TW202417013A - 小活化核酸分子及其在治療遺傳性血管性水腫中的用途 - Google Patents

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姜武林
龍承 李
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大陸商中美瑞康核酸技術（南通）研究院有限公司
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Abstract

本申請案涉及用於預防或治療遺傳性血管性水腫（HAE）的小活化核酸分子及其用途。該小活化核酸分子包含有義核酸股和反義核酸股，其中該有義核酸股和該反義核酸股獨立地為長度為16至35個核苷酸的寡核苷酸股，其中一條核苷酸股與選自標靶基因 SERPING1的啟動子區域的標靶具有至少75%的鹼基同源性或互補性。本申請案還涉及藥物組合物和選擇性的藥學上可接受的載體，以及用該小活化核酸分子或包含本文公開的該小活化核酸分子的藥物組合物來調升細胞中標靶基因的表現的方法和用於預防或治療由標靶基因表現不足誘導的病症的方法。

Description

小活化核酸分子及其在治療遺傳性血管性水腫中的用途
本申請案涉及核酸技術領域，具體而言，涉及與基因活化相關的小活化核酸分子及其藥物用途。
遺傳性血管性水腫（HAE）是一種由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）的編碼基因 SERPING1的異型結合突變引起的常染色體顯性疾病。據報導，患病率為約1/50,000人。HAE的特徵在於皮膚腫脹、嚴重腹痛及上氣道腫脹的頻繁且危及生命的急性發作。未經治療的個體平均每1週至2週發作一次，並且大多數發作持續約3天至4天。約25%的患病個體在生命的前二十年死亡，主要是由於缺乏治療。
SERPING1主要在肝臟中表現並編碼C1抑制蛋白，C1抑制蛋白被分泌到血液中，在其中參與接觸、凝血和纖維蛋白溶解系統的正常功能。該基因編碼C1酯酶抑制蛋白（C1EI或C1INH），C1酯酶抑制蛋白是絲胺酸蛋白酶抑制蛋白（SERPIN）超家族的最大成員，其作為以下蛋白的主要抑制蛋白發揮作用：a) 接觸系統中的C1r、C1s、甘露糖結合凝集素相關的絲胺酸蛋白酶MASP-1、MASP-2、因子XII和激肽釋放酶，b) 凝血系統中的因子XI和凝血酶，和 c) 纖維蛋白溶解系統中的組織型纖維蛋白溶酶原活化蛋白（tPA）和纖維蛋白溶酶。低功能性C1INH水準引起緩激肽的積累，從而引發血管穿透性增加的發作。HAE I型突變（85%的病例）導致不能分泌的截短的或錯折疊的蛋白質。HAE II型（15%的病例）源於導致酶失活的蛋白質活性位點或附近胺基酸的突變。
目前的治療側重於用需求性療法治療急性發作或者用預防性療法預防發作。需求性療法和預防性療法包括血漿來源的和重組的蛋白C1INH。雖然這些療法有效地降低了發作的發生率，但是由於此類藥物的半衰期很短，因此這些療法帶來了很高的經濟負擔，並且需要頻繁給藥。目前需要用於預防和治療C1INH缺乏相關的病况（例如遺傳性血管性水腫）的改進的方法和組合物。
為了解决上述問題，本申請案提供了一種小活化核酸分子（例如小活化RNA（saRNA）分子），用於通過RNA活化（RNAa）機制活化/調升 SERPING1轉錄並提高C1IHN蛋白的表現水準來治療由C1INH蛋白缺乏引起的疾病或病况（例如HAE）。
具體而言，本發明人發現了能夠活化/調升 SERPING1mRNA的表現的此類saRNA不是隨機分布在啟動子上，而是在某些特定熱點區聚集。 SERPING1基因的啟動子上只有一些區域有利於saRNA的活化/調升表現的功能，例如， SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域（SEQ ID NO: 1391）、-357至-279區域（SEQ ID NO: 1392）、-256至-215區域（SEQ ID NO: 1393）、-125至-81區域（SEQ ID NO: 1394）和-80至-15區域（SEQ ID NO: 1395）。本發明人還發現， SERPING1啟動子區內的saRNA的最佳標靶序列/有義股包括具有以下項的序列：(1) 35%至70%的GC含量；(2) 少於5個連續相同的核苷酸；(3) 3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 3個或更少的三核苷酸重複。作為有益的結果，標靶序列（例如，包含該標靶序列的分離核酸序列）在與saRNA相互作用之後，與 SERPING1mRNA的基線水準相比，可將 SERPING1mRNA的表現活化/調升至少10%。至少部分基於這些發現，本公開的特徵在於與 SERPING1基因的基線水準相比，saRNA、組合物和藥物組合物用於將 SERPING1mRNA的表現活化/調升至少10%。本文還提供了預防或治療個體的由C1INH蛋白的表現不足、C1INH基因突變和/或低功能性C1INH水準誘導的疾病或病况的方法，該方法包括施用本文所述的saRNA、組合物和/或藥物組合物中的任一者。
在本申請案的一態樣，提供了能夠活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的小活化核酸分子（例如saRNA分子），該小活化核酸分子（saRNA）包含長度為16至35個連續核苷酸的寡核苷酸序列，其中連續的寡核苷酸序列與SEQ ID NO: 1390所示的等長區域具有至少75%，或至少80%，或至少85%，或至少90%的序列同源性或互補性，從而將該基因的表現活化或調升至少10%。在一些實施例中，SEQ ID NO: 1390所示的等長區域位於 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域（SEQ ID NO: 1391）、-357至-279區域（SEQ ID NO: 1392）、-256至-215區域（SEQ ID NO: 1393）、-125至-81區域（SEQ ID NO: 1394）或-80至-15區域（SEQ ID NO: 1395）中。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA包含有義股和反義股，其中該有義股和該反義股各自包含互補區，其中該有義股和該反義股的互補區形成雙股核酸結構。在某些實施例中，本申請案公開的有義股和反義股具有至少90%的互補性。在某些實施例中，本申請案公開的有義股和反義股位於兩條不同的核酸股上。而在某些實施例中，本申請案公開的有義股和反義股位於相同的核酸股上，選擇性位於髮夾單股核酸分子上，其中有義股和反義股的互補區形成雙股核酸結構。在某些實施例中，本申請案公開的有義股和反義股包含長度範圍為0至6個核苷酸，或者長度範圍為2至3個核苷酸的3'突出端。在某些實施例中，該突出端的核苷酸中的至少一個核苷酸是胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸。在某些實施例中，本申請案公開的有義股和反義股獨立地包含約16至約35個、約17至約30個、約18至約25個或約19至約22個連續核苷酸的長度。
在某些實施例中，本申請案公開的有義股與選自SEQ ID NO: 274-545的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性，並且本申請案公開的反義股與選自SEQ ID NO: 548-819的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性。在某些實施例中，本申請案公開的有義股包含選自SEQ ID NO: 274-545的核苷酸序列，並且本申請案公開的反義股包含選自SEQ ID NO: 548-819的核苷酸序列。
在某些實施例中，本申請案公開的寡核苷酸序列與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性或互補性。在某些實施例中，本申請案公開的寡核苷酸序列的有義股與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性。在某些實施例中，本申請案公開的寡核苷酸序列的反義股與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列互補性。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA中的至少一個核苷酸是化學修飾的核苷酸。在某些實施例中，本申請案公開的saRNA的反義股和/或有義股中的至少一個核苷酸是化學修飾的。在某些實施例中，本申請案公開的化學修飾的核苷酸是具有至少一個以下修飾的核苷酸： a) saRNA的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； b) saRNA的核苷酸序列中核糖的2'-OH的修飾；以及 c) saRNA的核苷酸序列中鹼基的修飾。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA的至少一個核苷酸是鎖核酸、脫鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、胺基磷酸酯或包含非天然鹼基的核苷酸。
在某些實施例中，本申請案公開的至少一個化學修飾的核苷酸的化學修飾是在有義股或反義股的5'端新增(E)-乙烯基膦酸酯部分。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA的有義股或反義股綴合至選自以下項的一個或多個綴合基團：脂質、脂肪酸、螢光團、配體、醣、肽和抗體。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA的有義股或反義股綴合至選自以下項的一個或多個綴合基團：細胞穿透肽、聚乙二醇、生物鹼、色胺、苯並咪唑、喹諾酮、胺基酸、膽固醇、葡萄糖和N-乙醯半乳胺糖。在某些實施例中，綴合基團衍生自選自本申請案中所示的tC2和tC2x4的化合物。在某些實施例中，綴合至一個綴合基團的saRNA具有由O1和O2表示的結構。
在本申請案的另一態樣，提供了一種saRNA的分離標靶位點，其中該分離標靶位點是SEQ ID NO: 1390中具有16至35個核苷酸的長度的連續核苷酸序列。具體而言，該分離標靶位點是選自SEQ ID NO: 1-272的核酸序列。在本申請案的另一態樣，提供了使用saRNA的分離標靶位點的方法。
令人驚訝的是，本發明人發現了能夠活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的功能性saRNA不是隨機分布在啟動子上，而是在某些特定熱點區聚集。基於此類發現，本申請案還提供了 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的分離核酸序列，其中該分離核酸序列選自SEQ ID NO: 1391-1395。具體而言，該分離核酸序列富集本申請案公開的分離標靶位點。在某些實施例中，以本申請案公開的分離核酸序列作為標靶的經設計saRNA的至少30%可將 SERPING1基因的表現活化至少10%，其中經設計saRNA：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。例如，saRNA通過序列特異性方式與分離核酸序列的16至35個核苷酸的區域相互作用。作為有益的結果，分離核酸序列在與saRNA相互作用之後，可將 SERPING1基因的表現活化/調升至少10%。
本申請案的另一態樣提供了編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸。在一個實施例中，本文公開的saRNA是小活化RNA（saRNA）分子。在一個實施例中，該核酸是DNA分子。本申請案的另一態樣提供了包含本文公開的分離多核苷酸的載體。
本申請案的另一態樣提供了包含本文公開的saRNA、編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸，或本文公開的載體的細胞。在一個實施例中，該細胞是哺乳動物細胞，選擇性為人類細胞。在一些實施例中，該細胞是宿主細胞。上述細胞可以是體外的形式，例如細胞系（cell line）或細胞株（cell strain），也可以存在於哺乳動物體內，例如人體內。
本申請案的另一態樣提供了一種組合物，例如藥物組合物，該組合物包含上述saRNA或編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸，以及選擇性的藥學上可接受的載體。在一些實施例中，藥學上可接受的載體包括水性載體、脂質體、高分子聚合物或多肽。在一些實施例中，藥學上可接受的載體選自水性載體、脂質體、高分子聚合物和多肽。在一些實施例中，水性載體可以是例如無RNase水或無RNase緩衝液。在一些實施例中，該組合物可包含0.001nM至150nM（例如，0.001nM至100nM、0.001nM至50nM、0.001nM至20nM、10nM至100nM、10nM至50nM、20nM至50nM、20nM至100nM或50nM至150nM），或者選擇性為1nM至150nM的上述saRNA或編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸。
本申請案的另一態樣涉及上述saRNA、編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸或包含上述saRNA或本文公開的分離多核苷酸的組合物在製備用於活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的製劑中的用途。
本申請案還涉及用於活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的方法，其中該方法包括向該細胞施用上述saRNA、本文公開的分離多核苷酸或包含上述saRNA或本文公開的分離多核苷酸的組合物。同時，還提供了用於提高細胞中C1IHN蛋白水準或功能性血液C1IHN蛋白水準的方法，該方法包括將有效量的本文公開的saRNA、核酸或組合物引入細胞中。
上述saRNA、本文公開的分離多核苷酸或包含上述saRNA或本文公開的分離多核苷酸的組合物可直接引入細胞中，或可在將編碼saRNA的核苷酸序列引入細胞中之後在細胞中產生。細胞較佳為哺乳動物細胞，更佳為人類細胞。上述細胞可以是體外的形式，例如細胞系或細胞株，也可以存在於哺乳動物體內，例如人體內。人體是患有個體的由 SERPING1基因突變、低C1IHN水準和/或功能性C1IHN蛋白血液水準不足引起的疾病或症狀的患者，並且以足夠的量施用saRNA、本文公開的分離多核苷酸或包含上述saRNA或本文公開的分離多核苷酸的組合物以治療該疾病或症狀。具體而言，由 SERPING1基因突變導致的C1IHN蛋白缺乏和/或功能性C1IHN蛋白表現不足引起的症狀包括，例如HAE。在一個實施例中，由C1IHN蛋白表現不足，或 SERPING1基因突變，或功能性C1IHN蛋白血液水準不足引起的疾病是HAE。在一個實施例中，本文所述的HAE包括I型和II型HAE。
本申請案的另一態樣涉及用於預防或治療個體的由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或功能性C1IHN蛋白血液水準不足引起的病症的方法，該方法包括向個體施用治療有效量的本文公開的saRNA、編碼本文公開的saRNA的分離多核苷酸、本文公開的載體或包含本文公開的saRNA的組合物。在某些實施例中，該疾病或病况是遺傳性血管性水腫（HAE）。個體可以是哺乳動物，例如人類。在一個實施例中，個體患有由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或血液中低功能性C1IHN水準誘導的症狀，可包括例如HAE。在一個實施例中，由 SERPING1基因突變導致的功能性C1IHN蛋白血液水準不足引起的疾病是HAE。在一個實施例中，本文所述的HAE包括I型和II型HAE。在某些實施例中，通過選自以下施用途徑中的一種或多種向個體施用本文公開的saRNA、本文公開的分離多核苷酸、本文公開的載體或本文公開的組合物：腸胃外輸注、口服施用、鼻內施用、吸入施用、陰道施用和直腸施用。在某些實施例中，施用途徑選自以下項中的一種或多種：椎管內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、膀胱內、腦室內、玻璃體內和皮下施用。在某些實施例中，本文公開的方法將個體中 SERPING1基因或 SERPING1mRNA的表現活化/調升至少10%（例如，至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%或至少50%）。在某些實施例中，本文公開的方法將個體中C1IHN蛋白的水準提高至少10%。
本申請案的另一態樣涉及本文公開的saRNA、本文公開的分離多核苷酸或包含本文公開的saRNA或本文公開的分離多核苷酸的組合物在製備用於預防或治療個體的由功能性C1IHN蛋白血液水準不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準引起的病症或病况的藥物中的用途。個體可以是哺乳動物，例如人類。在一個實施例中，該疾病或病况可包括例如HAE。在一個實施例中，由 SERPING1基因突變導致的功能性C1IHN蛋白血液水準不足引起的疾病是HAE。在一個實施例中，本文所述的HAE包括I型和II型HAE。
此外，本申請案還提供了用於實施本文公開的預防或治療方法的套組，其中該套組包括：a) saRNA，b) 使用說明書，和 c) 選擇性的用於向個體施用該saRNA的手段。具體而言，套組可包裝在有標籤的包裝中，該包裝上的標籤指示該分子或組合物可用於預防或治療由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足誘導的病症或病况或用於針對HAE的預防或治療。
本申請案提供了用於實施本文公開的方法的套組，其中該套組包括：a) 本文公開的saRNA，和 b) 使用說明書。在某些實施例中，該使用說明書包括用於向個體施用本文公開的saRNA的手段或方法。
本申請案的態樣包括套組，該套組包括在有標籤的包裝中的本文公開的saRNA、本文公開的分離多核苷酸、本文公開的載體或本文公開的組合物，並且包裝上的標籤指示saRNA、分離多核苷酸、載體或组合物可用於預防或治療由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足誘導的疾病或病况或用於針對HAE的預防或治療。
本申請案還提供了用於檢測血液中或已經用上述saRNA或上述核酸或上述組合物轉染的本文公開的細胞中的C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（例如，緩激肽）的套組。
本文提供的活化/調升 SERPING1基因表現的saRNA（例如saRNA分子）可有效並具特異性地調升 SERPING1基因的表現，提高C1IHN mRNA的表現水準，並具有低毒副作用，可用於製備預防或治療與C1IHN蛋白表現不足相關的病症以及由 SERPING1基因突變導致的疾病或病况的藥物。
以基因調控序列（包括啟動子）作為標靶的雙股RNA（dsRNA）已被證明通過稱為RNA活化（RNAa）的機制在轉錄水準以序列特異性的方式調升標靶基因（Li, L. C.等人，Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.，PNAS (2006)）。此類dsRNA被稱為小活化RNA（saRNA）。
本公開的實施例部分基於以下令人驚訝的發現，即小活化核酸分子（saRNA，本文也稱爲「 SERPING1saRNA」）可活化或調升細胞中 SERPING1基因的表現。本申請案的saRNA施用之後，功能性 SERPING1mRNA產量的升高可實現 SERPING1mRNA和SERPING1蛋白（C1INH）水準的顯著升高或調升。
本公開的實施例還部分基於以下令人驚訝的發現，即能夠活化或調升細胞中 SERPING1基因的表現的saRNA在特定的 SERPING1啟動子區聚集，如圖2和圖10所示。本發明人鑑定了這些 SERPING1啟動子區的聚集體，它們被認為是富集所開發的功能性saRNA的標靶位點的「熱點」啟動子區。本申請案鑑定的這些特異性啟動子區（本文稱為「熱點」）的長度選擇性為至少42nt，或者具有在約42nt至約100nt範圍內的長度。本文中的「熱點」被定義為saRNA的標靶序列上的核酸區域，其中功能性saRNA的全長標靶富集並跨每個熱點內第一個saRNA標靶的5'端到最後一個saRNA標靶的3'端。在一些實施例中，被設計成以這些熱點區作為標靶的至少30%、約40%或甚至超過50%的saRNA被證明是功能性的，即可誘導標靶基因的mRNA水準或蛋白表現的1.1倍或更多的變化。在一些實施例中，被設計成以這些熱點區中的片段作為標靶的至少30%、約40%或甚至超過50%的saRNA被證明是功能性的，即可誘導標靶基因的mRNA水準或蛋白表現的1.1倍或更多的變化。本發明人驚奇地發現，功能性saRNA不是隨機分布在啟動子上，而是在特定熱點區聚集（參見例如表9）。例如，檢測到位於-466至-399區域（H1）、-357至-279區域（H2）、-256至-215區域（H3）、-125至-81區域（H4）和-80至-15區域（H5）中人類 SERPING1啟動子的5個熱點，以及位於啟動子TSS的-424至-325區域（H6）、-257至-182區域（H7）、-170至-117區域（H8）和-56至-11區域（H9）中的小鼠 Serping1啟動子的4個熱點，並且發現它們是通過RNA活化機制活化 SERPING1/ Serping1基因表現的saRNA的最佳標靶位點。
這種saRNA- SERPING1mRNA-SERPING1蛋白途徑可提供與目前治療C1INH缺乏相關的病症不同的替代治療方法，例如針對遺傳性血管性水腫患者。
在本申請案中，相關的術語定義如下：
如本文所用，術語「互補」是指在兩條寡核苷酸股之間形成鹼基對的能力。這些鹼基對通常通過反平行寡核苷酸股中核苷酸之間的氫鍵形成。互補的寡核苷酸股的鹼基可以Watson-Crick方式配對（例如A與T、A與U以及C與G），或以允許形成雙股體的任何其他方式配對（例如Hoogsteen或反向Hoogsteen鹼基配對）。
互補性包括完全互補性和不完全互補性。「完全互補性」或「100%互補性」意指來自第一寡核苷酸股的每個核苷酸可與雙股寡核苷酸分子的雙股區中的第二寡核苷酸股中相應位置處的核苷酸形成氫鍵，沒有鹼基對被「錯誤配對」。「不完全互補性」意指並非兩條股的所有核苷酸單位都通過氫鍵彼此結合。例如，對於雙股區中長度各為20個核苷酸的兩條寡核苷酸股，如果該雙股區中僅可通過氫鍵形成兩個鹼基對，則寡核苷酸股具有10%的互補性。在同一示例中，如果該雙股區中可通過氫鍵形成18個鹼基對，則寡核苷酸股具有90%的互補性。基本互補性是指至少約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或99%的互補性。
術語「寡核苷酸」或「多核苷酸」可互換使用，並且是指核苷酸的聚合物，並且包括但不限於DNA、RNA或DNA/RNA雜合體的單股或雙股核酸分子，含有規則和不規則交替的去氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸股，以及此類寡核苷酸的修飾和天然或非天然存在的框架。本文所述的用於活化標靶基因轉錄的寡核苷酸是小活化核酸分子。
如本文所用，術語「寡核苷酸股」、「股」和「寡核苷酸序列」可互換使用，是指具有少於35個鹼基的短核苷酸序列（包括去氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）中的核苷酸）的通用術語。在非限制性示例中，股的長度可以是16至35個核苷酸的任何長度。
如本文所用，術語「標靶基因」可指天然存在於生物體中，以及/或者可短暫或穩定轉染或併入細胞和/或其染色質中的核酸序列、轉基因、病毒或細菌序列、染色體或染色體外基因。標靶基因可以是蛋白質編碼基因或非蛋白質編碼基因（例如微小RNA基因和長股非編碼RNA基因）。標靶基因通常含有啟動子序列，並且針對標靶基因的正調節可通過設計與啟動子序列具有序列同一性（也稱為同源性）的saRNA來實現，其特徵在於調升標靶基因的表現。「標靶序列」或「標靶位點」可互換使用，是指標靶基因序列的序列中的序列片段，例如標靶基因啟動子，其與saRNA的有義股或反義股是同源的或互補的。
如本文所用，在saRNA雙股體中，術語saRNA的「有義股」是指與標靶基因的編碼股的片段具有序列同源性或序列同一性的股。
如本文所用，在saRNA雙股體中，術語saRNA的「反義股」是指與有義股具有序列互補性的股。該反義股可與標靶序列相互作用以活化或調升基因表現，該標靶序列可以是標靶基因的序列的編碼股的片段。
如本文所用，術語「編碼股」是指標靶基因中不能用於轉錄的DNA股，並且該股的核苷酸序列與轉錄產生的RNA的核苷酸序列相同（在RNA中，DNA中的T被U取代）。本文所述的標靶基因啟動子的雙股DNA序列的編碼股是指與標靶基因的DNA編碼股位於同一DNA股上的啟動子序列。
如本文所用，術語「模版股」是指與標靶基因的雙股DNA中的編碼股互補的另一條股，即作為模板可轉錄成RNA的股，並且該股與轉錄的RNA互補（A與U以及G與C）。在轉錄過程中，RNA聚合酶與模版股結合，沿著模版股的3'→5'方向移動，並且沿著5'→3'方向催化RNA的合成。本文所述的標靶基因啟動子的雙股DNA序列的模版股是指與標靶基因的DNA模版股位於同一DNA股上的啟動子序列。
如本文所用，術語「LNA」是指鎖核酸，其中2'-氧和4'-碳原子通過額外的橋狀架構連接。如本文所用，術語「BNA」是指可包含具有N-O鍵的五元或六元橋接結構的2'-O和4'-胺基乙烯橋接的核酸。如本文所用，術語「PNA」是指具有偽肽主鏈的核酸模擬物，該偽肽主鏈由N-(2-胺乙基)甘胺酸單元組成，其中核鹼基經由羰基亞甲基接頭連接至甘胺酸氮。
如本文所用，術語「啟動子」是指與蛋白編碼或RNA編碼核酸序列空間上相關，並且對蛋白編碼或RNA編碼核酸序列的轉錄起調節作用的序列。通常，真核基因啟動子含有100至5000個鹼基對，儘管該長度範圍不旨在限制本文所用的術語「啟動子」。儘管啟動子序列通常位於蛋白編碼或RNA編碼序列的5'末端，但啟動子序列也存在於外顯子和內含子序列中。
如本文所用，術語「轉錄起始位點」是指標記基因模版股上的轉錄起始的核苷酸。轉錄起始位點可出現在啟動子區的模版股上。基因可具有多於一個轉錄起始位點。
如本文所用，術語「同一性」或「同源性」意指saRNA的一條寡核苷酸股（有義股或反義股）與標靶基因的啟動子序列區域中的編碼股或模版股具有序列相似性。如本文所用，「同一性」或「同源性」可以是至少約75%、約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或99%。
如本文所用，術語「序列特異性方式」意指根據兩個核酸片段的核苷酸序列將它們結合或雜合的方式，例如Watson-Crick方式（例如A與T、A與U以及C與G）或允許形成雙股體的任何其他方式（例如Hoogsteen或反向Hoogsteen鹼基配對）。
如本文所用，術語「突出端」是指在寡核苷酸股的末端（5'或3'）處的非鹼基配對的核苷酸，其由雙股寡核苷酸中的一條股延伸到另一條股之外而形成。延伸到雙股體的3'末端和/或5'末端之外的單股區被稱為突出端。
如本文所用，術語「基因活化」或「活化基因表現」以及「基因調升」或「調升基因表現」可互換使用，並且意指通過測量轉錄水準、mRNA水準、蛋白水準、酶活性、甲基化狀態、染色質狀態或構型、轉譯水準或基因在細胞或生物系統中的活性或狀態而判定的某一核酸的轉錄、轉譯、表現或活性的升高。這些活性或狀態能以直接或間接的方式判定。此外，「基因活化」、「活化基因表現」、「基因調升」或「調升基因表現」是指與核酸序列相關的活性的升高，而不管此類活化的機制如何。例如，基因活化發生在轉錄水準以提高向RNA的轉錄，並且RNA被轉譯成蛋白質，從而提高蛋白質的表現。
如本文所用，術語「小活化RNA」、「saRNA」和「小活化核酸分子」可互換使用，並且是指可調升標靶基因表現並且可由第一核酸片段（有義股）和第二核酸片段（反義股）組成的核酸分子，該第一核酸片段含有與標靶基因的非編碼核酸序列（例如，啟動子或增強子）具有序列同一性的核苷酸序列，該第二核酸片段含有與第一核酸片段互補的核苷酸序列，其中該第一核酸片段和該第二核酸片段形成雙股體。saRNA還可由合成的或載體表現的單股RNA分子組成，該單股RNA分子可通過分子內的兩個互補區形成髮夾結構，其中第一區含有與基因的啟動子的標靶序列具有序列同一性的核苷酸序列，並且第二區含有與第一區互補的核苷酸序列。saRNA分子的雙股體區的長度通常為約10個至約50個鹼基對、約12個至約48個鹼基對、約14個至約46個鹼基對、約16個至約44個鹼基對、約18個至約42個鹼基對、約20個至約40個鹼基對、約22個至約38個鹼基對、約24個至約36個鹼基對、約26個至約34個鹼基對以及約28個至約32個鹼基對，並且通常為約10個鹼基對、約15個鹼基對、約20個鹼基對、約25個鹼基對、約30個鹼基對、約35個鹼基對、約40個鹼基對、約45個鹼基對或約50個鹼基對。此外，術語「saRNA」、「小活化RNA」和「小活化核酸分子」還包含除核糖核苷酸之外的核酸，包括但不限於修飾的核苷酸或類似物。
如本文所用，術語「熱點」是指長度為至少42bp的基因啟動子區，其中功能性saRNA富集，即被設計成以該區域作為標靶的saRNA的至少25%，例如約30%、約40%、約50%、約60%或約70%或超過70%是「功能性的」，即可誘導標靶基因的mRNA水準或蛋白表現的1.1倍或更多的變化。「熱點」和「熱點區域」可以互換使用，並且在本文中被定義為saRNA的標靶序列上的核酸區域，其中功能性saRNA的全長標靶富集並跨每個熱點內第一個saRNA標靶的5'端到最後一個saRNA標靶的3'端。在非限制性範例中，根據以下標準設計saRNA：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。
如本文所用，術語「功能性saRNA」是指將其預期標靶基因的表現活化至少10%（或至少1.1倍）的saRNA。術語「非功能性saRNA」是指將 SERPING1基因的mRNA水準和蛋白表現調節小於10%（或小於1.1倍）的saRNA。
如本文所用，本文所用的術語「分離標靶位點」意指與saRNA具有互補性或與其雜合的標靶位點。例如，標靶位點的分離核酸序列可包括與saRNA的區域具有互補性或與其雜合的核酸序列。如本文所用，術語「分離多核苷酸」意指編碼saRNA的多核苷酸。
如本文所用，術語「合成」是指合成寡核苷酸的方法，該方法包括允許RNA合成的任何方法，例如化學合成、體外轉錄和/或基於載體的表現。
如本文所用，術語「載體材料」是指，在自動寡核苷酸合成儀中，兩次過濾期間，保持在能夠讓所有套組溶劑自由通過的柱中，並且選擇性地產生3'或5'端綴合的寡核苷酸的固相起始物料。載體材料可選自可控微孔玻璃（CPG）、二氧化矽、矽膠、玻璃、陶瓷、聚合物、纖維素以及它們的組合。
如本文所用，大寫字母「 SERPING1基因」或「 SERPING1」是指人類基因；而首字母大寫的「 Serping1基因」或「 Serping1」是指與人類SERPING1直系同源的小鼠基因。
如本文所用，術語「 SERPING1mRNA」是指由 SERPING1基因的表現或 SERPING1基因的轉錄產生的傳訊RNA（mRNA）。
如本文所用，術語「SERPING1蛋白」和「C1IHN蛋白」可互換使用，是指由 SERPING1基因的表現或 SERPING1mRNA的轉譯產生的蛋白質。 saRNA
在本申請案中， SERPING1基因的表現通過RNA活化來調升，並且相關的疾病（特別是HAE）通過提高C1IHN蛋白（即，C1抑制蛋白）的表現水準來治療。由於 SERPING1基因編碼C1IHN蛋白，因此 SERPING1mRNA表現的升高提高了C1IHN蛋白的水準。在一些情況下，在本申請案中 SERPING1基因是標靶基因。
本申請案的態樣包括小活化核酸分子（saRNA），該小活化核酸分子包含具有在16至35個連續核苷酸範圍內的長度的寡核苷酸序列，其中連續的寡核苷酸序列與SEQ ID NO: 1390所示的等長部分具有至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%的序列同源性或互補性，並且其中該saRNA將 SERPING1基因的表現活化/調升至少10%。
在一些實施例中，本文公開的SEQ ID NO: 1390所示的等長部分位於 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域（SEQ ID NO: 1391）、-357至-279區域（SEQ ID NO: 1392）、-256至-215區域（SEQ ID NO: 1393）、-125至-81區域（SEQ ID NO: 1394）或-80至-15區域（SEQ ID NO: 1395）中。
在一些實施例中，本文公開的saRNA包含有義股和反義股。該有義股和該反義股包含能夠形成雙股核酸結構的互補區，該雙股核酸結構通過RNAa機制活化細胞中 SERPING1基因的表現。本文所用的RNAa機制（也稱為RNA活化）是指雙股核酸結構能夠在轉錄水準以序列特異性的方式調升標靶基因的機制。saRNA的有義股和反義股可存在於兩條不同的核酸股上或一條核酸股上。當有義股和反義股位於兩條不同的股上時，saRNA的至少一條股具有長度為0個至6個核苷酸的3'突出端，使得突出端的長度為0個、1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸，並且在一些情況下，兩條股都具有長度為2個或3個核苷酸的3'突出端。在一些情況下，突出端的核苷酸是dT。在一些情況下，當有義股和反義股位於一條核酸股上時，saRNA是髮夾單股核酸分子，其中有義股和反義股的互補區彼此形成雙股核酸結構。在一些實施例中，上述saRNA中的有義股和反義股分別具有在16個至35個核苷酸範圍內的長度。例如，在一些實施例中，有義股和反義股獨立地包含16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個核苷酸的長度。
本申請案提供了包含式I和式II的有義股或反義股的序列的saRNA也可引起 SERPING1基因活化。 AAAUUCCUGGCCUGGCCCNNN （式I） CUACCAGGGNNNNNNNNNN （式II）
其中N選自腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）和尿嘧啶（U）。
在某些實施例中，saRNA的一條股與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%（例如，至少約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%）的序列同源性或互補性。具體而言，本文公開的saRNA的有義股與選自SEQ ID NO: 274-545的任何核苷酸序列具有至少75%（例如，至少約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%）的序列同源性，並且本文公開的saRNA的反義股與選自SEQ ID NO: 548-819的任何核苷酸序列具有至少75%（例如，至少約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%）的序列同源性。更具體而言，本文公開的saRNA的有義股包括、包含選自SEQ ID NO: 274-545的任何核苷酸序列或由其組成；並且本文公開的saRNA的反義股包含選自SEQ ID NO: 548-819的任何核苷酸序列或由其組成，或者是選自SEQ ID NO: 548-819的任何核苷酸序列。在某些實施例中，saRNA的一條股與選自以下項的核苷酸序列具有至少75%（例如，至少約79%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%）的序列同源性或互補性：AAAUUCCUGGCCUGGCCCNNN和CUACCAGGGNNNNNNNNNN。例如，本申請案提供了包含式AAAUUCCUGGCCUGGCCCNNN和/或CUACCAGGGNNNNNNNNNN中的股的序列的saRNA也可導致 SERPING1基因活化。
在某些實施例中，本文公開的反義股能夠以序列特異性的方式與基因的啟動子的標靶核酸序列相互作用，這意味著反義股能夠通過氫鍵與標靶核酸雜合。在某些實施例中，反義股具有核苷酸序列，當以5'至3'的方向寫入時，該核苷酸序列包含其作為標靶的標靶核酸的標靶部分的反向互補序列。在某些此類實施例中，反義股具有核苷酸序列，當以5'至3'的方向寫入時，該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1390所示的標靶部分的反向互補序列，具體而言，該標靶部分是選自SEQ ID NO: 1-272的核酸序列。
在本文公開的saRNA中，所有核苷酸可以是天然的或非化學修飾的核苷酸，或者至少一個核苷酸是化學修飾的核苷酸。化學修飾的非限制性示例包括以下項的一種或多種組合： (1) saRNA的核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； (2) saRNA的核苷酸序列中核糖的2'-OH的修飾； (3) saRNA的核苷酸中鹼基的修飾；以及 (4) 小活化核酸分子的核苷酸序列中的至少一個核苷酸是鎖核酸。
本文所述的化學修飾是本技術領域中具有通常知識者熟知的，並且磷酸二酯鍵的修飾是指磷酸二酯鍵中氧的修飾，包括硫代磷酸酯修飾和硼代磷酸酯修飾。本文公開的修飾穩定了saRNA結構，從而維持對鹼基配對的高特異性和高親和力。
在一些實施例中，本申請案的saRNA包含至少一個化學修飾的核苷酸，該核苷酸在核苷酸的戊醣的2'-OH處被修飾，亦即在核糖的羥基位置處引入某些取代基，例如2'-氟修飾、2'-氧甲基修飾、2'-氧亞乙基甲氧基修飾、2,4'-二硝基苯酚修飾、鎖核酸（LNA）、2'-胺基修飾或2'-去氧修飾，例如2'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸、2'-去氧修飾的核苷酸。
在一些實施例中，本申請案的saRNA包含至少一個化學修飾的核苷酸，該核苷酸在核苷酸的鹼基處被修飾，例如5'-溴尿嘧啶修飾、5'-碘尿嘧啶修飾、N-甲基尿嘧啶修飾或2,6-二胺基嘌呤修飾。
在一些實施例中，saRNA的化學修飾是在有義序列或反義序列的5'端新增(E)-乙烯基膦酸酯部分。在一些實施例中，至少一個化學修飾的核苷酸的化學修飾是在有義序列或反義序列的5'端新增5'-甲基胞嘧啶部分。
在一些實施例中，本申請案的saRNA在小活化核酸分子的核苷酸序列中包含至少一個化學修飾的核酸核苷酸，例如，鎖核苷酸、脫鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、胺基磷酸酯和包含非天然鹼基的核苷酸。在一些實施例中，本文公開的saRNA包含用2'-O-甲基修飾的核苷酸和包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸進行的「內-輕（endo-light）」修飾。
在一些實施例中，本申請案的saRNA被化學修飾以增強穩定性或其他有益特徵。本申請案中特定的核酸可通過常規方法合成和/或修飾，例如描述於Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage, S. L.等人(Edrs.) John Wiley & Sons, Inc.，紐約，美國，在此透過參照方式併入本文。修飾包括，例如：(a) 末端修飾，例如5'端修飾（磷酸化、綴合、反向連接等），3'端修飾（綴合、DNA核苷酸、反向連接等），(b) 鹼基修飾，例如用穩定的鹼基、擾亂的鹼基或與擴展的配體庫鹼基配對的鹼基進行取代，鹼基（脫鹼基核苷酸）或綴合鹼基的去除，(c) 糖修飾（例如在2'位置或4'位置處）或糖的取代，以及 (d) 主鏈修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或取代。可用於本申請案的saRNA分子的具體示例包括但不限於含有修飾的主鏈或不含天然核苷間鍵的RNA。在一些實施例中，具有修飾的主鏈的RNA包括在主鏈中不具有磷原子的RNA。在一些實施例中，在其核苷間主鏈中不具有磷原子的修飾的RNA也可被認為是寡核苷。在一些實施例中，修飾的寡核苷酸在其核苷間主鏈中將具有磷原子。
