CN101550193A - 一种新型IZ-shGITRL融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的可溶性IZ－shGITRL融合蛋白。该融合蛋白由人GITRL胞外部分的N端通过两个亮氨酸与异亮氨酸拉链IZ组成。它可以通过以下方法制备：将获得的包含编码新型IZ－shGITRL融合蛋白的基因序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；再转化合适的工程表达菌；诱导转化后的工程表达菌，并从中纯化出IZ－shGITRL融合蛋白。本发明所说的融合蛋白还用于制备预防或治疗与GITRL相关的疾病的药物。

Description

一种新型IZ-shGITRL融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体的说，本发明涉及新的可溶性IZ-shGITRL融合蛋白，利用基因工程技术生产该可溶性融合蛋白的方法以及该融合蛋白的鉴定。本发明还涉及利用该融合蛋白预防或治疗与hGITRL相关疾病的方法。

背景技术

自身免疫性疾病和恶性肿瘤是涉及到多系统(如内分泌系统、消化系统和呼吸系统)的常见病、多发病，与机体的免疫失衡密切相关。

人类的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的相关配体(human glucocorticoid-inducedtumor necrosis factor receptor ligand，hGITRL)属于TNF家族II型跨膜蛋白，又称TNFSF18，其胞外区与其它TNF家族配体有20％的同源性，胞外区位于多肽链的C’端(aa52～aa177)。近年来研究表明，hGITRL基因位于人染色体1q23，编码由177个氨基酸组成的II型跨膜蛋白产物，包括胞浆区28个氨基酸、跨膜区21个氨基酸和胞外区128个氨基酸。人类GITRL(hGITRL)和鼠类GITRL(mGITRL)的同源性为51％。GITRL蛋白主要表达在抗原递呈细胞(APC)表面，如DC、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞等，静息或活化的T细胞不表达(Shin HH等(2002年)Cytokine，19(4)：187-192；Kim J D等(2003年)Genes Immun，4：564-569；Yu K Y等(2003年)BiochemBiophys Res Commun，310：433-438)。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子相关受体蛋白(glucocorticoid-induced tumor necrosisfactor receptor，GITR)又被称为活化诱导的肿瘤坏死因子受体(activation-induced tumor necrosisfactor receptor，AITR)。1997年Nocentini等人在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现GITR，与TNFRSF中的4-1BB、CD27、OX40及CD40具有一定的同源性。GITR是TNFRSF的第18位成员，又称TNFRSF18。天然CD4⁺CD25⁺Treg细胞组成性高表达GITR；静息或活化的T细胞也表达，其膜表达量会随着T细胞的激活而增加(Nocentini G等(2005年)European Journal ofImmunology，35(4)：1016-1022；Hanabuchi S等(2006年)Blood，107(9)：3617-3623)，而GITR被其配体蛋白(GITRL)激活后，可呈现增强效应T细胞的活化和取消Treg细胞的抑制功能的特点(Ronchetti S等(2004年)European Journal of Immunology，34(3)：613-622)。

GITR/GITRL的相互作用与自身免疫病、慢性感染、抗肿瘤免疫等疾病相关(Cuzzocrea S等(2006年)The Journal of Immunology，177(1)：631；Cuzzocrea S等(2004年)Journal ofLeukocyte Biology，76(5)：933)。GITR/GITRL的相互作用可打破Treg细胞介导的免疫耐受。一方面可诱发或加重自身免疫性疾病(Shimizu J等(2002年)Nat Immunol，3：135-142；CuzzocreaS等(2005年)FASEB J，19：1253-1265；Suri A等(2004年)Eur J Immunol，34：447-454；PatelM等(2005年)Eur J Immunol，35：430-437)。Treg细胞在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。Treg细胞组成性表达IL-2αR(CD25)、IL-2βR(CD122)、CTLA-4(CD152)、GITR及高水平的CD44和中低水平的CD45RB，50％表达HLA-DR，80％表达CD45。在对小鼠GITR的研究中人们发现，抗GITR的抗体(DTA-1)可解除Treg细胞对效应性T细胞的抑制作用。研究者认为此效应是由于GITR信号的活化，即DTA-1起到生理性GITRL的作用，通过使用GITRL的融合蛋白也进一步肯定了这一观点(Yoo YG等(2004年)J Biol Chem，35：36242-36249；Ji HB等(2004年)J Immunol，172：5823-5827)。小鼠接受GITR抗体刺激3个月后，可诱发自身免疫性胃炎，病变组织表现为与抗壁细胞自身抗体相关的组织学改变，而此抗体处理并不减少效应性T细胞或Treg细胞的数量(Shimizu J等(2002年)Nat Immunol，3：135-142)。另一方面却有助于机体清除感染的病原微生物以及增强对肿瘤的免疫应答等。机体的抗病毒作用主要是依赖CD8⁺T细胞完成，因此病毒的持续感染之所以能够形成，通常是由于宿主CD8⁺T细胞功能受限(Suvas S等(2005年)J Virol，79：11935-11942)。在研究病毒感染的小鼠模型时发现在机体感染眼部单纯疱疹病毒后，GITR及GITRL在相应引流淋巴结的T细胞和抗原递呈细胞表面的表达量瞬时上调，IFN-γ的产生也同步增多(Dittmer U等(2004年)Immunity，20：293-303；Suvas S等(2005年)Exp Mol Med，37：193-198)。

