JP6461306B2 - インサイチュで自己組織化した、毒性のあるｒｎａ阻害剤 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本願は、２０１４年７月１８日出願の米国特許仮出願第６２／０２６，２６６号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全文が本明細書に援用される。

ＲＮＡ機能障害は、アポトーシス促進タンパク質のマイクロＲＮＡサイレンシング^［１］、欠損型タンパク質の翻訳^［２］および機能獲得^［３］をはじめとする様々な機構によって疾患を引き起こす。しかし、ＲＮＡ機能の小分子化学プローブを設計することも、治療法を導くこともこれまで困難であった。非リボソームＲＮＡに小分子薬を投与するための広く応用できる方法が開発されたならば、それは化学生物学および医薬品化学^［４］において重要な用途があり得る。ＲＮＡ媒介性疾患の１つのクラスは、伸長した反復するＲＮＡ、またはマイクロサテライト障害によって引き起こされる。２０を上回るマイクロサテライト障害が公知であり、それには筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）および筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病；ＡＬＳ）が挙げられる^［５］。細胞におけるリピートの結果は様々であり、タンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡレベルの変更を含み得る。筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）は、ｒ（ＣＣＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐによる毒性機能獲得に起因する。筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、ｒ（ＣＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ）による毒性機能獲得に起因する。

本発明者らは、ＲＮＡモチーフ−小分子相互作用に基づいて筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）を引き起こすＲＮＡの阻害剤またはモジュレーターを設計した^［６］。ＤＭ２は、ジンクフィンガータンパク質９（ＺＮＦ９）プレ−ｍＲＮＡのイントロン１に位置するｒ（ＣＣＵＧ）リピートの伸長（ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐ）による毒性機能獲得によって引き起こされる^［７］。ＲＮＡは、ステムに５’ＣＣＵＧ／３’ＧＵＣＣ（２ｘ２ ヌクレオチド内部ループ）の繰り返し単位を含むヘアピン構造に折り畳まれる。ループは、選択的プレ−ｍＲＮＡのスプライシングのレギュレーターである、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様１タンパク質（ＭＢＮＬ１）との高親和性結合部位を形成し、該タンパク質はその結合により不活化する（図１Ａ）。本発明者らの設計したｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐの阻害剤は、カナマイシンＡ誘導体に基づいており、６’位でアシル化されており、５’ＣＣＵＧ／３’ＧＵＣＣと高い親和性で結合する。特に、６’アミンのアシル化は、ｒＲＮＡとの結合を除去する^［８］。実際に細胞モデルにおいて、カナマイシン誘導体およびそのモジュール式に組み立てた（または多価の）化合物は、ＤＭ２に関連する欠損を改善した^［６ａ］。その他のリピート伸長について観察されるように、モジュール式に組み立てた化合物は、おそらくそれらの高い親和性、選択性、およびそれらが標的を捕捉する表面積がより大きいことに起因して、細胞機能障害のより強力な阻害剤である^［６ａ］。たとえ多価化合物がインビトロでより強力で選択的であったとしても、一部の例ではそれらがあまり細胞透過性でないために、インセルロ（ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ）での効力は結合価の関数として減少する^［９］。従って、リガンドサイズ、効力、および透過性の間で慎重にバランスをとらなければならない。

本発明者らはまた、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を引き起こすＲＮＡの阻害剤またはモジュレーターを設計するためにも同様のアプローチを使用した。この例では、ＤＭ１は、筋強直性ジストロフィー（ｄｙｓｔｏｐｈｉａ ｍｙｏｔｏｎｉｃａ）プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置するｒ（ＣＵＧ）リピート伸長（ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ）による毒性機能獲得により引き起こされる^［７］。ＤＭ１についての本発明のその他の態様としては：（ｉ）ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを標的とする最適化された二量体化合物の設計；（ｉｉ）ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを標的とし、標的（結合したＲＮＡ）および小分子と結合するＲＮＡ中の部位の検証を可能にする共有結合小分子、；（ｉｉｉ）非常に強力かつ選択的な阻害剤をオンサイトで合成するためのインセルロクリックケミストリーの使用；（ｉｖ）ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐをＦＲＥＴセンサを合成するための触媒として使用する蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アプローチ；および（ｖ）患者由来細胞においてｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを切断する、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを標的化する小分子の設計が挙げられる。

本発明は、様々な実施形態において、細胞がそれに透過性である１または２の小分子モジュール、すなわちアルキン基とアジド基の両方を有する単一のモジュール、または筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）および１型（ＤＭ１）の原因物質であるｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐの隣接する内部ループに結合するアルキン部分とアジド部分をそれぞれ含む２つのモジュール（Ｄａｙ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ Ｒａｎｕｍ，Ｌ．Ｐ．（２００５）ＲＮＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５，５−１６．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｕｒｂｉｎａｔｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｅｎｇ−Ｕｍｎｕａｙ，Ｐ．，Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｂ．Ｊ．，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．（２０００）Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ（ＣＵＧ）_（ｎ）ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＥＭＢＯ Ｊ．１９，４４３９−４４４８；Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｂｅｃｋ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｏｗｅｒｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｍｏｘｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．，Ｃａｎｎｏｎ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２００２）Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＵＧ ｒｅｐｅａｔｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ａｂｅｒｒａｎｔ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｃｎ−１ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０，３５−４４）に細胞を曝露することを含む、生細胞内でＲＮＡ機能のモジュレーターを形成する方法を提供し、その結果、それぞれにおいて、１つのモジュール、または２つのモジュールは、１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を介して、１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応でのアルキンおよびアジド基の縮合により、ＤＭ１またはＤＭ２ ＲＮＡ機能障害のオリゴマーの強力な阻害剤に変換される。従って、オリゴマーモジュレーターのモノマー前駆体は、隣接部位と結合し、１，３ヒュスゲン双極性環状付加反応を受けることのできる、同じ分子上にアジドおよびアルキン単位を提示する単一の化合物であり得るか、あるいは、一方がアルキン基を有し、他方がアジド基を有する一対の分子構造であり得る。

本発明はまた、様々な実施形態において、モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞がそれに透過性である小分子モジュールに細胞を曝露することを含む、生細胞内でＲＮＡ機能のモジュレーターを形成する方法を提供する。本発明はさらに、様々な実施形態において、それぞれ筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）および１型（ＤＭ１）の原因物質である、ＲＮＡ伸張リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐまたはｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを含有する細胞を、細胞がそれに透過性である１または複数のＲＮＡ伸張リピート結合モジュールに曝露することにより形成される、ＲＮＡ機能のモジュレーターを提供し、これら２つのモジュールは、ヒュスゲン１，３−双極性環状付加反応によって縮合して、毒性のあるＲＮＡの機能を妨害するオリゴマーモジュレーターを形成することのできるアルキン部分とアジド部分をそれぞれ含む。ＤＭ２の処置用のｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐモジュレーターに関して、細胞透過性モジュールは、カナマイシン類似体を含むことができる。ＤＭ１の処置用のｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐモジュレーターに関して、細胞透過性モジュールは、ビス−ベンズイミダゾールまたはその他のヘテロアリール化合物を含むことができる。

