CN118076738A - 靶向LPA的siRNA及缀合物 - Google Patents

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Abstract

涉及靶向LPA的siRNA及缀合物，具体涉及靶向LPA的siRNA、siRNA缀合物、组合物及其医药用途。还涉及包含该siRNA的药物组合物、细胞或试剂盒，以及该siRNA、siRNA缀合物用于治疗和/或预防患相关障碍的受试者的方法。

Description

靶向LPA的siRNA及缀合物
本公开要求申请日为2021年12月16日的中国专利申请202111545699.6的优先权，本公开引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体涉及抑制载脂蛋白(a)基因(Apo(a)基因，LPA)表达的siRNA、缀合物、组合物及其医药用途。
背景技术
1963年挪威遗传学家Berg首先发现的脂蛋白(a)[Lp(a)]被鉴定为独特的脂蛋白(Berg K.A new serum type system in man-the Lp system.Acta Pathol Microbiol Scand 1963；59:369–82.)。[Lp(a)由脂质和蛋白质两部分组成：脂质部分主要是位于核心部位的LDL样微粒；蛋白质部分位于外周，由载脂蛋白(a)[apo(a)]和apoB100通过二硫键连接而成。apo(a)主要在肝脏中表达，其表达仅限于人类和非人类的灵长类动物，它的特征是存在三个内部二硫键稳定的三环结构的结构域(Kringle)。在人类谱系中，apo(a)中Kringle IV结构域的扩增和分化导致十种不同类型的KIV结构域，其中Kringle IV 2型(KIV-2)的进一步扩增产生了多等位基因(1～40拷贝)内拷贝数变异(CNV)，其他Kringle IV编码域(KIV-1和KIV-3至KIV-10)仅作为单拷贝存在(Schmidt K,Noureen A,Kronenberg F,et al.Structure,Function,and Genetics of Lipoprotein(a)[J].Journal of Lipid Research,2016,57(8):1339.)。所有Kringle均被转录和翻译，因此KIV-2CNV导致了编码的apo(a)的大小多态性，其表达与存在KIV-2结构域的数量成反比，当KIV-2拷贝数较少时，血浆中Lp(a)含量会显著增加。
Lp(a)升高的患者其心血管事件的风险是正常人群的2-3倍，引起包括动脉粥样硬化心血管疾病、下肢动脉病变、主动脉瓣膜狭窄等(EnAs EA,Varkey B,Dharmarajan T S,et al.Lipoprotein(a):An independent,genetic,and causal factor for cardiovascular disease and acute myocardial infarction[J].Indian Heart Journal,2019,71(2).)。Lp(a)可能通过以下两种机制导致不良的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)：一方面由于apo(a)在体外被证实可抑制纤溶，因此可能促进斑块破裂处的血栓形成或血管狭窄处的湍流，从而导致血管阻塞或促进血栓形成；另一方面LDL样颗粒可促进内膜胆固醇沉积、炎症或氧化磷脂，从而导致动脉粥样性狭窄或主动脉瓣狭窄(Albert Youngwoo Jang,Seung Hwan Han，Il Suk Sohn，et al.Lipoprotein(a)and Cardiovascular Diseases[J].Circulation Journal，2020，84:867–874)。但即使非常高水平的Lp(a)，其胆固醇含量也低于传统LDL临界值，因而，LDL样颗粒这部分的致病性可能比较少。
2016年中国成人血脂异常防治指南将>30mg/dl定义为Lp(a)异常，以此为标准，在中国约30％的既往有心血管事件的患者存在Lp(a)异常。2019年美国国家脂质协会推荐Lp(a)≥50mg/dl为水平升高，按照这个标准全球人口的20％均存在Lp(a)水平升高。尽管Lp(a)水平升高常见，但缺乏针对性治疗药物，迄今尚无靶向降低Lp(a)的药物获批用于临床。Lp(a)蛋白与多种脂蛋白结构相似，难以成为小分子和大分子药物的直接靶点，而Lp(a)基因转录的mRNA具有高专属性，可以通过siRNA转录后调控机制特异性降解其mRNA，进而抑制Lp(a)表达。因此设计靶向apo(a)基因(LPA)的siRNA使其表达减弱，从而降低血清中Lp(a)水平，进而降低心血管不良事件。
发明内容
本公开提供一种靶向LPA的siRNA。
一些实施方案中，本公开提供了一种siRNA，其包含形成双链区的正义链与反义链；
所述正义链包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任一的核苷酸序列相差不超过3个(例如0、1、2、3)核苷酸序列，且包含至少15个(例如16、17、18、19、20、21)连续核苷酸；
所述反义链包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一的核苷酸序列相差不超过3个(例如0、1、2、3)核苷酸序列，且包含至少15个(例如16、17、18、19、20、21)连续核苷酸。
一些实施方案中，反义链与靶序列至少部分地反向互补以介导RNA干扰。在一些实施方案中，反义链与靶序列之间存在不多于5个、不多于4个、不多于3个、不多于2个、不多于1个错配。在一些实施方案中，反义链与靶序列完全反向互补。
一些实施方案中，正义链与反义链至少部分地反向互补以形成双链区。在一些实施方案中，正义链与反义链之间存在不多于5个、不多于4个、不多于3个、不多于2个、不多于1个错配。在一些实施方案中，正义链与反义链完全反向互补。
一些实施方案中，本公开siRNA包含一个或两个平端。
一些具体的实施方案中，siRNA的每条链各自独立地包含具有1至2个未配对的核苷酸。
一些实施方案中，本公开siRNA包含位于所述siRNA反义链3’端的突出端。
一些实施方案中，正义链和反义链各自独立地具有16至35个、16至34个、17至34个、17至33个、18至33个、18至32个、18至31个、18至30个、18至29个、18至28个、18至27个、18至26个、18至25个、18至24个、18至23个、19至25个、19至24个、或19至23个核苷酸(例如19、20、21、22、 23个核苷酸)。
一些实施方案中，正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。本公开提供的siRNA的正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链的长度比为19/21。
一些实施方案中，所述正义链包含至少15个连续核苷酸，且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列相差不超过2个核苷酸。一些实施方案中，核苷酸序列相差不超过1个核苷酸；一些实施方案中，相差1个核苷酸；
一些实施方案中，所述反义链包含至少15个连续核苷酸序列，且与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4核苷酸序列相差不超过2个核苷酸；一些实施方案中，核苷酸序列相差不超过1个核苷酸；一些实施方案中，相差1个核苷酸。
一些实施方案中，正义链包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列至少15个连续核苷酸。一些实施方案中，至少16个连续核苷酸。一些实施方案中，至少18个连续核苷酸。一些实施方案中，至少19个连续核苷酸。
一些实施方案中，反义链包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一的核苷酸序列至少15个连续核苷酸。一些实施方案中，至少18个连续核苷酸。一些实施方案中，至少19个连续核苷酸。一些实施方案中，至少20个连续核苷酸。一些实施方案中，至少21个连续核苷酸。
一些实施方案中，所述正义链包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
一些实施方案中，所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
一些实施方案中，本公开所述的siRNA，其包含或选自以下任一组：
组1)，SEQ ID NO：1所示的正义链和SEQ ID NO：3所示的反义链；
组2)，SEQ ID NO：2所示的正义链和SEQ ID NO：4所示的反义链。
一些实施方案中，本公开所述的siRNA，其包含或选自以下任一组：
组1)，正义链是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
组2)，正义链是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
本公开中，按照5’-3’方向，
SEQ ID NO:1是GCUCCUUAUUGUUAUACGA；
SEQ ID NO:2是ACACCACAUCAACAUAAUA；
SEQ ID NO:3是UCGUAUAACAAUAAGGAGCUG；
SEQ ID NO:4是UAUUAUGUUGAUGUGGUGUCA。
一些实施方案中，正义链和/或反义链中至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，全部的核苷酸为修饰的核苷酸。
本公开提供了一种siRNA，其包含形成双链区的正义链与反义链；
所述正义链包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸序列，且包含至少15个连续核苷酸；所述反义链包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸序列，且包含至少15个连续核苷酸；所述反义链在其5’区域的第2位至第8位(例如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)上的至少一个核苷酸包含2'-甲氧基修饰或式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰：
式(I)选自：
其中：Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
J 2为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
Q 1为 Q 2为R 2；或者Q 1为R 2，Q 2为
其中：
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
J 1为H或C 1-C 6烷基；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B是碱基；
其中：所述式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰不是
在一些实施方案中，当X为NH-CO时，R 1不是H。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰核苷酸对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)选自式(I-1)：
其中：
Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B如式(I)中所定义。
式(I-1)的一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)选自式(I-2)：
其中，
Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基；r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B如式(I)中所定义。
式(I-2)的一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，上述化学修饰或其互变异构体修饰不是
在一些实施方案中，每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 3烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 3烷基；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 4烯基和C 2-C 4炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 4烯基和C 2-C 4炔基，r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
B如式(I)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或甲基；
R 3选自H、OH、F、Cl、NH 2、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-甲基氨基、-O-乙基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p＝1或2；
R 1选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q＝1或2；
R 2选自H、OH、F、Cl、NH 2、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-甲基氨基、-O-乙基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r＝1或2；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
B如式(I)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌 呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
B如式(I)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯中的那些。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，Y为O或NH；每个X独立地选自NH-CO、CH 2和NH；
n＝0或1；m＝0或1；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H；
R 1选自H、甲基和CH 2OH；
R 2选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
R 3选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B如式(I)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，Y为O或NH；每个X独立地选自NH-CO、CH 2和NH；
n＝0或1；m＝0或1；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H；
R 1选自H、甲基和CH 2OH；
R 2选自H、甲基和CH 2OH；
R 3选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中：B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，所述式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中：B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第2位至第8位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第5位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第5位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第6位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第6位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第7位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、 胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸选自包含式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸，
其中：Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
J 2为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
Q 1’为 Q 2’为R 2；或者Q 1’为R 2，Q 2’为
其中：
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
J 1为H或C 1-C 6烷基；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B是碱基；
M为O或S；
其中：所述式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰不是
在一些实施方案中，当X为NH-CO时，R 1不是H。
式(I’)的一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I’)选自式(I’-1)：
其中：Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，r＝1、2或3；
M为O或S；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
B如式(I’)中所定义。
式(I’-1)的一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I’)选自式(I’-2)：
其中Y选自O、NH和S；
每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 6烷基；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基和(CH 2) qR 7；其 中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、C 1-C 6烷基、C 1-C 6烷氧基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基；r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环；
M为O或S；
B如式(I’)中所定义。
式(I’-2)的一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，上述化学修饰或其互变异构体修饰不是
在一些实施方案中，当X为NH-CO时，R 1不是H。
在一些实施方案中，每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H或C 1-C 3烷基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或C 1-C 3烷基；
R 3选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 6烯基和C 2-C 6炔基，p＝1、2或3；
