CN100432102C - 血小板增进蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明披露一种与血小板生成素受体(MPL)有强亲和性的蛋白及其核苷酸编码序列。该蛋白具有提升体内血小板数量和加速血液凝结等功能，因而将本发明的蛋白称为血小板增进蛋白(Platelet Promoting Protein，简称PPP)。本发明的蛋白或核苷酸序列可以用于治疗人体血小板减少症等疾病。

Description

血小板增进蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及血小板增进蛋白及其应用。

发明背景

血小板是血液的重要组份之一，对受伤部位的迅速止血起关键的作用，并有修复受损血管的功能。血小板数量一旦低于正常水平，易引起大量失血而导致生命危险。目前，对血小板缺乏症病人通常施行血小板输注治疗。然而，与其它血液制品一样，用于输注的血小板制品的储存期较短，同时置病人于感染乙肝病毒、艾滋病病毒等血原性致病源和异源免疫反应等危险之中。

血小板生成素(TPO)是刺激血小板生成的细胞因子，通过与血小板生成素受体(MPL)结合发挥作用。MPL由三部分组成：胞外区域MPL-EC(26-491aa)(Extracellular domain)、跨膜区域(Transmembrane)、胞浆区域(Cytoplasmicdomain)。1994年国际上五间实验室同时成功克隆TPO。TPO的成功克隆给人们带来了治疗血小板减少症的新希望和新途径。但是，临床结果表明TPO对治疗血小板减少症效果在不同患者中差别很大，同时TPO的副作用也开始引起人们的注意：首先，TPO可活化血小板，刺激血小板聚集，从而导致血栓形成；其次，服用TPO后，体内可能出现TPO抗体。(Archimbaud E，et al.Blood.1999；94：3694-3701；Schiffer CA，et al，Blood.2000；95：2530-2535；Nash R，et al.Blood.1997；90 suppl.1：262a)。因此人们希望找到可以替代血小板生成素的其他种类的蛋白质或细胞因子。

酵母双杂交系统适用于研究蛋白之间的相互作用。该系统由两个表达载体质粒(A和B)和酵母宿主(C)组成。其原理是基于转录因子例如LexA或Gal4蛋白是由两个分离的域(domain)组成：DNA-结合域(DNA-BD)和转录活化域(AD)。A质粒表达钓饵蛋白和DNA-BD的融合蛋白，B质粒表达待测蛋白和AD的融合蛋白。当将A质粒和B质粒同时转化酵母宿主时，在酵母中同时表达的是两种融合蛋白如果发生相互作用，DNA-BD和AD将靠近，重新组装成LexA或GAL4蛋白并活化报告基因的转录。因而，采用已知的钓饵蛋白，可以研究其配体的功能或证实某些蛋白的功能。目前，Clontech公司提供的试剂盒Matchmaker Two-Hybrid System 3，Matchmaker LexA Two-HybridSystem就是这种酵母双杂交系统的商业化产品的例子。

发明内容

本发明目的在于找到一种与血小板生成素具有相同功能的新的分离的蛋白质。

本发明的目的还在于提供一种含有编码本发明蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA或含有该DNA的载体或质粒。

