PL178384B1

PL178384B1 - Wydzielone białko, wydzielone cząsteczki polinukleotydowe, wektor ekspresji, hodowana komórka, kompozycja farmaceutyczna do stymulacji wytwarzania płytek krwi u ssaka, sposób wytwarzania białka homeopoezyjnego, sposób otrzymywania przeciwciał, sposób stymulacji i namnażania komórek

Info

Publication number: PL178384B1
Application number: PL94315914A
Authority: PL
Inventors: Richard D. Holly; Si Lok; Donald C. Foster; Frederick S. Hagen; Kenneth Kaushansky; Joseph L. Kuijper; Catherine E. Lofton-Day; Pieter J. Oort; Steven K. Burkhead
Original assignee: Univ Washington; Zymogenetics Inc
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 2000-04-28
Also published as: AU691828B2; HU9602224D0; BG100771A; SK100896A3; BG63508B1; JPH09508797A; NO963371L; HUT75359A; BR9408534A; EP0745125A1; FI963185L; PL315914A1; FI963185A7; WO1995021920A1; KR100289201B1; FI963185A0; NZ271230A; CZ221496A3; AU7481094A; CN1148408A

Abstract

1 Wydzielone bialko, znamienne tym, ze wybiera sie je z grupy obejmujacej (a) bialka obejmujace/sekwencje aminokwasowa SEKW NR ID 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206, (b) allelowe wananty (a), i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których bialko stymuluje namnazanie lub róz- nicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych 13 Wydzielona czasteczka polmukleotydowa, znamienna tym, ze wybiera sie ja z grupy obejmujacej (a) czasteczki DNA kodujace bialko hemopoezyjne i zawierajace sekwencje nukleotydowa SEKW NR ID 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722, (b) allelowe warianty (a), (c) czasteczki DNA kodujace bialko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz (d) czasteczki komplementarne do (a), (b) lub (c) 15 Wektor ekspresji, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace operatywnie zwiazane elementy promotor transkrypcji, segment DNA wybrany z grupy obejmujacej (a) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne i zawierajace sekwencje nukleotydowa SEKW NR ID 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722, (b) allelowe warianty (a), (c) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz terminator transkrypcji 18 Hodowana komórka, znamienna tym, ze wprowadza sie do niej wektor ekspresji, który obejmuje nastepujace operatywnie zwiazane elementy promo- tor transkrypcji, segment DNA wybrany z grupy obejmujacej (a) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne i zawierajace sekwencje nukleotydowa SEKW NR ID 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722, (b) allelowe warianty (a), (c) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sek- wencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka ta daje ekspresje bialka hemopoezyjnego kodowanego przez segment DNA 23 Sposób wytwarzania bialka hemopoezyjnego, znamienny tym, ze hoduje sie komórke, do której wprowadzono wektor ekspresji, który obejmuje naste- pujace operatywnie zwiazane elementy promotor transkrypcji, segment DNA wybrany z grupy obejmujacej (a) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne i zawierajace sekwencje nukleotydowa SEKW NR ID 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722, (b) allelowe warianty (a), (c) segmenty DNA kodujace bialko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka daje ekspresje bialka hemopoezyjnego kodowanego przez segment DNA, oraz odzyskuje sie bialko hemopoezyjne 25 Kompozycja farmaceutyczna do stymulacji wytwarzania plytek krwi u ssaka, znamienna tym, ze zawiera leczniczo skuteczna ilosc bialka hemopoezyj- nego, wybranego z grupy obejmujacej (a) bialka obejmujace sekwencje aminokwasowa SEKW NR ID 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwaso- wej 206, (b) allelowe warianty (a), oraz (c) homologi gatunkowe (a) lub (b), w polaczeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nosnikiem 27 Sposób otrzymywania przeciwcial, polegajacy na tym, ze immunizuje sie ssaka oraz izoluje sie przeciwciala, znamienny tym, ze do immunizacji stosu- je sie bialko badz jego fragment, które wybiera sie z grupy obejmujacej, (a) bialka obejmujace sekwencje aminokwasowa SEKW NR ID 2 od reszty aminokwa- sowe 45 do reszty aminokwasowej 206, (b) allelowe warianty (a), i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których bialko stymuluje namnazanie lub róznicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidanych 28 Sposób stymulacji i namnazania komórek, znamienny tym, ze dodaje sie do hodowanych komórek szpiku kostnego wydzielone bialko wybrane z grupy obejmujacej (a) bialka obejmujace sekwencje aminokwasowa SEKW NR ID . 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206, (b) allelowe wa- rianty (a), i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których bialko stymuluje namnazanie lub róznicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych, w ilosci do- statecznej do stymulacji namnazania komórek PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wydzielone białko, charakteryzujące się tym, że wybiera się je z grupy obejmującej:

(a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych.

Korzystne jest wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 379.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 353.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 1 do reszty aminokwasowej 173.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że jest to białko myszy.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że jest to białko ludzkie.

Korzystne jest także wydzielone białko według wynalazku, charakteryzujące się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175 oraz sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 353.

Przedmiotem wynalazku jest także wydzielone białko stymulujące namnażanie lub różnicowanie szpikowych lub limfoidalnych prekursorów, charakteryzujące się tym, że obejmuje segment identyczny co najmniej w 80% na poziomie aminokwasów z sekwencją aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206.

Przedmiotem wynalazku jest także wydzielona cząsteczka polinukleotydowa, charakteryzująca się tym, że koduje białko, które wybiera się z grupy obejmującej:

Korzystna jest wydzielona cząsteczka DNA według wynalazku, charakteryzująca się tym, że stanowi cząsteczkę kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206.

Korzystnajest także wydzielona cząsteczka DNA według wynalazku, charakteryzująca się tym, że stanowi cząsteczkę kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175.

Przedmiotem wynalazku jest także wydzielona cząsteczka polinukleotydowa, charakteryzująca się tym, że wybiera się ją z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową sEkW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

178 384 (c) cząstecząs DNA k<Nujące biąHeo hemopoezyjne identyczne yo naj nrniejw 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b);

oraz (d) cząsteczki komplementarne do (a), (b) lub (c).

Przedmiotem wynalazku jest także wydzielona cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że wybiera się ją z grupy obejmującej:

(a) insert EcoRI-XhoI plazmidu pZGmpl-1081;

(b) allelowe warianty (a); oraz (c) cząsteczki DNA identyczne co najmniej w 60% do (a) lub (b) w sekwencji nukleotydowej, przy czym wydzielona cząsteczka DNA koduje białko o aktywności homopoozyjnoj.

Przedmiotem wynalazkujest także wektor ekspresji, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b);

oraz terminator transkrypcji.

Korzystny jest wektor ekspresji według wynalazku, charakteryzujący się tym, że obejmuje ponadto sekwencję sygnału sekrecji operatywnie związaną z segmentem DNA.

Korzystnyjest także wektor ekspresji według wynalazku, charakteryzujący się tym, że segment DNA jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW NR ID.: 18 od nukleotydu 64 do nukleotydu 519; oraz (b) allelowe warianty (a).

Przedmiotem wynalazku jest także hodowana komórka, charakteryzująca się tym, że wprowadza się do niej wektor ekspresji, który obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko homopoezyjno identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka ta daje ekspresję białka hemopoezyjnego kodowanego przez segment DNA.

Korzystna jest hodowana komórka według wynalazku, charakteryzująca się tym, że stanowi komórkę grzyba, korzystniej komórkę drożdży.

Korzystna jest także hodowana komórka według wynalazku, charakteryzująca się tym, że stanowi komórkę ssaka.

Korzystna jest także hodowana komórka według wynalazku, charakteryzująca się tym, że stanowi komórkę bakterii.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka hemopoezyjnego, charakteryzujący się tym, że hoduje się komórkę, do której wprowadzono wektor ekspresji, który obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko hewopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b); oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka daje ekspresję białka homopoozyjnego kodowanego przez segment DNA, oraz odzyskuje się białko homopoozyjne.

178 384

Korzystny jest sposób według wynalazku, charakteryzujący się tym, że białko hemopoezyjne ulega sekrecji przez komórkę i odzyskuje się go z pożywki, w której jest hodowana komórka.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do stymulacji wytwarzania płytek krwi u ssaka, charakteryzująca się tym, że zawiera leczniczo skuteczną ilość białka hemopoezyjnego, wybranego z grupy obejmującej:

(b) allelowe warianty (a); oraz (c) homologi gatunkowe (a) lub (b), w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, charakteryzująca się tym, że białko zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:

(a) SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175; oraz (b) allelowe warianty (a).

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania przeciwciał, polegający na tym, że immunizuje się ssaka oraz izoluje się przeciwciała, charakteryzujący się tym, że do immunizacji stosuje się białko bądź jego fragment, które wybiera się z grupy obejmującej;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidanych.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób stymulacji namnażania komórek, charakteryzujący się tym, że dodaje się do hodowanych komórek szpiku kostnego wydzielone białko wybrane z grupy obejmującej:

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych;

w ilości dostatecznej do stymulacji namnażania komórek.

Korzystny jest sposób według wynalazku, charakteryzujący się tym, że jako komórkę stosuje się megakariocyty lub prekursory megakariocytów.

Figura 1 jest częściową restrykcyjną mapą wektora pDX. Użyto symboli SV40 ori, początek replikacji z SV40; SV40 E, czynnik ułatwiający SV40; MLP, główny późny promotor adenowirusa; Ll-3, trójczęściowy lider adenowirusa; ss, sygnały dzielenia; pA, miejsce poliadenylacji.

Figura 2 ilustruje konstrukcję plazmidu pBJ3. Użyto symboli TPIp, promotor TPI1; TPIt, terminator TPI1; AAT, cDNA α- lantytrypsyny; alfa, lider czynnika alfa; mTPO, kodująca sekwencja mysiej TPO.

Przed opisaniem niniejszego wynalazku w szczegółach, może być pomocne zdefiniowanie pewnych użytych terminów: Allelowy wariant: Alternatywna forma genu powstająca przez mutację, lub zmieniony polipeptyd kodowany przez zmutowany gen. Mutacje genu mogą być milczące (bez zmian) w kodowanym polipeptydzie.

Promotor: Część genu, z którą wiąże się polimeraza RNA i rozpoczyna synteza mRNA.

Jak wspomniano wyżej, przedmiotem niniejszego wynalazku są materiały i sposoby do stosowania w wytwarzaniu białka mającego hemopoezyjnąaktywność. W niniejszym opisie, termin „hemopoezyjną” oznacza zdolność do stymulacji namnażania i/lub różnicowania szpikowych lub limfoidalnych prekursorów w sposób określony przez standardowe testy. Patrz, np., Metcalf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5327-5330, 1980; Metcalf i in., J. Celi. Physiol. 116:198-206,1983;iMetcalfiin.,Exp.Hematol. 1987. Typowo, komórki szpiku inkubuje się w obecności badanej próbki i próbki kontrolnej. Kultury zlicza się następnie na namnażanie i różnicowanie komórek optycznie i/lub przez barwienie. Szczególnie korzystnym

178 384 testem jest kolorymetryczny test MTT Mosmana (J. Immunol. Meth. 65:55-63,1983; dołączany jako odnośnik literaturowy) opisany dokładniej w poniższych przykładach.

Niniejszy wynalazek jest oparty częściowo na odkryciu an aktywności stymulującej wzrost komórek poprzez receptor MPL. Receptor ten (Souyri i in., Celi 63:1137-1147,1990) był przed tym odkryciem, nieprzypisanym receptorem, którego naturalny ligand był nieznany. Dzięki procesom klonowania i mutagenezy opisanym w szczegółach w poniższych przykładach, wynalazcy rozwinięli linię komórek zależną od stymulacji ścieżki związanej z receptorem MPL dla przeżycia i wzrostu, i zdolną do autokrynowej stymulacji receptora. Kondycjonowana pożywka z takich niezależnych od interleukiny-3 (IL-3) komórek okazała się wspomagać wzrost komórek dających ekspresję receptora MPL i w innych znaczeniach zależnych od IL-3. Eksperymenty zobojętniania przeciwciał wykazały, że aktywność ta nie pojawia się wskutek działania IL-3 lub IL-4, i że może być zobojętniona rozpuszczalną postaciąreceptora MPL. Następnie wytworzono bibliotekę cDNA z niezależnej od iL-3 linii komórek. DNA użyto do transfekcji komórek nerki młodego chomika (BHK), i pożywkę z tr^^^^fekt^^t^t^-w testowano na zdolność do stymulacji namnażania komórki zależnej od MPL. Pozytywny klon wydzielono i wytworzono rekombinacyjny ligand MPL. Rekombinacyjne białko okazało się stymulować namnażanie szerokiego spektrum szpikowych i limfoidalnych prekursorów, a w szczególności, stymulować wytwarzanie megakariocytów i krwinek białych obojętnochłonnych z komórek rodzicielskich w szpiku kostnym. Dodatko wo, rekombinacyjne białko okazało się stymulować wytwarzanie płytek krwi u zwierząt doświadczalnych. W świetle tych aktywności białko nazwano trombopoetyną(TPO).

Przedmiotem niniejszego wynalazku są wydzielone polinukleotydowe cząsteczki kodujące trombopoetynę. Przydatne w tym sensie polinukleotydowe cząsteczki obejmują mRNA, genomowy DNA, cDNA, syntetyczny DNA i cząsteczki DNA powstające przez ligację fragmentów z różnych źródeł.

W celu wytwarzania rekombinacyjnego TPO, korzystne są w większości systemów ekspresji cząsteczki DNA pozbawione intronów. Przez „wydzielone” rozumie się, że cząsteczki usuwa się z ich naturalnego środowiska genetycznego. Tak więc przedmiotem wynalazku są cząsteczki DNA wolne od innych genów, z których są zwykle związane. W szczególności, cząsteczki sąwolne od zewnętrznych lub niechcianych kodujących sekwencji, i w postaci dogodnej do stosowania w genetycznie przetworzonych systemach wytwarzania białek.

Sekwencje klonów cDNA kodujących reprezentatywne mysie i ludzkie białka TPO pokazano na SEKW. NR ID.: 1i SEKW. NR ID.: 18, odpowiednio, a odpowiednie sekwencje aminokwasowe pokazano na SEKW. NR ID.: 2 i SEKW. NR ID.: 19, odpowiednio. Fachowcy zauważą, że sekwencje SEKW. NR ID.: 12,18 i 19, i genomowe sekwencje SEKW. NR ID.: 28 i 29, odpowiadają pojedynczym allelom mysiego lub ludzkiego genu, i można się spodziewać allelowych odmian. Allelowe warianty sekwencji DNA SEKW. NR ID.: 1, SEKW. NR ID.: 18 i SEKW. NR ID.: 28, w tym zawierające milczące mutacje i te, w których mutacje dajązmiany sekwencji aminokwasów, mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku, takjak białka będące allelowymi wariantami SEKW. NR ID.: 2 i SEKW. NR ID.: 19. Oczywiste też będzie, że fachowiec może wstawić miejsca ułatwiające manipulacje sekwencjąnukleotydowąz alternatywnymi kodonami.

Mysie i ludzkie sekwencje opisane tutaj są przydatnymi narzędziami do wytwarzania wydzielonych polinukleotydowych cząsteczek kodujących białka TPO innych gatunków („homologi gatunkowe”). Korzystnie takie homologi gatunkowe obejmują homologi ssaków takie jak bydlęce, psie, świńskie, owcze, końskie i, w szczególności, białka naczelnych. Sposoby stosowania informacji sekwencyjnej z pierwszego gatunku do klonowania odpowiednich polinukleotydowych sekwencji z drugiego gatunku sądobrze znane fachowcom. Patrz, np. Ausubel i in., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Inc., NY, 1987. Cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku kodujące TPO są zwykle co najmniej w 60%, korzystnie co najmniej w 80%, i może w 90-95% lub bardziej identyczne z sekwencją SEKW. NR ID.: 1 i SEKW. NR ID: 18 i ich allelowymi wariantami. Cząsteczki trombopoetyny charakteiyszijąsię zdolnością do specyficznego wiązania z receptorem MPL tych samych gatunków i do stymulacji wytwarza178 384 nia płytek krwi in vivo. W normalnych zwierzętach doświadczalnych, TPO może podwyższać poziomy płytek krwi o 100% lub więcej w czasie 10 dni po rozpoczęciu codziennego podawania.

Analiza dystrybucji mRNA wykazała, że mRNA kodujący TPO znajdował się w kilku tkankach ludzkich i mysich, w większej ilości w płucach, wątrobie, sercu, mięśniach szkieletu i nerkach. Tak więc w celu wydzielenia homologów innych gatunków, wytwarza się bibliotekę cDNA, korzystnie z jednej z tkanek, które w'ytwarzały wyższe poziomy mRNA. Sposoby wytwarzania bibliotek cDNA są dobrze znane fachowcom. Patrz, np., Sambrook i in , wydawcy, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i podane tam odnośniki. W celu wykrycia cząsteczek kodujących TPO, biblioteki sonduje się następnie mysim lub ludzkim cDNA opisanym tutaj lub jego fragmentem lub jednym lub większą liczbą małych sond opartych na opisanych sekwencjach. Szczególnie przydatne są sondy obejmujące oligonukleotyd o co najmniej około 14 lub więcej nukłeotydach i mające do 25 lub więcej nukleotydów, co najmniej w 80% identyczne z częścią o tej samej długości SEKW. NR ID.: 1, SEKW. NR ID.: 18, SEKW. NR ID.: 28 lub ich komplementarnych sekwencji. Korzystne jest sondowanie biblioteki z niską intensywnościąhybrydyzacji, to jest około 2x SSC i w temperaturze hybrydyzaji około 50°C stosując znakowane sondy. Cząsteczki, z którymi hybrydyzuje sonda, wykrywa się stosując standardowe procedury wykrywania. Pozytywne klony potwierdza się analizą sekwencji i' testami aktywności, takimi jak zdolność do wiązania homologicznego receptora MPL (to jest receptora MPL z tego samego gatunku co cDNA) lub do stymulacji hemopoezy w homologicznych komórkach szpiku. Dla fachowca będzie oczywiste, że można stosować inne sposoby klonowania.

Polinukleotydowe cząsteczki kodujące TPO (w tym allelowe warianty i homologi gatunkowe cząsteczek opisanych tutaj) można też wydzielić przez klonowanie z liniąkomórek wytwarzających ligand MPL i wykazujących autokrynową stymulację wzrostu. Krótko, zależną od czynnika linię komórek transfekuje się dla wywołania ekspresji receptora MPL (Vigon i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644,1992; Skoda i in., EMBO J. 12:2645-2653,1993; i SEKW. NR ID.: 17), następnie mutagenizuje, i wybiera się niezależne od czynnika komórki. Te komórki stosuje się następnie jako źródło mRNA TPO. Dogodne zależne od czynnika linie komórek obejmuj ązależnąod IL-3 linię komórek BaF3 (Palacios i Steinmetz, Celi 41:727-734,1985; Mathey-Prevot i in., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135,1986),FDC-P1 (Hapel i in., Blood 64:786-790,1984), i M07e (Kiss i in., Leukemia 7:235-240,1993). Zależną od czynnika wzrostu linię komórek można ustalić zgodnie z opublikowanymi metodami (np. Greenberger i in., Leukemia Res. 8:363-375,1984; Dexter i in., in Baum i in. Eds., Expenmental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 19Ί9,145-156,1980). W typowej procedurze, komórki usuwa się z tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (np. szpiku kostnego, śledziony, wątroby płodowej) i hoduje w konwencjonalnej, uzupełnioną surowicą pożywce, takiej jak RPM.I 1640 uzupełniona 10% plodowąsurowicąbydlęcą(FBS), 15%surowicąkońskąi 10'⁶Mhydrokortyzonu. W odstępach 1-2 tygodni nieadhezyjne komórki zbiera się, i kultury karmi się świeżą pożywką. Zebrane, nieadhezyjne komórki przemywa się i hoduje w pożywce z dodanym źródłem czynnika wzrostu (np. RPMI 1640 + 10% FBS + 5-20% kondycjonowanej pożywki WEHI-3 jako źródła IL-3). Te komórki karmi się świeżą pożywką w odstępach 1-2 tygodni i rozprzestrzenia w miarę wzrostu kultury. Po kilku tygodniach do kilku miesięcy, indywidualne klony wydziela się umieszczając komórki na płytkach na półstałej pożywce (np. pożywce zawierającej metylocelulozę) lub metodą ograniczającego rozcieńczenia. Zależność klonów od czynnika potwierdza się hodując indywidualne klony przy braku czynnika wzrostu. Można stosować retrowirnsową infekcję lub chemiczną mutagenezę w celu wytworzenia większej ilości zależnych od czynnika wzrostu komórek. Zależne od czynnika komórki transfekuje się dla wywołania ekspresj i recept ora MPL, następnie mutagenizuje, np. przez chemiczną obróbkę, naświetlanie nadfioletem, naświetlanie promieniowaniem rentgenowskim, lub retrowirnsową insercyjną mutagenezę. Zmutowane komórki są następnie hodowane w warunkach, w których przeżycie komórki zależy od wytwarzania autokrynowego czynnika wzrostu, to znaczy przy braku egzogennego czynnika wzrostu wymaganego przez rodzicielskie komórki. Wytwarzanie TPO potwierdza się metodą skriningu, takąjak testowanie kondycjonowanej pożywki on komórkach dających lub nie dających ekspre12

178 384 sji receptora MPL lub testowanie aktywność kondycjonowanej pożywki w obecności rozpuszczalnego receptora MPL lub przeciwciała wobec znanej cytokiny.

Przedmiotem wynalazku są też wydzielone białka zasadniczo homologiczne do białek SEKW. NR ID.: 2 lub SEKW. NR ID.: 19 i ich homologi gatunkowe. Przez „wydzielone” rozumie się białko w stanie innym niż rodzime środowisko, takie jak poza tkankami krwi i zwierzęcymi. W korzystnej postaci, wydzielone białkojest zasadniczo wolne od innych białek, szczególnie innych białek zwierzęcego pochodzenia. Korzystne jest wytwarzanie białka w silnie oczyszczonej postaci, to jest ponad 95% czystości, korzystniej ponad 99% czystości. Termin „zasadniczo homologiczny” stosuje się tutaj do określania białka mając (ego 50%, korzystnie 60%, korzystniej co najmniej 80%, identyczności sekwencji z sekwencją pokazaną na SEKW. NR ID.: 2 lub SEKW. NR ID.: 19 lub ich homologach gatunkowych. Takie białka będą korzystniej co najmniej w 90% identyczne, i najkorzystniej w 95% lub bardziej identyczne z SEKW. NR ID.: 2 lub SEKW. NR ID.: 19 lub ich homologami gatunkowymi. Procent identyczności sekwencji określa się konwencjonalnymi metodami. Patrz, np. Altschul i in., Buli. Math. Bio. 48:603-616,1986 i Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919,1992. Krótko, dwie sekwencje aminokwasowe ustawia się względem siebie w celu optymalizacji zliczenia ustawienia stosując karę za otwarcie luki 10, karę za przedłużenie luki 1, i matrycę oceniania „blosum 62” Henikoffa i Henikoffa (ibid.) w sposób pokazany w tabeli 1 (aminokwasy są oznaczone standardowymi jednoliterowymi kodami). Procentową identyczność oblicza się następnie jako:

_całkowita liczba dopasowań__χ]θθ [długość dłuższej sekwencji plus liczba luk wprowadzonych dodłuższej sekwencji w celu wyrównaniaobu sekwencji]

Tabela 1

A	R	N	D	C	Q	E	G	H	I	L	K	M	F	P	S	T	W	Y	V
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
E	-1	0	0	2	-4	2	5
G	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3	4
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2	1	2	-1	5
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
W	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2	2	7
V	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1

178 384

Zasadniczo homologiczne białka charakteryzuje się jako mające jedno lub więcej aminokwasowych podstawień, delecji lub addycji. Zmiany te są korzystnie niewielkimi, konserwatywnymi aminokwasowymi podstawieniami nie wpływającymi znacząco na zwijanie lub aktywność białka (patrz tabela 2); małymi delecjami, typowo 1 do około 30 aminokwasów; i małymi amino- lub karboksyterminalnymi przedłużeniami, takimi jak amino-terminalna reszta metioninowa, mały linkerowy peptyd mający do około 20-25 reszt, lub małe przedłużenie ułatwiające oczyszczanie, takie jak trakt polihistydynowy, antygenowy epitop lub domena wiążąca. Patrz ogólnie Fordi in., Protein Expression and Purification 2:95-107,1991, dołączany jako odnośnik literaturowy.

Tabela 2

Konserwatywne podstawienia aminokwasowe

Zasadowe:	arginina lizyna histydyna
Kwasowe:	kwas glutaminowy kwas aspartowy
Polarne:	glutamina asparagina
Hydrofobowe:	leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne:	fenyloalsmins tryptofan tyrozyna
Małe:	glicyna alanina seryna treonina metionina

Najistotniejsze aminokwasy w TPO można zidentyfikować zgodnie z procedurami znanymi fachowcom, takimi jak skierowana na miejsce mutageneza lub mutageneza ze skanowaniem alaninowym (Cunningham i Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). W tej ostatniej technice, wprowadza się pojedyncze alaninowe mutacje na każdej reszcie w cząsteczce, i powstałe mutantowe cząsteczki testuje się na biologiczną aktywność (np. wiązanie receptora, aktywność namnażania in vitro lub in vivo) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych krytycznych dla aktywności cząsteczki. Miejsca interakcji ligand-receptor można też ustalić metodą analizy struktury krystalicznej takimi technikami jak magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia lub znakowanie fotopowinowactwa. Patrz, np., de Vos i in., Science 255:306-312,1992; Smith i in.,

J. Mol. Biol. 224:^^^-99)4,1992; Wlodaver i in., FEBS Lett. 309:59-64, 1992.

Ogólnie, cytokiny msjąprzewidywsną strukturę heliksu 4-alfa, z pierwsząi czwartą spiralą najważniejszą w interakcjach ligand-receptor i silnie zakonserwowaną pośród członków rodziny. Zgodnie z ludzką sekwencją aminokwasową TPO pokazaną na SEKW. NR ID.: 19, ułożenie wzajemne sekwencji cytokiny sugeruje, że te spirale sązwiązane resztami aminokwasowymi 29 i 53,80 i 99,108 i 130, i 144 i 168, odpowiednio (granice z dokładnością± 4 reszt) Granice heliksu mysich (SEKW. NR ID. : 2) i innych nie-ludzkich TPO można określić przez dopasowanie wzaj emne z ludzką sekwencją. Inne ważne strukturalne aspekty TPO obejmują reszty cysternowe w pozycjach 51,73,129 i 195 SEKW. NR ID.: 2 (odpowiednio do pozycji 28,50,106 i 172 SEKW. NR ID.: 19).

D odatkowo, białka według niniej szego wynalazku (lub ich polipeptydowe fragmenty) można przyłączyć do innych bioaktywnych cząsteczek, szczególnie innych cytokin, z wytworzeniem multi-funkcyjnej cząsteczki. Na przykład, C-terminalną domenę trombopoetyny można przyłączyć do innych cytokin w celu polepszenia ich biologicznych właściwości lub wydajności wytwarzania. Cząsteczka trombopoetyny wydaje się być złożona z dwu domen. Pierwsza (amino-terminalna) domena z około 150 aminokwasami jest podobna rozmiarami i niesie strukturalne podobieństwo do erytropoetyny i kilku innych hemopoezyjnych cytokin. Za tąpierwszą domeną jest druga domena z około 180 aminokwasami, mająca strukturę będącą nie będącą znacząco podobną do znanych struktur białek w bazach danych. Ta druga domena jest silnie wzbogacona N-związane miejsca glikozylacji i w serynę, prolinę, i trconinę, znaczniki O-związanych miejsc glikozylacji. Ta widocznie wysoka zawartość węglowodanów sugeruje, że domena gra rolę w czynieniu hydrofobowej pierwszej domeny względnie bardziej rozpuszczalną. Eksperymentalne dowody wskazują, że węglowodór związany z drugą domeną bierze udział w poprawnym wewnątrzkomórkowym składaniu i sekrecji białka podczas jego biosyntezy. Druga domena może grać także rolę w stabilizowaniu pierwsza domena wobec proteolitycznej degradacji i/lub przedłużaniu półtrwania cząsteczki in vivo, i może wzmacniać transmitancję biologicznego sygnału lub specyficzną aktywność białka.

Przedmiotem wynalazku jest więc seria nowych, hybrydowych cząsteczek, w których druga domena TPO jest połączona z drugącytokiną. Korzystnie przyłącza się C-terminalną domenę TPO do końca C drugiej cytokiny. Łączenie korzystnie prowadzi się przez cięcie na poziomie DNA dla umożliwienia ekspresji chimerycznej cząsteczki w układach rekombinacyj^ego wytwarzania. Powstałe cząsteczki testuje się następnie na takie właściwości, jak polepszona rozpuszczalność, polepszona trwałość, przedłużony czas półtrwania, lub polepszona ekspresja i sekrecja, oraz famakodynamika. Specyficzne przykłady takich chimerycznych cytokin obejmują te, w których druga domena TPO jest połączona z końcem C EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-6, IL-3 lub IL-11. Jak wspomniano wyżej, dogodnie jest tego dokonać przez fuzję DNA. Fuzyjny cDNA subklonuje się następnie do dogodnego wektora ekspresji i transformuje lub transfekuje do komórek gospodarza lub organizmów zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Powstałe białka fuzyjne oczyszcza się stosując konwencjonalne chromatograficzne techniki oczyszczania (np. chromatografię), i ich właściwości porównuje się z właściwościami rodzimej, niefUzyjnoj, macierzystej cytokiny. Takie hybrydowe cząsteczki mogą następnie obejmować dodatkowe reszty aminokwa:sowe (np. linker polipeptydowy) pomiędzy składowymi białkami lub polipeptydami.

Poza hemopoezyjnymi białkami opisanymi powyżej, niniejszy wynalazek obejmuje fragmenty tych białek i wydzielone polinukleotydowe cząsteczki kodujące fragmenty. Szczególnie interesujące są fragmenty o długości co najmniej 10 aminokwasów wiążące się z receptorem MPL, i polinuklootydowo cząsteczki o długości co najmniej 30 nukleotydów kodujące takie polipeptydy. Polipeptydy tego typu identyfikuje się znanymi metodami skriningu, takimi jak trawienie nietkniętego białka lub synteza małych, nakładających się polipeptydów lub polinukleotydów (i ekspresję tych ostatnich), ewentualnie w połączeniu z technikami strukturalnej analizy opisanymi powyżej. Powstałe polipeptydy testuje się następnie na zdolność do specyficznego wiązania receptora MPL i stymulacji namnażania komórek przez receptor MPL. Wiązanie określa się konwencjonalnymi metodami, takimi jak opisane przez Klotza, Science 217: 1247, 1982 („analiza Scatcharda”). Krótko, radioznakowany testowy polipeptyd inkubuje się z niosącymi receptor MPL komórkami w obecności rosnących stężeń nieznakowanego TPO. Związany z komórką, znakowany polipeptyd oddziela się od wolnego znakowanego polipeptydu przez odwirowanie przez olej ftalanowy. Powinowactwo wiązania testowego polipeptydu określa się wykreślając stosunek związanego do wolnego znakowanego związku na rzędnych wobec związanego na odciętych. Specyficzność wiązania określa się wetodąwspółzawodnictwo z cytokinami innymi niż TPO. Wiązanie receptora można też określić przez wytrącenie testowego związku przez unieruchomiony receptor MPL (lub jego wiążącą ligand pozakoimórkową domeną). Krótko, receptor lub jego część unieruchamia się na nierozpuszczalnym nośniku. Testowy związek znakuje się, np. metodą metabolicznego znakowania komórek gospodarza w przy1718384 padku rekombinacyjnego testowego związku, lub metodą konwencjonalnego znakowania in vitro (np. radio-jodowanie). Znakowany związek łączy się następnie z unieruchomionym receptorem, niezwiązany materiał usuwa się i związany, znakowany związek wykrywa się. Metody wykrywania różnych znaczników są znane. Stymulację namnażania dogodnie określa się stosując kolorymetryczny test MTT z niosącymi receptor MPL komórkami. Polipeptydy testuje się na aktywność w różnych stężeniach, typowo w zakresie od 1nM do 1 mM. Możliwe są też większe polipeptydy, do 50 lub więcej reszt, korzystnie 100 lub więcej reszt, korzystniej około 140 lub więcej reszt, do rozmiaru całego dojrzałego białka. Np., analiza i modelowanie sekwencji aminokwasowej pokazane na SEKW. NR ID.: 2 od reszty 51 do reszty 195, włącznie, lub SEKW. NR ID.: 19 od reszty 28 do reszty 172, włącznie, sugeruje, że te części cząsteczki sącytokinopodobnymi domenami zdolnymi do samodzielnego składania. Przedmiotem zainteresowania są także cząsteczki zawierające tę rdzeniową cytokinopodobną domenę plus jeden lub więcej dodatkowych segmentów lub domen produktu pierwszorzędowej tr^i^islacji. Tak więc inne polipeptydy będące przedmiotem zainteresowania obejmują pokazane w tabeli 3.