R 1选自H、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4炔基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 4烯基和C 2-C 4炔基，q＝1、2或3；
R 2选自H、OH、卤素、NH 2、C 1-C 3烷基、C 1-C 3烷氧基、C 2-C 4烯基、C 2-C 4 炔基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-烷基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、卤素、甲氧基、乙氧基、N 3、C 2-C 4烯基和C 2-C 4炔基，r＝1、2或3；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
在一些实施方案中，每个X独立地选自CR 4(R 4’)、S、NR 5和NH-CO，其中R 4、R 4’、R 5分别独立地为H、甲基、乙基、正丙基或异丙基；
n＝0、1或2；m＝0、1或2；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H或甲基；
R 3选自H、OH、F、Cl、NH 2、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-甲基氨基、-O-乙基氨基和(CH 2) pR 6；其中R 6选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p＝1或2；
R 1选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH 2) qR 7；其中R 7选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q＝1或2；
R 2选自H、OH、F、Cl、NH 2、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH 3、NCH 3(CH 3)、OCH 2CH 2OCH 3、-O-甲基氨基、-O-乙基氨基和(CH 2) rR 8；其中R 8选自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N 3、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r＝1或2；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，Y为O或NH；每个X独立地选自NH-CO、CH 2和NH；
n＝0或1；m＝0或1；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H；
R 1选自H、甲基和CH 2OH；
R 2选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
R 3选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，Y为O或NH；每个X独立地选自NH-CO、CH 2和NH；
n＝0或1；m＝0或1；s＝0或1；
每个J 1、J 2分别独立地为H；
R 1选自H、甲基和CH 2OH；
R 2选自H、甲基和CH 2OH；
R 3选自H、OH、NH 2、甲基和CH 2OH；
任选地，R 1和R 2直接相连成环。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，所述式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中，M为O或S；
B如式(I’)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，所述式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中：M为O或S；
B如式(I’)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，所述式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰选自：
其中：M为O或S；
B如式(I’)中所定义。
一些实施方案中，B是碱基；例如选自嘌呤碱基、嘧啶碱基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、异鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、C2修饰的嘌呤、N8修饰的嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鸟嘌呤、7-脱氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修饰的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。
一些实施方案中，B是所述反义链的修饰的核苷酸对应位置的碱基。
在一些实施方案中，所述式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰包括但不限于：
以及它们结构中的腺嘌呤被置换为鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些。
在一些实施方案中，所述反义链在其5’区域的第2位至第8位(例如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一个核苷酸包含2'-甲氧基修饰。
在一些实施方案中，所述反义链在其5’区域的第5位、第6位、第7位中任一核苷酸包含2'-甲氧基修饰。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸位于反义链在其5’区域的第2位至第8位任一。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸位于反义链5’区域的第5位、第6位或第7位任一。
在一些实施方案中，式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第5位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第5位中对应位置的碱基。
在一些实施方案中，式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第6位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第6位中对应位置的碱基。
在一些实施方案中，式(I’)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’区域的第7位时，B选自腺嘌呤、鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；一些实施方案中，B是所述反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，所述的siRNA正义链和/或反义链中至少一个另外的核苷酸为修饰的核苷酸，修饰的核苷酸选自：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷酸、3'-脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA。一些实施方案中，修饰的核苷酸相互独立地选自：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA的正义链中三个连续的核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA的正义链中，位于5’端第7-9位的三个连续的核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA的正义链中位于5’端第7-9位的三个连续的核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，正义链其余位置均为非2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反义链的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自独立地为2'-氟代修饰的核苷酸。
在另一些实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反义链的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自独立地为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链含有或选自如下式所示的核苷酸序列(5’-3’)：
N aN aN aN aXN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a
其中，每个X独立地为N a或N b；
N a为2'-甲氧基修饰的核苷酸，N b为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链含有如下式所示的核苷酸序列：
5’-N aN aN aN aN aN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；或，
5’-N aN aN aN aN bN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；
其中，N a为2'-甲氧基修饰的核苷酸，N b为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链选自如下式所示的核苷酸序列：
5’-N aN aN aN aN aN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；或，
5’-N aN aN aN aN bN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；
其中，N a为2'-甲氧基修饰的核苷酸，N b为2'-氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，反义链含有或选自如下式所示的核苷酸序列：
5’-N a’N b’N a’N b’N a’N b’W’N a’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N a’N a’-3’；或，
5’-N a’N b’N a’N b’N a’N b’W’N a’N b’N a’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N a’N a’-3’；
其中，N a’为2'-甲氧基修饰的核苷酸，N b’为2'-氟代修饰的核苷酸；W’表示2'-甲氧基修饰的核苷酸或包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸。
在一些具体的实施方案中，W’表示包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸；
在一些具体的实施方案中，式(I)选自：
其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具体的实施方案中，B选自反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
在一些具体的实施方案中，式(I)选自：
其中：M为O或S；其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具体的实施方案中，B选自反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些具体的实施方案中，M为S。一些具体的实施方案中，M为O。
在一些具体的实施方案中，W’表示2'-甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。所述修饰基团使得所述siRNA在生物样品或环境中具有增加的稳定性。在一些实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
在一些实施方案中，硫代磷酸酯基存在于选自以下的位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸末端；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸末端；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方案中，正义链和/或反义链中包括多个硫代磷酸酯基，所述硫代磷酸酯基存在于：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；和，
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；和，
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；和
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；和，
以及可选的，所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸末端，和/或，可选的所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；和/或，可选的所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；和/或，可选的反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间，和/或，可选的反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方案中，正义链选自包含如下式所示的核苷酸序列：
5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，或，
5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，
其中，Nm表示2'-甲氧基修饰的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修饰的C、G、U、A、T；Nf表示2'-氟代修饰的任意核苷酸，例如2'-氟代修饰的C、G、U、A、T；
小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；小写字母s在3’端第一个时表示与该字母s左侧相邻的一个核苷酸末端为硫代磷酸酯基。
在一些实施方案中，反义链选自包含如下式所示的核苷酸序列：
5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’或，
5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nf’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’s Nm’sNm’-3’
其中，Nm’表示2'-甲氧基修饰的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修饰的C、G、U、A、T；Nf’表示2'-氟代修饰的任意核苷酸，例如2'-氟代修饰的C、G、U、A、T；
小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，小写字母s在3’端第一个时表示与该字母s左侧相邻的一个核苷酸末端为硫代磷酸酯基；
W’表示2'-甲氧基修饰的核苷酸或包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸。
一些实施方案中，式(I)选自：
其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些实施方案中，B是反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)选自：
其中：M为O或S；其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具体的实施方案中，B是反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些具体的实施方案中，M为S。一些具体的实施方案中，M为O。
在一些实施方案中，所述正义链包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的序列，且包含至少15个连续核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的序列，且包含至少19个连续核苷酸；在一些实施方案中，核苷酸序相差不超过1个核苷酸。
在一些实施方案中，所述反义链包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的序列，且包含至少21个连续核苷酸；在一些实施方案中，核苷酸序列相差不超过1个核苷酸；其中，W’表示2'-甲氧基修饰的核苷酸，或包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链核苷酸序列选自：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一项。
在一些实施方案中，所述反义链核苷酸序列选自：SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6任一项，其中，W’表示2'-甲氧基修饰的核苷酸，或包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸。
一些实施方案中，式(I)选自：
其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些实施方案中，B是反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些实施方案中，式(I)选自：
其中：M为O或S；其中：B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；在一些具体的实施方案中，B是反义链在其5’区域的第7位中对应位置的碱基。
一些具体的实施方案中，M为S。一些具体的实施方案中，M为O。
一些具体的实施方案中，正义链包含SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:43任一项所示的核苷酸序列。
一些具体的实施方案中，反义链包含SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:52任一项所示的核苷酸序列。
一些具体的实施方案中，正义链选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:43任一项所示的核苷酸序列；
一些具体的实施方案中，反义链选自SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:52任一项所示的核苷酸序列。
一些具体的实施方案中，本公开所述的siRNA包含或选自以下任一项：
组1)，SEQ ID NO：42所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
组2)，SEQ ID NO：43所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
