TW202214301A - 一種碳水化合物分子簇及其製備方法和醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供了一種碳水化合物分子簇及其製備方法和醫藥用途。具體而言，本揭露提供一種靶向配體，結構如式(I)所示，其中，T、B、L1、L2、x分別如說明書中所定義。本揭露提供的靶向配體藉由與表達抑制性寡聚化合物結合達到了優異的表達抑制效果。
Description
本申請要求申請日為2020年06月16日的中國專利申請CN202010546412.0的優先權，本申請引用該中國專利申請的原文。
本揭露涉及一種碳水化合物分子簇及其製備方法和醫藥用途。本揭露還涉及這些碳水化合物分子簇與表達抑制性寡聚合物藉由共價鍵連接形成的綴合物，使得到的綴合物可以被靶向遞送到肝細胞內，發揮RNA干擾的作用。
RNA干擾是一種有效的沉默基因表達的方式。據統計，在人體內的疾病相關蛋白中，大約超過80%的蛋白質不能被目前一般的小分子藥物以及生物大分子製劑所靶向，屬於不可成藥蛋白。利用RNA干擾技術，可以根據編碼這些蛋白的mRNA，設計合適的siRNA，特異性靶向目標mRNA並降解目標mRNA，從而達到抑制相關的蛋白生成。因此siRNA具有非常重要的藥物開發前景。
然而要實現體內的治療目的RNA干擾效應，需要向體內特定的細
胞遞送siRNA分子。採用脂質體包裹siRNA，可以攜帶siRNA到達肝臟等組織，與細胞膜融合並進入細胞，達到遞送siRNA的目的，例如採用脂質體包裹遞送siRNA的藥物Onpattro已經上市。然而脂質體遞送系統也有諸多不足，容易引發炎症反應，在給藥前需要使用激素類藥物，並且脂質體可能產生的蓄積毒性導致潛在的安全隱患。
利用細胞表面受體的配體分子來遞送藥物是一種很好的選擇，近來，某些碳水化合物綴合物已顯示對於將siRNA遞送至肝臟細胞是一種代替脂質體的有價值的藥物遞送方式(JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY卷：136期：49頁：16958-16961)。去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是肝細胞特異性表達的受體，在肝細胞表面具有高豐度、胞內外轉換快速的特點。半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺等單糖和多糖分子對ASGPR有高親和性。將這些單糖或者多糖分子採用合適的分子結構連接，形成三簇或四簇分子，可以進一步提高其對ASGPR的親和力，進一步的，將分子簇與siRNA藉由共價偶聯，就可以攜帶siRNA到達肝臟細胞，並進入到肝臟細胞內部，實現高效的RNA干擾效應。
本揭露提供的靶向配體包括一個或者多個靶向部分，具體的，其結構如下式I所示：
其中T為靶向部分，B為分支基團，L1為接頭部分，L2為靶向部分
與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
可選的實施方式中，其中x選自2到8的整數。
可選的實施方式中，其中x選自3到5的整數。
可選的實施方式中，所述L1為
，
其中，
R1和R2各自獨立地選自-S-、-NH-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-CH2O-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12員雜環基，所述-CH2-任選被選自鹵素、烷基、烷氧基、烷胺基中的一個或多個基團所取代，所述烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素中的一個或多個基團所取代；
R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；
n選自0、1、2、3、4；
m選自0到20的整數(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。
可選的實施方案中，L1為
其中，
R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、羧基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；
n選自0、1、2、3、4。
可選的實施方案中，L1為
或
。
可選的實施方案中，L1為
或
。
可選的實施方案中，所述L1為
。
可選的實施方式中，所述B為
其中，R4、R5、R6和R7各自獨立地選自-C(O)NH-和-C(O)-，所述的-C(O)NH-，-C(O)-任選進一步被烷基取代，所述的烷基任選進一步被選自烷基、羥基、-C(O)O-、-C(O)O-烷基-、-C(O)NH-中的一個或多個基團所取代；
X2、X3、X4和X5各自獨立地選自0到10的整數(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
可選的實施方式中，所述B為
其中，R4、R5、R6和R7各自獨立地選自-C(O)NH-、-C(O)-、
X2、X3、X4和X5各自獨立地選自0到10的整數(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。
可選的實施方式中，所述B為
可選的實施方案中，所述B選自：
可選的實施方案中，所述B為
可選的實施方案中，所述B為：
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中，B為
，L1選自以下結構：
其中，
R1和R2各自獨立地選自-S-、-NH-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-CH2O-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12員雜環基，所述-CH2-任選被選自鹵素、烷基、烷氧基、烷胺基中的一個或多個基團所取代，所述烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素中的一個或多個基團所取代；
R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、
羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；
n選自0、1、2、3、4；
m選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中B為
、
或
，L1選自以下結構：
、
或
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中B為
，L1為
，即，B-L1為
。
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中B為
，L1為
或
，即B-L1為
或
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中B為
或
，L1為
，即B-L1為
或
。
可選的實施方式中，本揭露提供的靶向配體中B為
或
，L1為
或
，即B-L1為
本揭露中L2為靶向部分與分支基團間的栓系部分，L2在分支基團和各靶向部分之間發揮連接、間隔作用。
在一些實施方式中，L2的一端直接連接至靶向配體，而另一端直接連接至分支基團B。
在一些實施方式中，L2的一端直接連接至靶向配體，而另一端間接地連接至分支基團B。
在一些實施方式中，L2的一端間接地連接至靶向配體，而另一端間接地連接至分支基團B。
在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括2個L2和2個靶向部分。
在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括3個L2和3個靶向部分。
在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括4個L2和4個靶向部分。
在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括多個L2和多個靶向部分。
可選的實施方案中，本揭露中L2選自以下基團中的1個或2-20個
(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
或20)共價連接的組合：
、
、
、
、
、
、
、
可選的實施方案中，本揭露中L2選自以下基團中的1個或2-20個(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19
或20)共價連接的組合：
、
、
、
、
、
、
。
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
其中x6是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構
的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括具有如下所示結構的L2，
其中，x7是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z是
、
、
。
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有如下所示結構的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有如下所示結構的L2，
其中，x8是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z是
、
、
。
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有如下所示結構的L2，
其中x9和X10各自獨立地選自從1至20的整數(例如，1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z是
、
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有如下所示結構的L2，
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有如下所示結構的L2，
其中，x11和x12各自獨立地選自從1至20的整數(例如，1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z
是
、
、
。
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有以下結構：
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有以下結構：
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有以下結構：
可選的實施方式中，本文公開的靶向配體具有以下結構：
本揭露中所述的靶向配體的靶向部分是由一個或多個靶向基團或靶向部分組成，靶向配體協助引導將與其連接的治療性試劑遞送至所需靶位置。在一些情況中，靶向部分可以結合細胞或細胞受體，並且啟動內吞作用以促進治療性試劑進入細胞。靶向部分可以包括對細胞受體或細胞表面分子或抗體具有親和性的化合物。含有靶向部分的各種靶向配體可以與治療性試劑和其它化合物連接以將試劑靶向至細胞和特定細胞受體。
