티드 고상 합성 후의 정제 공정에서 역상 HPLC 를 사용하는 경우, 고상 합성 공정에서 생성된 사슬 길이가 짧은 올리고머의 유지 시간과, 목적으로 하는 올리고머의 유지 시간이 근접한 경우가 많아, 큰 스케일로 고순도 정제품을 획득하는 것은 매우 곤란하다. 올리고뉴클레오티드의 고상 합성에서는, 통상적으로 뉴클레오시드의 5'-수산기가 4,4'-디메톡시트리틸 (DMTr) 기로 보호된 핵산 유닛이 사용되기 때문에 합성되는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기는 DMTr 기를 갖게 된다. 이 DMTr 기의 높은 소수성을 이용한 역상 칼럼 정제 (이후, DMTr-on 역상 칼럼 정제라고도 부른다. 「DMTr-on」이란, DMTr 기를 5' 말단에 도입한 올리고뉴클레오티드를 사용하고 있는 것을 나타낸다), 및 DMTr-on 을 이용한 이온 교환 칼럼 정제 (이후, DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제라고도 부른다.) 의 예가, 비특허문헌 3 및 4 에 기재되어 있다. 그러나, 통상적으로 GalNAc 유닛은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 수산기에, DMTr 기를 탈보호하여 도입되기 때문에, 합성된 콘주게이트는 DMTr 기를 보유하지 않는다. 그 때문에, GalNAc 유닛이 콘주게이트되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드와의 분리·정제에는, 노력과 시간이 걸리는 HPLC 로 정제할 수 밖에 없었다 (비특허문헌 5). 지금까지 GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트체에 대한, DMTr-on 역상 칼럼 정제, 또는, DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제 방법을 활용한 예는 보고되어 있지 않다.
이와 같이, 간 실질 세포에 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 송달할 수 있고, 또한 대량 제조의 면에서도 유리한 구조를 갖는 GalNAc 유닛, 및 그 GalNAc 유닛과 질환의 치료 효과가 있는 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트체의 개발, 및 그 효율적인 제조 방법이 요망되고 있다.
국제공개 제2009/073809호 국제공개 제2014/076196호 국제공개 제2014/179620호 국제공개 제2015/006740호 국제공개 제2015/105083호 국제공개 제2016/055601호 국제공개 제2017/023817호 국제공개 제2017/084987호 국제공개 제2017/131236호
Methods in Enzymology, 1999년, 313 권, 297 ∼ 321 페이지 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 3690-3693 AKTAdesign Purification - User Manual 18-1124-23 Edition AD Organic Process Research & Development 2005, 9, 212-215 Molecules 2017, 22, 1356.
GalNAc 유닛을 이용하여 합성 핵산을 간장에 송달하는 연구에 있어서 종래 사용되고 있던 링커는 리간드 부위와 핵산을 멀리 떼어놓는 것이 중요시되어, 매우 긴 골격 중에 긴 직사슬 알킬이나 고리 구조를 갖는 구조가 채용되고, 또한 대부분의 경우 3 분기 이상의 복잡한 구조를 갖고 있었다. 그러나, 이와 같은 종래형의 장사슬 알킬 링커를 채용한 콘주게이트체를 농축시킨 결과, 고농도 용액에서는 미셀이 형성되어, 적절한 용량 조제가 곤란하다는 과제가, 발명자들의 연구로 새로 발견되었다. 또, 종래의 방법에서는, GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드의 칼럼 분리의 방법이 확립되어 있지 않아, 대량 제조가 곤란하였다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 링커 구조를 갖는 2 분기 GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트체가, 간 실질 세포로의 효율적인 송달능을 유지한 채로, 고용량의 용액 중에서도 양호한 용해성을 나타냈다. 또한, GalNAc 의 6 위치 수산기 상에 소수성이 높은 보호기 (예를 들어, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMTr) 기) 를 갖는 GalNAc 유닛과 결합한 올리고뉴클레오티드를 소수성 수지 칼럼에 의해 양호한 효율로 정제할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 이로써, 해당 콘주게이트체의 대량 스케일로의 이온 교환 칼럼 정제, 또는, DMTr-on 역상 칼럼 정제가 용이해지는 것을 기대할 수 있다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(A1) 간 실질 세포에 있어서 약리 효과가 기대되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 2 분기 GalNAc 유닛의 콘주게이트로서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 또는 3' 말단에 하기 식의 2 분기 GalNAc 유닛이 결합하고, 생체 내에서 간 실질 세포에 특이적으로 송달되는 것을 특징으로 하는 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염,
[화학식 1]
Figure pct00001
[식 중, W 는, 식
[화학식 2]
Figure pct00002
을 나타내고, G 는 5-아세트아미드-2-하이드록시메틸-3,4-디하이드록시테트라하이드로피란-6-일기 (GalNAc) 를 나타내고, Z 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고, L1 및 L2 는, 일방이 메틸렌기 (CH2) 를 나타내고, 타방이 원자를 사이에 두지 않는 것을 나타내고, o, q, r, 및 s 는 서로 독립적으로 0 또는 1 을 나타내고, n 은 1 ∼ 15 의 정수를 나타내고, m 은 0 ∼ 5 의 정수를 나타내고, v 는 1 ∼ 7 을 나타낸다. 단, n 이 1 일 때 m 은 0 ∼ 5 의 정수이고, n 이 2 ∼ 15 의 정수일 때 m 은 0 이다.] 으로 나타내는 기이다.
(A2) 2 분기 GalNAc 유닛의 식 중 o 및 q 가 0 인, (A1) 에 기재된 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
(A3) 2 분기 GalNAc 유닛이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하고 있는, (A1) 또는 (A2) 의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
(A4) 2 분기 GalNAc 유닛이, 이하의 어느 식
[화학식 3]
Figure pct00003
[화학식 4]
Figure pct00004
[화학식 5]
Figure pct00005
[화학식 6]
Figure pct00006
[화학식 7]
Figure pct00007
으로 나타내는 기인, (A1) 에 기재된 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
(A5) (A1) ∼ (A4) 중 어느 하나의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염을 포함하는, 의약.
또, 본 발명은, 이하의 제조 방법 및 당해 제조 방법의 중간체로서 사용되는 소수성 보호기 부가형 GalNac 유닛을 포함하는 화합물, 콘주게이트 등을 제공한다.
(B1) 이하의 공정을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 GalNAc 유닛의 콘주게이트의 제조 방법,
a : 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 하기 식으로 나타내는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조,
[화학식 8]
Figure pct00008
[식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 수소 원자 또는 유리 (遊離) 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기 사슬수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다.] 가 결합한 콘주게이트를 합성하는 공정,
b : 공정 a 의 산물을 포함하는 용액을 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼에 통액시키고, 당해 칼럼에 수성 세정액을 통액시키는 공정, 및
c : 공정 b 후의 칼럼으로부터 올리고뉴클레오티드를 용출시키는 공정.
(B2) 소수성 보호기가, 염기성 조건 또는 산성 조건에서 제거되는 보호기, 바람직하게는 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기, 보다 바람직하게는 치환되어 있어도 되는 트리틸기 또는 치환되어 있어도 되는 실릴기인, (B1) 의 제조 방법.
(B3) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5 위치 수산기에 결합하는 것을 특징으로 하는 (B1) 의 제조 방법.
(B4) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조에 있어서, Ra 가 소수성 보호기이고, Rb 및 Rc 가 수소 원자이고, t 가 1 ∼ 3 의 정수인 것을 특징으로 하는, (B1) 의 제조 방법.
(B5) 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지가, 스티렌-디비닐벤젠계 흡착 수지, 스티렌-디비닐벤젠계 수식형 흡착 수지, 메타크릴계 흡착 수지, 및 페놀계 흡착 수지에서 선택되는 어느 것인, (B1) 의 제조 방법.
(B6) 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼이, 이온 교환 칼럼 또는 역상 칼럼인, (B1) 의 제조 방법.
(B7) 공정 a 가 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, (B1) 의 제조 방법,
a1 : 3' 말단으로부터 5' 말단 방향으로 올리고뉴클레오티드를 신장시킬 수 있는 지지체를 사용해서, 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기의 탈보호, 뉴클레오시드의 축합을 반복하여 올리고뉴클레오티드 사슬을 신장시켜, 지지체 상에서 원하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 공정 ; 여기서, 사용하는 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기 이외의 보호기는, 올리고뉴클레오티드 3' 말단과 지지체의 결합의 절단 조건 (이하,「유리 조건」) 에서 탈보호되는 보호기가 선택되고, 동 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기로는 유리 조건에서는 탈보호되지 않는 보호기가 선택된다,
a2 : 지지체 상에 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기에 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛을 도입하는 공정 : 여기서, 소수성 보호기는 유리 조건에서는 탈보호되지 않는 것이 선택된다, 및
a3 : 공정 a2 에서 얻어진 지지체를 유리 조건의 용액으로 처리하여, 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트의 용액을 얻는 공정.
(B8) 공정 b 의 후, 칼럼에 흡착된 콘주게이트에 대하여 소수성 보호기의 탈보호를 실시하고, 그 후에 공정 c 를 실시하는 것을 특징으로 하는, (B1) 의 제조 방법.
(B9) 유리 조건이 염기성이고, 소수성 보호기가 산성에서 제거되는 보호기인, (B1) 의 제조 방법.
(B10) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.)
[화학식 10]
Figure pct00010
[화학식 11]
Figure pct00011
[화학식 12]
Figure pct00012
[화학식 13]
Figure pct00013
[화학식 14]
Figure pct00014
[화학식 15]
Figure pct00015
[화학식 16]
Figure pct00016
[화학식 17]
Figure pct00017
[화학식 18]
Figure pct00018
[화학식 19]
Figure pct00019
중 어느 1 개로 나타내는 (B1) 의 제조 방법.
(B11) 이하의 식
[화학식 20]
Figure pct00020
[식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 포스포아미다이트기 (바람직하게는 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2 또는 -P(OCH3)N(CH(CH3)2)2 로 나타내는 기이다.) 또는, H-포스포네이트기 (-PH(=O)(OH)) 를 나타낸다.] 으로 나타내는 화합물 또는 그 염.
(B12) Ra 가 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기이고, Rb 및 Rc 가 아세틸기이고, Y 가 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기이고, t 가 1 ∼ 3 의 정수인 (B11) 의 화합물 또는 그 염.
(B13) 이하의 식
[화학식 21]
Figure pct00021
[식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기이고, Y 는 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 나타낸다. 이하 동 항에 있어서 동일.]
[화학식 22]
Figure pct00022
[화학식 23]
Figure pct00023
[화학식 24]
Figure pct00024
[화학식 25]
Figure pct00025
중 어느 1 개로 나타내는 (B11) 또는 (B12) 의 화합물 또는 그 염.
(B14) 이하의 식
[화학식 26]
Figure pct00026
[식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
[화학식 27]
Figure pct00027
[화학식 28]
Figure pct00028
[화학식 29]
Figure pct00029
[화학식 30]
Figure pct00030
[화학식 31]
Figure pct00031
중 어느 1 개로 나타내는 (B11) 또는 (B12) 의 화합물 또는 그 염.
(B15) 소수성 보호기가, 치환되어 있어도 되는 트리틸기이고, 포스포아미다이트기가 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2, 또는, -P(OCH3)N(CH(CH3)2)2 인, (B11) ∼ (B14) 중 어느 하나의 화합물 또는 그 염.
(B16) 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 하기 식으로 나타내는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조,
[화학식 32]
Figure pct00032
[식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 수소 원자 또는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기 사슬수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다.] 가 결합한 콘주게이트 또는 그 염.
(B17) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
[화학식 33]
Figure pct00033
[식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
[화학식 34]
Figure pct00034
[화학식 35]
Figure pct00035
[화학식 36]
Figure pct00036
[화학식 37]
Figure pct00037
중 어느 1 개로 나타내는 (B16) 의 콘주게이트 또는 그 염.
(B18) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
[화학식 38]
Figure pct00038
[식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
[화학식 39]
Figure pct00039
[화학식 40]
Figure pct00040
[화학식 41]
Figure pct00041
[화학식 42]
Figure pct00042
[화학식 43]
Figure pct00043
중 어느 1 개로 나타내는 (B16) 의 콘주게이트 또는 그 염.
(B19) 소수성 보호기가 치환되어 있어도 되는 트리틸기이고, Y 가 인산디에스테르 결합 또는 인산티오에이트 결합을 개재하여 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기와 결합하는 결합손을 나타내는, (B16) ∼ (B18) 중 어느 하나의 콘주게이트 또는 그 염.
본 발명의 콘주게이트는, 다양한 올리고뉴클레오티드에 대하여, 간장으로의 적절한 송달과 높은 수용성을 실현하였다. 또, GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트의 DMTr-on 칼럼 정제 방법이 확립됨으로써, 큰 스케일로 제조하는 것이 가능해졌다. 이로써, 약리 효과를 높이기 위한 용량의 증가나 장기간 지속 제제에 적용하기 위한 고농도 약액의 조제가 가능해져, 다양한 니즈에 따른 핵산 의약의 제품 설계가 가능해진다.
도 1 은, 실시예 8 ∼ 14 의 화합물을 헤테로 녹인 마우스에 투여하였을 때의, 간장 중의 G6PC mRNA 의 이상 (異常) 스플라이싱의 시정 효과를 나타내는 도면이다. 헤테로 녹인 마우스 간장 중의 이상 스플라이싱이 시정된 G6PC mRNA 량을 qRT-PCR 로 상대 정량 평가 (액틴의 mRNA 량으로 보정) 하고 있다. Y 축은 정상 G6PC mRNA 의 발현량에 대해, saline 투여군을 1 로 한 경우의 각 투여군에 있어서의 상대값이다 (RQ : Relative Quantification ; mpk : ㎎/㎏).
도 2 는, 실시예 15 ∼ 23 의 화합물을 헤테로 녹인 마우스에 투여하였을 때의, 간장 중의 G6PC mRNA 의 이상 스플라이싱의 시정 효과를 나타내는 도면이다. 헤테로 녹인 마우스 간장 중의 이상 스플라이싱이 시정된 G6PC mRNA 량을 qRT-PCR 로 정량 평가 (액틴의 mRNA 량으로 보정) 하고 있다. Y 축은 도 1 과 동일하다. RQ : Relative Quantification ; mpk : ㎎/㎏
도 3 은, ApoB-ASO (백발 칼럼) 및 ApoB-ASO 콘주게이트 (빈틈없이 칠한 칼럼) 를 인간 초대 배양 간세포에 첨가하였을 때의, 세포 중의 ApoB mRNA 의 분해 효과를 나타내는 도면이다. 세포 중의 ApoB mRNA 량을 qRT-PCR 로 상대 정량 평가 (액틴의 mRNA 량으로 보정) 하고 있다. Y 축은 무처치의 인간 초대 배양 간세포 중의 ApoB mRNA 량을 100 ％ 로 한 경우의 각 첨가군에 있어서의 상대값 (％) 이다.
도 4 는, DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제시의 각 공정과 크로마토그래피 차트의 상관도이다.
도 5 는, GalNAc 의 수산기에 DMTr 기를 갖는 콘주게이트의 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제시의 크로마토그램 (검출 파장 260 ㎚) 이다.
도 6 은, 올리고뉴클레오티드의 부근에 DMTr 기를 갖는 콘주게이트의 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제시의 크로마토그램 (검출 파장 260 ㎚) 이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에 있어서,「콘주게이트」란, GalNAc 유닛이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 결합한 화합물을 의미한다.
본 명세서에 있어서,「GalNAc 유닛」이란, 간장의 간 실질 세포 상의 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합 가능한 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc) 을 포함하는 부분 구조를 의미한다. GalNAc 유닛에는, 직사슬 또는 분기된 링커 구조와 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 인산기 또는 티오인산기를 포함한다. 이와 같은 결합을 위한 인산기 또는 티오인산기를 1 개 포함하는 구조 단위를,「GalNAc 유닛」이라고 부르는 경우가 있다. 1 개의 GalNac 유닛에 포함되는 GalNac 의 수에는 제한이 없고, 특별히 명시되지 않는 한, 공지된 것 및 본 명세서에 개시된 것 등을 채용할 수 있다. ASGPR 에 대한 결합능이 유지되는 한, GalNAc 의 구조가 수식되어 있어도 된다. 또, 제조 과정에 있어서 GalNAc 에 보호기가 도입된 것 등도 포함한다.
본 명세서에 있어서, 2 분기 GalNAc 유닛이란, 특별히 언급이 없는 한, 상기 (A1) 의 식으로 나타내는 GalNAc 유닛을 의미한다.
본 명세서에 있어서,「올리고뉴클레오티드」란, 1 개의 사슬 길이가 100 염기 이하인 합성 가능한 핵산을 말하며, 1 본쇄여도 되고, 2 본쇄여도 된다. 채용되는 핵산은, 후술하는 바와 같이, DNA, RNA, 천연 핵산, 수식 핵산 등을 목적에 따라 구분하여 사용할 수 있으며, 1 개의 올리고뉴클레오티드 중에 이것들이 혼재하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서,「유리 조건」이란 올리고뉴클레오티드의 합성 과정에 있어서, 지지체와 올리고뉴클레오티드의 결합을 절단하여, 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 유리시킬 때에 채용되는 처리 조건을 의미한다. 일반적인 고상 합성에 있어서의 유리 조건은 염기성이다.
본 발명에 있어서「소수성 보호기」란, 수산기의 보호기로서 이용할 수 있으며, 소수성이 높은 구조를 갖고, 또한 유리 조건에서 제거되지 않는 보호기이다. 예를 들어, 유리 조건이 염기성인 경우, 산성 조건에서 제거되는 보호기가 바람직하고, 유리 조건이 산성인 경우, 염기성에서 제거되는 보호기가 바람직하다.
본 명세서에 있어서,「포스포아미다이트기」란, -P(OR)N(CH(CH3)2)2 (여기서 R 은 C1-C3 알킬기 또는 시아노-C1-C3 알킬렌기) 로 나타내는 핵산 합성에 있어서의 아미다이트 시약에 채용되는 관능기이다. 바람직하게는 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2, -P(OCH3)N(CH(CH3)2)2 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서,「H-포스포네이트기」란, -PH(=O)(OH) 또는, 그 염으로 나타내는 핵산 합성에 채용되는 관능기이다. H-포스포네이트기를 갖는 화합물은, -PH(=O)(O-) 에 대하여, 염을 형성할 수 있다. 그러한 염으로는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염 ; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염 ; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐화수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파르트산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있고, 바람직하게는 유기염이고, 보다 바람직하게는 트리에틸아민염이다. 이들 염은, 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드끼리의 결합 또는 뉴클레오티드와 콘주게이트의 구조에 있어서,「인산기를 개재한 결합」,「인산기를 포함하는 구조」등의 용어는, 2 개의 구조 단위가 인산디에스테르 결합이나 그 수식형 (예를 들어, 포스포로티오에이트 결합) 등의, 핵산 합성에 있어서 일반적으로 사용되는 결합 양식으로 결합하고 있는 것, 그러한 결합 양식을 포함하는 구조를 의미한다.
＜1. 올리고뉴클레오티드＞
본 명세서에 있어서,「핵산」,「올리고뉴클레오티드」또는「폴리뉴클레오티드」라는 용어는, 적어도 2 개의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를, 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본쇄 중 어느 형태로 함유하는 폴리머를 가리킨다.
특별히 지시가 없는 한, 구체적 핵산 서열은, 암묵 중에 그 보존적으로 수식된 변이물 (예를 들어 축중 코돈 치환물), 대립 유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열, 그리고 명시적으로 지시된 서열도 포함한다.
1-1. 핵산의 종류
본 발명의 핵산에는 당업자에게 알려져 있는 어떠한 형태도 포함할 수 있다. 그러한 핵산의 형태의 구체예로는 1 본쇄 DNA, 1 본쇄 RNA, DNA 와 RNA 가 혼합된 1 본쇄 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 다른 형태의 핵산의 구체예로는, 2 본쇄 DNA, 2 본쇄 RNA, DNA-RNA 의 하이브리드폴리뉴클레오티드, DNA 와 RNA 가 혼합된 2 종의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는, 2 본쇄 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산을 구성하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 천연형의 것에 추가하여 화학 수식된 수식 뉴클레오시드 또는 수식 뉴클레오티드도 포함된다. 수식 뉴클레오시드/뉴클레오티드로는, 예를 들어, 당 수식 뉴클레오시드/뉴클레오티드, 핵산 염기 수식 뉴클레오시드/뉴클레오티드, 골격 수식 뉴클레오시드/뉴클레오티드, 또는 그것들의 조합을 들 수 있다 (예를 들어, Nucleic Acid Research, 1997, Vol.25, No.22, 4429-4443 참조).
본 명세서에 있어서,「천연형의 뉴클레오시드」란, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시-5-메틸시티딘, 티미딘 등의 2'-데옥시뉴클레오시드, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 5-메틸시티딘, 우리딘 등의 리보뉴클레오시드를 말한다. 또,「올리고뉴클레오티드」란, 뉴클레오시드의 당 부분이 인산과 에스테르를 형성하고 있는 화합물로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 본 명세서에 있어서는, 올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드는 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서는 2'-데옥시아데노신을 At, 2'-데옥시구아노신을 Gt, 2'-데옥시시티딘을 Ct, 2'-데옥시-5-메틸시티딘을 5meCt, 티미딘을 Tt, 2'-데옥시우리딘을 Ut, 아데노신을 Art, 구아노신을 Grt, 시티딘을 Crt, 5-메틸시티딘을 5meCrt, 우리딘을 Urt 로 나타내는 경우도 있다. 또, 본 명세서 중에 있어서는, 2'-데옥시아데노신뉴클레오티드를 Ap, 2'-데옥시구아노신뉴클레오티드를 Gp, 2'-데옥시시티딘뉴클레오티드를 Cp, 2'-데옥시-5-메틸시티딘뉴클레오티드를 5meCp, 티미딘뉴클레오티드를 Tp, 2'-데옥시우리딘뉴클레오티드를 Up, 아데노신뉴클레오티드를 Arp, 구아노신뉴클레오티드를 Grp, 시티딘뉴클레오티드를 Crp, 5-메틸시티딘뉴클레오티드를 5meCrp, 우라실뉴클레오티드를 Urp 로 나타내는 경우도 있다.
본 명세서에 있어서는 뉴클레오티드의 인산에스테르 대신에 포스포로티오에이트에스테르로 되어 있는 포스포로티오에이트에스테르에 대해, Ap 에 대응하는 것으로서 As, Gp 에 대응하는 것으로서 Gs, Cp 에 대응하는 것으로서 Cs, 5meCp 에 대응하는 것으로서 5meCs, Tp 에 대응하는 것으로서 Ts, Up 에 대응하는 것으로서 Us, Arp 에 대응하는 것으로서 Ars, Grp 에 대응하는 것으로서 Grs, Crp 에 대응하는 것으로서 Crs, 5meCrp 에 대응하는 것으로서 5meCrs, Urp 에 대응하는 것으로서 Urs 로 나타내는 경우도 있다.
본 명세서에 있어서의,「당 수식 뉴클레오시드」란, 뉴클레오시드의 당 부분이 수식되어 있는 뉴클레오시드를 말한다. 당 수식 뉴클레오시드로는, 예를 들어, 2'-O-메틸뉴클레오시드, 2'-O,4'-C-에틸렌뉴클레오시드 (ENA), 2'-O,4'-C-메틸렌뉴클레오티드 (BNA/LNA) 를 들 수 있다.
이 중, 2'-O-메틸 수식의 예로는, 2'-O-메틸뉴클레오시드 및 2'-O-메틸뉴클레오티드가 있으며, Art 에 대응하는 것으로서 Am1t, Grt 에 대응하는 것으로서 Gm1t, Crt 에 대응하는 것으로서 Cm1t, 5meCrt 에 대응하는 것으로서 5meCm1t, Urt 에 대응하는 것으로서 Um1t, Arp 에 대응하는 것으로서 Am1p, Grp 에 대응하는 것으로서 Gm1p, Crp 에 대응하는 것으로서 Cm1p, 5meCrp 에 대응하는 것으로서 5meCm1p, Urp 에 대응하는 것으로서 Um1p, Ars 에 대응하는 것으로서 Am1s, Grs 에 대응하는 것으로서 Gm1s, Crs 에 대응하는 것으로서 Cm1s, 5meCrs 에 대응하는 것으로서 5meCm1s, Urs 에 대응하는 것으로서 Um1s 로 나타내는 경우도 있다.
본 명세서에 첨부하는 서열표에 있어서, 각 서열의 ＜223＞ 의 항목 중에서 "cm" 은 2'-O-메틸시티딘 (2'-O-Methylcytidine) 을 나타내고, "um" 은 2'-O-메틸우리딘 (2'-O-Methyluridine) 을 나타내고, "gm" 은 2'-O-메틸구아노신 (2'-O-Methylguanosine) 을 나타낸다.
본 명세서에 있어서 2'-O,4'-C-에틸렌뉴클레오티드 유닛 및「ENA 유닛」이란 상기 각 뉴클레오시드, 각 뉴클레오티드에 있어서 ENA 를 갖는 것을 말하며, At 에 대응하는 것으로서 A2t, Ap 에 대응하는 것으로서 Ae2p, As 에 대해서는 Ae2s, Gt 에 대응하는 것으로서 G2t, Gp 에 대응하는 것으로서 Ge2p, Gs 에 대해서는 Ge2s, 5meCt 에 대응하는 것으로서 C2t, 5meCp 에 대응하는 것으로서 Ce2p, 5meCs 에 대해서는 Ce2s, Tt 에 대응하는 것으로서 T2t, Tp 에 대응하는 것으로서 Te2p, Ts 에 대해서는 Te2s 라고 하는 바와 같이 ENA 유닛을 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 나타내는 경우도 있다.
본 명세서에 있어서 2'-O,4'-C-메틸렌뉴클레오티드 유닛 및「2',4'-BNA/LNA 유닛」이란 상기 각 뉴클레오시드, 각 뉴클레오티드에 있어서 2',4'-BNA/LNA 를 갖는 것을 말하며, At 에 대응하는 것으로서 A1t, Ap 에 대응하는 것으로서 Ae1p, As 에 대해서는 Ae1s, Gt 에 대응하는 것으로서 G1t, Gp 에 대응하는 것으로서 Ge1p, Gs 에 대해서는 Ge1s, 5meCt 에 대응하는 것으로서 C1t, 5meCp 에 대응하는 것으로서 Ce1p, 5meCs 에 대해서는 Ce1s, Tt 에 대응하는 것으로서 T1t, Tp 에 대응하는 것으로서 Te1p, Ts 에 대해서는 Te1s 라고 하는 바와 같이 2',4'-BNA/LNA 유닛을 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 나타내는 경우도 있다.
1-2. 표적 유전자