インセルロでの、ＤＭ２を引き起こすＲＮＡの強力な阻害剤を合成するためのインサイチュ・クリックケミストリーを示す図である。ＤＭ２は、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様１タンパク質（ＭＢＮＬ１）と結合し、それを捕捉するｒ（ＣＣＵＧ）リピートによって引き起こされる。アジドおよびアルキン官能基（Ｎ_３−Ｋ、Ｋ−Ａｋ、Ｎ_３−Ｋ−Ａｋ、およびＮ_３−Ｋ−ＡａＫ）を含む小分子は、ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐの隣接する部位と結合し、ヒュスゲン双極性環状付加反応を受ける。 ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐの模倣物に結合しているクリック反応可能なモジュールの分子運動学（ＭＤ）シミュレーションモデルを示す図である。（ＢＩ）：立体構造検索により、隣接部位に結合したＫモジュールによって表されるアジド基およびアルキン基が極めて近いことが明らかになる。（ＢＩＩ）：Ｎ_３−ＫおよびＫ−Ａａｋから得た１，４−トリアゾール付加物のＭＤシミュレーションで低エネルギー状態を示す立体図を示す図である。ＲＮＡとＫの間の水素結合は、破線で示される。（ＢＩＩＩ）：その他のリンカーモデルを示すＭＤシミュレーションの低エネルギースナップ写真を示す図である。 インセルロクリック反応およびクリック反応可能な小分子の標的の範囲の同定を示す図である。（Ａ）：小分子の細胞標的を同定するアプローチであるＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰの模式図を示す図である。クリック反応に関与する１つのＮ_３基を含むビオチン化モノマー、すなわちＮ_３−Ｋ−ビオチンを使用することによって研究が可能となった。このビオチン化モノマーは、細胞溶解物をストレプトアビジン樹脂の上に流すことによってクリック反応したオリゴマーおよび結合したＲＮＡ標的の単離を可能にする。（Ｂ）：ｒ（ＣＣＵＧ）_３００発現細胞においてのみ合成される、プルダウンされ、鋳型にされた小分子生成物のＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰ質量スペクトル分析の結果を示す図である。（Ｃ）：クリック反応した生成物のＲＮＡ標的を単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した、ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰの結果を示す図である。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「^＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。 インセルロでの、インサイチュクリックのＤＭ２に関連する欠損への効果を評価する細胞研究の結果を示す図である。（Ａ）：様々な化合物で処置することによるｒ（ＣＣＵＧ）_３００の核内フォーカスの生成抑制に対するクリック化合物の評価を示す図である。（Ｂ）：健康な細胞とｒ（ＣＣＵＧ）_３００発現細胞における、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）プレ−ｍＲＮＡエクソン１１の選択的スプライシングの模式図を示す図である。（Ｃ）：鋳型にされたクリック反応によるＢＩＮ１スプライシング欠損の救済を示す図である。上部、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下のＢＩＮ１スプライシング産物の代表的なゲル画像を示す図である。下部、処理細胞および未処理細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。各々の化合物の濃度は、上部の対応するバーにμＭで示される。Ｎ_３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋに関して、５μＭが各々の化合物の濃度を示す。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「^＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。 Ｎ_３−ＫおよびＫ−Ａｋによるインビトロクリック反応に使用したＲＮＡの二次構造を示す図である。 ｒ（ＣＣＵＧ）_１２の存在下および不在下でのＮ_３−ＫとＫ−Ａｋのインビトロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）_１２の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）_１２、ｒ（ＣＡＧ）_１２、ｒ（ＣＧＧ）_１２、ｒ（ＣＵＧ）_１２、完全に塩基対形成したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびビール酵母ｔＲＮＡの存在下および不在下での、Ｎ_３−ＫとＫ−Ａｋのインビトロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体の形成がｒ（ＣＣＵＧ）_１２によって選択的に触媒されることを示す（ｎ＝３）。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−ＫとＫ−Ａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−ＫとＮ_３−Ｋ−Ａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ_３−Ｋを使用して重合の程度を制限して、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ ｃｌｉｃｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−ＫとＮ_３−Ｋ−Ａａｋのインセルロクリック反応のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ_３−Ｋを使用して重合の程度を制限して、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ ｃｌｉｃｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−Ｋ−ビオチンとＫ−Ａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、ビオチン化Ｋ二量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。「^＊＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０１を示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−Ｋ−ビオチンとＮ_３−Ｋ−Ａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ_３−Ｋ−ビオチンを使用してポリマー形成の程度を制限し、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ ｃｌｉｃｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示す。 ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下および不在下でのＮ_３−Ｋ−ビオチンとＮ_３−Ｋ−Ａａｋのインセルロクリック反応から得た、プルダウンし、ビオチン標識した化合物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。これらのデータは、二量体および三量体がｒ（ＣＣＵＧ）_３００の存在下で形成されるが、不在下では形成されないことを示す。Ｎ_３−Ｋ−ビオチンを使用してポリマー形成の程度を制限し、ＬＣ−ＭＳ分析を容易にした（「インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ ｃｌｉｃｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」参照）。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３）により求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。 上部、ＢＩＮ１選択的スプライシングパターンへのＫ誘導体の効果を示す代表的なゲル画像を示す図である。Ｎ_３−ＫとＫ−Ａｋの１：１混合物は、予め合成した二量体と同程度にＢＩＮ１パターンを改善する。下部、処理細胞および未処理細胞におけるＢＩＮ１選択的スプライシングパターンの定量化を示す図である。モノマーＮ_３−ＫおよびＫ−Ａｋの活性を、予め合成した二量体ならびに各々のモノマーの等モル混合物と比較した。予め合成した二量体は、スプライシングを最も大きく改善し、一方、アジドおよびアルキンモノマーの混合物は、各々のモノマー単独よりもスプライシングを大きく改善した。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。 上部、Ｎ_３−Ｋ−Ａｋで処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの代表的なゲル画像を示す図である。細胞を１０および１μＭのＮ_３−Ｋ−Ａｋで処理した場合に、スプライシングパターンの改善が観察された。中央、Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋで処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの代表的なゲル画像を示す図である。細胞を１０μＭ、１μＭ、および１００ｎＭのＮ_３−Ｋ−Ａｋで処理した場合に、スプライシングパターンの改善が観察された。下部、未処理細胞およびオリゴマー形成可能なＫ化合物で処理した細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋは、評価した最も強力な化合物であった。それはナノモル濃度でＢＩＮ１プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損を有意に改善し、Ｋモノマーよりも１０００倍強力である。「^＊」は、両側スチューデントｔ検定（ｎ≧３）によって求めた、ｐ＜０．０５を示し；「^＊＊」はｐ＜０．０１を示し；「^＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。 上部、Ｋ誘導体が、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現しない細胞においてＢＩＮ１スプライシングパターンに影響を及ぼさないことを示す、代表的なゲル画像を示す図である。下部、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現しない細胞におけるＢＩＮ１スプライシングパターンの定量化を示す図である。評価したいずれの化合物も、両側スチューデントｔ検定によって求めたとおり（ｎ≧３）、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００の不在下でＢＩＮ１プレ−ｍＲＮＡスプライシングパターンに統計学的に有意な効果がなかった。試験した化合物の濃度は、括弧内に示される（ｍＭ）。 Ｋ１，４二量体の合成のためのスキームを示す図である。 Ｋ１，５二量体の合成のためのスキームを示す図である。 Ｎ_３−Ｋ−Ａｋの合成のためのスキームを示す図である。 Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋの合成のためのスキームを示す図である。 Ｎ_３−Ｋ−ビオチンの合成のためのスキームを示す図である。 ＤＭ１を引き起こす毒性のあるＲＮＡ−タンパク質複合体、ならびに疾患関連細胞機能障害およびインセルロでの標的選択性を改善し、調べるために使用する、設計された小分子を示す図である。 代謝安定性のための化合物のリード最適化を示す図である。化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅは、ミクロソームにおいて不安定であり（右下のプロット）、不安定性の原因はイミノプロトンであることを突き止めた。イミノプロトンはＮ−メチル化によって除去されて、ミクロソームにおいて安定している２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをもたらした。 設計された小分子２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、患者由来細胞株（左）およびＤＭ１マウスモデル（右）においてＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を改善することを示す図である。Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＵＧ ｒｅｐｅａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１７６９−１７７３。 設計された小分子２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、反応性モジュール（ＣＡ）および精製タグ（ビオチン）を付加されて２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンを生じることを示す図である。この化合物は、細胞において結合したＲＮＡと架橋（共有結合）を形成し、化学的架橋およびプルダウンによる単離（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｕｌｌ Ｄｏｗｎ）（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）というアプローチを用いることにより、それらを精製および定量化させ小分子の標的を検証する。（Ａ）：プローブ化合物の構造を示す図である。（Ｂ）：プローブがｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐと選択的に反応することを示すインビトロデータを示す図である。（Ｃ）：２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンが、細胞においてＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡのスプライシング欠損を改善することを示す図である。（Ｄ）：競合的（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ（Ｃ−Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）により測定されるように、非共有結合性化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ標的との反応から２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと競合することができることを示す図である。（Ｅ）：２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンによるＲＮＡ標的のプルダウンにより、化合物が疾患を引き起こす伸張した転写物と結合し、より短い（非病原性の長さの）ｒ（ＣＵＧ）リピートを含む他のＲＮＡと結合しないことが示されることを示す図である。 化学的架橋およびプルダウンによる単離ならびにリガンド結合部位のマッピング（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐ）を示す図である。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと反応したＤＭＰＫ ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの異なる領域と相補的なオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＲＮアーゼＨによって部位特異的に消化された。消化の後、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンと反応したＲＮＡの領域をストレプトアビジン樹脂に捕捉し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用することによって定量化した。データは、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンがＤＭＰＫ ｍＲＮＡのｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐと結合することを示す。 インビトロにおける、オンサイトでの薬剤合成を検証するために試験した化合物の構造を示す図である。 核酸を触媒として使用することによるインビトロでのオリゴマー薬剤合成のデータを示す図である。（Ａ）：反応に最適な距離を求めるためのリンカー長を調査した結果を示す図である。（Ｂ）：様々なＲＮＡの存在下、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳと２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサノエートＡａｋとのインビトロでの薬剤合成の評価を示す図である。 １つのｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ結合リガンド上にアジドおよびアルキン部位を有するオリゴマー種を形成することのできる設計された化合物Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを示す図である。 標的をプルダウンし定量化するための、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（図２８）およびＣｈｅｍ−Ｒｅａｃｔ−ＢＩＰのスキームを使用することによるインセルロクリックケミストリーを示す図である。 インセルロクリック化合物の、（Ａ）プレ−ｍＲＮＡスプライシング、（Ｂ）核内フォーカス、（Ｃ）およびＤＭ１に関連する翻訳欠損を改善させる能力を示す図である。 ＤＭ１患者由来細胞においてｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐの標的切断を可能にするために、ブレオマイシンにコンジュゲートされた２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ誘導体を示す図である。（Ａ）化合物の構造を示す図である。（Ｂ）標的が切断されていることを示すｑＲＴ−ＰＣＲデータを示す図である。（Ｃ）２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが標的化されたｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ切断を阻害することができることを示す、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５および２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが細胞に同時に添加される、競合切断データを示す図である。（Ｄ）下流のＤＭ１関連プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善を示す図である。 ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを触媒として使用することによる、ＦＲＥＴセンサを合成するための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）実験のスキームを示す図である。（Ａ）アプローチの概要を示す図である。（Ｂ）これらの実験で使用した化合物を示す図である。（Ｃ）代表的なデータを示す図である。 ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成スキームを示す図である。 ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成スキームを示す図である。 ２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成スキームを示す図である。 ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５の合成スキームを示す図である。 Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成スキームを示す図である。 Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチンの合成スキームを示す図である。 ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化アルキンの合成スキームを示す図である。 Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。 ビオチンＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。 Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡの合成スキームを示す図である。 ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成スキームを示す図である。

上記の考慮点を考え合わせて、本発明者らは、小分子「モジュール」の細胞透過性ならびにより高分子量の多価化合物の効力および選択性を活用することのでき得るＲＮＡリピート伸長を標的にする戦略を開発しようと試みた。インサイチュ・クリックケミストリーは、１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応（ＨＤＣＲ）によって、そのような戦略をもたらすことができた。つまり、２つのモジュールは、標的において隣接部位を結合させ、そうでなければ非反応性の基を極めて接近させて共有結合を形成させる；特に、アジド部分とアルキン部分は反応して安定なトリアゾールを形成する^［１０］。実際に、このアプローチは、アセチルコリンエステラーゼおよびＤＮＡ小溝を標的にするために使用されている^{［１０−１１］}。そのようなアプローチを細胞系に移すとそれは非常に影響力が強くなり得、高選択性の化学生物学プローブの開発を可能にし得るが、これはこれまでにまだ実証されていない。伸長した反復ＲＮＡは、それらが鋳型にする化合物のようにモジュール式であるので、おそらくこのアプローチに理想的な標的である（図１Ａ）。

ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐのインセルロでの、インサイチュクリックアプローチの開発は、二量体６’−Ｎ−アシル化カナマイシンＡ化合物（２Ｋ−４）とｒ（ＣＣＵＧ）リピートの結合モデルを使用することによって可能になった^［６ａ］。このモデルの分析により、６”位のアジド基（Ｎ_３−Ｋ）と６’位のアルキン基（Ｋ−Ａｋ）が、ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐの隣接する２ｘ２ヌクレオチド内部ループとの結合によって、反応するほど非常に近接し得ることが示された（図１Ｂ）。従って、Ｎ_３−ＫおよびＫ−Ａｋが等量で混合される場合、二量体が形成されることができた；同様に、６”アジドと６’アルキンの両方を提示する誘導体（Ｎ_３−Ｋ−Ａｋ；図１Ｂ）は、オリゴマーを形成することができた。本発明者らはまた、活性化された電子欠乏アルキン、Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋを含む化合物も合成し（図１Ａ）、それはＤｅｒｖａｎのグループによってＤＮＡを鋳型として使用してポリアミドを構築するのに用いられた^{［１１ｂ］}。全ての化合物は、既知経路の変形形態を用いることによって合成した（実施例の項参照）。

本発明者らは最初に、ｒ（ＣＣＵＧ）_１２（図４）がインビトロでＫオリゴマーの集合体を鋳型にする能力を試験した。インキュベーション後、反応生成物を質量分析によって分析した。実際に、原子価のより大きい化合物がｒ（ＣＣＵＧ）_１２の存在下で形成されたが、その不在下では形成されなかった（図５）。この鋳型にされた反応がｒ（ＣＣＵＧ）_１２に特異的であるか判断するために、本発明者らは、その他のＲＮＡがｒ（ＣＵＧ）_１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）_１２、ｒ（ＣＧＧ）_１２、ｒ（ＣＡＧ）_１２、完全に塩基対形成したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびｔＲＮＡを含むオリゴマー形成を触媒する能力を調査した（図４）。重要なことに、少量の二量体が観察されたｒ（ＣＵＧ）_１２（＜１０％；図６）を除いて、全てのＲＮＡについて重要な反応生成物は観察されなかった。親和性はｒ（ＣＣＵＧ）_１２よりもはるかに低いが、ｒ（ＣＵＧ）_１２が、Ｋと結合する時に少量の二量体を鋳型にしたことは驚くことではない^［１３］。さらに、多価化合物においてＫ ＲＮＡ−結合モジュールを分離する最適な距離は、ｒ（ＣＣＵＧ）_１２よりもｒ（ＣＵＧ）_１２の方がはるかに短い^［１３］。総合すると、これらの研究は、鋳型にされた反応が、ｒ（ＣＣＵＧ）_１２に対して選択的であり、官能基の位置決め、ＲＮＡ結合モジュール、およびＲＮＡ標的によって制御されることを示す（図６）。これらの研究は、細胞系においてこのアプローチを試験し、選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損および核内フォーカスの形成を含むＤＭ２に関連する欠損への、鋳型にされた化合物の生物学的影響を調べるきっかけをもたらした^［３ａ］。

多価化合物が実際にインセルロで鋳型にされたかを確認するために、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現している細胞モデル系を用いた^［１４］。細胞をＮ_３−ＫとＮ_３−Ｋ−ＡｋまたはＮ_３−Ｋ−Ａａｋで同時に処理した。生成物の分子量を制限し、質量スペクトル分析を可能にするために、Ｎ_３−Ｋを使用して反応を妨害した。処理後、細胞材料およびタンパク質を有機溶媒に沈殿させることにより、反応生成物を細胞溶解物から部分的に精製した。精製画分の質量スペクトル分析により、オリゴマー化は、細胞をＮ_３−Ｋ−ＡｋまたはＮ_３−Ｋ−ＡａＫで処理した場合に二量体と三量体の両方の反応生成物が観察される時にｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現している細胞で起こることが示された（図７〜９）。重要なことに、オリゴマー化は、ＲＮＡを発現しない細胞では観察されない（図７〜９）。従って、鋳型にされた合成は、疾患に冒された細胞にしか起こらず、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００がそれ自体の阻害剤の合成を触媒することが示唆される。

