CZ221496A3 - Haematopoetic protein, materials and processes for preparing thereof - Google Patents

Description

čísla 08/215,203 podaného 21. března 1984, jež je část pokračování přihlášky pořadového čísla 08/203 197 podané 25. února 1984, jež je část pokračování přihlášky pořadového čísla 08/196 025 podané 14. února 1984, kteréžto přihlášky jsou podány a jsou zde zahrnuty odkazem.

Tato přihláška je část po

Dosavadní stav techniky

Hernatopoese je proces, v němž se krevní buňky vyvíjejí a diferencují z pluripotentních kmenových buněk v kostní dřeni. Tento proces zahrnuje komplexní propojení akce polypeptidových růstových faktorů (cytokinů), působících prostřednictvím membránově vázaných receptorů na cílové buňky. Působení cytokinů vede k buněčné proliferaci a diferenciaci, přičemž odezva na konkrétní cytokin je často specifická pro určitou linii nebo stádium. Vývoj jednoho typu buněk, jako jsou destičky, z kmenových buněk, může vyžadovat koordinované působení více cytokinů, působících ve správném pořadí.

Známé cytokiny zahrnují interleukiny, jako jsou IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8 a j., a kolonie stimulující faktory, jako jsou G-CSF, N-CSF, GM-CSF, erythropoietin (EPO) a j. Obecně interleukiny působí jako mediátory imunitní a zánětlivé odezvy. Kolonie stimulující faktory stimulují proliferaci buněk odvozených z dřeně, aktivují maturní leukocyty, a tvoří jinak integrální součást hostitelské odezvy na zánětlivé, infekční a imunologické podněty.

Různé cytokiny byly vyvinuty jako terapeutická činidla. Například: Erythropoietin, jenž stimuluje vývoj erythrocytů, se používá v léčbě anemie, vznikající v důsledku selhání ledvin. Několik kolonie stimulujících faktorů se používá ve spojení s nádorovou terapií k urychlení obnovy imunitního systému pacienta. Interleukin-2, α-interferon a τ-interferon se používají v léčbě určitých nádorů. Aktivita stimulující megakaryocytopoesi a thrombocytopoesi byla zjištěna v tělesných tekutinách trobocytopenických zvířat a v literatuře se na ni odkazuje jako na thrombopoietin (recentní přehledy McDonald, Exp. Hematol. 16: 201-205, 1988 a McDonald, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14:

8-21, 1992). Navzdory více než třem dekádám výzkumu není tato aktivita definitivně charakterizována, zčásti pro nedostatek dobrého zdroje a chybějící dobrou analytikou metodu, a pro chybějící znalosti co do místa (míst) tvorby.

Mírné poruchy krvácení (mild bleeding disorders, MBDs) spojené s dysfunkcí destiček, jsou relativně běžné (Bachmann, Seminars in Hematology 17:292-305, 1980), jako je určitý počet vrozených poruch funkce destiček, včetně Bernardova-Soulierova syndromu (nedostatečnosti v destičkách GPIb), Glanzmannovy thrombasthenii (nedostatečnosti GPIIb a GPIIIa), vrozené afibrinogenemii (snížené nebo chybějící hladiny fibrinogenu v plazmě a destičkách), a šedého destičkového syndromu (absence α-granulí). Navíc existuje určitý počet poruch spojených se sekrecí destiček, nedostatečnou uloženou zásobou, abnormalitami dráhy arachidonové kyseliny v destičkách, nedostatkem cyklooxygenasy a thromboxansyntetasy v destičkách v aktivaci destiček (přehled: Rao a Holmsen,

Hematology 23:102-118, 1986). V současnosti není molekulární základ těchto poruch dobře pochopen.

Izolace a charakterizace bílkovin destiček by poskytla neocenitelné prostředky pro objasnění defektů, zakládajících mnohé dysfunkce destiček. Hlavní omezující krok podrobné molekulární analýzy spočívá v obtížích se získáváním mRNA z destiček nebo jejich prekursorů, megakaryocytů, k analýze a ke konstrukci cDNA knihovny. Destičkám chybí jádro a transkripce. Stopová množství mRNA, ještě spojených s destičkami, lze obtížné izolovat a podléhají často degradaci. Konstrukce cDNA knihoven destiček takto vyžadovala velké počty destiček, typicky z 25 až 250 jednotek celé krve (Izumi et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:7477-7481, 1990; Wicky et al., Thrombosis and Hemostasis 61:448-453, 1989; a Wenger et al., Blood 73:1498-1503, 1989) nebo z ferese pacientů se zvýšenými počty krevních destiček v důsledku esenciální thrombocythemie (Roth et al., Biochem. Biophys.. Res. Comm. 160: 705-710, 1989). Tam, kde byly izolovány cDNA a s defekty Seminars in specifické pro destičky, byly mRNA pravděpodobně nejstabilnější nebo nejhojnější ze všech druhů mRNA a přestavovaly pravděpodobně jen malý zlomek z celkového kódovacího repertoáru destiček.

Alternativní cestou k cDNA knihovně destiček je izolace a konstrukce knihovny z mRNA izolované z megakaryocytů, přímých buněčných prekursorů destiček. Megakaryocyty jsou polyploidní buňky a očekává se, že budou obsahovat mRNA kódující bílkoviny destiček a megakaryocytů v celé úplnosti. Ukázalo se však obtížným izolovat megakaryocyty v dostatečném počtu a čistotě.

Současné pokroky v molekulární biologii značně zlepšily naše chápání hernatopoese, ale současně ukázaly, že tento proces je krajně složitý. I když mnohé cytokiny byly charakterizovány a u některých bylo prokázáno, že mají klinickou využitelnost, v oboru stále přetrvává potřeba dalších činidel, jež stimulují proliferaci a diferenciaci myeloidních a lymfoidních prekursorů a tvorbu maturních krevních buněk. Existuje obzvláštní potřeba činidel, jež stimulují vývoj a proliferaci buněk magakaryocytové linie, včetně destiček. V oboru dále existuje potřeba činidel, jež by mohla být použita v léčbě cytopenií, včetně thrombocytopenie, stavu s abnormálně nízkým počtem destiček v oběhu (méně než asi 1 x 10⁵ destiček/mm³), a jiných poruch destiček. Předkládaný vynález vyplňuje tyto potřeby a poskytuje další příbuzné výhody.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí bílkovin majících hemetopoetickou aktivitu.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobů k produkci bílkovin majících hemetopoetickou aktivitu, jakož i izolovaných molekul DNA, vektorů a buněk, použitelných v rámci tohoto způsobu.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí protilátek, jež se váží k epitopům na hematopoetické bílkovině.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobů ke stimulaci produkce megakaryocytů, destiček a neutrufilů v savcích, včetně člověka.

aminokyselin Vzorce II od aminokyselinový zbytek 173; aminokyselin Vzorce II od aminokyselinový zbytek 175;

ad); a f) druhových homologů

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí řady nástrojů pro použití ve studiu vývoje, diferenciace a proliferace buněk kostní dřeně, a v detekci chorob charakterizovaných abnormalitami ve vývoji, diferenciaci a proliferaci buněk kostní dřeně.

V jednom ohledu tento vynález poskytuje izolovanou bílkovinu, vybranou ze skupiny sestávající z a) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196; b) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 206; c) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselinového zbytku 22 po

d) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselinového zbytku 22 po

e) alelických variant a), b), c)

a), b), c),d) ae), přičemž bílkovina stimuluje proliferaci a diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních prekursorů. V určitých provedeních bílkovina zahrnuje sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 379 nebo sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 353.

V podobném ohledu vynález poskytuje izolovanou polynukleotidovou molekulu kódující bílkovinu jak je uvedeno shora. V jednom provedení je polynukleotidovou molekulou molekula DNA obsahující kódující vlákno obsahující sekvenci nukleotidů Vzorce III od nukleotidu 237 po nukleotid 692 nebo sekvenci nukleotidů Vzorce IV od nukleotidu 64 po nukleotid 519. V jiných provedeních tato molekula obsahuje nukleotidy 237-1241, 174-1241, 105-722, 174-722 nebo 237-722 ze Vzorce III nebo odpovídající oblasti ze Vzorce IV. Vynález dále poskytuje alelické varianty těchto molekul a DNA molekuly kódující hernatopoetickou bílkovinu, kteréžto molekuly kódují bílkovinu, jež je alespoň z 80 % identická ve své aminokyselinové sekvenci s bílkovinou kódovanou jednou z uváděných částí Vzorce III nebo Vzorce IV. Jsou poskytnuty i molekuly komplementární k těmto sekvencím.

V jiném ohledu poskytuje vynález izolovanou DNA molekulu, vybranou ze skupiny sestávající z a) EcóRI-Xhol inzertu plasmidu pZGmpl-1081 (ATCC 69566). b) alelické varianty a), a c) DNA molekulu kódující bílkovinu, jež je alespoň z 80 % identická ve své aminokyselinové sekvenci s bílkovinou kódovanou a) nebo b), přičemž izolovaná DNA molekula kóduje bílkovinu, mající hematopoetickou aktivitu.

V jiném ohledu poskytuje vynález vektor exprese obsahující následující funkčně spojené prvky: promotor transkripce; úsek DNA, vybraný ze skupiny zahrnující a) úsek DNA kódující hemetopoetickou bílkovinu a obsahující nukleotidovou sekvenci jak je ukázána ve Vzorci III od nukleotidu 237 po nukleotid 692;

b) úsek DNA kódující hemetopoetickou bílkovinu a obsahující nukleotidovou sekvenci jak je ukázána ve Vzorci IV od nukleotidu 64 po nukleotid 519; c) alelické varianty a) nebo b) a d) DNA úseky kódující hematopoetickou bílkovinu, jež je alespoň z 80 % identická ve své aminokyselinové sekvenci s bílkovinou kódovanou a), b) nebo c); a terminátor transkripce.

V jiném ohledu poskytuje vynález kultivované buňky, do nichž byl zaveden vektor exprese jak je uváděn shora, přičemž buňky exprimují hemetopoetickou bílkovinu, kódovanou segmentem DNA. V určitých provedeních je buňkou buňka houby, savčí buňka nebo bakteriální buňka.

V jiném ohledu poskytuje vynález savce (jiného než člověka), do jehož zárodečné linie byl zaveden úsek heterologní DNA, jenž kóduje hemetopoetickou bílkovinu, jak se uvádí shora, přičemž savec produkuje hematopoetickou bílkovinu kódovanou řečeným úsekem DNA.

V jiném ohledu vynález poskytuje způsoby pro stimulaci produkce destiček v savci. Způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství hematopoetické bílkoviny vybrané ze skupiny sestávající z a) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196; b) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 173;

c) alelických variant a) a b); ad) druhových homologů a), b) nebo c), přičemž bílkovina stimuluje proliferaci a diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních prekursorů, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem.

Tyto a další.aspekty vynálezu budou objasněny s odkazy na následující podrobný popis a přiložené obrázky.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 je částečná restrikční mapa vektoru pDX. Použité symboly jsou: SV40 ori, počátek replikace z SV40; SV40 E, enhancer SV40; MLP, adenovirový hlavní pozdní promotor; Ll-3, adenovirová trojitá zaváděcí sekvence; ss, signály sestřihu; pA, místo polyadenylace.

Obrázek 2 ilustruje konstrukci plasmidu pBJ3. Použité symboly jsou: TPIp, promotor TPI1; TPIt, terminátor TPI1; AAT, a-1 antitrypsin cDNA; alfa, zaváděcí sekvence alfa-faktoru; mTPO, myší TPO kódující sekvence.

Podrobný popis vynálezu může být užitečné genů, jež vzniká kódovaný mutovaným

Před podrobným popisem tohoto vynálezu definovat určité pojmy zde používané.

Alelická varianta: Alternativní forma v důsledku mutace nebo pozměněný polypeptid genem. Mutace v genu může být mlčící (bez změny v kódovaném polypeptidu) nebo může kódovat polypeptidy mající pozměněnou aminokyselinovou sekvenci.

cDNA: Komplementární DNA, připravovaná reverzní transkripcí templátu messenger RNA, nebo klon nebo amplifikovaná kopie takovéto molekuly. Komplementární DNA může být jednovláknová nebo dvouvláknová.

Vektor exprese: Molekula DNA, lineární nebo cirkulární, která obsahuje úsek kódující bílkovinu, jež je předmětem zájmu, ve funkčním spojení s dalšími úseky, jež zajišťují jeho transkripci. Takovéto další úseky zahrnují promotorové a terminátorové sekvence, a mohou též zahrnovat jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selekčních markérů, enhancer, polyadenylační signál atd. Vektory exprese se obecně odvozují z plasmidové nebo virové DNA, a mohou obsahovat úseky z obou z nich. Výraz funkční spojení znamená, že úseky jsou uspořádány tak, že fungují společně v zamýšlených účelech, např. že transkripce začíná v promotoru a pokračuje přes kódující sekvenci k terminátoru.

Gen: Úsek chromosomální DNA, jenž kóduje polypeptidový řetězec. Gen obsahuje jednu nebo více oblastí kódujících aminokyseliny, jež jsou v některých případech proloženy nekódujícími ·’ intervenčními sekvencemi (introny), spolu s obklopujícími nekódujícími oblastmi, které zajišťují transkripci kódující sekvence.

Molekuly komplementární k: Polynukleotidové molekuly mající komplementární posloupnost baží a opačnou orientaci v porovnání s referenční sekvencí. Například: Sekvence 5' ATGCACGGG 3' je komplementární k 5' CCCGTCCAT 3'.

Promotor: Část genu, k němuž se váže polymerasa a kde je iniciována syntéza mRNA.

Jak je zmíněno shora, tento vynález poskytuje materiály a způsoby k použití v produkci bílkovin, majících hematopoetickou aktivitu. Jak se zde používá, výraz hernatopoetický znamená schopnost stimulovat proliferaci nebo diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních prekursorů, jak se stanovuje standardními testy. Viz například Metcalf, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:5327-5330, 1980; a Metcalf et al., Exp. Hewatol. 15:288-295, 1987. Typicky se buňky dřeně inkubují v přítomnosti testovaného vzorku a kontrolního vzorku. Kultury se pak hodnotí na proliferaci a diferenciaci buněk pomocí vizuálního prohlížení nebo barvení. Obzvlášť výhodný test je kolorimetrické stanovení s MTT podle Mosman («7. Iwwunol. Metli. 65: 55-63, 1983; zahrnuto zde odkazem), jež bude popsáno podrobněji v příkladech, jež následují.

Tento vynález je zčásti založen na objevu aktivity, která stimuluje růst buněk prostřednictvím MPL receptoru. Tento receptor (Souyri et al., Cell 63:1137-1147, 1990) byl před tímto objevem receptor sirotek, jehož přirozený ligand nebyl znám. V průběhu klonování a mutagenese, jež jsou podrobně popsány v Příkladech, které následují, vynálezci vyvinuli buněčnou linii závislou co do přežití a růstu na stimulaci dráhy spojené s MPL receptorem a schopnou autokrinní stimulace tohoto receptoru. U kondicionovaných médií těchto na interleukinu-3 (IL-3) nezávislých buněk se zjistilo, že podporují růst buněk exprimujících MPL receptor a jinak závislých na IL-3. Pokusy s protilátkovou neutralizací ukázaly, že tato aktivita nebyla spojena s IL-3 nebo IL-4 a že mohla být neutralizována rozpustnou formou MPL receptoru. Pak byla z IL-3 nezávislé buněčné linie připravena cDNA knihovna. DNA byla použita k transfekci křečcích ledvinných buněk (baby hamster kidney, BHK) a média transfektantů byla testována na schopnost stimulovat buněčnou proliferaci závislou na MPL. Byl izolován pozitivní klon a připraven rekombinantní MPL ligand. U rekombinantní bílkovině bylo nalezeno, že stimuluje proliferaci v širokém spektru myeloidních a lymfoidních prekursorů a obzvlášú že stimuluje produkci megakaryocytů a neutrofilů z progenitorních buněk v kostní dřeni. Navíc bylo nalezeno, že rekombinantní bílkovina stimuluje produkci destiček v pokusných zvířatech. S ohledem na tuto aktivitu byla tato bílkovina nazvána thrombopoietin (TPO).

Tento vynález poskytuje izolované polynukleotidové molekuly kódující thrombopoietin. Polynukleotidové molekuly užitečné v tomto ohledu zahrnují mRNA, genomovou DNA, cDNA, syntetickou DNA a DNA molekuly generované ligací fragmentů DNA z různých zdrojů. K produkci rekombinantního TPO jsou ve většině systémů exprese výhodné DNA molekuly bez intronů. Izolované je míněno tak, že molekuly jsou vyňaty ze svého přirozeného prostředí. Vynález tedy poskytuje DNA molekuly prosté jiných genů, s nimiž jsou normálně spojeny. Molekuly jsou obzvlášť: prosté nadbytečných a nežádoucích sekvencí, a jsou ve formě vhodné k použití v geneticko-inženýrském sytému produkce bílkoviny.

Sekvence cDNA klonů kódujících reprezentativní myší resp. lidské TPO bílkoviny jsou ukázány ve Vzorci III resp. Vzorci IV a odpovídající aminokyselinové sekvence jsou ukázány ve Vzorci I resp. Vzorci II. Ti, co jsou zběhlí v oboru rozpoznají, že sekvence ukázané ve Vzorcích I, II, III a IV, a genomické sekvence ukázané ve Vzorcích V a VII odpovídají jednotlivým alelám myšího nebo lidského genu a že se očekává existence alelických variací. Alelické variace DNA sekvencí ukázaných ve Vzorci III, Vzorci IV a Vzorci V, včetně těch, co obsahují mlčící mutace a těch, jejichž mutace vedou k záměnám aminokyselin, jsou v rozsahu tohoto vynálezu, jakož jsou i bílkoviny, které jsou alelickými variacemi Vzorce I a Vzorce II. Bude rovněž zřejmé, že ten, kdo je zběhlý v oboru může inženýrovat místa, která napomohou manipulaci nukleotidové sekvence, s použitím alternativních kodónů.

Myší a lidské sekvence zde zveřejněné jsou užitečnými nástroji pro přípravu izolovaných polynukleotidových molekul

své	sekvenci	obecně alespoň z 60	%,
% a	mohou být	z 90-95 % identické	se
IV	a jejich	alelickými variantami.

kódujících TPO bílkoviny z jiných druhů (druhové homology). Výhodné jsou takovéto druhové homology zahrnující savčí homology, jako jsou bovinní, psí, prasečí, ovčí, koňské, a obzvláště primáti bílkoviny. Metody pro využití sekvenční informace z jednoho druhu ke klonování odpovídající polynukleotidové sekvence z druhého druhu jsou v oboru dobře známé. Viz například Ausubel et al., vyd. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987. Molekuly DNA podle vynálezu kódující TPO jsou ve s výhodou alespoň z 8(

Vzorcem III a Vzorcem IV Thrombopoietinové molekuly jsou charakteristické svou schopností vázat se k MPL receptoru z téhož druhu a stimulovat produkci destiček in vivo. V normálních pokusných zvířatech je TPO schopný zvýšit hladinu destiček o 100 % nebo více během 10 dnů po začátku denního podávání.

Analýza distribuce mRNA ukázala, že mRNA kódující TPO byla přítomná v několika tkáních myši a člověka, a byla hojnější v plicích, játrech, srdci, kosterním svalu a ledvině. Pro izolaci homologů z jiných druhů se tedy připraví cDNA knihovna, s výhodou z jedné z tkání, u nichž se nalezla vysoká produkce mRNA. Způsoby přípravy cDNA knihoven jsou v oboru dobře známé. Viz například Sambrook et al., vyd., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, a odkazy tam citované. K detekci molekul kódujících TPO se pak knihovna testuje s myší nebo lidskou cDNA, zveřejněnou zde, nebo s jejich fragmenty nebo s jednou nebo více malými sondami založenými na zveřejněných sekvencích. Zvláště užitečné jsou sondy obsahující oligonukleotid alespoň o délce 14 nebo více nukleotidů až do 25 nebo více nuklotidů, jež jsou alespoň z 80 % identické s úsekem stejné délky ze Vzorce III, Vzorce IV, Vzorce V nebo jejich komplementární sekvence. Je výhodné testovat knihovnu při nízké hybridizační stringenci, t.j. asi 2 x SSC a hybridizační teplotě kolem 50’C za použití značených sond. Molekuly, s kterými sonda hybridizuje jsou detegovány s použitím standardních detekčních postupů. Pozitivní klony se potvrzují sekvenční analýzou a testy aktivity, jako je na schopnost vázat homologní MPL receptor (t.j. MPL receptor ze stejného druhu jako je cDNA) nebo na stimulaci hernatopoese z homologních dřeňových buněk.

Jak bude zřejmé tomu, kdo je zběhlý v oboru, lze použít i jiné klonovací metody.

Polynukleotidové molekuly kódující TPO (včetně alelických variant a duhových homologů molekul zde zveřejněných) lze také izolovat klonováním z buněčné linie, která produkuje MPL ligand a vykazuje autokrinní stimulaci růstu. Ve stručnosti: Faktor-dependentní buněčná linie se transfekuje k expresi MPL receptoru (Vigon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:5640-5644, 1992; Skoda et al., EMBO J. 12:2645-2653, 1993; a Vzorec VI), pak mutagenizuje a selektují se buňky nezávislé na faktoru. Tyto buňky se pak použijí jako zdroj TPO mRNA. Vhodné faktor-dependentní buněčné linie zahrnují IL-3-dependentní buněčnou linii BaF3 (Palacios a Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Methey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986),

FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64:786-790, 1984), a M07e (Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993). Buněčné linie závislé na růstovém faktoru mohou být založeny podle publikovaných metod (např. Greenberger et al., Leukemia Res. 8:363-375, 1984; Dexter et al., v Baum et al., vyd., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980). U typického postupu se buňky vyjmou z tkáně, o niž je zájem (např. kostní dřeň, slezina, fetální játra), a kultivují v konvenčním, sérem jako je RPMI 1640 doplněné 10 % fetálního (FBS), 15 % koňského séra a 10~⁶ M hydrokortisonem. V jedno- až dvoutýdenních intervalech se seberou neadherující buňky a ke kultuře se dá čerstvé médium. Sebrané neadherující buňky se promyjí a kultivují v médiu s přidaným zdrojem růstového faktoru (např. RPMI 1640 + 10 % FBS + 5-20 %

WEHI-3 kondicionovaného média jako zdroje IL3). Těmto buňkám se dává čerstvé médium v jedno- až dvoutýdenních intervalech a expandují se, jak kultura roste. Po několika týdnech až několika měsících jsou jednotlivé klony izolovány nanesením buněk na polotuhé médium (např. médium obsahující methylcelulosu), nebo pomocí limitujícího ředění. Závislost klonů na faktoru se potvrzuje kultivací jednotlivých klonů v nepřítomnosti růstového faktoru. Pro získání na růstovém faktoru závislých buněk ve vyšší frekvenci lze použít retrovirovou infekci nebo chemickou mutagenesu. Faktor-dependentní buňky se transfekují k expresi MPL receptoru, pak mutagenizují, jako např. chemickým působením, doplněném médiu, bovinního séra expozicí k ultrafialovému světlu, expozicí k rentgenovému záření, nebo retrovirovou inzerční mutagenesou. Mutagenizované buňky se pak kultivují za podmínek, kdy je přežití buněk závislé na autokrinní produkci růstového faktoru, tedy v nepřítomnosti exogenního faktoru(ů) vyžadovaného u rodičovských buněk. Produkce TPO se potvrzuje testováním, jako je testování kondicionovaných médií na buňkách exprimujcících a neexprimujících MPL receptor nebo testování aktivity kondicionovaných médií v přítomnosti rozpustného MPL receptoru a protilátek proti známým cytokinům.

Tento vynález také poskytuje izolované bílkoviny, jež jsou podstatné homologní s bílkovinami Vzorce I a Vzorce II a jejich druhovými homology. Izolovaná je myšleno tak, že bílkovina se nachází v podmínkách jiných než v přirozeném prostředí, jako je mimo krev a zvířecí tkáň. Ve výhodné formě je izolovaná bílkovina v podstatě prost jiných bílkovin, obzvláště jiných bílkovin zvířecího původu. Je s výhodou poskytnou bílkoviny ve vysoce vyčištěné formě, t.j. čistotě vyšší než 95 %, s výhodou vyšší než 99 %. Výraz podstatně homologní se zde používá k označení bílkovin majících 50 %, s výhodou 60 %, výhodněji alespoň 80 % sekvenční homologie se sekvencemi ukázanými ve Vzorci I nebo Vzorci II nebo jejich druhovými homology. Takovéto bílkoviny budou výhodněji z alespoň 90 % a nejvýhodněji z 95 % identické s Vzorcem I nebo Vzorcem II nebo jejich druhovými homology. Procento identity se určí konvenčními způsoby. Viz například Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992. Ve stručnosti: Dvě aminokyselinové sekvence se přiloží k sobě pro optimalizaci výsledku přiložení, s použitím pokuty za otevření mezery v hodnotě 10, rozšíření mezery v hodnotě 1, a hodnotící matrice blosum 62 Henikoffa a Henikoffa (ibid.). jak je ukázána v Tabulce 1 (aminokyseliny jsou označeny standardním jednopísměnkovým kódem). Procento identity se pak počítá jako:

Celkový počet shod x 100 [délka delší sekvence plus počet mezer zavedených do delší sekvence pro přiložení dvou sekvencí]

Tabulka 1

	A	R	N	D C	Q	E G H	I	L K	M	F P	S	T
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3 9
Q	-1	1	0	0 -3	5
E	-1	0	0	2 -4	2	5
G	0	-2	0	-1 -3	-2	-2 6
H	-2	0	1	-1 -3	0	0 “2 8
I	-1	-3	-3	-3 -1	-3	-3 -4 -3	4
L	-1	-2	-3	-4 -1	-2	-3 -4 -3	2	4
K	-1	2	0	-1 -3	1	1 -2 -1	-3	-2 5
M	-1	-1	-2	-3 -1	0	-2 -3 ~2	1	2 -1	5
F	-2	-3	-3	-3 “2	-3	-3 -3 -1	0	0 -3	0	6
P	-1	-2	-2	-1 -3	-1	-1 -2 -2	-3	-3 -1	-2	-4 7
S	1	-1	1	0 -1	0	0 0-1	-2	-2 0	—1	-2 -1	4
T	0	-1	0	-1 -1	-1	-1 “2 -2	-1	-1 -i	-1	-2 -1	1	5
W	-3	-3	-4	-4 -2	-2	-3 -2 -2	-3	-2 -3	-1	1 -4	-3	-2
Y	-2	-2	-2	-3 -2	-1	-2 -3 2	-1	-1 -2	-1	3 -3	-2	-2
V	0	-3	-3	-3 -1	-2	-2 -3 -3	3	1 2	1	-1 2	-2	0

W Y

V podstatě homologní bílkoviny jsou charakterizovány jako ty, jež mají jednu nebo více aminokyselinových záměn, delecí nebo adicí. Tyto změny jsou s výhodou menšího rázu, to je konzervativní záměny aminokyselin, jež výrazně neovlivní prostorové uspořádání a aktivitu bílkoviny (viz Tabulku 2); krátké delece, typicky jedné až asi 30 aminokyselin; a krátké Na C-koncové extenze, jako je N-koncový methioninový zbytek, malý spojovací peptid do asi 20-25 zbytků, nebo malá extenze, jež ulehčuje purifikaci, jako je polyhistidinový trakt, antigenní epitop nebo vazebná doména. Obecně viz Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991, což je zde zahrnuto odkazem.

