JP2007105044A - 治療薬としての修飾ペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】Ｆｃドメインと生物学的活性なペプチドの融合及び生物学的に活性なペプチドを使用して薬剤を製造する方法の提供。
【解決手段】対象とするタンパク質（Ａｎｇ−２）の活性を変化させる少なくとも１個のペプチドを選択し、選択したペプチドの少なくとも１個のアミノ酸に共有結合されたＦｃドメインを含む薬理学的物質の製造。ビヒクルへＦｃドメインの結合は、インビボで速やかに分解されるであろうペプチドの半減期を高める。ペプチドは、好ましくはファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、又は化学物質−ペプチドスクリーニングによって選択される。
【選択図】なし

Description

発明の背景
組換えタンパク質は最近出現してきた治療薬のクラスのひとつである。かかる組換え治療は、タンパク質の生成と化学修飾における進歩をもたらした。そのような修飾は、主としてタンパク質分解酵素への接触を遮断することにより、治療タンパク質を保護することができる。タンパク質の修飾はまた、治療タンパク質の安定性、循環時間及び生物活性を高めることもできる。タンパク質修飾と融合タンパク質を述べた総説論文が、参照してここに組み込まれる、Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）、成長因子への注目（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）、３：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｌｏｎｄｏｎ）である。

１つの有用な修飾は、抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組合せである。抗体は２つの機能的に独立した部分、すなわち抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変領域と、食細胞による補体活性化と攻撃の際にそのようなエフェクター機能と結合する、「Ｆｃ」として知られる定常領域を含む。Ｆｃは長い血清半減期を持つのに対し、Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と共に構築すると、Ｆｃドメインはより長い半減期を提供する、若しくはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定、さらにはおそらく胎盤移動のような機能も組み込むことができる。同上。表１は当技術において既知のＦｃ融合の使用をまとめたものである。

治療薬の開発のための全く異なるアプローチがペプチドライブラリーのスクリーニングである。タンパク質リガンドとその受容体の相互作用はしばしば比較的大きな界面で起こる。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して明らかにされたように、界面のいくつかの鍵となる残基だけが結合エネルギーの大半に寄与する、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：３８３−６。タンパク質リガンドのバルクは単に正しいトポロジーで結合エピトープを発現するか、若しくは結合には関係しない機能として働く。それ故、「ペプチド」の長さ（２−４０個のアミノ酸）の分子だけが一定の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。そのようなペプチドは、大タンパク質リガンドの生物活性を擬似する（「ペプチド作用物質」）、若しくは競合的結合を通して、大タンパク質リガンドの生物活性を阻害する（「ペプチド拮抗物質」）ことができる。

ファージディスプレイペプチドライブラリーは、そのようなペプチド作用物質と拮抗物質を同定する強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日発行の米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日発行の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日発行の米国特許第５，３３，６６５号；１９９９年７月１３日発行の米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開のＷＯ ９６／４０９８７号；及び１９９８年４月１６日公開のＷＯ ９８／１５８３３号（その各々が参照してここに組み込まれる）参照。そのようなライブラリーにおいては、任意のペプチド配列が線状ファージのコートタンパク質との融合によって発現される。典型的には、発現されたペプチドを受容体の抗体固定された細胞外ドメインに対して親和溶出する。残ったファージを連続的な親和精製と再増殖によって濃縮してもよい。最良の結合ペプチドを配列決定して、１つ又はそれ以上の構造的に関連するペプチドのファミリー内でキー残基を同定することができる。例えば、２つの異なるファミリーが同定された、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９参照。ペプチド配列はまた、どの残基がアラニンスキャニングによって若しくはＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって安全に置換できるかを示唆しうる。突然変異誘発ライブラリーを創造し、スクリーニングして、最良のバインダーの配列をさらに至適化することができる。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４。

タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大タンパク質リガンドの結合活性を擬似するペプチドを示唆するために使用しうる。そのような分析では、結晶構造が、ペプチドが設計される大タンパク質リガンドの決定的残基の同一性と相対的方向性を示唆すると考えられる。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０参照。これらの分析法は、結合親和性を高めるためのペプチドのさらなる修飾を示唆しうる、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択したペプチド間の相互作用を検討するためにも使用できる。

その他にもペプチド研究においてファージディスプレイに匹敵する方法がある。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合し、大腸菌において発現することができる。もうひとつの大腸菌に基づく方法は、ペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により細胞の外膜に発現させる。本文中以下では、これら及び関連する方法を集合的に「大腸菌ディスプレイ」と称する。もうひとつの方法では、ランダムＲＮＡの翻訳をリボソーム放出の前に停止させ、関連ＲＮＡがまだ結合しているポリペプチドのライブラリーを作製する。本文中以下では、この方法及び関連する方法を集合的に「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を用いるものである：例えば、ＲｏｂｅｒｔｓとＳｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３参照。本文中以下では、この方法及び関連する方法を集合的に「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と称する。ペプチドがポリエチレンロッド又は溶媒透過性樹脂のような安定な非生物学的物質上に固定されている、化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発されている。もうひとつの化学的に誘導されるペプチドライブラリーは、写真平板印刷を用いてガラススライド上に固定されたペプチドを走査する。本文中以下では、これら及び関連する方法を集合的に「化学物質−ペプチドスクリーニング」と称する。化学物質−ペプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸及び他の非天然類似体、ならびに非ペプチド要素を使用できるという点で有利であると考えられる。生物学的方法と化学的方法の両方が、ＷｅｌｌｓとＬｏｗｍａｎ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５−６２の中で考察されている。

概念的には、ファージディスプレイや上述したその他の方法を用いてどのようなタンパク質のペプチド擬似も発見しうる。これらの方法は、エピトープマッピングのため、タンパク質−タンパク質相互作用における決定的アミノ酸の同定のため、そして新しい治療薬発見のための先導役（ｌｅａｄ）として使用されてきた。例えばＣｏｒｔｅｓｅら（１９９６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１。現在、エピトープマッピングのような免疫学的試験においてはペプチドライブラリーが最も多く用いられている。Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９９６），Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）：１９−２０。

ここで特に興味深いのは、薬理学的に活性なペプチドの発見におけるペプチドライブラリー及びその他の手法の使用である。当技術において同定されたそのようなペプチドのいくつかを表２に要約する。ペプチドは列挙した公表文献中に記載されており、その各々が参照してここに組み込まれる。ペプチドの薬理学的活性を記述し、且つ多くの場合括弧内にその略語を示している。これらのペプチドの一部は修飾されている（例えば、Ｃ末端架橋二量体を形成するため）。典型的には、薬理学的に活性なタンパク質の受容体（例えばＥＰＯ受容体）への結合に関してペプチドライブラリーをスクリーニングした。少なくとも１つの場合には、モノクローナル抗体への結合に関してペプチドライブラリーをスクリーニングした。

ペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定されたペプチドは治療薬そのものではなく、治療薬の開発における「先導役（ｌｅａｄ）」とみなされてきた。他のタンパク質やペプチドと同様に、それらは腎濾過、細網内皮系における細胞クリアランス機序、又はタンパク質分解のいずれかによってインビボで速やかに除去されるであろう。Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）、成長因子への注目（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ） ３：４−１１。結果として、当技術は現在、同定されたペプチドを、薬剤標的を確認するため、又は化学的ライブラリースクリーニングではそれほど容易に又はそれほど速やかに同定されなかったであろう有機化合物の設計のための足場として使用している。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４；Ｋａｙら（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８。当技術は、そのようなペプチドが治療薬をより速やかに生み出すことができる方法から恩恵を受けるであろう。

発明の要旨
本発明は、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）との融合により、１つ又はそれ以上の生物学的に活性なペプチドのインビボ半減期を延長させる方法に関する。本発明では、薬理学的に活性な化合物を：
ａ）対象とするタンパク質の活性を変化させる少なくとも１個のペプチドを選択し、そして
ｂ）選択したペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に共有結合された少なくとも１つのビヒクルを含む薬理学的物質を調製する
ことを含む方法によって調製する。好ましいビヒクルはＦｃドメインである。ステップ（ａ）でスクリーニングしたペプチドを、好ましくはファージディスプレイライブラリーにおいて発現させる。ビヒクルとペプチドは、下記でさらに述べるように、ペプチド又はビヒクルのＮ又はＣ末端を通して結合しうる。上記化合物の誘導体（下記に述べる）も本発明に包含される。

本発明の化合物は、標準的合成法、組換えＤＮＡ手法、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他のなんらかの方法によって調製しうる。非ペプチド部分を含む本発明の化合物は、適用しうる場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的有機化学反応によって合成しうる。

期待される主たる用途は治療又は予防薬としてである。ビヒクル結合ペプチドは、ペプチドによって擬似される天然リガンドと同等、あるいはさらにそれ以上の活性を持つと考えられる。さらに、一部の天然リガンドベースの治療薬は患者自身の内因性リガンドに対する抗体を誘導しうる；ビヒクル結合ペプチドは、天然リガンドとほとんど又は典型的には全く配列同一性を持たないため、この問題を回避する。

主に治療薬として想定されるが、本発明の化合物はまた、そのような薬剤のスクリーニングにおいても有用であると考えられる。例えば、抗Ｆｃ被覆プレートを用いるアッセイにおいてＦｃペプチド（例えば、Ｆｃ−ＳＨ２ドメインペプチド）が使用できるであろう。ビヒクル、特にＦｃは、不溶性ペプチドを可溶性にすることができ、それ故多くのアッセイにおいて有用である。

本発明の化合物は、適当な製薬上のキャリア物質と共に製剤し、その必要のあるヒト（あるいは他の哺乳類）などの患者に有効量を投与することにより、治療又は予防目的に使用しうる。他の関連する態様も本発明に包含される。

図面と発明の詳細な説明を検討することにより、本発明の数多くの追加的態様と利点が明らかになるであろう。

図面の簡単な説明
図１は、本発明の例示的方法の概要図を示す。この好ましい方法では、ビヒクルはＦｃドメインであり、それがＦｃドメインとペプチドの両方をコードするＤＮＡ構築物からの発現によってペプチドに共有結合する。図１に示すように、Ｆｃドメインはこの方法において自発的に二量体を形成する。

図２は、ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである：
Ａ、Ｄ：一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域と可変領域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと２ＤにおけるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、若しくは非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によって形成されうる。図２ＡではＦｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合しており、２Ｄではカルボキシル末端で結合している。

Ｂ、Ｅ：二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖中の両方のシステイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、若しくはそのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成されうる。図２ＢではＦｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合しており、２Ｅではカルボキシル末端で結合している。

Ｃ、Ｆ：非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステイニル残基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に存在する他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成されるのを避けるため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆｃドメインの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより、他の二量体を形成することができる。

図３は、薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好ましい化合物の構造を示す。図３Ａは一本鎖の分子を示し、またかかる分子に関するＤＮＡ構築物も表わしうる。図３Ｂは、リンカー−ペプチド部分が二量体の１本の鎖にだけ存在する二量体を示す。図３Ｃは、両方の鎖上にペプチド部分を持つ二量体を示す。図３Ｃの二量体は、図３Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡ構築物の発現の際に一部の宿主細胞において自発的に形成される。他の宿主細胞では、細胞を二量体の形成を促進する条件下に置くか、若しくは二量体をインビトロで形成することができる。

図４は、本発明において使用しうるヒトＩｇＧ１ Ｆｃの例示的核酸及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。

図５は、ＰＥＧ化ペプチド１９（配列番号３）の製造のための合成概要図を示す。

図６は、ＰＥＧ化ペプチド２０（配列番号４）の製造のための合成概要図を示す。

図７は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号５及び６）を示す。

図８は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号７及び８）を示す。

図９は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号９及び１０）を示す。

図１０は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１及び１２）を示す。

図１１は、次のように定義される条件下で、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成される血小板数を示す。

ＰＥＧ−ＭＧＤＦ：大腸菌において発現される（従ってグリコシル化されていない）、還元的アミノ化によって天然ヒトＴＰＯのアミノ酸１−１６３のＮ末端アミノ基に連結した平均分子量２０ｋＤのＰＥＧ、
ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１３）を持つＴＰＯ擬似ペプチド、
ＴＭＰ−ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ−ＧＧＧＧＧＧＧＧ−ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１４）を持つＴＰＯ擬似ペプチド、
ＰＥＧ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：ＰＥＧ基が図６に示すような平均分子量５ｋＤのＰＥＧである、配列番号１４のペプチド、
Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図２に示すように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に結合して二量体を形成する）配列番号８（図８）の化合物、そして
ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＴＭＰ−ＴＭＰペプチドのＮ末端ではなくＣ末端で結合していることを除いて、ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃと同じように二量体化された配列番号１０（図９）の化合物である。

図１２は、移植した浸透圧ポンプを通して送達される種々の化合物で７日間にわたって処置した正常ＢＤＦ１マウスにおいて、インビボで生成された血小板の数を示す。化合物は図７について定義されたとおりである。

図１３は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５及び１６）を示す。

図１４は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７及び１８）を示す。

図１５は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９及び２０）を示す。

図１６は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１及び２２）を示す。

図１７Ａと１７Ｂは、発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９８１１３）を形成するためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４位）とＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入されるＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。

図１８Ａは、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘモグロビン、赤血球及びヘマトクリットを示す。図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／ｋｇ／日で処置したマウスについての同じ結果を示す。（両方の実験において、好中球、リンパ球及び血小板は影響を受けなかった。）これらの図において、用語は次のように定義される。

Ｆｃ−ＥＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図２に示すように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に結合して二量体を形成する）配列番号１６（図１３）の化合物、
ＥＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＥＭＰペプチドのＮ末端ではなくＣ末端で結合していることを除いて、Ｆｃ−ＥＭＰと同じように二量体化された配列番号１８（図１４）の化合物。

「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」は、ペプチドのカルボキシル末端により同じＦｃドメインに結合された同じペプチド（配列番号２０）のタンデムリピートを指す。「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」は、同じペプチドのタンデムリピートであるが、同じＦｃドメインがタンデムリピートのアミノ末端で結合しているものを指す。すべての分子は大腸菌において発現され、従ってグリコシル化されていない。

図１９Ａと１９Ｂは、下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す。

図２０Ａと２０Ｂは、下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す。

図２１Ａと２１Ｂは、下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。

図２２Ａと２２Ｂは、下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。

図２３Ａ及び２３Ｂは、下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。

図２４Ａと２４Ｂは、下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。

図２５Ａと２５Ｂは、下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。

図２６Ａと２６Ｂは、下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。

発明の詳細な説明
用語の定義
この明細書を通じて使用される用語は、特定の場合に限って異なる記載がないかぎり、下記のように定義される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、化合物が所与の配列のＮ又はＣ末端のいずれか又は両方に付加的なアミノ酸を含みうることを意味する。言うまでもなく、これらの付加的なアミノ酸は化合物の活性に有意に干渉してはならない。

「ビヒクル」（ｖｅｈｉｃｌｅ）という用語は、治療タンパク質の分解を妨げる及び／又は半減期を延長させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、若しくは生物活性を高める分子を指す。例示的なビヒクルは、Ｆｃドメイン（好ましい）ならびに線状ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストラン等）；分枝ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらへの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍへの同第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ ９３／２１２５９号参照）；脂質；コレステロール群（ステロイドなど）；炭水化物又はオリゴ糖；あるいはサルベージ受容体に結合する天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを含む。ビヒクルは下記でさらに詳述する。

