KR20150008870A - 락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천연 락토페린의 생물활성을 유지하고, 체내 수명이 유의하게 연장되어 있으며, 임상적 유용성이 천연 락토페린 및 유전자 재조합형 락토페린보다도 우수한 락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드와 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드의 융합 단백질로서,
Figure pct00010

〔식중, LF는 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드, Y는 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드, s는 0~10개의 임의의 아미노산의 서열, n은 1~10의 정수를 나타낸다〕
으로 표시되는 융합 단백질 또는 그의 개변체를 제공한다.

Description

락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법{Lactoferrin fusion protein and method for producing same}
본 발명은 개량된 특성을 갖는 락토페린 융합 단백질, 그의 용도 및 그의 제조방법 등에 관한 것이다.
락토페린은 주로 포유동물의 유즙 중에 존재하여, 호중구, 눈물, 타액, 콧물, 담즙, 정액 등에도 발견되고 있는 분자량 약 80,000의 당단백질이다. 락토페린은 철을 결합하는 것으로부터 트랜스페린 패밀리에 속한다. 락토페린의 생리활성으로서는 항균작용, 철 대사 조절작용, 세포증식 활성화작용, 조혈작용, 항염증작용, 항산화작용, 식작용 항진작용, 항바이러스작용, 비피더스균 생육 촉진작용, 항암작용, 암전이 저지작용, 트랜스로케이션 저지작용 등이 알려져 있다. 게다가 최근 락토페린이 지질 대사 개선작용, 진통·항스트레스작용, 안티에이징작용을 갖는 것도 명확해져 있다. 이와 같이 락토페린은 다양한 기능을 나타내는 다기능성 생리활성 단백질로, 건강의 회복 또는 증진을 위해 의약품이나 식품 등의 용도에 사용되는 것이 기대되고 있어, 락토페린을 포함하는 식품은 이미 시판되고 있다.
락토페린은 경구적으로 섭취한 경우, 위액 중에 존재하는 산성 프로테아제인 펩신에 의해 가수분해를 받아 펩티드로 분해되기 때문에, 락토페린 분자로서는 대부분 장관까지 도달하지 못한다. 그러나 락토페린 수용체는 소화관에서는 소장 점막에 존재하는 것이 알려져 있어, 최근 락토페린이 장관으로부터 체내에 흡수되어 생물활성을 발현하고 있는 것이 명확해져 있다. 이 때문에 락토페린이 갖는 생물활성을 발휘시키기 위해서는 락토페린을 위액 중에서의 펩신에 의한 가수분해를 받지 않는 상태로 장관까지 도달시키는 것이 중요하다. 또한 주사제로 한 경우, 키모트립신이나 엘라스타아제 등의 조직, 기관에 포함되는 프로테아제에 의한 분해에 노출되기 때문에, 체내에서의 투여 조직, 기관에서의 안정성을 증가시키기 위해서는 이들 프로테아제에 대한 저항성을 부여하는 것이 실용상 중요하다.
IgG 항체는 생체내에서 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor；이하 「FcRn」이라 한다)를 매개로 한 리사이클링 메커니즘에 의해 분해가 억제되기 때문에, 혈중 반감기가 긴 것이 알려져 있다. 또한 항체약은 특정 단백질이나 펩티드 등으로 표적이 한정되어 작용 메커니즘이 한정되기 때문에, 종래의 합성 화합물과 비교하여 부작용은 적은 것으로 생각되고 있다.
IgG 항체나 그의 Fc영역을 사용한 융합 단백질을 이용하는 생물학적 제제의 개념 자체는 종래 알려져 있어, 예를 들면 신장 이식 후의 급성 거부반응을 억제하는 약으로서 1986년에 CD3를 타겟으로 하는 항체 의약품이 승인되어 오래 사용되고 있다.
그러나 일반적으로 융합 단백질은 융합에 의해 활성 부위가 영향을 받음으로써, 융합되어 있지 않은 단백질과 비교하여 생물활성이 저감되는 것도 빈번히 관찰되고 있다. 예를 들면 TPOR 결합 유사 펩티드는 내재성의 TPO와 비교하여 TPOR과의 결합량에는 손색은 없으나, 인 비트로 시험에 있어서 생물활성은 약간 낮은 경향이 있었다.
또한 IFN-α와 Fc영역을 결합하여 IFN-α의 혈중 반감기를 증가시킨 융합 단백질에 대해서는, 혈중 반감기는 대폭으로 증가되었지만 IFN-α의 생리활성은 저하되어 버린다는 결점이 있다. 따라서 바람직한 특성을 구비한 융합 단백질을 제작하기 위한 조건 등에 대해서는 단백질별로 충분히 검토되어야만 한다.
일본국 특허공개 제2007-105044호 공보 일본국 특허 제4234438호 공보 일본국 특허공표 제2011-523351호 공보 일본국 특허공표 제2004-521655호 공보 미국 특허 제5,723,125호 공보
Jazayeri, J. A. et al., Biodrugs, 22, 11-26(2008) Yeung, Y. A. et al., J. Imunol., 182, 7663-7671(2009) Suzuki, T. et al., J. Immunol., 184, 1968-1976(2010) Batra, J. K., et al., Mol Immunol., 30, 379-386(1993) Dimitrov, D. S., mAbs, 1, 26-28(2009) Gong, R. et al., J. Biol. Chem., 286, 27288-27293(2011)
본 발명은 항원성을 저감하고, 프로테아제 내성을 부여하여, 경구, 조직, 기관 투여를 가능하게 하여 체내 수명을 연장시킨, 임상적 유용성이 높은 락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 천연 락토페린의 생물활성을 유지하고, 체내 수명이 유의하게 연장되어 있으며, 임상적 유용성이 천연 락토페린 및 유전자 재조합형 락토페린보다도 우수한 락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 천연물과 손색 없는 고차 구조를 갖는 락토페린으로서, 생리활성이 손상되어 있지 않을 뿐 아니라 긴 반감기를 유지하는 락토페린을 창출하기 위해 예의 노력하여, 락토페린 단백질에 FcRn 결합 단백질(Fc영역)을 융합시킨 것을 제조하고, 혈중에서의 안정성을 조사한 결과, Fc영역과 융합시킨 락토페린 단백질은 융합하고 있지 않은 것과 비교하여 반감기가 5.4배로 현저히 증대된 것을 발견하였다. 또한 CD 스펙트럼과 철 결합능의 측정 결과로부터, 융합 단백질에 있어서 Fc영역과 융합되는 것에 의한 락토페린 자체의 입체 구조의 변화는 보이지 않고, 열안정성에 대해서도 입체 구조가 적어도 30℃ 이상, 더 나아가서는 65℃ 이상에서도 유지되며, 생물활성에 대해서도 전혀 손상되어 있지 않다는 전혀 예기치 못한 결과인 것을 발견하고, 게다가 제조된 락토페린 융합 단백질은 프로테아제에 대한 저항성을 가지며, 가장 중요한 생물활성인 철킬레이트능도 보존되어 있다는 결과를 얻어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은
〔1〕FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드와 락토페린의 융합 단백질로서,
Figure pct00001
〔식중, LF는 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드, Y는 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드, s는 0~10개의 임의의 아미노산의 서열, n은 1~10의 정수를 나타낸다〕
으로 표시되는 융합 단백질 또는 그의 개변체；
〔2〕FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 IgG, IgG의 중쇄, IgG의 중쇄 Fc영역, Fc영역의 CH2 도메인 및 CH3 도메인, Fc영역의 CH2 도메인, 알부민 또는 알부민의 FcRn 결합영역 중 어느 하나를 포함하는, 〔1〕에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체；
〔3〕 융합 단백질이 단량체 또는 2량체(n=1 또는 2)인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체；
〔4〕 융합 단백질이 단량체인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체；
〔5〕 융합 단백질이 천연 락토페린의 50% 이상의 철킬레이트능을 유지하고 있는, 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체；
〔6〕 융합 단백질은 락토페린 수용체 또는/및 IgG/알부민 수용체를 매개로 흡수되는 것인, 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체.
〔7〕 융합 단백질은 천연 또는 유전자 재조합형 락토페린과 비교하여 키모트립신 내성이 향상된 것인, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체.