修飾的寡核苷酸主鏈包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、亞膦酸酯、胺基磷酸酯（包括3'-胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基胺基磷酸三酯，以及具有正常3'-5'鍵的硼代磷酸酯，這些硼代磷酸酯的2'-5'連接的類似物，以及具有相反極性的化合物，其中相鄰的核苷單元對是3'-5'連接至5'-3'或2'-5'連接至5'-2'。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
製備含磷鍵的非限制性範例包括但不限於美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美國專利RE39464，這些專利在此通過參照方式整體併入本文。
在某些實施例中，小活化核酸分子是RNA、DNA、BNA、LNA或肽核酸（PNA）。
此外，為了促進saRNA進入細胞，在上述修飾的基礎上，可將化學綴合基團引入saRNA的有義股或反義股的末端，以促進通過由脂質雙分子層組成的細胞膜以及細胞核膜和細胞核內的基因啟動子區域的作用。
在某些實施例中，本申請案公開的saRNA共價連接至一個或多個綴合基團。在某些實施例中，綴合基團改變了所連接的寡核苷酸的一或多種性質，包括但不限於藥效學、藥物動力學、穩定性、結合、吸收、組織分布、細胞攝取、電荷和清除率。在某些實施例中，綴合基團賦予了所連接的寡核苷酸新的性質，例如綴合基團能夠檢測寡核苷酸的螢光團或報告基團。某些綴合基團和綴合部分先前已有描述，例如：膽固醇部分（Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989, 86, 6553-6556）；膽酸（Manoharan等人， Bioorg. Med. Chem. Lett.，1994, 4, 1053-1060）；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇（Manoharan等人， Ann. N.Y. Acad. Sci.，1992, 660, 306-309；Manoharan等人， Bioorg. Med. Chem. Lett.，1993, 3, 2765-2770）；硫代膽固醇（Oberhauser等人， Nucl. Acids Res.，1992, 20, 533-538）；脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras等人， EMBO1，1991, 10, 1111-1118；Kabanov等人， FEBS Lett.，1990, 259, 327-330；Svinarchuk等人， Biochimie，1993, 75, 49-54）；磷脂，例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯（Manoharan等人， Tetrahedron Lett.，1995, 36, 3651-3654；Shea等人， Nucl. Acids Res.，1990, 18, 3777-3783）；聚胺或聚乙二醇鏈（Manoharan等人， Nucleosides& Nucleotides，1995, 14, 969-973）或金剛烷乙酸棕櫚醯部分（Mishra等人， Biochim. Biophys. Acta，1995, 1264, 229-237），硬脂胺或己胺基-羰基-羥膽固醇部分（Crooke等人， J. Pharmacol. Exp. Ther.，1996, 277, 923-937），生育酚基團（Nishina等人， Molecular Therapy Nucleic Acids，2015, 4, e220；以及Nishina等人， Molecular Therapy，2008, 16, 734-740），或GalNAc簇（例如WO2014/179620）。
在一些實施例中，本申請案的saRNA涉及saRNA的綴合至選自以下項目之一或多個綴合基團的有義股或反義股：嵌入劑、報導分子、聚胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、維生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、膽固醇、硫代膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂質、磷脂、生物素、吩嗪、啡啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、螢光素、羅丹明、香豆素、螢光團和染料。
在一些實施例中，綴合基團包含活性藥物物質，例如阿司匹林、華法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹醯肌胺酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亞葉酸、苯並噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜䓬、吲哚美辛、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺類藥物、抗糖尿病藥物、抗菌劑或抗生素。
在一些實施例中，本申請案的saRNA綴合至選自以下項目之一或多個綴合基團：脂質、脂肪酸、螢光團、配體、醣、肽和抗體。
根據一些實施例，本公開提供化合物tC2或tC2x4， （tC2）， （tC2x4） 其中 代表載體材料。根據一些實施例， 代表選自二氧化矽、矽膠、玻璃、陶瓷、聚合物、纖維素以及它們的組合的載體材料。在一些實施例中，載體材料為微珠形式。微珠可由任何材料製成，包括但不限於磁珠、順磁珠、矽珠、瓊脂糖珠等。根據一些實施例，衍生自tC2的綴合基團具有如下所示的結構： 其中星號表示綴合基團直接或通過連接部分（例如上文指出的那些）與鏈連接的位點。根據另一實施例，衍生自tC2x4的綴合基團具有如下所示的結構： 其中星號表示綴合基團直接或通過連接部分（例如上文指出的那些）與鏈連接的位點。在一些實施例中，本申請案的saRNA涉及saRNA的綴合至選自以下項目之一或多個綴合基團的有義股或反義股：細胞穿透肽、聚乙二醇、生物鹼、色胺、苯並咪唑、喹諾酮、胺基酸、膽固醇、葡萄糖和N-乙醯半乳胺糖。在某些實施例中，綴合基團衍生自選自本申請案中所示的tC2和tC2x4的化合物。可以理解，tC2或tC2x4化合物的一個或多個末端原子（如氫、鹵素、氮、氧、硫、磷等）或末端基團（如羥基、胺基、酯基、醚基、醯基等）可脫離以提供綴合基團，因此綴合基團可被認為是通過從tC2或tC2x4化合物中減去該一個或多個原子或末端基團而獲得的部分。根據一個實施例，衍生自tC2或tC2x4的綴合基團通過連接部分如–OP(O) 2O-或–P(O)-O-與saRNA的鏈連接。根據一些實施例，連接至綴合基團的saRNA具有由O1或O2表示的結構： O1 O2
在一些實施例中，綴合至實施例中公開的一個或多個綴合基團的saRNA直接接觸、轉移至、遞送至或施用至細胞或患者。
在一些實施例中，saRNA的有義股和反義股獨立地具有至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%的化學修飾的核苷酸的核苷酸。
在一些實施例中，saRNA的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%的核苷酸是化學修飾的核苷酸。
這些修飾可提高saRNA的生體可用率，改善對標靶序列的親和力，並提高對細胞中的核酸酶水解的抗性。
在一些實施例中，本申請案的saRNA在與細胞接觸時，有效活化或調升細胞中一種或多種基因的表現，較佳為活化或調升至少10%（例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少500%、至少800%、至少1000%、至少2000%或至少5000%）。 標靶序列
在某些實施例中，本申請案涉及本申請案的saRNA的分離標靶位點，具體而言，該分離標靶位點是SEQ ID NO: 1390所示的核苷酸序列中具有在16至35個核苷酸範圍內的長度的核苷酸序列。在某些實施例中，分離標靶位點是選自SEQ ID NO: 1-272的核酸序列。分離標靶位點能夠與本申請案公開的saRNA的反義股相互作用，因此能夠活化 SERPING1基因的表現（例如，mRNA表現、蛋白表現、C1IHN表現）。在一些實施例中，在基因序列上選擇標靶位點。在一些實施例中，在靠近基因的轉錄起始位點（TSS）的序列上選擇標靶位點。在一些實施例中，在TSS的啟動子序列上游選擇標靶位點。在一些實施例中，在來自TSS上游-5000bp、-4000bp、-3000bp、-2000bp、-1000bp或-500bp的序列上選擇標靶位點。在一些實施例中，通過每次向TSS移動1bp，並產生標靶序列，然後重複該步驟並向TSS增加額外的鹼基對（例如，n+1）來選擇標靶位點。在一些實施例中，標靶位點具有約8至約35個核苷酸的長度。在一些實施例中，標靶位點具有約8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個核苷酸的長度。 熱點
在某些實施例中，本申請案涉及位於人類 SERPING1基因或小鼠 Serping1基因的轉錄起始位點上游的分離核酸序列，或即「熱點」。在某些實施例中，本文所公開的分離核酸序列是具有至少42個連續核苷酸長度的寡核苷酸序列，並且與SEQ ID NO: 1390所示的核苷酸序列內的等長區域具有至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%的序列同源性。「熱點」和「熱點區域」可以互換使用，並且在本文中被定義為saRNA的標靶序列上的核酸區域，其中功能性saRNA的全長標靶富集並跨每個熱點內第一個saRNA標靶的5'端到最後一個saRNA標靶的3'端。在一些實施例中，被設計成以熱點作為標靶的至少30%（例如，35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%）的saRNA是功能性的，即可誘導標靶基因的mRNA水準或蛋白表現的至少1.1倍的變化。在非限制性範例中，根據以下標準設計saRNA：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。在一些實施例中，分離核酸具有約25至約250個核苷酸（例如，約33至約200個核苷酸、約36至約150個核苷酸、約39至約100個核苷酸、約42至約75個核苷酸、約45至約70個核苷酸或約48至約55個核苷酸）的長度。在一些實施例中，熱點是選自SEQ ID NO: 1391-1395的核酸序列。在一些實施例中，熱點是選自 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域、-357至-279區域、-256至-215區域、-125至-81區域和-80至-15區域的核酸序列。本申請案還提供了一種設計saRNA的方法，該方法提供了以本申請案所述分離核酸序列作為標靶的saRNA。
每種設計的saRNA的RNAa活性取决於複雜的無數因素，例如染色質環境、標靶本身和附近區域的序列特徵、轉錄因子結合等。核心潜在的决定性因素可以是DNA標靶的可及性。在具有較高可及性的區域中，dsRNA可顯示出較高的RNAa活性。而設計為以啟動子的其他區域作為標靶的dsRNA可表現出非功能性或甚至轉錄沉默效應。這可解釋存在熱點區，其中功能性saRNA聚集在一起。
在一些態樣中，還提供了使用 SERPING1基因的轉錄標靶位點上游的分離核酸的方法。 編碼saRNA的DNA
在某些實施例中，本申請案涉及編碼saRNA的核酸或多核苷酸，該saRNA可將細胞中 SERPING1基因的表現活化或調升至少10%。在某些實施例中，核酸是編碼saRNA的DNA。在某些實施例中，核酸是重組載體，具體而言是重組AAV載體。本文公開的載體包括編碼本申請案的saRNA的DNA片段。 包含saRNA的細胞
在接觸細胞之後，本文公開的saRNA可有效地活化或調升細胞中 SERPING1基因的表現，較佳為將表現調升至少10%。
在某些實施例中，本申請案涉及一種包含本文公開的saRNA的細胞。在一些實施例中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞是人類細胞，例如人類胚胎肝細胞、人類肝癌細胞（例如HepG2細胞）和人類肝細胞，或者來自小鼠的細胞，例如小鼠胚胎肝細胞（例如胚胎細胞系BNL.CL2）、小鼠肝癌細胞（例如肝癌細胞系LPC-H12）和初代小鼠肝細胞（PMH）。本文公開的細胞可以是體外的或離體的形式，例如細胞系或細胞株，也可以存在於哺乳動物體內，例如人體內。本文公開的人體是患有由 SERPING1基因突變、低C1IHN水準和/或功能性血液C1IHN蛋白水準不足引起的疾病或症狀的患者。在一些實施例中，細胞來自HAE患者。 包含saRNA的組合物
在某些實施例中，本申請案涉及一種包含本申請案的saRNA或核酸的組合物或藥物組合物。在一些實施例中，組合物包含至少一種藥學上可接受的載體。在一些實施例中，組合物包含至少一種藥學上可接受的載體，該藥學上可接受的載體選自水性載體、脂質體或LNP、聚合物、微胞、膠體、金屬奈米粒子、非金屬奈米粒子、生物綴合物（例如GalNAc）、多肽和抗體。在一個實施例中，水性載體可以是例如無RNase水或無RNase緩衝液。組合物可含有0.001nM-150nM，例如0.01nM-100nM，例如0.1nM-50nM，例如1nM-20nM，例如0.001nM-1nM、1nM-10nM、10nM-100nM、10nM-50nM、20nM-50nM、20nM-100nM，例如50nM的上述saRNA或根據本申請案的分離多核苷酸。在一些實施例中，組合物包含1nM-150nM的本申請案的saRNA。 使用saRNA的方法
本申請案的另一態樣涉及用於活化/調升細胞中 SERPING1表現的saRNA。該saRNA包含具有16個至35個連續核苷酸長度的寡核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸序列與SEQ ID NO: 1390所示的等長區域具有至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%的同源性或互補性，具體而言，saRNA將 SERPING1基因的表現活化/調升至少10%（例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少500%、至少800%、至少1000%、至少2000%或至少5000%）。在某些實施例中，當例如向細胞或受試者施用實施例中公開的saRNA時，將 SERPING1基因的表現活化/調升至少5倍（例如，至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少18倍、至少20倍或至少24倍）。在某些實施例中，saRNA將 SERPING1基因的表現活化/調升24倍。在某些實施例中，通過向細胞施用濃度為至少0.01nM，例如，0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM的實施例中公開的saRNA來活化/調升 SERPING1基因的表現。在某些實施例中，通過向細胞施用濃度為至少0.01nM，例如，0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM的實施例中公開的saRNA來活化/調升 SERPING1蛋白（C1INH）的誘導。
本申請案的另一態樣涉及預防或治療個體的由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的病症或病况的方法，該方法包括：向該個體施用有效量的本文公開的saRNA、編碼saRNA的核酸或分離多核苷酸或包含saRNA的組合物。在某些實施例中，本文公開的saRNA的有效量可以是0.01nM至50nM範圍內的濃度，例如0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.08nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.8nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM或150nM。在一些實施例中，病症或病况是遺傳性血管性水腫（HAE）。在一些實施例中，個體是哺乳動物。在一些實施例中，個體是人類。
在本文提供的任何實施例中，此類saRNA、編碼本申請案的saRNA的核酸或包含本申請案的此類saRNA的組合物可直接引入細胞中，或者可在將編碼saRNA的核苷酸序列引入細胞（例如哺乳動物細胞，包括但不限於HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和PMH，或人類細胞）後在細胞內產生。此類細胞可以是離體的形式，例如細胞系等，也可以存在於哺乳動物（例如人類）體內。在一些實施例中，人類是患有C1INH缺乏相關的病况或HAE的患者或個體。在某些實施例中，本申請案的核酸或編碼saRNA的分離多核苷酸或包含上述saRNA的組合物各自以足以實現HAE的治療的量存在。
本申請案的另一態樣涉及實施例中公開的saRNA對個體的施用途徑。在一些實施例中，施用途徑選自以下項中的一種或多種：腸胃外輸注、口服施用、鼻內施用、吸入施用、陰道施用和直腸施用。在一些其他實施例中，施用途徑選自以下項中的一種或多種：椎管內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、膀胱內、腦室內、玻璃體內和皮下施用。 給藥方案和施用途徑
本申請案的態樣涉及一種包含本發明的saRNA的藥物組合物。在一些實施例中，藥物組合物包含本申請案的saRNA和藥學上可接受的載體、治療性惰性載體、稀釋劑或藥學上可接受的賦形劑。本文公開的藥物組合物將開發成預防或治療C1INH缺乏相關的病况或HAE的藥物。
本申請案的態樣還涉及使用本申請案的saRNA製備此類組合物的方法。
本申請案的另一態樣涉及本申請案的saRNA在製備本文公開的藥物組合物中的用途。
本申請案的另一態樣涉及根據本文所述的實施例中的任一實施例的saRNA或分離多核苷酸或根據本文所述的實施例中任一實施例的組合物在製備用於預防或治療個體的由C1IHN蛋白的表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN蛋白水準誘導的基因或蛋白相關症狀的藥物中的用途。根據某些實施例的用途，病况可包括 SERPING1突變相關的病症或病况，其包括遺傳性血管性水腫疾病。根據某些實施例的用途，由C1IHN蛋白表現不足所誘導的症狀是遺傳性血管性水腫。還涉及根據某些實施例的用途，其中個體是哺乳動物，例如人類。
本申請案的saRNA或組合物可施用的劑量可在很大的範圍內變化，當然將符合每種情況下的個體需求。在某些實施例中，當受試者的年齡小於一週、小於一個月、小於3個月、小於6個月、小於一歲、小於2歲、小於15歲或大於15歲時，施用第一劑量的根據本申請案的藥物組合物。
saRNA的單劑量可以是0.01mg/kg至1000mg/kg，例如，約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、120mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、750mg/kg或1000mg/kg範圍內的單劑量。本文所述的劑量可含有本申請案的saRNA內的兩種或更多種saRNA序列。
擬定的給藥頻率是近似的，例如，在某些實施例中，如果擬定的給藥頻率是在第1天給藥並在第29天第二次給藥，則HAE患者可在接受第一次給藥25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天或34天後接受第二次給藥。例如，在某些實施例中，如果擬定的給藥頻率是在第1天給藥並在第15天第二次給藥，則HAE患者可在接受第一次給藥10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天後接受第二次給藥。例如，在某些實施例中，如果擬定的給藥頻率是在第1天給藥並在第85天第二次給藥，則HAE患者可在接受第一次給藥80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天或90天後接受第二次給藥。
在某些實施例中，注射的劑量和/或體積將基於患者的年齡、患者的體重、患者的體表面積、患者的症狀和/或患者的性別進行調節。
在某些實施例中，藥物組合物包含共溶劑體系。舉例來說，此類共溶劑體系包含苯甲醇、非極性界面活性劑、水混溶性有機聚合物和水相。在某些實施例中，此類共溶劑體系用於疏水性化合物。這種共溶劑體系的非限制性範例是VPD共溶劑體系，其為包含3% w/v苯甲醇、8% w/v非極性界面活性劑Polysorbate 80™和65% w/v聚乙二醇300的無水乙醇溶液。此類共溶劑體系的比例可以在不顯著改變其溶解度和毒性特性的情況下發生極大變化。此外，共溶劑組分的種類（identity）可以發生變化：例如，可以使用其他界面活性劑代替Polysorbate 80™；聚乙二醇的級分大小可以變化；其他生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；並且其他糖或多醣可以代替右旋糖。
與本文所述的小活化核酸分子、組合物和方法相關的其他組合物或組分的示例包括但不限於：稀釋劑、鹽、緩衝液、螯合劑、防腐劑、乾燥劑、抗微生物劑、針頭、注射器、包裝材料、管、瓶、燒瓶、燒杯等，例如用於使用、修飾、組裝、儲存、包裝、製備、混合、稀釋和/或保存特定用途的組分。在使用任何組分的液體形式的實施例中，液體形式可以是濃縮或可直接使用的形式。
核酸療法中使用的脂質部分可應用於本申請案以遞送本文公開的saRNA分子。在某些此類方法中，將核酸，例如寡聚化合物，引入由陽離子脂質和中性脂質的混合物製成的預製脂質體或脂質複合物中。在某些方法中，在不存在中性脂質的情況下形成具有單陽離子或多陽離子脂質的saRNA複合物。在某些實施例中，選擇脂質部分以提高藥劑向特定細胞或組織的分布。在某些實施例中，選擇脂質部分以提高藥劑向脂肪組織的分布。在某些實施例中，選擇脂質部分以提高藥劑向肌肉組織的分布。
在某些實施例中，藥物組合物包含遞送系統。遞送系統的範例包括但不限於脂質體和乳劑。某些遞送系統可用於製備某些藥物組合物，包括包含疏水性化合物的那些藥物組合物。在某些實施例中，使用某些有機溶劑，例如二甲亞碸。
在某些實施例中，藥物組合物包含被設計成將本發明的一或多種藥劑遞送至特定組織或細胞類型的一或多種組織特異性遞送分子。例如，在某些實施例中，藥物組合物包括用組織特異性抗體包覆的脂質體。
在一些實施例中，saRNA可經由載體遞送或施用。可使用任何可用於基因遞送的載體。在一些變化中，可使用病毒載體（例如AAV、腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒）。可在本申請案中使用的載體的非限制性範例包括但不限於人類免疫缺乏病毒、單純疱疹病毒（HSV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（Moloney murine sarcoma virus，MMSV）、鼠幹細胞病毒（MSCV）、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus，SFV）、辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SIN）、委內瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEE）、水泡性口炎病毒（VSV）和牛痘病毒（VV）。
在一些實施例中，載體是重組AAV載體。AAV載體是尺寸相對較小的DNA病毒，其能以穩定和位點特異性的方式整合到它們所感染的細胞的基因組中。它們能夠感染廣泛的細胞，而不誘導對細胞生長、形態或分化的任何作用，並且它們並未顯示涉及人類病理。AAV基因組已進行了複製、定序和特徵化。它包含大約4700個鹼基，並在每端含有大約145個鹼基的反向末端重複（ITR）區域，該ITR區域作為病毒的複製起點。基因組的其餘部分被分成具有封裝功能的兩個必需區域：基因組的左側部分，其含有參與病毒複製和病毒基因表現的rep基因；以及基因組的右側部分，其含有編碼病毒殼蛋白的cap基因。
AAV載體可使用本領域的標準方法製備。任何血清型的腺相關病毒都適合（例如，請參閱Blacklow，「Parvoviruses and Human Disease」的第165至174頁，J. R. Pattison編輯（1988）；Rose，Comprehensive Virology 3:1，1974；P. Tattersall，「The Evolution of Parvovirus Taxonomy」In Parvoviruses（J R Kerr、S F Cotmore.、M E Bloom、R M Linden、C R Parrish編輯）第5至14頁，Hudder Arnold，英國倫敦（2006）；以及D E Bowles、J E Rabinowitz、R J Samulski，「The Genus Dependovirus」（J R Kerr、S F Cotmore.、M E Bloom、R M Linden、C R Parrish編輯）第15至23頁，Hudder Arnold，英國倫敦（2006），以上揭露內容通過參照方式整體併入本文）。例如，有關用於純化載體的方法，可參閱美國專利號6,566,118、6,989,264和6,995,006以及標題為「Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors」的WO/1999/011764，其揭露內容通過參照方式整體併入本文。例如，PCT申請號PCT/US2005/027091中描述了雜合載體的製備，其揭露內容通過參照方式整體併入本文。已有使用衍生自AAV的載體在體外和體內轉移基因的相關描述（例如，請參閱國際專利申請公開號91/18088和WO 93/09239；美國專利號4,797,368、6,596,535和5,139,941；以及歐洲專利號0488528，所有這些專利均通過參照方式整體併入本文）。這些出版物描述了多種rep和/或cap基因被刪除並被目的基因取代之AAV衍生的建構體，以及使用這些建構體在體外（進入培養的細胞）或體內（直接進入生物體）轉移目的基因。根據本申請案的複製缺陷型重組AAV可以通過將含有兩側為兩個AAV反向末端重複（ITR）區域之目的核酸序列的質體和攜帶AAV封裝基因（rep和cap基因）的質體共轉染至人類輔助病毒（例如腺病毒）感染的細胞株中，以進行製備。然後，產生的AAV重組體會通過標準技術純化。
在一些實施例中，用於本申請案的方法的載體會被封裝到病毒顆粒中（例如AAV病毒顆粒，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16）。因此，本申請案可包括包含本文所述的任何載體的重組病毒顆粒（重組的形式，因為其含有重組多核苷酸）。製備此類顆粒的方法屬於本領域的已知範圍，並且美國專利號6,596,535中提供了相關描述。
本申請案的製劑、藥物組合物或藥物以符合「良好醫療實踐（good medical practice）」的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病況、病症的原因、藥劑的遞送部位、施用方法、施用的時間安排，以及醫師已知的其他因素。
對於本申請案的製劑、藥物組合物或藥物，遞送可選擇性通過腸胃外輸注，包括椎管內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、膀胱內、腦室內、玻璃體內或皮下施用；或通過口服施用、鼻內施用、吸入施用、陰道施用或直腸施用。
本申請案中的小活化核酸分子的典型製劑通過將本申請案的saRNA與載體或賦形劑混合來製備。本領域技術人員熟知合適的載體和賦形劑，其詳細描述包括：例如Ansel H. C.等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（2004）Lippincott，Williams & Wilkins，費城；Gennaro A. R.等人，Remington: The Science and Practice of Pharmacy（2000）Lippincott，Williams & Wilkins，費城；以及Rowe R. C，Handbook of Pharmaceutical Excipients（2005）Pharmaceutical Press，芝加哥。製劑還可包括一種或多種緩衝液、穩定劑、界面活性劑、潤濕劑、潤滑劑、乳化劑、助懸劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、助流劑、加工助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、調味劑、稀釋劑和其他已知的添加劑，以提供藥物（即，本申請案的saRNA或其藥物組合物）的優雅呈現或有助於藥物產品（即，藥物）的製備。 診斷方法
本申請案的另一態樣涉及用於檢測血液中C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（例如，緩激肽）的方法。在某些實施例中，該方法用於檢測用本文公開的saRNA、分離多核苷酸或包含saRNA的組合物轉染的細胞中的C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（例如，緩激肽）。作為某些實施例，本文公開的方法可用於檢測特定亞組的患者，這些患者患有由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足、SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的病症或病况。作為本文公開的方法的另選的實施例，該方法可用於上述通過本申請案的saRNA、編碼saRNA的核酸或分離多核苷酸、組合物或藥物治療的患者的療效或安全性監測。
在某些實施例中，基線測量值獲取自如本文所定義的生物樣本，該生物樣本在施用本文所述的療法之前從個體中獲得。在某些實施例中，生物樣本是周邊血液單核細胞、血漿、血清、皮膚組織、腦脊髓液（CSF）。
在一些實施例中，與上述基線測量值相比，本文提供的saRNA將功能性血液C1INH蛋白的量活化至少10%（例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少500%、至少800%、至少1000%、至少2000%或至少5000%）。
在一個具體實施例中，saRNA在由 SPERING1基因突變引起的疾病的治療、預防、延緩進展和/或改善方面，並且附加地對於與疾病的病理生理學有關的細胞的保護，特別是對於HAE的治療、預防、延緩進展和/或改善顯示出比累加效應或協同效應更大的效應。
本申請案另一態樣涉及用於活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的方法，該方法包括：施用本文公開的實施例的saRNA或分離多核苷酸或組合物。在一些實施例中，將saRNA或分離多核苷酸或組合物直接引入細胞中。在一些實施例中，本文公開的實施例的saRNA是在將編碼saRNA的核苷酸序列引入細胞後在細胞中產生的。在一些實施例中，本文公開的細胞是哺乳動物細胞，較佳為人類細胞。
本申請案的另一態樣涉及用於提高患者的細胞中C1IHN蛋白水準或功能性血液C1IHN蛋白水準的方法，該方法包括將本文公開的實施例的有效量的saRNA、編碼saRNA的核酸或多核苷酸或組合物引入細胞或受試者中。 套組
本申請案的另一態樣涉及用於實施提高細胞中C1IHN蛋白水準或中功能性血液C1IHN蛋白水準的方法的套組，該套組包括實施例中公開的saRNA和使用說明書。在某些實施例中，套組還包括用於向個體施用該saRNA的手段。在某些實施例中，套組在有標籤的包裝中，並且該包裝上的標籤指示saRNA或組合物可用於預防或治療由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足誘導的或針對HAE的疾病或病况。
如本文所用，「套組」通常定義為包括本申請案的組分或實施例中的一者或多者和/或與本申請案相關的其他組分的包裝、組件或容器（例如隔熱容器），例如如上所述。套組的任何藥劑或組分可以液體形式（例如，溶液）或以固體形式（例如，乾燥粉末、冷凍等）提供。
在其他實施例中，套組可包括為使用與本文所述的組分和/或方法相關的套組提供的任何形式的說明書、網站或其他來源的說明書。例如，說明書可包括針對與套組相關的組分和/或其他組分的使用、修飾、混合、稀釋、保存、組裝、儲存、包裝和/或製備的說明書。在一些情況下，說明書還可包括針對組分的遞送（例如在室溫、零下溫度、低溫等條件下運輸或儲存）的說明書。說明書能以套組的使用者可用的任何形式（例如書面或口頭（例如電話）、數位、光學、視覺（例如錄影帶、DVD等）和/或電子通訊（包括網際網路或基於網路的通訊）形式）來通過任何方式提供。
本申請案的另一態樣涉及用於檢測血液中C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（例如，緩激肽）的套組。在某些實施例中，套組用於檢測用本文公開的實施例中任一實施例的saRNA或分離多核苷酸或本文公開的組合物轉染的細胞中的C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（例如，緩激肽）。 saRNA合成
本申請案提供了用於製備小活化核酸分子的方法，該方法包括序列設計和合成。
小活化核酸分子可化學合成，或者可獲自專門研究核酸合成的生物技術公司。一般而言，核酸的化學合成包括以下四個步驟：a) 合成寡聚核糖核苷酸；b) 脫保護；c) 純化和分離；d) 脫鹽和退火。例如，化學合成saRNA的具體步驟如下： 合成寡聚核糖核苷酸：
在自動DNA/RNA合成儀（例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909）中合成1μM的RNA，並且每個循環的耦合時間設置為10分鐘至15分鐘。用固相結合的5'-O-p-二甲氧基三苯甲基-胸苷基質作為起始物，在第一個循環中將一個鹼基結合至固相基質，然後在第n個（19≥n≥2）循環中將一個鹼基結合至在第n-1個週期中結合的鹼基。重複該過程直至完成整個核酸序列的合成。 脫保護
將與saRNA結合的固相基質放入試管中，並將1mL乙醇和氫氧化銨（體積比：1:3）的混合物溶液加入試管。然後將試管密封並放置在培養箱中，將混合物在25℃至70℃下溫育2小時至30小時，過濾含有與saRNA結合的固相基質的溶液，並收集濾液。用雙蒸水（每次1mL）沖洗固相基質兩次，收集濾液。合併收集到的洗脫液，真空乾燥1小時至12小時，然後將1mL的四丁氟化銨的四氫呋喃（1M）溶液加入溶液，室溫下靜置4小時至12小時，然後加入2mL正丁醇。通過高速離心收集沉澱物，得到saRNA單股粗產物。 純化和分離
將得到的saRNA粗產物溶解於2mL的濃度為1mol/mL的乙酸銨水溶液中，用反相C18高壓液相層析柱分離該溶液，得到純化的saRNA單股產物。 脫鹽和退火
通過凝膠過濾（粒徑排阻層析法）除去鹽。將單個有義寡聚核糖核酸股和單個反義寡聚核糖核酸股以1:1的莫耳比混合到1mL至2mL的緩衝液（10mM Tris，pH=7.5-8.0，50mM NaCl）中。將溶液加熱至95℃，然後緩慢冷卻至室溫，得到含有saRNA的溶液。 細胞培養和處理
在37℃、5% CO 2的條件下，將人類肝癌HepG2（SCSP-510，國家認證細胞培養物保藏中心，中國）細胞置於補充有10%小牛血清（Sigma-Aldrich）和1%青黴素/鏈黴素（Gibco）的改良DMEM培養基（Gibco，賽默飛世爾科技，加利福尼亞州卡爾巴斯德市）中培養。從C57BL/6J小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）的肝分離出PMH，並在5% CO 2和37℃的條件下，將PMH置於補充有1%胰島素（S6955，Selleck，美國）和1%青黴素/鏈黴素（Gibco）的改良Willian's Medium E（WME）培養基（A12176-01，Gibco，賽默飛世爾科技，加利福尼亞州卡爾巴斯德市）中培養。將HepG2和PMH細胞分別以5000個細胞/孔接種到96孔盤中。按照逆轉染方案，分別用終濃度為2.5nM、10nM或25nM或任何其他濃度的0.3μL的RNAiMAX（Invitrogen，加利福尼亞州卡爾巴斯德市）將saRNA單獨轉染到每個孔中的HepG2細胞中，轉染持續時間為72小時。Mock（空白對照）是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2（SEQ ID NO: 547和821）作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2（SEQ ID NO: 273、546和820是SERPING1基因的雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。 RT-qPCR、PI染色和ELISA測定 (1)一步法反轉錄-定量聚合酶連鎖反應（一步法RT-qPCR）
轉染結束時，丟棄培養基，每孔用150μL PBS洗滌細胞一次。去除PBS之後，將100μL細胞裂解緩衝液（Power SYBR® Green Cellsto-Ct™套組，Life Technologies）加入每個孔中，並在室溫下溫育5分鐘。從每個孔中取出0.5μL溶胞液，並在Roche Lightcycler 480即時PCR儀中使用One Step TB Green TMPrimeScript TMRT-PCR套組II（Takara，RR086A）通過RT-qPCR進行分析。使用Bravo自動化液體處理平台（安捷倫）製備PCR反應。每個轉染樣本在3個重複孔中進行擴增。PCR反應條件如下表3所示。 表3. PCR反應製備
試劑 體積（μL）
2× One Step TB Green RT-PCR buffer 4 2.5
PrimeScript TM1 step enzyme Mix 2 0.2
正向和反向引子混合物（5μM） 0.4
無RNase的dH 2O 1.6
粗溶胞產物（RNA） 0.4 
總體積 5.1
反應條件如下：反轉錄反應（階段1）：42℃ 5分鐘，95℃ 10秒；PCR反應（階段2）：95℃ 5秒，59℃ 20秒，72℃ 10秒；40個擴增循環；和熔化曲線（階段3）。擴增人類 SERPING1基因和小鼠 Serping1基因作為標靶基因。還擴增人類參照基因（ HPRT1和 TBP）和小鼠參照基因（ Hprt1和 Tbp）作為RNA負載的內部對照。所有引子序列均在表4中列出。 表4. 用於RT-qPCR測定的引子序列
引子 基因 SEQ ID NO 序列（5'-3'） 產物長度（bp）
SERPING1 F 人類 SERPING1 1378 TGCTATCTACCTGAGTGCCAAG 126
SERPING1 R 1379 GCCACAGGGTACTTCTTGCTA
HPRT1 F 人類 HPRT1 1380 AAAGATGGTCAAGGTCGCAAG 120 
HPRT1 R 1381 TAGTCAAGGGCATATCCTACAAC