「天然Ｆｃ」という用語は、モノマー又はマルチマーの形態の、全抗体の消化から生じる非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を指す。天然Ｆｃの最初の免疫グロブリンソースは好ましくはヒト由来であり、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましいが、どのような免疫グロブリンであってもよい。天然Ｆｃは、共有（すなわちジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又はマルチマーに連結されうるモノマーポリペプチドから作製される。天然Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）によって１から４の範囲である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。ここで使用する「天然Ｆｃ」という用語は、モノマー、二量体及びマルチマー形態の総称名である。

「Ｆｃ変異体」という用語は、天然Ｆｃから改変されているが、まだサルベージ受容体、ＦｃＲｎについての結合部位を含んでいる分子又は配列を指す。国際特許願ＷＯ ９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ ９６／３２４７８号は例示的なＦｃ変異体ならびにサルベージ受容体との相互作用を述べており、参照してここに組み込まれる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子には必要とされない構造的特徴又は生物活性を提供するので、除去しうる部位を含んでいる。それ故、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択した宿主細胞との不適合性、（３）選択宿主細胞において発現される際のＮ末端の異質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、あるいは（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響する又は関与する１つ又はそれ以上の天然Ｆｃ部位又は残基を欠く分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体は下記でさらに詳述する。

「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義したような天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃの場合と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されるか若しくは他の手段によって産生される、モノマー又はマルチマー形態の分子を含む。

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるとき「マルチマー（多量体）」という用語は、共有結合、非共有結合、又は共有結合と非共有結合の相互作用によって連結された２本又はそれ以上のポリペプチド鎖を持つ分子を指す。ＩｇＧ分子は典型的には二量体を形成する；ＩｇＭはペンタマー（五量体）；ＩｇＤは二量体；ＩｇＡはモノマー、二量体、トリマー（三量体）又はテトラマー（四量体）を形成する。マルチマーは、Ｆｃの天然Ｉｇソースの配列と生じる活性を利用することにより、若しくはそのような天然Ｆｃを誘導体化する（下記に定義する）ことにより、形成されうる。

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるとき「二量体」という用語は、共有結合又は非共有結合によって連結された２本のポリペプチド鎖を持つ分子を指す。それ故、本発明の範囲内に含まれる例示的二量体は図２に示すとおりである。

「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、それぞれ（１）化合物が環状部分を持つ；例えば、化合物内でのシステイニル残基間の架橋；（２）化合物が架橋結合している又は架橋部位を持つ；例えば、化合物がシステイニル残基を持ち、従って培養又はインビボにおいて架橋二量体を形成する；（３）１つ又はそれ以上のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置換されている；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ^１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシニミド基、あるいは置換された又は置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−、［式中、ＲとＲ１及び環置換基は下記で定義するとおりである］によって置換されている；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２又は−ＮＲ^３Ｒ^４［式中、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は下記で定義するとおりである］によって置換されている；そして（６）個々のアミノ酸部分が、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる物質での処理を通して修飾されている化合物であるような方法及び生じる化合物を含む。誘導体は下記でさらに詳述する。

「ペプチド」という用語は、２から４０個のアミノ酸の分子を指し、３から２０個のアミノ酸の分子が好ましく、６から１５個のアミノ酸の分子が最も好ましい。例示的ペプチドは、ペプチドライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）において実施される、上記に引用した方法のいずれかによってランダムに生成するか、若しくはタンパク質の消化によって誘導されうる。

ペプチド配列を指すために使用するときの「ランダム化された」という用語は、完全にランダムな配列（例えばファージディスプレイライブラリーによって選択される）及び天然に生じる分子の１個又はそれ以上の残基が、天然に生じる分子ではその位置に出現しないアミノ酸残基によって置換されている配列を指す。ペプチド配列を同定するための例示的方法は、ファージディスプレイ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング等を含む。

「薬理学的に活性な」という用語は、そのように説明される物質が、医学的パラメータ（例えば血圧、血球数、コレステロールレベル）又は疾患状態（例えば癌、自己免疫疾患）に影響を及ぼす活性を持つことが明らかにされていることを意味する。従って、薬理学的に活性なペプチドは、下記に定義するような作用性又は擬似及び拮抗性ペプチドを含む。

「−擬似ペプチド」及び「−作用物質ペプチド」という用語は、対象とするタンパク質と相互作用するタンパク質（例えばＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ）と同等の生物活性を持つペプチドを指す。これらの語はさらに、対象とするタンパク質の天然リガンドの作用を増強することによるような、対象タンパク質の活性を間接的に擬似するペプチドを含む；例えば、表２及び７に列挙したＧ−ＣＳＦ擬似ペプチド参照。従って、「ＥＰＯ擬似ペプチド」という用語は、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−６３，Ｎａｒａｎｄａら（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７５６９−７４、若しくはＥＰＯ擬似を取り上げていると同定された表２の他の参考文献に記述されているように同定する又は誘導することができるいかなるペプチドも含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「ＴＰＯ擬似ペプチド」という用語は、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９、米国特許第５，８６９，４５１号、同第５，９３２，９４６号、及びＴＰＯ擬似を取り上げていると同定された表２の他の参考文献、ならびに本願と同日に出願され、参照してここに組み込まれる米国特許願、「血小板形成性化合物（Ｔｈｒｏｍｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）に記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「Ｇ−ＣＳＦ擬似ペプチド」という用語は、Ｐａｕｋｏｖｉｔｓら（１９８４），Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５：３０３−１１又はＧ−ＣＳＦ擬似を取り上げていると同定された表２の参考文献のいずれかにおいて同定されうる又は説明されうるペプチドを指す。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「ＣＴＬＡ４擬似ペプチド」という用語は、Ｆｕｋｕｍｏｔｏら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：２６７−７０において記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを指す。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「−拮抗物質ペプチド」又は「阻害因子ペプチド」という用語は、対象とする関連タンパク質の生物活性を遮断する又はなんらかの方法で生物活性に干渉する、若しくは対象とする関連タンパク質の既知の拮抗物質又は阻害因子と同等の生物活性を持つペプチドを指す。従って、「ＴＮＦ拮抗物質ペプチド」という用語は、Ｔａｋａｓａｋｉら（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０又はＴＮＦ拮抗物質を取り上げている同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「ＩＬ−１拮抗物質」及び「ＩＬ−１ｒａ擬似ペプチド」という用語は、ＩＬ−１によるＩＬ−１受容体の活性化を阻害する又は下方調節するペプチドを含む。ＩＬ−１受容体の活性化は、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１受容体補助タンパク質の間で複合体が形成されることから生じる。ＩＬ−１拮抗物質又はＩＬ−１ｒａ擬似ペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体又はＩＬ−１受容体補助タンパク質に結合して、複合体の２つ又は３つの成分間での複合体形成を妨げる。例示的なＩＬ−１拮抗物質又はＩＬ−１ｒａ擬似ペプチドは、米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号、同第５，８８０，０９６号、又はＩＬ−１ｒａ擬似又はＩＬ−１拮抗物質ペプチドを取り上げている同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導することができる。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「ＶＥＧＦ拮抗物質ペプチド」という用語は、Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ（１９９８），Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１７７５４−６４、及びＶＥＧＦ拮抗物質ペプチドを取り上げていると同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

「ＭＭＰ阻害因子ペプチド」という用語は、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７６８−７４、及びＭＭＰ阻害因子ペプチドを取り上げていると同定された表２の参考文献のいずれかにおいて記述されているように同定する又は誘導することができるペプチドを含む。当業者には、これらの参考文献の各々により、種々のペプチドライブラリーに関して開示されている手順に従ってその中で実際に開示されている以外の異なるペプチドを選択しうることは明白である。

さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩もここに包含される。「生理的に許容される塩」とは、製薬上許容されることが知られている又は今後発見される、いかなる塩も意味する。一部の特定例は：酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩及び臭化水素酸塩のようなヒドロハロゲン化物；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；及びシュウ酸塩である。

化合物の構造
全般。本発明に従って製造される物質の組成物においては、ペプチドのＮ末端又はＣ末端を通してペプチドをビヒクルに連結することができる。従って、本発明のビヒクル−ペプチド分子は次の式Ｉ：
（Ｘ^１）_ａ−Ｆ^１（Ｘ^２）_ｂ
［式中、Ｆ^１はビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり、
Ｘ^１及びＸ^２は、各々独立に−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３、及び−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４から選択され、
Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々独立に薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３及びＬ^４は各々独立にリンカーであり、そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件として、各々独立に０又は１である］
によって表わすことができる。

従って、化合物Ｉは式ＩＩ：
Ｘ^１−Ｆ^１
及びそのマルチマー［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、Ｘ^１のＣ末端で結合している］、式ＩＩＩ：
Ｆ^１−Ｘ^２
及びそのマルチマー［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、Ｘ^２のＮ末端で結合している］、式ＩＶ：
Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１
及びそのマルチマー［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１のＮ末端で結合している］、式Ｖ
Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２
及びそのマルチマー［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、−Ｌ^１−Ｐ^１−Ｌ^２−Ｐ^２のＮ末端で結合している］
の好ましい化合物を含む。

ペプチド。本発明と組み合わせてどのような数のペプチドも使用しうる。特に興味深いのは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ｒａ、レプチン、ＣＴＬＡ４、ＴＲＡＩＬ、ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−βの活性を擬似するペプチドである。ペプチド拮抗物質、特にＴＮＦ、レプチン、インターロイキンのいずれか（ＩＬ−１、２、３、…）、及び補体活性化に関与するタンパク質（例えばＣ３ｂ）の活性に拮抗するものも興味深い。腫瘍誘導（ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ）ペプチド、膜輸送ペプチド等を含めた標的ペプチドも興味深い。これらのクラスのペプチドすべてが本明細書で引用する参考文献及び他の参考文献において記述されている方法によって発見されうる。

ファージディスプレイは、特に、本発明において使用するためのペプチドを生成するのに有用である。ランダムペプチドのライブラリーからのアフィニティー選択を使用して、遺伝子産物の部位に関するペプチドリガンドを同定できることが記述されている。Ｄｅｄｍａｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体のような対象タンパク質又は線状エピトープを持つなんらかのタンパク質に結合するペプチドを同定するために特に適している。Ｗｉｌｓｏｎら（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙら（１９９８），Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ３：３７０−８。そのようなタンパク質は、参照してここに組み込まれる、Ｈｅｉｚら（１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ．１７（５）：６７１−７７６の中で広汎に検討されている。そのような対象タンパク質は本発明における使用のために好ましい。

特に好ましいペプチド群は、サイトカイン受容体に結合するものである。サイトカインは最近それらの受容体コードに従って分類された。参照してここに組み込まれる、Ｉｎｇｌｏｔ（１９９７），Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５：３５３−７参照。これらの受容体の中で、最も好ましいのはＣＫＲｓ（表３のＩファミリー）である。受容体分類を表３に示す。

本発明に関する例示的ペプチドを下記の表４から２０に示す。これらのペプチドは当技術において開示されている方法によって調製しうる。１文字のアミノ酸略語を使用している。これらの配列中（及び特定の場合に異なる記載がないかぎり、本明細書全体を通じて）のＸは、２０個の天然に生じるアミノ酸残基のいずれかが存在することを意味する。これらのペプチドにいずれも、リンカーにより又はリンカーなしで、タンデムに（すなわち連続的に）連結することができ、いくつかのタンデム結合例を表に示している。リンカーは「Λ」として列挙しており、ここで述べるリンカーのいずれでもよい。タンデムリピートとリンカーは、明瞭化のためダッシュで分けて示している。システイニル残基を含むいずれのペプチドも、もうひとつのＣｙｓ含有ペプチドと架橋することができ、ペプチドの一方又は両方がビヒクルに連結されていてもよい。いくつかの架橋例を表に示している。１個以上のＣｙｓ残基を持つペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合を形成することもできる；例えば、表５のＥＰＯ擬似ペプチド参照。ペプチド内ジスルフィド結合したペプチドのいくつかの例が表に記載されている。これらのペプチドのいずれもがここで述べたように誘導体化することができ、いくつかの誘導体化した例を表に示している。関連する非誘導体化ペプチドも本発明において使用できるので、表中の誘導体化ペプチドは限定ではなく例示である。カルボキシル末端をアミノ基でキャップすることができる誘導体に関しては、キャップアミノ基を−ＮＨ_２として示している。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の成分で置換されている誘導体については、置換基をσで表わしており、σは、参照してここに組み込まれる、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら（１９９７），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２に述べられている成分のいずれかを意味する。Ｊ置換基とＺ置換基（Ｚ_５、Ｚ_６、…Ｚ_４０）は、参照してここに組み込まれる米国特許第５，６０８，０３５号、同第５，７８６，３３１号及び同第５，８８０，０９６号で定義されているとおりである。ＥＰＯ擬似配列（表５）に関しては、置換基Ｘ^２からＸ^１１まで及び整数「ｎ」は、参照してここに組み込まれるＷＯ ９６／４０７７２号に定義されているとおりである。置換基「Ψ」、「Θ」、及び「＋」は、参照してここに組み込まれる、Ｓｐａｒｋｓら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１５４０−４に定義されているとおりである。Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＸ７は、インテグリン結合ペプチドに関して、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７及びＸ_８が、参照してここに組み込まれる１９９５年６月１日公開の国際特許願ＷＯ ９５／１４７１４号及び１９９７年３月６日公開のＷＯ ９７／０８２０３号に定義されているとおりであり、ＶＩＰ擬似ペプチドに関して、Ｘ_１、Ｘ_１’、Ｘ_１”、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＺならびに整数ｍとｎが、参照してここに組み込まれる１９９７年１０月３０日公開のＷＯ ９７／４００７０号に定義されているとおりであることを除いて、やはり参照してここに組み込まれる米国特許第５，７７３，５６９号に定義されているとおりである。下記のＸａａ及びＹａａは、参照してここに組み込まれる１９９８年３月１２日公開のＷＯ ９８／０９９８５号に定義されているとおりである。ＡＡ_１、ＡＡ_２、ＡＢ_１、ＡＢ_２、及びＡＣは、参照してここに組み込まれる１９９８年１２月３日公開の国際特許願ＷＯ ９８／５３８４２号に定義されているとおりである。表１７中のＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、１９９９年４月２８日公開の欧州特許願ＥＰ ０ ９１１ ３９３号に定義されているとおりである。太字で表示されている残基はＤ−アミノ酸である。特に異なる記載がないかぎり、すべてのペプチドはペプチド結合を通して連結されている。略語は本明細書の末尾に列挙している。「配列番号」の欄において、「ＮＲ」は、所与の配列に関して配列リストの記載を必要としないことを意味する。

本発明はまた、次の治療において活性を持つペプチドに関して特に有用である：
・ペプチドがＶＥＧＦ擬似又はＶＥＧＦ受容体拮抗物質、ＨＥＲ２作用物質又は拮抗物質、ＣＤ２０拮抗物質等である場合には、癌、
・対象とするタンパク質がＣＫＲ３拮抗物質、ＩＬ−５受容体拮抗物質等である場合には、喘息、
・対象とするタンパク質がＧＰＩＩｂ拮抗物質、ＧＰＩＩＩａ拮抗物質等である場合には、血栓症、
・対象とするタンパク質がＩＬ−２受容体拮抗物質、ＣＤ４０作用物質又は拮抗物質、ＣＤ４０Ｌ作用物質又は拮抗物質、サイモポイエチン擬似等である場合には、自己免疫疾患及び免疫調節に関わる他の状態。