Tabela 3

Mysie TPO (SEKW. NR ID.: 2):

Cys (reszta 51) — Wal (reszta 196)

Cys (51) — Pro (206)

Cys (51) — Tre (379)

Ser (45) — Cys (195)

Ser (45) — Wal (196)

Ser (45) — Pro (206)

Ser (45) — Tre (379)

Met (24) — Cys (195)

Met (24) — Wal (196)

Met (24) — Pro (206)

Met (24) — Tre (379)

Met (1) — Cys (195)

Met (1) — Wal (196)

Met (1) — Pro (206)

Met (1) — Tre (379)

Ludzki TPO (SEKW. NR ID.: 19)

Cys (28) — Wal (173)

Cys (28) — Arg (175)

Cys (28) — Gli (353)

Ser (22) — Cys (172)

Ser (22) — Wal (173)

Ser (22) — Arg (175)

Ser (22) — Gli (353)

Met (1) — Cys (172)

Met (1) — Wal (173)

Met (1) — Arg (175)

Met (1) — Gli (353)

Fachowcy zrozumieją, że pośrednie formy cząsteczek (np. te mające koniec C pomiędzy resztami 1961 206 SEKW. NR iD.: 2 lub te mające koniec N pomiędzy resztami 22 i 28 SeKw. NR ID.: 19) są także przedmiotem zainteresowania, takjak i polipeptydy mające jedno lub więcej aminokwasowych podstawień, delecji, insercji, lub N- lub C-terminalnych przedłużeń opisanych powyżej. Tak więc przedmiotem niniejszego wynalazku sąhemopoezyjne polipeptydy o co najmniej 10 resztach aminokwasowych, korzystnie co najmniej 50 resztach, korzystniej co najmniej

178 384

100 resztach i najkorzystniej co najmniej około 140 resztach, w których polipeptydy sązasadniczo homologiczne do podobnych rozmiarów polipeptydów SEKW. NR ID.: 2 lub SEKW. NR ID.: 19.

Białka według niniejszego wynalazku można wytwarzać w genetycznie przetworzonych komórkach gospodarza zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Dogodne komórki gospodarza to te komórki, które mogąbyć transformowane lub transfekowane egzogennym DNA i rosną w kulturze, i obejmują one bakterie, komórki grzyba i hodowane wyższe komórki eukariotyczne. Techniki manipulacji klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogennego dNa do różnych komórek gospodarza opisał Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, i Ausubel i in., ibid., dołączanym jako odnośnik literaturowy.

Ogólnie, sekwencja DNA kodująca białko według niniejszego wynalazku jest związana operatywnie z promotorem i terminatorem transkrypcji wewnątrz wektora ekspresji. Wektor będzie zwykle zawierałjeden lub więcej wybieralnych markerów i jeden lub więcej początków replikacji, chociaż fachowcy zrozumieją, że w pewnych systemach wybieralne markery można zapewnić na oddzielnych wektorach, i replikację egzogennego DNA można zapewnić przez integrację w genom komórek gospodarza. Dobór promotorów, terminatorów, wybieralnych markerów, wektorów i innych elementów jest sprawą rutynowego projektowania dla zwykłych fachowców. Wiele takich elementów opisano w literaturze i są one dostępne w handlu.

W celu skierowania białka według niniejszego wynalazku na ścieżkę sekrecji komórek gospodarza, w wektorze ekspresji umieszcza się sekwencję sygnału sekrecji (także znanąjako sekwencję liderową, sekwencję prepro lub sekwencję pre). Sekwencja sygnału sekrecji jest połączona z sekwencjąDNA koduj ącąbiałko według niniejszego wynalazku w poprawnej ramce odczytu. Sekwencja sygnału sekrecji jest zwykle umieszczona w kierunku 5' wobec sekwencji DNA kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania, chociaż pewne sekwencje sygnałowe mogąbyć położone gdziekolwiek w sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania (patrz, np., Welch i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5037743; Holland i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5143830). Sekwencja sygnału sekrecji może być zwyczajnie związana z białkiem według niniejszego wynalazku, lub z genem kodującym inne wydzielane białko.

Komórki drożdży, szczególnie komórki rodzaju Saccharomyces, są korzystnymi gospodarzami do stosowania w niniejszym wynalazku. Metody transformowania komórek drożdży egzogennym DNA i wytwarzania rekombinacyjnych białek opisał np. Kawasaki, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4599311; Kawasaki i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4931373; Brake, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4870008; Welch i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5037743; i Murray i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4845075, dołączane jako odnośniki literaturowe. Transformowane komórki wybiera się według fenotypu określonego przez wybieralny marker, zwykle oporność na lek lub zdolność do wzrostu przy braku poszczególnego składnika pokarmowego (np. leucyny). Korzystny układ wektorowy do stosowania w drożdżach to układ wektorowy POT1 opisany przez Kawasaki i in. (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4931373), który pozwala dobierać transformowane komórki według cechy wzrostu w zawierających glukozę pożywkach. Korzystna sekwencja sygnału sekrecji do stosowania w drożdżach pochodzi z genu S. cerevisiae MFal (Brake, ibid.; Kurjan i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4546082). Dogodne promotory i terminatory do stosowania w drożdżach obejmują pochodzące z genów enzymów glikolitycznych (patrz, np. Kawasaki, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4599311; Kingsman i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4615974; i Bitter, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4977092, dołączane jako odnośnik literaturowy) i genów dehydrogenazy alkoholu. Patrz także opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4990446; 5063154; 5139936 i 4661454, dołączane jako odnośniki literaturowe. Systemy transformacji w innych drożdżach, w tym Hansenulapolymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia guillermondii i Candida maltosa są znane

178 384 fachowcom. Patrz, np. Gleesoni in., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 i Cregg, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4882279.

Inne komórki grzybów są także dogodne jako gospodarze. Np., komórki Aspergillus można stosować zgodnie ze sposobami Mc Knighta i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4935349, dołączanyjako odnośnik literaturowy. Metody transformacji Acremonium chrysogenum opisał Sumino i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5162228, dołączany jako odnośnik literaturowy. Metody transformacji Neurospora opisał Lambowitz, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4486533, dołączany jako odnośnik literaturowy.

Hodowana komórka ssaka jest także korzystnym gospodarzem w niniejszym wynalazku. Metody wprowadzania egzogennego DNA do ssaczych komórek gospodarza obejmują mediowanąfosforanem wapnia transfekcję (Wigier i in., Celi 14:725,1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham i Van der Eb, Virology 52:456,1973), elektroporację (Neumann i in., EMBO J. 1:841-845,1982) i mediowanąDEAE-dekstranem tr^r^^:fekcję (Ausubel i in., wydawcy, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Ny, 1987), dołączane jako odnośnik literaturowy. Wytwarzanie rekombinacyjnego białka w hodowanych komórkach ssaka opisuje np. Levinson i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4713339; Hagen i in, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4784950; Palmiter i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4579821; i Ringold, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4656134, dołączanejako odnośniki literaturowe. Korzystne hodowane komórki ssaków obejmują linie komórek COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC nr CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573); Graham i in., J. Gen. Virol. 36:59-72,1977) i jajnika chomika chińskiego (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). Dodatkowe dogodne linie komórek są znane fachowcom i dostępne z publicznych depozytorów takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Ogólnie, korzystne są silne promotory transkrypcji, takie jak promotory SV-40 lub cytomegalowirusa. Patrz, np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4956288. Inne dogodne promotory obejmują promotory z genów metalotioneinowych (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4579821 i 4601978, dołączane jako odnośniki literaturowe) i główny późny promotor adenowirusa.

Dobór lekowy stosuje się zwykle w celu wybrania hodowanych komórek ssaka, w które wstawiono obcy DNA. Takie komórki są zwykle nazywane „transfektantami”. Komórki hodowane w obecności selektywnego środka i mogące przekazać gen będący przedmiotem zainteresowania potomstwu są nazywane „trwałymi transfektantami”. Korzystnym wybieralnym markerem jest gen kodujący oporność na antybiotyk neomycynę. Dobór prowadzi się w obecności leku typu neomecyny, takiego jak G-418 lub tym podobne. Systemy doboru można także stosować w celu zwiększenia poziomu ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, a proces określa się nazwą „wzmacniania”. Wzmacnianie prowadzi się hodując transfektanty w obecności małej ilości selektywnego środka i następnie zwiększając ilość selektywnego środka w celu wybrania komórek wytwarzających duże ilości produktów wprowadzonych genów. Korzystnym wzmacnialnym wybieralnym markerem jest reduktaza dihydrofolanu, nadająca oporność na metotreksan. Można także stosować inne geny oporności na lek (np. oporność na higromycynę, oporność na wiele leków, acetylotransferaza puromycyny).

Jako gospodarzy można także stosować inne wyższe eukariotyczne komórki, w tym komórki owadów, komórki roślinne i komórki ptaków. Transformację komórek owadów i wytwarzanie tam obcych białek opisująGuarino i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5162222; Bang i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4775624; i publikacja WIPO WO 94/06463, dołączane jako odnośniki literaturowe. Zastosowanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora dla ekspresji genów w roślinnych komórkach omówił Sinkar i in., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58,1987.

Korzystne prokariotyczne komórki gospodarza do stosowania w sposobach według niniejszego wynalazku są szczepy bakterii Escherichia coli, chociaż Bacillus i inne rodzaje są także przydatne. Techniki transformacji tych gospodarzy i ekspresji obcych sekwencji DNA klonowa18

178 384 nych tam są dobrze znane fachowcom (patrz, np., Sambrook i in., ibid.). Przy ekspresji białka w bakterii takie jak E. coli, białko może być zachowane w cytoplazmie, typowo jako nierozpuszczalne granulki, lub może być skierowane w przestrzeń peryplazmatycznąprzez bakteryjnąsekwencję sekrecji. W ostatnim przypadku komórki poddaje się lizie, i granulki odzyskuje się i denaturuje stosując, np., izotiocyjanian guanidyny. Denaturowane białko jest następnie zwijane przez rozcieńczenie denaturatu. W ostatnim przypadku białko można odzyskać z przestrzeni peryplazmatycznej w rozpuszczalnej i funkcyjnej postaci rozrywając komórki (np. działaniem ultradźwiękami lub szokiem osmotycznym) w celu uwolnienia zawartości w przestrzeń peryplazmatyczną i odzyskania białka.

Transformowane lub transfekowane komórki gospodarza hoduje się zgodnie z konwencjonalnymi procedurami w pożywce kultury zawierającej składniki pokarmowe i inne składniki wymagane dla wzrostu wybranych komórek gospodarza. Różne dogodne pożywki, w tym pożywki zdefiniowane i kompleksowe, są znane fachowcom i zwykle obejmująźródło węgla, źródło azotu, najistotniejsze aminokwasy, witaminy i minerały. Pożywki mogąteż zawierać takie składniki, jak czynniki wzrostu lub surowicę, w miarę potrzeby. Pożywkązwykle selekcjonuje komórki zawierające egzogenny DNA dzięki, np., doborowi leku lub niedoborowi istotnego składnika pokarmowego, uzupełnionego wybieralnym markerem niesionym na wektorze ekspresji lub kotransfekowaniem do komórek gospodarza.

W niniejszym wynalazku w celu wytwarzania TPO można wykorzystać technologię transgenicznego zwierzęcia. Korzystnie jest wytwarzać białka w gruczołach sutkowych gospodarza, samicy ssaka. Ekspresję w gruczole sutkowym i następującąsekrecję białka będącego przedmiotem zainteresowania do mleka pokonuje wiele trudności napotykanych przy wydzielaniu białka z innych źródeł. Mleko łatwo zbiera się, jest dostępne w dużych ilościach i dobrze scharakteryzowane biochemicznie. Ponadto, główne białka mleka występująw mleku w dużych stężeniach (od około 1 do 15 g/l).

Z handlowego punktu widzenia, oczywiście korzystne jest stosowanie jako gospodarza gatunku o dużej wydajności mleka. Chociaż można stosować mniejsze zwierzęta, takie jak myszy i szczury (korzystnie w stanie zabezpieczonym przed zapłodnieniem), w niniejszym wynalazku korzystnie jest stosować ssaki gospodarcze w tym, między innymi, świnie, kozy, owce i bydło. Owce są szczególnie korzystne wskutek takich czynników jak dotychczasowa historia transgenezy u tego gatunku, wydajność mleka, koszt i łatwa dostępność sprzętu do dojenia owiec. Patrz publikacja WIPO WO 88/00239, porównanie czynników wpływających na dobór gatunku gospodarza. Jest zwykle pożądane wybranie rasy zwierzęcia-gospodarza hodowanego w celach mlecznych, takiej jak owce East Friesland, lub utworzenia mlecznych odmian przez późniejszą hodowlę transgenicznej linii. W każdym przypadku należy stosować zwierzęta znane, o dobrym stanie zdrowia.

W celu uzyskania ekspresji w gruczole sutkowym, stosuje się promotor transkrypcji z genu białka mleka. Geny białka mleka obejmują geny kodujące kazeinę (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5304489, dołączany jako odnośnik literaturowy), beta-laktoglobulinę, α-laktoalbumin, i kwasowy białko serwatki. Korzystny jest promotor beta-laktoglobuliny (BLG). W przypadku genu owczej beta-laktoglobuliny, będzie się zwykle stosować region co najmniej sąsiednich 406 par zasad 5' flankującej sekwencji genu, chociaż są korzystne większe części 5' flankujących sekwencji, do około 5 tysięcy par zasad, takie jak segment DNA o 4,25 tysiącach par zasad obejmujący 5' flankujący promotor i niekodującą część genu beta-laktoglobuliny. Patrz Whitelaw i in., Biochem. J. 286:31-39,1992. Dogodne są także podobne fragmenty promotora DNA z innych gatunków.

Inne regiony genu beta-laktoglobuliny można także wstawiać w konstrukt, podobnie jak genomowe regiony genu poddawanego ekspresji. Przyjmuje się, że konstrukty pozbawione intronów, np., ulegająekspresji słabo w porównaniu z zawierającymi takie sekwencje DNA (patrz Brinsteri in., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 85:836-840,1988; Palmiter i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482, 1991; Whitelaw i in., Transqenic Res. 1:3-13, 1991; WO 89/01343; WO 91/02318). W tym sensie jest zwykle korzystnie, gdy to jest możliwe, stosować genomową

178 384 sekwencję zawierającą wszystkie lub pewne rodzime introny genu kodującego białko lub polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, korzystne jest włączenie co najmniej pewnych intronów z, np. genu beta-laktoglobuliny. Jednym z takich regionów jest segment DNA pozwalający na dzielenie intronu i poliadenylację RNA z 3' niekodującego regionu owczego genu beta-laktoglobuliny. Po podstawieniu za naturalną 3' niekodującą sekwencję genu, ten segment owczej beta-laktoglobuliny może polepszyć i stabilizować poziomy ekspresji białka lub polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. W innych odmianach, region otaczający inicjacyjny ATG sekwencji TPO zastępuje się odpowiednią sekwencją z genu specyficznego białka mleka. Takie zastąpienie stwarza przypuszczalne specyficzne dla tkanki środowisko inicjacji polepszające ekspresję. Dogodniejest zastąpić caląpre-pro TPO i 5'niekodującą sekwencję odpowiednikami z, np., genu BLG, chociaż można zastępować mniejsze regiony.

W celu ekspresji TPO w traisgenicznych zwierzętach, segment DNA kodujący TPO wiąże się operatywnie z dodatkowymi segmentami DNA wymaganymi dla jego ekspresji w celu wytworzenia jednostek ekspresji. Takie dodatkowe segmenty obejmująwyżej wspomniany promotor, jak też sekwencje pozwalające na terminację transkrypcji i poliadenylację mRNA. Jednostki ekspresji obejmująnastępnie segment DNA kodujący sekwencję sygnału sekrecji związany operatywnie z segmentem kodującym TPO. Sekwencja sygnału sekrecji może być rodzimą sekwencją sygnału sekrecji TPO lub może być sekwencją innego białka, takiego jak białko mleka. Patrz, np., von Heinje, Nuc. Acids Res. 1986; i Meade i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873316, dołączane jako odnośniki literaturowe.

Konstrukcję jednostek ekspresji do stosowania w traisgenicznych zwierzętach dogodnie prowadzi się wprowadzając do plazmidu lub wektora fugowego sekwencję TPO zawierającą dodatkowe segmenty DNA, chociaż jednostka ekspresji może być skonstruowana w praktycznie dowolnej sekwencji ligacji. Szczególnie dogodne jest wytworzenie wektora zawierającego segment DNA kodujący białko mleka i zastąpienie kodującej sekwencję białka mleka sekwencjąpolipeptydu TPO, z wytworzeniem fuzji genowej obejmującej ekspresję kontrolnej sekwencji genu białka mleka. W każdym przypadku, klonowanie jednostek ekspresji w plazmidach lub innych wektorach ułatwia wzmocnienie sekwencji TPO. Wzmacnianie dogodnie prowadzi się w bakteryjnych (np. E. coli) komórkach gospodarza, tak więc wektory typowo obejmująpoczątek replikacji i wybieralny marker działający w bakteryjnych komórkach gospodarza.

Jednostkę ekspresji wprowadza się następnie do zapłodnionych jaj (w tym embrionów we wczesnym okresie) dobranego gatunku gospodarza. Wprowadzenia hetetologicznego DNA można dokonać jedną z kilku dróg, w tym mikrowstrzykiwania (np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873191), retrowirusowej infekcji (Jaenisch, Science 240:1468-1474, 1988) lub skierowanej na miejsce integracji z użyciem komórki macierzystej embrionu stem (ES) (przegląd Bradleya i in., Bio/Technology 10:534-539,1992). Jaja implantuje się następnie do jajowodów lub macicy samic w ciąży rzekomej i pozwala się ciąży rozwinąć. Potomstwo niosące wprowadzony DNA w linii zarodkowej może przekazać DNA ich potomstwu w normalny, mendlowski sposób, umożliwiając rozwój transgemcznego stada.

Ogólne procedury wytwarzania transgenicznych zwierząt są znane fachowcom. Patrz, np., Hogan i in., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons i in., Bio/Technology 6:179-183, 1988; Wall i in., Biol. Reprod. 32:645-651, 1985; Buhler i in., Bio/Technology 8:140-143, 1990; Ebert i in., Bio/Technology 9:835-838, 1991; Krimpenfort i in., Bio/Technology 9:844-847, 1991; Wall i in., J. Celi. Biochem. 49:113-120, 1992; opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4873191 i 4873316; publikacje WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; i GB 87/00458, dołączane jako odnośniki literaturowe. Techniki wprowadzania obcych sekwencji DNA ssakom i komórkom zarodkowym początkowo rozwinięto u myszy. Patrz, np., Gordon i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:7380-7384,1980; Gordon i Ruddle, Science 214:1244-1246,1981;Palmiteri Brinster, Cell 41:343-345,1985; Brinster i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4438-4442,1985; i Hogan i in., (ibid.). Te techniki adaptowano następnie do stosowania u większych zwierząt, w tym gatunków hodowlanych (patrz np., publikacje WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, i WO 92/11757; i

Simons i in., Bio/Technology 6:179-182, 1988). Podsumowując, w najskuteczniejszej drodze użytej dotychczas do utworzenia transgenicznych myszy lub zwierząt hodowlanych, kilkuset liniowych cząsteczek DNA będącego przedmiotem zainteresowania wstrzykuje się do jednego z pro-jąder zapłodnionych jaj zgodnie z technikami standardowymi w tej dziedzinie. Można też wykorzystać wstrzykiwanie DNA do cytoplazmy zygoty.

Można też wykorzystać wytwarzanie w transgenicznych roślinach. Ekspresję można uogólnić lub skierować na poszczególny organ, taki jak bulwa. Patrz, Hiatt, Nature 344:469-479, 1990; Edelbaum i in., J. Interferon Res. 12:449-453, 1992; Sijmona i in., Bio/Technology 8:217-221, 1990; i Publikacja Europejskiego Urzędu Patentowego nr EP 255378.

TPO wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem oczyszcza się stosując zwykle sposoby znane fachowcom, takie jak oczyszczanie przez powinowactwo i rozdzielanie oparte na rozmiarach, ładunku, rozpuszczalności i innych właściwościach białka. Gdy białko wytwarza się w hodowanej komórce ssaka, korzystnie jest hodować komórki w wolnej od surowicy pożywce kultury w celu ograniczenia ilości zanieczyszczającego białka. Pożywkę zbiera się i frakcjonuje. Korzystne sposoby frakcjonowania obejmują chromatografię powinowactwa na konkanawalinie A lub innych lektynach, wykorzystując węglowodór obecny na białku. Białka można także oczyszczać stosując unieruchomione białko receptora MPL lub wiążącąligand jego część, lub stosując znacznik powinowactwa (np. polihistydynę, substancję P lub inny polipeptyd lub białko, dla którego jest dostępne przeciwciało lub inny specyficzny środek wiążący). Specyficzne miejsce przecięcia można zapewnić pomiędzy białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i znacznikiem powinowactwa.

Białka według niniejszego wynalazku można stosować leczniczo, tam gdzie to jest pożądane w celu podwyższenia namnażania komórek w szpiku kostnym, jak w leczeniu deficytów krwinek, takich jak indukowane przez aplastyczną anemię, zespoły mielodysplastyczne, chemoterapię lub wrodzony niedobór krwinek; u pacjentów z przeszczepami szpiku kostnego; u pacjentów z przeszczepami w krwi obwodowej; i w leczeniu stanów powodujących niewydolność szpiku kostnego; takich jak zespół mielodysplastyczny. Białka są także przydatne do podwyższania wytwarzania płytek krwi, jak w leczeniu małopłytkowości. Małopłytkowość jest związana z różnymi grupami chorób i klinicznych sytuacji, które mogą działać same lub razem z wywołaniem stanu. Obniżone liczby płytek krwi mogą wynikać z, np., defektów w wytwarzaniu płytek krwi (wskutek, np., wrodzonych zaburzeń takich jak zespół Fanconiego, małopłytkowość popromienna, zespół Wiskotta-Aldricha, anomalia Maya-Hegglina, zespół Beranda-Souliera, zespół Menneapolis, zespół Epsteina, zespół płytek krwi Montreal i zespół Ecksteina), nienormalnego rozkładu płytek krwi, strat przez rozcieńczenie przy wielkich transfuzjach, nienormalnego niszczenia płytek krwi, lub nienormalnego wiązania płytek krwi w śledzionie hipersplenicznych pacjentów (wskutek, np., marskości wątroby lub zastoinowej niewydolności serca). Np., leki chemoterapeutyczne stosowane w leczeniu raka mogą hamować rozwój komórek rodzicielskich płytek krwi w szpiku kostnym, a powstała małopłytkowość ogranicza chemoterapię i może wymagać transfuzji. Ponadto, pewne złośliwe nowotwory mogą zakłócać wytwarzanie płytek krwi i ich rozkład. Terapia radiacyjna stosowana do zabijania złośliwych komórek zabija także komórki rodzicielskie płytek krwi. Małopłytkowość może też powstać z różnych autoalergicznych zaburzeń płytek krwi indukowanych przez leki, noworodkowej alloimmunogenności, alloimmunogenności po transfuzji płytek krwi i wirusowej (w tym HIV) infekcji. Białka według niniejszego wynalazku mogą ograniczać lub eliminować zapotrzebowanie na tr^n^:fuzję, ograniczając występowanie alloimmunologenności płytek krwi. Nienormalne niszczenie płytek krwi może być spowodowane; (1) zwiększonym zużyciem płytek krwi przy przeszczepach naczyniowych lub urazach tkanek; lub (2) immunologicznymi mechanizmami związanymi, np., z wywołanąprzez leki małopłytkowością idiopatycznąplamicąmałopłytkową (ITP), chorobami autoalergicznymi, hematologicznymi zaburzeniami takimi jak leukemia i chłoniaki lub przerzuty raków z zaangażowaniem szpiku kostnego. Inne wskazania białek według niniejszego wynalazku obejmują aplastyczną anemię i wywołane przez leki zahamowanie czynności szpiku wynikłe z, np., chemoterapii lub leczenia infekcji HIV przy pomocy AZT.

178 384

Małopłytkowość przejawia się zwiększonym krwawieniem, takim jak krwawienia śluzówkowe z nosa i ust lub przewodu pokarmowegojak sączenie się ran, wrzodów lub miejsc zastrzyków.

Do zastosowań farmaceutycznych, białka według niniejszego wynalazku komponuje do podawania pozajelitowego, szczególnie dożylnego lub podskórnego, zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Dożylne podawanie będzie wstrzykiwaniem lub infuzjąprzez typowy okres od jednej do kilku godzin. Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne obejmą hemopoezyjne białko w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak solanka, buforowana solanka, 5% glukoza w wodzie lub tym podobne. Kompozycje dalej obejmująjodną lub więcej zarobek, konserwantów, środków rozpuszczających, buforów, albuminy do zapobiegania utracie białka na ściankach fiolki, itp. Dodatkowo, hemopoezyjne białka według niniejszego wynalazku można łączyć z innymi cytokinami, szczególnie wcześnie działającymi cytokinami takimi jak czynnik komórki macierzystej, IL-3, IL-6, IL-11 lub GM-CSF. Wykorzystując taką terapię kombinowaną, cytokiny można połączyć w jednej kompozycji lub można podawać je w oddzielnych kompozycjach. Sposoby komponowania są dobrze znane fachowcom i opisane, np., w Remington^ Pharmaoeutioal Sciences, wyd. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, dołączanym jako odnośnik literaturowy. Terapeutyczne dawki będą zwykle wynosiły od 0,1 do 100 I4g/kg masy pacjenta dziennie, korzystnie 0,5-20 pg/kg dziennie, z dokładną dawką określony przez lekarza zgodnie z akceptowanymi wzorcami, biorąc pod uwagę naturę i ostrość stanu leczonego, cechy pacjenta, itp. Określenie dawki mieści się w zakresie wiedzy zwykłego fachowca. Białka będą zwykle podawane przez okres do 28 dni po chemoterapii lub przeszczepie szpiku kostnego, lub do osiągnięcia liczby płytek krwi> 20000/mm³, korzystnie> 50000/mm³. Częściej białka będąpodawane przez tydzień lub krócej, często przez okres tygodnia do trzech dni. Ogólnie, leczniczo skuteczna ilość TPO jest ilością dostateczną do spowodowania klinicznie znaczącego wzrostu namnażania i/lub różnicowania limfoidalnych lub szpikowych komórek rodzicielskich, manifestowanego wzrostem liczby krążących dojrzałych komórek (np. płytek krwi lub krwinek białych obojętnochłonnych). Leczenie zaburzeń płytek krwi będzie się więc kontynuować aż do liczby płytek krwi co najmniej 20000/ζζ3, korzystnie 50000/mm3. Białka według niniejszego wynalazku można także podawać w połączeniu z innymi cytokinami takimi jak IL-3, -6 i -11; czynnikiem komórki macierzystej; erytropoetyną; G-CSF i GM-CSF. W reżimach kombinowanej terapii, dzienne dawki innych cytokin będą ogólnie wynosiły; EPO, < 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 pg/kg; IL-3,1-5 pg/kg; i G-CSF, 1-25 pg/kg. Leczenie kombinowane z EPO np., jest wskazane u anemicznych pacjentów z niskim poziomem EPO.

Białka według niniejszego wynalazku sątakże wartościowymi narzędziami do badań in vitro różnicowania i rozwoju howopoezyjnych komórek, takich jak wyjaśnianie mechanizmów różnicowania komórek i określania linii dojrzałych komórek, i mogą też znaleźć zastosowanie jako środki do namnażania w hodowlach komórkowych.

Białka według niniejszego wynalazku można także stosować ex vivo, jak w autologioznoj kulturze szpiku. Krótko, szpik kostny pobiera się z pacjenta przed chemoterapią i traktuje TPO, ewentualnie w połączeniu z jedną lub kilkoma innymi cytokinami. Tak potraktowany szpik wprowadza się ponownie pacjentowi po chemoterapii w celu przyspieszenia wyzdrowienia szpiku. Ponadto, białka według niniejszego wynalazku można także stosować do ekspansji komórek rodzicielskich szpiku lub obwodowej krwi (PBPC) ex vivo. Przed chemoterapiąszpik można stymulować czynnikiem komórek macierzystych (SCF) lub G-CSF w celu uwolnienia wczesnych komórek rodzicielskich do krążenia obwodowego. Komórki macierzyste z obwodowej krwi można zebrać i zatężyć, a następnie potraktować w hodowli TPO, ewentualnie w połączeniu z jedną lub kilkoma innymi cytokinami, w tym między innymi CSF, GCSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 lub IL-11, w celu różnicowania i namnażania w kulturę o dużej gęstości megakαriooytów, które można następnie wprowadzić ponownie pacjentowi po wysokodawkowej chemoterapii.

Przedmiotem wynalazku sątakże przeciwciała wiążące epitop na białku według niniejszego wynalazku. Takie przeciwciała można wytwarzać różnymi sposobami znanymi fachowcom. Wytwarzanie nie-ludzkich, monoklonalnych przociwoiαłjest dobrze znane i może być dokonane dzięki, np., iwwunizaoji zwierzęcia takiego jak mysz, szczur, królik, koza, owca lub świnka mor22

178 384 ska rekombinacyjnym lub syntetycznym TPO lub wybranymjego polipeptydowym fragmentem. Korzystnie jest immunizować zwierzę dobrze oczyszczonym białkiem lub polipeptydowym fragmentem. Jest także korzystne podawanie białka lub polipeptydu w połączeniu z adiuwantem, takim jak adiuwant Freunda, w celu polepszenia odpowiedzi immunologicznej. Chociaż pojedyncze wstrzykiwanie antygenu może być dostateczne do indukcji wytwarzania przeciwciał u zwierzęcia, zwykle korzystnie jest podawać duży początkowy zastrzyk, a następnie jeden lub więcej uzupełniających zastrzyków przez okres od kilku tygodni do kilku miesięcy. Patrz, np., Hurrell, wydawca, Monoclonal Hybridoma Antobodies: Techniąues and Applications, CRC Press Inc., BocaRaton, FL, 1982, dołączanym jako odnośnik literaturowy. Następnie pobiera się zwierzęciu krew i prowadzi do skrzepnięcia, a przeciwciała wydziela się z surowicy stosując konwencjonalne techniki takie jak wytrącenie solą, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa lub wysokowydajna chromatografia cieczowa.