〔8〕〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체를 코드하는 핵산 분자；
〔9〕〔8〕에 기재된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터；
〔10〕〔9〕에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주세포；
〔11〕〔8〕에 기재된 핵산 분자를 포함하는 비인간 유전자 재조합 동물；
〔12〕〔8〕에 기재된 핵산 분자를 포함하는 유전자 재조합 식물；
〔13〕〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체를 포함하는, 락토페린에 의해 개선되는 질환의 치료제；
〔14〕〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체 및 담체를 포함하는 의약품 조성물；
〔15〕〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체의 제조방법으로서, 이 융합 단백질 또는 그의 개변체를 코드하는 유전자를 포함하는 숙주세포를 배양하여 융합 단백질 또는 그의 개변체를 발현시키고, 이 숙주세포 또는 그의 배지로부터 융합 단백질 또는 그의 개변체를 회수하는 것을 포함하는 방법
을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질 또는 그의 개변체(이하, 「융합 단백질 등」으로 표기하는 경우가 있다)는, 락토페린이 갖는 철의 결합능이 유지되어 있고, 따라서 적어도 철 결합능에 기초하는 락토페린의 중요한 생물활성이 유지되어 있다. 또한 체내 수명이 길고, 프로테아제에 대한 저항성을 가지고 있기 때문에 체내에서 장시간에 걸쳐 생물활성을 발휘할 수 있다. 또한 융합 단백질로 함으로써 위에서의 펩신에 의한 소화 분해를 받기 어려워져 있기 때문에, 추가적인 장용화를 위한 제제적인 처리를 행하지 않더라도 충분히 장내에 도달할 수 있다.
또한 본 발명의 융합 단백질 등은 유전자 재조합에 의해 제조됨으로써, 제조관리·품질관리 측면에서도 유리하여, 의약품 성분으로서의 사용에 특히 적합하다. 즉 본 발명에 따른 융합 단백질 등 및 융합 단백질 등의 제조방법에 의해 락토페린을 의약품 성분으로서 더욱 유용성이 높은 형태로 할 수 있다. 락토페린은 안전성이 매우 높고, 다양한 생물활성을 갖기 때문에, 본 발명에 의해 유효한 치료약이 없는 질환 또는 증상의 치료약 또는 예방약으로서 더욱 유리하게 적용이 가능해진다. 예를 들면 생활습관병(동맥경화, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 고혈압, 당뇨병, 지방간 등), 암(발암 예방, 암의 2차 에방, 전이 언제, 제암제의 작용 증강 등), 자기면역질환(쇠그렌증후군에 의한 안구 및 구강 건조, 류머티스성 관절염, 악성 관절 류머티즘, 교원병, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스, 전신성 홍반성 낭창 등), 정신신경질환(치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 울병, 틀어박힘증(은둔현상), 통합실조증, 각종 스트레스성 질환, 갱년기장애 등), 동통 완화(몰핀 등의 오피오이드 증강작용, 암성 동통, 신경인성 동통, 헤르페스 후 동통, 섬유근통증, 술후 동통, 혀 통증, 생리통, 치통, 관절통, 갱년기장애 등), 간염(각종 바이러스성 간염, 비알코올성 간염, 간경변 등), 염증성 장질환(대장성 궤양염, 크론병 등), 과민성 장증후군, 전립선 비대, 빈뇨, 불면증, 변비 등으로 적응을 확대할 수 있다. 또한 락토페린은 항균·항바이러스 작용 및 면역능 부활작용이 있기 때문에, 본 발명의 융합 단백질 또는 그것을 포함하는 의약품 조성물은 각종 감염증 및 그에 기인하는 염증, 예를 들면 헬리코박터·피롤리균의 위점막 감염, 치주병, 치조농루, 구취, 구강 캔디다증, 구내염, 구각염, 비염, 식도염, 담낭염, 요로감염증, 질감염증, 무좀, 여드름, 헤르페스속 바이러스의 감염증, 노인성 폐렴, 술후 감염증 등으로의 적용도 가능하며, 또한 항생물질의 작용을 증강시키는 작용이 있다. 한편 락토페린은 면역적인 관용을 초래하는 작용도 있어, 본 발명의 융합 단백질 또는 그것을 포함하는 의약품 조성물은 화분증, 아토피성 피부염, 지루증, 두드러기 등의 알레르기성 질환에도 적용 가능하다. 주목해야할 것은 락토페린에는 철 킬레이트 작용에 기초하는 강한 항산화 스트레스 작용이 있어, 본 발명의 융합 단백질 또는 그것을 포함하는 의약품 조성물은 윌슨병, 극증간염 등이나, 피부나 눈의 항가령·젊어지는 작용, 가령성 황반 변성증, 당뇨병성 망막증, 점막 상피세포의 각화 억제·젊어지는 작용 등으로의 적용도 가능하다.
또한 본 발명의 융합 단백질은 락토페린 수용체, IgG 수용체 및 알부민 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수용체를 매개로 세포에 흡수되기 때문에, 부작용이 적은 것을 기대할 수 있다.
도 1은 전장 인간 락토페린(hLF) cDNA를 포함하는 벡터 pBSIILfAL에 BamHI 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입하여 pBSIILfAL/Bam을 제작하는 방법의 개략을 나타내는 도면이다.
도 2는 인간 IgG1　Fc영역의 힌지, CH2, CH3의 게놈 서열을 갖는 벡터 pTeuIgG의 구조 및 이 벡터로의 hLF cDNA의 삽입을 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 IgG1 Fc영역의 CH2, CH3의 cDNA 서열을 갖는 벡터 pmIgG의 구조 및 이 벡터로의 hLF cDNA의 삽입을 나타내는 도면이다.
도 4는 DG44 세포용 발현 벡터 pOpti-VEC에 벡터 pBluescript II(Stratagene사)의 T7 프라이머 결합부위로부터 T3 프라이머 결합부위까지의 영역을 삽입하여 벡터 pOpti-VEC-MCS를 제작하는 방법의 개략을 나타내는 도면이다.
도 5는 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc) 발현 벡터 및 힌지 결손 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc) 발현 벡터의 제작방법의 개략을 나타내는 도면이다. pTeuIgG/hLF의 hLF, 인간 IgG Fc영역의 힌지, CH2, CH3의 게놈 서열을 포함하는 영역, 또는 pmIgG/hLF의 인간 IgG　Fc영역의 CH2, CH3의 cDNA 서열을 포함하는 영역을 XhoI-NotI 단편으로서 잘라내고, pOptiVEC-MCS의 XhoI/NotI 사이트에 클로닝하였다.
도 6은 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)를 DG44 세포에 발현유도시켰을 때의 발현량을 나타내는 도면이다.
도 7은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc를 DG44 세포에 발현유도시켰을 때의 발현량을 나타내는 도면이다.
도 8은 힌지 부가 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 정제를 나타내는 도면이다.
도 9는 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 정제를 나타내는 도면이다.
도 10은 힌지 부가 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 황산암모늄 침전에 의한 농축을 나타내는 도면이다.
도 11은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 황산암모늄 침전에 의한 농축을 나타내는 도면이다.
도 12a는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 2차구조의 상동성을 나타내는 도면이다. 패널 A는 hLF의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 12b는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 2차구조의 상동성을 나타내는 도면이다. 패널 B는 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 12c는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 2차구조의 상동성을 나타내는 도면이다. 패널 C는 힌지 부가 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 13a는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성을 나타내는 도면이다. 패널 A는 hLF의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 13b는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성을 나타내는 도면이다. 패널 B는 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 13c는 hLF, 힌지 결손형 및 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성을 나타내는 도면이다. 패널 C는 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 분해를 나타내는 도면이다.
도 15a는 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 37℃, 3주간 후의 분해물을 나타내는 도면이다.
도 15b는 힌지 부가 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 모식도와 그 분해 개소를 나타내는 도면이다.
도 16은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 혈중 안정성을 나타내는 도면이다.
도 17a는 발현 벡터 pOptiVEC/hLF-dFc가 코드하는 인간 락토페린(hLF)/인간 IgG Fc 융합 단백질의 아미노산 서열(서열표의 서열번호 5)을 나타내는 도면이다. 이중선은 스페이서 아미노산, 이탤릭체는 힌지영역의 아미노산, 밑줄친 볼드체는 CH2 도메인의 아미노산, 볼드체는 CH3 도메인의 아미노산의 서열을 각각 나타낸다.
도 17b는 발현 벡터 pOptiVEC/hLF-mFc가 코드하는 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 아미노산 서열(서열표의 서열번호 6)을 나타내는 도면이다. 이중선은 스페이서 아미노산, 밑줄친 볼드체는 CH2 도메인의 아미노산, 볼드체는 CH3 도메인의 아미노산의 서열을 각각 나타낸다.
도 18은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 혈청 용액 중에서의 안정성을 나타내는 도면이다.
도 19는 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 소장 상피 유사 세포로의 흡수를 나타내는 도면이다.
도 20은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 키모트립신 내성을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 21은 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 키모트립신 내성을 나타내는 도면이다.
