JPH10511681A

JPH10511681A - 精製されたトロンボポエチン及びその製造方法

Info

Publication number: JPH10511681A
Application number: JP8521067A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．フォーストローム，ジョン; イー．ロフトン−デイ，キャサリン; ロク，シ
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-11-10
Also published as: AU4526096A; EP0804480B1; US5986049A; EP0804480A1; DE69534853D1; NZ300500A; CA2207577A1; CN1171791A; ATE319741T1; MX9703959A; WO1996020955A1

Abstract

(57)【要約】精製された哺乳類トロンボポエチンタンパク質及びそれらを製造するための方法が開示される。前記タンパク質は、変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトンにより特徴づけられ、そして汚染性タンパク質に対して少なくとも90％純粋である。前記タンパク質は、トロンボポエチンが、MPLレセプターのリガンド−結合ドメインを含んで成るポリペプチドに吸着され、そしてそのポリペプチドから溶離され、次に前記溶離されたトロンボポエチンがアニオン交換クロマトグラフィーにより分別される方法により調製され得る。

Description

【発明の詳細な説明】精製されたトロンボポエチン及びその製造方法発明の背景造血は、血液細胞が骨髄における多能性幹細胞から発育し、そして分化する過程である。この過程は、標的細胞上の膜結合−レセプターを通して作用するポリペプチド増殖因子（サイトカイン）の複雑な相互作用を包含する。サイトカイン作用は、しばしば系統−特異的及び／又は段階−特異的である特定のサイトカインに関して、細胞増殖及び分化をもたらす。幹細胞からの単一細胞型、たとえば血小板の発育は、適切な順序で作用する多くのサイトカインの共同作用を必要とする。既知のサイトカインは、インターロイキン、たとえばIL-1，IL-2，IL-3，IL-6 ，IL-8、等；及びコロニー刺激因子、たとえばG-CSF，M-CSF，GM-CSF、エリトロポエチン(EPO)、等を包含する。一般的に、インターロイキンは、免疫及び炎症応答の媒介物質として作用する。コロニー刺激因子は、骨髄由来の細胞の増殖を刺激し、成熟白血球を活性化し、そして他に、炎症、感染及び免疫学的挑戦に対する宿主の応答の統合部分を形成する。種々のサイトカインが治療剤として開発されて来た。たとえば、赤血球の発育を刺激するエリトロポエチンは、腎不全から生じる貧血の処理に使用される。コロニー刺激因子のいくつかは、患者の免疫系の回復を早めるために癌化学療法剤と共に使用されて来た。インターロイキン−２、α−インターフェロン及びγ− インターフェロンが、一定の癌の処理に使用される。巨核球形成及び血小板形成を刺激する活性は、血小板減少動物の体液中に同定されており、そして“トロンボポエチン(thrombopoietin)”（最近、McDonald，Exp.Hematol. 16：201-205，1988及びMcDonald，Am.J.Ped.Hemato l.Oncol ．14：8-21，1992により総説されている）として文献に言及されている。最近、いくつかのグループが、細胞MPLレセプターに結合し、そして巨核球形成及び血小板形成を刺激するタンパク質を同定し、そしてクローン化している。 de Sauvageなど., Nature 369 : 533-538，1994 ; Lokなど., Nature 369 : 565-568，1994；Kaushanskyなど., Nature 369 : 568-571，1994 ; Wendlin gなど., Nature 369 : 571-574，1994；及びBartleyなど., Cell 77：1117 -1124，1994を参照のこと。このタンパク質はトロンボポエチンと称することが提案されている（Kaushanskyなど., 前記）。このタンパク質はインビボで血小板生成を刺激することが示されているが（Kaushanskyなど., 前記）、それはタンパク質分解を受けやすいように見え、そして不均一な又は分解された形で単離された(Bartleyなど., 前記；de Sauvageなど., 前記)。タンパク質分解及び不均一性は、新規の医薬物質の開発を妨げる重要な問題である。トロンボポエチンの均質で分解されていない調製物及びそのような調製物の製造方法についての必要性が当業界に残存している。発明の要約トロンボポエチン、たとえばヒトトロンボポエチンの精製された調製物を供給することが本発明の目的である。トロンボポエチンの均一調製物を供給することが本発明のさらなる目的である。トロンボポエチンを精製し、そして製造するための方法を提供することもまた、本発明のさらなる目的である。１つの観点においては、本発明は、変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトンにより特徴づけられる精製された哺乳類トロンボポエチン(TPO)を提供し、ここでそれは、SDS− ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法により決定される場合、汚染性タンパク質に関して少なくとも90％純粋である。１つの態様において、その精製されたTPOはMr＜55KDのTPO種を実質的に有さない。他の態様において、その精製されたTPOは、マウスTPO、霊長類TPO又はヒトTPOである。もう１つの態様において、本発明は、（ａ）MPLレセプターのリガンド−結合ドメインを含んで成る、固体支持体に結合されるポリペプチドに、トロンボポエチンを含む生物学的流体を適用し、これにより前記トロンボポエチンが前記ポリペプチドに吸着され；（ｂ）吸着されていない物質を溶離するために前記ポリペプチドを洗浄し；（ｃ）前記ポリペプチドから前記吸着されたトロンボポエチンを溶離し、（ｄ）アニオン交換クロマトグラフィーにより前記溶離されたトロンボポエチンを分別し；そして（ｅ）前記分別されたトロンボポエチンを収集することを含んで成る、生物学的流体からトロンボポエチンを精製するための方法を提供する。１つの態様において、生物学的流体はならし細胞培養培地又はミルクである。さらにもう１つの態様において、前記方法は、生物学的流体をレセプターポリペプチドに適用する前、その生物学的流体を濃縮する段階をさらに含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、マウス又はヒトMPLレセプターのリガンド結合ドメインを含んで成る。さらにもう１つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号：７の残基27−480から実質的に成る。本発明のさらなる観点においては、TPOは上記に開示される方法により精製され、そして収集されたTPOは、変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトンにより特徴づけられ、そしてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法により決定される場合、汚染性タンパク質に関して少なくとも90％純粋である。１つの態様において、前記収集されたトロンボポエチンは、Mr＜55KDのTPO種を実質的に有さない。本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載及び図面から明らかになるであろう。図面の簡単な説明も左の２つのレーンは、分子量マーカー及び分別されていないTPOである。図２は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、そして銀染色された分別されたヒトTPOを示す。本発明の詳細な記載本発明を詳細に説明する前、本明細書に使用される一定の用語を定義することは助けになるであろう：対立遺伝子変異体：突然変異を通して生じる遺伝子の他の形、又は突然変異化された遺伝子によりコードされる変更されたポリペプチド遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化が存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。生物学的流体：細胞、細胞成分又は細胞生成物に由来するか又はそれらを含むいづれかの流体生物学的流体は、細胞培養上清液、細胞溶解物、清澄された細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、乳汁及びそれらの画分を包含するが、但し、それらだけには限定されない。 cDNA：mRNA鋳型の逆転写により調製された相補的DNA、又はそのような分子のクローン又は増幅されたコピー。相補的DNAは一本鎖でも又は二本鎖でもあり得る。発現ベクター：興味あるポリペプチドの転写を提供する追加のセグメントに作用可能的に連結されるそのポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、直鎖状又は環状のDNA分子。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーターを包含し、そしてまた、複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等を包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに由来し、又は両者の要素を含むことができる。用語“操作可能的に連結された”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために調和して機能し、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてターミネーターにコードセグメントを通して進行するよう配置されることを示す。遺伝子：ポリペプチド鎖をコードする染色体DNAのセグメント。遺伝子は、多くの場合、コード配列の転写を提供するフランキング非コード領域と共に、非コード“介在配列”（“イントロン”）間に散在される、アミノ酸コードの１又は複数の領域を含む。プロモーター：RNAポリメラーゼが結合し、そしてmRNA合成が開始される遺伝子の部分。上記に示されるように、本発明は、均一形でのトロンボポエチンの生成への使用のための材料及び方法を提供する。本発明のTPOは、変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、M r＝70,000±10,000ドルトンにより特徴づけられる。本発明のTPOは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法により決定される場合、他の汚染性タンパク質に関して少なくとも90％純度を付与される。好ましい態様においては、タンパク質は、TPOのＮ−末端に対して向けられたポリクローナル抗血清を用いて、“ウェスターン”ブロット分析（Towbinなど., Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 76：4350-4354，1979 ; Towbinなど., アメリカ特許第4,452,901号；これらは引用により本明細書に組込まれる）により決定される場合、より低い分子量の TPO(すなわちMr＜55KDを示すもの)を実質的に含まない。“実質的に有さない” とは、５％よりも高くない免疫反応性TPOがその低い分子量範囲に存在することを意味する。上記で示されたように、トロンボポエチンは、MPLレセプターを通して細胞増殖を刺激するタンパク質として同定された。このレセプター(Souyriなど., Cel l 63：1137-1147，1990)は、この発見の前、天然のリガンドが未知である“孤児(orphan)”レセプターであった。組換えTPOは、巨核球の増殖及び分化を刺激することが見出された。トロンボポエチン分子は、同じ種からのMPLレセプターに特異的に結合し、そしてインビボでの血小板生成を刺激するそれらの能力により特徴づけられる。通常の試験動物においては、TPOは、毎日の投与の開始後10日以内で、血小板レベルを100％又はそれ以上、高めることができる。用語“トロンボポエチン”とは、本明細書において使用される場合、十分な長さのトロンボポエチン分子及び生物学的に活性のその一部、すなわち損なわれていない分子の質的な生物学的活性（レセプター結合及び血小板生成のインビボ刺激）を示すトロンボポエチンのフラグメントを包含する。代表的なマウス及びヒトTPOタンパク質をコードするcDNAクローンの配列は、それぞれ配列番号１及び３に示されており、そしてそれらの対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び４に示されている。当業者は、配列番号１，２，３及び４に示される配列がネズミ又はヒト遺伝子の単一の対立遺伝子に対応し、そして対立遺伝子の変動の存在が予想されることを認識するであろう。配列番号１及び３に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体は、サイレント突然変異を含むもの、及び突然変異がアミノ酸配列の変更をもたらすものを包含する。当業者が、たとえば他のコドンを用いてヌクレオチド配列の操作を促進する部位を構築することによって、追加の変異体を創造できることは明白であろう。アミノ酸配列の分析は、成熟タンパク質が配列番号２のアミノ酸残基45(Ser) から残基379(Thr)(配列番号４の残基22〜353)に及ぶことを示す。ヒトタンパク質の予測されるアミノ末端は、組換えネズミTPOについての例示された成熟アミノ末端に正確に対応する(Lokなど., 前記)。本明細書に開示されるネズミ及びヒト配列は、他の種（“種相同体”）からの TPOタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を調製するための有用な手段である。好ましいそのような種相同体は、哺乳類相同体、たとえばウシ、イヌ、ブタ、羊、ウマ及び特に霊長類タンパク質を包含する。第２の種からの対応するポリヌクレオチド配列をクローン化するために第１の種からの配列情報を用いるための方法は当業界において良く知られている。たとえば、Ausubel など., Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc .，NY，1987を参照のこと。 mRNA分布の分析は、TPOコードのmRNAがヒト及びマウスのいくつかの組織に存在し、そして肺、肝臓、心臓、骨格筋及び腎臓においてより富んでいたことを示した。従って、他の種からの相同体を単離するためには、cDNAライブラリーが、好ましくは、高レベルのmRNAを生成することが見出された組織の１つから調製される。cDNAライブラリーを調製するための方法は、当業界において良く知られている。たとえば、Sambrookなど., Molecular Cloning : A Labora tory Manual ，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989及びそこに引用される引例を参照のこと。TPOをコードする分子を検出するためには、次にライブラリーが、本明細書に開示されるマウス又はヒトDNA配列又はそのフラグメントにより、又は開示される配列に基づく１又は複数の小さなプローブによりプローブされる。