ビヒクル。本発明は、アミノ酸残基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を通してペプチドに結合された少なくとも１つのビヒクル（Ｆ^１、Ｆ^２）の存在を必要とする。多数のビヒクルも使用しうる；例えば、各々の末端のＦｃ、又は一方の末端のＦｃと他方の末端又は側鎖のＰＥＧ基。

Ｆｃドメインは好ましいビヒクルである。ＦｃドメインはペプチドのＮ又はＣ末端に、又はＮ末端とＣ末端の両方に融合することができる。ＴＰＯ擬似ペプチドに関しては、分子のペプチド部分のＮ末端に融合されたＦｃドメインを持つ分子は他のそのような融合よりも生物活性であり、従ってＮ末端への融合が好ましい。

上述したように、Ｆｃ変異体は本発明の範囲内での適切なビヒクルである。天然Ｆｃを、サルベージ受容体への結合が保持されることを条件として、本発明に従ったＦｃ変異体を形成するために広汎に改変することができる；例えば、ＷＯ ９７／３４６３１号及びＷＯ ９６／３２４７８号参照。そのようなＦｃ変異体では、本発明の融合分子が必要としない構造的特徴又は機能的活性を提供する天然Ｆｃの１つ又はそれ以上の部位を除去しうる。例えば、残基を置換する又は欠失させる、残基を当該部位に挿入する、若しくは当該部位を含む部分を切断することによってそれらの部位を除去することができる。挿入される又は置換される残基は、ペプチド擬似又はＤ−アミノ酸のような改変されたアミノ酸であってもよい。Ｆｃ変異体は多くの理由から望ましいと考えられ、その内のいくつかを下記に述べる。例示的なＦｃ変異体は、次のような分子及び配列を含む：
１．ジスルフィド結合の形成に関わる部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を生成するために使用する宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。このために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを切断するか、若しくはシステイン残基を欠失させる又は他のアミノ酸（例えばアラニル、セリル）で置換することができる。特に、配列番号２のＮ末端の２０アミノ酸セグメントを切断する、若しくは配列番号２の７及び１０位のシステイン残基を欠失させる又は置換することができる。システイン残基を除去したときでも、一本鎖Ｆｃドメインはまだ、非共有結合で結ばれた二量体Ｆｃドメインを形成することができる。
２．選択した宿主細胞とより適合性にするために天然Ｆｃが修飾されている。例えば、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌の消化酵素によって認識されうる、典型的天然ＦｃのＮ末端近くのＰＡ配列を除去することができる。また、特に分子が大腸菌のような細菌細胞において組換え発現されるときには、Ｎ末端のメチオニン残基を付加することもできる。配列番号２のＦｃドメイン（図４）はそのようなＦｃ変異体の１つである。
３．選択した宿主細胞において発現されたときのＮ末端の異質性を防ぐために、天然ＦｃのＮ末端の一部が除去されている。このために、Ｎ末端の最初の２０個のアミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び５位のアミノ酸残基を欠失させることができる。
４．１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的には、グリコシル化されている残基（例えばアスパラギン）は細胞溶解反応をもたらすと考えられる。そのような残基を欠失させる又はグリコシル化されていない残基（例えばアラニン）で置換することができる。
５．Ｃ１ｑ結合部位のような補体との相互作用に関わる部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させる又は置換することができる。補体の集積は本発明の分子にとって有利ではないと考えられ、それ故かかるＦｃ変異体によって回避することができる。
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Ｆｃは、本発明の融合分子にとって必要ではない特定の白血球と相互作用するための部位を持つと考えられ、それ故かかる部位を除去することができる。
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は当技術分野において既知である；ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関しては、例えばＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）参照。これらの部位も本発明の融合分子には必要なく、従って除去されうる。
８．天然Ｆｃがヒト以外の抗体から誘導されるときには、天然Ｆｃをヒト化することができる。典型的には、天然Ｆｃをヒト化するために、ヒト以外の天然Ｆｃ中の選択した残基をヒト天然Ｆｃにおいて通常認められる残基で置換する。抗体のヒト化のための手法は当技術において周知である。

好ましいＦｃ変異体は次のものを含む。配列番号２（図４）において、１５位のロイシンがグルタメートで置換されうる；９９位のグルタメートがアラニンで、１０１位と１０３位のリシンがアラニンで置換されうる。さらに、１個又はそれ以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置き換えることができる。

代替的なビヒクルは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、又はサルベージ受容体に結合することができる小分子（例えばペプチド擬似化合物）であろう。例えば、Ｐｒｅｓｔａらへの１９９８年４月１４日発行の米国特許第５，７３９，２７７号に述べられているようなポリペプチドがビヒクルとして使用できるであろう。ペプチドはまた、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合に関するファージディスプレイによって選択することもできる。そのようなサルベージ受容体結合化合物も「ビヒクル」の意味するものの中に含まれ、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を高め（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を避けることにより）、且つ免疫原性を低下させる（例えば、抗体のヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を促進することにより）ように選択すべきである。

上述したように、ポリマービヒクルもＦ^１及びＦ^２に関して使用しうる。現在、ビヒクルとして有用な化学成分を結合するために様々な手段が使用でき、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、「Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質組成物及び方法（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題されたＰａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（「ＰＣＴ」）の国際特許公開ＷＯ ９６／１１９５３号参照。このＰＣＴ特許公開は、特にタンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示している。

好ましいポリマービヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は好都合な分子量を持つことができ、線状又は分枝のいずれでもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａから約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は一般に、ＰＥＧ成分上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通して本発明の化合物上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ又はエステル基）にアシル化又は還元的アルキル化することにより、本発明の化合物に結合される。

合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中で共役結合を形成することを通して、各々が他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を担う、ペプチドとＰＥＧ成分を結合することから成る。ペプチドは従来の固相合成を用いて容易に調製できる（例えば、図５及び６と本文中の付随する説明参照）。ペプチドは、特定部位において適切な官能基で「前活性化」されている。ＰＥＧ成分と反応させる前に、前駆物質を精製し、十分に特性付ける。ペプチドとＰＥＧのライゲーションは通常水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは分取ＨＰＬＣによって容易に精製でき、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱着質量分析によって特徴付けることができる。

多糖類ポリマーはタンパク質修飾に使用できるもうひとつのタイプの水溶性ポリマーである。デキストランは、主としてα１−６結合によって連結されたグルコースの個々のサブユニットから成る多糖類ポリマーである。デキストラン自体は多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量のものが容易に入手できる。デキストランは、それ自体でビヒクルとして若しくはもうひとつ別のビヒクル（例えばＦｃ）との組合せで、本発明における使用に適した水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ ９６／１１９５３号及びＷＯ ９６／０５３０９号参照。治療用又は診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されている；例えば、参照してここに組み込まれる欧州特許公開０ ３１５ ４５６号参照。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして使用するときには、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。

リンカー。どのような「リンカー」基も任意である。存在するときには、主としてスペーサーとして働くため、その化学構造は絶対条件ではない。リンカーは、好ましくはペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸で作製される。従って、好ましい実施態様では、リンカーはペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸から作られ、かかるアミノ酸は２０個の天然に生じるアミノ酸から選択される。当業者には明らかに理解されるように、これらのアミノ酸の一部はグリコシル化されている場合もある。より好ましい実施態様では、１から２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリシンから選択される。さらに一層好ましくは、リンカーは、その大半がグリシンとアラニンのように立体障害とならないアミノ酸で作製される。それ故、好ましいリンカーはポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）_４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、及びポリアラニンである。リンカーの他の特定例は次のものである：
（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号３３３）、
（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号３３４）、
（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号３３５）、及び
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号３３６）。
上記の表記法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組合せも好ましい。ここに示すリンカーは例示である；本発明の範囲内のリンカーははるかに長い場合もあり、また他の残基を含みうる。

非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）−、［式中、ｓ＝２−２０］のようなアルキルリンカーが使用できるであろう。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（例えばＣ_１−Ｃ_６）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニル等のような立体障害とならない基によって置換されていてもよい。例示的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカー、

［式中、ｎは、リンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を持つ数である］
である。ペプチドリンカーは、上述したのと同じようにして誘導体を形成するように改変することができる。

誘導体。本発明者はまた、化合物のペプチド及び／又はビヒクル部分を誘導体化することを考慮している。そのような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期等を改善すると考えられる。当該物質は、その代わりに、化合物の好ましくない副作用等を排除する又は軽減する場合もある。例示的な誘導体は次のような化合物を含む：
１．化合物又はその一部が環状である。例えばペプチド部分が、ジスルフィド結合の形成によって環化しうる２個又はそれ以上のＣｙｓ残基を含む（例えばリンカー中に）ように修飾することができる。環化誘導体の調製に関する参考文献の引用については表２参照。

２．化合物が架橋している又は分子間で架橋できるようになっている。例えば、ペプチド部分を１個のＣｙｓ残基を含むように改変し、それによって同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。化合物はまた、下記に示す分子のように、そのＣ末端を通して架橋されていてもよい。

３．

４．１つ又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が非ペプチジル結合によって置換されている。例示的非ペプチジル結合は、−ＣＨ_２−カルバメート［−ＣＨ_２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ_２−スルホンアミド［−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ_２−第二アミン、及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、式中、Ｒ６は低級アルキルである］である。

５．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端をアシル化するか又は置換アミンに改変することができる。例示的なＮ末端誘導体基は、−ＮＲＲ^１（−ＮＨ_２−以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、スクシニミド、又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）、［式中、ＲとＲ^１は各々独立に水素又は低級アルキルであり、フェニル環はＣ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、クロロ、及びブロモから成る群から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい］を含む。

６．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端がエステル化又はアミド化されている。例えば、当技術において記述されている方法を用いて、Ｃ末端に配列番号５０４から５０８のいずれかを持つ本発明の化合物に（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）２を付加することができる。同様に、当技術において記述されている方法を用いて、Ｃ末端に配列番号９２４から９５５、９６３から９７２、１００５から１０１３、又は１０１８から１０２３のいずれかを持つ本発明の化合物に−ＮＨ_２を付加することができる。例示的なＣ末端誘導体基は、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２［式中、Ｒ^２は低級アルコキシである］、又は−ＮＲ^３Ｒ^４［式中、Ｒ３とＲ４は各々独立に水素又はＣ_１−Ｃ_８アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_４アルキル）である］を含む。

７．ジスルフィド結合がもうひとつ別の、好ましくはより安定な、架橋成分（例えばアルキレン）で置換されている。例えば。Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９９３），Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．３５７−９参照。

８．１個又はそれ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。下記に詳述するように、様々な誘導体化物質が選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。

リシニル残基とアミノ末端残基は、リシニル残基の電荷を逆転させる無水コハク酸又は他の無水カルボン酸と反応しうる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチリソ尿素、２，４ペンタンジオン、及びトランスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応を含む。

アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンを含めた、従来の試薬のいずれか１つ又はいくつかの組合せとの反応によって修飾しうる。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応がアルカリ条件下で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンのグループならびにアルギニンイプシロンアミノ基と反応しうる。

チロシル残基の特異的修飾は広汎に検討されており、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種と３−ニトロ誘導体を形成する。

カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾しうる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に転換することができる。

グルタミニル及びアスパラギニル残基は対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミノ化することができる。代替的には、これらの残基は弱い酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。

システイニル残基は、ジスルフィド結合を取り除くため、あるいは逆に架橋を安定させるために、アミノ酸残基又は他の成分によって置換することができる。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９参照。

二官能物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの官能基誘導体を水不溶性支持体基質又は他の高分子ビヒクルに架橋結合するために有用である。一般に使用される架橋剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）のようなジスクシニミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデータのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生成する。その代わりに、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性基質及び米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号及び同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定に使用される。

炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質におけるグリコシル化部位であることが知られている部位に好都合に結合しうる。一般に、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ［Ｘはプロリン以外のどのようなアミノ酸でもよい］の一部であるときには、Ｏ結合オリゴ糖をセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に連結し、Ｎ結合オリゴ糖をアスパラギン（Ａｓｎ）残基に連結する。Ｘは、好ましくはプロリン以外の１９の天然に生じるアミノ酸の１つである。Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の構造及び各々の種類で認められる糖残基は異なる。両方で一般的に認められる糖の１つの種類はＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は通常、Ｎ結合及びＯ結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負の電荷により、グリコシル化化合物に酸性特性を与えうる。そのような部位は本発明の化合物のリンカーに組み込むことができ、好ましくはポリペプチド化合物の組換え産生（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳類細胞において）の際に細胞によってグリコシル化される。しかしながら、そのような部位は、当技術において既知の合成又は半合成手順によってさらにグリコシル化されうる。

他の可能な修飾は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，タンパク質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐ．７９−８６（１９８３）。

本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変化しうる。化合物のいずれかの部分のＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞とより適合性のあるコドンに変えることができる。好ましい宿主細胞である大腸菌に関しては、至適化されたコドンが当技術において既知である。制限部位を取り除くように、又は選択宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを助けるサイレント制限部位を含むように、コドンを置換することができる。上記の配列変更のいずれかを含むようにビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列を修飾することができる。

作製方法
本発明の化合物は、主として組換えＤＮＡ手法を用いて形質転換宿主細胞において作製されうる。そのために、当該ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は当技術において周知である。例えば、適当な制限酵素を使用して当該ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出すことができる。その代わりには、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）法のような化学合成手法を用いてＤＮＡ分子を合成することができる。また、これらの手法の組合せも使用できる。

本発明はまた、適当な宿主において当該ペプチドを発現することができるベクターを含む。ベクターは、適当な発現制御配列に操作的に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前又は挿入後のいずれかに、この操作的結合を生じさせる方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写又は翻訳の制御にかかわる他のシグナルを含む。

生じたＤＮＡ分子を持つベクターを使用して適当な宿主を形質転換する。この形質転換は、当技術において周知の方法を用いて実施しうる。

本発明の実施にあたって、数多くの入手可能な周知の宿主細胞が使用できる。個々の宿主細胞の選択は当技術において認識されている多くの因子に依存する。これらは、例えば、選択される発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生体安全性及びコストを含む。必ずしもすべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現のために等しく有効ではないとの理解を持って、これらの因子のバランスを決定しなければならない。これらの一般的ガイドラインの中で、有用な微生物宿主は、細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｐ．など）、酵母（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．など）及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳類（ヒトを含む）細胞、又は当技術において既知の他の宿主を含む。

次に、形質転換した宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望する化合物が発現されるように従来の発酵条件下で培養されうる。そのような発酵条件は当技術において周知である。最後に、当技術において周知の方法によってペプチドを培養から精製する。

当該化合物はまた、合成方法によって作製することもできる。例えば、固相合成手法が使用できる。適当な手法は当技術において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐ．３３５−６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓとＰａｎａｙｏｔｉｓ編集）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ（１９６９），固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら（１９７６），タンパク質（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（第３版）２：１０５−２５３；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６），タンパク質（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（第３版）２：２５７−５２７に述べられているものを含む。固相合成は小ペプチドを作製する最もコスト効果的方法であるので、個々のペプチドを作製する好ましい手法である。