본 명세서에 있어서,「표적 유전자」란, 이것을 도입하는 세포, 조직, 혹은 개체 (이하 이것을「피도입체」라고 칭하는 경우가 있다.) 에 있어서 RNA 이면 특별히 제한되지 않고, 단백질로 번역되는 mRNA 여도 되고 단백질로 번역되지 않는 논코딩 RNA 여도 된다. 논코딩 RNA 로는, 기능성 RNA, 예를 들어, mRNA 의 비번역 영역, tRNA, rRNA, mRNA 형 ncRNA (mRNA-likenon-coding RNA), 장사슬 ncRNA (longnon-coding RNA), snRNA (smallnuclear RNA), snoRNA (smallnucleolar RNA), miRNA (microRNA) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 도입하는 피도입체에 내재성의 것이어도 되고, 유전자 도입 등의 수법에 의해 도입되는 외래성의 것이어도 된다. 또, 염색체 상에 존재하는 유전자여도 되고, 염색체 밖의 것이어도 된다. 외래성의 유전자로는, 예를 들어, 피도입체에 감염 가능한 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생 동물 유래의 것을 들 수 있지만 이것들에 제한되지 않는다. 유전자의 기능에 대해서는 이미 알려진 것이어도 되고 미지의 것이어도 된다.
그러한 표적 유전자의 예로는, 간장에 있어서의 특정한 질환을 갖는 환자에 있어서 특이적으로 간장에서 발현이 상승하고 있는 및/또는 특이적으로 변이되어 있는 유전자를 들 수 있다. 질환으로는, 예를 들어, 순환기 질환 (예를 들어, 고혈압증, 심비대, 협심증, 동맥경화증, 고콜레스테롤 혈증 등), 암 (예를 들어, 간장암 등), 호흡기 질환 (예를 들어, 폐렴, 기관지염, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐섬유증 등), 당뇨병, 당뇨병 망막증, 당뇨병성 신증, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 수반되는 빈혈, 철 불응성 철 결핍성 빈혈 등), 가령성 황반 변성증, 면역계 질환 (예를 들어, 자기 면역 질환, 면역 부전, 백혈병 등), 간장·담낭 질환 (예를 들어, 비알코올성 지방성 간염, 간경변, 간염, 간부전, 담즙 울체증, 결석 등), 소화관 질환 (예를 들어, 궤양, 장염, 흡수 불량 등), 감염증, 비만, 섬유증 (예를 들어, 간섬유증 등) 을 들 수 있다.
이들 질환의 원인 유전자로는, 예를 들어, kinesin spindle protein (KSP), vascular endothelial growth factor (VEGF), transthyretin (TTR), proprotein convertase subtilisn/kexin type 9 (PCSK9), polo-like kinase 1 (PLK-1), ApoB-100, ribonucleotide reductase M2 subunit (RRM2), clusterin, heat shock protein 27 (Hsp27), survivin, eukaryotic initiation factor-4E (eIF-4E), alpha subunit of the interleukin 4 receptor (IL-4R-alpha), Factor XI, Factor VII, N-ras, H-ras, K-ras, bcl-2, bcl-xL, Her-1, Her-2, Her-3, Her-4, MDR-1, 인간 β-카테닌 유전자, DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), Myeloid Cell Leukemia Sequence 1 (MCL1) 유전자, PKR (Eif2ak2), Hsp47 (Serpinh1), Hepcidin, 활성화 프로테인 C (APC), signal tranducer and activator of transcription (STAT3), Collagen, type I, alpha 1 (Col1A1), ApoC-III, angiopoietin-like 3 protein (ANGPTL3), growth hormone receptor (GHr), prekallikrein (PKK), transmembrane protease, serine 6 (TMPRSS6), lipoprotein (a), glucagon receptors, or diacylglycerol acyltransferase 2 (DGAT2), angiotensinogen, complement factor B (FB), aminolevulinic acid synthase 1 (ALAS1), antithrombin (AT), Primary Hyperoxaluria Type 1 (PH1), C5 component of the complement, alpha-1 antitrypsin (AAT), hepatitis B virus (HBV) genome 을 들 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다.
1-3. 2 본쇄 올리고뉴클레오티드
본 발명의 핵산이 표적 유전자에 대하여 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산인 경우에는, 핵산의 RNA 간섭 작용을 갖는 한에 있어서 그 구조 및 화학 수식에 제한은 없지만, 예를 들어, siRNA (예를 들어, WO2002/044321, Current Opinion in Chemical Biology 570-579, 참조), RNA 와 2'-OMeRNA 를 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 AtuRNAi (예를 들어 WO2004/015107 참조), 이하의 3-4-1 의 항에서 설명하는, DNA 와 2'-OMeRNA 가 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드에 있어서 센스 사슬과 안티센스 사슬이 상이한 종류의 핵산이 왓슨-크릭 염기쌍으로 2 본쇄을 형성하고 있는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, WO2010/001909 참조), 이하의 3-4-2 의 항에서 설명하는, 올리고뉴클레오티드의 말단이 수식된 핵산 (예를 들어, WO2010/052715 참조), 및 이하의 3-4-3 의 항에서 설명하는, 안티센스 사슬 폴리뉴클레오티드의 5' 말단과 센스 사슬 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 각각이 링커를 개재하여 결합해서 1 본쇄가 되고, 추가로 분자 내에서 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 2 본쇄 구조를 갖는 1 본쇄 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, WO2012/074038 참조) 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 있어서,「표적 유전자와 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진다」는 것이란, 표적 유전자의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열로 이루어지는 것을 말하는데, 완전히 동일한 서열에 추가하여, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서, 실질적으로 동일한 서열도 포함한다. 「표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진다」는 것이란, 표적 유전자의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열로 이루어지는 것을 말하는데, 완전히 상보적인 서열에 추가하여, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서, 실질적으로 동일한 서열도 포함한다. 또, 표적 유전자에 SNPs 등이 알려져 있는 경우, 그것들의 변이를 갖는 서열도 동일한 뉴클레오티드 서열에 포함된다. 본 명세서 중에 있어서, 표적 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 표적 유전자에 대하여 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 폴리뉴클레오티드를 표적 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드라고 한다.
본 발명의 핵산의 뉴클레오티드 서열은, 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한에 있어서 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어, GENETYX (등록 상표) : GENETYX COORPORATION 제조 등.) 를 사용하여 표적 유전자에 대한 RNA 간섭 작용을 갖는 것으로 예상된 서열에 기초하여 센스 사슬 및 안티센스 사슬의 서열을 결정함으로써 결정할 수도 있고, 또한 선택된 서열에 기초하여 제조한 올리고뉴클레오티드의 RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 확인함으로써 결정할 수도 있다.
RNA 간섭 작용을 갖는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드의 센스 사슬 및 안티센스 사슬의 사슬 길이는, RNA 간섭 작용 및/또는 유전자 발현 억제 작용을 갖는 한, 10 뉴클레오티드에서 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 전체 길이까지의 어떠한 길이, 바람직하게는 18 뉴클레오티드에서, 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 전체 길이까지의 어떠한 길이, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 뉴클레오티드이고, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 30 뉴클레오티드이다.
RNA 간섭 작용을 갖는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드로서, DNA 와 2'-OMeRNA 가 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드에 있어서 센스 사슬과 안티센스 사슬이 상이한 종류의 핵산으로 왓슨-크릭 결합을 하고 있는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드 (WO2010/001909) 를 사용하는 경우에는, 센스 사슬로는, 18 ∼ 21 의 사슬 길이의 것이 바람직하고, 18 ∼ 19 의 사슬 길이의 것이 더욱 바람직하다. 안티센스 사슬로는, 19 ∼ 21 의 사슬 길이의 것이 바람직하고, 21 사슬 길이의 것이 더욱 바람직하다. 또 그 전체가 2 본쇄 구조일 필요는 없으며 5' 및/또는 3' 말단이 일부 돌출된 것도 포함하고, 그 돌출 말단은 1 ∼ 5 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 ∼ 3 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 2 뉴클레오티드이다. 또, 가장 바람직한 예로는, 안티센스 사슬의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 2 뉴클레오티드 돌출되어 있는 (오버행 구조) 구조를 갖고, 18 염기쌍을 형성하고 있는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
1-3-1. DNA 와 2'-OMeRNA 가 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드
본 발명의 핵산 지질 입자에 포함되는 핵산의 일례로는, DNA 와 2'-OMeRNA 가 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드에 있어서 센스 사슬과 안티센스 사슬이 상이한 종류의 핵산으로 왓슨-크릭 결합을 하고 있는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
그러한 2 본쇄 올리고뉴클레오티드의 구체예로는, 예를 들어, WO2010/001909, WO2010/001909 등에 기재된 2 본쇄 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
1-3-2. 수식 2 본쇄 올리고뉴클레오티드
핵산 지질 입자에 포함되는 핵산으로서 RNA 간섭 작용을 갖는 핵산을 사용하는 경우에는, RNA 간섭 작용을 갖는 한에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 말단이 수식된 핵산도 그 일례로서 들 수 있다. 예를 들어, siRNA, AtuRNAi, DNA 와 2'-OMeRNA 가 교대로 결합한 올리고뉴클레오티드에 있어서 센스 사슬과 안티센스 사슬이 상이한 종류의 핵산으로 왓슨-크릭 결합을 하고 있는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, WO2010/001909 참조) 등의 RNA 간섭 작용을 갖는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드에 있어서, 안티센스 사슬의 5' 말단의 인산기가 5' 아릴인산기로 수식되어 있는 2 본쇄 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, WO2010/052715 참조) 를 들 수 있다.
그러한 수식 2 본쇄 올리고뉴클레오티드의 구체예로는, 예를 들어, WO2010/052715, WO2015/005253 에 기재된 수식 2 본쇄 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
1-4. 1 본쇄 올리고뉴클레오티드
1-4-1. RNA 간섭 1 본쇄 뉴클레오티드
본 발명에 사용되는 핵산으로는, RNA 간섭 작용을 갖는 한에 있어서, 표적 유전자에 대한 센스 사슬 올리고뉴클레오티드, 및 그 센스 사슬 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열을 갖는 안티센스 사슬 올리고뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드로서, 그 안티센스 사슬 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 그 센스 사슬 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 각각에 있어서, 인산디에스테르 구조를 형성한 링커에 의해 결합된 1 본쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드도 포함된다 (예를 들어, WO2012/074038 참조).
그러한 화합물의 구체예로는, 예를 들어, WO2012/074038, WO2015/005253 에 기재된 것을 들 수 있다.
1-4-2. 안티센스 뉴클레오티드
안티센스 뉴클레오티드는, 유전자의 변이에서 기인하는 질환의 치료에 있어서, 당해 변이 유전자의 발현을 정상화 또는 억제함으로써 치료 가능한 질환의 치료를 목적으로 적용된다. 유전자 발현을 억제하는 경우, 표적 유전자의 mRNA 의 일부에 대하여 상보적인 서열을 갖고, 그 서열의 중간 정도의 핵산이 DNA 인 뉴클레오티드가 사용된다. 이와 같은 발현 억제용 안티센스 뉴클레오티드는, 표적 유전자의 mRNA 와 2 본쇄을 형성한다. 형성된 2 본쇄체 중의 RNA/DNA 2 본쇄 구조는, 생체 내의 RNaseH 에 의해 특이적으로 분해되기 때문에, 표적 유전자의 mRNA 가 특이적으로 파괴되고, 그 결과 표적 유전자의 발현이 억제된다.
유전자 발현을 정상화하는 것을 목적으로 한 안티센스 뉴클레오티드로는, 이상 스플라이싱을 억제하는 것, 유전자 상의 변이 지점을 정상적인 서열로 회복하는 것 등이 있다. 유전자 상의 변이를 정상적인 서열로 회복시키는 경우, 안티센스 뉴클레오티드의 3' 측에는, 표적 유전자의 센스 사슬에 있어서의 변이 지점의 5' 측 영역에 대한 안티센스 서열을 갖고, 그 5' 측에 뉴클레아제가 회합하는 헤어핀 구조 (2 개 지점의 서로 상보적인 서열이 중간의 링커/루프 서열로 연결된 서열) 를 구성하는 서열을 갖는다. 이와 같은 뉴클레오티드에 의해, 3' 측의 안티센스 영역이 표적 유전자 (mRNA 또는 게놈 DNA 의 센스 사슬) 의 변이 지점에 뉴클레아제를 유도하는 가이드 RNA 로서 기능한다. 이 현상은 CRISPR-Cas 시스템으로서 알려진 게놈 편집 기술과 유사하며, 다양한 유전자 편집에 적용할 수 있는 것이 널리 알려져 있다.
유전자 변이에 의해 이상 스플라이싱이 발생하는 메커니즘은, 프리 mRNA 로부터 성숙 mRNA 로의 스플라이싱 과정에 있어서, 변이에 의해, 정상의 프리 mRNA 에서는 결합하지 않는 지점을 스플라이싱 인자가 잘못 인식하여 결합함으로써, 이상 스플라이싱을 받은 mRNA 가 발현됨으로써, 표적 유전자로부터 발현되는 단백질에 기능 불량 또는 발현 불량이 발생한다. 이, 변이 프리 mRNA 상의 스플라이싱 인자가 오인식하는 영역에 안티센스 뉴클레오티드가 결합하면, 스플라이싱 인자가 당해 영역을 인식할 수 없고, 이상 스플라이싱이 억제된다. 이와 같은 유전자 변이에 의한 이상 스플라이싱에서 기인하는 질환으로는, 하기에 상세히 서술하는 당원병 1a 형의 G6PC 유전자에 있어서의 c.648G>T 변이에서 기인하는 이상 스플라이싱을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그 밖에 공지된 다양한 질환 치료용의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명은, 당원병 Ia 형 환자 중, c.648G>T 변이를 가진 G6PC 유전자를 mRNA 레벨로 수복하여, 정상적인 G6PC 단백질을 발현시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 그 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 82 번째 내지 92 번째의 어느 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어진다.
본 발명에 있어서, 당원병 Ia 형 환자 중, c.648G>T 변이를 하는 환자를 대상으로 할 수 있다. c.648G>T 변이의 호모 접합의 환자 뿐만 아니라, c.648G>T 변이와 다른 변이의 복합 헤테로 접합의 환자도 대상으로 할 수 있다.
G6PC 유전자의 c.648G>T 변이는, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 로부터 T 로의 변이이다. 엑손 5 의 5' 말단으로부터 86 번째에 위치한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 86 번째 내지 92 번째의 어느 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지면 되고, 92 번째의 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.
c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 cDNA 에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 염기수 15 ∼ 30 의 올리고뉴클레오티드로서, c.648G>T 변이를 갖는 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 82 번째 내지 92 번째의 어느 부위를 포함하는 영역에 상보적인 서열로 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드로는, 서열 번호 1 ∼ 32, 40 ∼ 42, 44 ∼ 48 의 어느 서열 (단, 서열 중의 t 또는 T 는, u 또는 U 여도 되고, u 또는 U 는, t 또는 T 여도 된다) 의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서「서열의 일부」란, 통상적으로 당해 서열 전체의 80 ％ 이상이며, 바람직하게는 85 ％ 이고, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이고, 가장 바람직하게는 94 ％ 이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 염기수는, 15 ∼ 30 이 적당하고, 15 ∼ 21 이 바람직하고, 15 ∼ 18 이 보다 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는, 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA 의 키메라, 이것들의 수식체 중 어느 것이어도 되는데, 적어도 1 개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 수식 뉴클레오티드로는, 당이 수식된 것 (예를 들어, D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화된 것, D-리보푸라노오스가 2'-O,4'-C-알킬렌화된 것, D-리보푸라노오스가 2'-,4'- 가교된 것), 인산디에스테르 결합이 수식 (예를 들어, 티오에이트화) 된 것, 염기가 수식된 것, 그것들을 조합한 것 등을 예시할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1 개의 D-리보푸라노오스가 2'-O-알킬화된 것이나 2'-O,4'-C-알킬렌화된 것은, RNA 에 대한 결합력이 높은 점, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 점에서, 천연형의 뉴클레오티드 (즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA) 보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 또, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 적어도 1 개의 인산디에스테르 결합이 티오에이트화된 것도, 뉴클레아제에 대한 내성이 높은 점에서, 천연형의 뉴클레오티드 (즉, 올리고 DNA, 올리고 RNA) 보다 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 상기와 같은 수식된 당과 수식된 인산디에스테르 결합의 양자를 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 뉴클레아제에 대한 내성이 보다 높은 점에서, 더욱 높은 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대해, 당의 수식의 예로는, D-리보푸라노오스의 2'-O-알킬화 (예를 들어, 2'-O-메틸화, 2'-O-아미노에틸화, 2'-O-프로필화, 2'-O-알릴화, 2'-O-메톡시에틸화, 2'-O-부틸화, 2'-O-펜틸화, 2'-O-프로파르길화 등), D-리보푸라노오스의 2'-O,4'-C-알킬렌화 (예를 들어, 2'-O,4'-C-에틸렌화, 2'-O,4'-C-메틸렌화, 2'-O,4'-C-프로필렌화, 2'-O,4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O,4'-C-펜타메틸렌화 등), D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, S-cEt(2',4'-constrained ethyl), AmNA (Amide-bridged nucleic acid), 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-D-리보푸라노오스, 3'-데옥시-3'-아미노-2'-데옥시-2'-플루오로-D-리보푸라노오스 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대해, 당의 2'-,4'- 가교 수식의 예로는, D-리보푸라노오스의 2'-O,4'-C-알킬렌화 (예를 들어, 2'-O,4'-C-에틸렌화, 2'-O,4'-C-메틸렌화, 2'-O,4'-C-프로필렌화, 2'-O,4'-C-테트라메틸렌화, 2'-O,4'-C-펜타메틸렌화 등), D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화, S-cEt(2',4'-constrained ethyl), AmNA 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대해, 인산디에스테르 결합의 수식의 예로는, 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 메틸티오포스포네이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 포스포아미데이트 결합 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 염기의 수식의 예로는, 사이토신의 5-메틸화, 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, N4-메틸화, 티민의 5-데메틸화 (우라실), 5-플루오로화, 5-브로모화, 5-요오드화, 아데닌의 N6-메틸화, 8-브로모화, 구아닌의 N2-메틸화, 8-브로모화 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 시판되는 합성기 (예를 들어, 퍼킨엘머사의 포스포아미다이트법에 의한 모델 392) 등을 사용해서, 문헌 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다. 그 때에 사용되는 뉴클레오시드 포스포아미다이트 시약은, 천연형의 뉴클레오시드 및 2'-O-메틸뉴클레오시드 (즉, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸우리딘) 에 대해서는, 시판되는 시약을 사용할 수 있다. 알킬기의 탄소수가 2 ∼ 6 개인 2'-O-알킬구아노신, 아데노신, 시티딘 및 우리딘에 대해서는, 이하와 같다.
2'-O-아미노에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-프로필구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-알릴구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 시판되는 시약을 사용할 수 있다.
2'-O-메톡시에틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 특허 (US6261840) 또는, 문헌 (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-부틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-펜틸구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 문헌 (Lesnik, E. A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.) 에 따라서 합성할 수 있다.
2'-O-프로파르길구아노신, 아데노신, 시티딘, 우리딘은, 시판되는 시약을 사용할 수 있다.
2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO99/14226 에 기재된 방법에 따라서, 알킬렌기의 탄소수가 2 ∼ 5 개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 시티딘, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO00/47599 에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
D-리보푸라노오스의 2'-데옥시-2'-C,4'-C-메틸렌옥시메틸렌화된 뉴클레오시드는, 문헌 (Wang, G. et al. Tetrahedron (1999), 55, 7707-7724) 에 따라서 합성할 수 있다.
S-cEt(constrained ethyl) 는, 문헌 (Seth, P. P. et al. J. Org. Chem (2010), 75, 1569-1581.) 에 따라서 합성할 수 있다.
AmNA 는, 문헌 (Yahara, A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.) 또는, WO2014/109384 에 따라서 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산 염기 서열은, 아데닌을 (A) 또는 (a), 구아닌을 (G) 또는 (g), 사이토신을 (C) 또는 (c), 티민을 (T) 또는 (t), 및 우라실을 (U) 또는 (u) 로 각각 기재할 수 있다. 사이토신 대신에, 5-메틸사이토신을 사용할 수 있다. 핵산 염기 중, 우라실 (U) 또는 (u) 와 티민 (T) 또는 (t) 는, 호환성이 있다. 우라실 (U) 또는 (u) 와 티민 (T) 또는 (t) 의 어느 쪽도, 상보 사슬의 아데닌 (A) 또는 (a) 와의 염기쌍 형성에 사용할 수 있다.
뉴클레오시드 포스포아미다이트 시약을 커플링 후, 황, 테트라에틸티우람디술파이드 (TETD, 어플라이드 바이오시스템사), Beaucage 시약 (Glen Research 사), 또는, 크산탄하이드라이드 등의 시약을 반응시킴으로써, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다 (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
합성기에서 사용하는 컨트롤드 포어 글라스 (CPG) 로는, 2'-O-메틸뉴클레오시드가 결합한 것은, 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또, 2'-O,4'-C-메틸렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO99/14226 에 기재된 방법에 따라서, 알킬렌기의 탄소수가 2 ∼ 5 개인 2'-O,4'-C-알킬렌구아노신, 아데노신, 5-메틸시티딘 및 티미딘에 대해서는, WO00/47599 에 기재된 방법에 따라서 제조한 뉴클레오시드를 문헌 (Oligonucleotide Synthesis, Edited by M. J. Gait, Oxford University Press, 1984) 에 따라서, CPG 에 결합할 수 있다. 수식된 CPG (일본 공개특허공보 평7-87982호의 실시예 12b 에 기재) 를 사용함으로써, 3' 말단에 2-하이드록시에틸인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또, 3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000 (link technologies) 을 사용하면, 3' 말단에 하이드록시알킬인산기, 또는, 아미노알킬인산기가 결합한 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
＜2. GalNAc 유닛＞
본 발명의 콘주게이트에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 GalNAc 가 링커 및 인산기를 개재하여 결합하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 GalNAc 유닛이란, GalNAc 가 결합한 링커가 결합한 인산기이고, 추가로, 1 개의 결합손을 갖고 있어도 된다. GalNAc 유닛의 인산기는, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단과 결합할 수 있고, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합한다. GalNAc 유닛이 결합손을 갖는 경우, 당해 결합손은, 수산기, GalNAc, GalNAc 가 결합한 링커, 다른 GalNAc 유닛의 인산기, 또는, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 인산기와 결합할 수 있다. 1 개의 GalNAc 유닛에 함유되는 GalNAc 의 수로는 2 개이다.
콘주게이트에 있어서, 1 개의 GalNAc 유닛이 올리고뉴클레오티드에 결합해도 되고, 복수의 GalNAc 유닛이 연속해서 결합하여, 올리고뉴클레오티드에 결합해도 된다. 1 개의 올리고뉴클레오티드에 결합하는 GalNAc 유닛의 수로는, 바람직하게는 1 내지 7 개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개이고, 특히 바람직하게는 1 내지 3 개이고, 최적 개수는 1 개이다.