TBP F 人類 TBP 1382 TGCTCACCCACCAACAATTTAG 139
TBP R 1383 TCTGCTCTGACTTTAGCACCTG
Serping1 F 小鼠 Serping1 1384 TACTTTGAAGGCCAAGGTGGGA 60
Serping1 R 1385 ACGATCACAAAGCTCAGGTTG
Hprt1 F 小鼠 Hprt1 1386 GATCAGTCAACGGGGGACAT 150
Hprt1 R 1387 CATTTTGGGGCTGTACTGCTT
Tbp F 小鼠 Tbp 1388 CCGTGAATCTTGGCTGTAAACT 116
Tbp R 1389 TGTCCGTGGCTCTCTTATTC
(2)兩步法RT-qPCR
為了定量mRNA在細胞中的表現，使用RNeasy Plus Mini套組（Qiagen，德國希爾登），根據其說明書從處理過的細胞中分離出總細胞RNA。通過使用含有gDNA Eraser（Takara，日本滋賀）的PrimeScript RT套組，將所得RNA（1μg）反轉錄為cDNA。在Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 384（羅氏，參考：4729749001，美國）中使用SYBR Premix Ex Taq II（Takara，日本滋賀）試劑和特異性擴增目的標靶基因的引子來擴增所得cDNA。反應條件如下：反轉錄反應（階段1）：42℃ 5分鐘，95℃ 10秒；PCR反應（階段2）：95℃ 5秒，60℃ 30秒，72℃ 10秒；40個擴增循環；熔化曲線（階段3）。PCR反應條件如表5和表6所示。 表5. RT反應
反應-1（Takara，RR047A） 體積（μL）
5× gDNA Eraser緩衝液 2
gDNA Eraser 1
總RNA（1μg）+無RNase的dH 2O 7
總體積 10
42℃ 5分鐘，4℃儲存 　
試劑-2（Takara，RR047A） 　
5× PrimeScript Buffer 2 4
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1
RT Prime Mix 1
無RNase的dH 2O 4
反應-1 10
總體積 20
37℃ 15分鐘，85℃ 5秒，4℃儲存 　
表6. RT-qPCR反應
試劑（Takara，RR820A） 體積（μL）
SYBR Premix Ex Taq II（2×） PCR引子（正向+反向），5μM cDNA（RT產物） 5 1 4
總計 10
為了計算saRNA轉染樣品中 SERPING1或 Serping1（標靶基因）相對於對照處理（Mock）的表現水準（ E rel ），將標靶基因和兩個內部參考基因的Ct值代入式III， （式III） 其中CtT m是來自mock處理樣本之標靶基因的Ct值；CtT s是來自saRNA處理樣本之標靶基因的Ct值；CtR1 m是來自mock處理樣本之內部參考基因1的Ct值；CtR1 s是來自saRNA處理樣本之內部參考基因1的Ct值；CtR2 m是來自mock處理樣本之內部參考基因2的Ct值；並且CtR2 s是來自saRNA處理樣本之內部參考基因2的Ct值。 (3) 碘化丙啶（PI）染色
saRNA處理後，將HepG2或PMH細胞置於96 孔盤中培養72小時。將細胞用冷PBS洗滌，並用40μL/孔的含有1.5μM PI的溶胞緩衝液（0.25% Igeal CA-630，140mM NaCl，2mM DTT，10mM Tris，pH 7.4）進行溶胞。將板在冰上培養5分鐘，然後在盤式分析儀系統（Infinite M2000 Pro）上，在535nm激發和615nm發射波長處測量光學密度（OD）。 (4)ELISA測定
為了對人類SERPING1蛋白表現水準進行定量，收集培養的細胞（例如，HepG2、Hep3B或PLC/PRF/5）的上清液，並使用ELISA套組（R & D Systems，目錄號：DY008，DY2488-05，美國）通過OD值進行檢測。根據套組製造商提供的以下ELISA套組說明書，獲得人類SERPING1蛋白表現水準。 (5)統計分析
使用單因素方差分析（ANOVA），然後進行Tukey多重比較來對連續變量組之間的差異進行比較。 P值小於0.05的 P值被認為是顯著不同的。*/#表示 p ＜0.05，**/##表示 p ＜0.01，***/###表示 p＜ 0.001，****/####表示 p ＜0.0001。 動物外科手術
所有動物外科手術均由經過認證的實驗室人員進行，並使用符合當地和州法規且由實驗動物管理和使用委員會核准的方案進行。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司的C57BL/6J小鼠（B204，中國北京）通過皮下（SC）注射給藥。 初代小鼠肝細胞（PMH）分離和自由攝取測定
將C57BL/6J小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）用異氟烷麻醉，並依次灌注初始沖洗試劑和消化試劑，然後將肝置於含有培養基的10cm培養皿中。用兩把鑷子撕開肝葉，得到懸浮液，將其通過70微米至75微米的膜過濾，將細胞懸浮液收集在50mL錐形管中。然後，在4℃下以100×g在搖臂離心機中離心2分鐘，除去上清液並用移液管吸取20mL冷PBS洗滌細胞（重複洗滌兩次）。使用0.4%台盼藍測試細胞生存力，並將細胞接種到在細胞接種前4小時至12小時包覆I型膠原蛋白的細胞培養板，以確保培養基中至少60%細胞匯合。確保所有細胞在接種後生長至其完整大小，達到90%至95%的最終匯合度，以進行實驗。
本申請案中發現，上述saRNA在被引入細胞後，能有效提高 SERPING1mRNA和蛋白質的表現水準。
以下將參考具體的實施例和圖式對本申請案進行進一步說明。請務必理解，這些實施例僅用於說明本申請案，而不用於限制本申請案的範圍。在以下實施例中，未標註具體條件的研究方法通常按照常規條件，例如Sambrook等人，Molecular Cloning: Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的條件，或按照製造商推薦的條件。 實施例 實施例1：以人類 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA的設計和合成
從ENSEMBL基因組資料庫中檢索了人類 SERPING1基因的啟動子序列（從轉錄起始位點（TSS）至上游-500bp的片段）（SEQ ID NO: 1390）的編碼股。為了鑑定能夠活化 SERPING1基因的表現的功能性小活化RNA（saRNA），在500bp SERPING1啟動子序列（表7）上選擇一系列19nt saRNA標靶，從TSS的上游-500bp開始，每次向TSS移動1bp，並產生標靶序列。 表7. 推定的人類 SERPING1啟動子序列（5'-3'）（SEQ ID NO: 1390） -500 tttttttttt ttttttaatt aggttgaatg cttgttgagc tgggtgcctc -450 acatccgttg tctgttatac aaagaactac tgattatggg tctctacgag -400 caaaaatggc agaacaccta cagggcacag gggagatggg agcagggatt -350 aggcttcaga atacttctcc aaatgagggt gatcagggcc cgacatttca -300 ctgctctaag gctcagtatc ttaactatca aatgggtaca atggggcaca -250 aagggttact ttgaggaata acggaggtga gcaatttcca aaaagttcat -200 tcctttaaaa actgcggagc acattttgtg tacatgctgt ttttattgtt -150 actcatgaag acgcggggga agctttggtt gtgtaaagct gagaactgca -100 cccaagcttc cccgttcacc ccacctacca ggggatttgg gctaaattcc -50 tggcctggcc cacaaagaag accaagcggt cagtcccatt ccgtcccatc
然後過濾標靶序列以保留符合以下標準的那些標靶序列：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。過濾後，保留272種標靶序列用來判定候選saRNA的有義股序列。
設計saRNA，使得有義股序列和反義股序列形成saRNA雙股體，其中有義股和反義股中的每一者的長度為21nt。saRNA的第一核糖核酸股（有義股）的5'區域中的19個核苷酸與啟動子的標靶序列具有100%的序列同一性，並且第一核糖核酸股的3'末端包括額外的2nt dTdT序列。可能的情況是，第二核糖核酸股（反義股）的5'區域中的19個核苷酸與第一核糖核酸股序列互補，並且第二核糖核酸股的3'末端包括額外的2nt dTdT序列。化學合成上述saRNA的兩條股，以1:1的莫耳比混合並退火，獲得雙股體saRNA。表1列出了實施例中設計的saRNA標靶序列、它們的有義股和反義股。 實施例2：以人類 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA的高通量篩選
為了鑑定能夠活化 SERPING1轉錄的saRNA，用上述272種saRNA中的每一種以25nM的轉染濃度轉染HepG2細胞。72小時後，裂解轉染的細胞，通過一步法RT-qPCR對溶胞產物進行分析，以獲得每個saRNA處理的樣品的 SERPING1基因的相對（與Mock處理相比）表現水準。 SERPING1mRNA的相對表現的結果（倍數變化）在表1中列出。圖1示出了從最強活化蛋白到最強抑制蛋白中分選的 SERPING1saRNA的活性分布（log2）。表8進一步示出了101種（37.1%）、27種（9.9%）和11種（4.0%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準顯示出高度活化（≥1.5倍）、中度活化（1.2倍-1.5倍）和輕度活化（1.1倍-1.2倍）。133種（49.0%）saRNA對 SERPING1mRNA的表現沒有明顯影響。觀察到的對 SERPING1mRNA表現的最高活化是24.69倍。具有活化活性的saRNA在本申請案中稱為「功能性saRNA」。 表8. 所有篩選的 SERPING1saRNA的活性總結
saRNA活性 SERPING1mRNA的log 2值變化（倍數） saRNA的數量 百分比（%）
高度活化 ≥ 0.49 (1.50) ~ ≤ 4.62 (24.69) 101 37.1
中度活化 ≥ 0.26 (1.20) ~ ＜ 0.49 (1.50) 27 9.9
輕度活化 ≥ 0.13 (1.10) ~ ＜ 0.26 (1.20) 11 4.0
無影響 ＜ 0.13 (1.10) 133 49.0
總計 　 272 100
當功能性saRNA通過它們在人類 SERPING1啟動子上的位置進行分類時（圖2），可以清楚地看到，功能性saRNA以聚集的方式分布在啟動子上，即在某些啟動子區中，存在功能性saRNA富集的「熱點」。在所測試的啟動子序列中，相對於TSS，存在5個熱點位於-466至-399區域（H1）、-357至-279區域（H2）、-256至-215區域（H3）、-125至-81區域（H4）和-80至-15區域（H5），並包含高度富集的功能性saRNA。通過遵循設計標準：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複，以所提供的熱點序列作為標靶的經設計saRNA的至少30%可將 SERPING1基因的表現活化至少10%。
能夠將 SERPING1表現調升至少1.1倍並且位於熱點H1（-466至-399）上的功能性saRNA序列如下： DS12A-0224、DS12A-0156、DS12A-0126、DS12A-0193、DS12A-0201、DS12A-0137、DS12A-0141、DS12A-0168、DS12A-0113、DS12A-0079、DS12A-0094、DS12A-0063、DS12A-0022、DS12A-0007、DS12A-0037、DS12A-0020、DS12A-0096、DS12A-0116、DS12A-0175、DS12A-0042、DS12A-0089、DS12A-0111、DS12A-0112、DS12A-0133、DS12A-0090。
位於熱點H2（-357至-279）的功能性saRNA序列如下： DS12A-0011、DS12A-0012、DS12A-0026、DS12A-0027、DS12A-0051、DS12A-0100、DS12A-0147、DS12A-0148、DS12A-0101、DS12A-0119、DS12A-0144、DS12A-0066、DS12A-0085、DS12A-0067、DS12A-0220、DS12A-0221、DS12A-0209、DS12A-0271、DS12A-0261、DS12A-0115、DS12A-0138、DS12A-0062、DS12A-0139、DS12A-0080、DS12A-0231、DS12A-0217、DS12A-0140、DS12A-0173、DS12A-0169、DS12A-0114、DS12A-0092、DS12A-0023、DS12A-0021、DS12A-0043、DS12A-0177、DS12A-0182、DS12A-0178、DS12A-0084、DS12A-0102、DS12A-0104、DS12A-0056、DS12A-0004、DS12A-0013、DS12A-0014、DS12A-0070、DS12A-0028。
可能的是，位於熱點H3（-256至-215）的功能性saRNA序列如下： DS12A-0048、DS12A-0045、DS12A-0097、DS12A-0117、DS12A-0082、DS12A-0129、DS12A-0194、DS12A-0215、DS12A-0132、DS12A-0134、DS12A-0025、DS12A-0136、DS12A-0093、DS12A-0077、DS12A-0130、DS12A-0058。
熱點H4（-125至-81）含有以下功能性saRNA： DS12A-0030、DS12A-0029、DS12A-0099、DS12A-0145、DS12A-0206、DS12A-0149、DS12A-0118、DS12A-0151、DS12A-0187、DS12A-0121、DS12A-0017、DS12A-0123、DS12A-0190、DS12A-0210、DS12A-0071、DS12A-0184、DS12A-0272、DS12A-0256、DS12A-0262、DS12A-0265、DS12A-0170、DS12A-0171、DS12A-0200、DS12A-0172、DS12A-0266。
熱點H5（-80至-15）含有以下功能性saRNA： DS12A-0160、DS12A-0191、DS12A-0240、DS12A-0229、DS12A-0225、DS12A-0018、DS12A-0006、DS12A-0019、DS12A-0049、DS12A-0044、DS12A-0050、DS12A-0086、DS12A-0219、DS12A-0146、DS12A-0203、DS12A-0207、DS12A-0188、DS12A-0222、DS12A-0189、DS12A-0212、DS12A-0257、DS12A-0241、DS12A-0242、DS12A-0213、DS12A-0192、DS12A-0214、DS12A-0076、DS12A-0088、DS12A-0110、DS12A-0108、DS12A-0128、DS12A-0125、DS12A-0124、DS12A-0258、DS12A-0075、DS12A-0055、DS12A-0072、DS12A-0106、DS12A-0196、DS12A-0197、DS12A-0195、DS12A-0135、DS12A-0163、DS12A-0164、DS12A-0216、DS12A-0232、DS12A-0247。
在小鼠 Serping1啟動子上的功能性saRNA分布中也觀察到了類似的結果。如圖10所示，存在4個熱點區-424至-325區域（H6），-257至-182區域（H7），-170至-117區域（H8）和-56至-11區域（H9），其中功能性saRNA富集。
能夠將 Serping1表現調升至少1.1倍並且位於熱點H6（-424至-325）上的功能性saRNA序列如下： DS12B-0170、DS12B-0171、DS12B-0034、DS12B-0035、DS12B-0036、DS12B-0056、DS12B-0085、DS12B-0086、DS12B-0087、DS12B-0269、DS12B-0270、DS12B-0252、DS12B-0253、DS12B-0254、DS12B-0224、DS12B-0172、DS12B-0173、DS12B-0174、DS12B-0175、DS12B-0097、DS12B-0098、DS12B-0099、DS12B-0100、DS12B-0101、DS12B-0102、DS12B-0176、DS12B-0103、DS12B-0104、DS12B-0105、DS12B-0106、DS12B-0177、DS12B-0225、DS12B-0226、DS12B-0227、DS12B-0178、DS12B-0179、DS12B-0107、DS12B-0108、DS12B-0109、DS12B-0110、DS12B-0111、DS12B-0112、DS12B-0180、DS12B-0228、DS12B-0181。
位於熱點H7（-257至-182）的功能性saRNA序列如下： DS12B-0188、DS12B-0137、DS12B-0138、DS12B-0139、DS12B-0140、DS12B-0141、DS12B-0142、DS12B-0143、DS12B-0144、DS12B-0145、DS12B-0275、DS12B-0276、DS12B-0277、DS12B-0001、DS12B-0015、DS12B-0016、DS12B-0017、DS12B-0018、DS12B-0019、DS12B-0020、DS12B-0037、DS12B-0021、DS12B-0022、DS12B-0038、DS12B-0057、DS12B-0039、DS12B-0040、DS12B-0023、DS12B-0146、DS12B-0147、DS12B-0189、DS12B-0190。
可能的是，位於熱點H8（-170至-117）的功能性saRNA序列如下： DS12B-0234、DS12B-0255、DS12B-0235、DS12B-0196、DS12B-0236、DS12B-0237、DS12B-0238、DS12B-0239、DS12B-0047、DS12B-0048、DS12B-0067、DS12B-0090、DS12B-0091、DS12B-0068、DS12B-0049、DS12B-0069、DS12B-0070、DS12B-0071、DS12B-0092、DS12B-0093、DS12B-0094、DS12B-0271、DS12B-0256、DS12B-0257、DS12B-0072、DS12B-0050、DS12B-0073、DS12B-0074、DS12B-0095、DS12B-0075、DS12B-0096。
熱點H9（-56至-11）含有以下功能性saRNA： DS12B-0258、DS12B-0241、DS12B-0259、DS12B-0260、DS12B-0261、DS12B-0242、DS12B-0206、DS12B-0207、DS12B-0156、DS12B-0208、DS12B-0209、DS12B-0210、DS12B-0211、DS12B-0157、DS12B-0212、DS12B-0213、DS12B-0243。
這些結果表明功能性saRNA不是隨機分布在啟動子上，而是在特定熱點區聚集。獲自人類 SERPING1啟動子和小鼠 Serping1啟動子的熱點序列在表9中列出。 表9. 人類 SERPING1和小鼠 Serping1saRNA熱點區域及其序列
熱點區域 人類 SERPING1啟動子上的熱點區域序列（5'-3'） SEQ ID NO 長度（bp）
H1（-466至-399） ttgagctgggtgcctcacatccgttgtctgttatacaaagaactactgattatgggtctctacgagca 1391 68
H2（-357至-279） agggattaggcttcagaatacttctccaaatgagggtgatcagggcccgacatttcactgctctaaggctcagtatctt 1392 79
H3（-256至-215） ggcacaaagggttactttgaggaataacggaggtgagcaatt 1393 42
H4（-125至-81） tggttgtgtaaagctgagaactgcacccaagcttccccgttcacc 1394 45
H5（-80至-15） ccacctaccaggggatttgggctaaattcctggcctggcccacaaagaagaccaagcggtcagtcc 1395 66
小鼠 Serping1啟動子上的熱點區域序列（5'-3'）   
H6（-424至-325） tccagcagccattaggtttttaggagattcgggcccaaggctggcatatctccaaatgagagcaatggaaggccatttaactacttctaaggcttggcct 1396 100
H7（-257至-182） gtgtgcttcttctgcctttatcttgatccacaaaacactaagatcactaagagcgtcactcaagcttccttatccc 1397 76
H8（-170至-117） tcctaccccattccaagaggaactccgggctaactggcccacagttcgagactc 1398 54
H9（-56至-11） aattcctggcctggcccacaaagaagaccaagcggtcagtcccatt 1399 46
實施例3：HepG2細胞中saRNA的劑量反應特徵和細胞毒性的評估
為了驗證能夠活化 SERPING1基因的功能性saRNA及其細胞毒性，基於高通量篩選結果，從139種功能性saRNA中選擇前73種 SERPING1saRNA（參見表1）以2.5nM、10nM和25nM用單個saRNA轉染HepG2細胞3天。分別通過RT-qPCR對轉染細胞的SERPING1 mRNA表現進行分析。
如圖3A所示，所有saRNA在3個測試濃度（2.5nM、10nM和25nM）下誘導超過1.1倍的 SERPING1mRNA，其中DS12A-0156在10nM下表現出最高的活性43.3倍。當以2.5nM處理時，5種（6.8%）和17種（23.3%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準誘導超過10倍和5倍。當以10nM處理時，9種（12.3%）和28種（38.4%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準誘導超過10倍和5倍。當以25nM處理時，10種（13.7%）和29種（39.7%）saRNA分別對SERPING1 mRNA水準誘導超過10倍和5倍。隨後經由PI染色進行細胞毒性分析，以進一步鑑定具有可接受的體外安全性特徵的雙股體。如圖3B所示，HepG2細胞耐受所有三種劑量的所有73種saRNA，具有0.5的相對細胞增殖閾值。整體而言，人類標靶序列選擇、saRNA設計和篩選標準鑑定了一組用於所有劑量範圍的強力且安全的候選物，以進行進一步的藥物開發。 實施例4：saRNA對HepG2細胞中 SERPING1mRNA和蛋白質表現的活化作用的評估
為了分析saRNA對HepG2細胞中 SERPING1mRNA和蛋白質表現的活化作用，選擇指定的saRNA（參見表1）以10nM轉染HepG2細胞5天。如圖4A所示，4種（約26.7%）和9種（約60%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準誘導超過2.0倍和1.5倍的活性，其中DS12A-0184表現出最高的活性（4.7倍）。如圖4B所示，5種（約20.8%）和18種（約75.8%）saRNA分別對SERPING1蛋白水準誘導超過2.0倍和1.5倍的活性，其中DS12A-0184和DS12A-0072表現出最高的活性（2.4倍）。結果表明saRNA的活化作用與HepG2細胞中SERPING1 mRNA和蛋白質的表現有很高的相關性。 實施例5：低濃度的saRNA對HepG2細胞中 SERPING1mRNA的表現的活化作用
為了證實saRNA對HepG2細胞中 SERPING1mRNA表現的活化作用，轉染低濃度（0.1nM和1nM）的29種saRNA（參見表1）3天。如圖5A所示，當以0.1nM處理時，11種（37.9%）和26種（89.7%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準誘導超過1.5倍和1.1倍的升高，其中DS12A-0184表現出最高的活性（2.2倍）。當以1nM處理時，22種（75.9%）和28種（96.6%）saRNA分別對 SERPING1mRNA水準誘導超過1.5倍和1.1倍的升高，其中DS12A-0184表現出最高的活性（4.7倍）。結果表明，saRNA能夠在低濃度下活化 SERPING1mRNA的表現，這將使它們能夠進一步進行藥物開發。 實施例6：saRNA對不同的人類肝癌細胞中SERPING1 mRNA和蛋白質表現的活化作用的評估
對所選擇的並以10nM轉染到人類肝癌細胞系HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5中4天的指定的saRNA（參見表1）進行在各種細胞中活化作用的驗證。表10示出了源自圖6A（HepG2）、圖6B（Hep3B）和圖6C（PLC/PRF/5）的SERPING1 mRNA和蛋白質的相對倍數變化。在HepG2細胞中，與Mock相比，所有saRNA都誘導了對SERPING1的顯著活化作用，在SERPING1 mRNA和蛋白質中範圍分別為1.9倍至9.3倍以及1.5倍至6.9倍，其中DS12A-0213表現出mRNA（9.3倍）和蛋白質（3.6倍）的最高活性。在Hep3B細胞中，與Mock相比，所有saRNA都誘導了對SERPING1的可變活化作用，範圍為1.2倍至2.4倍，除了DS12A-240之外，其引起 SERPING1mRNA升高0.8倍以及SERPING1蛋白升高2.1倍。對於蛋白質，與Mock相比，所有saRNA都誘導了對SERPING1的可變活化作用，升高範圍為1.1倍至3.2倍，其中DS12A-0077表現出蛋白質的最高活性（3.2倍）。在PLC/PRF/5細胞中，與Mock相比，所有saRNA都誘導了對SERPING1的可變活化作用，在SERPING1 mRNA和蛋白質中範圍分別為1.1倍至1.9倍以及1.3倍至2.6倍，其中DS12A-0225表現出mRNA（1.9倍）和蛋白質（2.6倍）的最高活性。資料統計示出了saRNA對不同細胞系中的SERPING1 mRNA和蛋白質的表現具有中等的相關性。 表10. SERPING1 mRNA和蛋白質的相對表現（倍數變化）
組別 HepG2 Hep3B PLC/PRF/5
SERPING1mRNA SERPING1 蛋白 SERPING1mRNA SERPING1 蛋白 SERPING1mRNA SERPING1 蛋白
Mock 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
dsCon2 0.99 0.69 1.18 1.33 1.03 1.25
DS12A-si2 0.04 0.01 0.02 0.05 0.04 0.02
DS12A-0072 4.55 3.05 / / / /
DS12A-0187 5.26 3.23 1.16 1.32 / /
DS12A-0213 9.28 6.84 2.21 1.96 / /
DS12A-0240 3.91 2.36 0.79 2.12 / /
DS12A-0043 5.45 5.98 / / / /
DS12A-0182 4.80 4.55 / / 1.13 1.42
DS12A-0070 1.86 1.99 / / / /
DS12A-0124 4.21 2.25 2.42 1.33 1.71 2.08
DS12A-0065 4.85 5.72 / / / /
DS12A-0225 2.94 2.62 1.62 1.71 1.90 2.63
DS12A-0077 4.20 2.31 1.72 3.17 1.83 1.63
DS12A-0048 3.12 1.47 1.17 1.08 1.41 1.34
注意：/意指未檢測。 實施例7：saRNA誘導的HepG2細胞中SERPING1 mRNA和蛋白質的表現的時間進程變化
選擇6種saRNA（即，DS12A-0043、DS12A-0072、DS12A-0187、DS12A-0182、DS12A-0240和DS12A-0213）（參見表1）以指定濃度（即，0.5nM、1.25nM、4nM、30nM）在HepG2細胞中轉染，持續時間範圍為1天至7天。在每個時間點檢測 SERPING1mRNA水準（表11，圖7A）和SERPING1蛋白水準（表12，圖7B）的相對倍數變化。整體而言，saRNA的單次轉染誘導了SERPING1 mRNA和蛋白質的相關表現，持續至少7天，其中DS12A-0213在所有測試的saRNA中表現出最高的效果。 表11. SERPING1mRNA的相對表現（倍數變化）
組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第7天
Mock 0.97 0.98 0.98 0.96 1.00 1.02
dsCon2 4 nM 0.93 0.75 0.79 1.02 1.05 1.08
dsCon2 30 nM 0.89 0.95 0.82 0.86 0.95 1.20
DS12A-si2 4 nM 0.15 0.21 0.13 0.12 0.13 0.16
DS12A-si2 30 nM 0.13 0.14 0.08 0.07 0.10 0.10
DS12A-0043 0.5 nM 1.31 2.81 2.74 2.82 3.46 2.02
DS12A-0043 30 nM 1.32 3.84 3.50 3.62 4.64 5.02
DS12A-0072 4 nM 1.37 3.13 3.91 4.47 4.51 6.10
DS12A-0072 30 nM 1.40 3.64 3.86 4.55 4.23 5.04
DS12A-0187 4 nM 1.28 2.38 3.55 4.98 5.10 4.54
DS12A-0187 30 nM 1.37 2.23 5.66 6.30 6.48 9.78
DS12A-0182 1.25 nM 1.24 2.90 3.60 2.85 2.98 2.75
DS12A-0182 30 nM 1.57 4.14 4.80 4.53 4.77 4.54
DS12A-0240 1.25 nM 1.23 2.12 2.26 2.64 2.98 2.97
DS12A-0240 30 nM 1.31 2.73 3.02 2.95 3.96 4.25
DS12A-0213 4 nM 1.36 2.63 6.05 8.34 8.67 9.34
DS12A-0213 30 nM 1.43 2.97 6.99 9.86 14.13 13.75
表12. SERPING1蛋白的相對表現（倍數變化）
組別 第3天 第4天 第5天 第7天
Mock 1.03 1.07 1.20 1.18
dsCon2 4 nM 1.14 1.74 1.08 0.70
dsCon2 30 nM 1.36 1.25 0.95 0.60
DS12A-si2 4 nM 0.00 0.10 0.12 0.11
DS12A-si2 30 nM 0.00 0.10 0.03 0.13
DS12A-0043 0.5 nM 5.25 7.01 9.49 5.38
DS12A-0043 30 nM 5.00 7.18 7.16 6.34
DS12A-0072 4 nM 4.84 6.50 7.28 6.24
DS12A-0072 30 nM 4.33 5.99 4.92 7.65
DS12A-0187 4 nM 5.42 7.24 10.05 7.15
DS12A-0187 30 nM 5.60 8.12 10.70 6.46
DS12A-0182 1.25 nM 4.09 5.64 11.28 4.26
DS12A-0182 30 nM 3.94 5.70 9.88 9.79
DS12A-0240 1.25 nM 2.59 3.89 5.07 5.38
DS12A-0240 30 nM 2.75 5.28 4.52 4.61
DS12A-0213 4 nM 3.91 11.56 15.87 16.84
DS12A-0213 30 nM 4.35 11.34 16.35 22.04
實施例8：saRNA誘導HepG2細胞中 SERPING1mRNA的表現的EC 50
為了進一步測試EC 50對 SERPING1mRNA表現的影響，選擇6種saRNA（即，DS12A-0043、DS12A-0072、DS12A-0187、DS12A-0182、DS12A-0240和DS12A-0213）（參見表1）以遞增的劑量（即，0.0017nM、0.0051nM、0.0152nM、0.046nM、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.111nM、33.333nM和100nM）轉染HepG2細胞4天。6種saRNA的 SERPING1mRNA的水準示於圖8A至圖8F。如表13中所總結的，DS12A-0072和DS12A-0240在誘導 SERPING1mRNA中分別表現出最高的EC 50（2.78nM）和最低的EC 50（0.98nM）。資料提供了未來開發中候選saRNA的更清楚的效力比較。 表13. HepG2細胞中 SERPING1mRNA的EC 50值
雙股體 EC 50（nM）
DS12A-0043 2.05
DS12A-0072 2.78
DS12A-0187 2.75
DS12A-0182 1.92
DS12A-0240 0.98
DS12A-0213 1.42
實施例9：以小鼠 Serping1啟動子作為標靶的saRNA的設計和合成
從ENSEMBL基因組資料庫中檢索了小鼠 Serping1基因從TSS至上游-500bp的啟動子序列（SEQ ID NO: 1400）（表14）的編碼股。為了鑑定能夠活化 Serping1基因的表現的功能性小活化RNA（saRNA），在500bp Serping1啟動子序列上選擇一系列19nt saRNA標靶，從TSS的上游-500bp開始，並每次向TSS移動1bp，從而產生標靶序列。 表14. 推定的小鼠 Serping1啟動子序列（5'-3'）（SEQ ID NO: 1400） -500 gttgtgcaac taaggggttg aagccagggc tcggctggaa actggagccg -450 gtgattacgt gtaggaatgg ggaagatcca gcagccatta ggtttttagg -400 agattcgggc ccaaggctgg catatctcca aatgagagca atggaaggcc -350 atttaactac ttctaaggct tggcctattt ctaaaggctt gctttaccca -300 ttaatctcaa aaagctcatc cattgtcaaa ccttaggcac gttgtgtgct -250 tcttctgcct ttatcttgat ccacaaaaca ctaagatcac taagagcgtc -200 actcaagctt ccttatccca accggtcaca tcctacccca ttccaagagg -150 aactccgggc taactggccc acagttcgag actcgtccca tccgtcccat -100 ccggatttac aggaactcac actagcaatc aatcatcctt aatttttaac -50 tgggctgtgt cctaaaccag ccaatagctg agagtgcccc ccccccacac
然後過濾標靶序列以保留符合以下標準的那些標靶序列：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。過濾後，剩餘277種標靶序列，並化學合成它們相應的雙股saRNA。本研究中使用的saRNA的有義股和反義股中的每一者的長度均為21nt。saRNA的第一核糖核酸股（有義股）的5'區域中的19個核苷酸與啟動子的標靶序列具有100%的序列同一性，並且第一核糖核酸股的3'末端是額外的2nt dTdT序列。第二核糖核酸股的5'區域中的19個核苷酸與第一核糖核酸股序列互補，並且第二核糖核酸股的3'末端是額外的2nt dTdT序列。將上述單個saRNA的兩條股以1:1的莫耳比混合並退火，獲得雙股體saRNA。表2列出了實施例中設計的saRNA標靶序列、它們的有義股和反義股。 實施例10：以小鼠 Serping1啟動子作為標靶的saRNA的高通量篩選
為了鑑定能夠活化 Serping1轉錄的saRNA，用上述277種saRNA中的每一種以25nM的轉染濃度轉染PMH細胞。圖9呈現出從最強活化蛋白到最強抑制蛋白中分選的 Serping1saRNA的活性分布（log2）。表15進一步示出了8種（2.9%）、49種（17.7%）和33種（11.9%）saRNA分別對 Serping1mRNA水準顯示出高度活化（≥1.5倍）、中度活化（1.2倍-1.5倍）和輕度活化（1.1倍-1.2倍）。187種（67.5%）saRNA對 Serping1mRNA的表現沒有明顯影響。觀察到的對 Serping1mRNA表現的最高活化是1.65倍。 表15. 所有篩選的 Serping1saRNA的活性總結
saRNA活性 Serping1mRNA的log 2值變化（倍數） saRNA的數量 百分比（%）
高度 ≥ 0.49 (1.50) ~ ≤ 0.72 (1.65) 8 2.9
中度 ≥ 0.26 (1.20 ) ~ ＜ 0.49 (1.50) 49 17.7
輕度 ≥ 0.13 (1.10) ~ ＜ 0.26 (1.20 ) 33 11.9
無影響 ＜ 0.13 (1.10) 187 67.5
總計 　 277 100
圖10進一步示出了 Serping1saRNA通過它們在 Serping1啟動子上的位置進行分類的活性分布，可以清楚地看到，功能性saRNA以聚集的方式分布在啟動子上，即在某些啟動子區中，存在功能性saRNA富集的「熱點」。從啟動子的TSS起，存在4個熱點位於-424至-325區域（H6）、-257至-182區域（H7）、-170至-117區域（H8）和-56至-11區域（H9），並包含高度富集的功能性saRNA。該結果（即功能性saRNA不是隨機分布在啟動子上）表明特定的熱點區在通過RNA活化機制調節 Serping1基因表現中是必需的。所有熱點序列均在表9中列出。 實施例11：saRNA在活化PMH細胞中的 Serping1基因中的劑量反應
從源自篩選的90種功能性saRNA中選擇前57種Serping1 saRNA（參見表2），以2.5nM、10nM和25nM轉染PMH細胞3天。通過RT-qPCR對轉染細胞的 Serping1mRNA表現進行分析。
如圖11所示。當以2.5nM處理時，4種（7.0%）和12種（21.1%）saRNA分別對 Serping1水準誘導超過2倍和1.5倍的活性，其中DS12B-0206和DS12B-0130表現出最高的活性（2.6倍）。當以10nM處理時，13種（22.8%）和30種（52.6%）saRNA分別對 Serping1水準誘導超過2倍和1.5倍，其中DS12B-0188表現出最高的活性（3.7倍）。當以25nM處理時，22種（38.6%）和37種（64.9%）saRNA分別對 Serping1水準誘導超過2倍和1.5倍，其中DS12B-0188表現出最高的活性（5.7倍）。