誘導体化されたペプチドを含む若しくは非ペプチド基を含む化合物は、周知の有機化学手法によって合成することができる。

化合物の使用
概説。本発明の化合物は、対象とするタンパク質の作用物質、擬似又は拮抗物質としてかかる対象タンパク質に結合するそれらの能力から生じる薬理学的活性を持つ。特定化合物の有用性を表２に示す。これらの化合物の活性は、当技術において既知のアッセイによって測定することができる。ＴＰＯ擬似及びＥＰＯ擬似化合物に関しては、本文中の実施例の章でさらに説明する。

治療用途に加えて、本発明の化合物は、対象とするそれらの関連タンパク質の機能障害を特徴とする疾患を診断する上で有用である。１つの実施態様では、（ａ）サンプルを本発明の化合物に接触させ、そして（ｂ）当該化合物による対象タンパク質の活性化を検出するステップを含む、活性化されうる対象タンパク質（例えば受容体）を生物学的サンプルにおいて検出する方法。生物学的サンプルは、組織標本、無傷細胞、又はそれらの抽出物を含む。本発明の化合物は、生物学的サンプルにおいて対象とするそれらの関連タンパク質の存在を検出するための診断キットの一部として使用しうる。そのようなキットは、検出を可能にする結合標識を持つ本発明の化合物を用いる。当該化合物は、対象とする正常又は異常タンパク質を同定するために有用である。ＥＰＯ擬似化合物に関しては、例えば、生物学的サンプル中に対象とする異常タンパク質が存在することは、ＥＰＯ受容体が機能不全であると考えられるダイアモンド−ブラックファン貧血（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｂｌａｃｋｆａｎ ａｎｅｍｉａ）のような疾患を表わすと考えられる。

ＥＰＯ擬似化合物の治療用途。本発明のＥＰＯ擬似化合物は、赤血球レベルが低いことを特徴とする疾患を治療するために有用である。哺乳類においてＥＰＯ受容体の内因性活性を調節する方法、好ましくはＥＰＯ受容体の活性を上昇させる方法は本発明に包含される。一般に、貧血のような、エリトロポイエチンによって治療しうるいかなる状態も、本発明のＥＰＯ擬似化合物によって治療されうる。これらの化合物を、治療する状態の性質と重症度に適した、当業者が探知しうる量と送達経路によって投与する。好ましくは、投与は皮下、筋肉内、又は静脈内のいずれかの注入による。

ＴＰＯ擬似化合物の治療用途。ＴＰＯ擬似化合物については、「巨核球の増殖と分化を刺激するための組成物及び方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」と題されたＷＯ ９５／２６７４６号に記述されているもののような標準的アッセイが利用できる。下記の実施例においてもインビボアッセイを示す。

治療される状態は、一般に既存の巨核球／血小板欠損又は予想される巨核球／血小板欠損（例えば、手術又は血小板供与が予定されているため）に関わるものである。そのような状態は通常、インビボでの活性Ｍｐ１リガンドの欠損（一過性又は永続的）の結果である。血小板欠損の一般名は血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）であり、従って本発明の方法及び組成物は一般に、その必要のある患者において血小板減少症を治療するために使用しうる。

血小板減少症（血小板欠損）は、化学療法及び様々な薬剤による他の治療、放射線療法、手術、偶発的血液損失、ならびに他の特異疾患状態を含めて、様々な理由から存在しうる。血小板減少症に関わる、本発明に従って治療しうる例示的な特異疾患状態は：再生不良性貧血、特発性血小板減少症、血小板減少症をもたらす転移性腫瘍、全身性エリテマトーデス、巨脾腫、ファンコーニ症候群（Ｆａｎｃｏｎｉ‘ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、メイ−ヘグリン異常（Ｍａｙ-Ｈｅｇｇｌｉｎ ａｎｏｍａｌｙ）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ならびに発作性夜間血色素尿症である。また、ＡＩＤＳに関する一部の治療は血小板減少症を生じさせる（例えばＡＺＴ）。一部の創傷治癒障害も血小板数の増加から恩恵を受けるであろう。

例えば後日の手術による、予想される血小板欠損に関しては、本発明の化合物を血小板が必要とされる数日前から数時間前に投与することができる。急性状況、例えば偶発的な大量失血に関しては、本発明の化合物を血液又は精製血小板と共に投与することができる。

本発明のＴＰＯ擬似化合物はまた、当該細胞がＭｐ１受容体を発現することが認められれば、巨核球以外の一部の細胞型を刺激する上で有用であると考えられる。Ｍｐ１リガンドによる刺激に対しての応答である、Ｍｐ１受容体を発現するそのような細胞に関連する状態も、本発明の範囲内である。

本発明のＴＰＯ擬似化合物は、血小板又は血小板前駆細胞の産生が所望される、若しくはｃＭｐ１受容体の刺激が所望されるいかなる状況においても使用できる。従って、例えば、本発明の化合物は、血小板、巨核球等が必要とされる哺乳類での状態を治療するために使用しうる。そのような状態は次の例示的ソースに詳述されており、ここに組み込まれる：ＷＯ９５／２６７４６号；ＷＯ９５／２１９１９号；ＷＯ９５／１８８５８号；ＷＯ９５／２１９２０号。

本発明のＴＰＯ擬似化合物はまた、血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の生存率又は貯蔵寿命を維持する上でも有用であると考えられる。それ故、そのような細胞を含む組成物中に１つ又はそれ以上のそのような化合物の有効量を含むことは有用であろう。

本発明の治療方法、組成物及び化合物はまた、血小板欠損だけでなく他の症状によっても特徴付けられる疾患状態の治療において、単独で若しくは他のサイトカイン、可溶性Ｍｐ１受容体、造血因子、インターロイキン、成長因子又は抗体と組み合わせて用いることができる。本発明の化合物は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦのような一般的な造血刺激物質との組合わせで一部の形態の血小板減少症を治療するのに有用であることが明らかにされると予想される。他の巨核球刺激因子、すなわちｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、又は巨核球刺激活性を持つ他の分子も、Ｍｐ１リガンドと共に用いることができる。そのような同時投与のためのさらなる例示的サイトカイン又は造血因子は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、又はＩＦＮ−γを含む。さらに、ひとたび巨核球が成熟形態に達すれば、巨核球を血小板へと切断する作用を持つと思われる可溶性哺乳類Ｍｐ１受容体の有効量を同時に又は連続的に投与することは有用であると考えられる。それ故、本発明の化合物の投与（成熟巨核球の数を高めるため）に続いて可溶性Ｍｐ１受容体を投与することは（リガンドを不活性化し、成熟巨核球に血小板を産生させるため）、血小板産生を刺激する特に有効な手段であると予想される。上記に引用した用量は、治療組成物中のそのような追加成分を補うように調節する。治療した患者の経過は従来の方法によってモニターすることができる。

本発明の化合物を血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の組成物に加える場合、含有される量は、一般に当技術において既知の手法及びアッセイによって実験的に探知されるであろう。そのような量の例示的範囲は、１０^６細胞につき本発明の化合物０．１μｇ−１ｍｇである。

製薬組成物
概説。本発明はまた、本発明の化合物の製薬組成物を使用する方法を提供する。そのような製薬組成物は、注入による投与、経口、肺、経鼻、経皮又は他の形態の投与用でありうる。一般に、本発明は、製薬上許容される希釈剤、防腐剤、溶解補助剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリアと共に本発明の化合物の有効量を含む製薬組成物を包含する。そのような組成物は、様々な緩衝剤含量（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、界面活性剤及び溶解補助剤（例えばＴｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）のような添加物、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばＴｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及び充填剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のようなポリマー化合物の微粒子製剤又はリポソームへの物質の組込みを含む。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中に存在する時間の延長を促進する作用を持つと考えられる。そのような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼしうる。例えば、参照してここに組込まれる、レミントンの製薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）ｐ．１４３５−１７１２参照。当該組成物は液体形態、若しくは凍結乾燥形態のような乾燥粉末で調製することができる。経皮製剤と同様に、移植可能な持続放出性製剤も考慮される。

経口投与形態。参照してここに組込まれるレミントンの製薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９９０），第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）の８９章に概説されている経口固形投与形態が、ここでの使用のために考慮される。固形投与形態は、錠剤、カプセル、丸剤、トローチ又はロゼンジ、カシェ剤又はペレット剤を含む。同様に、リポソーム又はプロテイノイド被包も本発明の組成物を製剤するために使用しうる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソーム被包も使用でき、様々なポリマーでリポソームを誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療のための可能な固形投与形態の説明は、参照してここに組込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，近代的製薬学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）（１９７９），Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒとＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｓ編集に述べられている。一般に、製剤は、本発明の化合物、及び胃環境に対する保護と腸における生物活性物質の放出を可能にする不活性成分を含む。

また明細には、上記の本発明の化合物の経口投与形態も考慮される。必要に応じて、経口送達が有効であるように当該化合物を化学修飾することができる。一般に、考慮される化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸からの血流への取込みを可能にする少なくとも１つの成分を、化合物の分子そのものに結合することである。また化合物の全体的安定性の上昇及び体内での循環時間の上昇も望ましい。本発明における共有結合ビヒクルとして有用な成分がこの目的にも使用できる。そのような成分の例は、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンを含む。例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉとＤａｖｉｓ，可溶性ポリマー−酵素付加物、薬剤としての酵素（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ）（１９８１），ＨｏｃｅｎｂｅｒｇとＲｏｂｅｒｔｓ編集，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．３６７−８３；Ｎｅｗｍａｒｋら（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９参照。使用できる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。上述したような製薬用途にはＰＥＧ成分が好ましい。

経口送達投与形態に関しては、本発明の治療化合物の吸収を高めるためのキャリアとして、Ｎ−（８［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）のような修飾脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを使用したヘパリン製剤の臨床効果は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって実施された第ＩＩ相試験において明らかにされた。米国特許第５，７９２，４５１号、「経口薬剤送達組成物及び方法（Ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ）」参照。

本発明の化合物を、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微細多粒子として製剤中の含めることができる。カプセル投与用物質の製剤は、粉末、軽度圧縮プラグ、またさらには錠剤であってもよい。圧縮によって治療薬を調製することができる。

着色剤及び着香剤もすべて含めることができる。例えば、タンパク質（又は誘導体）を製剤し（リポソーム又はミクロスフェア被包などによって）、さらに着色剤及び着香剤を含む冷却飲料のような食品の中に含めることができる。

不活性物質で本発明の化合物の容量を希釈する又は増加させることもできる。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、変性デキストラン及びデンプンを含みうる。一部の無機塩も、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含めて、充填剤として使用しうる。市販の希釈剤の一部として、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌがある。

崩壊剤も、固形投与形態の治療製剤中に含めることができる。崩壊剤として使用される物質は、デンプンをベースとする市販の崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂを含めて、デンプンを含むがそれに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海面及びベントナイトはすべて使用しうる。もうひとつの形態の崩壊剤は不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムは崩壊剤及び結合剤として使用でき、それらは寒天、カラヤゴム又はトラガカントのような粉末ゴムを含みうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

結合剤は、硬錠剤を形成するために治療薬と結合して用いることができ、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンのような天然産物からの材料を含む。その他にはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はいずれも、治療薬を顆粒化するためのアルコール溶液中で使用できる。

減摩剤（潤滑剤）は、製剤工程中の粘着を防ぐために治療薬の製剤に含めることができる。潤滑剤は治療薬と鋳型壁の間の層として使用でき、それらは、マグネシウム塩及びカルシウム塩を含めたステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びろうを含みうるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００及び６０００のような可溶性潤滑剤も使用できる。

製剤中の薬剤の流動特性を高めることができ、圧縮の際の再配列を助けるすべり剤（ｇｌｉｄａｎｔ）を添加してもよい。すべり剤は、デンプン、滑石、発熱性シリカ及び水和ケイアルミネートを含みうる。

水性環境への本発明の化合物の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムのような陰イオン界面活性剤を含みうる。陽イオン界面活性剤も使用でき、塩化ベンズアルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを含みうる。界面活性剤として製剤中に含めることができる潜在的な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で若しくは種々の比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在しうる。

添加物も化合物の吸収を高めるために製剤中に含めることができる。潜在的にこの特性を持つ添加物は、例えばオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸のような脂肪酸である。

制御放出製剤は望ましいと考えられる。本発明の化合物を、拡散又は浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムに組み込むことができる。緩やかに変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖類を製剤中に組み込むこともできる。本発明の化合物の制御放出のもうひとつの形態は、Ｏｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものであり、すなわち、浸透圧作用によって１個の小さな開口部を通して水が侵入し、薬剤を押し出す半透過性膜の中に薬剤が納められている。一部の腸溶剤皮も緩徐放出作用を持つ。

他の剤皮は製剤のために使用しうる。それらは、コーティングパンに適用することができる様々な糖類を含む。治療薬はまた薄膜被覆錠剤として提供することもでき、この場合にしようする材料は２つの群に分けられる。最初は非腸溶物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールを含む。第二の群は、一般にはフタル酸のエステルである腸溶物質から成る。

至適薄膜被覆を提供するために材料の混合物も使用しうる。薄膜被覆は、パンコーター又は流動床において、若しくは圧縮コーティングによって実施できる。

肺送達形態。本発明のタンパク質（又はその誘導体）の肺送達も考慮される。タンパク質（又はその誘導体）は吸入の際に哺乳類の肺に送達され、肺上皮内層を通って血流に入る。（これについての他の報告は、Ａｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉら（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（１９９０年３月）、「タンパク質のエーロゾル化（Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）、及びＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を含む。）
そのすべてが当業者には熟知のものである、ネブライザ、定量吸入器、及び粉末吸入器を含むがこれらに限定されない、治療薬剤の肺送達用に設計された広い範囲の機械的装置が、本発明を実施する際の使用に関して考慮される。本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの特定例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉが製造しているＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔネブライザ、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏが製造しているＡｃｏｒｎ ＩＩネブライザ、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａが製造しているＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器、及びＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが製造しているＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。

そのような装置はすべて、本発明の化合物を投薬するのに適した製剤を使用する必要がある。典型的には、各々の製剤は用いる装置の種類に特異的であり、治療において有用な希釈剤、アジュバント及び／又はキャリアに加えて、適切な推進物質の使用を含む。

本発明の化合物は、遠位肺への最も有効な送達のために、平均粒径１０μｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μｍの微粒子形態として最も好都合に製剤されるはずである。

製薬上許容されるキャリアは、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールのような炭水化物を含む。製剤において使用するための他の成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを含みうる。天然又は合成界面活性剤も使用できる。ＰＥＧも使用しうる（タンパク質又は類似体を誘導体化する上での使用とは別に）。シクロテキストランのようなデキストランも使用できる。胆汁酸塩及び他の関連増強剤も使用できる。セルロース及びセルロース誘導体も使用できる。アミノ酸も、緩衝剤製剤における使用のように、使用することができる。

またリポソーム、マイクロカプセル又はミクロスフェア、包接複合体、あるいは他の種類のキャリアの使用も考慮される。

ジェット噴霧器又は超音波噴霧器による使用に適した製剤は、典型的には、溶液ｍＬにつき生物活性タンパク質約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解した本発明の化合物を含む。製剤はまた、緩衝剤及び単糖も含みうる（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節のため）。ネブライザ製剤はまた、エーロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって生じるタンパク質の表面誘導凝集を低減する又は予防するために、界面活性剤を含みうる。

定量吸入装置に関して使用するための製剤は、一般に界面活性剤の助けを得て推進剤に懸濁した本発明の化合物を含む微細分割粉末を含有する。推進剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含めた炭化水素、若しくはそれらの組合せのような、このために使用される従来のいかなる物質でもよい。適当な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレシチンを含む。オレイン酸も界面活性剤として有用であると考えられる。