Tabulka 2

Konzervativní záměny aminokyselin

Bazické:	arginin lysin histidin
Kyselé:	kyselina glutamová kyselina asparagová
Polární:	glutamin asparagin
Hydrofobní:	leucin isoleuicin valin
Aromatické:	fenylalanin tryptofan tyrosin
Malé:	glycin alanin serin threonin methionin

magnetická rezonance, Viz například de Vos et

Aminokyseliny podstatné pro aktivitu TPO mohou být identifikovány podle postupů známých v oboru, jako jsou cílená mutagenesa nebo mutagenesa alaninovým projížděním” (Cunningham a Wells, Science 244:1081-1085, 1989). V poslední jmenované technice se zavádějí jednotlivé alaninové mutace do každého zbytku molekuly a výsledné mutantní molekuly se testují na biologickou aktivitu (např. vazbu k receptoru, in vivo nebo in vitro proliferační aktivitu) k identifikaci aminokyselinových zbytků, které jsou kritické pro aktivitu molekuly. Místa interakce ligand-receptor mohou být rovněž stanoveny takovými technikami jako jsou nukleární krystalografie a fotoafinitní značení, al., Science 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol.

224:899-904, 1992; Wlodawer et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992.

Obecně se u cytokinů předpovídá struktura čtyř alfa-helixů, přičemž první a čtvrtý helix jsou nejdůležitější a jsou konzervovanější mezi členy této rodiny. S odkazem na aminokyselinovou sekvenci lidského TPO, ukázanou ve Vzorci II, porovnání sekvencí cytokinů napovídá, že tyto helixy jsou spojeny aminokyselinovými zbytky 29 a 53, 80 a 99 108 a 130, a 144 a 168 (rozhraní jsou + 4 zbytky). Rozhraní helixů myšího (Vzorec I) a dalších TPO, jiných než lidských, může být stanoveno přiložením k lidské sekvenci. Jiné důležité strukturní aspekty TPO zahrnují cysteinové zbytky v pozicích 51, 73, 129 a 195 ze Vzorce I (odpovídající pozicím 28, 50, 106 a 172 ze Vzorce II).

Navíc mohou být bílkoviny podle vynálezu (nebo jejich polypeptidové fragmenty) spojeny s jinými bioaktivními molekulami, obzvlášt s jinými cytokiny, za poskytnutí multifunkčních molekul. Například: C-koncová doména thrombopoietinu může být spojena s jinými cytokiny k zesílení biologických vlastností nebo účinnosti produkce. Molekula thrombopoietinu se zdá být složena ze dvou domén. První (aminokoncová) doména přibližně 150 aminokyselin je podobná co do velikosti a připomíná co do struktury erythropoietin a jiné hematopoetické cytokiny. Za první doménou je druhá doména přibližně 180 aminokyselin, která má strukturu, jež není významné podobná žádné ze známých bílkovinných struktur v databázích. Tato druhá doména je vysoce obohacena na N-vazebná glykosylační místa a na zbytky šeřinu, threoninu a prolinu, jež jsou znameními

O-vazebných glykosylačních míst. Takto předpokládaný vysoký obsah cukrů napovídá, že tato doména má svou roli v tom, že činí hydrofobní první doménu poměrně rozpustnější. Experimentální důkazy prokazují, že cukr spojený s druhou doménou je zapojen do správného nitrobuněčného skládání a sekrece bílkoviny v průběhu biosyntézy. Druhá doména může také mít roli v stabilizaci první domény proti proteolytické degradaci nebo v prodloužení in vivo poločasu molekuly, a může potencovat přenos biologického signálu nebo specifickou aktivitu bílkoviny.

Předkládaný vynález tedy poskytuje sérii nových, hybridních molekul, v nichž je druhá doména TPO spojena s druhým cytokinem. Je s výhodou připojit C-koncovou doménu TPO k C-konci druhého cytokinu. Spojení se s výhodou provede manipulací na úrovni DNA pro zajištění exprese chimérních molekul v rekombinantních systémech produkce. Výsledné molekuly se pak testují na takové vlastnosti jako je zlepšená rozpustnost, prodloužený poločas, nebo zlepšené hladiny exprese a sekrece, a farmakodynamika. Konkrétní příklady takovýchto chimérních molekul zahrnují ty, v nichž je druhá doména TPO připojena k C-konci EPO, G-CSF, GM-CSF, XL-6, IL-3 nebo IL-11. Jak se poznamenává výše, toto se vhodně provádí pomocí fuze DNA. Fúzovaná DNA se pak subklonuje do vhodného vektoru exprese a transformuje nebo transfekuje do hostitelských buněk nebo organismů konvenčními metodami. Výsledné fúzované bílkoviny se čistí s použitím konvenčních chromatografických purifikačních technik (např. chromatografických technik), a jejich vlastnosti se porovnávají s vlastnostmi nativního, nefuzovaného, rodičovského cytokinu. Takovéto hybridní molekuly mohou mezi bílkovinnými nebo polypeptidovými součástmi navíc obsahovat další aminokyselinové zbytky (například polypeptidovou spojku).

Navíc k hernatopetickým bílkovinám zveřejňovaným shora, tento vynález zahrnuje fragmenty těchto bílkovin a polynukleotidové molekuly, které kódují tyto fragmenty. Předmětem zvláštního zájmu jsou fragmenty délky alespoň 10 aminokyselin, jež se váží k MPL receptorů, a polynukleotidové molekuly délky alespoň 30 nukleotidů, jež kódují takovéto polypeptidy. Polypeptidy tohoto typu se identifikují známými metodami vyhledávání, jako je pomocí digesce intaktní bílkoviny nebo syntézou malých, překrývajících se peptidů nebo polynukleotidů (a expresí posledně jmenovaných), případně ve spojení s technikami strukturní analýzy, uváděnými shora. Výsledné polypeptidy se pak testují na schopnost specificky vázat MPL receptor a stimulovat buněčnou proliferaci prostřednictvím MPL receptoru. Vazba se stanovuje konvenčními metodami, jako jsou ty, co zveřejňuje Klotz, Science 217: 1247, 1982 (Scatchardova analýza). Ve stručnosti: Radioaktivně značený testovaný polypeptid se inkubuje s buňkami nesoucími MPL receptor v přítomnosti zvyšující se koncentrace neznačeného TPO. Značený polypeptid vázaný k buňkám se oddělí od volného značeného polypeptidu centrifugací přes ftalátový olej. Vazebná afinita testovaného polypeptidu se stanoví vynesením podílu vázané značky k volné značce na svislé ose proti vázané značce na vodorovné ose. Vazebná specifita se stanoví kompeticí s cytokiny jinými než TPO. Vazbu k receptoru lze stanovit také srážením testované sloučeniny imobilizovaným MPL receptorem (nebo jeho ligand-vážící doménou). Ve stručnosti: Receptor nebo jeho část se imobilizují na nerozpustné podložce. Testovaná sloučenina se označí, např. metabolickým značením hostitelských buněk v případě rekombinantní testované sloučeniny, nebo konvenčními in vitro značkovacími metodami (např. radiojodací). Značená sloučenina se pak přidá k imobilizovanému receptoru, nenavázaný materiál se odstraní, a deteguje se vázaná značená sloučenina. V oboru jsou známy způsoby detekce pro řadu značek. Stimulace proliferace se vhodné stanovuje s použitím MTT kolorimetrického testu s buňkami nesoucími MPL receptor. Polypeptidy se testují na aktivitu při různých koncentracích, typicky v rozsahu 1 nM až 1 mM.

Poskytnuty jsou rovněž větší polypeptidy až do 50 nebo více zbytků, s výhodou 100 nebo více zbytků, výhodněji asi 140 nebo více zbytků, až do velikosti celé maturní bílkoviny. Například: Analýza a modelování sekvence ukázané ve Vzorci I od zbytku 51 po zbytek 195, včetně, nebo ve Vzorci II od zbytku 28 po zbytek 172, včetně, napovídají, že tyto části molekul jsou domény podobné cytokinům a schopné samostatného skládání. Zajímavé jsou také molekuly obsahující tuto základní cytokinu-podobnou doménu plus jeden nebo více dalších úseků nebo domén primárního translačního produktu. Jiné polypeptidy, jež jsou tedy předmětem zájmu, jsou shrnuty v Tabulce 3.

- 17 Tabulka 3

Myší TPO (Vzorec I)

Cys (zbytek 51)—Val (zbytek 196) Cys (51)—Pro (206)

Cys (51)—Thr (379)

Ser (45)—Cys (195)

Ser (45)—Val (196)

Ser (45)—Pro (206)

Ser (45)—Thr (379)

Met (24)—Cys (195)

Met (24)—Val (196)

Met (24)—Pro (206)

Met (24)—Thr (379)

Met (1)—Cys (195)

Met (1)—Val (196)

Met (1)—Pro (206)

Met (1)—Thr (379)

Lidský TPO ( Vzorec II)

Cys (28)—Val (173)

Cys (28)—Arg (175)

Cys (28)—Gly (353)

Ser (22)—Cys (172)

Ser (22)—Val (173)

Ser (22)—Arg (175)

Ser (22)—Gly (353)

Met (1)—Cys (172)

Met (1)—Val (173)

Met (1)—Arg (175)

Met (1)—Gly (353)

Ti, co jsou zběhlí v oboru, rozeznají, že intermediární formy těchto molekul (např. ty, které mají C-konce mezi zbytky 196 a 206 Vzorce I nebo ty, které mají N-konce mezi zbytky 22 a 28 Vzorce II) jsou také předmětem zájmu, stejně jako polypeptidy mající jednu nebo více aminokyselinových záměn, delecí, inzercí, nebo N- a C-koncové extenze, uváděné výše. Předkládaný vynález tedy poskytuje hematopoetická polypeptidy o alespoň 10 aminokyselinových zbytcích, s výhodou o alespoň 50 zbytcích, s výhodněji o alespoň 100 zbytcích, a nejvýhodněji o alespoň asi 140 zbytcích délky, kde řečené polypeptidy jsou v podstatě homologní s polypeptidy o podobné délce ze Vzorce I nebo Vzorce II.

Bílkoviny podle tohoto vynálezu mohou být produkovány v buňkách upravených genetickým inžernýrstvím podle konvenčních technik. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou ty, které mohou být transformovány nebo transfekovány exogenní DNA a pěstovány v kultuře, a zahrnují bakterie, buňky hub, a kultivované buňky vyšších eukaryotů. Techniky pro manipulaci klonované DNA a pro zavádění exogenní DNA do řady hostitelských buněk jsou popsány Sambrookem et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a Ausubelem et al., ibid., což je zde zahrnuto odkazem.

Obecně je DNA sekvence kódující bílkovinu podle vynálezu funkčně spojena s promotorem a terminátorem transkripce ve vektoru exprese. Vektor běžné obsahuje jeden nebo více selekčních nebo více počátků replikace, i když ti, co jsou rozpoznají, že v určitých systémech mohou být selekční markéry poskytnuty na oddělených vektorech a že replikace exogenní DNA může být zajištěna pomocí integrace do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, vektorů a jiných prvků je záležitostí rámci úrovně obyčejné zběhlosti v oboru.

V literatuře je popsáno mnoho takovýchto prvků, a tyto jsou dostupné od komerčních dodavatelů.

Pro směrování bílkoviny podle vynálezu do sekreční dráhy hostitelských buněk se ve vektoru exprese zajišůuje sekreční signální sekvence (známá rovněž jako zaváděcí sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence). Sekreční signální sekvence se připojuje k DNA sekvenci, kódující bílkovinu podle vynálezu, ve markérů a jeden zběhlí v oboru selekčních markérů, rutinního návrhu v jsou zveřejněny například Kawasaki et al., US patent

870 008; Welch et al., US správném čtecím rámci. Sekreční signální sekvence se běžně umísťují v 5' směru od DNA sekvence kódující bílkovinu, o niž je zájem, i když určité signální sekvence mohou být umístěny jinde v DNA sekvenci, jež je předmětem zájmu (viz např. Welch et al., US patent č. 5 037 743; Holland et al., US patent č. 5 143 830). Sekrečními signálními sekvencemi mohou být ty, jež jsou normálně spojeny s bílkovinou podle vynálezu nebo mohou být z genu kódujícího jinou secernovanou bílkovinu.

Kvasinkové buňky, obzvláště buňky rodu Saccharomyces, jsou výhodným hostitelem pro použití v rámci tohoto vynálezu. Způsoby transformace kvasinkových buněk exogenní DNA a produkce rekombinantních bílkovin z nich v Kawasaki, US patent č. 4 599 311; č. 4 931 373; Brake, US patent č.

patent č. 5 037 743; a Murray et al., US patent č. 4 845 075, což je zde zahrnuto odkazem. Transformované buňky se selektují podle fenotypu určeného selekčním markérem, běžně resistencí k léčivu nebo schopností růst v nepřítomnosti zvláštní výživné složky (např. leucinu). Výhodným vektorovým systémem pro použití v kvasinkách je vektorový systém POTÍ, zveřejněný Kawasakim et al. (US patent č. 4 931 373), jenž umožňuje selekci transformovaných buněk pomocí růstu na médiích obsahujících glukosu. Výhodná sekreční signální sekvence pro použití v kvasinkách je signální sekvence genu MFal S. cerevisiae (Brake et al., US patent č. 4 546 082). Vhodné promotory a terminátory pro použití v kvasinkách zahrnují promotory a terminátory genů glykolytických enzymů (viz např. Kawasaki, US patent č. 4 599 311; Kingsman et al., US patent č. 4 615 974; a Bitter, US patent č. 4 977 092, jež jsou zde zahrnuty odkazem) a genů alkoholdehydrogenásy. Viz též US patenty č. 4 900 446, 5 063 154, 5 139 936 a 4 661 454. Systémy transformace pro jiné kvasinky včetně Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago mydis, Pichia pas toris, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou v oboru známy. Viz například Gleason et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 a Cregg, US patent č. 4 882 279.

Buňky jiných hub jsou rovněž vhodné jako hostitelské buňky. Například: Buňky Aspergillus lze použít podle metod McKnighta et al., US patent č. 4 935 349, jenž je zde zahrnut odkazem. Způsoby transformace Acremonium chrysogenum jsou zveřejněny Suminoem et al., US patent č. 5 162 228, jenž je zde zahrnut odkazem. Způsoby transformace Neurospora jsou zveřejněny Lambowitzem, US patent č. 4 486 453, jenž je zde zahrnut odkazem.

Kultivované savčí buňky jsou rovněž výhodným hostitelem pro použití v rámci tohoto vynálezu. Způsoby zavádění exogenní DNA do savčích buněk zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler at al., Cell 14:725, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham a Van de Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporaci (Neumann et al., EMBO-J. 1:841-845, 1982) a transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), což je zde zahrnuto odkazem. Produkce rekombinantních bílkovin v savčích buňkách je zveřejněna například Levinsonem, US patent č. 4 713 339; Hagenem et al., US patent č. 4 784 950; Palmiterem et al., US patent č. 4 579 821 a Ringoldem, US patent č. 4 656 134), což je zde zahrnuto odkazem. Výhodné kultivované savčí buňky zahrnují COS-1 (ATCC č. CRL 1650), COS-7 (ATCC Č. CRL 1651), BHK (ATCC Č. CRL 1632), BHK 570 (ATCC č. CRL 10314), 293 (ATCC č. CRL 1573); Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) a buněčné linie vaječníků čínského křečka (např. CHO-K1, ATCC č. CCL 61). Další vhodné buněčné linie jsou v oboru známé a jsou dostupné z veřejných depozitářů jako je American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Obecné jsou výhodné silné transkripční promotory, jako jsou promotory z SV-40 nebo cytomegaloviru. Viz např. US patent č. 4 956 288. Jiné vhodné promotory zahrnují promotory metalothioneinových genů (US patenty č. 4 579 821 a 4 601 978, které jsou zde zahrnuty odkazem) a adenovirový hlavní pozdní promotor.

K selekci kultivovaných savčích buněk, do nichž byla zavedena cizí DNA se běžně používá resistence k léčivům. Na takovéto buňky se běžně odkazuje jako na transfektanty. Na buňky, které se kultivují v přítomnosti selekčního činidla a které jsou schopné přenést gen, jenž je předmětem zájmu, do progenní populace, se odkazuje jako na stabilní transfektanty. Výhodným selektovatelným markérem je gen kódující resistenci k antibiotiku neomycinu. Selekce se provádí v přítomnosti léčiva neomycinového typu, jako je G-418 nebo podobné. Selekční systémy lze použít též ke zvýšení hladiny exprese genu, o nějž je zájem: Na tento postup se odkazuje jako na amplifikaci”. Amplifikace se provádí kultivováním transfektantů v přítomnosti nízké hladiny selekčního činidla k selekci buněk,, které produkují vysoké hladiny produktů zavedených genů. Výhodným amplifikovatelný selektovatelným markérem je dihydrofolátreduktasa, které vyznačuje resistenci k methotrexátu. Lze používat i jiné geny resistence k léčivům (např. resistence k hygromycinu, multi-drogové resistence a puromycin acetyltransferasy).

Jako hostitele lze použít i jiné buňky vyšších eukaryotů, včetně hmyzích, rostlinných a ptačích buněk. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích bílkovin v nich je zveřejněna Guarinem et al., US patent č. 5 162 222; Bangem et al., US patent č. 4 775 624; a WIPO publikaci č. 94/06463, které jsou zde zahrnuty odkazem. Použití Agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresi genů v rostlinných buňkách bylo shrnuto v přehledu Sinkarem et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987.

Výhodné prokaryotické hostitelské buňky pro provádění tohoto vynálezu jsou kmeny bakterie Escherichia coli, i když užitečným je také Bacillus a jiné rody. Techniky transformace těchto hostitelů a exprese sekvencí cizích DNA klonovaných do nich jsou v oboru dobře známé (viz např. Sambrook et al., ibid.). Když se bílkoviny exprimují v bakteriích jako je E. coli, bílkovina může zůstávat v cytoplazmě, typicky jako může být bakteriální sekreční periplazmatického prostoru. V prvně jmenovaném lyžují, tělíska se shromáždí a zděnaturují guanidin isithiokyanátu. Denaturované bílkoviny se pak podrobí novému skládání struktury pomocí zředění denaturačního činidla. V druhém jmenovaném případě se mohou bílkoviny získat z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě pomocí rozrušení buněk (pomocí např. sonikace nebo osmotického šoku) za uvolnění obsahu periplazmatického prostoru a získání bílkoviny.

Transformované nebo transfekované hostitelské buňky se kultivují podle konvenčních postupů v kultivačním médiu obsahujícím složky výživy a další složky potřebné pro růst zvolených hostitelských buněk. V oboru je známa řada vhodných médií, včetně definovaných médií a komplexních médií: Obecně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, nerozpustná tělíska, nebo sekvencí směrována do případě se buňky s použitím např.

vitaminy a minerály. Média mohou podle potřeby také obsahovat takové složky, jako jsou růstové faktory nebo sérum. Růstovým médiem se obecně selektují buňky obsahující exogenně přidanou DNA, pomocí např. selekce s léčivem nebo deficience na esenciální výživnou složku, která je doplněna selektovatelným markérem, neseným vektorem exprese, nebo kotransfekovaným do hostitelské buňky.

V rámci tohoto vynálezu se může k produkci TPO použít technologie transgenních zvířat. Je s výhodou produkovat bílkoviny v mléčných žlázách samičího hostitelského zvířete. Exprese v mléčné žláze a následná sekrece bílkoviny, jež je předmětem zájmu, do mléka, obchází mnohé potíže, s nimiž se střetává izolace bílkovin z jiných zdrojů. Mléko se snadno shromažduje, je dostupné ve velkých množstvích a je dobře biochemicky charakterizováno. Navíc: Hlavní bílkoviny mléka jsou v mléce přítomné ve vysokých koncentracích (od asi 1 do 15 g/1).

Z komerčního hlediska je jasně výhodné použití hostitele takového druhu, jenž má vysoký výtěžek mléka. I když lze použít menších zvířat, jako jsou myši a potkani, (a lze je preferovat ve stádiu ověřování koncepce), v rámci tohoto vynálezu je výhodné použít hospodářská zvířata včetně, ale bez omezení, prasat, koz, ovcí a hovězího dobytka. Ovce jsou obzvlášť výhodné pro takové faktory jako je dřívější historie transgenese s tímto druhem, výtěžek mléka, náklady a běžná dostupnost zařízení pro sběr ovčího mléka. Pro porovnání faktorů ovlivňujících výběr hostitelského druhu viz WIPO publikaci WO 88/00239. Obecně je žádoucí vybrat plemeno hostitelského zvířete, jež bylo vyšlechtěno pro mlékárenské účele, jako je východně-frízská ovce, nebo zavést mlékárenský základ šlechtěním transgenní linie v pozdějším termínu. V každém případě se musí používat zvířata se známým, dobrým zdravotním stavem.

Pro získání exprese v mléčné žláze se používá transkripční promotor z genu mléčné bílkoviny. Geny mléčných bílkovin zahrnují geny kódující kaseiny (US patent č. 5 304 489, jenž je zde zahrnut odkazem), beta-laktoglobulin, α-laktalbumin a kyselou bílkovinu syrovátky. Výhodný je promotor beta-laktoglobulinu (BLG). V případě promotoru genu ovčího beta-laktoglobulinu se obecné použije oblast alespoň proximálních 460 bp ze sekvence 5' přilehlé ke genu, i když jsou výhodné větší části 5' přilehlé

Transgenic Res. 1; V tomto ohledu je sekvence, jako je -4,25 kb úsek DNA, obsahující 5' přilehlý promotor s nekódující část beta-laktoglobulinového genu. Viz Whitelaw et al., Biochem. J. 286:31-39, 1992. Vhodné jsou také podobné úseky promotorové DNA z jiných druhů.

Do konstruktů mohou být začleněny také jiné oblasti beta-laktoglobulinového genu, jako jsou genomové oblasti genu, jenž má být exprimován. Obecně se v oboru uznává, že například konstrukty bez intronů se exprimují špatně ve srovnání s těmi, jež takovéto sekvence DNA obsahují (viz Brinster et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 85:836-840, 1988; Palmiter et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 88:478-482, 1991; Whitelaw et al.,

3-13, 1991; WO 89/01343; WO 91/02318).

obecně výhodné použít tam, kde to lze, genomické sekvence obsahující všechny nebo některé z přirozených intronů genu kódujícího bílkovinu nebo polypeptid, jež jsou předmětem zájmu, a tedy je výhodné vložení alespoň některých intronů např. z beta-laktoglobulinových genů. Jednou takovouto oblastí je úsek DNA, jenž zajištuje sestřih intronů a RNA polyadenylace z 3' nekódující oblasti ovčího betalaktoglobulinového genu. Když je náhradou přirozených 3' nekódujících sekvencí, může tento ovčí beta-laktoglobulinový úsek zvyšovat a stabilizovat hladiny exprese bílkoviny nebo polypeptidu, o něž je zájem. V rámci jiných provedení se oblast obklopující iniciační ATG v TPO sekvenci nahradí odpovídajícími sekvencemi z genů pro specifické mléčné bílkoviny. Takováto náhrada zajištuje podmínky putativní tkáňově specifické iniciace pro zvýšení exprese. Je vhodné nahrazovat úplné pre-pro a 5' nekódující sekvence sekvencemi například z BLG, i když lze nahrazovat menší oblasti.

Pro expresi TPO v transgenních zvířatech se úsek DNA kódující TPO funkčně spojí s dalšími úseky DNA, potřebnými pro jeho expresi a k tvorbě jednotek exprese. Takovéto další úseky zahrnují shora zmiňovaný promotor, jakož i sekvence pro terminaci transkripce a polyadenylaci mRNA. Jednotky exprese dále zahrnou úsek DNA kódující sekreční signální sekvenci, funkčně spojený s úsekem kódujícím TPO. Sekreční signální sekvencí může být nativní TPO sekreční signální sekvence nebo sekvence z jiné bílkoviny, jako je mléčná bílkovina. Viz například von Heinje,

Nucl. Acids Res. 14:4683-4690, 1986; a Meade et al., US patent č. 4 873 316, jež jsou zde zahrnuty odkazem.

Konstrukce jednotek exprese k použití v transgenních zvířatech se vhodně provede inzercí TPO sekvence do plasmidového nebo fágového vektoru, obsahujícího další úseky DNA, i když jednotka exprese může být zkonstruována v podstatě ligacemi v jakékoli posloupnosti. Obzvlášť vhodné je zajistit vektor obsahující úsek DNA, kódující mléčnou bílkovinu a nahradit kódující sekvenci mléčné bílkoviny sekvencí, kódující TPO polypeptid, a takto vytvořit genovou fúzi, jež obsahuje sekvence řídící expresi genu mléčné bílkoviny. V každém případě umožňuje klonování jednotek exprese v plasmidech nebo jiných vektorech amplifikaci TPO sekvence. Je vhodné provádět amplifikaci v bakteriálních (např. E. coli) hostitelských buňkách, takže vektory typicky obsahují počátek replikace a selektovatelný markér, jež jsou funkční v bakteriálních hostitelských buňkách.

Jednotka exprese se pak zavede do oplodněných vajíček (včetně embryí ranného stádia) vybraného hostitelského druhu. Zavedení heterologní DNA lze dosáhnout jednou z několika cest, včetně mikroinjekcí (např. US patent č. 4 873 191), retrovirové infekce (Jaenisch, Science 240:1468-1474, 1988) nebo řízené integrace s použitím embryonálních kmenových (ES) buněk (přehled Bradley et al., Bio/Technology 10:534-539, 1992). Vajíčka se pak implantují do vejcovodů nebo děloh pseudopregnantních samiček a nechají se vyvíjet k vrhu. Potomstvo nesoucí zavedenou DNA ve své zárodečné linii může přenášet tuto DNA do své progenní populace normálním Mendelovským způsobem, což umožňuje vývoj transgenních stád.

Obecné postupy produkce transgenních zvířat jsou v oboru známy. Viz například Hogan et al., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:844-867, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32:645-651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 9: 835-838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120, 1992; US patenty č. 4 873 191 a 4 873 316; WIPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; a GB 87/00458, což je zde zahrnuto odkazem. Techniky pro zavedení sekvencí cizí DNA do savců a jejich zárodečných buněk byly vyvinuty v myších. Viz např.