為了評估saRNA處理和 Serping1活化之間的劑量效應關係，前57種 Serping1saRNA在PMH細胞中以6個遞增的濃度（即，0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM）轉染。圖12A示出了在單個PCR反應中，使用基因特異性引子通過兩步法RT-qPCR對 Serping1mRNA進行定量。表16示出了在 Serping1mRNA水準上活化相對至少1.5倍的變化的陽性saRNA的百分比。隨後經由PI染色進行細胞毒性分析，以進一步鑑定具有可能的安全性問題的雙股體。如圖12B所示，PMH細胞耐受所有六種劑量的所有57種saRNA，相對於mock處理，具有＞50%細胞增殖閾值。 表16. saRNA對小鼠 Serping1mRNA的活性總結
濃度（nM） 倍數變化 saRNA的數量 百分比（%） 最高倍數變化 具有最好活性的saRNA
100 ≥ 1.5 37 64.90 6.7 DS12B-0188
33.3 ≥ 1.5 40 70.20 7.5 DS12B-0188
11.1 ≥ 1.5 42 73.70 6.1 DS12B-0188
3.7 ≥ 1.5 40 70.20 6.6 DS12B-0188
1.23 ≥ 1.5 27 47.40 3.1 DS12B-0188
0.41 ≥ 1.5 15 26.30 2.3 DS12B-0274
實施例12：saRNA對PMH細胞中 Serping1mRNA表現的活化作用的評估
選擇前24種saRNA（參見表2）以25nM轉染PMH細胞3天，以證實saRNA對PMH細胞中 Serping1mRNA表現的活化作用。如圖13所示，24種saRNA中的22種（91.7%）saRNA誘導了 Serping1mRNA的顯著活化，顯示出多於2倍的活化，其中DS12B-0110表現出最高的活性（5.5倍）。僅剩餘的兩種DS12B-0276和DS12B-0274誘導了 Serping1mRNA的1.8倍和1.2倍的活化。資料表明，選擇的saRNA可在體外活化 Serping1mRNA的表現。 實施例13：突變體 SERPING1saRNA的設計和合成
為了通過 SERPING1saRNA的突變「walk」評估有義股的序列需求，設計並合成了一系列3nt突變saRNA。
RD-12118是雙股體saRNA，其被有義股的3nt任意核苷酸取代，從有義股的5'端開始，每次向3'端移動3nt，從而產生表17所示的RD-12226的新序列。
RD-12126是雙股體saRNA，其被有義股的3nt任意核苷酸取代，從有義股的5'端開始，每次向3'端移動3nt，從而按順序產生表17所示的新序列（即，RD-12232、RD-12233和RD-12234）。值得注意的是，通過取代RD-12126的最後4nt核苷酸合成RD-12234。 表17. 寡核苷酸序列和雙股體組合物
寡核苷酸名稱 類型 標靶基因 SEQ ID NO 序列（ 5'-3' ） 長度（ nt ）
RD-11633 siRNA 人類SERPING1 1401 fA*mG*fCmCfAmAfGmUfGfGfAmAfGmAfCmAfAmCfAmUfU-tC2 21
1402 mA*fA*mUfGmUfUmGfUmCfUmUfCmCfAmCfUmUfGmGfCmU*fA*mG 23
RD-11432 siRNA 小鼠Serping1 1403 mA*mC*mAmAmAmUfAmAfAfAfCmUmUmGmCmAmGmAmCmAmU-tC2 21
1404 mA*fU*mGmUmCfUmGfCfAmAmGmUmUfUmUfAmUmUmUmGmU*mA*mG 23
RD-12118 saRNA 人類SERPING1 1405 AAAUUCCUGGCCUGGCCCACA 21
1406 UGUGGGCCAGGCCAGGAAUUU 21
RD-12226 saRNA 人類SERPING1 1407 AAAUUCCUGGCCUGGCCCUUG 21
1408 CAAGGGCCAGGCCAGGAAUUU 21
RD-12126 saRNA 人類SERPING1 1409 CUACCAGGGGAUUUGGGCU 19
1410 CCCAAAUCCCCUGGUAG 17
RD-12232 saRNA 人類SERPING1 1411 CUACCAGGGUCAUUGGGCU 19
1412 CCCAAUGACCCUGGUAG 17
RD-12233 saRNA 人類SERPING1 1413 CUACCAGGGGAUACUGGCU 19
1414 CCAGUAUCCCCUGGUAG 17
RD-12234 saRNA 人類SERPING1 1415 CUACCAGGGGAUUUGCCAG 19
1416 GGCAAAUCCCCUGGUAG 17
RD-11823 saRNA 人類SERPING1 1417 mAfAmAfUmUfCmCfUmGfGmCfCmUfGmGfCmCfCmAfCmA 21
1418 fUmGfUmGfGmGfCmCfAfGfGmCfCmAfGmGfAmAfUmUfU 21
RD-11826 saRNA 人類SERPING1 1419 mC*fU*mAfCmCfAmGfGmGfGmAfUmUfUmGfGmG*fC*mU 19
1420 fC*mC*fCmAfAmAfUmCfCfCfCmUfGmGfU*mA*fG 17
RD-11513 saRNA 人類SERPING1 486 AAAUUCCUGGCCUGGCCCATT 21
760 UGGGCCAGGCCAGGAAUUUTT 21
RD-12065 saRNA 人類SERPING1 498 CUACCAGGGGAUUUGGGCUTT 21
772 AGCCCAAAUCCCCUGGUAGTT 21
RD-12369 saRNA 小鼠Serping1 1421 GGCUUGCUUUACCCAUUA 18
1422 UAAUGGGUAAAGCAAGCCUU 20
RD-12370 saRNA 小鼠Serping1 1423 CAACUAAGGGGUUGAAGCCA 20
1424 UGGCUUCAACCCCUUAGUUGCA 22
RD-12371 saRNA 小鼠Serping1 1425 UUGUGUGCUUCUUCUGCCUUU 21
1426 AAAGGCAGAAGAAGCACACAACG 23
RD-12367 saRNA 小鼠Serping1 1427 AACUGGCCCACAGUUCGAGACUC 23
1428 GUCUCGAACUGUGGGCCAGUU 21
RD-12349 saRNA 小鼠Serping1 1429 mG*fG*mCfUmUfGmCfUfUfUfAfCmCfCmAfU*mU*fA 18
1430 mU*fA*mAfUmGfGmGfUmAfAmAfGmCfAmAfGmCfC*mU*fU 20
RD-12350 saRNA 小鼠Serping1 1431 mC*fA*mAfCmUfAmAfGfGfGfGfUmUfGmAfAmGfC*mC*fA 20
1432 mU*fG*mGfCmUfUmCfAmAfCmCfCmCfUmUfAmGfUmUfG*mC*fA 22
RD-12351 saRNA 小鼠Serping1 1433 fU*mU*fGmUfGmUfGmCfUfUfCmUfUmCfUmGfCmCfU*mU*fU 21
1434 mA*fA*mAfGmGfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmCfAmCfAmA*fC*mG 23
RD-12347 saRNA 小鼠Serping1 1435 mA*fA*mCfUmGfGmCfCmCfAmCfAmGfUmUfCmGfAmGfAmC*fU*mC 23
1436 fG*mU*fCmUfCmGfAmAfCfUfGmUfGmGfGmCfCmAfG*mU*fU 21
RD-11927 saRNA 小鼠Serping1 1437 fU*mU*fGmUfGmUfGmCfUfUfCmUfUmCfUmGfCmCfUmUfU-tC2 21
1434 mA*fA*mAfGmGfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmCfAmCfAmA*fC*mG 23
RD-11931 saRNA 小鼠Serping1 1438 mC*fA*mAfCmUfAmAfGfGfGfGfUmUfGmAfAmGfC*mC*fA-tC2 20
1432 mU*fG*mGfCmUfUmCfAmAfCmCfCmCfUmUfAmGfUmUfG*mC*fA 22
RD-12189 saRNA 小鼠Serping1 1439 mG*fG*mCfUmUfGmCfUfUfUfAfCmCfCmAfU*mU*fA-tC2 18
1430 mU*fA*mAfUmGfGmGfUmAfAmAfGmCfAmAfGmCfC*mU*fU 20
RD-12497 saRNA 小鼠Serping1 1440 mC*fA*mAfCmUfAmAfGfGfGfGfUmUfGmAfAmGfC*mC*fA-S9- me U*me U*meG*me U*meA*me U*me U*me C*me U*meA*me U*meG*me U*me U 34
1432 mU*fG*mGfCmUfUmCfAmAfCmCfCmCfUmUfAmGfUmUfG*mC*fA 22
RD-13144 saRNA 小鼠Serping1 1441 mC*fA*mAfCmUfAmAfGfGfGfGfUmUfGmAfAmGfC*mC*fA-tC2x4 20
1442 VPmU*fG*mGfCmUfUmCfAmAfCmCfCmCfUmUfAmGfUmUfG*mC*fA 22
附註：大寫字母表示RNA；*表示硫代磷酸酯（PS）主鏈修飾；f表示2'-氟；m表示2'-O-甲基（2'-OMe）；me表示2'-O-甲氧基乙基（2'MOE）；VP表示5'-(E)-乙烯基膦酸酯； C表示5'-甲基胞嘧啶； U表示5'-甲基尿嘧啶；S9表示間隔物9接頭；tC2表示tC2化合物；tC2x4表示tC2x4化合物。 實施例14：通過 SERPING1saRNA的突變「walk」評估有義股的序列需求
為了通過 SERPING1mRNA的突變「walk」評估有義股的序列需求，將指定的 SERPING1saRNA以25nM在HepG2細胞中轉染3天。使用基因特異性引子通過RT-qPCR對saRNA的 SERPING1mRNA水準進行定量。RD-11633是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。RD-12118和RD-12126用作已知有效的saRNA。
如表18所示，RD-12118對 SERPING1mRNA誘導了3.95倍的升高，並且RD-12226（最後3nt核苷酸被取代的突變體saRNA）對 SERPING1mRNA誘導了2.36倍的增加，表明最後3nt核苷酸突變不會喪失活化活性。同樣，RD-12126對 SERPING1mRNA誘導了高活化活性，並且RD-12232、RD-12233和RD-12234都對 SERPING1mRNA誘導了高活化活性提高約4.0倍，表明最後10nt連續核苷酸突變不會喪失活化活性。本申請案提供了包含式I和式II的有義股的序列的saRNA也可引起 SERPING1基因活化。兩式都總結於表19中。
結果表明在標靶基因的特定位點處的誘變仍然保持活化活性。 表18. HepG2細胞中SERPING1 mRNA表現的總結
組別 SERPING1mRNA表現（倍數變化）
Mock 1.01
dsCon2 0.50
RD-11633 0.02
RD-12118 3.95
RD-12226 2.36
RD-12126 8.55
RD-12232 3.92
RD-12233 3.39
RD-12234 4.14
表19. SERPING1 saRNA的序列式
式 SEQ ID NO 有義股序列（ 5'-3' ） 長度（ nt ）
Formula I 1443 AAAUUCCUGGCCUGGCCCNNN 21
Formula II 1444 CUACCAGGGNNNNNNNNNN 19
附註：N選自腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）和尿嘧啶（U）。
實施例 15 ： HepG2 和 PLC/PRF/5 細胞中 SERPING1 saRNA 的時間進程處理
為了檢測由 SERPING1saRNA誘導的SERPING1 mRNA時間進程變化，將指定的saRNA（即，RD-11513，RD-11823，RD-12065和RD-11826）（參見表17）以25nM在HepG2和PLC/PRF/5細胞中轉染1天至7天。RD-11823和RD-11826是完全修飾的saRNA，分別源自RD-11513和RD-12065的雙股體saRNA。使用基因特異性引子組通過RT-qPCR對saRNA的 SERPING1mRNA水準進行定量。
如圖14A所示，RD-11513、RD-11823、RD-12065和RD-11826在7天內均誘導了 SERPING1mRNA水準的上升和持久的活化活性，分別誘導了約1.1倍至27.8倍、約1.3倍至20.7倍、約0.8倍至4.9倍以及約0.8倍至8.8倍，其中RD-11513在HepG2細胞中表現出最大且最持久（T max≥6天）的活化活性。RD-11826（化學修飾的saRNA）與缺少修飾的RD-12065相比，提高了活化活性，而RD-11823不能進一步提高 SERPING1mRNA的活化。如圖14B所示，RD-11513、RD-11823、RD-12065和RD-11826在7天內均誘導了SERPING1蛋白水準的上升和持久的活化活性，分別誘導了約1.1倍至24.4倍、約1.0倍至24.9倍、約0.9倍至5.8倍以及約1.1倍至13.3倍，其中RD-11823表現出最大且最持久（T max≥6天）的活化活性。RD-11826與缺少修飾的RD-12065相比，提高了活化活性，並且RD-11823和RD-11513示出了SERPING1蛋白的相似的活化活性。還定量了胱天蛋白酶3/7活性以判定對作為安全性指標的不期望的細胞毒性的誘導。如圖14C所示，RD-11513和RD-12065的胱天蛋白酶3/7活性在第6天和第7天示出了輕微的細胞毒性，而在直至7天的測試點中的任一測試點都沒有檢測出RD-11823和RD-11826，表明化學修飾可减弱細胞毒性。
圖15A描述出RD-12065和RD-11826從第1天至第4天誘導了 SERPING1mRNA水準的遞增的活化活性，並從第5天至第7天降低，其中在第4天發生 SERPING1mRNA誘導的峰值。RD-12065和RD-11826示出了 SERPING1mRNA水準表現的相似趨勢，其中RD-12065在第4天表現出最高的誘導（3.0倍）。如圖15B所示，RD-12065和RD-11826從第1天至第5天誘導了SERPING1蛋白水準的遞增的活化活性，並從第6天至第7天降低，其中在第5天發生SERPING1蛋白誘導的峰值。RD-12065和RD-11826示出了SERPING1蛋白水準表現的相似趨勢，其中RD-12065在第5天表現出最高的誘導（1.6倍）。如圖15C所示，在直至7天的測試點中的任一測試點都沒有檢測出RD-12065和RD-11826的胱天蛋白酶3/7活性。
資料表明， SERPING1saRNA可對SERPING1 mRNA和蛋白質誘導最大且持久的活化，並且化學修飾可提高活化效果並减弱細胞毒性。 實施例16 ：HepG2 細胞中SERPING1 saRNA 的活化活性和安全性的評估
為了檢測 SERPING1saRNA的活化活性和安全性，將指定的saRNA（即，RD-11513、RD-11823、RD-12065和RD-11826）以遞增的濃度（即，0.098nM、0.195nM、0.39nM、0.78nM、1.56nM、3.13nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM）在HepG2細胞中轉染5天。
繪製活化活性產生的劑量反應曲線，其中 SERPING1mRNA（圖16A）和蛋白質（圖16B）的EC 50和E max值被推斷為定義測試的saRNA中的每一者的活化活性。圖16A出了對於每種saRNA， SERPING1mRNA的活化是劑量依賴的，其中EC 50和E max值在較低的奈米莫耳範圍內分別為約0.21nM至13.35nM以及約4.78倍至14.23倍。圖16B示出了對於每種saRNA，SERPING1蛋白的活化是劑量依賴的，其中EC 50和E max值在較低的奈米莫耳範圍內分別為約0.24nM至9.86nM以及約3.36倍至10.09倍。如表20中所總結的，RD-12065是 SERPING1mRNA和蛋白質的最有效的saRNA，在0.21nM和0.24nM下分別具有最低的EC 50值。在RD-11553中，在100nM下出現 SERPING1mRNA的E max活化活性（14.23倍）。在RD-11823中，在25nM下出現SERPING1蛋白的E max活化活性（10.09倍）。如圖16C所示，在高達100nM的測試劑量濃度中的任一測試劑量濃度下沒有檢測出胱天蛋白酶3/7活性。結果表明， SERPING1saRNA可在體外誘導 SERPING1mRNA和蛋白質的活化。 表20. HepG2細胞中 SERPING1saRNA的EC 50和E max值的總結
saRNA EC 50（nM） E max活化活性（倍數）
  mRNA 蛋白質 mRNA 蛋白質
RD-11513 3.52 1.14 14.23 6.88
RD-11823 1.37 1.02 11.04 10.09
RD-12065 0.21 0.24 4.78  3.36
RD-11826 13.35 9.86 7.77 3.85
實施例17 ：不同長度、突出端和突變的SERPING1  saRNA 的設計和合成
為了評估同源性、突出端和突變對saRNA活性的影響，內部設計並合成了一系列saRNA變體。
RD-12065是21nt的示例性雙股體saRNA，其含有有義股和反義股。有義股的5'端中的19nt核苷酸與啟動子的標靶序列具有100%的序列同一性，反義股的5'端中的19個核苷酸與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端分別包括額外的2nt TT序列。基於RD-12065，設計了如表21所示的8種化合物（即，RD-13950、RD-13951、RD-13952、RD-13953、RD-13955、RD-13956、RD-13957和RD-13958）。
RD-13950用16nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處去除最後3nt GCU核苷酸而獲得，反義股與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端突出額外的2nt TT序列。
RD-13951用18nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處去除最後1nt U核苷酸而獲得，反義股與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端是平端。
RD-13952用22nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處新增額外的3nt AAA序列而獲得，並且具有20nt核苷酸的反義股與沒有2nt AA序列突出端的有義股互補。
RD-13953用30nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處新增額外的11nt AAAUUCCUGGC序列而獲得，並且具有28nt核苷酸的反義股與沒有2nt GC序列突出端的有義股互補。
RD-13955用RD-12065的相同的有義股和5個錯誤配對的核苷酸合成，這些錯誤配對的核苷酸與反義股的3'端每隔一個核苷酸錯誤配對一次，並且有義股和反義股的3'端包括額外的2nt TT序列。
RD-13956用20nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處突出額外的1nt A核苷酸而獲得，並且反義股與沒有2nt TT序列的RD-12065相同。
RD-13957用22nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處突出額外的3nt AAA核苷酸而獲得，並且反義股與沒有2nt TT序列的RD-12065相同。
RD-13958用24nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12065的有義股的3'端處突出額外的5nt AAAUU核苷酸而獲得，並且反義股與沒有2nt TT序列的RD-12065相同。
RD-11513是21nt的示例性雙股體saRNA，其含有有義股和反義股。有義股的5'端中的19nt核苷酸與啟動子的標靶序列具有100%的序列同一性，反義股的5'端中的19個核苷酸與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端分別包括額外的2nt TT序列。基於RD-11513，設計了如表21所示的5種化合物（即，RD-13959、RD-13960、RD-13962、RD-13965和RD-13966）。
RD-13959用17nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-11513的有義股的3'端處去除最後2nt CA核苷酸而獲得，反義股與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端突出額外的2nt TT序列。
RD-13960用19nt核苷酸的有義股合成，該有義股與沒有2nt TT序列的RD-11513相同，反義股與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端是平端。
RD-13962用35nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-11513的有義股的3'端處新增額外的16nt CAAAGAAGACCAAGCG序列而獲得，並且具有33nt核苷酸的反義股與沒有2nt CG序列突出端的有義股互補。
RD-13965用23nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-11513的有義股的3'端處突出額外的4nt CAAA核苷酸而獲得，並且反義股與沒有2nt TT序列的RD-11513相同。
RD-13966用25nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-11513的有義股的3'端處突出額外的6nt CAAAGA核苷酸而獲得，並且反義股與沒有2nt TT序列的RD-11513相同。
RD-12066是21nt的示例性雙股體saRNA，其含有有義股和反義股。有義股的5'端中的19nt核苷酸與啟動子的標靶序列具有100%的序列同一性，反義股的5'端中的19個核苷酸與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端分別包括額外的2nt TT序列。基於RD-12066，設計了如表21所示的4種化合物（即，RD-13967、RD-13968、RD-13969和RD-13970）。
RD-13967用16nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12066的有義股的3'端處去除最後3nt CAA核苷酸而獲得，反義股與有義股互補，並且有義股和反義股的3'端突出額外的2nt TT序列。
RD-13968用35nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12066的有義股的3'端處新增額外的16nt UUUCCAAAAAGUUCAU序列而獲得，並且具有29nt核苷酸的反義股與沒有6nt GUUCAU序列突出端的有義股互補。
RD-13969用16nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12066的反義股的3'端處去除最後3nt UUC核苷酸而獲得，有義股與反義股互補，並且有義股和反義股的3'端突出額外的2nt TT序列。
RD-13970用35nt核苷酸合成，該核苷酸通過在沒有2nt TT序列的RD-12066的反義股的3'端處新增額外的16nt CUCAAAGUAACCCUUU序列而獲得，並且具有29nt核苷酸的有義股與沒有6nt CCCUUU序列突出端的反義股互補。 表21. SERPING1 saRNA變體設計的寡核苷酸序列和雙股體組合物
saRNA 設計 股 SEQ ID NO 序列（ 5'-3' ） 長度（ nt ）
RD-12065 來自篩選的原始目標 有義股 498 CUACCAGGGGAUUUGGGCU TT 21
反義股 772 AGCCCAAAUCCCCUGGUAG TT 21
RD-13950 16bp，具有TT突出端 有義股 1445 CUACCAGGGGAUUUGG TT 18
反義股 1446 CCAAAUCCCCUGGUAG TT 18
RD-13951 18bp，具有平端 有義股 1447 CUACCAGGGGAUUUGGGC 18
反義股 1448 GCCCAAAUCCCCUGGUAG 18
RD-13952 22nt有義股和20nt反義股 有義股 1449 CUACCAGGGGAUUUGGGCUA AA 22
反義股 1450 UAGCCCAAAUCCCCUGGUAG 20
RD-13953 30nt有義股和28nt反義股 有義股 1451 CUACCAGGGGAUUUGGGCUAAA UUCCUG GC 30
反義股 1452 CAGGAAUUUAGCCCAAAUCCCC UGGUAG 28
RD-13956 1nt突出端 有義股 1453 CUACCAGGGGAUUUGGGCU A 20
反義股 1454 AGCCCAAAUCCCCUGGUAG 19
RD-13957 3nt突出端 有義股 1455 CUACCAGGGGAUUUGGGCU AAA 22
反義股 1456 AGCCCAAAUCCCCUGGUAG 19
RD-13958 5nt突出端 有義股 1457 CUACCAGGGGAUUUGGGCU AAA UU 24
反義股 1458 AGCCCAAAUCCCCUGGUAG 19
RD-13955 5nt「種子」序列突變為反義股 有義股 498 CUACCAGGGGAUUUGGGCU TT 21
反義股 1459 AGCCCAAAUC G C G U C G A A CTT 21
RD-11513 來自篩選的原始目標 有義股 486 AAAUUCCUGGCCUGGCCCA TT 21
反義股 760 UGGGCCAGGCCAGGAAUUU TT 21
RD-13959 17bp，具有TT突出端 有義股 1460 AAAUUCCUGGCCUGGCC TT 19
反義股 1461 GGCCAGGCCAGGAAUUU TT 19
RD-13960 19bp，具有平端 有義股 1462 AAAUUCCUGGCCUGGCCCA 19
反義股 1463 UGGGCCAGGCCAGGAAUUU 19
RD-13962 35nt有義股和33nt反義股 有義股 1464 AAAUUCCUGGCCUGGCCCACAA AGAAGACCAAG CG 35
反義股 1465 CUUGGUCUUCUUUGUGGGCCAG GCCAGGAAUUU 33
RD-13965 4nt突出端 有義股 1466 AAAUUCCUGGCCUGGCCCA CAAA 23
反義股 1467 UGGGCCAGGCCAGGAAUUU 19
RD-13966 6nt突出端 有義股 1468 AAAUUCCUGGCCUGGCCCA CAA AGA 25
反義股 1469 UGGGCCAGGCCAGGAAUUU 19
RD-12066 來自篩選的原始目標 有義股 350 GAAUAACGGAGGUGAGCAA TT 21
反義股 624 UUGCUCACCUCCGUUAUUC TT 21
RD-13967 16bp，具有TT突出端（有義股） 有義股 1470 GAAUAACGGAGGUGAG TT 18
反義股 1471 CUCACCUCCGUUAUUC TT 18
RD-13968 35nt有義股和29nt反義股 有義股 1472 GAAUAACGGAGGUGAGCAAUUU CCAAAAA GUUCAU 35
反義股 1473 UUUUUGGAAAUUGCUCACCUCC GUUAUUC 29
RD-13969 16bp，具有TT突出端（反義股） 有義股 1474 UAACGGAGGUGAGCAA TT 18
反義股 1475 UUGCUCACCUCCGUUA TT 18
RD-13970 29nt有義股和35nt反義股 有義股 1476 UUACUUUGAGGAAUAACGGAGG UGAGCAA 29
反義股 1477 UUGCUCACCUCCGUUAUUCCUC AAAGUAA CCCUUU 35
¶附註：大寫字母表示RNA。粗體核苷酸為突出端。粗體加斜體核苷酸為錯誤配對。
實施例18 ：評估同源性、突出端和突變對HepG2 和PLC/PRF/5 細胞中saRNA 活性的影響
為了評估同源性、突出端和突變對 SERPING1saRNA活性的影響，將指定的saRNA分別以25nM在HepG2和PLC/PRF/5細胞中轉染3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。RD-12065、RD-11513和RD-12066是雙股體saRNA，作為示例性對照。使用基因特異性引子組通過RT-qPCR對saRNA的 SERPING1mRNA水準進行定量。
A組包括7種化合物（即，RD-12065、RD-13950、RD-13951、RD-13952、RD-13956、RD-13957和RD-13958）（參見表21）。該組中除了RD-13950和RD-13952之外的所有化合物都具有比示例性saRNA對照（RD-12065）超出4.0倍至5.4倍的更好的活化活性，這表明saRNA核苷酸序列可耐受不同的突出端長度，其中某些變體可提供更大的效力（圖17A）。例如，在有義股的3'端處含有1個、3個或5個核苷酸突出端的RD-13956、RD-13957和RD-13958顯示出與示例性saRNA對照相比更好的活化活性，尤其是3個核苷酸的突出端（即，RD-13957），這表明突出端可為誘導 SERPING1mRNA水準提供益處，並可獨立地最佳化。具有平端的18nt核苷酸的較短大小的RD-13951對 SERPING1mRNA具有優異的誘導作用，這表明較短的核苷酸序列是可行的並提供益處。在3'端處具有2nt TT的16nt核苷酸的最短大小的RD-13950對 SERPING1mRNA具有很小的誘導作用，這表明最短的核苷酸序列同樣可行。有義股和反義股長度分別為22nt和20nt的較長大小的RD-13952具有適度的誘導作用，這表明較長的核苷酸序列是可行的。整體而言，資料表明長度範圍為16個至30個連續核苷酸的saRNA核苷酸序列是功能性的，其突出端為1個至5個核苷酸，與其標靶序列具有至少80%的同源性或互補性。
B組包括6種化合物（即，RD-11513、RD-13959、RD-13960、RD-13962、RD-13965和RD-13966）（參見表21）。如圖17A所示，分別具有2nt TT的17nt核苷酸和具有平端的19nt核苷酸的較短大小的RD-13959和RD-13960對 SERPING1mRNA引起了優異的誘導作用。35nt有義股長度和33nt反義股長度的較長大小的RD-13962對 SERPING1mRNA具有輕微的誘導作用。有義股3'端長度為4nt突出端（即，RD-13965）和6nt突出端（即，RD-13966）顯示出高活化活性，尤其是對於4nt突出端。整體而言，資料表明長度範圍為17個至35個連續核苷酸的saRNA核苷酸序列是功能性的，並且其突出端範圍為4個至6個核苷酸，與其標靶序列具有至少76%的同源性或互補性。
C組包括化合物（即，RD-12066、RD-13968和RD-13970）（參見表21）。如圖17A所示，具有較長大小（35nt有義股和29nt反義股）的RD-13968對 SERPING1mRNA具有輕微的誘導作用。具有較長大小（29nt有義股和35nt反義股）的RD-13970與示例性saRNA對照（RD-12066）相比對 SERPING1mRNA具有更好的誘導作用。整體而言，資料表明大小範圍為29nt至35nt並與其標靶序列具有至少83%的同源性或互補性的saRNA是功能性的。
D組包括9種化合物（即，RD-12065、RD-13950、RD-13951、RD-13952、RD-13953、RD-13955、RD-13956、RD-13957和RD-13958）（參見表21）。該組中除了RD-13950和RD-13955之外的所有化合物都具有等於或優於示例性saRNA對照（RD-12065）2.4倍至3.1倍的活化活性，這表明saRNA核苷酸序列可耐受不同的突出端長度，其中某些變體可提供更大的效力（圖17B）。例如，在有義股的3'端處含有1個、3個或5個核苷酸突出端的RD-13956、RD-13957和RD-13958顯示出等於或優於示例性saRNA對照的高活化活性，尤其是3個核苷酸的突出端（即，RD-13957），這表明突出端可為誘導 SERPING1mRNA水準提供益處，並可獨立地最佳化。具有平端的18nt核苷酸的較短大小的RD-13951對 SERPING1mRNA具有高的誘導作用，這表明較短的核苷酸序列是可行的並提供益處。在3'端處具有2nt TT的16nt核苷酸的最短大小的RD-13950對 SERPING1mRNA具有很小的誘導作用，這表明最短的核苷酸序列同樣可行。有義股和反義股長度分別為22nt和20nt的較長大小的RD-13952具有高的誘導作用，這表明較長的核苷酸序列是可行的。有義股和反義股長度分別為30nt和28nt的最長大小的RD-13953引起高的誘導作用，這表明最長的核苷酸序列是可行的。在全長為19nt的反義股中具有5nt錯誤配對的RD-13955引起對 SERPING1mRNA水準的1.3倍的誘導作用，這表明saRNA核苷酸序列具有至少26%的突變不會喪失活化活性（資料未示出）。整體而言，資料表明大小為16nt至30nt，具有1個至5個核苷酸的突出端，含有高達26%的序列突變，與其標靶序列具有至少80%的同源性或互補性的saRNA是功能性的。
E組包括5種化合物（即，RD-12066、RD-13967、RD-13968、RD-13969和RD-13970）（參見表21）。如圖17B所示，均在3'端處具有2nt TT的16nt核苷酸的較短大小的RD-13967和RD-13969對 SERPING1mRNA具有很小的誘導作用，這表明較短的核苷酸序列是可用的。35nt有義股長度和29nt反義股長度的較長大小的RD-13968對 SERPING1mRNA具有適度的誘導作用，這表明較長的核苷酸序列是可行的。具有較長大小（29nt有義股和35nt反義股）的RD-13970與示例性saRNA對照（RD-12066）相比對 SERPING1mRNA具有更強的誘導作用。整體而言，資料表明大小範圍為16nt至35nt並與其標靶序列具有至少83%的同源性或互補性的saRNA是功能性的。
總而言之，這些結果表明長度範圍從16個至35個連續核苷酸並且懸掛1個至6個核苷酸並且是26%突變的saRNA核苷酸序列是可行的並且具有至少76%的同源性或互補性。 實施例19 ：在PMH 細胞中由 Serping1saRNA 誘導的Serping1 mRNA 的時間進程變化
為了檢測 Serping1saRNA的動力學活性，將化學修飾的saRNA（即，RD-12349、RD-12350、RD-12351和RD-12347）（參見表17）以25nM在PMH細胞中轉染1天至7天。RD-12349、RD-12350、RD-12351和RD-12347均為完全修飾的saRNA，分別來源於雙股體saRNA RD-12369、RD-12370、RD-12371和RD-12367。使用基因特異性引子組通過RT-qPCR對saRNA的 Serping1mRNA水準進行定量。
如圖18所示，RD-12349和RD-12350在7天內誘導了 Serping1mRNA水準的上升和持久的活化活性，分別誘導了約1.1倍至3.3倍以及約1.1倍至3.2倍，其中RD-12349表現出最大且最持久（T max≥7天）的活化活性。RD-12351從第1天至第5天誘導了 Serping1mRNA水準的遞增的活化活性，並從第6天至第7天降低，其中在第5天發生 Serping1mRNA誘導的峰值（2.6倍）。RD-12347從第1天至第4天誘導了 Serping1mRNA水準的遞增的活化活性，並從第5天至第7天降低，其中在第4天發生 Serping1mRNA誘導的峰值（2.5倍）。資料表明化學修飾的saRNA在PMH細胞中顯示出各種動力學活性。
此外，隨後分別用25nM（圖19A）的RNAiMAX試劑和500nM（圖19B和圖19C）的自由攝取來測試另外的 Serping1saRNA（即，RD-11931、RD-11927和RD-12189）（參見表17）1天至5天。RD-11432是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。RD-11931、RD-11927和RD-12189是基於RD-12351、RD-12350和RD-12349，通過將衍生自tC2的綴合基團綴合到有義股的3'端而設計的。
具體地，tC2的結構如下所示： （tC2化合物），並且衍生自tC2的綴合基團具有如下所示的結構： 星號表示綴合基團直接或通過連接部分（例如上文指出的那些）與鏈連接的位點。
如圖19A所示，RD-11927和RD-12189在5天內誘導了 Serping1mRNA水準的活化活性，分別誘導了約1.0倍至2.8倍以及約0.9倍至1.8倍，其中在第4天活化降低並在第5天升高。RD-11931從第1天至第4天誘導了 Serping1mRNA水準的遞增的活化活性並在第5天降低，其中在第4天發生 Serping1mRNA誘導的峰值（2.4倍）。如圖19B所示，RD-11931和RD-11927從第1天至第4天誘導了 Serping1mRNA水準的遞增的活化活性並在第5天達到平臺期，其中RD-11931表現出最高的 Serping1mRNA誘導（1.6倍）。RD-12189從第2天至第4天誘導了 Serping1mRNA水準的輕微的活化活性並在第5天恢復，其中在第4天發生了最高的 Serping1mRNA誘導（1.2倍）。RD-11432顯示出在5天內通過RNAiMAX試劑或自由攝取， Serping1mRNA表現顯著減弱（約90%）。如圖19C所示，在直至5天的測試點中的任一測試點都沒有檢測出所有化合物的胱天蛋白酶3/7活性。
總而言之，這些結果表明化學修飾的saRNA顯示出各種動力學活性，並在PMH細胞中有良好的耐受性。 實施例20 ：C57BL/6J 小鼠的肝中 Serping1saRNA 的持久的活化
為了評估 Serping1saRNA的活化持久性，通過SC注射以20mg/kg將RD-12497施用於成年雌性C57BL/6J小鼠。基於RD-12350設計在有義股的3'端處經由S9接頭綴合有輔助單股寡核苷酸（ACO）序列的RD-12497。將生理食鹽水作為媒液對照，以建立 Serping1mRNA的基線表現水準。RD-11432是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。在相同的施用下，RD-11432以3mg/kg注射。在治療後第7天和第14天處死小鼠，並通過RT-qPCR在肝組織中對 Serping1mRNA誘導進行定量。如圖20A所示，RD-12497分別在第7天和第14天誘導了1.3倍和1.4倍的 Serping1mRNA的表現。RD-11432分別在第7天和第14天引起Serping1 mRNA的92%和90%的減弱。如圖20B所示，與生理食鹽水組相比，直至14天用RD-12497處理的動物的體重沒有明顯减輕，這表明修飾的saRNA在C57BL/6J小鼠中耐受良好。