肿瘤发生发展过程中，机体的免疫功能往往处于低下或被抑制的状态。近年来发现，在肺癌、胰腺癌和乳腺癌等病人体内，CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量明显增加，并且能够抑制宿主的抗瘤免疫应答，在肿瘤免疫调节中，人们试图通过抑制Treg细胞的功能激活机体的免疫应答。通过动物实验发现，用抗CD25单克隆抗体去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，可以使小鼠的白血病和纤维肉瘤得以消退，降低黑色素瘤的发病率和减缓瘤体的生长(Shimizu J等(1999年)JImmunol，163：5211-5218；Yu P等(2005年)J Exp Med，201：779-791)。有研究者将天然膜结合性或可溶性的GITRL(GITRLsol)分别重组入腺病毒的基因组中，并分别转染修饰过的B16细胞(B16-F0-CAR)，再将转染后的细胞注射入恶性的B16黑色素瘤小鼠体内。他们发现，5天以后在肿瘤细胞里GITRL过度表达，同时也有CD4⁺和CD8⁺T细胞也有显著的浸润。3周后，肿瘤直径缩小，甚至有些小鼠在观察期内一直存活。有趣的是，注射GITRLsol重组腺病毒的小鼠存活率(45％)比注射GITRL重组腺病毒的小鼠存活率(20％)要高一些(Calmels B等(2005年)Cancer Gene Ther，12：98-205)。我们前期实验结果也显示GITRL蛋白和表达质粒分别注射Lewis瘤，小鼠体内可明显减缓瘤体生长并显著提高小鼠存活率。如果能控制GITR与GITRL的结合来适当地降低或提高Treg细胞的功能，将对感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等有着潜在的治疗价值。

GITR/GITRL可作为T细胞活化的共刺激分子，具有与CD28分子相似的辅助功能，GITR和CD28都对T细胞激活提供共刺激信号，但GITR介导的协同刺激信号较弱，且如果缺乏CD28交联，CD4⁺CD25⁺和CD8⁺T细胞未能上调GITR表达(Shimizu J等(2002年)Nat Immunol，3：135-142；Stephens GL等(2004年)J Immunol，173：5008-5020；Simona R等(2007年)The Journal ofImmunology，179：5916-5926)。有研究者从淋巴结中获得CD8⁺和CD4⁺细胞，分别以亚活化浓度的anti-CD3 mAb刺激两群T细胞，以来源于GITR^-/-小鼠的T细胞作对照群。他们观察到当加入抗GITR抗体或与GITRL转染细胞株共培养时，检测组的两群T细胞都发生增殖(Ronchetti S等(2004年)Eur J Immunol，34：613-622)。用亚活化剂量anti-CD3 mAb活化鼠脾脏CD4⁺T细胞后，加入GITR抗体后，T细胞增殖活跃(Kanamaru F等(2004年)J Immunol，172：7306-7314)。GITR共刺激活化可以增强T细胞增殖的现象，进一步被细胞周期分析试验，以及对细胞活化标志物、细胞因子的检测所证实(Nocentini G等(2000年)Cell Death Differ，7：408-410；NocentiniG等(2000年)DNA Cell Biol，19：205-217；Li Z等(2003年)J Autoimmun，21：83-92)。

GITR信号对T细胞的共刺激活化作用可能是通过激活MAPK和NF-κB的活化而实现的。GITR介导的活化信号可以促使初始T细胞增殖，但却不足以拮抗活化后T细胞所发生的由CD3信号介导的活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death，AICD)(Esparza EM等(2005年)J Immunol，174：7869-7874)。细胞凋亡是生物体维持自身稳态的重要机制，凋亡进程的异常将导致免疫系统的功能紊乱。研究者发现高表达GITR分子的克隆在由anti-CD3 mAb所诱导的凋亡过程中受到保护，然而转染有反义GITRmRNA的T细胞克隆表现出对此种凋亡的高敏感性(Nocentini G等(1997年)PNAS USA，94：6216-6221)。之后的研究者也报道GITRL/GITR信号协同CD3途径保护T细胞免于凋亡，且活化的GITR^-/-T细胞较GITR^+/+T细胞更易发生AICD(Riccardi C等(1999年)Cell Death Differ，6：1182-1189；Ronchetti S等(2002年)Blood，100：350-352)。GITR信号可以同时调节T细胞的存活或凋亡，具有双向性。亚刺激TCR并充分刺激GITR时，表现为共刺激现象；而当TCR/GITR同时被充分刺激时，可促进凋亡(Tone M等(2003年)PNAS USA，100：15059-15064)。