鋳型にされた反応の程度と、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００が実際にオリゴマー化の触媒であったのかを確認するために、本発明者らは、ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｕｌｌ Ｄｏｗｎ；図２Ａ）というアプローチを開発し、実施した。ビオチン部分を６’位に含むカナマイシン類似体（Ｎ_３−Ｋ−ビオチン；図２０および１０〜１２）の存在下、細胞をＫ−Ａｋ、Ｎ_３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ_３−Ｋ−ＡａＫで処理した。Ｎ_３−Ｋ−ビオチンは、インセルロで重合反応を終わらせ、オリゴマー形成した化合物とそれに結合した細胞標的を穏やかに溶解した後にストレプトアビジンビーズに捕捉させる。（図２ＢおよびＣ）。上記のＮ_３−Ｋで達成した研究に一致して、オリゴマー形成した生成物は、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００発現細胞だけに形成され、生成物へのモノマーの変換は、予測した通りＮ_３−Ｋ−ＡｋよりもＮ_３−Ｋ−ＡａＫでの方が大きかった^{［１１ｂ］}。ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰによっても本発明者らが鋳型にされた反応の細胞標的を同定することができた。プルダウンされた画分のｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００が、Ｎ_３−Ｋ−ビオチンおよびＫ−Ａｋ、Ｎ_３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ_３−Ｋ−ＡａＫの生成物の主な標的であることを確認した（図２Ｃ）。プルダウンされたｒ（ＣＣＵＧ）_３００標的の量は、効力の関数として増加する：Ｎ_３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋ＜Ｎ_３−Ｋ−Ａｋ＜Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋ（下記参照）。本発明者らのその他の実験で観察されるように、多価化合物は、細胞がｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現した場合にのみ観察された（図２Ｃ）。

その他のマイクロサテライトの障害で観察されるように、様々なタンパク質とｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐの結合は、核内フォーカスの形成を引き起こす^［３ａ］。色素標識したオリゴヌクレオチドによる蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、本発明者らの化合物が、ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐを含有する核内フォーカスの形成を抑制するかどうか判定した（図３Ａ）。未処理細胞では、細胞あたりのフォーカスの平均数は、９±２である。Ｎ_３−ＫまたはＫ−Ａｋで処理すると、細胞あたりのフォーカスの平均数は、それぞれ６±２と６±１に減少する。Ｋ−ＡｋとＮ_３−Ｋの等モル混合物（Ｋ−Ａｋ＋Ｎ_３−Ｋ）で処理すると、フォーカスは細胞あたり１±１に減少し、これはＫ−ＡｋとＮ_３−Ｋの反応生成物を模倣する予め合成した二量体に類似していた（Ｋ１，４二量体およびＫ１，５二量体；図１６および１７）。インセルロでクリック反応して自己オリゴマー形成する誘導体である、Ｎ_３−Ｋ−ＡｋおよびＮ_３−Ｋ−Ａａｋは、さらにより強力であり、観察した細胞あたりのフォーカスは１よりも非常に小さかった（＜＜１）。このように、オリゴマー化の可能な程度は、生物活性に相関する。

核内フォーカスの崩壊は、ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐによって捕捉されたタンパク質が遊離していることを示唆する。従って、化合物は、フォーカスにおけるＭＢＮＬ１の隔離によって引き起こされる選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損も改善する可能性がある^［３ａ］。本発明者らは、本発明者らの化合物が、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）のプレ−ｍＲＮＡの調節不全を改善する能力を調べた（図３Ｂ〜Ｃ、１３、および１４）^［１４］。ｒ（ＣＣＵＧ）_３００が細胞に存在する場合、エクソン１１は非常に頻繁に読み飛ばされるので、包含率は成熟ｍＲＮＡ中約２０％となった。対照的に、エクソン１１の包含率は、影響を受けていない細胞で約６０％である。興味深いことに、フォーカスの崩壊によって測定される化合物の効力について観察される傾向は、本発明者らのＢＩＮ１選択的スプライシング欠損の改善の結果においてそっくり再現される（図２および３）。例えば、予め合成した二量体およびＮ_３−Ｋ＋Ｋ−Ａｋは、ＢＩＮ１選択的スプライシングパターンを同様の程度まで改善するが、Ｎ_３−Ｋ−ＡｋおよびＮ_３−Ｋ−ＡａＫはさらに強力である（図３Ｃ）。特に、Ｎ_３−Ｋ−ＡａＫは、ナノモル濃度でスプライシング欠損を改善する能力を保持し、本発明者らの第一世代のモジュール式に組み立てた化合物よりも１００倍超改善し^［６ａ］、モノマーＮ_３−ＫおよびＫ−Ａｋよりも１０００倍超良好である。重要なことに、化合物は、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現しない細胞ではＢＩＮ１スプライシングパターンに影響を及ぼさない（図１５）。まとめると、鋳型にされたクリック反応に関与する本発明者らの化合物は、現在までに公知のＤＭ２に関連するスプライシング欠損（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ）を改善する最も強力な非共有結合性化合物である。さらに、プレ−ｍＲＮＡスプライシングの改善は、結合しているｒ（ＣＣＵＧ）_３００に起因するものであり、非特異的作用によるものではない。

要するに、これらの研究は、ＨＤＣＲを使用してインセルロで疾患に冒された細胞においてのみＲＮＡ阻害剤の合成を鋳型にし得ることを確立する。Ｓｈａｒｐｌｅｓｓと同僚によって既に明確に表現されたように^［１０］、この技術には多数の用途がある。ＲＮＡ反復障害は、特に魅力的な用途であり得る。数千もの反復単位を有し得る標的の性質により、鋳型にされた産物を高収量で生成し得た。さらに、ＡＬＳ、ＤＭ１、およびＤＭ２などの多くのＲＮＡ機能獲得障害は、脳機能障害を引き起こすので、血液脳関門を通過する能力を有する低分子量化合物を開発することが重要になる。まとめると、クリック反応は、疾患の細胞と組織の両方のモデルにおいて多価化合物の効力をもつ高浸透性の低分子量モノマーを生じ得た。

このアプローチは、ＤＭ２に観察されるものと同様の疾患機構を有する、ＤＭ１の原因物質（ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ）の標的にも適用された。ＤＭ１は、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲに位置するｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐによって引き起こされ、それはまた、ＭＢＮＬ１などのＲＮＡ生合成に関与するタンパク質と結合し、それを捕捉する（図２１）。

本発明者らは、細胞およびＤＭ１マウスモデルにおいてｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐと結合し、ＤＭ１機能障害を改善させる、Ｎ−メチルペプチド骨格、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅに提示されるＨ ＲＮＡ結合モジュールを含む二量体化合物を既に記載している。（図２２；Ｒｚｕｃｚｅｋ ＳＧ，Ｇａｏ Ｙ，Ｔａｎｇ ＺＺ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＣＡ，Ｋｏｄａｄｅｋ Ｔ，Ｄｉｓｎｅｙ ＭＤ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｏｃｔ １８；８（１０）：２３１２−２１）。ラットミクロソームに２時間曝した後、化合物の３５％だけがインタクトであった。化合物を調べると、アミド結合が代謝的不安定性の原因（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）であり得ることが示唆された；従ってアミドをＮ−メチルアミドに置き換えて２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを生成した、これはラットミクロソームに安定性であることが分かった（図２２）。

この安定な化合物、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを、ＤＭ１患者由来線維芽細胞におけるプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善について試験し（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｐ．；Ｓｔｅｐｎｉａｋ−Ｋｏｎｉｅｃｚｎａ，Ｅ．；Ｓｏｂｃｚａｋ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４，４２，１０８７３参照）、１００ｎＭよりも高い濃度で欠損の５０％超を救済することを見出した（図２３）。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（代謝的に安定）および２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ（代謝的に不安定）を、次にＨＳＡ^ＬＲマウスモデルにおけるプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善について試験した（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＵＧ ｒｅｐｅａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１７６９−１７７３参照）。これらの結果は、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳが、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅと比較してマウスモデルにおいてＣｌｃｎ１プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善で７倍超強力であることを示す（図２３）。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの良好な活性を考え合わせて、この分子の細胞標的を化学的架橋およびプルダウンによる単離（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ）を用いて探索した。このアプローチでは、親化合物２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの反応性誘導体は、反応性モジュール（ＣＡ）および精製タグ（ビオチン）を含む。Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰプローブの構造を図２４Ａに示す。この化合物のＲＮＡ標的とのインビトロ反応の試験を達成し、この化合物がｒ（ＣＵＧ）_１０９と最も効果的に反応したことが示された（図２４Ｂ）。

次に、この化合物のＤＭ１患者由来線維芽細胞への適用を達成して、化合物のＲＮＡ標的の特性を明らかにした。化合物の曝露および細胞の溶解の後、全ＲＮＡをストレプトアビジン樹脂に捕捉した。結合したビオチン化物質を樹脂から遊離させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用することによって定量化した。これらの研究は、３’ＵＴＲにｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを含んだＤＭＰＫ ｍＲＮＡがプルダウンで著しく濃縮されることを示した（図２４Ｃ）。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンに対して過剰な非反応性２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを添加し、Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰを繰り返すことにより―この実験は、競合的化学的架橋およびプルダウンによる単離（Ｃ−Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰと呼ばれる―非反応性の化合物が、プルダウンされた画分中のＤＭＰＫの量を激減させることが示される（図２４Ｄ）。

次に、リガンド結合部位の位置付けのための化学的架橋およびプルダウンによる単離（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｕｌｌ Ｄｏｗｎ ｔｏ Ｍａｐ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ）（Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐ）を実施して、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ中の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの結合部位を同定した（Ｙａｎｇ，Ｗ．−Ｙ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｖｅｌａｇａｐｕｄｉ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．（２０１５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ＡＴＧ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＮＡ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，５３３６−５３４５）。これは、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンとアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮアーゼＨによってプルダウンしたＤＭＰＫ ｍＲＮＡを正確に切断することによって達成された。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンによる反応によってビオチン化された切断された断片をストレプトアビジン樹脂に捕捉し、精製した。定量化により、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを含有する断片が、プルダウンされた画分において著しく濃縮されたことが示され、化合物の予測した結合部位が検証された。

次に、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの誘導体を、本明細書においてＤＭ２ ＲＮＡについて提示される実験との類似性によって、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを標的化する二量体化合物をオンサイトで合成する細胞のクリック反応でそれを使用することができるように合成した。一連の化合物（ｉ）１つのアジドを提示した（Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ）；および（ｉｉ）Ｎ−メチル骨格から様々な距離で活性化アルキンを提示した（２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−活性化アルキン）が合成された。これらの構造を図２６に示す。

最初に、本発明者らは、隣接する部位に結合した２つの化合物間のＨＤＣＲによって、図２６に示される構造のオリゴマー化をｒ（ＣＵＧ）_１２が触媒することができるかを調べた。結果は、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋが、ｒ（ＣＵＧ）_１２の存在下でＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳと反応する最も良いアルキンスペーサー単位をもたらしたことを示す（図２７Ａ）。最適な化合物は、次に、その他の核酸を使用することによって触媒されているそれらの結合（ｕｎｉｏｎ）について試験され（図２７Ｂ）、ｒ（ＣＵＧ）_１２だけが有意な反応収量をもたらしたことが示された。

次に、上で明らかになったスペーシングの教訓を用いて、単一の小分子に反応性のアジド部分とアルキン部分を有する小分子を設計した。化合物Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋをこのように合成した（図２８）。この化合物は、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐの存在下で、対応するアジドおよびアルキンでタグ付けされた化合物の混合物よりも大きいオリゴマーを形成することができるはずである。

患者由来細胞におけるＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋオリゴマー化の程度は、ＣｈｅｍＲｅａｃｔＢＩＰを使用することによって試験した。このアプローチでは、出発物質および反応生成物の両方をストレプトアビジン捕捉によって細胞から精製させる（図２９Ｂ）、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの変形を合成した（ビオチン−Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ、図２９Ａ）。これらの研究は、オリゴマー生成物がＤＭ１由来線維芽細胞においてのみ見出されることを示した（図２９Ｃ）。

上記のデータは、ＤＭ１のオンサイトでの薬物合成が実行可能であることを示したので（図２９）、この化合物（Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ）の生物活性を評価した。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの添加は、ＤＭ１に関連するプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損を１０ｎＭの投与量で５０％超改善し、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ単独による処理またはＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳおよび２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの同時処理よりもはるかに強力であった（図３０Ａ）。次に、化合物のＲＮＡフォーカスへの影響を測定し、クリック反応可能な化合物Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋが細胞に添加された場合に、より少ないフォーカスが観察されたことが示された（図３０Ｂ）。最後に、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを含有するＤＭＰＫ ｍＲＮＡは、核内に保持されるほど十分に低いレベルで翻訳される（Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．；Ｒｚｕｃｚｅｋ，Ｓ．Ｇ．；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．；Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２）。従って、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋは、フォーカスでの隔離を緩和することによってＤＭＰＫの細胞内局在を変え、翻訳を刺激することができる。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを添加することにより、長い毒性のあるｒ（ＣＵＧ）リピートを含む細胞においてナノモル濃度でのＤＭＰＫ翻訳欠損が改善されたが、病原性のリピートをもたない細胞には影響がなかった。