為了進一步評估 Serping1saRNA的活化持久性，通過SC注射以50mg/kg將RD-13144施用於成年雌性C57BL/6J小鼠。RD-13144（完全修飾的 Serping1saRNA）是基於RD-12350通過將衍生自遞送增強化合物（DEC；即，tC2x4）的綴合基團連接到有義股的3'端處，並將乙烯基膦酸酯（VP）修飾綴合至反義股的5'位置處（5'VP）而設計的。將生理食鹽水作為媒液對照，以建立 Serping1mRNA的基線表現水準。tC2化合物或tC2x4化合物的結構如下所示： （tC2化合物）或 （tC2x4化合物）。
RD-11432是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。在相同的施用下，RD-11432以3mg/kg注射。在治療後第10天處死小鼠，並通過RT-qPCR在肝組織中對 Serping1mRNA誘導進行定量。如圖21A所示，RD-13114在第10天誘導了1.3倍的 Serping1mRNA的表現。RD-11432在第10天引起 Serping1mRNA的91%的減弱。如圖21B所示，與生理食鹽水組相比，直至10天用RD-12497和RD-11432處理的動物的體重沒有明顯减輕，這表明修飾的saRNA在C57BL/6J小鼠中耐受良好。
整體而言，這些結果表明化學修飾的saRNA具有持久的 Serping1mRNA的活化活性，沒有明顯的毒性。 實施例21 ：本公開的化合物tC2 的製備 1. 第1 部分：化合物3 的合成。 (1)化合物2的製備：
將二羧酸（20g，86.8mmol）溶解/懸浮至無水CH 2Cl 2（100mL）中。然後將草醯氯（16.2mL，190.96mmol）和DMF（5滴）加入到溶液中。反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後減壓濃縮，得到化合物2粗品，不經進一步純化直接用於下一步驟。 (2)化合物3的製備：
2小時內將苯甲醇（9.39g，86.8mmol）和Et 3N（12mL，86.8mmol）的THF（200mL）溶液滴加到冰冷的化合物 2（86.8mmol）的THF（100mL）溶液中。然後將溶液升溫至室溫並攪拌過夜。1小時內將H 2O（80mL）、Et 3N（12mL，86.8mmol）和THF（80mL）的混合物緩慢加入到該溶液中，並繼續攪拌2小時。然後除去THF，並向殘餘物中加入20mL H 2O。用乙醚（3×100mL）萃取混合物，合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。向殘餘物中加入乙酸乙酯（20mL），並過濾懸浮液以除去十二烷二酸。濃縮濾液後進行層析分析（己烷:乙酸乙酯=4:1至2:1），得到化合物3（12.5g，45%產率），為白色固體。MW計算值：320.20；MW實測值：319.02 [M-H] -。 2. 第2 部分：化合物6 的合成。 (1)化合物5的製備：
在室溫下向Fmoc-L-羥基脯胺酸（化合物4，13.3g，37.6mmol）的無水THF（250mL）溶液中緩慢加入硼烷-甲基硫醚絡合物（6.16g，80mmol）。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘，然後加熱回流大約1小時。將甲醇（15mL）小心地加入到反應混合物中，回流15分鐘。之後將反應混合物減壓濃縮。然後，將粗產物用甲醇蒸發三次（每次100mL）以除去硼相關雜質。所得化合物5粗產物不經進一步純化直接用於下一步驟。 (2)化合物6的製備：
在冰浴下，向化合物 5（37.6mmol）的無水吡啶（200mL）溶液中緩慢加入DMTrCl（14g，41.4mmol）。在氮氣保護下攪拌反應體系過夜，然後減壓濃縮。將粗產物溶於無水MeCN（300mL），然後向混合物中加入Et 3N（112.8mmol，15.6mL）並加熱至60℃反應4小時。減壓濃縮後，將所得殘餘物通過快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物 6（7.57g，48%產率），為黃色固體。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.41 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J= 8.8 Hz, 4H), 7.28 – 7.22 (m, 2H), 7.18 (t, J= 7.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 8.8 Hz, 4H), 4.34 (s, 1H), 3.75 (d, J= 11.1 Hz, 6H), 3.60 (dd, J= 12.7, 6.7 Hz, 1H), 3.10 – 2.92 (m, 5H), 2.86 (d, J= 11.5 Hz, 1H), 1.85 (dd, J= 13.5, 7.1 Hz, 1H), 1.63 (ddd, J= 13.7, 7.9, 5.9 Hz, 1H)。 3. 總合成路徑。 (1) 化合物9的製備：
向2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇（化合物7，25g，206mmol）的DMSO（50mL）溶液中緩慢加入氫氧化鈉溶液（0.83g NaOH溶於4mL H 2O）。然後在氮氣保護下緩慢加入3-(叔丁氧基)-3-氧代丙-1-烯-1-基銨（90g，700mmol）。反應體系在室溫下攪拌2天。然後將100mL H 2O加入到反應體系中，用乙酸乙酯（3×150mL）萃取混合物，合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。將所得殘餘物通過快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至5% MeOH/DCM），得到化合物 9（42g，40%產率），為無色油狀物。 (2) 化合物10的製備：
在氮氣保護下，向12-(芐氧基)-12-氧代十二烷酸（化合物 3，3.3g，10.3mmol）的DCM（50mL）溶液中加入HBTU（7.81g，20.6mmol）和DIPEA（5.1mL，30.9mmol）。5分鐘後，向反應體系中加入化合物 9（7.8g，15.45mmol）。之後將反應體系在室溫下攪拌4小時，然後將50mL H 2O加入到反應體系中，用DCM（3×100mL）萃取混合物，並將有機相合併，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。將所得殘餘物通過快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至30% EA/HX），得到化合物 10（7.16g，86%產率），為無色油狀物。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.42 – 7.27 (m, 5H), 6.00 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.70 (s, 6H), 3.64 (t, J= 6.3 Hz, 6H), 2.44 (t, J= 6.3 Hz, 6H), 2.34 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.17 – 2.09 (m, 2H), 1.59 (d, J= 11.6 Hz, 4H), 1.45 (s, 27H), 1.26 (s, 12H)。 (3) 化合物12的製備：
在氮氣保護下，向化合物 10（7.0g，8.67mmol）的DCM（100mL）溶液中加入CF 3COOH（50mL）。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後減壓濃縮，得到粗產物，為無色油狀物。之後，將無色油狀物溶於100mL DCM中，然後在氮氣保護下將HBTU（19.73g，52.02mmol）和DIPEA（13mL，78.03mmol）加入到反應體系中。五分鐘後，將(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯（化合物 11，6.8g，39mmol）加入到反應體系中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後，將50mL H 2O加入到反應液中，用DCM（3×100mL）萃取混合物，並將有機相合併，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。將所得殘餘物通過快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物 12（6.7g，70%產率），為無色油狀物。 (4) 化合物14的製備：
向化合物 12（1.0g，0.9mmol，1.0eq）的DCM（8mL）溶液中加入HCl/二氧六環（4M，8mL）。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後減壓濃縮，得到粗產物，為黃色固體。之後，將粗產物溶於15mL DCM中，然後在氮氣保護下將化合物 13（1.81g，4.05mmol，4.5eq）、HBTU（1.53g，4.05mmol，4.5eq）和DIPEA（1.79mL，10.8mmol，12.0eq）加入到反應體系中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後將10mL H 2O加入到反應混合物中。用DCM（3×20mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物 14（0.99g，52%產率），為白色固體。使用 1H NMR具體描述產物。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.37 – 7.32 (m, 5H), 5.34 (d, J= 2.9 Hz, 3H), 5.29 (s, 2H), 5.19 (dd, J= 11.2, 3.2 Hz, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.59 (d, J= 8.4 Hz, 3H), 4.12 (dd, J= 13.4, 5.8 Hz, 6H), 3.90 (d, J= 6.2 Hz, 4H), 3.67 (s, 12H), 3.47 (s, 6H), 3.26 (d, J= 5.3 Hz, 10H), 3.06 (q, J= 7.4 Hz, 4H), 2.42 (t, J= 5.4 Hz, 6H), 2.34 (t, J= 7.5 Hz, 3H), 2.22 (dd, J= 16.2, 7.7 Hz, 5H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.40 - 1.35 (m, 22H), 1.27 - 1.22 (m, 12H)。 (5) 化合物15的製備：
在氮氣保護下，向化合物 14（0.98g，0.47mmol）的MeOH（10mL）溶液中緩慢加入Pd/C（98mg）。然後用氫氣置換反應氣氛三次。之後，通過在室溫下用氫氣球吹掃將反應混合物攪拌過夜。然後過濾反應混合物並減壓濃縮得到粗產物。
將粗產物溶於DCM（20mL）中，然後在氮氣保護下將HBTU（267mg，0.705mmol，1.5eq）和DIPEA（265μL，1.598mmol，3.4eq）加入到反應中。五分鐘後，將化合物 6（236mg，0.564mmol，1.2eq）加入到反應混合物中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後將H 2O（10mL）加入到反應混合物中。用DCM（3×20mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至10% MeOH/DCM），得到化合物 15（0.79g，69%產率），為黄色固體。使用 1H NMR具體描述產物。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.34 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.25 – 7.20 (m, 5H), 6.97 – 6.89 (m, 2H), 6.80 (t, J= 8.6 Hz, 4H), 5.33 (s, 3H), 5.17 (ddd, J= 11.0, 7.7, 3.2 Hz, 3H), 4.60 (t, J= 9.1 Hz, 3H), 4.19 – 4.06 (m, 9H), 3.95 – 3.85 (m, 6H), 3.78 (d, J= 3.5 Hz, 6H), 3.67 (s, 12H), 3.48 (t, J= 10.8 Hz, 4H), 3.26 (s, 12H), 2.42 (t, J= 5.2 Hz, 6H), 2.24 (dd, J= 26.4, 11.2 Hz, 11H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.93 (s, 9H), 1.72 – 1.51 (m, 22H), 1.38 – 1.31 (m, 6H), 1.27 (d, J= 8.6 Hz, 12H)。 (6) 化合物16的製備：
在氮氣保護下，向化合物 15（780mg，0.324mmol，1.0eq）的無水DCM（6mL）溶液中加入DMAP（138mg，1.13mmol，3.5eq）、琥珀酸酐（97mg，0.97mmol，3.0eq）。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後將H 2O（10mL）加入到反應體系中。用DCM（3×20mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至15% MeOH/DCM），得到化合物 16（690mg，85%產率），為白色固體。使用 1H NMR具體描述產物。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.38 – 7.31 (m, 4H), 7.21 – 7.12 (m, 5H), 6.80 (dd, J= 13.7, 5.2 Hz, 4H), 5.33 (d, J= 2.7 Hz, 3H), 5.19 (d, J= 11.2 Hz, 3H), 4.63 (dd, J= 8.2, 4.9 Hz, 3H), 4.16 – 4.07 (m, 9H), 3.78 (s, 6H), 3.77 (s, 6H), 3.67 (s, 12H), 3.51 – 3.45 (m, 4H), 3.25 (s, 12H), 2.58 (d, J= 7.7 Hz, 4H), 2.43 (t, J= 5.2 Hz, 6H), 2.25 (td, J= 15.1, 7.7 Hz, 11H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.97 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.83 – 1.51 (m, 24H), 1.46 – 1.29 (m, 6H), 1.26 (d, J= 12.0 Hz, 12H)。 (7) 化合物tC2的製備：
在氮氣保護下，向化合物 16（690mg，0.275mmol，1.0eq）、可控微孔玻璃（CPG；代號：C3006-1000，河北迪納興科生物科技有限公司，中國；4.8g）、 N, N-二異丙基乙胺（DIPEA；137μL，0.825mmol，3.0eq）的乙腈（40mL）溶液中加入HBTU（208mg，0.55mmol，2.0eq）。反應混合物在25℃下振盪過夜，然後用DCM和乙醚洗滌，得到粗品載體材料。
在氮氣保護下，向乙酸酐（15mL）、吡啶（34mL）、NEt 3（500μL）的乙腈（22mL）溶液中加入粗品載體材料。反應混合物在25℃下振盪1h，然後用DCM和乙醚洗滌，得到本公開的化合物t C2（4.7g）。 實施例22 ：與衍生自本公開的化合物tC2 的綴合基團連接的寡核苷酸的製備 寡核苷酸的一般合成方法(1) 單股合成方法
通過固相合成技術，在K&A DNA合成儀（K&A Laborgeraete GbR，德國沙夫海姆）上合成單股寡核苷酸。
起始物料是通用載體材料或特殊載體材料，其可通過商業方式購買來獲得，或如前文中的揭露方法所述進行合成。通常，在DNA合成儀中，將包括各種接頭和綴合物的亞磷醯胺單體（0.1M，乙腈或二氯甲烷溶液）依次新增到載體材料上，以產生期望的全長寡核苷酸。每個亞磷醯胺加入循環由四個化學反應組成，包括脫三苯甲基、偶聯、氧化/硫醇化和封端。在第一個步驟中，使用3%二氯乙酸（TCA）的DCM溶液進行45秒的脫三苯甲基反應。在第二個步驟中，按12eq對所有亞醯胺進行6分鐘的亞磷醯胺偶合。在第三個步驟中，通過使用0.02M碘的THF:吡啶:水（70:20:10，v/v/v）溶液進行1分鐘的氧化；如果需要硫代磷酸酯修飾，則通過使用0.1M的氫化黃原素的吡啶:ACN（50:50，v/v）溶液進行3分鐘的硫醇化來代替氧化。在第四個步驟中，通過使用THF:乙酸酐:吡啶（80:10:10，v/v/v）（CAP A）和N-甲基咪唑:THF（10:90，v/v）（CAP B）進行20秒的封端。四個化學反應的循環將取決於單個寡核苷酸的長度。
脫保護I（核鹼基脫保護）：合成完成後，將載體材料轉移到螺旋蓋的微量離心管中。對於1μmol的合成規模，加入1mL甲胺和氫氧化銨的混合物。接著，將含有載體材料的管在60℃至65℃的烘箱中加熱15分鐘，然後使其冷卻至室溫。收集溶胞溶液並在SpeedVac中蒸發至乾，得到寡核苷酸單股粗品。
脫保護II（除去2'-TBDMS基團）：如果RNA寡核苷酸粗品仍攜帶2'-TBDMS基團，則將其溶於0.1mL DMSO。加入1mL三乙胺三氫氟酸鹽後，蓋上管蓋，並將混合物劇烈振盪，以確保完全溶解，然後在烘箱中於65℃的狀態下加熱15分鐘。將管從烘箱中移出並冷卻至室溫。將含有完全脫甲矽烷基化的寡核苷酸的溶液在乾冰上冷卻。將2mL冰冷的正丁醇（-20℃）以0.5mL每份小心地加入，以使寡核苷酸沉澱。將沉澱過濾，用1mL的冰冷正丁醇洗滌，隨後溶於0.01M三(羥甲基)胺基甲醇鹽酸鹽緩衝液中。 (2) 單股純化
寡核苷酸的純化在配備Source 15Q 4.6/100 PE柱的AKTA explorer 10上使用以下條件進行：緩衝液A：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5，B：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，pH 7.5，梯度：10% B至60% B，25分鐘內，流速：1mL/min。收集純的寡核苷酸，並通過HiPrep 26/10脫鹽柱脫鹽。(3) 退火形成雙股體
對於雙股體，在產生脫鹽的純化單股溶液後，將有義股和反義股在管中以相等莫耳濃度和相等體積進行混合。將管置於95℃的加熱塊中5分鐘，然後冷卻至室溫，隨後凍乾成粉末。
O1是按照上述寡核苷酸的一般合成方法，使用衍生自化合物tC2的綴合基團作為起始載體材料生成的。DEC-綴合寡核苷酸的示例性結構是如下所示的O1： O1（化合物tC2應用）
可以看出，在O1的結構中，衍生自遞送增強化合物tC2的綴合基團通過連接部分，例如–OP(O)2O-或–P(O)-O-，在有義股（S）的3'端與雙股RNA（dsRNA）雙股體（包括但不限於saRNA或siRNA）連接，其中（S）是有義股，而（AS）是反義股。 實施例 23 ：本公開的化合物 tC2x4 的製備 化合物tC2x4 (1) 化合物18是通過使用三乙酸(2 S,3 R,4 R,5 R,6 R)-3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2 H-吡喃-2,4,5-三基酯（化合物17）作為起始物料製備的。
在氮氣保護下，向三乙酸(2 S,3 R,4 R,5 R,6 R)-3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2 H-吡喃-2,4,5-三基酯（30g，77mmol，1.0eq）的DCM（300mL）溶液中加入TMSOTf（15.3mL，84.7mmol，1.1eq）。反應混合物在室溫下攪拌6小時。然後在冰浴中加入NaHCO 3溶液（21g NaHCO 3溶於200mL水），將反應物轉移到室溫。攪拌30分鐘後，用DCM萃取混合物3次，合併有機相，用鹽水洗滌，Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至50% EA/己烷），得到化合物18（19.8g，78%產率）。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：329.11；MW實測值：330.33 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H), 5.26 (dd, J = 11.4, 3.2 Hz, 1H), 4.53 (td, J = 11.4, 3.4 Hz, 1H), 4.43 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.27 (s, 1H), 4.11 – 4.08 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.00 (d, J = 7.3 Hz, 6H)。 (2) 化合物20的製備
在氮氣保護下，向化合物18（19.7g，59.8mmol，1.0eq）的DCE（260mL）溶液中加入己-5-烯-1-醇（化合物19；7.2g，71.8mmol，1.2eq）和TMSOTf（2.2mL，12mmol，0.2eq）。反應混合物在室溫下攪拌6小時，然後加入飽和NaHCO 3溶液（100mL），用DCM萃取混合物3次。合併有機相，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至5% MeOH/DCM），得到化合物20（18.7g，73%產率）。 (3) 化合物13的製備
在冰浴中，向化合物20（18.7g，43.6mmol，1.0eq）的ACN/DCM/H 2O（140mL/140mL/210mL）溶液中加入NaIO 4（37.3g，174.4mol，4.0eq）和RuCl 3•3H 2O（1.8g，8.72mol，0.2eq）。10分鐘後，將反應混合物轉移至室溫並攪拌過夜。然後過濾反應混合物並減壓濃縮。之後向混合物中加入水（100mL），然後用DCM萃取混合物3次，用鹽水洗滌有機相1次。用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮後，所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫液：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物13（19g，97%產率）。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：447.17；MW實測值：448.36 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.33 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 5.29 – 5.26 (m, 1H), 4.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 9.3, 6.8 Hz, 2H), 3.92 (dd, J = 8.4, 5.4 Hz, 2H), 3.50 (dd, J = 5.7, 4.0 Hz, 1H), 2.35 (dd, J = 14.3, 7.0 Hz, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.69 – 1.61 (m, 4H)。 (4) 本步驟包括由4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯製備化合物23。
在氮氣保護下，向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯（化合物21；8.0g，40.2mmol，1.0eq）和K 2CO 3（5.5g，40.2mmol）的無水DMF（100mL）溶液中加入(3-胺基丙基)胺基甲酸苯甲酯（化合物22；8.3g，40.2mmol，1.0eq）。將反應混合物在25℃下攪拌6小時，然後加入冷水（100mL）。用乙酸乙酯萃取混合物3次，有機相用飽和LiCl溶液洗滌3次，用鹽水洗滌1次。然後用無水Na 2SO 4乾燥，減壓濃縮，形成黃色固體化合物23，不經進一步純化直接用於下一步驟。 (5) 化合物24的製備
在冰浴中，向化合物23（10g，25.84mmol，1.0eq）的THF/H 2O（9:1，100mL）溶液中加入HCOONH 4（9.78g，155.04mmol，6.0eq）和Zn粉（10.14g，155.04mmol，6.0eq）。10分鐘後，將反應混合物移至室溫並攪拌過夜。然後過濾反應混合物並減壓濃縮。之後加入水（100mL），用乙酸乙酯萃取3次，有機相用鹽水洗滌1次。用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮後，形成的淡紅色固體化合物24不經進一步純化直接用於下一步驟。 (6) 化合物26的製備
在氮氣保護下，向化合物24（8.87g，24.84mmol，1.0eq）的EtOH（220mL）溶液中加入5-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)戊醛（化合物25；5.4g，24.84mmol，1.0eq）和AcOH（5.73mL，99.36mmol，4.0eq）。將反應混合物在80℃下攪拌過夜，然後減壓濃縮。然後加入飽和NaHCO 3溶液（100mL），用乙酸乙酯萃取混合物3次。合併有機相，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至5% MeOH/DCM），得到化合物26（6.3g，46%產率），為红色固體。使用質譜， 1H NMR和 13C NMR具體描述產物。MW計算值：553.30；MW實測值：554.29 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 8.5, 1.1 Hz, 1H), 7.44 – 7.28 (m, 5H), 7.26 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.16 (dd, J = 12.6, 5.3 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.67 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.28 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.04 – 1.88 (m, 4H), 1.67 (dd, J = 14.7, 6.6 Hz, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.04 (s, 6H)。 13C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 167.72, 156.63, 142.35, 138.19, 136.30, 128.60, 128.24, 124.10, 123.87, 121.63, 108.66, 66.96, 62.71, 60.41, 52.06, 41.31, 38.57, 32.46, 30.43, 27.30, 25.97, 24.15, 21.07, 18.34, 14.21。 (7) 化合物27的製備
在氮氣保護下，向化合物26（6.3g，11.4mmol，1.0eq）的無水THF（50mL）溶液中加入1M TBAF THF溶液（17.1mL，17.1mmol，1.5eq）。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，然後減壓濃縮。然後加入水（100mL），用DCM萃取混合物3次，合併有機相，用鹽水洗滌，Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物溶於50mL吡啶，並向其中加入DMTrCl（4.6g，13.68mmol，1.2eq）。將反應混合物在室溫下攪拌6小時，然後減壓濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至5% MeOH/DCM），得到化合物27（6.23g，74%產率），為黄色固體。使用質譜， 1H NMR和 13C NMR具體描述產物。MW計算值：741.34；MW實測值：303.11 [DMT]-，440.14 [去掉DMT+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.63 (dd, J = 5.7, 1.5 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 8.5, 1.1 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.37 – 7.28 (m, 11H), 7.21 (dd, J = 8.1, 6.1 Hz, 1H), 6.83 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 5.13 (s, 2H), 4.12 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.24 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 3.14 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.83 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.01 (dd, J = 16.0, 8.5 Hz, 4H), 1.79 (dd, J = 14.1, 6.6 Hz, 2H)。 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.81, 158.43, 156.64, 149.95, 145.34, 142.43, 138.26, 136.57, 136.05, 130.11, 128.69, 128.39, 128.26, 128.23, 127.84, 126.75, 124.17, 123.89, 121.70, 113.11, 108.75, 85.93, 67.02, 62.90, 55.31, 52.16, 41.37, 38.64, 30.50, 29.76, 27.30, 24.53。 (8) 將化合物27中所含的羰氧基還原為亞甲氧基，得到化合物28。
在氮氣保護和冰浴下，向化合物27（5.0g，6.74mmol，1.0eq）的無水THF（60mL）溶液中加入LiAlH 4（384mg，10.11mmol，1.5eq）。10分鐘後，將混合物轉移至室溫並攪拌約1小時。然後將反應物轉移至冰浴，向混合物中緩慢加入飽和酒石酸鈉鉀溶液（30mL）。反應30分鐘後，用Et 2O萃取反應體系3次，然後合併有機相，用鹽水洗滌，用Na 2SO 4乾燥，並濃縮。將所得殘餘物溶於20mL DMF，然後加入咪唑（688mg，10.11mmol，1.5eq）和TBSCl（1.524g，10.11mmol，1.5eq）。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。減壓濃縮後，所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至5% MeOH/DCM），得到化合物28（4.78g，86%產率），為黃色固體。使用質譜， 1H NMR和 13C NMR具體描述產物。MW計算值：827.43；MW實測值：303.16 [DMT]-，526.50 [去掉DMT+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.69 (s, 1H), 7.47 – 7.42 (m, 2H), 7.40 – 7.28 (m, 11H), 7.22 (t, J = 3.5 Hz, 3H), 6.86 – 6.80 (m, 4H), 5.13 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.15 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.13 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.05 – 1.94 (m, 4H), 1.81 – 1.74 (m, 2H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 0.97 (s, 9H), 0.13 (s, 6H)。 13C NMR (100 MHz, CDCl 3) δ 171.27, 158.45, 156.60, 154.95, 145.40, 142.93, 136.66, 135.52, 134.14, 130.14, 128.70, 128.37, 128.28, 127.85, 126.74, 120.93, 117.18, 113.13, 108.73, 85.93, 67.00, 65.53, 63.00, 60.51, 55.32, 53.55, 41.19, 38.74, 30.51, 29.85, 27.33, 26.14, 24.78, 21.17, 18.57, 14.33。 (9) 由起始物料4-氟-3-硝基苯甲酸（化合物29）製備化合物30。
在氮氣保護下，向4-氟-3-硝基苯甲酸（化合物29；35g，189.1mmol，1.0eq）和Na 2CO 3（30.6g，283.6mmol，1.5eq）的無水DMF（500mL）溶液中緩慢加入溴化芐（35.6g，207.98mmol，1.1eq）。將反應混合物在45℃下攪拌3小時，然後加入冷水（200mL）。用乙酸乙酯萃取混合物3次，有機相用飽和LiCl溶液洗滌3次，用鹽水洗滌1次。有機相經無水Na 2SO 4乾燥，減壓濃縮，形成黃色油狀的化合物30，不經進一步純化直接用於下一步驟。 (10) 化合物31的製備
在氮氣保護下，向化合物 30（52g，189.1mmol，1.0eq）和K 2CO 3（26.13g，189.1mmol，1.0eq）的無水DMF（500mL）溶液中加入(3-胺基丙基)胺基甲酸叔丁酯（化合物11；32.9g，189.1mmol，1.0eq）。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後加入冷水（200mL）。用乙酸乙酯萃取混合物3次，有機相用飽和LiCl溶液洗滌3次，用鹽水洗滌1次。用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮後，形成黃色固體化合物 31，不經進一步純化直接用於下一步驟。 (11) 還原化合物31生成化合物32。
在冰浴中，向化合物31（81.16g，189.1mmol，1.0eq）的THF/H 2O（9:1，666mL）溶液中加入HCOONH 4（71.58g，1.134mol，6.0eq）和Zn粉（74.19g，1.134mol，6.0eq）。10分鐘後，將反應混合物移至室溫並攪拌過夜。然後過濾反應混合物並減壓濃縮。之後向混合物中加入水（200mL），然後用乙酸乙酯萃取混合物3次，用鹽水洗滌有機相1次。有機鹽水經無水NaSO 4乾燥，減壓濃縮，形成淡紅色固體化合物32，不經進一步純化直接用於下一步驟。 (12) 通過用 N2, N6-雙(叔丁氧基羰基)-L-賴胺酸醯化化合物32生成化合物34。
在氮氣保護下，向化合物32（16.8g，42mmol，1.0eq）的DCM（300mL）溶液中加入 N2, N6-雙(叔丁氧基羰基)-L-賴胺酸（化合物33；21.82g，63mmol，1.5eq）、EDCI（12.08g，63mmol，1.5eq）和DMAP（2.565g，21mmol，0.5eq）。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後向反應混合物中加入200mL H 2O，用DCM（3×100mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至50% EA/己烷），得到化合物34（27.5g，90%產率），為黃色固體。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：727.42；MW實測值：728.47 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88 (dd, J = 8.6, 1.9 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.35 (ddt, J = 9.8, 7.1, 5.5 Hz, 5H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.16 (s, 1H), 3.37 – 2.97 (m, 6H), 1.78 (d, J = 25.4 Hz, 4H), 1.51 (s, 2H), 1.48 – 1.35 (m, 27H), 1.36 – 1.13 (m, 2H)。 (13) 由化合物34製備包含苯並咪唑結構的化合物35。
在氮氣保護下，將化合物34（20g，27.5mmol，1.0eq）加入AcOH（100mL）中。反應混合物在95℃下攪拌4小時，然後加入飽和NaHCO 3溶液（100mL），用乙酸乙酯萃取混合物3次，然後合併有機相，用飽和NaHCO 3溶液（3×100mL）洗滌，用Na 2SO 4乾燥，並濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至50% EA/己烷），得到化合物35（8.78g，45%產率），為白色固體。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：709.41；MW實測值：710.57 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 8.04 (dd, J = 8.5, 1.4 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.38 – 7.34 (m, 3H), 5.39 (s, 2H), 5.02 (dd, J = 15.8, 7.7 Hz, 1H), 3.20 - 3.10 (m, 6H), 2.08 - 1.96 (m, 4H), 1.57 – 1.48 (m, 4H), 1.41 (d, J = 8.6 Hz, 27H)。 (14) 化合物36的製備