组3)，SEQ ID NO：42所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
组4)，SEQ ID NO：43所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
组5)，SEQ ID NO：39所示的正义链和SEQ ID NO：44所示的反义链；
组6)，SEQ ID NO：40所示的正义链和SEQ ID NO：45所示的反义链；
组7)，SEQ ID NO：39所示的正义链和SEQ ID NO：46所示的反义链；
组8)，SEQ ID NO：40所示的正义链和SEQ ID NO：47所示的反义链；
组9)，SEQ ID NO：41所示的正义链和SEQ ID NO：48所示的反义链。
一些具体的实施方案中，本公开所述的siRNA选自以下任一项：
有义链包含自SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列。
一些具体的实施方案中，本公开所述的siRNA选自以下任一项：
有义链是SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:47所 示的核苷酸序列；
有义链是SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列，并且反义链是SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列。
本公开中，按照5’-3’方向，
SEQ ID NO:39是
GmsCmsUmCmCfUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmAm；
SEQ ID NO:40是
AmsCmsAmCmCfAmCfAfUfCmAmAmCmAmUmAmAmUmAm；
SEQ ID NO:41是
AmsCmsAmCmCmAmCfAfUfCmAmAmCmAmUmAmAmUmsAm；
SEQ ID NO:42是
GmsCmsUmCmCmUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmsAm；
SEQ ID NO:43是
GmsCmsUmCmCmUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmAm；
SEQ ID NO:44是
UmsCfsGmUfAmUfAmAmCfAmAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUmsGm；
SEQ ID NO:45是
UmsAfsUmUfAmUfGmUmUfGmAmUfGmUfGmGfUmGfUmsCmsAm；
SEQ ID NO:46是
UmsCfsGmUfAmUfAmAfCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUfsGm；
SEQ ID NO:47是
UmsAfsUmUfAmUfGmUfUmGfAmUfGmUfGmGfUmGfUmsCfsAm；
SEQ ID NO:48是
UmsAfsUmUfAmUfGmUmUmGfAmUfGmUfGmGfUmGfUmsCmsAm；
SEQ ID NO:49是
UmsCfsGmUfAmUf(-)hmpNA(A)AmCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUmsGm；
SEQ ID NO:50是
UmsCfsGmUfAmUfAmAmCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUmsGm；
其中，其中，Af＝腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf＝胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Uf＝尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；Gf＝鸟嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Am＝腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm＝胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；Gm＝鸟嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；Um＝尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；
s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸二酯基连接；
(-)hmpNA(A)表示
本公开还提供了一种siRNA缀合物，其包含上述siRNA中的任意一种和连接至所述siRNA的靶向配体。
在一些实施方案中，siRNA和所述靶向配体共价或非共价连接。
一些实施方案中，所述靶向配体靶向肝脏；一些实施方案中，所述靶向配体结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)；一些实施方案中，所述靶向配体包括半乳糖簇或半乳糖衍生物簇，所述半乳糖衍生物选自N-乙酰基-半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺或N-异丁酰基半乳糖胺。
在一些实施方案中，所述靶向配体连接至所述siRNA的正义链3’末端。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或膦酸基团与siRNA末端连接；一些实施方案中，通过磷酸二酯基团与siRNA末端连接。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或膦酸基团与siRNA末端间接连接；一些实施方案中，通过磷酸二酯基团与siRNA末端间接连接。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或膦酸基团与siRNA末端直接连接；一些实施方案中，通过磷酸二酯基团与siRNA末端直接连接。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA正义链末端直接连接；一些实施方案中，通过磷酸二酯基团与siRNA正义链末端连接。
在一些实施方案中，靶向配体通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA正义链3’末端直接连接；一些实施方案中，通过磷酸二酯基团与siRNA正义链3’末端直接连接。
在一些实施方案中，为了促进siRNA进入细胞，可以在siRNA正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团，亲脂性的基团包括以共价键与小干扰核酸结合，如末端引入胆固醇、脂蛋白、维生素E等，以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。同时，siRNA也可以进行非共价键修饰，如通过疏水键或离子键结合磷脂分子、多肽、阳离子聚合物等增加稳定性和生物学活性。
在一些具体的实施方式中，靶向配体选自以下结构或其药学上可接受的盐：
T为靶向部分。
在一些具体的实施方式中，靶向配体选自以下结构或其药学上可接受的盐构：
T为靶向部分。
在一些具体的实施方式中，靶向配体具有以下结构：
T为靶向部分。
在一些具体的实施方式中，靶向配体选自以下结构或其药学上可接受的盐：
T为靶向部分。
一些实施方案中，靶向配体的靶向部分是由一个或多个靶向基团或靶向部分组成，靶向配体协助引导将与其连接的治疗性试剂递送至所需靶位置。在一些情况中，靶向部分可以结合细胞或细胞受体，并且启动内吞作用以促进治疗性试剂进入细胞。靶向部分可以包括对细胞受体或细胞表面分子或抗体具有亲和性的化合物。含有靶向部分的各种靶向配体可以与治疗性试剂和其它化合物连接以将试剂靶向细胞和特定细胞受体。
一些实施方案中，靶向部分的类型包括碳水化合物、胆固醇和胆甾醇基团或类固醇。可以结合细胞受体的靶向部分包括糖类，诸如半乳糖、半乳糖衍生物(如N-乙酰基-半乳糖胺，N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、甘露糖和甘露糖衍生物)。
已知结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的靶向部分可特别用于引导递送寡聚化合物至肝脏。脱唾液酸糖蛋白受体在肝脏细胞(肝细胞)上大量表达。靶向ASCPR的细胞受体靶向部分包括半乳糖和半乳糖衍生物。具体而言，半乳糖衍生物的簇，包括由2、3、4或超过4个N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)组成的簇可以促进肝细胞中某些化合物的摄取。偶联寡聚化合物的GalNAc簇用于引导组合物至肝脏，在这里N-乙酰基-半乳糖胺糖能够结合肝脏细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体。脱唾液酸糖蛋白受体的结合被认为将启动受体介导的内吞作用，从而促进化合物进入细胞内部。
一些实施方案中，靶向配体可以包括2、3、4或超过4个靶向部分。在一些实施方式中，本文所公开的靶向配体可以包括1、2、3、4或超过4个通过L 2连接至分支基团的靶向部分。
在一些实施方式中，各靶向部分包括半乳糖胺衍生物，其为N-乙酰基-半乳糖胺。可用作靶向部分且对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的其他糖可选自半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基-半乳糖胺等。
在一些实施方式中，本公开中的靶向配体包括N-乙酰半乳糖胺做为靶向部分，
在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(诸如N-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对唾液酸糖蛋白受体均具有亲和性。在一些实施方式中，靶向配体包括三个末端N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作为靶向部分。
在一些实施方式中，靶向配体包括四个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(诸如N-乙酰基-半乳糖胺)，其各自对脱唾液酸糖蛋白受体均具有亲和性。在一些实施方式中，靶向配体包括四个末端N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作为靶向部分。
当述及三个末端N-乙酰基-半乳糖胺时本领域常用的术语包括三触角(tri-antennary)、三价物(tri-valent)和三聚体。
当述及四个末端N-乙酰基-半乳糖胺时本领域常用的术语包括四触角(tetra-antennary)、四价物(tetra-valent)和四聚体。
一些具体实施方案中，本公开提供的靶向配体选自以下结构或其药学上可接受的盐，
一些具体实施方案中，本公开提供的靶向配体选自以下结构或其药学上可接受的盐，
在一些实施方案中，可以用N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺或N-异丁酰基半乳糖胺替换以上靶向配体中的N-乙酰基-半乳糖胺部分。
在一些具体的实施方案中，siRNA缀合物正义链包含：SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:57任一项。
在一些具体的实施方案中，siRNA缀合物反义链包含：SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:60任一项。
在一些具体的实施方案中，siRNA缀合物包含或选自以下任一组：
组1)，SEQ ID NO：56所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
组2)，SEQ ID NO：57所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
组3)，SEQ ID NO：56所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
组4)，SEQ ID NO：57所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
组5)，SEQ ID NO：53所示的正义链和SEQ ID NO：46所示的反义链；
组6)，SEQ ID NO：54所示的正义链和SEQ ID NO：47所示的反义链；
组7)，SEQ ID NO：55所示的正义链和SEQ ID NO：48所示的反义链。
一些具体的实施方案中，本公开所述的siRNA选自以下任一项：
有义链包含自SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列。
一些具体的实施方案中，本公开所述的siRNA选自以下任一项：
有义链包含自SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
有义链包含SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，并且反义链包含SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列。
本公开中，按照5’-3’方向，
SEQ ID NO:53是
GmsCmsUmCmCfUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmAm-NAG0052’；
SEQ ID NO:54是
AmsCmsAmCmCfAmCfAfUfCmAmAmCmAmUmAmAmUmAm-NAG0052’；
SEQ ID NO:55是
AmsCmsAmCmCmAmCfAfUfCmAmAmCmAmUmAmAmUmsAm-NAG0052’；
SEQ ID NO:56是
GmsCmsUmCmCmUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmsAm-NAG0052’；
SEQ ID NO:57是
GmsCmsUmCmCmUmUfAfUfUmGmUmUmAmUmAmCmGmAm-NAG0052’；
SEQ ID NO:46是
UmsCfsGmUfAmUfAmAfCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUfsGm；
SEQ ID NO:47是
UmsAfsUmUfAmUfGmUfUmGfAmUfGmUfGmGfUmGfUmsCfsAm；
SEQ ID NO:48是
UmsAfsUmUfAmUfGmUmUmGfAmUfGmUfGmGfUmGfUmsCmsAm；
SEQ ID NO:49是
UmsCfsGmUfAmUf(-)hmpNA(A)AmCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUmsGm；
SEQ ID NO:50是
UmsCfsGmUfAmUfAmAmCmAfAmUfAmAfGmGfAmGfCmsUmsGm；
其中，其中，Af＝腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf＝胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Uf＝尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；Gf＝鸟嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Am＝腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm＝胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；Gm＝鸟嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；Um＝尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；
s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸二酯基连接；
(-)hmpNA(A)表示 NAG0052’表示
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物其为如下结构或其药学上可接受的盐：
其中，
Af＝腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；
Cf＝胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；
Uf＝尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；
Gf＝鸟嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；
Am＝腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；
Cm＝胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；
Gm＝鸟嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；
Um＝尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)。
表示硫代磷酸酯基， 表示磷酸二酯基，
NAG0052’表示
(-)hmpNA(A)表示
在一些实施方案中，所述药学上可接受的盐可为本领域常规的盐，包括但不 限于：钠盐、钾盐、铵盐、胺盐等。
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100396、TJR100436、TJR100397、TJR100437、TJR100391、TJR100392、TJR100395。
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100396，其为如下结构：
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100436，其为如下结构：
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100397，其为如下结构：
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100437，其为如下结构：
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物选自TJR100395，其为如下结构：
Af＝腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；
Cf＝胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；
Uf＝尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；
Gf＝鸟嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；
Am＝腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；
Cm＝胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；