도 22는 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc가 용액 중에서 호모다이머를 형성하는 것을 나타내는 도면이다.
아래에 본 발명을 상세하게 설명한다. 아래의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태로만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은 그 요지를 일탈하지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌 및 공개공보, 특허공보 기타 특허문헌은 참조로써 본 명세서에 포함하는 것으로 한다. 또한 본 명세서는 2012년 4월 23일에 출원된 본원 우선권주장의 기초가 되는 일본국 특허출원(특원 제2012-098085호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드와 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드의 생물학적으로 활성인 융합 단백질이다. 본 발명의 융합 단백질에 있어서 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드와 결합되는 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 FcRn에 결합하는 것이 알려져 있는 서열을 포함하는 단백질이나 펩티드로, 생체에 대해 적합 가능 또는 약리학적으로 불활성이면 된다. 예를 들면 혈액 성분 단백질인 IgG 또는 알부민은 FcRn에 결합하는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명에 있어서 사용되는 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드로서는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7), IgG의 중쇄, IgG의 중쇄에 있는 Fc영역, Fc영역의 CH2 도메인 및 CH3 도메인, CH2 도메인, 알부민, 알부민의 FcRn 결합영역을 포함하는 영역을 들 수 있다. 이들 단백질 및 펩티드의 아미노산 서열은 공지로, 본 발명에 있어서 사용되는 경우 천연의 서열과 동일해도 되고 또한 변이를 가지고 있어도 된다.
바람직하게는 본 발명에 있어서 사용되는 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드는 락토페린과 융합시킨 상태로부터 분해하기 어려운 것이 좋다. 예를 들면 IgG의 힌지영역을 포함하는 Fc영역을 사용하면 힌지영역이 디설피드 결합을 형성함으로써 2량체 형태의 융합 단백질이 형성되는데, 힌지영역은 프로테아제에 대해 감수성이 높기 때문에 힌지영역을 포함하지 않는 것, 또는 힌지영역의 시스테인을 다른 아미노산으로 치환하거나 시스테인의 위치를 변경한 것을 사용할 수 있다. 또는 당쇄 부가 부위를 포함하는 다른 아이소타입 유래의 힌지영역과 바꿈으로써 당쇄에 의해 프로테아제 내성을 증대시켜도 되고(특허문헌 2), 이들도 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드에 포함된다.
힌지영역의 프로테아제에 의한 분해를 방지하기 위해서는 힌지영역을 삭제함으로써 힌지 결손형 융합 단백질을 제작하는 방법이 바람직하다. 이 융합 단백질은 힌지영역을 갖지 않는 것으로부터, 이펙터 기능에 관여하는 Fcγ 수용체나 보체로의 결합 저하가 생각되어, 부작용으로 이어지는 이펙터 기능을 매개로 한 세포장애나 혈중으로부터의 융합 단백질의 배제로 이어지는 이펙터 기능을 매개로 한 면역반응의 활성화가 경감되어, 힌지영역을 갖는 것(힌지 부가형 융합 단백질 등)과 비교하여 유리하다.
이러한 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드는 FcRn 결합영역에 더하여 다른 서열을 포함하고 있어도 되고, 예를 들면 IgA, IgM 등의 다량체를 형성하는 J쇄가 포함되는 서열을 부가함으로써 추가로 다량체화할 수 있다.
락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드와 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드는 융합 단백질에 있어서 어느 쪽을 N말단 측 또는 C말단 측에 위치시켜도 되나, 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드를 N말단 측, FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 C말단 측으로 하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 융합 단백질로서는 (LF-Y)n으로 표시되는 것 및/또는 상기 〔1〕의 식에 있어서 n=1 또는 2인 것이 바람직하고, (LF-Y)n으로 표시되는 것으로서 n=1인 것이 더욱 바람직하다. 또한 후술하는 바와 같이 LF와 Y 사이에 부가적인 서열이 존재해도 된다.
본 발명의 융합 단백질 등에 있어서 사용되는 「락토페린」(LF) 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드는 유전자 재조합형(일부의 아미노산이 치환된 개변형을 포함하는) 락토페린으로서, 사용되는 서열이 유래하는 생물종 및 개변의 유무 등은 불문한다. 예를 들면 락토페린은 인간 및 각종 동물(소, 말, 돼지, 양, 염소, 낙타 등)로부터 얻어지는 천연의 락토페린과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있어도 되고, 목적으로 하는 락토페린의 생리활성을 갖는 한 일부의 아미노산이 결실, 부가, 치환되어 있어도 된다. 락토페린의 기능적(생물활성을 갖는) 단편, 펩티드는 각종의 것이 공지로(예를 들면 「프로그램·초록집 제2회 임상 락토페린 심포지엄 2009」, 21~27페이지(시마자키 게이이치), Peptides. 2011 Sep；32(9)：1953-63. Epub 2011 Jul 30，Discovery and development of asynthetic peptide derived from lactoferrin for clinical use, Brouwer CP, Rahman M. Welling MM, Biometals. 2010 Jun；23(3)：493-505. Epub 2010 Mar 18，The human lactoferrin-derived peptide hF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response, van der Does AM, Bogaards SJ, Jonk L, Wulferink M, Velders MP, Nibering PH, J Agric Food Chem. 2010 Jun 9；58(11)：6721-7, Antihypertensive properties of lactoferricin B-derived peptides, Ruiz-Gimenez P, Ibanez A, Salom JB, Marcos JF, Lopez-Diez JJ, Valles S, Torregrosa G, Alborch E, Manzanares P), 필요에 따라 설계할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 등에 관하여 「생물(학적)활성」이란 특별히 언급하지 않는 한, 락토페린의 생리 약리활성을 의미한다. 특히 본 발명의 융합 단백질 등은 천연 락토페린(또는 천연과 동등한 서열을 갖는 재조합형 락토페린)과 동등한 철 킬레이트(결합)능을 가지고 있다. 구체적으로는, 후술하는 실시예의 방법으로 측정하여 천연 락토페린(또는 천연과 동등한 서열을 갖는 재조합형 락토페린)의 철 결합능을 100%로 한 경우에, 본 발명의 융합 단백질 등은 적어도 50% 이상(예를 들면 약 50%~약 150% 또는 약 50%~약 120%)의 철 결합능을 유지하고 있고, 바람직한 태양에 있어서는 본 발명의 융합 단백질 등은 천연 락토페린(또는 천연과 동등한 서열을 갖는 재조합형 락토페린)의 약 70%~약 100% 또는 그 이상(예를 들면 약 70%~약 150% 또는 약 70%~약 120%), 더 나아가서는 약 90% 이상에 상당하는 철 결합능을 갖는다. 또한 철 결합능은 실시예에 기재한 방법 또는 그것과 동등한 방법에 의해 측정하는 경우 ±20% 정도의 오차가 있을 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 또한 부가적인 아미노산 서열 및(또는) 당쇄 등을 포함하고 있어도 된다. FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드와 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드 사이에, 스페이서 서열로서 적절한 길이의 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 스페이서 서열(s)은, 예를 들면 0~10개, 또는 0~5개의 임의의 아미노산의 서열일 수 있다. 그 밖의 부가적인 서열은 스페이서 서열과 같은 입체구조 상의 이점을 제공하는 것이어도 되고, 또한 예를 들면 시그널 펩티드나 정제에 이용되는 태그 서열과 같이 어떠한 기능을 융합 단백질에 부여하는 것이어도 되며, 이들을 갖는 것을 개변체라 칭한다.
본 발명의 융합 단백질 등은 유전자 재조합에 의해 제조할 수 있다. 목적하는 아미노산 서열을 갖는 락토페린 유전자와 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드의 유전자를 통상의 방법으로 연결하고, 목적하는 숙주세포에 있어서 발현시키는데 필요한 그 밖의 요소를 포함하는 발현 벡터를 구축하여, 이 벡터를 숙주세포에 도입하여 융합 단백질을 발현시키고, 발현된 융합 단백질을 세포 또는 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 등을 코드하는 핵산 분자는 공지의 서열 및 표준적인 유전자 조작기술에 의해 설계하여 제작할 수 있다. 락토페린 및 FcRn 결합영역 함유 단백질을 코드하는 유전자는 공지의 핵산 또는 아미노산 서열에 기초하는 프로브를 사용하여, 일반적으로 이용 가능한 각종 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하거나, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)법에 의해 합성함으로써 얻을 수 있다. 이들 유전자에 목적하는 개변을 가하거나 변이를 도입해도 된다.