要するに、これらのデータは、化合物のリード最適化が、それらをより安定にするために骨格を変えることによって達成され得ることを示す。これらの化合物がアジド部分およびアルキン部分を備えることにより、ＤＭ１患者由来細胞におけるオンサイトでの薬物合成が可能になり、非常に高い効力がもたらされる。

次に、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを切断するアプローチを開発した。天然物ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）はＤＮＡを切断できることが示されたが、インビトロでＲＮＡ標的を切断したことも示された（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．；ｄｅ Ｖｒｏｏｍ，Ｅ．；Ｌｏｎｇ，Ｅ．Ｃ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ，Ｇ．Ａ．；ｖａｎ Ｂｏｏｍ，Ｊ．Ｈ．；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０，８７，９３７３）。従って、ブレオマイシンに２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを付加することにより、これらの化合物に患者由来細胞においてｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを切断する能力を与えることができ得る。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）Ａ５の合成は、このように達成した（図３１Ａ）。この化合物をＤＭ１患者由来線維芽細胞に適用すると、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されるＤＭＰＫ ｍＲＮＡのレベルは低下するが、健康な線維芽細胞ではＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルには影響がなかった（図３１Ｂ）。この化合物がＤＭＰＫ ｍＲＮＡを選択的に切断する能力をさらに試験するため、４倍過剰の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳに対して２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｃｙｉｎ）Ａ５を細胞に添加した。予期した通り、非反応性の化合物は結合に関して反応性の化合物と競合し、切断の量を低下させ、選択性を示唆した（図３１Ｃ）。これらの切断実験は、プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の改善とも相関した（図３１Ｄ）。

蛍光レポーターも、ＲＮＡに触媒されるクリック反応に基づいてオンサイトで合成した。このアプローチでは、クリック反応時にＦＲＥＴを観察することができるように、クリック反応を受けることのできる化合物をＦＲＥＴ対でタグ付けする（図３２Ａ）。ＦＡＭ（フルオレセイン）およびＴＡＭＡＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）ＦＲＥＴ染料対を使用し、ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＡａｋおよびＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＡＲＡを得た。化合物の添加により、ｒ（ＣＵＧ）_１２の存在下でのみ、ＦＲＥＴの強化が示された。従って、このアプローチは、広い適用性を有するＦＲＥＴレポーターのオンサイトでの合成を可能にする。

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［９］Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．Ｒｚｕｃｚｅｋ，Ｃ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，８５６−８６２。

［１０］Ｗ．Ｇ．Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｇ．Ｇｒｅｅｎ，Ｆ．Ｇｒｙｎｓｚｐａｎ，Ｚ．Ｒａｄｉｃ，Ｐ．Ｒ．Ｃａｒｌｉｅｒ，Ｐ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００２，４１，１０５３−１０５７。

［１１］ａ）Ａ．Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｚ．Ｒａｄｉｃ，Ｒ．Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｊ．Ｒａｕｓｈｅｌ，Ｐ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，６６８６−６６９２；ｂ）Ａ．Ｔ．Ｐｏｕｌｉｎ−Ｋｅｒｓｔｉｅｎ，Ｐ．Ｂ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１５８１１−１５８２１。

［１２］Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００７，８，６４９−６５６。

［１３］Ｍ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ａ．Ｐｕｓｈｅｃｈｎｉｋｏｖ，Ｊ．Ｍ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｋ．Ｓｏｂｃｚａｋ，Ｃ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，１７４６４−１７４７２。

［１４］Ｃ．Ｆｕｇｉｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｙ．Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｖ．Ｔｏｓｃｈ，Ａ．Ｖｉｇｎａｕｄ，Ａ．Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ，Ｙ．Ｋｏｋｕｎａｉ，Ｒ．Ｔｓｕｂｕｒａｙａ，Ｐ．ｄｅ ｌａ Ｇｒａｎｇｅ，Ｄ．Ｄｅｍｂｅｌｅ，Ｖ．Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｇ．Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔ，Ｃ．Ｂｏｕｌａｄｅ−Ｌａｄａｍｅ，Ｍ．Ｃ．Ｈｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ｄｅ Ｍｕｎａｉｎ，Ｎ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ，Ａ．Ｌａｑｕｅｒｒｉｅｒｅ，Ｃ．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｆ．Ｄｅｒｙｃｋｅｒｅ，Ｄ．Ａｕｂｏｅｕｆ，Ｌ．Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｕｄｄ，Ｂ．Ｓｃｈｏｓｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｇ．Ｂａｓｓｅｚ，Ｊ．Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｄ．Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｎ．Ｃｈａｒｌｅｔ−Ｂｅｒｇｕｅｒａｎｄ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１，１７，７２０−７２５。

［実施例］
コンピュータ解析のための方法
本発明者らは以前、２Ｋ−４、すなわちペプトイドによって連結された２つのＫ ＲＮＡ−結合モジュールと、２つの５’ＣＣＵＧ／３’ＧＵＣＣループを含有するＲＮＡとの結合のモデルを公開した^［１］。ペプトイドを除去し、リンカーを含めるためにＫ ＲＮＡ−結合モジュールを次のように編集した：（ｉ）１つのＫの環ＩのＣ６’には、ヘキサ−５−インアミドかまたはＮ−（２−アミノ−２−オキソエチル）プロピオルアミドのいずれかを含めた；そして（ｉｉ）アジド基をもう一方のＫの環ＩＩＩのＣ６”に付加した。リンカーの立体構造の走査を実施して、２つのＫの反応性の終端が互いのすぐ近くにあるかどうかを調べた。非冗長性の立体構造の徹底的走査を、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）でＯＰＬＳ＿２００５力場を使用して実施した^［２］。結果は、複数の立体構造が２つの反応性基を非常に近接させていて、エチニルＣとアジドＮとの最も短い距離は、ヘキサ−５−インアミドおよびＮ−（２−アミノ−２−オキソエチル）プロピオルアミドリンカーにおいて、それぞれ２．６１Åおよび２．３７Åであることを示した（図１、ＢＩ）。

各々の構造中で最も近い反応性基を有するこれらのリンカーの組を使用して、環化付加最終産物、Ｋ１，４−二量体およびＫ１，５−二量体のモデルを作製した。各々のリンカーの組み合わせ（ヘキサ−５−インアミド＋Ｎ_３またはＮ−（２−アミノ−２−オキソエチル）プロピオルアミド＋Ｎ_３）で、Ｋ１，５−二量体は、１つの立体構造を有する。各々のリンカーの組み合わせで、Ｋ１，４−二量体は、２つの主な立体構造、溶媒に向かうトリアゾール環Ｃ_５Ｈ（Ｃ_５Ｈ−ｏｕｔ）かまたはＲＮＡ主溝に向かうトリアゾール環Ｃ_５Ｈ（Ｃ_５Ｈ−ｉｎ）が可能であることを示した。合計６つのモデルをこのように作製した（図１、ＢＩＩおよびＢＩＩＩ）。複合体の安定性と、結合したＫのリンカーの影響を観察するために、手短に各々の構造のエネルギー極小化、続いて分子運動学（ＭＤ）シミュレーションを行った。ＭＤシミュレーションは、Ｄｅｓｍｏｎｄ^［３］とＯＰＬＳ＿２００５力場^［２］を用いて実施した。各々のモデル構造を、各方向に１０Åを安定させる（ｂｕｆｆｅｒｓ）、ＴＩＰ３水および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む斜方晶の箱で溶媒和させた。追加のイオンを添加して系を中和させた。ＭＤシミュレーションの前に、拘束／非拘束最小化および等温と等圧のアンサンブルを用いる短いシミュレーションからなる、ＮＰＴ緩和プロトコルを用いて系を予め平衡させた。１０ナノ秒のＭＤシミュレーションを、一定の温度（３００Ｋ）および圧力（１．０１３２５ｂａｒ）で実施した。位置拘束がシミュレーションを通してＲＮＡに適用された。短距離および長距離のクーロン力の相互作用を、９Å半径（短い）を用いるカットオフ法および許容差ｏ １×１０^−９（長い）を用いる滑らかな粒子・メッシュ・エワルド許容差法に設定した。シミュレーションの解析は、Ｍａｅｓｔｒｏグラフィックインターフェースによって達成した。

系の体積、圧力、温度および可能なエネルギーに顕著な変動がないことを観察した。値が連続的に増加した２つの例を除いて、シミュレーションの大部分で約４〜６ナノ秒後に系の全エネルギーを安定化させた。しかし、シミュレーション期間中の勾配は０．０５ｋｃａｌ／ｐｓ未満であった。Ｋ部分とＲＮＡとの水素結合は、シミュレーションを通して保存された。図は、ＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）を用いて準備された。

化合物の合成方法および化合物の特徴づけ
略語。ＤＩＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＨＲＭＳ、高解像度質量分析；ＬＣ−ＭＳ、液体クロマトグラフィー−質量分析；ＭｅＯＨ、メタノール；ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ／ＴｏＦ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型／飛行時間型；ＭＳ、質量分析；ＮＢＤ、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸
合成。Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５９ミリモル／ｇ）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、無水）は、ＥＭＤより購入し、さらなる精製を行わずに使用した。ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、および２−ブロモ酢酸は、シグマ・アルドリッチより購入した。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、およびＦｍｏｃ−β−アラニンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入した。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンおよびＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、Ｃｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓより購入した。Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、Ｏａｋｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓより購入した。クロラムブシルは、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓより購入した。ブレオマイシンＡ５は、ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。ヘキストカルボン酸塩（Ｐｕｓｈｅｃｈｎｉｋｏｖ Ａ，Ｌｅｅ ＭＭ，Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ ＪＬ，Ｓｏｂｃｚａｋ Ｋ，Ｆｒｅｎｃｈ ＪＭ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＣＡ，Ｄｉｓｎｅｙ ＭＤ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００９ Ｊｕｌ ２２；１３１（２８）：９７６７−７９）、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅ（Ｒｚｕｃｚｅｋ ＳＧ，Ｇａｏ Ｙ，Ｔａｎｇ ＺＺ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＣＡ，Ｋｏｄａｄｅｋ Ｔ，Ｄｉｓｎｅｙ ＭＤ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｏｃｔ １８；８（１０）：２３１２−２１）、およびビオチンアミン（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．；Ｈａｒａｄａ，Ｋ．；Ｍａｅｄａ，Ｙ．；Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，３７，３７６２）は、これまでに報告されたように合成した。Ｎ−メチルペプチドは、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋ＳＰ Ｗａｖｅマイクロ波を用いて合成した。

化合物の精製および分析。分取ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ２４８７二重波長吸光度検出器およびＷａｔｅｒｓ Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ＯＢＤ ５μｍ １９×１５０ｍｍカラムを備えたＷａｔｅｒｓ１５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプを用いて実施した。吸光度は、２８０および２２０ｎｍでモニターした。６０分で０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏ中０〜１００％ＭｅＯＨの勾配を化合物の精製に使用した。分析用ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ５μｍ ４．６×１５０ｍｍカラムを用いて実施した。評価した全ての化合物は、分析用ＨＰＬＣにより測定して、９５％以上の純度を有した。質量分析は、アプライドバイオシステムズＭＡＬＤＩ ＴｏＦ／ＴｏＦ分析計４８００プラスでα−ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを用いて実施した。全てのマイクロ波反応は、Ｂｉｏｔａｇｅイニシエーター＋ＳＰ Ｗａｖｅマイクロ波を用いて実施した。高解像度質量スペクトル分析は、ケミカルサイエンス質量分析センターのイリノイ大学アーバナ・シャンペーン校によって実施された。