Gordon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:7380-7384, 1980; Gordon a Ruddle, Science 214:1244-1246, 1981; Palmiter a Brinster, Cell 41:343-345, 1985; Brinster et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985; a Hogan et al., (ibid.). Tyto techniky byly následně adaptopvány k použití na větších zvířatech, včetně hospodářských zvířat (viz např. WIPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; Simons et al., Bio/Technology 6:844-867, 1988). Ve shrnutí: V nejúčinnějších dosavadních cestách pro vytvoření transgenních myší nebo hospodářských zvířat se injikuje několik set lineárních molekul DNA, jež je předmětem zájmu, do jednoho z pro-jader oplodněného vajíčka pomocí technik, jež se staly standardními v oboru. Lze použít i injekci DNA do cytoplazmy nebo zygoty.

Lze používat také produkci v transgenních rostlinách. Exprese může být zobecněná nebo řízená ke konkrétnímu orgánu, jako je hlíza. Viz Hiatt, Nátuře 344:469-479, 1990; Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453, 1992; Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221, 1990; a publikace Evropského patentového úřadu EP 255 378.

TPO připravený podle tohoto vynálezu je čištěn s použitím metod obecně známých v oboru, jako je afinitní purifikace a separace založené na velikosti, náboji, rozpustnosti a jiných vlastnostech této bílkoviny. Když se bílkovina produkuje v kultivovaných savčích buňkách je s výhodou kultivovat buňky v bezsérovém kultivačním médiu, aby se omezilo množství kontaminující bílkoviny. Médium se sbírá a frakcionuje. Výhodné metody frakcionace zahrnují afinitní chromatografii na konkavalinu A nebo jiném lektinu, a takto se využije cukr přítomný na bílkovině. Bílkoviny lze rovněž čistit s použitím imobilizované bílkoviny MPL receptoru nebo jeho části vážící ligand nebo s použitím afinitní značky [tag] (např. polyhis^tidinu, substance P nebo jiného polypeptidu nebo bílkoviny, pro níž je dostupná protilátka nebo jiné specificky se vážící činidlo). Mezi bílkovinou, o niž je zájem, a finitní značkou může být zajištěno specifické štěpící místo.

Bílkoviny tohoto vynálezu mohou být terapeuticky použity všude, kde je to žádoucí pro zvýšení proliferace buněk kostní dřené, jako je tomu v léčbě cytopenie, jako je cytopenie vyvolaná aplastickou anemií, myelodysplastickými syndromy, chemoterapií nebo kongenitální cytopenií; u pacientů s transplantací kostní dřené; u pacientů s transplantací kmenových buněk periferní krve; a v léčbě stavů, které způsobují selhání kostní dřeně, jako je myelodysplastický syndrom. Tyto bílkoviny jsou rovněž užitečné ke zvyšování tvorby destiček, jako je v léčbě thrombocytopenie. Thrombocytopenie je spojena s různorodou skupinou chorob a klinických situací, které mohou působit samostatně nebo společně k vytvoření tohoto stavu. Snížené počty destiček mohou vznikat například z poruch tvorby destiček (z příčin např. vrozených vad jako je Fanconiho syndrom, syndrom thrombocytopenia absent radii, Wiskott Aldrich, Mayova Hegglinova anomálie, Bernard-Soulierův syndrom, minneapoliský syndrom, Epsteinův syndrom, montreálský destičkový syndrom a Ecksteinův syndrom), abnormální distribuce destiček, ztrát ředěním z příčin masivních transfuzí, rozkladu destiček, nebo abnormálního odstraňování destiček ve slezinách hypersplenických pacientů (např. z příčin cirrhosy nebo kongestivního srdečního selhání). Například; Chemoterapeutická léčiva používaná v nádorové terapii mohou potlačovat vývoj progenitorních buněk destiček v kostní dřeni, a výsledné thrombocytopenie omezuje chemoterapii a může přinášet nutnost transfuzí. Navíc mohou určité neoplasie narušovat tvorbu a distribuci destiček. Radiační terapie, jež se používá k zabití maligních buněk zabíjí také progenitorní buňky destiček. Thrombocytopenie muže vznikat též z různých autoimunních poruch destiček, indukovaných léčivy, neonatální imunitou, transfúzní alloimunitou destiček a virovou infekcí (včetně HIV). Bílkoviny podle tohoto vynálezu mohou snižovat nebo odstraňovat potřebu transfúzí, a takto snižovat incidenci destičkové alloimunity. Abnormální rozklad destiček může být výsledkem: 1) zýšené spotřeby destiček ve vaskulárních štěpech nebo traumatizované tkáni, nebo 2) imunitního mechanismu, spojeného například s thrombocytopenií indukovanou léčivy, idiopatickou throbocytopenickou purpurou (ITP), autoimunitní chorobou, hernatologickými poruchami a lymfomem nebo metastázující rakovinou, zahrnující kostní dřeň. Jiné indikace pro bílkovinu tohoto vynálezu zahrnují aplastickou anémii a léčivy indukované potlačení dřeně, jako následku, například, chemoterapie nebo léčby infekce HIV pomocí AZT.

Thrombocytopenie se projevuje jako zvýšené krvácení, jako je slizničné krvácení z oblasti nosu a úst nebo gastrointestinálního traktu, nebo mokvání z ran, vředů a míst injekcí.

K farmaceutickému použití se bílkoviny tohoto vynálezu formulují podle konvenčních metod pro parenterální, obzvláště intravenozní nebo subkutánní podávání. Intravenozní podávání bude injekcí nebo infuzí s typickou periodou jedné až několika hodin. Obecně budou farmaceutické prostředky obsahovat hematopoetickou bílkovinu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je solný roztok, pufrovaný solný roztok, 5 % dextrosa Ve vodě a podobně. Prostředky mohou navíc obsahovat jeden nebo více excipientů, konzervační látky, solubilizéry, pufrační činidla, albumin k zábraně ztrát bílkoviny na povrchu ampule, atd. Navíc mohou být hematopoetické bílkoviny tohoto vynálezu kombinovány s jinými cytokiny, obzvlášť rychle působícími cytokiny jako je faktor kmenových buněk, IL-3, IL-6, IL-11 nebo GM-CSF. Když se používá takováto kombinovaná léčba, cytokiny mohou být kombinovány v jednom přípravku nebo mohou být podávány v oddělených přípravcích. Způsoby formulace jsou dobře ‘známé v oboru a jsou zveřejněné například v Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, vyd., Mek Publishing Co., Easton PA, 1990, což je zde zahrnuto odkazem. Terapeutické dávky budou obecně v rozsahu 0,1 až 100 μg/kg váhy pacienta za den, s výhodou 0,5 až 20 μg/kg za den, s tím, že přesnou dávku stanoví klinik podle zavedených standardů, s ohledem na povahu a vážnost stavu, jež se léčí, pacientovu minulost atd. Stanovení dávky je na úrovni obvyklé zběhlosti v oboru. Bílkoviny se běžně podávají v průběhu období až 28 dní následujících po chemoterapii nebo transplantaci kostní dřeně nebo dokud se nedosáhne počet destiček > 20 000/mm³, s výhodou > 50 000/mm³. Běžněji se bílkoviny podávají v průběhu jednoho týdne nebo kratčeji, často během období jednoho až tří dnů. Obecně je terapeuticky účinným množstvím TPO množství dostatečné k vyvolání klinicky významného vzrůstu proliferace nebo diferenciace myeloidních nebo lymfoidních progenitorních buněk, jenž se projeví zvýšením hladin maturních buněk (např. destiček nebo neutrofilů) v oběhu. Léčba poruch destiček bude tedy trvat dokud se nedosáhne počet destiček alespoň 20 000/mm , s výhodou 50 000/mm³. Bílkoviny tohoto vynálezu mohou být také podávány v kombinaci s jinými cytokiny, jako IL-3, -6 a -11 faktor kmenových buněk, erythropoietin, G-CSF a GM-CSF. u režimů kombinované léčby budou obecně tyto denní dávky jiných cytokinů: EPO < 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 μg/kg; IL-3, 1-5 μg/kg; a G-CSF, 1 - 25 μg/kg. Kombinovaná léčba s EPO je například indikována u anemických pacientů s nízkými hladinami EPO.

Bílkoviny tohoto vynálezu jsou také cennými nástroji pro in vitro studie diferenciace a vývoje hernatopoetických bunék, jako je pro objasňování mechanismů buněčné diferenciace a pro stanovování rodokmenů maturních buněk; uplatnění mohou nalézt rovněž jako proliferativní činidlo v tkáňových kulturách.

Bílkoviny tohoto vynálezu mohou být rovněž používány ex vivo, jako v autologních kulturách kostní dřeně. Ve stručnosti: Kostní dřeň se pacientovi odebere před chemoterapií a zpracuje se s TPO, případně v kombinaci s jedním nebo více jiných cytokinů. Opracovaná dřeň se pak po chemoterapii vrátí pacientovi k urychlení nápravy dřeně. Navíc mohou být bílkoviny tohoto vynálezu používány také pro ex vivo expanzi progenitorních buněk dřeně nebo periferální krve (PBPC). Před chemoterapeutickou být dřeň stimulována faktorem kmenových buněk (SCF) k uvolnění progenitorních buněk do periferálního progenitory mohou být sebrány a zkoncentrovány krve a pak zpracovány v kultuře s TPO, případně jedním nebo více cytokiny, včetně, ale bez omezení, IL-3, GM-CSF, IL-6 nebo IL-11, k diferenciaci na megakaryocytové kultury o vysoké hustotě, jež být vráceny pacientovi po vysoce dávkované léčbou může nebo G-CSF oběhu. Tyto z periferální v kombinaci s SCF, G-CSF, a proliferaci pak mohou chemoterapii.

Poskytnuty jsou také protilátky, které váží epitopy na bílkovinách tohoto vynálezu. Takovéto protilátky mohou být produkovány řadou prostředků, známých v oboru. Produkce monoklonálních protilátek jiných než lidských je dobře známa a může být prováděna například imunizací zvířete, jako je myš, potkan, králík, koza, ovce nebo morče, rekombinantním nebo syntetickým TPO nebo jejich vybranými polypeptidovými fragmenty. Výhodné je imunizovat zvíře vysoce purifikovanou bílkovinou či polypeptidovým fragmentem. Výhodné je také podávat bílkovinu nebo polypeptid v kombinaci s adjuvans, jako je Freundovo adjuvans, ke zvýšení imunitní odezvy. I když k indukci produkce protilátky ve zvířeti může postačovat jediná injekce antigenu, obecně je výhodné podávat velkou počáteční injekci následovanou jednou nebo více booster injekcemi v období několika týdnů až několika měsíců. Viz např. Hurrell, vyd., Monoclonal Hybridova Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press lne., Boča Raton, FL, 1982, což je zde zahrnuto odkazem. Ze zvířete se pak odebere a srazí krev, a protilátky se izolují ze séra s použitím konvenčních technik, jako jsou solná precipitace, ionexová chromatografie, afinitní chromatografie nebo vysokotlaká kapalinová chromatograf ie.

Použití monoklonálních protilátek je obecně výhodnější než polyklonálních antisér. Monoklonální protilátky poskytují výhody snadné produkce, specifity a reprodukovatelnosti. Způsoby produkce monoklonálních protilátek jsou v oboru dobře známy a jsou zveřejněny například Kohlerem a Milsteinem (Nátuře 256:495, 1975 a Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976). Viz též Hurrell, ibid. a Hart, US patent č. 5 094 941, jež jsou zde zahrnuty odkazem. Ve stručnosti: Protilátky produkující buňky, získané z imunizovaných zvířat, jsou imortalizovány a hodnoceny, nebo napřed hodnoceny, na produkci protilátky vážící se k TPO. Pozitivní buňky se pak imortalizují fúzí s myelomovými buňkami. Protilátky jiné než lidské mohou být humanizovány podle známých technik. Viz například US patent č. 4 816 397; publikace Evropského patentového úřadu 173 494 a 239 400; WIPO publikace WO 87/02671 a WO 90/00616, jež jsou zde zahrnuty odkazem. Ve stručnosti: Geny lidské konstantní oblasti se spojují s vhodnými lidskými nebo jinými než lidskými geny pro variabilní oblast. Například aminokyselinové sekvence, jež reprezentují vazebná místa pro antigen (CDR, oblasti určující komplementaritu) rodičovské (ne-lidské) monoklonální protilátky se roubují na úrovni DNA na sekvence lidské variabilní základní [framework] oblasti. Postupy této technologie jsou v oboru dobře známy a jsou zveřejněny například Jonesem et al., (Nátuře 326:522-525, 1986), Riechmannem et al. (Nátuře 322:323-327, 1989) a Queenem et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989). Spojené geny se pak transfekují do hostitelských buněk, které se pak kultivují podle konvenčních postupů. V alternativě se buňky , produkující protilátky, transfekují klonovanými geny pro lidskou konstantní oblast a geny chimérické protilátky vznikají homologní rekombinací. Takto je možné sestavit monoklonální protilátky tak, že významná část jejich struktury je lidská, a tím zajistit protilátky, jež jsou vhodnější pro opakované podávání lidským pacientům.

Jednořetězcové protilátky lze připravit expresí rekombinantního polypeptidu, jenž je obecně složen z variabilní sekvence lehkého řetězce spojené, typicky prostřednictvím spojovacího polypeptidu, s variabilní sekvencí těžkého řetězce. Způsoby produkce jednořetězcových protilátek jsou v oboru známé a jsou zveřejněné například Davisem et al., (Bio/Technology 9: 165-169, 1991).

Protilátky vážící se k epitopům TPO jsou užitečné například v diagnostice chorob charakterizovaných sníženými hladinami destiček, megakaryocytů a jiných krevních nebo progenitorních buněk, přičemž tyto choroby jsou spojeny s deficiencí v proliferaci nebo diferenciaci progenitorních buněk. Takováto diagnostika se obecně provádí testováním krve nebo plazmy s použitím konvenčních metod imunotestů, jako je s enzymy spojené imunoadsorpční stanovení radioimunotest. Stanovení tohoto typu jsou v oboru dobře známa. Viz například Hart et al., Biochem. 29:166-172, 1990; Ma et al., British Journal of Haematology 80: 431-436, 1992; a André et al., Clin. Chem. 38/5: 758-763, 1992. Diagnostické testy mohou být užitečné k identifikaci populací pacientů, kteří mohou nejpravděpodobněji mít prospěch z terapie TPO. Protilátky k TPO jsou také užitečné při čištění TPO, jako při zakotvení protilátky k pevnému nosiči, jako je zrnitá matrice naplněná do kolony, a průtok roztoku obsahujícího bílkovinu touto kolonou. Navázaná bílkovina je pak eluována patřičným pufrem. Obecně se bílkovina navazuje ke koloně za fyziologických podmínek nízké iontové síly a pH blízko neutrálního. Kolona se pak promývá k eluci nenavázaných kontaminujících složek. Eluce navázané bílkoviny se provádí změnou iontové síly a pH, jako s 3M KSCN (jednoduše nebo gradientem) nebo s citrátovým pufrem o nízkém pH. Obecně je potřeba vyhnout se pH pod asi 2,5.

Tento vynález poskytuje také způsoby pro produkci velkých počtů megakaryocytů nebo destiček, které mohou být použity například pro přípravu knihoven cDNA. Protože destičky jsou směrovány k místům poranění, soudí se o nich, že jsou prostředníky hojení ran a, za určitých podmínek, prostředníky patogenese. Podrobné pochopení molekulární biologie destiček a megakaryocytů by tudíž mohlo vnášet jasno do funkce homeostáze a klinicky relavantních poruch funkce destiček. Bílkoviny tohoto vynálezu poskytují lepší prostředky k přípravě knihoven cDNA megakaryocytů nebo destiček.

Rekombinantní thrombopoietin indukuje proliferaci megakaryocytů z prekursorových buněk když je podáván zvířatům nebo aplikován na kultivované buňky sleziny nebo kostní dřeně. Expanze megakaryocytů a jejich prekursorů a maturace megakaryocytů po podávání TPO umožňuje izolaci megakaryocytů ve vysoké čistotě a v počtu postačujícím k izolaci mRNA a konstrukci knihoven cDNA. Nastavení dávkování TPO a režimu podávání mohou být z primárních buněk sleziny nebo kostní dřeně selektivně expandovány megakaryocyty v ranné nebo plné maturaci a megakaryocyty, které se aktivně šíří. Podle toho mohou být konstruovány reprezentativní cDNA knihovny odpovídající ranným, intermediárním nebo pozdním fázím megakaryopoese.

Použití výsledných cDNA knihoven je mnohé. Takovéto knihovny mohou například být použity k identifikaci a klonování bílkovin o malém výskytu, jež hrají roli v různých dysfunkcích destiček. Snadnost, s níž lze pacientovy destičky expandovat a izolovat jejich mRNA k analýze velice napomáhá molekulárnímu zhodnocení choroby. Knihovny mohou být rovněž zdrojem pro klonování nových růstových faktorů a jiných bílkovin s potenciální terapeutickou využitelností. Užitečné destičkové bílkoviny již klonované zahrnují růstový faktor odvozený z destiček (Ross et al., Cell 26:155-169, 1986); transformující růstový faktor (Miletich et al., Blood 54:1015-1023, 1979; Roberts a Sporn, Growth Factors 8: 1-9, 1993); z destiček odvozený růstový faktor endothelových buněk (Miletich et al., Blood 54:1015-1023, 1979) a PF-4 Doi et al., Mol. Cell. Biol. 7:898-904, 1987; Poncz et al., Blood 69: 219-223, 1987). Nové růstové faktory mohou být identifikovány v cDNA knihovnách exprese vyhledáváním funkčními testy nebo vyhledáváním pomocí hybridizace se sondami známých růstových faktorů při snížené stringenci. Navíc: Systematické a úplné DNA sekvenování knihovny poskytuje databázi sekvencí cDNA megakaryocytů. V takovéto databázi lze dolovat užitečné sekvence řadou počítačových vyhledávacích algoritmů.

Magakaryocyty připravené jak se zveřejňuje shora mohou být použity rovněž k přípravě knihovny bílkovin. Tato knihovna bílkovin je komplementární ke knihovně cDNA. Informace získané z knihovny bílkovin kódujících bílkoviny, jež jsou sekvencích bílkovin pro návrhy dvojrozměrnou gelovou pak podrobí tryptické o aminokyselinových sekvencích umožňují rychlou izolaci cDNA předmětem zájmu. Použití dat o primerů k izolaci DNA odstraňuje problémy, které vznikají u konvenčních metod přípravy knihoven pro různou relativní hojnost rnRNA. Spojení knihoven bílkovin a cDNA rovněž umožňuje cílené klonování sekvencí, o něž je zvláštní zájem.

Knihovna bílkovin se připravuje extrakcí bílkovin (celkové bílkoviny nebo frakce, o něž je zájem) z megakaryocytů podle známých metod, pak separací bílkovin elektroforézou. Izolované bílkoviny se digesci in šitu, následované separací pomocí mikroporézní HPLC. Separované fragmenty se pak analyzují hmotovou spektrometrií. Výsledný hmotnostní profil se zkoumá proti databázi bílkovinných sekvencí k odvození identity bílkoviny. Neidentifikované peptidy mohou být sekvenovány Edmanovou degradací.

Knihovny cDNA a bílkovin jsou cennými zdroji nových bílkovin a sekvencí, jež je kódují. O destičkách se soudí, že jsou důležitými prostředníky hojení ran a, za určitých okolností, prostředníky patogenese. Bylo identifikovány a charakterizovány mnohé důležité bílkoviny destiček včetně růstového faktoru odvozeného z destiček, transformujícího růstového faktoru-β, z destiček odvozeného růstového faktoru endothelových buněk 4. Identifikace a charakterizace dalších byla krajně prospěšná pro objasňování procesů, jež jsou základem hojení ran a patogenese, a dalo by se od ní očekávat, že poskytne důležitá terapeutická činidla a strategie.

Jak se popisuje podrobněji níže, gen lidského TPO byl lokalizován na chromosomu 3q26. Tato informace ve spojení se sekvencí genu lidského TPO (Vzorec V) umožňuje přímou diagnózu (genetickým hodnocením) dědičných poruch v genu TPO nebo v regulaci jeho exprese. Takovéto poruchy zahrnují změny v promotorových sekvencích, jež vedou k vzrůstu nebo poklesu v hladině exprese, chromosomové translokace v kódujících nebo nekódujících oblastech, a juxtapozice nových regulačních sekvencí k TPO lokusu. Diagnostické metody, které lze používat, jsou v oboru známé. Například: Primery nebo hybridizační sondy o délce a destičkového faktoru bílkovin destiček by alespoň 5 nukleotidů, s výhodou o 15 - 30 nukleotidů nebo více, mohou být navrženy z genomické sekvence a použity k detekci chromosomálních abnormalit nebo k měření hladin mRNA. Řada vhodných detekčních a měřících metod je v oboru známa, a zahrnuje Southernův přenos, polymerasovou řetězovou reakci (Mullis, US patent č. 4 683 202) a ligasovou řetězovou reakci (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991). Například: Pacientova DNA může být digerována jedním nebo více restrikčních enzymů a přenesena na nitrocelulosu k vytvoření Southern přenosu. Přenesený materiál se pak sonduje k detekci hrubých změn ve velikosti fragmentů jako následku mutací v rekogniční sekvenci restrikčního místa. V jiném postupu dovoluje analýze abnormální genové sekvence a porovnání s normálními a abnormálními sekvencemi návrh primerů, které mohou být použity k identifikaci abnormálního (např. přerušeného nebo translokováného) genu. Pacientova DNA se amplifikuje polymerasovou řetězovou reakcí k detekci amplifikačních produktů charakteristických pro normální gen nebo pro konkrétní přeuspořádání genu.

Vynález je dále objasněn následujícími neomezujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace cDNA lidského MPL receptorů cDNA kódující isoformy lidských MPL-P a MPL-K receptorů byly izolovány z lidských erythroidních leukemických (HEL) buněk (Martin a Papayannopoulu, Science 216: 1233-1235, 1982) reverzně-transkriptasovou polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím primerů připravených k publikované sekvenci kódující amino- a karboxylové konce těchto receptorů (Vigon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:5640-5644, 1992). Templátová cDNA HEL buněk byla syntetizována z póly d(T)-selektované poly(A)⁺ RNA

S použitím primeru 2C5499 (CGAGCCACTT TCTGCACTCC tcgagttttt TTTTTTTTTT TT). Třináct μΐ poly(A)⁺ RNA HEL buněk o koncentraci 1 μ9/μ1 bylo smícháno s 3 μΐ 20 pmol/μΐ roztoku primeru prvního vlákna ZC5499 (CGAGCCACTT TCTGCACTCC TCGAGTTTTT TTTTTTTTTT TT). Směs byla zahřívána na 65’C po 4 minuty a ochlazena chlazením na ledu.

Syntéza prvního vlákna cDNA byla spuštěna přidáním 8 μΐ pufru prvního vlákna (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl₂) (5x SUPERSCRIPT™ pufr; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), 4 μΐ 100 mM dithiothreitolu a 3 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a 5-methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). Reakční směs byla zahřívána na 45’C po 4 minuty s následným přidáním 10 μΐ 200 υ/μΐ roztoku RNasy H“ reversní transkriptasy (SUPERSCRIPT™ reverzní transkriptasa, GIBCO BRL) ke směsi RNA-primer. Reakce byla inkubována při 45’C po 1 hodinu s následnou inkubací při 50’C po 15 minut. K reakci bylo přidáno šedesát μΐ TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) a následovala chromatografie přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (CHROMÁ SPIN+TE400™; Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) k odstranění přebytku primeru.

cDNA prvního vlákna HEL buněk se použila jak templát pro amplifikaci lidského MPL-P receptoru s použitím primerů odpovídajících oblasti kódující amino- a karboxylové konce receptorové bílkoviny (Vigon et al., ibid.). Každý primer také zahrnoval různé restrikční enzymové štěpící místo, jež posloužilo k směrovanému klonování amplifikovaného produktu (ZC5746, GAGAGAGAGA GAGAATTCAT GCCCTCCTGG GCCCTCTTCA TGGTC, obsahoval

Eco RI místo; ZC5762, AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TCAAGGCTGC

TGCCAATAGC TTAGTGGTAG GT, obsahoval Xho I místo). Byla sestavena 100 μΐ reakční směs, jež obsahovala 10 ng templátové cDNA, po 50 pmolů primerů, 200 μΜ každý deoxynukleotid trifosfát Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), 1 μΐ lOx PCR pufru (Promega Corp., Madison, WI), a 10 jednotek Taq polymerasy (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Polymerasová řetězová reakce byla nechána běžet po 35 cyklů (1 minuta při 95'C, 1 minuta při 60’C, a 2 minuty při 72’C, s jednou další vteřinou přidávanou v každém následujícím cyklu), s následující 10 minutovou inkubací při 72’C.

cDNA lidského MPL-K receptoru byla izolována amplifikácí polymerasovou řetězovou reakcí z cDNA HEL buněk způsobem identickým s cDNA MPL-P receptoru, jak je popsán shora, až na to Že primer ZC5762, AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TCAAGGCTGC

TGCCAATAGC TTAGTGGTAG GT, byl nahrazen ZC5742 (GACCCTGGAG CYGCGCCCGC GATCTCGCTA). PCR primer ZC5742 je specifický pro 3’ konec lidské MPL-P cDNA a zahrnoval Xho I místo k usnadnění klonování.

Reakční produkty byly extrahovány dvakrát fenol/chloroformem (1:1), pak jednou chloroformem a byly sraženy ethanolem. Po digesci Eco RI a Xho I byly produkty frakcionovány na 0,8 % gelu nízkotající agarosy (SEA PLAQUE GTG^TIÍ nízkotající agarosa; FMC Corp., Rockland, ME). 1,9 Kb amplifikovaný produkt odpovídající cDNA lidského MPL-P receptoru a 1,7Kb amplifikovaný produkt odpovídající cDNA lidského MPL-K receptoru byly získány z vyřezaných proužků gelu digesci gelové matrice β-agarasou (New England Biolabs, lne., Beverly, MA) s následným sražením p

ethanolem. cDNA byly subklonovány do vektoru pBluescnpt^ SK+ (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) pro ověření sekvenováním.

Příklad 2

Izolace cDNA myšího MPL receptoru

Byly vyňaty sleziny z C57BL/KsJ-db/db myší a okamžitě dány do kapalného dusíku. Celková RNA z tkáně slezin byla připravena s použitím guanidin isothiokyanátu (Chirgwin et al., Biocheaistry 18:52-94, 1979) s následným krokem CsCl centrifugace. Slezinná poly(A)⁺ RNA byla izolována s použitím chromatografie na oligo d(T) celulose (Aviv a Leder, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, 1972).