众所周知，TNF/TNFR家族分子有一个共性：TNF为三聚体结构，相应与三个受体分子相结合，形成了三倍对称的复合物，即受体∶配体＝3∶3，这一几何结构也影响了受体分子胞浆尾区的结构，促进了胞浆区尾区对信号衔接蛋白的招募，导致下游信号的活化(Locksley RM等(2001年)Cell，104：487-501)。hGITRL的晶体结构显示，与TNF家族相似的是，hGITRL胞外段采用β片层结构折叠，而且通过非共价键形成同型三聚体结构，内部亚基裂口附近的亲水性环袢形成受体识别接触面。hGITRL的三聚体明显不同于其它的TNF家族的成员的是，hGITRL三聚体采用非典型扩大结构，使其形态更接近于“盛开的花朵”，而不是与大多数TNF家族成员相似的“截断的金字塔结构”。对于结构的研究还显示hGITRL三聚体的接触面明显较小，而且缺乏TNF家族成员三聚体都具有的内部紧密填充的芳香族疏水性的残基。与hGITRL相近的这种疏松扩大的晶体结构曾见于OX40L(Compaan DM等(2006年)Structure，14：1321-1330；Kausik C等(2007年)PNAS USA，49：19452-19457)。

此外晶体结构的研究还显示hGITRL主要以多聚体发挥生物学功能，可溶性的hGITRL在溶液中表现出的特异的单体-多聚体的动态平衡，且多聚体比单体能更好的促进T细胞的增殖和活化，而小鼠仅以二聚体发挥生物学功能。hGITRL表现出的特异的单体-三聚体的动态平衡可能会影响到GITR的信号，因为增强可溶性的hGITRL的三聚体化作用后，其与受体的结合力增加了100倍，同时增强了信号强度，但是这种结合力的改变是由于hGITRL自身的较弱的自联作用引起的，而与hGITRL-GITR之间的固有亲和力无关(Kausik Chattopadhyay等(2007年)PNAS，USA，104：19452-19457；Kausik Chattopadhyay等(2008年)PNAS，U S A，15；105：635-640；Zhaocai Zhou等(2008年)PNAS U S A.2008；105：641-645；Zhaocai Zhou等(2008年)，PNAS，U S A，105：5465-70)。hGITRL三聚体的动态平衡调节T细胞与APC细胞表面GITR与GITRL的相互作用(Eissner G等(2004年)Cytokine Growth Factor Rev，15：353-366.)，为效应性T细胞的活化提供最适应的生物学信号。在细胞表面，hGITRL通过其胞外部分共价键结合形成多聚体结构，主要以三聚体的形式和GITR结合，在细胞免疫和体液免疫中起作用，因此三聚体结构对于GITRL的生物学活性至关重要。

在生物体内，一些DNA结合蛋白中存在着一种被称为亮氨酸拉链(Leucine Zipper)的结构，亮氨酸拉链基序由35个氨基酸残基形成两性的卷曲螺旋型α螺旋(coiled-coilα-helix)，每圈螺旋3.5个残基，2圈有1个亮氨酸，单体通过疏水作用形成拉链，这种结构有利于蛋白形成聚合体(Pehr B.Harbury等(1993年)Science，262(26)：1401-1406；H.WENDT等(1995年)Protein Sci，4：1563-1570)。有文献报道将亮氨酸拉链融合到可溶性CD40L的N端，亮氨酸拉链结构可有效地促使CD40L形成三聚体，提高其生物学活性(FanslowW C等(1994年)Semin Immunol，1994，6：267-278)。

而最近的实验表明以异亮氨酸取代亮氨酸拉链中的亮氨酸，形成异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)，能够更有效地使蛋白质形成三聚体结构。异亮氨酸拉链(IZ)多肽本身容易形成三聚体(Kazuo Suzuki等(1998年)Protein Engineering，11：1051-1055；Pehr B.Harbury等(1994)Nature，371，6492)，而且异亮氨酸拉链(IZ)修饰的sCD40L/IgG可形成多聚体，增强sCD40L/IgG的生物学活性(Arvia E.Morris等(1999年)JBC，274：418-423；Sebastian Stark等(2005年)JIM，296：149-158)。

因此，研制具有生物学功能的三聚体shGITRL是目前解决shGITRL临床应用的重要前提。

发明内容

按照本发明的第一个方面，提供了新型的IZ-shGITRL融合蛋白。

本发明涉及的IZ-shGITRL融合蛋白，是人GITRL胞外部分(E52-S177)的N端通过两个亮氨酸与异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)组成的融合蛋白。

本文描述的新型IZ-shGITRL融合蛋白包含了hGITRL功能部分即胞外段shGITRL(E52-S177)，shGITRL与IZ组成的融合蛋白在理论和实践上都比现有的shGITRL蛋白更好的形成多聚体。