配列番号１，３，５又はそれらの相補的配列の同じ長さの部分に少なくとも80％同一である、少なくとも約14個又はそれ以上のヌクレオチド及び25まで又はそれ以上のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブが、特に有用である。ラベルされたプローブを用いて、低いハイブリダイゼーション緊縮性、すなわち約２×SSC及び約50℃のハイブリダイゼーション温度でライブラリーをプローブすることが好ましい。プローブがハイブリダイズする分子は、標準の検出方法を用いて検出される。陽性クローンは、配列の分析及び活性のアッセイ、たとえば相同MPLレセプター（すなわちcDNAと同じ種からのMPLレセプター）を結合し、又は相同の骨髄細胞からの巨核球形成を刺激する能力により確かめられる。他のクローニング方法が使用され得ることは、当業者に明らかであろう。 TPOタンパク質は、配列番号２又は４、及びそれらの種相同体のタンパク質に対して実質的に相同である。用語“実質的に相同”とは、配列番号２又は４、又はそれらの種相同体に示される配列に対して50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を示すために使用される。そのようなタンパク質は、配列番号２又は４、又はそれらの種相同体に対して、より好ましくは少なくとも90％及び最とも好ましくは95％又はそれ以上の同一性を有するであろう。％配列同一性は、従来の方法により決定される。たとえば、Altschulなど., Bull.Math.Bio. 48 : 603-616，1986及びHenikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 89 : 10915-10919，1992を参照のこと。手短に言及すれば、２種のアミノ酸配列は、表１（アミノ酸は標準の一文字コードにより示される）に示されるように、10のギャップ開口ペナルティ(gap opening penalty)、１のギャップ拡張ペナルティ( gap extension penalty)、及びHenikoff and Henikoff(前記)の“blosum 62”評点マトリックスを用いて、整合する評点を最適化するために整合される。次に、％同一性は次のようにして計算される：実質的に相同のタンパク質は、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変更は、好ましくは、マイナーな性質のもの、たとえばタンパク質の折りたたみ又は活性に対して有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換である（表２を参照のこと）。一般的には、Fordなど ., Protein Expression and Purification ２：95-107，1991（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。 TPOにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば部位特定突然変異誘発又はアラニン−スキャンニング突然変異誘発に従って同定され得る(Cunningham and Wells，Science 244 ，1081-1085，1989)。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異分子が、その分子の活性に対して臨界であるアミノ酸残基を同定するために生物学的活性（たとえば、レセプター結合、インビトロ又はインビボ増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学又はフォトアフィニティーラベルのような技法により決定されるような結晶構造の分析により決定され得る。たとえば、de Vosなど., Science 255 : 306-312，1992 ; Smithなど., J.Mol.Biol ． 224 : 899-904，1992；Wlod averなど., FEBS Lett. 309：59-64，1992を参照のこと。一般的に、サイトカインは４−αヘリックス構造を有することが予想され、ここで第１及び第４ヘリックスがリガンド−レセプター相互作用において最とも重要であり、そしてそのファミリーのメンバー間でより高く保存される。配列番号４に示されるヒトTPOアミノ酸配列に関して、整合したサイトカイン配列は、それらのヘリックスがそれぞれアミノ酸残基29と53，80と99，108と130、及び144 と168により結合されることを示唆する（境界は±４個の残基である）。マウス（配列番号２）及び他の非ヒトTPOのヘリックス境界は、ヒト配列との整合により決定され得る。TPOの他の重要な構造観点は、配列番号12の位置51，73，129及び195(配列番号４の位置28，50，106及び172に対応する)でシステイン残基を含む。本発明においては、トロンボポエチンは、種々の分離源、たとえば血液、血漿、尿、細胞培養物及び乳汁から調製され得る。遺伝子的に構築された培養細胞又は多細胞生物において組換えタンパク質としてTPOを生成することが一般的に好ましい。次に、タンパク質は細胞溶解物又は抽出物、ならし培養培地、又は多細胞生物の場合、乳汁又は他の流体から精製される。トロンボポエチンは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された培養細胞において生成され得る。適切な宿主は、外因性DNAにより形質転換され、又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得る細胞型であり、そして細菌、菌類細胞及び培養された高等真核細胞を包含する。クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は、Sambrookなど., Molecular Cloning : A Laboratory Manual ，2nded. ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989、及びAusubelなど., 前記（これらは引用により本明細書に組込まれる）により開示されている。一般的に、TPOタンパク質をコードするDNA配列は、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターは通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むが、但し、当業者は、一定の系において、選択マーカーが別のベクター上に供給され、そして外因性DNA の複製が宿主細胞のゲノム中への組込みにより提供されることも理解するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内での通常の企画の出来事である。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的な供給者を通して入手できる。宿主細胞の分泌路中にTPOを向けるためには、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、本発明のタンパク質をコードするDNA配列に、正しく読取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は通常、興味あるタンパク質をコードするDNA配列に対して５′側に位置するが、但し、あるシグナル配列は興味あるDNA配列において他の場所に位置することができる（たとえば、Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号 ; H ollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。分泌シグナル配列はTPOに通常関連する配列であり、又はもう１つの分泌されたタンパク質、たとえば組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子からであり得る。マウス及びヒトTPOのための発現ベクターは、調製され、そしてブダペスト条約の規定下で、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive，Ro ckville，MDに寄託された。ベクターpZGmp1-1081(ATCC 69566)は、アデノウィルスの主要後期プロモーターに連結されるマウスTPO cDNAを含む。ベクターpZGmp1 -124（ATCC 69615）は、マウスメタロチオネインプロモーター及びhGHターミネーターに連結されるヒトTPO cDNA、及びDHFR選択マーカーを含む。酵母細胞、特にサッカロミセス属(Saccharomyces)の細胞が、組換えTPOの生成への使用のための好ましい宿主である。外因性DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えタンパク質を生成するための方法は、たとえばKawasaki ，アメリカ特許第4,599,311号；Kawasakiなど., アメリカ特許第4,931,373号 ; Brake，アメリカ特許第4,870,008号 ; Welchなど., アメリカ特許第5,037,743 号；及びMurrayなど., アメリカ特許第4,845,075号（これらは引用により本明細書に組込まれる）により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常は薬物耐性、又は特定の栄養素（たとえばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により、形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasakiなど.(アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT1ベクター系である。酵母への使用のための好ましい分泌シグナル配列は、Ｓ．セレビシアエ(S．cere visiae)MFα１遺伝子(Brake，前記；Kurjanなど., アメリカ特許第4,546,082号 )の配列である。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖系酵素遺伝子（たとえば、Kawasaki，アメリカ特許第4,599,311号；Kin gsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter，アメリカ特許第4,977, 092号；これらは引用により本明細書中に組込まれる）及びアルコール脱水素酵素遺伝子からのものである。また、アメリカ特許第4,990,446号；第5,063,154号；第5,139,936号；及び第4,661,454号（これらは引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。他の酵母、たとえばハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、スキゾサッカロミセスプロムベ(Schizosaccharomyces pombe) 、クルイベロミセスラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセスフラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴマイジス(Ustilago mayd is)、ピチアパストリス(Pichia pastoris)、ピチアグイレルモンディ（Pich ia guillermondii）及びカンジダマルトサ(Candida maltosa)のための形質転換システムは当業界に知られている。たとえば、Gleesonなど., J.Gen.Microbi ol. 132 ：3459-3465，1986 ; Cregg.，アメリカ特許第4,882,279号；及びStro manなど., アメリカ特許第4,879,231号を参照のこと。他の菌類細胞もまた、宿主細胞として適切である。たとえばアスペルギラス(A spergillus)細胞は、KcKnightなど., アメリカ特許第4,935,349号（引用により本明細書に組込まれる）の方法に従って利用され得る。アクレモニウムクリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法が、Suminoなど., アメリカ特許第5,162,228号（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz，アメリカ特許第4,486,533号（引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。培養された哺乳類細胞はまた、本発明において好ましい宿主である。哺乳類宿主細胞中への外因性DNAを導入するための方法は、リン酸カルシウム−介在のトランスフェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725，1978 ; Corsaro and Pea rson，Somatic Cell Genetics ７ : 603，1981 ; Graham and Van der Eb，Vi rology 52 : 456，1973）、エレクトロポレーション（Neumanなど., EMBO J.１ : 841-845，1982）、DEAE−デキストラン介在のトランスフェクション(Ausub elなど.，eds., Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and S ons，Inc.，NY，1987)、及びカチオン性脂質−介在のトランスフェクション(Haw ley-Nelsonなど., Focus 15 : 73-79，1993)を包含する（前記文献は、引用により本明細書に組込まれる）。培養された哺乳類細胞における組換えタンパク質の生成は、たとえばLevinsonなど., アメリカ特許第4,713,339号 ; Hagenなど., アメリカ特許第4,784,950号；Palmiterなど., アメリカ特許第4,579,821 号；及びRingold, アメリカ特許第4,656,134号（これらは引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。好ましい培養された哺乳類細胞は、COS-1( ATCC No.CRL 1650)，COS-7(ATCC No．CRL 1651)，BHK(ATCC No．CRL 1632)，BHK 570(ATCC No．CRL 10314)，293(ATCC No．CRL 1573)；Grahamなど., J.Gen.Vi rol. 36 : 59-72，1977）及びチャイニーズハムスター卵巣（たとえばCHO-K1 ; ATCC No．CCL 61）細胞系を包含する。さらなる適切な細胞系は、当業界において知られており、そして公共の受託所、たとえばAmerican Type Culture Collec tion，Rockville，Marylandから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、たとえばSV-40又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。