粉末吸入装置から投薬するための製剤は、本発明の化合物を含む微細分割乾燥粉末を含有し、同時に、装置からの粉末の散布を促進する量、例えば製剤の５０から９０重量％の量の、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はキシリトールのような充填剤も含みうる。

経鼻送達形態。本発明の化合物の経鼻送達も考慮される。経鼻送達は、薬剤が肺に沈着することを必要とせずに、治療薬剤を鼻に投与したあとタンパク質が直接血流へと通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤は、デキストラン又はシクロデキストランを含有するものを含む。他の粘膜を通しての輸送による送達も考慮される。

投与量。上述した状態を治療するための方法に関わる用量レジメンは、薬剤の作用を変化させる様々な因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食生活、感染の重症度、投与の時間、ならびに他の臨床的因子を考慮して、主治医によって決定されるであろう。一般に、１日量は体重キログラム当り本発明の化合物０．１−１０００マイクログラム、好ましくはキログラム当り０．１−１５０マイクログラムの範囲とすべきである。

特定の好ましい態様
発明者は多くの異なる種類の活性を有する分子の好ましいペプチド配列を決定した。発明者はさらに、好ましいリンカーおよびビヒクルと結合するこれらの好ましいペプチドの好ましい構造を決定した。これらの好ましいペプチドの好ましい構造を以下の表２１に列挙する。

実施例
前記の化合物を以下に記載するように調製できる。これらの実施例は本発明の好ましい態様を含んでなり、本発明を説明するが、これを限定するものではない。

実施例１
ＴＰＯ−擬似物質
以下の実施例では本明細書に後記する表Ａに示す数字で同定されたペプチドを使用する。

ペプチド１９の調製
ペプチド１７ｂ（１２ｍｇ）およびＭｅＯ−ＰＥＧ−ＳＨ５０００（３０ｍｇ、２当量）を水性緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶解した。混合物を室温で約３０分インキュベートし、分析用ＨＰＬＣにより反応を確認し、＞８０％の反応が完了したことが示された。調製用ＨＰＬＣによりＰＥＧ化物質を単離した。

ペプチド２０の調製
ペプチド１８（１４ｍｇ）およびＭｅＯ−ＰＥＧマレイミド（２５ｍｇ）を水性緩衝液（ｐＨ８）約１．５ｍｌに溶解した。混合物を室温で約３０分間インキュベートし、そのときサンプルのアリコートをＨＰＬＣカラムに供して分析用ＨＰＬＣでモニター観察し、約７０％の形質転換が完了していた。調製用ＨＰＬＣによりＰＥＧ化物質を精製した。

生物活性検定
ＴＰＯインビトロ生物検定はヒトｍｐｌ受容体でトランスフェクトしたマウス３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存性クローンを利用する細胞分裂誘起検定である。この検定に関してはＷＯ９５／２６７４６により詳細に記載されている。細胞を１０％胎児クローンＩＩおよび１ｎｇ／ｍｌ ｍＩＬ−３を含有するＭＥＭ培地中に保持する。サンプルを添加する前にｍＩＬ−３不含成長培地で２回すすいで細胞を調製する。拡張１２点ＴＰＯ検量線を作成し、３３ないし３９ｐｇ／ｍｌの範囲になる。各サンプルに関して４希釈（検量線の直線部分内に入ると推測される、１００ないし１２５ｐｇ／ｍｌ）を調製し、三重に実施する。１００００セル／ウェルを含有する９６ウェル・マイクロタイタープレートの適当なウェルに１００μｌの容量のサンプルの各希釈物または標準物質を加える。３７℃および１０％ ＣＯ_２で４４時間後、ＭＴＳ（細胞によりホルマザンに生物還元されるテトラゾリウム化合物）を各ウェルに加える。約６時間後、プレート・リーダーで４９０ｎｍにおける光学密度を読み取る。用量依存性曲線（ｌｏｇＴＰＯ濃度対Ｏ．Ｄ．バックグランド）を作成し、検量線の直線部分に入る点の直線回帰分析を行う。得られた直線の方程式および希釈因子の補正を用いて未知の試験サンプルの濃度を決定する。

ポリグリシン・リンカーを有するＴＭＰ縦列反復
連続して連結するＴＭＰ反復の設計は、ｃ−Ｍｐｌ（ＴＰＯ受容体）と効果的に相互作用するためにＴＭＰの二量体形態が要求され、受容体との関係においてそれらが互いにどのように巻きついているかに依存して、全体的な二量体立体配座を乱さないように２個のＴＭＰ分子がＣからＮ末端への立体配置で一緒につなぎとめられているという仮定に基づいている。明らかに、縦列連結した反復の設計の成功は、２個の連続し、整列したＴＭＰ単量体のＣおよびＮ末端に結合するリンカーの長さおよび組成の適切な選別に依存するものである。ｃ−Ｍｐｌに結合するＴＭＰの構造に関する情報を利用できないので、０ないし１０および１４個のグリシン残基（表Ａ）からなるリンカーを有する一連の反復ペプチドを合成した。融通性のあるポリグリシンペプチド鎖により２個のつなぎとめられたＴＭＰ反復の自由な折りたたみが可能になり、要求される立体配座にでき、一方その他のアミノ酸配列は、その剛性により受容体との関係において反復ペプチドの正常なパッキングが崩壊する望ましくない二次構造をとるという理論に基づいて、平易性および融通性の故にグリシンを選択した。

そのペプチドはすでにＦｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃのいずれかの化学を用いる慣用的な固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３））により入手できる。擬似対称的に２個のペプチド鎖を作る最初の分岐点として直交する保護リジン残基を使用することが要求される、Ｃ末端に連結した平行二量体の合成（Ｃｗｉｒｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−９９（１９９７））とは異なり、これらの縦列反復をＣからＮ末端に向かって連続したペプチド鎖の集合体を直線的に、段階的に合成する。ＴＭＰの二量体形成はＣ末端二量体で認められるような結合親和性よりも増殖活性に、より劇的に効果があるので（Ｃｗｉｒｌａら、（１９９７））、ｃ−Ｍｐｌ全長でトランスフェクトしたマウス３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存的クローンを用いてＴＰＯ依存的細胞増殖検定で生物学的活性に関して合成ペプチドを直接的に試験した（Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｃｅｌｌ，４１：７２７（１９８５））。試験結果が示すように、全てのポリグリシン連結縦列反復は単量体と比して強度において＞１００倍の増強が示され、細胞増殖検定においてはＣ末端二量体よりも強力でさえあった。我々の検定においてはＣ末端の絶対活性は元来のＴＰＯタンパク質の活性より低く、これはＣ末端二量体が天然リガンドのように活性であることが見出されたという依然に報告された知見（Ｃｗｉｒｌａら、（１９９７））と異なる。これは二つの検定において使用した条件の相違によるであろう。それにもかかわらず、同一検定における縦列（第２の単量体のＮ末端に連結した第１の単量体のＣ末端）およびＣ末端（第２の単量体のＣ末端に連結した第１の単量体のＣ末端、平行とも称する）二量体間の活性の相違により、縦列反復ストラテジーが平行ペプチド二量体形成よりも優れていることが明らかに示された。リンカーとして広範な長さが許容されることは興味深く留意されるところである。選択されたＴＭＰ単量体を用いる縦列ペプチド間の最適なリンカーは明らかに８個のグリシンから成る。

その他の縦列ペプチド
この最初の一連のＴＭＰ縦列反復に続いて、異なるリンカーと共にかまたは単量体そのもの中に修飾を含んでいくつかのその他の分子を設計した。これらの分子の第１のものはペプチド１３であり、βターン型２次構造を形成する傾向が高いことで知られている配列であるＧＰＮＧから成るリンカーを有する。単量体よりも約１００倍以上強力であるが、このペプチドは等価のＧＧＧＧ連結アナログよりも＞１０倍以下の活性であることが見出されている。このように、比較的堅固なβターンをリンカー領域で導入することにより、この短いリンカー形態において最適な作用物質立体配座にわずかな歪を生じるようである。

ＴＭＰ配列におけるＴｒｐ９はランダムペプチドライブラリーから単離された活性なペプチドのなかで高度に保存された残基である。またＥＰＯ擬似ペプチドのコンセンサス配列にも高度に保存されたＴｒｐがあり、このＴｒｐ残基が２個のＥＭＰ間の疎水性コアの形成に関与し、ＥＰＯ受容体との疎水性相互作用に寄与することが見出された。Ｌｉｖｎａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４６４−７１（１９９６）。類推によって、ＴＭＰにおけるＴｒｐ９残基はペプチドリガンドの二量体形成に類似の機能を有し、２個のインドール環により非共有結合性疎水力の影響を変調し、評価する試みとして、Ｔｒｐにおける変異から数種のアナログを作った。そしてペプチド１４では２個のＴＭＰ単量体の各々においてＴｒｐ残基をＣｙｓと置換し、酸化により２個のシステインの間で分子内ジスルフィド結合を形成し、これはペプチド二量体形成における２個のＴｒｐ残基間の疎水性相互作用を擬似することが想定される。ペプチド１５はペプチド１４の還元体である。ペプチド１６では２個のＴｒｐ残基がＡｌａにより置換された。検定データに示されるように、３個のアナログは全て不活性であった。これらのデータによりさらにＴｒｐが二量体形成に関してのみではなく、ＴＰＯ擬似ペプチドの活性に関して必須であることを示された。

次の２個のペプチド（ペプチド１７ａおよび１８）の各々はその８アミノ酸リンカーにＬｙｓまたはＣｙｓ残基を含む。これらの２個の化合物は、ＰＥＧ部分でＬｙｓまたはＣｙｓの側鎖が修飾されている２個のＰＥＧ化ペプチド（ペプチド１９および２０）の前駆体である。ＰＥＧ部分が比較的長いリンカーの中央に導入され、そのために大きなＰＥＧ構成要素（５ｋＤ）がペプチド分子内の臨界結合部位から十分離れている。ＰＥＧは生物適合性を有する重合体であることが知られており、共有結合性の改変剤としてペプチドおよびタンパク質基盤の治療の薬物動態プロファイルを改善するのに使用されることが増えてきている。

合成または組換えペプチドを都合よくＰＥＧ化するために、モジュラー、ソルーション基盤の方法が考案された。この方法は現在ではよく確立された相互反応性官能基対間の特異的反応を利用する化学選択的ライゲーション・ストラテジーに基づいている。そして、ＰＥＧ化ペプチド１９では、リジン側鎖をあらかじめブロモアセチル基で活性化し、ペプチド１７ｂをチオール誘導したＰＥＧとの反応に順応させた。そうするために、直交する保護基Ｄｄｅをリジンεアミンの保護に用いた。一度全ペプチド鎖を集合させると、Ｎ末端アミンをｔ−Ｂｏｃで再度保護した。次いでＤｄｅを除去してブロモアセチル化した。このストラテジーにより慣用的な逆相ＨＰＬＣを用いて容易に精製し、高品質の粗ペプチドを得た。ｐＨ８の水性緩衝液中でペプチドとチオール修飾したＰＥＧとライゲートし、反応は３０分間以内に完了した。精製し、ＰＥＧ化した物質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により隣接するピーク間で４４Ｄａの増加を伴う特徴的なベル型のスペクトラムが示された。ＰＥＧ−ペプチド２０では、システイン残基がリンカー領域に在り、その側鎖チオール基をマレイミド含有ＰＥＧの結合部位として提供する。このペプチドのＰＥＧ化に類似の条件を用いた。検定データが示すように、これらの２個のＰＥＧ化ペプチドはこれらのＰＥＧ化していない相当物と比較してインビトロ生物活性はより高い。

ペプチド２１はその８−アミノ酸リンカーにおいてグリコシル化され得るモチーフＮＧＳを有する。例示した縦列反復がペプチド結合により連結される天然アミノ酸から成るので、適当な真核細胞系におけるかかる分子の発現によりＡｓｎの側鎖カルボキシアミドに糖質基が加えられたグリコペプチドが作られるはずである。グリコシル化は水溶性およびインビボ安定性を増強することにより規定のタンパク質の生物学的活性に多くの肯定的な影響を与えることができる一般的な翻訳後修飾方法である。検定データが示すように、このグリコシル化モチーフのリンカーへの組み込みにより高い生物学的活性が維持された。潜在的グリコペプチドの合成前駆体は−（Ｇ）_８−連結アナログのものに比べて有効な活性を有した。一度グリコシル化されると、ＰＥＧおよび糖質基が呈する類似の物理化学的特性のために、このペプチドはＰＥＧ化ペプチドと同一の活性オーダーを有すると考えられる。

最後のペプチドは縦列反復の二量体である。これはペプチド１８を酸化することにより調製され、リンカーに位置する２個のシステイン残基の間で分子内ジスルフィド結合を形成する。このペプチドはＴＭＰが四量体として活性である可能性に注意を向けるために設計された。検定データによりこのペプチドがモル調整に基づいて平均的な縦列反復ほど活性ではないことが示され、これはＴＭＰの活性体はまさしく二量体であり、そうでなければ縦列反復の二量体形成は生物学的活性により影響を与えるであろうということを間接的に支持している。

動物におけるインビトロデータを確認するために１個のＰＥＧ化ＴＭＰ縦列反復（表Ａの化合物２０）を浸透圧ポンプを介して正常マウスに皮下投与した。処理期間中血小板の時間および用量依存的増加が認められた。８日には血小板レベルが基底値の４倍を越えた。ＰＥＧ化ＴＭＰ反復１０μｇ／ｋｇ／日の用量で、同一経路により投与したｒＨｕＭＧＤＦ（ＰＥＧ化していない）１００μｇ／ｋｇ／日に類似の応答が得られた。

論考
ＭＧＤＦがｈＧＨに類似の方法で作用する、すなわち活性化のためにタンパク質リガンドの１個の分子が受容体の２個の分子に結合することは周知である。Ｗｅｌｌｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：６０９−３４（１９９６）。現在、この相互作用はもっと小さいペプチドであるＴＭＰの作用により擬似される。しかしながら、本研究は、Ｃ−Ｃ平行またはＣ−Ｎ連続のいずれかの様式のＴＭＰの共有結合性二量体形成が１０^３以上の因子で元来の単量体のインビトロ生物学的能力を増強するので、この擬似が２個のＴＭＰ分子の協奏作用を要求することを示唆している。単量体の生物学的能力が相対的に低いのは恐らく非共有結合性二量体の形成の効率が悪いためである。あらかじめ形成された共有結合性反復は非共有結合性二量体形成のためにエントロピーバリヤを排除する能力を有し、これは小型の１４−残基ペプチドの２個の分子間の弱い非共有結合性相互作用により排他的にもたらされる。