Gm＝鸟嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；
Um＝尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)。
表示硫代磷酸酯基， 表示磷酸二酯基，
NAG0052’表示
(-)hmpNA(A)表示
本公开另一方面提供一种组合物，其包含权利要求上述缀合物，和一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如载剂、运载体、稀释剂、和/或递送聚合物。
本公开中，各种递药系统是已知的并且可以用于本公开siRNA或siRNA缀合物，例如封装在脂质体中、微粒、微囊、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的细胞内吞作用、构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分。
本公开另一方面提供一种上述缀合物或含有缀合物的组合物在制备治疗受试者疾病的药物中的用途，在一些实施方案中选自肝源性疾病。
本公开另一方面提供一种治疗受试者疾病的法，包括向受试者给予上述缀合物，或组合物。
本公开另一方面提供一种抑制受试者体内mRNA表达的方法，该方法包括给予受试者上述缀合物，或组合物。
本公开另一方面提供一种体内递送表达抑制性寡聚化合物至肝脏的方法，给与受试者上述缀合物，或组合物。
本文所公开的缀合物、组合物和方法可以在细胞、细胞群、细胞群、组织或对象中降低靶mRNA的水平，包括：向对象给予治疗有效量的本文所述的表达抑制性寡聚合物，所述表达抑制性寡聚合物与靶向配体连接，从而抑制靶mRNA在 对象中的表达。
在一些实施方式中，所述对象已在先前被鉴定为在靶向的细胞或组织中具有靶基因的病原性上调。
本公开中所述的受试者是指患有将会受益于靶mRNA表达之减少或抑制的疾病或病症的对象。
递送可以是通过局部给药(例如，直接注射、植入、或局部给予)，全身给药，或皮下，静脉内，腹膜内，或胃肠外途径，包括颅内(例如，心室内，实质内和鞘内)，肌肉内，透皮，气道(气溶胶)，鼻，口服，直肠，或局部(包括口颊和舌下)给药。
可选的实施方案中，本公开提供的药物组合物可以通过注射给予，例如，静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射。
可选的实施方案中，当靶向配体与表达抑制性聚化合物连接成缀合物后，所述缀合物可被包装在试剂盒中。
本公开还提供了一种药物组合物，其包含本公开的siRNA或siRNA缀合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物中还可以包含药学上可接受的辅料和/或佐剂，该辅料可以为一种或多种本领域常规采用的各种制剂或化合物。例如，所述药学上可接受的辅料可以包括pH缓冲剂、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
在一些实施方案中，上述siRNA、siRNA缀合物或药物组合物当接触到表达靶基因的细胞时，由例如：psiCHECK活性筛选和荧光素酶报告基因检测法，其他如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，例如Western Blot或流式细胞术测定的，上述siRNA缀合物或药物组合物会抑制靶基因的表达至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。
在一些实施方案中，上述siRNA、siRNA缀合物或药物组合物当接触到表达靶基因的细胞时，由例如：psiCHECK活性筛选和荧光素酶报告基因检测法，其他如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，例如Western Blot或流式细胞术测定的，上述siRNA缀合物或药物组合物引起的靶基因mRNA剩余表达百分比为不高于99％、不高于95％、不高于90％、不高于85％、不高于80％、不高于75％、不高于70％、不高于65％、不高于60％、不高于55％、不高于50％、不高于45％、不高于40％、不高于35％、不高于30％、不高于25％、不高于20％、不高于15％、或不高于10％。
在一些实施方案中，上述siRNA、siRNA缀合物或药物组合物当接触到表达 靶基因的细胞时，由例如：psiCHECK活性筛选和荧光素酶报告基因检测法，其他如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，例如Western Blot、或流式细胞术测定的，siRNA缀合物在保持在靶活性的同时，将脱靶活性减少了至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
在一些实施方案中，上述siRNA、siRNA缀合物或药物组合物当接触到表达靶基因的细胞时，由例如：psiCHECK活性筛选和荧光素酶报告基因检测法，其他如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，例如Western Blot、或流式细胞术测定的，siRNA缀合物使在靶活性降低至多20％、至多19％、至多15％、至多10％、至多5％或超过1％的同时，将脱靶活性减少了至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
在一些实施方案中，上述siRNA、siRNA缀合物或药物组合物当接触到表达靶基因的细胞时，由例如：psiCHECK活性筛选和荧光素酶报告基因检测法，其他如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，例如Western Blot、或流式细胞术测定的，siRNA缀合物使在靶活性提高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％的同时，将脱靶活性减少了至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
本公开还提供了一种细胞，其包含本公开的siRNA或siRNA缀合物。
本公开还提供了一种试剂盒，其包含本公开的siRNA或siRNA缀合物。
本公开还提供了一种用于沉默细胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，该方法包括将根据本公开的siRNA、siRNA缀合物和/或药物组合物引入该细胞中的步骤。
本公开还提供了一种用于在体内或在体外沉默细胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，该方法包括将根据本公开的siRNA、siRNA缀合物和/或药物组合物引入该细胞中的步骤。
本公开还提供了一种用于抑制靶基因或靶基因的mRNA表达的方法，该方法包括向有其需要的受试者施用有效量或有效剂量的根据本公开的siRNA、siRNA缀合物和/或药物组合物。
在一些实施方案中，施用通过包括肌肉内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、静脉内、皮下、脑脊髓、或其组合的给药方式进行。
在一些实施方案中，siRNA、siRNA缀合物和/或药物组合物的有效量或有效剂量为约0.001mg/kg体重至约200mg/kg体重、约0.01mg/kg体重至约100mg/kg 体重或约0.5mg/kg体重至约50mg/kg体重。
在一些实施方案中，靶基因是LPA。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物，用于治疗和/或预防受试者与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病，相关联的任何其他病症、病理或综合征；在一些实施方案中，所述与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，所述心血管疾病选自
缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物，用于治疗和/或预防疾病，所述疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，所述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物，用于降低脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于抑制LPA的表达的药物中的用途。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防受试者与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病；在一些实施方案中，所述与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，所述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，所述疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于降低降低载脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平的药物中的用途。
本公开提供了一种抑制LPA表达的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
本公开提供了一种治疗和/或预防受试者与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物；在一些实施方案中，所述与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，所述心血管疾病选自 缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物，所述疾病选自心血管疾病；在一些实施方案中，所述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
本公开提供了一种用于降低脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
本公开提供了一种体内递送抑制LPA表达和/或复制的siRNA至肝脏的方法，给与受试者前述siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
本公开还提供了一种siRNA或siRNA缀合物，其特征在于以碱基T，替换本公开任一siRNA或siRNA缀合物的一个或多个碱基U，例如1个、2个、3个、3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。
本公开中所述化合物可药用盐选自无机盐或有机盐，本公开所述化合物可与酸性或碱性物质反应成相应盐。
另一方面，在不指明构型的情况下，本公开化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本公开设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本公开的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本公开的范围之内。
另外，在不指明构型的情况下，本公开的化合物和中间体还可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含于本公开的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指可经由低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移的互变，如酮-烯醇及亚胺-烯胺、内酰胺-内酰亚胺异构化。内酰胺-内酰亚胺平衡实例是在如下所示的A和B之间。
本公开中的所有化合物可以被画成A型或B型。所有的互变异构形式在本公开的范围内。化合物的命名不排除任何互变异构体。
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本公开某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本公开还包括一些与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本公开化合物。可结合到本公开化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为 2H、 3H、 11C、 13C、 14C、 13N、 15N、 15O、 17O、 18O、 31P、 32P、 35S、 18F、 123I、 125I和 36Cl等。
除另有说明，当一个位置被特别地指定为氘(D)时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即，至少10％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘、至少2000倍的丰度的氘、至少3000倍的丰度的氘、至少4000倍的丰度的氘、至少5000倍的丰度的氘、至少6000倍的丰度的氘或更高丰度的氘。本公开还包括各种氘化形式的式I和式II的化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式I和式II化合物。在制备氘代形式的式I和式II化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
在不指明构型的情况下，本公开所述化合物的化学结构中，键 表示未指定构型，即如果化学结构中存在手性异构体，键 可以为 或者同时包含 两种构型。虽然为简便起见将全部上述结构式画成某些异构体形式，但是本公开可以包括所有的异构体，如互变异构体、旋转异构体、几何异构体、非对映异构体、外消旋体和对映异构体。本公开所述化合物的化学结构中，键 并未指定构型，即键 的构型可以为E型或Z型，或者同时包含E和Z两种构型。
术语解释
为了更容易理解本公开，以下具体定义了一些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
如无特别说明，在本公开上下文中，术语“载脂蛋白(a)基因”、Apo(a)基因、LPA在本公开中可互换使用。LPA包括但不限于人类LPA、食蟹猴LPA、小鼠LPA、大鼠LPA，其氨基酸和完整编码序列、mRNA序列容易利用已公开的数据库取得，例如，GenBank、UniProt、OMIM和猕猴(Macaca)基因组计划网站。
术语“靶序列”指在LPA转录期间所形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为主要转录产物的RNA加工产物的mRNA。所述靶序列中被靶向的部分应当足够长，才能作为iRNA指导的切割(iRNA-directed cleavage)的底物。在一个实施方式中，该靶序列在LPA的蛋白质编码区内。
如本文所使用的，在RNA介导的基因沉默的情形中，正义链(又称SS、SS链或有义链)是指包含与靶mRNA序列相同或基本上相同的序列的链；反义链(又称AS或AS链)是指具有与靶mRNA序列互补的序列的链。
在描述本文所述的siRNA正义链的上下文中，术语“与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2任一的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸序列，且包含至少15个连续核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA正义链包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中任一正义链的至少15个连续核苷酸，或与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中任一正义链的至少15个连续核苷酸相差不超过3个核苷酸序列(任选地，相差不超过2个核苷酸序列；任选地，相差1个核苷酸序列)。任选地，本文所述的siRNA正义链包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2任一正义链的至少16个连续核苷酸，或与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2任一正义链的至少16个连续核苷酸相差不超过3个核苷酸序列(任选地，相差不超过2个核苷酸序列，任选地，相差1个核苷酸序列)。
在描述本文所述的siRNA反义链的上下文中，术语“与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4任一反义链相差不超过3个核苷酸序列，且包含至少15个连续核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA反义链包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中任一反义链的至少15个连续核苷酸，或与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中任一反义链的至少15个连续核苷酸相差不超过3个核苷酸序列(任选地，相差不超过2个核苷酸序列，任选地，相差1个核苷酸序列)。
本公开中，正义链或反义链的“5’区域”也即“5’端”、“5’末端”，可替换使用。例如反义链5’区域的第2位至第8位的核苷酸，也可替换为反义链5’端的第2位至第8位的核苷酸。同理，正义链或反义链的“3’区域”、“3’末端”和“3’端”也可替换使用。
如无特别说明，本公开上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”与“U”分别代表核苷酸，其分别包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷与尿嘧啶的碱基。小写字母d表示该 字母d下游相邻的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；小写字母m表示该字母m上游相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f上游相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
如本公开所使用的，术语“2'-氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非2'-氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。
如本公开所使用的，术语“2'-甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
如本文所使用的，术语“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(或者在RNA中为尿嘧啶)相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤始终与嘧啶碱基胞嘧啶相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
如本文所使用的，术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。抑制可通过这些变量中的一个或多个与对照水平相比的绝对或相对水平的减少来评估。该对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。例如，可以采用mRNA剩余表达量来表征siRNA对靶基因表达的抑制程度，如mRNA剩余表达量为不高于99％、不高于95％、不高于90％、不高于85％、不高于80％、不高于75％、不高于70％、不高于65％、不高于60％、不高于55％、不高于50％、不高于45％、不高于40％、不高于35％、不高于30％、不高于25％、不高于20％、不高于15％、或不高于10％。靶基因表达的抑制率可以采用 Luciferase Assay System检测，分别读取萤火虫化学发光值(Fir)和海肾化学发光值(Ren)，计算相对值Ratio＝Ren/Fir；本公开中，剩余mRNA表达量比例(或剩余活性％)＝Ratio(siRNA处理组)/Ratio(无siRNA对照组)，抑制率(％)＝100％-剩余mRNA表达量(％)。