본 발명에서, 2 개의 GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 도입하는 경우에는, Symmetric Doubler Phosphoramidite (1,3-bis-[5-(4,4'-dimethoxytrityloxy)pentylamido]propyl-2-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, Glen Research) 등을 올리고뉴클레오티드 합성시에 사용하고, 3 개의 GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 도입하는 경우에는, Trebler Phosphoramidite (Tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimethoxytrityloxy)propyloxymethyl]ethyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, Glen Research), 또는, Long Trebler Phosphoramidite (Tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimethoxytrityloxy)propyloxymethyl]methyleneoxypropyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, Glen Research) 등을 올리고뉴클레오티드 합성시에 사용함으로써 합성할 수 있다. 4 개의 GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 도입하는 경우에는, Symmetric Doubler Phosphoramidite 등을 올리고뉴클레오티드 합성시에 2 회 커플링하여 사용함으로써, 합성할 수 있다. 5 개의 GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 도입하는 경우에는, Symmetric Doubler Phosphoramidite, 및 Trebler Phosphoramidite 또는, Long Trebler Phosphoramidite 를 올리고뉴클레오티드 합성시에 1 회씩 커플링하여 사용함으로써, 합성할 수 있다. 5 개 이상의 GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 도입하는 경우에는, Symmetric Doubler Phosphoramidite, Trebler Phosphoramidite 또는, Long Trebler Phosphoramidite 를 적절히 조합하여, 합성할 수 있다.
본 발명에서, GalNAc 유닛을 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 도입하는 경우에는, Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite (1-[5-(4,4'-dimethoxytrityloxy)pentylamido]-3-[5-levulinyloxypentylamido]-propyl-2-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, Glen Research) 등을 올리고뉴클레오티드 합성시에 사용함으로써 합성할 수 있다. 구체적으로는, 시판되는 Unylinker Support (예를 들어, Glen UnySuppor 1000, Glen Research) 에 Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite 를 커플링하고, DMTr 기를 제거 후, 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 사슬 신장을 실시한다. 목적으로 하는 사슬 길이에 달성한 후, Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite 시약에 첨부된 프로토콜에 따라서, levulinyl 기를 하이드라진 등의 시약을 사용하여 탈보호하고, GalNAc 유닛을 커플링함으로써 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 도입할 수 있다.
본 발명에서는, GalNAc 유닛과 결합하는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에, 약효를 발현하는 올리고뉴클레오티드와는 상이한 염기 서열로서, 인산디에스테르 결합으로 이루어지고, 생체 내에서 절단될 수 있는 부가적인 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고 있어도 된다. 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사슬 길이로는, 1 내지 6 뉴클레오티드가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 뉴클레오티드이다. 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드는, 절단될 수 있는 것이면, 특별히 한정은 없지만, 전부가 DNA 로 이루어지는 천연형 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 전부가 RNA 로 이루어지는 천연형 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 염기 서열로는, 절단될 수 있는 서열이면, 특별히 한정은 없지만, 5'-TCATCA-3', 5'-CATCA-3', 5'-ATCA-3'5'-TCA-3', 5'-CA-3', 5'-A-3' 등을 들 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 있어서의 2 분기 GalNAc 유닛은, 하기 식
[화학식 44]
Figure pct00044
[식 중, W 는, 식
[화학식 45]
Figure pct00045
으로 나타내는 기이고, G 는 5-아세트아미드-2-하이드록시메틸-3,4-디하이드록시테트라하이드로피란-6-일기 (GalNAc) 를 나타내고, Z 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고, L1 및 L2 는, 일방이 메틸렌기 (CH2) 를 나타내고, 타방이 원자를 사이에 두지 않는 것을 나타내고, o, q, r 및 s 는 서로 독립적으로 0 또는 1 을 나타내고, n 은 1 ∼ 15 의 정수를 나타내고, m 은 0 ∼ 5 의 정수를 나타내고, v 는 1 ∼ 7 을 나타낸다. 단, n 이 1 일 때 m 은 0 ∼ 5 의 정수이고, n 이 2 ∼ 15 의 정수일 때 m 은 0 이다.] 으로 나타내는 기이고, 바람직하게는 o 및 q 가 0 이다.
상기 식에 있어서, L1 및 L2 는, 바람직하게는 L2 가 메틸렌기 (CH2) 를 나타내고, L1 은 원자를 사이에 두지 않는다. n 은 바람직하게는 1 ∼ 10 의 정수, 보다 바람직하게는 2 ∼ 7 의 정수를 나타내고, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 4 의 정수이다. m 은 바람직하게는 0 ∼ 3 의 정수이다. v 는 바람직하게는 1 ∼ 5 의 정수이다. 보다 바람직하게는, 상기 식에 있어서, s 가 1 이고, n 이 2 ∼ 7 의 정수이고, m 이 0, 1 또는 2 이고, v 가 1 ∼ 5 의 정수인 기이며, 더욱 바람직하게는, 상기 식에 있어서, s 가 1 이고, n 이 2 또는 3 이고, m 이 0 이고, v 가 1 ∼ 3 의 정수인 기이다.
본 발명의 바람직한 2 분기 GalNAc 유닛은, 인산기로부터 3 원자 이내에, 각각에 글리세롤 구조를 갖는 2 분기 구조를 갖고, 각각의 분기 사슬의 말단에 각각 GalNac 를 갖고, 분기점에서 GalNac 까지의 링커 구조는 거의 동일하고, GalNAc 부와 인산기부를 연결하는 링커 골격은 15 원자 이하의 길이이며, 헤테로 원자의 함유율이 높고, 또한 연속되는 알킬 사슬 길이가 C5 이하임으로써, 물에 대하여 양호한 용해성을 나타낸다.
본 발명의 2 분기 GalNAc 유닛의 구체예로는, 이하의 식으로 나타내는 기를 들 수 있다.
[화학식 46]
Figure pct00046
[화학식 47]
Figure pct00047
[화학식 48]
Figure pct00048
[화학식 49]
Figure pct00049
[화학식 50]
Figure pct00050
＜3. 콘주게이트의 제조 방법＞
본 발명의 GalNAc 유닛이 결합한 올리고뉴클레오티드는, GalNAc 유닛에 포함되는 포스포아미다이트체를 뉴클레오시드의 포스포아미다이트 시약과 동일하게 사용함으로써, 시판되는 합성기 (예를 들어, 퍼킨엘머사의 포스포아미다이트법에 의한 모델 392) 등을 사용해서, 문헌 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 에 기재된 방법에 준하여 합성할 수 있다.
GalNAc 유닛 함유 포스포아미다이트의 합성법
본 발명의 GalNAc 유닛 함유 포스포아미다이트 혹은 H-포스포네이트는, 후술하는 A 법, 혹은 B 법에 따라서 제조할 수 있다. A 법 혹은 B 법에 있어서, 각 반응 종료 후, 각 반응의 목적 화합물은 통상적인 방법에 따라서, 반응 혼합물로부터 채취된다. 예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화시키고, 또, 불용물이 존재하는 경우에는 여과에 의해 제거한 후, 물과 아세트산에틸과 같은 혼화되지 않는 유기 용매를 첨가하고, 목적물을 포함하는 유기층을 분리하고, 물 등으로 세정 후, 무수 황산나트륨 등으로 건조 후, 용제를 증류 제거함으로써 얻어진다. 얻어진 화합물은, 필요하다면, 통상적인 방법, 예를 들어 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리·정제할 수 있다. 혹은, 재침전, 재결정에 의해 정제할 수 있다. 단, r ＝ 0 의 경우에는, A 법, B 법 대신에 C 법을 사용한다.
[A 법]
A 법은, 화합물 (3) 을 이용하여, 분기형의 화합물 (7) 및 화합물 (7') 를 제조하기 위한 방법이다. 화합물 (1) 의 입체 배치는 한정하지 않는다. 화합물 (3) 을 사용함으로써, GalNAc 부분의 6 위치 수산기의 보호기를 적절히 선택할 수 있다. r ＝ 0 의 경우에는, C 법을 사용한다.
[화학식 51]
Figure pct00051
(식 중 R13 은 수산기의 일반적인 보호기인데, 바람직하게는 벤질기이다. 식 중 R14 는 수산기의 일반적인 보호기인데, 바람직하게는 아세틸기, 또는 소수성 보호기 (보다 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸기) 이다. 식 중 R15 는 카르보닐기의 일반적인 보호기인데, 바람직하게는 벤질기이다. 식 중, -P(R3)R4 는, [R3 및 R4 는, 동일하거나 또는 상이하고, 수산기, 보호된 수산기, 메르캅토기, 보호된 메르캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 4 개의 알콕시기, 탄소수 1 내지 4 개의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 5 개의 시아노알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4 개의 알킬기로 치환된 아미노기를 나타낸다] 를 나타낸다. 식 중 X 는, 탄소 혹은 산소이다. 식 중 n 은 1 ∼ 15 의 정수이고, m 은 0 ∼ 5 의 정수이다. 단, n 이 1 일 때, m 은 0 ∼ 5 의 정수이고, n 이 2 ∼ 15 의 정수일 때, m 은 0 이다. 식 중 r 은 독립적으로, 0 이나 1 이다. 식 중 v 는, 1 ∼ 7 이다.
공정 A-1 은, 카르바메이트화하는 공정이며, 불활성 용매 중, 활성화제, 염기의 존재하, 화합물 (1) 을 활성 에스테르로 변환 후, 화합물 (2) 와 반응시켜, 카르바메이트화한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들어, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화탄화수소류, 에테르류 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 활성화제로는, 활성화 에스테르를 형성하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 탄산비스(펜타플루오로페닐), 탄산비스(4-니트로페닐), 4-니트로페닐클로로포르메이트 등을 들 수 있다. 바람직하게는 4-니트로페닐클로로포르메이트이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들어, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 활성 에스테르를 조제할 때에는 피리딘을 사용하고, 계속해서 아민과 반응시킬 때에는 N,N-디이소프로필에틸아민을 추가한다.
반응 온도는, 활성화제, 염기, 불활성 용매 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 -20 ℃ 내지 환류 온도이다. 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃ 이다.
반응 시간은, 활성화제, 염기, 불활성 용매, 반응 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 15 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 4 시간이다.
공정 A-2 는, 보호기인 R13 및 R15 를 제거하는 공정이다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들어, T. H. Greene, P. G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc. 등에 기재된 방법과 같은 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
공정 A-3 은, 불활성 용매 중, 축합제, 염기의 존재하, 화합물 (3) 과 아미드 축합시키는 공정이다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매는, 사용하는 축합제의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 물, 알코올류, 비프로톤성 극성 용매 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄 또는 N,N-디메틸포름아미드이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들어, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
상기 반응에 사용되는 축합제로는, 예를 들어, 카르보디이미드계 축합제인 WSC (1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드), DIC (N,N'-디이소프로필카르보디이미드), 이미다졸계 축합제인 CDI (N,N'-카르보닐디이미다졸), 트리아진계 축합제인 DMT-MM (4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 ＝ 클로라이드 n 수화물), 유로늄계 축합제인 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로인산염), TSTU (O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄테트라플루오로붕산염), 포스포늄계 축합제인 PyBOP (1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로인산염) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 WSC 또는 HATU 이다. 또, 필요에 따라, 첨가제인 HOAt (1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸), HOBt (1-하이드록시벤조트리아졸), Oxyma (에틸(하이드록시이미노)시아노아세테이트) 를 첨가해도 된다.
반응 온도는, 축합제, 염기, 용매 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 -20 ℃ 내지 환류 온도이다. 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃ 이다.
반응 시간은, 축합제, 염기, 용매, 반응 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 15 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 24 시간이다.
공정 A-4 는, 화합물 (7) 을 제조하는 공정이며, 불활성 용매 중, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포아미다이트와 염기의 존재하, 화합물 (6) 의 2 급 수산기에 -P(R3)R4 를 도입한다.
상기 반응에 사용되는 불활성 용매로는, 예를 들어, 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화탄화수소류, 에테르류, 아세토니트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄이다.
상기 반응에 사용되는 염기로는, 예를 들어, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등을 들 수 있고, 바람직하게는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
반응 온도는, 염기, 불활성 용매 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 -20 ℃ 내지 환류 온도이다. 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃ 이다.
반응 시간은, 염기, 불활성 용매, 반응 온도 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 15 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 4 시간이다.
공정 A-5 는, 화합물 (7) 로부터 화합물 (8) 을 합성하는 공정이며, 보호기인 R15 만을 제거한다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들어, T. H. Greene, P. G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc. 등에 기재된 방법과 같은 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
공정 A-6 은, 화합물 (8) 을 아미드화하는 공정이다. 전술한 공정 A-3 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 A-7 은, 보호기인 R13 을 제거하는 공정이다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들어, T. H. Greene, P. G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc. 등에 기재된 방법과 같은 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
공정 A-8 은, 화합물 (6) 으로부터 H-포스포네이트체인 화합물 (7') 를 합성하는 공정이다. 화합물 (6) 에, 불활성 용제 중에서, 포스포아미다이트화의 시약 대신에, 예를 들어 미리 문헌 (B. C. Freohler, P. G. Ng and MD. Matteucci, Nucleic Acids Res., 14 5399 (1986)) 에 따라서 삼염화인과 1,2,4-트리아졸로부터 조제한 트리스-(1,2,4-트리아졸릴)포스파이트를 반응시킨 후, 물을 첨가하여 반응을 정지시키고, 후처리를 함으로써, H-포스포네이트체를 얻을 수 있다. 사용되는 용매로는 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만 바람직하게는 염화메틸렌과 같은 할로겐화탄화수소이다. 반응 온도는 -20 ℃ ∼ 100 ℃ 까지 특별히 한정은 없지만 통상적으로는 실온에서 실시한다. 반응 시간은 사용하는 용매, 반응 시간에 따라 상이하지만 염화메틸렌 중 실온에서 반응시킨 경우에는 30 분이다.
[B 법]
B 법은, 화합물 (3) 을 이용하여, 분기형의 화합물 (14) 및 화합물 (14') 를 제조하기 위한 방법이다. 화합물 (10) 의 입체 배치는 한정하지 않는다. 화합물 (3) 을 사용함으로써, GalNAc 부분의 6 위치 수산기의 보호기를 적절히 선택할 수 있다. r ＝ 0 의 경우에는, C 법을 사용한다.
[화학식 52]
Figure pct00052
R12 는 수산기의 일반적인 보호기인데, 바람직하게는 벤질기이다. 식 중 R3, R4, X, n, m, r, v, R14 및 R15 는, 상기와 동일한 의의를 나타낸다.
공정 B-1 은, 화합물 (10) 을 카르바메이트화하는 공정이며, 전술한 공정 A-1 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-2 는, 보호기인 R12 및 R15 를 제거하는 공정이다. 전술한 공정 A-2 와 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-3 은, 화합물 (12) 를 아미드화하는 공정이며, 전술한 공정 A-3 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-4 는, 화합물 (13) 의 수산기에 -P(R3)R4 를 도입하는 공정이며, 전술한 공정 A-3 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-5 는, 화합물 (11) 로부터 화합물 (15) 을 합성하는 공정이며, 보호기인 R15 만을 제거한다. 전술한 공정 A-5 와 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-6 은, 화합물 (15) 를 아미드화하는 공정이다. 전술한 공정 A-6 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-7 은, 보호기인 R12 를 제거하는 공정이다. 전술한 공정 A-7 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 B-8 은, 화합물 (13) 으로부터 화합물 (14') 를 합성하는 공정이다. 전술한 공정 A-8 과 동일하게 실시할 수 있다.
[C 법]
C 법은, 화합물 (3) 을 이용하여, 분기형의 화합물 (19) 혹은 화합물 (22), 및 화합물 (19') 혹은 화합물 (22') 를 제조하기 위한 방법이다. 화합물 (1) 및 화합물 (10) 의 입체 배치는 한정하지 않는다. 화합물 (3) 을 사용함으로써, GalNAc 부분의 6 위치 수산기의 보호기를 적절히 선택할 수 있다.
[화학식 53]
Figure pct00053
식 중 R3, R4, X, n, m, r, R12, R13 및 R14 는, 상기와 동일한 의의를 나타낸다.
공정 C-1 은, 화합물 (1) 혹은 화합물 (10) 을 카르바메이트화하는 공정이며, 화합물 (2) 대신에 화합물 (3) 을 사용하여, 전술한 공정 A-1 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 C-2 는, 보호기인 R12 혹은 R13 을 제거하는 공정이다. 보호기의 제거는 그 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로 유기 합성 화학의 기술에 있어서 주지의 방법, 예를 들어, T. H. Greene, P. G. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis. Third Edition, 1999년, John Wiley & Sons, Inc. 등에 기재된 방법과 같은 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
공정 C-3 은, 화합물 (19) 혹은 화합물 (22) 의 수산기에 -P(R3)R4 를 도입하는 공정이며, 전술한 공정 A-3 과 동일하게 실시할 수 있다.
공정 C-4 는, 화합물 (18) 로부터 화합물 (19') 를, 혹은 화합물 (21) 로부터 화합물 (22') 를 합성하는 공정이다. 전술한 공정 A-8 과 동일하게 실시할 수 있다.
＜4. 소수성 보호기를 사용한 제조 방법＞
본 발명은, GalNAc 부위의 3 위치, 4 위치, 6 위치의 어느 1 개 이상의 수산기 상에 소수성이 높은 보호기가 도입된 GalNAc 유닛을 합성 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합시키고, 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지에 흡착시킴으로써 불순물과 분리함으로써, GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트를 제조하는 방법 및 당해 제조 방법에 중간체로서 사용하는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 를 포함하는 결합용 화합물 (포스포아미다이트, H-포스포네이트), 콘주게이트 등을 제공한다.
본 발명의 제조 방법은, 이하의 공정을 포함한다.
a : 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가 결합한 콘주게이트를 합성하는 공정,
b : 공정 a 의 산물을 포함하는 용액을 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼에 통액시키고, 당해 칼럼에 수성 세정액을 통액시키는 공정, 및
c : 공정 b 후의 칼럼으로부터 올리고뉴클레오티드를 용출시키는 공정.
본 제조 방법에 있어서, 소수성 보호기로는, 상기 정의에 합치하는 한, 다양한 것을 채용할 수 있다. 통상적인 핵산 합성에서는, 암모니아수 등의 염기성 처리로 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 유리시키기 때문에, 산성 조건 처리로 제거되는 보호기, 예를 들어, 치환되어 있어도 되는 트리틸기, 치환되어 있어도 되는 실릴기 등을 이용할 수 있다. 이와 같은 치환되어 있어도 되는 트리틸기의 구체예로는, 트리틸기, 모노메톡시트리틸기, 디메톡시트리틸기이다. 또 치환되어 있어도 되는 실릴기의 예로는, 트리페닐실릴기, tert-부틸디메틸실릴기, tert-부틸디페닐실릴기 등이고, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸기 (DMTr 기) 이다.
염기성 조건에서 제거되는 소수성 보호기로는, 다양한 종류의 에스테르기를 채용할 수 있지만, 바람직하게는 아세틸기, 벤조일기가 예시된다.
본 발명에 있어서,「소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조」란, 이하의 식으로 나타내는 구조를 말한다.
[화학식 54]
Figure pct00054
상기 식 중, GalNAc 상의 수산기의 치환기인 Ra, Rb 및 Rc 는, 적어도 1 개는 소수성 보호기이고, 그 이외는 수소 원자 또는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. 전부가 소수성 보호기여도 되고, 어느 2 개가 소수성 보호기여도 되고, 어느 1 개만이 소수성 보호기여도 된다. 바람직하게는 Ra 가 소수성 보호기 (보다 바람직하게는 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기이고, 더욱 바람직하게는 치환되어 있어도 되는 트리틸기이고, 가장 바람직하게는 DMTr 기이다.) 이고, Rb 및 Rc 는 수소 원자이다. 이 치환기가 소수성 보호기가 아닌 경우, 유리 조건에서 제거되는 보호기가 결합하고 있어도 되지만, 올리고뉴클레오티드의 지지체로부터의 절출 과정에서 이들 보호기는 제거되고, 공정 a 에 사용하는 단계에서는 수소 원자 (GalNAc 상에서는 수산기) 가 된다.
X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. 여기서 채용되는 링커 구조로는, 알킬 사슬, PEG 사슬, 펩티드 사슬 등, 다양한 골격을 채용할 수 있다. 이 링커 구조는 도중에 분기됨으로써, 복수의 GalNAc 를 포함하고 있어도 된다. 링커 구조 중의 분기 사슬의 수 (t)는, 1 ∼ 10 정도이며, 바람직하게는 1 ∼ 3 이다. 2 이상의 분기 사슬을 갖는 경우, 분기점과 GalNAc 사이의 링커 구조는, 동일해도 되고, 각각 상이해도 된다. 복수의 GalNAc 가 포함되는 경우, 각각의 GalNAc 에 적어도 1 개의 소수성 보호기가 결합한다.
상기 식에 있어서, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하는 경우, 당해 말단의 뉴클레오시드의 5'-수산기와 인산디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합한다. 이와 같은 결합은, 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조의 Y 가 포스포아미다이트 구조, 또는, H-포스포네이트 구조인 화합물 (소수성 보호기 부가형 GlcNAc 유닛 아미다이트형 화합물) 을, 올리고뉴클레오티드의 고상 합성에 계속해서, 뉴클레오시드 포스포아미다이트 시약과 동일하게 사용함으로써, 합성할 수 있다. 본 발명의 2 분기 GalNAc 유닛에 대응하는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛 아미다이트형 화합물의 구체예는, 상기 (B13) 에 기재되어 있다.
본 발명의 제조 방법은, 상기한 본 발명의 2 분기 GalNAc 유닛에 한정되지 않으며, 공지된 GalNAc 유닛 (예를 들어, 특허문헌 1 ∼ 9, 비특허문헌 1, 2 등에 기재된 것) 과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트의 제조에도 적용할 수 있다. 이 경우, 소수성 보호기 부가형 GlcNAc 유닛 포스포아미다이트, 또는, H-포스포네이트로서, 공지된 GlcNAc 유닛에 대응한 구조의 화합물을 채용한다. 이들 공지된 GalNAc 유닛에 대응한 아미다이트형 화합물로는, 예를 들어, 이하의 화합물을 예시할 수 있다.
이하의 화합물은, J. Med. Chem. 2016, 59, 2718-2733 및 그 인용문헌 등을 참고로 하여 제조할 수 있다.
For Tris based GalNAc unit
[화학식 55]
Figure pct00055
For Triacid based GalNAc unit
[화학식 56]
Figure pct00056
For Pentaerythritol based GalNAc unit
[화학식 57]
Figure pct00057
For Lys based GalNAc unit
[화학식 58]
Figure pct00058
이하의 식으로 나타내는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛 포스포아미다이트는, WO19027009 를 참고로 하여 제조할 수 있다.
For Aryl based GalNAc unit
[화학식 59]
Figure pct00059
이하의 화합물은, J. Med. Chem. 2016, 59, 2718-2733 및 그 인용문헌 등을 참고로 하여 제조할 수 있다.
For Hydroxyprolinol based GalNAc unit / Piperidine based GalNAc unit
[화학식 60]
Figure pct00060
상기 공지된 GlcNAc 유닛에 대응한 아미다이트형 화합물의 식 중, R1 은 소수성 보호기를 나타낸다. X 는 링커 구조, 바람직하게는 C3 ∼ C6 알킬 직사슬을 나타낸다. Y 는 포스포아미다이트기, 또는, H-포스포네이트기를 나타낸다.
공지된 GlcNAc 유닛에 대응하는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-포스포아미다이트 혹은 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-H-포스포네이트는, 당해 GalNAc 유닛의 합성 과정에서, 상기 A 법 내지 C 법에 기재한 화합물 (3) 에 해당하는 GalNAc 유도체를 적절히 사용함으로써, 합성 가능해진다. 3 위치, 4 위치 및 6 위치의 수산기 중 적어도 1 개가 소수성 보호기로 보호된 GalNAc 유도체는, 예를 들어, 실시예 1 의 방법을 참고로 하여, 다양한 것을 합성할 수 있다.