按照本发明的第二个方面，提供了编码新型IZ-shGITRL融合蛋白的核酸构建体。

按照本发明的第三个方面，提供了利用基因工程方法生产新型IZ-shGITRL融合蛋白的方法。

按照本发明的第四个方面，提供了新型IZ-shGITRL融合蛋白更好地促进PBMC的增殖、活化，在预防或治疗hGITRL相关疾病(肿瘤免疫和抗感染免疫)中的应用。

作为本发明的第一个方面，所说的新型的IZ-shGITRL融合蛋白，是人GITRL胞外部分的N端通过两个亮氨酸与异亮氨酸拉链IZ组成的融合蛋白。还包括该融合蛋白的衍生物或功能等同物。

在一具体实施方案中所述的IZ-shGITRL融合蛋白中IZ部分具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一具体实施方案中所述的IZ-shGITRL融合蛋白中shGITRL部分具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明最优选的实施方案中IZ-shGITRL融合蛋白具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

作为本发明的第二个方面，所说的核酸构建体，它含有编码上述的IZ-shGITRL融合蛋白的核苷酸序列。具体是含有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

作为本发明的第三方面，提供了生产重组IZ-shGITRL融合蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

(1)获得包含编码新型IZ-shGITRL融合蛋白的基因序列；

(2)将步骤(1)获得的序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；

(3)用步骤(2)获得的核酸构建体转化合适的工程表达菌；

(4)在适宜的培养条件下，诱导步骤(3)的转化后的工程表达菌，并从中纯化出IZ-shGITRL融合蛋白。

具体的操作是：

根据大肠杆菌密码子的偏爱性，从已知的异亮氨酸拉链序列推出核苷酸序列并由上海生物工程有限公司合成含有33个氨基酸的异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)，通过PCR扩增获得IZ的基因序列，5’端酶切位点为BamHI。

上游及下游引物序列见SEQ.ID.NO.7及8。

以人脐静脉的内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的cDNA为模板，通过PCR扩增获得GITRL的胞外段shGITRL(E52-S177)基因序列，3’端酶切位点为HindIII。为了便于扩增shGITRL，我们在引物设计过程中通过在该目的基因的末段增加65bp的无关基因(不参加蛋白的表达)来设计最优的引物。即在SEQ.ID.NO.11中，目的基因shGITRL为1～378bp，而379～443bp为无关基因(因为379～381碱基为TAG是氨基酸的终止密码子)。

上游及下游引物序列见SEQ.ID.NO.9及10。

以获得的IZ和shGITRL序列为模板，通过IZ的5’端引物和shGITRL的3’端引物进行PCR扩增，得到全长的包括新型IZ-shGITRL基因的序列见SEQ.ID.NO.12。其中新型IZ-shGITRL基因序列为1～483bp；而增加的无关基因的序列为：484～568bp。

PCR产物通过GenClean琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒(上海捷瑞公司)进行回收后，用BamHI和HindIII进行双酶切，克隆到质粒载体PET32a(+)中。用T7通用引物，通过上海英骏生物技术有限公司测序，证实PCR产物已经准确克隆到表达载体中。

将鉴定正确的克隆后的表达载体通过热激法转化到工程表达菌ROS菌中，并通过抗生素AMP⁺(终浓度为100μg/ml)筛选阳性菌落。将阳性菌落抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定。

将鉴定正确的阳性菌落在PH7.0的LB管(AMP⁺浓度为100μg/ml)中进行增菌培养，当OD值＝0.6～0.8时，加入IPTG(Sigma公司)进行蛋白诱导。经过在诱导过程中的时间梯度、温度梯度、IPTG浓度梯度的实验，最终确定IPTG终浓度为0.8mmol/L，30℃诱导表达6～8小时，通过SDS-PAGE电泳分析确定目的蛋白的表达量最大。

收集在上述条件下诱导的部分菌体，加入适量的上样缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCL，5mmol/L咪唑，PH8.0)，冰浴中超声破碎，12000rpm/min离心10分钟，取上清经SDS-PAGE电泳分析，证实该融合蛋白主要为可溶性的。

取上清经Ni⁺-IMAC柱(Bio-Red公司)进行亲和层析纯化。上样前Ni⁺-IMAC柱先经过10倍体积的上样缓冲液洗柱。控制流速使上样中目的蛋白在柱内的停留时间不少于10分钟，穿流液检查无目的蛋白后弃去。上样完成后的层析柱用洗涤液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/LNaCL，10mmol/L咪唑，PH8.0)洗10个柱体积，准备洗脱。洗脱液：50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCL，250mmol/L咪唑，PH8.0，收集洗脱的融合蛋白组分。获得的蛋白经过PH7.0、0.01mmol/L的PBS透析24小时，用PEG4000进行浓缩，将浓缩后的融合蛋白经过SDS-PAGE和Western blots鉴定证实后于-80℃保存备用。

根据肠激酶(Novagen公司)的使用说明按照70μg融合蛋白加入1U肠激酶的比例，于22℃酶切16小时。为去除Trax及His.Tag的融合部分，酶切后的蛋白溶液再一次经过Ni⁺-IMAC柱纯化，收集穿透峰，经过透析、浓缩获得重组IZ-shGITRL融合蛋白，该融合蛋白经过SDS-PAGE和Western blots鉴定证实后于-80℃保存备用。