핵산 분자를 복제하기 위해 사용하는 숙주세포 및 벡터계, 및 융합 단백질을 발현시키기 위해 사용하는 숙주 및 벡터계는 공지의 다수의 진핵세포(포유동물세포, 식물세포, 효모, 곤충세포 등) 및 원핵세포(세균 등)의 계로부터 적절히 선택해서 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터는 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드를 코드하는 서열 및 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 서열(또는, FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 서열 및 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드를 코드하는 서열)에 더하여, 일반적으로 작동 가능하게 연결된 상태에서 전사 프로모터, 분비 시그널 펩티드 서열, 전사 터미네이터, 폴리 A 시그널 등의 요소를 포함하고, 추가로 통상 약제 내성 유전자 등의 선택 마커를 포함한다.
이들 벡터를 사용하여 공지의 각종 기술에 따라 숙주세포를 형질전환할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 등은 유전자 재조합 식물 및 유전자 재조합 동물을 제조함으로써 이들의 동물 및 식물로 생산시킬 수 있다. 예를 들면 양, 염소 등의 비인간 동물의 게놈에 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 핵산 분자를 삽입함으로써, 본 발명의 융합 단백질을 유즙 중에 분비시키도록 할 수 있다. 또한 식물에 삽입함으로써 본 발명의 융합 단백질 등을 생산하는 유용 식물을 제조하는 것도 가능하다(예를 들면 일본국 특허공표 제2004-528022호 공보).
본 발명의 융합 단백질 등은 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포의 배지 등으로부터 황산암모늄 침전, 겔여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 기술을 적절히 사용하여 단리 정제할 수 있다. 특히 바람직한 정제방법으로서는 이온 교환 크로마토그래피를 들 수 있다.
락토페린은 항균작용, 철 대사 조절작용, 세포증식 활성화작용, 조혈작용, 항염증작용, 항산화작용, 식작용 항진작용, 항바이러스작용, 비피더스균 생육 촉진작용, 항암작용, 암전이 저지작용, 트랜스로케이션 저지작용, 지질대사 개선작용, 진통작용, 항스트레스작용 등을 포함하는 광범위한 생리활성을 가지고 있어, 이들 작용에 의해 생활습관병(예를 들면 고콜레스테롤혈증, 고지혈증 등), 동통 관리(암성 동통, 신경인성 동통 등), 교원병(쇠그렌증후군에 의한 안구 및 구강 건조, 류머티스성 관절염 등), 치주병, C형 간염 등을 포함하는 많은 질환 또는 증상의 치료(개선을 포함한다) 및 예방이 가능하다.
본 발명의 융합 단백질 등은 락토페린의 생물활성을 충분히 유지하고 있기 때문에, 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 락토페린이 유효한 질환의 예망 또는 치료제로서 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 융합 단백질 등은 제제학의 분야에서 공지인 각종 담체, 치료상 불활성의 기제 및/또는 첨가물을 배합함으로써 목적하는 제형의 의약품 조성물로 할 수 있다. 편의상 본 발명에 관하여 의약품 또는 의약품 조성물이라 할 때는 투여 대상이 인간인 경우 외에, 동물인 경우(즉, 수의약 등)도 포함한다. 이러한 의약품 조성물에 함유시킬 수 있는 각종 성분 및 제형은 당업자에게는 충분히 공지이다.
본 발명의 융합 단백질 등을 포함하는 치료제 또는 의약품 조성물의 유효 투여량은 치료 또는 예방 대상 질환 또는 증상의 종류나 정도, 투여 대상의 상태, 제형, 투여 경로 등에 따라 상이하여, 공지의 유효 락토페린량을 기준으로 적절히 선택할 선택할 수 있다. 일반적으로 공지의 유효 락토페린량과 비교하여 유의하게 적은 용량(예를 들면 락토페린량 환산으로 1/2~1/20량)으로 할 수 있고, 동등한 용량으로 사용하는 것이라면 투여 횟수를 줄이는 것이 가능하다.
실시예
아래에 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 실시예에 나타내어지는 범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1：인간 락토페린(hLF)과 힌지영역을 포함하는 인간 IgG Fc영역의 융합 단백질의 제작 및 생물활성 평가
1. 인간 락토페린(hLF) 유전자의 클로닝
인간 락토페린(hLF) cDNA는 인간 cDNA 라이브러리(상품명「Human Leukocyte Marathon-Ready cDNA」, 클론텍사)로부터 PCR법에 의해 취득하였다. 포워드측 프라이머로서 S＿LFex＿XhoI＿ATG(서열번호 1；5'-CTCGAGATGAAACTTGTCTTCCTCGTC(개시코돈인 ATG의 상류에 하선부 XhoI 사이트를 도입), 리버스측 프라이머로서 AS＿LFex＿TAA＿XbaI(서열번호 2；5'-TCTAGATTACTTCCTGAGGAATTCAC(종지코돈 TAA의 하류에 하선부 XbaI 사이트를 도입)를 사용하고, DNA 합성효소는 「KOD-plus」(상품명, 도요보사)를 사용하여 hLF cDNA를 증폭시켰다.
얻어진 DNA 단편에 A를 부가하고 「TOPO TA 클로닝 벡터」(상품명, 인비트로젠사)로 클로닝하였다. 그 후 이 벡터를 XhoI과 XbaI로 소화함으로써 hLF cDNA의 DNA 단편을 잘라내고, 사전에 XhoI과 XbaI로 소화한 벡터 「pBluescript II」(상품명, Stratagene사)로 클로닝하였다. 이 벡터를 「pBSIILfAL」로 명명하였다. hLF cDNA의 염기서열은 디데옥시법 시퀀싱으로 확인하였다. pBSIILfAL에는 hLF 유전자 전장이 벡터의 XhoI 및 XbaI 제한효소 사이트 사이에 끼이는 형태로 클론화되어 있다. pBSIILfAL의 구조를 도 1(좌측 도면)에 나타낸다.
상기에서 제작한 hLF 유전자 전장을 포함하는 벡터 pBSIILfAL을 사용하여 hLF 유전자 3'말단 측에 존재하는 EcoRI와 XbaI 사이에 BamHI 사이트를 도입한 벡터, pBSIILfAL/Bam을 제작하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 Eco＿hLF＿Bam-S(서열번호 3；5'-AATTCCTCAGGAAGGATCCT-3') 및 Eco＿hLF＿Bam-A(서열번호 4；5'-CTAGAGGATCCTTCCTGAGG-3')를 준비하고, 각각 100 μM의 농도로 멸균수에 용해하였다. 그 후 아래의 표 1에 나타낸 시약을 혼합하여 샘플 용액으로 하였다.
Figure pct00002
이 샘플 용액을 70℃로 가열 후 천천히 실온까지 냉각시킴으로써 어닐링시켜 이중 가닥 DNA를 형성시켰다(어닐링 올리고). EcoRI와 XbaI로 완전 소화한 pBSIILfAL(10 ng/㎕)을 준비하고, 아래의 표 2에 나타낸 시약을 혼합하여 16℃에서 30분간 라이게이션하였다.
Figure pct00003
이 라이게이션 용액 5 ㎕와 적격세포(competent cell) TOP10 50 ㎕를 혼합하여 빙상에서 30분 인큐베이트하였다. 그 후 42℃에서 40초간 적격세포에 열충격을 가하고 빙상에서 2분간 정치 후, SOC 배지를 100 ㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 1시간 인큐베이트한 샘플을 암피실린이 든 LB 한천배지에 뿌리고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 얻어진 콜로니를 1.5 ㎖의 LB 액체배지(100 ㎍/㎖ 암피실린이 들어 있음) 중에서 37℃, 200 rpm의 조건하에서 하룻밤 진탕배양하였다.
플라스미드 DNA 추출은 「QIAprep Spin Miniprep Kit」(상품명, QIAGEN사)를 사용해서 행하였다. 어닐링 올리고와 pBSIILfAL의 라이게이션은 어닐링 올리고 근방의 염기서열을 해독함으로써 확인하였다. 제작한 벡터를 pBSIILfAL/Bam으로 명명하였다(도 1, 우측 도면).
2. 힌지영역을 포함하는 hLF/hIgG Fc 융합 단백질 발현 벡터의 구축
2-1 pTeuIgG/hLF의 구축
hLF와 인간 IgG Fc(hIgG Fc)의 융합 단백질(hLF/hIgG Fc)이 힌지영역에서 디설피드(s-s) 결합에 의해 2량체화된 구조의 융합 단백질(힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)로 표기하는 경우가 있다)을 동물세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축하였다.