상기와 같은 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛 아미다이트형 화합물을, 뉴클레오시드 아미다이트 시약과 동일하게 사용하고, 상기 방법에 따라서, 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 도입함으로써, 소수성 보호기 부가형 GalNAc-인산기를 포함하는 구조 (상기 식 중, Y 가 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다.) 를 갖는 콘주게이트를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 합성되는 콘주게이트의 예로는, (B17) 및 (B18) 에 기재된 콘주게이트를 들 수 있다.
소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-H-포스포네이트 화합물을 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 도입하는 반응에 사용되는 용매로는, 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 무수 (無水) 의 아세토니트릴이 사용된다. 축합제로서 사용되는 시약으로는, 카르복실산이나 인산의 산염화물이 사용되지만 바람직하게는 피발로일클로라이드가 사용된다. H-포스폰산 결합을 인산디에스테르 결합으로 산화시키는 산화제로는, 통상적으로 산화 반응에 사용되는 것이면 특별히 한정은 없으며, 과망간산칼륨, 이산화망간과 같은 산화망간류 ; 사산화루테늄과 같은 산화루테늄류 ; 이산화셀렌과 같은 셀렌 화합물 ; 염화철과 같은 철 화합물 ; 사산화오스뮴과 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산수은과 같은 수은 화합물, 산화납, 사산화납과 같은 산화납 화합물 ; 크롬산칼륨, 크롬산-황산 착물, 크롬산-피리딘 착물과 같은 크롬산 화합물, 세륨암모늄나이트레이트 (CAN) 와 같은 세륨 화합물 등의 무기 금속 산화제 ; 염소 분자, 브롬 분자, 요오드 분자와 같은 할로겐 분자 ; 과요오드산나트륨과 같은 과요오드산류 ; 오존 ; 과산화수소수 ; 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 아염소산칼륨, 아염소산나트륨과 같은 아염소산 화합물 ; 과황산칼륨, 과황산나트륨과 같은 과황산 화합물 등의 무기 산화제 ; DMSO 산화에 사용되는 시약류 (디메틸술폭사이드와 디시클로헥실카르보디이미드, 옥살릴클로라이드, 무수 아세트산 혹은 오산화인의 착물 또는 피리딘-무수 아세트산의 착물) ; t-부틸하이드로퍼옥사이드와 같은 퍼옥사이드류 ; 트리페닐메틸 카티온과 같은 안정적인 카티온류 ; N-브로모숙신산이미드와 같은 숙신산이미드류, 차아염소산 t-부틸과 같은 차아염소산 화합물 ; 아조디카르복실산메틸과 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸디술파이드, 디페닐디술파이드, 디피리딜디술파이드와 같은 디술파이드류와 트리페닐포스핀 ; 아질산메틸과 같은 아질산에스테르류 ; 사브롬화메탄과 같은 테트라할로겐화탄소, 2,3-디클로로-5,6-디시아노-p-벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논 화합물 등의 유기 산화제를 들 수 있고, 바람직하게는 요오드 분자이다. 사용되는 탈산제로는, 피리딘, 디메틸아미노피리딘과 같은 복소 고리 아민류, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민류를 들 수 있지만, 바람직하게는 복소 고리 아민류 (특히 피리딘) 이다. 포스포로티오에이트 결합을 형성시키는 경우에는, H-포스폰산 결합에 반응하여 포스포로티오에이트 결합을 형성할 수 있는 시약이면 특별히 한정은 되지 않지만, 황, 테트라에틸티우람디술파이드, Beaucage 시약, 페닐아세틸디술파이드 등이 있고, 바람직하게는 황이다. 합성된 콘주게이트는, 통상적인 올리고뉴클레오티드의 DMTr-on 정제와 동일한 방법으로 소수성 보호기를 유지한 채로 지지체로부터 유리시킬 수 있다.
이와 같은 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조를 갖는 콘주게이트는, 통상적인 올리고뉴클레오티드의 DMTr-on 정제와 동일한 방법으로 소수성 보호기를 유지한 채로 지지체로부터 유리시킬 수 있다. 통상적으로는, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 지지체의 결합은 암모니아수로 절단되고, 염기성 조건에서 올리고뉴클레오티드가 유리된다. 그 때문에, 소수성 보호기로는, 염기성에서 제거되지 않는 보호기, 예를 들어, 산성 조건에서 제거되는 것이 선택된다. 한편으로, 이 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 지지체의 결합 양식으로서 산성 조건에서 절단되는 결합 양식이 채용된 경우, 올리고뉴클레오티드의 유리 조건은 산성이 되기 때문에, 소수성 보호기로는, 산성 조건에서 제거되지 않는 보호기, 예를 들어, 염기성 조건에서 제거되는 보호기가 선택된다.
이와 같이 하여 얻어진 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-올리고뉴클레오티드 콘주게이트는, 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼에 흡착시킨 후, 수성 세정액으로 칼럼을 세정함으로써, 소수성 보호기를 갖지 않는 불순물을 분리할 수 있다.
「소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지」란, 소수성이 높은 성분이 기재에 사용된 수지이면, 특별히 한정없이, 다양한 것이 사용되지만, 예를 들어, 스티렌-디비닐벤젠계 흡착 수지, 스티렌-디비닐벤젠계 수식형 흡착 수지, 메타크릴계 흡착 수지 또는 페놀계 흡착 수지 등을 들 수 있다.
소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-올리고뉴클레오티드 콘주게이트를 칼럼에 흡착시킬 때에 사용하는 충전액으로는, 유기 용매를 많이 포함하지 않는 염기성 수용액이 바람직하다. 예를 들어, 고상 합성 후에 올리고머를 지지체로부터 잘라내는 데에 이용한 농암모니아수, 혹은 그 암모니아수를 적절한 양의 용매 (물, 완충액 등) 로 희석시킨 염기성 수용액을 이용할 수 있다.
칼럼으로부터의 불순물 제거에 사용되는 세정액으로는, 소수성 보호기가 탈보호되지 않고, 수지와의 소수성 상호 작용이 유지되는 성질의 용액이면 다양한 것을 채용할 수 있다. 이와 같은 세정액으로는, 수지와의 소수성 상호 작용이 유지될 정도의 저농도의 유기 용매를 함유하는 수용액을 사용함으로써, 불순물의 제거 효율이 향상된다. 소수성 보호기가 DMTr 기인 경우의 세정액으로는, 구체적으로는, 적당량의 염을 포함한 수용액 혹은 아세토니트릴 함유 수용액 등을 사용할 수 있다.
GalNAc 에 결합한 소수성 보호기는, 채용된 보호기에 따른 탈보호 조건에서 콘주게이트를 처리함으로써, 탈보호할 수 있다. 일반적인 올리고뉴클레오티드 합성에 계속해서 본 제조 방법을 적용하는 경우, DMTr 기와 같은 산성 조건에서 탈보호되는 소수성 보호기가 채용되기 때문에, 탈보호는 산성 용액에 의한 처리로 실시된다.
탈보호 처리는, 콘주게이트가 흡착된 칼럼 상에서 적절히 탈보호 처리함으로써, 보호기 유래의 불순물을 칼럼 상에 흡착시킨 채로, 탈보호된 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트를 취득할 수 있다.
또, 탈보호되지 않고 칼럼으로부터 용출된 소수성 보호기 부가형 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트를 탈보호 처리하고, 처리 후의 용액을 다시 동일한 소수성 상호 작용 흡착 수지 칼럼에 통액시킴으로써, 보호기 유래의 불순물과 탈보호된 콘주게이트를 분리할 수 있다.
콘주게이트를 유지한 칼럼은, 채용한 수지에 따른 적절한 그레이디언트 용출법을 이용함으로써, 높은 정제도로 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트를 분획할 수 있다. 소수성 보호기를 탈보호하지 않고 칼럼으로부터 용출시키는 경우, 유기 용매 함유량을 증가시키는 그레이디언트 용출에 의해, 소수성 보호기와 흡착 수지 간의 소수성 상호 작용을 저해함으로써, 콘주게이트를 용출시킬 수 있다.
칼럼에 흡착된 상태에서 탈보호 처리를 실시하는 경우, 탈보호된 콘주게이트의 칼럼으로의 유지 양식에 따라 적절한 용출 조건을 적절히 선택할 수 있다.
소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 이온 교환 칼럼을 사용하는 경우에는, 콘주게이트가 칼럼에 흡착된 상태에서 탈보호 처리하고, 칼럼으로부터의 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트의 용출은, 용출액 중의 염 농도를 이용하여, 이온 교환 칼럼으로부터의 용출에 채용되는 통상적인 방법에 따라서 용출·분획할 수 있다. 구체적으로는, 칼럼에 RESOURCE Q (GE 헬스케어 제조) 를 사용하는 경우, 수산화나트륨/염화나트륨 수용액 혼합액에 있어서 염화나트륨 함유량을 0 에서 2 M (2 mol/L) 까지 서서히 증가시키는 그레이디언트 용출액을 이용할 수 있다.
역상 칼럼을 사용하는 경우, 칼럼으로부터의 GalNAc-올리고뉴클레오티드 콘주게이트의 용출은, 적당한 유기 용매를 사용하여, 역상 칼럼으로부터의 용출에 채용되는 통상적인 방법에 따라서 용출·분획할 수 있다. 구체적으로는, 칼럼에 Clarity QSP (Phenomenex 제조) 를 사용하는 경우, 적절한 양의 아세토니트릴을 포함하는 트리스하이드록시메틸아미노메탄 (Tris)-염산 완충액을 이용할 수 있다.
목적물의 검출에는, 핵산의 검출 파장인 260 ㎚ 의 흡광도가 이용된다. 상기 칼럼의 통과액에 대해 260 ㎚ 의 흡광도를 시간 경과적으로 측정하고, 용출 공정에서 검출되는 획분을 회수함으로써, 목적물을 취득할 수 있다.
＜5. 의약＞
본 발명의 콘주게이트는, 포함되는 올리고뉴클레오티드가 목적으로 하는 질환을 치료하기 위한 의약으로서 사용할 수 있다. 치료에는 예방 및 사후 치료 모두 포함된다.
본 발명의 콘주게이트는, 제약상 허용되는 염의 형태로 사용해도 된다. 「제약상 허용되는 염」이란, 올리고뉴클레오티드의 염을 말하며, 그러한 염으로는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염 ; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염 ; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐화수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파르트산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있고, 바람직하게는 알칼리 금속염이고, 보다 바람직하게는 나트륨염이다. 이들 염은, 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
또, 콘주게이트 및 그 제약상 허용되는 염은, 용매화물 (예를 들어, 수화물) 로서도 존재하는 경우가 있으며, 그러한 용매화물이어도 된다. 본 발명에 있어서, 이와 같은 용매화물은, 올리고뉴클레오티드 혹은 콘주게이트의 염에 포함되는 것으로서 취급한다.
본 발명의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염을 의약품에 사용하는 경우에는, 그 자체 혹은 적절한 제약상 허용되는 부형제, 희석제 등과 혼합하여, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 혹은 시럽제 등에 의해 경구적으로, 혹은, 주사제, 좌제, 첩부제 혹은 외용제 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.
이들 제제는, 부형제 (예를 들어, 젖당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체 ; 옥수수 전분, 감자 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체 ; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체 ; 아라비아 고무 ; 덱스트란 ; 풀루란과 같은 유기계 부형제 ; 경질 무수 규산, 합성 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘과 같은 규산염 유도체 ; 인산수소칼슘과 같은 인산염 ; 탄산칼슘과 같은 탄산염 ; 황산칼슘과 같은 황산염 등의 무기계 부형제 등), 활택제 (예를 들어, 스테아르산 ; 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘과 같은 스테아르산 금속염 ; 탤크 ; 콜로이드 실리카 ; 비드 왁스, 경랍 (鯨蠟) 과 같은 왁스류 ; 붕산 ; 아디프산 ; 황산나트륨과 같은 황산염 ; 글리콜 ; 푸마르산 ; 벤조산나트륨 ; DL 류신 ; 라우릴황산나트륨, 라우릴황산마그네슘과 같은 라우릴황산염 : 무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류 ; 상기 전분 유도체 등), 결합제 (예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골, 상기 부형제와 동일한 화합물 등), 붕괴제 (예를 들어, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 내부 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체 ; 카르복시메틸 스타치, 카르복시메틸 스타치 나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분·셀룰로오스류 등), 유화제 (예를 들어, 벤토나이트, 비검과 같은 콜로이드성 점토 ; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 금속 수산화물 ; 라우릴황산나트륨, 스테아르산칼슘과 같은 음이온 계면 활성제 ; 염화벤잘코늄과 같은 양이온 계면 활성제 ; 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면 활성제 등), 안정제 (메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산에스테르류 ; 클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류 ; 염화벤잘코늄 ; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류 ; 티메로살 ; 디하이드로아세트산 ; 소르브산 등), 교미 교취제 (예를 들어, 통상적으로 사용되는 감미료, 산미료, 향료 등), 희석제 등의 첨가제를 사용하여 주지의 방법으로 제조된다.
본 발명의 치료약은, 0.1 ∼ 250 μmoles/mL 의 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 를 함유하면 되며, 바람직하게는 1 ∼ 50 μmoles/mL 의 올리고뉴클레오티드 또는 그 제약상 허용되는 염, 0.02 ∼ 10 ％w/v 의 탄수화물 또는 다가 알코올 및 0.01 ∼ 0.4 ％w/v 의 제약상 허용되는 계면 활성제를 함유시켜 두어도 된다.
상기 탄수화물로는, 단당류 또는 이당류가 특히 바람직하다. 이들 탄수화물 및 다가 알코올의 예로는, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 락토오스, 말토오스, 만니톨 및 소르비톨을 들 수 있다. 이것들은, 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또, 본 발명에 있어서의 계면 활성제의 바람직한 예로는, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 ∼ 트리-에스테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌, 나트륨타우로콜레이트, 나트륨콜레이트, 및 다가 알코올에스테르를 들 수 있다. 이 중 특히 바람직한 것은, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 ∼ 트리-에스테르이고, 여기에 있어서 에스테르로서 특히 바람직한 것은, 올레에이트, 라우레이트, 스테아레이트 및 팔미테이트이다. 이것들은 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또, 본 발명의 치료약은, 더욱 바람직하게는 0.03 ∼ 0.09 M 의 제약상 허용되는 중성염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 및/또는 염화칼슘을 함유시켜 두어도 된다.
또, 본 발명의 치료약은, 더욱 바람직하게는 0.002 ∼ 0.05 M 의 제약상 허용되는 완충제를 함유할 수 있다. 바람직한 완충제의 예로는, 시트르산나트륨, 나트륨글리시네이트, 인산나트륨, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 들 수 있다. 이들 완충제는, 단독으로 사용해도 되고, 병용해도 된다.
또한, 상기 치료약은, 용액 상태로 공급해도 된다. 그러나, 어느 기간 보존할 필요가 있는 경우 등을 위해, 올리고뉴클레오티드를 안정화시켜 치료 효과의 저하를 방지할 목적으로 통상적으로는 동결 건조시켜 두는 것이 바람직하고, 그 경우에는 용시 (用時) 에 용해액 (주사용 증류수 등) 으로 재구성 (reconstruction) 하여, 즉 투여되는 액체 상태로 하여 사용하면 된다. 따라서, 본 발명의 치료약은, 각 성분이 소정의 농도 범위가 되도록 용해액으로 재구성하여 사용하기 위한, 동결 건조된 상태의 것도 포함한다. 동결 건조물의 용해성을 촉진시킬 목적으로, 알부민, 글리신 등의 아미노산을 추가로 함유시켜 두어도 된다.
본 발명의 콘주게이트는, 국제공개 제2015/005253호에 기재되어 있는 지질 등을 사용하여 봉입하고, 국제공개 제2015/005253호 등에 기재되어 있는 바와 같은 핵산 지질 나노 입자 혹은 리포솜으로서 투여해도 된다.
본 발명의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염을 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들어, 성인 1 일당 약 0.01 ∼ 100 ㎎/㎏ (체중), 바람직하게는 0.1 ∼ 20 ㎎/㎏ (체중) 의 투여량으로, 1 회 또는 수 회로 나눠 피하 주사, 점적 정맥 주사, 또는, 정맥 주사하면 되는데, 그 투여량이나 투여 횟수는, 질환의 종류, 증상, 연령, 투여 방법 등에 따라 적절히 변경할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
핵산 자동 합성기로서,「ABI 392 DNA/RNA Synthesizer」(Applied Biosystems 제조)「ABI 394 DNA/RNA Synthesizer」(Applied Biosystems 제조), AKTA Oligopilot (GE Healthcare 제조), nS-8II Synthesizer (Gene Design Inc.) 중 어느 것을 사용하고, 포스포아미다이트법 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 을 사용하고, 합성 스케일에 따른 합성 프로그램을 사용하였다.
축합 활성화제로서, 액티베이터 용액-3 (0.25 mol/L 5-벤질티오-1H-테트라졸·아세토니트릴 용액, 와코 순약 공업 제조, product No. 013-20011) 을 사용하였다.
캡핑 시약으로서, CAP A for AKTA (1-메틸이미다졸·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, product No. L040050), Cap B1 for AKTA (무수 아세트산·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, product No. L050050), Cap B2 for AKTA (피리딘·아세토니트릴 용액, Sigma-Aldrich 제조, product No. L050150) 를 사용하였다.
디블록으로서, DCA Deblock (디클로로아세트산·톨루엔 용액, Sigma-Aldrich 제조, product No. L023050), 혹은, 디블로킹 용액-1 (3 w/v％ 트리클로로아세트산·디클로로메탄 용액, 후지 필름 와코 순약 공업, product No. 042-28921) 을 사용하였다.
포스포로티오에이트 결합을 형성하기 위한 티오화 시약으로서, 0.2 M 이 되도록 페닐아세틸디술파이드 (CARBOSYNTH 제조, product No. FP07495) 를, 아세토니트릴 (탈수, 칸토 화학 제조, product No. 01837-05), 피리딘 (탈수, 칸토 화학 제조, product No. 11339-05) 1 : 1 (v/v) 용액을 사용하여 용해시켜 사용하였다.
산화제로서, OXDIZER 0.05 M (Sigma-Aldrich 제조, product No. L560250-04), 혹은, 0.02 M 이 되도록 요오드 (칸토 화학 제조, product No. 20035-00) 를, 테트라하이드로푸란 (탈수, 칸토 화학 제조, product No. 40993-05), 피리딘 (탈수, 칸토 화학 제조, product No. 11339-05), 증류수 78 : 20 : 2 (v/v/v) 용액을 사용하여 용해시켜 사용하였다.
뉴클레오시드 포스포아미다이트 시약으로서, 2'-O-Me 뉴클레오시드의 포스포아미다이트 (아데노신체 product No. ANP-5751, 시티딘체 product No. ANP-5752, 구아노신체 product No. ANP-5753, 우리딘체 product No. ANP-5754) 는 ChemGenes 제조의 것을 사용하였다.
비천연형 뉴클레오시드의 포스포아미다이트는 일본 공개특허공보 2000-297097호의 실시예 14 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-6-N-벤조일아데노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포아미다이트), 실시예 27 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-2-N-이소부티릴구아노신-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포아미다이트), 실시예 22 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-4-N-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포아미다이트), 실시예 9 (5'-O-디메톡시트리틸-2'-O,4'-C-에틸렌-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필)포스포아미다이트) 의 화합물을 사용하였다.
고상 담체로서, NittoPhase UnyLinker 100, 10 μmol (닛토 전공 제조), Primer Support 5G UnyLinker 350, 10 μmol (GE Healthcare 제조), Primer Support 5G Unylinker 350, 100 μmol (GE Healthcare 제조), 혹은, Glen UnySupport CPG 500, 1 μmol (GlenResearch 제조) 을 합성 스케일에 맞춰 적절히 선택하였다.
(실시예 1) 소수성 보호기 부가형 GalNAc 의 합성
(1A) [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[3-(벤질옥시카르보닐아미노)프로폭시]테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 1A) 의 합성
[화학식 61]
Figure pct00061
N-(3-하이드록시프로필)카르밤산벤질 (6.4 g, 30.8 mmol) 과, 문헌으로 이미 알려진 화합물인 [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (WO2011053614) (10 g, 25.7 mmol) 의 디클로로메탄 (200 ml) 현탁 용액에, 트리플루오로메탄술폰산 (450 μl, 5.1 mmol) 을 첨가하고, 45 도에서 4 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 증류 제거하여 농축시켰다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이소프로필에테르 (100 ml) 를 첨가하고, 3 시간 교반하였다. 얻어진 고형물을 여과하여, 목적물 1A (11.9 g) 를 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00062
(1B) 벤질 N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필]카르바메이트 (화합물 1B) 의 합성
[화학식 62]
Figure pct00063
공정 (1A) 에서 합성한 화합물 (12.4 g, 23 mmol) 의 에틸알코올 (200 ml) 현탁 용액에, 28 ％ 나트륨메톡사이드메탄올 용액 (0.85 ml) 을 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 반응의 진행에 수반하여, 한 번 클리어한 용액이 된다. 60 분간 방치하니 침전물이 얻어졌다. 침전물을 여과하고, 에틸알코올, 디이소프로필에테르로 세정한 후, 감압하 건조시켰다. 목적물 1B 를 포함하는 미정제 생성물 (10 g) 을 고체로서 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00064
(1C) N-[(2R,3R,4R,5R,6R)-2-(3-아미노프로폭시)-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-3-일]아세트아미드염산염 (화합물 1C) 의 합성
[화학식 63]
Figure pct00065
공정 (1B) 에서 합성한 화합물 (22.8 g, 55.3 mmol) 을 테트라하이드로푸란 (280 ml)/1 N 염산 (61 ml) 에 용해시켰다. 10 ％ 팔라듐/탄소 (wet) (5.56 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 3.5 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하였다. 적당량의 에틸알코올을 첨가하여 생성된 고형물을 여과하고, 에틸알코올, 디에틸에테르로 세정 후, 감압하 건조시켰다. 목적물 1C 를 포함하는 미정제 생성물 (17 g) 을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00066
(1D) 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필]카르바메이트 (화합물 1D) 의 합성
[화학식 64]
Figure pct00067
공정 (1C) 에서 합성한 화합물 (16.4 g, 52.1 mmol) 을 테트라하이드로푸란 (200 ml)/순수 (50 ml) 에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (12.7 mL, 72.9 mmol) 을 첨가하였다. 빙랭하, N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐옥시]숙신이미드 (21.1 g, 62.5 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 디에틸에테르 (100 ml) 를 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 고형물을 에틸알코올, 아세트산에틸, 디에틸에테르로 순차적으로 세정한 후, 감압하 건조시켜, 목적물 1D 를 포함하는 미정제 생성물 (22.9 g) 을 얻었다.
Figure pct00068
(1E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-6-[3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)프로폭시]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 1E) 의 합성
[화학식 65]
Figure pct00069
공정 (1D) 에서 합성한 화합물 (1.56 g, 3.1 mmol) 의 피리딘 (20 ml) 현탁액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (1.27 g, 3.7 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 계속해서, 무수 아세트산 (1.18 ml, 12.5 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 20 시간 교반하였다. 반응 종료 후, N,N-디이소프로필에틸아민 (1.1 mL, 6.2 mmol), 에틸알코올 (2 ml) 을 첨가하고, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산 : 아세트산에틸 ＝ 75 : 25 - 0 : 100, v/v, 1 ％ 트리에틸아민 함유) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 1E (2.8 g, quant.) 를 얻었다.
Figure pct00070
(1F) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-4-아세톡시-6-(3-아미노프로폭시)-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 1F) 의 합성
[화학식 66]
Figure pct00071
공정 (1E) 에서 합성한 화합물 (2.49 g, 2.8 mmol) 의 디클로로메탄 (8 ml) 용액에, 피페리딘 (0.45 ml, 4.5 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 반응이 완료되지 않는 경우에는, 적절히 피페리딘을 추가하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 NH-실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 85 : 15, v/v) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 1F (1.48 g, 수율 79 ％) 를 얻었다.
Figure pct00072
(실시예 2) GalNAc 유닛 X18 에 대응하는 아미다이트 시약 (소수성 보호기 부가형 GalNAc-인산기를 갖는 화합물) 의 합성
(2A) 벤질 2-[[2-벤질옥시-3-[(2-벤질옥시-2-옥소-에틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]아세테이트 (화합물 2A) 의 합성
[화학식 67]
Figure pct00073
2-벤질옥시-1,3-프로판디올 (2.5 g, 14 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐 (5.8 g, 29 mmol) 을 테트라하이드로푸란 (100 ml) 에 용해시키고, 피리딘 (5.0 ml, 61.8 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 20 분 교반하였다. 석출된 고체를 여과한 후, 테트라하이드로푸란 (70 ml) 을 첨가하였다. 계속해서, 글리신벤질에스테르 TFA 염 (9.2 g, 33 mmol) 과 N,N-디이소프로필에틸아민 (9.6 mL, 55 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산 : 아세트산에틸 ＝ 100 : 0 - 40 : 60, v/v) 로 정제하여, 검상의 목적물 2A (6.5 g, 수율 84 ％) 를 얻었다.
Figure pct00074
(2B) 2-[[3-(카르복시메틸카르바모일옥시)-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]아세트산 (화합물 2B) 의 합성
[화학식 68]
Figure pct00075
공정 (2A) 에서 합성한 화합물 2A (7.3 g, 2.8 mmol) 을 테트라하이드로푸란 (200 ml)/순수 (50 ml) 에 용해시켰다. 20 ％ 수산화팔라듐-활성 탄소 (약 50 ％ 함수) (3 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 5 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하여 목적물 2B 를 포함하는 미정제 생성물 (3.2 g) 을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00076
(2C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐 l-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 2C) 의 합성