如无特殊说明，本公开的“化合物”、“配体”、“核酸配体缀合物”、“siRNA缀合物”、“核酸”、“缀合物”、化学修饰”、“靶向配体”、“dsRNA”、“RNAi”均可独立地以盐、混合盐或非盐(例如游离酸或游离碱)的形式存在。当以盐或混合盐的形式存在时，其可为药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐，优选钠盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
“有效量”或“有效剂量”指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶基因、靶mRNA或靶蛋白相关病症的发病率或改善所述病症的一个或更多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶基因、靶mRNA或靶蛋白相关病症的进展。
如本文所使用的，“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用，包括人类或者非人类动物，例如哺乳动物，例如人或猴。
本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领 域技术人员所熟知的。
术语“化学修饰”或“修饰”包括核苷酸经化学手段的所有改变，例如化学部分的添加或去除、或以一个化学部分取代另一个化学部分。
术语“碱基”包含任何已知的DNA和RNA碱基、碱基类似物，例如嘌呤或嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黄苷和天然类似物。
术语“平端”或“平末端”可互换使用，是指在siRNA的给定的末端没有非配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出。大多数情况下，两个末端都是平末端的siRNA将在其整个长度范围内是双链的。
术语“约”、“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测(即测量体系的限度)。例如，“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围，例如1％至15％之间、在1％至10％之间、在1％至5％之间、在0.5％至5％之间、在0.5％至1％之间变化。本公开中，数字或数值范围之前有术语“约”的每种情况也包括给定数的实施方案。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
除另有说明，“任选地”、“任选”、“可选的”或“可选”是指意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如“任选地，R 1和R 2直接相连成环”是指R 1和R 2直接相连成环可以发生但不必须存在，该说明包括R 1和R 2直接相连成环的情形和R 1和R 2不成环的情形。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列时，也旨在涵盖由该具体序列组成的情形。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团。在一些实施方案中选自含有1至12个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4- 乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。在一些实施方案中选自的是含有1至6个碳原子的烷基，非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基在一些实施方案中选自一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基在一些实施方案中选自一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。同理，“炔氧基”、“烯氧基”、“环烷氧基”、“杂环烷氧基”、“环烯氧基”的定义如上述“烷氧基”定义。
术语“烯基”指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少一个碳-碳双键，并且具有2-10个碳原子。在这样的基团中可以存在多达5个碳-碳双键。例如，“C 2-C 6”烯基被定义为具有2-6个碳原子的烯基。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。烯基的直链、支链或环状部分可以含有双键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
术语“环烯基”表示具有特定数量的碳原子和至少一个碳-碳双键的单环烃基。
术语“炔基”指直链或支链的烃基，其含有2-10个碳原子并且含有至少一个碳-碳三键。可以存在多达5个碳-碳三键。因此，“C 2-C 6炔基”表示具有2-6个碳原子的烯基。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、2-丙炔基和2-丁炔基。炔基的直链、支链部分可以含有正常化合价所允许的三键，并且在正常化合价所允许的任何位置任选地被单-、二-、三-、四-或五-取代。
术语“酮”指代本文所述通过羰基桥连接的任何烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基或芳基。酮基的示例包括但不限于：烷酰基(例如，乙酰 基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基)，烯酰基(例如，丙烯酰基)，炔酰基(例如，乙炔酰基，丙炔酰基，丁炔酰基，戊炔酰基，己炔酰基)，芳酰基(例如，苯甲酰基)，杂芳酰基(例如，吡咯酰基，咪唑酰基，喹啉酰基，吡啶酰基)。
术语“烷氧基羰基”指通过羰基桥连接的上述定义的任何烷氧基(即，-C(O)O-烷基)。烷氧基羰基的示例包括但不限于：甲氧基羰基，乙氧基羰基，异丙氧基羰基，正丙氧基羰基，叔丁氧基羰基，苄氧基羰基或正戊氧基羰基。
术语“芳氧基羰基”指通过氧羰基桥连接的上述定义的任何芳基(即，-C(O)O-芳基)。芳氧基羰基的例子包括但不限于：苯氧基羰基和萘氧基羰基。
术语“杂芳氧基羰基”指通过氧基羰基桥连接的上述定义的任何杂芳基(即，-C(O)O-杂芳基)。杂芳基氧基羰基的示例包括但不限于：2-吡啶氧基羰基，2-噁唑基氧基羰基，4-噻唑基氧基羰基或嘧啶基氧基羰基。
术语“环烷基”或“碳环”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子。在一些实施方案中选自包含3至7个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基等。多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。环烷基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代。在一些实施方案中选自一个或多个以下基团，独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
所述环烷基环可以稠合于芳基或杂芳基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基在一些实施方案中选自一个或多个以下基团，其独立地选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基，所述C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯氧基、C 2-6炔氧基、C 3-6环烷氧基、3至6元杂环烷氧基、C 3-8环烯氧基、5至6元芳基或杂芳基任选被一个或多个选自卤素、氘、羟基、氧代、硝基、氰基所取代。
术语“杂环烷基”或“杂环”或“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O) m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。在一些实施方案中选自包含3至12个环原子，其中1至4个是杂原子。在一些实施方案中选自包含3至7个环原子。单环杂环烷基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二 氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环烷基包括螺环、稠环和桥环的杂环烷基。“杂环烷基”非限制性实例包括：
等等。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“卤代烷基”指被卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
术语“氰基”指-CN。
术语“硝基”指-NO 2。
术语“氧代”指＝O基团，例如，碳原子与氧原子通过双键连接，其中形成酮或醛基。
术语“氨基”指-NH 2。
术语“羧基”指-C(O)OH。
术语“醛基”指-CHO。
在本公开的化学结构式中， 其可以根据本文所述发明范围连接一个或多个任何基团；星号“*”表示手性中心。
本公开中，如无特别说明“磷酸酯基”为磷酸二酯基。
本公开中，硫代磷酸酯基是指一个非桥接氧原子被硫原子替代而修饰的磷酸二酯基，可用 (M为S原子)互换使用。
本公开上下文中，基团 中的 可以替换为能够与相邻核苷酸实现连接的任意基团。
术语“连接”，当表示两个分子之间的联系时，指两个分子通过共价键连接或者两个分子经由非共价键(例如，氢键或离子键)关联，包括直接连接、间接连接。
术语“直接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团在没有任何间插原子或原子基团的情况下连接。
术语“间接连接”指第一化合物或基团与第二化合物或基团通过中间基团、化合物或分子(例如，连接基团)连接。
术语“取代的”表示指定原子(通常是碳、氧和氮原子)上的任何一个或多个氢原子被本文所限定的任何基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物。取代基的非限制性示例包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素(例如，F、Cl、Br、I)。当取代基是酮或氧代(即，＝O)时，则原子上有两个(2个)氢被替代。
“被一个或多个……取代”是指可以被单个或多个取代基取代。当被多个取代基取代时，可以是复数个相同取代基，也可以是一个或复数个不同取代基的组合。
本公开中的一些缩略语定义如下：
DCE：二氯乙烷；
Sc(OTf) 3：三氟甲烷磺酸钪；
TFH：四氢呋喃；
Pd/C：钯-碳；
TFA：三氟乙酸；
DMF：二甲基甲酰胺；
DIPEA：N-乙基二异丙基胺；
HoBt：1-羟基苯并三唑；
EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；
DMTrCl：4,4'-双甲氧基三苯甲基氯；
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
LiOH：氢氧化锂；
DMAP：4-二甲氨基吡啶；
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；
DMTrCl:1-[氯(4-甲氧基苯基)苄基]-4-甲氧基苯
CF 3SO 3H：三氟甲磺酸；
BnBr：溴化苄；
DEPBT：3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮；
Bz：苯甲酰基保护基；
MMTr：甲氧基苯基二苯甲基；
DMTr：二甲氧三苯甲基保护基。
附图说明
图1为TRD002218和TRD007205在给药后第7天TTR中mRNA的表达量。
图2为TRD002218和TRD007205在给药后第28天TTR中mRNA的表达量。
具体实施方式：
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
第一部分.防脱靶修饰
实施例1.化学修饰的制备
1.1合成化合物1-1a和化合物1-1b
将化合物1(500mg,3.42mmol)和三乙胺(Et 3N，692mg,6.84mmol,0.95mL)溶于二氯甲烷(DCM，10mL)中，冰浴下滴加4-甲苯磺酰氯(tsCl,717mg,3.76mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，滴加完毕后反应在室温下搅拌过夜，待反应完毕后，用水淬灭，水相用二氯甲烷(15mL)提取三次，合并的有机相先用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)洗涤，再用饱和食盐水(20mL)洗涤，随后减压蒸干溶剂得到粗品2(820mg,80％)，直接用于下一步反应。MS m/z：C 14H 21O 5S，[M+H] +理论：301.10实测：301.2。
将化合物3(239mg,1.22mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF，10mL)中，冰浴下加入NaH(60％溶解在矿物油中,93mg,2.33mmol)溶液，该反应下搅拌30分钟，然后滴加化合物2(350mg,1.16mmol)，滴加完毕后反应在60℃下搅拌5小时，反应完毕后，加水淬灭，水相用乙酸乙酯(15mL)提取三次，合并的有机相先用水(10mL)洗涤三次，再用饱和食盐水(10mL)洗涤，随后减压蒸干溶剂，经反相制备HPLC(C 18，条件：5-50％(A:H 2O，B：CH 3CN),流速：70mL/min)，冻干后得到220mg化合物4。MS m/z：C 19H 21N 5O 3Na，[M+Na] +理论：390.16，实测：390.3。
室温下将化合物4(1.50g,4.08mmol)溶解于20mL的醋酸和水(4:1)的混合溶液中，60℃下搅拌30分钟，待反应完毕后减压蒸干溶剂，经反相制备HPLC(C 18，条件：5-25％(A:H 2O，B：CH 3CN),流速：70mL/min)，冻干后得到1.10g化合物5。MS m/z：C 16H 18N 5O 3，[M+H] +理论：328.13，实测：328.4。
将化合物5(1.00g,3.05mmol)溶于吡啶(Py，10mL)中，冰浴下滴4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl,1.50g,4.58mmol)的吡啶(5mL)溶液，滴加完毕后反应在室温下搅拌过夜，待反应完毕后，用水淬灭，减压蒸干溶剂，经反相制备HPLC(C 18，条件：5-80％(A:H 2O，B：CH 3CN),流速：70mL/min)，冻干后得到1.00g化合 物6。MS m/z：C 37H 36N 5O 5，[M-H] +理论：630.26，实测：630.5。消旋体化合物6经手性柱(Daicel IE 250*4.6mm,5μm，A：正己烷，B：乙醇)拆分得410mg 6A(-)和435mg 6B(+)。
将化合物6A(-)(200mg,0.32mmol)，四氮唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子筛(500mg)溶于10mL的乙腈中，室温下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室温下搅拌过夜。反应完毕后，将分子筛过滤掉，加入二氯甲烷(30mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)洗涤三次，再用饱和食盐水(20mL)洗涤，滤液旋干并经反相制备HPLC(C 18，条件：5-100％(A：水，B：CH 3CN),流速：70mL/min)，冻干后得到200mg化合物1-1a。MS m/z：C 40H 39N 6O 7P，[M-二异丙基+OH] +理论：747.26，实测：747.6。1H NMR(400MHz,乙腈-d 3)δ7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。
将化合物6B(+)(200mg,0.32mmol)，四氮唑(11mg,0.16mmol)，N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)，3A分子筛(500mg)溶于10mL的乙腈中，室温下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室温下搅拌过夜。反应完毕后，将分子筛过滤掉，加入二氯甲烷(30mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)洗涤三次，再用饱和食盐水(20mL)洗涤，滤液旋干并经反相制备HPLC(C 18，条件：5-100％(A：水，B：CH 3CN),流速：70mL/min)，冻干后得到200mg化合物1-1b。MS m/z：C 40H 39N6O 7P，[M-二异丙基+OH] +理论：747.26，实测：747.5。
1.2合成化合物1-6a
将化合物1(10g,68.404mmol),化合物2(15g,62.186mmol)和三苯基膦(32.62g,124.371mmol)溶于无水THF(30mL),于0℃下缓慢滴加DIAD(24.656mL，124.371mmol)。该反应液在25度下反应12h.LCMS显示反应完成。将该反应液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有机相干燥将滤液浓缩，得到的残留物用正向柱纯化(DCM/MeOH＝10/1)得目标产物3(20g)。
将化合物3(20g,28.585mmol)溶于醋酸(24mL,426.016mmol)和H2O(12mL)中，60℃搅拌1小时。之后将反应液旋干加入THF(12mL)和H2O(12mL)，80℃搅拌7小时。LCMS显示反应完成。将反应液加入乙酸乙酯(200mL)和水(100mL)萃取，水相加入碳酸钠固体直到水相有大量固体析出。将固体过滤，用水洗涤，将滤饼用油泵拉干，得到目标化合物5(9g)。
在氮气保护下,将化合物5(6.8g,18.581mmol)溶于吡啶(80mL)中，于0度下缓慢加入TMSCl(14.250mL,111.489mmol)，搅拌2h。之后在0度下加入异丁酰氯(2.044mL,19.511mmol)，于25度下搅拌1h.LCMS显示反应完成。用二氯甲烷(200mL)和水(200mL)萃取，有机相干燥旋干后拌样，用正向柱纯化(DCM:MeOH＝10:1)过柱，在4.8％处出峰)，得到黄色油状化合物6(12g)。
在氮气保护下,将化合物6(5.5g,12.392mmol)溶于吡啶(30mL)，加入分子筛4A 1/16(7g,12.392mmol)，然后在0℃下分批加入DMTrCl(5.04g,14.870mmol)固体，25℃反应2h.TLC(PE:EtOAc＝1:1,Rf＝0.69)显示反应已经完成。该反应液和TJN200879-040-P1合并一起处理。将反应液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有机相干燥旋干后拌样用正向柱纯化(PE:EtOAc过柱，在84％处出峰)，得到黄色油状化合物7(12g)。