Sedm a půl μΐ póly d(T)-selektované poly(A)⁺ RNA myších slezin o koncentraci 1,7 μg/μl bylo smícháno s 3 μΐ 20 pmol/μΐ roztoku primeru prvního vlákna ZC6091 (GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT) obsahujícího restrikční místo Not I. Směs byla zahřívána na 65*C po 4 minuty a ochlazena chlazením na ledu. Syntéza prvního vlákna cDNA byla spuštěna přidáním 8 μΐ 250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl₂ (5x SUPERSCRIPT™ pufr; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), 4 μΐ 100 mM dithiothreitolu a 3 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a 5-methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology lne.) ke smési RNA-primer. Reakční směs byla inkubována při 45’C po 4 minuty s následným přidáním 10 μΐ 200 U/μΙ roztoku RNasy H~ reversní transkriptasy (GIBCO BRL). Účinnost syntézy prvního vlákna byla analyzována v paralelní reakci přidáním 10 μθί ³²P-adCTP k 10 μΐ alikvotu reakční směsi ke značení reakce pro analýzu. Reakce byly inkubovány při 45°C po 1 hodinu s následnou inkubací při 50’C po 15 minut. Neinkorporovaný ³²P-adCTP ve značené reakci byl odstraněn chromatografii přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (CHROMÁ SPIN + TE400™; Clontech Laboratories lne.). Neinkorporované nukleotidy v reakci neznačeného prvního vlákna byly odstraněny dvojím srážením cDNA v přítomnosti 8 μg glykogenového nosiče, 2,5 M octanu amonného a 2,5 objemu ethanolu. Neznačená cDNA byla resuspendována v 50 μΐ vody pro použití v syntéze druhého vlákna. Délka značeného prvního vlákna cDNA byla stanovena elektroforézou v agarosovém gelu.

Syntéza druhého vlákna byla prováděna na prvním vlákně cDNA za podmínek, jež podporují startování syntézy druhého vlákna prvním vláknem s výslednou tvorbou DNA smyček. Reakční směs se sestavovala za pokojové teploty a skládala se z 50 μΐ cDNA neznačeného prvního vlákna, 16,5 μΐ vody, 20 μΐ 5 x pufru pro polymerasu I (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 1 μΐ 100 mM dithiothreitolu, 2 μΐ roztoku obsahujícího po 10 mM koncentraci všech deoxynukleotid trifosfátů, 3 μΐ 5 mM roztoku β-NAD, 15 μΐ 3 U/μΙ roztoku E. coli DNA ligasy (New England Biolabs, lne., Beverly, MA) a 5 μΐ 10 U/μΙ roztoku E. coli DNA polymerasy I (Amersham Corp. , Arlington Heights, IL). Reakce byla inkubována 5 minut při pokojové teplotě s následujícím přidáním 1,5 μΐ 2ϋ/μ1 roztoku RNasy H (GIBCO BRL). K monitorování účinnosti syntézy druhého vlákna byla použita paralelní reakce, v níž byl 10 μΐ alikvot smési pro syntézu druhého vlákna značen 10 μθί ³²P-adCTP. Reakce byly inkubovány při 15’C po dvě hodiny s následnou inkubací 15 minut při pokojové teplotě. Neinkorporovaný ³²P-adCTP ve značené reakci byl před analýzou pomocí elektroforézy v agarosovém gelu odstraněn chromatografií přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (CHROMÁ SPIN + TE400™; Clontech Laboratories lne.). Neznačená reakce byla ukončena dvojí extrakcí fenol/chloroformem (1:1) a extrakcí chloroformem, s následnou ethanolovou precipitací v přítomnosti 2,5 M octanu amonného.

Jednovláknová DNA ve struktuře smyčky byla štěpena s použitím rostlinné (mung beán) nukleasy. Reakční směs obsahovala 100 μΐ cDNA druhého vlákna, 20 μΐ lOx nukleasového pufru (Stratagene Cloning Systems La Jolla, CA), 16 μΐ 100 mM dithiothreitolu, 51,5 μΐ vody a 12,5 μΐ 1:10 ředění mung beán nukleasy (Promega Corp.; konečná koncentrace 10,5 U/μΙ) v ředícím mung beán nukleasovém pufru. Reakce byla inkubována při 37’C po 15 minut. Reakce byla ukončena přidáním 20 μΐ 1 M Tris-HCl, pH 8,0, s následnou postupnou extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora. Po extrakci byla DNA sražena v ethanolu a resuspendována ve vodě.

V resuspendované cDNA byly zatupeny konce T4 DNA polymerasou. cDNA, která byla resuspendovaná ve 190 μΐ vody, byla smíchána s 50 μΐ 5x T4 DNA polymerasového pufru (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM KC1, 25 mM MgCl₂), 3 μΐ 0,1 M dithiothreitolu, 3 μΐ roztoku obsahujícího po 10 mM koncentraci všech deoxynukleotid trifosfátů, 4 μΐ l U/μΙ roztoku T4 DNA polymerasy (Boehringer Mannheim Corp., Indianopolis, IN). Po inkubaci po 1 hodinu při 10’C byla reakce ukončena přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA, s následnou seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora. DNA byla chromatografováné přes gelové-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories lne., Palo Alto, CA) k odstranění stopových množství bílkovin a k odstranění krátkých cDNA o délce méně než -400 bp. cDNA byla sražena ethanolem v přítomnosti 12 μg glykogenového nosiče a 2,5 M octanu amonného, a byla resuspendována v 10 μΐ vody. Na základě inkorporace ³²P-adCTP byl výtěžek cDNA určen jako -2 μg z počátečních 12,5 μg mRNA templátu.

Na 5’ konce této cDNA byly zaligovány Eco RI adaptory pro umožnění klonování do lambda fágového vektoru. 10 μΐ alikvot cDNA (-2 μg) a 10 μΐ 65 pmol/μΐ roztoku Eco RI adaptorů (Pharmacia LKB Biotechnology lne.) bylo smícháno s 2,5 μΐ lOx ligasového pufru (Promega Corp.), 1 μΐ 10 mM ATP a 2,5 μΐ 15 U/μΙ roztoku T4 DNA ligasy (Promega Corp.). Reakce byla inkubována přes noc (-18 hodin) při teplotním gradientu 0*C až 18‘C 15 minut. Reakce byla dále inkubována přes noc při 12*0. Reakce byla ukončena přidáním 75 μΐ vody a 10 μΐ 3 M octanu sodného, s následující inkubací při 65’C po 30 minut. Po inkubaci byla cDNA extrahována fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora a precipitována v přítomnosti 2,5 M octanu amonného a 1,2 objemu isopropanolu. Po centrifugaci byla cDNA peleta myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 89 μΐ vody.

K zajištění jednosměrného klonování této cDNA do lambda fágového vektoru byla tato cDNA digerována Not I, což dalo cDNA mající 5' Eco RI a 3’ Not I lepivé konce. Restrikční místo Not I na 3’ konci cDNA bylo dříve zavedeno s primerem ZC6091 (GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT). Digesce restrikčním enzymem byla prováděna v reakci obsahující 89 μΐ cDNA popsané shora, 10 μΐ 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT (lOx D pufr, Promega Corp., Madison, WI) a 1 μΐ 12ϋ/μ1 Not I (Promega Corp.). Reakce byla ukončena seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem. cDNA byla sražena ethanolem, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 20 μΐ lx nakládacího gelového pufru (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 5 % glycerol a 0,125 % bromfenolová modř).

Resuspendovaná cDNA byla zahřáta na 65°C po 5 minut, ochlazena na ledu a podrobena elektroforéze na 0,8 % gelu nízkotající agarosy (SEA PLAQUE GTG™ nízkotající agarosa, FMC Corp.). Neinkorporováné adaptory a cDNA pod délku 1,6 Kb byly vyříznuty z gelu. Elektrody byly přehozeny a cDNA byla podrobena elektroforéze dokud se nezkoncentrovala blízko počátku dráhy. Oblast obsahující zkoncentrovanou cDNA byla vyříznuta a dána do mikrocentrifugační zkumavky a byl stanoven přibližný objem řezu gelu. Do zkumavky byl přidán alikvot vody (300 μΐ), přibližně trojnásobného objemu řezu gelu, a agarosa byla roztavena zahřátím na 65“C po 15 minut. Po ekvilibraci vzorku na 42’C, bylo přidáno 10 μΐ Ιϋ/μΐ β-agarasy (New England Biolabs, lne.) a směs byla inkubována 90 minut k digesci agarosy. Po inkubaci bylo ke vzorku přidáno 40 μΐ 3 M octanu sodného a směs byla inkubována na ledu po 15 minut. Vzorek byl centrifugován při 14 000 x g po 15 minut za pokojové teploty k odstranění nezdigerované agarosy. cDNA byla ze supernatantu sražena ethanolem, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 37 μΐ vody na kinasovou reakci k fosforylaci zaligovaných Eco RI adaptorů.

K 37 μΐ roztoku cDNA popsaného shora se přidalo 10 μΐ lOx ligasového pufru (Stratagene Cloning Systems) a směs byla zahřívána na 65’C po 5 minut. Směs byla ochlazena na ledu a přidalo se 5 μΐ 10 mM ATP a 3 μΐ 10 U/μΙ T4 polynukleotid kinasy (Stratagene Cloning Systems). Reakce byla inkubována při 37“C po 45 minut a ukončena zahříváním na 65’C po 10 minut s následující seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem. Fosforylovaná cDNA byla sražena ethanolem v přítomnosti 2,5 M octanu amonného, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 12,5 μΐ vody. Koncentrace fosforylované cDNA byla stanovena na -40 fmol/μΙ.

Výsledná cDNA byla klonována do lambda fágového vektoru ^ExCell™ (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.), zakoupeného jako predigerovaného s Eco RI a Not I a defosforylovaného. Ligace cDNA do vektoru se provedla v reakci obsahující 2 μΐ 20 fmol/μΙ preparovaných ramen XExCell™, 4 μΐ vody, 1 μΐ lOx ligasového pufru (Promega Corp.), 2 μΐ 40 fmol/μΐ cDNA a 1 μΐ 15 U/μΙ roztoku T4 DNA ligasy (Promega Corp.). Ligace se prováděla po 48 hodin při 4'C. Přibližně 50 % ligační směsi bylo baleno do fága s použitím balícího extraktu GIGAPACK^R II Gold (stratagene Cloning Systems) podle instrukcí výrobce. Výsledná knihovna cDNA obsahovala více než 1,5 x 10⁷ nezávislých rekombinantů s hladinou pozadí fágů bez inzertů nižší než 1,5 %.

K izolaci cDNA myšího MPL receptoru z fágové knihovny cDNA myší sleziny se použila sonda ³²P-značené cDNA lidského MPL-K receptoru. Knihovna cDNA byla nanesena na buňky E. coli kmene SURE^R (Stratagene Cloning Systems) při hustotě 40 000 až 50 000 PFU/misku o průměru 150 mm. Fágové plaky ze třiceti tří misek byly přeneseny na nylonové membrány (Hybond™; Ámersham Corp., Arlington Heights, IL) a zpracovány podle instrukcí výrobce. Zpracované filtry byly upečeny ve vakuové peci při 80’C po 2 hodiny a následovalo několik mytí při 70’C v promývacím pufru (0,25 x SSC, 0,25 % SDS, 1 mM EDTA) a prehybridizace přes noc při 65’C v hybridizačním roztoku (5x SSC, 5x Denhardtův roztok, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA a 100 4g/ml tepelně denaturované DNA lososího spermatu) v hybridizační peci (model HB-2; Techne Inc., Princeton, NJ). Po prehybridizaci byl hybridizační roztok odstraněn a nahrazen čerstvým hybridizačním roztokem obsahujícím přibližné 2 x 10⁶ cpm/ml ³²P-značené cDNA lidského MPL-K připravené s použitím komerčně dostupné soupravy pro značení (souprava MEGAPRIME™; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Před přidáním do hybridizačního roztoku byla sonda denaturována při 98’C po 5 minut. Hybridizace byla při 65’C přes noc. Filtry byly promývány při 55’C v promývacím pufru (0,25 x SSC, 0,25 % SDS, 1 mM EDTA) a autoradiografovány s intenzifikační fólií po dny při -70’C na XAR-5 film (Kodak lne., Rochester, NY).

použitím autoradiogramu jako templátu byly z oblastí misek odpovídajících primárním signálům získány agarové válečky a ponořeny do SM (0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,02 % želatina) k eluci fága k purifikaci plaku. Bylo izolováno sedm fágů purifikovaných plaků, jež nesly inzerty hybridizující se sondou lidského MPL-K receptoru. Fagemidy obsažené v rámci \ExCell™ fágů byly získány s použitím in vivo rekombinačního systému v souladu s instrukcemi dodavatele. Identita cDNA inzertů byla potvrzena sekvenováním DNA.

Izolované klony kódovaly bílkovimu vykazující vysoký stupeň sekvenční identity s lidským MPL-P receptorem a s nedávno oznámeným myším MPL receptorem (Skoda et al., EMBO J. 12: 2645-2653, 1993). Sedm klonů spadalo do dvou tříd, jež se od sebe lišily třemi klony, majícími deleci sekvencí kódujících posloupnost 60 aminokyselinových zbytků blízko N-konce. Na cDNA kódující bílkovinu bez této delece se odkazuje jako na cDNA MPL receptoru typu I. cDNA MPL receptoru typu II chyběly sekvence kódující zbytky 131 až 190 receptoru typu I, Vzorec VI. Navíc se receptory typu I a II lišily od oznámené sekvence myšího MPL receptoru (Skoda et al., ibid.) přítomností sekvence kóduj ící aminokyselinové zbytky Val-Arg-Thr-Ser-Pro-Ala-Gly-Glu vnesené za aminokyselinový zbytek 222 a substitucí glycinového zbytku serinem v pozici 241 (pozice odkazují na myší receptor typu I).

cDNA myších MPL receptorů typu I a II byly k expresi v savčích buňkách subklonovány do plasmidového vektoru pHZ-1. Plasmid pHZ-1 je vektor exprese, jenž může být k expresi bílkovin použit v savčích buňkách, nebo v translačním systému žabích oocytů z mRNA, jež byly transkribovány in vitro. Jednotka exprese pHZ-1 zahrnuje promotor myšího metalothioneinu-1, promotor bakteriofága T7 s přilehlými mnohočetnými klonovacími okraji, obsahujícími unikátní restrikční místa pro inzerci kódujících sekvencí, terminátor lidského růstového hormonu a terminátor bakteriofága T7. Navíc pHZ-1 obsahuje E. coli počátek replikace, bakteriální beta-laktamasový gen, jednotku exprese savčího selekční markéru, zahrnující SV40 promotor a počátek replikace, a gen resistence k neomycinu a SV40 transkripční terminátor. Pro zajištění jednosměrného klonování do pHZ-1 byla použita polymerasová řetězová reakce s patřičnými primery k vytvoření Eco RI místa resp. Xho I místa, před kodonem translační iniciace resp. za translačním terminačním kodonem. Polymerasová řetězová reakce se prováděla ve směsi obsahující 10 μΐ lOx ULTMA DNA polymerasového pufru (Roche Molecular Systems, lne., Branchburg, NJ), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 0,2 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology lne.), 2,5 μΐ 20 pmol/μΐ roztoku primeru ZC6603 (GAGGAATTCG CAGAAGCCAT GCCCTCTTGG GCCCTCTTCA TGGTC), 2,5 μΐ pmol/μΐ roztoku primeru ZC5762 (AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TCAAGGCTGC TGCCAATAGC TTAGTGGTAG GT), 32,8 μΐ vody, 1 μΐ kultury bakterií ranně logaritmické fáze, obsahujících plasmid myšího MPL receptorů bud typu I nebo typu II a 1 μΐ 6ϋ/μ1 DNA polymerasy (ULTMA™ polymerasa; Roche Molecular Systems, lne., Branchburg, NJ). V reakci byl použit AmpliWax™ ( Roche Molecular Systems, lne.) podle instrukcí dodavatele. Polymerasová řetězová reakce byla nechána běžet po 25 cyklů (1 minuta při 95’C, 1 minuta při 55*C, a 3 minuty při 72’C), s následující 10 minutovou inkubací při 72*C. Amplifikované produkty byly seriálně extrahovány fenol/chloroformem a chloroformem a sraženy ethanolem v přítomnosti 6 μg glykogenového nosiče a 2,5 M octanu amonného. Pelety byly resuspendovány v 87 μΐ vody do níž se přidalo 10 μΐ 10 x H pufru (Boehringer Mannheim Corp.), 2 μΐ 10 U/μΙ Eco RI (Boehringer Mannheim) a 1 μΐ 40 U/μΙ Xho I (Boehringer Mannheim Corp.). Digesce se prováděla 1 hodinu při 37’C. Reakce byla ukončena zahřátím na 65’C po 15 minut a chromatografována přes gelové-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (CHROMÁ SPIN + TE400™; Clontech Laboratories lne.).

Izolované receptorové inzerty popsané shora byly ligovány do Eco RI a Xho I digerovaného a defosforylovaného vektoru pHZ-1. Ligační reakce obsahovala 1 μΐ 50 ng/μΐ upraveného pHZ-1 vektoru, 5 μΐ 5 ng/μΐ cDNA inzertu, 2 μΐ lOx ligasového pufru (Promega

Corp.), 11,75 μΐ vody a 0,25 μΐ 4 U/μΙ roztoku T4 DNA ligasy (Stratagene Cloning Systems). Ligace se prováděla při 10‘C přes noc. Ligované DNA byly transfekovány do E. coli (MAX EFFICIENCY DH108™ kompetentní buňky; GIBCO BRL) v souladu s výrobcovými instrukcemi. Platnost inzertů myšího MPL receptoru typu I a typu II a lidského MPL-P receptoru v pHZ-1 byla potvrzena sekvenováním DNA. Výsledné plasmidy pSLmpl-8 resp. pSLmpl-9 nesly cDNA myšího MPL receptoru typu I resp. typu II. Plasmid pSLmpl-44 nesl inzert cDNA lidského MPL-P receptoru.

Příklad 3

Konstrukce BaF3 buněčných linií exprimujících MPL receptory

BaF3, pre-lymfoidní, na interleukinu-3 závislá buněčná linie, odvozená z myší kostní dřeně (Palacios a Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Methey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) byla udržována v kompletním médiu (RPMI 1640

KS), doplněném 10 % tepelně séra, 4 % kondicionovaného (Becton Dickinson Labware, médium; JRH Bioscience lne., Lenexa, inaktivováného fetálního bovinního média z kultivovaných WEHI-3 buněk Bedford, MA), 2 mM glutaminem, 2-merkaptoethanolem (finální konc. 1 : 280 000) a PSN antibiotiky (GIBCO BRL). Před elektroporací do bunék BaF3 byly plasmidy pSLmpl-8, pSLmpl-9 a pSLmpl-44, purifikované s cesium chloridem, linearizovány v místě Nde I. Buňky BaF3 byly pro elektroporací promyty jednou v RPMI 1640 médiu a resuspendovány v RPMI 1640 médiu na hustotu 10⁷ buněk/ml. Po jednom ml resuspendovaných buněk BaF3 bylo smícháno s 30 μg DNA každého z linearizovaných plasmidů a směsi byly přeneseny do oddělených jednorázových elektroporačních komůrek (GIBCO BRL). Po asi 15 minutové inkubaci za pokojové teploty dostaly buňky sérii dvou šoků (800 μΡ3ύ/300 V., 1180 μΡ3ύ/300 V.) dodaných elektoporačním přístrojem (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Po 5 minutách času na vzpamatování byly elektroporované buňky přeneseny do 10 ml kompletního média a umístěny na 15 - 24 hodin do inkubátoru (37’C, 5 % CO₂). Buňky pak byly stočeny a resuspendovány v 10 ml kompletního média obsahujícího

1600 μg/ml G418 a naneseny při limitujících ředěních na

96-jamkové destičky pro tkáňové kultury k izolaci G418-resistentních klonů. Na expresi MPL receptorů v G418-resistentních BaF3 klonech se usuzovalo podle Northernovy analýzy přítomnosti MPL receptorových transkriptů v BaF3 mRNA. U buněčné linie označené BaF3/MPLRl.l byla nalezena vysoká hladina exprese mRNA myšího MPL receptoru typu I a tato linie byla používána pro následné testy s MPL ligandovou aktivitou v kondicionovaných médiích transfekovaných buněk BHK 570. Buněčná linie exprimující mRNA receptoru typu II byla označena BaF3/MPLR2.

Příklad 4

Produkce rozpustného myšího MPL receptoru

Savčí plasmid exprese kódující rozpustný myší MPL receptor typu I (pLDmpl-53) byl vytvořen spojením segmentu DNA z pSLmpl-9, savčího plasmidu exprese, obsahujícího cDNA kódující myší MPL receptor typu I, jak je popsána výše a plné délky, se segmentem DNA z pSLmpl-25, plasmidu exprese konstruovaného k produkci rozpustného myšího MPL receptoru typu I v bakteriích.

cDNA segment kódující rozpustný myší MPL receptor typu I byl izolován PCR s použitím primerů ZC6704 (GAAGAGGAAT TCACCATGGA TGTCTTCTTG CTGGCCTTGG GCACAGAG) a ZC6703 (CGACTTTACC TCGAGTGCTA CTGATGCTCT TCTGCCAGCA GTCTCGGAGC CCGTGGACAC) a jako templátu plasmidu pSLmpl-9 s receptorem plné délky. Pro zajištění jednosměrného klonování byla do primerů ZC6704 resp. ZC6703 v jejich 5' koncích zahrnuta restrikční místa Eco RI resp. Xho I. Primer ZC6703 také kódoval ve správném čtecím rámci konsensus cílovou sekvenci protein kinasy k umožnění in vitro značení purifikovaného rozpustného

Nati. Acad. Sci. USA 86: směsi obsahující 10 μΐ lOx ULTMA^rn DNA polymerasového pufru (Roche Molecular Systems, lne.), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 0,2 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology lne.), 11 μΐ 4,55 pmol/μΐ roztoku primerů ZC6704 (GAAGAGGAAT TCACCATGGA TGTCTTCTTG CTGGCCTTGG GCACAGAG), 21 μΐ 2,43 pmol/μΐ roztoku primerů receptoru

558-562, 1989). kTM ³²P-tATP (Li et al., Proč.

PCR se prováděla ve

ZC6703 (CGACTTTACC TCGAGTGCTA CTGATGCTCT TCTGCCAGCA GTCTCGGAGC CCGTGGACAC), 50,3 μΐ vody, 1 μΐ 50 ng/μΐ pSLmpl-9 digerovaného Hind III a Xba I, a l μΐ 6υ/μ1 ULTMA™ DNA polymerasy (Roche Molecular Systems, Inc.). v reakci byl použit AmpliWax™ (Roche Molecular Systems, Inc.) podle instrukcí dodavatele. Polymerasová řetězová reakce byla nechána běžet po 3 cykly (1 minuta při 95“C, 1 minuta při 50’C, a 2 minuty při 72’C), s následujícími 11 cykly při zvýšené stringenci hybridizace (1 minuta při 95’C, 30 sekund při 55’C, a 2 minuty při 72’C), s následující 10 minutovou inkubací při 72’C. Amplifikované produkty byly seriálně extrahovány fenol/chloroformem a chloroformem, s následnou chromatografií přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories Inc.). PCR produkt byl sražen ethanolem v přítomnosti 20 μg glykogenového nosiče a 2,5 M octanu amonného. Peleta byla resuspendována v 32 μΐ vody. K 16 μΐ resuspendovaného PCR produktu se přidaly 2 μΐ 10 x H pufru (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μΐ 10 U/μΙ Eco RI (Boehringer Mannheim) a 1 μΐ 40 U/μΙ Xho I (Boehringer Mannheim Corp.). Digesce se prováděla 1 hodinu při 37’C. Digesce byla ukončena zahřátím na 65’C po 15 minut a produkt byl purifikován na 0,7 % gelu nízkotající agarosy. Získání fragmentu z nízkotající agarosy se provedlo digesci gelové matrice β-agarasou (New England Biolabs).

Výsledný PCR produkt kódoval N-koncovou extracelulární doménu myšího MPL receptoru typu I (zbytky 27 až 480 Vzorce VI). V nepřítomnosti putativní receptorové transmembránové domény (zbytky 483 až 504 Vzorce VI) se očekává, že exprimované bílkovina bude v přítomnosti vhodného signálního peptidu secernována. Myší cDNA kódující rozpustný MPL receptor typu II byla získána s použitím PCR podmínek popsaných shora až na to, že jako templát byl použit pSLmpl-8. Platnost obou fragmentů receptorů byla potvrzena sekvenováním DNA.

Fragmenty DNA kódující myší rozpustné MPL receptory typu I a typu II byly klonovány do Eco RI a Xho I digerovaného vektoru pOmpA2-5 za vzniku pSLmpl-26 respektive pSLmpl-27. Plasmid pOmpA2-5 je modifikace pOmpA2 (Ghrayab et al., EMBO J. 3:2437-2442, 1984), bakteriálního vektoru exprese navrženého ke směrování rekombinantní bílkoviny do periplazmatického prostoru. pOmpA2-5 byl zkonstruován náhradou 13 bp sekvence mezi Eco RI a Bam HI místy pOmpA2 syntetickou 42 bp sekvencí. Sekvence byla vytvořena hybridizací dvou 42 nukleotidových komplementárních olignukleotidů (ZC6707, AATTCGCCAT GGGACTCGAG CATCACCATC

ACCATCACTG AG; a ZC6706, GATCCTCAGT GATGGTGATG GTGATGCTCG AGTGCCATGG CG), které při zpárování baží vytvořily Eco RI a Bam HI lepivé konce, což zjišťovalo jednosměrné klonování do Eco RI a Bam HI digerovaného p0mpA2. Uvnitř vložené sekvence je Xho I místo ve stejném čtecím rámci jako bakteriální zaváděcí sekvence a kódující cDNA myšího rozpustného MPL receptoru, jakož i úsek šesti histidinových kodonů ve stejném rámci, lokalizovaný 3' od Xho I místa, k umožnění purifikace rekombinantní bílkoviny pomocí kovově-chelatační afinitní chromátografie (Houchuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325, 1988). Za sekvencí kódující histidinový úsek následoval terminační kodon ve stejném rámci. Platnost pOmpA2-5, pSLmpl-26 a pSLmpl-27 byla ověřena sekvenováním DNA.

pLDmpl-53, savčí vektor exprese, produkující myší rozpustný MPL receptor typu I, byl zkonstruován spojením segmentů pSLmpl-9 a pSLmpl-26 do vektoru exprese pHZ-200 (pHZ-1, v němž je gen neomycinové resistence nahrazen dihydrofolát reduktasovou sekvencí). 1164 bp Eco ΈΙ/Bam HI cDNA fragment z pSLmpl-9 nahradil savčí signální sekvenci deletovanou během konstrukce bakteriálního plasmidu exprese pSLmpl-26. 416 bp Bam HI fragment z pSLmpl-26 dodal kódující sekvenci pro karboxy-koncovou část rozpustného MPL receptoru, doménu pro značení kinasou, poly-histidinový úsek a translační terminátor. Tyto dva fragmenty byly purifikovány na gelu a klonovány do Eco Έϊ/Bam HI míst pBluescript^R KS+ (Stratagene Cloning Systems) za vzniku plasmidu pBS8.76LD-5. Správná orientace 416 bp Bam HI fragmentu, odvozeného od pSLmpl-26, vzhledem k 1164 bp Eco EI/Bam HI fragmentu, odvozenému od pSLmpl-9, byla v pBS8.76LD-5 stanovena pomocí PCR s použitím primerů ZC6603 (GAGGAATTCG CAGAAGCCAT GCCCTCTTGG GCCCTCTTCA TGGTC) a ZC6703 (CGACTTTACC TCGAGTGCTA CTGATGCTCT TCTGCCAGCA GTCTCGGAGC CCGTGGACAC). Místo Xba I uvnitř poly-spojkové sekvence pBS8.76LD-5 umožňovalo vynětí rekonstituované receptorové cDNA jako 1,5 kb Eco RI/Xba I fragmentu ke klonování do pHZ-200 po digesci tohoto vektoru s Eco RI a Xba I. Výsledný savčí plasmid exprese, pLDmpl-53, byl připraven ve velkém měřítku pro transfekci do buněk BHK.