인간 IgG Fc영역의 힌지, CH2, CH3의 게놈 서열을 갖는 발현 벡터, pTeuIgG(도 2)의 XhoI/BamHI 사이트에 pBSIILfAL/Bam의 XhoI-BamHI 단편을 클로닝하였다. 이 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc) 발현 벡터를 pTeuIgG/hLF로 명명하였다. 발현 벡터의 제작은 상기의 방법에 준하였다.
또한 pTeuIgG는 강력한 발현 프로모터인 SRα의 하류에 인간 IgG1의 힌지, CH2, CH3영역에 대응하는 게놈 DNA 서열을 도입해서 구축하였다(Sato, A. et al., Biochem. J. 371, 603-608(2003)).
hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 안정 발현 세포주 구축을 위해 CHO세포의 일종인 DHFR 결손 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(DG44)를 사용하였다. DHFR이란 디히드로엽산 환원효소로, 핵산의 생합성에는 필수이다. DHFR의 안타고니스트인 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에서 세포를 배양하면 DHFR의 생산이 저해된다. 그때 세포는 살아남기 위해 DHFR 유전자를 증폭시키고, DHFR 유전자의 근방에 존재하는 유전자도 증폭되기 때문에, 그 유전자의 단백질 발현이 증폭하는 것이 알려져 있다. 이와 같이 하여 목적으로 하는 단백질을 고발현시키는 것이 가능하다.
DG44 세포용 발현 벡터에는 인비트로젠사 제조 pOptiVEC(상품명)를 사용하였다. 벡터 pBluescript II(상품명, Stratagene사)의 T7 프라이머 결합부위로부터 T3 프라이머 결합부위까지의 영역을 PCR법으로 증폭하고, TA 클로닝법으로 pOptiVEC에 연결함으로써 벡터 pOptiVEC-MCS를 제작하였다(도 4).
힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc) 발현 벡터를 제작하기 위해, 벡터 pTeuIgG/hLF로부터 hLF, 인간 IgG Fc영역의 힌지, CH2, CH3의 게놈 서열을 포함하는 영역을 XhoI-NotI 단편으로서 잘라내고, pOptiVEC-MCS의 XhoI/NotI 사이트로 클로닝하였다. 이 벡터를 pOptiVEC/hLF-dFc로 명명하였다(도 5). 발현 벡터의 제작은 상기의 방법에 준하였다.
힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc) 발현 벡터인 pOptiVEC/hLF-dFc가 코드하는 인간 락토페린(hLF)/인간 IgG Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 5에 기재하였다. 서열번호 5에 있어서 각각 아미노산 번호 1~711은 hLF, 712~714는 스페이서, 715~729는 힌지영역, 730~839는 CH2 도메인, 840~946은 CH3 도메인의 아미노산 서열이다(도 17a：Genbank 등록번호 AAB60324.1. 및 AAA02914.1 서열에 기초한다).
3. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 발현 및 정제
3-1. DG44세포를 숙주로 하는 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질 안정 발현 세포주의 구축
제작한 pOptiVEC/hLF-dFc를 DG44세포로 도입하여 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc) 안정 발현 세포주를 수립하였다. 발현 벡터를 효율적으로 세포로 도입하기 위해 벡터 20 ㎍분을 PvuI로 제한효소 처리하여 직쇄상으로 하였다. 이 샘플에 페놀/클로로포름 1 용량분을 첨가하고, 믹서(Vortex)로 교반하여 단백질을 제거하였다. 15,000 rpm으로 5분간 원심 후, 상청을 새로운 튜브로 옮겼다. 상청에 1/10 용량의 3M 초산나트륨 및 2.5 용량의 100% 에탄올을 첨가하고, 15,000 rpm으로 20분간 원심하여 벡터를 침전시켰다. 상청을 제거한 튜브에 70% 에탄올을 100 ㎕ 첨가해 린스하였다. 그 후 15,000 rpm으로 5분간 원심하여 상청을 버리고 10분간 풍건하였다. 풍건한 튜브에 멸균수 15 ㎕를 첨가하고 발현 벡터를 현탁하였다. PvuI 처리한 발현 벡터를 pOptiVEC/hLF-dFc/PvuI로 명명하였다.
제작한 pOptiVEC/hLF-dFc/PvuI를 사용하여 DG44세포로의 트랜스펙션을 행하였다. pOptiVEC/hLF-dFc/PvuI 20 ㎍분을 「Free Style MAX Reagent」(상품명, 인비트로젠사) 15 ㎕, 「Opti Pro SFM」(상품명, 인비트로젠사) 1,200 ㎕와 혼합하고, 실온에서 10분간 정치하여 트랜스펙션 용액으로 하였다. DG44세포(15×106세포)를 배지(「complete CD DG44　medium」, 인비트로젠사) 30 ㎖에 현탁하고, 이 중에 사전에 준비한 트랜스펙션 용액을 혼합하여 CO2 인큐베이터(37℃, 5%CO2)에서 48시간 배양하였다. 그 후 배지를 「complete CD DG44　medium」에서 「complete CD opti CHO medium」(인비트로젠사)으로 교환하였다. 이 배지는 히포크산틴이나 티미딘을 함유하지 않는 배지로, DHFR 결손 세포는 생육할 수 없다. 한편 PvuI로 제한효소 처리한 발현 벡터는 DHFR 유전자를 코드하고 있기 때문에, DG44세포의 염색체에 발현 벡터가 삽입되면 세포가 생육 가능해진다. 트랜스펙션 후 48시간 경과한 세포를 400×g으로 5분간 원심하여 모으고, 「complete CD opti CHO medium」 30 ㎖에 현탁하였다(3×106세포/㎖). 그 후 배지 교환을 2일마다 행하면서 CO2 인큐베이터(37℃, 5%CO2)에서 배양하였다. 세포밀도가 배양개시시의 90% 이상이 될 때까지 배양하였다.
그 후 메토트렉세이트(MTX, 와코 순약)에 의한 세포 내의 게놈 증폭을 행하였다. 「Complete CD opti CHO medium」에서 배양한 DG44세포의 세포 수를 계측하여, 1.2×107세포분을 400×g으로 5분간 원심하였다. 이 세포를 「complete CD opti CHO medium」 30 ㎖와 1 mM MTX 1.5 ㎕(최종농도：0.05 μM)의 혼합배지에 현탁하였다. 그 후 CO2 인큐베이터(37℃, 5%CO2)에서 세포밀도가 배양개시시의 90% 이상이 될 때까지 배양하였다. 그 후에는 MTX의 농도를 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM로 단계적으로 올려 동일한 배양을 행하였다.
3-2. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 발현 확인
1.2×107세포분의 세포를 각 농도(0, 0.05 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM)의 MTX를 포함하는 「complete CD opti CHO medium」에 현탁하여 CO2 인큐베이터(37℃, 5%CO2)에서 세포밀도가 배양개시시의 90% 이상이 될 때까지 배양하였다. 그 시점에서 400×g으로 5분간 원심하여 세포를 침전시키고, 그 상청을 회수하였다. 상청 15 ㎕에 비환원의 4×샘플 완충액(0.5M Tris-HCl(pH 6.8)을 2 ㎖, 라우릴황산나트륨(나칼라이테스크사)을 0.8 g, 글리세린(Wako사)을 4 ㎖ 혼화하고, 순수로 10 ㎖로 묽게 하여 조제)을 5 ㎕ 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리를 행하여 7.5% SDS-PAGE로 해석하였다. 밴드의 염색에는 CBB를 사용하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 목적인 d(hLF/hIgG Fc)의 분자량은 약 210 kDa이다. MTX 농도 1 μM부터 화살표로 나타낸 약 210 kDa 부근에 밴드가 보이고, MTX 농도가 상승함에 따라 그 밴드는 진해져 단백질의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
MTX 농도 4 μM 존재하에서 수립한 세포주를 DG44-d(hLF/hIgG Fc)라 명명하였다.
3-3. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 대량 발현
대량 발현은 175 ㎠의 T플라스크(그레이너사 제조, 배지 50 ㎖ 사용) 또는 Nunc사 제조 트리플플라스크(배지 200 ㎖ 사용)를 사용한 정치 배양으로 행하였다. 힌지 부가형 융합 단백질 안정 발현주는 무혈청 배지 「Complete CD Opti medium」으로 계대 배양하였다. 단백질 발현시에는 배지를 「Hybridoma Serum Free Medium」(상품명, Invitrogen사)＋4 μM 메토트렉세이트(MTX)＋60 ㎍/㎖ 프롤린(이하 「Hybridoma SFM」이라 한다)으로 바꾸고, 세포농도 1×106세포/㎖로 뿌려 37℃, 5%CO2에서 7일간 배양하였다. 7일 후 세포 배양액을 400×g으로 5분간 원심함으로써 상청과 세포를 분리하였다. 세포는 재차 Hybridoma SFM 50 ㎖에 현탁하고 37℃, 5%CO2에서 추가로 1주간 배양함으로써 단백질을 발현시켰다. 상청은 8,000 rpm으로 5분간 재원심하고 얻어진 상청에 최종농도 0.02% 아지드화나트륨을 첨가하여 4℃에서 보존하였다.