たとえば、アメリカ特許第4,956,288号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのもの（アメリカ特許第4, 579,821号及び第4,601,978号；これらは引用により本明細書に組込まれる）、及びアデノウィルスを主要後期プロモーターを包含する。薬物選択は、一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞について選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を移行することができる細胞は、“安定したトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシンタイプの薬物、たとえばG-418又は同様のものの存在下で実施される。選択システム、すなわち“増幅 ”として言及される方法もまた、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるために使用され得る。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞について選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセート(MTX)に対して耐性を付与する、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬物耐性遺伝子（たとえば、ヒグロマイシン耐性、複数の薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。他の高等真核細胞、たとえば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞がまた、宿主細胞として使用され得る。昆虫細胞の形質転換及びそこでの外来性タンパク質の生成は、Guarinoなど., アメリカ特許第5,162,222号；Bangなど., アメリカ特許第4,775,624号；及びWIPO公開WO 94／06463(これらは引用により本明細書中に組込まれる )により開示される。植物細胞における発現ベクターのためのベクターとしてのアグロバクテリウムリゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sink arなど., J.Biosci.(Bangalore) 11 : 47-58，1987により再検討されている。好ましい原核宿主細胞は細菌Ｅ．コリの株であるが、しかしバシラス（Bacill as）及び他の属もまた有用である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化された外来性DNA配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（たとえば、Sambrookなど., 前記を参照のこと）。細菌、たとえばＥ．コリにタンパク質を発現する場合、そのタンパク質は、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そしてたとえばグアニジンイソチオシアネートを用いて変性される。次に、変性されたタンパク質は、その変性体を希釈することによって再生される。後者の場合、タンパク質は、可溶性で且つ機能的な形で細胞周辺腔から、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（たとえば音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、回収され得る。形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、たとえば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び必要なら、成長因子又は血清を含む。増殖培地は一般的に、発現ベクター上に担持され又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる選択マーカーにより補充される必須栄養素における薬物選択又は栄養素欠乏により、外因的に付加されたDNAを含む細胞について選択するであろう。トランスジェニック動物技法はまた、TPOを生成するために用いられ得る。雌の宿主哺乳類の乳腺内にタンパク質を生成することが好ましい。乳腺における発現及び乳汁中への興味あるタンパク質の続く分泌は、他の源からのタンパク質の単離において遭遇する多くの困難性を克服する。乳汁は容易に集められ、多量に入手でき、そして生化学的に十分に特徴づけられる。さらに、主要な乳汁タンパク質は、高濃度（約１〜15ｇ／ｌ）で乳汁に存在する。商業的な観点から、多量の乳汁生成の種を宿主として使用することが明らかに好ましい。小動物、たとえばマウス及びラットは使用され得るが（及び概念の証明段階で好ましい）、家畜哺乳類、たとえばブタ、ヤギ、羊及び畜牛を用いることが好ましい。羊は、この種におけるトランスジェネシスの前の歴史、乳汁生成、費用、及び羊の乳汁の収集のための装置の容易な入手性のような要因のために特に好ましい。宿主種の選択に影響を及ぼす要因の比較のためには、WIPO公開WO 88／00239を参照のこと。乳業使用のために繁殖された宿主動物の品種、たとえばEast Friesland羊を選択し、又は後日にトランスジェニック系の繁殖により酪農用系統を導びくことが一般的に所望される。いづれにせよ、既知の良好な健康状態の動物が使用されるべきである。乳腺における発現を得るためには、乳汁タンパク質遺伝子からの転写プロモーターが使用される。乳汁タンパク質遺伝子は、カゼイン（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第5,304,489号を参照のこと）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、及び乳清酸性タンパク質をコードするそれらの遺伝子を包含する。β−ラクトグロブリン(BLG)プロモーターが好ましい。羊β−ラクトグロブリン遺伝子の場合、その遺伝子の５′側フランキング配列の少なくとも隣接する406bpの領域が一般的に使用されるが、但し約５kbpまでの、その５′側フランキング配列の大きな部分、たとえば５′側フランキングプロモーター、及びβ−ラクトグロブリン遺伝子の非コード部分を包含する−4.25kb pのDNAセグメントが好ましい。Whitelawなど., Biochem.J. 286 : 31-39，19 92を参照のこと。他の種からのプロモーターDNAの類似するフラグメントもまた、適切である。トランスジェニック動物を生成するための一般的な方法は、当業界においては知られている。たとえば、Hoganなど., Manipulating the Mouse Embryo : A L aboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，1986 ; Simonsなど., B io/Technology ６：179-183，1988 ; Wallなど., Biol.Reprod. 32：645-651 ，1985 ; Buhlerなど., Bio/Technology ８：140-143，1990 ; Eberなど., B io/Technology ９ : 835-838，1991 ; Krimpenfortなど., Bio/Technology ９：844-847，1991 ; Wallなど., J.Cell.Biochem. 49 : 113-120，1992；アメリカ特許第4,873,191号及び第4,873,316号；WIPO公開WO 88／00239，WO 90／051 88，WO 92／11757 ；及びGB 87／00458(これらは引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。哺乳類及びそれらの生殖細胞中に外来性DNA配列を導入するための技法は、元来、マウスにおいて開発された。たとえば、Gordonなど., Proc .Natl.Acad.Sci ．USA 77 : 7380-7384，1980 ; Gordon and Ruddle，Science 214 : 1244-1246，1981 ; Palmiter and Brinster，Cell 41：343-345，198 5 ; Brinsterなど., Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 82 : 4438-4442，1985；及び Hoganなど.(前記)を参照のこと。続いて、それらの技法は、より大きな動物、たとえば家畜種への使用のために適合された（たとえば、WIPO公開WO 88／00239， WO 90／05188及びWO 92／11757 ; 及びSi monsなど., Bio/Technology ６ : 179-183，1989を参照のこと）。要約すれば、トランスジェニックマウス又は家畜の生成において現在のところ使用される最とも効果的な経路において、興味あるDNAの数百の直鎖状分子が、当業界において標準化されている技法に従って、受精された卵のプロ−核の１つ中に注入される。接合体の細胞質中へのDNAの注入がまた用いられ得る。トランスジェニック植物における製造もまた用いられ得る。発現は、一般化され、又は特定の器官、たとえば塊茎に向けられ得る。Hiatt，Nature 344 : 46 9-479，1990 ; Edelbaumなど., J.Interferon Res ． 12 : 449-453，1992 ; S izmonsなど., Bio/Technology ８：217-221，1990 ; ヨーロッパ特許公開EP 2 55,378；及びHiattなど., アメリカ特許第5,202,422号を参照のこと。本発明によれば、TPOが、タンパク質の電荷に基づいて、親和性精製及び分離を包含する方法の組合せを用いて精製される。親和性精製は固定されたMPLレセプタータンパク質又はそのリガンド結合部分に対して行なわれ、そして結合されたTPOが従来の方法に従って、溶離され、そしてさらなる分別にゆだねられる。上記に示されたように、流体、たとえばならされた細胞培養培地、乳汁又はそれらの画分からトロンボポエチンを精製することが好ましい。一般的には、遺伝子的に構築された細胞及び生物は、“天然”源（たとえば血液、血漿、尿）のタンパク質よりも一層の費用効果であり、そして調節し、そしてモニターするのに容易である生成システムを提供する。分別のために必要とされる時間を減じるためは、まず、生物学的流体における TPOを濃縮することが好ましい。濃縮は、当業界において知られている多くの手段のいづれかにより達成され得る。濃縮の好ましい方法は、約10KD〜約30KDの分子量カットオフを有する膜を用いての限外濾過、及び吸着剤、たとえば色素樹脂（たとえば、Mimetic Gree n(TM)，Lexton Scientific International，Signal Hill，CA）上への直接的な捕獲を包含する。トロンボポエチン含有生物学的流体が、MPLレセプターのリガンド結合ドメインを含んで成る、固体支持体に結合されるポリペプチドに適用される。MPLレセプターは、科学文献に記載されている。たとえば、Vigonなど., Proc.Natl.Aca d.Sci ．U.S.A. 89 : 5640-5644，1992及びSkodaなど., EMBO J．12 : 2645-26 53，1993を参照のこと。マウスMPLレセプターのＮ末端細胞外ドメインのアミノ酸配列が配列番号７に示されている。当業者は、配列番号７がマウスMPLレセプターの単一の対立遺伝子の代表であり、そして対立遺伝子の変動の存在が予測されることを認識するであろう。他の種（たとえば、ヒト又は他の霊長類、ラット、犬、ブタ、等）からのMPLレセプターが、マウスレセプターに対する機能及び構造類似性により固定され得る。マウスMPLレセプターのリガンド結合ドメインは、タンパク質の細胞外部分内に含まれ(配列番号７の残基27〜480)、そして残基293−297，358−361及び398−419がリガンド結合のために特に重要なものであると思われる。適切な固体支持体は、使用される条件下で不溶性である、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、及び同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基により変性され得る。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にレセプターポリペプチドを結合するための方法は、当業界において良く知られている。特定の方法の選択は、通常の企画の事項であり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。たとえば、Af finity Chromatography : Principles & Methods ，Pharmacia LKB Biotechnolog y，Uppsala，Sweden，1988を参照のこと。本発明の好ましい態様においては、固体支持体に結合されるレセプターポリペプチドがカラムの形で提供される。生物学的流体が、レセプター上へのTPOの吸着を好む条件下で（たとえば、0〜1.0ＭのNaClを含むpH7.0〜9.0の緩衝液において）、カラム上に通される。次に、カラムが洗浄され、吸着されていない物質が除去される。適切な洗浄条件は、当業者に明らかであろう。低〜中程度の塩濃度の中性〜わずかに塩基性の緩衝溶液、たとえば0.5〜1.0ＭのNaClを含む、pH7.0 〜9.0のトリス−緩衝溶液により洗浄することが好ましい。次に、吸着されたTPO が、レセプターポリペプチドから溶離される。溶離は、カオトロピック剤、たとえばKSCN、尿、又はグアニジン HCl、好ましくは2.0〜3.5ＭのKSCNによりレセプターTPO複合体を洗浄することによって行なわれる。他方では、TPOがレセプターポリペプチドにバッチ態様で吸着され得る。典型的な方法においては、レセプターポリペプチドが、不溶性粒子（たとえば樹脂ビーズ）に結合され、そしてTPOを含む溶液と共に２〜24時間インキュベートされる。固定されたポリペプチドに結合されたTPOが、たとえば軽い遠心分離又は濾過により溶液から除去される。次に、レセプターポリペプチド粒子が一般的に上記に開示されたように緩衝溶液により洗浄され、そしてTPOがカオトロピック剤によりポリペプチドから溶離される。溶離は、ポリペプチドからTP Oを開放するためにカオトロピック剤を添加し、続いて、不溶性レセプターポリペプチド粒子から可溶性TPOを分離するために遠心分離することによって、バッチ態様で実施され得る。他の方法においては、粒子−レセプターポリペプチド− TPO複合体が、カラム中に注がれ、そしてTPOが上記に開示されるようにして溶離される。さらなる精製の前、溶離されたTPOから溶離剤を除去することが好ましい。除去するための適切な方法は、透析、ゲル濾過、及び直接的な捕獲を包含し、そして透析が好ましい。透析緩衝液の選択は、当業者のレベル内である。弱アルカリ性の緩衝溶液が好ましい。次に、TPO含有溶液が、たとえばアニオン交換クロマトグラフィーにより分別され得る。好ましいクロマトグラフィー媒体は、第四アミン又はジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換マトリッ harmacia Biotech，Piscataway，NJから入手できる）を包含する。溶離の前、カラムは低いイオン強度の緩衝液、たとえば0.025Ｍのトリス−HCl(pH8.5)により洗浄される。TPOは、pH8.5のトリス緩衝液における、たとえば０〜0.5ＭのNaCl の塩グラジエントを適用することによってカラムから溶離される。