Ｋ１，４二量体の合成。図１６を参照されたい。Ｎ_３−Ｋ（５０ｍｇ、５０μモル）およびＫ−Ａｋ（４５ｍｇ、５０μモル）を、ＤＭＦおよび水（３ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、ポリトリアゾールＣｕ（Ｉ）触媒（１０ｍｇ、１６μモル）^［４］、およびＥｔ_３Ｎ（５００μＬ、３．６ミリモル）で処理した。反応混合物を、１００℃で２．５時間電子レンジにかけ、その後、反応混合物を濃縮し、上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：１１％；６．２ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。Ｈ^１ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ４．３１（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），３．９２（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｍ，９Ｈ），３．５４（ｍ，７Ｈ），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），３．３１（ｍ，２Ｈ），３．２４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７，１３），２．７３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），２．５２（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），１．９２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｍ，４Ｈ）；Ｃ^１３ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１７９．８，１６６．２，１６６．０，１６５．８，１６５．６，１５０．３，１３２．１，１２７．８，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１１６．８，１０３．７，１０３．５，１０１．２，１００．３，８６．６，８２．４，８１．７，７６．０，７５．７，７５．０，７４．９，７４．１，７４．０，７３．７，７３．６，７２．９，７２．５，７１．６，７１．１，７０．９，６９．５，６８．２，６２．６，５７．９，５３．１，５２．９，５２．６，５１．２，５０．９，４３．２，４２．１，３８．０，３１．２，３０．７，３０．６，２８．１，２７．０ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ Ｃ_４２Ｈ_７９Ｎ_１２Ｏ_１１についての計算値（Ｍ＋Ｈ）１０８７．５４８３；実測値１０８７．５４５３。

Ｋ１，５二量体の合成。図１７を参照されたい。Ｂｏｃ−Ｎ_３−Ｋ（２０ｍｇ、２０μｍｏｌ）およびＢｏｃ−Ｋ−Ａｋ（２３ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、トルエン（２ｍＬ）に溶解し、アルゴン下に置いた。このサンプルをペンタメチルシクロペンタジエニルビス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）クロライド（６ｍｇ、０．８μｍｏｌ）で処理し、１３０℃で３時間電子レンジにかけた。次に、反応混合物を濾過し、濃縮した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中ＴＦＡの１：１混合物で０℃で２時間処理した。反応混合物を濃縮し、上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：０．５％；１ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ７．６６（ｓ，１Ｈ），３．５２（ｍ，３２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｍ，２Ｈ），１．９８，（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ），１．３４（ｍ，４Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１７９．８，１６６．２，１６６．０，１６５．８，１６５．６，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１１６．８，１０３．５，１０３．４，１０１．０，９８．４，８７．６，８６．５，８２．３，８１．２，７６．０，７５．９，７５．８，７５．７，７５．１，７４．１，７４．０，７３．６，７３．０，７２．９，７１．７，７１．６，７１．１，６８．２，６２．６，５７．９，５７．３，５２．６，５１．１，５１．０，５０．８，５０．５，４５．５，４３．２，４２．１，３７．５．３０．９，３０．６，２７．０，２０．６，１９．９，１９．２，１５．１ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ Ｃ_４２Ｈ_７８Ｎ_１１Ｏ_２２についての計算値（Ｍ＋Ｈ）１０８８．５３２３；実測値１０８８．５３１６。

Ｎ_３−Ｋ−Ａｋの合成。図１８を参照されたい。Ｎ_３−Ｋ（２５ｍｇ、４９μｍｏｌ）を、アセトンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、ＮＢＤ−活性化６−アミノヘキシン酸（６ｍｇ、４９μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で一晩撹拌した後、溶媒を真空除去した。得られる残渣を上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：２０％；５ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９），３．７４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４，１４），３．７０（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５，１５），３．５５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５，１２），３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０），２．７１（ｓ，１Ｈ），２．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２），１．８６（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１６６．２，１６６．０，１６５．８，１６５．６，１６２．２，１２１．８，１２０．１，１１９．６，１１８．４，１１８．０，１１６．８，１０３．６，１０２．０，８６．５，７６．１，７５．２，７４．３，７３．９，７３．５，７１．１，６９．１，５７．７，５３．３，５２．９，４３．２，４１．６，１９．４，１９．０ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ Ｃ_２４Ｈ_４２Ｎ_７Ｏ_１１についての計算値（Ｍ＋Ｈ）６０４．２９４２；実測値６０４．２９３８。

Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋの合成。図１９を参照されたい。２−プロピオルアミド酢酸（Ｐｒｏｐｉｏｌａｍｉｄｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（１７５ｍｇ、１．３６ミリモル）を、無水ＤＭＦに溶解し、ＤＩＣ（２１３μＬ、１．４ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン（ｎｏｒｂｏｒｅｎｅ）−２，３−ジカルボキシイミド（２４３ｍｇ、１．３６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（６００μＬ、３．４ミリモル）で処理した。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌した。次に、Ｎ_３−Ｋ（２０ｍｇ、４０μモル）を、アセトンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、５００μＬのＮＢＤ−活性化酸を４時間にわたって徐々に添加した。次に、溶媒を真空除去し、得られる残渣を上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：２％、６００μｍｏｌ。^１Ｈ ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５），３．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３，１１），３．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１０），３．５２（ｍ，１４Ｈ），２．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１），１．７３（ｍ，２Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１６９．８，１６６．３，１６６．０，１６５．８，１６５．６，１３１．９，１２６．０，１２１．８，１２０．１，１１８．４，１１６．８，１０３．４，７６．５，７５．２，７４．２，７４．２，７４．１，７３．８，７３．７，７３．４，７１．６，７１．２，６９．４，６９．２，５７．７，５３．６，５３．３，５３．２，５３．０，５１．５，４５．５，４３．２，４２．７ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ Ｃ_２３Ｈ_３９Ｎ_８Ｏ_１２についての計算値（Ｍ＋Ｈ）６１９．２６８７；実測値６１９．２６８０。

Ｎ_３−Ｋ−ビオチンの合成。図２０を参照されたい。Ｎ_３−Ｋ（１７ｍｇ、３０μｍｏｌ）を、アセトンおよび水（２ｍＬ）の１：１混合物に溶解し、ＮＢＤ−ビオチン（１２ｍｇ、３０μｍｏｌ）を添加した。反応を室温で一晩撹拌した後、溶媒を真空除去した。得られる残渣を上記のような逆相ＨＰＬＣによって精製した。収率：７％；１．６ｍｇの白色の固体をＴＦＡ塩として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（７００ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝４．６０（ｍ １Ｈ），４．４１（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４，１１），３．８３（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｍ，５Ｈ），３．５５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝５，１４），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｍ，１Ｈ），２．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８，１３），２．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３），２．３８（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７），１．６５（ｍ，５Ｈ），１．３９（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｍ，２Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１７５ｍＨｚ，Ｄ_２Ｏ，ＴＳＰ）：δ＝１７７．４，１７７．０，１６５．３，１６３．３，１６２．９，１６２．５，１６２．２，１３４．３，１２０．５，１１７．６，１１４．７，１１１．８，１００．５，９８．３，８３．４，７９．９，７３．０，７２．２，７１．４，７１．２，７１．１，７０．１，６８．１，６６．２，６２．０，６０．２，５５．４，５４．７，５１．１，５０．４，４９．８，４８．１，４４．３，４２．６，３９．６，３９．１，３５．３，２７．８，２７．６，２５．１ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ Ｃ_２８Ｈ_５０Ｎ_９Ｏ_１２Ｓについての計算値（Ｍ＋Ｈ）７３６．３３００；実測値７３６．３２９７。

小分子二量体の合成。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成。図３３を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計４回繰り返した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。６４０ナノモルの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した；０．２％。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ_８１Ｈ_１０１Ｎ_１９Ｏ_９）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１４８４．８１、ＭＳ実測値１４８４．９３（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３２分。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ官能基化中間体の合成。Ｒｉｎｋアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０５ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成。図３４を参照されたい。上で調製した２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体樹脂を、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ビオチンアミン（２００ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−β−アラニン（２５２ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間で処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。次に、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１×１０分）によって除去し、その後真空濃縮した。１４３ナノモル（０．０５％）の遊離アミン二量体を単離し、クロラムブシル（１ｍｇ、３μモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（２５μＬ）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液で室温にて３時間処理した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。１１９ナノモルの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンを単離した；０．０４％。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチン（Ｃ_１１３Ｈ_１４９Ｃｌ_２Ｎ_２６Ｏ_１４Ｓ）ＭＳ計算値２１９６．０８（Ｍ＋Ｈ）、ＭＳ実測値２１９５．９６（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３０分。

２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンの合成。図３５を参照されたい。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチンについて上記のように合成したが、ヘキストカルボン酸塩と結合する代わりに、ペプチドを無水酢酸およびＤＩＥＡの１：１溶液（合計量４００μＬ）で室温で１時間処理した。８００ナノモルの２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した；０．３％）。２ＮＡｃ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ_５９Ｈ_９６Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１２ＳＮａ）ＭＳ計算値１３１７．６３（Ｍ＋Ｎａ）、ＭＳ実測値１３１７．２８（Ｍ＋Ｎａ）；ｔ_Ｒ＝１８分。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５の合成。図３６を参照されたい。上で調製した２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体樹脂を、６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）ヘキサン酸（２８６ｍｇ、０．８１ミリモル）ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４１μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させ、添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間で処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（８０ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。次に、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１×１０分）によって除去し、その後真空濃縮した。４５０ｎｍｏｌ（０．２％）の遊離アミン二量体を単離し、それをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（４５０ｎｍｏｌ、ＬＫＴ Ｌａｂｓ）およびＤＩＥＡ（１０μＬ）の無水ＤＭＦ（５０μＬ）中の溶液で処理した。反応物を室温で撹拌し、さらなるＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートを、出発物質の８０〜９０％が消費されるまで定期的に添加した。次に、ブレオマイシンＡ５−銅錯体（４５０ｎｍｏｌ）の無水ＤＭＦ中の溶液を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次に、溶液を真空濃縮し、逆相ＨＰＬＣを用いて最初に水中０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）を１５分間使用した後、０〜１００％のＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡを１時間にわたって使用することによって精製した。５２ナノモルの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５を単離した（０．０２％）。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５（Ｃ_１４６Ｈ_２０３Ｎ_４０Ｏ_３２Ｓ_２）ＭＳ計算値３０９２．４９（Ｍ＋Ｈ）、ＭＳ実測値３０９２．１８（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３５分。

Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳの合成。図３７を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（２００ｍｇ、０．１２ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、３−アジドプロピルアミン（６０ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×３ｍＬ）。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６０ｍｇ、０．３ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×３ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（１３２ｍｇ、０．４ミリモル）、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）、ＨＯＡｔ（５５ｍｇ、０．４ミリモル）、およびＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計４回繰り返した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。６４０ナノモルのＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳを単離した；０．５％。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ（Ｃ_８５Ｈ_１０８Ｎ_２３Ｏ_１０）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６１０．８７、ＭＳ実測値１６１０．９６（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３４分。

Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳビオチンの合成。図３８を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、３−アジドプロピルアミン（１２０ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２６４ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４０μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（４ｍＬ）およびＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０５ｍｇ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、樹脂をＤ−ビオチン（１９５ｍｇ、０．８１ミリモル）、ＤＩＣ（２５０μＬ、１．６ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１０ｍｇ、０．８１ミリモル）、およびＤＩＥＡ（１４０μＬ、０．８１ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、その後、３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間で処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。６４０ナノモルのＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチンを単離した；０．２％。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ビオチン（Ｃ_９７Ｈ_１２７Ｎ_２６Ｏ_１２Ｓ）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１８７９．９８、ＭＳ実測値１８７９．８７（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３１分。

２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化アルキンの合成。図３９を参照されたい。各々のアルキン誘導体について、３００ｍｇの樹脂（０．１８ミリモル）と２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ中間体を、Ｎ−Ｆｍｏｃカルボン酸塩リンカー（０．６ミリモル）、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）、ＨＯＡｔ（７２ｍｇ、０．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（８０μＬ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。次に樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、ＤＩＥＡ（８０μＬ、０．６ミリモル）を含む２ｍＬのＤＭＦに懸濁した。懸濁液にアルゴンを流し、０℃に冷却した。次に、ＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）を添加し、それに続いてプロピオル酸（３７μＬ、０．６ミリモル）のＤＭＦ（５００μＬ）溶液をゆっくり添加した。反応物を低温で１時間撹拌し、その後、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次に、樹脂を３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳプロピオル酸塩（ｎ＝０）９００ナノモル（０．５％）（Ｃ_８５Ｈ_１０５Ｎ_２０Ｏ_１０）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１５６５．８３、ＭＳ実測値１５６５．６１（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３１分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳグリシン（ｎ＝１）６００ナノモル（０．３％）（Ｃ_８７Ｈ_１０８Ｎ_２１Ｏ_１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６２２．８５４、ＭＳ実測値１６２２．８５４（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３０分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳβ−アラニン（ｎ＝２）７５０ナノモル（０．４％）（Ｃ_８８Ｈ_１１０Ｎ_２１Ｏ_１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６３６．８７、ＭＳ実測値１６３６．７（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３１分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアミノヘキサン酸塩（ｎ＝５、Ａａｋ）４．９３μモル（３％）（Ｃ_９１Ｈ_１１６Ｎ_２１Ｏ_１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１６７８．９２、ＭＳ実測値１６７８．７（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３１分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアミノオクタン酸塩（ｎ＝７）１．６μモル（０．９％）（Ｃ_９３Ｈ_１２０Ｎ_２１Ｏ_１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１７０６．９５、ＭＳ実測値１７０７．０（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３３分。２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアミノドデカン酸塩（ｎ＝１１）４．４９μモル（３％）（Ｃ_９７Ｈ_１２８Ｎ_２１Ｏ_１１）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１７６３．０１、ＭＳ実測値１７６３．２（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３４分。

Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成。図４０を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（８００ｍｇ、０．４７ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（５ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、３−アジドプロピルアミン（３００ｍｇ、３ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。樹脂を再び、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２４０ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（５２８ｍｇ、１．６ミリモル）、ＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２０ｍｇ、１．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（２８０μＬ、１．６ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。このサイクルを合計３回繰り返した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（５ｍＬ）およびＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×５ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−（４−アミノエチル）−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２１０ｍｇ、１．２ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。次に、樹脂を、Ｎ−Ｆｍｏｃ アミノヘキサン酸（５６５ｍｇ、１．６ミリモル）、ＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）、ＨＯＡｔ（２２０ｍｇ、１．６ミリモル）、およびＤＩＥＡ（２８０μＬ、１．６ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液で処理し、添加し、反応物をマイクロ波によって７５℃に３０分間加熱した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦで除去した（２×１０分）。次に樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、ＤＩＥＡ（２８０μＬ、１．６ミリモル）を含む５ｍＬのＤＭＦに懸濁した。懸濁液にアルゴンを流し、０℃に冷却した。次に、ＤＩＣ（５００μＬ、３．２ミリモル）を添加し、それに続いてプロピオル酸（１４８μＬ、３．２ミリモル）のＤＭＦ（５００μＬ）溶液をゆっくり添加した。反応物を低温で１時間撹拌し、その後、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次に、樹脂を３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）で１０分間処理した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。５２３ナノモル（０．１％）のＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを単離した。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋ（Ｃ_９６Ｈ_１２４Ｎ_２５Ｏ_１２）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）１８１８．９８６１、ＭＳ実測値１８１９．００８１（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３２分。

ビオチン−Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋの合成。図４１を参照されたい。Ｒｉｎｋアミド樹脂（２５０ｍｇ、０．１５ミリモル）をＤＭＦ中で室温で１０分間膨潤させ、次にＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で脱保護した（３ｍＬ、２×２０分）。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、ＤＭＦ中１Ｍブロモ酢酸の溶液（２ｍＬ）およびＤＩＣ（１２５μＬ、０．８ミリモル）と２回反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し（３×３ｍＬ）、１０％電力に設定した７００Ｗのマイクロ波を用いるマイクロ波照射（３×１５秒）によって、Ｎ−［２−（Ｄ−ビオチニルアミノ）エチル］アミン^３（１００ｍｇ、０．３ミリモル）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液と反応させた。樹脂をこの溶液とともに室温で１時間振盪し、その後ＤＭＦで洗浄した（３×５ｍＬ）。残りの合成は、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋについて上に記載されるように合成した。２３０ナノモルのビオチン−Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを単離した；０．２％）。ビオチン−Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（Ｃ_１１０Ｈ_１４６Ｎ_２９Ｏ_１５Ｓ）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２１４５．１３、ＭＳ実測値２１４５．０７（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３４分。

Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）の合成。図４２を参照されたい。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをＦｍｏｃ６−アミノヘキサン酸塩とともに含有する樹脂２５０ｍｇを、１０分間かけて３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）によってビーズから切断した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。２．９５μモルの生成物を単離し、室温で２０分間１ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理することによってＦｍｏｃを除去し、溶液を真空濃縮した。残渣を、上記の条件を用いる逆相ＨＰＬＣによって再び精製した。二量体の一部（３１５ナノモル）を、マイクロ波照射によって１．５時間７５℃に加熱することにより、ＤＭＦ（５００μＬ）中で５−ＴＡＭＲＡ（０．４ｍｇ、０．９５μモル）とＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）と結合させた。反応混合物を濃縮し、上記のように精製して、２１６ナノモルのＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ；（０．１％）を得た。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＴＡＭＲＡ（Ｃ_１１８Ｈ_１４４Ｎ_２７Ｏ_１５）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２１７９．１３３５、ＭＳ実測値２１７９．０４８３（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３４分。

ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（フルオレセイン）の合成。図４３を参照されたい。Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳをＦｍｏｃ６−アミノヘキサン酸塩とともに含有する樹脂５００ｍｇを、１０分間かけて３０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ）によってビーズから切断した。溶液を真空濃縮し、トルエンで３回共沸させた。結果として得られる淡黄色の油状物質を、ヘキストカルボン酸塩（４０ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ミリモル）、ＤＩＣ（２５μＬ、０．１６ミリモル）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液で処理し、マイクロ波によって７５℃に１．５時間加熱した。次に、溶液を真空濃縮し、１時間にわたって２０〜１００％ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。生成物を単離し、室温で２０分間１ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理することによってＦｍｏｃを除去し、溶液を真空濃縮した。残渣を、上記の条件を用いる逆相ＨＰＬＣによって再び精製して、８μモルの二量体を得た。次にこれをＦＡＭアルキン（２５ｍｇ、６μｍｏｌ）および銅触媒（１ｍｇ、１．６μｍｏｌ）とともに、ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１ｍＬ）中でトリメチルアミン（２５０μＬ）とともに１２０℃で３時間加熱することによってクリック反応させた。次に、反応混合物を濃縮し、上記のように精製して５５０ナノモルのＦＡＭ二量体を得た。これをトルエンとともに３回共沸させた後、プロピオル酸スクシンイミジルエステル^４（１ｍｇ、６μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２５μＬ）のＤＭＦ（２５０μＬ）溶液で処理した。反応物を室温で４時間撹拌し、その後上記のように精製した。５．９ナノモルのＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋを単離した；（０．００２％）。ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ（Ｃ_１２０Ｈ_１３９Ｎ_２６Ｏ_１８）ＭＳ計算値（Ｍ＋Ｈ）２２３２．０７６１、ＭＳ実測値２２３２．０８２７（Ｍ＋Ｈ）；ｔ_Ｒ＝３５分。

生化学および細胞アッセイの方法
液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によるインビトロクリック反応の評価。ＤＭ２を引き起こす反復ＲＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどうかを判定するために、アルキンを含有する化合物およびアジドを含有する化合物を、１２のＣＣＵＧリピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。ｒＣＣＵＧ_１２（最終濃度５０μＭ）は、５分間６０℃の１×フォールディングバッファー（８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、１８５ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で折り畳まれた。室温に冷却した後、Ｎ_３−ＫおよびＫ−Ａｋ（各々の最終濃度５００μＭ）を添加し、反応混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。各々のサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。各成分の全イオン数を、Ｎ_３−Ｋ、Ｋ−Ａｋ、およびＫ１，４二量体の等モル混合物を含む制御注入を使用することにより測定される、各々の成分のイオン化率に正規化した。ｒ（ＣＵＧ）_１２、ｒ（ＡＵＵＣＵ）_１２、ｒ（ＣＡＧ）_１２、ｒ（ＣＧＧ）_１２、完全に塩基対形成したステムを含むＲＮＡヘアピン、およびビール酵母ｔＲＮＡ（ロシュ）を使用する制御反応も、同様に評価した。

ＤＭ２細胞培養モデルにおけるＤＭ２に関連するプレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損の評価。クリック反応可能な化合物のＤＭ２に関連する選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシング欠損への効果を判定するために、既に報告された細胞培養モデルを用いた^［５］。手短に言えば、Ｃ２Ｃ１２細胞を単層として増殖培地（１×ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および１×グルタマックス（インビトロジェン））で３７℃および５％ＣＯ_２で維持した。９６ウェルプレートの細胞が６０〜７０％の集密度に達したら、１μＬのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各サンプルに２００ｎｇの全プラスミドをトランスフェクトした。３００個のＣＣＴＧリピートを含むＤＭ２ミニ遺伝子^［１］およびＢＩＮ１レポーターミニ遺伝子を発現する等量のプラスミドを使用した^［５］。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地（１×ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、および１×グルタマックス）に置き換えた。７２時間後、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡミニプレップキットを用いて全ＲＮＡを回収した。約１５０ｎｇの全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに供した。ＢＩＮ１ミニ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲプライマーは、５’ＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣ（フォワード）および５’ＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＣＣＧＣＣ（リバース）であった。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１×ＴＢＥ緩衝液中２００Ｖで９０分間実施する変性８％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。産物を、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色することによって可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋イメージングシステムを用いて走査した。

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による、核内フォーカスの崩壊におけるインセルロクリック反応の評価。ＦＩＳＨを用いて、核内フォーカスの形成へのクリック反応可能な化合物の影響を判定した。Ｃ２Ｃ１２を、Ｍａｔ−Ｔｅｋ ９６ウェルガラスボトムプレートの増殖培地で継代培養した。細胞が６０〜７０％の集密度に達したら、１μＬのリポフェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各ウェルに２００ｎｇの全プラスミドをトランスフェクトした。ＤＭ２ミニ遺伝子^［１］およびトランスフェクションの陽性マーカーとして使用されるＥＧＦＰを発現する等量のプラスミドを使用した。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地に置き換えた。細胞を化合物で７２時間処理し、その後、１ｎｇ／μＬ ＤＹ５４７−２’ＯＭｅ−（ＣＡＧＧ）_５ ^［６］を用いて前に記載されるようにＦＩＳＨを行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０００共焦点顕微鏡を１００倍の倍率で使用して、１×ＤＰＢＳ中で細胞を画像化した。

インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定。Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖培地のＴ−７５ディッシュで増殖させた。細胞が６０〜７０％の集密度に達したら、リポフェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各ディッシュに１０μｇのＤＭ２ミニ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクトした。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地に置き換えた。トランスフェクションの直後に、１２．５μＭ Ｎ_３−Ｋと、１２．５μＭ Ｋ−Ａｋか、１２．５μＭ Ｎ_３−Ｋ−Ａｋか、１２．５μＭ Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋのいずれかとの混合物で細胞を処理した。ＬＣ−ＭＳによる検出を可能にするために、Ｎ_３−Ｋを添加してオリゴマー産物の分子量を制限した。７２時間後、細胞をアセトニトリル中１０％水で凍結融解することによって溶解した。解凍した溶解物を濃縮し、１ｍＬのアセトニトリル中１０％水に再懸濁した。不溶性の細胞残屑をペレット化し、上清を質量スペクトル分析に使用した。約２０μＬの各サンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。各成分の全イオン数を、Ｎ_３−Ｋ、Ｋ−Ａｋ、およびＫ１，４二量体の等モル混合物を含む制御注入中の各成分のイオン化率に正規化した。

ｑＲＴ−ＰＣＲによる標的プルダウンの分析。Ｃ２Ｃ１２細胞を、Ｔ−２５フラスコで増殖培地中の単層として増殖させ、６０〜７０％の集密度でトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００を製造業者の標準プロトコルに従って用いて、各ディッシュに３．４μｇのＤＭ２ミニ遺伝子発現プラスミドをトランスフェクトした。５時間後、トランスフェクションカクテルを除去し、目的の化合物を含有する分化培地に置き換えた。トランスフェクションの直後に、５μＭ Ｎ_３−Ｋ−ビオチンと、５μＭ Ｋ−Ａｋか、５μＭ Ｎ_３−Ｋ−Ａｋか、５μＭ Ｎ_３−Ｋ−Ａａｋのいずれかとの混合物で細胞を処理した。ＬＣ−ＭＳによる検出を可能にするために、Ｎ_３−Ｋ−ビオチンを添加してオリゴマー産物の分子量を制限した。７２時間後、細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した。ペレット化した細胞を、５００μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％ ＮＰ４０、１／２５ ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ）、および１ｕ／μＬ ＲＱ１ ＤＮＡｓｅ（プロメガ））^［７］で５分間室温で処理することによって溶解し、その後、７５℃で５分間インキュベートした。

１５ナノモルのストレプトアビジン−アガロースビーズ（シグマ、ビオチン添加量１５μｇ／ｍＬ）を用いて約９０％の細胞溶解物をプルダウンに使用した。溶解物を５００ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間ビーズとともにインキュベートした。溶液を除去し、ビーズを１×ＰＢＳの５００μＬアリコートで洗浄した。結合した材料を、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する９５％ホルムアミド３０μＬ、ｐＨ８．２中で９５℃にて５分間加熱することにより、ビーズから遊離させた。