向化合物35（1.8g，2.54mmol，1.0eq）的DCM（10mL）溶液中加入HCl/二氧六環（4M，20mL）。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後減壓濃縮，得到粗產物，為黃色固體。之後，將粗產物溶於25mL DCM中，然後在氮氣保護下將化合物13（3.4g，7.62mmol，3.0eq）、HBTU（3.37g，8.89mmol，3.5eq）和DIPEA（5.05mL，30.48mmol，12.0eq）加入到反應體系中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後將20mL H 2O加入到反應混合物中。用DCM（3×30mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物36（3.67g，85%產率），為黄色固體。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：1697.80；MW實測值：1698.53 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (d, J = 22.5 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.40 – 7.31 (m, 4H), 5.42 – 5.26 (m, 7H), 5.19 (td, J = 11.0, 3.3 Hz, 2H), 4.64 – 4.55 (m, 2H), 4.24 – 3.99 (m, 10H), 3.94 – 3.75 (m, 6H), 3.68 – 3.62 (m, 1H), 3.35 – 3.16 (m, 4H), 3.11 – 3.06 (m, 1H), 2.35 – 2.26 (m, 3H), 2.23 – 2.15 (m, 6H), 2.12 (d, J = 6.9 Hz, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 1.92 (dd, J = 11.6, 5.2 Hz, 9H), 1.78 (s, 2H), 1.71 – 1.61 (m, 6H), 1.51 (dd, J = 12.6, 6.5 Hz, 8H), 1.42 (d, J = 6.6 Hz, 4H)。 (15) 將化合物36連接到衍生自化合物28的化合物37
在氮氣保護下，向化合物36（1.85g，1.09mmol，1.0eq）的MeOH（20mL）溶液中緩慢加入Pd/C（185mg）。然後用氫氣置換反應氣氛三次。之後，通過在室溫下用氫氣球吹掃將反應混合物攪拌過夜。然後過濾反應混合物並減壓濃縮得到粗產物。
將粗產物溶於DCM（20mL）中，然後在氮氣保護下將HBTU（826mg，2.18mmol，2.0eq）和DIPEA（614μL，3.7mmol，3.4eq）加入到反應中。五分鐘後，將通過還原化合物28產生的化合物37（849mg，1.2mmol，1.1eq）加入到反應混合物中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。然後向反應體系中加入H 2O（20mL），用DCM（3×50mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至8% MeOH/DCM），得到化合物38（1.8g，72%產率），為白色固體。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：2282.08；MW實測值：1142.33 [M+2H]+/2。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.38 (dd, J = 12.7, 8.1 Hz, 4H), 7.28 (d, J = 8.8 Hz, 5H), 7.23 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.20 – 7.15 (m, 2H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.33 (s, 3H), 5.23 – 5.11 (m, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.58 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 2H), 4.18 (d, J = 10.6 Hz, 3H), 4.17 – 4.04 (m, 8H), 3.96 – 3.80 (m, 6H), 3.75 (s, 6H), 3.63 (dd, J = 13.3, 6.6 Hz, 1H), 3.57 – 3.40 (m, 5H), 3.22 (s, 3H), 3.07 (dd, J = 10.9, 4.7 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.42 (s, 6H), 2.20 (dd, J = 34.7, 6.1 Hz, 8H), 2.10 (d, J = 7.6 Hz, 9H), 2.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 2.01 (d, J = 3.3 Hz, 9H), 1.97 (dd, J = 7.5, 2.4 Hz, 9H), 1.89 (dd, J = 28.9, 13.9 Hz, 9H), 1.80 – 1.64 (m, 6H), 1.62 – 1.46 (m, 12H), 1.40 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.92 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)。 (16) 通過將化合物38的TBS基團脫保護然後用琥珀酸酐醯化生成化合物39。
在氮氣保護下，向化合物38（1.57g，0.687mmol，1.0eq）的無水THF（10mL）溶液中加入1M TBAF THF溶液（2.06mL，2.06mmol，3.0eq）。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，然後減壓濃縮，得到粗產物。
將粗產物溶於DCM（15mL）中，然後在氮氣保護下加入DMAP（587mg，4.8mmol，3.5eq）和琥珀酸酐（137mg，1.374mmol，2.0eq）。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後將H 2O（20mL）加入到反應混合物中。用DCM（3×50mL）萃取混合物。合併有機相，用Na 2SO 4乾燥，濃縮。所得殘餘物經快速層析法純化。所得殘餘物經快速層析法純化（矽膠，梯度洗脫劑：1%至10% MeOH/DCM），得到化合物39（1.0g，64%產率），為黃色油狀物。使用質譜和 1H NMR具體描述產物。MW計算值：2268.01；MW實測值：1135.22 [M+2H]+/2。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.17 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.30 – 7.26 (m, 5H), 7.24 (s, 2H), 7.18 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.50 (s, 2H), 5.32 (s, 2H), 5.29 (s, 5H), 5.25 – 5.12 (m, 4H), 4.60 (dd, J = 15.7, 8.3 Hz, 2H), 4.17 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.14 – 3.96 (m, 8H), 3.87 (dd, J = 15.1, 6.5 Hz, 5H), 3.76 (s, 6H), 3.45 (s, 6H), 3.19 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.08 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.01 (s, 10H), 2.90 – 2.77 (m, 2H), 2.63 (d, J = 17.4 Hz, 4H), 2.19 (dd, J = 24.8, 17.2 Hz, 9H), 2.12 – 2.08 (m, 9H), 2.01 (d, J = 3.7 Hz, 9H), 1.98 – 1.94 (m, 9H), 1.87 (dd, J = 24.8, 13.3 Hz, 9H), 1.76 – 1.62 (m, 6H), 1.55 (d, J = 15.4 Hz, 12H)。 (17) 將化合物39與載體材料可控微孔玻璃（CPG）連接以製備本發明的化合物tC2x4。
在氮氣保護下，向化合物39（233mg，0.103mmol，1.0eq）、可控微孔玻璃（CPG；1.8g）和 N, N-二異丙基乙胺（DIPEA；51μL，0.309mmol，3.0eq）的乙腈（14mL）溶液中加入HBTU（78mg，0.206mmol，2.0eq）。反應混合物在25℃下振盪過夜，然後用DCM和乙醚洗滌，得到粗品載體材料。
在氮氣保護下，向乙酸酐（6.2mL）、吡啶（12mL）、NEt 3（186μL）的乙腈（7.9mL）溶液中加入粗品載體材料。反應混合物在25℃下振盪1h，然後用DCM和乙醚洗滌，得到本公開的化合物tC2x4（1.84g）。 實施例 24 ：與衍生自本公開的化合物 tC2x4 的綴合基團連接的綴合寡核苷酸的製備
O2是按照上述實施例22中所示的寡核苷酸的一般合成方法，使用衍生自化合物tC2x4的綴合基團作為起始載體材料生成的。DEC-綴合寡核苷酸的示例性結構是如下所示的O2： O2（化合物tC2x4應用）
可以看出，在O2的結構中，衍生自遞送增強化合物tC2x4的綴合基團通過連接部分，例如–OP(O)2O-或–P(O)-O-，在有義股（S）的3'端與雙股RNA（dsRNA）雙股體（包括但不限於saRNA或siRNA）連接，其中（S）是有義股，而（AS）是反義股。
總而言之，基於以 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA的高通量篩選，鑑定了多個熱點和以該熱點作為標靶的能夠顯著活化 SERPING1基因表現的saRNA。這些saRNA不僅可以劑量依賴的方式調升 SERPING1基因的表現，還可顯著提高細胞中功能性蛋白質的比例。此外，體內功效研究證明本文公開的saRNA可顯著改善功能性C1INH蛋白的血液水準。這些結果清楚地表明，用以 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA在轉錄水準活化 SERPING1表現以提高C1INH蛋白表現是治療HAE的有希望的策略。 表1. 人類 SERPING1saRNA序列
dsRNA SEQ ID NO 標靶序列 （ 5'-3' ） SEQ ID NO 有義（ 5'-3' ） SEQ ID NO 反義（ 5'-3' ） 相對 SERPING1 mRNA （倍數變化） 相對 SERPING1 mRNA （ log2 ）
DS12A-0001 1 cagggattaggcttcagaa 274 CAGGGAUUAGGCUUCAGAATT 548 UUCUGAAGCCUAAUCCCUGTT 0.83 -0.263
DS12A-0002 2 gaggtgagcaatttccaaa 275 GAGGUGAGCAAUUUCCAAATT 549 UUUGGAAAUUGCUCACCUCTT 0.32 -1.628
DS12A-0003 3 ggaagctttggttgtgtaa 276 GGAAGCUUUGGUUGUGUAATT 550 UUACACAACCAAAGCUUCCTT 0.54 -0.899
DS12A-0004 4 actgctctaaggctcagta 277 ACUGCUCUAAGGCUCAGUATT 551 UACUGAGCCUUAGAGCAGUTT 0.66 -0.592
DS12A-0005 5 ggaggtgagcaatttccaa 278 GGAGGUGAGCAAUUUCCAATT 552 UUGGAAAUUGCUCACCUCCTT 0.44 -1.181
DS12A-0006 6 accaggggatttgggctaa 279 ACCAGGGGAUUUGGGCUAATT 553 UUAGCCCAAAUCCCCUGGUTT 2.12 1.081
DS12A-0007 7 tcacatccgttgtctgtta 280 UCACAUCCGUUGUCUGUUATT 554 UAACAGACAACGGAUGUGATT 1.39 0.474
DS12A-0008 8 atgggtctctacgagcaaa 281 AUGGGUCUCUACGAGCAAATT 555 UUUGCUCGUAGAGACCCAUTT 0.95 -0.074
DS12A-0009 9 tgggtctctacgagcaaaa 282 UGGGUCUCUACGAGCAAAATT 556 UUUUGCUCGUAGAGACCCATT 1.26 0.329
DS12A-0010 10 cggaggtgagcaatttcca 283 CGGAGGUGAGCAAUUUCCATT 557 UGGAAAUUGCUCACCUCCGTT 1.52 0.602
DS12A-0011 11 agggattaggcttcagaat 284 AGGGAUUAGGCUUCAGAAUTT 558 AUUCUGAAGCCUAAUCCCUTT 2.63 1.393
DS12A-0012 12 gggattaggcttcagaata 285 GGGAUUAGGCUUCAGAAUATT 559 UAUUCUGAAGCCUAAUCCCTT 0.56 -0.843
DS12A-0013 13 ctgctctaaggctcagtat 286 CUGCUCUAAGGCUCAGUAUTT 560 AUACUGAGCCUUAGAGCAGTT 1.71 0.777
DS12A-0014 14 tgctctaaggctcagtatc 287 UGCUCUAAGGCUCAGUAUCTT 561 GAUACUGAGCCUUAGAGCATT 0.80 -0.315
DS12A-0015 15 gggaagctttggttgtgta 288 GGGAAGCUUUGGUUGUGUATT 562 UACACAACCAAAGCUUCCCTT 2.49 1.317
DS12A-0016 16 agcagggattaggcttcag 289 AGCAGGGAUUAGGCUUCAGTT 563 CUGAAGCCUAAUCCCUGCUTT 1.32 0.403
DS12A-0017 17 agctgagaactgcacccaa 290 AGCUGAGAACUGCACCCAATT 564 UUGGGUGCAGUUCUCAGCUTT 1.89 0.915
DS12A-0018 18 taccaggggatttgggcta 291 UACCAGGGGAUUUGGGCUATT 565 UAGCCCAAAUCCCCUGGUATT 2.37 1.248
DS12A-0019 19 ccaggggatttgggctaaa 292 CCAGGGGAUUUGGGCUAAATT 566 UUUAGCCCAAAUCCCCUGGTT 1.17 0.232
DS12A-0020 20 catccgttgtctgttatac 293 CAUCCGUUGUCUGUUAUACTT 567 GUAUAACAGACAACGGAUGTT 2.77 1.472
DS12A-0021 21 cgacatttcactgctctaa 294 CGACAUUUCACUGCUCUAATT 568 UUAGAGCAGUGAAAUGUCGTT 5.61 2.487
DS12A-0022 22 ctcacatccgttgtctgtt 295 CUCACAUCCGUUGUCUGUUTT 569 AACAGACAACGGAUGUGAGTT 11.16 3.480
DS12A-0023 23 ccgacatttcactgctcta 296 CCGACAUUUCACUGCUCUATT 570 UAGAGCAGUGAAAUGUCGGTT 2.29 1.192
DS12A-0024 24 gcggagcacattttgtgta 297 GCGGAGCACAUUUUGUGUATT 571 UACACAAAAUGUGCUCCGCTT 2.74 1.455
DS12A-0025 25 gaggaataacggaggtgag 298 GAGGAAUAACGGAGGUGAGTT 572 CUCACCUCCGUUAUUCCUCTT 1.39 0.470
DS12A-0026 26 ggattaggcttcagaatac 299 GGAUUAGGCUUCAGAAUACTT 573 GUAUUCUGAAGCCUAAUCCTT 1.70 0.763
DS12A-0027 27 aggcttcagaatacttctc 300 AGGCUUCAGAAUACUUCUCTT 574 GAGAAGUAUUCUGAAGCCUTT 1.79 0.840
DS12A-0028 28 ctctaaggctcagtatctt 301 CUCUAAGGCUCAGUAUCUUTT 575 AAGAUACUGAGCCUUAGAGTT 2.00 1.002
DS12A-0029 29 ggttgtgtaaagctgagaa 302 GGUUGUGUAAAGCUGAGAATT 576 UUCUCAGCUUUACACAACCTT 1.32 0.405
DS12A-0030 30 tggttgtgtaaagctgaga 303 UGGUUGUGUAAAGCUGAGATT 577 UCUCAGCUUUACACAACCATT 2.15 1.104
DS12A-0031 31 gagatgggagcagggatta 304 GAGAUGGGAGCAGGGAUUATT 578 UAAUCCCUGCUCCCAUCUCTT 7.50 2.906
DS12A-0032 32 tgggtacaatggggcacaa 305 UGGGUACAAUGGGGCACAATT 579 UUGUGCCCCAUUGUACCCATT 0.96 -0.061
DS12A-0033 33 gggtacaatggggcacaaa 306 GGGUACAAUGGGGCACAAATT 580 UUUGUGCCCCAUUGUACCCTT 1.12 0.166
DS12A-0034 34 atggggcacaaagggttac 307 AUGGGGCACAAAGGGUUACTT 581 GUAACCCUUUGUGCCCCAUTT 0.44 -1.198
DS12A-0035 35 gagcagggattaggcttca 308 GAGCAGGGAUUAGGCUUCATT 582 UGAAGCCUAAUCCCUGCUCTT 0.91 -0.143
DS12A-0036 36 gcagggattaggcttcaga 309 GCAGGGAUUAGGCUUCAGATT 583 UCUGAAGCCUAAUCCCUGCTT 0.68 -0.553
DS12A-0037 37 cacatccgttgtctgttat 310 CACAUCCGUUGUCUGUUAUTT 584 AUAACAGACAACGGAUGUGTT 3.18 1.668
DS12A-0038 38 tatgggtctctacgagcaa 311 UAUGGGUCUCUACGAGCAATT 585 UUGCUCGUAGAGACCCAUATT 1.31 0.390
DS12A-0039 39 aacggaggtgagcaatttc 312 AACGGAGGUGAGCAAUUUCTT 586 GAAAUUGCUCACCUCCGUUTT 1.39 0.476
DS12A-0040 40 aactgcggagcacattttg 313 AACUGCGGAGCACAUUUUGTT 587 CAAAAUGUGCUCCGCAGUUTT 2.81 1.493
DS12A-0041 41 ctgcggagcacattttgtg 314 CUGCGGAGCACAUUUUGUGTT 588 CACAAAAUGUGCUCCGCAGTT 3.95 1.981
DS12A-0042 42 actgattatgggtctctac 315 ACUGAUUAUGGGUCUCUACTT 589 GUAGAGACCCAUAAUCAGUTT 1.01 0.010
DS12A-0043 43 gacatttcactgctctaag 316 GACAUUUCACUGCUCUAAGTT 590 CUUAGAGCAGUGAAAUGUCTT 14.20 3.828
DS12A-0044 44 aggggatttgggctaaatt 317 AGGGGAUUUGGGCUAAAUUTT 591 AAUUUAGCCCAAAUCCCCUTT 1.67 0.743
DS12A-0045 45 gcacaaagggttactttga 318 GCACAAAGGGUUACUUUGATT 592 UCAAAGUAACCCUUUGUGCTT 1.00 0.004
DS12A-0046 46 ggagcacattttgtgtaca 319 GGAGCACAUUUUGUGUACATT 593 UGUACACAAAAUGUGCUCCTT 0.95 -0.068
DS12A-0047 47 gcacattttgtgtacatgc 320 GCACAUUUUGUGUACAUGCTT 594 GCAUGUACACAAAAUGUGCTT 0.81 -0.306
DS12A-0048 48 ggcacaaagggttactttg 321 GGCACAAAGGGUUACUUUGTT 595 CAAAGUAACCCUUUGUGCCTT 5.97 2.579
DS12A-0049 49 caggggatttgggctaaat 322 CAGGGGAUUUGGGCUAAAUTT 596 AUUUAGCCCAAAUCCCCUGTT 1.02 0.029
DS12A-0050 50 ggggatttgggctaaattc 323 GGGGAUUUGGGCUAAAUUCTT 597 GAAUUUAGCCCAAAUCCCCTT 9.23 3.207
DS12A-0051 51 ggcttcagaatacttctcc 324 GGCUUCAGAAUACUUCUCCTT 598 GGAGAAGUAUUCUGAAGCCTT 0.51 -0.973
DS12A-0052 52 agatgggagcagggattag 325 AGAUGGGAGCAGGGAUUAGTT 599 CUAAUCCCUGCUCCCAUCUTT 0.36 -1.478
DS12A-0053 53 ggtacaatggggcacaaag 326 GGUACAAUGGGGCACAAAGTT 600 CUUUGUGCCCCAUUGUACCTT 2.02 1.014
DS12A-0054 54 ggggcacaaagggttactt 327 GGGGCACAAAGGGUUACUUTT 601 AAGUAACCCUUUGUGCCCCTT 1.01 0.013
DS12A-0055 55 ggcccacaaagaagaccaa 328 GGCCCACAAAGAAGACCAATT 602 UUGGUCUUCUUUGUGGGCCTT 2.02 1.011
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DS12A-0150 150 aatggcagaacacctacag 423 AAUGGCAGAACACCUACAGTT 697 CUGUAGGUGUUCUGCCAUUTT 0.15 -2.746
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DS12A-0164 164 aagaagaccaagcggtcag 437 AAGAAGACCAAGCGGUCAGTT 711 CUGACCGCUUGGUCUUCUUTT 0.70 -0.516
DS12A-0165 165 accaagcggtcagtcccat 438 ACCAAGCGGUCAGUCCCAUTT 712 AUGGGACUGACCGCUUGGUTT 0.14 -2.796
DS12A-0166 166 ccaagcggtcagtcccatt 439 CCAAGCGGUCAGUCCCAUUTT 713 AAUGGGACUGACCGCUUGGTT 0.32 -1.657
DS12A-0167 167 caagcggtcagtcccattc 440 CAAGCGGUCAGUCCCAUUCTT 714 GAAUGGGACUGACCGCUUGTT 0.59 -0.759
DS12A-0168 168 ggtgcctcacatccgttgt 441 GGUGCCUCACAUCCGUUGUTT 715 ACAACGGAUGUGAGGCACCTT 1.18 0.236
DS12A-0169 169 ggcccgacatttcactgct 442 GGCCCGACAUUUCACUGCUTT 716 AGCAGUGAAAUGUCGGGCCTT 2.70 1.435
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DS12A-0181 181 aatgcttgttgagctgggt 454 AAUGCUUGUUGAGCUGGGUTT 728 ACCCAGCUCAACAAGCAUUTT 0.22 -2.158
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DS12A-0184 184 agaactgcacccaagcttc 457 AGAACUGCACCCAAGCUUCTT 731 GAAGCUUGGGUGCAGUUCUTT 20.44 4.353
DS12A-0185 185 gaatgcttgttgagctggg 458 GAAUGCUUGUUGAGCUGGGTT 732 CCCAGCUCAACAAGCAUUCTT 0.27 -1.899
DS12A-0186 186 agaacacctacagggcaca 459 AGAACACCUACAGGGCACATT 733 UGUGCCCUGUAGGUGUUCUTT 0.79 -0.346
DS12A-0187 187 aaagctgagaactgcaccc 460 AAAGCUGAGAACUGCACCCTT 734 GGGUGCAGUUCUCAGCUUUTT 6.09 2.605
DS12A-0188 188 ttgggctaaattcctggcc 461 UUGGGCUAAAUUCCUGGCCTT 735 GGCCAGGAAUUUAGCCCAATT 0.48 -1.064
DS12A-0189 189 gggctaaattcctggcctg 462 GGGCUAAAUUCCUGGCCUGTT 736 CAGGCCAGGAAUUUAGCCCTT 2.54 1.346
DS12A-0190 190 ctgagaactgcacccaagc 463 CUGAGAACUGCACCCAAGCTT 737 GCUUGGGUGCAGUUCUCAGTT 0.40 -1.305
DS12A-0191 191 cacctaccaggggatttgg 464 CACCUACCAGGGGAUUUGGTT 738 CCAAAUCCCCUGGUAGGUGTT 1.64 0.718
DS12A-0192 192 aattcctggcctggcccac 465 AAUUCCUGGCCUGGCCCACTT 739 GUGGGCCAGGCCAGGAAUUTT 3.40 1.764
DS12A-0193 193 agctgggtgcctcacatcc 466 AGCUGGGUGCCUCACAUCCTT 740 GGAUGUGAGGCACCCAGCUTT 0.49 -1.039
DS12A-0194 194 ctttgaggaataacggagg 467 CUUUGAGGAAUAACGGAGGTT 741 CCUCCGUUAUUCCUCAAAGTT 2.66 1.410
DS12A-0195 195 acaaagaagaccaagcggt 468 ACAAAGAAGACCAAGCGGUTT 742 ACCGCUUGGUCUUCUUUGUTT 1.45 0.540
DS12A-0196 196 ccacaaagaagaccaagcg 469 CCACAAAGAAGACCAAGCGTT 743 CGCUUGGUCUUCUUUGUGGTT 0.54 -0.890
DS12A-0197 197 cacaaagaagaccaagcgg 470 CACAAAGAAGACCAAGCGGTT 744 CCGCUUGGUCUUCUUUGUGTT 4.68 2.225
DS12A-0198 198 cagtcccattccgtcccat 471 CAGUCCCAUUCCGUCCCAUTT 745 AUGGGACGGAAUGGGACUGTT 0.66 -0.593
DS12A-0199 199 agtcccattccgtcccatc 472 AGUCCCAUUCCGUCCCAUCTT 746 GAUGGGACGGAAUGGGACUTT 1.05 0.075
DS12A-0200 200 acccaagcttccccgttca 473 ACCCAAGCUUCCCCGUUCATT 747 UGAACGGGGAAGCUUGGGUTT 1.30 0.375
DS12A-0201 201 ctgggtgcctcacatccgt 474 CUGGGUGCCUCACAUCCGUTT 748 ACGGAUGUGAGGCACCCAGTT 2.06 1.044
DS12A-0202 202 ccgttcaccccacctacca 475 CCGUUCACCCCACCUACCATT 749 UGGUAGGUGGGGUGAACGGTT 0.23 -2.144
DS12A-0203 203 atttgggctaaattcctgg 476 AUUUGGGCUAAAUUCCUGGTT 750 CCAGGAAUUUAGCCCAAAUTT 0.30 -1.738
DS12A-0204 204 ggttgaatgcttgttgagc 477 GGUUGAAUGCUUGUUGAGCTT 751 GCUCAACAAGCAUUCAACCTT 1.58 0.661
DS12A-0205 205 tgaatgcttgttgagctgg 478 UGAAUGCUUGUUGAGCUGGTT 752 CCAGCUCAACAAGCAUUCATT 1.06 0.085
DS12A-0206 206 gtgtaaagctgagaactgc 479 GUGUAAAGCUGAGAACUGCTT 753 GCAGUUCUCAGCUUUACACTT 2.18 1.126
DS12A-0207 207 tttgggctaaattcctggc 480 UUUGGGCUAAAUUCCUGGCTT 754 GCCAGGAAUUUAGCCCAAATT 0.54 -0.902
DS12A-0208 208 atggcagaacacctacagg 481 AUGGCAGAACACCUACAGGTT 755 CCUGUAGGUGUUCUGCCAUTT 0.31 -1.710
DS12A-0209 209 aaatgagggtgatcagggc 482 AAAUGAGGGUGAUCAGGGCTT 756 GCCCUGAUCACCCUCAUUUTT 0.81 -0.296
DS12A-0210 210 tgagaactgcacccaagct 483 UGAGAACUGCACCCAAGCUTT 757 AGCUUGGGUGCAGUUCUCATT 1.68 0.747
DS12A-0211 211 ttgttgagctgggtgcctc 484 UUGUUGAGCUGGGUGCCUCTT 758 GAGGCACCCAGCUCAACAATT 0.06 -4.047
DS12A-0212 212 ggctaaattcctggcctgg 485 GGCUAAAUUCCUGGCCUGGTT 759 CCAGGCCAGGAAUUUAGCCTT 1.65 0.721
DS12A-0213 213 aaattcctggcctggccca 486 AAAUUCCUGGCCUGGCCCATT 760 UGGGCCAGGCCAGGAAUUUTT 12.09 3.596
DS12A-0214 214 attcctggcctggcccaca 487 AUUCCUGGCCUGGCCCACATT 761 UGUGGGCCAGGCCAGGAAUTT 1.26 0.336
DS12A-0215 215 tttgaggaataacggaggt 488 UUUGAGGAAUAACGGAGGUTT 762 ACCUCCGUUAUUCCUCAAATT 2.12 1.085
DS12A-0216 216 agaagaccaagcggtcagt 489 AGAAGACCAAGCGGUCAGUTT 763 ACUGACCGCUUGGUCUUCUTT 0.31 -1.696
DS12A-0217 217 cagggcccgacatttcact 490 CAGGGCCCGACAUUUCACUTT 764 AGUGAAAUGUCGGGCCCUGTT 3.60 1.848
DS12A-0218 218 ggtcagtcccattccgtcc 491 GGUCAGUCCCAUUCCGUCCTT 765 GGACGGAAUGGGACUGACCTT 6.30 2.655
DS12A-0219 219 ggatttgggctaaattcct 492 GGAUUUGGGCUAAAUUCCUTT 766 AGGAAUUUAGCCCAAAUCCTT 0.48 -1.073
DS12A-0220 220 ccaaatgagggtgatcagg 493 CCAAAUGAGGGUGAUCAGGTT 767 CCUGAUCACCCUCAUUUGGTT 0.96 -0.055
DS12A-0221 221 caaatgagggtgatcaggg 494 CAAAUGAGGGUGAUCAGGGTT 768 CCCUGAUCACCCUCAUUUGTT 2.20 1.135
DS12A-0222 222 tgggctaaattcctggcct 495 UGGGCUAAAUUCCUGGCCUTT 769 AGGCCAGGAAUUUAGCCCATT 1.71 0.771
DS12A-0223 223 tgttgagctgggtgcctca 496 UGUUGAGCUGGGUGCCUCATT 770 UGAGGCACCCAGCUCAACATT 0.41 -1.283
DS12A-0224 224 ttgagctgggtgcctcaca 497 UUGAGCUGGGUGCCUCACATT 771 UGUGAGGCACCCAGCUCAATT 1.93 0.945
DS12A-0225 225 ctaccaggggatttgggct 498 CUACCAGGGGAUUUGGGCUTT 772 AGCCCAAAUCCCCUGGUAGTT 17.02 4.089
DS12A-0226 226 gttgagctgggtgcctcac 499 GUUGAGCUGGGUGCCUCACTT 773 GUGAGGCACCCAGCUCAACTT 1.15 0.205
DS12A-0227 227 acaggggagatgggagcag 500 ACAGGGGAGAUGGGAGCAGTT 774 CUGCUCCCAUCUCCCCUGUTT 0.93 -0.103
DS12A-0228 228 acctacagggcacagggga 501 ACCUACAGGGCACAGGGGATT 775 UCCCCUGUGCCCUGUAGGUTT 0.40 -1.324
DS12A-0229 229 cctaccaggggatttgggc 502 CCUACCAGGGGAUUUGGGCTT 776 GCCCAAAUCCCCUGGUAGGTT 3.20 1.680
DS12A-0230 230 ttgttactcatgaagacgc 503 UUGUUACUCAUGAAGACGCTT 777 GCGUCUUCAUGAGUAACAATT 2.10 1.073
DS12A-0231 231 tcagggcccgacatttcac 504 UCAGGGCCCGACAUUUCACTT 778 GUGAAAUGUCGGGCCCUGATT 1.74 0.797
DS12A-0232 232 gaagaccaagcggtcagtc 505 GAAGACCAAGCGGUCAGUCTT 779 GACUGACCGCUUGGUCUUCTT 2.13 1.093
DS12A-0233 233 agcttccccgttcacccca 506 AGCUUCCCCGUUCACCCCATT 780 UGGGGUGAACGGGGAAGCUTT 1.00 -0.004
DS12A-0234 234 gaccaagcggtcagtccca 507 GACCAAGCGGUCAGUCCCATT 781 UGGGACUGACCGCUUGGUCTT 0.63 -0.661
DS12A-0235 235 cagaacacctacagggcac 508 CAGAACACCUACAGGGCACTT 782 GUGCCCUGUAGGUGUUCUGTT 0.29 -1.798
DS12A-0236 236 gaacacctacagggcacag 509 GAACACCUACAGGGCACAGTT 783 CUGUGCCCUGUAGGUGUUCTT 1.29 0.372
DS12A-0237 237 tgcttgttgagctgggtgc 510 UGCUUGUUGAGCUGGGUGCTT 784 GCACCCAGCUCAACAAGCATT 0.80 -0.314
DS12A-0238 238 gcagaacacctacagggca 511 GCAGAACACCUACAGGGCATT 785 UGCCCUGUAGGUGUUCUGCTT 0.27 -1.864
DS12A-0239 239 atgggagcagggattaggc 512 AUGGGAGCAGGGAUUAGGCTT 786 GCCUAAUCCCUGCUCCCAUTT 0.67 -0.572
DS12A-0240 240 acctaccaggggatttggg 513 ACCUACCAGGGGAUUUGGGTT 787 CCCAAAUCCCCUGGUAGGUTT 5.13 2.358
DS12A-0241 241 ctaaattcctggcctggcc 514 CUAAAUUCCUGGCCUGGCCTT 788 GGCCAGGCCAGGAAUUUAGTT 2.52 1.332
DS12A-0242 242 taaattcctggcctggccc 515 UAAAUUCCUGGCCUGGCCCTT 789 GGGCCAGGCCAGGAAUUUATT 1.59 0.666
DS12A-0243 243 gcttgttgagctgggtgcc 516 GCUUGUUGAGCUGGGUGCCTT 790 GGCACCCAGCUCAACAAGCTT 0.41 -1.283
DS12A-0244 244 ctacagggcacaggggaga 517 CUACAGGGCACAGGGGAGATT 791 UCUCCCCUGUGCCCUGUAGTT 0.06 -4.170
DS12A-0245 245 cacaggggagatgggagca 518 CACAGGGGAGAUGGGAGCATT 792 UGCUCCCAUCUCCCCUGUGTT 0.34 -1.555