TPOは、約0.0 5〜0.15Ｍの間の塩濃度で溶離する。精製は、従来の方法、たとえば分光光学的に又は電気泳動的にモニターされる。銀染色法及び“ウェスターン”ブロットを用いてのSDS−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動が、精製をモニターする好ましい方法である。典型的なアニオン交換分別は、図１に示されている。TPOは、低い（18,000〜5 5,000ドルトン）及び高い（70,000±10,000ドルトン）の分子量種に分離される。次に、Mr＜55KDのTPO種を実質的に含度に精製されたTPO画像がプールされる。本発明に従って調製されたタンパク質は、たとえば再生不良性貧血、骨髄形成異常症候群、化学療法又は先天性血球減少症により誘発される血球減少症の処理に；及び貧血の処理において、骨髄における細胞の増殖を高めることが所望される。タンパク質は、特に、血小板減少症の処理において血小板生成を高めるために有用である。血小板減少症は、病状を生成するために単独で又は一斉に作用することができる、種々のグループの疾病及び臨床学的状況に関連している。低められた血小板計数は、たとえば血小板生成の欠陥、異常な血小板分布、多量の輸血による希釈性損失、又は血小板の異常な破壊に起因する。たとえば、癌治療に使用される化学療法薬物が骨髄における血小板前駆体細胞の増殖を抑制し、そしてその結果の血小板減少症が化学療法を制限し、そして輸血を必要とする。さらに、一定の悪性が血小板生成及び血小板分布を害する。悪性細胞を殺害するために使用される放射線療法はまた、血小板前駆体細胞も殺害する。血小板減少症はまた、薬物、新生児異種免疫性又は血小板輸血異種免疫性により誘発される種々の血小板自己免疫疾患からも生じる。本発明のタンパク質は輸血のための必要性を減じ又は排除し、それにより、血小板異種免疫性の発生率を減じる。血小板の異常破壊は、（１）血管移植片又は傷つけられた組織における高められた血小板消費；又は（２）たとえば薬物誘発された血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、自己免疫疾患、血液学的疾患、たとえば白血病及びリンパ腫、又は骨髄を包含する転移性癌に関連する免疫機構に起因する。本発明のタンパク質のための他の徴候は、再生不良性貧血、及びたとえば化学療法、又はAZTによるH IV感染の処理に起因する、薬物誘発性骨髄抑制を包含する。血小板減少症は、高められた出血、たとえば鼻腔領域又は胃腸管からの粘膜性出血、及び創傷、潰瘍又は注射部位からの滲出として明示される。 TPOの消費はまた、循環性赤血球及び赤血球前駆体細胞のレベルを高めるために効果的であると思われる。それらの細胞の循環レベルの低下が貧血として知られている。血液における赤血球レベルが、血液100ml当たりのヘモグロブリンの量として又は血液100ml当たりのパックされた赤血球細胞の体積として測定される。患者は、彼らのヘマトクリットレベルが血液100ml当たり11〜13ｇ以下に落ちる場合（患者の年齢及び性別に依存する）、貧血として診断される。TPOは、血液細胞形成の低下がたとえば化学療法の毒性効果に関連する、骨髄不全に関連する貧血の処理のために特に有用である。さらに、一定の悪性が、血小板及び赤血球生成及び分布を害する。悪性細胞を殺害するために使用される放射線療法はまた、血小板及び赤血球前駆体細胞をも殺害する。血小板及び赤血球の異常破壊は、血液学的疾患、たとえば白血病、及びリンパ腫、又は骨髄を包含する転移性癌に起因する。同時発生する貧血及び血小板減少症を処理するための本発明のタンパク質のための他の徴候は、再生不良性貧血、及びたとえば化学療法、又はAZ TによるHIV感染の処理に起因する、薬物誘発性骨髄抑制を包含する。これに関して、TPOは、単独で又はエリトロポエチンと組合して投与され得る。医薬使用のためには、TPOは非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は１〜数時間の典型的な期にわたってボーラス注射又は注入によってであろう。一般的に、医薬製剤は、医薬的に許容できるビークル、たとえば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース又は同様のものと共にTPOを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を妨ぐためのアルブミン、等を含むことができる。さらに、TPOは、他のサイトカイン、特に初期作用性サイトカイン、たとえば幹細胞因子、IL-3，IL-6，IL-11又はGM-CSFと共に組合され得る。そのような組合せ療法を用いる場合、サイトカインは、単一の製剤に組合され得、又は別々の製剤に投与され得る。配合方法は、当業界において良く知られており、そしてたとえばRe mington's Pharmaceutical Sciences ，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，E aston PA，1990（引用により本明細書に組込まれる）に開示される。本発明のTP Oの治療用量は一般的に、0.1〜100μｇ／kg体重／日、好ましくは0.5〜50μｇ／ kg体重／日であり、そして正確な用量は、処理されるべき病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容された基準に従って臨床医により決定される。ある場合、たとえば高められた感度を示し、又は長期の処理を必要とする場合、１日当たり0.1〜20μｇ／kgの用量が必要であろう。用量の決定は、当業者のレベル内である。TPOは通常、化学療法又は骨髄移植後、28日までの期間、又は＞20,000／mm³、好ましくは＞50,000／mm³の血小板計数が達成されるまで、投与されるであろう。より通常には、TPOは１週間又はそれ以下の期間にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与されるであろう。一般的に、治療的有効量の TPOは、血小板又は赤血球の循環レベルの上昇として明示される、骨髄性前駆体細胞の増殖及び／又は分化における臨床的に有意な上昇を生成するのに十分な量である。従って、血小板疾患の処理は、少なくとも20,000／mm³、好ましくは50, 000／mm³の血小板計数に達するまで、続けられる。貧血の処理は、正常なヘマトクリットが回復されるまで続けられるであろう。TPOはまた、他のサイトカイン、たとえばIL-3，-6、及び-11 ；幹細胞因子；エリトロポエチン； G-CSF及びGM-CSFと一緒に投与されるであろう。組合せ療法の手段においては、他のサイトカインの毎日の用量は、一般的に次の通りであろう：EPO,≦150Ｕ／kg；GM-CSF，５−15μｇ／kg；IL-3，１〜５ μｇ／kg；及びG-CSF，１〜25μｇ／kg。EPOとの組合せ療法は、低EPOレベルの貧血患者に示される。 EPOはまた、造血細胞の分化及び増殖のインビトロ研究のための、たとえば細胞分化の機構を誘発するための及び成熟細胞の系統を決定するための価値ある手段でもあり、そしてまた、細胞培養物における増殖剤として利用され得る。 TPOはまた、エクソビボで、たとえば自己由来の骨髄培養物にも使用され得る。手短に言及すれば、骨髄が化学療法の前、患者から除去され、そして場合によっては、１又は複数の他のサイトカインと組合して、TPOにより処理される。次に、処理された骨髄が、骨髄の回収を早めるために化学療法の後、患者に戻される。さらに、TPOはまた、骨髄又は末梢血液前駆体（PBPC）細胞のエクソビボ拡張のためにも使用され得る。化学療法処理の前、骨髄が末梢循環中に初期前駆体細胞を放すために幹細胞因子(SCF)又はG-CSFにより刺激され得る。それらの前駆体が末梢血液から集められ、そして濃縮され、そして次に、場合によっては、１又は複数の他のサイトカイン、たとえばSCF，G-CSF，IL-3，GM-CSF，IL-6又はIL -11と組合して、TPOにより培養において処理され、高い用量の化学療法に続いて患者に戻され得る、高密度巨核球培養物中に分化され、そして増殖される。本発明はさらに、次の非制限的な例により例示される。例例１：ヒト TPO遺伝子のクローニング Cloning Systems，La Jolla，CA）を、プローブとしてマウスTPOcDNA(Lokなど. , 前記及び配列番号１)を用いて、ヒトトロンボポエチンをコードする遺伝子についてスクリーンした。ライブラリーを力価し、そしてＥ．コリ株LE-392細胞（ Stratagene Cloning Systems）により接種された30個の150mmプレートを４×10⁴ 個のプラーク形成単位(PFU)により感染せしめた。プレートを37℃で一晩インキュベートした。フィルタープラークリフトを、製造業者により推薦された方法に従って、HYBOND-N^TMナイロン膜(Amersham Corp., Arlington Heights，IL)を用いて製造した。フィルターを、1.5ＭのNaCl及び0.5ＭのNaOHを含む溶液における変性により室温で７分間、処理した。フィルターを、フィルター紙上に手短にブロットし、過剰の変性溶液を除去し、続いて１Ｍのトリス−HCl(pH7.5)及び1.5 ＭのNaClにおいて５分間、中和した。ファージDNAを、ST 1,200μジュールのUVエネルギーによりフィルター上に固定した。固定の後、フィルターを、0.25×SSC、0.25％のSDS及び１mMのEDTAにより65℃で３度、予備洗浄した。予備洗浄した後、フィルターを、0.45μＭのフィルターを通して濾過されたハイブリダイゼーション溶液（５×SSC、５×Denhardt's溶液、0.2％のSDS 及び１mMのEDTA）においてプレハイブリダイズした。熱変性された、剪断サケ精子DNA（100μｇ／mlの最終濃度）を、使用の直前に添加した。フィルターを、65 ℃で一晩、プレハイブリダイズした。 pZGmp1-1081(1994年２月14日、Ｅ．コリ DH5α形質転換体としてAmerican Typ e Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MDに寄託され、そして受託番号ATCC 69566として受託された)からの十分な長さのマウスTPO cDNA を、製造業者により推薦された方法に従って、MEGAPRIME^TM DNA Labeling System（Amersham）を用いてランダムプライミングすることによって³²Ｐによりラベルした。プレハイブリダイゼーション溶液を、約１×10⁶cpmのプローブを含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液により置換し、そして65℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてフィルターを、0.25 ×SSC、0.25％のSDS、及び１mMのEDTAを含む洗浄溶液により４又は５回すすいだ。すすぎの後、フィルターを洗浄溶液により50℃で８回の連続した洗浄により洗浄した。最終洗浄に続いて、フィルターを、強化スクリーンにより−70℃で４日間、オートラジオグラムフィルム(XAR-5 ; Eastman Kodak Co. ; Rochester，NY )に暴露した。オートラジオグラフの試験は、ラベルされたプローブとハイブリダイズした数百の領域を示した。寒天プラグを、精製のために100の領域から採取した。個々の寒天プラグを、１％（ｖ／ｖ）クロロホルムを含むSM（１ｌ当たり5.8ｇのNaC l、２ｇのMgSO₄・7H₂O、１Ｍのトリス−HCl(pH7.5)50ml、２％のゼラチン５mlを含む；Maniatisなど.，eds., Molecular Cloning : A Laboratory Manual ，Co ld Spring Harbor，NY，1982）１mlに一晩ソークした。一晩のインキュベーションの後、個々のプラグからのファージをSMに１：1,000で希釈した。５μｌのアリコートを、Ｅ．コリ株LE392細胞上にプレートした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、そしてフィルターリフトを、上記のようにして調製し、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、洗浄し、そしてオートラジオグラフ処理した。その得られるオートラジオグラフの試験は、２種の主要単離物からの強い陽性のシグナル及び18種の他の単離物からの弱いシグナルを示した。寒天プラグを20のシグナルの個々のために陽性の領域から採取した。寒天プラグを上記のようにして処理した。個々の寒天プラグから溶離されたファージをSMにより１：100に希釈し、そして１μｌのアリコートをＥ．コリ株LE392 細胞と共にプレートした。そのプレートをインキュベートし、そしてファージフィルターリフトを上記のようにして調製し、そしてハイブリダイズした。フィルターを洗浄緩衝液により55℃で洗浄した。フィルターのオートラジオグラムは、３種の元の単離物、８−３−２，10−１−１及び29−２−１からの単一の別々のファージプラークに対応するハイブリダイゼーションの領域を示した。ファージ単離物８−３−２，10−１−１及び29−２−１は、それぞれλZGmp1- HB- λZGmp1-H10及びλZGmp1-H29として与えられた。単離物λZGmp1-H8，λZGmp 1-H10及びλZGmp1-H29からのDNAを、製造業者の指針に従って、LAMBDASORB^TMファージ吸着剤（Promega Corp.，Madison，WI）を用いて精製した。ファージからのヒトゲノムDNA挿入体を、XbeＩによる消化によりファージベクターDNAから分離し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。すべての３種のファージ単離体は、サザンブロット分析により示されるように、マウスmp１レセプターリガンドcDNAプローブにハイブリダイズした配列を含んだ（Maniatisなど., 前記）。ファージλZGmp1-H8を分析し、そしてλZGmp1-H8のハイブリダイズする領域は、9.5kb，2.5kb及び１kbの長さの３種のXbaＩ DNAフラグメント上に存在することが見出された。2.5kbのフラグメントを、XbaＩ消化さ）中にサブクローン化し、プラスミドpZGmp1-H82.5を生成した。ヒトTPO遺伝子の配列及びそのコードされたアミノ酸配列は、配列番号５及び配列番号６に示されている。例２：ヒトTPO cDNAのクローニング十分な長さのヒトTPO−コードのcDNAを、pZGmp1-H82.5に基づいて同定されたエキソン配列及びマウスTPO cDNAの保存された５′側の未翻訳配列に起因する特異的プライマーを用いてヒト肝臓及び腎臓cDNA鋳型からポリメラーゼ鎖反応により単離した。ヒト腎臓、肝臓及び肺ポリd(T)選択されたポリ(A)⁺RNA（Clontech，Palo Alto ，CA）を用いて、第１鎖cDNAを合成した。個々の反応混合物を、１μｇのオリゴ d(T)₁₈（５′側ホスフェートを含まない）mRNAプライマー（New England Biolab s，Beverly，MA）と共に混合された４μｇのポリ(A)⁺RNAを用いて19μｌの最終体積で調製した。前記混合物を65℃に５分間、加熱し、そして氷上で急冷により冷却した。cDNA合成を、RNA−プライマー混合物の個々に、８μｌの５×SUPERSC RIPT^TM緩衝液（GIBCO BRL，Garthersburg，MD）、100mMのジチオトレイトール２ μｌ、それぞれ10mMのdATP，dTTP及びdCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.