将化合物7(12g,15.389mmol)溶于EtOAc(140mL)，加入湿钯碳Pd/C(7g,15.389mmol)该反应液在25度，氢气(15Psi)下反应2小时。TLC(PE:EtOAc＝0:1,Rf＝0.09)显示反应已经完成。将反应液过滤，滤饼用乙酸乙酯(30mL)冲洗三遍后，收集滤液。滤液旋干后加入50mL二氯甲烷和2mL三乙胺拌样用正向柱纯化(DCM:MeOH＝10:1过柱，在0.5％处出峰)，得到9g(黄色泡沫状固体).将所得消旋化合物SFC拆分，得到产品目标化合物7A(-)(3.9g)和目标化合物7B(+)(3.8g)。
将化合物7A(-)(3.30g,5.40mmol)，四氮唑(190mg,2.70mmol)，1-甲基咪唑(90mg,1.10mmol)，3A分子筛(500mg)溶于30mL的乙腈中，室温下加入化合物8(2.50g,8.10mmol)，在室温下搅拌2h。反应完毕后，将分子筛过滤掉，加入DCM(150mL)，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(30mL*3)，再用饱和食盐水(30mL)洗涤，滤液旋干并经反相制备HPLC(C18,条件：5-100％(A：水，B： CH3CN)，流速：70mL/min)，冻干后得到1-6a(2.9g,66％)。MS m/z：C43H55N7O7P[M+H]+，理论：812.38，实测：812.5。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。
1.3合成化合物1-7a
在氮气保护下，将化合物1(5g,23.1272mmol),化合物2(6.76g,46.254mmol)和三苯基磷(7.28g,27.753mmol)溶于30mL二氧六环中，于0℃缓慢滴加入DEAD(5.502mL,27.753mmol)。滴加完成后，反应缓慢升温至25℃继续反应1h.在反应液里加入100mL H2O和100mL EtOAc萃取，有机相合并干燥过滤浓缩后拌样过柱，用正向柱纯化(PE:EtOAc＝1:1过柱得目标产物(4g)。
将化合物3(3.3g)溶于HOAc(16mL)和H2O(4mL),油浴60℃加热0.5h.将反应液旋干得到的残留物用正向柱纯化(PE:EtOAc＝0:1过柱)，得到目标产物4(3g)。
将化合物4(3g,8.873mmol)溶于5mL吡啶中，在氮气保护下于0℃缓慢滴加DMTrCl(3.91g,11.535mmol)的10mL吡啶的溶液。滴加完毕后反应升温至 25℃并继续反应1h。在反应液中加入50mL水和100mL乙酸乙酯萃取。水相再用100mL乙酸乙酯萃取三次，有机相合并干燥过滤浓缩用正向柱纯化(用PE:EtOAc＝2:1)。得到目标产物5(4g)。
将化合物5(4g,5.769mmol)溶于甲醇(10mL),加入饱和的NH3甲醇溶液(40mL),0℃反应6h.将反应液旋干用正向柱纯化(用PE:EtOAc＝0:1)得消旋化合物2.4g SFC拆分，得到目标产物6A(750mg,100％纯度)和目标产物6B(400mg,99.16％纯度)。
将化合物6A(-)(700mg,1.40mmol)，四氮唑(50mg,0.70mmol)，1-甲基咪唑(23mg,0.28mmol)，3A分子筛(500mg)溶于10mL的乙腈中，室温下加入化合物7(630mg,2.10mmol)，在室温下搅拌2h。反应完毕后，将分子筛过滤掉，加入DCM(50mL)，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(10mL*3)，再用饱和食盐水(20mL)洗涤，滤液旋干并经反相制备HPLC(C18,条件：5-100％(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，冻干后得到1-7a(700mg,72％)。MS m/z：C38H47N4O7PNa[M+Na]+，理论：725.32，实测：725.5。
1.4合成化合物1-8a
将化合物1(8.5g,76.508mmol),化合物2(30.64g,91.809mmol)溶于DMF(150mL),加入CS2CO3(29.91g,91.809mmol)，反应于氮气保护下，90℃反应12h。LCMS检测反应完成。将反应液过滤，油泵旋干，正向柱分离纯化(80g,DCM/MeOH＝10/1至5/1)得到目标产物3(13.5g,80％纯度)。
将化合物3(10.5g,35.105mmol)溶于吡啶(65mL)和CH3CN(65mL)，向溶液中滴加BzCl(4.894mL,42.126mmol)，于25℃反应2h。LCMS检测大部分原料反应完成，加H2O(100mL)淬灭，EtOAc(100mL×3)萃取，干燥旋干，柱分离(合并TJN200872-101)纯化(80g,PE/EtOAc＝10/1至0/1,DCM/MeOH＝10/1)得到目标产物4(14g,90％纯度)。
将化合物4(14g,36.694mmol)溶于HOAc(56mL,314.796mmol)和H2O(14mL)，于60℃反应2h,LCMS显示反应完成。油泵浓缩，正向柱分离(40g,DCM/MeOH＝1/0至5/1)得到目标产物5(8.4g,90％纯度&2.4g,80％纯度)。
将化合物5(7.4g,21.957mmol),DMAP(0.54g,4.391mmol),分子筛4A(11.1g,2.967mmol)溶于吡啶(60mL)，冰浴下搅拌10min，然后加入DMTrCl(8.93g,26.348mmol)，反应搅拌1.8h.LCMS检测约19％原料剩余，约60％目标MS。合并(TJN200872-105&106)一起纯化。向反应液中加入H2O(50mL)，经DCM(50mL×3)萃取，干燥，旋干，柱分离(120g,PE/(EA:DCM:TEA＝1:1:0.05)＝1/0至0/1至DCM/MeOH＝10/1)得到黄色固体化合物6(11g,89％纯度,TJN200872-105&106&107),回收原料(3.0g,70％纯度)。
化合物6(15g,22.041mmol)经SFC(DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm,10um)；0.1％NH3H2O EtOH，B:45％-45％；200ml/min)分离得到目标产物6A(5.33g,94.29％纯度),目标产物6B(6.14g,97.91％纯度),化合物6回收1.0g。
将化合物6B(-)(5.4g,8.92mmol)，四氮唑(312mg,4.46mmol)，1-甲基咪唑(146mg,1.78mmol)，3A分子筛(500mg)溶于40mL的乙腈中，室温下加入化合物7(4g,13.4mmol)，在室温下搅拌2h。反应完毕后，将分子筛过滤掉，加入DCM(200mL)，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(30mL*3)，再用饱和食盐水(50mL) 洗涤，滤液旋干并经反相制备HPLC(C18,条件：5-100％(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，冻干后得到1-8a(5.8g,80％)。MS m/z：C45H51N5O7P，[M+H]+，理论：804.36，实测：804.4。
实施例2.siRNA的合成
siRNA的合成与通常的亚磷酰胺固相合成法无异，在合成AS链5’第7位修饰的核苷酸时，使用上述合成的亚磷酰胺单体替换母序列原核苷酸。合成过程简要描述如下：于Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上，以通用CPG载体为起始，根据合成程序逐个连接核苷亚磷酰胺单体。除上述描述的AS链5’第7位的核苷亚磷酰胺单体外，其余核苷单体原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等核苷亚磷酰胺单体购自上海兆维或苏州吉玛。采用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作为活化剂(0.6M乙腈溶液)，使用0.22M的PADS溶于1:1体积比的乙腈和三甲基吡啶(苏州柯乐玛)溶液作为硫化试剂，使用碘吡啶/水溶液(柯乐玛)作为氧化剂。
固相合成完成后，寡核糖核苷酸自该固体支撑物裂解，采用3:1的28％氨水和乙醇溶液在50℃条件下浸泡16小时。然后离心，将上清液转移到另一个离心管中，浓缩蒸发干后，使用C18反向色谱纯化，流动相为0.1M TEAA和乙腈，并使用3％三氟乙酸溶液脱除DMTr。目标寡核苷酸收集后冻干，并经LC-MS鉴定为目标产物，再经过UV(260nm)定量。
所得到的单链寡核苷酸，根据等摩尔比，按照互补配对，退火，最后所得到的双链siRNA溶于1×PBS中，并调整至实验所需浓度备用。
实施例3.psiCHECK活性筛选实验
siRNA样品合成见前述，质粒来源于生工生物工程(上海)股份有限公司。psiCHECK实验耗材如表1所示。
表1.psiCHECK实验耗材和试剂
实验步骤：细胞铺板、细胞转染，其中，转染复合物具体配制量如表2所示。
表2. 96孔板每孔所需转染复合物用量
注：Lipo：0.2μL/孔；质粒：0.05μL/孔；Opti-MEM：10μL/孔。
依照表3，根据不同的实验需求稀释至不同浓度作为工作液备用，现用现配。转染24h后，按照 Luciferase Assay System检测试剂盒的实验操作方案进行检测。
计算相对值Ratio＝Ren/Fir(海肾/萤火虫比值)；
计算抑制率1-(Ratio+siRNA/仅报告基因)*100％＝抑制率(％)；
本公开中，剩余活性％(也称为mRNA剩余表达量％或mRNA剩余表达比例)＝100％-抑制率(％)。
表3.多浓度的稀释方案
终浓度(nM) 加水与样品
/ /
40 4μL siRNA(20μM)+96μL H 2O
13.33333333 30μL siRNA+60μL H 2O
4.444444444 30μL siRNA+60μL H 2O
1.481481481 30μL siRNA+60μL H 2O
0.49382716 30μL siRNA+60μL H 2O
0.164609053 30μL siRNA+60μL H 2O
0.054869684 30μL siRNA+60μL H 2O
0.018289895 30μL siRNA+60μL H 2O
0.006096632 30μL siRNA+60μL H 2O
0.002032211 30μL siRNA+60μL H 2O
0.000677404 30μL siRNA+60μL H 2O
实施例4.化学修饰的表征
利用实施例1的化合物、采用实施例2的方法合成siRNA，并通过实施例3的方法验证各siRNA的在靶活性和脱靶活性，其中各siRNA采用相同的正义链，且反义链5’端第7位分别为以下修饰核苷酸/化学修饰，
其中：我们将由2-羟甲基-1,3-丙二醇为起始原料合成的核苷酸定义hmpNA；
(+)hmpNA(A)为实施例1.1节中核苷亚磷酰胺单体1-1b通过固相合成获得，绝对构型为(S)-hmpNA(A)；
(-)hmpNA(A)为实施例1.1节中核苷亚磷酰胺单体1-1a通过固相合成获得，绝对构型为(R)-hmpNA(A)。
类似的，替换hmpNA的碱基种类，通过固相合成获得以下结构并确认绝对构型：
(+)hmpNA(G)，绝对构型为(S)-hmpNA(G)；
(-)hmpNA(G)，绝对构型为(R)-hmpNA(G)；
(+)hmpNA(C)，绝对构型为(S)-hmpNA(C)；
(-)hmpNA(C)，绝对构型为(R)-hmpNA(C)；
(+)hmpNA(U)，绝对构型为(R)-hmpNA(U)；
(-)hmpNA(U)，绝对构型为(S)-hmpNA(U)。
(S)-hmpNA(G)，(R)-hmpNA(G)，(S)-hmpNA(C)，(R)-hmpNA(C)，(S)-hmpNA(U)和(R)-hmpNA(U)的绝对构型由其中间体或衍生物经X-Ray衍射而确认。
中间体或衍生物的结构为：
TJ-NA067:检测晶体为无色块状(0.30×0.10×0.04mm3)，属于单斜晶系P21空间群。晶胞参数 α＝90°,β＝118.015(4)°,γ＝90°, Z＝4。计算密度Dc＝1.389g/cm3，单胞中电子数F(000)＝504.0，单胞的线性吸收系数μ(Cu Kα)＝0.840mm–1，衍射实验温度T＝150.00(11)K。
6A(+):检测晶体为无色块状(0.30×0.20×0.10mm3)，属于单斜晶系P21空间群。晶胞参数 α＝90°,β＝113.876(3)°,γ＝90°, Z＝2。计算密度Dc＝0.999g/cm3，单胞中电子数F(000)＝1318.0，单胞的线性吸收系数μ(Cu Kα)＝0.570mm–1，衍射实验温度T＝100.01(18)K。
TJ-NA048:检测晶体为无色针状(0.30×0.04×0.04mm3)，属于单斜晶系P1空间群。晶胞参数 α＝85.007(4)°,β＝88.052(4)°,γ＝70.532(4)°, Z＝2。计算密度Dc＝1.366g/cm3，单胞中电子数F(000)＝620.0，单胞的线性吸收系数μ(Cu Kα)＝0.856mm–1，衍射实验温度T＝150.00(13)K。
TJ-NA092:检测晶体为无色棱柱状(0.30×0.10×0.10mm3)，属于三斜晶系P1空间群。晶胞参数 α＝93.146(2)°,β＝101.266(2)°,γ＝96.134(2)°, Z＝2。计算密度Dc＝1.412g/cm3，单胞中电子数F(000)＝228.0，单胞的线性吸收系数μ(Cu Kα)＝0.945mm–1，衍射实验温度T＝100.00(10)K。
实施例5.包含不同化学修饰的siRNA的序列依赖性实验
在多条不同序列上测试了本公开的实验化合物。使用了靶向不同基因mRNA的siRNA，使用(+)hmpNA(A)、(-)hmpNA(A)和作为对照的GNA(A)化合物修饰AS链5’端第7位(序列如表4-1、表4-2所示)。
表4-1.靶向不同基因的siRNA正义链
表4-2.靶向不同基因的包含化学修饰的siRNA反义链
在靶活性实验结果参见表5，GNA (A)显现出明显的序列依赖性，不同序列的在靶活性差异明显。本公开的实验化合物没有显示出明显的序列依赖性，普遍适用性更强。
表5.针对不同靶序列的siRNA的在靶活性结果
脱靶活性实验结果参见表6，可以看出，相对于母序列，本公开的实验化合物明显降低了siRNA的脱靶活性。
表6.针对不同靶序列的siRNA的脱靶活性结果
实施例6.评估AS链9位和10位不同修饰
本实验考察本公开的不同位点2’-氟代修饰的siRNA缀合物在体内对靶基因mRNA表达量的抑制效率。
将雄性6-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组共6只，每个时间点各3只，分别向每组小鼠给予测试缀合物(2个，TRD007047和TRD006870)、对比缀合物(TRD002218)以及PBS。所有动物依据体总计算给药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为1mg/kg，给药体积为5mL/kg。给药7天后处死小鼠，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；随后用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用组织RNA提取试剂盒(凡知医疗科技，FG0412)根据操作说明书标注的操作步骤提取得到肝组织总RNA。将总RNA反转录成cDNA并采用实时荧光定量PCR方法检测肝组织中的TTR mRNA的表达量。在该荧光定量PCR法中，以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，使用针对TTR和GAPDH的Taqman探针引物分别检测TTR和GAPDH的mRNA表达量。化合物信息参见表7，小鼠体内实验化合物分组信息参见表8，引物参见表9。
如无特别之处，以下表中以及说明书其他地方所列举的序列均为5’至3’方向。
表7.AS链9位和10位修饰
NAG1结构为：
按照专利WO2021254360A1所述的方法制备了化合物NAG1；
L96结构为：
按照专利WO2014025805A1所述的方法制备了对照化合物L96。
表8.小鼠体内实验分组信息
表9.检测引物序列
给药28天后，本公开的不同位点氟代修饰的siRNA缀合物的在体内对靶基因mRNA表达量的抑制效率见表10。参比阳性对照TRD002218，不同位点氟代修饰的siRNA缀合物在给药后28天对于TTR mRNA的表达抑制高于参比阳性对照，两种修饰方法均表现出高抑制效率且无显著性差异，说明AS链9位和10位两种修饰方法能够介导更高效抑制效率。
表10. 7天和28天检测结果
TTR mRNA表达量按照如下等式计算：
TTR mRNA表达量＝【(测试组TTR mRNA表达量/测试组GAPDH mRNA表达量)/(对照组TTR mRNA表达量/对照组GAPDH mRNA表达量)】×100％
第二部分.靶向配体
实施例7.制备NAG0052、L96
化合物NAG0024、NAG0026购买自天津药明康德新药开发有限公司。除非特别说明，以下实施例中所用的试剂均为市售商品。
(1)化合物NAG0052的合成
起始原料化合物1采购自江苏倍达医药科技有限公司。
NAG0052的具体制备过程如下：
化合物2
在0度以及氮气保护下，往化合物1(12.3mL,101mmol)的THF(300mL)溶液中分批加入NaH(12.2g,304mmol，纯度60％)。该混合物在20℃下搅拌1小时之后再次冷却到0℃，接着往体系中逐滴加入苄溴(36.3mL,304mmol)，并且在20℃搅拌12小时。将该反应液用H 2O(100mL)淬灭后，用EtOAc(200mL×2)萃取。合并后的有机相用饱和食盐水(100mL)洗涤,Na 2SO 4干燥，过滤，浓缩得到的残留物经过硅胶柱层析分离后得到目标化合物2(20.0g,51.8mmol,产率51％)。
LCMS:t R＝2.615 and 2.820min in 30-90AB_7min_220&254_Shimadzu.lcm(Xtimate C18,3um,2.1*30mm),MS(ESI)m/z＝351.2[M+Na] +。
1H NMR:(400MHz,CDCl 3)δppm 7.35-7.12(m,10H),5.06-4.95(m,1H),4.51-4.39(m,4H),4.24-3.87(m,2H),3.50-3.40(m,2H),3.38-3.20(m,3H),2.20-1.91 (m,2H)。
化合物3和化合物4
在20℃以及氮气保护下，往化合物2(13.0g,33.6mmol)的DCM(300mL)溶液中一次性加入TMSCN(13.5mL,101mmol)，接着逐滴加入TMSOTf(9.14mL,50.5mmol)的DCM(30mL)溶液。该反应液在20℃下搅拌15小时。反应结束之后用饱和NaHCO 3水溶液(80mL)淬灭该体系，并且用DCM(150mL×2)萃取，合并后的有机相用饱和食盐水(80mL)洗涤，Na 2SO 4干燥，过滤以及浓缩后通过硅胶柱层析分离后得到目标化合物3(3.30g,9.18mmol,产率27％)以及淡黄色油状液体化合物4(8.50g,9.18mmol,产率70％)。
化合物3
1H NMR:(400MHz,CDCl 3)δppm 7.42-7.29(m,10H),4.81(t,J＝7.8Hz,1H),4.65-4.49(m,4H),4.30-4.21(m,2H),3.65-3.57(m,1H),3.57-3.49(m,1H),2.49-2.40(m,2H)。
化合物4
1H NMR:(400MHz,CDCl 3)δppm 7.42-7.26(m,10H),4.93-4.87(m,1H),4.65-4.48(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.21-4.17(m,1H),3.79-3.70(m,1H),3.54(d,J＝4.0Hz,1H),2.45-2.37(m,2H)。
化合物5
在0℃及氮气保护下将化合物4(3.00g,9.28mmol)的THF(15mL)溶液，滴加到LiAlH 4(0.79g,20.9mmol)的THF(15mL)溶液中，滴加完后体系在0℃反应1小时。TLC(PE:EtOAc＝3:1)监测到原料完全消失。向反应液中缓慢加入十水硫酸钠，加至不冒泡为止。之后将反应液过滤，滤饼用二氯甲烷(60mL)洗涤三次后，收集滤液旋干，得目标化合物5(3.00g,产率90％).