可選的實施方式中，靶向部分的類型包括碳水化合物、膽固醇和膽甾醇基團或類固醇。可以結合細胞受體的靶向部分包括糖類，如半乳糖、半乳糖衍生物(如N-乙醯基-半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基-半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物；其它碳水化合物、聚糖、半抗原、維生素、葉酸、生物素、適體、和肽(如含RGD的肽、胰島素、EGF和轉鐵蛋白)。
已知結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的靶向部分可特別用於引導遞送寡聚化合物至肝臟。脫唾液酸糖蛋白受體在肝臟細胞(肝細胞)上大量表達。靶向ASCPR的細胞受體靶向部分包括半乳糖和半乳糖衍生物。具體而言，半乳糖衍生物的簇，包括由2、3、4或超過4個N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)組成的簇，可以促進肝細胞中某些化合物的攝取。偶聯寡聚化合物的GalNAc簇
用於引導組成物至肝臟，在這裡N-乙醯基-半乳糖胺糖能夠結合肝臟細胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體。脫唾液酸糖蛋白受體的結合被認為將啟動受體介導的內吞作用，從而促進化合物進入細胞內部。
本文所公開的靶向配體可以包括2、3、4或超過4個靶向部分。在一些實施方式中，本文所公開的靶向配體可以包括1、2、3、4或超過4個藉由L2連接至
分支基團的靶向部分。
在一些實施方式中，靶向配體是半乳糖簇的形式。
在一些實施方式中，各靶向部分包括半乳糖胺衍生物，其為N-乙醯基-半乳糖胺。可用作靶向部分且對脫唾液酸糖蛋白受體具有親和性的其他糖可選自半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺和N-異丁醯基-半乳糖胺等。
在一些實施方式中，本揭露中的靶向配體包括如下所示的N-乙醯基-半乳糖胺作為靶向部分，
在一些實施方式中，靶向配體包括三個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括三個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。
在一些實施方式中，靶向配體包括四個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對脫唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括四個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。
當述及三個末端N-乙醯基-半乳糖胺時本領域常用的術語包括三觸角(tri-antennary)、三價物(tri-valent)和三聚體。
當述及四個末端N-乙醯基-半乳糖胺時本領域常用的術語包括四觸角(tetra-antennary)、四價物(tetra-valent)和四聚體。
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體具有如下結構，
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體具有如下結構，
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體具有如下結構，
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體具有如下結構，
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體可連接至治療性試劑。所述的治療性試劑可為寡聚化合物，特別是表達抑制性寡聚化合物。
可選的實施方案中，本揭露提供的靶向配體可連接至RNAi試劑。所述的RNAi試劑可為雙鏈的或為siRNA。
在一些實施方式中，治療性試劑連接至靶向配體，形成具有如下所示的綴合物，
其中T為靶向部分，B為分支基團，L1為接頭部分，L2為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數，Y為治療性試劑。
可選的實施方式中，x、T、L2、B、L1如前任一實施方式中所定義。
可選的實施方式中，可以使用靶向配體靶向的一類治療性試劑是寡聚化合物，即Y為寡聚化合物。
可選的實施方式中，Y為寡聚化合物，特別是表達抑制性寡聚化合物。
本揭露中所述“寡聚化合物”是含有10-50個核苷酸或核苷酸鹼基對的核苷酸序列。
在一些實施方式中，寡聚化合物具有這樣的核鹼基序列，其與細胞內表達的靶核酸或靶基因中的編碼序列至少部分互補。
在一些實施方式中，在將寡聚化合物遞送至表達基因的細胞後，寡聚化合物能夠抑制潛在基因的表達，並且在本文中被稱為“表達抑制性寡聚化合物”，可以體外或體內抑制基因表達。“寡聚化合物”包括但不限於：寡核苷酸、單鏈寡核苷酸、單鏈反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、核糖酶、干擾RNA分子、和Dicer酶底物。
在一些實施方式中，Y為RNAi試劑，本揭露中所述“RNAi試劑”指含有能夠以序列特異性方式降解或抑制靶信使RNA(mRNA)轉錄並翻譯的RNA或RNA樣(例如，化學修飾的RNA)寡核苷酸分子的試劑。本揭露中RNAi試劑可以藉由RNA干擾機制(即，藉由與哺乳動物細胞的RNA干擾通路構成機制(RNA誘導的沉默複合物或RISC)相互作用誘導RNA干擾)操縱，或藉由任何其它機制或途徑起作用。RNAi試劑包括但不限於：單鏈寡核苷酸、單鏈反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)和Dicer底物。
本文所述的RNAi試劑包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有與靶向的mRNA至少部分互補的鏈。
在一些實施方式中，本文所述RNAi試劑是雙鏈的，並且包括反義鏈以及與反義鏈至少部分互補的正義鏈。
在一些實施方式中，本文所述的RNAi試劑是單鏈的。
可選的實施方案中，本揭露提供一種包含靶向配體和表達抑制性寡聚合物的綴合物，其結構如下所示，
其中Y為表達抑制性寡聚合物。
可選的實施方式中，本揭露提供一種包含靶向配體和表達抑制性寡聚合物的綴合物，
其中Y為表達抑制性寡聚合物。
可選的實施方式中，本揭露提供一種包含靶向配體和表達抑制性
寡聚合物的綴合物，
其中Y為表達抑制性寡聚合物。
可選的實施方式中，本揭露提供一種包含靶向配體和表達抑制性寡聚合物的綴合物，
其中Y為表達抑制性寡聚合物。
可選的實施方案中，所述L1與Y藉由磷酸酯基團、硫基磷酸酯基團或膦酸基團連接。
本揭露提供一種式(III)所示的化合物，由上述靶向配體與W連接形成，所述W為羥基保護基團，較佳為脂基保護基、烷氧基甲基保護基、烷基保護基、矽烷基保護基、芳基保護劑，最佳為芳基保護基，特別佳為三苯甲基、對甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，
其中x、T、L2、B、L1如式(I)所定義。
本揭露中所述脂基保護基包括但不限於乙醯基、二氯乙醯基、苯甲醯基、第三丁基甲醯基、第三丁氧基甲醯基、苄氧基甲醯基、9-芴甲氧基甲醯基。本揭露中所述烷氧基甲基保護基包括但不限於甲氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、苄氧基甲基、對甲氧基苄氧基、四氫吡喃基。本揭露中所述烷基保護基包括但不限於甲基。本揭露中所述芳基保護基包括但不限於苄基、對甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、三苯甲基、對甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。本揭露中所述矽烷基保護基包括但不限於三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基。
可選的實施方式中，T選自N-乙醯基-D-半乳糖胺三乙酸酯。
本揭露提供一種式(IV)所示化合物，
其中T為N-乙醯基-D-半乳糖胺三乙酸酯，B為分支基團，L2為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數，
其中L1-W結構如下所示，
R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、
羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；
W為羥基保護基團，較佳為脂基保護基、烷氧基甲基保護基、烷基保護基、矽烷基保護基、芳基保護基，最佳為芳基保護基，特別佳為三苯甲基、對甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基；
B和L2如上所定義。
可選的實施方案中，L1-W結構如下所示：
可選的實施方案中L1-W結構如下所示：
可選的實施方案中，L1-W結構如下所示：
可選的實施方式中，B選自：
可選的實施方式中，式(IV)所示化合物，其為：
本揭露另一方面提供一種綴合物，其由式(IV)所示化合物與高分子載體綴合而成，所述高分子載體為帶胺基的玻璃珠或帶胺基的高分子聚合物。
本揭露另一方面提供一種組成物，其包含如上所述的綴合物，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑，例如載劑、運載體、稀釋劑、和/或遞送聚合物。所述的綴合物可為治療有效量。
本揭露另一方面提供一種上述綴合物或上述的組成物在製備治療患者疾病的藥物中的用途，所述疾病較佳為肝源性疾病。所述的綴合物或組成物可為治療有效量。
本揭露另一方面提供一種治療患者疾病的方法，其包括向患者給予上述綴合物或上述的組成物。所述的綴合物或組成物可為治療有效量。
本揭露另一方面提供一種抑制患者體內mRNA表達的方法，其包括向患者給予上述綴合物或上述的組成物。所述的綴合物或組成物可為治療有效量。
本揭露另一方面提供一種體內遞送表達抑制性寡聚化合物至肝臟的方法，其包括向患者給予上述綴合物或上述的組成物。所述的綴合物或組成物可為治療有效量。
本文所公開的綴合物、組成物和方法可以在給藥物件的細胞、細胞群或組織中降低靶mRNA的量級，包括：向物件給予治療有效量的本文所述的表達抑制性寡聚合物，所述表達抑制性寡聚合物與靶向配體連接，從而抑制靶mRNA在物件中的表達。
在一些實施方式中，所述物件已在先前被鑑定為在靶向的細胞或組織中具有靶基因的病原性上調。
本揭露中所述的患者是指患有將會受益於靶mRNA表達之減少或抑制的疾病或病症的對象。
遞送可以是藉由局部給藥(例如，直接注射或植入)或全身給藥，也可藉由口服、直腸或胃腸外途徑進行給藥，所述腸胃外途徑包括但不限於皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮給藥、吸入給藥(如氣溶膠)、黏膜給藥(如舌下、鼻內給藥)、顱內給藥等。
可選的實施方案中，本揭露提供的組成物可以藉由注射施用，例如，靜脈內、肌肉內、皮內、皮下、十二指腸內或腹膜內注射。
可選的實施方案中，當靶向配體與表達抑制性聚化合物連接成綴合物後，所述綴合物可被包裝在試劑盒中。
本揭露提供一種由上述的式(IV)所示化合物與高分子載體綴合而成的綴合物的製備方法，其包括將上述的式(IV)所示化合物在縮合劑存在下與高分子載體反應得到所述綴合物的步驟，所述高分子載體為帶胺基的玻璃珠或帶胺基的高分子聚合物。