[화학식 69]
Figure pct00077
공정 (2B) 에서 합성한 화합물 2B (0.31 g, 1.05 mmol), 공정 (1E) 에서 합성한 화합물 1F (1.47 g, 2.21 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.91 mL, 5.27 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (9 ml) 용액에, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트 (11.3 g, 29.6 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 디에틸에테르 (합계 185 ml) 에 적하하였다. 상청의 용매를 제거한 후에 얻어진 젤리상의 미정제 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 15 : 85, v/v, 1 ％ 트리에틸아민 함유) 로 정제하여, 목적물 2C (1.05 g, 수율 63 ％) 를 고체로서 얻었다.
Figure pct00078
(2D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[3-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 2D) 의 합성
[화학식 70]
Figure pct00079
공정 (2C) 에서 합성한 화합물 2C (0.47 g, 0.30 mmol) 를 적당량의 아세트산에틸/톨루엔 (1/1) 으로 공비한 후, 디클로로메탄 (3 ml) 에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (210 μl, 1.18 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포아미다이트 (79 μl, 0.36 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 또한, 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포아미다이트 (20 μl, 0.09 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (아세트산에틸 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 85 : 15, v/v, 1 ％ 트리에틸아민 함유) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 2D (0.34 g, 수율 64 ％) 를 얻었다.
Figure pct00080
(실시예 3) GalNAc 유닛 X19 에 대응하는 아미다이트 시약 (소수성 보호기 부가형 GalNAc-인산기를 갖는 화합물) 의 합성
(3A) 벤질 2-[[3-벤질옥시-2-[(2-벤질옥시-2-옥소-에틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]아세테이트 (화합물 3A) 의 합성
[화학식 71]
Figure pct00081
2-벤질옥시-1,3-프로판디올 대신에, (＋/－)-3-벤질옥시-1,2-프로판디올 (1.0 g, 5.5 mmol) 을 사용하고, 공정 (2A) 와 동일하게 하여, 목적물 3A (2.8 g, 수율 90 ％) 를 얻었다.
Figure pct00082
(3B) 2-[[2-(카르복시메틸카르바모일옥시)-3-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]아세트산 (화합물 3B) 의 합성
[화학식 72]
Figure pct00083
화합물 2A 대신에, 화합물 3A (2.8 g, 5.0 mmol) 를 사용하고, 공정 (2B) 와 동일하게 하여, 목적물 3B 를 포함하는 미정제 생성물 (1.2 g) 을 얻었다.
Figure pct00084
(3C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-3-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐 l-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 3C) 의 합성
[화학식 73]
Figure pct00085
화합물 2B 대신에, 화합물 3B (0.31 g, 1.05 mmol) 를 사용하고, 공정 (2C) 와 동일하게 하여, 목적물 3C (0.74 g, 수율 44 ％) 를 얻었다.
Figure pct00086
(3D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[[2-[[2-[[2-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-2-옥소-에틸]카르바모일옥시]-3-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]카르보닐아미노]아세틸]아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 3D) 의 합성
[화학식 74]
Figure pct00087
화합물 2C 대신에, 화합물 3C (0.31 g, 1.05 mmol) 를 사용하고, 공정 (2D) 와 동일하게 하여, 목적물 3D (0.60 g, 수율 72 ％) 를 얻었다.
Figure pct00088
(실시예 4) GalNAc 유닛 X20 에 대응하는 아미다이트 시약 (소수성 보호기 부가형 GalNAc-인산기를 갖는 화합물) 의 합성
(4A) 3-[[2-벤질옥시-3-[(3-벤질옥시-3-옥소-프로필)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]프로판산벤질에스테르 (화합물 4A) 의 합성
[화학식 75]
Figure pct00089
공정 (2A) 에서 사용한 글리신벤질에스테르 TFA 염 대신에, 3-아미노프로판산벤질에스테르 TFA 염 (2.4 g, 8.17 mmol) 을 사용하고, 공정 (2A) 와 동일하게 하여, 목적물 4A (1.62 g, 수율 80 ％) 를 얻었다.
Figure pct00090
(4B) 3-[[3-(2-카르복시에틸카르바모일옥시)-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]프로판산 (화합물 4B) 의 합성
[화학식 76]
Figure pct00091
공정 (2B) 에서 사용한 화합물 2A 대신에, 화합물 4A (1.62 g, 2.73 mmol) 를 사용하고, 공정 (2B) 와 동일하게 하여, 목적물 4B (0.89 g, quant) 를 얻었다.
Figure pct00092
(4C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 4C) 의 합성
[화학식 77]
Figure pct00093
공정 (2C) 에서 사용한 화합물 2B 대신에, 화합물 4B (300 ㎎, 0.93 mmol) 를 사용하고, 공정 (2C) 와 동일하게 하여, 목적물 4C (950 ㎎, 수율 63 ％) 를 얻었다.
Figure pct00094
(4D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐 l]옥시-프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 4D) 의 합성
[화학식 78]
Figure pct00095
공정 (2D) 에서 사용한 화합물 2C 대신에, 화합물 4C (945 ㎎, 0.58 mmol) 를 사용하고, 공정 (2D) 와 동일하게 하여, 목적물 4D (638 ㎎, 수율 60 ％) 를 얻었다.
Figure pct00096
(실시예 5) GalNAc 유닛 X21 에 대응하는 아미다이트 시약 (소수성 보호기 부가형 GalNAc-인산기를 갖는 화합물) 의 합성
(5A) 4-[[2-벤질옥시-3-[(4-벤질옥시-4-옥소-부틸)카르바모일옥시]프로폭시]카르보닐아미노]부탄산벤질에스테르 (화합물 5A) 의 합성
[화학식 79]
Figure pct00097
공정 (2A) 에서 사용한 글리신벤질에스테르 TFA 염 대신에, 4-아미노부탄산벤질에스테르 TFA 염 (1.30 g, 4.21 mmol) 을 사용하고, 공정 (2A) 와 동일하게 하여, 목적물 5A (0.85 g, 수율 78 ％) 를 얻었다.
Figure pct00098
(5B) 4-[[3-(3-카르복시프로필카르바모일옥시)-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]부탄산 (화합물 5B) 의 합성
[화학식 80]
Figure pct00099
공정 (2B) 에서 사용한 화합물 2A 대신에, 화합물 5A (0.85 g, 1.4 mmol) 를 사용하고, 공정 (2B) 와 동일하게 하여, 목적물 5B (0.49 g, quant) 를 얻었다.
Figure pct00100
(5C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[4-[[3-[[4-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-4-옥소-부틸]카르바모일옥시]-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]부타노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 5C) 의 합성
[화학식 81]
Figure pct00101
공정 (2C) 에서 사용한 화합물 2B 대신에, 화합물 5B (300 ㎎, 0.86 mmol) 를 사용하고, 공정 (2C) 와 동일하게 하여, 목적물 5C (1.16 g, 수율 82 ％) 를 얻었다.
Figure pct00102
(5D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-4-옥소-부틸]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]카르보닐아미노]부타노일아미노]프로폭시]-4-아세톡시-2-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]테트라하이드로피란-3-일]아세테이트 (화합물 5D) 의 합성
[화학식 82]
Figure pct00103
공정 (2D) 에서 사용한 화합물 2C 대신에, 화합물 5C (1.16 g, 0.71 mmol) 를 사용하고, 공정 (2D) 와 동일하게 하여, 목적물 5D (795 ㎎, 수율 61 ％) 를 얻었다.
Figure pct00104
(실시예 6) GalNAc 유닛 X22 에 대응하는 아미다이트 시약의 합성
(6A) 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[5-(벤질옥시카르보닐아미노)펜톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 6A) 의 합성
[화학식 83]
Figure pct00105
문헌으로 이미 알려진 화합물인 N-벤질옥시카르보닐-1-하이드록시펜틸-5-아민 (J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 4058-4073.) (8.05 g, 33.9 mmol) 과 문헌으로 이미 알려진 화합물인 아세트산[(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4,6-트리아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸 (WO2011053614) (12.0 g, 30.8 mmol) 의 디클로로메탄 (200 mL) 현탁 용액에, 트리플루오로메탄술폰산 (450 μL, 5.23 mmol) 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 절반 정도 감압 증류 제거하여 농축시키고, 아세트산에틸/포화 탄산수소나트륨 수용액의 혼합 용액에 첨가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수/인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산 : 아세트산에틸 ＝ 100 : 0 - 0 : 100, v/v) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 6A (17.0 g, 수율 94 ％) 를 얻었다.
Figure pct00106
(6B) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(5-아미노펜톡시)테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트염산염 (화합물 6B) 의 합성
[화학식 84]
Figure pct00107
공정 (6A) 에서 합성한 화합물 6A (3.87 g, 6.83 mmol) 를 테트라하이드로피란 (32 ml)/ 1 N 염산 (8 ml) 에 용해시켰다. 10 ％ 팔라듐/탄소 (wet) (2 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하여 목적물 6B (3.1 g, 수율 97 ％) 의 미정제 생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00108
(6C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-벤질옥시-프로폭시]카르바모일아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 6C) 의 합성
[화학식 85]
Figure pct00109
2-벤질옥시-1,3-프로판디올 (600 ㎎, 3.29 mmol), 클로로포름산 4-니트로페닐 (1.39 g, 6.91 mmol) 을 테트라하이드로푸란 (22 ml) 에 용해시키고, 피리딘 (1.1 ml, 13.2 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 석출된 고체를 여과한 후, 테트라하이드로푸란 (16 ml) 을 첨가하였다. 계속해서, 공정 (6B) 에서 합성한 화합물 (6B) (3.09 g, 6.59 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (15 ml)/디클로로메탄 (5 ml) 용액과 N,N-디이소프로필에틸아민 (3.4 mL, 19.8 mmol) 을 첨가하고, 40 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 디클로로메탄을 첨가하고, 유기층을 0.5 N 염산, 포화 식염수, 0.2 N 수산화나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 90 : 10, v/v) 로 정제하여, 목적물 6C 를 메인으로 포함하는 혼합물 (2.1 g) 을 얻었다.
Figure pct00110
(6D) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 6D) 의 합성
[화학식 86]
Figure pct00111
공정 (6C) 에서 얻어진 6C 를 포함하는 혼합물 (2.1 g) 을 테트라하이드로피란 (20 ml)/순수 (1 ml) 에 용해시켰다. 1 N 염산 (0.38 ml), 10 ％ 팔라듐/탄소 (wet) (1 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (아세트산에틸 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 90 : 15, v/v) 로 정제하여, 목적물 6D (1.38 g, 수율 72 ％) 를 고체로서 얻었다.
Figure pct00112
(6E) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[5-[[3-[5-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시펜틸카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]카르바모일아미노]펜톡시]-3,4-디아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 6E) 의 합성
[화학식 87]
Figure pct00113
공정 (2D) 에서 사용한 화합물 2C 대신에, 화합물 6D (1.38 g, 1.37 mmol) 를 사용하고, 공정 (2D) 와 동일하게 하여, 목적물 6E (850 ㎎, 수율 51 ％) 를 얻었다.
Figure pct00114
(실시예 7) GalNAc 유닛 X20 에 대응하는 아미다이트 시약의 합성
(7A) [(2R,3R,4R,5R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-(3-아미노프로폭시)테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트염산염 (화합물 7A) 의 합성
[화학식 88]
Figure pct00115
공정 (1A) 에서 합성한 화합물 1A (10 g, 18.6 mmol) 를 테트라하이드로푸란 (200 ml)/1 N 염산 (20 ml) 에 용해시켰다. 10 ％ 팔라듐/탄소 (wet) (1 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 1 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하여 목적물 7A 를 포함하는 미정제 생성물 (8.97 g) 을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00116
(7B) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-하이드록시-프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 7B) 의 합성
[화학식 89]
Figure pct00117
공정 (4B) 에서 합성한 화합물 4B (200 ㎎, 0.62 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (2 ml) 용액에, O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄테트라플루오로붕산염 (411 ㎎, 1.37 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.32 ml, 1.86 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 20 분 교반하였다. 이 반응액을 공정 (37B) 에서 합성한 화합물 37B (657 ㎎, 1.49 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (2 ml) 용액에 첨가한 후, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.32 ml, 1.86 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 60 분 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 디에틸에테르 (합계 80 ml) 에 적하하였다. 상청의 용매를 제거한 후에 얻어진 젤리상의 미정제 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 75 : 25, v/v) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 7B (408 ㎎, 수율 60 ％) 를 얻었다.
Figure pct00118
(7C) [(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-6-[3-[3-[[3-[[3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시프로필아미노]-3-옥소-프로필]카르바모일옥시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]카르보닐아미노]프로파노일아미노]프로폭시]-3,4-디아세톡시-테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 7C) 의 합성
[화학식 90]
Figure pct00119
공정 (2D) 에서 사용한 화합물 2C 대신에, 화합물 7B (1.53 g, 1.40 mmol) 를 사용하고, 공정 (2D) 와 동일하게 하여, 목적물 7C (510 ㎎, 수율 28 ％) 를 얻었다.
Figure pct00120
(실시예 8)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
핵산 자동 합성 장치에 ABI 392 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems 제조) 를, 고상 담체로서, NittoPhase UnyLinker 100, 10 μmol (닛토 전공 제조) 을 사용하고, 포스포아미다이트법 (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 으로 올리고뉴클레오티드 서열 15e_001 을 합성 후, 추가로 GlcNAc 유닛 아미다이트로서, 실시예 2 에서 합성한 2D 를 사용하여, 1 회 축합시켰다. 보호된 올리고뉴클레오티드 유연체를 6 mL 의 농암모니아수로 처리함으로써 올리고머를 지지체로부터 잘라냄과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 분리하였다. Clarity QSP (Phenomenex 제조) 를 사용하여, 첨부되어 있는 프로토콜에 따라서 정제하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6247.96).
(실시예 9)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 15e_001.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6233.97).
(실시예 10)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 44)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 15e_005.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 105 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6235.97).
(실시예 11)
X18-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열 번호 45)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 15e_006.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 90 번째 내지 104 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6200.94).
(실시예 12)
X18-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 42)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 16e_001.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 107 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6593.02).
(실시예 13)
X18-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 47)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 16e_002.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6595.01).
(실시예 14)
X18-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2s-Um1t-H (서열 번호 48)
실시예 8 에서 사용한 서열 대신에 상기 서열인 16e_003.5 를 사용하여, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 90 번째 내지 105 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6571.98).
(실시예 15)
X20-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
GalNAc 유닛 아미다이트로서 화합물 2D 대신에 실시예 4 에서 제조한 화합물 4D 를 사용함으로써, X18 의 부분을 X20 과 치환시켜, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5 이다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6261.98).
(실시예 16)
X20-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 44)
서열을 상기 서열 15e_005.5 로 하여, 실시예 15 와 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 105 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6264.00).
(실시예 17)
X20-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 42)
서열을 상기 서열 16e_001.5 로 하여, 실시예 15 와 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 107 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6621.04).
(실시예 18)
X20-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 47)
서열을 상기 서열 16e_002.5 로 하여, 실시예 15 와 동일하게 합성을 실시하였다
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6623.05).
(실시예 19)
X21-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
GalNAc 유닛 아미다이트로서 실시예 5 에서 합성한 화합물 5D 를 사용함으로써, X18 의 부분을 X21 과 치환시켜, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5 이다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6290.02).
(실시예 20)
X22-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
GalNAc 유닛 아미다이트로서 실시예 6 에서 합성한 화합물 6D 를 사용함으로써, X18 의 부분을 X22 와 치환시켜, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다. 사용한 서열은 상기 서열 15e_001.5 이다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6175.96).
(실시예 21)
X22-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 44)
서열을 상기 서열 15e_005.5 로 하여, 실시예 20 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 105 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6177.98).
(실시예 22)
X22-Am1s-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 42)
서열을 상기 서열 16e_001.5 로 하여, 실시예 20 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 107 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6535.03).
(실시예 23)
X22-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Ae2s-Um1s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1s-Ce2t-H (서열 번호 47)
서열을 상기 서열 16e_002.5 와 치환시켜, 실시예 20 과 동일하게 합성을 실시하였다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 91 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6537.05).
(실시예 24)
X20-Ge2s-Ce2s-As-Ts-Ts-Gs-Gs-Ts-As-Ts-Te2s-Ce2s-Ae2t-H (서열 번호 96)
실시예 15 에서 사용한 서열 대신에, human apolipoprotein B (APOB) GenBank accession No. NM_000384.2 의 핵산 서열 10177-10189 에 상보적인 상기 서열을 사용하여, 실시예 15 와 동일하게 GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트 (ApoB-ASO 콘주게이트) 를 합성하였다. 또, 동 방법에 있어서, 상기 서열의 올리고뉴클레오티드가 합성된 단계에서 합성을 종료하고, 절출·회수를 실시함으로써, GalNAc 유닛이 결합하지 않는 올리고뉴클레오티드 (ApoB-ASO) 를 합성하였다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 5296.83 (ApoB-ASO 콘주게이트), 4392.50 (ApoB-ASO)).
(시험예 1) 배양 세포를 사용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
(1-1) 293A 세포 (인간 태아 신세포) 의 배양
이하와 같이 하여, 293A 세포 (R705-07 invitrogen) 의 배양을 실시하였다.
293A 세포를 유지 배지 (DMEM, 10 ％ FBS) 에서 유지 배양하였다. 실험에서는 6 웰 플레이트에 2 × 105 세포/웰 12 웰 플레이트에 1 × 105 세포/웰의 밀도로 세포를 파종하고, 다음날, 후술하는 바와 같이 실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터를 동시에 도입하여, 평가에 사용하였다.
(1-2) 인간 G6PC 전체 길이 플라스미드 벡터 제조
이하와 같이 하여, 인간 G6PC 전체 길이 플라스미드 벡터 (pcDNA hG6PC, pcDNA hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4) 를 제조하였다.
Human Multiple Tissue cDNA Panel 을 주형으로 하고, 하기 G6PC cDNA Amplified primer 를 사용하여 G6PC cDNA 를 증폭 후, 추가로 G6PC cDNA IF primer 로 증폭시켰다. 증폭된 단편을 InFusion System 에 의해 pcDNA3.1 의 BamHI site 에 삽입하였다 (pcDNA hG6PC).
G6PC cDNA Amplified primer :
포워드 프라이머 5'-ATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCC-3' (서열 번호 49)
리버스 프라이머 5'-ATTCCACGACGGCAGAATGGATGGC-3' (서열 번호 50)
G6PC IF primer :
포워드 프라이머 5'-TACCGAGCTCGGATCCACCACCAAGCCTGGAATAACTGC-3' (서열 번호 51),
리버스 프라이머 5'-CTGGACTAGTGGATCCTGGCATGGTTGTTGACTTTAAAC-3' (서열 번호 52)
Human Genome DNA 를 주형으로 하고, 하기 G6PC Int4 Amplified primer 를 사용하여 G6PC Intron4 와 Exon5 를 일부 포함하는 영역을 증폭시키고, 추가로 G6PC Intron4 를 G6PC Int4 IF primer 로 증폭시켰다. 또, STEP1-1 제조의 pcDNA hG6PC 를 하기 hG6PC vector IF primer 를 사용하여 증폭시켰다. 또한, InFusion primer 에는 Exon5 내의 c.648G>T 변이를 도입하였다. 양 단편을 InFusion System 에 의해 연결하고, pcDNA hG6PC 내에 G6PC Intron4 서열을 삽입하였다 (pcDNA hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4).
G6PC Int4 Amplified primer :
포워드 프라이머 5'-TCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTG-3' (서열 번호 53)
리버스 프라이머 5'-GTAGGGGATGACACTGACGGATGCC-3' (서열 번호 54)
G6PC Int4 IF primer :