本发明的再一个目的在于提供本发明蛋白质的用途，包括制药用途和治疗疾病的用途。

为实现上述目的，本发明用血小板生成素受体胞外区域(MPL-EC)为钓饵，运用酵母双杂交系统，从人体胎儿肝cDNA文库中筛选与血小板生成素受体(MPL)互相作用的蛋白，获得了一种与MPL受体胞外区域特异性结合的新蛋白质。该蛋白具有331个氨基酸。经Blast分析表明，该蛋白质与血小板生成素TPO没有同源性。由于发现本发明的蛋白质在巨核细胞成熟和血小板生成方面具调控作用，故称之为血小板增进蛋白(Platelet Promoting Protein；下文有时简称PPP)。其氨基酸序列见序列表中的SEQ ID NO.：2(下文简称“序列2”)，其核苷酸编码序列见序列表中的SEQ ID NO.：1(下文简称“序列1”)。本申请文本所用的术语“血小板增进蛋白”或“PPP”是指一种具有序列表中序列2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明还提供该PPP蛋白质的衍生物。“血小板增进蛋白衍生物”或“PPP衍生物”或“其衍生物”包括那些具有可在体内刺激血小板生成和加速血液凝结功能的、其氨基酸序列为序列2所示氨基酸序列的突变体、序列2的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式、序列2的部分或全部串联重复形式以及与其他蛋白质和细胞因子的融合蛋白形式。例如，本发明PPP衍生物的一个具体的例子是在序列2所示的氨基酸序列的N末端还具有2-6个组氨酸。

在本申请文本所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9-37，1984)。

具体而言，首先根据人MPL-EC的DNA编码序列设计与其两端对应的引物MPLEC-F和MPLEC-R，并分别在引物中加入适宜的酶切位点。以人体总cDNA为模板，扩增并分离出1.3Kb的MPL-EC cDNA。然后，经酶切后连接到pLexA质粒的多克隆位点中，得到pLexA-MPL-EC质粒。

接下来，将得到的pLexA-MPL-EC质粒与人胎儿肝cDNA文库DNA共转化酵母菌EGY48，在营养缺陷型培养基上筛选出阳性克隆。酶切该阳性克隆的质粒DNA，分析插入基因的核苷酸序列如序列1所示，由之推测的氨基酸序列如序列2所示。

随后，将PPP基因插入表达载体pET-28b得pET-PPP，并将此表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得含有该质粒载体的大肠杆菌转化子。经诱导后，表达的PPP的N端融合有6个连续的组氨酸。利用与组氨酸有亲和作用的Co²⁺配体亲和层析柱，纯化PPP。

然后将纯化的PPP注射正常小鼠，然后检测外周血血小板的数量和出血时间(Bleeding Times)的变化。结果表明，纯化的PPP具有明显的促进体内血小板生成，和增加外周血血小板量的生物活性。

由于本发明的蛋白质具有促进体内血小板生成的作用，因而其可用于制备治疗血小板减少症的药物的或用于制备促进止血的药物用途。所述药物可为注射剂、粉剂、片剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂等。所述药物的给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射给药。

本发明还相应地提供一种药物组合物，其含有本发明蛋白质PPP或其具有提升体内血小板数量功能的衍生物；以及药学上可以接受的载体。所述可药用载体包括液体载体如纯净水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、白蛋白溶液等，固体载体如抗氧化剂、淀粉、糊精等。本发明的药物组合物还可任选地含有其他造血细胞因子类生物制品如白介素、粒细胞集落刺激因子(MCSF)、促红细胞生成素等。

本发明的含有PPP的药物组合物是可以很方便地制备的。可以采用制药领域中的常规技术和设备，将本发明的蛋白质配制成药物组合物。例如，可以将本发明的蛋白质溶解在无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、白蛋白溶液中，配制成1μg-100μg/ml的溶液。

本发明的PPP可以参照血小板生成素的建议给药剂量安排给药。例如，给药剂量范围在1-1000μg/kg体重/日的范围内，并由有资格的医师根据患者的年龄、体重、疾病的严重程度、病因和病史等因素在该范围内选择。

本发明中所述载体、宿主菌等可由商业途径得到，如pET-28b和BL21(DE3)购自Novagen公司，酵母双杂交筛选系统Matchmaker LexA Two-Hybrid System及纯化His-PPP所需的Co²⁺配体亲和层析柱TALON Metal Affinity Resin可购自美国Clontech公司。

以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明不受下述具体文字和图片描述的限制，本发明可在权利要求所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