1H NMR:(400MHz,DMSO-d 6)δppm 7.40-7.14(m,10H),4.54-4.38(m,4H),4.06-3.99(m,2H),3.91(q,J＝6.4Hz,1H),3.48-3.37(m,2H),2.67-2.52(m,2H),2.21-2.18(m,1H),1.77-1.73(m,1H)。
化合物6
在氮气保护下，将化合物5(3.00g,8.25mmol)溶于DCM(30mL)，加入TEA(3.44mL,24.7mmol)和CbzCl(1.76mL,12.4mmol)，20℃反应2小时。LCMS显示反应完成。将反应液加入二氯甲烷(30mL)和水(60mL)萃取。有机相用水(60mL×3)洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩用正向柱纯化(PE:EtOAc＝1:1)，得到目标化合物6(2.5g,产率90％)。
LCMS:t R＝0.810min in 5-95AB_1min,MS(ESI)m/z＝462.2[M+H] +。
1H NMR:(400MHz,CDCl 3)δppm 7.39-7.29(m,15H),5.35(s,1H),5.15-5.01(m,2H),4.72(d,J＝6.0Hz,1H),4.54-4.40(m,3H),4.26(s,1H),4.23-4.18(m,1H),4.11-4.04(m,1H),3.54-3.41(m,3H),3.37-3.25(m,1H),2.34-2.23(m,1H),1.85-1.79(m,1H)。
化合物7
在氮气保护下，将化合物6(2.00g,3.90mmol)溶于DCM(5mL)，在-78℃下加入BCl 3的THF溶液(1M,27.3mL)，反应1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)监测到原料完全消失。将反应液在-78℃下加入甲醇(20mL)淬灭，浓缩，用正向柱纯化(DCM:MeOH＝10:1)，得到目标化合物7(2.00g,产率60％)。
1H NMR:(400MHz,CD 3OD)δppm 7.41-7.23(m,5H),5.08(s,2H),4.25-4.07(m,2H),3.85-3.75(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.48(m,1H),3.30-3.27(m,2H),2.34-2.21(m,1H),1.71-1.64(m,1H)。
化合物8
在氮气保护下，将化合物7(0.50g,1.78mmol)溶于吡啶(5mL)中，在0℃下加入4A分子筛(500mg)和DMTrCl(0.66mL,2.13mmol)，之后升温至20℃反应1.5小时。TLC(PE:EtOAc＝2:1)监测到原料完全消失。将反应液加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)萃取，有机相用水(60mL×3)洗涤三次后用无水硫酸钠干燥，浓缩，用正向柱纯化(PE:EtOAc＝1:1)，得到目标化合物8(800mg,产率90％)。
1H NMR:(400MHz,CDCl 3)δppm 7.44(d,J＝7.6Hz,2H),7.37-7.23(m,11H),7.22-7.15(m,1H),6.84(d,J＝8.8Hz,4H),5.09(s,2H),4.31-4.17(m,2H),4.02-3.91(m,1H),3.84-3.73(m,6H),3.33(s,1H),3.28(s,1H),3.19-3.01(m,2H),2.34-2.25(m,1H),1.70-1.62(m,1H)。
化合物9
将化合物8(800mg,1.234mmol)溶于EtOAc(5mL)，加入Pd/C 10％(800mg,7.517mmol)，反应在H 2条件(15Psi)，20℃下反应1小时。LCMS显示反应已经完成。反应液过滤，滤饼用二氯甲烷(100mL)和甲醇(100mL)洗涤三次，浓缩，经过反相柱分离得到化合物9(300mg,54％)。
LCMS:t R＝2.586min in 10-80CD_3min MS(ESI)m/z＝450.2[M+H] +。
化合物11
将化合物10(435mg,1.780mmol)溶于DCM(10mL)，加入DIEA(0.441mL,2.67mmol)和HATU(677mg,1.78mmol)后,再加入化合物9(400mg,0.890mmol)，20℃反应1小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)监测反应完成。将反应液加入二氯甲烷(60mL)和水(60mL)萃取，有机相用水(60mL×3)洗涤三次,无水硫酸钠干燥，浓缩用正向柱纯化(PE:EtOAc＝0:1过柱，在100％处出产品峰),得到目标化合物11(600mg,产率90％)。
LCMS:t R＝2.745min in 30-90CD_3min,MS(ESI)m/z＝698.4[M+Na] +。
1H NMR:(400MHz,CD 3OD)δppm 7.46-7.38(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.16(m,1H),6.90-6.78(m,4H),4.29-4.21(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.77(s,6H),3.66-3.62(m,3H),3.41(s,1H),3.18-3.04(m,2H),2.36-2.17(m,5H),1.71-1.50(m,5H),1.39-1.25(m,14H)。
化合物12
将化合物11(600mg,0.799mmol)溶于THF(3mL)和H 2O(1mL)，加入LiOH.H 2O(134mg,3.20mmol)，20℃反应12小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示反应完成。将反应液旋干，用水(5mL)和甲醇(5mL)溶解，用反向柱纯化(H 2O:CH 3CN＝1:1,在35％左右出峰)，得到目标化合物12(460mg,产率100％，锂盐)。
LCMS:t R＝1.346min in 10-80CD_3min,MS(ESI)m/z＝684.3[M+Na] +。
HPLC:t R＝1.879min in 10-80CD_6min。
1H NMR:(400MHz,CD 3OD)δppm 7.47-7.39(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.91-6.79(m,4H),4.31-4.18(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.44-3.33(m,2H),3.18-3.04(m,2H),2.35-2.27(m,1H),2.24-2.10(m,4H),1.70-1.51(m,5H),1.31-1.23(m,12H)。
化合物13
室温环境，氮气保护下，将化合物NAG0024(271mg,0.151mmol)溶解于无水THF(2mL)和无水DMF(4mL)，加入3A分子筛，再依次加入化合物12(100mg,0.151mmol),HOBt(25mg,0.181mmol),DCC(38mg,0.181mmol)和DIEA(39mg,0.302mmol)。反应液45℃反应16h.LC-MS显示反应完全后，加水淬灭，过滤。滤液浓缩后，经C18反相柱纯化(H 2O/MeCN)，得到化合物13(210mg，产率57％)。
化合物NAG0052
室温环境下，化合物13(230mg，0.094mmol)溶于吡啶(5mL)，加入分子筛，加入DMAP(12mg，0.283mmol)，丁二酸酐(28mg，0.283mmol)。氮气保护，50℃搅拌16小时。LCMS检测反应完全，过滤旋干。过C18反相柱纯化后，由制备HPLC二次纯化，得到目标化合物NAG0052(123mg，0.048mmol，产率51％)。
MS(ESI)m/z＝2535.3[M-1] -.理论：2536.2。
1H NMR(400MHz,乙腈-d 3)δ7.48-7.43(m,2H),7.37-7.12(m,11H),7.00-6.85(m,10H),6.66(s,1H),5.31(dd,J＝3.4,1.1Hz,3H),5.20-5.13(m,1H),5.05(dd,J＝11.3,3.4Hz,3H),4.56(d,J＝8.5Hz,3H),4.30(dd,J＝7.7,5.3Hz,1H),4.18-3.93(m,14H),3.79(s,10H),3.65(q,J＝4.7,3.6Hz,13H),3.56-3.07(m,24H),2.56(s,6H),2.37(t,J＝5.8Hz,10H),2.17(t,J＝7.5Hz,9H),2.02-1.96(m,20H),1.88(s,8H),1.82-1.73(m,2H),1.60(dt,J＝15.0,7.3Hz,16H),1.27(s,13H)。
实施例8.siRNA缀合物的合成
1.自制带有载体的树脂
将含有羧酸基团的化合物NAG0052(157mg,0.062mmol)溶于无水DMF(3mL)，待底物完全溶解后，依次加入无水乙腈(4mL),DIEA(0.03mL,0.154mmol，2.5eq)和HBTU(35mg,0.093mmol，1.5eq)。反应液混合均匀后，再加入大孔 胺甲基树脂(476mg,空白载量为0.41mmol/g,目标载量为0.1mmol/g)。将反应液放入摇床上(温度：25℃，转速：200rpm)振摇过夜。反应液过滤，滤饼依次分别用DCM，无水乙腈洗涤，收集固体，真空干燥过夜。
将上步固体分散于无水乙腈(5mL)，依次加入吡啶(0.18mL)，DMAP(3mg)，NMI(0.12mL)和CapB1(2.68mL)。将反应液放入摇床上(温度：25℃，转速：200rpm)振摇2h。反应液过滤，滤饼用无水乙腈洗涤，收集固体，真空干燥过夜，得到带有载体的树脂。载量经过测定为0.1mmol/g。
2.对于已经连接在树脂上的NAG0052，使用该树脂作为起始，按照核苷酸排布顺序自3’-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，操作为本领域常规。化合物NAG0052经过固相合成连接到序列上，再经过胺解后，NAG0052结构脱去一部分官能团成为NAG0052’。
制得的siRNA缀合物表11和表12中所示的有义链和反义链。
表11 siRNA缀合物列表
表12有义链和反义链的核酸序列
表13.缀合物的结构
其中，缀合物TRD002218作为参比阳性化合物，Z表示siRNA。
实施例9.siRNA缀合物在体内对靶基因mRNA表达量的抑制
本实验考察本公开的缀合不同结构的siRNA缀合物在体内对靶基因mRNA表达量的抑制效率。
将雄性6-8周龄C57BL/6小鼠随机分组，每组共6只，每个时间点各3只，分别向每组小鼠给予本公开的缀合物TRD007205、参比阳性核酸配体缀合物TRD002218以及PBS。
所有动物依据体总计算给药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为1mg/kg，给药体积为5mL/kg。给药7天、28天后处死小鼠，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；随后用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用组织RNA提取试剂盒(凡知医疗科技，FG0412)根据操作说明书标注的操作步骤提取得到肝组织总RNA。将总RNA反转录成cDNA并采用实时荧光定量PCR方法检测肝组织中的TTR mRNA的表达量。在该荧光定量PCR法中，以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作为内参基因，使用针对TTR和GAPDH的Taqman探针引物分别检测TTR和GAPDH的mRNA表达量。检测引物的序列同表9。
表14小鼠体内实验化合物分组信息
TTR mRNA表达量按照如下等式计算：
TTR mRNA表达量＝【(测试组TTR mRNA表达量/测试组GAPDH mRNA表达量)/(对照组TTR mRNA表达量/对照组GAPDH mRNA表达量)】x 100％。
给药7天、28天后，本公开的缀合不同结构的siRNA缀合物的在体内对靶基因mRNA表达量的抑制效率分别见图1和图2。
由图1的结果可知，缀合物TRD007205在给药后7天对于TTR mRNA的表达抑制均具有良好的效果，说明其能够介导更高效的递送效率。由图2可知，给药28天后，TRD007205对靶基因mRNA表达量的抑制作用均优于TRD002218。
第三部分、靶向LPA的siRNA、siRNA缀合物筛选和活性验证
实施例10.人LPA siRNA的设计和合成
1)siRNA设计，以人LPA(NM_005577.3)作为靶基因，以满足活性siRNA的一般规则设计19/21nt的siRNA。未经修饰的正义链及反义链序列详见表15、16。
在合成AS链5’第7位修饰的核苷酸时，使用实施例1合成的亚磷酰胺单体或经过2’-甲氧基修饰磷酰胺单体的替换母序列原核苷酸。经过AS链5’第7位修饰的反义链序列详见表15，其中，W’选自：2'-甲氧基修饰的核苷酸或包含 所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸；
其中：M为O或S；其中：SEQ ID NO:5中，W’选自 时，B选自A；SEQ ID NO:6中，W’选自 时，B选自G；
表15.人LPA siRNA的未修饰的正义链、反义链和7位化学修饰反义链
表16.人LPA siRNA的未修饰的正义链、反义链(对照组)
LPA siRNA经过2’-氟代、2’-甲氧基等修饰的正义链和反义链序列详见表17、20；反义链7位修饰旋光变化详见表18；LPA siRNA缀合物经过修饰的正义链及反义链序列详见表19、21。
表17.人LPA siRNA经过修饰的正义链和反义链
表18.AS链7位不同旋光化学修饰
表19.人LPA siRNA缀合物经过修饰的正义链和反义链
表20.人LPA siRNA经过修饰的正义链和反义链(对照组)
表21.人LPA siRNA缀合物经过修饰的正义链和反义链(对照组)
表17至表21中，将由2-羟甲基-1,3-丙二醇为起始原料合成的核苷酸定义hmpNA；hmpNA为消旋结构；
(-)hmpNA(A)为实施例1.1节中核苷亚磷酰胺单体1-1a通过固相合成获得；(+)hmpNA(A)为旋光异构体；
小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸；
小写字母s在大写字母中间时表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；
小写字母s在3’端第一个时表示与该字母s左侧相邻的一个核苷酸末端为硫代磷酸酯基。
NAG0052’结构为：
实施例11 siRNApsiCHECK 5浓度点在靶活性
HEK293A细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃，5％CO 2条件下培养。转染前24h，将HEK293A细胞接种于96孔板，接种密度为每孔8×10 3个细胞，每孔100μL培养基。
按照说明书，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)对细胞共转染siRNA及对应质粒，每孔使用0.3μL Lipofectamine2000。质粒转染量为40ng每孔。对于在靶质粒，siRNA共设置5个浓度点，最高浓度点终浓度为10nM，10倍梯度稀释(10nM，1nM，0.1nM，0.01nM，0.001nM)。转染后24h，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)检测在靶活性。结果如表22所示。结果表明，siRNA TRD001307具有显著活性。
表22.siRNApsiCHECK多剂量在靶活性结果
实施例12 siRNA/siRNA缀合物psiCHECK 9浓度点在靶活性
在HEK293A细胞中采用9个浓度梯度对siRNA/siRNA缀合物进行体外分子水平模拟在靶活性筛选。
HEK293A细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃，5％CO 2条件下培养。转染前24h，将HEK293A细胞接种于96孔板，接种密度为每孔8×10 3个细胞，每孔100μL培养基。
按照说明书，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)对细胞共转染siRNA/siRNA缀合物及对应质粒，每孔使用0.3μL Lipofectamine2000。质粒转染量为40ng每孔。对于在靶序列质粒，siRNA/siRNA缀合物共设置9个浓度点，最高浓度点终浓度为20nM，3倍梯度稀释，20nM，6.666666667nM，2.222222222nM，0.740740741nM，0.24691358nM，0.082304527nM，0.027434842nM，0.009144947nM，0.003048316nM。转染后24h，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)检测在靶水平。