포워드 프라이머 5'-CTGGAGTCCTGTCAGGTATGGGC-3' (서열 번호 55)
리버스 프라이머 5'-AGCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAG-3' (서열 번호 56)
hG6PC vector IF primer :
포워드 프라이머 5'-TCTTCCTTTTCAGCTTCGCCATCGG-3' (서열 번호 57)
리버스 프라이머 5'-CTGACAGGACTCCAGCAACAAC-3' (서열 번호 58)
(1-3) 실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터의 코트랜스펙션
이하와 같이 하여, 실시예의 화합물, 및 플라스미드 벡터를 코트랜스펙션하였다.
하기 A 액과 B 액을 제조 후, 혼합하였다.
6 웰 플레이트에서 실시하는 경우, 1 웰 당, A 액으로서 250 μL Opti-MEM Medium (gibco), 0.50 μL 플라스미드 벡터 (1 ㎎/mL), 4.0 μL (final : 20 nM) 실시예에서 제조한 화합물 (12.5 μM) 을 준비하고, B 액으로서 250 μL Opti-MEM Medium (gibco), 6.0 μL Lipofectamine2000 (Invitrogen) 을 준비하고, A 액과 B 액을 혼합하였다. 12 웰 플레이트에서 실시하는 경우, 1 웰 당, A 액으로서 125 μL Opti-MEM Medium (gibco), 0.25 μL 플라스미드 벡터 (1 ㎎/mL), 2.0 μL (final : 20 nM) 실시예에서 제조한 화합물 (12.5 μM) 을 준비하고, B 액으로서 125 μL Opti-MEM Medium (gibco), 3.0 μL Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 준비하고, A 액과 B 액을 혼합하였다.
상기 혼합액을 20 분간 실온에서 인큐베이션 후, 계대 다음날의 세포에 첨가하였다 (코트랜스펙션). 첨가 6 시간 후에 신선한 유지 배지와 교환하고, 상기 혼합액 첨가로부터 24 시간 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
(1-4) RT-PCR 에 의한 mRNA 의 평가
[1] RNA 추출 (in vitro)
이하와 같이 하여 RNA 의 추출을 실시하였다.
코트랜스펙션 후 24 시간 인큐베이션한 세포를, cold PBS 로 1 회 세정하였다. RNeasy mini kit 혹은 RNeasy 96 kit (Qiagen) 의 세포 용해액을, 1 웰에 대해 300 μL 씩 첨가하고, 실온에서 5 분간 인큐베이션 후 회수하였다. 회수액에 대해, DNase 처리를 포함하는 키트의 프로토콜에 따라서 RNA 정제를 실시하였다. DNase 처리에는 RNase-Free DNase set (Qiagen 89254) 를 사용하였다. 정제·용출된 RNA 는 후술하는 역전사 반응을 실시하였다.
[2] 역전사 반응
이하와 같이 하여 역전사 반응을 실시하였다.
추출 RNA 를 25 ∼ 100 ㎎/mL 로 조정 후, High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied biosystems) 를 사용해서, 1 sample 당 10 μL Buffer mix, 1 μL Enzyme mix, 9 μL 정제수, ＋ 추출 RNA 가 되도록 혼합하여 역전사 반응을 실시하였다 (37 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold).
역전사 반응 산물 20 μL 에 대하여 정제수 80 μL 로 5 배 희석시켜 -30 ℃ 에서 보존하였다.
[3] qRT-PCR (SYBR Green)
하기와 같이 qRT PCR Primer (SYBR Green) 를 설계하였다.
Repaired hG6PC primer (SYBR) :
포워드 프라이머 5'-TTGTGGTTGGGATTCTGGGC-3' (서열 번호 59)
리버스 프라이머 5'-ATGCTGTGGATGTGGCTGAA-3' (서열 번호 60)
hActin primer (SYBR) :
포워드 프라이머 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3' (서열 번호 61)
리버스 프라이머 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' (서열 번호 62)
또 PCR 반응액을 1 웰 당, 5 μL 2x FAST SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), 2 μL 정제수, 1 μL Primer mix (10 μM), 2 μL cDNA (5 배 희석 완료) 를 현탁하고, viia7 (Applied Biosystems) 로 PCR 반응을 실시하였다 (프로그램 : SYBR Green Regents, FAST, include Melt curve)).
[4] qRT-PCR (Taqman assay)
하기와 같이 Repaired hG6PC primer set, Total hG6PC primer set 를 설계하고, 20x primer probe mix (primer 농도 : 1000 nM probe 농도 : 250 nM) 를 조정하였다. hActin primer set, ㎃ctin primer set 는 원액인 채를 사용하였다.
Repaired hG6PC primer set (Taqman) :
포워드 프라이머 5'-GCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTT-3' (서열 번호 63)
리버스 프라이머 5'-TGGATGTGGCTGAAAGTTTCTGTA-3' (서열 번호 64)
프로브 5'-TCCTGTCAGGCATTGC-3' FAM (서열 번호 65)
hActin primer set (Taqman) : ABI Hs01060665_g1 FAM
㎃ctin primer set (Taqman) : ABI Mm02619580_g1 FAM
18s primer set (Taqman) : ABI Hs99999901_s1 FAM
또 1 웰 부근에 5 μL 2x Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), 2.5 μL 정제수, 0.5 μL 20x Primer probe mix (10 μM), 2 μL cDNA (5 배 희석 완료) 를 현탁하여 PCR 반응액을 조정 (1 tube 당) 하고, viia7 또는 Quantstadio7 (Applied Biosystems 사) 로 PCR 반응을 실시하였다 (프로그램 : Taqman regents, FA).
(1-5) 인간 G6PC 전체 길이 플라스미드 벡터 (pcDNA hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4) 를 사용한 실시예의 올리고뉴클레오티드에 의한 G6PC mRNA 의 이상 스플라이싱의 수복 평가
인간 G6PC 전체 길이 플라스미드 벡터 (pcDNA hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4) 와 올리고뉴클레오티드 (15e_001, 15e_002, 및 컨트롤로서 국제공개 제2004/048570호의 실시예 93 의 화합물) 의 코트랜스펙션을 실시하고, G6PC (c.648G>T) 에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지를 qRT-PCR (SYBR Green) 로 평가하였다. 그 결과, 15e_001, 15e_002 의 화합물에서 G6PC mRNA 의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(시험예 2) 모델 마우스를 사용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
(2-1) 마우스의 작출
벡터의 제조
하기 순서에 따라서, G6PC KI vetor 를 제조하였다.
Mouse Genome DNA 를 주형으로, 하기 mG6PC 5' arm Amplified primer 를 사용하여, G6PC 5' arm 영역을 증폭시켰다. 추가로 mG6PC 5' arm IF primer 로 증폭 후, pBluescriptII (＋/－) 의 XhoI site 에 삽입하였다 (G6PC 5' arm vector).
mG6PC 5' arm Amplified primer :
포워드 프라이머 5'-GGGAAACATGCATGAAGCCCTGGGC-3' (서열 번호 67)
리버스 프라이머 5'-TCCCTTGGTACCTCAGGAAGCTGCC-3' (서열 번호 68)
mG6PC 5' arm IF primer :
포워드 프라이머 5'-CGGGCCCCCCCTCGAAAACTAGGCCTGAAGAGATGGC-3' (서열 번호 69)
리버스 프라이머 5'-TACCGTCGACCTCGAGGGTTGGCCTTGATCCCTCTGCTA-3' (서열 번호 70)
다음으로 Mouse Genome DNA 를 주형으로, 하기 mG6PC 3' arm Amplified primer 를 사용하여, G6PC 3' arm 영역을 증폭시켰다. 추가로 mG6PC 3' arm IF primer 로 증폭 후, G6PC 5' arm vector 의 NotI saite 에 삽입하였다 (G6PC 5' ＋ 3' arm vector).
mG6PC 3' arm Amplified primer :
포워드 프라이머 5'-GGTTGAGTTGATCTTCTACATCTTG-3' (서열 번호 71)
리버스 프라이머 5'-GCAAGAGAGCCTTCAGGTAGATCCC-3' (서열 번호 72)
mG6PC 3' arm IF primer :
포워드 프라이머 5'-AGTTCTAGAGCGGCCGCCCATGCAAAGGACTAGGAACAAC-3' (서열 번호 73)
리버스 프라이머 5'-ACCGCGGTGGCGGCCAATGTTGCCTGTCTTCCTCAATC-3' (서열 번호 74)
앞서 서술한 pcDNA hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 를 주형으로 하고, 하기 hG6PC ＋ Int4 IF primer 를 사용하여 hG6PC (c.648G>T) ＋ Intron4 를 증폭시켰다. 또, G6PC 5' ＋ 3' arm vector 를 주형으로 하고, 하기 Arm vector IF Primer 를 사용하여 증폭시켰다. 양 단편을 InFusion System 을 사용해서 연결하여 G6PC KI vetor 를 제조하였다.
hG6PC ＋ Int4 IF primer :
포워드 프라이머 5'-GGCCAACCCTGGAATAACTGCAAGGGCTCTG-3' (서열 번호 75)
리버스 프라이머 5'-TTGCATGGTTGTTGACTTTAAACACCGAAGA-3' (서열 번호 76)
Arm vector IF Primer :
포워드 프라이머 5'-TCAACAACCATGCAAAGGACTAGGAACAAC-3' (서열 번호 77)
리버스 프라이머 5'-ATTCCAGGGTTGGCCTTGATCCCTCTGCTA-3' (서열 번호 78)
pSPgRNA (addgene) 의 gRNA 서열 도입 영역에, 하기 KI 5' gRNA, KI 3' gRNA 서열을 도입하여 pSPgRNA (KI 5'), pSPgRNA (KI 3') 를 제조하였다.
KI 5' gRNA : 5'-GGGATCAAGGCCAACCGGCTGG-3' (서열 번호 79)
KI 3' gRNA : 5'-TAAAGTCAACCGCCATGCAAAGG-3' (서열 번호 80)
(2-2) 마이크로인젝션
각종 벡터를 멸균 증류수를 사용하여, 최종 농도가 G6PC KI vetor 10 ng/μL, pSPgRNA (KI 5') 5 ng/μL, pSPgRNA (KI 3') 5 ng/μL, pSPCas9 (addgene) 5 ng/μL 이 되도록 조정한 후, MILLEX-GV 시린지 필터 (밀리포어) 를 통과시킨 것을 C57BL/6J 마우스 수정란의 전핵이 충분히 부풀어 오를 정도까지 (약 2 pL) 인젝션하였다. 그 수정란을 리시피언트 C57BL/6J 마우스의 난관에 이식하여, F0 마우스를 취득하였다.
(2-3) Genotyping, F1 계통화
이하의 순서로 Genotyping 을 실시, F1 계통화를 실시하였다.
F0 마우스의 꼬리 조직으로부터 핵산 자동 추출 장치 (PI-200 쿠라보) 및 전용 키트를 사용하여 게놈 DNA 를 추출하였다. 추출 DNA 를 Amplitaq Gold Master mix (Thermo fisher) 를 사용하여 및 하기 KI screening primer 를 사용하여 증폭시켰다 (95 ℃ 10 min, (95 ℃ 30 sec, 60 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec) 35 cycles, 72 ℃ 2 min, 4 ℃ Hold).
KI screening primer :
포워드 프라이머 5'-TACGTCCTCTTCCCCATCTG-3' (서열 번호 81),
리버스 프라이머 5'-CTGACAGGACTCCAGCAACA-3' (서열 번호 82)
상기 PCR 산물에 대해 겔 전기 영동을 실시하고, 433bp 부근에 밴드를 확인한 개체의 게놈 DNA 를 템플릿으로 하고, PrimeSTAR GXL (takara) 및 하기 KI genotyping primer 를 사용하여 증폭시켰다 (98 ℃ 2 min, (95 ℃ 15 sec, 68 ℃ 5 min) 38 cycles, 68 ℃ 7 min, 15 ℃ Hold).
KI genotyping primer (5') :
포워드 프라이머 5'-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCTCTATGT-3' (서열 번호 83 과 동일 (1))
리버스 프라이머 5'-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAGAAGACC-3' (서열 번호 84 와 동일 (2))
KI genotyping primer (3') :
포워드 프라이머 5'-GAGTCTATATTGAGGGCAGGCTGGAGTC-3' (서열 번호 85),
리버스 프라이머 5'-TAGTCTGCCTGCTCACTCAACCTCTCCT-3' (서열 번호 86)
상기 PCR 산물에 대해 겔 전기 영동을 실시하였다. KI genotyping primer (5') 및 KI genotyping primer (3') 중 어느 것이라도 기대된 서열 길이 (4705bp, 4026bp) 로 증폭을 확인한 개체의 게놈 DNA 의 KI genotyping primer (5') 를 사용한 PCR 산물을 Gentetic analyzer (Lifetechnology) 및 하기 KI sequence primer 를 사용하여 다이렉트 시퀀스를 실시하였다. 기대한 서열의 KI 를 확인할 수 있었던 것을 KI 양성 F0 으로 하였다.
KI sequence primer (5') : 5'-GAGTCTATATTGAGGGCAGGCTGGAGTC-3' (서열 번호 87)
KI 양성 F0 과 C57BL/6J 를 교배시켜 F1 을 취득하였다. F1 의 귓바퀴 조직으로부터 DNeasy 96 Blood & Tissue Kit (Qiagen) 를 사용하여 게놈 DNA 를 추출하고, PrimeSTAR GXL (takara) 및 앞서 서술한 KI genotyping primer (5') 를 사용하여 증폭시켰다 (98 ℃ 2 min, (95 ℃ 15 sec, 68 ℃ 5 min) 38 cycles, 68 ℃ 7 min, 15 ℃ Hold).
상기 PCR 산물에 대해 겔 전기 영동을 실시하고, 기대된 서열 길이 (4705 b) 로 증폭을 확인한 개체를 KI 양성 F1 로 하였다. KI 양성 F1 중에서 선별한 1 라인을 번식시켜 hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 KI 계통으로 하였다.
(2-4) hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 계통의 genotyping
귓바퀴 조직으로부터 DNeasy 96 Blood & Tissue Kit (Qiagen) 를 사용하여 게놈 DNA 를 추출하고, KOD FX (TOYOBO) 및 하기 KI genotyping primer, mG6PC WT primer 를 사용하여 multiprex 증폭시켰다 (98 ℃ 2 min, (95 ℃ 15 sec, 68 ℃ 5.5 min) 32 cycles, 68 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold).
KI genotyping primer (5') :
포워드 프라이머 5'-TTCCTTCCAAAGCAGGGACTCTCTATGT-3' (서열 번호 83 과 동일 (1))
리버스 프라이머 5'-CTTGCAGAAGGACAAGACGTAGAAGACC-3' (서열 번호 84 와 동일 (2))
mG6PC WT primer :
포워드 프라이머 5'-TAAATTTGACCAATGAGCACTGGAGGTC-3' (서열 번호 88)
리버스 프라이머 5'-AAAATCATGTGTATGCGTGCCTTTCCTA-3' (서열 번호 89)
상기 PCR 산물에 대해 겔 전기 영동을 실시하고, 4705b 근방의 증폭을 KI 얼릴, 2536bp 근방의 증폭을 mG6PC WT 얼릴로 하고, 산자 (産子) 의 genotyping (WT, Ht, Homo) 을 판별하였다.
(2-5) 마우스의 제재
이하와 같이 하여 마우스의 제재를 실시하였다.
제재의 전날 저녁에 분식 (糞食) 을 피하기 위한 바닥망을 설치한 후, 절식을 개시하였다. 다음날, 마취 도입하에서 개복하고, 충분히 탈혈 후, 간장, 신장을 적출하였다. 각 장기는 ice cold PBS 로 세정 후, 적절한 크기로 트리밍하여, 미리 호모게나이즈 비드 (닛카토) 를 넣은 튜브에 보존하였다. 각 장기는 액체 질소로 순간 냉각시킨 후 -80 ℃ 에서 보관하였다.
(2-6) qRTPCR 에 의한 mRNA 의 평가
[1] RNA 추출 (in vivo)
이하와 같이 하여 RNA 의 추출을 실시하였다.
조직 보존 튜브당, RNeasy mini kit 혹은 Qiacube system (Qiagen) 의 세포 용해액을 600 μL 씩 첨가하고, tissue lyserII (Qiagen) 로 25 kHz 2 min 으로 호모게나이즈를 하였다. 빙랭하에서 10 분간 인큐베이션 후, 8000 G, 10 분간, 실온에서 원심하여 상청을 회수하였다. 상청에 대해, DNase 처리를 포함하는 각 키트의 프로토콜에 따라서 RNA 정제를 실시하였다. DNase 처리에는 RNase-Free DNase set (Qiagen) 를 사용하였다. 정제·용출된 RNA 는 앞서 서술한 역전사 반응을 실시하고, 앞서 서술한 qRT-PCR (Taqman assay) 에 따라서 수복 G6PC mRNA 의 정량을 실시하였다.
(2-7) hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 Ht KI 마우스를 사용한 실시예 화합물에 의한 이상 스플라이싱의 수복 평가
hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 Ht KI 마우스에 대하여 실시예 8 ∼ 14 의 화합물을 오오츠카 생리 식염 주사액에 용해시키고, 30 ㎎/㎏ 이 되도록 피하 투여를 실시하였다. 투여 7 일 후에 하룻밤 절식 조건하에서 마우스의 간장 조직을 채취하고, G6PC (c.648G>T) 에 의한 이상 스플라이싱이 수복되는지 qRT-PCR (Taqman) 로 평가한 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 실시예 8 ∼ 14 의 화합물에서 hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA 의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
또, 실시예 15 ∼ 23 의 화합물에 대해 동일하게 평가한 결과, 도 2 에 나타낸 바와 같이, 실시예 15 ∼ 23 의 화합물에서 hG6PC (c.648G>T) ＋ Int4 Ht KI 마우스의 간장에 있어서 mRNA 의 이상 스플라이싱의 정상화가 확인되었다.
(시험예 3) ApoB Knock down 시험을 이용한 GalNAc 유닛 콘주게이트에 의한 간장 세포로의 올리고뉴클레오티드 송달 성능 평가
(3-1) 인간 초대 간세포의 배양
이하와 같이 하여, 인간 초대 간세포의 배양을 실시하였다.
변법 랜포드 배지 (닛스이 제약) 에, FBS (Gibco) 를 10 ％ 가 되도록 첨가하여, 접착 배지를 조제하였다. 인간 동결 초대 간세포 (Gibco, Hu8105) 를 액체 질소 탱크로부터 꺼내어, 37 ℃ 에서 융해 후, 즉시 CHRM (Invitrogen) 에 따라 넣고, 젠틀하게 혼화한 후, 실온에서 원심 (100 g, 10 분) 하였다. 아스피레이터로 상청을 제거한 후, 37 ℃ 로 가온된 접착 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 조제하였다. 생 (生) 세포수를 자동 카운터 (BioRAD) 로 카운트한 후, 콜라겐 코트의 24 웰 플레이트에 세포를 파종하였다 (파종 생세포수 : 1.4 ∼ 2.1 × 105 세포/웰). CO2 인큐베이터에서 4 ∼ 5 시간 배양한 후, 현미경으로 세포가 접착되어 있는 것을 확인하고, 후술하는 화합물 첨가 실험을 실시하였다.
(3-2) 실시예 화합물의 첨가
이하와 같이 하여, 인간 초대 간세포에 실시예 화합물의 첨가를 실시하였다.
10 ％ FBS 함유의 변법 랜포드 배지에 GalNAc 유도체가 결합하고 있지 않은 참고예 45 의 화합물, 또는, GalNAc 유도체가 결합하고 있는 실시예 208 의 화합물을 첨가하여, 목적 농도 (이하에 기재하는, ApoB mRNA 발현 평가 (1) 에서는 100 nM, ApoB mRNA 발현 평가 (2) 에서는 10 nM 및 100 nM) 의 화합물 함유 배지를 조제하였다. 24 웰 플레이트에서 배양된 인간 초대 간세포의 각각의 웰의 배지를 흡인 제거한 후, 화합물 함유 배지를 0.5 mL 씩 첨가하여, 인큐베이션을 개시하였다. 72 시간 후, 후술하는 RNA 추출 실험을 실시하였다.
(3-3) qRT-PCR 에 의한 mRNA 의 평가
[1] RNA 추출 (in vitro)
이하와 같이 하여 RNA 의 추출을 실시하였다.
인큐베이션 후의 인간 초대 간세포의 각 웰의 화합물 함유 배지를 흡인 제거한 후, 빙랭시킨 PBS (0.5 mL) 로 세정하였다. RNeasy Mini QIAcube Kit (Qiagen) 의 RLT buffer 에 1/100 양의 2-Mercaptoethanol 첨가한 것을 세포 용해액으로 하고, 1 웰에 대해 400 μL 씩 세포 용해액을 첨가하고, 실온에서 5 분간 인큐베이션 후 회수하였다. 회수액 350 μL 로부터, QIAcube 를 사용하여 RNeasy Mini - Animal tissues and cells - DNase digest 의 프로토콜로 RNA 정제를 실시하였다. DNase 처리에는 RNase-Free DNase set (Qiagen) 를 사용하였다. 정제·용출된 RNA 는 후술하는 역전사 반응을 실시하였다.
[2] 역전사 반응
이하와 같이 하여 역전사 반응을 실시하였다.
추출 RNA 를 25 ∼ 100 ㎎/mL 로 조정 후, High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied biosystems) 를 사용하여, 1 sample 당 10 μL Buffer mix, 1 μL Enzyme mix, 9 μL 정제수, ＋ 추출 RNA 가 되도록 혼합하여 역전사 반응을 실시하였다 (37 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min, 4 ℃ Hold). 역전사 반응 산물 20 μL 에 대하여 정제수 80 μL 로 5 배 희석시켜 -30 ℃ 에서 보존, 혹은 이하의 qRT-PCR 평가에 제공하였다.
[3] qRT-PCR (Taqman assay)
이하의 ApoB primer probe set (x20), Actinb primer probe set (x20) 를 사용하였다.
ApoB primer probe set (x20) (Taqman) : ABI Hs00181142_m1 FAM
Actinb primer probe set (x20) (Taqman) : ABI Hs01060665_g1 FAM
또 1 웰 부근에 5 μL 2x Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), 2.5 μL 정제수, 0.5 μL 20x Primer probe mix (10 μM), 2 μL cDNA (5 배 희석 완료) 를 현탁하여 PCR 반응액을 조정 (1 tube 당) 하고, Quantstadio7 (Applied Biosystems 사) 로 PCR 반응을 실시하였다 (95 ℃ 20 sec, (95 ℃ 1 sec, 60 ℃ 20 sec) 40 cycles, 4 ℃ Hold). Actinb 를 내재성 컨트롤로 하고, ApoB mRNA 의 발현량을 상대 평가하였다.
(3-4) 인간 간 배양 세포를 사용한 실시예 화합물에 의한 ApoB mRNA 발현 억제 평가 (2)
인간 초대 간세포의 파종과 동시에 10 nM 및 100 nM 으로 조정한 실시예 24 에서 합성한 화합물을 첨가하고, 72 시간 배양 후의 세포의 ApoB mRNA 의 발현을 qRT-PCR (Taqman assay) 로 평가하였다. 화합물 무첨가의 4 웰의 ApoB mRNA 의 발현의 평균을 100 ％ 로 하였을 때, 도 3 에 나타낸 바와 같이, 10 nM 을 사용한 경우, ApoB-ASO 는 4.4 ％ 의 발현 억제를 나타내고, ApoB-ASO 콘주게이트는 30.3 ％ 의 발현 억제를 나타냈다. 100 nM 을 사용한 경우, ApoB-ASO 는 41.2 ％ 의 발현 억제를 나타내고, ApoB-ASO 콘주게이트는 68.6 ％ 의 발현 억제를 나타냈다. 이 것은, GalNAc 유도체가 결합하고 있는 화합물은, GalNAc 유도체가 결합하고 있지 않은 화합물보다 강하게 발현을 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 25) GalNAc 부위의 6 위치 수산기 상에 4,4'-디메톡시트리틸기를 갖는 GalNAc 유닛과 결합한 올리고뉴클레오티드의 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제
(1) 올리고머의 합성과 혼합액의 조제
실시예 16 에 기재한 화합물의 합성을 실시하였다. 단, 핵산 자동 합성 장치에 AKTA Oligopilot (GE Healthcare 제조) 를 사용하고, 고상 담체로서 Primer Support 5G Unylinker 350, 390 μmol (GE Healthcare 제조) 을 사용하고, 스케일에 적합한 합성 프로그램을 사용하였다. 합성 종료 후, 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, GalNAc 부위의 6 위치 수산기가 4,4'-디메톡시트리틸기 보호된 콘주게이트와 올리고뉴클레오티드 유연체의 혼합물이 얻어졌다. 얻어진 혼합물을 2 분할하고, 각각 25 mL 의 농암모니아수로 처리함으로써 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 절출함과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 분리하고, 필터가 형성된 튜브를 사용하여 여과함으로써, 목적으로 하는 콘주게이트를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 혼합액 (25 mL) (2 개) 을 얻었다.
정제 장치에 AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조) 을 사용하고, 충전제 SOURCE 15Q (96 mL) (GE 헬스케어 제조) 를 칼럼 FineLINE Pilot (35 ㎜ × 100 ㎜) (GE 헬스케어 제조) 에 충전하고, 이하의 방법으로, 상기 올리고뉴클레오티드 혼합물을 2 회로 나눠 정제하였다. UV 검출 파장을 (260 ㎚, 280 ㎚, 350 ㎚) 로 설정하고, 이하의 3 개의 공정을 1 개의 정제 프로그램으로서 사용하였다. 이들 공정 중, 칼럼 통과액의 검출은 길이 260 ㎚ 및 350 ㎚ 의 흡수를 검출한 크로마토그램을 도 5 에 나타낸다.
(i) DMTr-on 올리고뉴클레오티드의 칼럼으로의 흡착 공정
유속을 40 ml/min 으로 설정하고, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 1 CV 흘렸다. 유속을 10 ml/min 으로 변경하고, 올리고뉴클레오티드 혼합물 (25 mL) 을 칼럼 상부에 첨가하고, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 170 mL 분류 (分流) 하였다. 계속해서, 유속을 40 ml/min 으로 설정하고, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 1 CV 흘렸다. 계속해서, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) : 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) (35 : 65) 을 6 CV 흘림으로써, X20 이 결합하고 있지 않은 올리고뉴클레오티드나 불순물을 씻어 버렸다. 마지막으로, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 2 CV 흘렸다.
(ii) 칼럼 상에서의 탈 DMTr 화 공정
유속을 40 ml/min 으로 설정하고, 버퍼 A2 (0.4 ％ 트리플루오로아세트산 수용액) 를 1 CV 흘렸다. 계속해서, 유속을 20 ml/min 으로 변경하고, 6.25 CV 흘림으로써, 칼럼 충전제 상에 흡착된 X20 이 결합한 올리고뉴클레오티드의 탈 DMTr 화를 실시하였다.
(iii) 목적물의 용출 공정
유속을 40 ml/min 으로 설정하고, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 3 CV 흘려, 평형화하였다. 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) : 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) (75 : 25) 로부터 (25 : 75) 의 그래디언트 (15 CV) 후, 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) 을 2 CV 흘리고, 탈 DMTr 화된 올리고뉴클레오티드를 분획하였다 (분획량을 48 mL 로 하였다).
용출 중에 UV 검출 (260 ㎚) 된 프랙션에 대해, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조) 를 사용해서 확인하여, 프랙션 용액 (1 회째 : 432 ml, 2 회째 : 480 ml) 을 얻었다 (도 5).
칼럼을 한 번 사용한 후, 다음의 정제를 하기 전에, 30 ％ 이소프로필알코올 함유 2 M 염화나트륨 수용액을 사용하여 세정하였다.
(2) 농축, 투석, 동결 건조
프랙션 용액 (1 회째 : 432 ml, 2 회째 : 480 ml) 을 1 개로 합치고, 적당량의 아세트산을 첨가하여, pH 7.5 - 8.0 으로 조제하였다. 그 후, Xampler ultrafiltration cartridge3K, 140 ㎠ (GE 헬스케어) 를 장착한 KR2i TFF 시스템 (레플리젠) 을 사용하여 농축 후, 오오츠카 증류수로 투석한 후에 동결 건조시켰다. 표기 목적물의 동결 건조 분말 (합계 1.14 g) 을 얻었다.
(비교예 1) 올리고뉴클레오티드 부근에 DMTr 기를 도입한 콘주게이트의 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제
실시예 25 에 대한 비교를 위해, 이하에 나타내는 X13 으로 구성되는 GalNAc 콘주게이트를 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제하였다. X13 에 포함되는 GalNAc 상의 3 위치 수산기, 4 위치 수산기, 6 위치 수산기의 보호기를 아세틸기로 통일할 수 있다. 이로써, 합성 공정에서 보호기의 구별이 불필요하기 때문에, GalNAc 유닛 부분의 합성이 용이해진다. 또한, 고상 합성 공정에서는 올리고뉴클레오티드 5' 말단측과의 커플링 횟수를 조정함으로써, 간편하게 GalNAc 수를 증감시킬 수 있다. 그러나, 올리고머의 고상 합성 종료 후, 4,4'-디메톡시트리틸기를 1 개 밖에 남길 수 없다.
[비교예 1-1] X13 에 대응한 GalNAc 유닛 아미다이트 (화합물 Ref1F) 의 합성
(Ref1A) 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-하이드록시-프로폭시]에톡시]에틸]카르바메이트 (화합물 Ref1A) 의 합성
[화학식 91]