DS12A-0246 246 ttcaccccacctaccaggg 519 UUCACCCCACCUACCAGGGTT 793 CCCUGGUAGGUGGGGUGAATT 0.22 -2.212
DS12A-0247 247 aagaccaagcggtcagtcc 520 AAGACCAAGCGGUCAGUCCTT 794 GGACUGACCGCUUGGUCUUTT 1.70 0.767
DS12A-0248 248 tcagtcccattccgtccca 521 UCAGUCCCAUUCCGUCCCATT 795 UGGGACGGAAUGGGACUGATT 1.50 0.589
DS12A-0249 249 cgttcaccccacctaccag 522 CGUUCACCCCACCUACCAGTT 796 CUGGUAGGUGGGGUGAACGTT 0.61 -0.706
DS12A-0250 250 agaccaagcggtcagtccc 523 AGACCAAGCGGUCAGUCCCTT 797 GGGACUGACCGCUUGGUCUTT 1.26 0.332
DS12A-0251 251 cttgttgagctgggtgcct 524 CUUGUUGAGCUGGGUGCCUTT 798 AGGCACCCAGCUCAACAAGTT 0.29 -1.792
DS12A-0252 252 tggcagaacacctacaggg 525 UGGCAGAACACCUACAGGGTT 799 CCCUGUAGGUGUUCUGCCATT 0.39 -1.357
DS12A-0253 253 aacacctacagggcacagg 526 AACACCUACAGGGCACAGGTT 800 CCUGUGCCCUGUAGGUGUUTT 2.34 1.225
DS12A-0254 254 gatgggagcagggattagg 527 GAUGGGAGCAGGGAUUAGGTT 801 CCUAAUCCCUGCUCCCAUCTT 0.36 -1.467
DS12A-0255 255 tgggagcagggattaggct 528 UGGGAGCAGGGAUUAGGCUTT 802 AGCCUAAUCCCUGCUCCCATT 0.33 -1.612
DS12A-0256 256 aactgcacccaagcttccc 529 AACUGCACCCAAGCUUCCCTT 803 GGGAAGCUUGGGUGCAGUUTT 1.70 0.765
DS12A-0257 257 gctaaattcctggcctggc 530 GCUAAAUUCCUGGCCUGGCTT 804 GCCAGGCCAGGAAUUUAGCTT 2.12 1.084
DS12A-0258 258 ctggcccacaaagaagacc 531 CUGGCCCACAAAGAAGACCTT 805 GGUCUUCUUUGUGGGCCAGTT 1.09 0.130
DS12A-0259 259 ggcagaacacctacagggc 532 GGCAGAACACCUACAGGGCTT 806 GCCCUGUAGGUGUUCUGCCTT 0.63 -0.668
DS12A-0260 260 acacctacagggcacaggg 533 ACACCUACAGGGCACAGGGTT 807 CCCUGUGCCCUGUAGGUGUTT 1.69 0.754
DS12A-0261 261 atgagggtgatcagggccc 534 AUGAGGGUGAUCAGGGCCCTT 808 GGGCCCUGAUCACCCUCAUTT 0.73 -0.463
DS12A-0262 262 actgcacccaagcttcccc 535 ACUGCACCCAAGCUUCCCCTT 809 GGGGAAGCUUGGGUGCAGUTT 0.64 -0.635
DS12A-0263 263 gttcaccccacctaccagg 536 GUUCACCCCACCUACCAGGTT 810 CCUGGUAGGUGGGGUGAACTT 1.40 0.486
DS12A-0264 264 aagcggtcagtcccattcc 537 AAGCGGUCAGUCCCAUUCCTT 811 GGAAUGGGACUGACCGCUUTT 1.13 0.178
DS12A-0265 265 tgcacccaagcttccccgt 538 UGCACCCAAGCUUCCCCGUTT 812 ACGGGGAAGCUUGGGUGCATT 0.81 -0.312
DS12A-0266 266 ccaagcttccccgttcacc 539 CCAAGCUUCCCCGUUCACCTT 813 GGUGAACGGGGAAGCUUGGTT 3.43 1.779
DS12A-0267 267 caagcttccccgttcaccc 540 CAAGCUUCCCCGUUCACCCTT 814 GGGUGAACGGGGAAGCUUGTT 0.34 -1.536
DS12A-0268 268 aagcttccccgttcacccc 541 AAGCUUCCCCGUUCACCCCTT 815 GGGGUGAACGGGGAAGCUUTT 0.27 -1.915
DS12A-0269 269 ttccccgttcaccccacct 542 UUCCCCGUUCACCCCACCUTT 816 AGGUGGGGUGAACGGGGAATT 0.48 -1.057
DS12A-0270 270 gtcagtcccattccgtccc 543 GUCAGUCCCAUUCCGUCCCTT 817 GGGACGGAAUGGGACUGACTT 0.83 -0.265
DS12A-0271 271 aatgagggtgatcagggcc 544 AAUGAGGGUGAUCAGGGCCTT 818 GGCCCUGAUCACCCUCAUUTT 1.26 0.332
DS12A-0272 272 gaactgcacccaagcttcc 545 GAACUGCACCCAAGCUUCCTT 819 GGAAGCUUGGGUGCAGUUCTT 2.00 0.999
DS12A-si2 273 ccaagtggaagacaacatt 546 CCAAGUGGAAGACAACAUUTT 820 AAUGUUGUCUUCCACUUGGTT 0.09 -3.474
dsCon2 陰性對照dsRNA 547 ACUACUGAGUGACAGUAGATT 821 UCUACUGUCACUCAGUAGUTT 0.74 -0.434
附註：標靶序列與確定的有義序列相同，但核苷酸「U」被轉化成「T」，不包括突出端2個核苷酸「TT」。dsCon2用作非特異性雙股體對照。DS12A-si2是陰性對照。
表2. 小鼠 Serping1saRNA序列
saRNA SEQ ID NO 有義（ 5'-3' ） SEQ ID NO 反義（ 5'-3' ） 相對 Serping1 mRNA （倍數變化） 相對 Serping1 mRNA （ log2 ）
DS12B-0001 822 AAGAUCACUAAGAGCGUCATT 1100 UGACGCUCUUAGUGAUCUUTT 0.83 -0.274
DS12B-0002 823 AUCCGGAUUUACAGGAACUTT 1101 AGUUCCUGUAAAUCCGGAUTT 1.00 -0.004
DS12B-0003 824 AAACUGGAGCCGGUGAUUATT 1102 UAAUCACCGGCUCCAGUUUTT 0.95 -0.070
DS12B-0004 825 GAUUACGUGUAGGAAUGGGTT 1103 CCCAUUCCUACACGUAAUCTT 1.05 0.069
DS12B-0005 826 AUUACGUGUAGGAAUGGGGTT 1104 CCCCAUUCCUACACGUAAUTT 0.87 -0.193
DS12B-0006 827 UUACGUGUAGGAAUGGGGATT 1105 UCCCCAUUCCUACACGUAATT 0.76 -0.401
DS12B-0007 828 UACGUGUAGGAAUGGGGAATT 1106 UUCCCCAUUCCUACACGUATT 0.83 -0.266
DS12B-0008 829 UUGUCAAACCUUAGGCACGTT 1107 CGUGCCUAAGGUUUGACAATT 0.74 -0.442
DS12B-0009 830 UGUCAAACCUUAGGCACGUTT 1108 ACGUGCCUAAGGUUUGACATT 0.83 -0.261
DS12B-0010 831 GUCAAACCUUAGGCACGUUTT 1109 AACGUGCCUAAGGUUUGACTT 1.02 0.028
DS12B-0011 832 UCAAACCUUAGGCACGUUGTT 1110 CAACGUGCCUAAGGUUUGATT 0.80 -0.329
DS12B-0012 833 CAAACCUUAGGCACGUUGUTT 1111 ACAACGUGCCUAAGGUUUGTT 0.87 -0.193
DS12B-0013 834 AAACCUUAGGCACGUUGUGTT 1112 CACAACGUGCCUAAGGUUUTT 0.79 -0.333
DS12B-0014 835 AACCUUAGGCACGUUGUGUTT 1113 ACACAACGUGCCUAAGGUUTT 1.00 0.001
DS12B-0015 836 AGAUCACUAAGAGCGUCACTT 1114 GUGACGCUCUUAGUGAUCUTT 1.00 0.007
DS12B-0016 837 GAUCACUAAGAGCGUCACUTT 1115 AGUGACGCUCUUAGUGAUCTT 0.94 -0.082
DS12B-0017 838 AUCACUAAGAGCGUCACUCTT 1116 GAGUGACGCUCUUAGUGAUTT 0.82 -0.294
DS12B-0018 839 UCACUAAGAGCGUCACUCATT 1117 UGAGUGACGCUCUUAGUGATT 1.04 0.058
DS12B-0019 840 CACUAAGAGCGUCACUCAATT 1118 UUGAGUGACGCUCUUAGUGTT 1.05 0.071
DS12B-0020 841 ACUAAGAGCGUCACUCAAGTT 1119 CUUGAGUGACGCUCUUAGUTT 1.02 0.028
DS12B-0021 842 UAAGAGCGUCACUCAAGCUTT 1120 AGCUUGAGUGACGCUCUUATT 1.27 0.348
DS12B-0022 843 AAGAGCGUCACUCAAGCUUTT 1121 AAGCUUGAGUGACGCUCUUTT 1.01 0.011
DS12B-0023 844 CGUCACUCAAGCUUCCUUATT 1122 UAAGGAAGCUUGAGUGACGTT 1.02 0.029
DS12B-0024 845 UUAUCCCAACCGGUCACAUTT 1123 AUGUGACCGGUUGGGAUAATT 1.36 0.446
DS12B-0025 846 CCAUCCGGAUUUACAGGAATT 1124 UUCCUGUAAAUCCGGAUGGTT 0.83 -0.262
DS12B-0026 847 CAUCCGGAUUUACAGGAACTT 1125 GUUCCUGUAAAUCCGGAUGTT 1.02 0.027
DS12B-0027 848 UCCGGAUUUACAGGAACUCTT 1126 GAGUUCCUGUAAAUCCGGATT 0.94 -0.097
DS12B-0028 849 CCGGAUUUACAGGAACUCATT 1127 UGAGUUCCUGUAAAUCCGGTT 0.88 -0.183
DS12B-0029 850 CGGAUUUACAGGAACUCACTT 1128 GUGAGUUCCUGUAAAUCCGTT 0.90 -0.155
DS12B-0030 851 GAAACUGGAGCCGGUGAUUTT 1129 AAUCACCGGCUCCAGUUUCTT 0.86 -0.211
DS12B-0031 852 AACUGGAGCCGGUGAUUACTT 1130 GUAAUCACCGGCUCCAGUUTT 1.06 0.077
DS12B-0032 853 ACGUGUAGGAAUGGGGAAGTT 1131 CUUCCCCAUUCCUACACGUTT 0.78 -0.366
DS12B-0033 854 CGUGUAGGAAUGGGGAAGATT 1132 UCUUCCCCAUUCCUACACGTT 0.99 -0.019
DS12B-0034 855 UUUUAGGAGAUUCGGGCCCTT 1133 GGGCCCGAAUCUCCUAAAATT 1.32 0.401
DS12B-0035 856 UUUAGGAGAUUCGGGCCCATT 1134 UGGGCCCGAAUCUCCUAAATT 1.15 0.203
DS12B-0036 857 UUAGGAGAUUCGGGCCCAATT 1135 UUGGGCCCGAAUCUCCUAATT 1.30 0.380
DS12B-0037 858 CUAAGAGCGUCACUCAAGCTT 1136 GCUUGAGUGACGCUCUUAGTT 1.36 0.441
DS12B-0038 859 AGAGCGUCACUCAAGCUUCTT 1137 GAAGCUUGAGUGACGCUCUTT 1.20 0.264
DS12B-0039 860 AGCGUCACUCAAGCUUCCUTT 1138 AGGAAGCUUGAGUGACGCUTT 1.56 0.643
DS12B-0040 861 GCGUCACUCAAGCUUCCUUTT 1139 AAGGAAGCUUGAGUGACGCTT 1.65 0.724
DS12B-0041 862 AGCUUCCUUAUCCCAACCGTT 1140 CGGUUGGGAUAAGGAAGCUTT 0.91 -0.138
DS12B-0042 863 CUUCCUUAUCCCAACCGGUTT 1141 ACCGGUUGGGAUAAGGAAGTT 1.00 -0.003
DS12B-0043 864 UUCCUUAUCCCAACCGGUCTT 1142 GACCGGUUGGGAUAAGGAATT 0.89 -0.162
DS12B-0044 865 UCCUUAUCCCAACCGGUCATT 1143 UGACCGGUUGGGAUAAGGATT 1.11 0.152
DS12B-0045 866 CUUAUCCCAACCGGUCACATT 1144 UGUGACCGGUUGGGAUAAGTT 1.02 0.026
DS12B-0046 867 UAUCCCAACCGGUCACAUCTT 1145 GAUGUGACCGGUUGGGAUATT 1.21 0.278
DS12B-0047 868 CAUUCCAAGAGGAACUCCGTT 1146 CGGAGUUCCUCUUGGAAUGTT 1.12 0.161
DS12B-0048 869 AUUCCAAGAGGAACUCCGGTT 1147 CCGGAGUUCCUCUUGGAAUTT 1.05 0.071
DS12B-0049 870 AAGAGGAACUCCGGGCUAATT 1148 UUAGCCCGGAGUUCCUCUUTT 1.04 0.055
DS12B-0050 871 UAACUGGCCCACAGUUCGATT 1149 UCGAACUGUGGGCCAGUUATT 1.43 0.511
DS12B-0051 872 GUCCCAUCCGGAUUUACAGTT 1150 CUGUAAAUCCGGAUGGGACTT 1.08 0.114
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DS12B-0086 907 GAGAUUCGGGCCCAAGGCUTT 1185 AGCCUUGGGCCCGAAUCUCTT 1.04 0.060
DS12B-0087 908 AGAUUCGGGCCCAAGGCUGTT 1186 CAGCCUUGGGCCCGAAUCUTT 1.38 0.467
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DS12B-0089 910 CCGGUCACAUCCUACCCCATT 1188 UGGGGUAGGAUGUGACCGGTT 1.08 0.114
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DS12B-0196 1017 UACCCCAUUCCAAGAGGAATT 1295 UUCCUCUUGGAAUGGGGUATT 1.12 0.159
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DS12B-0198 1019 ACAGGAACUCACACUAGCATT 1297 UGCUAGUGUGAGUUCCUGUTT 1.15 0.197
DS12B-0199 1020 CAGGAACUCACACUAGCAATT 1298 UUGCUAGUGUGAGUUCCUGTT 1.06 0.081
DS12B-0200 1021 GGAACUCACACUAGCAAUCTT 1299 GAUUGCUAGUGUGAGUUCCTT 1.04 0.056
DS12B-0201 1022 UUUUAACUGGGCUGUGUCCTT 1300 GGACACAGCCCAGUUAAAATT 0.79 -0.339
DS12B-0202 1023 UUUAACUGGGCUGUGUCCUTT 1301 AGGACACAGCCCAGUUAAATT 1.15 0.197
DS12B-0203 1024 UUAACUGGGCUGUGUCCUATT 1302 UAGGACACAGCCCAGUUAATT 1.10 0.142
DS12B-0204 1025 UAACUGGGCUGUGUCCUAATT 1303 UUAGGACACAGCCCAGUUATT 1.04 0.051
DS12B-0205 1026 AACUGGGCUGUGUCCUAAATT 1304 UUUAGGACACAGCCCAGUUTT 1.00 -0.004
DS12B-0206 1027 UGUGUCCUAAACCAGCCAATT 1305 UUGGCUGGUUUAGGACACATT 1.34 0.420
DS12B-0207 1028 GUGUCCUAAACCAGCCAAUTT 1306 AUUGGCUGGUUUAGGACACTT 0.90 -0.153
DS12B-0208 1029 GUCCUAAACCAGCCAAUAGTT 1307 CUAUUGGCUGGUUUAGGACTT 0.96 -0.064
DS12B-0209 1030 UCCUAAACCAGCCAAUAGCTT 1308 GCUAUUGGCUGGUUUAGGATT 1.10 0.136
DS12B-0210 1031 CCUAAACCAGCCAAUAGCUTT 1309 AGCUAUUGGCUGGUUUAGGTT 0.84 -0.251
DS12B-0211 1032 CUAAACCAGCCAAUAGCUGTT 1310 CAGCUAUUGGCUGGUUUAGTT 0.69 -0.526
DS12B-0212 1033 AAACCAGCCAAUAGCUGAGTT 1311 CUCAGCUAUUGGCUGGUUUTT 1.06 0.085
DS12B-0213 1034 AACCAGCCAAUAGCUGAGATT 1312 UCUCAGCUAUUGGCUGGUUTT 1.05 0.065
DS12B-0214 1035 GCAACUAAGGGGUUGAAGCTT 1313 GCUUCAACCCCUUAGUUGCTT 1.13 0.175
DS12B-0215 1036 CAACUAAGGGGUUGAAGCCTT 1314 GGCUUCAACCCCUUAGUUGTT 0.94 -0.082
DS12B-0216 1037 ACUAAGGGGUUGAAGCCAGTT 1315 CUGGCUUCAACCCCUUAGUTT 0.67 -0.571
DS12B-0217 1038 GUAGGAAUGGGGAAGAUCCTT 1316 GGAUCUUCCCCAUUCCUACTT 0.88 -0.181
DS12B-0218 1039 AGGAAUGGGGAAGAUCCAGTT 1317 CUGGAUCUUCCCCAUUCCUTT 1.22 0.291
DS12B-0219 1040 GAAUGGGGAAGAUCCAGCATT 1318 UGCUGGAUCUUCCCCAUUCTT 1.07 0.094
DS12B-0220 1041 AAUGGGGAAGAUCCAGCAGTT 1319 CUGCUGGAUCUUCCCCAUUTT 0.92 -0.121
DS12B-0221 1042 GGAAGAUCCAGCAGCCAUUTT 1320 AAUGGCUGCUGGAUCUUCCTT 0.79 -0.341
DS12B-0222 1043 AGAUCCAGCAGCCAUUAGGTT 1321 CCUAAUGGCUGCUGGAUCUTT 0.65 -0.630
DS12B-0223 1044 GAUCCAGCAGCCAUUAGGUTT 1322 ACCUAAUGGCUGCUGGAUCTT 0.99 -0.015
DS12B-0224 1045 CAAGGCUGGCAUAUCUCCATT 1323 UGGAGAUAUGCCAGCCUUGTT 1.27 0.344
DS12B-0225 1046 AUGAGAGCAAUGGAAGGCCTT 1324 GGCCUUCCAUUGCUCUCAUTT 0.87 -0.205
DS12B-0226 1047 UGAGAGCAAUGGAAGGCCATT 1325 UGGCCUUCCAUUGCUCUCATT 1.14 0.190
DS12B-0227 1048 GAGAGCAAUGGAAGGCCAUTT 1326 AUGGCCUUCCAUUGCUCUCTT 1.11 0.153
DS12B-0228 1049 CUACUUCUAAGGCUUGGCCTT 1327 GGCCAAGCCUUAGAAGUAGTT 0.91 -0.144
DS12B-0229 1050 GGUCACAUCCUACCCCAUUTT 1328 AAUGGGGUAGGAUGUGACCTT 0.92 -0.118
DS12B-0230 1051 GUCACAUCCUACCCCAUUCTT 1329 GAAUGGGGUAGGAUGUGACTT 1.08 0.107
DS12B-0231 1052 UCACAUCCUACCCCAUUCCTT 1330 GGAAUGGGGUAGGAUGUGATT 1.23 0.295
DS12B-0232 1053 CACAUCCUACCCCAUUCCATT 1331 UGGAAUGGGGUAGGAUGUGTT 1.14 0.193
DS12B-0233 1054 CAUCCUACCCCAUUCCAAGTT 1332 CUUGGAAUGGGGUAGGAUGTT 0.85 -0.228
DS12B-0234 1055 UCCUACCCCAUUCCAAGAGTT 1333 CUCUUGGAAUGGGGUAGGATT 1.24 0.306
DS12B-0235 1056 CUACCCCAUUCCAAGAGGATT 1334 UCCUCUUGGAAUGGGGUAGTT 1.09 0.124
DS12B-0236 1057 ACCCCAUUCCAAGAGGAACTT 1335 GUUCCUCUUGGAAUGGGGUTT 1.10 0.139
DS12B-0237 1058 CCCCAUUCCAAGAGGAACUTT 1336 AGUUCCUCUUGGAAUGGGGTT 1.26 0.328
DS12B-0238 1059 CCCAUUCCAAGAGGAACUCTT 1337 GAGUUCCUCUUGGAAUGGGTT 0.92 -0.118
DS12B-0239 1060 CCAUUCCAAGAGGAACUCCTT 1338 GGAGUUCCUCUUGGAAUGGTT 0.92 -0.122
DS12B-0240 1061 ACUGGGCUGUGUCCUAAACTT 1339 GUUUAGGACACAGCCCAGUTT 0.86 -0.221
DS12B-0241 1062 UGGGCUGUGUCCUAAACCATT 1340 UGGUUUAGGACACAGCCCATT 0.90 -0.148
DS12B-0242 1063 CUGUGUCCUAAACCAGCCATT 1341 UGGCUGGUUUAGGACACAGTT 1.08 0.112
DS12B-0243 1064 ACCAGCCAAUAGCUGAGAGTT 1342 CUCUCAGCUAUUGGCUGGUTT 1.27 0.350
DS12B-0244 1065 CCAGCCAAUAGCUGAGAGUTT 1343 ACUCUCAGCUAUUGGCUGGTT 1.03 0.042
DS12B-0245 1066 CAGCCAAUAGCUGAGAGUGTT 1344 CACUCUCAGCUAUUGGCUGTT 1.09 0.122
DS12B-0246 1067 AGCCAAUAGCUGAGAGUGCTT 1345 GCACUCUCAGCUAUUGGCUTT 1.03 0.036
DS12B-0247 1068 CUAAGGGGUUGAAGCCAGGTT 1346 CCUGGCUUCAACCCCUUAGTT 0.72 -0.471
DS12B-0248 1069 UAAGGGGUUGAAGCCAGGGTT 1347 CCCUGGCUUCAACCCCUUATT 0.84 -0.259
DS12B-0249 1070 GGAAUGGGGAAGAUCCAGCTT 1348 GCUGGAUCUUCCCCAUUCCTT 0.98 -0.029
DS12B-0250 1071 AUGGGGAAGAUCCAGCAGCTT 1349 GCUGCUGGAUCUUCCCCAUTT 0.93 -0.099
DS12B-0251 1072 GGGAAGAUCCAGCAGCCAUTT 1350 AUGGCUGCUGGAUCUUCCCTT 0.66 -0.594
DS12B-0252 1073 GCCCAAGGCUGGCAUAUCUTT 1351 AGAUAUGCCAGCCUUGGGCTT 1.30 0.376
DS12B-0253 1074 CCCAAGGCUGGCAUAUCUCTT 1352 GAGAUAUGCCAGCCUUGGGTT 1.29 0.364
DS12B-0254 1075 CCAAGGCUGGCAUAUCUCCTT 1353 GGAGAUAUGCCAGCCUUGGTT 1.62 0.699
DS12B-0255 1076 CCUACCCCAUUCCAAGAGGTT 1354 CCUCUUGGAAUGGGGUAGGTT 1.23 0.294
DS12B-0256 1077 GGCUAACUGGCCCACAGUUTT 1355 AACUGUGGGCCAGUUAGCCTT 0.63 -0.662
DS12B-0257 1078 GCUAACUGGCCCACAGUUCTT 1356 GAACUGUGGGCCAGUUAGCTT 0.88 -0.182
DS12B-0258 1079 CUGGGCUGUGUCCUAAACCTT 1357 GGUUUAGGACACAGCCCAGTT 1.34 0.418
DS12B-0259 1080 GGGCUGUGUCCUAAACCAGTT 1358 CUGGUUUAGGACACAGCCCTT 1.23 0.293
DS12B-0260 1081 GGCUGUGUCCUAAACCAGCTT 1359 GCUGGUUUAGGACACAGCCTT 1.30 0.378
DS12B-0261 1082 GCUGUGUCCUAAACCAGCCTT 1360 GGCUGGUUUAGGACACAGCTT 1.27 0.345
DS12B-0262 1083 GCCAAUAGCUGAGAGUGCCTT 1361 GGCACUCUCAGCUAUUGGCTT 0.97 -0.049
DS12B-0263 1084 CCAAUAGCUGAGAGUGCCCTT 1362 GGGCACUCUCAGCUAUUGGTT 1.14 0.186
DS12B-0264 1085 CAAUAGCUGAGAGUGCCCCTT 1363 GGGGCACUCUCAGCUAUUGTT 1.08 0.116
DS12B-0265 1086 AAGGGGUUGAAGCCAGGGCTT 1364 GCCCUGGCUUCAACCCCUUTT 0.95 -0.080
DS12B-0266 1087 AGGGGUUGAAGCCAGGGCUTT 1365 AGCCCUGGCUUCAACCCCUTT 1.09 0.124
DS12B-0267 1088 UGGGGAAGAUCCAGCAGCCTT 1366 GGCUGCUGGAUCUUCCCCATT 1.32 0.403
DS12B-0268 1089 GGGGAAGAUCCAGCAGCCATT 1367 UGGCUGCUGGAUCUUCCCCTT 0.90 -0.148
DS12B-0269 1090 GGGCCCAAGGCUGGCAUAUTT 1368 AUAUGCCAGCCUUGGGCCCTT 1.64 0.716
DS12B-0270 1091 GGCCCAAGGCUGGCAUAUCTT 1369 GAUAUGCCAGCCUUGGGCCTT 1.64 0.714
DS12B-0271 1092 GGGCUAACUGGCCCACAGUTT 1370 ACUGUGGGCCAGUUAGCCCTT 0.94 -0.097
DS12B-0272 1093 GGUGAUUACGUGUAGGAAUTT 1371 AUUCCUACACGUAAUCACCTT 0.92 -0.117
DS12B-0273 1094 GUGAUUACGUGUAGGAAUGTT 1372 CAUUCCUACACGUAAUCACTT 1.12 0.166
DS12B-0274 1095 UGAUUACGUGUAGGAAUGGTT 1373 CCAUUCCUACACGUAAUCATT 1.22 0.289
DS12B-0275 1096 ACUAAGAUCACUAAGAGCGTT 1374 CGCUCUUAGUGAUCUUAGUTT 1.47 0.553
DS12B-0276 1097 CUAAGAUCACUAAGAGCGUTT 1375 ACGCUCUUAGUGAUCUUAGTT 1.22 0.282
DS12B-0277 1098 UAAGAUCACUAAGAGCGUCTT 1376 GACGCUCUUAGUGAUCUUATT 1.34 0.425
DS12B-si2 1099 CCAAGUGGAAGAUAACAUUTT 1377 AAUGUUAUCUUCCACUUGGTT 0.04 -4.644
附註：標靶序列與確定的有義序列相同，但核苷酸「U」被轉化成「T」，不包括突出端2個核苷酸「TT」。DS12B-si2是陰性對照。 參考文獻 1. Chen, M., and M. A. Riedl. 2017. 'Emerging Therapies in Hereditary Angioedema', Immunol Allergy Clin North Am, 37: 585-95. 2. Cohn, D. M., N. J. Viney, L. M. Fijen, E. Schneider, V. J. Alexander, S. Xia, G. E. Kaeser, C. Nanavati, B. F. Baker, R. S. Geary, M. Levi, J. C. M. Meijers, and E. S. G. Stroes. 2020. 'Antisense Inhibition of Prekallikrein to Control Hereditary Angioedema', The New England journal of medicine, 383: 1242-47. 3. Craig, T., P. Busse, R. G. Gower, D. T. Johnston, J. M. Kashkin, H. H. Li, W. R. Lumry, M. A. Riedl, and D. Soteres. 2018. 'Long-term prophylaxis therapy in patients with hereditary angioedema with C1 inhibitor deficiency', Ann Allergy Asthma Immunol, 121: 673-79. 4. Farfara, Dorit, Emily Feierman, Allison Richards, Alexey S. Revenko, Robert A. MacLeod, Erin H. Norris, and Sidney Strickland. 2018. 5. Farkas, H., M. L. Debreczeni, and K. V. Kohalmi. 2018. 'Investigational drugs in phase I and phase II clinical trials for hereditary angioedema', Expert Opin Investig Drugs, 27: 87-103. 6. Farkas, Henriette, Nora Veszeli, Kinga V. Kőhalmi, and Lilian Varga. 2018. 'Real-life experience with recombinant human C1-inhibitor in treatment of hereditary angioedema with C1-inhibitor deficiency', Journal of Allergy and Clinical Immunology, 141: AB49. 7. Ferrone, J. D., G. Bhattacharjee, A. S. Revenko, T. A. Zanardi, M. S. Warren, F. J. Derosier, N. J. Viney, N. C. Pham, G. E. Kaeser, B. F. Baker, E. Schneider, S. G. Hughes, B. P. Monia, and A. R. MacLeod. 2019. 'IONIS-PKKRx a Novel Antisense Inhibitor of Prekallikrein and Bradykinin Production', Nucleic acid therapeutics, 29: 82-91. 8. Germenis, A. E., and M. Speletas. 2016. 'Genetics of Hereditary Angioedema Revisited', Clin Rev Allergy Immunol, 51: 170-82. 9. Hahn, J., M. Nordmann-Kleiner, C. Bonner, G. Kojda, T. K. Hoffmann, and J. Greve. 2019. 'The Influence of ACE Inhibition on C1-Inhibitor: A Biomarker for ACE Inhibitor-Induced Angioedema?', Biomed Hub, 4: 1-9. 10.  Han, Eun D., Ryan C. MacFarlane, Aideen N. Mulligan, Jennifer Scafidi, and Alvin E. Davis. 2002. 'Increased vascular permeability in C1 inhibitor–deficient mice mediated by the bradykinin type 2 receptor', Journal of Clinical Investigation, 109: 1057-63. 11.  Liu, J., J. Qin, A. Borodovsky, T. Racie, A. Castoreno, M. Schlegel, M. A. Maier, T. Zimmerman, K. Fitzgerald, J. Butler, and A. Akinc. 2019. 'An investigational RNAi therapeutic targeting Factor XII (ALN-F12) for the treatment of hereditary angioedema', RNA, 25: 255-63. 12.  Liu, S., Y. Xu, Y. Liu, and Y. Zhi. 2019. 'Hereditary angioedema: a Chinese perspective', Eur J Dermatol, 29: 14-20. 13.  Liu, Yang, Thomas L. Saunders, Thomas Sisson, Robert Blackburn, David S. Ginsberg, and Duane Day. 2018. 14.  Lumry, W. R. 2018. 'Hereditary Angioedema: The Economics of Treatment of an Orphan Disease', Front Med (Lausanne), 5: 22. 15.  Prada, Anne E., Kamyar Zahedi, and Alvin E. Davis. 1998. 'Regulation of C1 Inhibitor Synthesis', Immunobiology, 199: 377-88. 16.  Qiu, T., M. J. Chiuchiolo, A. S. Whaley, A. R. Russo, D. Sondhi, S. M. Kaminsky, R. G. Crystal, and O. E. Pagovich. 2019. 'Gene therapy for C1 esterase inhibitor deficiency in a Murine Model of Hereditary angioedema', Allergy, 74: 1081-89. 17.  Valerieva, A., S. Caccia, and M. Cicardi. 2018. 'Recombinant human C1 esterase inhibitor (Conestat alfa) for prophylaxis to prevent attacks in adult and adolescent patients with hereditary angioedema', Expert Rev Clin Immunol, 14: 707-18. 18.  Zahedi, K., A. E. Prada, and A. E. Davis, 3rd. 1994. 'Transcriptional regulation of the C1 inhibitor gene by gamma-interferon', J Biol Chem, 269: 9669-74. 19.  Zeerleder, S., and M. Levi. 2016. 'Hereditary and acquired C1-inhibitor-dependent angioedema: from pathophysiology to treatment', Ann Med, 48: 256-67. 20.  Zuraw, B. L. 2010. 'The pathophysiology of hereditary angioedema', World Allergy Organ J, 3: S25-8.