Dvacet mikrogramů purifikovaného plasmidu pLDmpl-53 bylo transfekováno do buněk BHK 570 s použitím kalcium fosfátové precipitační metody. Po pěti hodinách dostaly buňky šok s 15 % glycerolem po 3 minuty k usnadnění záchytu DNA. Čerstvé růstové médium bylo přidáno přes noc. Následující den byly buňky rozděleny do různých ředění a bylo přidáno selekční médium obsahující 1 μΜ methotrexát. Přibližně po dvou týdnech byly viditelné jednotlivé methotrexát-resistentní kolonie. Resistentní kolonie byly bud spojeny, anebo udržovány jako oddělené klony. Použitá média ze spojených kolonií byla okamžitě testována na přítomnost rozpustné bílkoviny MPL receptoru.

Rozpustná bílkovina MPL receptoru byla izolována prostřednictvím interakce poly-histidinového úseku, přítomného v karboxy-konci bílkoviny, s kovově-chelatační pryskyřicí obsahující imobilizovaný Ni²⁺ (HIS-BIND™? Novagen, Madison, WI). Bezsérové kultivační médium použité u spojených kolonií pLDmpl-53 bylo necháno protéct přes tuto pryskyřici a navázaná bílkovina byla eluována 1 M imidazolem. SDS-PAGE analýza ukázala jediný pruh při -67 kDa. Tato bílkovina byla podrobena analýze N-koncových aminokyselin a byla potvrzena jako myší MPL receptor.

Rozpustná bílkovina MPL receptoru byla purifikována ze spojených BHK transfektantů, jež byly transfekovány plasmidem pLDmpl-53, exprimujícím myší rozpustný MPL receptor typu I. Tento purifikovaný rozpustný receptor byl imobilizovaná na matrici CNBr-aktivované SEPHAROSE™ 4B (Pharmacia LKB Biotechnology, lne.) v podstatě jak je doporučováno výrobcem a použit k purifikaci MPL aktivity v kondicionovaných médiích buněk 24-11-5. Afinitní matrice byla naložena do kolony XK16 (Pharmacia LKB Biotechnology lne.). Kondicionované médium z buněk 24-11-5 bylo zkoncentrováno na membráně dutých vláken s mezí 10 kDa (A/G Technology Corp., Needham, MA) a receptorovou afinitní kolonu při průtoku promyta solným roztokem pufrovaným fosfátem naneseno zdola na MPL 1 ml/min. Kolona byla (PBS), obsahujícím

0,5 M NaCl a 0,01 % azidu sodného. MPL aktivita byla z kolony eluována 3 M thiokyanátem draselným (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) při průtoku 0,5 ml/min. Thiokyanát draselný byl odstraněn dialýzou proti PBS. Aktivní frakce byly identifikovány pomocí MTT proliferačního testu (popsáno v Příkladu 7).

Příklad 5

Izolace a charakterizace buněčné linie exprimující ligand MPL receptorů.

Buňky BaF3/MPLRl.l jsou IL-3 dependentní buňky, exprimující stabilně transfekovaný myší MPL receptor typu I. Byla rozplánována mutagenese a selekční schéma pro izolaci buněčných linií exprimujících ligand MPL receptorů za použití mutagenese buněk BaF3/MPLRl.l a selekce na autokrinní růst v nepřítomnosti exogenního IL-3.

Přibližně 1,2 x 10⁶ buněk BaF3/MPLRl.l bylo peletováno a promyto GM (RPMI 1640 médium doplněné 2-merkaptoethanolem (finální konc. 1 : 280 000), 2 mM L-glutaminem, 110 μg/ml pyruvátu sodného, 50 μg/ml G418 a 10 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra. Buňky byly resuspendovány v 2 ml GM obsahujícího 0,15 % (obj./obj.) mutagenu 2-ethylmethansulfonátu (EMS) a inkubovány po 2 hodiny při 37°C. Po inkubaci byly buňky promyty jednou v PBS a jednou v GM a naneseny na 10 cm misky při hustotě asi 40 000 buněk/ml v GM doplněném 5 % kondicionovaného média WEHI-3 buněk (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) jako zdroje IL-3. Před selekcí na růst nezávislý na IL-3 byly buňkám ponecháno k nápravě období sedmi dní inkubace při 37°C pod 5 % C0₂. Po tomto období byla v kultuře husté životaschopné buňky. Buňky byly promyty GM a kultivovány v GM bez WEHI-3 kondicionovaného média. Po jedenácti dnech selekce byl pozorován malý počet životaschopných buněk. Hustota životaschopných buněk na IL-3 nezávislé kultury byla odhadnuta na 250 buněk/ml. Po jednom ml na IL-3 nezávislé kultury bylo naneseno do 19 jamek 24-jamkové kultivační destičky k další charakterizaci.

Kondicionovaná média ze shora popsaného růstu buněk BaF3/MPLRl.l nezávislého na IL-3 byla testována na proliferační aktivitu k buňkám BaF3/MPLR. U kondicionovaných médií ze všech 19 vzorků [pools] nezávislých co do růstu na IL-3 bylo nalezeno, že mají aktivitu v MTT proliferačním testu (popsaném v Příkladu 7). Pozitivní média byla dále testována na proliferační aktivitu v přítomnosti 2 μg/ml potkaních protilátek proti myšímu IL3, myšímu IL-4 nebo v přítomnosti obou neutralizujících protilátek (Pharmigen, San Diego, CA) k identifikaci mutantů, jejichž růst byl nezávislý na IL-3 a jež exprimovaly tyto cytokiny. (V předcházejícím experimentu bylo nalezeno, že buňky BaF3 odpovídaly také na IL-4). Pouze u kondicionovaného média z buněk z destičky č. 11 (označených jako buňky 24-11) bylo nalezeno, že má aktivitu, jež nebyla neutralizována protilátkami k IL-3 nebo IL-4.

Mutagenizační a selekční schéma popsané shora se aplikovalo na pět dalších BaF3/MPLR klonů (BaF3/MPLRl klony č. 4, 9, 12, 15 resp. 18, označované jako BaF3/MPLR1.4, .9, .12, .15 resp. .18). U sedmnácti izolátů bylo zjištěno, že mají kondicionovaná média, která stimulují proliferaci BaF3/MPLRl buněk. U aktivity všech těchto médií bylo nalezeno, že je neutralizována protilátkami k IL-3 nebo IL-4, jednotlivě nebo v kombinaci. Tyto klony nebyly dále charakterizovány.

Proliferační aktivita kondicionovaných médií ze vzorku 24-11 byla podrobně charakterizována. Vzorek [pool] 24-11 byl rozdělen na devatenáct menších vzorků [subpoolsj a kondicionovaná média byla re-testována na aktivitu. Všech devatenáct menších vzorků (t.j. 24-11-1 až 24-11-19) stimulovalo v nepřítomnosti exogenního IL-3 proliferaci buněk BaF3/MPLRl, růstově závislých na IL-3. Tato aktivita nebyla inhibována neutralizujícími protilátkami IL-3 nebo IL-4, nebo kombinací obou těchto protilátek.

Ke stanovení specifity 24-11 aktivity se provedly dva pokusy. Kondicionovaná média byla testována na proliferační aktivitu na kontrolních BaF3 buňkách, které neexprimují MPL receptor. V nepřítomnosti exogenního IL-3 nebyla proliferace kontrolních BaF3 buněk pozorována s žádným z kondicionovaných médií z devatenácti menších vzorků 24-11. V druhém pokusu byla proliferační aktivita testována na inhibici rozpustným MPL receptorem. Buňky BaF3/MPLRl byly kultivovány v GM doplněném 50 % kondicionovaného média 24-11. Ke vzorkům byl přidáván myší rozpustný MPL receptor typu I na konečnou koncentraci 0,0; 0,625; 1,25; 2,5 nebo 5,0 μg/ml. Výsledky byly odečítány MTT testem buněčné proliferace po 4 dnech. Proliferační aktivita kondicionovaného média 24-11 byla úplně blokována při 0,625 až 1,25 μg/ml rozpustného MPL receptoru. Koncentrace rozpustného receptoru, které úplně inhibovaly aktivitu, neměly žádný vliv na IL-3 nebo IL-4 stimulaci BaF3/MPLRl buněk. Tyto výsledky ukázaly, že rozpustný MPL receptor kompetuje o stimulační aktivitu

24-11 médií a byly v souladu s hypotézou, že buňky 24-11 exprimují ligand MPL receptoru.

Klony odvozené od buněk 24-11 byly izolovány nanesením limitujících ředění. Jeden klon, označený 24-11-5 #3, vykazoval ve svých kondicionovaných médiích vysokou hladinu proliferační aktivity v relaci k celkovému vzorku 24-11. Pro proliferační aktivitu bylo nalezeno, že je stejná jako u ředění 1:2000 kondicionovaného média z WEHI-3 buněk (Becton Dickinson Labware).

Příklad 6

Konstrukce knihovny cDNA 24-11-5 #3

Celková RNA se připravila z -2,7 χ 10⁸ buněk 24-11-5 #3 s použitím guanidin isothiokyanátu s následnou CsCl centrifugací (Chirgwin et al., ibid). poly(A)⁺ RNA byla izolována s použitím izolační soupravy OLIGOTEX-dT-mRNA (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) podle výrobcových instrukcí.

První vlákno cDNA z 24-11-5 #3 bunék se syntetizovalo ve 4 oddělených paralelních reakcích. Každá reakce obsahovala 7 μΐ póly d(T)-selektované poly(A)⁺ RNA 24-11-5 #3 o koncentraci

1,6 μg/μl a 2,5 μΐ 20 pmol/μΐ roztoku primeru prvního vlákna ZC6172 (GTCGGTGCTC AGCATTCACT ACTCGAGGGT TTTTTTTTTT TTTTTTT), obsahujícího restrikční místo Xho I. Směs byla zahřívána na 65’C po 4 minuty a ochlazena chlazením na ledu. Syntéza prvního vlákna cDNA byla spuštěna přidáním 8 μΐ pufru prvního vlákna (5x SUPERSCRIPT™ pufr; GIBCO BRL), 4 μΐ 100 mM dithiothreitolu a 2 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a 5-methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) ke směsi RNA-primer. Reakční směs byla inkubována při 45’C po 4 minuty s následným přidáním 10 μΐ 200 U/μΙ roztoku RNasy H” reversní transkriptasy (GIBCO BRL). Účinnost syntézy prvního vlákna byla analyzována v paralelní reakci přidáním 10 μθί ³²P-adCTP k 10 μΐ alikvotu jedné z reakčních směsí ke značení reakce pro analýzu. Reakce byly inkubovány při 45’C po 1 hodinu s následnou inkubací při 50’C po 15 minut. Neinkorporovaný ³²P-adCTP ve značené reakci byl odstraněn chromatografií přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories lne.). Neznačené reakce pro tvorbu prvního vlákna byly spojeny a neinkorporované nukleotidy v reakci neznačeného prvního vlákna byly odstraněny dvojím srážením cDNA v přítomnosti 32 μg glykogenového nosiče, 2,5 M octanu amonného a 2,5 objemu ethanolu. Neznačená cDNA byla resuspendována ve 144 μΐ vody pro použití v syntéze druhého vlákna. Délka značeného prvního vlákna cDNA byla stanovena elektroforézou v agarosovém gelu.

Syntéza druhého vlákna byla prováděna na prvním vlákně cDNA za podmínek, jež podporují startování syntézy druhého vlákna prvním vláknem s výslednou tvorbou DNA smyček. Provedly se tři oddělené paralelní reakce pro druhého vlákna. Každá reakce pro druhé vlákno obsahovala 48 μΐ cDNA neznačeného prvního vlákna, 16,5 μΐ vody, 20 μΐ 5 x pufru pro polymerasu I (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 500 mM KC1, 25 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 1 μΐ 100 mM dithiothreitolu, 2 μΐ roztoku obsahujícího po 10 mM koncentraci všech deoxynukleotid trifosfátů, 3 μΐ 5 mM roztoku β-NAD, 15 μΐ 3 U/μΙ roztoku E. coli DNA ligasy (New England Biolabs, lne.) a 5 μΐ 10 U/μΙ roztoku E. coli DNA polymerasy I (Amersham Corp.). Reakce byla sestavována při pokojové teplotě a byla inkubována 5 minut při pokojové teplotě s následujícím přidáním 1,5 μΐ 2ϋ/μ1 roztoku RNasy H (GIBCO BRL). K monitorování účinnosti byl 10 μΐ alikvot z jedné směsi pro značen 10 μθΐ ³²P-adCTP. Reakce byly inkubovány při 15’C po dvě hodiny s následnou inkubací 15 minut při pokojové teplotě. Neinkorporovaný ³²P-adCTP ve značené reakci byl před analýzou pomocí elektroforézy v agarosovém gelu odstraněn chromatografii přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories). Neznačené reakce byly spojeny a extrahovány fenol/chloroformem a chloroformem, s následnou ethanolovou precipitací v přítomnosti 2,5 M octanu amonného.

Jednovláknová DNA ve struktuře smyčky byla štěpena s použitím rostlinné (mung beán) nukleasy. Reakční směs obsahovala 100 μΐ cDNA druhého vlákna, 20 μΐ lOx nukleasového pufru (Stratagene Cloning Systems), 16 μΐ 100 mM dithiothreitolu, 48 μΐ vody a 10 μΐ ředícího mung beán nukleasového pufru (Stratagene Cloning Systems), a 6 μΐ 50 U/μΙ mung beán nukleasy (Promega Corp.). Reakce byla inkubována při 37’C po 30 minut. Reakce byla ukončena přidáním 20 μΐ 1 M Tris-HCl, pH 8,0, syntézy druhého vlákna syntézu druhého vlákna s následnou postupnou extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora. Po extrakci byla DNA sražena v ethanolu a resuspendována ve vodě.

V resuspendované cDNA byly zatupeny konce T4 DNA polymerasou. cDNA, která byla resuspendovaná ve 188 μΐ vody, byla smíchána s 50 μΐ 5x T4 DNA polymerasového pufru (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM KC1, 25 mM MgCl₂), 3 μΐ 0,1 M dithiothreitolu, 4 μΐ roztoku obsahujícího po 10 mM koncentraci všech deoxynukleotid trifosfátů, 5 μΐ 1 U/μΙ roztoku T4 DNA polymerasy (Boehringer Mannheim Corp.). Po inkubaci po 30 minut při 15’C byla reakce ukončena přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA, s následnou seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora. DNA byla chromatografována přes gelové-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories lne.) k odstranění stopových množství bílkovin a k odstranění krátkých cDNA o délce méně než -400 bp. cDNA byla sražena ethanolem v přítomnosti 10 μg glykogenového nosiče a 2,5 M octanu amonného, a byla resuspendována v 15 μΐ vody. Na základě inkorporace ³²P-adCTP byl výtěžek cDNA určen jako -8 μg z počátečních 40 μg mRNA templátu.

Na 5' konce cDNA popsané shora byly zaligovány Eco RI adaptory pro umožnění klonování do vektoru exprese. 10 μΐ alikvot cDNA (-5 μg) a 21 μΐ 65 pmol/μΐ roztoku Eco RI adaptoru (Pharmacia LKB Biotechnology lne.) bylo smícháno s 4 μΐ lOx ligasového pufru (Promega Corp.), 3 μΐ 10 mM ATP a 3 μΐ 15 U/μΙ roztoku T4 DNA ligasy (Promega Corp.). Reakce byla inkubována přes noc (-48 hodin) při 9^eC. Reakce byla ukončena přidáním 140 μΐ vody a 20 μΐ lOx H pufru (Boehringer Mannheim Corp.) a inkubací při 65’C po 40 minut. Po inkubaci byla cDNA extrahována fenol/chloroformem a chloroformem, jak je popsáno shora a precipitována v přítomnosti 2,5 M octanu amonného a 1,2 objemu isopropanolu. Po centrifugací byla cDNA peleta myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 89 μΐ vody.

K zajištění jednosměrného klonování této cDNA do vektoru exprese byla tato cDNA digerována Xho I, což dalo cDNA mající 5’ Eco RI lepivý konec a 3' Xho I lepivý konec. Restrikční místo Xho I na 3' konci cDNA bylo dříve zavedeno s primerem ZC6172 (GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT). Digesce restrikčním enzymem byla prováděna v reakci obsahující 89 μΐ cDNA popsané shora, 10 μΐ lOx H pufru (Promega Corp.) a 1.5 μΐ 40 U/μΙ Xho I (Boehringer Mannheim Corp.). Reakce byla ukončena seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem a chromatografii přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories Inc.).

cDNA byla sražena ethanolem, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 20 μΐ lx nakládacího gelového pufru (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 5 % glycerol a 0,125 % bromfenolová modř). Resuspendovaná cDNA byla zahřáta na 65’C po 5 minut, ochlazena na ledu a podrobena elektroforéze na 0,8 % gelu nízkotajíci agarosy (SEA PLAQUE GTG™ nízkotajíci agarosa, FMC Corp.). Kontaminující adaptory a cDNA pod délku 0,5 Kb byly vyříznuty z gelu. Elektrody byly přehozeny a cDNA byla podrobena elektroforéze dokud se nezkoncentrovala blízko počátku dráhy. Oblast obsahující zkoncentrovanou cDNA byla vyříznuta a dána do mikrocentrifugační zkumavky a byl stanoven přibližný objem řezu gelu. Do zkumavky byl přidán alikvot vody, přibližně trojnásobného objemu řezu gelu (300 μΐ), a agarosa byla roztavena zahřátxm na 65’C po 15 minut. Po ekvilibraci vzorku na 42’C, bylo přidáno 5 μΐ ΐυ/μΐ β-agarasy (New England Biolabs, Inc.) a směs byla inkubována 90 minut při 45’C k digesci agarosy. Po inkubaci bylo ke vzorku přidáno 40 μΐ 3 M octanu sodného a směs byla inkubována na ledu po 15 minut. Vzorek byl centrifugován při 14 000 x g po 15 minut za pokojové teploty k odstranění nezdigerované agarosy, s následnou chromatografií přes gelově-filtrační kolonu s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories Inc.). cDNA byla sražena ethanolem, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 70 μΐ vody na kinasovou reakci k fosforylaci zaligovaných Eco RI adaptorů.

K 70 μΐ roztoku cDNA se přidalo 10 μΐ lOx ligasového pufru (Stratagene Cloning Systems) a směs byla zahřívána na 65’C po 5 minut. Směs byla ochlazena na ledu a přidalo se 16 μΐ 10 mM ATP a 4 μΐ 10 U/μΙ T4 polynukleotid kinasy (Stratagene Cloning Systems). Reakce byla inkubována při 37’C po 1 hodinu a ukončena zahříváním na 65’C po 10 minut s následující seriální extrakcí fenol/chloroformem a chloroformem. Fosforylovaná cDNA byla sražena ethanolem v přítomnosti 2,5 M octanu amonného, myta 70 %-ním ethanolem, usušena na vzduchu a resuspendována v 10 μΐ vody. Koncentrace fosforylované cDNA byla stanovena na -40 fmol/μΐ.

Savčí vektor exprese pDX (zveřejněný v US patentu č. 4 959 318) /Obrázek) byl modifikován pro zavedení 24-11-5 #3 cDNA, jež byla syntetizována s Eco RI a Xho I konci. Endogenní Sal I místo na pDX bylo zrušeno digescí plasmidu a Sal I a recirkularizací, jež následovala po zatupení kohezivních konců Sal I T4 DNA polymerasou. Recirkulovaný plasmid byl digerován Eco RI a byla k němu zaligována krátká sekvence poly-spojky, sestávající ze dvou komplementárních oligonukleotidů, ZC6936 (AATTGGCGGC CGCGTCGACT CGTGGATG) a ZC6937 (AATTCATCCA CGAGTCGACG CGGCCGCC) za vzniku plasmidu pDX.ES. Zavedená sekvence poly-spojky na pDX.ES obsahovala Eco RI a Sal I místa k zajištění jednosměrného klonování 24-11-5 cDNA, syntetizované s Eco RI a Xho I konci.

Plasmidová cDNA knihovna byla připravena ligací Eco Rl-Xho 1 24-11-5 cDNA do Eco Rl/Sal 1 digerovaného pDX.ES. Ligační směs byla elektroporována do E. coli (kompetentní buňky ELEKTROMAX™ DH10B™; GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), s použitím pulzačního přístroje 0,2 cm kyvety (gene pulser/pulse controller, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) s nastavením 0,2 KV, 400 ohm a 25 μΡΑϋ. Buňky byly zředěny v 1,5 ml Luriovy půdy a inkubovány při 37’C po 45 minut, s následujícím přidáním 0,75 ml 50 % glycerolu. Transfekované buňky byly rozalikvotovány a skladovány při -70’C do doby použití. Z osmdesáti fmolů cDNA vzniklo více než 700 000 nezávislých rekombinantních plasmidů.

Příklad 7

Hodnocení exprese v 24-11-5 cDNA knihovně na MPL aktivitu

24-11-5 #3 cDNA knihovna byla nanesena na přibližně dva tisíce misek o průměru 10 cm s Luriovým živným agarem, doplněným 100 μ'ς/ιηΐ ampicilinu. Hustota nanášení byla mezi 200 a 250 bakteriálními koloniemi na misky. Plasmidová DNA pro transfekci do buněk BHK 570 se připravila z každé bakteriální misky s použitím DNA purifikační pryskyřice MAGIC MINIPREPS™ (Promega

Corp.) podle výrobcových instrukcí. Plasmidové DNA skladovány při -20’C do doby transfekce BHK 570 buněk.

Vzorky [pools] plasmidů 24-11-5 #3 cDNA, každý obsahující přibližně 200 až 250 cDNA klonů, byly transfekovány do buněk BHK 570 s použitím 3 : 1 liposomového přípravku z 2,3-dioleyloxyN-[2(sperminkarboxyamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetátu a dioleylfosfatidylethanolaminu ve vodě (LIPOFECTAMINE™; GIBCO BRL). Dvacet μΐ 30 ng/ml DNA bylo přidáno k 20 μΐ 1:10 zředěného roztoku LIPOFECTAMINE™ a inkubováno při pokojové teplotě po 30 minut. Po inkubaci se ke směsi DNA/LIPOFECTAMINE™ přidalo 160 μΐ bezsérového média (Hams F12: Dulbeccovo NEM (1 : 1), doplněné 2 mM L-glutaminem, 110 μg/ml pyruvátu sodného, 5 μg/ml insulinu, 5 μg/ml fetuinu, 10 μg/ml transferinu, 2 ng/ml kysličníku seleničitého a 25 mM HEPES pufrem) a směs se přenesla do 24 jamkové mikrotitrační destičky obsahující -100 000 buněk BHK 570. Buňky byly inkubovány při 37°C pod 5 % C0₂ po 4 hodiny a potom bylo přidáno 200 μΐ BHK růstového média (Dulbeccovo modifikované Eaglesovo médium doplněné 2 mM L-glutaminem, 0,11 mg/ml pyruvátu sodného, 5 % tepelně inaktivovaného fetálního antibiotiky (GIBCO BRL)). Buňky se byla odstraněna a nahražena 0,5 ml čerstvého BHK růstového média, jež se před testováním na MPL aktivitu kondicionovalo po 48 hodin.

K detekci přítomnosti MPL aktivity v kondicionovaných médiích buněk BHK 570 transfekováných knihovnou se použil test buněčné proliferace. Sto μΐ kondicionováného média se přidalo ke 100 μΐ 10⁶/ml promytých buněk BaF3/MPLRl.l v RPMT médiu (JRH Bioscience lne., Lenexa, KS) doplněném 2 mM L-glutaminem a PSN antibiotiky (GIBCO BRL), 0,00036 % 2-merkaptoethanolu a 10 % tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra. Před testováním na proliferaci byly buňky inkubovány po 3 dny při 37*C pod 5 % C0₂.

Buněčná proliferace v přítomnosti MPL byla kvantifikována s použitím kolorimetrického testu založeného na metabolickém rozkladu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dfenyl tetrazolium bromidu (MTT) (Mosman, J. Inuaunol. Meth. 65: 55-63, 1983).

Dvacet μΐ 10 mg/ml roztoku MTT (Polyscience, lne., Warrington, PA) se přidalo k 100 μΐ testovných buněk BaF3/MPLRl.l a buňky se telecího séra a lOOx PSN inkubovaly po 16 hodin. Média inkubovaly při 37*C. Po 4 hodinách se přidalo 200 μ.1 0,04 N HC1 v isopropanolu, roztok se promíchal a absorbance vzorku se změřila při 570 nM na ELISA čtečce modelu EL320 (Bio-Tek Instruments lne., Highland Park, VT).

Do buněk BHK 570 byl transfekován jeden vzorek spojených plasmidů [pool], jenž byl shledán pozitivní a označen T108X. Supernatanty těchto transfektantů dávaly pozitivní signál v MTT proliferačním testu. PCR a pokusy s neutralizací protilátkami ukázaly, že tato aktivita nabyla způsobena IL-3 nebo IL-4.

Plasmidy tohoto pozitivního vzorku se použili k transformaci E. coli DH10B a buňky se nanesly na misky (42 misek s přibližně 15 - 20 koloniemi na misku, 10 misek s přibližně 90 koloniemi na misku a 8 misek s přibližně 250 koloniemi na misku). Připravily se repliky všech misek a uložily se při 4’C. Kolonie originálních misek se seškrábly a nechaly narůst v tekuté kultuře ještě několik hodin v tekuté kultuře a pak se připravila DNA.

Plasmidová DNA z těchto menších vzorků [sub-pools] byla transfekována do buněk BHK 570 a buněčné supernatanty byly sebrány a testovány jako shora. Po přibližně dvou hodinách byl jeden vzorek (#22) zhodnocen jako pozitivní mikroskopickým prohlížením (prodloužený tvar buněk). 0 několik hodin později byly dva další vzorky (#19 a #28) také zhodnoceny jako pozitivní. Zbývající supernatanty z každého pozitivního vzorku byly testovány s kontrolními BaF3 buňkami a nebyla u nich shledána žádná aktivita. Navíc: U aktivita z těchto tří pozitivních vzorků bylo nalezeno, že je inhibována rozpustným receptorem typu I.