作为本发明的第四方面，本发明也提供了含有上述任一融合蛋白及其可作药用的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，根据需要该药物组合中可加入其他活性成分。给药途径可从制药领域中常用的那些方案中进行选择。

本发明药物组合物中融合蛋白的具体剂量水平取决于多种因素，如治疗对象的种类，所治疗的具体疾病以及给药的途径和方法等。根据所应用的具体情况，本领域的普通技术人员能够很容易确定药物组合物中活性成分的有效剂量。

本发明的药物组合物可用于预防或治疗与hGITRL相关的疾病，如肺癌、黑色素瘤、肝癌、爱滋病、乙型肝炎等。

在发明中将异亮氨酸拉链(IZ)基因融合至hGITRL胞外功能区shGITRL(E52-S177)基因的非功能端(N端)，形成IZ-shGITRL的重组基因，在大肠杆菌中表达融合蛋白并初步检测生物学活性。

实验证明，在大肠杆菌中，异亮氨酸拉链结构可以使shGITRL形成聚合体(以三聚体为主)，与shGITRL单体相比，其生物学活性得到明显提高，促进PBMC增殖能力明显高于单体蛋白。

本发明的IZ-shGITRL融合蛋白比现有的shGITRL/hGITRL蛋白具有更高的与GITR相互作用的的生物功能，这一特点有可能使IZ-shGITRL成为疗效更好的生物工程药物。

附图说明

图1显示了新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白的核酸电泳图结果。

图1A，Lane1：IZ；Lane2：DL2000；Lane3：IZ-shGITRL；Lane4：shGITRL；

图1B，Lane5：DL2000；Lane6：PET32a(+)-IZ-shGITRL双酶切(Bam HI+Hind III)；

Lane7：PET32a(+)-shGITRL双酶切(Bam HI+Hind III)；

Lane8：Markerλ-EcoT14 I digest；

图2显示了Trax-IZ-shGITRL融合蛋白和Trax-shGITRL蛋白的SDS-PAGE电泳图结果。在该实验中，新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白的核酸序列分别插入到PET32a(+)载体，而PET32a(+)载体中的Trax融合基因有助于目的蛋白在表达过程中形成可溶性的蛋白，减少包涵体的形成。

图中，Lane1：蛋白Marker；IPTG：0.8umol/ml，诱导6小时；

Lane2：PET32a(+)-IZ-shGITRL未诱导；

Lane2：PET32a(+)-IZ-shGITRL诱导全菌；

Lane2：PET32a(+)-IZ-shGITRL诱导超声后上清；

Lane2：PET32a(+)-IZ-shGITRL超声后上清Ni柱纯化后蛋白；

Lane2：PET32a(+)-shGITRL未诱导；

Lane2：PET32a(+)-shGITRL诱导全菌；

Lane2：PET32a(+)-shGITRL诱导超声后上清；

Lane2：PET32a(+)-shGITRL超声后上清Ni柱纯化后蛋白

图3显示了Trax-IZ-shGITRL融合蛋白和Trax-shGITRL蛋白的Western blots图结果。

图中，Lane1：Trax-shGITRL；Lane2：Trax-IZ-shGITRL。

一抗为小鼠抗人单抗GITRL，二抗为山羊抗小鼠IgG-HRP，ECL发光。

图4显示了新型Trax-IZ-shGITRL融合蛋白和Trax-shGITRL蛋白经肠激酶酶切及纯化后的SDS-PAGE电泳图结果。

图中，Lane1：Ni柱纯化后的Trax-IZ-shGITRL融合蛋白；

Lane2：Trax-IZ-shGITRL融合蛋白经肠激酶酶切后的蛋白；

Lane3：融合蛋白经肠激酶酶切后再经Ni柱纯化后的IZ-shGITRL蛋白；

Lane4：纯化后的Trax-shGITRL融合蛋白；

Lane5：Trax-shGITRL融合蛋白经肠激酶酶切后的蛋白；

Lane6：融合蛋白经肠激酶酶切后的蛋白经Ni柱纯化后的shGITRL蛋白；

Lane7：蛋白Marker。

在该实验中，我们利用肠激酶(Novagen公司)将Trax蛋白切除是为了在后续的实验中更好的显示新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白的结构和生物学功能。我们使用了Ni⁺-IMAC柱(Bio-Red公司)进行亲和层析纯化，收集穿透峰的蛋白即为目的蛋白。

图5显示了新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白Western电泳图结果。

图中，Lane1：Trax-shGITRL融合蛋白经肠激酶酶切后再经Ni柱纯化的shGITRL蛋白(约14.7KD)；

Lane2：Trax-IZ-shGITRL融合蛋白经肠激酶酶切后再经Ni柱纯化的IZ-shGITRL蛋白(约18KD)；

一抗为小鼠抗人单抗GITRL(自制)，二抗为山羊抗小鼠IgG-HRP，ECL发光。

图6显示了新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白的非还原性SDS-PAGE电泳图结果。

图中，Lane1、2：IZ-shGITRL蛋白；Lane3、4：shGITRL蛋白。

图7显示了新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白的SephadexG-100琼脂糖凝胶过滤层析图结果。