逆転写反応を、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造業者のプロトコルに従って細胞溶解物かまたは溶離した材料のいずれかの約１０％量を添加することにより実施した。次に、各ｃＤＮＡサンプルの３０％を、各プライマーセットに対するリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析に使用した。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いて７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）で実施した。ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐを含有するｍＲＮＡに対するＰＣＲプライマーは、５’ＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＡ（フォワード）および５’ＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＣ（リバース）であった。１８ＳリボソームＲＮＡに対するＰＣＲプライマーは、５’ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ（フォワード）および５’ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ（リバース）であった。

プルダウンした反応産物のＬＣ−ＭＳによる分析。プルダウンした反応産物を検出するために、約４μＬの溶離材料を、０．１％ＴＦＡを含有する５体積の水に希釈し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した。

これらのサンプルを、ｒ（ＣＣＵＧ）_３００を発現しなかった、化合物で処理した細胞由来のプルダウンしたサンプルと比較した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。

患者由来神経芽細胞におけるＤＭ１スプライシング欠損の評価。５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）および健康な線維芽細胞（ＧＭ０７４９２）を使用することによって、小分子二量体の生物活性を評価した。細胞を、１２ウェルプレートで増殖培地（１Ｘ ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中の単層として増殖させた。細胞が約８０％の集密度に達したら、細胞を目的の化合物を含む増殖培地（１０、１、０．１および０．０１μＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ；１００、１０および１ｎＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチン；１μＭ Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ；５００ｎＭ Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ＋５００ｎＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサン酸塩；１０００、１０および０．１ｎＭ Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ；２５０、１００、および５０ｎＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ブレオマイシンＡ５）で処理した。４８時間後、細胞を溶解し、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡミニプレップキットを用いて全ＲＮＡを回収した。オンカラムＤＮＡ消化を、製造業者の推奨するプロトコルによって達成した。約１５０ｎｇの全ＲＮＡを、１００単位のスーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）を用いて５０℃で逆転写した。次に、ＲＴ反応の２０％を、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）を用いるＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、２５サイクルの９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分、および７２℃１分の最終伸長の後に観察された。産物は、１×ＴＡＥ緩衝液中１００Ｖで１時間実施した２％アガロースゲルで分離した。産物を、臭化エチジウムで染色することにより可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋イメージングシステムを用いて走査した。ＭＢＮＬ１に対するＲＴ−ＰＣＲプライマーは、５’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣ（フォワード）および５’ＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧ（リバース）であった。

ＤＭ１マウスモデルを用いるスプライシング欠損の評価。全ての試験手順、マウスの取り扱い、および飼育は、実験動物ケア評価認証協会（ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）に従って達成した。ＤＭ１^［８］のマウスモデルに、２０ｂ系統のＨＳＡ^ＬＲを使用した。ＨＳＡ^ＬＲマウスは、３’ＵＴＲに２５０個のＣＵＧリピートを含むヒト骨格アクチンＲＮＡを発現する。年齢と性別の一致するＨＳＡ^ＬＲマウスに、処置用の１００ｍｇ／ｋｇの水中２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅまたは１３．３ｍｇ／ｋｇの２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ、および対照用の０．９％ＮａＣｌを１日１回、７日間腹腔内注射した。最後の注射の１日後にマウスを犠牲にし、広筋を入手した。ＲＮＡを広筋組織から抽出し、前に記載されるようにｃＤＮＡを合成した。

ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐを標的化するために化合物を使用することによる、小分子二量体とＲＮＡのインビトロ反応およびプルダウン。増殖培地（（１Ｘ ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ 抗生物質／抗真菌薬（コーニング）２ｍＬ）を９５℃で１５分間熱失活させ、その後、ゆっくりと室温まで冷却した。次に、約１０，０００カウントのγ^３２Ｐ標識ＲＮＡ（ｒＣＵＧ_１０９、ＧＣに基づく塩基対形成したＲＮＡおよびｔＲＮＡ）を添加し、９５℃で１分間折り畳んだ。次に、化合物の２倍希釈液（最終濃度８００、４００、２００および１００ｎＭ）を、５０μＬのＲＮＡ溶液中に調製し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、ストレプトアビジン−アガロースビーズ（シグマ）の４００μＬのスラリーを、１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、その後、２ｍＬの１Ｘ ＰＢＳに再懸濁した。次に、３０μＬのこのスラリーを各サンプルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、サンプルを遠心し、上清を別の管に移した。次に、ビーズを１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、遠心した。上清を、非結合ＲＮＡを含む管に移した。結合ＲＮＡと非結合ＲＮＡの全放射線カウントを、シンチレーション計数によって測定した。

ＤＭ１系を使用することによるＣｈｅｍ−ＣＬＩＰによる標的同定およびプルダウン。５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）および健康な線維芽細胞（ＧＭ０７４９２）を使用して、小分子二量体の標的同定を評価した。細胞を、増殖培地（１Ｘ ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ 抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中、１００ｍｍ^２の単層として増殖させた。細胞が約８０％の集密度になったら、それらを目的の化合物（１００ｎＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチン）を含む増殖培地で処理した。４８時間後、細胞を溶解させ、トリゾール試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて全ＲＮＡを回収した。約１０μｇの全ＲＮＡをストレプトアビジン−アガロースビーズ（１００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、ビーズを１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、結合したＲＮＡを１００μＬの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２を６０℃で１０分間添加することにより溶離した。Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡミニプレップキットを用いて結合したＲＮＡを浄化した。約１００ｎｇのＲＮＡを、ＲＴ ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に使用した。ＲＴ反応の１０％は、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）で実施したリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ライフテクノロジーズ）とともに使用した。ｒＣＵＧを含有するｍＲＮＡである、ＤＭＰＫ（５００リピート）、ＳＵＰＴ２０ＨＬ１（１７リピート）、ＣＡＳＫ（１６リピート）、ＬＲＰ８（１１リピート）、ＭＡＰ３Ｋ４（１１リピート）、ＳＣＵＢＥ（７リピート）およびＳＯＲＣＳ２（７リピート）をモニターした。ＧＡＰＤＨと比較するΔΔＣ_ｔにより定量した。

Ｃｈｅｍ−ＣＬＩＰ−Ｍａｐによる標的同定およびプルダウン。５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）を使用して、小分子二量体の結合部位の標的同定を評価した。細胞を、増殖培地（１Ｘ ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ 抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中、１００ｍｍ^２の単層として増殖させた。細胞が約８０％の集密度になったら、それらを目的の化合物（１００ｎＭ ２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−ＣＡ−ビオチン）を含有する増殖培地で処理した。４８時間後、細胞を溶解し、トリゾール試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて全ＲＮＡを回収した。約６μｇの全ＲＮＡを、１Ｘ ＲＮアーゼＨ緩衝液中の８μＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて９５℃に１分間加熱し、その後氷上で冷却することにより折り畳ませた。次に、５単位のＲＮアーゼＨ（ライフテクノロジーズ）を添加し、反応物を３７℃で１．５時間インキュベートし、その後６５℃で２０分間熱失活させた。次に、切断したＲＮＡをＤＮアーゼで３７℃で３０分間処理した後、停止緩衝液を添加し、６５℃で１０分間インキュベートした。切断したＲＮＡ溶液をストレプトアビジン−アガロースビーズ（１００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、ビーズを１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、結合したＲＮＡを１００μＬの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２を６０℃で１０分間添加することにより溶離した。Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＲＮＡミニプレップキットを用いて結合したＲＮＡを浄化した。約１５０ｎｇのＲＮＡを、ＲＴ ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に使用した。ＲＴ反応の４０％は、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）で実施したリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ライフテクノロジーズ）とともに使用した。ＧＡＰＤＨと比較するΔΔＣ_ｔにより定量した。

液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によるインビトロクリック反応の評価。ＤＭ１を引き起こす反復ＲＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどうかを判定するために、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳアジドおよび各々の２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ活性化アルキン誘導体を、１２個のＣＵＧリピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。ｒＣＵＧ_１２（最終濃度１００μＭ）は、５分間６０℃の１×フォールディングバッファー（８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、１８５ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で折り畳まれた。室温に冷却した後、アジドおよびアルキン二量体（各々の最終濃度２５μＭ）を添加し、反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。各々のサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳによって分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。ｒ（ＣＵＧ）_１２との反応が最も大きかったアルキン、２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−アミノヘキサン酸塩Ａａｋを、次に、他のＲＮＡ標的の存在下で形成された二量体の量を分析することによって、選択性について評価した。評価した他のＲＮＡは、各々１００μＭ最終濃度のｒ（ＣＣＵＧ）_１２、ｒ（ＣＡＧ）_１２、ｒ（ＣＧＧ）_１２、およびビール酵母ｔＲＮＡ（ロシュ）であった。

ＤＭ１線維芽細胞を用いる、インセルロでクリック反応した生成物の質量分析による同定。ＤＭ１を引き起こす反復ＲＮＡが、細胞内でのオリゴマー化の鋳型となるかどうかを判定するために、５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）および健康な線維芽細胞（ＧＭ０７４９２）を、８０％の集密度までＴ２５ディッシュ中の増殖培地（１Ｘ ＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（コーニング）および１Ｘ 抗生物質／抗真菌薬（コーニング））で増殖させ、等モル量のＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳビオチンおよび２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａｈｘ Ａｌｋｙｎｅ（各５００ｎＭ）で２日間処理した。細胞を１Ｘ ＤＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理した。次に、増殖培地でクエンチし、遠心沈殿させた。細胞を１Ｘ ＤＰＢＳで２回洗浄し、その後０．２５ｍＬの溶解緩衝液（合計２ｍＬ＝２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、２％ ＮＰ４０、８０ｕＬ ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（１／２５）および５０ｕＬ ＤＮＡｓｅ）を室温で５分間添加することにより溶解し、その後７５℃に５分間加熱した。２００μＬの溶解物を、ストレプトアビジン−アガロースビーズ（１００μＬ、シグマ）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、ビーズを１Ｘ ＰＢＳτで洗浄し、２０μＬの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２を６０℃で５分間添加することによって、結合したＲＮＡを溶離した。約４μＬの各々のサンプルを、０．１％ギ酸を加えた水２０μＬに希釈し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−ＥＴＤ質量分析計を用いるＬＣ−ＭＳにより分析した。１０分にわたる、０．１％ギ酸を加えた水中０〜１００％アセトニトリルの勾配を分析に使用した。

蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる核内フォーカスの評価。ＦＩＳＨを用いて、核内フォーカスの形成および崩壊への小分子二量体の影響を判定した。５００個のＣＴＧリピートを含むＤＭ１患者由来線維芽細胞（ＧＭ０３９８７）を、Ｍａｔ−Ｔｅｋ ９６ウェルガラスボトムプレートの増殖培地で約８０％の集密度まで増殖させた。細胞を目的化合物で４８時間増殖培地において処理し、その後、１ｎｇ／μＬ ＤＹ５４７−２’ＯＭｅ−（ＣＡＧ）_６を用いて前に記載されるように^［６］ＦＩＳＨを行った。ＭＢＮＬ１の免疫染色を、前に記載されるように^［７］ＭＢ１ａ抗体（１：４希釈）を用いて達成した。その抗体はＧｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ教授（Ｗｏｌｆｓｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）^［９］により寛大にも供給されたものである。１：２００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８コンジュゲートを用いてこれを蛍光標識した。ＤＡＰＩの１Ｘ ＤＰＢＳ中１μｇ／μＬ溶液を用いて未処理対照を染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０００共焦点顕微鏡を１００倍の倍率で使用して、１×ＤＰＢＳ中で細胞を画像化した。

ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる翻訳による欠損の評価。ルシフェラーゼの３’ＵＴＲにおいて８００個または０個のＣＴＧリピートを発現するＣ２Ｃ１２細胞株を、９６ウェルプレートで増殖培地（１Ｘ ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１Ｘ ｇｌｕｔａｇｒｏ（コーニング）および１Ｘ抗生物質／抗真菌薬（コーニング））中の単層として増殖させた^［１０］。細胞が７０％の集密度になったら、クリック官能化二量体を、１００μＬの増殖培地（１０００ｎＭ Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳおよび１０００、１０および０．１ｎＭ Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋ）に添加した。細胞を化合物で４８時間処理した後、細胞数を、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ）を用いて正規化した。次に、細胞を１Ｘ ＤＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＰＰＢＴ溶解緩衝液で室温で１０分間処理することによって溶解した。次に、５０μＬのルシフェラーゼ基質を添加し、発光を測定した。