3-4. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 정제
정제에는 대량 발현으로 얻어진 배지 상청(최종농도 0.02% 아지드화나트륨을 포함한다)을 그대로 사용하였다. 양이온 교환 담체인 「MacroCap SP」(상품명, GE 헬스케어사) 400 ㎕를 「Poly-Prep Chromatography Columns」(상품명, 바이오래드사)에 충전하고, 5 칼럼용량(CV)분의 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)으로 평형화하였다. 평형화에 사용한 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)을 버리고 대량 발현으로 얻어진 배지 상청 4 ㎖를 첨가하여, 씨소 쉐이커로 30분간 반응시켰다. 반응 후 용액은 플로우 쓰루 분획으로서 회수하였다. 「Poly-Prep Chromatography Columns」를 「UV DETECTOR」(도쿄 이화기계사, 280 nm의 흡광도를 측정), 마이크로튜브 펌프(도쿄 이화기계사)와 접속하여 펌프의 속도를 1 ㎖/min로 설정하고, 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)을 흘려 담체를 세정하였다. 「UV DETECTOR」의 280 nm의 흡광도가 상승하기 시작한 시점부터 배출액을 회수하였다(Wash 분획). 이 회수는 280 nm의 흡광도가 0이 될 때까지 계속하였다. 그 후 용액을 0.2M NaCl＋10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6)으로 바꿔 동일한 조작을 행하였다(0.2M NaCl 용출 분획). 이 일련의 조작을 NaCl 농도를 0.1M씩 올리면서 1.0M NaCl까지 계속하였다. 회수한 각 용출액은 4℃에서 보존하였다.
각 용출 분획 15 ㎕에 비환원의 4×샘플 완충액을 5 ㎕ 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리를 행하여 7.5% SDS-PAGE로 해석하였다. 밴드의 염색에는 CBB를 사용하였다.
그 결과를 도 8에 나타낸다. 0.4M NaCl의 분획으로부터 목적 단백질인 힌지 부가형 d(hLF/hIgG Fc)가 용출되어 있었다. 이 결과로부터 「MacroCap SP」에 결합한 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)는 0.3M NaCl로 세정하고, 1.0M NaCl로 용출함으로써 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.
3-5. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 황산암모늄 침전에 의한 농축
액량 1 ㎖에 대해 황산암모늄이 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 포화가 되도록, 각각 황산암모늄 0.113 g, 0.176 g, 0.242 g, 0.314 g, 0.390 g, 0.472 g, 0.561 g, 0.657 g을 미량 전자저울로 칭량하여 덜어 2.0 ㎖ 튜브에 넣었다. 각각의 튜브에 양이온 교환 담체로 정제한 PBS에 현탁한 힌지 부가형 d(hLF/hIgG Fc) 단백질 용액을 1 ㎖씩 첨가하고, 황산암모늄이 녹을 때까지 전도 혼화한 후, 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 그 후 15,000 rpm, 30분간의 조건으로 원심을 행하여 단백질을 침전시켰다. 상청을 회수하고 침전은 100 ㎕의 PBS에 용해하였다. PBS로 용해한 각 침전과 회수한 상청을 7.5% SDS-PAGE 및 CBB 염색으로 조사하였다.
그 결과를 도 10에 나타낸다. 50% 내지 90%의 포화 황산암모늄에서 침전이 확인되었다. 또한 침전이 확인된 50% 내지 90%의 포화 황산암모늄의 분획에 대해서는, 용액 중의 단백질 농도를 기지 농도의 BSA를 표준으로 해서 브래드포드법(프로테인 어세이, 바이오래드사)으로 측정하여, 황산암모늄 침전에서의 회수율을 산출하였다(n=5). hIgG Fc 융합 단백질의 경우는 분자량을 사용하여 hLF 환산 농도를 산출하였다. 구체적으로는, 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 경우는 hLF의 분자량이 80 kDa(×2), Fc 부분의 분자량은 50 kDa으로서 계산하였다. 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc의 경우는 hLF의 분자량이 80 kDa, Fc 부분의 분자량은 25 kDa으로서 계산하였다. 각 황산암모늄 농도와 그 회수율(%)을 아래의 표 3에 나타낸다.
Figure pct00004
70% 황산암모늄에서 회수율이 가장 높았다. 황산암모늄 침전 후에는 침전을 PBS에 현탁하고, PBS에 대해 투석을 행함으로써 황산암모늄을 제거하였다.
4. 생물학적 활성 측정
4-1. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 철 결합능의 측정
락토페린은 분자량 8만의 비헴성의 철 결합성 당단백질로, N로브, C로브라 불리는 2개의 영역으로 이루어지고, 탄산이온(CO3 2-)의 존재하에서 단백질 1분자당 2개의 철이온(Fe3＋)을 가역적으로 킬레이트 결합하는 능력을 갖는다(Anderson et al., Nature, 344 784-78(1990)). 락토페린의 철 결합능의 측정은 아래와 같이 행하였다. 홀로(holo)형 락토페린으로부터 철이온(Fe3＋)을 유리(遊離)시켜 아포(apo)형 락토페린을 조제한다. 이어서 탄산이온(CO3 2-) 존재하에서 철이온(Fe3＋)을 부가시킨 철 재결합 락토페린을 조제하였다. apo형 및 철 재결합 락토페린의 철 함량 및 단백질 농도를 측정하고, 철 결합량의 측정을 행하였다. 구체적으로는, apo형 락토페린은 Aspergillus 유래의 재조합형 인간 LF, 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)를 0.1M 구연산 완충액(pH 2.1)으로 24시간, 추가로 증류수로 24시간 투석을 행하여 조제하였다. 철 재결합형 락토페린은 apo형 락토페린을 0.001% 구연산 철 암모늄, 50 mM 탄산나트륨 및 50 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 완충액(pH 7.5)으로 24시간 투석을 행한 후, 과잉의 철이온을 제거하기 위해 증류수, 이어서 50 mM 염화나트륨을 포함하는 인산 완충액(pH 7.5)에 대해 24시간 투석을 행하여 조제하였다. 단백질에 결합해 있는 철이온을 비색법으로 측정하기 위해 혈청 철 측정 키트 「Fe C-테스트와코」(상품명, 와코 순약)를 사용하였다. 철의 결합능은 브래드포드법으로 정량한 hLF 단백질 1 ㎎(인간 IgG Fc 융합 단백질의 경우는 분자량을 사용하여 산출한 hLF 환산으로 1 ㎎)당 결합해 있는 철의 결합량으로서 산출하였다. 2회 실험을 행한 결과를 아래의 표 4에 나타낸다.
Figure pct00005
Aspergillus 유래의 재조합형 hLF의 철의 결합활성을 100%로 한 경우, 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)는 거의 100%의 활성을 나타내었다.
4-2. CD 스펙트럼을 사용한 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성의 검토
Aspergillus 유래의 재조합형 hLF와 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)의 열안정성을 원편광 이색성(CD) 스펙트럼으로 해석하였다. 원편광 이색성(CD) 스펙트럼이란, 물질에 있는 파장을 조사한 경우의 우측 원편광과 좌측 원편광의 흡수 차를 측정하는 방법으로, 단백질의 2차구조의 유무나 종류, 함량을 추정하는 것이 가능하다.
먼저 PBS(-)에 0.1 ㎎/㎖로 현탁한 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF, 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)를 준비하고, 실온(약 20℃)에서 파장 200 nm~250 nm의 CD 스펙트럼을 측정하였다(일본 분광의 J-720 사용).
그 결과를 도 12에 나타낸다. 재조합형 hLF(패널 A)와 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)(패널 C)의 2차구조에는 커다란 차이는 확인되지 않았다.
다음으로 각 단백질의 열안정성을 조사하였다. 단백질 용액의 온도를 저온에서 고온으로 변화시키면서 CD 스펙트럼을 측정하면, 어느 온도에서 ［θ］가 상승하고 일정 값을 취한다. 이 현상은 열에 의해 단백질의 변성이 일어나 2차구조가 변화되는 것에 기인하고 있다. 열안정성을 관찰하는 경우는 일반적으로 측정하는 파장은 225 nm 부근을 사용한다. PBS(-)에 0.1 ㎎/㎖로 현탁한 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF, 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)를 준비하고, 30~90℃까지 1℃씩 상승시키면서 파장 225 nm의 CD 스펙트럼을 측정하였다(일본 분광의 J-720 사용).