Stosowanie monoklonalnych przeciwciał jest zwykle korzystne w porównaniu z poliklonalnymi antysurowicami. Monoklonalne przeciwciała dająkorzyści łatwego wytwarzania, specyficzności i powtarzalności. Sposoby wytwarzania monoklonalnych przeciwciał są dobrze znane fachowcom i opisane, np., przez Kohlera i Milsteina (Nature 256:495,1975 i Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976). Patrz także Hurrell, ibid. iHarta, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5094941, dołączane jako odnośnik literaturowy. Krótko, wytwarzające przeciwciała komórki otrzymane z immunizowanych zwierząt immortalizuje się· i poddaje skriningowi, lub najpierw poddaje skriningowi, w celu wytworzenia przeciwciał wiążących TPO. Pozytywne komórki immortalizuje się następnie przez fuzję z komórkami szpiczaka. Nie-ludzkie przeciwciała mogą być „humanizowane” zgodnie z znanymi technikami. Patrz, np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4816397; Publikacje Europejskiego Urzędu Patentowego nr 173494 i 239400; i publikacje WIPO nr WO 87/02671 i WO 90/00616, dołączane jako odnośniki literaturowe. Krótko, ludzkie geny stałego regionu przyłącza się do właściwych genów ludzkiego lub nie-ludzkiego zmiennego regionu. Np., sekwencję aminokwasową reprezentującą miejsce wiązania antygenu (CDR, lub regiony określające komplementamość) macierzystego (nie-ludzkiego) monoklonalnego przeciwciała zaszczepia się na poziomie DNA na ludzkiej sekwencji ramowej zmiennego regionu. Metody w tej technice są znane fachowcom i opisane, np., przez Jonesa i in. (Nature 326:522-525,1986), Riechmanna i in. (Nature 322:323-327,1988) i Queena i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033,1989). Połączone geny transfekuje się następnie do komórek gospodarza, które hoduje się zgodnie z konwencjonalnymi procedurami. Alternatywnie monoklonalne przeciwciało wytwarzające komórki można transfekować klonowanym genem ludzkiego stałego regionu, a chimeryczne geny przeciwciała wytwarzać przez homologiczną recombinację. Tak więc możliwe jest składanie monoklonalnego przeciwciała w znaczącej części struktury ludzkiego, wytwarzając przeciwciała bardziej dogodne do wielokrotnego podawania ludzkim pacjentom.

Pojedynczołańcuchowe przeciwciała można rozwinąć przez ekspresję rekombinacyjnego polipeptydu, złożonego zwykle ze zmiennej lekkołańcuchowej sekwencji połączonej, typowo przez linkerowy polipeptyd, ze zmienną ciężkołańcuchową sekwencją. Sposoby wytwarzania pojedynczołancuchowych przeciwciał są znane fachowcom i opisane, np., przez Davisa i in. (Bio/Technology 9:165-169,1991).

Przeciwciała wiążące epitopy TPO sąprzydatne, np., w diagnozowaniu chorób charakteryzujących się zmniejszonym poziomem płytek krwi, megakariocytów lub innych komórek krwi lub rodzicielskich, które to choroby są spokrewnione z niedoborami w namnażaniu lub różnicowaniu komórek rodzicielskich. Taką diagnozę postawi się zwykle dzięki testowaniu krwi lub osocza stosując konwencjonalne immunotesty takie jak immunoadsorpcja związana z enzymem lub testy radioimmunologiczne. Testy tych typów są dobrze znane fachowcom. Patrz, np., Hart i in., Biochem. 29:166-172,1990; Ma i in., British Journal of Haematology 80:431-436,1992; i Andre i in., Clin. Chem. 38/5:758-763, 1992. Diagnostyczne testy aktywności TPO mogą być przydatne do identyfikacji populacji pacjentów mogących najlepiej skorzystać z terapii TPO. Przeciwciała do TPO są także przydatne w oczyszczaniu TPO, takim jak wiązanie przeciwciała

178 384 ze stałym nośnikiem, np. rozdrobnioną substancją upakowaną w kolumnę, i przepuszczenie roztworu zawierającego białko przez kolumnę. Związane białko eluuje się następnie właściwym buforem. Ogólnie, białko wiąże się z kolumną w warunkach fizjologicznych niskiej siły jonowej i prawie obojętnego pH. Kolumnę przemywa się następnie w celu wyeluowania niezwiązanych zanieczyszczeń. Elucję związanego białka prowadzi się zmieniając siłę jonową lub pH, np. przy pomocy 3 M KSCN (wsad lub gradient) lub buforem cytryⁿ'anowym o niskim pH. Odczynu pH poniżej około 2,5 powinno się zwykle unikać.

Przedmiotem wynalazku są też sposoby wytwarzania dużych ilości megakariocytów i płytek krwi, które można stosować, np., do wytwarzania bibliotek cDNA. Ponieważ płytki krwi są kierowane do miejsc uszkodzeń, uważa się, że pośredniczą w leczeniu ran i, w pewnych warunkach, w patogenezie. Wobec tego, szczegółowe rozumienie biologii cząsteczkowej płytek krwi i megakariocytów da wgląd w homeostazę i kliniczne zaburzenia funkcji płytek krwi. Białka według niniejszego wynalazku stanowią ulepszone środki wytwarzania bibliotek cDNA megakariocytów lub płytek krwi.

Rekombinacyjna trombopoetyna podawana zwierzętom lub na hodowane komórki śledziony lub szpiku kostnego indukuje namnażanie megakari^i^;ytów z komórek prekursorowych. Ekspansja megakariocytów i ich prekursorów i dojrzewanie megahari^cytów następujące po podaniu tPo pozwala na wydzielanie megakariocytów o dużej czystości i dostatecznej liczbie, aby wydzielać mRNA i konstruować bibliotekę cDNA. Regulując dawkowanie TPO i reżim podawania, można selektywnie ekspandować wczesne lub w pełni dojrzałe megakariocyty i te, które aktywnie wydalają płytki krwi z pierwszorzędowych komórek śledziony lub szpiku kostnego. Tak więc można skonstruować reprezentatywne biblioteki cDNA odpowiadające wczesnym, pośrednim lub późnym stadiom lub megakariopoezie.

Jest wiele zastosowań powstałych bibliotek cDNA. Takich bibliotek można użyć, np., do identyfikacji i klonowania mało licznych białek grających rolę w różnych dysfunkcjach płytek krwi. Łatwość ekspandowania megakariocytów pacjenta i wydzielania ich mRNA do analizy ogromnie pomaga w cząsteczkowym zbadaniu chorób. Biblioteki są także źródłem dla klonowania nowych czynników wzrostu i innych białek z potencjalnąprzydatnościąterapeutyczną. Przydatne białka płytek krwi już klonowane obejmują czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi (Ross i in., Celi 26:155-169, 1986); transformujący czynnik wzrostu (Miletich i in., Blood 54:1015-1023, 1979; Roberts i Spom, Growth Factors 8:1-9, 1993); pochodzący z płytek krwi śródblonkowy czynnik wzrostu komórek (Miletich i in., Blood 54:1015-1023,1979) i PF-4 (Doi i in., Mol. Celi. Biol. 7:898-904, 1987; Poncz i in., Blood 69:219-223, 1987). Nowe czynniki wzrostu można zidentyfikować dzięki funkcyjnemu skriningowi bibliotek ekspresji cDNA lub dzięki hybrydyzacyjnemu skriningowi ze zmniejszoną ze znanymi sondami czynników wzrostu. Wydzielania nowych czynników wzrostu można też dokonać w reakcji łańcuchowej polimerazy wykorzystując zdegenerowane startery zachowanych regionów znanych czynników wzrostu. Dodatkowo, systematyczne i kompletne sekwencjonowanie DNA biblioteki daje bazę danych sekwencji cDNA megakariocytu. Taką bazę danych można przeszukiwać szukając przydatnych sekwencji według różnych komputerowych algorytmów przeszukiwania.

Megakariocyty wytworzone jak opisano powyżej można także stosować do wytwarzania biblioteki białek. Biblioteki białek są komplementarne z bibliotekami cDNA. Informacja o aminokwasówej sekwencji otrzymana z biblioteki białka pozwala na szybkie wydzielanie cDNA kodującego białka będące przedmiotem zainteresowania. Stosowanie danych sekwencji białka do projektowania starterów do wydzielania DNA usuwa problemy związane z konwencjonalnymi sposobami wytwarzania biblioteki dzięki względnej obfitości mRNA. Sprzęganie białek i bibliotek cDNA ułatwia także konkretne klonowania szczególnie interesujących sekwencji.

Biblioteki białek wytwarza się ekstrahując białka (całkowite białka lub frakcje będącej przedmiotem zainteresowania) z megakariocytów zgodnie ze znanymi metodami, następnie oddzielając białka metodą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Wydzielone białka poddaje się następnie in situ trawieniu trypsyną a następnie oddzielaniu małokalibrową HPLC. Oddzielone fragmenty analizuje się następnie metodą spektrometrii masowej. Powstałe profile masowe prze24

178 384 szukuje się wobec bazy danych sekwencji białkowych dla stwierdzenia tożsamości białka. Niezidentyfikowane peptydy można sekwencjonować metodą degradacji Edmana.

Biblioteki cDNA i białek są wartościowymi źródłami nowych białek i sekwencji kodujących je. Płytki krwi uważa się za ważne mediatory leczenia ran i, w pewnych warunkach, patogenezy. Wiele ważnych białek płytek krwi zidentyfikowano i zanalizowano, w tym pochodzący z płytek krwi czynnik wzrostu, transformujący czynnik wzrostu β, pochodzący z płytek krwi śródbłonkowy czynnik wzrostu komórek, i czynnik płytek krwi 4. Identyfikacja i analiza innych białek płytek krwi będzie niezwykle pomocna w wyjaśnieniu procesów leżących u podłoża leczenia ran i patogenezy, i może pozwolić wytworzyć ważne terapeutyczne środki i strategie.

Jak opisano bardziej szczegółowo poniżej, ludzki gen TPO jest zlokalizowany na chromosomie 3q26. Ta informacja, w połączeniu z sekwencją ludzkiego genu TPO (SEKW. NR ID.:28), pozwala na bezpośrednią diagnozę, dzięki genetycznemu skriningowi, dziedzicznych zaburzeń w genie TPO lub regulacji jego ekspresji. Takie zaburzenia obejmują zmiany w sekwencji promotor prowadzące do podwyższenia lub obniżenia poziomu ekspresji, translokacji chromosomowych w kodujących lub niekodujących regionach, i umieszczenie obok siebie nowych sekwencji regulacyjnych w miejscu TPO. Możliwe diagnostyczne metody są znane fachowcom. Np., startery lub sondy hybrydyzacji mające co najmniej 5 nukleotydów, korzystnie 15-30 lub więcej nukleotydów, można zaprojektować z genomowej sekwencji i użyć do wykrywania chromosomowych nienormalności lub mierzenia poziomów mRNA. Liczne dogodne sposoby wykrywania i pomiaru są znane fachowcom, i obejmują analizę „Southern”, reakcję łańcuchową polimerazy (Mullis, opis patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4683202), i reakcję łańcuchowąligazy (Barany, PCRMethods and Applications 1:5-16, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991). Np., DNA pacjenta można trawić jeden lub wieloma enzymami restrykcyjnymi i przenieść na nitrocelulozę w celu wytworzenia plamy Southema. Plamę sonduje się następnie w celu wykrycia większych zmian w rozmiarach fragmentów powstałych z mutacji w sekwencji rozpoznawania miejsca restrykcji. W innej procedurze, analiza nienormalnej sekwencji genu i porównanie normalnej i nienormalnej sekwencji pozwala na zaprojektowanie starterów, które można stosować w celu zidentyfikowania nienormalnego (np. zerwanego lub translokowanego) genu. DNA pacjenta wzmacnia się w reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wykrycia produktów wzmocnienia charakterystycznych dla normalnego genu lub poszczególnych przebudowań genu.

Wynalazek zilustrowano poniżej następującymi nie ograniczającymi przykładami.

Przykład I. Wydzielanie cDNA ludzkiego receptora MPL cDNA kodujący ludzkie izoformy receptor MPL-P i MPL-K wydzielono z ludzkich erytroidowych komórek białaczkowych (HEL) (Martin i Papayannopoulu, Science 216: 1233:1235, 1982) metodę reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z odwrotną transkrypfcazą wykorzystując startery wytworzone zgodnie z opublikowaną sekwencją kodującą aminowe i karboksylowe zakończenia receptorów (Vigon i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 56-40--^(5^^^1,1992). Matrycę cDNA komórek HEL zsyntetyzowano z wybranego poli d(T) poli(A) + RNA stosując starter ZC5499 (SEKW. NR ID.: 3). 13 pi poli(A) + RNA komórek HEL w stężeniu 1 pg/pl zmieszano z 3 μΐ 20 pmol/pl pierwszej nici startera ZC5499 (SEKW. NR ID.: 3). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65°C przez 4 minuty i ochłodzono na lodzie.

Syntezę pierwszej nici cDNA zainicjowano dodaniem 8 pl bufora dla pierwszej nici (250 mM Tris-HCl, pH 8,3,375 mM KCl, 15 mM MgClj) bufor 5x SUPERSCRIPT™; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), 4 pl 100 mM ditiotreitolu i 3 pl roztworu trifosforanów deoksynukleotydów zawierającego po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i 5-metylo-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). Mieszaninę ^^a^t^^yjną inkubowano w temperaturze 45°C przez 4 minuty, po czym dodano 10 pl 200 U/pl odwrotnej transkryptazy RNase H‘ (odwrotna transkryptaza SUPERSCRIPT™; GIBCO BrL) do mieszaniny RNA-storter. Reakcję inkubowano w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 50°C przez 15 minut. Dodano 60 pl TE (10 mM Tris:HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), a następnie chromatografowano na żelu o rozmiarach porów

400 na kolumnie filtracyjnej (CHROMA SPIN+TE-400™; Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) w celu usunięcia nadmiaru startera.

Pierwszej nici cDNA komórek HEL użyto jako matrycy do wzmacniania cDNA ludzkiego receptora MPL-P stosując startery odpowiednie dla regionu kodującego aminowe i karboksylowe zakończenie białka receptora (Vigon i in., ibid.). Startery rep^^^^^n^i^^waby też różne miejsca przecięcia enzymów restrykcyjnych dla ułatwienia ukierunkowanego klonowania wzmocnionego produktu (ZC5746, SEKW. NR ID. : 4, zawierający miejsce EcoRI; ZC5762, SEKW. NR ID. : 5, zawierający miejsce Xhol). Rozpoczęto reakcję w 100 μΐ zawierających 10 ng matrycy cDNA, 50 pmol każdego startera; 200 μίΗ trifosforanu każdego deoksynukleotydu (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.); 1 μl bufora PCR 10x (Promega Corp., Madison, WI); i 10 jednostek polimerazy Taq (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono przez 35 cykli (1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 60°C i 2 minuty w temperaturze 72°C z 1 sekundądodanądo każdego kolejnego cyklu), a następnie 10 minut inkubacji w temperaturze 72°C.

cDNA ludzkiego receptora MPL-K wydzielono przez wzmocnienie w reakcji łańcuchowej polimerazy z cDNA komórek HEL w sposób identyczny do cDNA receptora MPL-P opisanego powyżej, poza tym, że starter ZC5762 (SEKW. NR ID.: 5) zastąpiono ZC5742 (SEKW. NR ID.: 6). Starter PCR ZC5742jest specyficzny dla końca 3' cDNA ludzkiego MPL-K i zawiera miejsce restrykcji Xhol w celu ułatwienia klonowania.

Produkty reakcji ekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol/chloroform (1:1), następnie raz chloroformem i wytrącono etanolem. Po trawieniu witb EcoRI i Xhol, produkty frakcjonowano na 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym (SEA PLAQUE GTG™ niskotopliwy żel agarozowy; FMC Corp., Rockland, ME). Wzmocniony produkt o 1,9 tysiącach par zasad odpowiadający cDNA ludzkiego receptora MPL-P i o 1,7 tysiącach par zasad odpowiadający cDNA ludzkiego receptora MPL-K odzyskano z wyciętego ścinka żelu przez trawienie matrycy żelowej β- agaraząl (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), a następnie wytrącenie etanolem. cDNA subklonowane do wektora pBluescript® SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) do walidacji przez sekwencjonowanie.

Przykład II. Wydzielanie cDNA mysiego receptora MPL

Śledziony z myszy C57BL/KsJ-db/db usunięto i natychmiast umieszczono w ciekłym azocie. Całkowity RNA wytworzono z tkanki śledziony stosując izotiocyjanian guanidyny (Chirgwin i in., Biochemistry 18: 52-94, 1979) a następnie odwirowanie z CsCl. Poli(A)+ RNA śledziony wydzielono stosując chromatografię na oligo-d(T)celulozie (Aviv i Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69: 1408-1412,1972).

7,5 μΐ wybranwyb poli-o(T) poli(A)+ RNA śledziony myszy w stężeniu 1,7 pg/μΐ zmieszano z 3 μl 20 pmol/pl pierwszej nici startera ZC6091 (SEKW. Nr Id. : 7) zawierającej miejsce restrykcji Notl. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65°C przez 4 minuty i ochłodzono na lodzie. Syntezę pierwszej nici cDNA zainicjowano dodaniem 8 μΐ 250 mM Tris-HCl, pH 8,3,375 wM KCl, 15 mM MgCl₂ (bufor 5x SUPERSCRIPT™; GIBCO BRL), 4 μΐ 100 mM ditiotreitolu i 3 fd roztworu trifosforanów deoksynukleotydów zawierających po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i 5-metylo-dCTP (Pharmacia LKB Biotec^ology Inc.) do mieszaniny RNA-starter. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 45°C przez 4 minuty, a następnie dodano 10 μl 200 U/ąl odwrotnej transkryptazy RNase H (GIBCO BRL). Wydajność syntezy pierwszej nici zanalizowano w równoległej reakcji z dodatkiem 10 pCi ³²P-adCTP do 10 μΐ porcji mieszaniny reakcyjnej w celu oznakowania reakcji do analizy. Reakcje inkubowano w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, następnie inkubowano w temperaturze 50°C przez 15 minut. Niewstawiony ³²P-adCTP w znakowanej reakcji usunięto metodą chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (CHROMA SPIN+TE-400™; Clontech Laboratories Inc.). Niewstawiony nukleotyd w oi7zoakowao7j reakcji pierwszej nici usunięto dwukrotnie cDNA w obecności 8 (pg glikogenowego nośnika, 2,5 M octanu amonu i 2,5 objętości etanolu. Niezopkowpoż cDNA umieszczono w zawiesinie w 50 μΐ wody do stosowania w syntezie drugiej nici. Długość znakowanej pierwszej nici cDNA określono przez elektroforezę na żelu agarozowym.

178 384

Syntezę drugiej nici prowadzono na pierwszej nici cDNA w warunkach, które promowały przygotowanie pierwszej nici do syntezy drugiej nici, co dało utworzenie DNA w postaci typu szpilki do włosów. Mieszanina reakcyjna złożona w temperaturze pokojowej składała się z 50 pl nieznakowanej pierwszej nici cDNA, 16,5 pl wody, 20 pl bufora 5x polimerazy I (100 mM Trrs:HCl, pH 7,4,500 mM KCl, 25 mM MgCl₂,50 mM (NH4)₂S04), 1 pl 100 mM ditiotreitolu, 2 pl roztworu zawierającego 10 mM trifosforanu każdego deoksynukleotydu, 3 pl 5 mM β-NAD, 15 pl 3 U/pl ligazy DNA E. coli (New England Biolabs Inc., Beverly, mA) i 5 pl 10 U/pl polimerazy I DNA E. coli (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Reakcję inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, następnie dodano 1,5 pl 2 U/pl RNase H (GIBCO BRL). Równoległej reakcji, w której 10 pl porcję mieszaniny do syntezy drugiej nici znakowanej dodaniem 10 pC i ³2P-adCTP użyto do monitorowania wydajności syntezy drugiej nici. Reakcje inkubowano w temperaturze 15°C przez 2 godziny, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Niewstawiony 3²P-adCTP w znakowanej reakcji usunięto metodą chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories, Inc.) przed analizą metodą elektroforeza na żelu agarozowym. Nieznakowaną reakcję zakończono dwoma ekstrakcjami mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, a następnie wytrącenie etanolem w obecności 2,5 M octanu amonu.

Jednoniciowy DNA o strukturze typu szpilki do włosów przecięto stosując nukleazę fasoli mung. Mieszanina reakcyjna zawierała 100 pl drugiej nici cDNA, 20 pl bufora 10x nukleazy fasoli mung (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), 16 pl 100 mM ditiotreitolu, 51,5 pl wody i

12.5 pl rozcieńczenia 1:10 nukleazy fasoli mung (Promega Corp.; końcowe stężenie 10,5 U/pl) w buforze rozcieńczenia nukleazy fasoli mung. Reakcję inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 minut. Reakcję zakończono dodaniem 20 pl 1M Tris:HCl, pH 8,0, a następnie kolejnymi ekstrakcjami fenolem/chloroformem i chloroformem, jak opisano powyżej. Po ekstrakcjach DNA wytrącono w etanolu i umieszczono w zawiesinie w wodzie.

Umieszczony w zawiesinie cDNA zakończono lepkimi końcami przy pomocy polimerazy DNA T4. cDNA, który umieszczono w zawiesinie w 190 pl wody, zmieszano z 50 pl bufora 5x polimerazy DNA T4 (250 mM Tris:HCl, pH 8,0,250 mM KCl, 25 mM MgClJ, 3 p 0,1 M ditiotreitolu, 3 pl roztworu zawierającego 10 mM trifosforanu każdego deoksynukleotydu i 4 pl i 1 U/pl polimerazy DNA T4 (Boehringer Mannheim Corp., Idianapolis, IN). Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 10°C, reakcję zakończono dodaniem 10 pl 0,5 M EDTA, a następnie kolejno ekstrakcjami fenolem/chloroformem i chloroformem, jak opisano powyżej. DNA poddano chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories Inc., Pało Alto, CA) w celu usunięcia śladowych poziomów białka i w celu usunięcia krótkiego cDNA poniżej 400 par zasad. DNA wytrącono etanolem w obecności 12 pg glikogenowego nośnika i

2.5 M octanu amonu i umieszczono w zawiesinie w 10 p wody. W oparciu o włączanie 32P-ndCTP, wydajność cDNA oszacowano na 2 pg z 12,5 pg początkowej matrycy mRNA.

Adaptery EcoRI ligowano na końce 5' cDNA w celu umożliwienia klonowania do wektora faga lambda. 10 pl porcję cDNA (2 pg) i 10 p 65 pmol/p adaptera EcoRI (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) zmieszano z 2,5 pl bufora 10x ligazy (Promega Corp.), 1 pl 10 mM ATP i 2 pl 15 U/pl ligazy dNa t4 (Promega Corp.). Reakcję inkubowano przez noc (18 godzin) z gradientem temperatury od 0°C do 18°C. Reakcję inkubowano następnie przez noc w temperaturze 12°C. Reakcję zakończono dodawaniem 75 fi wody i 10 fi 3M octanu sodu, a następnie inkubację w temperaturze 65°C przez 30 minut. Po inkubacji cDNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, jak opisano powyżej, i wytrącono w obecności 2,5 M octanu amonu i 1,2 objętości izopropanolu. Po odwirowaniu, granulkę cDNA przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 89 fi wody.

W celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania cDNA do wektora faga lambda, cDNA trawiono Notl, co dało cDNA mający lepkie końce 5' EcoRI i 3' Notl. Miejsce restrykcji Notl na końcu 3'cDNA było uprzednio wprowadzone przez starter ZG6091 (SEKW. NR ID. : 7). Trawienie enzymem restrykcyjnym prowadzono w reakcji zawierającej 89 p cDNA opisanego powyżej, 10 pl6mMTris:HCll6mMMgCl2,150mMNaCl, 1mMDTT (bufor 10xD; Promega Corp.,

Madison, WI) i 1 pl 12 U/|P Notl (Promega Corp.). Trawienie prowadzono w temperaturze 37°C przez godzinę. Reakcję zakończono kolejnymi ekstrakcjami fenolew/chloroformom i chloroformem. cDNA wytrącono etanolem, przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 20 pl 1x buforze ładowania na żel (10 mM Tris:HCl, pH 8,0,1 mM EDTA, 5% gliceryny i 0,125% błękitu bromofenolowego).

Umieszczony w zawiesinie cDNA ogrzewano do temperatury 65°C przez 5 minut, ochłodzono na lodzie poddano elektroforezie na 0,8% niskotopliwego żelu agarozowego (SEA PLAQUE GTG™ niskotopliwy żel agarozowy; FMC Corp.). Niewstawiony adaptery i cDNA poniżej

1,6 tysiąca par zasad wycięto z żelu. Elektrody odwrócono i cDNA poddano elektroforezie do stężenia bliskiego początkowi ścieżki. Pole na żelu zawierające stężony cDNA wycięto i umieszczono w probówce do mikrowirowania, i określono przybliżoną objętość ścinka żelu. Do probówki dodano porcję wody (300 pl) w przybliżeniu trzy razy większą od objętości ścinka żelu, i żel agarozowy stopniowo przez ogrzanie do 65°C przez 15 minut. Po zrównoważeniu próbki do 42°C, dodano 10 pl i 1 U/pl β-agarazy I (New England Biolabs, Inc.), i mieszaninę inkubowano przez 90 minut w celu przetrawienia żelu agarozowego. Po inkubacji, do próbki dodano 40 pl 3 M octanu sodu, i mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut. Próbki odwirowano przy 14000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia nieprzotrawionoj agarozy. cDNA w supemata^cie wytrącone etanolem, przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 37 pl wody do reakcji kinazy w celu fosforylowania ligowanych adapterów EcoRI.

Do 37 pl roztworu cDNA opisanego powyżej dodano 10 pl bufora 10x ligazy (Stratagene Cloning Systems), i mieszaninę ogrzewano do 65°C przez 5 minut. Mieszaninę ochłodzono na lodzie, i dodano 5 pl 10 mM ATP i 3 pl 10 U/pl polinuklootydowej kinazy T4 (Stratagene Cloning Systems). Reakcję inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut i zakończono przez ogrzanie do 65°C przez 10 minut, a następnie kolejne ekstrakcje mieszaniną fenol/chloroform i chloroform. Fosforylowany cDNA wytrącono etanolem w obecności 2,5 M octanu amonu, przemyto 70% etanol, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 12,5 pl wody. Stężenie fosforylowanego cDNA oszacowano na 40 fmol/pl.

Powstały cDNA klonowano do wektora faga lambda XExCell™ (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), nabytego w postaci przetrawionej EcoRI i Notl i defosforylowanej. Ligację cDNA do wektora prowadzono w mieszaninie zawierającej 2 pl 20 fmol/pl wytworzonych ramion faga AExCell™, 4 pl wody, 1 pl bufora 10x ligazy (Promega Corp.), 2 pl 40 mol/pl cDNA i 1 pl 15 U/pl ligazy DNA T4 (Promega Corp.). Ligację prowadzono w temperaturze 4° C przez 48 godzin. W przybliżeniu 50% mieszaniny ligacyjnej wstawiono do faga stosując ekstrakt pakujący GIGAPACK® II Gold (Stratagene Cloning Systems) zgodnie ze wskazówkami wytwórcy. Powstała biblioteka cDNA zawierała ponad 1,5 x 10⁷ niezależnych rekombinantów·' z poziomami tła faga bez insertów mniej niż 1,5%.

Znakowaną 3²P sondę cDNA ludzkiego receptora MPL-K użyto do wydzielenia cDNA receptora MPL myszy z fagowej biblioteki cDNA śledziony myszy. Bibliotekę cDNA umieszczono na płytkach na komórkach szczepu SURE® E.coli (St^^^^agene Cloning Systems) przy gęstości 40,000 do 50,000 PFU na płytki 150 mm średnicy. Łysinki faga z 33 płytek przeniesiono na nylonowe membrany (Hybond N™, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) i przetworzono zgodnie ze wskazówkami wytwórcy. Przetworzone filtry wygrzewano przez 2 godziny w temperaturze 80°C w piecu próżniowym, a następnie kilkakrotnie przemyto w temperaturze 70°C w buforze myjącym 0,25 x SSC, 0,25% SDS, 1 mM EDTA) i prehybiydyzowano przez noc w temperaturze 65°C w roztworze hybrydyzacji (5x SSC, 5x roztwór Denhardta, 0,1% SDS, 1 mM EDTA i 100 pg/ml denaturowanej cieplnie DNA spermy łososia) w piecu hybrydyzacyjnym (model HB-2; Techne Inc., Princeton, NJ). Po prehybrydyzacji, roztwór hybrydyzacji odrzucono i zastąpiono świeżym roztworem hybrydyzacji zawierającym w przybliżeniu 2 x 10⁶ cpm/ml znakowanego 3²P ludzkiego cDNA MpL-K wytworzonego przy pomocy dostępnego w handlu zestawu do znakowania (MEGAPRIME™; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Sondę denaturowano w temperaturze 98°C przez 5 minut przed dodaniem do roztworu hybrydyzacji. Hybrydyzowano w temperaturze 65°C przez noc. Filtry przemyto w temperaturze 55°C w bufo28

178 384 rze myjącym (0,25 x SSC, 0,25% SDS, 1 mM EDTA) i autoradiografowano z ekranami o rosnącej intensywności przez 4 dni w temperaturze 70°C na filmie XAR-5 (Kodak Inc., Rochester, NY). Wykorzystując autor^i^iog^^if jako wzorzec, odzyskano stemple agarowe z reginów płytek odpowiadających pierwszorzędowym sygnałom i namoczono w SM (0,1M NaCl; 50 mM Tris:HCl, pH 7,5,0,C^^% żelatyny) w celu wyeluowania faga do oczyszczania łysinkowego. Wydzielono 7 łysinkowo oczyszczonych fagów niosących inserty hybrydyzujące z sonda ludzkiego receptora MPL-K. Fagamidy zawarte w fagu λ ExCell™ odzyskano stosując układ rekombinacyjny in vivo zgodnie ze wskazówkami wytwórcy. Tożsamość insertów cDNA potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA.