本揭露提供的由式(IV)所示化合物與高分子載體綴合而成的綴合物的製備方法進一步包括將上述的式(III)所示化合物與丁二酸酐反應得到式
(IV)所示化合物的步驟。
本揭露提供一種連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物1-t的合成方法，
其包括以下製備化合物1-t、1-s、1-r、1-l、1-q、1-p、1-n、1-k、1-j、1-i、1-g、1-h步驟的一步或者多步，
其中化合物1-t藉由以下方案1製備：
方案1
化合物1-l與化合物1-q在鹼性試劑與多肽縮合劑的存在下反應得
到化合物1-r；
化合物1-r與丁二酸酐在鹼性試劑存在下反應得到化合物1-s；
化合物1-s在鹼性試劑和縮合劑的存在下與表面胺基修飾的固相載體反應得到化合物1-t；
其中，化合物1-q藉由以下方案2製備：
方案2
化合物1-m與DMTrCl反應得到化合物1-n；
化合物1-n在鹼性試劑與縮合劑存在下與化合物1-o反應得到化合物1-p；
化合物1-p脫保護基得到化合物1-q；
其中，化合物1-l藉由以下方案3製備：
方案3
化合物1-h與化合物1-g在鹼性試劑和縮合劑的存在下反應得到化合物1-i；
化合物1-i脫保護基得到化合物1-j；
化合物1-j與化合物1-d在鹼性試劑和縮合劑存在下反應得到化合物1-k；
化合物1-k在氫氣氛下，Pd/C和TFA存在下反應得到化合物1-l；
其中化合物1-h藉由以下方案4製備：
方案4
化合物1-f脫保護基得到化合物1-h；
其中化合物1-g藉由以下方案5製備：
方案5
化合物1-a與化合物1-b在三氟甲烷磺酸鈧存在下反應得到化合物1-c；
化合物1-c在氫氣氛圍下，在Pd/C和TFA存在下反應得到化合物1-d；
化合物1-d與化合物1-e在鹼性試劑和縮合劑存在下反應得到化合物1-f；
化合物1-f在氫氣氛下，在Pd/C和TFA存在下反應得到化合物1-g。
本揭露還提供一種連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物2-e的合成方法，
其包括以下製備化合物2-e、2-d、2-c、2-b、1-l、1-k、1-j、1-i、1-
g、1-h步驟的一步或者多步，
其中化合物2-e藉由以下方案6製備：
方案6
化合物1-l與化合物2-b在鹼性試劑和縮合劑的存在下反應得到化合物2-c；
化合物2-c與丁二酸酐在鹼性試劑存在下反應得到化合物2-d；
化合物2-d在鹼性試劑和縮合劑的存在下與表面胺基修飾的固相載體反應得到化合物2-e；
其中化合物2-b藉由以下方案7製備：
方案7
化合物2-a在氫氧化鋰存在下反應得到化合物2-b；
其中，化合物1-l藉由如上方案3製備。
本揭露還提供一種連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物3-n的合成方法，
其包括以下製備化合物3-n、3-m、3-k、3-l、3-h、3-i、3-g、3-d、2-b步驟的一步或者多步，
其中化合物3-n藉由以下方案8製備：
方案8
化合物3-k與化合物2-b在鹼性試劑和縮合劑的存在下反應得到化合物3-l；
化合物3-l與丁二酸酐在鹼性試劑存在下反應得到化合物3-m；
化合物3-m在鹼性試劑和縮合劑的存在下與表面胺基修飾的固相載體反應得到化合物3-n；
其中化合物3-k藉由以下方案9製備：
方案9
化合物3-d與化合物3-g在鹼性試劑存在下反應得到化合物3-h；
化合物3-h脫保護基得到化合物3-i；
化合物3-i與化合物3-j在鹼性試劑和縮合劑的存在下反應得到化合物3-k；
其中化合物3-d藉由以下方案10製備：
方案10
化合物3-a與化合物3-b在三氟甲磺酸(CF3SO3H)存在下反應得到化合物3-c；
化合物3-c在氫氣氛下，在Pd/C和TFA存在下反應得到化合物3-d；
其中化合物3-g藉由以下方案11製備：
方案11
化合物3-e與BnBr在鹼性試劑存在下反應得到化合物3-f；
化合物3-f與對硝基苯基氯甲酸酯在鹼性試劑存在下反應得到化合物3-g。
本揭露還提供一種連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物4-c的合成方法，
包括以下製備化合物4-c、4-b、4-a、1-q、3-k步驟的一步或者多步，
其中化合物4-c藉由以下方案12製備，
方案12
化合物3-k與化合物1-q在鹼性試劑及縮合劑的存在下反應得到化合物4-a；
化合物4-a與丁二酸酐在鹼性試劑存在下反應得到化合物4-b；
化合物4-b在鹼性試劑、縮合劑的存在下與表面胺基修飾的固相載
體反應得到化合物4-c；
其中化合物3-k藉由以上方案9製備；
化合物1-q藉由以上方案2製備。
本揭露提供以下化合物，
其中，“
”為固相載體，較佳為固相載體CPG，更佳為表面胺基修飾的固相載體CPG-NH2。
本揭露還包括與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本申請化合物。可結合到本申請化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，如分別為2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少3000倍的豐度的氘(即，至少45%的氘摻入)。
本揭露中所用術語“連接”，當表示兩個分子之間的聯繫時，指兩個分子藉由共價鍵連接或者兩個分子經由非共價鍵(例如，氫鍵或離子鍵)關聯。
本揭露中所述“直接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團在沒有任何間插原子或原子基團的情況下連接。本文所用術語“間接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團藉由中間基團、化合物或分子(例如，連接基團)連接。
本揭露中所述“寡核苷酸”指連接的核苷的聚合物，各連接的核苷可以被獨立地修飾或不被修飾。
本揭露中所述“單鏈寡核苷酸”指具有與靶mRNA至少部分互補的序列的單鏈寡聚化合物，其能夠藉由氫鍵在哺乳動物生理條件(或相當的體外環境)下與靶mRNA雜交。在一些實施方式中，單鏈寡核苷酸是單鏈反義寡核苷酸。
雖然為簡便起見將全部上述結構式畫成某些異構體形式，但是本揭露可以包括所有的異構體，如互變異構體、旋轉異構體、幾何異構體、非對映
異構體、外消旋體和對映異構體。
互變異構體是有機化合物的結構異構體，藉由被稱為互變異構化的化學反應容易相互轉化。這種反應常導致氫原子或質子的形式遷移，伴隨著單鍵和鄰近的雙鍵的轉換。一些常見的互變異構對為：酮-烯醇、內醯胺-內醯亞胺。內醯胺-內醯亞胺平衡實例是在如下所示的A和B之間：
本揭露中的所有化合物可以被畫成A型或B型。所有的互變異構形式在本揭露的範圍內。化合物的命名不排除任何互變異構體。
“任選地”或“任選”是指意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如“任選地被鹵素或者氰基取代的C1-C6烷基”是指鹵素或者氰基可以但不必須存在，該說明包括烷基被鹵素或者氰基取代的情形和烷基不被鹵素和氰基取代的情形。
本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“/”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“/”可以為“
”或“
”，或者同時包含“
”和“
”兩種構型。本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“
”並未指定構型，即可以為Z構型或E構型，或者同時包含兩種構型。
本揭露中，“
”指固相載體，進一步可為固相載體CPG，更進一步可為表面胺基修飾的固相載體CPG-NH2。
本揭露中，“磷酸酯基團”可為磷酸一酯、磷酸二酯或磷酸三酯；“硫基磷酸酯基團”中的“磷酸酯基團”也具有同樣的含義。
本揭露中所述“部分互補”表示在核鹼基序列的雜交對中，第一多核苷酸的連續序列中至少70%(但不是所有)的鹼基將與第二多核苷酸的連續序列中相同數量的鹼基雜交。
本文所用術語“取代的”表示指定原子(通常是碳、氧和氮原子)上的任何一個或多個氫原子被本文所限定的任何基團所替代，條件是不超過所述指定原子的正常化合價並且取代生成穩定化合物。取代基的非限制性示例包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羥基、側氧基、羧基、環烷基、環烯基、雜環基、雜芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基或鹵素(例如，F、Cl、Br、I)。當取代基是酮或側氧(即，=O)時，則原子上有兩個(2個)氫被替代。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳為含有1至12個碳原子的烷基，更佳為含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-
二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基和羧酸酯基。
術語“環烷基”指飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳為包含3至12個碳原子，更佳為包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀基團，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳為包含3至12個環原子，其中1-4個是雜原子；最佳為包含3至8個環原子，其中1~3是雜原子；最佳為包含3至6個環原子，其中1-2是雜原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫基嗎啉基、
高呱嗪基、吡喃基等，較佳為哌啶基、呱嗪基或嗎啉基。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
所述雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共用毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，例如苯基和萘基。更佳為苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10員，含1至3個雜原子；更佳為5員或6員，含1至2個雜原子；較佳為例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，
較佳為咪唑基、四唑基、吡啶基、噻吩基、吡唑基或嘧啶基、噻唑基；更有選吡啶基。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
雜芳基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基和羧酸酯基。
術語“烯基”指直鏈或支鏈的非芳香族烴基，其含有至少一個碳-碳雙鍵，並且具有2-10個碳原子。在這樣的基團中可以存在多達5個碳-碳雙鍵。例如，“C2-C6”烯基被定義為具有2-6個碳原子的烯基。烯基的示例包括但不限於：乙烯基、丙烯基、丁烯基和環己烯基。烯基的直鏈、支鏈或環狀部分可以含有雙鍵，並且在正常化合價所允許的任何位置任選地被單-、二-、三-、四-或五-取代。
術語“環烯基”表示具有特定數量的碳原子和至少一個碳-碳雙鍵的單環烴基。