，Piscataway，NJ）２μｌ、２μｌの１μCi／μｌの³²P-α-dCTP（Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）及び20 0Ｕ／μｌのSUPERSCRIPT^TM逆転写酵素(GIBCO BRL)８μｌを添加することによって開始せしめた。その反応物を45℃で１時間インキュベートし、そしてTE（10mM のトリス−HCl、pH 8.0、１mMのEDTA）により 120μｌに希釈した。cDNAを、８Ｍの酢酸アンモニウム50μｌ及びイソプロパノール160μｌの添加により２度、沈殿せしめた。得られるcDNAペレットをTE 10μｌに再懸濁した。個々の反応についての第１鎖cDNAの収量を、³²P-dCTP組込みのレベルから評価した。肝臓、肺及び腎臓mRNAからの第１鎖cDNAが、別々のポリメラーゼ鎖反応を用いて、２種のcDNAセグメント、すなわち配列のＮ末端側の１／３及びＣ−末端側の２／３のセグメントを生成するために使用された。Kp nＩ制限部位を、プライマーZC7422（配列番号８）及びZC7423（配列番号９）を用いてのPCR突然変異誘発によるゲノム配列からの単一の塩基の変更により前記c DNAセグメント中に導入した。得られるヌクレオチド変更は、予測されるアミノ酸コードの変更を伴わないで通常のKpnＩ制限部位を創造した。Ｎ−末端セグメントを、５ngの鋳型cDNA（腎臓、肝臓及び肺cDNAについて別々の反応において）、80ｐモルの個々のオリゴヌクレオチドZC7424（配列番号10）及びZC7422（配列番号８）、2.5mMのデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Cetus ，Corp.，Emeryville，CA）５μｌ、10×PCR緩衝液（Promega Corp.，Madison， WI）５μｌ、及び2.5単位のTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim Inc.，Indi anapolis，IN）を含む反応混合物50μｌにおいて増幅した。ポリメラーゼ鎖反応を35サイクル行ない（94℃で１分、58℃で１分及び72℃で1.5分）、続いて、72 ℃で７分間インキュベートした。センスプライマーZC7424（配列番号10）は、マウスMPLレセプターリガンド５′未翻訳領域に拡張し、そしてATG開始コドンを含んだ。アンチセンスプライマーZC7422（配列番号８）は、ヒトゲノムTPO DNAのエキソン４及び５に対応する領域からの配列を含んだ。Ｃ末端セグメントを、５ngの鋳型cDNA（上記のようなヒト腎臓、肝臓又は肺）、80ｐモルの個々のオリゴヌクレオチドZC7423（配列番号９）及びZC7421（配列番号11）、2.5mMのデオキシヌクレオチド三リン酸溶液(Cetus Corp.)５μｌ、10 ×PCR緩衝液(Promega Corp.)及び2.5単位のTaqポリメラーゼ(Boehringer Mannhe im，Inc.)を含む反応混合物50μｌにおいて増幅した。ポリメラーゼ鎖反応を35 サイクル行ない（94℃で１分、65℃で１分及び72℃で1.5分）、続いて75℃で７分間インキュベートした。センスプライマーZC 7423（配列番号９）は、ヒトゲノムTPO DNAのエキソン４及び５に対応する領域からの配列を含んだ。アンチセンスプライマーZC7421（配列番号11）は、ヒト遺伝子の３′非コード配列に対応する領域からの配列、及び翻訳終結コドンを含んだ。増幅されたPCR生成物を、指図的なDNA配列決定により分析し、そしてマウスcD NA配列及びヒトゲノム配列への比較によるさらなる分析のためにpGEM-T(Promega Corp.)中にサブクローン化した。ヒトTPOをコードするDNA配列は、配列番号３に示されており、そしてそのコードされたアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。配列の分析は、シグナルペプチド切断がSer21(配列番号４)に続いて生じ、そして成熟タンパク質がアミノ酸22（配列番号４）で開示することを示す。ヒトＮ−末端及びＣ−末端PCRフラグメントを、EcoRＩ−KpnＩフラグメントとしてpGEM-Tから切り出し、そして発現ベクターZem229RのEcoRＩ部位中に連結した。このプラスミドを、Lipofectamine^TM(GIBCO BRL)を用いてBHK 570細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培養培地（DMEM＋PS N＋10％ FCS）を新鮮な培地と交換し、そして細胞を選択剤の不在下で48時間インキュベートした。ならし培地を、BaF3／MPLR1.1細胞系(American Type Cultur e Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MDにブダペスト条約の規定下で1994年９月28日に寄託され、そして受託番号CRL 11723として受託されている)を用いて増殖活性についてアッセイした。手短に言及すれば、ならし培地を、２mMのＬ−グルタミン、PSN抗生物質(GIBCO BRL)、0.00036％の２−メルカプトエタノール及び10％の熱不活性化されたウシ胎児血清により補充されたRPMI 1 640培地(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS)中、10⁶／mlの洗浄されたBaF3／MPL R1.1細胞100μｌに添加した。細胞を、増殖についてのアッセイの前、５％CO₂下で37℃で３日間インキュベートした。TPOの存在下での細胞増殖を、３−（４，５−ジメチルチアゾール− ２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MMT)(Mosman，J.Immu nol.Meth ．65 : 55-63，1983)の代謝性分解に基づく比色アッセイを用いて定量化した。MTT(Polyscience，Inc.，Warrington PA)の10mg/ml溶液20μｌを、100 μｌのBaF3／MPLR1.1 アッセイ細胞に添加し、そして細胞を37℃でインキュベートした。４時間後、イソプロパノール中、0.04ＮのHCl溶液200μｌを添加し、その溶液を混合し、そしてそのサンプルの吸光度をモデルEL320 ELISA読取機(Bio- Tek Instruments Inc.，Highland Park，VT)により570nmで読み取った。その結果は、前記培養培地がマウスMPLレセプターを発現するBaF3細胞の増殖を刺激したことを明確に示した。 cDNAを、製造業者の規格に従って、SUPERSCRIPT^TM逆転写酵素(GIBCO BRL)を用いてヒト肝臓及び腎臓mRNA（Clontech Laboratories，Inc．から得られた）から製造した。次に、肝臓−及び腎臓−由来のヒトTPO DNAクローンを、２種のPCR反応（その条件は表３に示されている）を用いて製造した。反応は、94℃で１分、 58℃で１分、72℃で1.5分間で35サイクル行ない；続いて72℃で７分間インキュベートした。 PCR生成物を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールにより処理し、そして95％ ETOHにより沈殿せしめ、乾燥せしめ、そして水20μｌに再懸濁した。個々の生成物を制限酵素Asp718及びEcoRＩにより切断し、そして１％アガロースゲル上で電気泳動した。反応＃１からの410bpのフラグメント（肝臓及び腎臓）及び反応＃２からの6 99bpのフラグメント（肝臓及び腎臓）を、ゲルから切り出し、そしてナイロンウールを通してゲルスラブの遠心分離により溶離した。反応＃１及び反応＃２のPC R生成物を、EcoRＩにより切断されているベクターZem229R(American Type Cultu re Collection，12301 Parklawan Drive，Rockville，MDに1993年９月28日、受託番号69447として寄託されている)と共に一緒に連結し、それにより創造された Asp718部位で２種の生成物を連結した。得られるプラスミドを、＃10（腎臓由来のcDNAを含む）及び＃28（肝臓由来のcDNAを含む）と称した。 DNAの配列決定に基づけば、単一のPCR−生成された誤差がそれぞれ＃28及び＃ 10プラスミドにおける５′及び３′側のユニークAvrII部位に見出された。誤差のないTPO DNAを創造するために、826bpのEcoRＩ−AvrII 5′フラグメントを＃1 0から単離し、そして283bpのAvrII−EcoRＩ 3′フラグメントを＃28から単離した。それらの２つのフラグメントを、EcoRＩにより切断されたベクターZem229R と共に連結した。その得られるプラスミドは、pZGmp1-124と命名した。このプラスミドを、受託番号69615のＥ．コリDH10b形質転換体として、American Type Cu lture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MDに1994年５月４日；寄託された。例３：ヒト MPLレセプターcDNAのクローニングヒトMPL-P及びMPL-KレセプターイソフォームコードのcDNAを、レセプターのアミノ及びカルボキシル末端をコードする公開された配列(Vigonなど., Proc.Nat l.Acad.Sci ．USA 89 : 5640-5644，1992)に従って製造されたプライマーを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応(PCR)によりヒト赤血球性白血病(HEL)細胞 (Martin and Papayannopoulu，Science 216 : 1233-1235，1982)から単離した。鋳型HEL細胞cDNAを、プライマーZC5499（配列番号14）を用いて、ポリd (T)−選択されたポリ(A)⁺RNAから合成した。１μｇ／μｌの濃度でのHEL細胞ポリ(A)⁺RNA 13μｌと、20ｐモル／μｌの第１鎖プライマーZC5499（配列番号14）３μｌとを混合した。その混合物を65℃で４分間、加熱し、そして氷上での急冷により、冷却した。第１鎖cDNA合成を、８μｌの第１鎖緩衝液(250mMのトリス−HCl、pH8.3、375m MのKCl、15mMのMgCl₂)(５×SUPERSCRIPT^TM緩衝液；GIBCO BRL)、100mMのジチオトレイトール４μｌ及びそれぞれ10mMのdATP，dGTP，dTTP及び５−メチル−dCTP を含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Pharmacia Biotech Inc.，Piscataw ay，NJ）３μｌの添加により開始した。その反応混合物を45℃で４分間インキュベートし、続いて、そのRNA−プライマー混合物に200Ｕ／μｌのRNase H^-逆転写酵素(SUPERSCRIPT^TM逆転写酵素；GIBCO BRL)10μｌを添加した。その反応混合物を45℃で１時間インキュベートし、続いて50℃で15分間インキュベートした。TE （10mMのトリス−HCl、pH8.0、１mMのEDTA）60μｌを前記反応混合物に添加し、次に、これを400孔サイズのゲル濾過カラム（CHROMASPIN＋TE-400^TM ; Clontech Laboratories，Inc.）を通してのクロマトグラフィー処理により分別し、過剰のプライマーを除去した。第１鎖HEL細胞cDNAを、レセプタータンパク質のアミノ及びカルボキシル末端をコードする領域に対応するプライマーを用いて、ヒトMPL-PレセプターcDNAの増幅のための鋳型として使用した(Vigonなど., 前記)。プライマーはまた、増幅された生成物の直接的なクローニングにおいて助力になる異なった制限酵素切断部位をそれぞれ組込んでいた（EcoRＩ部位を含むZC5746、配列番号15； XhoＩ部位を含むZC5762、配列番号16）。10ngの鋳型cDNA、50ｐモルの個々のプライマー； 200μＭの個々のデオキシヌクレオチド三リン酸(Pharmacia B iotech，Inc.)；１μｌの10×PCR緩衝液(Promega Corp.)；及び10単位のTaqポリメラーゼ(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)を含む反応混合物1 00μｌを供給した。ポリメラーゼ鎖反応を35サイクル行ない（95℃で１分、60℃ で１分及び72℃で２分、並びに個々の連続的なサイクルに１回の特別な第２サイクルが付加された）、続いて72℃で10分間インキュベートした。ヒトMPL-KレセプターcDNAを、上記の態様でHEL細胞cDNAからポリメラーゼ鎖反応増幅により単離した。但し、プライマーZC5762（配列番号16）がZC5746（配列番号17）により置換された。PCRプライマーZC5742は、ヒトMPL-K cDNAの３′末端に対して特異的であり、そしてクローニングを促進するためにXhoＩ制限部位を組込んでいた。反応生成物を、フェノール／クロロホルム（１：１）により二度、次にクロロホルムにより１度抽出し、そしてエタノール沈殿した。EcoRＩ及びXhoＩによる消化に続いて、生成物を0.8％低溶融アガロースゲル(SEA PLAQUE GTG^TM低溶融アガロース；FMC Corp.，Rockland，ME)上で分別した。ヒトMPL-PレセプターcDNA に対応する1.9kbの増幅された生成物、及びヒトMPL-KレセプターcDNAに対応する 1.7kbの生成物を、β−アガラーゼＩ(New England Biolabs，Inc.，Beverly MA) によるゲルマトリックスの消化、続くエタノール沈殿により、切り出されたゲルスライスから回収した。cDNAを、 ratagene Cloning Systems）中にサブクローン化した。例４：マウス MPLレセプターcDNAのクローニング C57BL／KsJ-db／dbマウスからの脾臓を取り出し、そしてすぐに、液体窒素に置いた。全RNAを、グアニジンイソチオシアネート（Chirgwinなど. , Biochemistry 18 : 52-94，1979）、続いてCsCl遠心分離段階を用いて脾臓組織から調製した。脾臓ポリ(A)⁺RNAを、オリゴd(T)セルロースクロマトグラフィー（Aviv and Leder，Proc.Natl.Acad.Sci ．U.S.A. 69：1408-1412，1972）を用いて単離した。 1.7μｇ／μｌの濃度でのポリd(T)−選択されたポリ(A)⁺マウス脾臓 RNA7.5μ ｌを、NotＩ制限部位を含む、20ｐモル／μｌの第１鎖プライマーZC6091（配列番号18）３μｌと共に混合した。その混合物を65℃で４分間、加熱し、そして氷上での急冷により冷却した。第１鎖cDNA合成を、RNA−プライマー混合物に250mM のトリス−HCl(pH8.3)、375mMのKCl、15mMのMgCl₂(５×SUPERSCRIPT^TM緩衝液；G IBCO BRL)８μｌ、100mMのジチオトレイトール４μｌ、及びそれぞれ10mMのdATP ，dGTP，dTTP及び５−メチル−dCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（ Pharmacia Biotech Inc.）３μｌを添加することによって開始した。反応混合物を45℃で４分間インキュベートし、続いて200Ｕ／μｌのRNase H^-逆転写酵素(GI BCO BRL)10μｌを添加した。