Wydzielone klony kodowały białko wykazujące wysoki stopień identyczności sekwencji z ludzkim receptorem MPL-P i ostatnio opisanym receptorem MPL myszy (Skoda i in., EMBO J. 12: 2645-2653,1993). 7 klonów mieściło się w dwu klasach różniących się od siebie 3 klonami mającymi delecję sekwencji kodującej ciąg 60 reszt aminokwasowych blisko końca N. cDNA kodujący białko bez delecji nazwano cDNA receptora MPL typu I myszy. cDNA receptora typu II nie miał sekwencji kodującej reszty 131 do 190 SEKW. NR ID.: 17 receptora typu I. Dodatkowo, receptory typu I i II różniły się od opisanej sekwencji receptora MPL myszy (Skoda i in., ibid.) obecnością sekwencji kodującej reszty aminokwasowe Wal-Arg-Tre-Ser-Pro-Ala-Gli-Glu (SEKW. NR ID.: 9) wstawionej po reszcie aminokwasowej 222 i substytucjąreszty glicyny za serynę w pozycji 241 (pozycje odnoszą się do receptora typu I myszy).

cDNA receptora typu I i II MPL myszy subklonowane do plazmidowego wektora pHZ-1 dla ekspresji w komórce ssaka. Plazmid pHZ-1 jest wektorem ekspresji, który można stosować do wywołania ekspresji białka w systemie translacji komórki ssaka lub oocytu żaby z mRNA transktybowanego in vitro. Jednostka ekspresji pHZ-1 obejmuje promotor metallotioneiny-1 myszy, promotor bakteriofaga T7 flankowany bankami wielokrotnego klonowania zawierającymi unikalne miejsca restrykcji do insercji kodujących sekwencji, terminator ludzkiego hormonu wzrostu i terminator bakteriofaga T7. Dodatkowo, pHZ-1 zawiera początek replikacji E. coli; gen bakteryjnej beta laktamazy; jednostka ekspresji wybieralnego markera ssaka obejmującąpromotor SV40 i początek, gen oporności na neomycynę i terminator transkrypcji SV40. W celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania do pH2-1, zastosowano reakcję łańcuchową polimerazy wykorzystującą właściwe startery do wytworzenia miejsca EcoRI i miejsca Xhol w górę od kodonu początku translacji i w dół od kodonu zakończenia translacji, odpowiednio. Reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono w mieszaninie zawierającej 10 μΐ bufora 10x ULTMA™ polimerazy DNA (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), 6 μl 25 mM MgCl₂, 0,2 μΐ roztworu trifosforanów deoksynukleotydów zawierającego po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i dCTP (Pharmacia LKB Biotechnologa Inc.), 2,5 μΐ 20 pmol/μ startera ZC6603 (SEKW. NR ID.: 8),

2,5 μ 20 pmoLl/μ starteer ZC5776 (SEKW.TNRID.: 5),32,8 μ wody, l μ wcceenee logasytmicznej fazy bakteryjnej kultury niosącej plazmid receptora MPL myszy typu I lub typu II i 1 μΐ 6 U/μΙ polimerazy dNa (ULTMA™ polimerazy; Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). AmpliWax™ (Roche Molecular Systems, Inc.) wykorzystano w reakcji zgodnie ze wskazówkami producenta. Reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono przez 25 cykli (1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 55°C i 3 minuty w temperaturze 72°C) a następnie inkubowano 10 minut w temperaturze 72°C. Wzmocnione produkty seryjne ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, następnie wytrącone etanolem w obecności 6 μg glikogenowego nośnika i 2,5 M octanu amonu. Granulki umieszczono w zawiesinie w 87 μ wody, do której dodano 10 μ bufora 10x H (Boehringer Mannheim Corp.), 2 prl 10 U/μ EcoRI (Boehringer Mannheim) i 1 μ 40 U/μ Xhol (Boehringer Mannheim Corp.). Trawienie prowadzono w temperaturze 37°C przez godzinę. Reakcję zakończono ogrzewając do 65°C przez 15 minut i poddano chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (CHROMA SPIN+TE-400™; Clontech Laboratories Inc.).

Wydzielone inserty receptora opisanego powyżej ligowano do trawionego EcoRI i Xhol i defosforylowanego wektora pHZ-1. Mieszanina ligacji zawierała 1 μΐ 50 ng/μ wytworzonego wektora pHZ-1, 5 μΐ 5 ng/μ insertu cDNA, 2 μ bufora 10x ligazy (Promega Corp.), 11,75 pl wody i 0,25 pl 4 U/pl ligazy DNA T4 (Stratagene Cloning Systems). Ligację prowadzono w temperaturze 10°C przez noc. Ligowany DNA transfekowano do E. coli (MAX EFFICIENCY DH10B™ kompetentne komórki; GIBCO BRL) zgodnie ze wskazówkami producenta. Ważność insertów typu I i typu II MPL myszy i ludzkiego receptora MPL-P w pHZ-1 potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA. Powstałe plazmidy pSLmpl-8 i pSLmpl-9 niosły cDNA receptora MPL typu II i typu I myszy, odpowiednio. Plazmid pSLmpl-44 niósł cDNA insertu ludzkiego MPL-P.

Przykład III. Konstrukcja linii komórek BaF3 o ekspresji receptorów MPL

BaF3, zależną od interleukiny-3 pre-limfoidalną linię komórek pochodzącą z mysiego szpiku kostnego (Palacios i Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot i in., Mol. Cell. Biol. 6:4133-41-3^, 1986), treymano na pełnej pożywce (pożywka RpMi 1640 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) uzupełniona 10% zdezaktywowanej cieplnie płodowej surowicy cielęcej, 4% kondycjonowanej pożywki z hodowanych komórek WEHI-3 (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA), 2m M L-glutaminy, 2-merkaptoetanolem (1:280000 końcowe stężenie) i antybiotykami PSN (GIBCO BRL). Oczyszczone chlorkiem cezu plazmidy pSLmpl-e, pSLmpl-9 i pS Lmpl-44 linearyzowano na miejscu Ndel przed elektroporacjądo komórek BaF3. Komórki BaF3 do elektroporacji przemyto raz pożywką RPMI 1640 i umieszczono w zawiesinie w RPMI 1640 z gęstością komórek 107 komórek/ml. 1 ml umieszczono w zawiesinie komórek BaF3 zmieszanych z 30 pg DNA każdego linearyzowanego plazmidu i przeniesiono do oddzielnych jednorazowych komórek elektroporacji (GIBCO BRL). Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórkom dano dwa kolejne szoki (800 pF/300 V; 1180 pF/300 V) dostarczone przez aparat do elektroporacji (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Po 5 minutach odpoczynku, elektroporowane komórki przeniesiono do 10 ml kompletnej pożywki i umieszczono w inkubatorze na 15-24 godziny (37°C, 5% CO₂). Komórki odwirowano następnie i umieszczono w zawiesinie w 10 ml kompletnej pożywki zawierającej 1600 pg/ml G418 i umieszczono w ograniczających rozcieńczeniach w 96-studzienkowych płytkach do kultur tkankowych w celu wydzielenia opornych na G418 klonów. O ekspresji receptora MPL w opornych na G418 klonach BaF3 wnioskowano dzięki analizie Northern mRNA NaF3 na obecność transkryptu receptora MPL. Linia komórek nazwana BaF3/MPLRl.l okazała się dawać ekspresję dużych ilości mRNA receptora MPL typu I myszy i użyto jej do kolejnego testu na aktywność ligandu MPL w kondycjonowanej pożywce transfekowanych BHK 570 komórek. Linię komórek BaF3 dającą ekspresję mRNA receptor typu II nazwano BaF3/MPLR2.

Przykład IV. Wytwarzanie rozpuszczalnego receptora MPL myszy.

Plazmid ekspresyjny ssaka kodujący rozpuszczalny receptor MPL typu I myszy (pLDmpl-53) wytworzono łącząc segmenty DNA z pSLmpl-9, plazmidu ekspresyjnego ssaka zawierającego cDNA kodujące pełnej długości receptor MPL typu I myszy opisany powyżej, z segmentem DNA z pSLmpl-26, plazmidu ekspresji skonstruowanego do wytwarzania rozpuszczalnego receptora MPL typu I myszy w bakterii.

Segment cDNA kodujący rozpuszczalny receptor MPL typu I myszy wydzielono metodą PCR wykorzystując startery ZC6704 (SEKW. NR ID.: 10) i ZC6703 (SEKW. NR ID.: 11) stosując pełnej długości plazmid pSLmpl-9 receptora jako matrycę. W celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania, startery ZC6704 i ZC6703 miały miejsca restrykcji EcoRI i Xhol na ich odpowiednich końcach 5'. Starter ZC6703 także kodował wewnątrzramkową uzgodnioną docelową sekwencję dla białka kinazy w celu umożliwienia znakowania in vitro oczyszczonego rozpuszczalnego receptor 3²P YATP (Li i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:558-562,1989). PCR prowadzono w mieszaninie zawierającej 10 pl bufora 10x ULTMA™ polimerazy DNA (Roche Molecular Systems, Inc.), 6 pl 25 mM MgCl2,0,2 pl roztworu trifosforanów deoksynukleotydów zawierającego po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i dCTp (Pharmacia LKB Biotejhnology Inc.), 11 pl 4,55 pmol/pl startera ZC6704 (SEKW. NR ID.: 10), 21 pl 2,43 pmol/pl startera ZC6703 (SEKW. NRID.: 11), 50,3 pl wody, 1 pl 50 ng/pl trawionego Hind III i Xbal pSLmpl-9 i 1 pl 6 U/pl ULTMA™ polimerazy DNA (Roche Molecular Systems, Inc.). AmpliWax™ (Roche Molecular Systems, Inc.) wykorzystano w reakcji zgodnie ze wskazówkami wytwórcy. Reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono przez 3 cykle (1 minuta w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze

50°C i 2 minuty w temperaturze 72°C), a następnie 11 cykli przy zwiększonej intensywności hybrydyzacji (1 minuta w temperaturze 95°C, 30 sekund w temperaturze 55°C i 2 minuty w temperaturze 72°C), a następnie 10 minut inkubacji w temperaturze 72°C. Wzmocniony produkt kolejno ekstrahowano mieszaninąfenol/chloroform i chloroformem, a następnie chromatografowano na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories, Inc.). Produkt PCR wytrącono etanolem w obecności 20 pg glikogenowego nośnika i 2,5 M octanu amonu. Granulkę umieszczono w zawiesinie w 32 pl wody. Do 16 pl umieszczonego w zawiesinie produktu PCR dodano 2 jjI bufora 10x H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 pl 10 U/pl EcoRI (Boehringer Mennheim Corp.) i 1 pl 40 U/pl XhoI (Boehringer Mannheim Corp.). Trawienie prowadzono w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Trawienie zakończono przez ogrzanie do 65°C przez 15 minut i oczyszczenie na 0,7% niskotopliwym żelu agarozowym. Fragmenty odzyskano z niskotopliwej agarozy przez trawienie matrycy żelowej β-agarazą I (New England Biolabs).

Powstały produkt PCR kodował N-terminalną pozakomórkową domenę receptora MPL typu I myszy (reszty 27 do 480 SEKW. NR ID.: 17). Przy braku przepuszczalnej trans-membranowej domeny receptora (reszty 483 do 504 SEKW. NR ID.: 17) poddane ekspresji białko powinno być wydzielane w obecności dogodnego peptydu sygnałowego. cDNA kodujący rozpuszczalny receptora MPL typu II myszy otrzymano stosując warunki PCR opisane powyżej poza tym, że jako matrycy użyto pSLmpl-8. Tożsamość obu fragmentów receptorów potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA.

Fragmenty DNA kodującego rozpuszczalny receptor MPL typu I i typu II myszy klonowano do trawionego EcoRI i XhoI wektora pOmpA2-5 wytwarzając pSLmp1 -26 i pSLmp 1 -27 , odpowiednio. Plazmid pOmpA2-5 jest modyfkacjąpOmpA2 (Ghrayab i in., EMBO J. 3: 2437-2442, 1984), bakteryjnego wektora ekspresji zaprojektowanego do umieszczania rekombinacyjnego białka w przestrzeni peryplazmatycznej. pOmpA2-5 skonstruowano przez zastąpienie sekwencji 13 par zasad pomiędzy miejscami EcoRI i BamHI pOmpA2 syntetyczną sekwencją 42 par zasad. Sekwencję utworzono przez zgrzewanie dwu 42-nukleotydowych komplementarnych oligonukleotydów (ZC6707, SEKW. NR ID.: 12; ZC 6706, SEKW. NR ID.: 13), który po sparowaniu zasad utworzyłby lepkie końce EcoRI i BamHI, ułatwiając ukierunkowane klonowania do trawionego EcoRI i BamHI pOmpA2. Wewnątrz wstawionej sekwencji znajduje się miejsce XhoI w ramce względem bakteryjnej sekwencji lidera i cDNA kodującego rozpuszczalny receptor MPL myszy opisany powyżej, jak też wewnątrzramkowy trakt 6 histydynowych kodonów umiejscowionych w kierunku 3' od miejsca XhoI w celu umożliwienia oczyszczenia rekombinacyjnego białka metoda chromatografii powinowactwa z chelacją metalem (Houchuli i in., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988). Po sekwencji kodującej histydynowy trakt znajdował się wewnątrzramkowy kodon terminacji. Tożsamość pOmpA2-5, pSLmpl-26 i pSLmpl-27 potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA.

pLDmp 1-53, plazmid ekspresyjny ssaka wytwarzający rozpuszczalny receptor MPL typu I myszy, skonstruowano łącząc segmenty DNA z pSLmp 1-9 i pSLmp 1-26 w wektor ekspresji pHZ-200 (pHZ-1, w którym podstawiono sekwencję reduktazy dihydrofolanu za gen oporności na neomycynę). Fragment cDNA o 1164 parach zasad EcoRI/BamHI z pSLmp 1 -9 zastąpiono sekwencją sygnałową ssaka wyciętą podczas konstrukcji bakteryjnego plazmidu ekspresji pSLmp 1 -26. Fragment BamHI o 416 parach zasad z pSLmp 1-26 dostarczył kodującą sekwencję dla części karboksy-terminalnej rozpuszczalnego receptora MPL, domenę znakowania kinazy, traktu polihistydynowego i terminatora translacji. Dwa fragmenty oczyszczono na żelu i klonowano do miejsca EcoRI/BamHI pBluescript® KS+ (Stratagene Cloning Systems) z wytworzeniem plazmidu pBS8.76LD-5. Poprawną orientację pochodzącego z pSLmp 1-26 fragmentu BamHI o 416 parach zasad względem pochodzącego z pSLmp 1-9 fragmentu EcoRI/BamHI o 1164 parach zasad w pBS8. 76LD-5 określono metodą PCR stosując startery ZC6603 (SEKW. NR ID.: 8) i ZC6703 (SEKW. NR.: 11). Miejsce Xbal w sekwencji polilinkerapBS8.76LD-5 pozwalało na wycięcie odtworzonego cDNA receptora jako fragmentu EcoRI/XbaI o 1,5 tysiącach par zasad do klonowania w pHZ-200 po trawieniu wektora EcoRI i Xbal. Powstały plazmid ekspresyjny saka, pLDmpl-53, wytworzono w dużej skali do transfekcji w komórkach BHK.

178 384 pg oczyszczonego plazmidu pLDmpl-53 transfekowane w komórki BHK 570 stosując metodę wytrącania fosforanu wapnia. Po 5 godzinach komórki wytrząśnięto z 15% gliceryną przez 3 minuty w celu ułatwienia poboru DNA. Świeżą pożywkę wzrostu dodawano przez noc. Następnego dnia komórki podzielono na różne rozcieńczenia, i dodano pożywkę selekcyjną zawierającą 1 pM metotreksatu. Po około 2 tygodniach, widoczne były pojedyncze - oporne na metotreksat kolonie. Oporne kolonie albo zebrano, albo trzymano jako odrębne klony. Zużyte pożywki z zebranych kolonii natychmiast testowano na obecność rozpuszczalnego białko receptora MPL.

Rozpuszczalne białko receptora MPL wydzielono dzięki oddziaływaniu traktu τolihistżdynowego obecnego na karboksy-termioalzej części białka z żywicą do chelacji metalem zawierającą unieruchomiony Ni2+ (HISBIND™; Novpg7o, Madison, WI). Wolne od surowicy zużyte pożywki kultura ze zbioru pLDmpl-53 przepuszczono nad żywicą, i związane białko eluowano IM imidazol7w. Analiza SDS-PAGE ujawniła pojedyncze pasmo przy 67 kDa. Białko poddano N-terminalnej analizie aminokwasów i potwierdzono, że jest to receptor MPL myszy.

Rozpuszczalny receptor MPL myszy oczyszczono z puli traosfektaotów BHK, które transfekowaoo plazmidem ekspresji pLDmpl-53 rozpuszczalnego receptora MPL typu I myszy. Oczyszczony rozpuszczalny receptor unieruchomiono na aktywowanej CNBr matrycy SEPHAROSE™ 4B (Pharmacia LKB Biot7chnologż, Inc.) według wskazówek producenta i użyto do oczyszczania przez powinowactwo aktywności MPL w kondżcjonowpożcb pożywkach komórek 24-11 -5. Matrycę powinowactwa upakowano kolumn ąXK 16 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). Koodycjonowaną pożywkę z komórek 24-11-5 zatężono na membranie z pustych włókien z odcięciem 10 Kd (A/G Technology Corp., N7edbaw, MA) i załadowano na dół kolumny powinowactwa receptora MPL przy natężeniu przepływu 1 ml/wioutę. Kolumnę przemyto solanką buforowaną fosforanem (PBS) zawierającą 0,5 M NaCl i 0,01% azydku sodu. Aktywność MPL eluowaoo z kolumny 3M tiocyjpniao7w potasu (Sigma Che-ical Company, St. Louis, MO) przy natężeniu przepływu 0,5 wl/minutę. Tiocżjaoiao potasu usunięto przez dializę wobec PBS. Aktywne frakcje zidentyfikowane w teście oamopżpoia MTT (opisanym w przykładzie VII).

Przykład V. Wydzielanie i analiza linii komórek dającej ekspresję ligaodu receptora MPL.

Kowórki BpF3/MPLR1.1 są zależnymi od IL-3 komórkami dającymi ekspresję trwale transfekowanego receptora MPL typu I wyszy. Opracowano schemat mutageoeęż i selekcji do wydzielenia linii komórek dających ekspresję ligandu receptora MPL wetodą mutagenezy komórki BaF3/MPLRl.(, i selekcji ze względu na autokry^^^ wzrostu przy braku egzogennej IL-3.

W przybliżeniu 1,2 x 10⁶ komórek BaF3/MPLR1. 1 granulowano i przemyto GM (pożywka RPMI 1640 uzupełniona 2-merkaptoetPoolew (końcowe stężenie 1:12^^0000), 2 mM L-glutaminy, 110 pg/ml τirogronipou sodu, 50 pg/ml G418 i 10% dezaktywanej cieplnie płodowej surowicy bydlęcej). Komórki umieszczono w zawiesinie w 2ml GM zawierającej 0,15% (objętościowo) mutagennego 2-etżlometpoosulfooiaou (EMS) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji, komórki przemyto raz PBS i raz GM i umieszczono na 10 cm płytkach przy gęstości około 40000 komórek/ml w Gm uzupełnionej 5% kondycjooowaoej pożywki WEHI-3 (Becton Dickinsoo Labware, Bedford, MA) jako źródła IL-3. Komórki pozostawiono na 7 dni inkubacji w temperaturze 37°C z 5% CO2 przed selekcjąoa wzrost niezależny od IL-3. Po tym okresie, kultura była pełna żywotnych komórek. Kowórki przemyto GM i hodowano w GM przy braku koodycjooowan7j pożywki WEHI-3. Po 11 dniach selekcji obserwowano małą liczbę żywotnych komórek. Gęstość żywotnych komórek niezależnych od IL-3 oszacowano na 250 kowórek/wl. 1 ml niezależnej od IL-3 kultury umieszczono do 19 studzienek na 24-studęienkowżcb na płytkach do kultur do następnej analizy

Koodżcjooowaoe pożywki z powyższych niezależnych od IL-3 komórek BaF3/MPLR1. 1 testowano na aktywność oαmoażaoia komórek BaF3/MPLR. Koodżcjooowaoa pożywka ze wszystkich 19 pul niezależnych od IL-3 wykazywała aktywność w teście namnażania MTT (opisanym w przykładzie VII). Pozytywne pożywki przetestowano ponownie na aktywność oamoażaoia w obecności 2 (pg/ml szczurzej aoty-mysiej IL-3, anty-mysiej IL-4 lub w obecności obu neutralizujących przeciwciał (Pharmiogeo, Spo Diego, CA) w celu zidentyfikowania mutantów o wzroście niezależnym od IL-3 dających ekspresję tej cytokiny (w poprzednim eksperymencie znaleziono, że końcówki BaF3 także odpowiadały na IL-4). Tylko kondycjonowana pożywka z komórek z płytki nr 11 (nazwanych komórkami „24-11”) wykazywała aktywność nie zobojętnianą przeciwciałami IL-3 lub IL-4.

Schemat mutagenezy i selekcji opisany powyżej zastosowano do 5 innych klonów BaF3/MPLRl (klony BaF3/MPLRl nr4,9, 12,15 i 18, nazwane BaF3/MPLR1.4,.9,.12,.15 i .18, odpowiednio). 17 izolatów okazało się mieć kondycjonowane pożywki stymulujące namnażanie komórek BaF3/MPLRl. Aktywność wszystkich pożywek była zobojętniana przeciwciałem anty-IL-3 lub IL-4 samym lub łącznie. Klonów tych nie badano dalej.

Aktywność namnażania kondycjonowanej pożywki z puli 24-11 zanalizowano szczegółowo. Pulę 24-11 podzielono na 19 części i kondycjonowanąpożywkę przetestowano ponownie na aktywność. Wszystkie 19 podpul (to jest 24-11-1 do 24-11-19) stymulowało namnażanie zależnych od IL-3 komórek BaF3/MPLRl przy braku egzogennej IL-3. Aktywności nie inhibitowały neutralizujące IL-3 lub IL-4 przeciwciała lub ich kombinacja.

Przeprowadzono 2 eksperymenty w celu określenia specyficzności aktywności 24-11. Kondycjonowane pożywki testowano na aktywność namnażania wobec kontrolnych komórek BaF3 nie dających ekspresji receptora MPL. Przy braku egzogennej IL-3, nie obserwowano namnażania kontrolnej komórki BaF3 w kondycjonowanej pożywce dla żadnej z 19 podpul 24-11. W drugim eksperymencie, testowano aktywność namnażania na inhibicji przez oczyszczony rozpuszczalny receptor MPL. Komórki BaF3/MPLRl hodowane na pożywce GM uzupełnionej 50% kondycjonowanej pożywki 24-11. Do każdej próbki dodano rozpuszczalny receptora MPL typu I myszy do końcowego stężenia 0,0 0,625,1,25,2,5 lub 5,0 pg/ml. Wyniki oceniono 4 dni później w teście namnażania komórek MTT. Aktywność namnażania kondycjonowanej pożywki 24-11 była całkowicie blokowana przy od 0,625 do 1,25 (g/ml rozpuszczalnego receptora MPL. Stężenia rozpuszczalnego receptora, które całkowicie inhibitowały aktywność, nie miały żadnego wpływu na stymulację IL-3 lub IL-4 komórek BaF3/MPLR1. Wyniki wskazały, że rozpuszczalny receptor MPL współzawodniczy o stymulacyjną aktywność pożywki 24-11 i były zgodne z hipotezą, że komórki 24-11 dawały ekspresję ligandu receptora MPL.

Klony pochodzące z komórek 24-11 wydzielono umieszczając na płytkach w ograniczających rozcieńczeniach. Jeden z klonów, nazwany 24-11-5 #3, wykazał wysoką aktywność namnażania swojej kondycjonowanej pożywki względem puli 24-11. Aktywność namnażania okazała się równa 1:2000 rozcieńczeniu kondycjonowanej pożywki z komórek WEH3-3 (Becton Dickinson Labware).

Przykład VI. Konstrukcja biblioteki cDNA 24-11-5 #3

Całkowity RNA wytworzono z ~2,7 x 10⁸ komórek 24-11 -5 #3 stosując izotiocyjanian guanidyny, a następnie odwirowanie z CsCl pChlrgwin in ., ibid). Poli(A)+ RNA wydzielono stosując na zestaw do wydzielania OLIGOTEX-dT-mRNA (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Pierwsze nici cDNA z komórek 24-11 -5#3 zsyntetyzowano w 4 oddzielnych równoległych reakcj ach. Każda zawierała 7 pl wybranego poli (dT) poli(A)+ RNA 24-11 -5#3 w stężeniu 1,6 pg/pl i

2,5 pl 20 pmol/pl startera pierwszej nici ZC6172 (SEKW. NR ID.: 14) zawierającego miejsce restrykcji Xhol. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65°C przez 4 minuty i ochłodzono na lodzie. Syntezę pierwszej nici cDNA zainicjowano dodaniem 8 pl bufora pierwszej nici (bufor 5x SUPERSCRIPT™; GIBCO BRL), 4 pl 100 mM ditiotreitolu i 2 pl roztworu trifosforanów deoksynukleotydów zawierających po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i 5-metylo-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnolog^ Inc.) do mieszaniny RNA-starter. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 45°C przez 4 minuty, następnie dodano 10 pl 200 U/pl odwrotną transkryptazę RNase H (GIBCO BRL). Wydajności pierwszej nici syntezy zanalizowano w równoległej reakcji dodaniem 10 pCi 32P-adCTP do 10 pl porcji z jednej z mieszanin reakcyjnych w celu oznakowania reakcji do analizy. Reakcje inkubowano w temperaturze 45°C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 50°C przez 15 minut. Niewstawiony 32P-adCTP w znakowanej reakcji usunięto metodą chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Labo178 384 ratories). Mieszaniny z reakcji z nieznakowanąpierwsząniciązebrano, i niewstawione nukleotydy usunięto dwukrotnie wytrącając cDNA w obecności 32 pg glikogenowego nośnika, 2,5 M octanu amonu i 2,5 objętości etanolu. Nieznakowany cDNA umieszczono w zawiesinie w 144 pl wody do stosowania w syntezie drugiej nici. Długość znakowanej pierwszej nici cDNA określono przez elektroforezę na żelu agarozowym.

Syntezę drugiej nici prowadzono na pierwszej nici cDNA w warunkach które promowały przygotowanie pierwszej nici do syntezy drugiej nici, co dało utworzenie DNA w postaci typu szpilki do włosów. Przeprowadzono 3 oddzielne równoległe reakcje drugiej nici. Każda reakcja drugiej nici zawierała 48 pl nieznakowanej pierwszej nici cDNA, 16,5 pl wody, 20 pl bufor 5x polimerazy I (100 mM Tris: HC1, pH 7,4,500 mM KC1,25 mM MgCl₂,50 mM (Nh₄)₂SC>4), 1 pl 100 mM ditiotreitolu, 1 pl roztworu zawierającego ^^m^tri;fo:sfo^i^iuka^(^<^j^odeoksynu^ieot^di^,3 pl 5 mM β-NAD, 1 pl3 U/pl ligazy DNA E. coli (New England Biolabs Inc.) i 5 pl 10 U/pl polimerazy I DNA E. coli (Amersham Corp.). Reakcję zestawiono w temperaturze pokojowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, następnie dodano 1,5 pl 2 U/pl RNase H (GIBCO BRL). 10 pl porcję zjednej z reakcji syntezy drugiej nici znakowano dodaniem 10 pCi „P-adCTP w celu monitorowania wydajności syntezy drugiej nici. Reakcje inkubowano w temperaturze 15°C przez 2 godziny, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Niewstawiony „P-adCTP w znakowanej reakcji usunięto metodą chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories) przed analizą elektroforetyczną na żelu agarozowym. Mieszaniny z nieznakowanych reakcji zebrano i ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, a następnie wytrącono etanolem w obecności 2,5 M octanu amonu.

Jednoniciowy DNA o strukturze szpilki do włosów przecięto stosując nukleazy fasoli mung. Mieszanina reakcyjna zawierała 100 pl drugiej nici cDNA, 20 pl bufora 10x nukleazy fasoli mung (Stratagene Cloning Systems), 16 p 100 mM ditiotreitolu, 48 pl wody, 10 pl bufora rozcieńczania nukleazy fasoli mung (Stratagene Cloning Systems) i 6 pl 50 U/pl nukleazy fasoli mung (Promega Corp.). Reakcję inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Reakcję zakończono dodaniem 20 pl 1M Tris: HC1, pH 8,0, a następnie kolejnymi ekstrakcjami fenolem/chloroformem i chloroformem, jak opisano powyżej. Po ekstrakcjach, DNA wytrącano w etanolu i umieszczono w zawiesinie w wodzie.

Umieszczony w zawiesinie cDNA zakończono lepkimi końcami przy pomocy polimerazy DNA T4. cDNA, który umieszczono w zawiesinie w 188 pl wody, zmieszano z 50 pl bufora 5x polimerazy DNA T4 (250 mM Tris:HCl, pH 8,0,250 mM KC1,25 mM MgCl₂), 3 pl 0,1 M ditiotreitolu, 4 pl roztworu zawierającego 10 mM trifosforanu każdego deoksynukleotydu i 5 pl 1 U/pl polimerazy DNA T4 (Boehringer Mannheim Corp.). Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 15°C, reakcję zakończono dodaniem 10 pl 0,5 M EDTA, a następnie kolejnymi ekstrakcjami fenolem/chloroformem i chloroformem, jak opisano powyżej. DNA poddano chromatografii na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories Inc.) w celu usunięcia śladowych poziomów białek i w celu usunięcia krótłdego cDNA poniżej ~400 par zasad. DNA wytrącono etanolem w obecności 10 fig glikogenowego nośnika i 2,5 M octanu amonu i umieszczono w zawiesinie w 15 pl wody. W oparciu o włączanie „P-adCTP, wydajność cDNA oszacowano na ~8 pg z 40 pg początkowej matrycy mRNA.

Adaptery EcoRI ligowano do końców 5' cDNA opisanego powyżej w celu umożliwienia klonowania do wektora ekspresji, 10 pl porcję cDNA (~5 pg) i 21 pl 65 pmol/p adaptera EcoRI (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) zmieszano z 4 pl bufora 10x ligazy (Promega Corp.), 3 pl 10 mM ATP i 3 pl 15 U/pl ligazy DNA T4 (Promega Corp.). Reakcję inkubowano przez noc (~48 godzin) w temperaturze 9°C. Reakcję zakończono dodaniem 140 pl wody, 20 pl bufora 10x H (Boehringer Mannheim Corp.) i inkubowano w temperaturze 65°C przez 40 minut. Po inkubacji cDNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem, jak opisano powyżej, i wytrącono w obecności 2,5 M octanu amonu i 1,2 objętości izopropanolu. Po odwirowaniu, granulkę cDnA przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 89 pl wody.

W celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania cDNA do wektora ekspresji, cDNA trawiono Xhol, co dało cDNA mający lepki koniec 5' Eco RI i lepki koniec 3' Xhol. Miejsce restry34

178 384 kcji Xhol na końcu 3' cDNA było uprzednio wprowadzone starterem ZC6172 (SEKW. NR ID.: 14). Trawienie enzymem restrykcyjnym prowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 89 pl cDNA opisanego powyżej, 10 pl bufora 1 Ox H (Promega Corp.) i 1,5 pl 40 U/pl Xhol (Boehringer Mannheim Corp.). Trawienie prowadzono w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Reakcję zakończono kolejnymi ekstrakcjami fenolem/chloroformem i chloroformem i chromatografiąna żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories Inc.).

cDNA wytrącono etanolem, przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 20 pi bufora 1x ładowania na żel (10 mM Tris:HCl, pH 8,0,1 mM EDTA, 5% gliceryny i 0,125% błękitu bromofenolowego. Umieszczony w zawiesinie cDNA ogrzewano do 65°C przez 5 minut, ochłodzono na lodzie i poddano elektroforezie na 0,8% niskotopliwym żelu agarozowym SEA PLAQUE GTG™ niskotopliwy żel agarozowy; FMC Corp.) zanieczyszczające adaptery i cDNA poniżej 0,5 tysięcy par zasad wycięto z żelu. Elektrody odwrócono i cDNA poddane elektroforezie do stężenia bliskiego początkowi ścieżki. Pole na żelu zawierające stężony cDNA wycięto i umieszczono w probówce do mikrowirowania, i określono przybliżoną objętość ścinka żelu. Do probówki dodano porcję wody (300 pl) w przybliżeniu trzy razy większą od objętości ścinka żelu, i żel agarozowy stopiono przez ogrzanie do 65°C przez 15 minut. Po zrównoważeniu próbki do 45°C, dodano 5 pl 1 U/pl β-agarazy I (New England Biolabs, Inc.), i mieszaninę inkubowano przez 90 minut w temperaturze 45°C w celu przetrawienia żelu agarozowego. Po inkubacji dodano do próbki 40 pl 3M octanu sodu, i mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut. Próbki odwirowano przy 14,000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia nieprzetrawionej agarozy, a następnie chromatografowano na żelu o rozmiarach porów 400 na kolumnie filtracyjnej (Clontech Laboratories). cDNA wytrącono etanolem, przemyto w 70% etanolu, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 70 pl wody do reakcji kinazy w celu fosforylowania ligowanych adapterów EcoRI.