術語“炔基”指直鏈或支鏈的烴基，其含有2-10個碳原子並且含有至少一個碳-碳三鍵。可以存在多達5個碳-碳三鍵。因此，“C2-C6炔基”表示具有2-6個碳原子的烯基。炔基的示例包括但不限於：乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。炔基的直鏈、支鏈部分可以含有正常化合價所允許的三鍵，並且在正常化合價所
允許的任何位置任選地被單-、二-、三-、四-或五-取代。
術語“烷氧基”表示如上所定義的烷基具有藉由氧橋連接的所示數量的碳原子。C1-6烷氧基意在包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷氧基。C1-8烷氧基意在包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8烷氧基。烷氧基的示例包括但不限於：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、第二戊氧基、正庚氧基和正辛氧基。
術語“烷硫基”烷基-S-，其中“烷基”的定義同上。
術語“酮”指本文所述藉由羰基橋連接的任何烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環基、雜芳基或芳基。酮基的示例包括但不限於：烷醯基(例如，乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基)，烯醯基(例如，丙烯醯基)，炔醯基(例如，乙炔醯基、丙炔醯基、丁炔醯基、戊炔醯基、己炔醯基)，芳醯基(例如，苯甲醯基)，雜芳醯基(例如，吡咯醯基、咪唑醯基、喹啉醯基、吡啶醯基)。
術語“烷氧基羰基”指藉由羰基橋連接的上述定義的任何烷氧基(即，-C(O)O-烷基)。烷氧基羰基的示例包括但不限於：甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、正丙氧基羰基、第三丁氧基羰基或正戊氧基羰基。
術語“芳氧基羰基”指藉由氧-羰基橋連接的上述定義的任何芳基(即，-C(O)O-芳基)。芳氧基羰基的例子包括但不限於：苯氧基羰基和萘氧基羰基。
術語“雜芳氧基羰基”指藉由氧-羰基橋連接的上述定義的任何雜芳基(即，-C(O)O-雜芳基)。雜芳基氧基羰基的示例包括但不限於：2-吡啶氧基羰基、2-噁唑基氧基羰基、4-噻唑基氧基羰基或嘧啶基氧基羰基。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
除非另外指出，本文所使用符號
表示其可以根據本文所述公開範圍連接一個或多個任何基團。
本揭露中的一些縮略語定義如下：
Cbz：苄氧基羰基；
DCE：二氯乙烷；
Sc(OTf)3：三氟甲烷磺酸鈧；
THF：四氫呋喃；
Pd/C：鈀-碳；
TFA：三氟乙酸；
TEAA：乙酸三乙胺；
DMF：二甲基甲醯胺；
DIPEA/DIEA：N,N-二異丙基乙胺；
DEPBT：3-(二乙氧基鄰醯氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮
HoBt：1-羥基苯并三唑；
EDCI：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽；
DMTrCl：4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯；
HATU：2-(7-氮雜苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
LiOH：氫氧化鋰；
DMAP：4-二甲胺基吡啶；
HBTU：苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽；
CF3SO3H：三氟甲磺酸；
BnBr：溴化苄；
DEPBT：3-(二乙氧基磷醯氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮。
圖1為胺基半乳糖分子簇綴合siRNA對於鼠原代肝細胞mTTR基因抑制活性。
圖2為胺基半乳糖分子簇綴合siRNA對於小鼠mTTR基因的體內抑制活性。
圖3為胺基半乳糖分子簇綴合siRNA對於小鼠mTTR基因的體內長效抑制活性。
以下實施例並不是限制性的，旨在說明本揭露的某些實施方式。
實施例1 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物1-t的合成
合成路線如下：
1)化合物1-g的合成路線
2)化合物1-h的合成路線
3)化合物1-l的合成路線
4)化合物1-q的合成
5)連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物1-t的合成
步驟一
將原料1-a(297g，763mmol)和原料1-b(160g，636mmol)溶解於960ml DCE中，在15℃加入Sc(OTf)3(15.6g，31.8mmol)，然後升高反應溫度到85℃，攪拌反應2h。反應結束後加入1.5L飽和NaHCO3中止反應，分出有機相，並用1.5升飽和食鹽水洗滌，有機相用無水Na2SO4乾燥，過濾後的溶液減壓蒸餾後矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯5：1-0：1)，得到目標產物1-c(328g，544mmol，收率為85.5%，純度為96.4%)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.44-7.29(m,5H),5.83(d,J=8.8Hz,1H),5.40-5.23(m,2H),5.18-5.06(m,2H),4.86(s,1H),4.66(d,J=8.4Hz,1H),4.21-4.07(m,2H),4.04-3.77(m,3H),3.51-3.45(m,1H),3.31-3.11(m,2H),2.18(d,J=2.0Hz,1H),2.14(s,3H),2.06(s,3H),2.03-1.99(m,3H),1.95(s,3H),1.64-1.46(m,4H),1.43-1.29(m,4H)。
MS，C28H40N2O11，實測M+ 581.3。
步驟二
將步驟一所得化合物1-c平行分成兩份進行：每個反應包含化合物1-c(72.0g，124mmol)加入432mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(20.0g，10%純度)，再加入TFA(14.1g，124mmol，9.18mL)。在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，合併兩個平行進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到目標產物1-d(139g)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.85(d,J=9.2Hz,1H),7.74(s,3H),5.21(d,J=3.6Hz,1H),4.97(dd,J=2.8,10.8Hz,1H),4.48(d,J=8.8Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.93-3.82(m,1H),3.73-3.68(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.43-3.38(m,
1H),2.82-2.71(m,2H),2.13-2.09(m,3H),2.01-1.97(m,3H),1.91-1.87(m,3H),1.77(s,3H),1.76-1.73(m,1H),1.52-1.44(m,4H),1.28(s,4H)。
步驟三
將化合物1-d(139g，247mmol)和化合物1-e(75.3g，223mmol)加入DMF溶液(834mL)中，在0℃再加入DIPEA(41.6g，322mmol，56.1mL)、HOBt(36.8g，272mmol)和EDCI(52.2g，272mmol)，保持15℃攪拌反應16h。反應完成後，將反應液用二氯甲烷(400mL)稀釋，然後用飽和氯化銨溶液(1L)、飽和NaHCO3溶液(1.00L)、飽和食鹽水依次洗滌，分出有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸餾除去溶劑，殘餘物藉由矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=5：1-0：1)，得到目標產物1-f(108g，收率為56.8%)。
1HNMR(40(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.89-7.78(m,2H),7.41-7.27(m,6H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.08-4.92(m,3H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.07-3.99(m,3H),3.97-3.81(m,2H),3.75-3.64(m,1H),3.42-3.37(m,1H),3.13-2.93(m,2H),2.20(t,J=8.0Hz,2H),2.10(s,3H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.87-1.79(m,1H),1.76(s,3H),1.74-1.64(m,1H),1.48-1.41(m,2H),1.38(s,12H),1.29-1.20(m,4H),1.19-1.14(m,1H)。
MS，C37H55N3O14，實測值M+766.4。
步驟四
將上述所得化合物1-f平行分成兩份進行：每個反應包含化合物1-f(47.0g，61.3mmol)，加入280mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(15.0g,10%純度)，再加入TFA(7.00g，61.3mmol，4.54mL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，合併兩個平行
進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到目標產物1-g(94.0g，粗品)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.38(s,1H),8.10(s,3H),7.83(d,J=9.2Hz,1H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),4.96(dd,J=3.6,11.2Hz,1H),4.47(d,J=8.4Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.92-3.82(m,1H),3.75-3.67(m,2H),3.60(s,1H),3.43-3.37(m,1H),3.18-3.04(m,2H),2.30-2.24(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.95-1.90(m,2H),1.89(s,3H),1.78-1.75(m,3H),1.49-1.41(m,3H),1.40(s,9H),1.26(s,4H)。
步驟五