附图说明

图1显示pLexA-MPL-EC质粒的构建示意图。

图2显示pB42AD质粒简图。

图3显示表达载体pET-28b简图。

图4显示表达本发明PPP的pET-PPP表达载体的构建示意图。

图5显示融合蛋白His-PPP SDS-PAGE电泳检测图。蛋白样品经10％SDS-PAGE电泳，凝胶用考马斯亮蓝染色，箭头所示为His-PPP，约45kDa。泳道1，蛋白分子量标准；泳道2和3，未经和经IPTG诱导的大肠杆菌细胞裂解液；泳道4，可溶性His-PPP粗提物；泳道5，经Co²⁺配体亲和层析柱纯化的His-PPP。

图6表示His-PPP刺激小鼠体内血小板增长的图。灰色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤体重的实验组(第一组)，黑色柱代表每天注射50μgHis-PPP/公斤体重的实验组(第二组)，白色柱代表注射PBS的对照组(第三组)。第0天开始，连续腹腔注射7天。第0、4、7、10、13、16和19天时取尾静脉外周血20μl，检测血小板数量。血小板数表示为：平均数±标准差×10⁹/L。

图7表示本发明His-PPP缩短出血时间的柱图。黑色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤体重的实验组(第一组)，白色柱代表注射PBS的对照组(第二组)。第0天开始，连续腹腔注射7天。第0，4，7，10，13，16和19天时检测小鼠出血时间。

具体实施方式

下列实施例仅用于说明而不应视为限定本发明的范围，实施例中未注明具体条件者，按常规或制造商建议的条件进行。

实施例1、运用酵母双杂交系统分离与血小板生成素受体胞外区域(MPL-EC26-491aa)相结合的血小板增进蛋白

1.1靶蛋白质粒pLexA-MPL-EC的构建

根据人体血小板生成素受体胞外区域的DNA序列设计与其两端对应的引物MPLEC-F和MPLEC-R，并分别在引物中加入EcoRI和XhoI酶切位点(下划线)以便于克隆。

MPLEC-F：5’-CCGGAATTCCAAGATGTCTCCTTGCTGGCATCAGA-3’；

MPLEC-R：5’-CCGCTCGAGTTATCCGACCACGAGCTCCAGGG-3’。

如图1所示，以人体总cDNA为模板，PCR合成人体血小板生成素受体胞外区域。PCR反应液为：1×PCR反应缓冲液，0.5μM MPLEC-F，0.5μMMPLEC-R，1μg人体总cDNA，2 U Taq DNA聚合酶(购自Fermentas Inc.，Maryland，USA)，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5mM MgCl₂，用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：

            94℃，90sec  循环30次

94℃，5min→55℃，60sec→→→→→→→72℃，10min

            72℃，120sec

1％琼脂糖电泳分离和纯化分子量约1.45Kb的PCR产物。将上述纯化的扩增产物用EcoRI和XhoI酶切后，用T4连接酶连接到亦经EcoRI和XhoI酶切的pLexA载体(购自美国Clontech公司)上，获得重组DNA质粒pLexA-MPL-EC。pLexA-MPL-EC构建步骤见图1。

1.2筛选与MPL-EC相互作用的蛋白

筛选系统采用Matchmaker LexA Two-Hybrid System(购自美国Clontech公司)。该系统是基于LexA的酵母双杂交系统，用于在酵母中检测蛋白与蛋白之间的相互作用。具体使用操作方法按生产厂家提供的说明书进行。

将以pB42AD(见图2)为载体的人体胎儿肝cDNA文库(购自美国Clontech公司)稀释后涂布于LB平板上，37℃过夜培养。用消毒的棉花棒收集细菌细胞菌落，在液体LB培养基中37℃过夜培养，用质粒DNA提取试剂盒E.Z.N.A.