Do 70 pl roztworu cDNA dodano 10 pl bufora 10x ligazy (Stratagene Cloning Systems), i mieszaninę ogrzewano do 65°C przez 5 minut. Mieszaninę ochłodzono na lodzie, i dodano 16 pl 10 mM ATP i 4 pl 10 U/pl polinukleotydowej kinazy T4 (Stratagene Cloning Systems). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę i zakończono przez ogrzanie do 65°C przez 10 minut, a następnie kolejnymi ekstrakcjami mieszaniną fenol/chloroform i chloroformem. Fosforylowany cDNA wytrącono etanolem w obecności 2,5 M octanu amonu, przemyto 70% etanolem, osuszono na powietrzu i umieszczono w zawiesinie w 10 pl wody. Stężenie fosforylowanego cDNA oszacowano na ~40 fmol/pl.

Wektor ekspresji ssaka pDX (opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4959318) (fig.) zmodyfikowano w celu przyjęcia cDNA 24-11-5#3 zsyntetyzowanego z końcami EcoRI-XhoI. Endogenne miejsce Sal I na pDX wyeliminowano przez trawienie plazmidu Sali i recyrkularyzację plazmidu po wytworzeniu lepkich końców Sali polimeraząDNA T4. Recyrkularyzowany plazmid trawiono EcoRI i ligowano do niego a krótką sekwencję polilinkera złożoną z 2 komplementarnych oligonukleotydów, ZC6936 (SEKW. NR ID.: 15) i ZC6937 (SEKW. NR ID.: 16), tworząc plazmid pDX.ES. Wprowadzona sekwencja polilinker na pDX.ES zawierała miejsca EcoRI i Sali w celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania cDNA 24-11-5 zsyntetyzowanego z końcami EcoRI-XhoI.

Plazmidowąbibliotekę cDNA wytworzono przez ligację EcoRI^hol cDNA 24-11 -5 z trawionym EcoRI/Sall pDX.ES. Mieszaninę ligacyjną elektroporowano do E. coli (ELECTROMAX DH10B™ kompetentne komórki; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) stosując pulsator genowy/sterownik pulsów i 0,2 cm kuwetę (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) w warunkach 0,2 KV, 400 Ω i 25 pF. Komórki rozcieńczono do 1,5 ml bulionem Luria i inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut, następnie dodano 0,75 ml 50% gliceryny. Transfekowane komórki podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -70°C do użycia. 80 fmol cDNA dało ponad 700,000 niezależnych rekombinacyjnych plazmidów.

Przykład VII. Ekspresyjny skriningbiblioteki cDNA 24-11-5 na aktywność MPL.

Bibliotekę cDNA 24-11-5#3 umieszczono na około 2000 10 cm średnicy agarowych płytek z bulionem Luria uzupełnionym 100 pg/ml ampicyliny. Gęstość na płytkach wynosiła po178 384 między 200 i 250 bakteryjnych kolonii na płytkę. Plazmid DNA do transfekcji komórek BHK 570 wytworzono z każdej bakteryjnej płytki stosując żywicę do oczyszczania DNA MAGIC MINIPRES™ (Promega Corp.), zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Plazmidy DNA przechowywano w temperaturze -20°C do t^^^nsfekcji w komórki BHK 570.

Pule plazmidu cDNA 24-11-5#3, zawierające w przybliżeniu po 200 to 250 klonów cDNA, transfekowane do komórek BHK 570 stosując 3:1 liposomową kompozycję 2,3-dioloiloksy-N-[2(sperminokarboksyamido)etylo]-N,N-dimetylo-l-propanaminiotrifluorooctanu i dioleilofosfatydylootanoloawiny w wodzie (LIPOFECTAMINE™; GIBCO BRL). 20 pl 30 pg/pl DNA dodano do 20 fil 1:10 rozcieńczenia roztworu LIPOFECTAMINE™ i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji, 160 pl wolnej od surowicy pożywki (Hams F^Dulbeccos MEM (1:1) uzupełnionej 2mM L-glutaminy, 0,11 mg/ml pirogronianu sodu, 5 pg/ml insuliny, 5 pg/ml fetuiny, 10 pg/ml transferyny, 2 ng/ml tlenku selenu IV i 25 mM bufora HEPES) dodano do mieszaniny DNA/LIPOFECTAMINE™ i przeniesiono na 24-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania zawierające ~ 100,000 komórek BHK 570. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C z 5% CO2 przez 4 godziny, po czym dodano 200 pl Pożywki Wzrostu BHK (zmodyfikowanej pożywki Du^ec^s Eagles's uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 0,11 mg/ml pirogronianu sodu, 5% dezaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej i 100x antybiotykami PSM (GIBCO BRL). Komórki inkubowano przez 16 godzin. Pożywki usunięto i zastąpiono 0,5 ml świeżej Pożywki Wzrostu BHK, kondycjonowanąprzez 48 godzin przed testem na aktywność MPL.

Użyto testu na namnażanie komórek w celu wykrycia obecności aktywności MPL w kondycjonowanej pożywce komórek BHK 570 transfekowanych biblioteką. 100 pl kondycjonowanej pożywki dodano do 100 pl 106/ml przemytych komórek BaF3/MPLR1.1 w pożywce RPMI 1640 (JRH Biosoionoe Inc., Lenexa, KS) uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, antybiotykami PSN (GIBCO BRL), 0,00036% 2-merkαptootanolu i 10% dezaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej. Testowane komórki inkubowano przez 3 dni w temperaturze 37°C z 5% CO2 przed testem na namnażanie.

Namnażanie komórek w obecności MPL oceniono ilościowo stosując kolorymetryczny test oparty na metabolicznym rozkładzie bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difeoylototrazoliowego (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983). 20 p 10 mg/ml roztworu MTT (Poliscienoo, Inc., Warrington, PA) dodano do 100 pl testowych komórek BaF3/MPLRl. 1, i komórki inkubowano w temperaturze 37°C. Po 4 godzinach, dodano 200 pl 0,04 N HC1 w izopropaaolu, roztwór mieszano, i odczytano absorbancję próbki dla 570 nm na czytniku ELISA EL320 (Bio-Tek Instr^iments Inc., Highland Park, VT).

Jedna pula plazmidu określonojako pozytywną, nazwano T1081, i transfekowane do komórek BHK 570. Supernatant z transfektantów dał pozytywny sygnał w teście namnażania MTT. Eksperymenty PCR i neutralizacji przeciwciał wykazały, że aktywność nie była związana z IL-3 lub IL-4.

Plazmidy z pozytywnej puli zastosowano do transformacji DH1 0B E. coli, i komórki umieszczono na płytkach (42 płytki z w przybliżeniu 15-20 koloniami na płytkę, 10 płytek z w przybliżeniu 90 koloniami na płytkę i 8 płytek z w przybliżeniu 250 koloniami na płytkę). Wykonano replikę każdej płytki i przechowywano w temperaturze 4°C. Kolonie z oryginalnych płytek zdrapano i umieszczono w ciekłej kulturze na jeszcze kilka godzin, następnie wytworzono DNA.

Plazmid DNA z podpuli transfekowano do komórek BHK 570, i supematanty komórek zebrano i testowano jak powyżej. Po około 2 godzinach, one podpula (#22) okazała się pozytywna w badaniu mikroskopowym (wydłużone komórki). Kilka godzin później 2 dodatkowe podpule (# 19 i #28) także okazały się pozytywne. Pozostałe supematanty z każdej pozytywnej podpuli testowano wobec kontrolnej komórki BaF3 i nie stwierdzono aktywności. Ponadto, aktywność z 3 pozytywnych podpul była inhibitowana rozpuszczalnym receptorem MPL typu I.

Repliki płytek z 3 pozytywnych podpul pozostawiono do rośnięcia przez kilka godzin, następnie indywidualne kolonie zebrano i użyto do szczepienia 3 ml kultur. Kultury hodowano w przybliżeniu 8 godzin w temperaturze 37°C, następnie wytworzono DNA w.ioipreparatywną1wetodą, jak opisano powyżej. Plazmid DNA trasfekowano do komórek BHK 570, i supematanty

178 334!

zbierano w przybliżeniu 10 godzin później i testowano na aktywność. Po godzinie jeden klon (nazwany T1081 -19-25, odpowiadający podpuli #19) był pozytywny. Klon rozprowadzono na pojedyncze kolonie. DNA wytworzono z 12 kolonii i transfekowane do komórek BHK 570. W szystkie 12 tr^^^fektan^^-w okazało się pozytywnych w teście. DNA z 1z 12e pozytywnych kolonii transformowano do E. coli DH5a. Plazmid nazwano pZGmp 1-1081. Transformant złożono 14 lutego 1994 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD pod numerem dostępu 69566.

Określono sekwencję nukleotydowącDNA kodującego hemopoezyjne białko (trombopoetynę) (SEKW. NR.: 1). Analiza kodowanej sekwencji aminokwasowej (SEKW. NR ID.: 2) wskazała, że koniec aminowy dojrzałego białka znajduje się na reszcie aminokwasowej 45. Dwa kodony metioniny, w pozycjach 105 i 174 SEKW. NR ID.: 1, wydają się być kodonami startu, z głównym miejscem startu spodziewanym w pozycji 174.

Przykład VIII. Hemopoezyjna aktywność rekombinscyjnej trombopoetyny

Szpik zebrano z kości udowych i piszczelowych samic myszy CD-1 po ciąży do 25 ml bufora CATCH (99 mg teofiliny, 0,7 5 g cytrynianu sodu, 75 mg adenozyny, 20 ml 10x zrównoważonego roztworu solanki Hanka bez Ca⁺⁺ Mg**, na 200 ml dH₂0; pH 7,4). Komórki umieszczono w pojedynczokomórkowej zawiesinie pipetując 25 ml pipetą. Objętość podwyższono do 50 ml buforem CATCH, i komórki granulowano przy 1000 rpm przez 7 minut. Granulkę umieszczono w zawiesinie w 25 ml bufora CATCH i inkubowano w naczyniu T75 do kultur tkankowych przez pierwszy etap przywierania do tworzywa sztucznego w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Nie przywierające komórki zebrano przez odwirowanie przy 1000 rpm przez 7 minut otrzymując granulowane komórki. Granulkę umieszczono w zawiesinie w 15 ml alfa-MEM + 10% FBS ^L-glutamina, pirogronian sodu, i antybiotyki PSN) i inkubowano w kolbie T75 przez drugi etap przywierania do tworzywa sztucznego, jak opisano powyżej dla pierwszego. Po końcowym odwirowaniu i umieszczeniu w zawiesienie, komórki zliczono, 0,5 ml komórek w stężeniu 576000 komórek /ml umieszczono na 24 studzienkowych płytkach do kultur tkankowych, wraz z próbkami pożywki a kontrolnych komórek BHK lub kondycjonowaną pożywką komórek BHK tr^l^ftfekowanych pZGmpl-1081. Po 3 dniach inkubacji w temperaturze 37°C, komórki zebrano i zabarwiono jak opisano poniżej.

150 μ komórek zebrano z kontrolnej studzienki potraktowanej standardową kondycjonowanąpożywką. 50 μΐ komórek zebrano ze studzienki potraktowanej kondyjjonowanąpożywkąz komórek BHK transfekowanych pZGmpl-1081. Próbki odwirowano i wytworzono standardowe mikroskopowe przezrocza.

Przezrocza utrwalono w 100% metanolu, następnie zalano with 1:1 barwnikiem Wrighta (0,5 g barwnika Wrighta w 300 ml metanolu/H20 na 6 minut, przemyto wodą, i osuszono. Przezrocza zalano następnie barwnikiem Giemsa (Sigma Chemical Corp.) w buforze Sorensena (2,28 g KHoP04/0,38 g NaP^4 w 250 ml H₂0), przemyto wodą i osuszono.

Po wzięciu poprawki na zużyte objętości próbka pożywki BHK/pZGm1-1081 zawierała 120 megakariocytów an 150 μ objętości w porównaniu z 9 megakariocytami na 150 μ objętości kontrolnej pożywki. Ponadto, megsksriocyey w potraktowanej eksperymentalnej próbce wydawały się pod mikroskopem znacząco większe niż komórki kontrolne i zabarwiały się silniej ze względu na zawartość polijąder.

Kondycjonowąpożywkę z mutantowej linii BaF3/MPLR1.1 24-11-5 #3 zebrano przy braku surowicy i zatężono 20-krotnie na urządzeniu filtracyjnym Amicon Inc. (Beverly, MA) z odcięciem 10 Kd. Szpik zebrano z kości udowych myszy i umieszczono w zawiesinie w Pożywce Dulbeco, modyfikacja Iscove (GIBCO BRL) +15% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Po umieszczeniu w zawiesinie, komórki z jądrami zliczono i umieszczono na płytkach z gęstością 75000 komórek/ml i 0,9 ml/płytkę w pożywce zawierającej 50% metylocelulozy, 15% FCS, 10% BSA, i 0,6% PSN (półstałej pożywki) na 1ml płytkach do kultur tkankowych. Dodano różne kondycjonowane pożywki i kontrolne próbki dla zwiększenia całkowitej objętości do 1 ml. Płytki inkubowano w temperaturze 37^/5% CO2 przez 6 dni i następnie zbadano mikroskopowo na ilość kolonii grandocytów/makrofagów (GM). Płytki inkubowane w obecności 24-11-5 #3 kondycjo178 384 nowanej pożywki wykazującej słabą podobną do GM-CSF aktywność, wytwarzające 25 kolonii, porównano ze zliczeniem zero dla negatywnej kontrolnej próbki, i zliczeniem 130 dla płytki stymulowanej pozytywną kontrolną (kondycjonowana pożywka mitogenu szkarłatki ze śledzioną (PWMSCM); wytworzono przez inkubację rozdrobnionej śledziony myszy przez tydzień w obecności mitogenu szkarłatki (z Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) + 2 jednostki/ml erytropoetyny).

Szpik zebrano z kości udowych myszy i umieszczono w zawiesinie w Pożywce Dulbecco, modyfikacja Iscove (GIBCO-BRL) zawierającej 15% FCS, i komórki zjądrami zliczono i umieszczono na płytkach w półstałej pożywce, jak opisano powyżej. Komórki zastosowano do testu aktywności tworzenia kolonii megakariocytów białka kodowanego przez insert pZGmp 1-1081.

Pulę komórek BHK 570 trwale transfekowanych pZGmp1-1081 hodowano przy braku surowicy, i zebrano kondycjonowaną pożywkę. Kondycjonowaną pożywkę testowano samą i w połączeniu z kondycjonowaną pożywką mitogenu szkarłatki ze śledzioną, rekombinacyjną mysią IL-3, IL-6 (Genzyme Corp., Cambridge, MA), IL-11 (Genzyme Corp.) lub kombinacjami tych czynników. PWMSCM użytojako pozytywnej kontroli. NiekondycjonowanaJ pożywki kultury użyto jako negatywnej kontrolnej.

Testowe lub kontrolne próbki dodano do kultury szpiku zwiększaj ąc całkowitą obj ętość do 1 ml. Płytki inkubowano przez 6 dni w temperaturze 37°C w 5% CO₂, następnie zbadano mikroskopowo na ilość megakariocytowych kolonii. Wyniki pokazano w tabeli 4. Podsumowując, kondycjonowana pożywka BHK/pZGmpl-1081 wykazywała aktywność tworzenia kolonii magakariocytów, polepszaną w obecności wcześnie działających czynników do poziomów znacząco wyższych niż w przypadku samych wcześnie działających czynników.

Tabela 4

Próbka

Negatywna kontrola PWMSCM BHK/pZGmpl-1081 BHK/pZGmpl- 1081+PWMSCM IL-3

IL-3+ BHK/pZGmpl-1081 IL-6

IL-6+ BHK/pZGmpl-1081 IL-11

IL-11+ BHK/pZGmpl-1081 IL-3+ IL-6

IL-3+ IL-6+ BHK/pZGmpl-1081 IL-3+ IL^11

IL-3+ IL-11+ BHK/pZGmpl-1081

Kolonie megak^ocytów 0

2 15

0 6 1 6 2 9

In vivo aktywność kondycjonowanej pożywki BHK/pZGmpl-1081 testowano na myszach. Wolną od surowicy pożywkę zebrano i zatężono pięciokrotnie stosując urządzenie filtracyjne odcinające przy 10 Kd (Amicon, Inc., Beverly, MA). Kontrolną (nie kondycjonowaną) pożywkę zatężono w podobny sposób. 6 myszy BALB/c (Simonsen Laboratories, Inc., Gilroy, CA) potraktowano 7 dzienne dootrzewnowymi zastrzykami 0,5 ml kontrolnej lub kondycjonowanej pożywki. Próbki krwi zebrano w dniu 0,3, i 7 i zliczono na zawartość płytek krwi. Wyni38

178 384 ki, pokazane w tabeli 5, pokazują, że kondycjonowana pożywka z komórek BHK/pZGmp1-1081 wykazuje trombopoezyjną aktywność.

Tabela 5

Zliczenie płytek krwi (104/pl)

Leczenie	Dzień 0	Dzień 3	Dzień 7
Kontrolna	141	141	87
Kontrolna	159	149	184
BHK/pZGmpl-1081	157	160	563
BHK/pZGmpl-1081	169	154	669
BHK/pZGmp1-1081	139	136	492
BHK/pZGmp1-1081	135	187	554

Przykład IX. Wydzielanie genu ludzkiej trombopoetyny

Wzmocnioną genomową bibliotekę ludzkiego płuca Lambda FIX® (Stratagene Cloning Systems) poddano skriningowi na gen kodujący ludzkątrombopoetynę z zastosowaniem cDNA ligandu receptora myszy mpl jako sondy. Bibliotekę mianowano, i 30 150-mm płytek zaszczepionych komórkami E. coli szczep LE-392 (Sratagene Cloning Systems) zakażono 4x104 jednostek tworzących łysinki (PFU). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Pobrano odcinki na filtr stosując nylonowe membrany HYBOND-N™ (Amersham) zgodnie z procedurą zalecanąprzez producenta. Filtry przetworzono przez denaturację w roztworze zawierającym 1,5 M NaCl i 0,5 M NaOH przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Filtry osuszono krótko na sączku w celu usunięcia nadmiaru roztworu denaturacyjnego, a następnie neutralizowano przez 5 minut w 1M Tris-HCl (pH 7,5) i 1,5 M NaCl. Faga DNA utrwalono na filtrach energią nadfioletową 1200 pJ w urządzeniu sieciującym STRATALENKER® (Stratagene Cloning Systems). Po utrwaleniu, filtry przemyto trzykrotnie w 0,25 x SSC, 0,25% SDS i 1 mM EDTA w temperaturze 65°C. Po przemyciu, filtry prehybrydyzowano w roztworze hybrydyzacyjnym (5x SSC, 5X roztworu Denhardta, 0,2% SDS i 1 mM EDTA) przesączonym przez filtr 0,45 pM. Denaturowane cieplnie, utarte DNA spermy łososia (końcowe stężenie 100 pg/ml) dodano natychmiast przed użyciem. Filtry prehybiydyzowano w temperaturze 65°C przez noc.

Pełnej długości cDNA TPO myszy z pZGmp1-1081 znakowane 32p metodą swobodnego przygotowania stosując MEGAPRIME™ DNA Labelling Systems (Amersham) zgodnie ze sposobem zalecanym przez wytwórcę. Wstępny roztwór hybrydyzacyjny zastąpiono świeżym roztworem hybrydyzacji zawierającym w przybliżeniu 1 x 10⁶ cpm sondy i pozostawiono do hybrydyzacji przez noc w temperaturze 65°C. Po hybrydyzacji, roztwór hybrydyzacji usunięto, i filtry przepłukano 4 lub 5 razy w roztworze myjącym zawierającym 0,25x SSC, 0,25% SDS, i 1 mM EdtA. Po przepłukaniu, filtry przemyto kolejno 8 razy w temperaturze 50°C w roztworze myjącym. Po końcowym przemywaniu, filtry wystawiono na film autoradiograficzny (XAR-5; Eastman Kodak Co.; Rochester, NY) na 4 dni w temperaturze -70°C z ekranem wzmacniającym.

Badanie autoradiografów ujawniło kilkaset regionów hybrydyzujących ze znakowaną sondą. Stemple agarowe pobrano ze 100 regionów do oczyszczania. Każdy stempel moczono przez noc w 1ml SM zawierającego 1% (objętościowo) chloroformu (wyd. Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Po inkubacji przez noc, faga z każdego stempla rozcieńczono 1:1000 w SM. Porcje 5 pl umieszczono na płytkach na komórkach E. coli szczep LE392. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, pobrano odciski na filtr, prehybrydyzowano, hybrydyzowano, przemyto i autoradiografowano, jak opisane powyżej.

Badanie powstałych autoradiografów ujawniło silne pozytywne sygnały z dwu pierwszorzędowych izolatów i słabe sygnały z 18 innych. Stemple agarowe pobrano z pozytywnych ob178 384 szarów dla każdego z 20 sygnałów. Stemple agarowe potraktowano, jak opisano powyżej. Faga eluowazego z każdego stempla agarowego rozcieńczono 1:100 w SM, i porcje 1 pl umieszczono oa płytkach z komórkami E. coli szczep LE392. Płytki iokubowaoo, wytworzono odciski faga na filtrze i hybrydyzowano, jak opisano powyżej. Filtry przemyto w temperaturze 55°C w buforze wyjącyw. Autoradiografy filtrów ujawniły pola hybrydyzacji odpowiadające pojedynczym, dyskretnym łysinkom faga z 3 oryginalnych izolatów, 8-3-2,10-1-1 i 29-2-1.

Izolaty faga 8-3-2, 10-1-1 i 29-2-1 oznaczono GGmpl-H8, λΖ(—ηρ1-Η1 li i ZZGmpl-H99, odpowiednio. DNA. z isolatów XZGmpl-H8, XZGmpl-H10 i XZGmpl-H29 oczyszczono stosując adsorbent fagów LAMBDASORB™ (Prowega Corp., Madison, WI) zgodzie ze wskazówkami wytwórcy. Ludzkie geoomowe inserty DNA z faga oddzielono od DNA wektora faga przez trawienie Xbal i oczyszczono przez elektroforezę oa żelu agarozowym. Wszystkie trzy izolaty faga zawierały sekwencję, która hybrydyzowała z soodą cDNA ligaodu receptora mysiego mpl w sposób pokazany w analizie Southema (Maoiatis i io., ibid). Faga iZGmpl-H8 zanalizowano i hybrydyzujące regiony iZGmpl-H8 znaleziono oa trzech fragmenty Xbal DNA o długości 9,5 par zasad, 2,5 tysięcy par zasad i 1 tysięcu par zasad. Fragment o 2,5 tysiącach par zasad subklonowaoo do trawionego Xbal fpgemid BLuEsCRIPT® II SK+ (Stratageoe Cloniog Systems), wytwarzając plazmid pZGmpl-H82.5.

Sekwencję ludzkiego geou TPO i kodowaną sekwencję aminokwasową pokazano na SEKW. NR ID.: 28 i SEKW. NR ID.: 29.

Przykład X. Wydzielanie pełnej długości cDNA ludzkiej tromboτoetyoż.

Pełnej długości cDNA kodujący ludzki TPO wydzielono przez reakcję łańcuchową polimerazy z matryc cDNA z ludzkiej wątroby i nerek wykorzystając specyficzne startery pochodzące z egęooowżcb sekwencji ęid7otżfikowaożcb na pZGwpl-H82.5 i z zachowanej 5' oietranslowanej sekwencji cDNA mysiego TPO.

Wybrany z poli d(T) ludzkiej nerki, wątroby i płuc pol^A) + RNA (Clootech, Palo Altro, CA) użyto do syntezy pierwszej nici cDNA. Każdą mieszaninę wytworzono stosując 4 pg poRA) + RNA zmieszany z 1 pg starterem oligo d(T)i₈mRNA (bez fosforanu 5' (New Eoglaod Biolab, B7V7rlż, MA) w końcowej objętości 19 pl. Mieszaninę ogrzewano do 65°C przez 5 miout i ochłodzono na lodzie. Syntezę cDNA zainicjowano dodaniem 8 pl bufora 5x SUPERSCRIPT™ (GIBCO BRL), 2 μΐ 100 mM ditiotreitolu, 2 pl roztworu trifosforanów deoksyzukleotydów zawierającego po 10 mM dATP, dGTP, dTTP i dCTP (Pharmacia LKB Biotechoology Inc., Piscataway, NJ), 2 pl 1 pCi/p- ³²P-a-dCTP (Amersham, Arliogton Heights, IL) i 8 pl 200 U/pl odwrotnej transkryptazy sUpeRsCRIPT™ (GIBCO BRL) do każdej mieszaniny RNA-starter. Reakcje inkubowano w temperaturze 45°C przez 1 godzinę i rozcieńczono do 120 pl TE (10 mM Tris:HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). cDNA wytrącono dwukrotnie dodaniem 50 pl 8 M octanu amonu i 160 pl izopropanolu. Powstałe granulki cDNA umieszczono w zawiesioie w 10 pl TE. Wydajność pierwszej oici cDNA dla każdej reakcji oszacowano z poziomu włączania 32p-dCTP.

Pierwsze oici cDNA z mRNA wątroby, płuc i nerek użyto do generowania dwu segmentów cDNA, N-termioaloej jednej trzeciej i C-termioalnych dwu trzecich sekwencji, stosując oddzielne reakcje łańcuchowe polimerpęż. Wprowadzono miejsce restrykcji KpoI do segmentów cDNA przez pojedynczą zmianę zasady w genomowej sekwencji metodą-utageoezy PCR z wykorzystaniem starterów ZC7422 (SEKW. NR ID.: 20) iZC7423 (SEKW. NR ID.: 21). Powstała zmiana nukleotydu stworzyła zwykłe miejsce restrykcji KpnI bez zmiany w przewidywanym kodowaniu aminokwasów.

N-terwioploy segment wzmocniono w 50 pl reakcji zawierającej 5 og matrycy cDNA (w oddzielnych reakcjach dla cDNA oerki, wątroby i płuc), 80 pmol każdego oligonukleotydu ZC7424 (SEKW. NR ID.: 22) i ZC7422 (SEKW. NR ID.: 20), 5 pl 2,5 mM roztworu tnfosforaoów deoksynukleotydów (Cetus Corp., Emeryi/ille, CA), 5 pl bufora 10x PCR (Promegp Corp., Madison, Wi) i 2,5 jednostek τolim7razy Taq (Boehrioger Mannheim). Reakcję łańcuchową poliwerazy prowadzono przez 35 cykli (1 wiouta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 58°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C) z 7 minutami inkubacji w temperaturze 72°C. Sensowny starter ZC7424 (SEKW. NR ID. : 22) zamyka nietranslowaoy region 5' ligaodu receptora mpl my40

178 384 szy i obejmuje kodon startu ATG. Antysensowny starter ZC7422 (SEKW. NR ID.: 20) obejmował sekwencję od regionu odpowiadającego egzonom 4 i 5 DNA ludzkiego genomowego TPO.

C-terminalny segment wzmocniono w 50 pl reakcji zawierającej 5 ng matrycy cDNA (ludzkiej nerki, wątroby lub płuc, jak opisano powyżej), 80 pmol każdego oligonukleotydu ZC7423 (SEKW. NR ID. :21) i ZC7421 (SEKW. NR ID. :23), 5 pl 2,5 mM roztworu trifosforanów deoksynukleotydów (Cetus Corp.), 5 pl bufora 10X PCR (Promega Corp.) i 2,5 jednostek polimerazy Taq (Boehringer Mannheim). Reakcję łańcuchowąpolimerazy prowadzono przez 35 cykli (1 minuta w temperaturze 94°C, 1 minuta w temperaturze 65°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C) z 7 minutami inkubacji w temperaturze 72°C. Sensowny starter ZC7423 (SEKW. NR ID.: 21) obejmował sekwencję z regionów odpowiadających egzonom 4 i 5 DNA ludzkiego genomowego TPO. Antysensowny starter ZC7421 (SEKW. NR ID.: 23) obejmował sekwencj ę z regionu odpowiadającego niekodującej sekwencji 3' ludzkiego genu i kodon zakończenia translacji.

Wzmocnione produkty PCR zanalizowano metodą bezpośredniego sekwencjonowania DNA i subklonowano w pGEM-T (Promega Corp.) do dalszej analizy przez porównanie z sekwencjącDNA myszy i ludzką genomową sekwencją. Sekwencję DNA kodującą ludzki TPO pokazano na SEKW. Nr ID.: 18, a kodowaną sekwencję aminokwasową pokazane na SEKW. NR ID.: 19. Analiza sekwencji wskazuje, że odcięcie peptydu sygnałowego zachodzi na aminokwasie 22 (SEKW.NRID.: 19) i dojrzałe białko rozpoczyna się od aminokwasu 22 (SEKW NR ID.: 19).

Ludzkie N-terminalne i C-terminalne fragmenty PCR wycięto z pGEM-T jako fragmenty EcoRI-KpnI i ligowano w miejsce EcoRI wektora ekspresji Zem229R. Plazmid tn transfekowane w komórki BHK 570 stosując Lipofectamine™ (GIBCO BRL). 24 godziny po transfekcji pożywkę kultury (DMEM + PSN + 10% FCS) zastąpiono świeżą pożywką, i komórki inkubowano przez 48 godzin przy braku selektywnych środków. Kondycjonowaną pożywkę przetestowano na aktywność namnażania stosując linię komórek BaF3/MPLR1.1 jak opisano powyżej. Wyniki jasno wykazały, że ludzki TPO w pożywce kultury stymulował namnażanie komórek BaF3 dających ekspresję receptora MPL myszy.

cDNA wytworzono z mRHA ludzkiej wątroby i nerek (otrzymany from Clontech Laboratories, Inc.) stosując odwrotną transkryptazę SUPERSCRIPT™ (GIBCO BRL) zgodnie z opisem producenta. Pochodzące z wątroby i nerek klony DNA ludzkiego TPO wytworzono następnie stosując dwie reakcje PCR (warunki pokazano w tabeli 6). Reakcje prowadzono przez 35 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 58°C przez 1 minutę, 72°C przez 1,5 minuty; a następnie 7 minut inkubacji w temperaturze 72°C.