图7A，IZ-s GITRL；

图7B，shGITRL。

洗液流速为0.3ml/m，洗液为0.05mol/L，PH7.2 PBS。

图8显示了凝胶过滤层析系统收集峰的SDS-PAGE和Western blots图结果。

图8A，SDS-PAGE

Lane1：Marker；Lane2：shGITRL蛋白多聚体；

Lane3：shGITRL蛋白单体；Lane4：IZ-shGITRL蛋白多聚体；

图8B，Western-blot

Lane5：shGITRL蛋白多聚体；Lane6：shGITRL蛋白单体；

Lane7：IZ-shGITRL蛋白多聚体；

一抗为小鼠抗人单抗GITRL(自制)，二抗为山羊抗小鼠IgG-HRP，ECL发光。

图9显示了新型IZ-shGITRL融合蛋白和shGITRL蛋白促进人单个核细胞(PBMC)增殖实验结果。

图中，1、anti-CD3+PBMC；    2、anti-CD3+Trax+PBMC；

3、anti-CD3+shGITRL+PBMC；  4、anti-CD3+IZ-shGITRL+PBMC；

PB MC：2×105个/孔；Anti-CD3：30ng/ml；

蛋白：5μg/ml

具体实施方式

下面通过实施例更进一步的描述本发明

如果在实施例中没有其他的说明，所有制备和操作重组DNA的方法都是按照在Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第三版(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Third Edition)，科学技术出版社，黄培堂(2002)一书和在许彦鸣等(2006)医学分子生物学实验指导。PCR技术方法可在，M.A.Innis、D.H.Gelfend、J.J.Sninsky和T.J.White编辑的“PCR技术：方法于应用指南”(“PCR Protocols：a guide to methods and applications”)(AcademicPress，Inc.，1990)一书中找到。

本发明中所用的表达载体PET32a(+)：购自Novagen公司。

在实施例、权利要求和叙述中所涉及的序列如下：

1、异亮氨酸拉链(IZ)的核苷酸序列和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2)；

2、可溶性shGITRL的核苷酸序列和氨基酸序列(分别是SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4)；

3、重组IZ-shGITRL的核苷酸序列及氨基酸序列(分别是SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6)；

4、IZ引物1的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.7)；

5、IZ引物2的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.8)；

6、shGITRL引物1的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.9)；

7、shGITRL引物2的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.10)；

8、包含shGITRL的延长的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.11)；

9、包含重组IZ-shGITRL的延长的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.12)

实施例

实施例1、新型IZ-shGITRL的克隆与表达

根据大肠杆菌密码子的偏爱性，从已知的异亮氨酸拉链序列推出核苷酸序列并由上海生物工程有限公司合成由33个氨基酸组成的异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)，PCR扩增获得IZ的基因序列(SEQ.ID.NO.1)，5’端酶切位点为BamHI。以人脐静脉的内皮细胞株(humanumbilical vein endothelial cells，HUVEC)的cDNA为模板，通过PCR扩增获得包含GITRL的胞外段shGITRL(E52-S177)基因序列(SEQ.ID.NO.11)，3’端酶切位点为HindIII。以获得的IZ和shGITRL序列为模板，以IZ的5’端引物和shGITRL的3’端的引物进行PCR扩增，得到全长的包含新型IZ-shGITRL基因序列(SEQ.ID.NO.12)。

PCR产物和表达载体PET32a(+)，分别用BamHI和HindIII进行双酶切，通过T4DNA连接酶，将目的基因克隆到质粒载体PET32a(+)中。用T7通用引物，通过上海英骏生物有限公司测序，证实PCR产物已经准确克隆到载体中。

将克隆后的表达载体通过热激法转化到工程表达菌ROS菌中，并通过抗生素AMP+(终浓度为100μg/ml)筛选阳性菌落，进行质粒PCR和酶切鉴定。(图1)

将鉴定正确的阳性菌落在PH7.0的LB管(AMP⁺浓度为100μg/ml)中进行增菌培养，当OD值＝0.6～0.8加入IPTG(Sigma公司)进行蛋白诱导。经过诱导的时间梯度、温度梯度、IPTG浓度梯度的实验，最终确定IPTG终浓度为0.8μmol/L，30℃诱导表达6～8小时，通过SDS-PAGE电泳分析确定目的蛋白的表达量最大。

收集在上述条件下诱导的部分菌体，加入适量的上样缓冲液，冰浴中超声破碎，12000rpm/min离心10分钟，取上清经SDS-PAGE电泳分析，证实该融合蛋白主要为可溶性的。