將上述所得化合物1-f平行分成兩份進行：每個反應包含化合物1-f(46.0g，60mmol)加入HCl-EtOAc(2.00M，276mL)中，在15℃下攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，減壓濃縮，殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到目標產物1-h(91.0g，粗品)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.91-7.80(m,2H),7.42-7.26(m,6H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.07-4.92(m,4H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.98-3.82(m,3H),3.73-3.65(m,1H),3.44-3.35(m,1H),3.12-2.94(m,2H),2.22(t,J=8.0Hz,2H),2.10(s,3H),2.01-1.97(m,4H),1.94-1.90(m,1H),1.89(s,3H),1.87-1.79(m,2H),1.76(s,3H),1.74-1.67(m,1H),1.49-1.40(m,2H),1.40-1.32(m,2H),1.24(d,J=4.0Hz,4H),1.19-1.13(m,1H)。
MS，C33H47N3O14，實測M+710.3。
步驟六
平行進行兩個反應：每個反應包含化合物1-g(45.0g，60.3mmol)
和化合物1-h(38.5g，54.3mmol)加入到270mL DMF，在0℃再加入DIPEA(10.1g，78.4mmol，13.6mL)，再加入HOBt(8.97g，66.3mmol)和EDCI(12.7g，66.3mmol)。在15℃下攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，並加入300mL DCM稀釋，依次使用飽和氯化銨(800mL)、飽和NaHCO3溶液(800mL)和飽和食鹽水(800mL)洗滌，有機相用無水Na2SO4乾燥。過濾後，減壓濃縮，殘餘物使用矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=5：1-0：1)，得到目標產物1-i(66.0g，47.4mmol，收率為39.3%，純度為95.1%)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.96-7.78(m,5H),7.41-7.25(m,6H),5.21(d,J=3.6Hz,2H),5.05-4.92(m,4H),4.48(d,J=8.8Hz,2H),4.22-4.12(m,1H),4.02(s,6H),3.94-3.80(m,3H),3.74-3.64(m,2H),3.45-3.35(m,2H),3.11-2.92(m,4H),2.20-2.12(m,4H),2.10(s,6H),1.99(s,6H),1.89(s,6H),1.82-1.79(m,2H),1.76(s,6H),1.74-1.63(m,2H),1.44(d,J=6.0Hz,4H),1.37(s,12H),1.24(s,9H)。
MS：C62H94N6O25，實測值m/z 1323.8。
步驟七
分成11個反應進行：在每個反應中加入化合物1-i(5.00g，3.78mmol)和甲苯(300mL)，加入矽膠(45.0g)。在100℃攪拌反應40h，反應完成後合併11個反應混合物。減壓蒸餾除去溶劑後，殘餘物加入異丙醇和二氯甲烷，並攪拌20分鐘。過濾除去不溶物，並使用異丙醇洗滌濾餅至無產物溶出，得到的溶液除去溶劑並乾燥後得到目標產物1-j(43.2g，34.0mmol，收率為82.0%)。
1HNMR：(400MHz,DMSO-d6)δ 8.01(d,J=7.6Hz,1H),7.93-7.79(m,2H),7.39-7.27(m,3H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.06-4.91(m,2H),4.48(d,J=
8.0Hz,1H),4.07-3.97(m,3H),3.94-3.82(m,2H),3.73-3.65(m,1H),3.45-3.36(m,2H),3.10-2.94(m,2H),2.15(d,J=7.6Hz,2H),2.10(s,3H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.86-1.79(m,1H),1.77(s,3H),1.74-1.65(m,1H),1.44(s,2H),1.37(d,J=5.2Hz,2H),1.24(s,4H)。
MS：C58H86N6O25，實測m/z=1267.8。
步驟八
此步平行分成兩個反應進行：每個反應包含化合物1-d(11.8g，21.0mmol)和化合物1-j(21.3g,16.8mmol)加入到70mL DMF，在0℃再加入DIPEA(3.54g，27.3mmol，4.77mL)，再加入HOBt(3.13g，23.1mmol)和EDCI(4.44g，23.1mmol)。在15℃攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，並加入500mL DCM稀釋，依次使用飽和氯化銨溶液(1.5L)、飽和NaHCO3溶液(1.5mL)和飽和食鹽水(1.5mL)洗滌，有機相用無水Na2SO4乾燥。過濾後，減壓濃縮，殘餘物使用矽膠柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=50：1-10：1)，得到目標產物1-k(54.0g,31.8mmol，收率為75.6%)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.91(d,J=7.6Hz,1H),7.87-7.78(m,5H),7.73(t,J=5.2Hz,1H),7.42-7.24(m,6H),5.21(d,J=3.6Hz,3H),5.06-4.92(m,5H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.19-4.09(m,2H),4.07-3.97(m,10H),3.94-3.80(m,4H),3.76-3.64(m,3H),3.42-3.37(m,4H),3.08-2.94(m,6H),2.20-2.12(m,2H),2.10(s,9H),2.08-2.01(m,2H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.87-1.79(m,2H),1.77(s,9H),1.74-1.63(m,2H),1.44(d,J=5.6Hz,6H),1.40-1.31(m,6H),1.24(s,13H)。
MS：C78H118N8O33，實測值m/z=1696.1。
步驟九
此步平行分成3個反應進行：在每個反應中加入化合物1-k(17.0g，10.0mmol)和THF(100mL)，在氬氣保護下加入Pd/C(5.0g，純度10%)，再加入TFA(1.14g，10.0mmol，742μL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在15Psi，加熱至30℃並攪拌反應4小時。反應完成後，合併3個平行進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。殘餘物使用製備液相層析(C18，流動相A 0.1%TFA-Water，流動相B：10-40% CAN，20min)純化，得到目標產物1-l(17.3g，10.2mmol，收率為34.0%)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 8.45(t,J=5.2Hz,1H),8.14(d,J=5.2Hz,3H),7.97(t,J=5.2Hz,1H),7.90-7.77(m,4H),5.21(d,J=2.8Hz,3H),4.96(dd,J=3.2,11.6Hz,3H),4.47(d,J=8.4Hz,3H),4.20-4.10(m,1H),4.02(s,8H),3.87(q,J=9.6Hz,3H),3.75-3.61(m,4H),3.46-3.34(m,3H),3.21-2.93(m,6H),2.21(s,2H),2.14-2.02(m,11H),1.99(s,9H),1.96-1.82(m,12H),1.80-1.65(m,10H),1.44(d,J=5.6Hz,8H),1.36(d,J=6.4Hz,4H),1.30-1.17(m,12H)。
MS：C70H112N8O31，實測值m/2z=781.8。
步驟十
將化合物(1-m)(2g，12.64mmol)溶於吡啶(10mL)中，室溫滴加DMTrCl(4.71g，13.90mmol)的吡啶(10mL)溶液，反應液在室溫攪拌5小時，待反應完畢後，用甲醇淬滅，減壓濃縮得到粗品，用矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=10：1沖提)，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到4g的目標產物1-n。
MS m/z：C29H32O5，[M+H]+實測：461.3。
步驟十一
將化合物1-n(2g，4.34mmol)、N,N-二異丙基乙胺(DIEA，1.43mL，8.68mmol)和HATU(2.47g，6.51mmol)溶解於DMF(10mL)中，室溫加入化合物1-o的DMF(5mL)溶液，該反應在室溫攪拌8小時。反應完畢後，加水淬滅，水相用乙酸乙酯萃取，合併的有機相先用水洗滌，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑，殘餘物經反相製備HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：25-80%(A：水0.075% NH3．H2O，B：CH3CN)，流速：55mL/min)，凍乾後得到2.4g目標產物1-p。
MS m/z：C33H39NO7，[M+H]+實測：562.4。
步驟十二
將化合物1-p(2.4g，4.27mmol)溶解於15mL的甲醇和水(2：1)的混合溶劑中，室溫加入LiOH(0.36g，8.54mmol)並攪拌過夜。待反應完畢後，減壓蒸乾溶劑，殘餘物經反相製備HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：25-75%(A：水0.075% NH3．H2O，B：CH3CN)，流速：55mL/min)，凍乾後得到2g目標產物1-q。
MS m/z：C32H37NO7，[M+H]+實測：548.6。
步驟十三
將化合物1-q(0.37g，0.69mmol)、DIEA(0.19mL，1.15mmol)和HATU(0.32g，0.86mmol)溶於2mL的DMF中，室溫加入化合物1-l(0.9g，0.69mmol)的DMF(2mL)溶液，在室溫攪拌過夜。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO3(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，有機相用無水Na2SO4乾燥，過濾後減壓濃縮。殘餘物經反相製備HPLC(柱：
Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：25-65%(A：水0.075% NH3．H2O，B：CH3CN)，流速：45mL/min)純化，凍乾後得到0.5g目標產物1-r。