Tabela 6

Reakcji #1:

ng cDNA wątroby lub nerek pl oligonukleotydu ZC7454 (20 pM/pl) (SEKW. NR ID.: 24; wprowadza miejsce EcoRI 5' od ATG) pl oligonukleotydu ZC7422 (20 pM/pl) (SEKW. NR ID.: 20; wytwarza miejsce Asp718) pl roztworu dNTP zawierającego 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP, 2,5 mM dCTP i 2,5 mM dTTP 5 pl bufora 10X Tag (Boehringer Mannheim) pl polimerazy Taq(Boehringer Mannheim) pl H20

Reakcji #2:

ng cDNA wątrobie lub nerkach p oligonukleotydu ZC7443 ((0 pIM-dl (SEKW. (NRID.: 20; (wywarza miejsse Asp718) pl oligonkkljotydu ZC7453 (20 p M/p) (SEKW. NR ID.:25; wytwarza miejsce EcoRI 3' od TGA) pl roztworu dNTP zawierającego 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP, 2,5 mM dCTP i 2,5 mM dTTP 5 pl bufora 10X Taq (Boehringer Mannheim) pl polimerazy Taq(Boehringer Mannheim) pl H₂O

178 384

Produkty PCR potraktowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy i wytrącono 95% EtOH, osuszono, i umieszczono w zawiesinie inw 20 pl H20. Każdy produkt cięto następnie enzymami restrykcyjnymi Asp718 i EcoRI i poddano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym. Fragmenty 410 par zasad (wątroba i nerki) z reakcji #1 i fragmenty 699 par zasad (wątroba i nerki) z reakcji #2 wycięto z żelu i eluowano przez odwirowanie bryłek żelu przez wełnę nylonową. Produkty PCR reakcji #1 i reakcji #2 ligowano z wektorem Zem229R (złożonym w American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Drive, Rockville, MD 28 września 1993 z numerem dostępu 69447) pociętym EcoRI, łącząc w ten sposób oba produkty w utworzonym miejscu Asp718. Powstałe plazmidy nazwano #10 (zawiera cDNA z nerek) i #28 (zawiera cDNA z wątroby).

Przy sekwencjonowaniu DNA znaleziono pojedyncze spowodowane przez PCR błędy w kierunkach 5' i 3' od unikalnego miejsca Avrll w plazmidach #28 i #10, odpowiednio. W celu wytworzenia bezbłędnego DNA TPO, fragment 5' o 826 parach zasad EjoRI-AvnΠ wydzielono z #10 i fragment 3' o 283 parach zasad AvrII-EcoRI wydzielono z #28. Oba fragmenty ligowano z wektorem Zem229R pociętym EcoRI. Powstały plazmid nazwano pZGmp1-124. Plazmid złożono w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 4 maja 1994 jako transformant E. coli DHOb pod numerem dostępu 69615.

Przykład XI. Megakariocytowa biblioteka cDNA

W celu wzmocnienia megakariocytowyjh prekursorów in vivo 20 myszy zastrzyknięto dootrzewnowo 40000 jednostkami aktywności (jednostki zdefiniowano jako 50 U/ml dające połowę maksymalnego natężenia namnażania komórek BaF3/MPLR1.1 w teście MTT (przykład VII) rekombinacyjnej mysiej trombopoetyny dzienne (stężona wolna od surowicy kondycjonowana pożywka z komórek BHK 570 trwale transfekowanych cDNA trombopoetyny myszy). Piątego dnia wstrzykiwania, śledziony usunięto i umieszczono w buforze CATCH + Hepes (zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) wolny od wapnia i magnezu, 10 mM Hepes (GIBCO BRL), 1,4 mM adenozyny, 2,74 mM teofiliny (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 0,38% cytrynianu sodu (J.T. Baker Inc., Philipsburg, NJ) o pH ustawionym na 7,40 wodorotlenkiem sodu). Przetworzonojednocześnie 5 śledzion nacinając każdąi wyciskając komórki pomiędzy dwoma stalowymi sitami do bufora CATCH + Hepes. Po rozdrobnieniu bryłek komórek pipetą25 ml objętość zwiększono do 50 ml, i komórki odwirowywano przez 7 minut przy 208 x g w wirówce Sorval TJ-6. Każdągranulkę umieszczono w zawiesinie w 10 ml bufora CATCH + Hepes i przesączono przez 130 pm nylonowe sito z wytworzeniem pojedynczokomórkowej zawiesiny. Objętość zwiększono do 50 ml buforem CATCH + Hepes, i komórki odwirowywano przez 15 minut przy 33 x g. Komórki przemyto dodatkowymi 50 ml CATCH +Hepes i odwirowywano przez 10 minut przy 33 x g. Granulki komórek umieszczono w zawiesinie w 10 ml bufora CATCH + Hepes i ułożono w trzystopniowej wirówce Percoll (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Szwecja) gradientowej (65,40 i 27% w buforze 1x CATCH+Hepes, 12 ml każdego w 50 ml probówce do wirowania) i odwirowywano przez 45 minut przy 833 x g. Komórki w warstwie pomiędzy 40 i 63% z Percoll zebrano, i objętości zwiększono do 50 ml buforem CATCH + Hepes. Komórki odwirowywano przez 7 minut przy 208 x g i umieszczono w zawiesinie w 50 ml pożywki wzrostu megakariocytów (minimalna modyfikacja zasadniczej pożywki alfa, wolna od rybonukłeozydów i dezoksyrybonukleozydów z 15% dezaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminianu (składniki pożywki Z JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronianu sodu (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) i 1x mieszaniny antybiotyków PSN (GIBCO BRL) i 1000 jednostek aktywności rekombinacyjnej mysiej trombopoetyny/ml (wolnej od surowicy kondycjonowanej pożywki z komórek bHk 570 trwale transfekowanych cDNA trombopoetyny myszy). Komórki umieszczono następnie na 150 mm płytkach do kultur tkankowych przy 10⁶jednojądr owych komórek/ml i hodowano w całkowicie nawilżonym inkubatorze z 6,0% CO2 w powietrzu w temperaturze 37°C. Po 3 dniach wzrostu nieprzywierające komórki zebrano w 50 ml probówkach do wirowania i ochłodzono na lodzie. Duże komórki granulowano odwirowując przy 33 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Granulki komórek umieszczono w zawiesinie w 50 ml bufora CATCH + Hepes w temperaturze pokojowej i odwirowywano przez 10 minut przy

178 384 x g. (Wszystkie następne etapy przeprowadzono w temperaturze pokojowej). Przemywanie powtórzono wytwarzając wyższej czystości dojrzałe megakariocyy. Pozostałe komórki umieszczono w zawiesinie w 15 ml CATCH + Hepes (łączna objętość) i położono na trzech stopniach gradientu płodowej surowicy bydlęcej (JRH Biosciences) (65% i 40% rozcieńczenia buforem CATCH + Hepes) do sedymentacji przy 1 x g przez 30 minut. Dolne 5 ml frakcji 65% zebrano, rozcieńczono do 50 ml buforem CATCH + Hepes, i odwirowywano przez 10 minut przy 33 x g. Granulka zawierała ponad 10¹ komórek. Komórki przetestowane na esterazę acetylocholiny sposobem Bursteina i in. (J. Celi. Physiol. 122:159 -165,1985) i określono jako dojrzałe megakariocytyczne komórki o czystości ponad 99%. Granulowane komórki poddano następnie lizie w roztworze tiocyjanianu guanidyniowego/2-merkspeoetsnolu dla wydzielenia RNA przez odwirowanie z gradientem gęstości chlorku cezu.

cDNA wytwarza się z RNA megsksriocytu tak, jak opisano w przykładzie VI, powyżej.

Przykład XII. Fluorescencyjne in situ mapowanie hybrydyzacyjńe ludzkiego genu trombopoetyny.

Do 1,5 ml mikroprobówek do wirowania na lodzie dodano: 1 μg λZGmpl-H8, λZGmpl-H10 lub λZGmpl-H29 zawierającego ludzki gen trombopoetyny, 5 μ bufora 10x translacji (0,5 M Tris/HCl, 50 mM MgC^, 0,5 mg/ml BSA (wolny od nukleazy), 5 μ roztworu dNTP zawierającego 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP i 0,5 mM dCTP, 5 μΐ 5 mM Bio-11-dUTP (5'-trifosforanu 7-(N-[N-biotynylo-E-sminokaμroilo)-3-sminoallilo)-2'-deoksyurydyny, Sigma Chemical Co.), 5 μ! 100 mM DTT, 5 μ DNase I (1000χ rozcieńczenie 10 U/μ roztworu, Boehringer Mannheim, wolny od RNase), μ fi μ polimerazy I DNA (5 U/μ, Boehringer Mannheim), H₂0 do końcowej objętości 50 μΐ. Po zmieszaniu, całość inkubowano w temperaturze 15°C przez 2 godziny w mikrochłodziarce Boekel. Reakcje zatrzymano dodając 5 μ 0,5 M EDTA, pH 7,4. Sondy oczyszczono stosując kolumny Sephadex® G-50 do oczyszczania DNA z wirowaniem (Worthington BiLjhemijal Corporation, Freehold, NJ) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Dla sprawdzenia rozmiarów znakowanych sond, 5-10 μ każdej oczyszczonej sondy zmieszano z 5 μ bufora ładowania na żel (12,5% Ficoll, 0,2% błękitu bromofenolowego, 0,2 M Tris-octanu, 0,1 M octanu sodu, 1 mM EDTA) i przeniesiono na 0,7% agarozowy mini-żel przy 80 V. Fragmenty λ-Hind III (GIBCO BRL) i <bXHaeIII (GIBCO BRL) użytojako znaczniki rozmiaru w parach zasad (bp). Znakowaną digoksygeninącentromeryczną sondę specyficzną dla chromosomu 3 (D3Z1) otrzymano z Oncor (Gaithersburg, MD).

Metafazowe chromosomy otrzymano z hodowli komórkowych HEL. 100 μ Colcemid® (GIBCO BRL, 10 5g/ml roztwór) dodano do pożywki na 100 x 15 mm szalce Petriego do hodowli komórkowych i inkubowano w temperaturze 37°C. Po 2,5 - 3 godzinach, pożywki usunięto z szalki stosując 10 ml sterylna plastykową pipetę i przeniesiono do 15 ml polipropylenowej stożkowej probówki (Blue Max™, Becton Dickinson). Dodano na szalkę 2 ml 1x PB S (140 mM NaCl, 3 mM KC1,8 mM Na2HPO4,1,5 mM KH2PO4, pH 7,2) w celu przemycia przy pomocy 5 ml sterylnej plastykowej pipety i przeniesiono do stożkowej probówki. Dodano 2 ml trypsyny (GIBCO BRL, roztwór) na szalkę stosując 5 ml sterylną plastykową pipetę, i szalkę łagodnie zakołysano i umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C na 3-5 minuty. Komórki zmyto następnie z szalki stosując a 5 ml sterylnąplastykowąpipetę i dodano do probówki z pożywką. Probówkę z kulturą odwirowano przy 250 x g przez 8 minut, i całość supematanta poza 0,5 ml usunięto. Granulkę umieszczono w zawiesinie przez postukiwanie, następnie powoli i łagodnie dodano 8 ml 0,075 M KCl (ogrzany do 37°C). Zawiesinę mieszano łagodnie i umieszczono w łaźni wodnej 37°C na 10 minut. Roztwór odwirowano przy 250 x g przez 5 minut, i Supernatant znad granulki usunięto poza 0,5 ml. Granulkę umieszczono w zawiesinie przez postukiwanie w probówkę. Dodano kroplami 2 ml zimnej mieszaniny metanol: kwas octowy (3:1) z wytrząsaniem dla utrwalenia komórek. Łącznie dodano 8 ml utrwalacza w taki sposób. Probówkę umieszczono w lodówce na 20 minut, następnie przez 5 minut odwirowywano przy 250 x g. Supernatant ponownie odessano i powtórzono utrwalanie jeszcze dwa razy. Dla wytworzenia preparatów metafazy na 25 x 75 mm oczyszczonych, ochłodzonych szkiełkach (VWR Scientific, Media, PA), 5 μ 50% kwasu octowego rozprowadzono na każdym szkiełku przy pomocy 20 μΐ pipety Pipetman™ (Gilson Medi178 384 cal Eloctrooios, Inc., Middloton, WI), a następnie 5 p zawiesiny komórek. Szkiełka osuszono na powietrzu i następnie starzono przez noc w piecu w temperaturze 42°C (Boekel Indust^os, Inc., Philadelphia, PA) przed użyciem. Szkiełka przejrzano szukając motafazy pod mikroskopem wyposażonym w szkło podwyższające kontrast. Pewne wotafazσwe preparaty chromosomowe zabarwiono granicznie polepszonym przez Gurra barwnikiem R66 Giemsa (BDH Ltd., Dorset, England), sfotografowano, i odbarwiono przed użyciem w eksperymentach hybrydyzacji. Szkiełka z preparatami ludzkich wotafazowych chromosomów inkubowano przez 2 godziny w 2X SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M cytrynianu sodu, pH 7,0), przemyto krótko w H20 i zabarwiono barwnikiem Gurra Giemsa rozcieńczonym 1:4 w buforowym roztworze Giemsa, pH 6,5 (BDH Ltd.) i przesączono przez filter Whatman #1 przed użyciem. Powoo preparaty inkubowano najpierw przez 45 minut do 1 godziny w piecu w temperaturze 90°C i chłodzono przód inkubacją in SSC. Preparaty ri^iżnicowano następnie w roztworze buforowym Giemsa, przepłukano H20 i osuszono na powietrzu. Dogodnej granicznie zabarwione motafazowe chromosomy sfotografowano pod mikroskopom Olympus stosując Kodak Ektachromo TM 400 diapozytywny i w postaci cyfrowej przechowywano stosując Optronics (Goleta, CA) ZVS-47E CCD RGB kolorowąwideokaworę i oprogramowanie Optimus (z Bio Scan Inc^Edmonds, WA). Preparaty odbarwiono przez około 20 min. w 100% EtOH i osuszono na powietrzu przód następnym użyciom. Niezużyte szkiełka motafazowych chromosomowych preparatów przechowywano w temperaturze -70°C.

Wytworzono mieszaniny hybrydyzacyjno in 1,5 ml sterylnych probówkach do wikromiareczkowania łącząc 2,5 pg współzawodniczącego DNA (Cot-1 DNA,GIBCO BRL), 40-60 ng znakowanego biotynąfaga XZGmpl-H8,A^.ZGwpl-H10 lub XZGmpl-l-H29 (zawierającego ludzki gon trowbopoetyny), 7 pg nośnika DNA (denaturowany testowany DNA łososia, Sigma Chomical Co.), 1 ml 3 MNaOAc i 2 objętości etanolu osuszonego próżniowo w zatężaczu Spoodvac. Granulkę rozpuszczono w 10 pl roztworu hybrydyzacji obejmującego 10% siarczanu dekstranu, 2x SSC i 50% formamidu (EM Science, GibbstowO, NJ). Sondę i współzawodniczący DNA denaturowano w temperaturze 70-80°C przez 5 minut, ochłodzono na lodzie i wygrzano w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny. Denaturację chromosomów wykonano przez zanurzenie każdego slajdu w 70% formamidu, 2x SSC w temperaturze 70-80°C przez 5 minut, a następnie natychmiastowo ochłodzenie w lodowatym 70% etanolu, następnie w 100% etanolu przez 5-10 minut. Szkiełka osuszono następnie na powietrzu i ogrzano do 42°C przed pipetowaniom na nio mieszanin hybrydyzacji pipetą 20 p Gilson Pipotman™. Mieszaniny hybrydyzacji i chromosomy przykryto następnie 18x 18 mm przykrywkami nr 1 (VWR Sciootifio). Hybrydyzacja zachodziła w komorze o dużej wilgotności przez noc w temperaturze 37°C. W pewnych przypadkach po około 6 godzinach hybrydyzacji, dodano do preparatów 5-10 ng denaturowanej, znakowanej digoksygeninąD3Zl centromoryczoej sondy (w 10% siarczanie dekstranu, 2 x SSC i 65% roztworze formamidu).

Po usunięciu pokrywek, szkiełka przemyto 3x5 minut 50% formamidem, 2 x SSC w temperaturze 42°C, 3x5 minut 2 x SSC w temperaturze 42°C i 1x 3 minuty 4 x SSC, 0,05% monolaurynianu polloksyotylenosorbltaou (Twooo-20, Sigma Chewical Co.). Następnie preinkubowano 20 minut z 4 x SSC zawierającym 5% chudego mleka w proszku w wilgotnej komorze (100 pl pod przykryvką24 x 50 mm). Dla preparatów z cootromeryczoą sondą chromosomu 3 D3Z1, prowadzono 45 minutową inkubację z rozcieńczoną 1:100 znakowaną biotyną, mysią antydigoksyną (Sigma Chow^al Co.) w 4 X SSC/5% BSA, a następnie trzykrotnie przemywano po 3 minuty 4 x SSC, 0,05% Tweon-20. Pohybrydyzacyjne etapy przeprowadzono dla wszystkich preparatów, 20-wmutową inkubacją zo znakowaną fluoroscoiną awidyną (Flouroscoin Avidm DCS, Voctor Laboratories, Burlingame, CA) (100 pl, 5 (pg/ml, w 4 x SSC, 5% chudego mleka w proszku) pod pokrywką24 x 50 mm. Szkiełka przemyto następnie 3x3 minuty w 4 x SSC, 0,05% Twóoo-20, a następnie 20 minut inkubowano z biotynylowaną kozią anty-awidiną D (oczyszczana przez powinowactwo, Vector Laboratories) (5 pg/ml w 4 x SSC, 5% chudego mleka w proszku) pod pokrywką 24 x 50 ww. Szkiełka ponownie przemyto 3x3 minuty w 4 x SSC, 0,05% Tween 20, a następnie znów inkubowano zo znakowaną fluo^^scoiną awidyną (100 pl/ml w 4 x SSC, 5% chudego mleka w proszku) pod pokrywką 24 x 50 ww. W pewnych przypadkach, procedurę

178 384 wzmocnienia sygnału powtarzano jeden raz. Na koniec przemyto 2x3 minuty w 4 x SSC, 0,05% Tween-20 i 1x 3 minuty w 1x PBS. Szkiełka zamontowano w pożywce obejmującej 9 części gliceryny zawierającej 2% M-diazobicyklo^^^j-oktanu (DABCO, rozpuszczone w temperaturze 70°C) i jedną część 0,2 M Tris/HCl, pH 7,5 i 0,25-0,5 pg/ml jodku propidiowego. Szkiełka obserwowano pod mikroskopem Olympus BH2 wyposażonym w BH2 -RFC przystawkę fluorescencyjną do światła odbitego, system PM-10 ADS automatycznej fotomikrografii, system Optronics ZVS-47E CCD RGB kolorowej wideokamery i filtr Chroma Technology Corp. (Brattlebow, VT) FITC/Texas Red do wizualizacji FITC. Obrazy metafaz chromosomów w postaci cyfrowej przechowywano stosując Optronics wideokamerę i oprogramowanie Optimus.

Wstępne wyniki fizycznego mapowania wskazują, że gen ludzkiej trombopoetyny mieści się na ramieniu q chromosomu 3 w regionie 3q26.

Przykład XIII. Ekspresja cytokinowej domeny TPO myszy w Saccharomyces cerevisiae.

Plazmid pBJ3-5 zawiera promotor TPII S. cerevisiae, lider sekrecji α-czynnika, sekwencję kodującą TPO myszy (SEKW. NR ID.: 1) od pary zasad 237 do 692, terminator transkrypcji TPII, sekwencje 2 pi replikacji w drożdżach i gen Schizosaccharomyces pombe izomerazy fosforanu triozy (gen POTI) dla selekcji w drożdżach. Plazmid zaprojektowano w celu kierowania sekrecji białka TPO zawierającego aminokwasy 45-196 SEKW. NR ID.: 2.

W celu skonstruowamapBJ3-5, pMVRl (fig. 2) trawiono SphI i Xbal, uzyskując rdzeń wektora zawierający część 5' promotora TPII i terminator TPII. Następujące fragmenty wstawiono następnie do rdzenia wektora:

1) Fragment SphI/HindIII otrzymany z pB5114 zawieraj ący część 3' promotora TPII i lider α-czynnika. Plazmid pB5114 jest drożdżowym wektorem shuttle, który zawiera promotor TPII i lider α-czynnika, a następnie sekwencję polilinkera obejmującą miejsce Hindlll.

2) Otrzymany z PCR fragment Hindlll/Sall zawierający miejsce Hindlll w ramce z miejscem Hindin w liderze α-czynnika, proteolityczne miejsce przecięcia Kex2 i sekwencję TPO myszy od pary zasad 237 do 335 SeKw. NR ID.: 1.

3) Fragment Sall/EcoRI zawierający pary zasad 336 do 692 SEKW. NR ID.: 1 TPO myszy pochodzące z plazmidu pSL-MPL-100 (skonstruowanego przez wzmocnienie pZGmpl-1081 ze starterami ZC7319 (SEKW. NR ID.: 27) i ZC7318 (SEKW. NR ID.: 26), trawienie EcoRI i klonowanie fragmentu obejmującego sekwencję domeny cytokiny TPO i niekodujące sekwencje 5' do miejsca EcoRI Zem229R [ATCC 69447]). Fragment ten zmieniono na fragment Sall/Xbal przez klonowanie go w pIC19H trawiony najpierw Sali i EcoRI.

Powstały plazmid nazwano pBJ3 (fig. 2), trawiono BgUI i Xhol w celu uwolnienia całej kasety ekspresji zawierającej promotor, lider, kodujący sekwencję TPO i terminator. Ten fragment BgIII/XhoI wstawiono w pRPOT (opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5128321, dołączanym jako odnośnik literaturowy) trawiony BamHI i Xhol. Powstały plazmid nazwano pBJ3-5.

S. cerevisiae szczep JG134 (ΜΑΤαη^^ Ieu2-A2 pep4-Al Atpil::URA3 [cir⁰]) transformowane pBJ3-5 i pRPOT w procedurze z octanem litu (jak opisuje Ito i in., J. Bacteriol. 153: 163-168,1983). Transformanty wybrano przez ich wzrost na zawierających glukozę pożywkach. JG134/pBJ3-5 i JG134/pRPOT hodowano na ciekłej pożywce YEPD przez 3 dni. Pożywkę kultury oddzielono od komórek przez odwirowanie i zanalizowano w teście namnażania komórek dla komórek BaF3 zawierających receptor MPL. Pożywki ze szczepu JG134/pBJ3-5 zawierały 5000-7000 jednostek/ml TpO aktywności, a negatywne kontrolne JG134/pRpOT nie wykazywały aktywności. Wynik ten wskazuje, że drożdże mogą wydzielać biologicznie aktywnąpostać TPO.

Przykład XIV. Aktywność rekombinacyjnego ludzkiego TPO

Plazmid DNA z dwu 5 ml całonocnych bakteryjnych kultur transformowano pZGmp1-124 wytworzonym przez alkaliczną lizę komórek, a następnie wiązanie DNA do żywicy w wysokim stężeniu soli (stosując zestaw Magic Minipreps™ Sampler z Promega Corp.). DNA eluowano 75 pl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0.

Hodowle komórkowe BHK 570 o gęstości 50000 komórek/studzienkę ^^fekow^e DNA pZGmpl-124. 20 pl rozcieńczenia 1:10 LIPOFECTAMINE™ (GIBCO BRL) dodano do 20 pl plazmidu DNA i 160 pl pożywki wolnej od surowicy (pożywka F/DV [1:1 mieszanina DMEM i Ham FI2] uzupełniona 10 pg/ml fetuiny, 2 ng/ml selenu, 5 fg/ml insuliny, 10 pg/ml transferyny, 2 mM L-glutaminy, 110 pg/ml pirogronianu sodu, 25 mM HEPES, i 0,1 mM roztworu nie najistotniejszych aminokwasów (GIBCO BRL) w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem do komórek BHK 570 i inkubacją przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Następnie dodano 200 pl Pożywki Wzrostu [DMEM (Biowhittaker) uzupełniona 2 mM L-glutaminy, 110 pg/ml pirogronianu sodu, 0,05 mg/ml penicyliny, 0,05 mg/ml streptomycyny, 0,01 mg/ml neomycyny, 25 mM HEPES, 10% płodowej surowicy cielęcej, i komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Pożywkę kultury zastąpiono następnie Pożywką Wzrostu zawierającą 5% płodowej surowicy cielęcej i inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 godziny.

Kondycjonowanąpożywkę z transfektanów BHK 570 testowano następnie na zdolność do powodowania namnażania komórek dla komórek BaF3 dających ekspresję receptor MPL myszy. Komórki hodowano na pożywce BaF3 (pożywka RPMI 1640 (JRH Biosciances) uzupełniona 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM L-glutaminy, 1m M pirogronianu sodu, 10mM HEPES, 57 pM β-merkaptoetanolu, 0,05 mg/ml penicyliny, 0,05 mg/ml streptomycyny, 0,01 mg/ml neomycynę i 4% objętościowo kondycjonowanej pożywki z kultury komórek WEHI-3 (mysia interleukina-3, dodatek do kultury, Collaborative Biomedical Products). Przed testem, komórki BaF3 rozcieńczono i umieszczono w zawiesinie w wolnej od IL-3 pożywki BaF3 do ilości 10000 komórek/ 100 pl. Dodano 100 pl kondycjonowanej pożywki z transfekowanych pZGmpl-124 komórek BHK 570, i kultury inkubowano w temperaturze 37°C. Komórki zbadano następnie wizualnie na wydłużenie po 30 minutach i po 24 godzinach. Negatywną próbę kontrolną obejmującą pożywkę BaF3 bez IL-3 i pozytywną próbę kontrolną z kondycjonowaną pożywką z komórek BHK 570 trans fekowanąDNA TPO myszy także poddano testowi. Wyniki wykazały brak wydłużenia komórki BaF3 w negatywnej próbie kontrolnej, pewne wydłużania komórek w pozytywnej próbie kontrolnej i znaczące wydłużenie komórek w komórkach transfekowanych pZGmpl-124.

Przykład XV. Wytrącanie z powinowactwem receptora

Płytki 150 mm do kultur tkankowych zawierające komórki wytwarzające TPO lub normalne komórki BHK znakowano przez 18 godzin 10 ml MEM Dulbecco bez metioniny zawierającym 2 mM L-glutaminy, antybiotyki i 200 pCi ^S^press (Amersham, Arlington Heights, IL).

Po nocnej inkubacji zużyte pożywki zebrano i zatężono 15 razy stosując zatężacz Centriprep-10™ (Amicon, Inc.). Powstałe 0,7 ml zatężonego supematanta zmieszano z 40 p zakończonego poli-histydyną rozpuszczalnego receptora MPL linkowanego do CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia) według instrukcji dostawcy. Mieszaninę inkubowano przez 2 godziny na lodzie, z wytrząsaniem.

Komórki przemyto raz PBS, następnie lizowano 1 ml bufor RIP A (10 mM Tris, pH 7,4,1 % deoksycholanu, 1 % Triton X-100,0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Lizat odwirowano w celu usunięcia nierozpuszczalnych materiałów, i 40 pl MPL-Sepharose dodano takj ak powyżej.

MPL-Sepharose granulowano następnie przez powolne odwirowanie, i zużyte pożywki i supematanty lizatu komórek usunięto. Granulkę przemyto 4x PBS zawierającym 0,5 M NaCl. Po końcowym przemywaniu PBS usunięto, i dodano 40 pl bufora 2x próbki (10% gliceryny, 4% SDS, 50 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,05% błękitu bromofanolowago) zawierającego 4% beta-merkaptoetanolu.

Próbki gotowano przez 5 minut, i 18 pl każdego załadowano na 10-20% gradientowy mini-żel (Integrated Separation Systems), następnie poddano elektroforezie przy 100 V przez w przybliżeniu 2 godziny. Żel utrwalano przez 30 minut (w 40% metanolu, 16% lodowatym kwasie octowym w wodzie destylowanej), następnie moczono w Amplify™ (Amersham) przez 20 minut. Po osuszeniu, żel wystawiono na działanie filmu przez noc. Pasmo ~70 kD było wyraźnie widoczne na ścieżce odpowiadającej zużytej pożywce z komórek transfekowanych cDNA TPO.

178 384

Pasmo nie występowało w zużytych pożywkach z komórek BHK lub lizatów komórek z obu linii komórek.

Z powyższego opisu należy zrozumieć, że, chociaż opisano tu specyficzne odmiany wynalazku dla celów ilustracji, można dokonywać różnych modyfikacji bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku. Tak więc wynalazek nie jest ograniczony niczym poza załączonymi zastrzeżeniami.

178 384

LISTĘ SEKWENCJI (1) OGÓLNA INFORMACJA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Zymo Genetics, Inc.

1201 Eastlake Avenue East

Seattle

WA

US

98102

ZGŁASZAJĄCY: University of Washington

Seattle

WA

US

98195 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: BIAŁKO HEMOPOEZYJNEJ, SPOSÓB I MATERIAŁY DO

JEGO WYTWARZANIA (lil) LICZBA SEKWENCJI: 29 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Zymo Genetics, Inc.

(B) ULICA: 1201 Eastlake Avenue East (C) MIASTO: Seattle (D) STAN: WA (E) KRAJ: USA (F) KOD: 98102 (v) POSTAĆ KOMPUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY:

(D) OPROGRAMOWANIE: Patent In Release #1.0, Version #1.25

177 384 (V1) DANE O ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU:

(A) NAZWISKO: Parker, Gary E (B) NUMER REJESTRACJI: 31-648 (C) NUMER SPRAWY: 93-12PC (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 206-442-6600 wew. 6673 (B) TELEFAX: 206-442-6678 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1486 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: c DNA (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 1081 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 105..1241 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:1:

CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC

CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC

GCC CCA GGA 116

ATG

Met Ala Pro Gli

178 384

AAG

ATT

CAG

GGG

AGA

GGC

CCC

ATA

CAG

GGA

(^l^c:

ACT

1 GCA

AGA

CAC

160

Liz

Ile

Gin

Gli

Arg

Gli

Pro

Ile

Gin

GU

ag.

Ago

Ser

WwI

Arg

His

5

10

11

20

CTG

GCC

AGA

ATG

CTG

ACT

GAT

TTG

ccc:

CTG

GCG

GCC

ATG

CTT

212

Leu

Ala

Arg

Met

Glu

Leu

Tre

Asp

Llu

ACa

ACu

Me t

Leu

25

33

GCA

GTG

GCA

GGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CAA

(Sr^CC

dT

CCT

(SC^CA

TGT

GAC

2 60

Ala

Wal

AAa

.Arg

Leu

Tre

Leu

Ser

Ppo

WwI

AGl

Ppo

AGu

Cys

Asp

00

40

50

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

(GAG

CTG

CGT

GAC

TTT

CAC

CTG

CTT

CAC

AGC

308

Pro

Arg

Leu

Asn

(Liz

Leu

Arg

AAp

Ser

Hii

Llu

His

Ser

55

60

65

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

CCC

GTG

TGT

AGC

CCT

GTT

CTG

35 6

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Wal

Asp

Ppo

Llu

Cer

IIl

Ppo

Wal

Leu

70

75

80

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

CTG

GGA

GGCA

GGG

GACA

ACT

CAC

ACG

GGAA

0 00

Leu

Pro

Ala

Wal

Asp

Fen

Ser

Leu

Gli

du

Cep

Llz

Cer

dl

Cce

Glu

85

90

95

110

CAG

AGC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GGA

CGG

GGC

CCT

CC^CA

CTG

GAG

05 2

Gln

Ser

Liz

Ala

Gin

As p

Ile

Leu

GH

AGl

GwI

Gee

Alu

Glu

105

111

GGA

GTG

ATG

GCA

CGA

GGA

CAG

TTT

GGA

GCA

GGC

acg

ccc:

GCA

TCC

500

Gli

Wal

Met;

Ala

Arg

Gli

Gin

Ll;

dl

Gpo

Gee

CCS

Glu

Cer

Ser

420

115

113

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GGC

CTG

GCT

ccc;

CGG

HC

CTG

50 8

Leu

Gli.