Fastfilter Plasmid Midiprep Kit(购自美国Omega Bio-Tek公司)抽提质粒DNA。将提取得到的100μg人体胎儿肝cDNA文库DNA和100μg按实施例1.1制备的pLexA-MPL-EC DNA共转化含p80p-lacZ(Ura+，Lac+，Leu+)质粒的酵母菌EGY48(购自美国Clontech公司)。将转化的酵母菌在含X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu营养缺陷型培养基(配方参照Clontech公司的产品说明书)上30℃培养，选择阳性克隆，即在营养缺陷型培养基上生长并呈蓝色的菌落。结果，获得1个阳性克隆，命名为pB42AD-PPP。提取质粒后，通过酶切分析发现pB42AD-PPP的插入片段约为1300bp。该克隆携有993bp完整的编码序列，命名为PPP，编码331个氨基酸。将插入片段进行核苷酸序列测定，然后氨基酸编码分析，结果分别如序列1和2所示。经Blast分析表明，PPP基因所编码的氨基酸序列与血小板生成素TPO没有同源性，但与生理功能不明的Human Nuclear Distribution Gene C(HNUDC)之cDNA序列(Matsumoto，N.and Ledbetter，D.H，Hum.Genet.104，498-504，1999；Genbankdatabase gi：12052969)完全相同。由于本发明发现该蛋白具有提升体内血小板数量和加速血液凝结等功能，故名命为血小板增进蛋白(Platelet PromotingProtein；PPP)。

实施例2血小板增进蛋白表达载体pET-28b的构建与血小板增进蛋白的表达纯化

采用如图3所示的表达载体pET-28b(购自美国Novagen公司)克隆表达本发明的血小板增进蛋白，此载体含有His-tag，故所表达的血小板增进蛋白His-PPP的N端带6个连续的组氨酸残基，可经Co²⁺配体亲和层析一步纯化。

pET-28b载体有多克隆位点。根据pET-28b载体的酶切位点和血小板增进蛋白cDNA序列，设计两端引物：

PPP-F：5’-CGGGATCCGTACCCGCATGATATGCAGTAGAT-3’，含BamH I酶切位点(下划线)；

PPP-R：5’-CCGCTCGAGTTAGCTTGGAGCTAAGGTGCAT-3’，含XhoI酶切位点(下划线)。

以实施例1获得的pB42AD-PPP质粒DNA为模板扩增血小板增进蛋白cDNA。PCR反应条件为：1×PCR反应缓冲液，0.5μM PPP-F，0.5μM PPP-R，1μg pB42AD-PPP质粒，2U DNA聚合酶(Fermentas公司)，50μM dATP，50μMdTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5mM MgCl₂，用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：

            94℃，60sec    循环30次

94℃，5min→55℃，60sec→→→→→→→→→72℃，10min

            72℃，90sec

1％琼脂糖电泳分离和纯化分子量约1Kb的PCR扩增产物。将上述纯化的扩增产物用BamH I和Xho I双酶切后，用T4DNA连接酶连接到亦经BamHI和Xho I双酶切的pET-28b载体上His-tag之下游，获得重组DNA质粒pET-PPP，构建过程见图4。

将如上获得的重组DNA质粒pET-PPP转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)。将含pET-PPP的大肠杆菌BL21(DE3)的转化子接种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃培养过夜。以1％接种量，接种至LB液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素)，37℃摇床培养至A₆₀₀为0.5～0.6。在培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(简称IPTG)至终浓度为0.5mM，30℃诱导4小时，离心收集菌体。用50mM磷酸钠缓冲液(含300mM NaCl，1mM苯甲基磺酰氟(简称PMSF)，pH 7.4)重悬菌体。超声波破碎细胞壁，10,000g离心30分钟，弃去细胞碎片，得到His-PPP的粗提液，用TALON Metal AffinityColumn(美国Clontech公司)将His-PPP提纯，操作按厂家的说明书进行，获得可溶His-PPP融合蛋白(45kDa)。经10％SDS-PAGE电泳检测，His-PPP纯度达95％以上，见图5。