ＦＲＥＴによって測定するインビトロクリック反応の評価。ＤＭ１を引き起こす反復ＲＮＡが、ＨＤＣＲによるオリゴマー化の鋳型となるかどうかを判定するために、ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ ＡａｋおよびＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋを、１２のＣＵＧリピートを含むＲＮＡとともにインキュベートした。ｒＣＣＵＧ_１２（最終濃度８０μＭ）は、１×フォールディングバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００Ｍ ＫＣｌ、および１０ｍＭ ＮａＣｌ）中で折り畳まれた。室温まで冷却した後、ＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋ（最終濃度６０ｎＭ）およびＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋ（最終濃度４０ｎＭ）を添加し、反応混合物を３７℃で合計４８時間インキュベートした。ＦＲＥＴは、４８５ｎｍで励起させ、５９０ｎｍでの発光を測定することにより測定した。ＦＲＥＴの増強は、ＲＮＡの不在下で対照とＦＡＭ−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋ（最終濃度６０ｎＭ）およびＮ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ Ａａｋ（最終濃度４０ｎＭ）を比較することによって定量された。また、ＦＲＥＴは、塩基対対照ＲＮＡ（ｒ（ＧＣ）_２０）を陰性対照として用いて測定された。

実施例の項の引用文献
［１］Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｉ．Ｙｉｌｄｉｒｉｍ，Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｒ．Ｌｏｈｍａｎ，Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｔ．Ｔｒａｎ，Ｐ．Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．Ｃ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，９，５３８−５５０。

［２］Ｊ．Ｌ．Ｂａｎｋｓ，Ｈ．Ｓ．Ｂｅａｒｄ，Ｙ．Ｃａｏ，Ａ．Ｅ．Ｃｈｏ，Ｗ．Ｄａｍｍ，Ｒ．Ｆａｒｉｄ，Ａ．Ｋ．Ｆｅｌｔｓ，Ｔ．Ａ．Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｄ．Ｔ．Ｍａｉｎｚ，Ｊ．Ｒ．Ｍａｐｌｅ，Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｍ．Ｐｈｉｌｉｐｐ，Ｍ．Ｐ．Ｒｅｐａｓｋｙ，Ｌ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｂ．Ｊ．Ｂｅｒｎｅ，Ｒ．Ａ．Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｅ．Ｇａｌｌｉｃｃｈｉｏ，Ｒ．Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００５，２６，１７５２−１７８０。

［３］Ｋ．Ｊ．Ｂｏｗｅｒｓ，Ｅ．Ｃｈｏｗ，Ｈ．Ｘｕ，Ｒ．Ｏ．Ｄｒｏｒ，Ｍ．Ｐ．Ｅａｓｔｗｏｏｄ，Ｂ．Ａ．Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｋｌｅｐｅｉｓ，Ｉ．Ｋｏｌｏｓｓｖａｒｙ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｒａｅｓ，Ｆ．Ｄ．Ｓａｃｅｒｄｏｔｉ，Ｊ．Ｋ．Ｓａｌｍｏｎ，Ｙ．Ｓｈａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＭ／ＩＥＥＥ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ＳＣ０６），Ｔａｍｐａ，ＦＬ ２００６。

［４］Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，２８５３−２８５５。

［５］Ｃ．Ｆｕｇｉｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｙ．Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｖ．Ｔｏｓｃｈ，Ａ．Ｖｉｇｎａｕｄ，Ａ．Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．Ｍｅｓｓａｄｄｅｑ，Ｙ．Ｋｏｋｕｎａｉ，Ｒ．Ｔｓｕｂｕｒａｙａ，Ｐ．ｄｅ ｌａ Ｇｒａｎｇｅ，Ｄ．Ｄｅｍｂｅｌｅ，Ｖ．Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｇ．Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔ，Ｃ．Ｂｏｕｌａｄｅ−Ｌａｄａｍｅ，Ｍ．Ｃ．Ｈｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ｄｅ Ｍｕｎａｉｎ，Ｎ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ，Ａ．Ｌａｑｕｅｒｒｉｅｒｅ，Ｃ．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｆ．Ｄｅｒｙｃｋｅｒｅ，Ｄ．Ａｕｂｏｅｕｆ，Ｌ．Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｕｄｄ，Ｂ．Ｓｃｈｏｓｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｇ．Ｂａｓｓｅｚ，Ｊ．Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｄ．Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｎ．Ｃｈａｒｌｅｔ−Ｂｅｒｇｕｅｒａｎｄ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１，１７，７２０−７２５。

［６］Ｍ．Ｂ．Ｗａｒｆ，Ｍ．Ｎａｋａｍｏｒｉ，Ｃ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｃ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００９，１０６，１８５５１−１８５５６。

［７］Ｙ．Ｋ．Ｈｏ，Ｗ．Ｔ．Ｘｕ，Ｈ．Ｐ．Ｔｏｏ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１３，８，ｅ７２４６３。

［８］Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，Ｌｏｇｉｇｉａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｌ．，ＭｃＣｌａｉｎ，Ｃ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｒｙｍ，Ｍ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０００）Ｍｙｏｔｏｎｉｃｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＵＧ ｒｅｐｅａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１７６９−１７７３。

［９］Ｈｏｌｔ，Ｉ．；Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．；Ｆｕｒｌｉｎｇ，Ｄ．；Ｂｕｔｌｅｒ−Ｂｒｏｗｎｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｄａｖｉｄ Ｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅ．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２００７，１２，１０３５。

［１０］Ｃｈｉｌｄｓ−Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．；Ｒｚｕｃｚｅｋ，Ｓ．Ｇ．；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．；Ｄｉｓｎｅｙ，Ｍ．Ｄ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２。

本発明は、当業者がそれを作製し使用するように十分に詳細に記載および例証されているが、特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱しない様々な代替形態、変更形態、および改良形態が当業者には明らかであろう。

本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が参照によりその全文が援用されると具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。

用いられている用語および表現は、記述の用語として使用されており、制限の用語として使用されているものではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載される特徴またはその一部分の等価物を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが理解される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の変更および改変が当業者によってなされてよく、そのような変更および改変は添付される特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内にあるとみなされることは当然理解される。

[項目１]
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡの機能のモジュレーターであって、前記ＲＮＡが伸長したリピート配列を含み、前記モジュレーターが、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、アルキンとアジドの両方の部分を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合反応から、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合から、生細胞内でインサイチュで形成されるＲＮＡに結合するオリゴマーであり、前記縮合反応が、前記ＲＮＡ伸長リピート結合モジュール間で前記アルキン部分とアジド部分との間の１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応によって起こる、ＲＮＡに結合するオリゴマーを含む、モジュレーター。
[項目２]
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐによって形成される隣接する内部ループを含む、項目１に記載のモジュレーター。
[項目３]
各々の細胞透過性モジュールが、修飾されたカナマイシン部分を含む、項目２に記載のモジュレーター。
[項目４]
前記細胞透過性モジュールがＮ_３−Ｋ−Ａｋ、またはＮ_３−Ｋ−ＡａＫであるか、あるいは、一緒に使用される一対の細胞透過性モジュールがＮ_３−ＫとＫ−Ａｋである、項目３に記載のモジュレーター。
[項目５]
筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）の処置のための項目２〜４のいずれか１項に記載のモジュレーター。
[項目６]
前記毒性のあるＲＮＡと結合した項目２に記載のモジュレーターを形成する方法であって、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透過性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮＡを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
[項目１０]
前記毒性のあるＲＮＡが、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐによって形成される隣接する内部ループを含む、項目１に記載のモジュレーター。
[項目１１]
各々の細胞透過性モジュールが、ビス−ヘテロアリール部分、好ましくはビス−ベンズイミダゾール部分を含む、項目１０に記載のモジュレーター。
[項目１２]
前記細胞透過性モジュールが、Ｎ_３−２Ｈ−Ｋ４ＮＭｅＳ−Ａａｋである、項目１１に記載のモジュレーター。
[項目１３]
筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の処置のための、項目１０〜１２のいずれか一項に記載のモジュレーター。
[項目１４]
前記毒性のあるＲＮＡと結合した項目１１に記載のモジュレーターを形成する方法であって、一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、前記細胞透過性モジュールがアルキン部分とアジド部分の両方を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、または、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮＡを含む前記生細胞を曝露する工程を含む、方法。
[項目１５]
毒性のある疾患誘導性ＲＮＡを切断する方法であって、前記ＲＮＡが伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、核酸切断部分をさらに含む、項目１〜４または１０〜１２のいずれか１項に記載のモジュレーターを含む、方法。
[項目１６]
前記核酸切断部分がブレオマイシンの誘導体である、項目１５に記載の方法。
[項目１７]
患者において疾患を処置する方法であって、前記疾患が伸長リピート配列を有する毒性のあるＲＮＡの存在下で誘導され、前記患者の細胞の中に項目１に記載のモジュレーターを形成することを含む、方法。
[項目１８]
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）であり、前記毒性のあるＲＮＡがｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよびアジド基を有するカナマイシン誘導体を含む細胞透過性モジュール、または、各々がカナマイシン誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモジュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュールからインサイチュで形成される、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
前記疾患が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、前記毒性のあるＲＮＡがまたはｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ伸長リピート配列を含み、前記モジュレーターが、アルキンおよびアジド基を有する１つの細胞透過性モジュール、または、各々がビス−ベンズイミダゾール誘導体を含む第１および第２のモジュールであって、アルキン基を有する第１のモジュール、およびアジド基を有する第２のモジュールを含む一対の細胞透過性モジュールからインサイチュで形成される、項目１７に記載の方法。
[項目２０]
前記モジュレーターが核酸切断部分をさらに含む、項目１８または１９に記載の方法。

Claims (6)

1. 一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールまたは一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールを含む医薬組成物であって、
   前記モジュールは患者の細胞中で、毒性のある疾患誘導性ＲＮＡの機能のモジュレーターを形成し、
   前記疾患が、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）または筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、
   前記ＲＮＡが、各々、ＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐまたはＲＮＡ伸長リピート配列ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐによって形成される隣接する内部ループを含む、伸長したリピート配列を含み、
   前記モジュレーターが、前記一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、アルキンとアジドの両方の部分を含む、細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合反応から、または、前記一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールであって、第１のモジュールがアルキン部分を含み、第２のモジュールがアジド部分を含む、一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールの縮合反応から、生細胞内でインサイチュで形成されるＲＮＡに結合するオリゴマーを含み、
   前記縮合反応が、前記ＲＮＡ伸長リピートに結合したモジュール間で前記アルキン部分とアジド部分との間の１，３ヒュスゲン双極子付加環化反応によって起こり、
   前記細胞透過性モジュールが下記式で表されるＮ_３−Ｋ−Ａｋ、
   

   

   
   または下記式で表されるＮ_３−Ｋ−ＡａＫ
   

   

   
   であるか、
   あるいは、一緒に使用される一対の細胞透過性モジュールが下記式で表されるＮ_３−Ｋ
   

   

   
   と下記式で表されるＫ−Ａｋ
   

   

   
   である、前記医薬組成物。
2. 請求項１に記載の医薬組成物であって、
   請求項１に記載の前記一つの細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、または、請求項１に記載の前記一対の細胞透過性ＲＮＡ伸長リピート配列結合モジュールに、前記毒性のあるＲＮＡを含む前記生細胞を曝露することにより、前記毒性のあるＲＮＡと結合した請求項１に記載の前記モジュレーターを形成するための前記医薬組成物。
3. 毒性のある疾患誘導性ＲＮＡを切断するための請求項１に記載の医薬組成物であって、
   前記ＲＮＡが伸長リピート配列を含み、
   前記モジュレーターが、核酸切断部分をさらに含む、前記医薬組成物。
4. 前記核酸切断部分がブレオマイシンの誘導体である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. ｒ（ＣＣＵＧ）^ｅｘｐ伸長リピート配列を含む毒性のあるＲＮＡの存在下で誘導される筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、または、ｒ（ＣＵＧ）^ｅｘｐ伸長リピート配列を含む毒性のあるＲＮＡの存在下で誘導される筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を患者において処置するための、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記モジュレーターが核酸切断部分をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。

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