第１鎖合成の効率を、分析のために前記反応をラベルするために前記反応混合物の10μｌアリコートに10μCiの³²P-αdCTPを添加することにより反応に平行して分析した。反応混合物を45℃で１時間、続いて50℃ で15分間インキュベートした。ラベルされた反応における組込まれなかった³²P- αdCTPを、400孔サイズのゲル濾過カラム(CHROMA SPIN＋TE-400^TM；Clontech La boratories Inc.)上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされていない第１鎖反応における組込まれていないヌクレオチドを、８μｇのグリコーゲンキャリヤー、2.5Ｍの酢酸アンモニウム及び2.5体積のエタノールの存在下で cDNAを２度沈殿せしめることによって除去した。ラベルされていないcDNAを、第２鎖合成への使用のために水50μｌに再懸濁した。ラベルされた第１鎖cDNAの長さを、アガロースゲル電気泳動により決定した。第２鎖の合成は、DNAヘアーピン形成をもたらす第２鎖合成の第１鎖プライミングを促進する条件下で第１鎖cDNAに基づいて行なわれた。反応混合物を、室温でアセンブルし、そして50μｌのラベルされていない第１鎖cDNA、16.5μｌの水、20μｌの５×ポリメラーゼＩ緩衝液(100mMのトリス−HCl、pH7.4、500mMのKCl 、25mMのMgCl₂、50mMの(NH₄)₂SO₄)、100mMのジチオトレイトール１μｌ、それぞれ10mMのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液２μｌ、５mMのβ-NAD ３μ ｌ、３Ｕ／μｌのＥ．コリDNAリガーゼ(New England Biolabs Inc.，Beverly，M A)15μｌ及び10Ｕ／μｌのＥ．コリDNAポリメラーゼＩ(Amersham Corp.，Arling ton Heights，IL)５μｌから構成された。反応混合物を、室温で５分間インキュベートし、続いて２Ｕ／μｌのRNase H(GIBCO BRL)1.5μｌを添加した。第２鎖合成混合物の10μｌアリコートが10μCiの³²P-αdCTPの添加によりラベルされた同等の反応混合物を用いて、第２鎖合成の効率をモニターした。反応混合物を15 ℃で２時間、続いて室温で15分間インキュベートした。ラベルされた反応における組込まれなかった³²P-αdCTPを、アガロースゲル電気泳動による分析の前、40 0孔サイズのゲル濾過カラム(Clontech Laboratories，Inc.)を通してクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされなかった反応を、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムによる２回の抽出により停止し、続いて2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめた。ヘアーピン構造の一本鎖DNAを、ヤエナリのヌクレアーゼを用いて切断した。反応混合物は、100μｌの第２鎖cDNA、20μｌの10× ヤエナリヌクレアーゼ緩衝液（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）、100mMのジチオトレイトール16μｌ、水51.5μｌ、及びヤエナリヌクレアーゼ希釈緩衝液中、ヤエナリヌクレアーゼ（Promega Corp．；10.5Ｕ／μｌの最終濃度）の１：10希釈溶液12.5μｌを含んだ。反応混合物を37℃で15分間インキュベートした。反応を１Ｍのトリス−HCl(pH8.0)20μｌの添加により停止し、続いて、上記のようにして、連続的なフェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出を行なった。抽出に続いて、DNAをエタノールにより沈殿し、そして水に再懸濁した。再懸濁されたcDNAを、T4 DNAポリメラーゼによりブラント末端化した。水190 μｌに再懸濁されたcDNAを、50μｌの５×T4 DNAポリメラーゼ緩衝液(250mMのトリス−HCl、pH8.0、250mMのKCl、25mMのMgCl₂)、0.1Ｍのジチオトレイトール３ μｌ、それぞれ10mMのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液３μｌ、及び１Ｕ／μｌのT4 DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim，Inc.)４μｌと共に混合した。10℃で１時間のインキュベーションの後、反応を0.5ＭのEDTA 10μｌの添加により停止し、続いて、上記のようにして一連のフェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出を行なった。DNAを、400孔サイズのゲル濾過カラム(Clontec h Laboratories，Inc.)を通してクロマトグラフィー処理し、微量レベルのタンパク質を除去し、そして長さ約400bp以下の短いcDNAを除去した。DNAを、グリコーゲンキャリヤー12μｇ及び2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめ、そして水10μｌに再懸濁した。³²P-αdCTPの組込みに基づけば、cDNA の収率は、12.5μｇの出発mRNA鋳型から約２μｇであることが評価された。 EcoRＩアダプターを、λファージベクター中へのクローニングを可能にするためにcDNAの５′端上に連結した。cDNAの10μｌアリコート（約２μｇ）及び65ｐモル／μｌのEcoRＩアダプター（Pharmacia Biotech Inc.）10μｌを、2.5μｌの10×リガーゼ緩衝液(Promega Corp.)、10mMのATP １ μｌ及び15Ｕ／μｌのT4 DNAリガーゼ(Promega Corp.)２μｌと共に混合した。反応混合物を、０℃〜18℃の温度グラジエントで一晩（約18時間）インキュベートした。反応混合物を12℃で一晩さらにインキュベートした。反応を、水75μｌ及び３Ｍの酢酸ナトリウム10μｌの添加により停止し、続いて65℃で30分間インキュベートした。インキュベーションの後、cDNAを上記のようにして、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、そして2.5Ｍの酢酸アンモニウム及び1.2体積のイソプロパノールの存在下で沈殿せしめた。遠心分離の後、c DNAペレットを70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、そして水89μｌに再懸濁した。 λファージベクター中へのcDNAの指図的なクローニングを促進するために、cD NAをNotＩにより消化し、５′EcoRＩ及び３′NotＩ付着端を有するcDNAをもたらした。cDNAの３′端でのNotＩ制限部位を、プライマーZG6091（配列番号18）を通して前もって導入した。制限酵素消化を、上記cDNA 89μｌ、６mMのトリス−H Cl 10μｌ、６mMのMgCl₂、150mMのNaCl、１mMのDTT(10×Ｄ緩衝液；Promega Cor p.)及び12Ｕ／μｌのNotＩ(Promega Corp.)１μｌを含む反応において行なった。反応を一連のフェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により停止せしめた。cDNAをエタノール沈殿し、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして20μｌの１×ゲル負荷緩衝液（10mMのトリス−HCl、pH8.0、１mMのEDTA 、５％のグリセロール及び0.125％のブロモフェノールブル）に再懸濁した。再懸濁されたcDNAを65℃に５分間、加熱し、氷上で冷却し、そして0.8％低溶融アガロースゲル(SEA PLAQUE GTG^TM低溶融アガロース；FMC Corp.) 上で電気泳動した。組込まれなかったアダプター及び長さ1.6kb以下のcDNAをゲルから切り出した。電極を反転し、そしてcDNAを、レーン起点近くで濃縮されるまで、電気泳動した。濃縮されたcDNAを含むゲルの領域を切り出し、そして微小管に配置し、そしてゲルスライスのおおよその体積を決定した。ゲルスライスの体積の約３倍の水(300μｌ)のアリコートを前記管に添加し、そしてアガロースを65℃に15分間、加熱することによって溶融した。42℃にサンプルを平衡化した後、１Ｕ／μｌのβ−アガロースＩ(New England Biolabs，Inc.)10μｌを添加し、そしてその混合物を90分間インキュベートし、アガロースを消化した。インキュベーションの後、３Ｍの酢酸ナトリウム40μｌをサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間インキュベートした。サンプルを室温で15分間、14,0 00×ｇで遠心分離し、消化されなかったアガロースを除去した。上清液における cDNAをエタノール沈殿せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、そしてキナーゼ反応のために水37μｌに再懸濁し、連結されたEcoRＩアダプターをリン酸化した。上記cDNA溶液37μｌに、10μｌの10×リガーゼ緩衝液（Stratagene Cloning S ystems）を添加し、そしてその混合物を65℃に５分間、加熱した。混合物を氷上で冷却し、そして10mMのATP５μｌ及び３μｌの10Ｕ／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Stratagene Cloning Systems）を添加した。反応混合物を37℃で 45分間インキュベートし、そして65℃に10分間、加熱することによって停止し、続いてフェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより連続して抽出した。リン酸化されたcDNAを2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、そして水12.5μｌに再懸濁した。リン酸化されたcDNAの濃度は、約40ｆモル／μｌであることが評価された。得られるcDNAを、EcoRＩ及びNotＩにより予備消化され、そして脱リン酸化されたλファージベクターλExCell^TM（Pharmacia Biotech Inc.）中にクローン化した。ベクターへのcDNAの連結は、20ｆモル／μｌの調製されたλExCell^TMファージアーム２μｌ、水４μｌ、１μｌの10×リガーゼ緩衝液(Promega Corp.)、4 0ｆモル／μｌのcDNA ２μｌ及び15Ｕ／μｌのT4 DNAリガーゼ(Promega Corp.) １μｌを含む反応において行なわれた。連結を４℃で48時間、行なった。連結混合物の約50％を、製造業者の指図に従って、GIGAPA ）を用いてファージ中にパッケージした。得られるcDNAライブラリーは、1.5％以下の挿入体を含まないファージのバックグラウンドレベルを伴って、1.5×10⁷ 個以上の独立した組換え体を含んだ。 ³²Ｐ−ラベルされたヒトMPL-KレセプターcDNAプローブを用いて、マウス脾臓c DNAファージライブラリーからマウスMPLレセプターcDNAを単離した。cDNAライブラリーを、150mmの直径のプレート当 tagene Cloning Systems）上にプレートした。33個のプレートからのファージプラークを、ナイロン膜（Hybond N^TM；Amersham Corp.，Arlington Heights，IL ）上に移し、そして製造業者の指針に従って処理した。その処理されたフィルターを真空オーブン中において80℃で２時間ベークし、続いて洗浄緩衝液（0.25× SSC、0.25％のSDS、１mMのEDTA）により70℃で数回洗浄し、そしてハイブリダイゼーションオーブン（モデルHB-2；Techne Inc.，Princeton，NJ）においてハイブリダイゼーション溶液(５×SSC、５×Denhardt's溶液、0.1％のSDS、１mMのED TA及び100μｇ／mlの熱変性されたサケ精子DNA)により65℃で一晩、予備ハイブリダイズした。予備ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリダイゼーション溶液を捨て、そして市販のラベリングキット(MEGAPRIME^TMキット；Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)の使用により調製された、約２×10⁶cpm／mlの³²Ｐ−ラベルされたヒトMPL-K cDNAを含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液により置換した。プローブを、ハイブリダイゼーション溶液への添加の前、98℃で５分間、変性した。ハイブリダイゼーションを65℃で一晩行なった。フィルターを洗浄緩衝液（0.25×SSC、0.25％のS DS、１mMのEDTA）により55℃で洗浄し、そしてXAR-5フィルム（Eastman Kodak C o.，Rochester，NY）上で−70℃で４日間、強化スクリーンを伴ってオートラジオグラフィー処理した。鋳型としてオートラジオグラフを用いて、寒天プラグを、主要シグナルに対応するプレートの領域から回収し、そしてSM(0.1ＭのNaCl； 50mMのトリス−HCl、pH7.5；0.02％のゼラチン)によりソークし、プラーク精製のためにファージを溶離した。ヒトMPL-Kレセプタープローブにハイブリダイズする挿入体を担持する、７個のプラーク−精製されたファージを単離した。λEx Cell^TMファージ内に含まれるPhagemidsを、製造業者の指針に従って、インビボ組換えシステムを用いて回収した。cDNA挿入体の正体が、DNA配列決定により確認された。単離されたクローンは、ヒトMPL-Pレセプター及び最近報告されたマウスMPLレセプターに対して高い程度の配列同一性を示すタンパク質をコードした(Skodaなど., EMBO J ． 12：2645-2653，1993)。７個のクローンはお互いとは異なる２つのクラスに分類され、ここで３個のクローンはＮ−末端近くで60個の長さのアミノ酸残基をコードする配列の欠失を有する。前記欠失を有さないタンパク質をコードするcDNAを、マウスタイプＩ MPLレセプターcDNAとして言及した。タイプIIレセプターcDNAは、配列番号７のタイプＩレセプター残基131 〜190をコードする配列を欠いていた。さらに、タイプＩ及びIIレセプターは、アミノ酸残基222の後に挿入されたアミノ酸残基Val-Arg-Thr-Ser-Pro-Ala-Gly-G lu（配列番号19）をコードする配列の存在により、及び位置241(位置はタイプＩマウスレセプターを言及する)でセリンとグリシン残基との置換により、報告されたマウスMPLレセプター配列(Skodaなど., 前記)とは異なった。タイプＩ及びIIマウスMPLレセプターcDNAを、哺乳類細胞における発現のためにプラスミドベクターpHZ-1中にサブクローン化した。プラスミドpHZ-1は、哺乳類細胞において、又はインビトロで転写されたmRNAからのカエル卵母細胞翻訳システムにおいて、タンパク質を発現するために使用され得る発現ベクターである。pHZ-1発現単位は、マウスメタロチオネイン−１プロモーター、コード配列の挿入のためのユニーク制限部位を含む複数のクローニングバンクを両端に有するバクテリオファージＴ７プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、及びバクテリオファージＴ７ターミネーターを含んで成る。