결과를 도 13에 나타낸다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF(패널 A)는 67℃ 부근에서 CD 스펙트럼값의 커다란 변화가 관찰되었다. 한편 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)(패널 C)에서는 30~90℃까지 가열해도 225 nm에 있어서의 CD 스펙트럼에 커다란 변화는 관찰되지 않았다.
이상으로부터 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF와 비교하여 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)는 열에 대한 안정성이 향상되어 있는 것이 나타내어졌다. 구조적으로 안정해진 힌지 부가형 융합 단백질 d(hLF/hIgG Fc)는 인 비보에 있어서의 혈중 안정성의 향상도 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
4-3. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 안정성의 검토
3-4.에서 나타낸 양이온 교환 담체 「MacroCap SP」로 정제 후의 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질을 PBS에 투석하고, 추가로 PBS로 희석함으로써 336 ㎍/mL 농도의 샘플을 조제하였다. 이 샘플을 1.5 mL 튜브에 100 μL 첨가하고, 37℃에서 3주간 정치 반응시켰다. 반응 0, 1, 2, 3주간 후의 샘플을 3 μL 취하고, 비환원의 4×샘플 완충액을 1 ㎕ 혼합하여 95℃, 5분 열처리를 행하였다. 그 후 7.5% SDS-PAGE로 해석하였다.
CBB 염색의 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14에 있어서 M은 마커, 레인 1은 hLF(1 ㎍/레인), 레인 2~5는 각각 0, 1, 2, 3주간 후의 샘플이다. 37℃에서도 수 주간은 안정하나, 시간 경과와 함께 ＊로 나타낸 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 밴드가 엷어지고, 분해물로 생각되는 ＊＊, ＊＊＊의 밴드가 진해졌다. 이는 정제 과정에서 혼입된 프로테아제에 의해 분해된 것으로 생각된다. 또한 힌지 결손형 융합 단백질(후술)에서는 이러한 분해는 관찰되지 않았다.
4-4. 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 분해 개소의 해석
힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 분해 개소를 특정하기 위해 분해된 밴드의 N말단 아미노산 서열을 해석하였다. 전술한 방법으로 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질(12 ㎍분)을 37℃에서 3주간 정치 반응시킨 후, 분해된 샘플을 10% SDS-PAGE로 영동하였다. 영동 후 통상의 방법에 따라 단백질을 PVDF막(밀리포어사)으로 전사하였다. PVDF막을 CBB 염색한 도면을 도 15a에 나타낸다. 도 15a에 있어서 M은 마커, 레인 1은 hLF(4 ㎍), 레인 2~6은 모두 분해 후의 샘플(각 2 ㎍/레인)이다. 이 PVDF막으로부터 약 50 kDa의 밴드(화살표)를 잘라내어 탈색하였다. 그 밴드의 N말단 아미노산 서열을 procise 491HT(상품명, ABI사)로 해석하였다. 얻어진 아미노산 서열은 T-H-T-X-P(4아미노산째는 해독 불능)로, 그 서열을 조사한 바, 서열표의 서열번호 5의 아미노산 번호 722~726(힌지영역 내)에 대응하고 있었다(도 15b).
실시예 2：인간 락토페린과 힌지영역을 포함하지 않는 인간 IgG Fc영역의 융합 단백질(「힌지 결손형」)의 제작, 생물활성 및 혈중 안정성 평가
1. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질 발현 벡터의 구축
상기에서 제작한 벡터 pBSIILfAL/Bam(도 1)을 사용하여 hLF와 힌지영역을 포함하지 않는 hIgG Fc의 융합 단백질(힌지 결손형 hLF/mhIgG Fc)을 동물세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 구축하였다.
힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc 발현 벡터를 제작하기 위해, 인간 IgG Fc영역의 CH2, CH3의 cDNA 서열을 갖는 발현 벡터 pmIgG(도 3)의 XhoI/BamHI 사이트에 pBSIILfAL/Bam의 XhoI-BamHI 단편을 클로닝하였다. 이 벡터를 pmIgG/hLF로 명명하였다. 각 발현 벡터의 제작은 상기의 방법에 준하였다.
또한 pmIgG은 아래와 같이 하여 구축하였다. 전술한 힌지 부가형 융합 단백질 발현 벡터인 pTeuIgG의 BamHI-XbaI에 존재하는 인간 IgG1의 힌지, CH2, CH3영역에 대응하는 게놈 DNA 서열을 인간 IgG1의 CH2와 CH3영역에 대응하는 cDNA 서열로 바꿔 제작하였다.
힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc 발현 벡터를 제작하기 위해 pmIgG/hLF의 hLF, 인간 IgG Fc영역의 CH2, CH3의 cDNA 서열을 포함하는 영역을 XhoI-NotI 단편으로서 잘라내고, 상기에서 제작한 pOptiVEC-MCS(도 4)의 XhoI/NotI 사이트에 클로닝하였다. 이 벡터를 pOptiVEC/hLF-mFc라 명명하였다(도 5). 발현 벡터의 제작은 상기의 방법에 준하였다. 힌지 결손형 융합 단백질 hLF/mhIgG Fc 발현 벡터 pOptiVEC/hLF-mFc가 코드하는 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 6에 기재하였다. 서열번호 6에 있어서 각각 아미노산 번호 1~711은 hLF, 712~713은 스페이서, 714~823은 CH2 도메인, 824~930은 CH3 도메인의 아미노산 서열이다(도 17b：Genbank 등록번호 AAB60324.1 및 AAA02914.1의 서열에 기초한다).
2. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 발현 및 정제
2-1. DG44세포를 숙주로 하는 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질 안정 발현 세포주의 구축
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 제작한 pOptiVEC/hLF-mFc를 DG44세포로 도입하여, hLF/hIgG Fc 융합 단백질 안정 발현 세포주를 수립하였다. PvuI 처리한 발현 벡터를 pOptiVEC/hLF-mFc/PvuI라 명명하였다.
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 제작한 pOptiVEC/hLF-mFc/PvuI를 사용하여 DG44세포로의 트랜스펙션을 행하고, MTX의 농도를 단계적으로 올려 동일한 배양을 행하였다.
2-2. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 발현 확인
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 7.5% SDS-PAGE 및 CBB 염색으로 해석하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. 목적인 hLF/mhIgG Fc의 분자량은 약 105 kDa이다. MTX 농도 0.5 μM부터 화살표로 나타낸 약 105 kDa 부근에 밴드가 보이고, MTX 농도가 상승함에 따라 그 밴드는 진해져, 단백질의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
MTX 농도 4 μM 존재하에서 수립한 세포주를 DG44-hLF/mhIgG Fc라 명명하였다.
2-3. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 대량 발현
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 세포를 계대 배양하여 융합 단백질을 대량 발현시켰다. 얻어진 상청을 4℃에서 보존하였다.
2-4. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 정제
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 대량 발현으로 얻어진 배지 상청으로부터 융합 단백질을 정제하였다.
그 결과를 도 9에 나타낸다. 0.5M 내지 0.7M NaCl로 목적 단백질인 힌지 결손형 hLF/mhIgG Fc가 용출되었다. 이 결과로부터 그 후에는 「MacroCap SP」에 결합한 힌지 결손형 hLF/mhIgG Fc는 0.4M NaCl로 세정하고, 1.0M NaCl로 용출함으로써 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.
2-5. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 황산암모늄 침전에 의한 농축
힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 융합 단백질을 황산암모늄 침전에 의해 농축하고, 7.5% SDS-PAGE 및 CBB 염색으로 조사하였다.
그 결과를 도 11에 나타낸다. 60% 내지 90%의 포화 황산암모늄에서 침전이 확인되었다. 또한 n 침전이 확인된 60% 내지 90%의 포화 황산암모늄의 분획에 대해서는, 용액 중의 단백질 농도를 브래드포드법으로 측정하여 황산암모늄 침전에서의 회수율을 산출하였다(n=2). 각 황산암모늄 농도와 그 회수율(%)을 아래의 표 5에 나타낸다.
Figure pct00006
60% 황산암모늄에서 회수율이 가장 높았다. 황산암모늄 침전 후에는 침전을 PBS에 현탁하고, PBS에 대해 투석을 행함으로써 황산암모늄을 제거하였다.
3. 생물적 활성 측정
3-1. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 철 결합능의 측정
락토페린의 철 결합능의 측정은 힌지 부가형의 경우와 동일하게 해서 행하였다. 2회 실험을 행한 결과를 아래의 표 6에 나타낸다.