实施例3His-PPP刺激BALB/c小鼠血小板的生成

体内注射药物测外周血血小板数方法参照Kaushansky et.al.，Nature，Vol.369，1994，565-568。

用含有0.1％牛血清白蛋白(简称BSA)的磷酸盐缓冲液(简称PBS)，pH 8.0将如实施例2所述纯化的His-PPP制配成每毫升含10μg His-PPP的溶液作为下述注射用样品。取6～7周龄正常雄性BALB/c小鼠30只，随机分成三组，每组10只。第一组每天注射10μg His-PPP/公斤体重，第二组每天注射50μg His-PPP/公斤体重，第三组作为对照组每天注射含有0.1％BSA的PBS。连续腹腔注射7天。第0，4，7，10，13，16和19天时取尾静脉外周血20μl，用F-820Sysmex半自动血细胞分析仪(Sysmex Corp.Ltd，Japan)测血小板数量。

结果如图6所示。开始注射后4～7天时，在所述两种剂量His-PPP刺激下，小鼠体内血小板数均有显着增加(n＝10，p＜0.05)。第4天时，10μg剂量组血小板数(1346±54)比对照组(1162±72)增长15.8％，50μg剂量组血小板数(1506±70)比对照组增长29.6％。第7天时，10μg剂量组血小板数(1418±80)比对照组(1169±78)增长21.3％，50μg剂量组血小板数(1489±57)比对照组增长27.4％。停止药物注射后，血小板数量逐渐缓慢回落，至第19天即注射停止后12天时方下降到注射前水平。

实施例4.His-PPP缩短小鼠出血时间

出血时间指皮肤刺破后出血到出血自然停止所需要的时间，是评价血小板功能的试验。测出血时间的方法参考Alves-Rosa et.al.，Blood，Vol.96，2000，2834-2840。

用含有0.1％BSA的PBS，pH 8.0将如实施例2所述纯化的His-PPP制备成每毫升含10μg His-PPP的溶液作为下述注射用样品。取20只BALB/c小鼠随机分成二组，每组10只。第一组每天注射10μg His-PPP/公斤体重；第二组为对照组，每天注射含有0.1％BSA的PBS。第0天开始，连续腹腔注射7天。在第0，4，7，10，13，16和19天时检测小鼠出血时间。出血时间由下列方法测定：在小鼠尾巴末端剪20mm口子，每隔30秒用滤纸轻轻触及伤口取血印迹，直至滤纸上无血迹为止，计算其间所需时间。

结果如图7所示。第0天时两组小鼠出血时间基本相同，为5.5分钟左右。第4天His-PPP组出血时间为4.2分钟，比对照组的6.3分钟下降33.5％(n＝10，p＜0.05)；第7天时His-PPP组为2.9分钟，比对照组的5.9分钟下降50.8％(n＝10，p＜0.05)；第10天时出血时间达最低值2.4分钟，比对照组的6.3分钟下降了61.9％(n＝10，p＜0.05)。停止注射后，His-PPP组出血时间逐渐缓慢回升，到第19天即注射停止后12天时出血时间方回复到注射前水平。

本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>百瑞全球有限公司(BioRight Worldwide Company Ltd.)

<120>血小板增进蛋白及其应用

<130>002FPI0003C1

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgggcggag agcaggagga ggagcggttc gacggcatgt tgctggccat ggctcagcag     60