報告された二量体形成が興味深いように、この縦列反復の研究が生物学的活性の増強に類似の影響を及ぼすのは興味深い。これらの二つのストラテジーにより二つの非常に異なった分子立体配置が得られた。Ｃ−Ｃ二量体は擬似対称性分子であり、一方縦列反復ではその直線構造にかかる対称性はない。１次構造における差異にかかわらず、これらの二つの型の分子は類似の生物学的に活性な立体配座に効果的に折り畳まれ、ｃ−Ｍｐｌの二量体形成および活性化を引き起こすことができるようである。これらの実験観察により、２個のＴＭＰ分子がｃ−Ｍｐｌに対する結合においてどのように互いに相互作用を示すことができるかということに多くの洞察が得られた。Ｃ末端二量体に関するデータに示唆されるように、第１に２個の結合ＴＭＰ分子の２個のＣ末端が相対的に互いに非常に接近していなければならない。第２に、受容体複合体において２個のＴＭＰ分子のＮおよびＣ末端の各々もまた互いに非常に近接して並んでいなければならず、これらを１個のペプチド結合と一緒に直接つなぎとめて、縦列反復ストラテジーにより得られるほぼ最大の活性増強効果を認めることができるようにする。接合点での１個またはそれ以上（１４個まで）のグリシン残基を挿入しても活性をさらに有意に増大（または減少）させることはなかった。これは柔軟なポリグリシンペプチド鎖が立体配座全体においていかなる有意な変化をも引き起こさずに接合部から容易にループ形成できるという事実のためであろう。この柔軟性によりＴＭＰペプチド鎖の配向性が自由になり、受容体との相互作用において要求される立体配座に折り畳まれ、それが修飾部位として確認されるようである。これを支持する間接的な証拠はペプチド１３に関する研究から得られ、そこではリンカーとしてより堅固なβターン形成配列がリンカーの周囲でバックボーンの並びに明らかに偏りを生じさせ、結果的に光学的立体配座のわずかな歪を生じ、その結果４−Ｇｌｙリンカーを有する類似の化合物と比較して活性が穏やかに（１０倍）低下した。第３に、ＴＭＰにおけるＴｒｐ９はＥＭＰにおけるＴｒｐ１３と類似の役割を果たし、これは二量体形成に関するペプチド：ペプチド相互作用に関係するのみならず、ペプチド：受容体相互作用における疎水力の寄与に関しても重要である。ＷからＣへの変異アナログであるペプチド１４で得られた結果により、共有結合性ジスルフィド連結はＴｒｐペアにより提供される疎水性相互作用に近似するのに十分ではなく、結合が短いので２個のＴＭＰ単量体が接近しすぎ、そのために光学二量体構造の立体配座全体を乱すことが示唆される。

ＴＭＰペプチドの可能な２次構造を分析することにより、ＴＭＰとｃ−Ｍｐｌとの相互作用に関してより理解を深めることができる。報告されたＥＰＯ擬似ペプチドの構造を参考にすることにより容易に理解できるようになる。Ｌｉｖｎａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４６４−７５（１９９６）。受容体結合ＥＭＰは配列の中央で高度なコンセンサスＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒにより形成されるβターンを伴うβヘアピン構造を有する。ＧＰＬＴの代りに、ＴＭＰが高度に選択されたＧＰＴＬ配列を有し、これは類似のターンを形成する可能性がある。しかしながら、このターン様のモチーフはＴＭＰのＮ末端部分の近くに位置する。チャウ・ファスマン法を用いる２次構造の予測により、ペプチドのＣ末端の半分はらせん状の立体配座をとる傾向があることが示唆される。９位置で高度に保存されたＴｒｐと一緒にこのＣ末端ヘリックスは二量体構造の安定性に寄与できる。ほとんどの縦列反復がＣ末端平行二量体よりも強力であることは興味深く留意されるところである。縦列反復はＣ−Ｃ平行二量体形成よりもよりよく適合する立体配座を分子に提供するようである。縦列反復の見かけの非対称的様相のために、それは非対称性分子として２個の異なる部位を用いて２個の同等の受容体分子に結合する天然リガンドに近くなる。

ＰＥＧ部分の導入によりタンパク質溶解性の分解に対して保護することにより、および腎臓濾過によるそのクリアランスを減速させることにより、修飾ペプチドのインビボ活性が増強されることが確認された。細胞基盤の増殖検定においてＰＥＧ化により縦列反復しているＴＭＰペプチドのインビトロ生物活性がより増強されるということは予想されなかった。

実施例２
Ｆｃ−ＴＭＰ融合
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とのＮ末端かまたはＣ末端のいずれかの融合体として単量体または二量体のいずれかの形態でＴＭＰ（および実施例３に記載のＥＭＰ）を発現した。全ての場合においてケースで発現ベクターｐＡＭＧ２１にてｌｕｘＰＲプロモーター・プロモーターを用いて発現を構築した。

Ｆｃ−ＴＭＰ
ＴＰＯ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を標準的なＰＣＲ技術を用いて構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ベクターおよび合成ＴＭＰ遺伝子であった。合成遺伝子を以下に示す３個の重複オリゴヌクレオチドから構築し（各々配列番号３６４、３６５および３６６）：

これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングしてアミノ酸配列をコードする二本鎖を形成し（各々配列番号３６７および３６８）、以下に示す：

センスおよびアンチセンスプライマーとして１８４２−９８および１８４２−９７を用いてＰＣＲ反応でこの二本鎖を増幅した。

以下に示すプライマー（配列番号３６９および３７０）を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った：

オリゴヌクレオチド１８３０−５１および１８４２−９８は２４個のヌクレオチドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１８４２−９７を用いて第３の反応において前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより、２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合されるようになる。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載されるように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７２８株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号５および６）を図７に示す。

Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ
標準的なＰＣＲ技術を用いてＴＰＯ擬似ペプチドの二量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ベクターおよび合成ＴＭＰ−ＴＭＰ遺伝子であった。４個の重複オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を構築し（各々配列番号３７１ないし３７４）以下に示す：

４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列をコードする二本鎖を形成し（各々配列番号３７５および３７６）、以下に示す：

センスおよびアンチセンスプライマーとして１８３０−５２および１８３０−５５を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。

Ｆｃ−ＴＭＰに関して前記したように、プライマー１２１６−５２および１８３０−５１を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１８３０−５５を用いて第３のＰＣＲ反応から融合体遺伝子全長を得た。

実施例１に記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７２７株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７および８）を図８に示す
ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＴＰＯ擬似ペプチドの縦列反復をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型は＃３６８８株のＥＭＰ−Ｆｃプラスミド（実施例３を参照のこと）およびＴＭＰ二量体をコードする合成遺伝子であった。７個の重複オリゴヌクレオチドから縦列反復の合成遺伝子を構築し（各々配列番号３７７ないし３８３）以下に示す：

これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖を形成しこれは以下に示すアミノ酸配列をコードすることが示された（各々配列番号３８４および３８５）：

センスおよびアンチセンスプライマーとして１８８５−５２および１８８５−５８を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。

プライマー１８８５−５４および１２００−５４を用いてＥＭＰ−Ｆｃ融合株＃３６８８からのＤＮＡ（実施例３を参照のこと）とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマー１８８５−５２および１２００−５４を用いて第３のＰＣＲ反応から融合体遺伝子全長を得た。

本明細書でＦｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７９８株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号９および１０）を図９に示す
ＴＭＰ−Ｆｃ
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＴＰＯ擬似ペプチドの単量体をコードするＤＮＡ配列を偶然にもＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃのライゲーションで得たが、これは恐らくプライマー１８８５−５４が１８８５−５３および１８８５−５８にアニリーリングする能力によるものであろう。ＴＭＰ−Ｆｃ構築物に関して正確なヌクレオチド配列を有する１個のクローンを選別し、アムゲン＃３７８８株と称した。

融合タンパク質のヌクレオトドおよびアミノ酸配列（配列番号１１および１２）を図１０に示す。

大腸菌における発現
大腸菌ＧＭ２２１におけるｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の各々の培養物を５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃で成長させた。合成オートインデューサーＮ−（３−オクソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを培養培地に添加し、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌにして、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子生成物の発現を誘導した。培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。３時間後、封入体の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で試験し、次いで遠心により収集した。誘導した培養物中光屈折性の封入体が観察され、これはＦｃ融合体が大腸菌の不溶性分画においてほとんど生成されていることを示している。１０％β−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サンプル緩衝液に細胞ペレットを再懸濁することにより直接的に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各々の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適当な分子量のクーマシー染色の強いバンドが観察された。

ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１はアムゲン発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）から誘導でき、これもまた米国特許第４７１０４７３号に記載のアムゲン発現ベクター系から誘導した。ｐＣＦＭ１６５６プラスミドは：
（ａ）Ｔ４ポリメラーゼ酵素で末端を埋め、次いで平滑末端ライゲーションを行うことにより、２個の内在するＮｄｅＩ制限部位を崩壊させること；
（ｂ）合成Ｐ_Ｌプロモーターを含有する独自のＡａｔＩＩおよびＣｌａＩ制限部位間のＤＮＡ配列を、Ｐ_Ｌプロモーターを含有するｐＣＦＭ６３６（特許番号第４７１０４７３号）から得られた類似のフラグメント（以下の配列番号３８６を参照のこと）と置き換えること；および
（ｃ）独自のＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限部位間の小型のＤＮＡ配列を配列番号３８８の配列を有するオリゴヌクレオチドと置換すること；
により記載したｐＣＦＭ８３６プラスミド（特許番号第４７１０４７３号）から誘導できる。

次いでＰＣＲ重複オリゴ変異誘発およびＤＮＡ配列置換により一連の部位特異的塩基変化を作ることによりｐＣＦＭ１６５６から発現プラスミドｐＡＭＧ２１を誘導できる。ＢｇＩＩＩ部位（プラスミド塩基対＃１８０）すぐの５‘でプラスミド複製プロモーターＰｃｏｐＢに向かって出発し、プラスミド複製遺伝子に向かって進んだときの、塩基対変化を以下の表Ｂに示す。

独自のＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６の＃４３６４位置）およびＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６の＃４５８５位置）制限部位間のＤＮＡ配列を図１７Ａおよび１７Ｂで示すＤＮＡ配列（配列番号２３）で置換する。この置換ＤＮＡ配列の付着端をライゲートしている間に外側のＡａｔＩＩおよびＳａｃＩＩ部位を崩壊する。置換されたＤＮＡには独自のＡａｔＩＩおよびＳａｃＩＩ部位が存在する。

ＧＭ２２１（アムゲン＃２５９６）
アムゲン＃２５９６宿主株はアムゲン＃３９３株から誘導した大腸菌Ｋ１２株である。これを修飾し、初期ｅｂｇ領域に温度感受性ラムダレプレッサーｃＩ８５７ｓ７、後期ｅｂｇ領域にｌａｃＩ^Ｑレプレッサーの両方を含むようにした（６８分）。これらの２個のレプレッサー遺伝子の存在によりこの宿主が種々の発現系と共に使用できるようになるが、しかしながらこれらの両方のレプレッサーはｌｕｘＰ_Ｒからの発現には適切ではない。形質転換されなかった宿主は抗生物質抵抗性がない。

ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位を修飾して強化ＲＢＳを含むようにした。介在ｅｂｇ配列を欠失したジーンバンク受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ Ｂａを付与されたヌクレオチド１１７０および１４１１位置間のｅｂｇオペロンにこれを挿入した。挿入配列を以下に示し、小文字は以下の挿入配列をフランキングするｅｂｇ配列を表している（配列番号３８８）。

ＭＭｅｂｇ−ｃＩ８５７ｓ７強化ＲＢＳ＃４と称する組換えファージを用いてＦ‘ｔｅｔ／３９３の染色体に構築物を分配した。組換えおよび切開の後、前記の染色体挿入物のみが細胞に残る。これを再度Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１と名付けた。次いで介在ｅｂｇ配列を欠失したジーンバンク受入番号Ｍ６４４４１Ｇｂ Ｂａを付与されたヌクレオチド位置２４９３および２９３７間のｅｂｇオペロンにｌａｃＩ^Ｑ構築物を分配することによりＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１を修飾した。挿入配列を以下に示し、小文字は以下の挿入配列をフランキングするｅｂｇ配列を表している（配列番号３８９）。

ＡＧｅｂｇ−ＬａｃＩＱ＃５と称する組換えファージを用いてＦ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１の染色体に構築物を分配した。組換えおよび切開の後、前記の染色体挿入物のみが細胞に残る。これを再度Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ２２１と名付けた。ＬＢ中２５μｇ／ｍｌの濃度のアクリジン・オレンジを用いてＦ’ｔｅｔエピソームを株からキュアリングした。キュアリングされた株はテトラサイクリン感受性であると同定され、ＧＭ２２１として保存した。

発現
誘導前に大腸菌ＧＭ２２１のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰの培養物を５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃でインキュベートした。最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように培養培地に合成オートインデューサーＮ−（３−オクソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを添加することによりｌｕｘＰＲプロモーターからＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ遺伝子生成物発現を誘導し、培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。３時間後、封入体の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で試験し、次いで遠心により収集した。誘導した培養物中光屈折性の封入体が観察され、これはＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰが大腸菌の不溶性分画においてほとんどが生成されていることを示している。１０％β−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サンプル緩衝液に再懸濁することにより細胞ペレットを直接的に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおよそ３０ｋＤａのクーマシー染色の強いバンドが観察された。予測される遺伝子生成物は２６９個のアミノ酸の長さであり、予測される分子量は約２９．５ｋＤａである。また１０ｌのスケールで標準バッチ条件下発酵をも行い、ベンチスケールで得られた発現レベルに類似したＦｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰの発現レベルが得られた。

Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰの精製
高圧ホモジナイゼーション（１４０００ＰＳＩで２パス）により水中（１／１０）で細胞を破壊し、遠心（Ｊ−６Ｂで４２００ＲＰＭで１時間）により封入体を回収した。６Ｍ グアニジン、５０ｍＭ トリス、８ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．７）中１時間１／１０の比率で封入体を可溶化する。可溶化した混合物を２Ｍ 尿素、５０ｍＭ トリス、１６０ｍＭ アルギニン、３ｍＭ システイン（ｐＨ８．５）で２０倍希釈する。混合物を一晩冷却して攪拌し、次いで限外濾過により約１０倍に濃縮する。次いで１０ｍＭ トリス、１．５Ｍ 尿素（ｐＨ９）で３倍希釈する。次いでこの混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整する。沈殿物を遠心により除去し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・カラムに上澄を装填する（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１００ｍＭ ＮａＣｌないし５００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてタンパク質を溶出する。カラムからのプールを３倍希釈し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填する（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１５０ｍＭ ＮａＣｌないし４００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてタンパク質を溶出する。ピークをプールし、濾過する。

Ｆｃ−ＴＭＰ活性の特徴付け
以下は本発明の種々化合物を用いたマウスにおけるインビボデータの要旨である。

マウス：およそ１０ないし１２週齢の正常雌ＢＤＦ１。

出血スケジュール：群あたり１０匹のマウスを０日に処置、４日後に２群で開始、全部で群あたりマウス２０匹。各時間に５匹のマウスを出血させ、最低週３回出血させた。イソフルランでマウスを麻酔し、眼窩洞の穿刺により血液全量で１４０ないし１６０μｌを得た。ネズミ血液に関するソフトウェアを用いてテクニコンＨ１Ｅ血液アナライザーで血液をカウントした。測定したパラメーターは白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、好中球である。

処置：マウスにボーラス処置用に皮下注射するかまたは連続投与用に７日用マイクロ浸透圧ポンプを埋めこんだ。０．２ｍｌの容量を皮下注射した。麻酔したマウスの皮膚と肩甲骨の間で皮下切開し、浸透圧ポンプを挿入した。化合物を０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。全実験には対照群が含まれ、この希釈物のみで処置されたものには「キャリヤ」とラベル表示した。ポンプ中の試験物質の濃度を調整し、ポンプからの測定流速から処置レベルが得られ、これをグラフに表示した。