在该实施例中，使用了正义链和反义链均未经修饰的TJR00366(包含SEQ ID NO：2所示的正义链和SEQ ID NO：4所示的反义链)和TJR00373(包含SEQ ID NO：1所示的正义链和SEQ ID NO：3所示的反义链)，以及包含经修饰的正义链和反义链并与NAG0052’缀合的TJR100391(包含SEQ ID NO：53所示的正义链和SEQ ID NO：46所示的反义链)和TJR100392(包含SEQ ID NO： 54所示的正义链和SEQ ID NO：47所示的反义链)进行了测试。
结果表明，未修饰的siRNA(裸序列)TJR100366和TJR100373与各自相似未修饰的siRNA序列(分别是TJR100367-TJR100372和TJR100374-TJR100380)相比均具有显著活性，并且裸序列修饰后的TJR100391和TJR100392与各自相似siRNA缀合物(分别是TJR100390和TJR100394)相比也具有显著活性。
表23.siRNA/siRNA缀合物在psi-Check系统9点活性结果
实施例13 siRNA对人原代肝细胞(PHH)中人LPA的抑制-7个浓度点抑制活性
在人原代肝细胞(PHH)中采用7个浓度梯度对siRNA序列进行PHH活性筛选。各个siRNA样品转染起始终浓度为20nM，5倍梯度稀释和7个浓度点。
PHH冻存于液氮中，转染前24h，将人原代肝细胞(PHH)复苏后接种于96孔板，接种密度为每孔3×10 4个细胞，每孔80μL培养基。
参照产品说明手册，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)转染siRNA，siRNA转染的梯度终浓度为20nM，4nM，0.8nM，0.16nM，0.032nM，0.0064nM和0.00128nM。在处理24小时后，使用高通量细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取、RNA逆转录实验和定量实时PCR检测，测定人LPA的mRNA水平，根据GAPDH内参基因水平对人LPA的mRNA水平进行校正。
其中，在定量实时PCR检测时，采用的是探针Q-PCR检测实验，其引物信息如表24和25所示。
Taqman探针Q-PCR检测实验完毕后，按照系统自动设定的阈值获取相应的Ct值，可以通过Ct值比较，相对定量某个基因的表达：比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的差值来计算基因表达差异,也称之是2 -△△Ct，△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。抑制率(％)＝(1-目的基因表达剩余量)*100％。
结果以相对于经过对照siRNA处理的细胞的人LPA mRNA表达剩余百分比来表示。抑制率的IC50结果见表26。
结果表明，TJR100373具有显著优势活性。
表24.Taqman LPA探针引物信息表
表25.Taqman GAPDH探针引物信息表
引物名称 品牌 货号
Human GAPDH TaqMan Probe Thermo 4326317E
表26.siRNA对人原代肝细胞(PHH)中人LPA的多剂量抑制活性

Claims (26)

  1. 一种靶向LPA的siRNA，其包含形成双链区的正义链与反义链；
    所述正义链包含至少15个连续核苷酸，且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的任一核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；和
    所述反义链包含至少15个连续核苷酸，且与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一核苷酸序列相差不超过3个核苷酸。
  2. 根据权利要求1所述的siRNA，其包含或选自以下任一组所示的核苷酸序列：
    组1)，SEQ ID NO：1所示的正义链和SEQ ID NO：3所示的反义链；
    组2)，SEQ ID NO：2所示的正义链和SEQ ID NO：4所示的反义链。
  3. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述正义链和/或反义链中至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。
  4. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述反义链在其5’端的第2位至第8位中的至少一个核苷酸是修饰核苷酸，其中：
    -所述修饰核苷酸是2'-甲氧基修饰的核苷酸，或
    -所述修饰核苷酸包含式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰，所述式(I)所示的化学修饰选自：
    B各自独立地选自反义链5’端的第2位至第8位对应位置的碱基。
  5. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述反义链在其5’端的第5位、第6位或第7位的核苷酸是：
    -2'-甲氧基修饰的核苷酸，或
    -包含权利要求5所定义的式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸；
    当式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’端的第5位时，B是所述反义链在其5’端的第5位的碱基；
    当式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’端的第6位时，B是所述反义链在其5’端的第6位的碱基；
    当式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰在5’端的第7位时，B是所述 反义链在其5’端的第7位的碱基。
  6. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述正义链中的三个连续核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸；和/或
    按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自独立地为2'-氟代修饰的核苷酸；或
    按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自独立地为2'-氟代修饰的核苷酸。
  7. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述正义链含有或选自下式所示的核苷酸序列：
    5’-N aN aN aN aN aN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；或，
    5’-N aN aN aN aN bN aN bN bN bN aN aN aN aN aN aN aN aN aN a-3’；
    其中，N a为2'-甲氧基修饰的核苷酸，N b为2'-氟代修饰的核苷酸。
  8. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中所述反义链含有或选自下式所示的核苷酸序列：
    5’-N a’N b’N a’N b’N a’N b’W’N a’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N a’N a’-3’；或，
    5’-N a’N b’N a’N b’N a’N b’W’N a’N b’N a’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N b’N a’N a’N a’-3’；
    其中，
    N a’为2'-甲氧基修饰的核苷酸，
    N b’为2'-氟代修饰的核苷酸；
    W’是2'-甲氧基修饰的核苷酸，或W’是如权利要求4或5定义的式(I)所示的化学修饰或其互变异构体修饰的核苷酸。
  9. 根据权利要求8所述的siRNA，其中W’选自包含 修饰的核苷酸；其中：B是碱基；优选的，B选自反义链在其5’端的第7位中对应位置的碱基。
  10. 根据权利要求8所述的siRNA，其中W’选自2'-甲氧基修饰的核苷酸。
  11. 根据前述权利要求中任一项述的siRNA，其中所述正义链和/或反义链中至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，优选为硫代磷酸酯基。
  12. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA，其中
    所述正义链包含SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:43中任一项所示的核苷酸序列；
    所述反义链包含SEQ ID NO:44至SEQ ID NO:52中任一项所示的核苷酸序列；
    优选地，所述的siRNA包含以下任一组的正义链和反义链：
    组1)，SEQ ID NO：42所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
    组2)，SEQ ID NO：43所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
    组3)，SEQ ID NO：42所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
    组4)，SEQ ID NO：43所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
    组5)，SEQ ID NO：39所示的正义链和SEQ ID NO：44所示的反义链；
    组6)，SEQ ID NO：40所示的正义链和SEQ ID NO：45所示的反义链；
    组7)，SEQ ID NO：39所示的正义链和SEQ ID NO：46所示的反义链；
    组8)，SEQ ID NO：40所示的正义链和SEQ ID NO：47所示的反义链；
    组9)，SEQ ID NO：41所示的正义链和SEQ ID NO：48所示的反义链。
  13. 一种siRNA缀合物，其包含：
    权利要求1至12中任一项所述的siRNA，和连接至所述siRNA末端的靶向配体；
    优选地，所述靶向配体连接至所述siRNA的正义链3’末端。
  14. 根据权利要求13所述的siRNA缀合物，其中：
    所述靶向配体包含至少一个靶向部分，
    所述靶向部分各自独立地选自：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基-半乳糖胺；
    优选地，所述靶向部分是N-乙酰基-半乳糖胺；
    更优选地，所述靶向配体包含三个相同或不同的靶向部分。
  15. 根据权利要求14所述的siRNA缀合物，所述靶向配体是如式(II)所示化合物或其药学上可接受的盐，所述式(II)为：
  16. 一种siRNA缀合物，其包含形成双链区的正义链与反义链；
    所述正义链包含SEQ ID NO:53至SEQ ID NO:57任一项；
    所述反义链包含SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:60任一项；
    优选地，所述的siRNA缀合物，其包含以下任一组的正义链和反义链：
    组1)，SEQ ID NO：56所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
    组2)，SEQ ID NO：57所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
    组3)，SEQ ID NO：56所示的正义链和SEQ ID NO：50所示的反义链；
    组4)，SEQ ID NO：57所示的正义链和SEQ ID NO：49所示的反义链；
    组5)，SEQ ID NO：53所示的正义链和SEQ ID NO：46所示的反义链；
    组6)，SEQ ID NO：54所示的正义链和SEQ ID NO：47所示的反义链；
    组7)，SEQ ID NO：55所示的正义链和SEQ ID NO：48所示的反义链。
  17. 一种药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物，和药学上可接受的载体。
  18. 一种细胞，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA。
  19. 一种试剂盒，其包含根据权利要1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物。
  20. 一种抑制LPA表达的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物。
  21. 一种治疗和/或预防受试者中与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高相关的疾病的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物；优选的，所述与脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平升高 相关的疾病选自心血管疾病；更优选的，所述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
  22. 一种治疗和/或预防疾病的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物，所述疾病选自心血管疾病；优选的，所述心血管疾病选自缺血性中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、下肢动脉病变或主动脉瓣狭窄、心肌梗塞、冠状动脉狭窄、颈动脉狭窄、股动脉狭窄、心脏衰竭。
  23. 一种用于降低脂蛋白(a)和/或载脂蛋白(a)水平的方法，包括给予受试者有效量或有效剂量的根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物。
  24. 一种体内递送抑制LPA表达和/或复制的siRNA至肝脏的方法，给与受试者根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物。
  25. 一种制备siRNA或siRNA缀合物的方法，其包括：合成权利要求1-12中任一项所述的siRNA或根据权利要求13-16中任一项所述的siRNA缀合物、或根据权利要求17所述的药物组合物。
  26. 一种载体，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA。
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EP2992009B1 (en) * 2013-05-01 2020-06-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
US11253601B2 (en) * 2016-07-11 2022-02-22 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
WO2019204668A1 (en) * 2018-04-18 2019-10-24 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for knockdown of apo(a) by gene editing for treatment of cardiovascular disease
CN111378655B (zh) * 2018-12-28 2024-03-19 苏州瑞博生物技术股份有限公司 抑制CTGF基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
CN112876534B (zh) * 2019-11-29 2024-02-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 肝靶向化合物及缀合物
US20230201361A1 (en) * 2020-01-11 2023-06-29 Oncolmmunin, Inc. Targeted and localized in vivo delivery of oligonucleotides

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