Gin

Leu

Ser

Gil

G!n

Wal

Aa o

Alu

dl

CGu

Alu

135

140 ii

178 384

CAG

GGC

CTC

CTA

GGA

Ad

TCA

CTT

TCC

TCT.

TCA

Td

TCG

TCC

TCT

Td

5 96

Gln

Gli

Leu

Gli

Tire

TGn

Teu

PPr

Teu

TGu

Td

Tao

Tto

TTl

150

115

116

CAC

AAG

GAC

CCC

tatt

Gd

CTC

TTT

TTG

Td

TTC

TTT

TTA

TCT

dT

Td

(544

His

Liz

Asp

Pro

Asn

ATl

Leu

FFn

Te'e

Tse

Teu

d^

dl

Teu

Arg '

165

110

118

GGA

AAG

GTG

CGC

TTC

CTG

CCT

CTG

GGA

dTC

Gd

TCC

ACC

TCC

Td

CTC

622

Gli

Liz

Wal

Arg

Fen

Le^u

Leu

Wal·

du

GH

Tpo

Tto

Teu

TCs

Waa

185

199

119

AGA

CGG

ACC

CTG

CCA

ACC

ACA

GCT

GTC

CCA

Ad

TCT

CCAT

CTC

700

Arg

Tre

Leu

Paro

Tre

Ala

Wal·

PPr

Sse

Tsu

Tto

Tsu

dn

Leu

200

225

221

CTC

ACA

CTA

AAC

TARG

TTC

CCA

TA^C

AGG

Ad

TCT

GGA

TTC

GAG

ACG

7T 8

Leu

Tre

Leu

Asn

Liz

Fen

Pro

Asn

Arg

Tto

Sse

Gd

Leu

GGu

Tto

215

220

225

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

GCC

AGA

ACT

Gd

GGC

Cd

GGA

CTC

CCC

AGC

AGG

3T 6

Asn

Fen

Ser

Wail

Tre

Ala

Arg

Tace

Ala

di

Ppo

Gd

Leu

Ssr

Arg

230

223

224

CTT

CAG

GGA

TTC

AGA

GTC

TC^G

ATT

ACT

Cd

Gd

CAG

CTA

TCAT

CCAT

ACC

844

Leu

Gin

Gli

Fen

Arg

Wal

Liz

II e

Tire;

Ppo

Gd

GGn

Leu

Asn

dn

Tto

245

250

225

220

TTC

AGG

TCC

CCA

GTC

CCTT

ATC

TCT

GGA

TAC

CTG

TTAC

Ad

ACA

CAC

GGA

322

Ser

Arg

Ser

Pro

Wal

Gin

Ile

SSr

Gd

Tyr

L^u

Asn

Aa^g

Tto

HHi

Gd

265

220

CCC

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

Gd

GGA

Ad

TCA

dT

CAG

ACC

8 T 0

Pro

Wal

Asn

Gli

Tre

Hhs

Gil

Leu

FFn

ATl

dl

Tto

Sse

Leu

Gin

Tce

280

228

229

TD 384

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

TCG

CCC

GGA

G<^T

TTC

AAC

AAA

GGC

TCC

CTG

1128

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

Ul

Ser

PPr

Gli

Ala

Fen

Asn

Liz

Gli

Ssu

Leu

295

300

305

GCA

TTT

NAC

CTC

CAG

GGT

GGA

CTT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GGT

CCT

110 6

Ala

FFn

Asn

Leu

Gln

Gli

Llu

Pio

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

AJ_u

Pro

310

315

320

GAT

GGA

CAC

ACA

CCC

TTC

CCT

CCC

TCA

CCT

GCC

TTG

c<^cr

ACC

AAC

CAT

1114

Asp

GU.

His

Tre

Pro

FFn

Pro

PPr

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Tre

Tto

Hhs

325

330

335

340

GGA

TTT

CCA

CCC

CAG

CTT

CAC

CCC

CTG

TTT

CCT

GAC

CCT

TCC

AGC

ACC

1117

Gli

SSe

Pro

Gln

Leu

His

Ppo

Leu

Fen

Pro

Asp

Pro

Ser

Tao

Sto

345

350

355

ATG

CCC

NAC

TCT

ACC

GCC

CCT

CCA

GTC

ACA

ATG

TAC

CCT

DCC

1120

Met

Pro

Asn

Ser

Tre

AAl

Pro

Hhs

Sro

Wal

Tre

Met

Tyr

Pro

Hhs

Sro

360

365

370

AU	AAT	TTT	TCT	TCT	AU	ADΑTCDCGCGGGC AlJNCTTlAT TCADTGClTA	I127
Arg	Asn	Llu	Ser	Gin	GGu	Tre
		375

CAGCTTCTCT	TAGGGATATG	CTTCCCCAGG	ΑΑCG1TTΑCΑ	DGCAGCTGCA	TCTGTTTlJA	mi
ATGTTCTGCT	TTTATTTAAA	AGGCCCTGGG	GACCGlACAC	NCAGCACTGG	AGATCGCAAA	mi
ATTTTAGGAA	CTATTTTTTT	TTAACCTATC	AClJACACTT	NTCAGAGCAG	CTAGTTAGTl	ACA I
TTUTCTATT	TTTllTATAA	ATA^^^C^GGAA^^P	CCCTA			1 ^I 6

(2) INFORMACJA DLA SEKK. NR ID..2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 379 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

178 384 ) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:2:

Met 1

Ala

Ppr

Gli

Liz 5

II l

iln

Gil.

Arg

Gli. 11

Pro

Ile

iln

Gli

Ala 11

Tre

Ser

Wal

Arr

His

Leu

Ala

Arg

Met

Glu

Lru

Tre

Asp

Leu

Ala

20

22

33

Ala

Met

Leu

Ala

Wal

Ala

Air cg

Lru

Tre

Leu

Ser

Ppo

Wal

Ala

35

44

Pro

Ala

ccy

Asp

Pro

Arg

Leu

Asn

Lm

Leu

Arg

Asp

Ser

His

50

55

66

Leu

Llu

His

Srr

Arg

Leu

Srr

Gin

Cys

Pro

Aap

Wal

Asp

Pro

Leu

Ser

65

70

80

Iln

Pro

Wwl.

Leu

Pro

Ala

Wal

Asp

Fen

Srr

Leu

Gli

Glu

Trp

Liz

85

99

95

Tre

Gin

T to

ilu

Gin

Ser

Liz

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gli

Ala

Wal

Ser

100

110

Leu

Llu

Glu

Gli

Wal

Met

Ala

Arg

Gli

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

115

110

112

Cys

Leu

SSr

Ser

Leu

Lru

Gin

Gln

Lru

Ser

Gli

Gln

Wal

Arg

Leu

130

135

110

Leu

Gin.

Ala

Lru

Gin

Gli

Leu

GM

Tre

Gin

Lnu

Pro

Leu

Gln

Gli

145

150

115

160

Arg

Tre

Tto

Ala

His

Liz

Asp

Ppo

Asn

AAa

Lru

Fen

Leu

Ser

Leu

Gln

165

110

115

iln

Leu

L eu

Arg

Gli

Liz

Wal

Arg

Fen

Lnu

Leu

Wal

Glu

Gli

Pro

180

118

110

Tre

Leu

Ccy

Wal

Arg

Tre

Leu

Pro

Tre

Ala

Wai

Pro

Ser

195

220

Tre Ser Gin Leu Leu Tre Leu Asn Liz Fen Pro Asn Arg Tre Ser Gli

1718384

210

2 21

220

Leu

Glu

Tre

Asn

Fen

Ser

Wal

Ere

Ala

Arg

Ere

Ala

Gli

Pro

Gli

225

230

235

220

Leu

Ser

Arg

Leu

Gln

Gli

Fen

Arg

Wal

Liz

Ile

Ere

Pro

Gli

Gln

245

250

2255

Leu

Asn

Gin

Trs

Ser

Arg

Ser

Pro

WwI

Gln

Ile

Ser

Gli

Tyr

Leu

Asn

260

225

227

Arg

Ere

His

Gli

Pro

Wal

Asn

Gli

Tre

iis

Gli

Leu

Fen

All

Gli

Tre

275

280

285

Ser

Leu

Gin

Tire

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

Ile

Ser

Pro

Gli

All

Fen

Asn

290

2 99

300

Liz

Gli

Ser

Leu

Ala

Fen

Asn

Leu

Gln

Gli

Leu

Pro

Ser

Pro

305

330

315

330

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gli

His

TEe

Peo

Fen

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

325

330

333

Pro

Ere

Tre

His

Gli

Ser

Pro

Ppo

Gin

Leu

iis

Pro

Leu

Fen

Pro

Asp

340

334

335

Pro

Ser

Tre

Met

Pro

Asn

Ser

Tre

Ala

Pro

iis

Pro

WwI

Sre

Met

355

360

365

Eyr

Pro

H is

Pito

Arg

Asn

Leu

See

Gin

Glu

Eee

370 375 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 7 (i) CCHARAKKERYSTEfKA SEEKWSNCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:: 42 par zasad (B) ESP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vil) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

178 384 (B) KLON: ZC5499 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:3:

CGAGCCACTT TCTGCACTCC TCGAGTTTTT TTTTTTTTTT TT 42 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC5746 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:4

GAGAGAGAGA GAGAATTCAT GCCCTCCTGG GCCCTCTTCA TGGTC 45 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 52 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC5762 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:5:

AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TCAAGGCTGC TGCCAATAGC TTAGTGGTAG GT 52 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza

178 384 (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC5742 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:6:

GACCCTGGAG CTGCGCCCGC GATCTCGCTA 30 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:7:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC6091 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:7:

GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTT 4 9 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(B) KLON: ZC6603 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:8:

GAGGAATTCG CAGAAGCCAT GCCCTCTTGG GCCCTCTTCA TGGTC 45 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów

178 384 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOTOGIA: limoin (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR lD.:9:

Wal Arg Tre Ser Pro Ala Gli Glu

5 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR lD.:10:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: OC67Z4 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR lD.:10:

GAAGAGGAAT TCACCATGGA TGTCTTCTTG CTGGCCTTGG GCACAGAG 48 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR lD.:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ON67Z3 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR lD.:11:

CGACTTTACC TCGAGTGCTA CTGATGCTCT TCTGCCAGCA GTCTCGGAGO CCGTGGACAC 60 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR lD.:12:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad

178 384 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC6707 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:12

AATTCGCCAT GGGACTCGAG CATCACCATC ACCATCACTG AG 42 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC6706 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:13:

GATCCTCAGT GATGGTGATG GTGATGCTCG AGTCCCATGG CG 42

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:14
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A)	DŁUGOŚĆ: 47 par zasad
(B)	TYP: kwas nukleinowy
(C)	NIĆ: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA: liniowa

(vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC6172 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:14:

GTCGGTGCTC AGCATTCACT ACTCGAGGGT TTTTTTTTTT TTTTTTT 4 4 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:15:

178 384 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ON:9ZC (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR lD.:15:

AATTGGCGGC CGCGTCGACT CGTGGATG 28 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR lD.:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NlĆ: pojedyncza , (D) TOPOLOGlA: liniowa (vil) BEZPOŚREDNlE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ON:9ZC (xi) OPlS SEKWENCJl: SEKW. NR lD.:16:

AATTCATCCA CGAGTCGACG CGGCCGCC 28 (2) ^FORMACJA DLA SEKW. NR lD.:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJl:

(A) DŁUGOŚĆ: 633 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKl: białko (xi) OPlS SEKWENCJl: SEKW. NR lD.:17:

Met Pro Ser Trp Ala Leu Fen Met Wal Tre Ser Cys Leu Leu Leu Ala

178 384

Leu

Pro

Asn

Gin 20

Ala

Gln

Wal

Tre

Ser 25

dn

Asp

WaO

Fer

Leu 30

Leu

Ala

Leu

di

Tre

Glu

Pro

Leu

Asn

Ccs

Firn

Ser

Gln

Tre

Fen

Glu

Asp

Leu

35

44

Tre

Cys

Fen

Trp

Asp

Glu

GG.U

Glu

Ala

Alo

Pito

Ser

Gli

Tre

Tyr

dn

50

55

66

Leu

Tyr

Al a

A.a

Arg

Gli

Glu

Gaz

Pn

A og

Air

Cys

PrA

i ou

ysp

65

77

75

80

Ser

Gin

Ser

W^^al

Pro

Tre

Fen

Gli

Tre

Arg

Tyr

Wal

Cso

Gln

F«rn

Pro

85

90

95

Ala

Gin

Asp

Gl u

Gal

Ara

0 eu

Fe n

Leu

Pro

Leu

ri o

Leu

TrH

Wal

Liw

100

105

110

Asn

Wal

Ser

Leu

Asn

Gln

Tre

Leu

Ole

Gln

Arg

WaO

Leu

Fen

Wiał

Asp

115

112

115

Ser

Wal

Gli

Leu

Pro

Alla

Pre

Pro

Arg

WuO

He

Liz

Ala

Arg

di

dl

130

115

110

Ser

dn

Pro

Gli

Glu

Llu

Gln

Ile

His

Trp

Glu

Ala

Pro

Ala

Pro

GGu

145

155

115

110

Ile

Ser

Asp

Fen

Leu

Aal

His

Glu

eru

Arg

Tyr

di

Pro

Tre

Asp

SSr

165

110

1175

Ser

Asn

Ala

Tre

Ala

Pro

Ser

Wal

11i

GG.n

Leu

SSr

Tre

Glu

Tre

180

118

110

Cys

Pro

Tre

Leu

Trp

Mrt

Pro

Asn

Pro

Wal

Pro

Wć^l

Leu

Asp

Gln

195

220

Pro

CCy

Wal

His

Peo

Tre

Ala

Seo

Gln

Pro

His

di

Pro

Wal

Aal

210

221

222

Tre

Ssu

Pito

Ala

di

GGu

Ala

Pro

Fen

Leu

Oro

Wal

eiz

GGa.

GG.i

Ssu

225

233

220

178 384

Cys

Lru

Wal

Ser

ili 245

Leu

iln

Ala

ili

Liz 225

Ser

Tyr

Trp

Lru

iln 255

Lnu

Arg

Srr

Gln

Prn

Asp

ili

Wal

Ser

Leu

Arg

Gli

Ser

Trp

Gli

Ppo

Trp

260

225

270

Srr

Fen

Pro

Wal

Tre

Wal

Asp

Leu

Pro

Gli

Asp

Ala

Wal

Tre

11l

ili

205

228

2 85

Lnu

iln

Cys

Fen

Tre

Leu

Asp

Leu

Liz

Met

Wal

Tire;

Cys

Gin

Tto

iln

250

225

330

iln

Asp

Arg

Tre

Ser

Gln

Gli

Fen

Arg

His

Ser

Arg

Trn

305

331

320

Arg

Cys

Pro

Tre

Asp

Arg

Asp

Pro

Tre

Trp

ilu

Li z

Cys

Glu

ilu

325

333

335

ilu

Pro

Arg

Pro

ili

Ser

Gln

Ppo

Ala

Leu

Wal

Ser

Arg

Ccs

His

340

334

350

enn

Liz

Ser

Arg

Asn

Asp

Sen

WwI

Ile

His

Ile

Leu

Wal

ilu

WwI

Tre

355

336

365

Tre

Ala

Gln

Gli

Ala

Wan

HHi

Ser

Tyr

Leu

Gil

SSe

Pro

Fen

Trp

Ile

300

370

338

His

iln

Ala

Wal

Lru

Leu

Pro

Tre

Pro

Ser

Leu

His

Trp

Arg

Glu

Wal

385

330

335

400

Srr

Ser

Gli

Arg

Leu

Giu

Leu

Glu

Trp

Gln

HHi

iln

Ser

Top

Ala

405

441

415

Ala

iln

Glu

Tre

Cys

Tyr

Gln

Leu

Aa: o

Tyr

Tre

Gli

ilu

Gli

Arr

ilu

420

442

430

Asp

Trp

Liz

Wal

Leu

Glu

Pro

SSr

Leu

Gli

Ala

Arg

Gli

Tto

Lru

435

444

445

llu

Leu

Arg

Ppo

Arg

Ala

Arg

Tyr

Ser

Leu

iln

Leu

Arg

AAl

Trp

Lru

450

445

446

178 384

Csn

Gli

Pro

Tre

Tyr

Gln

Giń.

Pro

Trp

err

Ala

Trp

err

Pro

Ala

065

470

407

400

Arg

Wal

Ser

Tri

Gli

Ser

Glu

Tor

Ala

Top

IIu

Crr

Leu

Wal

Tre

Ala

085

490

405

Leu

WaC

Leu

Ser

Lru

Ser

Ala

Lru

Leu

Gil

Leu

Llu

Leu

500

555

551

Liz

Top

Gln

Fen

Pro

Ala

Hii

Tyr

Arg

Lru

Arg

His

Ala

Leu

Trp

515

550

525

Pro

eer

Leu

Pro

Asp

Leu

His

Arg

Wal

Leu

Gli

Gin

Tyr

Leu

Arg

Asp

530

535

540

Cre

Ala

Leu

Ser

Pro

Ser

Liz

Ala

Tre

WwI

Crr

Asp

eer

Cys

Glu

505

550

555

5(50

Glu

Wal

Glu

Pro

Por

Uou

Llu

GUl

Ile

Leu

Ppo

Lzz

err

eer

Glu

Ser

565

570

557

Cre

Pro

Leu

Pri

Leu

Cys

Pro

Ser

GGn

Pro

Gin

eet

Asp

Tcs

Arg

Gli

580

555

Leu

Gln

Pro

Cys

Leu

Crg

Tro

Mer

Poo

Lru

err

Wal

Cys

Pro

Ppo

Met

555

660

6(05

Cla

Glu

Tre

Gli

eer

Cys

Tre

Cre

Hzs

Ile

Ala

Asn

His

Ser

Tyr

610

615

660

Leu

Poo

Leu

Ser

Typ

Trp

Gln

Pro

625

663

(2) INFORMACJA DLA eEKW. NR ID.:18:

(i) CHGRGKCERYeCYKA eEKaENCJI: (G) DŁUGOŚĆ: 1062 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

178 384 (ii) TYP CZĄSTECZKl: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 1..1059 (xi) OPlS SEKWENCJl: SEKW. NR lD.:18:

ATG

GAG

CCG

ACT

GCT

AAT

GCT

OTT

GTC

AAT

GCT

GCA

GAC

GCA

48

Met

Glu

Llu

Tre

Tlu

Oue

ueu

Geu

Gw1

Wal

MeS

Gasi

Geu

Gto

Ala

1

5

10

11

AGG

CTA

AAC

CTG

CCA

CCC

GGC

GCC

CCT

GAC

GOT

di

GCT

GCA

GGC

96

Arg

Leu

Tto

Leu

Aer

Sos

1pi

Ain

Ppo

Pro

AAa

GC-s

Aip

Geu

ago

Wul

20

25

33

CTC

AGT

AAA

CTG

TTC

HA

GTC

Hi

GTC

CCT

CAG

AGG

AGA

CCG

AGC

14 G

Leu

Sur

LAi

Leu

Aua

Aip

Gee

HHi

Wal

Leu

Hśi

See

Aao

Leu

Ser

35

40

45

CAG

TGC

CCA

GAG

TTC

CCC

TTG

CCC

ACA

CCC

GGT

CCT

GCT

CCT

GCT

192

Gln

Cys

Prr

Glu

Gnu

ais

Prr

Leu

Pro

Tru

Pro

Wal

Leu

Pro

Ala

50

55

60

GTG

GAC

TTT

AGC

m

HA

GGG

7AAA

ACC

HG

AAG

GAG

ACC

GAAG

200

Wal

Asp

Ffu

Ser

un

mu

Trp

LAi

Tre

mn

MmŁ

mu

Tre

LAz

65

70

75

80

GCA

CAG

HA

ATT

TH

AGC

7AG

AAC

CTT

CCT

GCT

gaa;

GGA

GGG

ATG

G 88

Ala

GOn

Aip

Ile

lnu

uu G

Ala

Ww1

Tre

Leu

Ll^u

Leu

mu

Ww1

MMt

85

90

99

GCA

CCG

GGA

HA

AAC

GH

GCC

AAC

TGC

CCT

GTA

GTC

GCT

CCG

GGG

336

Ala

Air

Gli

Gm

One

ug o

?go

Tri

Cys

Leu

Gee

Leu

GGl

100

115

110

CAG

CTT

TTC

GGA

HA

GTC

CCG

CTC

CCT

CTT

GGG

GGC

GCT

GC^G

AGC

CCC

3G 4

Gln Leu Ser 7] i Gln lal Ago Geu Leu Leu do Ain 7eu Gln SSe Leu

178 384

115 120 125

CEE

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

ACG

SCC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

4 S2

Leu

Gli

Tre

Gln

Leu

Pro

Gln

dl

Aig

Scr

Ala

His

Lii

Aip

130

135

140

CCC

AAE

GCC

CATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CCGC

SCC

SCE

CGA

GGA

AAG

GGG

450

Peo

Asn

Ala

Ile

Fen

Leu

Ser

Fen

dl

His

Seu

Arg

Gli

Lii

Sal

145

150

155

115

CGE

GGC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

SCC

SGC

GTC

AGG

CCG

GCC

52 S

Aeg

Fen

Leu

Met

Leu

Wal

Gli

Gli.

Ssr

Scr

Seu

SCr

Wal

Arg

Aig

Ala

155

170

175

CCA

CCC

ACC

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

SCC

SCE

GTC

CTC

ACA

CTG

57 5

Peo

Tre

Ala

Wal

Pro

SSr

Aig

Sco

Ssu

Seu

Wiał

Leu

Tce

Se;u

180

115

190

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

SEE

SEG

Sd

ACA

CCC

TEE

ACCC

52 S

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Tre

SSr

di

Le^u

Seu

dl

Tire

Asn

Fen

Sce

195

220

205

GCC

ECA

GCC

AGA

ACT

GGC

TET

GGG

SCC

TGG

CAG

Cd

GGA

57 S

Ala

Ser

Ala

OArg

Tre

Gil

SSr

dl

Seu

Sei

Trp

Gln

dn

dl

210

225

220

EEC

AGA

GCC

CUG

ATT

CCT

GGT

CTC

SAG

SCC.

SCC

TCC

AGG

TCC

SCG

720

Fen

Aeg

Ala

Liz

Ile

Pro

Gil

Leu

Am

Sd

Sce

Ser

Aj^<3

Ssu

Seu

225

220

235

224)

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

SGC

ACG

Sd

SAA

CTC

TTG

AAC

GGA

7 S5

Asp

Gln

Ile;

Pro

Gli

Tyr

Leu

Am

Air

Sil

Sii

Sd

Leu

Am

su

245

250

255

ACE

CGE

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

SEA

SC'

SGG

SCC

CTA

GGA

dC

SCC

515

Eee

Aeg

Gli

Leu

Fen

Pro

di

Pro

Ssu

Sig

Sce

Leu

Gl:i

All

Sre

250

225

220

178 384

GAC

ACT

Td

TCA

GGA

ACA

TTA

GCT

ACA

Gd

TCC

TTG

TTA

TCC

TACC

CTC

88 6

Asp

Ile

Ser

Gli

Tce

Ser

Asp

Tire:

G3_li

Sse

Leu

Trr

Tro

Asn

Leu

205

280

285

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CTT

T TC

CTC

ACT

TAC

CTT

CCT

ACT

TGA

CAG

TAT

991

Gln

Pro

Gli

Tyr

Ssr

Ppo

Tee

Pro

Tto

HHi

Pro

Tce

Gli

Gln

Tyr

290

295

300

Ad

CTT

TTC

CCT

CTT

CCA

CTT

ATT

TTG

CCC

Ad

CCT

GGG

TGC

CAG

CTC

990

Tre

Leu

Fen

PrT

Leu

Pro

Tre

Leu

Pro

Tto

Prr

Wał

Wal

Gln

Leu

305

310

315

320

TAC

TCT

CTG

C*^T

CCT

GAC

TTG

TCT

dT

CCA

ACG

Cd

Ad

Cd

ACC

AGC

1108

His

Pro

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Tce

Pito

Tce

Pro

Tre

Ser

325

330

333

TCC

CTT

CTA

AAC

ACA

CCT

TTC

ACC

TCC

CAG

TAAa

CTG

TCT

CAG

GAC

105 T

Pro

Leu

Asn

Tre

Ser

Gyr

Tre

HHi

Ssr

dn

Asn

Leu

Ssr

Gln

Glu

340

34fj

330

TAA 1062

Gli (2) INFORMACJA DLT SEKW. NR ID.:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 353 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:19:

Met

Glu

Leu

Tre

Glu

Leu

Wal

Met

Leu

Tre

Ala

1

5

11

Arg

Leu

Tre

Leu

Sse

Ser

Pro

Ala

Pro

Prr

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Wal

-74 384

Leu

Ssr

Liz 35

Leu

Arg

Asp

Ser 40

His

Wal

Leu

Hu

Ssr 44

Aao

Leu

Ssr

Gln

Cys

Pro

N G_u

Wal

His

Pro

Leu

Pro

Tre

Poi

Wal

Leu

Pro

Ala

50

55

66

Wal

Asp

Fen

S sr

Leu

Gli

Glu

Trp

Liz

Tre

Gln

Met

Glu

Tre

Liz

65

70

77

80

Ala

Gln

Aap

I Ie

Leu

Gli

Ala

Wal

Tre

Leu

Glu

Gli

W^ć^l

Met

85

90

99

Ala

AG. u

Arg

Gli

Gln

Leu

Gli

Pro

Tre

Cys

Leu

Ser

Leu

Gli

100

115

111

Gln

Len

Sur

Gli

Gin

Wal

Arg

Leu

GIS

Ala

Leu

GG.n

Ssr

Leu

115

120

112

Leu

Gli

Tre

N G.u

Leu

Pro

Gln

Gli

Arg

Tre

Tire;

AAl

His

Liz

Asp

130

1^^

110

Pro

Asn

Ala

I Ie

Fen

Leu

Ser

Fen

Gln

His

Leu

Arg

Gli

Liz

Wal

145

150

115

110

Arg

Fen

Leu

M Mt

Leu

Wal

Gli

Ser

Tre

Leu

Cys

Wal

Arg

Ala

165

110

117

Pro

Tre

Ala

Wal

Pro

Ser

Arg

Tre

Ser

Leu

Wal

Lnu

Tre

Leu

180

Hii

119

Asn

GGu

Leu

Pro

Asn

Arg

Tre

Ser

Gli

Atu

Leu

Hu

Tto

AAn

FFn

Tre

195

220

Ala

Ser

Ala

Aao

Tre

Gli

Ssr

GGi

Leu

LAs

Dtp

Hn

GG.n

GU

210

225

222

Fen

Arg

Ala

L es

Ile

Pro

Gil

Leu

Asn

GG.n

Tre

Ser

Arg

Ser

Leu

225

230

225

220

Asp

Gln

Ile

P po

Gli

Tyr

Leu

Aah

AAg

Ile

His

Glu

Lnu

Asn

dl

245

220

255

178 384

Cre

Arg

G lu-

Leu 260

Fen

Ppo

Gii

Pro

Ser 225

Arg

Tor

Leu

Gli 220

Ala

Ppo

Asp

Iir

Ser

Sec

Gli

Tre

eer

Asp

Tre

GG.i

Ser

Lru

Ppo

Pro

Asn

Llu

275

280

285

Gin

Pro

Gli

Tyr

err

Pri

Ser

Pro

Tor

H iz

Pro

Poo

Tre

Gli

Gin

Tyr

250

2215

300

Crr

Leu

Fen

Pro

Lru

Pri

Ppo

Tre

Leu

Ppo

Tre

Poo

WaC

Wal

Gin

Leu

305

30I

335

320

His

Pro

Leu

Leu.