取上清经Ni⁺-IMAC柱进行亲和层析纯化。上样前Ni⁺-IMAC柱先经过10倍体积的上样缓冲液洗柱。控制流速使上样中目的蛋白在柱内的停留时间不少于10分钟，穿流液检查无目的蛋白后弃去。上样完成后的层析柱用洗涤液至少洗10个柱体积，准备洗脱。收集洗脱峰的融合蛋白组分。获得的融合蛋白经过PH7.0，0.01mmol/L的PBS透析24h，用PEG4000进行浓缩，将浓缩后的融合蛋白经过SDS-PAGE和Western blots鉴定证实后于-80℃保存备用(图2、3)。

根据肠激酶的使用说明按照70μg融合蛋白加入1U肠激酶的比例，于22℃酶切16小时。为去除Trax及His.Tag的融合部分，酶切后的蛋白溶液再一次经过Ni⁺-IMAC柱纯化，收集穿透峰，经过透析、浓缩获得重组IZ-shGITRL融合蛋白，该融合蛋白经过SDS-PAGE和Western鉴定证实后于-80℃保存备用。表达后单体IZ-shGITRL融合蛋白的分子量约为18KDa，单体shGITRL蛋白的分子量约为14KDa(图4、5)。

实施例2、新型IZ-shGITRL融合蛋白与shGITRL蛋白的结构分析

(1)非还原性SDS-PAGE电泳结果比较

取825μg/ml的IZ-shGITRL融合蛋白和912μg/ml的shGITRL蛋白各20μl，分别加入20μl的非还原性SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液，蛋白电泳每孔上样15μl，按照《医学分子生物学实验技术》(许彦鸣等，2006)一书中的方法严格进行电泳。结果显示IZ-shGITRL融合蛋白比shGITRL蛋白更容易形成多聚体(主要为三聚体)。(图6)

(2)SephadexG-100琼脂糖凝胶层析结果比较

取755μg/ml的IZ-s GITRL融合蛋白和816μg/ml的shGITRL蛋白各2ml，按照Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析的操作说明进行严格操作。结果显示IZ-shGITRL融合蛋白主要以三聚体甚至超聚体形式存在，而shGITRL主要以单体和二聚体存在。(图7)

(3)通过SDS-PAGE和Western blots鉴定凝胶过滤层析系统收集峰的蛋白

取IZ-shGITRL和shGITRL收集峰的蛋白各20μl，分别加入20μl的2×SDS蛋白电泳上样缓冲液，蛋白电泳每孔上样17μl，按照《医学分子生物学实验技术》(许彦鸣等，2006)一书中的方法严格进行蛋白电泳和Western blots的操作。结果显示图8A收集峰的蛋白为IZ-shGITRL融合蛋白；图8B收集峰的蛋白均为shGITRL蛋白。(图8)

实施例3、人单个核细胞(PBMC)增殖实验结果比较。

采取健康成年人静脉血10ml，严格按照单个核细胞分离步骤，采用差速密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)。每孔加入PBMC为2×105个，Anti-CD3终浓度为30ng/ml，蛋白终浓度为5μg/ml。实验分为4组：第1组：anti-CD3+PBMC；第2组：anti-CD3+Trax+PBMC；第3组：anti-CD3+shGITRL+PBMC；第4组：anti-CD3+IZ-shGITRL+PBMC；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养72小时。按照CCK-8试剂盒操作说明，通过双波长(490，630nm)检测吸光度。实验数据利用统计学分析软件：S P S S 1 0.0进行分析，结果显示第1、2组无统计学意义；第3组分别与第1、2组比较P值均小于0.05；第4组分别与第1、2组比较P值均小于0.05；第4组与第3组比较P值也小于0.05。实验结果表明新型IZ-shGITRL融合蛋白比shGITRL蛋白更能促进PBMC增殖。(图9)

本领域的技术人员可以理解，可以对本申请中所描述的实验方案进行修改而不超出本发明的概念。本领域技术人员还应该理解，本发明并非局限于具体公开的实施方案，而是包括落在本发明实质和范围内的对实施方案做的各种修改。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏大学

<120>一种新型IZ-shGITRL融合蛋白及其制备方法和应用

<160>12

<210>1

<211>99

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(99)

<400>1

agaatgaaac aaatcgaaga caagatcgaa gaaatccttt cgaaaatcta tcacatcgaa 60

aatgagatcg ccagaatcaa gaaattaatc ggcgaacgc                        99

<210>2

<211>33

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys

1                5                   10                  15

Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile

16              20                   25                  30

Gly Glu Arg

 31      33

<210>3

<211>378

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(378)

<400>3

gagactgcta aggagccctg tatggctaag tttggaccat taccctcaaa atggcaaatg 60

gcatcttctg aacctccttg cgtgaataag gtgtctgact ggaagctgga gatacttcag 120

aatggcttat atttaattta tggccaagtg gctcccaatg caaactacaa tgatgtagct 180

ccttttgagg tgcggctgta taaaaacaaa gacatgatac aaactctaac aaacaaatct 240

aaaatccaaa atgtaggagg gacttatgaa ttgcatgttg gggacaccat agacttgata 300

ttcaactctg agcatcaggt tctaaaaaat aatacatact ggggtatcat tttactagca 360

aatccccaat tcatctcc                                               378

<210>4

<211>126

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro

 1               5                  10                  15

Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys

16              20                  25                  30

Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu

31              35                  40                  45

Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala

46              50                  55                  60

Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr

61              65                  70                  75

Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu

76              80                  85                  90

Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His

91              95                  100                 105

Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala

106             110                 115                 120

Asn Pro Gln Phe Ile Ser

121             125

<210>5

<211>483

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(483)