雖然本揭露已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭露，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭露之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
當結合附圖閱讀以下詳細描述時，本揭露的各種態樣將最易於理解。應注意的是，根據行業標準操作規程，各種特徵結構可能並非按比例繪製。事實上，為了論述之清晰性，可以任意地增大或減小各種特徵結構之尺寸。為讓本揭露之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 圖1示出了HepG2細胞中以saRNA為媒介的人類 SERPING1mRNA表現水準的變化。將272種以人類 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA以25nM的濃度單獨轉染到人類肝癌細胞系（HepG2）中3天。saRNA股的序列和雙股體組合物如表1所示。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。在PCR反應的每個PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過一步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行定量。還擴增了 HPRT1和 TBP，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸，log2）示出了在標準化為 HPRT1和 TBP（兩個重複轉染孔的平均值±SEM）之後，相對於Mock處理，272種saRNA中的每一者的 SERPING1mRNA表現水準的相對倍數變化。saRNA在x軸上按它們誘導 SERPING1mRNA表現的活性（log2）以遞降次序進行分類。 圖2示出了saRNA按它們在HepG2細胞中的人類 SERPING1啟動子上的標靶位置和熱點區進行分類。將272種以人類 SERPING1啟動子作為標靶的saRNA以25nM單獨轉染到HepG2中3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。在單個PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過一步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行定量。還擴增了 HPRT1和 TBP，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸，log2）示出了在標準化為 HPRT1和 TBP之後，相對於Mock處理，saRNA中的每一項的 SERPING1mRNA表現水準的相對倍數變化。saRNA在x軸上按它們在 SERPING1轉錄起始位點（TSS）上游-500bp至-1bp的啟動子上的位置進行分類。5個saRNA熱點區的位置在矩形虛線框中標記為H1至H5。這些框上方的數字表明熱點區相對於 SERPING1TSS（0位點）的邊界。 圖3A至圖3B示出了HepG2細胞中 SERPING1saRNA的劑量反應特徵和細胞毒性。將前73種人類 SERPING1saRNA以2.5nM、10nM和25nM的濃度轉染到人類HepG2細胞中3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2雙股體（SEQ ID NO: 547和821）作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2（SEQ ID NO: 273、546和820）是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。在單個PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行定量。還擴增了 HPRT1和 TBP，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。圖3A示出了分別以2.5nM、10nM和25nM的濃度用前73種 SERPING1saRNA轉染的HepG2細胞中 SERPING1mRNA水準的相對倍數變化。值（y軸）表示為在標準化為 HPRT1和 TBP參考之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。圖3B示出了HepG2細胞中前73種 SERPING1saRNA的細胞毒性。通過用碘化丙啶（PI）染色鑑定凋亡細胞來評估細胞毒性。值（y軸）是相對於Mock處理的PI染色的OD值。 圖4A至圖4B示出了幾種主要saRNA對HepG2細胞中的SERPING1基因表現的活化作用。將細胞以10nM的saRNA濃度處理5天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2雙股體作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。圖4A示出了使用表4所示的基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR測定的HepG2細胞中SERPING1的相對mRNA水準。還擴增了 TBP作為內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 TBP之後，相對於Mock處理的SERPING1 mRNA表現水準。圖4B示出了通過使用SERPING1 ELISA套組檢測OD值得到的SERPING1蛋白水準。值（y軸）表示為相對於Mock處理的SERPING1蛋白表現水準。與Mock處理相比，* p ＜0.05、** p ＜0.01、*** p＜ 0.001、**** p ＜0.0001。 圖5示出了低濃度的幾種主要saRNA對HepG2細胞中的 SERPING1mRNA表現的活化作用。將細胞以0.1nM或1nM的saRNA濃度處理3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。在單獨的PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行定量。還擴增了 TBPmRNA作為內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 TBP之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。與Mock處理相比，* p ＜0.05、** p ＜0.01、*** p＜ 0.001、**** p ＜0.0001。 圖6A至圖6C示出了幾種主要saRNA對人類肝癌細胞系中的SERPING1表現的活化作用。將HepG2（圖6A）、Hep3B（圖6B）和PLC/PRF/5（圖6C）細胞系用10nM的saRNA處理4天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對相對 SERPING1mRNA水準進行測定。通過使用ELISA套組對HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5細胞中的相對SERPING1蛋白水準進行測定。作為內部參考，還擴增了 HPRT1和 TBP基因，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。這些圖中的值（y軸）表示為在標準化為 HPRT1和 TBP參考之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。這些圖中的值（y軸）還表示為相對於Mock處理的SERPING1蛋白表現水準。與Mock處理相比，* p ＜0.05、** p ＜0.01、*** p＜ 0.001、**** p ＜0.0001。 圖7A至圖7B示出了幾種主要saRNA對HepG2細胞中的SERPING1表現的時間進程變化。將細胞用指定濃度（即，0.5nM、1.25nM、4nM、30nM）的單個saRNA轉染1至7天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。圖7A示出了在單獨的PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR測定的HepG2細胞中 SERPING1的mRNA水準。還擴增了 TBPmRNA作為內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 TBP之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。圖7B示出了通過使用SERPING1 ELISA套組檢測OD值得到的SERPING1蛋白水準。值（y軸）表示為相對於Mock處理的SERPING1蛋白表現水準。 圖8A至圖8F示出了saRNA對HepG2細胞中的 SERPING1mRNA表現的活化作用。將六種saRNA（即，DS12A-0043、DS12A-0072、DS12A-0187、DS12A-0182、DS12A-0240和DS12A-0213）以指定濃度（即，0.0017nM、0.0051nM、0.0152nM、0.046nM、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.111nM、33.333nM和100nM）單獨轉染到HepG2細胞中4天。圖8A至圖8F示出了使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行測定。還擴增了 HPRT1和 TBP，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 HPRT1和 TBP之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。 圖9示出了PMH細胞中以saRNA為媒介的小鼠 Serping1mRNA表現水準的變化。將277種以小鼠 Serping1啟動子作為標靶saRNA以25nM的濃度單獨轉染到初代小鼠肝細胞（PMH）中3天。saRNA股的序列和雙股體組合物如表2所示。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。在單獨的PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過一步法RT-qPCR對 Serping1的mRNA水準進行定量。還擴增了 Hprt1和 Tbp，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）示出為在標準化為 Hprt1和 Tbp之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。saRNA在x軸上按它們誘導 Serping1mRNA表現的活性（log2）以遞降次序進行分類。 圖10示出了saRNA按它們在PMH細胞中的小鼠 Serping1啟動子上的標靶位置和熱點區進行分類。將277種以小鼠 Serping1啟動子作為標靶saRNA以25nM單獨轉染到PMH中3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。在單獨的PCR反應中，使用表4所示的基因特異性引子組通過一步法RT-qPCR對 Serping1的mRNA水準進行定量。還擴增了 Hprt1和 Tbp，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸，log2）示出了在標準化為 Hprt1和 Tbp之後，相對於Mock處理，saRNA中的每一項的 Serping1mRNA表現水準的倍數變化。saRNA在x軸上按它們在 Serping1轉錄起始位點（TSS）上游-500bp至-1bp的啟動子上的位置進行分類。4個saRNA熱點區的位置在矩形虛線框中標記為H6至H9。這些框上方的數字表明熱點區相對於 Serping1TSS的邊界。 圖11示出了PMH細胞中前57種小鼠 Serping1saRNA的劑量反應特徵。將前57種小鼠 Serping1saRNA以2.5nM、10nM和25nM的不同濃度轉染到PMH細胞中3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12B-si2（SEQ ID NO: 1099和1377）是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。在單個PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 Serping1的mRNA水準進行定量。還擴增了 Hprt1和 Tbp，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 Hprt1和 Tbp參考之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。 圖12A至圖12B示出了PMH細胞中前57種小鼠 Serping1saRNA的劑量反應特徵和細胞毒性。將前57種小鼠 Serping1saRNA以不同的濃度（即，0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM）轉染到PMH細胞中3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12B-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。在單個PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 Serping1的mRNA水準進行定量。還擴增了 Hprt1和 Tbp，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。圖12A示出了轉染saRNA之後PMH細胞中 Serping1mRNA水準的變化。值（y軸）表示為在標準化為 Hprt1和 Tbp參考之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。圖12B示出了PMH細胞中前57種Serping1 saRNA的細胞毒性。通過用碘化丙啶（PI）染色鑑定凋亡細胞來評估細胞毒性。值（y軸）是相對於Mock處理的PI染色的OD值。 圖13示出了幾種主要saRNA對PMH細胞中的 Serping1mRNA表現的活化作用。將細胞用25nM濃度的saRNA處理3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12B-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 Serping1的mRNA水準進行定量。還擴增了 Tbp作為內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 Tbp之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。與Mock處理相比，* p ＜0.05、** p ＜0.01、*** p＜ 0.001、**** p ＜0.0001。 圖14A至圖14C示出了HepG2細胞中 SERPING1saRNA的時間進程變化和安全性。將指定的saRNA（即，RD-11513、RD-11823、RD-12065和RD-11826）以25nM轉染到HepG2細胞中7天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。圖14A示出了在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1mRNA水準進行定量。還擴增了 TBP和 HPRT1，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。圖14B示出了通過使用SERPING1 ELISA套組檢測OD值得到的SERPING1蛋白水準。值（y軸）表示為相對於Mock處理的SERPING1 mRNA和蛋白表現水準。圖14C示出了通過使用胱天蛋白酶3/7套組（G8092，Promega）檢測OD值得到的胱天蛋白酶3/7活性。值（y軸）表示為相對於Mock處理的胱天蛋白酶3/7活性。 圖15A至圖15C示出了PLC/PRF/5細胞中SERPING1 saRNA的時間進程變化和安全性。將指定的saRNA（即，RD-12065和RD-11826）以25nM轉染到PLC/PRF/5細胞中7天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。圖15A示出了在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1mRNA水準進行定量。還擴增了 TBP和 HPRT1，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。圖15B示出了通過使用SERPING1 ELISA套組檢測OD值得到的SERPING1蛋白水準。值（y軸）表示為相對於Mock處理的SERPING1 mRNA和蛋白表現水準。圖15C示出了通過使用胱天蛋白酶3/7套組檢測OD值得到的胱天蛋白酶3/7活性。值（y軸）表示為相對於Mock處理的胱天蛋白酶3/7活性。 圖16A至圖16C示出了HepG2細胞中SERPING1 saRNA的活化活性和安全性。將指定的saRNA（即，RD-11513、RD-11823、RD-12065和RD-11826）以25nM轉染到HepG2細胞中7天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。圖16A示出了在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1mRNA水準進行定量。還擴增了 TBP和 HPRT1，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。圖16B示出了通過使用SERPING1 ELISA套組檢測OD值得到的SERPING1蛋白水準。值（y軸）表示為相對於Mock處理的SERPING1 mRNA和蛋白表現水準。圖16C示出了通過使用胱天蛋白酶3/7套組檢測OD值得到的胱天蛋白酶3/7活性。值（y軸）表示為相對於Mock處理的胱天蛋白酶3/7活性。 圖17A至圖17B示出了saRNA對HepG2和PLC/PRF/5細胞中的 SERPING1mRNA表現的活化作用。將細胞用25nM濃度的saRNA處理3天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染。將dsCon2作為非特異性雙股體對照。DS12A-si2是雙股體siRNA，作為陰性對照進行轉染。RD-12065、RD-11513和RD-12066是雙股體saRNA，用作示例性對照。圖17A至圖17B示出了在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 SERPING1的mRNA水準進行定量。還擴增了 HPRT1和 TBP，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 HPRT1和 TBP兩個參考之後，相對於Mock處理的 SERPING1mRNA表現水準。與Mock處理相比，* p ＜0.05、** p ＜0.01、*** p＜ 0.001、**** p ＜0.0001。 圖18示出了PMH細胞中 Serping1saRNA的時間進程變化和安全性。將指定的saRNA（即，RD-12349、RD-12350、RD-12351和RD-12347）以25nM轉染到PMH細胞中7天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子通過兩步法RT-qPCR對 Serping1mRNA水準進行定量。還擴增了 Tbp和 Hprt1，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 Tbp和 Hprt1之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。 圖19A至圖19C示出了PMH細胞中 Serping1saRNA的時間進程變化和安全性。將指定的saRNA（即，RD-11432、RD-11931、RD-11927和RD-12189）通過RNAiMAX以25nM（圖19A）以及通過自由攝取以500nM（圖19B至圖19C）處理到PMH細胞中5天。Mock是在不存在寡核苷酸的情況下進行轉染（未示出）。圖19A至圖19B示出了在單獨的PCR反應中，使用基因特異性引子組通過兩步法RT-qPCR對 Serping1mRNA水準進行定量。還擴增了 Tbp和 Hprt1，並且將它們的幾何平均值用作內部參考。值（y軸）表示為在標準化為 Tbp和 Hprt1之後，相對於Mock處理的 Serping1mRNA表現水準。圖19C示出了通過使用胱天蛋白酶3/7套組檢測OD值得到的胱天蛋白酶3/7活性。值（y軸）表示為相對於Mock處理的胱天蛋白酶3/7活性。 圖20A至圖20B示出了在SC注射修飾的saRNA之後，對C57BL/6J小鼠的 Serping1mRNA的活化作用和體重的變化。將指定的saRNA（即，RD-12497）經由SC注射以20mg/kg施用到成年C57BL/6J小鼠中。注射生理食鹽水作為媒液對照。RD-11432是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。RD-11432經由SC以3mg/kg注射。在治療後第7天和第14天處死小鼠。圖20A示出了在RNA分離和RT反應之後，使用基因特異性引子組通過RT-qPCR在肝組織中對 Serping1mRNA水準進行定量。擴增了 Tbp和 Hprt1，並且將它們的幾何平均值用作RNA負載的內部參考。示出了在標準化為 Tbp和 Hprt1之後，相對於生理食鹽水組中的mRNA水準的每組3隻動物的肝組織中的平均 Serping1mRNA水準。圖20B示出了給藥後C57BL/6J小鼠的體重（g）變化。各組中所示為每組3隻動物的平均體重水準。 圖21A至圖21B示出了在SC注射修飾的saRNA之後，對C57BL/6J小鼠的 Serping1mRNA的活化作用和體重的變化。將指定的saRNA（即，RD-13144）經由SC注射以50mg/kg施用到成年C57BL/6J小鼠中。注射生理食鹽水作為媒液對照。RD-11432是化學修飾的siRNA，用作陰性對照。RD-11432經由SC以3mg/kg注射。在治療後第10天處死小鼠。圖21A示出了在RNA分離和RT反應之後，使用基因特異性引子組通過RT-qPCR在肝組織中對 Serping1mRNA水準進行定量。擴增了 Tbp和 Hprt1，並且將它們的幾何平均值用作RNA負載的內部參考。示出了在標準化為 Tbp和 Hprt1之後，相對於生理食鹽水組中的mRNA水準的每組3隻動物的肝組織中的平均 Serping1mRNA水準。圖21B示出了給藥後C57BL/6J小鼠的體重（g）變化。各組中所示為每組3隻動物的平均體重水準。
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Claims (75)

  1. 一種小活化核酸分子（saRNA），該小活化核酸分子包含具有在16至35個連續核苷酸範圍內的長度的寡核苷酸序列，其中該連續的寡核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 1390所示的等長部分具有至少75%、至少80%、至少85%或至少90%的同源性或互補性的核苷酸序列，其中該saRNA將 SERPING1基因的表現活化至少10%。
  2. 如請求項1之saRNA，其中該SEQ ID NO: 1390所示的等長部分位於該 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域（SEQ ID NO: 1391）、-357至-279區域（SEQ ID NO: 1392）、-256至-215區域（SEQ ID NO: 1393）、-125至-81區域（SEQ ID NO: 1394）或-80至-15區域（SEQ ID NO: 1395）中。
  3. 如請求項1至2中任一項之saRNA，其中該saRNA包含有義股和反義股，其中該有義股和該反義股各自包含互補區，其中該有義股和該反義股的該互補區形成雙股核酸結構。
  4. 如請求項1至2中任一項之saRNA，其中該有義股和該反義股具有至少90%的互補性。
  5. 如請求項3之saRNA，其中該有義股和該反義股位於兩條不同的核酸股上。
  6. 如請求項3之saRNA，其中該有義股和該反義股位於相同的核酸股上，選擇性位於髮夾單股核酸分子上，其中該有義股和該反義股的該互補區形成雙股核酸結構。
  7. 如請求項3之saRNA，其中該有義股和該反義股中的至少一者包含長度範圍為0至6個核苷酸的3'突出端。
  8. 如請求項7之saRNA，其中該有義股和該反義股包含長度範圍為2至3個核苷酸的3'突出端。
  9. 如請求項7之saRNA，其中該突出端的該核苷酸中的至少一個核苷酸是胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸。
  10. 如請求項3至9中任一項之saRNA，其中該有義股和該反義股獨立地包含約16至約35個、約17至約30個、約18至約25個或約19至約22個連續核苷酸的長度。
  11. 如請求項3至10中任一項之saRNA，其中該有義股與選自SEQ ID NO: 274-545的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性，並且該反義股與選自SEQ ID NO: 548-819的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性；或者其中該有義股或該反義股與AAAUUCCUGGCCUGGCCCNNN和/或CUACCAGGGNNNNNNNNNN中的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性。
  12. 如請求項11之saRNA，其中該有義股包含選自SEQ ID NO: 274-545的核苷酸序列，並且該反義股包含選自SEQ ID NO: 548-819的核苷酸序列。
  13. 如請求項1之saRNA，其中該寡核苷酸序列與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性或互補性。
  14. 如請求項1之saRNA，其中該寡核苷酸序列的該有義股與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列同源性。
  15. 如請求項1之saRNA，其中該寡核苷酸序列的該反義股與選自SEQ ID NO: 1-272的核苷酸序列具有至少75%的序列互補性。
  16. 如請求項1至15中任一項之saRNA，其中該saRNA的至少一個核苷酸是化學修飾的核苷酸。
  17. 如請求項16之saRNA，其中該saRNA的該反義股和/或該有義股中的至少一個核苷酸是化學修飾的。
  18. 如請求項16之saRNA，其中該化學修飾的核苷酸是具有至少一個以下修飾的核苷酸： 該saRNA的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； 該saRNA的核苷酸序列中核糖的2'-OH的修飾；以及 該saRNA的核苷酸序列中鹼基的修飾。
  19. 如請求項16之saRNA，其中該saRNA的至少一個核苷酸是鎖核酸、脫鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、胺基磷酸酯或包含非天然鹼基的核苷酸。
  20. 如請求項16之saRNA，其中該至少一個化學修飾的核苷酸的化學修飾是在該有義股或該反義股的5'端新增(E)-乙烯基膦酸酯部分。
  21. 如請求項1至20中任一項之saRNA，其中該saRNA的該有義股或該反義股綴合至選自以下項的一個或多個綴合基團：脂質、脂肪酸、螢光團、配體、醣、肽和抗體。
  22. 如請求項21之saRNA，其中該saRNA的該有義股或該反義股綴合至選自以下項的一個或多個綴合基團：細胞穿透肽、聚乙二醇、生物鹼、色胺、苯並咪唑、喹諾酮、胺基酸、膽固醇、葡萄糖和N-乙醯半乳胺糖。
  23. 如請求項22之saRNA，其中該綴合基團選自tC2和tC2x4， （tC2）， （tC2x4） 其中 代表載體材料。
  24. 一種如請求項1之saRNA的分離標靶位點，其中該分離標靶位點是SEQ ID NO: 1390所示的具有在16至35個連續核苷酸範圍內的長度的核苷酸序列。
  25. 如請求項24之分離標靶位點，其中該分離標靶位點是選自SEQ ID NO: 1-272的核酸序列。
  26. 一種 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的分離核酸序列，其中該分離核酸序列選自SEQ ID NO: 1391-1395。
  27. 一種分離核酸序列，該分離核酸序列選自該 SERPING1基因的該轉錄起始位點上游的-466至-399區域、-357至-279區域、-256至-215區域、-125至-81區域和-80至-15區域。
  28. 如請求項26或27之分離核酸序列，其中該分離核酸序列富集如請求項24或25之分離標靶位點。
  29. 如請求項26或27之分離核酸序列，其中以該分離核酸序列作為標靶的經設計saRNA的至少30%可將該 SERPING1基因的表現活化至少10%，其中該經設計saRNA：(1) 具有35%至65%的GC含量；(2) 具有少於5個連續相同的核苷酸；(3) 具有3個或更少的二核苷酸重複；以及 (4) 具有3個或更少的三核苷酸重複。
  30. 如請求項26或27之分離核酸序列，其中具有在16至35個核苷酸範圍內的長度的該分離核酸序列的核苷酸區域通過序列特異性方式結合如請求項1之saRNA。
  31. 一種設計saRNA的方法，其中該方法提供以如請求項26至30中任一項之分離核酸序列作為標靶的saRNA。
  32. 一種分離多核苷酸，該分離多核苷酸編碼如請求項1至23中任一項之saRNA。
  33. 如請求項32之分離多核苷酸，其中該分離多核苷酸是DNA。
  34. 一種載體，該載體包含如請求項32或33之分離多核苷酸。
  35. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項1至23中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸或如請求項34之載體。
  36. 一種組合物，該組合物包含如請求項1至23中任一項之saRNA或如請求項32或33之分離多核苷酸，以及選擇性的藥學上可接受的載體。
  37. 如請求項36組合物，其中該藥學上可接受的載體選自水性載體、脂質體、高分子聚合物、多肽和抗體。
  38. 如請求項36或37之組合物，其中該組合物包含0.001nM至150nM的該saRNA。
  39. 如請求項38之組合物，其中該組合物包含1nM至150nM的該saRNA。
  40. 一種saRNA，該saRNA包含具有在16至35個連續核苷酸範圍內的長度的寡核苷酸序列用於活化/調升細胞中的 SERPING1表現，其中該寡核苷酸序列與SEQ ID NO: 1390所示的等長部分具有至少75%或至少80%或至少85%或至少90%的序列同源性或互補性，其中該saRNA將該 SERPING1基因的表現活化至少10%。
  41. 如請求項40之saRNA，其中該SEQ ID NO: 1390所示的等長區域位於該 SERPING1基因的轉錄起始位點上游的-466至-399區域（SEQ ID NO: 1391）、-357至-279區域（SEQ ID NO: 1392）、-256至-215區域（SEQ ID NO: 1393）、-125至-81區域（SEQ ID NO: 1394）或-80至-15區域（SEQ ID NO: 1395）中。
  42. 如請求項41之saRNA，其中該saRNA包含有義股和反義股，其中該有義股包含選自SEQ ID NO: 274-545的核苷酸序列，並且該反義股包含選自SEQ ID NO: 548-819的核苷酸序列。
  43. 一種用於預防或治療個體的由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的疾病或病况的方法，該方法包括：向該個體施用有效量的如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物。
  44. 如請求項43之方法，其中該疾病或病况是遺傳性血管性水腫（HAE）。
  45. 如請求項43之方法，其中該個體是哺乳動物。
  46. 如請求項45之方法，其中該個體是人類。
  47. 如請求項43之方法，其中該個體患有由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的症狀。
  48. 如請求項43之方法，其中通過選自以下施用途徑中的一種或多種向個體施用如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物：腸胃外輸注、口服施用、鼻內施用、吸入施用、陰道施用和直腸施用。
  49. 如請求項48之方法，其中該施用途徑選自以下項中的一種或多種：椎管內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、膀胱內、腦室內、玻璃體內和皮下施用。
  50. 如請求項43之方法，其中該方法將該個體中的 SERPING1基因或 SERPING1mRNA的表現活化/調升至少10%。
  51. 如請求項43之方法，其中該方法將該個體中的C1IHN蛋白水準提高至少10%。
  52. 一種方法，該方法用於檢測如請求項35之細胞中的C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（緩激肽）。
  53. 一種用於實施如請求項43之方法的套組，該套組包括：a) 如請求項1至23和40至42之saRNA；以及 b) 使用說明書。
  54. 如請求項53之套組，其中該使用說明書包括用於向個體施用如請求項1至23和40至42之saRNA的手段。
  55. 一種套組，該套組包括在有標籤的包裝中的如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物，包裝上的標籤指示該saRNA、該分離多核苷酸、該載體或該組合物可用於預防或治療由血漿蛋白C1抑制蛋白（C1INH）表現不足誘導的疾病或病况或用於針對HAE的預防或治療。
  56. 一種套組，該套組用於檢測如請求項35之細胞中的C1INH蛋白或C1INH調節的蛋白（緩激肽）。
  57. 如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物在製備用於預防或治療個體的由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的疾病或病况的藥物中的用途。
  58. 如請求項57之用途，其中該疾病或病况是遺傳性血管性水腫。
  59. 如請求項57之用途，其中該個體是哺乳動物，其中該哺乳動物選擇性為人類。
  60. 如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物在製備用於活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的製劑中的用途。
  61. 如請求項60之用途，其中如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物直接引入該細胞中。
  62. 如請求項61之用途，其中該saRNA是在將編碼該saRNA的核苷酸序列引入該細胞後在該細胞中產生的。
  63. 如請求項60至62中任一項之用途，其中該細胞是哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞選擇性為人類細胞。
  64. 如請求項63之用途，其中該細胞在人體內。
  65. 如請求項64之用途，其中該人體是患有由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的症狀的患者，其中以足夠的量施用該saRNA、該分離多核苷酸或該組合物以治療該症狀。
  66. 如請求項65之用途，其中由C1IHN蛋白表現不足所誘導的該症狀是遺傳性血管性水腫。
  67. 一種用於活化/調升細胞中 SERPING1基因的表現的方法，該方法包括：向該細胞施用有效量的如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物。
  68. 如請求項67之方法，其中如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物直接引入該細胞中。
  69. 如請求項68之方法，其中如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物通過由以下項組成的手段中的一種或多種引入該細胞中： 1) 將如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物中的該saRNA與選自以下項的藥學上可接受的載體組合：水性載體、脂質體、高分子聚合物、多肽和抗體；以及 2) 將如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物中的該saRNA共價綴合至選自以下項的一個或多個綴合基團：細胞穿透肽、聚乙二醇、生物鹼、色胺、苯並咪唑、喹諾酮、胺基酸、膽固醇、葡萄糖和N-乙醯半乳胺糖。
  70. 如請求項69之方法，其中該綴合基團衍生自選自tC2和tC2x4的化合物， （tC2）， （tC2x4） 其中 代表載體材料。
  71. 如請求項67至70中任一項之方法，其中該細胞是哺乳動物細胞，較佳為來自人體的細胞。
  72. 如請求項71之方法，其中該人體是患有由C1IHN蛋白表現不足、 SERPING1基因突變和/或低功能性血液C1IHN水準誘導的症狀的患者，其中以足夠的量施用該saRNA、該分離多核苷酸或該組合物以治療該症狀。
  73. 如請求項72之方法，其中由C1IHN蛋白表現不足所引起的該症狀是遺傳性血管性水腫。
  74. 一種用於提高細胞中C1IHN蛋白的水準的方法，該方法包括：將有效量的如請求項1至23和40至42中任一項之saRNA、如請求項32或33之分離多核苷酸、如請求項34之載體或如請求項36至39中任一項之組合物中的該saRNA引入該細胞中。
  75. 一種化合物tC2或tC2x4， （tC2）， （tC2x4），其中 代表載體材料。
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