化合物：化合物の滴定用量を７日用マイクロ浸透圧ポンプでマウスに送達した。７日用マイクロ浸透圧ポンプで１回用量１００μｇ／ｋｇの種々化合物でマウスを処置した。次いで同一化合物のいくつかを１回ボーラス注射してマウスに投与した。

活性試験結果：活性実験の結果を図１１および１２に示す。７日用マイクロ浸透圧ポンプを用いる用量依存性検定では配列番号１８の化合物１００μｇ／ｋｇ／日で最大効果が得られ；１０μｇ／ｋｇ／日の用量で最大活性の約５０％、および１μｇ／ｋｇ／日はこの検定系で活性が認められる最低用量であった。化合物は１０μｇ／ｋｇ／日の用量で同一実験におけるＰＥＧ化していないｒＨｕ−ＭＧＤＦ１００μｇ／ｋｇ／日とほぼ同等の活性を示した。

実施例３
Ｆｃ−ＥＭＰ融合
Ｆｃ−ＥＭＰ
標準ＰＣＲ技術を用いてＥＰＯ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はＦｃ配列（ｐＦｃ−Ａ３、１９９７年７月３日公開の国際出願ＷＯ９７／２３６１４に記載）を含有するベクターおよびＥＰＯ単量体をコードする合成遺伝子であった。単量体の合成遺伝子は以下に示す４個の重複オリゴヌクレオチド（各々配列番号３９０ないし３９３）から構築した：

４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングして以下に示すアミノ酸配列をコードする二本鎖を形成した（各々配列番号３９４および３９５）：

センスおよびアンチセンスプライマーとして

および

（各々配列番号３９６および３９７）を用いてこの二本鎖をＰＣＲ反応で増幅した。

プライマー：

（配列番号３９８および３９９）を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ領域を作った。オリゴヌクレオチド１７９８−１７および１７９８−１８は６１個のヌクレオチドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１７９８−１９を用いて第３の反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより、２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合できるようになる。

最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１（以下に記載）にライゲートし、またＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ライゲートしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株のコンピテント宿主細胞（本明細書においてＧＭ２２１と称する）に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３７１８株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１５および１６）を図１３に示す。

ＥＭＰ−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＥＰＯ擬似ペプチドの単量体をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はｐＦｃ−Ａ３ａベクターおよびＥＰＯ単量体をコードする合成遺伝子であった。４個の重複オリゴヌクレオチド１７９８−４および１７９８−５（前記）並びに１７９８−６および１７９８−７（各々配列番号４００および４０１）から以下に示す単量体の合成遺伝子を構築した：

４個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列をコードする二本鎖を形成し（各々配列番号４０２および４０３）、以下に示す：

センスおよびアンチセンスプライマーとして：

および

（各々配列番号４０４および４０５）を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。

プライマー

（各々配列番号４０６および４０７）を用いてｐＦｃ−Ａ３とのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。オリゴヌクレオチド１７９８−２２および１７９８−２３は４３個のヌクレオチドの重複を含有し、アウトサイド・プライマー１７８７−２１および１２００−５４を用いて第３のＰＣＲ反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより２個の遺伝子を正確な読み枠に一緒に融合できる。

前記するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３６８８株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１７および１８）を図１４に示す
ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＥＰＯ擬似ペプチドの二量体をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型は前記の＃３６８８株のＥＭＰ−ＦｃプラスミドおよびＥＰＯ二量体をコードする合成遺伝子であった。８個の重複オリゴヌクレオチドから以下に示す二量体の合成遺伝子を構築した（各々配列番号４０８ないし４１５）：

８個のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、アミノ酸配列（各々配列番号４１６および４１７）をコードする以下に示す二本鎖を形成した：

センスおよびアンチセンスプライマーとして１８６９−２３および１８７１−７９（前記で示す）を用い、ＰＣＲ反応で二本鎖を増幅した。

プライマー１７９８−２３および１２００−５４（前記で示す）を用いて＃３６８８株ＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。

オリゴヌクレオチド１８７２−７９および１７９８−２３３１個のヌクレオチド重複を含有し、アウトサイド・プライマー１８６９−２３および１２００−５４を用いて第３のＰＣＲ反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより２個の遺伝子を正確な読み枠に一緒に融合させる。

Ｆｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３８１３株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（各々配列番号１９および２０）を図１５に示す。１４５位置にサイレント変異（ＡからＧ、太字で示す）があり、最終構築物がそれを誘導したオリゴヌクレオチド１８７１−７２とは異なるヌクレオチド配列を有するようになる。

Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ
標準的なＰＣＲ技術を用いてＥＰＯ擬似ペプチドの二量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型は前記の３６８８および３８１３株からのプラスミドであった。

プライマー１２１６−５２および１７９８−１７（前記で示す）を用いて＃３６８８株ＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。分子のＥＭＰ二量体部分はプライマー１７９８−１８（これも前記で示す）および以下に示す配列番号４１８：

を用いた＃３８１３株ＤＮＡとの第２のＰＣＲ反応の生成物であった。

オリゴヌクレオチド１７９８−１７および１７９８−１８は６１個のヌクレオチド重複を含有し、アウトサイド・プライマー１２１６−５２および１７９８−２０を用いて第３の反応で前記のＰＣＲ生成物を組合わせることにより２個の遺伝子を正確な読み枠に一緒に融合させる。

Ｆｃ−ＥＭＰに関して記載するように、最終的なＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃３８２２株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（各々配列番号 および ）を図１６に示す。

Ｆｃ−ＥＭＰ活性の特徴付け
インビボでの特徴づけは以下のとおり実施した。

マウス：およそ１０ないし１２週齢の正常雌ＢＤＦ１。

出血スケジュール：群あたり１０匹のマウスを０日に処置、４日後に２群で開始、全部で群あたりマウス２０匹。各時間に５匹のマウスを出血させ、最低週３回出血させた。イソフルランでマウスを麻酔し、眼窩洞の穿刺により血液全量で１４０ないし１６０μｌを得た。ネズミ血液に関するソフトウェアを用いてテクニコンＨ１Ｅ血液アナライザーで血液をカウントした。測定したパラメーターは白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板、好中球、リンパ球である。

処置：マウスにボーラス処置用に皮下注射するかまたは連続投与用に７日用マイクロ浸透圧ポンプを埋めこんだ。０．２ｍｌの容量を皮下注射した。麻酔したマウスの皮膚と肩甲骨の間で皮下切開し、浸透圧ポンプを挿入した。化合物を０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。全実験には対照群が含まれ、この希釈物のみで処置されたものには「キャリヤ」とラベル表示した。ポンプ中の試験物質の濃度を調整し、ポンプからの測定流速から処置レベルが得られ、これをグラフに表示した。

実験：種々のＦｃ結合ＥＰＯ擬似ペプチド（ＥＭＰ）を１００μｇ／ｋｇの用量で１回ボーラス注射してマウスに投与した。Ｆｃ−ＥＭＰは７日用マイクロ浸透圧ポンプでマウスに分配した。７日の終わりにポンプを取り替えなかった。マウスを５１日まで出血させ、そのときヘモグロビンおよびヘマトクリットが基底値に戻った。

実施例４
ＴＮＦ−α阻害因子
Ｆｃ−ＴＮＦ−α阻害因子
標準的なＰＣＲ技術を用いてＴＮＦ−α阻害因子の単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。センスプライマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２２９５−８９（各々配列番号１１１２および１１１３）を用いてＦｃ−ＥＭＰ融合＃３７１８株（実施例３を参照のこと）のＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グリシンリンカー部分を作った。以下に示すＰＣＲプライマー２２９５−８９によりＴＮＦ−α阻害ペプチドをコードするヌクレオチドが提供される：

オリゴヌクレオチド２２９５−８９は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子を正確な読み枠で一緒に融合した。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５４４株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５５および１０５６）を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。

ＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＴＮＦ−α阻害ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型は５個のグリシンリンカーを介してＦｃに融合した関連性のないペプチドを含有するプラスミドであった。アンチセンスプライマーとして提供されるプライマー１２００−５４とセンスＰＣＲプライマー２２９５−８８（各々配列番号１１１７および４０７）によりＴＮＦ−α阻害ペプチドをコードするヌクレオチドが提供された。プライマー配列を以下に示す：

オリゴヌクレオチド２２９５−８８は２４個のヌクレオチドにより鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子を正確な読み枠で一緒に融合した。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５４３株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５７および１０５８）を図２０Ａおよび２０Ｂに示す。

大腸菌における発現
大腸菌ＧＭ２２１のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の各々の培養物を５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン含有ルリア・ブロス培地中３７℃でインキュベートした。最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで培養培地に合成オートインデューサーＮ−（３−オクソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを添加することによりｌｕｘＰＲプロモーターから遺伝子生成物の発現を誘導した。培養物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。３時間後、封入体の存在に関して細菌培養物を顕微鏡で試験し、次いで遠心により収集した。誘導した培養物中光屈折性の封入体が観察され、これはＦｃ融合体が大腸菌の不溶性分画においてほとんどが生成されていることを示している。１０％β−メルカプトエタノールを含有するラエムリ・サンプル緩衝液に再懸濁することにより細胞ペレットを直接的に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各々の場合でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適当な分子量のクーマシー染色の強いバンドが観察された。

Ｆｃペプチド融合タンパク質の精製
高圧ホモジナイゼーション（１４０００ＰＳＩで２パス）により水中（１／１０）で細胞を破壊し、遠心（Ｊ−６Ｂで４２００ＲＰＭで１時間）により封入体を回収した。６Ｍ グアニジン、５０ｍＭ トリス、８ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．７）中１時間１／１０の比率で封入体を可溶化する。可溶化した混合物を２Ｍ 尿素、５０ｍＭ トリス、１６０ｍＭ アルギニン、３ｍＭ システイン（ｐＨ８．５）で２０倍希釈する。混合物を一晩冷却して攪拌し、次いで限外濾過により約１０倍に濃縮する。次いで１０ｍＭ トリス、１．５Ｍ 尿素（ｐＨ９）で３倍希釈する。次いでこの混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整する。沈殿物を遠心により除去し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・カラムに上澄を装填する（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１００ｍＭ ＮａＣｌないし５００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてカラムからタンパク質を溶出する。カラムからのプールを３倍希釈し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で平衡にしたＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填する（１０ｍｇ／ｍｌ タンパク質装填、室温）。１５０ｍＭ ＮａＣｌないし４００ｍＭ ＮａＣｌの範囲の同一緩衝液の２０カラム容量グラジエントを用いてタンパク質を溶出する。ピークをプールし、濾過する。

Ｆｃ−ＴＮＦα阻害因子およびＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃの活性の特徴付け
本明細書の教示を熟知する当業者に可能な方法によりＢＩＡコアによりこれらのペプチド融合タンパク質のＴＮＦ−αへの結合を特徴付けできる。

実施例５
ＩＬ−１拮抗物質
Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質
標準的なＰＣＲ技術を用いてＩＬ−１拮抗物質ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。センスプライマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２２６９−７０（各々配列番号１１１２および１１１８）を用いてＦｃ−ＥＭＰ融合＃３７１８株（実施例３を参照のこと）のＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グリシンリンカー部分を作った。以下に示すＰＣＲプライマー２２６９−７０によりＩＬ−１拮抗物質ペプチドをコードするヌクレオチドが提供される：

オリゴヌクレオチド２２６９−７０は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合される。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換し。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５０６株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０５９および１０６０）を図２１Ａおよび２１Ｂに示す。

ＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＩＬ−１拮抗物質ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型は５個のグリシンリンカーを介してＦｃに融合した関連性のないペプチドを含有するプラスミドであった。アンチセンスプライマーとして提供されるプライマー１２００−５４とセンスＰＣＲプライマー２２６９−６９により（各々配列番号１１１９および４０７）ＩＬ−１拮抗物質ペプチドをコードするヌクレオチドが提供された。プライマー配列を以下に示す：

オリゴヌクレオチド２２６９−６９は２４個のヌクレオチドで鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲで得られた２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合される。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５０５株と称した。

融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６１および１０６２）を図２２Ａおよび２２Ｂに示す。発現および精製は前記の実施例のとおりに実施する。

Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質ペプチドおよびＩＬ−１拮抗物質ペプチド−Ｆｃの活性の特徴付け
ＩＧＥＮ系を用いてＩＬ−１β、Ｉｌ−１ＲＡおよびＦｃ−結合ＩＬ−１ペプチド配列間のＩＬ−１受容体結合競合検定を実施した。反応物は０．４ｎＭビオチン−ＩＬ−１Ｒ＋１５ｎＭ ＩＬ−１−ＴＡＧ＋３μＭ コペティター＋２０μｇ／ｍｌストレプトビジン結合ビーズを含有し、ここでコンペティターはＩＬ−１ＲＡ、Ｆｃ−ＩＬ−１拮抗物質、ＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃである。コンペティター濃度３μＭないし１．５ｐＭの範囲で競合を検定した。結果を以下の表Ｃに示す：

実施例６
ＶＥＧＦ−拮抗物質
Ｆｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質
標準的なＰＣＲ技術を用いてＶＥＧＦ擬似ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はｐＦｃ−Ａ３プラスミドおよび合成ＶＥＧＦ擬似ペプチド遺伝子であった。以下の２個のオリゴヌクレオチドプライマー（各々配列番号１１２０および１１２１）をアニーリングして合成遺伝子の集合体を形成した：

２個のオリゴヌクレオチドをアニーリングして以下に示すアミノ酸配列をコードする二本鎖を形成した（配列番号１１２２）：

センスおよびアンチセンスプライマーとして２２９３−０５および２２９３−０６（各々配列番号１１２５および１１２６）を用いてこの二本鎖をＰＣＲ反応で増幅した。

センスおよびアンチセンスプライマーとしてプライマー２２９３−０３および２２９３−０４（各々配列番号１１２３および１１２４）を用いてｐＦｃ−Ａ３プラスミドとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマー２２９３−０３および２２９３−０６を用いて第３のＰＣＲ反応で融合遺伝子全長を得た。これらのプライマーを以下に示す：

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株細胞に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５２３株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６３および１０６４）を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。

ＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＶＥＧＦ擬似ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。ＰＣＲ反応の鋳型はｐＦｃ−Ａ３プラスミドおよび前記の合成ＶＥＧＦ擬似ペプチド遺伝子であった。センスおよびアンチセンスプライマーとして２２９３−０７および２２９３−０８（各々配列番号１１２７および１１２８）を用いてＰＣＲ反応で合成二本鎖を増幅した。

センスおよびアンチセンスプライマーとしてプライマー２２９３−０９および２２９３−１０（各々配列番号１１２９および１１３０）を用いてｐＦｃＡ３プラスミドとのＰＣＲ反応で分子のＦｃ部分を作った。アウトサイド・プライマー２２９３−０７および２２９３−１０を用いて第３のＰＣＲ反応で融合遺伝子全長を得た。これらのプライマーを以下に示す：

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５２４株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６５および１０６６）を図２４Ａおよび２４Ｂに示す。発現および精製は前記の実施例のとおり実施した。