さらに、pHZ-1は、複製のＥ．コリ起点；細菌性βラクタマーゼ遺伝子；SV40プロモーター及び起点を含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；耐ネオマイシン性遺伝子及びSV40転写ターミネーターを含む。pHZ-1中への直接的なクローニングを促進するために、適切なプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応を用いて、翻訳開始コドンから上流に及び翻訳停止コドンから下流にそれぞれEcoRＩ部位及びXhoＩ部位を創造した。ポリメラーゼ鎖反応を、10μｌの10×ULTMA^TM DNAポリメラーゼ緩衝液(Roche Molecular Systems，Inc.)、25mMのMgCl₂６μｌ、それぞれ10mMのdATP，dGTP，d TTP及びdCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Phar macia Biotech，Inc.）0.2μｌ、20ｐモル／μｌのプライマーZC6603(配列番号2 0)2.5μｌ、20ｐモル／μｌのプライマーZC5762(配列番号16)2.5μｌ、水32.8μ ｌ、タイプＩ又はタイプIIマウスMPLレセプタープラスミドのいづれかを両端に有する初期対数相細菌培養物１μｌ、及び６Ｕ／μｌのDNAポリメラーゼ(ULTMA^T ^M ポリメラーゼ；Roche Molecular Systems，Inc.)１μｌを含む混合物において実施した。AmpliWax^TM(Roche Molecular Systems，Inc.)を、製造業者の指針に従って反応に使用した。ポリメラーゼ鎖反応を25サイクル行ない（95℃で１分、 55℃で１分及び72℃で３分）、続いて72℃で10分間インキュベートした。増幅された生成物を連続的にフェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、次に６μｇのグリコーゲンキャリヤー及び2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめた。ペレットを、水87μｌに再懸濁し、これに、10μｌの10×Ｈ緩衝液(Boehringer Mannheim，Inc.)、10Ｕ／μｌのEcoRＩ（Boehringe r Mannheim，Inc.）２μｌ及び40Ｕ／μｌのXhoＩ(Boehringer Mannheim，Inc.) １μｌを添加した。消化を37℃で１時間行なった。反応を、65℃に15分間、加熱することによって停止し、そして400孔サイズのゲル濾過カラム(CHROMA SPIN＋T E-400^TM；Clontech Laboratories Inc.)を通してクロマトグラフィー処理した。上記単離されたレセプター挿入体を、EcoRＩ及びXhoＩ消化され、そして脱リン酸化されたpHZ-1ベクター中に連結した。連結反応は、50ng／μｌの調製されたpHZ-1ベクター１μｌ、５ng／μｌのDNA挿入体５μｌ、10×リガーゼ緩衝液(P romega Corp.)２μｌ、水11.75μｌ及び４Ｕ／μｌのT4 DNAリガーゼ（Stratage ne Cloning Systems）0.25μｌを含んだ。連結を10℃で一晩行なった。連結されたDNAを、製造業者の指針に従って、Ｅ．コリ（MAX EFFICIEN CY DH10B^TMコンピテント細胞 ; GIBCO BRL）中にトランスフェクトした。pHZ-1 におけるタイプＩ及びタイプIIマウスMPL及びヒトMPL-Pレセプター挿入体をDNA 配列決定により確かめた。得られるプラスミドpSLmp1-8及びpSLmp1-9は、それぞれマウスタイプII及びタイプＩ MPLレセプターcDNAを担持した。プラスミドpSLm p1-44は、ヒトMPL-P cDNA挿入体を担持した。例５：可溶性 MPLレセプターの調製可溶性マウスタイプＩ MPLレセプターをコードする哺乳類発現プラスミド(pLD mp1-53)を、pSLmp1-9からのDNAセグメント、すなわち上記の十分な長さのマウスタイプＩ MPLレセプターをコードするcDNAを含む哺乳類発現ベクターと、pSLmp1 -26からのDNAセグメント、すなわち細菌において可溶性マウスタイプＩ MPLレセプターを生成するために構成された発現プラスミドとを組合すことによって生成した。マウスタイプＩ MPL可溶性レセプターをコードするcDNAセグメントを、鋳型として十分な長さのレセプタープラスミドpSLmp1-9を用いてプライマーZC6704（配列番号21）及びZC6703（配列番号22）を用いてのPCRにより単離した。指図的なクローニングを促進するために、プライマーZC6704及びZC6703は、それらのそれぞれの５′端でEcoRＩ及びXhoＩ制限部位を組込んだ。プライマーZC6703はまた、³²P γ-ATPによる精製された可溶性レセプターのインビトロラベリングを可能にするために、タンパク質キナーゼのための整合したコンセンサス標的配列をコードした(Liなど., Proc.Natl.Acad.Sci ．U.S.A. 86：558-562，1989)。PCRを、10μｌの10×ULTMA^TM DNAポリメラーゼ緩衝液(Roche Molecular Systems，Inc .)、25mMのMgCl₂６μｌ、それぞれ10mMのdATP，dGTP，dTTP及びdCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸(Pharmacia Biotech Inc.) 0.2μｌ、4.55ｐモル／μｌのプライマーZC6704（配列番号21）11μｌ、2.43ｐモル／μ ｌのプライマーZC6703（配列番号22）21μｌ、水50.3μｌ、50ng／μｌのHindII I及びXbaＩ消化されたpSLmp1-9（１μｌ）及び６Ｕ／μｌのULTMA^TM DNAポリメラーゼ(Roche Molecular Systems，Inc.)１μｌを含む混合物において行なった。AmpliWax^TM(Roche Molecular Systems，Inc.)を、製造業者の指針に従って反応に使用した。ポリメラーゼ鎖反応を３サイクル行ない（95℃で１分、50℃で１分及び72℃で２分）、続いて、高められたハイブリダイゼーション緊縮性下で11 サイクル行ない（95℃で１分、55℃で30秒及び72℃で２分）、続いて72℃で10分間インキュベートした。増幅された生成物をフェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより連続的に抽出し、続いて400孔サイズのゲル濾過カラム(Clontech Laboratories，Inc.)を通してクロマトグラフィー処理した。PCR生成物を、20 μｇのグリコーゲンキャリヤー及び2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめた。ペレットを水32μｌに再懸濁した。その再懸濁されたPCR生成物16μｌに、10×Ｈ緩衝液(Boehringer Mannheim，Inc.)２μｌ、10Ｕ／μｌのEcoRＩ(Boehringer Mannheim，Inc.)１μｌ及び40Ｕ／μｌのXhoＩ(Boehringe r Mannheim，Inc.)１μｌを添加した。消化を37℃で１時間、行なった。消化を6 5℃に15分間、加熱することによって停止し、そしてDNAを0.7％低溶融アガロースゲル上で精製した。低溶融アガロースからのフラグメントの回収は、β−アガラーゼＩ(New England Biolabs)によるゲルマトリックスの消化により行なわれた。得られるPCR生成物は、マウスタイプＩ MPLレセプターのＮ−末端細胞外ドメインをコードした(配列番号７の残基27〜480)。推定上のレセプタートランスメンブランドメイン(配列番号７の残基483〜504)の不在下で、発現されたタンパク質は、適切なシグナルペプチドの存在下で分泌されることが予測される。マウスタイプII可溶性MPLレセプターcDNAを、上記PCR条件を用いて得た。但し、pSLmp1-8が鋳型として使用された。両レセプターフラグメントの有効性は、DNA配列決定により確認された。可溶性マウスタイプＩ及びタイプII MPLレセプターDNAフラグメントを、EcoR Ｉ及びXhoＩ消化されたベクターpOmpA2-5中にクローン化し、それぞれpSLmp1-26 及びpSLmp1-27を生成した。プラスミドpOmpA2-5は、pOmpA2(Ghrayabなど., EMB O J ．３ : 2437-2442，1984)の変性体、すなわち、細胞周辺腔に組換えタンパク質を向けるよう企画された細菌発現ベクターである。pOmpA2-5を、pOmpA2のEcoR Ｉ及びBamHＩ部位間の13bp配列を合成の42bp配列により置換することによって構成した。配列は、塩基対合される場合、EcoRＩ及びBamHＩ消化されたpOmpA2中への指図的なクローニングを促進するEcoRＩ及びBamHＩ付着端を形成する、２種の 42個のヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチド（ZC6707、配列番号23；ZC6706 、配列番号24）のアニーリングにより創造された。挿入された配列内には、細菌性リーダー配列及び上記マウスMPL可溶性レセプターcDNAに対して整合されたXho Ｉ部位、及び金属キレート化親和性クロマトグラフィー（Houchuliなど., Bio/ Technol. ６ : 1321-1325，1988）による組換えタンパク質の精製を可能にするためにXhoＩ部位の３′側に位置する整合系の６個のヒスチジンコドンが存在する。前記ヒスチジン系をコードする配列に続いて、停止コドンが存在した。pOmp A2-5，pSLmp1-26及びpSLmp1-27の有効性は、DNA配列決定により確認された。 pLDmp1-53、すなわち可溶性マウスタイプＩ MPLレセプターポリペプチドを生成する哺乳類発現プラスミドを、発現ベクターpHZ-200(ジヒドロ葉酸レダクターゼ配列が耐ネオマイシン遺伝子のために置換されているpHZ-1)中へのpSLmp1-9及びpSLmp1-26からのDNAセグメントを組合すことによって構成した。pSLmp1-9からの1164bpのEcoRＩ／BamHＩ cDNAフラグメントが、細菌性発現プラスミドpSLmp1-26の構成の間に欠失された哺乳類シグナル配列を置換した。pSLmp1-26からの416bpのBamHＩフラグメントが、可溶性MP Lレセプターのカルボキシ−末端部分のためのコード配列、キナーゼラベリングドメイン、ポリ−ヒスチジン系及び翻訳ターミネターを供給＋（Stratagene Cloning Systems）のEcoRＩ／BamHＩ部位中にクローン化し、プラスミドpBS8.76LD-5を生成した。pBS8.76LD-5における、1164bpのpSLmp1-9由来のEcoRＩ／BamHＩフラグメントに対する、416bpのpSLmp1-26由来のBamHＩフラグメントの正しい配向は、プライマーZC6603（配列番号20）及びZC6703（配列番号 22）を用いてPCRにより決定された。pBS8.76LD-5のポリリンカー配列内のXbaＩ部位は、EcoRＩ及びXbaＩによるベクターの消化に続いてのpHZ200中へのクローニングのための1.5kbのEcoRＩ／XbaＩフラグメントとしての再構成されたレセプターcDNAの切り出しを可能にした。得られる哺乳類発現プラスミド、すなわちpL Dmp1-53を、BHK細胞中へのトランスフェクションのために大規模に調製した。精製されたpLDmp1-53プラスミド20μｇを、リン酸カルシウム沈殿法を用いてB HK 570細胞中にトランスフェクトした。５時間後、細胞を15％グリセロールにより３分間、ショックを与え、DNAの摂取を促進した。新鮮な増殖培地を一晩添加した。次の日、細胞を種々の希釈度で分け、そして１μＭのメトトレキセートを含む選択培地を添加した。約２週間後、別々のメトトレキセート耐性コロニーが認識できた。耐性コロニーをプールし、又は明確なクローンとして維持した。プールされたコロニーからの古い培地をすぐに、可溶性MPLレセプターポリペプチドの存在について試験した。可溶性MPLレセプターポリペプチドを、ポリペプチドのカルボキシ末端上に存在するポリ−ヒスチジン系と、固定されたNi²⁺を含む金属キレート化樹脂（HIS- BIND^TM；Novagen，Madison，WI）との相互作用により単離した。pLDmp1-53プールからの血清フリーの古い培養培地を、前記樹脂上に通し、そして結合されたポリペプチドを１Ｍのイミダゾールにより溶離した。SDS-PAGE分析は、約67kDaで単一のバンドを示した。このポリペプチドを、Ｎ−末端アミノ酸分析にゆだね、そしてマウスMPLレセプターであることを確認した。可溶性マウスMPLレセプターポリペプチドを、プラスミドpLDmp1-53によりトランスフェクトされたBHKトランスフェクタントのプールから精製した。精製された可溶性レセプターポリペプチドを、製造業者により指図されるようにしてCNBr −活性化されたSEPHAROSE^TM 4B(Parmacia Biotech)マトリックス上に固定し、そして24−11−５細胞のならし培地におけるMPL活性の親和性精製のために使用した。24−11−５細胞からのならし培地を、10KDのカットオフ中空繊維膜(A/G Tec hnology Corp.，Needham，MA)上で濃縮し、そして１ml／分の流速でMPLレセプター親和性カラムの底に負荷した。カラムを、0.5ＭのNaCl及び0.01％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液(PBS)により洗浄した。MPL活性（トロンボポエチン）を、0.5ml／分の流速で、３Ｍのカリウムチオシアネート（Sigma Chemical Company，St.Louis，MO）によりカラムから溶離した。カリウムチオシアネートを、PBSに対する透析により除去した。親和性カラムからの活性画分を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)(Mosman，J.Immunol.Me th ． 65 : 55-63，1983)の代謝性分解に基づいて比色アッセイにより同定した。MTT（Polyscience，Inc. ，Warrington，PA）の10mg／ml溶液20μｌを、BaF₃／MPLRI.1アッセイ細胞100μ ｌに添加し、そして細胞を37℃でインキュベートした。４時間後、イソプロパノール中、0.04ＮのHCl 200μｌを添加し、その溶液を混合し、そしてサンプルの吸光度をモデルEL320 ELISA読取り機(Bio-Tek Instruments Inc.，Highland Par k，VT)上で570nmで読取った。例６：組換えヒト TPOの調製 pZGmp1-124により形質転換された２種の５mlの一晩の細菌培養物からのプラスミドDNAを、アルカリ細胞溶解、続く、高い塩での樹脂へのDNAの結合により調製した（Promega Corp．からのMagic Minipreps^TM Samplerキットを用いて）。DNA を、10mMのトリス、１mMのEDTA溶液（pH8.0）75μｌにより溶離した。 50,000個の細胞／ウェルでのBHK 570細胞培養物を、pZGmp1-124 DNAによりトランスフェクトした。