<400>5

agaatgaaac aaatcgaaga caagatcgaa gaaatccttt cgaaaatcta tcacatcgaa 60

aatgagatcg ccagaatcaa gaaattaatc ggcgaacgcc tgctggagac tgctaaggag 120

ccctgtatgg ctaagtttgg accattaccc tcaaaatggc aaatggcatc ttctgaacct 180

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ggagggactt atgaattgca tgttggggac accatagact tgatattcaa ctctgagcat 420

caggttctaa aaaataatac atactggggt atcattttac tagcaaatcc ccaattcatc 480

tcc                                                               483

<210>6

<211>161

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys

1                5                  10                  15

Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile

16              20                  25                  30

Gly Glu Arg Leu Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys

31              35                  4045

Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro

46              50                  55                  60

Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln

61              65                  70                  75

Asn Gly Leu Tyr Leu IIe Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

76              80                  85                  90

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys

91              95                  100                 105

Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val

106             110                 115                 120

Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile

121             125                 130                 135

Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly

136             140                 145                 150

Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

151             155                 160

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>7

cgcggatcca gaatgaaaca aatcgaagac aaga  34

<210>8

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>8

ccagtctcca gcaggcgttc gccgattaat ttcttga     37

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>9

ccgaacgcct gctggagact gctaaggagc cctgtatgg   39

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>10

taaaagctta atccacccac tggcacctct a          31

<210>11

<211>443

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(443)

<400>11

gagactgcta aggagccctg tatggctaag tttggaccat taccctcaaa atggcaaatg   60

gcatcttctg aacctccttg cgtgaataag gtgtctgact ggaagctgga gatacttcag 120

aatggcttat atttaattta tggccaagtg gctcccaatg caaactacaa tgatgtagct 180

ccttttgagg tgcggctgta taaaaacaaa gacatgatac aaactctaac aaacaaatct 240

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aatccccaat tcatctccta gagacttgat gatttgatct cctcattccc ttcagcacat 420

gtagaggtgc cagtgggtgg att                                         443

<210>12

<211>568

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(568)

<400>12

agaatgaaac aaatcgaaga caagatcgaa gaaatccttt cgaaaatcta tcacatcgaa 60

aatgagatcg ccagaatcaa gaaattaatc ggcgaacgcc tgctggagac tgctaaggag 120

ccctgtatgg ctaagtttgg accattaccc tcaaaatggc aaatggcatc ttctgaacct 180

ccttgcgtga ataaggtgtc tgactggaag ctggagatac ttcagaatgg cttatattta 240

atttatggcc aagtggctcc caatgcaaac tacaatgatg tagctccttt tgaggtgcgg 300

ctgtataaaa acaaagacat gatacaaact ctaacaaaca aatctaaaat ccaaaatgta 360

ggagggactt atgaattgca tgttggggac accatagact tgatattcaa ctctgagcat 420

caggttctaa aaaataatac atactggggt atcattttac tagcaaatcc ccaattcatc 480

tcctagagac ttgatgattt gatctcctca ttcccttcag cacatgtaga ggtgccagtg 560

ggtggatt                                                          568

Claims (9)

1、一种新型的IZ-shGITRL融合蛋白，其特征在于，是人GITRL胞外部分的N端通过两个亮氨酸与异亮氨酸拉链IZ组成的融合蛋白。

2、根据权利要求1所说的IZ-shGITRL融合蛋白，其特征在于，其中IZ部分具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3、根据权利要求1所说的IZ-shGITRL融合蛋白，其特征在于，其中shGITRL部分具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。

4、根据权利要求1所说的IZ-shGITRL融合蛋白，其特征在于，所说的IZ-shGITRL融合蛋白具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

5、一种核酸构建体，其特征在于，它含有编码权利要求1-4之一的IZ-shGITRL融合蛋白的核苷酸序列。

6、根据权利要求5所说的核酸构建体，其特征在于，它含有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

7、一种制备权利要求1-4之一所述IZ-shGITRL融合蛋白的方法，其特征是，包括下列步骤：

(1)获得包含编码新型IZ-shGITRL融合蛋白的基因序列；

(2)将步骤(1)获得的序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体；

(3)用步骤(2)获得的核酸构建体转化合适的工程表达菌；

(4)在适宜的培养条件下，诱导步骤(3)的转化后的工程表达菌，并从中纯化出IZ-shGITRL融合蛋白。

8、一种含有权利要求1-4之一所述融合蛋白的药物组合物。

9、权利要求1所述融合蛋白在制备用于预防或治疗与hGITRL相关的肿瘤免疫和抗感染免疫的药物中的应用。

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