Misky s replikami ze tří pozitivních vzorků byly ponechány růst po několik hodin, pak byly vypíchnuty jednotlivé kolonie a použity k inokulaci 3-ml kultur. Kultury se rozrůstaly přibližné 8 hodin při 37’C, pak se připravila DNA miniprepovým způsobem popsaným shora. Plasmidová DNA byla transfekována do buněk BHK 570 a buněčné byly sebrány přibližně po 10 hodinách a testovány na aktivitu. Jeden klon (označený T1081-19-215 a odpovídající vzorku #19) byl hodnocen po jedné hodině jako pozitivní. Tento klon byl znovu nanesen k získání jednotlivých kolonií. Z dvanácti kolonií byla připravena DNA a transfekována do buněk BHK 570. Všech dvanáct transfektantů bylo později v testu shledáno jako pozitivní. DNA z jedné z dvanácti pozitivních kolonií byla transformována do E. coli DHPa. Tento plasmid byl označen pZGmpl-1081. Tento transformant byl uložen 14. února 1994 u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, pod přístupovým číslem 69566.

Byla stanovena nukleotidová sekvence cDNA kódující hematopoetickou bílkovinu (thrombopoietin) (Vzorec III). Analýza kódované aminokyselinové sekvence (Vzorec I) ukazovala, že amino-konec maturní bílkoviny je u aminokyselinového zbytku 45. Dva methioninové kodony, v pozicích 105 a 174 ve Vzorci III se zdají být iniciačními kodony, s hlavním místem iniciace očekávaným v pozici 174.

Příklad 8

Hernatopoetická aktivita rekombinantního thrombopoietinu.

Z femurů a tíbií samičích CD-I post-pregnantních myší byla vzata dřeň do 25 ml CATCH pufru (99 mg theofylinu, 0,75 g citrátu sodného, 75 mg adenosinu, 20 ml lOx Hankova vyváženého solného roztoku bez Ca⁺⁺ a Mg⁺⁺ na 200 ml v dH₂O; pH 7,4). Buňky byly suspendovány na suspenzi jednotlivých buněk pipetováním 25 ml pipetou. Objem byl nastaven CATCH pufrem na 50 ml a buňky byly peletovány při 1000 rpm po 7 minut. Peleta byla resuspendována v 25 ml CATCH pufru a inkubována v T75 láhvích pro tkáňové kultury k prvnímu kolu adheze k plastu po 2 hodiny při 37°C. Neadherované buňky byly sebrány a centrifugovány při 1000 rpm po 7 minut k zpeletování buněk. Peleta byla resuspendována v 15 ml alfa-NEM + 10 % FBS (+ L-glutamin, Na-pyruvát a PSN antibiotika) a inkubována v T75 láhvích pro tkáňové kultury k druhému kolu adheze k plastu jak je popsáno shora pro první kolo. Po finální centrifugací a resuspendování byly buňky počítány. Jedna polovina buněk o 576 000 buňkách/ml byla nanesena do 24-jamkových kultivačních destiček, spolu se vzorkem média z kontrolních BHK buněk nebo s kondicionovaným médiem z BHK buněk transfekováných pZGmpl-1081. Po třech dnech inkubace při 37“C byly buňky sebrány a barveny jak se popisuje shora.

Z kontrolní jamky se standardním kondicionovaným médiem se vzalo 150 μΐ buněk. Z jamek s kondicionovaným médiem z BHK buněk transfekovaných pZGmpl-1081 se bralo 50 μΐ buněk. Tyto vzorky byly stočeny a byla připraveny standardní mikroskopické preparáty.

Preparáty byly fixovány v 100 %-ním methanolu, pak omývány 1 : i Wrightovým roztokem (0,5 g Wrightova barviva v 300 ml methanolu) / H₂O po 6 minut, promyty vodou a usušeny. Preparáty byly pak omývány v barvivu Giemsa (Sigma Chemical Corp.) v Sorensenově pufru (2,28 g KH₂PO^ / 2,38 g NaPO^ v 250 ml H₂O), myty vodou a usušeny.

Po vztažení na použité objemy, vzorek s médiem BHK/pZGmpl-1081 obsahoval 120 megakaryocytů na 150 μΐ objem ve srovnání s 9 megakaryocyty na 150 μΐ objem u kontrolního média. Navíc bylo u megakaryocytů vzorku s experimentálním působením mikroskopicky pozorováno, že jsou rozměrově významně větší a že mají významné vyšší barvení na polynukleární obsah.

Kondicionované média z mutantní linie BaF3/MPLRl.l 24-11-5 #3 bylo sebráno a zkoncentrováno 20 krát na filtračním zařízení Amicon lne. s mezí 10 kDa (Beverly, MA). Vzala se dřeň z myších femurů a suspendovala v Iscoveově modifikovaném Dulbeccově médiu (GIBCO BRL) + 15 % fetálního telecího séra (FCS). Po suspendování byly buňky s jádry spočítány a naneseny s 0,9 ml/misku při 75 000 buněk/ml, v médiu nastaveném tak, aby obsahovalo 50 % methylcelulosy, 15 % FCS, 10 % BSA a 0,6 % PSN (polotuhé médium), na 1-ml misky pro tkáňové kultury. Přidala se různá kondicionované média a kontrolní vzorky tak, aby se celkový objem dostal na 1 ml. Misky se inkubovaly při 37’C / 5 % CO₂ po 6 dní a pak se prohlížely mikroskopicky ke stanovení počtů kolonií granulocytů/magrofágů (GM). U misek inkubovaných v přítomnosti kondicionovaného média 24-11-5 #3 se pozorovalo, že mají slabou aktivitu podobnou GM-CSF, produkující počet kolonií 25, ve srovnání s nulovým počtem pro vzorek negativní kontroly a počtem 130 pro misku stimulovanou s pozitivní kontrolou (kondicionované médium sleziny stimulované řepkovým mitogenem (PWMSCM), připravené inkubací rozdrcené myší sleziny po jeden týden v přítomnosti řepkového mitogenu (získaného od Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) + 2 jednotky/ml erythropoietinu).

Vzala se dřeň z myších femurů a suspendovala v Iscoveové modifikovaném Dulbeccově médiu (GIBCO BRL) obsahujícím 15 % FCS a buňky s jádry byly spočítány a naneseny na polotuhé médium jak je popsáno shora. Tyto buňky se používaly k testování aktivity bílkoviny, kódované inzertem pZGmpl-1081, ve tvorbě kolonií megakaryocytů.

Populace [pool] buněk BHK 570 stabilně transfekovaných pZGmpl-1081 se kultivovala v nepřítomnosti séra, a sbíralo se kondicionované médium. Toto kondicionované médium se testovalo jako takové a v kombinaci s kondicionovaným médiem sleziny a řepkového mitogenu, rekombinantním myším IL-3, IL-6 (Genzyme Corp., Cambridge, MA), IL-11 (Genzyme Corp.) nebo s kombinacemi těchto faktorů. PWMSCM se používalo jako pozitivní kontrola. Jako negativní kontrola se používalo nekondicionované kultivační médium.

Testované nebo kontrolní vzorky se přidávaly ke kulturám dřeně tak, aby nastavily konečný objem na 1 ml. Misky se inkubovaly při 37’C v 5 % CO₂ po 6 dní a pak se prohlížely mikroskopicky ke stanovení počtů kolonií megakaryocytů. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4. Pro souhrn: Kondicionované médium BHK/pZGmpl-1081 vykazovalo aktivitu podporující tvorbu kolonií megakaryocytů, jež byla zesilována v přítomnosti rychle působících faktorů na hladiny značně vyšší než hladiny dosahované s kterýmkoli rychle působícím faktorem samotným.

Tabulka 4

Vzorek Kolonii meqakarvocvtů

Negativní kontrola 0

PWMSCM 7

BHK/pZGmpl-1081 2

BHK/pZGmpl-1081 + PWMSCM 15

IL-3 1

IL-3 + BHK/pZGmpl-1081 8

IL-6 0

IL-6 + BHK/pZGmpl-1081 6

IL-11 1

IL-11 + BHK/pZGmpl-1081 6

IL-3 + IL-6 2

IL-3 + IL-6 + BHK/pZGmpl-1081 9

IL-3 + IL-11 5

IL-3 + IL-11 + BHK/pZGmpl-1081 15

In vivo aktivita kondicionovaného média BHK/pZGmpl-1081 byla testována na myších. Bezsérové a zkoncentrováno 5 krát filtračního (Amicon lne., Beverly, MA). Kontrolní bylo zkoncentrováno podobným způsobem. Na šest myší BALB/c (Simonsen Laboratories, lne., Gilroy, CA) se působilo denně sedmi intraperitoneálními injekcemi 0,5 ml bud kontrolního nebo kondicionovaného média. Vzorky krve byly odebírány ve dnech 0, 3 a 7, a byl v nich spočítán obsah destiček. Výsledky, ukázané v Tabulce 5, předvádějí, že kondicionované médium z buněk BHK/pZGmpl-1081 má thrombopoetickou aktivitu.

médium bylo sebráno zařízení s mezí 10 kDa (nekondicionované) médium

Tabulka 5

Působení	Počet destiček (104/μ1)
den 0	den 3	den 7
Kontrola	141	141	87
Kontrola	159	149	184
BHK/pZGmpl-1081	157	160	563
BHK/pZGmpl-1081	169	154	669
BHK/pZGmpl—1081	139	136	492
BHK/pZGmpl-1081	135	187	554

Příklad 9

Izolace lidského thrombopoietinového genu

Amplifikovaná Lambda FIX^R genomická knihovna (Stratagene Cloning Systems) byla probírána k kódujícího lidský thrombopoietin s použitím myší cDNA Iigandu mpl receptoru jako sondy. Knihovna byla ztitrována a 30 150-mm misek s inokulovaných buňkami E. coli kmene LE-392 (Stratagene Cloning Systems) bylo infikováno s 4 x 10⁴ jednotek tvorby plaků (PFU). Misky byly inkubovány přes noc při 37’C. Vyzvednutí plaků na filtry se provedlo s použitím HYBOND-N™ membrán (Amersham) podle postupu doporučovaného výrobcem. Filtry byly zpracovány denaturací v roztoku obsahujícím 1,5 M NaCl a 0,5 M NaOH po 7 minut při pokojové teplotě. Filtry byly krátce odsáty na filtračním papíru k odstranění přebytku denaturačního roztoku, po čemž následovala neutralizace po 5 minut v 1 M Tris-HCl (pH 7,5) a 1,5 M NaCl. Fágová DNA byla fixována na filtry s 1 200 gJouly UV energie v přístroji STRATALINKER^R UV crosslinker (Stratagene Cloning Systems). Po fixaci se filtry předmyly třikrát v 0,25 x SSC, 0,25 % SDS a 1 mM EDTA při 65°c. Po předmytí byly filtry prehybridizovány v hybridizačním roztoku (5x SSC, 5x Denhardtův roztok, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA), jenž byl zfiltrován přes 0,45 μιη filtr. Tepelné denaturovaná DNA lososího spermatu (konečná lidských plic nalezení genu koncentrace 100 μg/ml) byla přidána těsně před použitím. DNA filtry se prehybridizovaly přes noc při 65*C.

TPO cDNA plné délky z pZGmpl-1081 byla označena ³²P pomocí startování náhodnými primery s použitím systému MEGAPRIME™ DNA Labelling System (Amersham). Prehybridizačni roztok byl odstraněn a nahražen čerstvým hybridizačním roztokem obsahujícím přibližně 1 x 10⁶ cpm sondy a hybridizace byla ponechána přes noc při 65C. Po hybridizaci byl hybridizační roztok odstraněn a každý filtr byl čtyři- nebo pětkrát ponořen do promývacího roztoku obsahujícího 0,25 x SSC, 0,25 % SDS, 1 mM EDTA. Po ponořeních byly filtry promyty osmi po sobě následujícími mytími v promývacím roztoku při 55’C. Po posledním mytí byly filtry exponovány na autoradiografický film (XAR-5; Eastman Kodak Co., Rochester, NY) s intenzifikační fólií po 4 dny při -70°C.

Prohlídka autoradiogramů odhalila několik set míst, jež hybridizovala se značenou sondou. Ze 100 míst byly vypíchnuty agarové válečky a ponořeny do SM obsahujícího 1 % (obj./obj.) chloroformu (Maniatis et al., vyd., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Po inkubaci přes noc byly fágy z každého agarového válečku zředěny 1 : 1 000 v SM. Alikvoty 5 μΐ byly nanášeny na buňky E. coli kmene LE-392. Misky byly inkubovány přes noc při 37*C a vyzvednutí plaků na filtry, prehybridizace, hybridizace, promývání a autoradiografie se provedly jak je popsáno shora.

Prohlídka výsledných autoradiogramů odhalila silné pozitivní signály z dvou primárních izolátů a slabé signály z osmnácti dalších. Z pozitivních oblastí všech dvaceti signálů byly vypíchnuty agarové válečky. Tyto agarové válečky byly zpracovány jak je popsáno shora. Fágy z každého agarového válečku byly zředěny 1 : 100 v SM a alikvoty 1 μΐ byly nanášeny na buňky E. coli kmene LE-392. Misky byly inkubovány, a vyzvednutí plaků a hybridizace se provedly jak je popsáno shora. Filtry se promývaly v promývacím pufru při 55*C. Autoradiogramy těchto filtrů odhalily místa hybridizace odpovídající jednotlivým, odděleným fágovým plakům ze tří původních izolátů, 8-3-2, 10-1-1 a 29-2-1.

Fágové izoláty 8-3-2, 10-1-1 resp. 29-2-1 byly označeny jako XZGmpl-H8, \ZGmpl-H10 resp. )<ZGmpl-H29. DNA z izolátů )<ZGmpl-H8, XZGmpl-H10 a XZGmpl-H29 byla čištěna s použitím fágového

- 62 adsorbentu LAMBDASORB™ (Promega Corp., Madison, WI) podle návodu výrobce. Inzerty lidské genomické DNA ve fágu byly od fagové vektorové DNA separovány digesci Xba I a vyčištěny gelovou elektroforézou. Všechny tři fágové izoláty obsahovaly sekvence, které hybridizovaly se sondou myší cDNA ligandu mpl receptoru, jak ukázala Southernova analýza (Maniatis et al., ibid.). Byl analyzován fág \ZGmpl-H8 a pro hybridizující oblasti \ZGmpl-H8 se nalezlo, že sídlí ve třech Xba I DNA fragmentech o délkách 9,5 kb, 2,5 kb alkb. Fragment 2,5-kb délky byl subklonován do Xba I digerovaného fagemidů BLUESCRIPT¹* II SK+ (stratagene Cloning Systems) za vzniku plasmidu pZGmpl-H82.5.

Příklad 10

Izolace cDNA lidského thrombopoietinu plné délky cDNA plné délky, kódující lidský TPO, byla izolována polymerasovou řetězovou reakcí z templátové cDNA lidských jater a ledvin s použitím specifických primerů odvozených od exonových sekvencí identifikovaných v pZGmpl-H82.5 a od konzervované 5’ nepřekládané sekvence myší TPO cDNA.

K syntéze prvního vlákna se použily póly d(T)-selektované poly(A)⁺ RNA lidských ledvin, jater a plic (Clontech, Palo Alto, CA). Každá reakce se připravila s použitím čtyř mikrogramů poly(A)⁺ RNA smíchaných s 1 μg oligo d(T)₁₈ (bez 5' fosfátu) rnRNA primerů (New England Biolab, Beverly, MA) v konečném objemu 19 μΐ. Směsi byly zahřívány na 65 *C po pět minut a ochlazeny chlazením na ledu. Syntéza cDNA byla spuštěna přidáním 8 μΐ 5x SUPERSCRIPT™ pufru (GIBCO BRL), 2 μΐ 100 mM dithiothreitolu, 2 μΐ roztoku deoxynukleotid trifosfátů obsahujícího po 10 mM dATP, dGTP, dTTP a dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ), 2 μθί 1 μθί/μ1 ³²P-adCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) a 8 μΐ 200 jednotek/μΐ SUPERSCRIPT™ reversní transkriptasy (Gibco BRL) ke každé směsi RNA-primer. Reakce byly inkubovány při 45’C po 1 hodinu a byly zředěny na 120 μΐ pomocí TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). cDNA byly sráženy dvakrát přidáním 50 μΐ 8 M octanu amonného a 160 μΐ isopropanolu. Výsledné cDNA pelety byly resuspendovány v 10 μΐ TE. Výtěžek cDNA prvního vlákna byl pro každou reakci stanoven z hladiny inkorporace ^{3 2}P-adCTP.

cDNA prvního vlákna z jaterní, plicní a ledvinové mRNA byla použita ke generování dvou segmentů cDNA, N-koncové třetiny a C-koncových dvou třetin sekvence, za použití separátních polymerasových řetězových reakcí. Do cDNA segmentů bylo zavedeno Kpn 1 restrikční místo pomocí záměny jediné báze genomické sekvence s použitím PCR mutagenesy využívající primery ZC7422 (GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT) a ZC7423 (AGCCTCCTTG GTACCCAGCT TCC). Výsledná nukleotidová záměna vytvořila společné Kpn I restrikční místo bez změny v predikovaném kódování aminokyselin.

N-koncový segment byl amplifikován v 50 μΐ reakci obsahující 5 ng templátové cDNA (v oddělených reakcích pro cDNA ledvin, jater a plic), po 80 pmolech obou oligonukleotidů ZC7424 (TTAGACACCT GGCCAGAATG) a ZC7422 (GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT), 5 μΐ 2,5 mM roztoku deoxynukleotid trifosfátů (Cetus Corp., Emeryville, CA), 5 μΐ 10 x CPR pufru (Promega Corp., Madison, WI) a 2,5 jednotky Taq polymerasy (Boehringer Mannheim). Řetězová reakce byla nechána běžet po 35 cyklů (1 minuta při 94’C, 1 minuta při 58’C, a 1,5 minuty při 72’C), s následující 10 minutovou inkubací při 72’C. Sense primer ZC7424 (TTAGACACCT GGCCAGAATG) pokrýval 5' nepřekládanou sekvenci myšího Iigandu mpl receptoru a zahrnoval iniciační kodon ATG. Antisense primer ZC7422 (GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT) zahrnoval sekvence z oblastí odpovídajících exonům 4 a 5 lidské genomické TPO DNA.

C-koncový segment byl amplifikován v 50 μΐ reakci obsahující jater nebo plic jak je oligonukleotidů ZC7423 (TGATGTCGGC AGTGTCTGAG ng templátové cDNA (lidských ledvin, popsáno shora), po 80 pmolech obou (AGCCTCCTTG GTACCCAGCT TCC) a ZC7421 AACC), 5 μΐ 2,5 mM roztoku deoxynukleotid trifosfátů (Cetus Corp.), 5 μΐ 10 x CPR pufru (Promega Corp.) a 2,5 jednotky Taq polymerasy (Boehringer Mannheim). Řetězová reakce byla nechána běžet po 35 cyklů (1 minuta při 94’C, 1 minuta při 65’C, a 1,5 minuty při 72’C), s následující 7 minutovou inkubací při 72’C. Sense primer ZC7423 (AGCCTCCTTG GTACCCAGCT TCC) zahrnoval sekvence z oblastí odpovídajících exonům 4 a 5 lidské genomické TPO DNA. Antisense primer ZC7421 (TGATGTCGGC AGTGTCTGAG AACC)

Vzorci II. signálního

Sekvenční peptidu se ukázaly, že lidský TPO proliferaci buněk BaF3 zahrnoval sekvenci z oblasti odpovídající 3' nekódující sekvence lidského genu a obsahoval translační terminační kodon.

Amplifikované produkty PCR byly analyzovány přímým sekvenováním DNA a subklonovány do pGEM-T (Promega Corp.) k další analýze porovnáváním s myší cDNA sekvencí a lidskými genomickými sekvencemi. DNA sekvence kódující lidský TPO je ukázána ve Vzorci IV a kódovaná aminokyselinová sekvence je ukázána ve analýza ukazuje, že místo oštěpení nachází u aminokyseliny 22 (Vzorec II) a že maturní bílkovina začíná u aminokyseliny 22 (Vzorec li).

Lidské N-terminální a C-terminální PCR fragmenty byly vyňaty z pGEM-T jako EcoRI-KpnI fragmenty a zaligovány do EcoRI místa vektoru exprese Zem229R. Tento plasmid byl transfekován do buněk BHK 570 s použitím Lipofectamine™ (GIBCO BRL). 24 hodin po transfekci bylo kultivační médium (DMEM + PSN + 10 % FCS) nahrazeno čerstvým médiem a buňky byly inkubovány po 48 hodin bez selekčních činidel. Kondicionovaná média byla testována na proliferační aktivitu s použitím buněk BaF3/MPLRl.l jak bylo popsáno dříve. Výsledky jasně v kultivačním médiu stimuluje exprimujících myší MPL receptor.

cDNA se připravila jak z lidské jaterní, tak z lidské ledvinové mRNA (získaných z Clontech Laboratories, Inc.) s použitím SUPERSCRIPT™ reversní transkriptasy (GIBCO BRL) podle výrobcových specifikací. Klony lidské TPO DNA odvozené z jater a z ledvin byly pak připraveny s použitím dvou PCR reakcí (podmínky ukázané v Tabulce 6). Reakce byly nechány běžet po 35 cyklů při 94C po 1 minutu, 58’C po 1 minutu, 72’C po 1,5 minuty; s následující 7 minutovou inkubací při 72’C.

Tabulka 6

Reakce č. 1 ng cDNA jater nebo ledvin μΐ oligonukleotidu ZC7454 (CCGGAATTCT TAGACACCTG

GCCAGAATG) (20 ρΜ/μΙ), zavádí EcoRI místo 5' od ATG μΐ oligonukleotidu ZC7422 (GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT) (20 ρΜ/μΙ), vytváří Asp718 místo μΐ dNTP roztoku obsahujícího 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP,

2,5 mM dCTP a 2,5 mM dTTP 5 μΐ 10 x Taq pufru (Boehringer Mannheim) μΐ Taq polymerasy (Boehringer Mannheim) μΐ H₂O

Reakce č. 2 ng cDNA jater nebo ledvin μΐ oligonukleotidu ZC7423 (AGCCTCCTTG GTACCCAGCT TCC) (20 ρΜ/μΙ), vytváří Asp718 místo μΐ oligonukleotidu ZC7453 (CCGGAATTCT GATGTCGGCA

GTGTCTGAGA ACC) (20 ^οΜ/μΙ), zavádí EcoRI místo 3'

Od TGA μΐ dNTP roztoku obsahujícího 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP,

2,5 mM dCTP a 2,5 mM dTTP 5 μΐ 10 x Taq pufru (Boehringer Mannheim) μΐ Taq polymerasy (Boehringer Mannheim) μΐ H₂O

Produkty PCR byly zpracovány fenolem/chloroformem/ isoamylalkoholem a sraženy 95 % EtOH, usušeny a resuspendovány v 20 μΐ H₂O. Každý produkt Asp718 a EcoRI a podroben 410 bp fragmenty (játra a pak byl štěpen restrikčními enzymy elektroforéze v gelu 1 % agarosy.

ledviny) z reakce č. 1 a 699 bp fragmenty (játra a ledviny) z reakce č. 2 byly vyříznuty z gelu a eluovány z řezů gelu centrifugací přes nylonovou vatu.

PCR produkty reakce č. 1 a reakce č. 2 byly zaligovány dohromady s vektorem Zem229R (uloženým u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 28. září 1993 pod přístupovým číslem 69447), jenž byl otevřen EcoRI, za spojení těchto dvou produktů ve vytvořeném Asp7l8 místě. Výsledné plasmidy byly označeny #10 (obsahuje cDNA odvozenou z ledvin) a #29 (obsahuje cDNA odvozenou z jater).

Při sekvenování těchto DNA byla nalezena jediná PCR-generovaná chyba 5’ resp. 3' od unikátního AvrlI místa plasmidů #28 resp. #10. Pro vytvoření bezchybné TPO DNA byl izolován 826 bp EcoRI-AvrlI 5' fragment z plasmidu #10 a 283 bp AvrlI-EcoRI 3' fragment z plasmidu #28. Tyto dav fragmenty byly zaligovány dohromady s vektorem Zem229R, jenž byl otevřen EcoRI. Tento plasmid byl uložen u American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 4. května 1994 jako E. coli DHlOb transformant pod přístupovým číslem 69615.

Příklad 11

Knihovna cDNA megakaryocytů

K amplifikaci prekursorů megakaryocytů in vivo bylo 20 myším intraperitoneálné injikováno denně 40 000 aktivitních jednotek (jednotky jsou definovány tak, že 50 jednotek/ml je potřebných u buněk BaF3/MPLRl.l v MTT testu (Příklad 7) k získání proliferační rychlosti rovné polovině maximální) rekombinantního myšího thrombopoietinu (koncentrovaného bezsérového kondicionovaného média z buněk BHK 570 stabilně transfekovaných myší thrompoietinovou cDNA). V pátý den injekcí byly vyňaty sleziny a dány do CATCH pufru + HEPES (lOx Hankův vyvážený solný roztok bez vápníku a hořčíku, 10 mM HEPES (GIBCO BRL), 1,4 mM adenosin, 2,74 mM theofylin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) a 0,38 % citrát sodný, pH nastaveno hydroxidem sodným na 7,

40). Sleziny byly zpracovávány po pěti tak, že na každé se provedly řezy a buňky z nich byly vytlačeny mezi dvěmi nerezovými síťkami do CATCH pufru + HEPES. Po rozvolnění určitých chuchvalců buněk 25 ml pipetou byl objem zvýšen na 50 ml a buňky byly stočeny při 208 x g po 7 minut v centrifuze Sorval TJ-7. Každá (alfa modifikace ribonukleosidů a

BHK 570 stabilně Buňky pak byly kultury při 10⁶ plně zvlhčovaném buněčná peleta byla resuspendována v 10 ml CATCH pufru + HEPES a filtrována přes 130 μη nylonovou šířku k získání suspenze jednotlivých buněk. Objemy bylý zvýšeny na 50 ml CATCH pufrem + HEPES a buňky byly stočeny při 33 x g po 10 minut. Buněčné pelety byly resuspendovány v 10 ml CATCH pufru + HEPES a navrstveny na třístupňový gradient Percollu (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Švédsko) (gradient 65, 40 a 27 % v 1 x CATCH pufru + HEPES, 12 ml každého v 50 ml centrifugační kývete) a centrifugovány při 833 x g po 45 minut. Byly sebrány buňky mezi vrstvami 40 a 5 % Percollu a objemy byly zvýšeny na 50 ml CATCH pufrem + HEPES. Buňky byly stočeny při 208 x g po 7 minut a resuspendovány v 50 ml megakaryocytového růstového média minimálního esenciálního média, bez desoxyribonukleosidů), s 15 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra, 2 mM L-glutamátem (složky médií získány od JRH Bioscience lne., Lenexa, KS), 1 mM pyruvátem sodným (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) 1 x PSN směsí antibiotik (GIBCO BRL) a přidanými 1 000 aktivitními jednotkami rekombinantního myšího thrombopoietinu/ml (koncentrovaného bezsérového kondicionovaného média z buněk transfekováných myší thrompoietinovou cDNA) naneseny na 150 mm misky pro tkáňové monojaderných buňkách/ml a nechány růst v inkubátoru s 6,0 % C0₂ ve vzduchu při 37*C. Po třech dnech růstu byly neadherované buňky sebrány do 50 ml centrifugačních kyvet a ochlazeny na ledu. Velké buňky byly peletovány centrifugací při 33 x g po 15 minut při 4’C. Buněčné pelety byly resuspendovány v 50 ml CATCH pufru + HEPES za pokojové teploty a stočeny při 33 x g po 10 minut. (Všechny další kroky se provádějí za pokojové teploty). Toto promytí se zopakovalo s cílem získat vyšší čistotu maturních megakaryocytů. Zbývající buňky se resuspendovaly v 15 ml CATCH pufru + HEPES (spojený objem) a navrstveny na tři stupňové gradienty fetálního bovinního séra (JRH Biosciences) (65 a 40 % v CATCH pufru + HEPES) k sedimentaci při 1 x g po 30 minut. Spodních 5 ml z 65 %-ních frakcí se spojilo, zředilo na 50 ml CATCH pufrem + HEPES a stočilo při 33 x g po 10 minut. Pelety obsahovaly víc než 10⁷ buněk. Buňky byly testovány na acetylcholinesterasu metodou Bursteina et al., («7. Cell. Physiol. 122:159-165, 1985) a byly stanoveny jako maturní megakaryocyty ο čistotě vyšší než 99 %. Peletované buňky byly pak lyžovány v roztoku guanidinium thiokyanátu/2-merkaptoethanolu k izolaci RNA centrifugací v hustotním gradientu chloridu césného.