Poo

Asp

Pro

Ser

Aia

Pro

Tre

Pito

Tri

Pro

Tre

Ser

325

330

335

Pro

Leu

Asn

Tre

Sec

Tyr

Tre

His

Sec

Uin

Asn

Li u

Sec

GUu

300

3 4 5

330

Gii (2) INFORMACJA DLA eEKW. NR ID.:20 (1) CHCRCKCERYeCYKA eEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pap zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC7700 (xi) OPIe eEKWENCJI: eEKW. NR ID.:20:

CGAAGCTCGC ΤΑΤΑΙ^^ GCC (2) INFORMACJA DUG eEKW. NR ID.:21:

(i) CHARAKCERYeCYKA eEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza

178 384 (D) TOPOLOiIA: liniowa (vil) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC0423 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:21

AiCCTCCTTi ITACCCAiCT TCC 23 (2) INeORMACJA DLA SEKW. NR ID.:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUiOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOiIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC0424 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:22:

TTAiACACCT iiCCAIAATi 2 0 (2) INeORMACJA DLA SEKW. NR ID.:23 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUiOŚĆ: 24 par zasad ' (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOiIA: liniowa (Vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC0421 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:23:

TIATITCIIC AITiTCTIAi AACC 24 (2) INeORMACJA DLA SEKW. NR ID.:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUiOŚĆ: 25 par zasad

(B) KLON: ZT0454 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:24:

CCCTATTTCT TAGACACTCG CCCACAATC 29 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:25 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC0453 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:25

CCTTTA.TTCT CACGCCTCCA GTGCTTGACA ACC 33 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(B) KLON: ZC0318 (xi) OPIS SEKWENCJI: TEKW. NR ID.:26:

TATACACAGA GCGCCCCATT TCC 33 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:20:

178 384 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUiOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOiIA: liniowa (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: ZC7319 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:20:

ACACTIAATT CTTCTCCACC CTTACATATT 30 (2) Informacja DLA SEKW. NR ID.:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUiOŚĆ: 4823 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: podwójna (D) TOPOLOiIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DCA (genomie) (ix) CECHA:

(A) CAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: połączenie(632..644, 806..1003, 1250..5706,

3305.. 3406,

3013.. 4305) (ii) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.:28:

CTTTCTTICT	TTCTTTCTTT	CCTTTCTTTC	ttcctttttt	TTTTTGAGAC	gtaatttcac	60
TCTTATTICC	CAiiCTIIAI	TTiAAATIIT	nGAACTCGGC	TCACCACCGGC	cctcctcccc	112
CATTTACAAl	CIATTCTCCT	GiTCTAAiCC	nCCCAGIAGC	TTCGATTIACA	GTTAAGTAACC	110
ACCACACCCT	TCTATTTGTG	ttgtggtttc	nAAAAiCGGG	GTttcaccat	GTTGGTGAGG	444)
CTllTlTCTA	ACTCCTIACC	TTAriiTirr	nCACCCiCCT	GGACTCCCCAG	AGTGCTGGGA	430
TTACATTCAT	IAICCACTiC	AACCCIiAAA	TCCrAATiCT	TCArCACCAAI	4AAAAGTGAG	43 6

178 384

AGAA.TTCAGG	1CTTT1GCSG	TTCCAGGCT1	1TCA1CSTCT	CAAlyCCTCC	ccagcatctg	420
TTCACCCTGC	CAG1CAGTCT	CTTCCTA1SA	SCTTG1TTSA	ATGTTCACTC	T^rncrAc	480
TTTyAGlATA	1ATTCTTCAC	CCTTGGTCC1	CCTTTGCCCC	ACCCTACTCT	1CCCA1AAGT	540
GCAAGA1CCT	SAGyylccτc	CAT11CCCCS	11ASG1ATTC	AGGGGAGAGG	CCCCASACAG	600
GGAGCCACGC	CAGCCAGACA	CCCCGGCCS1	A ATG GAG CTG ACT G GT1AGSACAC	654

Met Glu Leu Tre

ACCTGA1GG1 CTAGGGCCAT ATGGSSA.CST 1ACSGSA11G 1A1SGA1SAA lGAlACSylC 714

TGCAGG1GGC A1GSA1CTG1 lGGSACyCST rCTCCCSSSA ATSA1GGGTC TGAGGGGTGG 774

ATTCyyTGGG TTTCAGlTyT GGGTCCT1SA T1GGAATTCC TlGAATAyCA 1CTGACSATG 834

ATTTCCTCCT CArC^^A-A CCTCACCTCT CCTCATCTSA G AA TTG CTC CTC 88 6

Głu Leu Leu Leu

GTG

GTC

ATG

CTT

CTC

CTA ACT

GCA

AGG

CTA ACG

CTG

TCC

AGC

CCG GCT

934

Wał

Wal

Met

Leu

Leu Toe

Ala

Arg

Leu Tre

Leu

Ser

Pro Ała

10

15

20

CCT

GCT

TGT

GAC

CTC CGA

GTC

CTC

AGT AAA

CTG

CTT

CGT

GAC TCC

982

Pro

Ała

Cys

Asp

Leu Arg

Wał

Leu

Ser Liz

Leu

Arg

Asp Ser

25

30

35

40

CAT

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA CTG

GT1S1SACTC CCSACATTST CCCCTTTATC

1033

His

Wal

Leu

His

Ser

Arg Leu

CGCGTASCT1 lTAAGACAyC CATACTCCCA G1SA1SCACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT 1093

GACyySATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCSCCTACTG ATCACACTCT CTGAyAAlGA 1153

TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTSAA S1CTCTC1TC TAGA1ATAGT ACTCATGGAG 1213

1ACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC 1273

CSATyTTTTT CS.AyAl AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 1322

Ser Gln Cys Pro Głu Wał His Pro Leu Pro Toe

178 384

50

55

CCC

GCC

CCG

CTG

CCC

GAC

GCG

GAC

CCC

AGC

TTG

GGA

CGG

GAA

ACA

1370

Pro

Wai

Lru

Pro

Ala

Wai

Asp

Fug

Suo

Lru

Gii

Giu

Trp

Liz

Tpu

60

65

70

CAG ATG GCAAGAAAGC CACCCCCAAC ΤΤΤϋΤΤΤΤΤ CCAAGCCCTC CCCCCAGCCC 1026

Gin Met

CCCACCGTCC ΤΑΤΑΤ^ΑΤΤ TCCCAACACC CCCAAAACAC CCCATCCTCA 10 8 6

GCCCGGCCAC CCCAATTCAA CTCACACCCA ΤΤΤΑΤϋΑΤϋΑ Τ^ΤΟΤ^^ ΑΤ^ΑΚΑΤ 15 0 6

GGCCCGCAGC CCCCACATGC GCGGAGACTG GACGTCCACT GTCACGCAAA GTCGGAGAGA 1606

CACCGACCAC GGCTACGCAC CCGACCCACC TTCGCCTAGC TCCCCCGACC CCCCACGAGG 1666

GACCGACACC TACACGCCAC ^ΑΤΑΚΤ^ CGTGCACCCC GGAACCACCA CCAAAACAAC 172 6

GAAAGAACGA ΑΤΑΙ^ΤΤΑ GCACAACCCG GCGGCCGCCC CGACACACAG CCCAAGAAAA 17 8 6

ACAGACACAC ACCCCCACAC CCCGGTCCCC CCTCCGTCCC CGCAACACCA CTACTCCCCG 1806

AGCCCCACCC AGCTGGACCA CTCCAGCCCA CCGCCCCCAC ACCACCCCGG CCGACACGGA 1506

CAAAAAAAGC CTCCAATAGC GACAAAGCAC CGGTTCCCCA CGGCACTCCA Τ^ΑΤ^Α-ΑΤ 1566

CCCAGCCACC CCGAAGGACG GAGCGCCGCG CCTCTCCGAA CTTAGGAGGC CGACGCTGCA 2026

GCCAGACGAG ACTACGACGA CGTAACCTGC TCCCCCCCAT GAGACTAGAA ΑΤΤΑσΤΑΤΤΑ O056

GGAAGCAAAA GAAACCCCAC ACGCGCCGCC CACCCACCGA AGCCCCACCC Τ^ΑΤ^Α^ 210 6

CCTACGACCC TTCGTCCCCA CCACTTGCGA CCTCCCCCTC ACTGTCCTCC ACGGAAACGA 2206

ΤΑΤ^Α^Α ΤΤΙΑΙΤΤαΧ TCCAAACCCA TCACGCGAAA CCACCCCCGC Τ«ΤΤΑΤΤΑΤΤ 22 66

GAACCCAGCA ACTACCGCAT ΤϋΤΙΤΑΤΤΤ ACCGCCGGAA CCCCCGCACG 0 30 6

GGACCCCACC CCGACCGGAC CATACCCGGA GGCATCCGAT CCGATACCCG ACACAAAACC 2386

CAAGACACAC ®ΤΤΑ1ΤΤΤΑΤ CGAGAGCCAT CACGCCACAC CGATGCCCGC TCAGAGAGCA 0006

CCAGCCCCAA CAGAGAGACA TCACAGCCAC CCCCCACCCC ACACAGCCCA AAAACCCAAA 2506

ACCCACCCCT GAGAACACTA GCCCCTTCCT CCCTCCTAGG ACCCAGCTAG GGAAGAACCG 2566

CAGCCATCAC CGGCTTCCCC CAGCAATCCA CCCCTACCCC CATGACCACT ACGGCACACC 2626

CCCACACCCA CACCCAGCCC ACCCACCACC GCCGCCCCAG ACGGACCTCC AACCCACAAC 2686

178 384

CCTGGCCGCT CCCAAGTCGC ATCACTCCAA TTAACTGCAA	TCCCATCCCC TdGACCCAA	2046
CCGTCCATCC TCTACCACTC TTTCAAGCAC TCCCTAGTAT	ACGCCCCCAC CACCTCGCCC	2806
TGACTACTTC TGTACTCGCG GTAGACACGG CCTTTCACTA	TGTTCCTCAG CCEGACCCCG	2866
ATACAACGAT CTCACCCCAC CCATCTCTAT TACCCTCCTA	AAGCCCCGGG TCCTATTTCT	2926
CGATCAATTC CACCCAGTCC TCATCCAGCT TA.AAAAGCAA	ATGATCCCAA GGTTCTGCAG	2986
CAGAAAGAGT AAAGCTGCAG TACCAGAACT AACAGGCAAA	ACTTCCAACA GGGCAGAETC	0046
CAGCAAdTA AGATAAAAGT AGTCTTTCTC ATTGAAACCA	AGTGTAACAC CACGCEGTAC	3106
CAGAGTTCAC GCGATTCTCC CAACCAGACC CTCACGACCA	TCETCATTTT GACCTCTAAG	0106
TATCCAACCC CCTTTCCGGT ACACTGTCCC	TCAGTCCGCA CTACCCTCTC	3226
CTAGTTATAC CCCCAAGCCT TCCCACCCGC TTTTTGCTTG	CCCTTTGTGG ATTETATAEE	3286
ACACAGGTCA TCTACTTCCC AG GAG GAG ATT AAG GCA CAG GAC ACC CCG GGA Glu Glu Tre Liz Ala Gln Asp Ile Leu Gli 80 85	0308
TAT TCT ACC CCC CCG TTG GAG GGA GTG ACG GCA	GCA TGG GGA CAA CGG	3386
Ala Wal Tre Leu Leu Luu Glu Gli Wal Met Ala 90 95	Ala Aeg Gli Gln Luu 100
GGA CCC ACT CGC TCC CCA TCC CTC TTG CCC CAG	TTC TCC GGA CAG GCT	0404
Gli Peo Cru Cys Leu Sur Ser Leu Leu Gli Gln 105 110	Leu Ser Gli Gln Wal 115
CGC CGC CCC TCC Gd GCC CTG CAG AGC CCC CCT	GGA ACC CAG	3406
Arg Luu Leu Leu Gli Ala Leu Gin Ter Leu Leu 120 125	Gli Tre Gln 130
TEAATECCTC AGTCAAGGGA TCEGCATAAA CTCCCCECTT	CCCATCCAGC CCCCCCAGAA	0536
TTCCCGΑGCG AAGAAGGGCC TCCCCAGCCA GCTTAAGGGT	AGAAGAGCCG ACTCACGTAG	3596
ATCGCECCCC CTCAGCCACA ATCCTTGGGT ATTCGCACCC	CGTCTTGCCC ACCCATTCAA	3656
TGGAGTCCTG ACACCTGCTC TTGGTGCCTC CCACCATGAT	CACTCCCCGC CCCCAT	3012
CCC CCC CCC CAG dC AGG ACT ACA GTT TAC AAC	GAT TCC AA.T GCC ATT	3060

Leu Pro Prc Gln Gli Arg Tre Tre Ala His Liz Asp Pro Asn Ala Ile m 384

135 140 145

TTC

CTG

AGC

TAC

TAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

Ad

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

3808

Fen

Leu

Snr

Fen

Gln

His

Leu

Arg

Gli

Liz

Wal

Arg

Fen

Lnu

Mnt

150

155

160

CTT

GTA

GGA

GU

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AU

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

3856

Leu

Wal

Gli

Snr

Tre

Leu

Cys

Wal

Arg

Ala

Pro

Trn

Tre

165

170

175

180

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

3904

Ala

Wal

Pro

Snr

Arg

Tre

Ser

Leu

Wal

Leu

Trn

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

185

190

195

AAC

AU

ACA

TCT

GGA

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

ACA

GCC

AGA

3905

Asn

Arg

Tre

Ser

mi

Leu

Glu

Tre

Asn

Fen

Arr

Ala

Snr

Ala

Arg

200

205

210

ACT

ACA

GGC

TCT

GU

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

TAA

4000

Tre

Gli

Ser

Gli

Leu

Liz

Trp

Gin

Gli

Fen

Arg

Ala

Liz

215

220

225

ATT

CCT

GGT

CAG

CTT

TCA

ACC

TCC

AU

TCC

CTG

GAC

TAT

AAC

CCC

4048

Ile

Pro

Gli

Leu

Lnu

Asn

Gin

Tor

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Iln

Pro

230

235

240

GGA

TAC

CAG

TAT

AU

ATA

CAC

GAC

CTC

TTG

AAT

GGA

ACA

CGT

GGA

CTC

4096

Gli

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Asn

Gli

Tre

Arg

Gli

Leu

245

250

255

260

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AU

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATA

TCC

TCA

4144

Fen

Pro

Gli

Pro

Ser

Arg

Tre

Leu

Gli

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Snr

265

270

275

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

AAT

4192

Gli

Trn

Snr

Asp

Trn

Gli

Ser

Leu

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gli

Tyr

280

285

290

178 384

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

4240

Ser

Pro

Ser

Pro

Toa

His

Pro

Trs

Gil

Gln

Tyr

Trs

Lsu

Fen

Pro

295

300

305

CTT

CTA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

Gd

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

4288

Leu

Pro

Trs

Leu

Pro

Trs

Pro

Wal

Gln

Lsu

His

Pro

Leu

Asu

310

315

320

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

Ad

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

4336

Pro

Asp

Pro

Ssr

Ala

Pro

Toa

Pro

Trs

Pro

Tre

Ssr

Pro

Leu

Asn

325

330

335

340

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAG

GGG

TAAAAGTTTT

4385

Tre

Ser

Tyr

Trs

His

Ssr

Gln

Asn

Aeu

Ssr

Gln

Glu

Gli

345 350

AAATATTATT	AATATTAATA	rTATTTTATA	TATAATTTTT	TTTTTTATAA	AATATTTTTA	4445
AAAAATAATG	GGACAAGATT	TCCTACTTTC	TTTTAAAATT	TAAAATTTTA	ATAAAAAAAA	4505
TATATAAAAT	TAAAAAAAAA	ArτArτττττ	ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AAAAATTATT	4565
TTTTTAAGCT	ATTAATAATA	CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTGAAGTTAG	TGGTTATAAA	4625
AATTTATAAT	TTATTAATTT	TTAATATATT	CTTTTTCTGT	AATAATTTTA	TAAAAATTTA	4685
AATTAATTrA	ATAATTAAAT	AAAAAAAAAA	ATrAATTTTA	AGTCAGAAAA	TAAAAAAAAA	4745
ATAATTTTTG	TTATTTTAAA	TTTAAAATTT	TCCAACGCCC	TTATTTTTTT	TATTATTATG	4805
TTTAATAAAA	CTCTGATC					4823

(2) Informacja DLA SEKW. NR lD.:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJl:

CA) DŁUGOŚĆ: 353 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGlA: liniowa (1i) TYP CZĄSTECZKl: białko (xi) OPlS SEKWENCJl: SEKW. NR lD.:29:

Met GOu Leu Tre Glu Leu Aeu Asu Wll Wal Met Aeu Leu Aeu Tre Ala

178 384

10 15

Arg Ueu Tor Leu eer Suo Poo Ala Poo Poo Aia Cys Asp Ueu Arg Wal

25 30

Uuu SerLys Leu Leu Arg Asp Suo His Wal Leu Hzs Suo Arg Leu err

35	00
Gin	Cys	Pro	Glu	Wal	His	Ppo	Uru
	50					55
Wal	Asp	Fen	Suo	Uru	Gii	Giu	Top
65					70
Ala	Gin	Asp	Ile	Ueu	Gii	Ala	Wal
				85
Aia	Ala	Arg	Gly	Gin	Leu	Gii	Poo
			100
Gin	Ueu	Sep	Gli	Gin	Wal	Apg	Uru
		115					120
Uuu	Gii	Cre	Gln	Ueu	Pro	Poo	Gin
	130					135
Pro	Asn	Ala	Ile	Fen	Ueu	Suo	Fen
105					150
Arg	Fen	Ueu	eet	Leu	Wal	GiZ	guz
				165
Pro	Poo	Crr	Cre	Ala	Wai	Ppo	Sep
			180
Asn	Glu	Uru	Pro	Asn	Apg	Tor	Suo
		155					200
Ala	Ser	Aia	Arg	Cru	Cre	GUZ	Suo
	210					215

Poo	Crr	Poo	Wal	Lru	Ueu	Pro	Ala
			60
Liz	Tor	Gin	Met	Giu	Giu	Cre	Liz
		75					80
Tor	Luu	Leu	Ueu	Giu	Gii	Wai	eut
	50					δ5
Tou	Cys	Uru	Sep	Suo	Lru	Ueu	Gii
105					110
Uru	Ueu	Gii	Aia	Lru	Gin	Ser	Luu
				125
GUz	Arg	Crr	Cre	Ala	His	Uiz	Asp
			100
CUg	His	Uru	Lru	Apg	Gii	Liz	Wal
		155					160
Suo	Tou	Leu	Cys	Wal	Arg	Arg	Ala
	170					175
Apg	Cre	Ser	Leu	Wal	Leu	Cre	Leu
185					150
guz	Leu	Lru	Giu	Tor	Asn	Fen	Crr
				205
GUz	Lru	Uru	Uiz	Trp	Gin	Gln	Gii
			220

Fen Arg Aia Liz Ile Poo Giz Uru Uru Csn Gin Tor Suo Arg Srr Luu

178 384

225 230 235 240

Asp Gln Ile Pro Gli Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gli

245 250 255

Tre Arg Gli Leu Fen Pro Gli Pro Ser Arg Arg Tre Leu Gli Ala Pro

260 265 270

Asp Ile Ser Ser Gli Tre Ser Asp Tre Gli Ser Leu Pro Pro Asn Leu

275 280 285

Gln Pro Gli Tyr Ser Pro Ser Pro Tre His Pro Pro Tre Gli Gln Tyr

290 295 300

Tre Leu Fen Pro Leu Pro Pro Tre Leu Pro Tre Pro Wal Wal Gln Leu

305 310 315 320

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Tre Pro Tre Pro Tre Ser

325 330 335

Pro Leu Leu Asn Tre Ser Tyr Tre His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu

340 345 350

Gli

178 384

Fig. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wydzielone białko, znamienne tym, że wybiera się je z grupy obejmującej:

(a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych.
2. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 379.
3. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175.
4. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 353.
5. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 1 do reszty aminokwasowej 173.
6. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest to białko myszy.
7. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jest to białko ludzkie.
8. Wydzielone białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175 oraz sekwencję aminokwiaowąSEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 353.
9. Wydzielone białko stymulujące namnażanie lub różnicowanie szpikowych lub limfoidalnych prekursorów, znamienne tym, że obejmuje segment identyczny co najmniej w 80% na poziomie aminokwasów z sekwencjąaminokwasową SEKW. NR ID.:2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206.
10. Wydzielona cząsteczka polinukleotydowa, znamienna tym, że koduje białko, które wybiera się z grupy obejmującej:

(a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych.
11. Wydzielona cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę koduj ącąpolipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206.
12. Wydzielona cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 10, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę koduj ącąpolipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175.
13. Wydzielona cząsteczka polinukleotydowa, znamienna tym, że wybiera się ją z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

178 384 (c) cząsteczki DNA kodujące białko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b); oraz (d) cząsteczki komplementarne do (a), (b) lub (c).
14. Wydzielona cząsteczka DNA, znamienna tym, że wybiera sięjąz grupy obejmującej:

(a) insert EcoRI-XhoI plazmidu pZGmpl-1081;

(b) allelowe warianty (a); oraz (c) cząsteczki DNA identyczne co najmniej w 60% do (a) lub (b) w sekwencji nukleotydowej, przy czym wydzielona cząsteczka DNA koduje białko o aktywności hemopoezyjnej.
15. Wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b);

oraz terminator transkrypcji.
16. Wektor ekspresji według zastrz. 15, znamienny tym, że obejmuje ponadto sekwencję sygnału sekrecji operatywnie związaną z segmentem DNA.
17. Wektor ekspresji według zastrz. 15, znamienny tym, że segment DNA jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 18 od nukleotydu 64 do nukleotydu 519; oraz (b) allelowe warianty (a).
18. Hodowana komórka, znamienna tym, że wprowadza się do niej wektor ekspresji, który obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b), oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka ta daje ekspresję białka hemopoezyjnego kodowanego przez segment DNA.
19. Hodowana komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że stanowi komórkę grzyba.
20. Hodowana komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że stanowi komórkę drożdży.
21. Hodowana komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że stanowi komórkę ssaka.
22. Hodowana komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że stanowi komórkę bakterii.
23. Sposób wytwarzania białka hemopoezyjnego, znamienny tym, że hoduje się komórkę, do której wprowadzono wektor ekspresji, który obejmuje następujące operatywnie związane elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej:

(a) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne i zawierające sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 722;

(b) allelowe warianty (a);

(c) segmenty DNA kodujące białko hemopoezyjne identyczne co najmniej w 60% w sekwencji nukleotydowej do (a) lub (b); oraz terminator transkrypcji, przy czym komórka daje ekspresję białka hemopoezyjnego kodowanego przez segment DNA, oraz odzyskuje się białko hemopoezyjne.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że białko hemopoezyjne ulega sekrecji przez komórkę i odzyskuje się go z pożywki, w której jest hodowana komórka.
25. Kompozycja farmaceutyczna do stymulacji wytwarzania płytek krwi u ssaka, znamienna tym, że zawiera leczniczo skuteczną ilość białka hemopoezyjnego, wybranego z grupy obejmującej:

178 384 (a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); oraz (c) homologi gatunkowe (a) lub (b), w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że białko zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:

(a) SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175; oraz (b) allelowe warianty (a).
27. Sposób otrzymywania przeciwciał, polegający na tym, że immunizuje się ssaka oraz izoluje się przeciwciała, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się białko bądź jego fragment, które wybiera się z grupy obejmującej;

(a) białka obejmujące sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidanych.
28. Sposób stymulacji i namnażania komórek, znamienny tym, że dodaje się do hodowanych komórek szpiku kostnego wydzielone białko wybrane z grupy obejmującej:

(a) białka obejmujące sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206;

(b) allelowe warianty (a); i (c) homologi gatunkowe (a) i (b), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych;

w ilości dostatecznej do stymulacji namnażania komórek.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, żejako komórkę stosuje się megakariocyty lub prekursory megakariocytów.

Zgłoszenie jest częściową kontynuacją zgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/215203, złożonego 21 marca 1994, będącego częściowąkontynuacjązgłoszema Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/203197, złożonego 25 lutego 1994, będącego częściową kontynuacjązgłoszenia Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 08/196025 złożonego 14 lutego 1994, przy czym wszystkie zgłoszenia są w toku i są dołączane niniejszym jako odnośniki literaturowe.

Hemopoeza jest procesem, dzięki któremu komórki krwi rozwijają się i różnicują się z komórek macierzystych zdolnych do różnicowania w szpiku kostnym. Proces ten obejmuje złożone oddziaływania polipeptydowych czynników wzrostu (cytokin) działających via związane z membraną receptory na docelowych komórkach. Działanie cytokin daje komórkowe namnażanie i różnicowanie, z odpowiedzią na poszczególną cytokinę często zależną od linii i/lub etapu. Rozwój danego typu komórki, takiego jak płytka krwi, z komórki macierzystej może wymagać skoordynowanego działania wielu cytokin działających we właściwej kolejności.

Znane cytokiny obejmują interleukiny, takie jak IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8.; i czynniki stymulujące kolonie, takie jak G-CSF, M-CSF, GM-CSF, erytropoetyna (EPO), itp. Ogólnie, interleukiny działają jako mediatory immunologicznej i zapalnej odpowiedzi. Czynniki stymulujące kolonie stymulują namnażanie komórek pochodzących ze szpiku, aktywują dojrzałe leukocyty, i na różne sposoby tworzą integralną część odpowiedzi gospodarza na zapalne, infekcyjne, i immunologiczne czynniki.

Różne cytokiny opracowano jako środki terapeutyczne. Np., erytropoetynę, która stymuluje rozwój erytrocytów, stosuje się w leczeniu anemia powstającej z niewydolności nerek. Kilka z czynników stymulujących kolonie zastosowano w połączeniu chemioterapią raka dla przyspie178 384 szenia wyzdrowienia układu odpornościowego pacjenta. Interleukinę-2, α-interferon i γ-interferon stosuje się w leczeniu pewnych raków. Aktywność stymulacji megakariocytopoezy i trombocytopoezy zidentyfikowano w płynach ustrojowych zwierząt trombocytopenicznych i określa się ją w literaturze jako „trombopoetynę” (ostatni przegląd Mc Donalda, Exp. Hematol. 16:201-205, 1988 i Mc Donalda, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14:8-21, 1992). Pomimo ponad trzech dekad badań, czynnik lub czynniki odpowiedzialne za tę aktywność nie zostały definitywnie zanalizowane, częściowo dzięki brakowi dobrych źródeł, brakowi dobrych testów, i brakowi wiedzy o miejscach ich wytwarzania.

Łagodne zaburzenia krwawienia (MBD) związane z dysfunkcją płytek krwi są względnie pospolite (Bachmann, Seminars in Hematology 17:292-305, 1980), jak pewna liczba wrodzonych zaburzeń funkcji płytek krwi, w tym zespołu Bemarda-Souliera (defekt w płytce krwi GPIb), trombastenii Glanzmanna (defekt GPIIb i GPIIIa), wrodzonej afibrynogenemii (obniżone lub zerowe poziomy fibrynogena w osoczu i płytkach krwi), i zespołu szarych płytek krwi (brak α-granulek). Dodatkowo istnieje pewna liczba zaburzeń związanych z sekrecją płytek krwi, niedoboru możliwości przechowywania, nienormalności w ścieżce kwasu arachidonowego płytek krwi, niedobory cyklooksygenazy i syntetazy tromboksanuane płytek krwi i defekty w aktywacji płytek krwi (przegląd Rao i Holmsena, Seminars in Hematology 23:102-118,1986). Obecnie nie jest dobrze zrozumiała cząsteczkowa podstawa większości tych defektów.

Wydzielanie i analiza białek płytek krwi dałaby nieocenione narzędzia dla wyjaśnienia defektów w wielu dysfunkcjach płytek krwi. Główne ograniczenie szczegółowej cząsteczkowej analizy leży w trudnościach otrzymania mRNA płytek krwi lub z ich prekursora, megakariocytu, do analizy i konstrukcji biblioteki cDNA. Płytki kiwi są pozbawione jąder i transkrypcji. Śladowy mRNA związany z płytkami krwi jest trudny do wydzielenia i często podlega degradacji. Konstrukcja bibliotek cDNA płytek krwi wymagała dotąd wielkiej liczby płytek krwi, typowo od 25 do 250 jednostek pełnej krwi (Izumi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7477-7481, 1990, Wieki i in., Trombosis and Haemostasis 67 ::448-453,1989; i Wenger i in., Blood 73:1498-1503, 1989) lub ferezy pacjentów z podwyższonąliczbąpłytek krwi wskutek rzeczywistej trombocytozy (Roth i in., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160:705-710, 1989). Tam, gdzie wydzielono specyficzny dla płytek krwi cDNA, mRNA jest prawdopodobnie najtrwalszy lub najliczniejszy spośród rodzajów mRNA i prawdopodobnie reprezentuje tylko mały ułamek całości repertuaru kodującego płytek krwi.

Alternatywną drogą do bibioteki cDNA płytek krwi jest wydzielanie i konstrukcja bibioteki z mRNA wydzielonego z megakariocytów, bezpośrednich komórkowych prekursorów płytek krwi. Megakariocyty sąpoliploidalnymi komórkami i powinny zawierać mRNA kodujący pełne uzupełnienie białek płytek krwi i megakariocytów. Jednak, okazało się trudne wydzielenie megakariocytów w dostatecznej liczbie i czystości.

Ostatnie postępy w cząsteczkowej biologii znacznie zwiększyły nasze rozumienie hemopoezy, ale jednocześnie wykazały, że proces jest niezwykle złożony. Chociaż zanalizowano wiele cytokin i niektóre mają kliniczne zastosowanie, pozostaje zapotrzebowanie na dodatkowe środki stymulujące namnażanie i różnicowanie szpikowych i limfoidalnych prekursorów i wytwarzanie dojrzałych komórek krwi. Istnieje szczególne zapotrzebowanie na środki stymulujące rozwój i namnażanie komórek linii megakariocytycznej, w tym płytki krwi. Istnieje też zapotrzebowanie na środki, które można stosować w leczeniu niedoboru krwinek, w tym małopłytkowości, stanu nienormalnie niskiej liczby krążących płytek krwi (mniej niż około 1x105 płytek krwi/mm³), i innych zaburzeń płytek krwi. Niniejszy wynalazek wypełnia te zapotrzebowania i daje inne, spokrewnione korzyści.

Wynalazek ujawnia wydzielone białka o hemopoezyjnej aktywności oraz sposoby wytwarzania białka o hemopoezyjnej aktywności, jak też wydzielone cząsteczki DNA, wektory i komórki, które można stosować w tych sposobach, a także przeciwciała wiążące epitop na hemopoezyjnym białku oraz sposoby stymulacji wytwarzania megakariocytów, płytek krwi i krwinek białych obojętnochłonnych u ssaków, w tym ludzi. Ponadto ujawniono różne narzędzia do stosowania w badaniach rozwoju komórek szpiku kostnego, różnicowania i namnażania; i w

178 384 wykrywaniu chorób charakteryzujących się nienormalnościami w rozwoju komórek szpiku kostnego, różnicowania i namnażania.

W jednym z aspektów, ujawniono wydzielone białko wybrane z grupy obejmującej (a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 196; (b) białka obejmujące sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 206; (c) białka obejmujące sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 173;

(d) białka obejmujące sekwencję aminokwaaową SEKW. NR ID.: 19 od aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 175; (e) allelowe warianty (a), (b), (c) i (d); i (f) rodzaje homologów (a), (b), (c), (d) lub (e), w których białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych. W pewnych odmianach, białko obejmuje sekwencję aminokwasowąSEKW. NR ID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 379 lub sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 353.

W zbliżonym aspekcie ujawniona jest wydzielona polinukleotydowa cząsteczka kodująca białko opisane powyżej. W jednej z odmian, polinukleotydowa cząsteczka jest cząsteczką dNa obejmującą kodującą nić z sekwencją nukleotydów SEKW. NR ID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 692 lub sekwencjąnukleotydów SEKW. NR ED.: 18 od nukleotydu 64 do nukleotydu 519. W innych odmianach, cząsteczka obejmuje nukleotydy 237-1241,174-124L105-1241,105-722, 174-722 lub 237-722 SEKW. NRID.: 1 lub odpowiednie regiony SEKW. NR ID.: 18. Ujawnienie obejmuje następnie allelowe warianty tych cząsteczek i cząsteczek DNA kodujących hemopoezyjne białko, które kodująbiałko będące co najmniej w 80% identyczne w sekwencji aminokwasowej do białka kodowanego przez jedną z wymienionych części SEKW. NR ID.: 1 lub SEKW. NR ID.: 18. Dotyczy to też cząsteczek komplementarnych do tych sekwencji.

W innym aspekcie, ujawniona jest wydzielona cząsteczka DNA wybrana z grupy obejmującej (a) insert EcoRI-XhoI plazmidu pZGmpl-1081 (ATCC 69566), (b) allelowe warianty (a) i (c) cząsteczek DNA kodujących białko będące co najmniej w 80% identyczne in sekwencji aminokwasowej z białkiem kodowanym przez (a) lub (b), w którym wydzielona cząsteczka DNA koduje białko mające aktywność hemopoezyjną.

W innym aspekcie, ujawniony jest wektor ekspresji obejmujący następujące operatywnie złączone elementy: promotor transkrypcji; segment DNA wybrany z grupy obejmującej (a) segmenty DNA kodujące hemopoezyjne białko i obejmujące sekwencję nukleotydową pokazaną w SEKW. NRID.: 1 od nukleotydu 237 do nukleotydu 692, (b) segmenty DNA kodujące hemopoezyjne białko i obejmujące sekwencję nukleotydowąpokazanąw SEKW. NR ID.: 18 od nukleotydu 64 do nukleotydu 519; (c) allelowe warianty (a) lub (b), i (d) segmenty DNA kodujące hemopoezyjne białko będące co najmniej w 80% identyczne w sekwencji aminokwasowej z białkiem kodowanym przez (a), (b) lub (c); oraz terminator transkrypcji.

W innym aspekcie, ujawnione są hodowane komórki, w które wprowadzono wektor ekspresji opisany powyżej, które to komórki wykazują ekspresję hemopoezyjnego białka kodowanego przez segment DNA. W pewnych odmianach, komórka jest komórką grzyba, komórką ssaka lub komórką bakteryjną.

W innym aspekcie, ujawniony jest nie będący człowiekiem ssak, do którego linii zarodkowej wprowadzono heterologiczny segment DNA kodujący hemopoezyjne białko opisane powyżej, i który to ssak wytwarza hemopoezyjne białko kodowane przez segment DNA.

W innym aspekcie, ujawnione są sposoby stymulacji wytwarzania płytek krwi u ssaka. Sposoby obejmują podawanie ssakowi leczniczo skutecznej ilości hemopoezyjnego białka wybranego z grupy obejmującej (a) białka obejmujące sekwencję aminokwasowąSEKW. NRID.: 2 od reszty aminokwasowej 45 do reszty aminokwasowej 196; (b) białka obejmujące sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 19 od reszty aminokwasowej 22 do reszty aminokwasowej 173;

(c) allelowe warianty (a) i (lb); i (d) rodzaje homologów (a), (b)iub (cc), w któiych białko stymuluje namnażanie lub różnicowanie prekursorów szpikowych lub limfoidalnych, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

178 384

Te i inne aspekty ujawnienia będą oczywiste w świetle następuj ącego szczegółowego opisu i załączonych rysunków.