Figure pct00121
문헌으로 이미 알려진 화합물인 9H-플루오렌-9-일메틸 N-[2-(2-하이드록시 에톡시)에틸]카르바메이트 (Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 755-761) (3.11 g, 10 mmol) 와 벤질 (S)-(＋)-글리시딜에테르 (0.8 g, 5 mmol) 를 디클로로메탄 (30 mL) 에 용해시키고, 삼불화붕소-디에틸에테르 착물 (0.1 mL, 1 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산 : 아세트산에틸 ＝ 80 : 20 - 0 : 100, v/v) 로 정제하여, 유상의 목적물 Ref1A (0.74 g, 수율 30 ％) 를 얻었다.
Figure pct00122
(Ref1B) (2R)-1-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]-3-벤질옥시-프로판-2-올, 트리플루오로아세트산염 (화합물 Ref1B) 의 합성
[화학식 92]
Figure pct00123
공정 (Ref1A) 에서 합성한 화합물 Ref1A (13.8 g, 28.1 mmol) 를 에탄올/테트라하이드로푸란 (50 mL/50 mL) 에 용해시키고, 1 N 수산화나트륨 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 유기 용매를 감압 증류 제거하고, 1 N 염산 (100 mL) 을 첨가하였다. 생성된 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 통과액인 수층에 포함되는 부생성물을 아세트산에틸로 추출하고, 감압 증류 제거한 후에 얻어지는 잔류물에 아세토니트릴을 첨가하고, 여과하였다. 통과액을 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 한 역상 HPLC (GL 사이언스, Inertsil ODS-3) 로 분리 정제를 실시하고, 목적물이 포함되는 프랙션을 합치고, 용매를 감압 증류 제거하여, 유상의 목적물 Ref1B (7.1 g, 수율 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00124
(Ref1C) 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-3-벤질옥시-2-하이드록시-프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 Ref1C) 의 합성
[화학식 93]
Figure pct00125
문헌으로 이미 알려진 화합물인 2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미드-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로피란-2-일]옥시아세트산 (WO2012037254) (6 g, 14.8 mmol), 1-(-3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드염산염 (3.4 g, 17.8 mmol), 3H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-3-올 (2.0 g, 14.8 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (9.0 mL, 51.8 mmol), 공정 (Ref1B) 에서 합성한 화합물 Ref1B (6.7 g, 17.5 mmol) 를 디클로로메탄 (130 mL) 에 용해시키고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 유기층을 1 N 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하여 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (아세트산에틸 : 메탄올 ＝ 100 : 0 - 90 : 10, v/v) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 Ref1C (7.9 g, 수율 81 ％) 를 얻었다.
Figure pct00126
(Ref1D) 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸아세테이트 (화합물 Ref1D) 의 합성
[화학식 94]
Figure pct00127
공정 (Ref1C) 에서 합성한 화합물 Ref1C (7.9 g, 12 mmol) 를 에탄올 (80 mL) 에 용해시켰다. 20 ％ 수산화팔라듐/탄소 (wet) (2.0 g) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 50 ℃ 에서 8 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 종료 후, 여과하고, 얻어진 통과액을 감압 증류 제거하였다. 아모르퍼스상의 목적물 Ref1D (6.7 g, 수율 98 ％) 를 얻었다.
Figure pct00128
(Ref1E) 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-하이드록시-프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 Ref1E) 의 합성
[화학식 95]
Figure pct00129
공정 (Ref1D) 에서 합성한 화합물 Ref1D (6.8 g, 12 mmol) 에 적당량의 피리딘을 첨가하고, 감압하, 공비하였다. 피리딘 (40 mL) 에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (4.5 g, 13 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 적당량의 톨루엔을 첨가하여 공비한 후, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (아세트산에틸 : 아세트산에틸/메탄올 (5/1) ＝ 100 : 0 - 50 : 50, v/v, 1 ％ 트리에틸아민 함유) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 Ref1E (6.9 g, 수율 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00130
(Ref1F) 아세트산[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-아세트아미드-3,4-디아세톡시-6-[2-[2-[2-[(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-[2-시아노에톡시-(디이소프로필아미노)포스파닐]옥시-프로폭시]에톡시]에틸아미노]-2-옥소-에톡시]테트라하이드로피란-2-일]메틸 (화합물 Ref1F) 의 합성
[화학식 96]
Figure pct00131
공정 (Ref1E) 에서 합성한 화합물 Ref1E (6.9 g, 7.9 mmol) 를 적당량의 톨루엔으로 공비한 후, 디클로로메탄 (80 mL) 에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (5.5 mL, 32 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포아미다이트 (2.1 mL, 9.5 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용매를 감압 증류 제거하여, 미정제 생성물을 얻었다. 이것을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (아세트산에틸 : 아세트산에틸/메탄올 (5/1) ＝ 100 : 0 - 50 : 50, v/v, 1 ％ 트리에틸아민 함유) 로 정제하여, 아모르퍼스상의 목적물 Ref1F (6.6 g, 수율 78 ％) 를 얻었다.
Figure pct00132
[비교예 1-2] X13 이 도입된 콘주게이트의 합성
HO-X13-X13-X13-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
GalNAc 유닛 아미다이트로서 화합물 Ref1F 를 사용함으로써 X18 의 부분을 X13 과 치환시켜, 실시예 8 과 동일하게 합성을 실시하였다. 단, GalNAc 유닛 아미다이트의 부가 반응은 3 회 반복하여, X13 을 3 개 결합시켰다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6878.11).
[비교예 1-3] 5' 말단측에 4,4'-디메톡시트리틸기를 갖는 GalNAc 유닛과 결합한 올리고뉴클레오티드의 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제
(1) 올리고머의 합성과 혼합액의 조제
HO-X13-X13-X13-Am1s-Ae2s-Um1s-Cm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Te2s-Gm1s-Gm1s-Ce2s-Gm1s-Am1s-Ae2s-Gm1t-H (서열 번호 40)
핵산 자동 합성 장치에 AKTA Oligopilot (GE Healthcare 제조) 를 사용하고, 고상 담체로서 Primer Support 5G Unylinker 350, 390 μmol (GE Healthcare 제조) 을 사용하고, 스케일에 적합한 합성 프로그램을 사용하였다.
얻어진 고상 담체 중 10 μmol 을 사용하여, ABI 392 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems 제조) 로 GalNAc 유닛 X13 을 3 회 축합시켰다. 합성 종료 후, 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드 서열을 갖고, 5' 말단측에 4,4'-디메톡시트리틸기를 갖는 GalNAc 유닛과 결합한 올리고뉴클레오티드 유연체의 혼합물이 얻어졌다. 6 mL 의 농암모니아수로 처리함으로써 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 절출함과 함께, 인 원자 상의 보호기 시아노에틸기와 핵산 염기 상의 보호기를 분리하였다.
정제 방법 1 : Clarity QSP (Phenomenex 제조) 정제
실시예 8 과 동일하게 정제하니, 표기 목적물이 얻어졌다.
본 화합물의 염기 서열은, Homo sapiens glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), transcript variant 1, mRNA (NCBI-GenBank accession No. NM_000151.3) 의 뉴클레오티드 번호 728 의 G 에서 T 로 변이되어 있는, c.648G>T 변이 G6PC 유전자의 엑손 5 의 5' 말단으로부터 92 번째 내지 106 번째에 상보적인 서열이다. 화합물은 부이온 ESI 질량 분석에 의해 동정하였다 (실측값 : 6878.11).
정제 방법 2 : DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제
올리고뉴클레오티드 혼합물을 DMTr-on 이온 교환 칼럼 정제하기 전에, 10 mM 수산화나트륨 수용액으로 치환시켰다.
정제 장치에 AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조), 정제 칼럼에 RESOURCE Q 6 mL (GE 헬스케어 제조) 를 사용하여, 이하의 방법으로, 상기 올리고뉴클레오티드 혼합물을 정제하였다. UV 검출 파장을 (260 ㎚) 로 설정하고, 이하의 3 개의 공정을 1 개의 정제 프로그램으로서 사용하였다. 이들 공정 중의 칼럼 통과액의 검출 파장 260 ㎚ 의 크로마토그램을 도 6 에 나타낸다.
(i) DMTr-on 올리고뉴클레오티드의 이온 교환 칼럼으로의 흡착 공정
유속 3 ml/min 으로 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 2 CV 흘렸다. 유속 2 ml/min 으로 올리고뉴클레오티드 혼합물 (1.5 mL, 10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 칼럼 상부에 첨가하고, 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 2.5 CV 흘렸다. 계속해서, 유속 3 ml/min 으로 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 1 CV 흘린 후, 유속 2.4 ml/min 으로 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) : 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) (40 : 60 ∼ 25 : 75 를 2 CV, 25 : 75 를 4 CV) 을 흘렸다.
(ii) 이온 교환 칼럼 상에서의 탈 DMTr 화 공정
유속 1.2 ml/min 으로 버퍼 A2 (0.4 ％ 트리플루오로아세트산 수용액) 를 7 CV 흘렸다.
(iii) 목적물의 용출 공정
유속 3 ml/min 으로 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) 을 5 CV 흘려 평형화하였다. 계속해서, 유속 3 ml/min 으로 버퍼 A1 (10 mM 수산화나트륨 수용액) : 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) (30 : 70) 으로부터 (0 : 100) 의 그래디언트 (10 CV) 후, 버퍼 B1 (10 mM 수산화나트륨/2 M 염화나트륨 수용액) 을 2 CV 흘렸다.
도 6 의 결과, 탈보호 후의 용출 공정에서 260 ㎚ 의 흡수가 검출되지 않았던 점에서, DMT-on 콘주게이트는 최초의 흡착 공정에서 칼럼에 흡착되지 않고, 통과하고 있었던 것이 판명되었다. 그 때문에, 목적물을 이온 교환 칼럼 정제할 수는 없었다. 이 점에서, GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트를 DMTr-on 칼럼 정제하기 위해서는, 소수성 보호기가 GalNAc 상에 결합하고 있는 것, 및/또는, 1 개의 GalNAc 유닛에 포함되는 소수성 보호기의 수가 GalNAc 의 수와 동일하거나 그 이상인 것이 중요한 것으로 생각된다.
또한, 본 명세서에 있어서, At, Gt, 5meCt, Ct, Tt, Ut, Ap, Gp, 5meCp, Cp, Tp, Up, As, Gs, 5meCs, Cs, Ts, Us, Am1t, Gm1t, Cm1t, 5meCm1t, Um1t, Am1p, Gm1p, Cm1p, 5meCm1p, Um1p, Am1s, Gm1s, Cm1s, 5meCm1s, Um1s, A2t, G2t, C2t, T2t, Ae2p, Ge2p, Ce2p, Te2p, Ae2s, Ge2s, Ce2s, Te2s, A1t, G1t, C1t, T1t, Ae1p, Ge1p, Ce1p, Te1p, Ae1s, Ge1s, Ce1s, Te1s, Am2t, Gm2t, 5meCm2t, Tm2t, Am2p, Gm2p, 5meCm2p, Tm2p, Am2s, Gm2s, 5meCm2s, Tm2s, X, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X22 는, 하기에 나타내는 구조를 갖는 기이다.
[화학식 97]
Figure pct00133
[화학식 98]
Figure pct00134
[화학식 99]
Figure pct00135
[화학식 100]
Figure pct00136
[화학식 101]
Figure pct00137
[화학식 102]
Figure pct00138
[화학식 103]
Figure pct00139
[화학식 104]
Figure pct00140
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명은, 당원병 Ia 형의 치료에 이용할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1 ∼ 48, 93 ∼ 96 : 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는, 천연형 DNA, 천연형 RNA, DNA/RNA 의 키메라, 이것들의 수식체 중 어느 것이어도 되는데, 적어도 1 개가 수식 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
서열 번호 49 ∼ 65, 67 ∼ 92 : 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열 번호 66 : 펩티드의 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Conjugate of GalNAc-Oligonucleotide For Delivery To Liver and Manufacturing Method Thereof <130> DSPCT-FP2020 <150> JP2019-164564 <151> 2019-09-10 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 1 agataaaauc cgauggcgaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 2 taaaauccga uggcgaagcu g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonuleotide <400> 3 aauccgaugg cgaagcugaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 4 ccgauggcga agcugaaaag g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 5 auggcgaagc ugaaaaggaa g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 6 gcgaagcuga aaaggaagaa g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 aagcugaaaa ggaagaaggu a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 8 cugaaaagga agaagguaau g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 9 aaaaggaaga agguaaugag a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 10 aggaagaagg uaaugagaaa a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 11 aagaagguaa ugagaaaata t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 12 gauaaaaucc gatggcgaag c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 13 auaaaatccg auggcgaagc t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 14 aaaauccgat ggcgaagctg a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 15 aaatccgaug gcgaagcuga a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 16 auccgatggc gaagctgaaa a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 17 tccgauggcg aagcugaaaa g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 18 cgatggcgaa gctgaaaagg a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 19 gauggcgaag cugaaaagga a 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 20 uaaaauccga tggcgaag 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 21 aaaatccgau ggcgaagc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 22 aaauccgaug gcgaagcu 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 23 aauccgatgg cgaagctg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 24 atccgauggc gaagcuga 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 25 uccgauggcg aagcugaa 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 26 ccgatggcga agctgaaa 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 27 cgauggcgaa gcugaaaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 28 gauggcgaag cugaaaag 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 29 atggcgaagc tgaaaagg 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 30 uggcgaagcu gaaaagga 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 31 ggcgaagcug aaaaggaa 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 32 gcgaagctga aaaggaag 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 33 agataaaauc cgauggcgaa g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 34 gcagauaaaa uccgatggcg a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 35 cagauaaaat ccgauggcga a 21 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 36 cagataaaau ccgauggc 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 37 agauaaaauc cgatggcg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 38 gauaaaatcc gauggcga 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 39 ataaaauccg auggcgaa 18 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 40 aauccgatgg cgaag 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 41 ccgatggcga agctg 15 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 42 aaauccgatg gcgaag 16 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 43 tcaaauccga tggcgaag 18 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 44 atccgauggc gaagc 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 45 uccgauggcg aagcu 15 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 46 aaaauccgat ggcgaag 17 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 47 aauccgatgg cgaagc 16 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 48 auccgatggc gaagcu 16 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 atagcagagc aatcaccacc aagcc 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 attccacgac ggcagaatgg atggc 25 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 taccgagctc ggatccacca ccaagcctgg aataactgc 39 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ctggactagt ggatcctggc atggttgttg actttaaac 39 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tctgggctgt gcagctgaat gtctg 25 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gtaggggatg acactgacgg atgcc 25 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ctggagtcct gtcaggtatg ggc 23 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 agctgaaaag gaagaaggta atgag 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 tcttcctttt cagcttcgcc atcgg 25 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ctgacaggac tccagcaaca ac 22 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ttgtggttgg gattctgggc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 atgctgtgga tgtggctgaa 20 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 tggcacccag cacaatgaa 19 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ctaagtcata gtccgcctag aagca 25 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gctgctcatt ttcctcatca agtt 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 tggatgtggc tgaaagtttc tgta 24 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tcctgtcagg cattgc 16 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 66 Trp Cys Glu Gln Pro Glu Trp Val His Ile Asp Thr Thr Pro Phe Ala 1 5 10 15 Ser Leu Leu Lys 20 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gggaaacatg catgaagccc tgggc 25 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 tcccttggta cctcaggaag ctgcc 25 <210> 69 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 cgggcccccc ctcgaaaact aggcctgaag agatggc 37 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 taccgtcgac ctcgagggtt ggccttgatc cctctgcta 39 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggttgagttg atcttctaca tcttg 25 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 gcaagagagc cttcaggtag atccc 25 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 agttctagag cggccgccca tgcaaaggac taggaacaac 40 <210> 74 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 accgcggtgg cggccaatgt tgcctgtctt cctcaatc 38 <210> 75 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ggccaaccct ggaataactg caagggctct g 31 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ttgcatggtt gttgacttta aacaccgaag a 31 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tcaacaacca tgcaaaggac taggaacaac 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 attccagggt tggccttgat ccctctgcta 30 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 gggatcaagg ccaaccggct gg 22 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 taaagtcaac cgccatgcaa agg 23 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 tacgtcctct tccccatctg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ctgacaggac tccagcaaca 20 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ttccttccaa agcagggact ctctatgt 28 <210> 84 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 cttgcagaag gacaagacgt agaagacc 28 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gagtctatat tgagggcagg ctggagtc 28 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 tagtctgcct gctcactcaa cctctcct 28 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gagtctatat tgagggcagg ctggagtc 28 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 taaatttgac caatgagcac tggaggtc 28 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 aaaatcatgt gtatgcgtgc ctttccta 28 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 ttgtggttgg gattctgggc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 tccagagtcc acaggaggtc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 gctgtgcagc tgaatgtctg 20 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 93 aatccgatgg cgaag 15 <210> 94 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 94 atccgatggc gaagc 15 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 95 auccgauggc gaagc 15 <210> 96 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense-oligonucleotide sequence for ApoB mRNA <400> 96 agcattggta ttca 14