Z megakaryocytové RNA se cDNA připraví tak, jak je uvedeno v Příkladu 6, shora.

Příklad 12

Mapování lidského thrombopoietinového genu fluorescenční in šitu hybridizací.

Do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky na ledu byly přidány následující složky: 1 μg ^ZGmpl-H8, XZGmpl-H10 nebo XZGmpl-H29 obsahujícího lidský thrombopoietinový gen, 5 μΐ 10 x nick-translačního pufru (0,5 M Tris-HCl, 50 mM MgCl₂ , 0,5 mg/ml BSA (prostého nukleas)), 5 μΐ dNTP roztoku obsahujícího 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP a 2,5 mM dCTP, 5 μΐ 5 mM Bio-ll-dUTP (5-(N-[N-biotinyl-e-aminokaproyl]-3-aminoallyl)-2'-deoxyuridin 5'-trifosfát, Sigma Chemical Co.), 5 μΐ 100 mM DTT, 5 μΐ DNasy (1000 x ředění ze zásobního roztoku 10 U/μΙ, Boehringer Mannheim, RNasy prostá), 2,5 μΐ DNA polymerasy I (5 U/μΙ, Boehringer Mannheim), H₂0 do konečného objemu 50 μΐ. Po smíchání byly reakce inkubovány při 15°C po 2 hodiny v chladicí mikrolázni typu Boekel. Reakce byly zastaveny přidání 5 μΐ 0,5 M EDTA, pH 7,4. Sondy byly vyčištěny s použitím DNA-purifikačních centrifugačních kolonek Sephadex^R G-50 (Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ) podle výrobcových instrukcí. K ověření velikostí značených sond bylo 5 - 10 μΐ každé vyčištěné sondy smícháno s 5 μΐ nakládacího gelového pufru (12,5 % ficoll, a 0,2 % bromfenolová modř, 0,2 M Tris-acetát, 0,1 mM octan sodný, 1 mM EDTA) a necháno běžet na mini-gelu 0,7 % agarosy při 80 V. Jako markéry velikosti v párech baží (bp) se použily χ-Hind III fragmenty (GIBCO BRL) a ^X-Hae III fragmenty (GIBCO BRL). Digoxigeninem značená centromerická sonda specifická pro chromosom 3 (D3Z1) byla získána od firmy Oncor (Gaithersburg, MD).

Metafázové chromosomy byly získány z kultury buněk HEL. Do média v používané 100 x 15 mm Petriho misce se přidalo 100 μΐ

Colcemid^R (GIBCO BRL, zásobní roztok 10 μg/ml) a buněčná kultura se inkubovala při 37*C. Po 2,5 - 3 hodinách se z Petriho misky s použitím 10 ml sterilní plastové pipety odebralo médium a přeneslo do 15 ml polypropylenové kónické zkumavky (Blue Max , Becton Dickinson). Na Petriho misku se přidalo s použitím 5 ml sterilní plastové pipety k opláchnutí 2 ml 1 x PBS (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 ,1,5 mM KH2PO4 , pH 7,2) a přeneslo do kónické zkumavky. Do Petriho misky se s použitím 5 ml sterilní plastové pipety přidalo 2 ml trypsinu (GIBCO BRL, zásobní roztok) a Petriho miskou se jemně zakývalo a dala se na 3 - 5 minut do 37’C-inkubátoru. Buňky se pak s použitím 5 ml sterilní plastové pipety smyly z Petriho misky a daly do zkumavky s médiem. Kultivační zkumavka se centrifugovala při 250 x g po 8 minut a celý supernatant až na 0,5 ml byl odstraněn. Peleta se resuspendovala poklepáním a pak se pomalu a jemně přidalo 8 ml 0,075 M KCl (předehřátého na 37*C). Suspenze se jemně promíchala a umístila ve vodní lázni o 37’C na 10 minut. Roztok se centrifugoval při 250 x g po 5 minut a celý supernatant až na 0,5 ml nad peletou byl odstraněn. Peleta se resuspendovala poklepáním na zkumavku. K fixování buněk se po kapkách přidaly dva ml studené směsi methanol/kyselina octová (3 : 1). Celkově se takto přidalo 8 ml fixační směsi. Zkumavka se na 20 minut umístila do lednice, s následnou centrifugací po 5 minut při 250 x g. Supernatant byl znovu odtažen a fixační proces opakován ještě dvakrát. U nanesení metafázových nátěru na 25 x 75 mm předčištěná matovaná sklíčka (VWR Scientific, Media, PA) se na každé sklíčko bodově naneslo pomoci 20 μΐ pipetoru Pipetman^Ali (Gilson Medical Electronics, lne., Middleton, WI) 5 μΐ 50 % kyseliny octové a následně 5 μΐ suspenze buněk. Sklíčka byla ponechána uschnout na vzduch a pak před použitím nechána dozrát přes noc v 42’C-pícce (Boekel Industries, lne., Philadelphia, PA). Na sklíčkách se s použitím mikroskopu vybaveného kondensorem pro fázový kontrast spočítaly vhodné metafázové nátěry. Některé preparace matafázových chromosomů byly před použitím k hybridizačním experimentům vybarveny na G-pruhy Gurrovým vylepšeným R66 Giems barvivém (BDH Ltd., Dorset, Anglie), fotografovány a odbarveny. Preparovaná sklíčka s nátěry lidských metafázových chromosomů byla inkubována po 2 hodiny v 2 x SSC (0, 3 M NaCl, 0,03 M citrát sodný, pH 7,0), ponořena krátce do H2O

- 70 a barvena v Gorrově Giemsa barvivu, jež bylo před použitím zředěno 1 : 4 Giemsa pufrovacím roztokem, pH 6,5 (BDH Ltd.) a zfiltrováno přes filtr Whatman #1. Některé preparáty byly před inkubací v SSC napřed inkubovány po 45 minut až 1 hodinu v pícce při 90 *C a ponechány vychladnout. Preparáty pak byly rozlišeny v pufrovaném roztoku Giemsa, opláchnuty H₂O a usušeny na vzduchu. Vhodné nátěry metafázových chromosomů s G-pruhy fotografovány na mikroskopu Olympus s použitím inverzního filmu Kodak Ektachrome™ 400, a digitalizovány a uloženy s použitím barevného video-kamerového systému Optronics (Goleta, CA) ZVS-47E CCD RGB a software Optimus (od BioScan lne., Edmonds, WA). Preparáty byly před dalším použitím odbarveny po asi 20 min. v 100 % EtOH a usušeny na vzduchu. Nepoužité preparáty sklíček s metafázovými chromosomy byly skladovány při -70’C.

Hybridizační směsi se připravovaly v 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavkách smícháním 2,5 μΐ kompetitorové

DNA (Cot-1 DNA, GIBCO BRL) 40-60 ng biotinylem značeného fága

XZGmpl-H8, XZGmpl-H10 nebo /ZGmpl-H29 (obsahujícího lidský thrombopoietinový gen), 7 μg nosičové DNA (denaturovaná DNA lososích testes, Sigma Chemical Co.), 1 ml 3 M NaOAc a 2 objemů ethanolu; byly vakuové odpařeny v koncentrátoru typu Speedvac.

Pelety byly rozpuštěny v 10 μΐ hybridazačního roztoku, sestávajícího z 10 % dextran sulfátu, 2 x SSC a 50 % formamidu (EM Science, Gibbstown, NJ). DNA sondy a kompetitorová DNA byly denaturovány při 70 - 80’C po 5 minut, ochlazeny na ledu a předhybridizovány při 37*C po 1 - 2 hodiny. Denaturace chromosomů se provedla ponořením každého sklíčka do 70 % formamidu, 2 x SSC při 70 - 80*C na 5 minut, s následujícím okamžitým ochlazením v ledově chladném 70 % ethanolu, pak v 100 % ethanolu, pokaždé po 5 - 10 minut. Pak byla sklíčka těsně TM před tím, než na ně byly pomocí 20 μΐ pipetoru Gilson Pipetman pipetovány hybridizační směsi, usušena na vzduch a zahřáta na 42’C. Hybridizační směsi a chromosomy pak byly pokryty 18 x 18 mm krycími sklíčky No. 1 (VWR Scientific). Hybridizace probíhala ve vlhké komůrce při 37’C přes noc. V některých případech se po přibližně 6 hodinách hybridizačního času přidalo k preparátům 5 - 10 ng denaturované, digoxigeninem značené centromerické sondy D3Z1 (v hybridizačním roztoku 10 % dextran sulfátu, 2 x SSC a 50 % formamidu).

x SSC, 0,05 % Sigma Chemical

Po odstranění krycích sklíček se sklíčka s preparáty promývala 3x5 minut v 50 % formamidu, 2 x SSC při 42*c, 3 x 5 minut v 2 x SSC při 42’C, a 1 x 3 minuty v monolaurátu polyoxyethylensorbitanu (Tween-20,

Co.). Toto bylo následováno 20 minutovou inkubací s 4 x SSC, 5 % netučného sušeného mléka ve vlhké komůrce (100 μΐ pod krycím sklem 24 x 50 mm). Pro preparace které zahrnovaly centromerickou sondu D3Z1 pro chromosom 3 se pak prováděla 45-minutová inkubace s 1 : 100 ředěním biotinem značené myší anti-digoxinové protilátky (Sigma Chemical Co.) v 4 x SSC / 5 % BSA, následovaná třikrát 3-minutovým mytím v 4 x SSC, 0,05 % Tween-20. Pak pro všechny preparace následovaly post-hybridizačni kroky, s 20 minutami inkubace s fluorescein-značeným avidinem (Fluorescein Avidin, DCS, Vector Laboratories, Burlingame, CA) (100 μΐ, 5 μg/ml, v 4 x SSC, 5 % netučného sušeného mléka) pod krycím sklem 24 x 50 mm. Sklíčka pak byla myta 3 x 3 minuty v 4 x SSC, 0,05 % Tween-20, s následující 20 minutovou inkubací s biotinylovanou ovčí protilátkou proti avidinu D (afinitně purifikovanou, Vector Laboratories) (5 μ9/ιη1 v 4 x SSC, 5 % netučného sušeného mléka) pod krycím sklem 24 x 50 mm. Sklíčka pak byla znovu myta 3 x 3 minuty v 4 x SSC, 0,05 % Tween-20, s následující další inkubací s fluorescein-značeným avidinem (100 μΐ, 5 μg/ml, v 4 x SSC, 5 % netučného sušeného mléka) pod krycím sklem 24 x 50 mm. V některých případech byl tento postup amplifikace signálu zopakován ještě jednou. Finální promytí bylo 2x3 minuty v 4 x SSC, 0,05 % Tween-20 a 1 x 3 minuty v 1 x PBS. Sklíčka byla upevněna na protistínící médium sestávající z 9 dílů glycerolu obsahujícího 2 % l,4-diazobicyklo-(2,2,2)oktanu (DABCO, rozpuštěn při 70”C) a 1 dílu 0,2 M Tris-HCl, pH 7, 5, a 0,25 až 0,5 μg/ml propidium jodidu. Sklíčka byla prohlížena na mikroskopu Olympus BH2 vybaveném BH2-RFC přídavným zařízením pro fluorecsenci v odraženém světle, PM-10 ADS automatickým fotomikrografickým systémem, ZVS-47E CCD RGB barevným video-kamerovým systémem Optronics, a sadou filtrů FITC/Texas Red, Chromá Technology Corp. (Brattlebow, VT), k vizualizaci FITC. Obrazy nátěrů metafázových chromosomů byly digitalizovány a uloženy s použitím barevného video-kamerového systému Optronics a software Optimus.

Předběžné výsledky z postupu fyzikálního mapování ukázaly, že lokus lidského thrombopoietinového genu je distální k oblasti 3q26 ramene q chromosomu 3.

Příklad 13

Exprese myší TPO cytokinové domény v Saccharomyces cerevisiae

Plasmid pABJ3-5 obsahuje promotor S. cerevisiae TPI1, sekreční zaváděcí sekvenci α-faktoru, myší TPO kóující sekvenci (Vzorec XII) od bp 237 po 692, translační terminátor TPI1, 2μ sekvence pro replikaci v kvasinkách a triosofosfát isomerasový gen Schizosaccharomyces pombe (POTÍ gen) k selekci v kvasinkách. Tento plasmid byl určen k řízení sekrece myší TPO bílkoviny obsahující aminokyseliny 45 - 196 ze Vzorce I.

Pro konstrukci pBJ3-5 byl pMVRl (Obrázek 2) digerován Sphl a Xbal, a byl získán základ vektoru, obsahující 5' část promotoru TPI1 a terminátor TPI1. Do základu vektoru byly vloženy následující fragmenty:

1) SphI/HindlII fragment odvozený z pBS114, jenž obsahuje 3' část TPI1 promotoru a zaváděcí sekvenci a-faktoru. Plasmid pBS114 je kvasinkový přehazovací [shuttle] vektor, jenž obsahuje promotor TPI1 a zaváděcí sekvenci α-faktoru, následovanou sekvencí poly-spojky, která zahrnuje HindlII místo.

2) PCR-generovaný HindlI/SalI fragment obsahujcící HindlI místo, určené k tomu, aby bylo ve stejném čtecím rámci s HindlII místem v zaváděcí sekvenci α-faktoru, Kex2 místo protolytického štěpení a myší TPO sekvenci od bp 237 po 335 ze Vzorce III.

3> Sall/EcoRI fragment obsahující myší TPO páry baží od 336 po 692 ze Vzorce III, jenž byl odvozen z plasmidu pSL-MPL-100 (zkonstruovaného amplifikací pZGmpl-1081 primerů ZC7319 (ACACTGAATT CTTCTCCACC s použitím CGGACAGAGT) a ZC7318

GGGTGGGACC TTC), digescí fragmentu obsahujícího (TACCGAATTC TAGACACAGA EcoRI a zaklonováním cytokinovou doménu a 5' nekódující sekvenci do EcoRI místa Zem229R [ATCC 69447]). Tento fragment byl zaměněn na Sall/Xbal fragment jeho klonováním do pIC19H, který byl předtím digerován Sáli a EcoRI.

Výsledný plasmid, označený pBJ3 (Obrázek 2), byl pak digerován BglII a Xhol pro uvolnění obsahující promotor, zaváděcí sekvenci, a terminátor. Tento BglII/Xhol fragment (zveřejněného v US patentu č. 5 128 321, jenž je zde zahrnut odkazem) digerovaného BamHI a Xhol. Výsledný plasmid byl označen pBJ3-5.

celé kazety exprese TPO kódující sekvenci byl vložen do pRPOT

S. cerevisiae kmene JG134 (MATa ura3-52 leu2- Δ2 pep4- /\1 fcytpil:: URA3 [cir⁰]) byly transformovány pBJ3-5 a pRPOT lithium acetátovým postupem (jak je obecně zveřejněno Itoem et al., J. Bacteriol. 153: 163-168, 1983). Transformanty se selektovaly pomocí růstu na médiích obsahujících glukosu. JG134/pBJ3-5 a JG134/pRPOT se nechaly růst na tekutém médiu YEPD po tři dny. Kultivační média byla separována od buněk centrifugací a analyzována v testu buněčné proliferace s BaF3 buňkami obsahujícími MPL receptor. Média z kmene JG134/pBJ3-5 obsahovala 5000 - 7000 jednotek/ml TPO aktivity, zatím co negativní kontrola JG134/pRPOT neměla žádnou aktivitu. Tento výsledek ukazuje, že kvasinky mohou secernovat bilogicky aktivní formu TPO.

Příklad 14

Aktivita rekombinantního lidského TPO

Plasmidová DNA ze dvou bakteriálních kultur s pZGmpl-124 kultivovaných přes noc byla připravena pomocí alkalické lyže buněk, následované navázáním DNA k náplni při vysoké soli (s použitím soupravy Magie Minipreps™ Sampler od Promega Corp.). DNA byla eluována 75 μΐ 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0.

Kultury buněk BHK 570 byly při 50 000 buňkách/ml transfekovány pZGmpl-124 DNA. 20 μΐ ředění 1 : 10 LIPOFECTAMINE™ (GIBCO BRL) se přidalo k 20 μΐ plasmidové DNA a 160 μΐ bezsérového média (F/DV médium [směs 1 : 1 DMEM a Ham F12] doplněné 10 μ9/πι1 fetuinu, 2 ng/ml selenu, 5 μg/ml insulinu, 10 μg/ml transferinu, 2 mM L-glutaminem, 110 ug/ml pyruvátu sodného, 25 mM HEPES a 0,1 mM roztokem neesenciálních aminokyselin (GIBCO BRL)) při pokojové teplotě na 30 minut před přidáním buněk BHK 570 a inkubovalo 4 hodiny při 37’C. Pak se přidalo 200 μΐ růstového média (DMEM (Biowhittaker) doplněného 110 μg/ml pyruvátu sodného, 0,05 mg/ml penicilinu, 0,05 mg/ml streptomycinu, 0,01 mg/ml neomycinu, 25 mM HEPES, 10 % fetálního telecího séra a buňky se inkubovaly při 37’C přes noc. Kultivační médium se nahradilo růstovým médiem obsahujícím 5 % fetálního telecího séra a buňky se inkubovaly 4 hodiny při 37’C.

Kondicionovaná média z transfektantů buněk BHK 570 se testovala na schopnost způsobit proliferaci buněk exprimujících myší MPL receptor. Buňky rostly v BaF3 médiu (RPMI 1640 médium (JRH Biosciences) doplněné 10 fetálního telecího séra, 2 mM L-glutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 10 mM HEPES, 57 μΜ β-merkaptoethanolem, 0,05 mg/ml penicilinu, 0,05 mg/ml streptomycinu, 0,01 mg/ml neomycinu, 4 % (obj./obj.) kondicionovaného média z WEHI-3 buněk (kultivační přídavek myšího interleukinu-3, Collaborative Biomedical Products)). Před testem se BaF3 buňky zředily a resuspendovaly v BaF3 médiu bez IL-3 na 10 000 buněk/100 μΐ. Přidalo se 100 μΐ kondicionovaného média z buněk BHK 570 transfekovaných pZGmpl-124 a kultury se inkubovaly při 37’C. Po 30 minutách a po 24 hodinách byly buňky vizuálně prohlíženy zda se prodlužují. Testovala se rovněž negativní kontrola, sestávající z BaF3 média bez IL-3, a pozitivní kontrola kondicionovaného média z BHK 570 buněk transfekovaných myší TPO DNA. Výsledky ukázaly chybějící prodlužování buněk BaF3 u negativní kontrole, určité prodlužování buněk u pozitivní kontroly a významné prodlužování buněk pro pZGmpl-124-transfekované buňky.

Příklad 15

Afinitní precipitace receptoru

150 mm misky pro tkáňové kultury, obsahující buňky, jež produkují TPO nebo normální buňky BHK, se značily po 18 hodin s 10 ml Dulbeccova MEM bez methioninu, obsahujícího 2 mM

L-glutamin, antibiotika a 200 μϋΐ preparátu ³⁵S-Express (Amersham, Arlington Heights, IL).

Po inkubaci přes noc byla použitá média sebrána

ΦΜ a zkoncentrována 15 krát s použitím koncentrátoru Centriprep-10¹ (Amicon, Inc.). Výsledných 0,7 ml koncentrovaného supernatantu se smíchalo s 40 μΐ rozpustného MPL receptoru, majícího připojený poly-histidin, který byl navázán podle návodu dodavatele k CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). Směs byla za třepání inkubována dvé hodiny na ledu.

Buňky byly promyty jedenkrát s PBS, pak lyžovány 1 ml RIP A pufru (10 mM Tris, pH 7,4, 1 % desoxycholát, 1 % Triton X-100,

0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Lyzát se zcentrifugoval k odstranění nerozpustného materiálu a přidalo se 40 μΐ MPL-Sepharose jako shora.

MPL-Sepharose pak byla usazena centrifugací při malých obrátkách a použitá média nebo buněčné lyzáty se odstranily. Peleta se myla čtyřikrát s PBS obsahujícím 0,5 M NaCl. Po posledním mytí se PBS odstranil a přidalo se 40 μΐ 2 x vzorkového pufru (10 % glycerol, 4 % SDS, 50 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA, a 0,05 % bromfenolová modř) obsahujícího 4 % beta-merkaptoethanolu.

Vzorky se vařily po 5 minut a po 18 μΐ z každého vzorku se naneslo na 10-20 % gradientovy mini-gel (Integrated Separation

Systems), a pak podrobilo elektroforéze při 100 V po dvě hodiny. Gel byl fixován po 30 minut (v 40 % methanolu, 16 % ledové kyselině octové v destilované vodě), pak namočen do roztoku Amplify™ (Amersham) na dvacet minut.

Po usušení byl gel přes noc exponován na film. -70 kDa pruh byl silně viditelný v dráze odpovídající v použitých médiích z buněk transfekovaných TPO cDNA. Tento pruh nebyl přítomen v použitých médiích z BHK bunék nebo v buněčných lyzátech žádné buněčné linie.

- 76 Z předchozího bude rozpoznáno, že i když zde byla pro účele vysvětlování popsána konkrétní provedení vynálezu, mohou se bez odklonu od ducha a rozsahu vynálezu provádět různé modifikace vynálezu. V souladu s tím není tento vynález omezen jinak než připojenými nároky.