MS m/z：C102H147N9O37，[M-H]+實測：2088.5。
步驟十四
將化合物1-r(300mg,0.14mmol)和丁二酸酐(28.70mg，0.28mmol)溶解於四氫呋喃中，向反應液中加入DMAP(3.50mg，0.028mmol)並在40℃攪拌過夜。待反應完畢後，加入甲醇(18.8mg)，並攪拌反應10分鐘，然後將反應液用二氯甲烷(3mL)稀釋，並用飽和NaHCO3(5mL)洗滌2次。將有機相減壓濃縮至乾，殘餘物經反相製備HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：25-65%(A：水0.075% NH3．H2O，B：CH3CN)，流速：35mL/min)純化，凍乾後得到140mg目標產物1-s。
MS m/z：C106H151N9O40，[M-H]+實測：2189.4。
步驟十五
將上步得到的化合物1-r(140mg，64μmol)加入乙腈(5mL)，再加入HBTU(48.7mg，128μmol)，加入表面胺基修飾的固相載體(CPG-NH2，2.3g)，加入DIEA(41.5mg，320μmol，55μL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,10.0mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。得到2.1g連接在固相載體上的目標產物1-t。
實施例2 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物2-e的合成
合成路線如下：
1)化合物2-b的合成
2)化合物2-e的合成
步驟一
將化合物2-a(1.00g，2.37mmol)加入THF(7.5mL)和H2O(7.5mL)中，再加入LiOH.H2O(109mg，2.60mmol)，保持16℃攪拌反應16h。反應完成後，減壓蒸發除去溶劑，殘餘物繼續冷凍乾燥，得到目標產物2-b(960mg，2.32mmol，收率為97.8%)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.44(d,J=8.4Hz,2H),7.34-7.23(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.86(d,J=8.0Hz,4H),3.73(s,6H),3.66(d,J=6.4Hz,1H),3.32(d,J=12.0Hz,1H),3.11(dd,J=2.0,9.2Hz,1H),2.85(t,J=8.8Hz,1H)。
MS m/z：C24H24O6，實測m/z：407.2。
步驟二
將化合物1-l(500mg，0.30mmol)加入二氯甲烷(3mL)中，於15℃再將化合物2-b(0.14g，0.34mmol)加入反應中，在0℃再加入HBTU(142mg，375μmol)和DIEA(115mg，895μmol)，保持15℃反應16h。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO3(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，有機相無水Na2SO4乾燥，過濾後減壓濃縮，殘餘物經過製備液相層析純化(柱：Welch Xtimate C18 250*70mm*10μm；流動相：水-ACN；B%：40%-66%，18min)，得到目標產物2-c。
MS m/z：C94H134N8O36，[M-H]+實測：1952.1。
步驟三
將化合物2-c(230mg，0.12mmol)和丁二酸酐(23.5mg，0.26mmol)溶解於二氯甲烷溶液(2mL)中，向反應液中加入DMAP(43.1mg，0.35mmol)保持在15℃攪拌16h。待反應完畢後，加入甲醇(18.8mg)，並攪拌反應10分鐘，然後將反應液用二氯甲烷(3mL)稀釋，並用飽和NaHCO3洗滌2次。將反應液減壓濃縮抽乾得到目標產物2-d(240mg，粗品)。
MS m/z：C106H151N9O40，[M-H]+實測：m/2z：2070.2。
步驟四
將上步得到的化合物2-d(240mg，116μmol)加入乙腈(8mL)，
再加入HBTU(88.7mg，233μmol)，加入表面胺基修飾的固相載體(CPG-NH2，4g)，加入DIEA(75.5mg，584μmol，101μL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,10.0mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。得到3.7g目標產物連接在固相載體上的目標產物2-e。
實施例3 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物3-n
合成路線如下：
化合物3-d的合成
2)化合物3-g的合成
3)化合物3-n的合成
步驟一
將原料1-a(78.8g，202mmol)和原料3-b(40g，168mmol)溶解於DCE(250mL)，在15℃加入CF3SO3H(4.15g，8.43mmol)，然後升高反應溫度到75℃，攪拌反應2h。反應結束後加入1L飽和NaHCO3中止反應，分離有機相，並用1L飽和食鹽水洗滌，有機相無水Na2SO4乾燥，過濾後的濾液減壓蒸餾後矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯5：1-0：1)，得到目標產物3-c(63.2g,107mmol，收率為63.5%)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.35-7.26(m,5H),5.88(s,1H),5.34-5.25(m,2H),4.65(d,J=8.4Hz,1H),4.16-4.13(m,2H),3.92-3.87(m,3H),3.18-3.17(m,1H),3.15-3.14(m,2H),2.16-1.91(m,15H),1.58-1.50(m,5H),1.49-1.36(m,2H)。
MS m/z：C24H40N2O11，實測m/z：567.4。
步驟二
將上述所得化合物3-c(60.0g，106mmol)加入360mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(15.0g，純度10%)，再加入TFA(12.1g，106mmol，7.84mL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次(500mL x 3)。減壓抽乾後得到目標產物3-d(44g，102mmol，收率為96.1%)。
步驟三
將化合物3-e(60.0g，447mmol)溶解於DMF(300mL)，加入K2CO3(92.7g，671mmol)，在0℃滴加入BnBr(115g，671mmol，79.7mL)。保持25℃攪拌反應6h。將反應液倒入碎冰中，然後使用乙酸乙酯(100mL×6)萃取，有
機相再依次用水洗滌(100ml×2)，飽和食鹽水洗滌(100ml×3)。有機相用無水硫酸鈉乾燥後減壓蒸餾除去溶劑，殘餘物使用矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=2：1-0：1)，得到目標產物3-f(60.3g，269mmol，收率60.1%)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.37-7.26(m,5H),5.18(d,J=4.4Hz,2H),3.95-3.90(m,2H),3.75-3.71(m,2H),1.08(s,1H)。
MS m/z：C12H16O4，實測m/z：223.5。
步驟四
將化合物3-f(50.0g，223mmol)溶解在二氯甲烷中(300mL)，加入吡啶(73.5g，929mmol，75mL)和溶解於二氯甲烷(50mL)的對硝基苯基氯甲酸酯(180g，892mmol)，氮氣保護下保持25℃攪拌反應24h。反應完成後，加入二氯甲烷(250mL)稀釋，然後依次使用NaHSO4溶液(30mL×3)和飽和食鹽水(30mL×2)洗滌，有機相使用MgSO4乾燥後，過濾，減壓蒸發掉溶劑。所得到的粗品使用矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=3：1)，得到目標產物3-g(37.0g，66.7mmol，收率為29.9%)。
MS m/z：C26H22N2O12，實測m/z：553.4。
步驟五
將化合物3-g(22.0g，39.7mmol)加入乙腈(120mL)中，在氮氣保護條件下，再加入三乙胺(24.1g，238mmol，33,1mL)，將反應液冷卻到0℃，滴加入溶解在乙腈(120mL)中的化合物3-d(42.1g，40mmol)，升高溫度到25℃，並攪拌反應1h。反應完成後，減壓濃縮除去溶劑，然後使用矽膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=2：1)得到目標產物3-h(37.0g，12.0mmol，收率為30.2%)。
MS m/z：C52H76N4O24，實測m/z：1141.8。
步驟六
將化合物3-h(11.0g，9.64mmol)溶解於乙酸乙酯(60mL)中，加入Pd/C(2.00g，純度10%)，反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在40Psi，溫度25℃攪拌反應8h。反應完成後，過濾，並減壓蒸發至乾燥，得到目標產物3-i(10.0g，9.42mmol，收率為97.7%)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.79(d,J=9.2Hz,2H),7.10(s,2H),5.74(t,J=1.6Hz,2H),5.21(d,J=3.6Hz,2H),4.98-4.95(m,2H),4.48(d,J=8.4Hz,2H),4.02(d,J=4.8Hz,11H),3.87-3.84(m,2H),3.69-3.67(m,2H),3.41-3.39(m,2H),2.94-2.90(m,4H),2.10(s,5H),1.99(s,7H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.47-1.35(m,8H),1.26-1.24(m,4H),1.23-1.08(m,3H)。
MS m/z：C45H70N4O24，實測m/z：1051.4。
步驟七
將化合物3-i(5.00g，4.76mmol)加入到二氯甲烷(30mL)和DMF(30mL)的混合溶劑中，再加入化合物(3-j)(312mg，2.38mmol)，加入HBTU(1.80g，4.76mmol)和DIEA(615mg，4.76mmol)，保持25℃攪拌反應12h。反應完成後，將反應液倒入乙酸乙酯(100mL)中，然後使用飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4乾燥後，過濾並減壓蒸發除去溶劑，殘餘物使用製備HPLC純化(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：5-50%(A：水，B：CH3CN)，流速：45mL/min)得到目標產物3-k(2.1g，956μmol，收率為20.1%)。