LIPOFECTAMINE^TM（GIBCO BRL）の１：10希釈溶液20μｌを、プラスミドDNA 20μｌ及び160μｌの血清フリーの培地（10μｇ／mlのフェチュイン、２ng／mlのセレン、５μｇ／mlのインスリン、10μｇ／mlのトランスフェリン、２mMのＬ−グルタミン、 110μｇ／mlのピルビン酸ナトリウム、25mM のHEPES、及び0.1mMの非必須アミノ酸溶液(GIBCO BRL)により補充されたＦ／DV 培地〔DMEM及びHam's F12の１：１混合物〕）に、室温で30分間にわたって添加し、その後、BHK 570細胞を添加し、そして37℃で４時間インキュベートした。2 00μｌの増殖培地(２mMのＬ−グルタミン、110μｇ／mlのピルビン酸ナトリウム、0.05mg／mlのペニシリン、0.05mg／mlのストレプトマイシン、0.01mg／mlのネオマイシン、25mMのHEPES、10％のウシ胎児血清により補充されたDMEM(Bio Whit taker，Inc，Walkersville，MD))を次に添加し、そして細胞を37℃で一晩インキュベートした。次に、培養培地を、５％ウシ胎児血清を含む増殖培地により置換し、そして細胞を37℃で４時間インキュベートした。次に、BHK 570トランスフェクタントからのならし培地を、マウスMPLレセプターを発現するBaF3細胞における細胞増殖を引き起こす能力についてアッセイした。細胞を、BaF3培地（10％ウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES、57μＭのβ−メルカプトエタノール、0.05mg／m lのペニシリン、0.05mg／mlのストレプトマイシン、0.01mg／mlのネオマイシン、及びWEHI-3細胞（マウスインターロイキン−３、培養補充物、Collaborative Biomedical Products）の培養物からの４％（ｖ／ｖ）ならし培地により補充されたRPMI 1640培地(JRH Biosciences，Lexena，KS)）において増殖せしめた。アッセイの前、BaF3細胞を希釈し、そしてIL-3−フリーのBaF3培地に再懸濁し、10 ,000細胞／100μｌにした。pZGmp1-124によりトランスフェクトされたBHK 570細胞からのならし培地100μｌを添加し、そしてその培養物を37℃でインキュベートした。次に、細胞を、30分及び24時間後、細胞拡張について眼により試験した。IL-3を含まないBaF3培地からなる負の対照、及びマウスTPO DNAによりトランスフェクトされたBHK 570細胞からのならし培地から成る正の対照をまたアッセイした。結果は、負の対照におけるBaF3細胞の細胞拡張の不在、正の対照におけるいくらかの細胞の拡張、及びpZGmp1-124によりトランスフェクトされた細胞における有意な細胞拡張を示した。例７：組換えマウス TPOの調製プラスミドpZGmp1-1081を、EcoRＩ及びNotＩにより消化し、そしてTPO DNAセグメントを回収した。このDNAを、NotＩ／EcoRＩリンカーにより、EcoRＩ−消化された、アルカリホスフェート処理されたプラスミドZem229R中に挿入した。mp1 .229Rと称するその得られるプラスミドにより、BHK 570細胞（ATCC CRL 10314）をトランスフェクトした。そのトランスフェクタントを、血清フリーの培地において、10−層細胞製造所(Nunc.Inc. ; VWR Scientific，Seattle，WAから得られた)において増殖し、そして１μＭのメトトレキセートにおいて選択した。16ｌのならし培地を集めた。例８：TPOの精製及び特徴決定ヒト及びマウスTPOを、限外濾過、固定されたMPLレセプター上での親和性クロマトグラフィー処理、及びアニオン交換クロマトグラフィー処理の組合せによりならし細胞培養培地から精製した。 40〜60ｌの粗ならし培養培地を、約１ｌに、10,000の分子量カットオフ膜上で濃縮した。その濃縮物を、4.0ＭのNaClの添加により0.5ＭのNaClに調節し、そしてそのpHをpH8.5に調節した。次に、その溶液を、0.22μのフィルターに通し、そしてCNBr−活性化されたSepharose^TM(Pharmacia Biotech)に結合される可溶性マウスMPLレセプター（膨張した樹脂１ml当たり約15mgのレセプター）の4.0cm（高さ）カラムにより2.5cm（直径）に適用した。適用の流速は5.0ml／分であり、そしてカラムは４℃で実施された。サンプルの適用の後、カラムを、0.5ＭのNaC lを含む20mMのトリス（pH8.5）溶液100mlにより洗浄した。TPOを、5.0ml／分の流速で、20mMのトリス（pH9.5）、3.0ＭのKSCNの溶液によりカラムから溶離した。タンパク質溶離は、280nmでの吸光度によりモニターされた。タンパク質溶離物を含む画分を、20mMのトリス（pH8.5）により透析し、KSCNを除去した。次に、透析された溶離物を、2.0ml／分のそしてカラムを20℃で実施した。サンプルの適用の後、カラムを、20mMのトリス（pH8.0）20mlにより洗浄した。次に、タンパク質を、20mMのトリス（pH8.5）中、20分間の０〜0.5ＭのNaClグラジエントにより溶離した。その溶離プロフィールを220nmでの吸光度によりモニターし、そして2.0mlの画分を集めた。ウェスターンブロットを、カラム画分の可視化のためにドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)と共に使用した。マウスTPOのためには、ウェスターンブロット分析を、マウスTPOに由来するペプチド配列（配列番号２のAsp-52〜Leu-66）に対して生成されたラットポリクローナル抗血清を用いて行なった。個々の画分20μｌを、変性（還元）サンプル緩衝液における４〜20％のトリス−グリシンSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。タンパク質をエレクトロブロットによりニトロセルロースに移した。タンパク質を、前記ブロットとラット抗−TPOペプチド抗血清、続いてウサギ抗−ラット抗体／ホースラディシュペルオキシダーゼ接合体(Bio Source International，Camar illo，CA)及びECL^TM検出試薬（Amersham Corp.）とを反応せしめることによって可視化した。次に、前記ブロットを、種々の画分における70KD及び≧35KDのTPO 種の相対量を決定する手段として、１又は10秒間、オートラジオグラフィーフィルムに暴露した。１秒の暴露の後、同じレーンにおいて70KDのフラグメントのバンドよりも、10秒の暴露の後の≧35KDのフラグメントのバンドがより一層、低い強度のものである場合、その画分は少なくとも90％の70KDのTPOを含むことが決定された。眼による検査によれば、いくつかの画分は、＞95％の70KDのTPOを含むことが判定された。＞90％の70KDのTPOを含む画分をプールした。１秒の暴露の後、同じレーンにおいて、35KDのバンドよりも、10秒の暴露の後の70KDのバンドがより低い強度のものである場合、その画分は少なくとも90％の35KDのTPOを含むことが決定され、そしてそのような画分をまたプールした。プールされた画分10μｌ（アミノ酸組成分析により決定される場合、70KDのTPO 0.83μｇ及び35KDのTPO 0.24μｇ）を、製造業者の指針に従って、変性条件下で SDS-PAGE（４〜20％ゲル）により、続いてDalichiの銀染色キット（カタログNo ．SE140001 ; Integrated Separation Systems，Natick，MA）を用いての銀染色法により分析した。銀染色によるゲルの展開の後、70KDのプールされた画分は、ゲルレーンの眼による調査により判断される場合、35KDのTPOを実質的に有さないことが決定され、そして35KDの画分は70KDの物質を実質的に有さないことが決定された。70KD及びそれ以下の分子量種中へのマウスTPOの分別を示すウェスターンブロットが、図１に例示されている。精製されたヒトTPOを類似する方法により分析した。ウェスターンブロット分析を、損なわれていないヒトTPOに対するウサギポリクローナル抗血清を用いて実施した。ヒトTPO画分の純度は、マウスタンパク質について観察される純度に類似した。図２は、プールされたヒトTPO画分の銀染色されたゲルを示す。70KD の画分は、＞90％の純度を有し、そしてMr＜55KDのTPO種を実質的に有さないものとして判断された。精製された70KDのTPOを、BaF3／MPLR1.1細胞（安定してトランスフェクトされたタイプＩマウスMPLレセプターを発現するIL-3−依存性細胞 ; American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MDにブダペスト条約の規定下で1994年９月28日に寄託され、そして受託番号CRL 11723として受託されている）に対するインビトロ有糸分裂誘発アッセイにより生物学的活性についてアッセイした。１／２最大活性の点（16の曲線の平均）を、50Ｕ／mlの値として割り当てた。元の標準溶液(pZGmp1-1081によりトランスフェクトされたBHK細胞系によりならされた血清フリーの培地)は、26,600Ｕ／mlマウスTPOを含むことが計算された。TPOサンプルを、57μＭの２−メルカプトエタノール、２mMのＬ−グルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウム、PSN抗生物質混合物、10mMのHEPES及び10％の熱不活性化されたウシ胎児血清により補充されたRPMI 1640培地により、一般的に８〜24希釈度で希釈した。手短に言及すれば、100μｌの希釈された試験サンプル又は標準サンプル及び100μｌのBaF3細胞（添加された最終細胞数、約10,000個の細胞／ウェル）を、96のウェルプレートのウェルに組合した。内部の標準は、マウス TPOアッセイのために１mlマウスTPO当たり100Ｕの８種の２−倍希釈溶液、又はヒトTPOアッセイのために１mlマウスTPO当たり150Ｕの８種の２−倍希釈溶液を含んだ。個々のウェルに、３Ｈ−チミジン（１μCi／μｌ；Amersham）２μｌを添加し、そしてプレートを37℃で一晩インキュベートした。個々のプレート中の個々のウェルの内容物を、Packard装置を用いて、フィルター／プレートに移した。フィルターを水により８度洗浄し、そしてフィルターを乾燥せしめ、そして計数した。個々のサンプルのウェルにおけるTPO活性の単位を、標準曲線への比較により決定した。合計のタンパク質含有量を、アミノ酸比較分析により決定した。精製された70KDのマウスTPOは、129,000単位／μｇの比活性を有し、そして精製された70KDのヒトTPOは、それらの方法により5,000単位／μｇの比活性を有することが見出された。前述から、本発明の特定の態様が例示目的で記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかであろう。従って、本発明は、付随する請求の範囲を除いて、限定的でない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロフトン−デイ，キャサリンイー. アメリカ合衆国，ワシントン 98036，ブリアー，サーティーフィフスアベニュウエスト 23908 (72)発明者ロク，シアメリカ合衆国，ワシントン 98107，シアトル，ノースウエストフィフティーセカンドストリート 806

Claims

【特許請求の範囲】１．精製された哺乳類トロンボポエチンであって、ａ）変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトン；及びｂ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法により決定される場合、汚染性タンパク質に対して少なくとも90％純粋であることによって特徴づけられる精製されたトロンボポエチン。２．Mr＜55KDのTPO種を実質的に有さない請求の範囲第１項記載の精製されたトロンボポエチン。３．マウストロンボポエチンである請求の範囲第１項記載の精製されたトロンボポエチン。４．前記トロンボポエチンが残基45(Ser)から残基379(Thr)の、配列番号２に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成る請求の範囲第３項記載の精製されたトロンボポエチン。５．霊長類トロンボポエチンである請求の範囲第１項記載の精製されたトロンボポエチン。６．ヒトトロンボポエチンである請求の範囲第５項記載の精製されたトロンボポエチン。７．前記トロンボポエチンが残基22(Ser)から残基353(Gly)の、配列番号４に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成る請求の範囲第６項記載の精製されたトロンボポエチン。８．生物学的流体からトロンボポエチンを精製するための方法であって、 MPLレセプターのリガンド−結合ドメインを含んで成る、固体支持体に結合されるポリペプチドに、トロンボポエチンを含む生物学的流体を適用し、それにより前記トロンボポエチンが前記ポリペプチドに吸着され；吸着されていない物質を溶離するために前記ポリペプチドを洗浄し；前記ポリペプチドから吸着されたトロンボポエチンを溶離し；前記溶離されたトロンボポエチンをアニオン交換クロマトグラフィーにより分別し；そして前記分別されたトロンボポエチンを集めることを含んで成る方法。９．前記生物学的流体がならし細胞培養培地又は乳汁である請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記生物学的流体が濃縮されたならし細胞培養培地である請求の範囲第８項記載の方法。 11．生物学的流体をレセプターポリペプチドに適用する前、その生物学的流体を濃縮する段階をさらに含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 12．前記固体支持体が架橋されたアガロースビーズである請求の範囲第８項記載の方法。 13．前記集められたトロンボポエチンが、ａ）変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトン；及びｂ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法により決定される場合、汚染性タンパク質に対して少なくとも90％純粋であることによって特徴づけられる請求の範囲第８項記載の方法。 14．前記集められたトロンボポエチンがMr＜55KDのTPO種を実質的に有さない請求の範囲第13項記載の方法。 15．前記トロンボポエチンがマウストロンボポエチンである請求の範囲第８項記載の方法。 16．前記トロンボポエチンが霊長類トロンボポエチンである請求の範囲第８項記載の方法。 17．前記トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである請求の範囲第８項記載の方法。 18．前記ポリペプチドがマウス又はヒトMPLレセプターのリガンド−結合ドメインを含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 19．前記ポリペプチドが配列番号７の残基27〜480から実質的に成る請求の範囲第18項記載の方法。 20．医薬的に許容できるビークルと共にトロンボポエチンを含んで成る医薬組成物であって、ここで前記トロンボポエチンが、変性条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される場合、Mr＝70,000±10,000ドルトンにより特徴づけられ、そして前記組成物がMr＜55KDのトロンボポエチン種を実質的に有さないことを特徴とする医薬組成物。