実施例７
ＭＭＰ阻害因子
Ｆｃ−ＭＭＰ阻害因子
標準的なＰＣＲ技術を用いてＭＭＰ阻害ペプチドの単量体にイン・フレーム融合したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。センスプライマー１２１６−５２およびアンチセンスプライマー２３０８−６７（各々配列番号１１１２および１１３１）を用いてＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合株＃４５４４（実施例４を参照のこと）からのＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グシリンリンカー部分を作った。ＭＭＰ阻害因子ペプチドをコードするヌクレオチドはＰＣＲプライマー２３０８−６７により提供され、以下に示す：

オリゴヌクレオチド２３０８−６７は２２個のヌクレオチドにより鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲにより２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合される。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載するように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１）にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５９７株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６７および１０６８）を図２５Ａおよび２５Ｂに示す。発現および精製は前記の実施例のとおり実施した。

ＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ
標準的なＰＣＲ技術を用いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン・フレーム融合したＭＭＰ阻害ペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築した。Ｆｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合株＃４５４３（実施例４を参照のこと）からのＤＮＡとのＰＣＲ反応で分子のＦｃおよび５グシリンリンカー部分を作った。ＭＭＰ阻害ペプチドをコードするヌクレオチドはアンチセンスプライマーとして供されるプライマー１２００−５４とセンスＰＣＲプライマー２３０８−６６により提供された。プライマー配列は以下に示す：

オリゴヌクレオチド２２６９−６９は２４個のヌクレオチドで鋳型のグリシンリンカーおよびＦｃ部分を重複し、ＰＣＲにより２個の遺伝子が正確な読み枠で一緒に融合される。

本明細書でＥＭＰ−Ｆｃに関して記載されるように、ＰＣＲ遺伝子生成物（融合遺伝子全長）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１にライゲートし、コンピテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２５９６株に形質転換した。組換えタンパク質生成物を製造し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関してクローンをスクリーニングした。かかるクローン１個を選別し、アムゲン＃４５９８株と称した。

得られた融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１０６９および１０７０）を図２６Ａおよび２６Ｂに示す。

本発明はここに十分に記載されるが、本明細書において前記した本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者がそこに多くの変更および修飾を行うことができるのは明らかであろう。

略語
本明細書において使用した略語を特記しない限り以下のように定義する。
Ａｃ：アセチル（アセチル化残基に関して使用）
ＡｃＢｐａ：アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞毒性
Ａｉｂ：アミノイソブチル酸
βＡ：ベータ・アラニン
Ｂｐａ：ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ：ブロモアセチル（ＢｒＣＨ_２Ｃ（Ｏ））
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｃａｐ：カプロン酸
ＣＴＬ：細胞毒性Ｔリンパ球
ＣＴＬＡ４：細胞毒性Ｔリンパ球抗原４
ＤＡＲＣ：ダッフィ式血液型抗原受容体
ＤＣＣ：ジシルコヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオクソ−シクロヘキシルジエン）エチル
ＥＭＰ：エリトロポエチン擬似ペプチド
ＥＳＩ−ＭＳ：電子スプレイイオン化質量分析法
ＥＰＯ：エリトロポエチン
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子
ＧＨ：成長ホルモン
ＨＣＴ：ヘマトクリット
ＨＧＢ：ヘモグロビン
ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＬ：インターロイキン
ＩＬ−Ｒ：インターロイキン受容体
ＩＬ−１Ｒ：インターロイキン−１受容体
ＩＬ−１ｒａ：インターロイキン−１受容体拮抗物質
Ｌａｕ：ラウリン酸
ＬＰＳ：リポ多糖類
ＬＹＭＰＨ：リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：行列補助レーザー脱離イオン化質量分析法
Ｍｅ：メチル
ＭｅＯ：メトキシ
ＭＨＣ：主要組織適合複合体
ＭＭＰ：マトリックス・メタロプロテイナーゼ
ＭＭＰＩ：マトリックス・メタロプロテイナーゼ・阻害因子
１−Ｎａｐ：１−ナフチルアラニン
ＮＥＵＴ：好中球
ＮＧＦ：神経成長因子
Ｎｌｅ：ノルロイシン
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｅｃ：ピペコリン酸
ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
Ｐｉｃ：ピコリン酸
ＰＬＴ：血小板
ｐＹ：ホスフォチロシン
ＲＢＣ：赤血球
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ＲＴ：室温（２５℃）
Ｓａｒ：サルコシン
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ：セリン−スレオニン・キナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ：ターシャリー・ブトキシカルボニル
ｔＢｕ：ターシャリー・ブチル
ＴＧＦ：組織成長因子
ＴＨＦ：胸腺液性因子
ＴＫ：チロシン・キナーゼ
ＴＭＰ：トロンボポエチン擬似ペプチド
ＴＮＦ：組織壊死因子
ＴＰＯ：トロンボポエチン
ＴＲＡＩＬ：ＴＮＦ関連アポトシス誘起リガンド
Ｔｒｔ：トリチル
ＵＫ：ウロキナーゼ
ＵＫＲ：ウロキナーゼ受容体
ＶＥＧＦ：血管内皮細胞成長因子
ＶＩＰ：血管作用性小腸ペプチド
ＷＢＣ：白血球

図１は、本発明の例示的方法の概要図を示す。この好ましい方法では、ビヒクルはＦｃドメインであり、それがＦｃドメインとペプチドの両方をコードするＤＮＡ構築物からの発現によってペプチドに共有結合する。図１に示すように、Ｆｃドメインはこの方法において自発的に二量体を形成する。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域と可変領域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと２ＤにおけるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、若しくは非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によって形成されうる。Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合している。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖中の両方のシステイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、若しくはそのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成されうる。Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で結合している。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステイニル残基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に存在する他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成されるのを避けるため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆｃドメインの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより、他の二量体を形成することができる。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 一重ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には定常領域と可変領域の間のちょうつがい部位に２個のジスルフィド結合を持つ。図２Ａと２ＤにおけるＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位間の切断によって、若しくは非反応性残基（例えばアラニル）によるシステイニル残基の置換によって形成されうる。Ｆｃドメインはカルボキシル末端で結合している。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである：二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖中の両方のシステイニル残基を保持するように親抗体を切断することによって、若しくはそのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成されうる。Ｆｃドメインはカルボキシル末端で結合している。 ＩｇＧ１抗体から誘導しうる例示的Ｆｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、ここでの「Ｆｃドメイン」の意味するものの範囲内の何らかのＦｃ変異体を表わす。「Ｘ^１」及び「Ｘ^２」は、下記で定義されるようなペプチド又はリンカー−ペプチドの組合せを表わす。特定の二量体は次のとおりである： 非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断又は置換によるシステイニル残基の除去によって形成されうる。当該システイニル残基と宿主細胞中に存在する他のタンパク質のシステイニル残基の反応によって不純物が形成されるのを避けるため、システイニル残基を除去することが所望される場合がある。Ｆｃドメインの非共有結合は二量体を結びつけるのに十分である。異なる種類の抗体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導したＦｃドメインを使用することにより、他の二量体を形成することができる。 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好ましい化合物の構造を示す。本図面は、一本鎖の分子を示し、またかかる分子に関するＤＮＡ構築物も表わしうる。 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好ましい化合物の構造を示す。本図面は、リンカー−ペプチド部分が二量体の１本の鎖にだけ存在する二量体を示す。 薬理学的に活性なペプチドのタンデムリピートを特徴とする、本発明の好ましい化合物の構造を示す。本図面は、両方の鎖上にペプチド部分を持つ二量体を示す。本図面の二量体は、図３Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡ構築物の発現の際に一部の宿主細胞において自発的に形成される。他の宿主細胞では、細胞を二量体の形成を促進する条件下に置くか、若しくは二量体をインビトロで形成することができる。 図４は、本発明において使用しうるヒトＩｇＧ１ Ｆｃの例示的核酸及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。 図５は、ＰＥＧ化ペプチド１９（配列番号３）の製造のための合成概要図を示す。 図６は、ＰＥＧ化ペプチド２０（配列番号４）の製造のための合成概要図を示す。 図７は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号５及び６）を示す。 図８は、下記の実施例２において「Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号７及び８）を示す。 図９は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号９及び１０）を示す。 図１０は、下記の実施例２において「ＴＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１及び１２）を示す。 図１１は、次のように定義される条件下で、種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成される血小板数を示す。 ＰＥＧ−ＭＧＤＦ：大腸菌において発現される（従ってグリコシル化されていない）、還元的アミノ化によって天然ヒトＴＰＯのアミノ酸１−１６３のＮ末端アミノ基に連結した平均分子量２０ｋＤのＰＥＧ、 ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１３）を持つＴＰＯ擬似ペプチド、 ＴＭＰ−ＴＭＰ：アミノ酸配列、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ−ＧＧＧＧＧＧＧＧ−ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１４）を持つＴＰＯ擬似ペプチド、 ＰＥＧ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：ＰＥＧ基が図６に示すような平均分子量５ｋＤのＰＥＧである、配列番号１４のペプチド、 Ｆｃ−ＴＭＰ−ＴＭＰ：同一の第二モノマーで二量体化された（すなわち、図２に示すように、Ｃｙｓ残基７と１０が第二モノマー中の対応するＣｙｓ残基に結合して二量体を形成する）配列番号８（図８）の化合物、そして ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃは、ＦｃドメインがＴＭＰ−ＴＭＰペプチドのＮ末端ではなくＣ末端で結合していることを除いて、ＴＭＰ−ＴＭＰ−Ｆｃと同じように二量体化された配列番号１０（図９）の化合物である。 図１２は、移植した浸透圧ポンプを通して送達される種々の化合物で７日間にわたって処置した正常ＢＤＦ１マウスにおいて、インビボで生成された血小板の数を示す。化合物は図７について定義されたとおりである。 図１３は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５及び１６）を示す。 図１４は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７及び１８）を示す。 図１５は、下記の実施例３において「ＥＭＰ−ＥＭＰ−Ｆｃ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９及び２０）を示す。 図１６は、下記の実施例３において「Ｆｃ−ＥＭＰ−ＥＭＰ」として同定される分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１及び２２）を示す。 発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９８１１３）を形成するためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４位）とＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入されるＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。 発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣアクセス番号９８１１３）を形成するためにユニークＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４３６４位）とＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中４５８５位）制限部位の間に挿入されるＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘモグロビンを示す。 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成される赤血球を示す。 種々の化合物の１００μｇ／ｋｇの単回ボーラス注射によって処置した正常雌性ＢＤＦ１マウスにおいてインビボで生成されるヘマトクリットを示す。 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／ｋｇ／日で処置したマウスについてのヘモグロビンを示す。 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／ｋｇ／日で処置したマウスについての赤血球を示す。 図１８Ｂは、ＥＭＰに関しては１００μｇ／ｋｇ、ｒｈＥＰＯに関しては３０Ｕ／マウスで送達される微小浸透圧ポンプにより７日間にわたって１００μｇ／ｋｇ／日で処置したマウスについてのヘマトクリットを示す。 下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す。 下記の実施例４で述べるＦｃ−ＴＮＦ−α阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５５及び１０５６）を示す。 下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す。 下記の実施例４で述べるＴＮＦ−α阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５７及び１０５８）を示す。 下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。 下記の実施例５で述べるＦｃ−ＩＬ−１拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０５９及び１０６０）を示す。 下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。 下記の実施例５で述べるＩＬ−１拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６１及び１０６２）を示す。 下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。 下記の実施例６で述べるＦｃ−ＶＥＧＦ拮抗物質融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６３及び１０６４）を示す。 下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。 下記の実施例６で述べるＶＥＧＦ拮抗物質−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６５及び１０６６）を示す。 下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。 下記の実施例７で述べるＦｃ−ＭＭＰ阻害因子融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６７及び１０６８）を示す。 下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。 下記の実施例７で述べるＭＭＰ阻害因子−Ｆｃ融合分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１０６９及び１０７０）を示す。

Claims (22)

1. 式：
   Ｉ：（Ｘ^１）_ａ−Ｆ^１−（Ｘ^２）_ｂ
   ［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、
   Ｘ^１及びＸ^２は、各々独立に−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３、及び−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４から選択され、
   Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々独立にＡｎｇ−２結合ペプチドの配列であり、
   Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３及びＬ^４は各々独立にリンカーであり、そして
   ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件として、各々独立に０又は１であり、ペプチドは２〜４０アミノ酸の分子を指し、Ｘ^１もＸ^２も天然タンパク質ではない］
   の物質及びその多量体の組成物。
2. 式：
   ＩＩ：Ｘ^１−Ｆ^１
   又は
   ＩＩＩ：Ｆ^１−Ｘ^２
   の請求項１に記載の物質の組成物。
3. 式：
   ＩＶ：Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１
   の請求項１に記載の物質の組成物。
4. 式：
   Ｖ：Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２
   の請求項１に記載の物質の組成物。
5. Ｆ^１がＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の物質の組成物。
6. Ｆ^１がＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の物質の組成物。
7. Ｆ^１が配列番号２の配列を含む、請求項１に記載の物質の組成物。
8. 請求項１から７のいずれかに記載の物質の組成物をコードするＤＮＡ。
9. 請求項８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
11. 細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１０に記載の細胞。
12. Ａｎｇ−２結合化合物を製造する方法であって、
    ａ）少なくとも１個のランダムＡｎｇ−２結合ペプチドを選択し、そして
    ｂ）式Ｉ：
    Ｉ：（Ｘ^１）_ａ−Ｆ^１−（Ｘ^２）_ｂ
    ［式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、
    Ｘ^１及びＸ^２は、各々独立に−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３、及び−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４から選択され、
    Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々独立に選択されたＡｎｇ−２結合ペプチドの配列であり、
    Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３及びＬ^４は各々独立にリンカーであり、そして
    ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、ａとｂの少なくとも一方が１であることを条件として、各々独立に０又は１である］の化合物及びその多量体を調製すること、
    を包含する、前記方法。
13. 式：
    ＩＩ：Ｘ^１−Ｆ^１
    又は
    ＩＩＩ：Ｆ^１−Ｘ^２
    の化合物が製造される、請求項１２に記載の方法。
14. 式：
    ＩＶ： Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１
    又は
    Ｖ：Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、
    の化合物が製造される、請求項１２に記載の方法。
15. Ｆ^１がＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の方法。
16. Ｆ^１がＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の方法。
17. Ｆ^１が配列番号２の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
18. Ａｎｇ−２結合ペプチドが、酵母に基づくスクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析、或いは、ファージディスプレイライブラリー、大腸菌ディスプレイライブラリー、リボソームライブラリー、又は化学ペプチドライブラリーのスクリーニングから選択される１以上の技術を含む方法で選択される、請求項１２に記載の方法。
19. Ａｎｇ−２結合ペプチドがファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより選択される、請求項１２に記載の方法。
20. 式Ｉの化合物の製造が、
    ａ．選択ペプチドをコードする核酸配列およびＦｃドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を調製すること；
    ｂ．遺伝子構築物を発現すること、
    によって行なわれる、請求項１２に記載の方法。
21. 遺伝子構築物が大腸菌細胞において発現される、請求項２０に記載の方法。
22. Ａｎｇ−２結合ペプチドの選択が、
    ａ．第一選択ペプチドをコードする核酸配列およびＦｃドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子構築物を調製すること；
    ｂ．遺伝子構築物および突然変異性プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、
    を包含し、ここで、
    ｉ）第１突然変異性プライマーは遺伝子構築物のコード鎖の５’末端または近くの配列に相補的な核酸配列を含み、
    ｉｉ）第２突然変異性プライマーは遺伝子構築物の非コード鎖の３’末端に相補的な核酸配列を含む、前記方法。

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