1HNMR：(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.84-7.81(m,5H),7.12-7.07(m,3H),5.21(d,J=3.6Hz,4H),4.99-4.96(m,4H),4.49(d,J=8.4Hz,4H),4.06-4.00(m,24H),3.88-3.86(m,4H),3.55-3.52(m,4H),3.49-3.43(m,4H),3.25-3.05(m,4H),
2.94-2.93(m,8H),2.11(s,12H),2.00(s,16H),1.90(s,12H),1.78(s,12H),1.46-1.44(m,8H),1.38-1.35(m,8H),1.26-1.24(m,8H),1.18-1.16(m,6H),1.09-0.99(m,2H)。
MS m/z：C96H153N11O46，實測m/z：2197.5。
步驟八
將化合物3-k(100mg，45.5μmol)加入DMF(1mL)中，再將化合物2-b(21.1mg，54μmol)加入反應中，再加入HBTU(21.8mg，57.3μmol)和DIEA(17.7mg，136μmol)，保持15℃反應16h。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO3和飽和食鹽水洗滌，有機相無水Na2SO4乾燥，過濾後減壓濃縮，殘餘物經過製備液相純化(柱：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5μm；流動相：水-ACN；B%：35%-75%，12min)，得到目標產物3-l。
MS m/z：C120H175N11O51，實測：2586.9。
步驟九
將化合物3-l(14mg，5.4μmol)和丁二酸酐(1.08mg，10.8μmol)溶解於二氯甲烷溶液(1mL)中，向反應液中加入DMAP(2.0mg，16μmol)和TEA(1.1mg，10.8μmol，1.5μL)，保持在15℃攪拌16h。待反應完畢後，加入甲醇(0.9mg)，並攪拌反應10分鐘，然後將反應液用二氯甲烷稀釋，並用飽和NaHCO3洗滌2次。將反應液減壓濃縮抽乾得到目標產物3-m(18mg)。
MS m/z：C124H179N11O54，實測：2687.2。
步驟十
將上步得到的化合物3-m(18mg，6.7μmol)加入乙腈(3mL)，再加入HBTU(5.1mg，13.4μmol)，加入表面胺基修飾的固相載體(CPG-NH2，
200mg)，加入DIEA(4.3mg，33.5μmol，5.8μL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(2mL x 4)、二氯甲烷(2mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,2mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇、二氯甲烷洗滌。得到200mg目標產物連接在固相載體上的目標產物3-n。
實施例4 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物4-c
合成路線如下：
化合物4-c的合成
步驟一
將化合物3-k(149.5mg，68μmol)、DIEA(141.0mg，1.09mmol)、3A分子篩(500mg)和DEPBT(163.4mg，0.55mmol)溶於5mL的DCM中，室溫加入化合物1-q(400mg，0.18mmol)，在室溫攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，濾液旋乾並經反相製備HPLC(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：5-50%(A：水，B：CH3CN)，流速：45mL/min)，凍乾後得到目標產物4-a(118mg，32μmol，收率為62.6%)。
MS m/z：C128H188N12O52，實測[M+HCOO-]=2770.6。
步驟二
將化合物4-a(110mg，4.0μmol)、DMAP(7.4mg，40μmol)、3A分子篩(100mg)和丁二酸酐(11.9mg，120μmol)溶於5mL的THF中，氬氣保護，40℃攪拌4h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，濾液旋乾並經反相製備HPLC
純化(柱：Boston Green ODS 150*30mm*5μm，條件：5-50%(A：水，B：CH3CN)，流速：45mL/min)，凍乾後得到目標產物4-b(80mg，28.3μmol，收率為70.8%)。
MS m/z：C132H192N12O55，[M-H]+實測：2824.6。
步驟三
將上步得到的化合物4-b(71mg，25μmol)加入乙腈(5mL)，再加入HBTU(19.0mg，50μmol)，加入表面胺基修飾的固相載體(CPG-NH2，0.86g)，加入DIEA(16.2mg，125μmol，21.6μL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(5mL x 4)、二氯甲烷(5mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,6.0mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇、二氯甲烷洗滌。得到0.74g連接在固相載體上的目標產物4-c。
實施例5 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物L96’的製備
按照專利申請WO2014025805A1記載的方法，並按照上述的連接固相載體同樣的方法，連接到CPG固相載體上，得到化合物L96’。
實施例6 合成胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA
用於測試的siRNA，靶向小鼠TTR基因mRNA的siRNA(Molecular Therapy Vol.26 No 3 March 2018)如下，在SS鏈的3’末端藉由共價鍵連接胺基半乳糖分子簇M。
siRNA的合成與通常的亞磷醯胺固相合成法無異，所不同的是在合成siRNA的SS鏈時，使用上述所合成的連接有胺基半乳糖分子簇的CPG載體代替通常的Universal-CPG載體。簡要描述如下：於Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上，以上述合成的胺基半乳糖連接的CPG載體為起始，根據合成程式逐個連接核苷亞磷醯胺單體。核苷亞磷醯胺單體原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等購自上海兆維或蘇州吉瑪。採用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)，使用0.22M的PADS溶於1：1體積比的乙腈和三甲基吡啶(蘇州柯樂瑪)溶液作為硫化試劑，使用碘吡啶/水溶液(柯樂瑪)作為氧化劑。
固相合成完成後，寡核糖核苷酸自該固體支撐物裂解，採用3：1的28%氨水和乙醇溶液在50℃條件下浸泡16小時。然後離心，將上清液轉移到另一個離心管中，濃縮蒸發乾後，使用C18反向層析純化，流動相為0.1M TEAA和乙腈，並使用3%三氟乙酸溶液脫除DMTr。目標寡核苷酸收集後凍乾，並經LC-MS鑑定為目標產物，再經過UV(260nm)定量。
所得到的單鏈寡核苷酸，根據等莫耳比，按照互補配對，與AS鏈退火，最後所得到的雙鏈siRNA溶於1X PBS中，並調整至實驗所需濃度。
合成胺基半乳糖簇綴合的siRNA化合物，實驗所用siRNA序列靶向小鼠TTR mRNA。
實施例7 胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在肝原代細胞中對mRNA表達的抑制
參照Severgini等報導的方法(Cytotechnology.2012；64(2)：187-195.)分離獲得新鮮小鼠原代肝細胞。
原代肝細胞分離後，按照10萬每孔接種於24孔盤中，按照終濃度為50nM、10nM、2nM、0.4nM、0.08nM、0.016nM、0.0032nM、0.00064nM分別加入待測siRNA化合物。隨後，將原代肝細胞置於37℃，5% CO2的環境中培養24小時。24h後，採用qPCR方法檢測mTTR的mRNA表達量級。
圖1顯示了不同濃度的S-1、S-2、S-3、S-4和S-L96對mRNA的抑制率。如圖1所示，S-1、S-2、S-3、S-4均表現了優秀的mTTR基因表達抑制效率。S-1及S-4的IC50值低於其它兩組，與對照組S-L96的IC50值0.280nM相比，S-1的IC50值為0.131nM，S-4的IC50值為0.135nM，表明S-1及S-4化合物綴合的siRNA體外被原代肝細胞自由攝取的效率優於對照組，S-1及S-4化合物能更高效介導siRNA進入原代肝細胞。
實施例8 胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在體內對mRNA表達的抑制
使用8週齡的C57BL/6小鼠(昭衍生物，SPF級，雌性)，採用上述的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA經皮下注射遞送。在第1天，在小鼠肩頸部的鬆弛皮膚上，給予100μl溶液的皮下注射，其含有PBS(稱為Mock組，即空白對照組)或PBS配製的1mg/kg(mpk)、0.2mpk劑量的對應的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA(S-L96、S-3、S-2、S-4或S-1)。各個組別注射6隻小鼠。
在給藥3天後，斷頸犧牲小鼠，使用qPCR檢測小鼠肝組織mTTR的mRNA表達量級。
圖2顯示了分別給藥不同劑量的S-1、S-2、S-3、S-4和S-L96後，小鼠肝組織中mRNA的表達量級。如圖2所示，S-1、S-2、S-3、S-4均表現了優秀的
mTTR基因表達抑制效率。其中，S-2、S-3、S-4與對照組S-L96相比，在1mpk及0.2mpk的活性相近。S-1在1mpk及0.2mpk的活性量級優於對照組S-L96。
實施例9 胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在體內對mRNA表達抑制的長效性實驗
按照前述合成方法再次合成兩組siRNA化合物，用於小鼠體內給藥。
使用8週齡的C57BL/6小鼠(昭衍生物，SPF級，雌性)，採用上述的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA經皮下注射遞送。在第0天，在小鼠肩頸部的鬆弛皮膚上，給予100μl溶液的皮下注射，其含有PBS(稱為Mock組，即空白對照組)或PBS配置的1mg/kg(mpk)劑量的對應的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA(S-1-2和S-L96-2)。各個組別注射9隻小鼠。
分別在給藥7天、14天、28天後，斷頸犧牲各3隻小鼠，每隻小鼠取兩份肝組織樣本，使用qPCR檢測小鼠肝組織mTTR的mRNA表達量級。
表1和圖3顯示了給藥化合物S-1-2和S-L96-2後的7天、14天及28天，小鼠肝組織中mRNA的表達量級。
表1
如表1和圖3所示，所給藥siRNA在28天仍顯示出高效的mRNA抑制率，與對照組S-L96-2相比，S-1-2的抑制率更高。
<110> 上海拓界生物醫藥科技有限公司(TUOJIE BIOTECH(SHANGHAI)CO.,LTD.)