Seznam sekvencí:

Vzorec I

Met

Ala

Pro

Gly

Lys

Ile

Gin

Gly

Arg

Gly

Pro

Ile

Gin

Gly

Ala

Thr

1

5

10

15

Ser

Val

Arg

His

Leu

Ala

Arg

Met

Glu

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu

Leu

Ala

20

25

30

Ala

Met

Leu

Leu

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Ala

35

40

45

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

50

55

60

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

65

70

75

80

Ile

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

85

90

95

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

100

105

110

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

115

120

125

(pokr. Vzorce I)

Cys Leu Ser 130

Ser

Leu

Leu

Gly Gin Leu Ser Gly Gin

Val

Arg

Leu

Leu

135

140

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

145

150

155

160

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

165

170

175

Gin

Leu

Leu

Arg Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Pro

180

185

190

Thr

Leu

Cys

Val

Arg Arg

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Ser

195

200

205

Thr

Ser

Gin

Leu

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

210

215

220

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Arg

Thr

Al a

Gly

Pro

Gly

225

230

235

240

Leu

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg

Val

Lys

Ile

Thr

Pro

Gly

Gin

245

250

255

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro

Val

Gin

Ile

Ser

Gly Tyr

Leu

Asn

260

265

270

Arg

Thr

His

Gly

Pro

Val

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Ala

Gly

Thr

275

280

285

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

Ile

Ser

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

290

295

300

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

GÍn

Gly Gly

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

305

310

315

320

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

His

Thr

Pro

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

325

330

335

Pro

Thr

Thr

His

Gly

Ser

Pro

Pro

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

340

345

350

Pro

Ser

Thr

Thr

Met

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Val

Thr

Met

355 360 365

Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gin Glu Thr 370 375

Vzo

rec

II

Met

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu

Leu

Va\

Val

Met

Leu

Leu

Leu

Thr

Ala

I

5

10

15

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

35

40

45

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

50

55

60

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

65

70

75

80

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Gly

GÍ n

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

100

105

110

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

130

135

140

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

145

150

155

160

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

cys

Val

Arg

Arg

Ala

165

170

175

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

180

185

190

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

195

200

205

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu L>s Trp Gin Gin Gly 210 215 220 (pokr. Vzorce II)

Phe

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

225

230

235

240

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

260

265

270

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

275

280

285

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

290

295

300

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

305

310

315

320

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

325

330

335

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

340 345 350

Gly

Vzorec III

CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC 60

CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC ATG GCC CCA GGA 116

Met Ala Pro Gly

AAG

ATT

CAG

GGG

AGA

GGC

CCC

ATA

CAG

GGA

GCC

ACT

TCA

GTT

AGA

CAC

164

Lys

Ile

Gin

Gly

Arg

Gly

Pró

Ile

Gin

Gly

Ala

Thr

Ser

Val

Arg

His

5

10

15

20

CTG

GCC

AGA

ATG

GAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

GCG

GCC

ATG

CTT

CTT

212

Leu

Ala

Arg

Met

Glu

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu

Leu

Ala

Ala

Met

Leu

Leu

25

30

35

GCA GTG GCA AGA

CTA Leu

ACT CTG Thr Leu

TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC

260

Ala

Val

Ala

Arg 40

Ser Ser 45

Pro

Val

Ala Pro

Ala 50

Cys

Asp

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

AAA

CTG

CTG

CGT

GAC

TCC

CAC

CTC

CTT

CAC

AGC

308

Pro

Arg

Leu

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg Asp

Ser

His

Leu

Leu

His

Ser

55

60

65

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTT

CTG

356

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Val

Asp Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Val

Leu

70

75

80

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

CTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACG

GAA

404

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

85

90

95

100

CAG

AGC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GCA

GTG

TCC

CTT

CTA

CTG

GAG

452

Gin

Ser

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Glu

105

110

115

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGA

GGA

CAG

TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

CTC

TCA

TCC

500

Gly

Val

Met

Al a

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

120

125

130

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GTT

CGC

CTC

CTC

TTG

GGG

GCC

CTG

548

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

135

140

145

CAG

GGC

CTC

CTA

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CTA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

596

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

150

155

160

CAC

AAG

GAC

CCC

AAT

GCC

CTC

nc

TTG

AGC

nG

CAA

CAA

CTG

cn

CGG

644

His

Lys Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Arg

165

170

175

180

GGA

AAG

GTG

CGC

nc

CTG

CTT

CTG

GTA

GAA

GGT

CCC

ACC

CTC

TGT

GTC

692

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Leu

Leu

Val

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Cys

Val

185

190

195

AGA

CGG

ACC

CTG

CCA

ACC

ACA

GCT

GTC

CCA AGC

AGT

ACT

TCT

CAA

CTC

740

Arg Arg

Thr

Leu

Pro

Thr'Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

Ser

Gin

Leu

200

205

210

CTC Leu

ACA CTA

AAC AAG TTC Asn Lys Phe

CCA Pro

AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACG

788

Thr

Leu 215

Asn 220

Arg Thr

Ser

Gly Leu Leu 225

Glu

Thr

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

GCC

AGA

ACT

GCT

GGC

CCT

GGA

CTT

CTG

AGC

AGG

836

Asn

Phe

Ser

Val

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

230

235

240

CTT

CAG

GGA

TTC

AGA

GTC

AAG

ATT ACT

CCT

GGT

CAG

CTA

AAT

CAA

ACC

884

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg

Val

Lys

Ile

Thr

Pro

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin

Thr

245

250

255

260

TCC

AGG

TCC

CCA

GTC

CAA

ATC

TCT

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ACA

CAC

GGA

932

Ser

Arg

Ser

Pro

Val

Gin

Ile

Ser

Gly Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly

265

270

275

CCT

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

GCT

GGA

ACC

TCA

CTT

CAG

ACC

980

Pro

Val

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

Leu

Gin

Thr

280

285

290

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

TCG

CCC

GGA

GCT

TTC

AAC

ΛΑΑ

GGC

TCC

CTG

1028

Leu

Glu

Al a

Ser

Asp

Ile

Ser

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn

i-ys

Gly

Ser

Leu

295

300

305

GCA

TTC

AAC

CTC

CAG

GGT

GGA

CTT

CCT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GCT

CCT

1076

Ala

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly

Gly

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

310

315

320

GAT

GGA

CAC

ACA

CCC

TTC

CCT

CCT

TCA

CCT

GCC

TTG

CCC

ACC

ACC

CAT

1124

Asp Gly

His

Tr;·

Pro

Phe

Pro

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Thr

Thr

His

325

330

335

340

GGA TCT

CCA

CCC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

TTT

CCT

GAC

CCT

TCC

ACC

ACC

1172

Gly

Ser

Pro

Pro

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

Thr

Thr

345

350

355

ATG

CCT

AAC

TCT

ACC

GCC

CCT

CAT

CCA

GTC

ACA

ATG

TAC

CCT

CAT

CCC

1220

Met

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Val

Thr

Met

Tyr

Pro

His

Pro

360

365

370

AGG

AAT

TTG

TCT

CAG

GAA

ACA

TAGCGCGGGC ACTGGCCCAG TGAGCGTCTG

1271

Arg

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Thr

*

375 (pokr. Vzorce III)

CAGCTTCTCT CGGGGACAAG CTTCCCCAGG AAGGCTGAGA GGCAGCTGCA TCTGCTCCAG 1331

ATGTTCTGCT TTCACCTAAA AGGCCCTGGG GAAGGGATAC ACAGCACTGG AGATTGTAAA 1391

ATTTTAGGAG CTATTTTTTT TTAACCTATC AGCAATATTC ATCAGAGCAG CTAGCGATCT 1451

TTGGTCTATT TTCGGTATAA ATTTGAAAAT CACTA 1486

A

Vzorec IV

ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 48

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

5 10. 15

AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 96

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

25 30

CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 144

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

40 45 (pokr. Vzorce IV)

CAG Gin

TGC Cys 50

CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT

192

Pro

Glu Val His Pro 55

Leu

Pro

Thr

Pro

Val 60

Leu

Leu

Pro

Ala

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

240

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

65

• 70

75

80

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

288

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

85

90

95

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

TCA TCC

CTC

CTG

GGG

336

Ala

Ala Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

100

105

110

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

384

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

115

120

125

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

432

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

Thr

Thr

Ala

H-s

Lys

Asp

130

135

140

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

480

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

145

150

155

160

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

528

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg Arg

Ala

165

170

175

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

576

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

180

185

190

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT TCT

GGA TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

624

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

195

200

205

GCC

TCA

GCC

AGA ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

672

Ala

Ser Ala

Arg Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

%

210

215

220

(pokr. Vzorce IV)

TTC AGA

GCC AAG ATT

CCT Pro 230

GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG

720

Phe 225

Arg

Ala

Lys

Ile

Gly Leu

Leu

Asn

Gin 235

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu 240

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

768

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

245

250

255

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

816

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser Arg Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

260

265

270

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

864

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

275

280

285

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

912

Gin

Pro

Gly Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

290

295

300

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

960

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Va1

Gin

Lau

305

310

315

320

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

1008

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

325

330

335

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

1056

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

340.. 345 350

GGG TAA Gly

1062

Vzorec V ctttcttgct ttctttcttt ctttctttct τκτττττπ tttttgagac ggagtttcac 6o

TCTTATTGCC CAGGCTGGAG TGCAATGGTG CGATCTCGGC TCACCACAAC CTCCGCCTCC 120

CAGGTACAAG CGATTCTCCT GTCTCAGCCT CCCAAGTAGC TTGGATTACA GGCATGAACC 180

ACCACACCCT GCTAGTTTTT TTGTATTTCG TAGAGCCGGG GTTTCACCAT GTTAGTGAGG 240

CTGGTGGCGA ACTCCTGACC TCAGGTGATC CACCCGCCTT GGACTCCCAA AGTGCTGGGA 300

TTACAGGCAT GAGCCACTGC ACCCGGCACA CCATATGCTT TCATCACAAG AAAATGTGAG 360

AGAATTCAGG GCTTTGGCAG TTCCAGGCTG GTCAGCATCT CAAGCCCTCC CCAGCATCTG 420

TTCACCCTGC CAGGCAGTCT CTTCCTAGAA ACTTGGTTAA ATGTTCACTC TTCTTGCTAC 480

TTTCAGGATA GATTCTTCAC CCTTGGTCCG CCTTTGCCCC ACCCTACTCT GCCCAGAAGT 540

GCAAGAGCCT AAGCCGCC-C CATGGCCCCA GGAAGGATTC AGGGGAGAGG CCCCAAACAG 600

GGAGCCACGC CAGCCAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC 654 Met Glu Leu Thr

ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC 714

TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG 774

ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG 834

ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC 886

Glu Leu Leu Leu

GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT 934

Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala ' 15 20

CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC 982

Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser

30 35 40

CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC 1033

His Val Leu His Ser Arg Leu

CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT 1093

GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA 1153

TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG 1213

GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC 1273

CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 1322

Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

55

CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC ITT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 1370

Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

65 70

CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT 1426

Gin Met 75

CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA 1486

GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT 1546

GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA 1606

AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCCGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG 1666

AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC 1726

AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 1786

AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG 1846

AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC 1906

GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAGAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT 1966

CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA 2026

GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 2086

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG

GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC

TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA

AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT

GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA

GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC

GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT

ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC

CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC

CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT

CCAGGCTGGA GTGCAGTGG3 ATGATCTCAA

GCGATTCTCC TGTCTCAGTC TCCCAAGTAG

AGCTAATTTG TGTATTTGTG GTAGAGATGG

AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT

TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT

CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC

CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC

TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG

GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC

TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC

CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG Glu Glu

CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA

CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT

TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA

TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT

CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA

GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA

TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG

TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT

ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC

CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA

CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CACCATGCCC

GGTTTCACCA TGTTGGGCAG GCTGATCTTG

CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG

TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG

AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT

ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC

CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG

TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC

TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT

ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu Gly 80 85

2146

2206

2266

2326

2386

2446

2506

2566

2626

2686

2746

2806

2866

2926

2986

3046

3106

3166

3226

3286

3338

GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG 3386

Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala^Ala Arg Gly Gin Leu

95 100

GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC 3434

Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val

105 110 115

CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG 3476

Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin

120 125 130

GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCCCTAGAA 3536 *

GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG ATCTACTAAG 3596

AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC TGTCTTTCCT ACTTAGACAA 3656

GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAG 3712

CTT CCT CCA CAG GGC A5G ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC 3760

Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile

135 140 145

TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG 3808

Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met

150 155 160

CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA 3856

Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr

165 170 175 180

GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA 3904

Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro

185 190 195 ’ AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA 3952

Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg

200 205 210

ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG 4000

Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys

215 220 225 (pokr. Vzorce V)

ATT CCT GGT ITe Pro Gly

CTG CTG AAC

CAA Gin 235

ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA

ATC Ile

CCC Pro

4048

Leu

Leu Asn

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu Asp 240

Gin

230

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

4096

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

245

250

255

260

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

4144

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser Arg

Arg

Thr

Leu

Gly Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

265

270

275

GGA ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

4192

Gly Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

280

285

290

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT ACT

GGA

CAG

TAT ACG

CTC

TTC

CCT

4240

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

295

300

305

cn

CCA CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

4288

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

310

315

320

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA ACG

CCC

ACC

CCT ACC

AGC

CCT

cn

CTA AAC

4336

Pro

Asp

Pro

Ser Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu Asn

325

330

335

340

ACA TCC

TAC

ACC CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGnCTC

4385

Thr Ser

Tyr

Thr His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

345 350

AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG 4445

GGAGACAACT GGACAAGAH TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA 4505

TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT 4565

TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA 4625

AATTTGCAAC TCACTGATTC TCAACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGACCTG 4685 (pokr. Vzorce V)

X

GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGGAAGG

GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT

CTCAGTGGGA CTCTGATC

4745

4805

4823

Vzorec VI

Met

Pro

Ser

Trp

Ala

Leu

Phe

Met

Val

Thr

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Pro

Asn

Gin

Ala

Gin

Val

Thr

Ser

Gin

Asp

Val

Phe

Leu

Leu

Ala

20

25

30

Leu

Gly

Thr

Glu

Pro

Leu

Asn

Cys

Phe

Ser

Gin

Thr

Phe

Glu

Asp

Leu

35

40

45

Thr

Cys

Phe

Trp

Asp

Glu

Glu

Glu

Ala

Ala

Pro

Ser

Gly

Thr

Tyr

Gin

50

55

60

Leu

Leu

Tyr

Ala

Tyr

Arg

Gly

Glu

Lys

Pro

Arg

Ala

Cys

Pro

Leu

Tyr

70 75 80

(pokr. Vzorce

VI)

Ser

Gin

Ser

Val

Pro

Thr

Phe

Gly

Thr

Arg

Tyr

Val

Cys

Gin

Phe

Pro

85

90

95

Ala

Gin

Asp

Glu

Val

Arg

Leu

Phe

Phe

Pro

Leu

His

Leu

Trp

Val

Lys

100

105

110

Asn

Val

Ser

L^u

Asn

Gin

Thr

Leu

Ile

Gin

Arg

Val

Leu

Phe

Val

Asp

115

120

125

Ser

Val

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Pro

Arg

Val

Ile

Lys

Ala

Arg

Gly

Gly

130

135

140

Ser

Gin

Pro

Gly

Glu

Leu

Gin

Ile

His

Trp

Glu

Ala

Pro

Ala

Pro

Glu

145

150

155

160

Ile

Ser

Asp

Phe

Leu

Arg

His

Glu

Leu

Arg

Tyr

Gly

Pro

Thr

Asp

Ser

165

170

175

Ser

Asn

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser

Val

Ile

Gin

Leu

Leu

Ser

Thr

Glu

Thr

180

185

190

Cys

Cys

Pro

Thr

Leu

Trp

Met

Pro

Asn

Pro

Val

Pro

Val

Leu

Asp

Gin

195

200

205

Pro

Pro

Cys

Val

His

Pro

Thr

Ala

Ser

Gin

Pro

His

Gly

Pro

Val

Arg

210

215

220

Thr

Ser

Pro

Ala

Gly

Glu

Ala

Pro

Phe

Leu

Thr

Val

Lys

Gly

Gly

Ser

225

230

235

240

Cys

Leu

Val

Ser

Gly

Leu

Gin

Ala

Gly

Lys

Ser

Tyr

Trp

Leu

Gin

Leu

245

250

255

Arg

Ser

Gin

Pro

Asp

Gly

Val

Ser

Leu

Arg

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Trp

260

265

270

Ser

Phe

Pro

Val

Thr

Val

Asp

Leu

Pro

Gly

Asp

Ala

Val

Thr

Ile

Gly

275

280

285

Leu

Gin

Cys

Phe

Thr

Leu

Asp

Leu

Lys

Met

Val

Thr

Cys

Gin

Trp

Gin

290

295

300

Gin

Gin

Asp

Arg

Thr

Ser

Ser

Gin

Gly

Phe

Phe

Arg

His

Ser

Arg

Thr

305

310

315

320

(pokr. Vzorce VI)

Arg Cys Cys Pro Thr

Asp

Arg Asp Pro Thr Trp Glu Lys Cys Glu

Glu

325

330

335

Glu

Glu

Pro

Arg

Pro

Gly

Ser

Gin

Pro

Ala

Leu

Val

Ser

Arg Cys

His

340

345

350

Phe

Lys

Ser

Arg

Asn

Asp

Ser

Val

Ile

His

Ile

Leu

Val

Glu

Val

Thr

355

360

365

Thr

Ala

Gin

Gly

Ala

Val

His

Ser

Tyr

Leu

Gly

Ser

Pro

Phe

Trp

Ile

370

375

380

His

Gin

Ala

Val

Leu

Leu

Pro

Thr

Pro

Ser

Leu

His

Trp Arg

Glu

Val

385

390

395

400

Ser

Ser

Gly Arg

Leu

Glu

Leu

Glu

Trp

Gin

His

Gin

Ser

Ser

Trp

Ala

405

410

415

Ala

Gin

Glu

Thr

Cys Tyr

Gin

Leu

Arg Tyr

Thr

Gly Glu Gly Arg

Glu

420

425

430

Asp Trp

Lys

Val

Leu

Glu

Pro

Ser

Leu

Gly

Ala

Arg Gly Gly

Thr

Leu

435

440

445

Glu

Leu Arg

Pro

Arg

Ala

Arg Tyr

Ser

Leu

Gin

Leu

Arg

Ala

Arg

Leu

450

455

460

Asn

Gly

Pro

Thr

Tyr

Gin

Gly

Pro

Trp

Ser

Ala

Trp

Ser

Pro

Pro

Ala

465

470

475

480

Árg

Val

Ser

Thr

Gly

Ser

Glu

Thr Ala

Trp

Ile

Thr

Leu

Val

Thr

Ala

485

490

495

Leu

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ser Ala

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

500

505

510

Lys

Trp

Gin

Phe

Pro

Ala

His

Tyr Arg Arg

Leu

Arg

His

Ala

Leu

Trp

515

520

525

Pro

Ser

Leu

Pro

Asp

Leu

His

Arg Val

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu

Arg Asp

530

535

540

Thr

Ala

Ala

Leu

Ser

Pro

Ser

Lys Ala

Thr

Val

Thr Asp

Ser

Cys Glu

545

550

555

560

(pokr. Vzorce VI)

Glu

Val

Glu

Pro

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Leu

Pro

Lys

Ser

Ser

Glu

Ser

565

570

575

Thr

Pro

Leu

Pro

Leu

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Gin

Met

Asp

Tyr

Arg

Gly

580

585

590

Leu

Gin

Pro

Cys

Leu

Arg

Thr

Met

Pro

Leu

Ser

Val

cys

Pro

Pro

Met

595

600

605

Ala

Glu

Thr

Gly

Ser

Cys

Cys

Thr

Thr

His

Ile

Ala

Asn

His

Ser

Tyr

610

615

620

Leu

Pro

Leu

Ser

Tyr

Trp

Gin

Gin

Pro

625

630

Vzorec VII

Met Glu Leu Thr Glu

Leu Leu

Leu

Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

1

5

10

15

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys Asp

Leu

Arg

Val

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

35

40

45

Gin

Cys

Pro

G'i u

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Al a

50

55

60

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

65

70

75

80

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

85

90

95

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

100

105

110

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

115

120

125

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys Asp

130

135

140

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

145

150

F55

160

Arg

Phe

Leu Met

Leu

Val

Gly Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg Arg

Ala

165

170

175

Pro

Pro

Thr Thr Al a

Val

Pro

Ser Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

180

185

190

Asn

Glu

Leu Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu Thr Asn

Phe

Thr

195

200

205

Ala

Ser

Ala Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys Trp Gin

Gin

Gly

210

215

220

Phe

Arg

Ala Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr Ser Arg

Ser

Leu

225

230

235

240

(pokr. Vzo

rce

VII

:)

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

245

250

255

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

260

265

270

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

275

280

285

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

290

295

300

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

305

310

315

320

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

325

330

335

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

340 345 350

Gly

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná bílkovina, vybraná ze skupiny sestávající z

   a) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196;

   b) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 206;

   c) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 173;

   d) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 175;

   e) alelických variant a)_zb),c)ad);a

   f) druhových homologů a), b), c), d) a e), přičemž bílkovina stimuluje proliferaci a diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních prekursorů.
2. 2. Izolovaná bílkovina podle nároku 1, přičemž řečená bílkovina obsahuje sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 379.
3. 3. Izolovaná bílkovina podle nároku 1, pncemz řečena bílkovina obsahuje sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po
4. 4. Izolovaná bílkovina bílkovina je myší bílkovina.
5. 5. Izolovaná bílkovina bílkovina je lidská bílkovina.
6. 6. Izolovaná bílkovina bílkovina obsahuje:

   sekvenci aminokyselin aminokyselinového zbytku 45 po sekvenci aminokyselin aminokyselinového zbytku 24 po sekvenci aminokyselin aminokyselinový zbytek 353.

   podle nároku 1, přičemž řečená podle nároku 1/ přičemž řečená podle nároku 1, přičemž řečená ukázanou ve Vzorci I od

   aminokyselinový zbytek 379, ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinový zbytek 196, ukázanou ve Vzorci I od

   - 97 aminokyselinového zbytku 24 po aminokyselinový zbytek 206, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 24 po aminokyselinový zbytek 379, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 196, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 206, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 379.
7. 7. Izolovaná bílkovina podle nároku 1, přičemž řečená bílkovina obsahuje:

   sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 173, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 175, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od aminokyselinového zbytku 1 po aminokyselinový zbytek 353, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 353.
8. 8. Izolovaná bílkovina sestávající v podstatě ze sekvence vybrané ze skupiny zahrnující:

   sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 206, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 379, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 175, sekvenci aminokyselin ukázanou ve Vzorci II od

   aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 353.
9. 9. Izolovaná bílkovina, jež stimuluje proliferaci a diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních prekursorů, přičemž řečená bílkovina obsahuje úsek, jenž je na úrovni aminokyselin alespoň z 80 % identický s aminokyselinovou sekvencí Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196, nebo se sekvencí aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 173.
10. 10. Izolovaná polynukleotidové molekula kódující bílkovinu podle nároku 1.
11. 11. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 10, přičemž řečená molekula je DNA molekula, obsahující kódující vlákno, jež obsahuje nukleotidovou sekvenci Vzorce III od nukleotidu 237 po nukleotid 692.
12. 12. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 10, přičemž řečená molekula je DNA molekula, obsahující kódující vlákno, jež obsahuje nukleotidovou sekvenci Vzorce IV od nukleotidu 64 po nukleotid 519.
13. 13. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 10, přičemž řečená molekula kóduje aminokyselinovou sekvenci Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196.
14. 14. Izolovaná polynukleotidové molekula podle nároku 10, přičemž řečená molekula kóduje aminokyselinovou sekvenci Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 173.
15. 15 Izolovanoá polynukleotidové sestávající z

    a) DNA molekul kódujících a obsahujících sekvenci nukleotidů nukleotidu 237 po nukleotid 692,

    b) DNA molekul kódujících a obsahujících sekvenci nukleotidů nukleotidu 64 po nukleotid 519, molekula vybraná ze skupiny hernatopoetickou bílkovinu ukázanou ve Vzorci III od hematopoetickou bílkovinu ukázanou ve Vzorci IV od

    c) alelických variant a) nebo b),

    d) DNA molekul kódujících hematopoetickou bílkovinu, jež je v aminokyselinové sekvenci alespoň z 80 % identická s bílkovinami kódovanými v a), b) nebo c)

    e) molekul komplementárních k a), b), c) nebo d).
16. 16. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 15, přičemž řečená molekula kóduje hematopoetickou bílkovinu, jež je v aminokyselinové sekvenci alespoň z 90 % identická s bílkovinami kódovanými v a), b) nebo c).

    *
17. 17. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 15, přičemž řečená molekula zahrnuje nukleotid 237 až nukleotid 722 ze Vzorce III nebo nukleotid 64 až nukleotid 525 ze Vzorce IV.
18. 18. Izolovanou DNA molekula vybraná ze skupiny sestávající z

    a) EcóRI-Xhol inzertu plasmidů pZGrapl-1081 (ATCC 69566),

    b) alelické varianty a), a

    c) DNA molekul kódujících bílkovinu, jež je ve své aminokyselinové sekvenci alespoň z 80 % identická s bílkovinou kódovanou a) nebo b), přičemž řečená izolovaná DNA molekula kóduje bílkovinu, mající hematopoetickou aktivitu.
19. 19. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 18, přičemž řečená molekula kóduje polypeptid, jenž obsahuje aminokyselinovou sekvenci Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196.

    *
20. 20. Vektor exprese, jenž obsahuje následující funkčně spojené prvky:

    ¹ promotor transkripce;

    úsek DNA, vybraný ze skupiny zahrnující

    a) úsek DNA kódující hemetopoetickou bílkovinu a obsahující nukleotidovou sekvenci jak je ukázána ve Vzorci III od nukleotidu 237 po nukleotid 692;

    b) úsek DNA kódující hemetopoetickou bílkovinu a obsahující nukleotidovou sekvenci jak je ukázána ve Vzorci IV od nukleotidu 64 po nukleotid 519;

    1OO

    c) alelické varianty a) nebo b), a

    d) DNA úseky kódující hematopoetickou své aminokyselinové sekvenci alespoň s bílkovinou kódovanou a), b) nebo c); a transkripční terminátor.

    30;

    bi z

    < -O i— 33 > CS co 2 —I -I lksvái^i, oj- σ co o

    5eá ege r— ciden^ i ckác i

    a
21. 21. Vektor exprese podle nároku 20, přičemž řečený úsek DNA kóduje hematopoetickou bílkovinu, jež je v aminokyselinové sekvenci alespoň z 90 % identické s bílkovinami kódovanými v a),

    b) nebo c).
22. 22. Vektor exprese podle nároku 20, přičemž řečený úsek DNA zahrnuje nukleotid 237 až nukleotid 722 ze Vzorce III nebo nukleotid 64 až nukleotid 525 ze Vzorce IV.
23. 23. Vektor exprese podle nároku 20 obsahuje! dále sekvenci signálu sekrece funkčně spojenou s řečeným úsekem DNA.
24. 24. Způsob vyznačuj ící přípravy hematopoetické se t i m, ž e zahrnuje bilkov i ny kultivaci buněk, do nichž byl zaveden vektor exprese podle nároku 20, přičemž řečené buňky exprimují hematopoetickou bilkov i nu kódovanou řečeným úsekem DNA a získáni hematopoetické bílkoviny.
25. 25. Způsob přípravy hematopoetické bílkoviny podle nároku 24, vyznačující se tím, že hematopetická bílkovina je řečenými buňkami secernována a je získávána z média, v němž se řečené buňky kultivují.
26. 26. Farmaceutický prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje bílkovinu podle nároku 1 v kombinaci s farmaceutíčky přijatelným nosičem.
27. 27. Protilátka, jež se váže k epitopu bílkoviny podle nároku 1.
28. 28. Sonda, která obsahuje oligonukleotid o alespoň 14 nukleotidech, přičmž sekvence řečeného oligonuklotidu je alespoň

    ΙΟΙ z 80 % identická k části o stejné délce z

    al Vzorce III b> Vzorce IV c) Vzorce V d) sekvencí

    komplementárn1ch Vzorce IV nebo Vzorce V sekvencí)

    Vzorce III,
29. 29. Způsob pro detekci DNA molekuly, kódující thrombopoietin, ve směsi DNA molekul, vyznačuj ící se t í m, ž e zahrnuje sondování směsi DNA molekul sondou, která obsahuje oligonukleotid o alespoň 14 nukleotidech, přičmž sekvence řečeného oligonuklotidu je alespoň z 80 % identická k části o stejné délce z

    a) Vzorce III

    b) Vzorce IV

    c) Vzorce V

    d) sekvencí komplementárních k sekvencím Vzorce III, Vzorce IV nebo Vzorce V a detekci DNA molekul, s nimiž řečená sonda hybridizuje.
30. 30. Způsob stimulace buněčné proliferace vyznačující se tím, že se ke kultivovaným buňkám kostní dřeně in vitro přidává izolovaná bílkovina podle nároku 1 v množství postačujícím ke stimulaci buněčné proliferace.
31. 31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že řečené buňky jsou megakaryocyty nebo prekursory megakaryocytů.
32. 32. Způsob čiětěnl thrombopoietinu vyznačuj ící se t í m, ž e obsahuje vystavení roztoku obsahujícího thrombopoietin protilátce navázané na pevnou podložku, přičemž řečená protilátka se váže k epitopu bílkoviny podle nároku 1, promytí řečené protilátky k odstranění nenavázaných kontam i nuj ící ch 1átek, eluci navázaného thrombopoietinu z řečené protilátky, a získání eluovaného thrombopoietinu.

    102

    3 . ·

    3<; Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje bílkovinu podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

    Δ.

    3|. Protilátka, jež se váže k epitopu bílkoviny podle nároku 1.

    3^C Způsob stimulace tvorby krevních destiček u savce, vyznačující se tím, že řečenému savci se podává terapeuticky účinné množství hematopoetické bílkoviny, vybrané ze skupiny sestávající z

    a) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce I od aminokyselinového zbytku 45 po aminokyselinový zbytek 196;

    c) bílkovin obsahujících sekvenci aminokyselin Vzorce II od aminokyselinového zbytku 22 po aminokyselinový zbytek 173;

    c) alelických variant a) nebo b), a

    d) druhových homologů a), b), nebo c), přičemž řečená bílkovina stimuluje a diferenciaci myeloidních nebo lymfoidních v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

    proliferaci prekursorů,

    3χ. Sonda, která obsahuje oligonukleotid o alespoň 14 nukleotidech, přičmž sekvence řečeného oligonuklotidu je alespoň z 80 % identická k části o stejné délce z

    a) Vzorce III

    b) Vzorce IV

    c) Vzorce V

    d) sekvencí komplementárních k sekvencím Vzorce III, Vzorce IV nebo Vzorce V