cacgagggcg gcgtgcagga gcttgtgaac accttcttca gcttccttcg acgcaaaaca    120

gactttttca ttggaggaga agaagggatg gcagagaagc ttatcacaca gactttcagc    180

caccacaatc agctggcaca gaagacccgg cgggagaaga gagcccggca ggaggccgag    240

cggcgggaga aggcggagcg ggcggccaga ctggccaagg aagccaagtc agagacctca    300

gggccccaga tcaaggagct aactgatgaa gaggcagaga ggctgcagct agagattgac    360

cagaaaaagg atgcagagaa tcatgaggcc cagctcaaga acggcagcct tgactcccca    420

gggaagcagg atactgagga agatgaggag gaagatgaga aggacaaagg aaaactgaag    480

cccaacctag gcaacggggc agacctgccc aattaccgct ggacccagac cctgtcggag    540

ctggacctgg cggtcccttt ctgtgtgaac ttccggctga aagggaagga catggtggtg    600

gacatccagc ggcggcacct ccgggtgggg ctcaaggggc agccagcgat cattgatggg    660

gagctctaca atgaagtgaa ggtggaggag agctcgtggc tcattgagga cggcaaggtg    720

gtgactgtgc atctggagaa gatcaataag atggagtggt ggagccgctt ggtgtccagt    780

gaccctgaga tcaacaccaa gaagattaac cctgagaatt ccaagctgtc agacctggac    840

agtgagactc gcagcatggt ggaaaagatg atgtatgacc agcgacagaa gtccatgggg    900

ctgccaactt cagacgaaca gaagaaacag gagattctga agaagttcat ggatcaacat    960

ccggagatgg atttttccaa ggctaaattc aac                                 993

<210>2

<211>331

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Gly Gly Glu Gln Glu Glu Glu Arg Phe Asp Gly Met Leu Leu Ala

1               5                   10                  15

Met Ala Gln Gln His Glu Gly Gly Val Gln Glu Leu Val Asn Thr Phe

            20                  25                  30

Phe Ser Phe Leu Arg Arg Lys Thr Asp Phe Phe Ile Gly Gly Glu Glu

        35                  40                  45

Gly Met Ala Glu Lys Leu Ile Thr Gln Thr Phe Ser His His Asn Gln

    50                  55                  60

Leu Ala Gln Lys Thr Arg Arg Glu Lys Arg Ala Arg Gln Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Arg Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Ala Arg Leu Ala Lys Glu Ala Lys

                85                  90                  95

Ser Glu Thr Ser Gly Pro Gln Ile Lys Glu Leu Thr Asp Glu Glu Ala

            100                 105                 110

Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His

        115                 120                 125

Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp

    130                 135                 140

Thr Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys

145                 150                 155                 160

Pro Asn Leu Gly Asn Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln

                165                 170                 175

Thr Leu Ser Glu Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Asn Phe Arg

            180                 185                 190

Leu Lys Gly Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg

        195                 200                 205

Val Gly Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn

    210                 215                 220

Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val

225                 230                 235                 240

Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser Arg

                245                 250                 255

Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn Pro Glu

            260                 265                 270

Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser Met Val Glu

        275                 280                 285

Lys Met Met Tyr Asp Gln Arg Gln Lys Ser Met Gly Leu Pro Thr Ser

    290                 295                 300

Asp Glu Gln Lys Lys Gln Glu Ile Leu Lys Lys Phe Met Asp Gln His

305                 310                 315                 320

Pro Glu Met Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe Asn

                325                 330

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Primer

<400>3

ccggaattcc aagatgtctc cttgctggca tcaga                      35

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>4

ccgctcgagt tatccgacca cgagctccag gg                         32

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>5

cgggatccgt acccgcatga tatgcagtag at                         32

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>primer

<400>6

ccgctcgagt tagcttggag ctaaggtgca t                          31

Claims (7)

1.一种分离的蛋白质，其从N端至C端的氨基酸序列为：

MGSSHHHHHH    SSGLVPRGSH    MASMTGGEEM    GRGSEGGEQE

EERFDGMLLA    MAQQHEGGVQ    ELVNTFFSFL    RRKTDFFIGG

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KAKFN。

2.一种质粒，其特征在于，包含编码权利要求1所述的蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。

3.根据权利要求2所述的质粒，其为表达载体pET-PPP。

4.权利要求1所述的蛋白质用于制备治疗血小板减少症的药物或用于制备促进止血的药物的用途。

5.权利要求4所述的用途，其特征是所述药物为注射剂、粉剂、片剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂。

6.权利要求4所述的用途，其特征是所述药物的给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

7.一种药物组合物，其含有：

权利要求1所述的蛋白质；以及药学上可以接受的载体。

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