<120> 一種碳水化合物分子簇及其製備方法和醫藥用途
<130> 721059CPCT
<150> CN202010546412.0
<151> 2020-06-16
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi試劑反義鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 這些位置的鹼基是RNA
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNAi試劑反義鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 這些位置的鹼基是RNA
<400> 2
Claims (35)
- 一種靶向配體，其結構如下式(I)所示，
其中T為靶向部分，B為分支基團，L1為接頭部分，L2為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數，較佳為2到8的整數，最佳為3到5的整數。 - 根據請求項1所述的靶向配體，其中L1為
其中，R1和R2各自獨立地選自-S-、-NH-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-CH2O-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12員雜環基，所述-CH2-任選被選自鹵素、烷基、烷氧基、烷胺基中的一個或多個基團所取代，所述烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素中的一個或多個基團所取代；R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基的一個或多個基團所取代；n選自0、1、2、3、4；m選自0到20的整數。 - 根據請求項2所述的靶向配體，其中L1為
其中，R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、羧基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；n選自0、1、2、3、4，較佳為n為0；較佳地，L1為
更佳地，L1為
- 根據請求項1所述的靶向配體，其中L1為
- 根據請求項1所述的靶向配體，其中B為
其中，R4、R5、R6和R7各自獨立地選自-C(O)NH-、-C(O)-、、
、
X2、X3、X4和X5各自獨立地選自0到10的整數。 - 根據請求項5所述的靶向配體，其中B為
- 根據請求項2-4任一項所述的靶向配體，其中所述B選自
、
、
，較佳為
、
或
，最佳為
- 根據請求項5或6所述的靶向配體，其中L1選自以下結構：
較佳地，L1選自、
、
更佳地，L1選自或
；
其中，R1和R2各自獨立地選自-S-、-NH-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-CH2O-、-NH-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-NH-、-NH(CO)NH-、3-12員雜環基，所述-CH2-任選被選自鹵素、烷基、烷氧基、烷胺基中的一個或多個基團所取代，所述烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素中的一個或多個基團所取代；R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；n選自0、1、2、3、4；m選自0到20的整數。 - 根據請求項8所述的靶向配體，其中L1為
其中，R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基的一個或多個基團所取代；n選自0、1、2、3、4；較佳地，n為0；較佳地，L1為或
。
- 根據請求項1所述的靶向配體，其中，B為、
或
，
L1選自、
和
。
- 根據請求項1-10中任一項所述的靶向配體，其中L2選自以 下基團中的1個或2-20個共價連接的組合：、
、
、
、
、
、
、取代的或未取代的環烷基、取代的或 未取代的環烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的雜芳基、取代的 或未取代的雜環基，較佳為以下基團或其共價連接的組合：
、
、
- 根據請求項11所述的靶向配體，其中L2為
其中，x6是從1至20的整數；較佳為、
、
、
或
最佳為；或者
L2為
其中，x7是從1至20的整數，並且Z是、
、
；
較佳為；或者
L2為，
其中，x8是從1至20的整數，並且Z是、
、
；或者
L2為，其中x9和X10各自獨立選自從1至20的整數，並 且Z是
、
、
；或者
L2為；或者
L2為，其中，x11和x12各自獨立選自從1至20的整數，並且 Z是
、
、
。
- 根據請求項11所述的靶向配體，其選自以下結構：
- 根據請求項1-13中任一項所述的靶向配體，其中T選自N-乙醯基-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺、N-異丁醯基-半乳糖胺、聚糖、半抗原、維生素、葉酸、生物素、適體和肽，較佳為N-乙醯基-半乳糖胺。
- 根據請求項1-14中任一項所述的靶向配體，其選自以下結構：
- 一種式(II)所示的綴合物，其由根據請求項1-15中任一項所述的靶向配體與表達抑制性寡聚化合物Y連接形成，
其中x、T、L2、B、L1如請求項1-15中任一項所定義。 - 根據請求項16所述的式(II)所示的綴合物，其中所述表達抑制性寡聚化合物為RNAi試劑，所述的RNAi試劑較佳是雙鏈的或是siRNA。
- 根據請求項17所述的式(II)所示的綴合物，其中所述RNAi試劑包括一個或多個修飾的核苷酸。
- 根據請求項17所述的式(II)所示的綴合物，其中所述靶向配體連接至RNAi試劑正義鏈的5’末端或3’末端。
- 根據請求項16所述的式(II)所示的綴合物，其選自：
其中Y為表達抑制性寡聚合物。 - 根據請求項16-20中任一項所述的式(II)所示的綴合物，其中L1與Y藉由磷酸酯基團、硫基磷酸酯基團或膦酸基團連接。
- 一種式(III)所示的化合物，其由根據請求項1-13和15中任一項所述的靶向配體與W連接形成，其中W為羥基保護基團，較佳為脂基保護基、烷氧基甲基保護基、烷基保護基、矽烷基保護基、芳基保護基，更佳為芳基保護基，特別佳為三苯甲基、對甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，
其中x、T、L2、B、L1如請求項1-13和15中任一項所定義。 - 根據請求項22所述的式(III)所示的化合物，其中T選自N-乙醯基-D-半乳糖胺三乙酸酯。
- 一種式(IV)所示的化合物，
其中T為N-乙醯基-D-半乳糖胺三乙酸酯，B為分支基團，L2為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數，其中L1-W結構如下所示，
R3選自氘、鹵素、烷基、胺基、氰基、硝基、烯基、炔基、羧基、羥基、巰基、烷硫基、烷氧基、烷胺基、-C(O)-烷基、-C(O)-O-烷基、-CONH2、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH2、-S(O)ONH-烷基，所述的烷基、烯基、炔基、烷硫基、烷氧基、-C(O)-烷基、- C(O)-O-烷基、-CONH-烷基、-OC(O)-烷基、-NH-C(O)-烷基、-S(O)O-烷基、-S(O)ONH-烷基任選進一步被選自鹵素、羥基、胺基、巰基中的一個或多個基團所取代；n選自0、1、2、3、4；較佳為或
，
更佳為或
，
或者L1-W結構如下所示
W為羥基保護基團，較佳為脂基保護基、烷氧基甲基保護基、烷基保護基、矽烷基保護基、芳基保護基，更佳為芳基保護基，特別佳為三苯甲基、對甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基；B、L2如請求項1-13中任一項所定義。 - 根據請求項24所述的式(IV)所示的化合物，其中B選自
- 根據請求項25所述的式(IV)所示的化合物，其選自：
- 一種綴合物，其由根據請求項24-26中任一項所述的式(IV)所示的化合物與高分子載體綴合而成，所述高分子載體為帶胺基的玻璃珠或帶胺基的高分子聚合物。
- 一種根據請求項27所述的綴合物的製備方法，其包括將根據請求項24-26中任一項所述的式(IV)所示化合物在縮合劑存在下與高分子載體或玻璃珠反應得到所述綴合物，所述高分子載體為帶胺基的高分子聚合物，所述玻璃珠為帶胺基修飾的二氧化矽。
- 根據請求項28所述的綴合物的製備方法，其進一步包括將式(III)所示的化合物與丁二酸酐反應得到式(IV)所示的化合物的步驟，其中式(III)所示化合物如請求項23定義。
- 一種組成物，其包含根據請求項16-21中任一項所述的式(II)所示的綴合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
- 一種根據請求項16-21中任一項所述的式(II)所示的綴合物或根據請求項30所述的組成物在製備治療患者疾病的藥物中的用途，所述疾病較佳為肝源性疾病。
- 一種治療患者疾病的方法，其包括向患者給予根據請求項16-21中任一項所述的式(II)所示的綴合物或根據請求項30所述的組成物。
- 一種抑制患者體內mRNA表達的方法，其包括向患者給予根據請求項16-21中任一項所述的式(II)所示的綴合物或根據請求項30所述的組成物。
- 一種體內遞送表達抑制性寡聚化合物至肝臟的方法，其包括向患者給予根據請求項16-21中任一項所述的式(II)所示的綴合物或根據請求項30所述的組成物。
- 一種化合物或綴合物，其選自以下結構：
其中，“”為固相載體，較佳為固相載體CPG，更佳為表面胺基修飾的固相載體CPG-NH2。
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