Claims (24)

  1. 간 실질 세포에 있어서 약리 효과가 기대되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 2 분기 GalNAc 유닛의 콘주게이트로서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 또는 3' 말단에 하기 식의 2 분기 GalNAc 유닛이 결합하고, 생체 내에서 간 실질 세포에 특이적으로 송달되는 것을 특징으로 하는 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00141

    [식 중, W 는, 식
    Figure pct00142

    을 나타내고, G 는 5-아세트아미드-2-하이드록시메틸-3,4-디하이드록시테트라하이드로피란-6-일기 (GalNAc) 를 나타내고, Z 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고, L1 및 L2 는, 일방이 메틸렌기 (CH2) 를 나타내고, 타방이 원자를 사이에 두지 않는 것을 나타내고, o, q, r, 및 s 는 서로 독립적으로 0 또는 1 을 나타내고, n 은 1 ∼ 15 의 정수를 나타내고, m 은 0 ∼ 5 의 정수를 나타내고, v 는 1 ∼ 7 을 나타낸다. 단, n 이 1 일 때 m 은 0 ∼ 5 의 정수이고, n 이 2 ∼ 15 의 정수일 때 m 은 0 이다.] 으로 나타내는 기이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    2 분기 GalNAc 유닛의 식 중 o 및 q 가 0 인, 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    2 분기 GalNAc 유닛이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합하고 있는, 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
  4. 제 1 항에 있어서,
    2 분기 GalNAc 유닛이, 이하의 어느 식
    Figure pct00143

    Figure pct00144

    Figure pct00145

    Figure pct00146

    Figure pct00147

    으로 나타내는 기인, 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 콘주게이트 또는 그 제약상 허용되는 염을 포함하는, 의약.
  6. 이하의 공정을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 GalNAc 유닛의 콘주게이트의 제조 방법,
    a : 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 하기 식으로 나타내는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조,
    Figure pct00148

    [식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 수소 원자 또는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기 사슬수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다.] 가 결합한 콘주게이트를 합성하는 공정,
    b : 공정 a 의 산물을 포함하는 용액을 소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼에 통액시키고, 당해 칼럼에 수성 세정액을 통액시키는 공정, 및
    c : 공정 b 후의 칼럼으로부터 올리고뉴클레오티드를 용출시키는 공정.
  7. 제 6 항에 있어서,
    소수성 보호기가, 염기성 조건 또는 산성 조건에서 제거되는 보호기인, 제조 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5' 위치 수산기에 결합하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조에 있어서, Ra 가 소수성 보호기이고, Rb 및 Rc 가 수소 원자이고, t 가 1 ∼ 3 의 정수인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지가, 스티렌-디비닐벤젠계 흡착 수지, 스티렌-디비닐벤젠계 수식형 흡착 수지, 메타크릴계 흡착 수지 및 페놀계 흡착 수지에서 선택되는 어느 것인, 제조 방법.
  11. 제 6 항에 있어서,
    소수성 상호 작용에 의한 흡착성을 갖는 수지를 충전한 칼럼이, 이온 교환 칼럼 또는 역상 칼럼인 제조 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    공정 a 가 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법,
    a1 : 3' 말단으로부터 5' 말단 방향으로 올리고뉴클레오티드를 신장시킬 수 있는 지지체를 사용해서, 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기의 탈보호, 뉴클레오시드의 축합을 반복하여 올리고뉴클레오티드 사슬을 신장시켜, 지지체 상에서 원하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 공정 ; 여기서, 사용하는 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기 이외의 보호기는, 올리고뉴클레오티드 3' 말단과 지지체의 결합의 절단 조건 (이하,「유리 조건」) 에서 탈보호되는 보호기가 선택되고, 동 뉴클레오시드의 5'-수산기의 보호기로는 유리 조건에서는 탈보호되지 않는 보호기가 선택된다,
    a2 : 지지체 상에 합성된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기에 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛을 도입하는 공정 : 여기서, 소수성 보호기는 유리 조건에서는 탈보호되지 않는 것이 선택된다, 및
    a3 : 공정 a2 에서 얻어진 지지체를 유리 조건의 용액으로 처리하여, 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛과 올리고뉴클레오티드의 콘주게이트의 용액을 얻는 공정.
  13. 제 6 항에 있어서,
    공정 b 의 후, 칼럼에 흡착된 콘주게이트에 대하여 소수성 보호기의 탈보호를 실시하고, 그 후에 공정 c 를 실시하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  14. 제 6 항에 있어서,
    유리 조건이 염기성이고, 소수성 보호기가 산성에서 제거되는 보호기인, 제조 방법.
  15. 제 6 항에 있어서,
    소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
    Figure pct00149

    (식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.)
    Figure pct00150

    Figure pct00151

    Figure pct00152

    Figure pct00153

    Figure pct00154

    Figure pct00155

    Figure pct00156

    Figure pct00157

    Figure pct00158

    Figure pct00159

    중 어느 1 개로 나타내는 제조 방법.
  16. 이하의 식
    Figure pct00160

    [식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기 사슬수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 나타낸다.] 으로 나타내는 화합물 또는 그 염.
  17. 제 16 항에 있어서,
    Ra 가 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기이고, Rb 및 Rc 가 아세틸기이고, Y 가 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기이고, t 가 1 ∼ 3 의 정수인 화합물 또는 그 염.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    이하의 식
    Figure pct00161

    [식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기이고, Y 는 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 나타낸다. 이하 동 항에 있어서 동일.]
    Figure pct00162

    Figure pct00163

    Figure pct00164

    Figure pct00165

    중 어느 1 개로 나타내는 화합물 또는 그 염.
  19. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    이하의 식
    Figure pct00166

    [식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 포스포아미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
    Figure pct00167

    Figure pct00168

    Figure pct00169

    Figure pct00170

    Figure pct00171

    중 어느 1 개로 나타내는 화합물 또는 그 염.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 보호기가, 치환되어 있어도 되는 트리틸기이고, 포스포아미다이트기가 -P(OCH2CH2CN)N(CH(CH3)2)2, 또는, -P(OCH3)N(CH(CH3)2)2 인, 화합물 또는 그 염.
  21. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 하기 식으로 나타내는 소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조,
    Figure pct00172

    [식 중, Ra, Rb 및 Rc 중 적어도 1 개는 소수성 보호기, 그 이외는 수소 원자 또는 유리 조건에서 제거되는 보호기이다. X1 및 X2 는, 각각 독립적으로 링커 구조를 나타내고, X1 과 X2 의 사이에서 분기되어 있어도 된다. t 는 링커 구조 중의 분기 사슬수이며, 1 ∼ 10 의 정수이다. Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다.] 가 결합한 콘주게이트 또는 그 염.
  22. 제 21 항에 있어서,
    소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
    Figure pct00173

    [식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
    Figure pct00174

    Figure pct00175

    Figure pct00176

    Figure pct00177

    중 어느 1 개로 나타내는 콘주게이트 또는 그 염.
  23. 제 21 항에 있어서,
    소수성 보호기 부가형 GalNAc 유닛-인산기를 포함하는 구조가, 이하의 식,
    Figure pct00178

    [식 중, R1 은 산성 조건에서 제거되는 소수성 보호기를 나타내고, X 는 링커 구조를 나타내고, Y 는 인산기 또는 티오인산기를 개재하여 올리고뉴클레오티드와 결합하는 결합손을 나타낸다. 이하, 동 항에 있어서 동일.]
    Figure pct00179

    Figure pct00180

    Figure pct00181

    Figure pct00182

    Figure pct00183

    중 어느 1 개로 나타내는 콘주게이트 또는 그 염.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 보호기가 치환되어 있어도 되는 트리틸기이고, Y 가 인산디에스테르 결합 또는 인산티오에이트 결합을 개재하여 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 뉴클레오시드의 5'-수산기와 결합하는 결합손을 나타내는, 콘주게이트 또는 그 염.
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