Figure pct00007
Aspergillus 유래의 재조합형 hLF의 철의 결합활성을 100%로 한 경우, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 100%의 활성을 나타내었다.
3-2. CD 스펙트럼을 사용한 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성의 검토
Aspergillus 유래의 재조합형 hLF와 힌지 부가형 및 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 열안정성을 힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 CD 스펙트럼으로 해석하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF(패널 A)와 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질(패널 B)의 2차구조에는 커다란 차이는 확인되지 않았다.
다음으로 힌지 부가형의 경우와 동일하게 하여 각 단백질의 열안정성을 조사하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF(패널 A)는 67℃ 부근에서 CD 스펙트럼값의 커다란 변화가 관찰된 것에 대해, 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질(패널 B)에서는 30~90℃까지 가열해도 225 nm에 있어서의 CD 스펙트럼에 커다란 변화는 관찰되지 않았다.
이상으로부터, hLF와 비교하여 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질은 열에 대한 안정성이 향상되어 있는 것이 나타내어져, 인 비보에 있어서의 혈중 안정성의 향상도 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
3-3. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 랫트를 사용한 혈중 안정성의 검토
8주령의 Wistar계 랫트(수컷) 6마리에 펜토바르비탈나트륨에 의한 마취하에서 외경정맥에 채혈용 캐뉼러를 유치하였다. 대퇴정맥 내 주사에 의해 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF(1 ㎎/㎏ 체중으로 투여) 및 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)(hLF 환산으로 1 ㎎/㎏ 체중으로 투여)을 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180, 240분 후에 외경정맥에 유치한 캐뉼러로부터 채혈하고, 혈장 중의 hLF 농도는 ELISA(「Assay Max Human Lactoferrin ELISA kit」, Assaypro사 제조)에 의해 측정하였다. 또한 예비 검토에 의해 채혈시에 사용한 항응고제인 EDTA 및 혈장은 이 ELISA 측정에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한 사용한 ELISA 키트는 비오틴화 항인간 락토페린 항체(1차 항체)와 퍼옥시다아제 표지 스트렙토아비딘으로 구성되어 있다. 따라서 2차 항체를 사용하는 일반적인 ELISA로 문제가 되는 2차 항체와 힌지 결손형(hLF/mhIgG Fc)의 Fc영역의 교차 반응을 우려할 필요가 없다.
먼저 브래드포드법으로 농도 기지인 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF 및 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)을 사용하여 검량선을 작성하였다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF는 0.47~7.5 ng/㎖에서, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 0.235~30.0 ng/㎖에서 각각 직선성이 얻어졌기 때문에, 이 범위에 측정값이 들어가도록 각 혈장 샘플을 희석하여 단백질 농도를 측정하였다.
그 결과를 도 16에 나타낸다. 투여 전에는 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc) 투여군 모두 혈중으로부터 LF는 검출되지 않았다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF 투여군은 투여 후 60분 후에는 혈중으로부터 거의 클리어런스되었으나, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc) 투여군은 240분 후에 있어서도 검출되었다.
통계 해석 소프트웨어 「GraphPad Prism 4」(GraphPad Software사)를 사용하여 혈중 반감기와 시간 곡선하면적(area under the curve, AUC)을 산출하였다. Aspergillus 유래의 재조합형 hLF 투여군의 반감기는 12.6분인 것에 대해 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc) 투여군은 67.7분으로 약 5.4배로 연장되었다. AUC에 대해서는 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc) 투여군이 hLF 투여군의 약 7.4배로 증가되어 있었다. 이상으로부터 Aspergillus 유래의 재조합형 hLF와 비교하여 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 혈중 안정성의 현저한 향상을 나타내었다.
3-4. 힌지 결손형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 인 비트로에서의 프로테아제 내성 시험
힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)을 75% 소혈청/PBS 중에서 0.2 ㎍/㎕의 농도로 장기간 37℃에서 반응시켰다. 0, 14, 21, 38, 55일 후에 샘플을 채취하여, 항hLF 항체를 사용한 이뮤노블로팅에 의해 잔존하는 LF의 사이즈 및 양을 검출하였다.
그 결과, 55일간까지의 보존 기간 중 0일과 비교하여 거의 분해를 받지 않고 당초의 분자량을 유지하며, 검출량도 감소되어 있지 않았다(도 18). 따라서 본 발명의 융합 단백질은 혈중에서의 프로테아제에 의한 분해에 대해 충분한 내성을 갖는다.
실시예 3：인간 락토페린과 인간 IgG Fc영역의 융합 단백질(「힌지 결손형」)의 인간 소장 상피 유사 세포로의 흡수 평가 및 키모트립신 내성 평가
1. 인간 소장 상피 유사 세포 Caco2로의 흡수 평가
LF는 장관으로부터 흡수되어 흉관 림프로 이행하는 것이 알려져 있다. 이에 본 연구에서 제작한 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)이 이 경로로부터 흡수되는지를 인간 소장 상피 유사 세포 Caco2 세포를 사용해서 확인하였다.
hLF와 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 형광 프로브인 Alexa Fluor 488로 표지하였다. 1 ㎎의 Alexa Fluor 488에 DMSO 100 ㎕를 첨가한 후, 1M NaHCO3를 첨가한 각 단백질과 Alexa Fluor 488을 몰비 1：10으로 혼합하여 실온에서 1 h 반응시켰다. 반응 후 반응액을 1×PBS(-)에 대해 24시간 투석을 행하여 미표지 Alexa Fluor 488을 제거하였다.
Caco-2 세포를 12 웰 플레이트에 세포농도 5×104 cells/㎖가 되도록 뿌리고, 37℃，5% CO2에서 1주간 배양(2일 간격으로 배지 교환)하였다. Caco-2 세포에 PBS(-)를 1 ㎖/well 첨가하고, 3회 세정을 행하여, 배지 성분을 완전히 제거하였다. 다음으로 Alexa 표지가 끝난 각 단백질을 15 ㎍/well 첨가하여 1 hr 반응시켰다. 1 hr 후 Alexa 표지가 끝난 각 단백질을 제거하고, cold PBS(-)를 1 ㎖/well 첨가하여 1회 세정을 행하였다. 세정 후 0.25% Trypsin/EDTA를 250 ㎕/well 첨가하고 37℃ 조건하에서 5 min 반응시켰다. 5 min 후 세포를 tube에 전량 회수하고, 원심기를 사용하여 200×g，2 min，4℃에서 원심을 행하였다. 원심 후 상청액을 제거하고, cold PBS(-)를 1 ㎖/tube 첨가하여 가볍게 현탁하고, 200×g，2 min，4℃에서 원심을 행하였다. 원심 후 상청을 제거하고, 4% PFA/PBS(-)를 200 ㎕/tube 첨가하여 가볍게 현탁하고, 실온에서 15 min 반응시켰다. 15 분 후 200×g，2 min，4℃에서 원심을 행하였다. 원심 후 상청을 제거하고, 1 ㎍/㎖ 비스벤즈이미드/PBS(-)를 200 ㎕/tube 첨가하여 가볍게 현탁하고, 실온에서 15 min 반응시켰다(핵 염색). 15 min 후 200×g，2 min，4℃에서 원심을 행하였다. 원심 후 상청액을 제거하고, cold PBS(-)를 200 ㎕/tube 첨가하여 가볍게 현탁하였다. 현탁 후 200×g，2 min，4℃에서 원심을 행하였다. 원심 후 상청액을 제거하고, cold PBS(-)를 200 ㎕/tube 첨가하여 가볍게 현탁하고, 전량을 8 웰 챔버 플레이트로 옮겼다. 그 후 공초점 레이저 스캔 현미경 LSM510으로 흡수된 형광을 관찰하였다.
그 결과, hLF 및 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 4℃ 조건하에서는 Caco2 세포로 흡수되지 않으나(도 19a), 37℃ 조건하에서는 Caco2 세포로 흡수되어 있는 것이 확인되었다(도 19b). 또한 37℃에 있어서의 흡수는 NaN3(도 19c) 및 과잉량의 미표지 소 락토페린(bLF)(도 19d)으로 저해되었기 때문에, 이 세포 내 흡수는 수용체 개재성으로, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 LF의 흡수 루트로 세포 내에 흡수되는 것이 확인되었다. 즉, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 락토페린 수용체, IgG 수용체 또는 알부민 수용체 중 어느 하나 이상의 수용체를 매개로 흡수되는 것으로 생각된다.
2. 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)의 키모트립신 소화성 평가
본 실험에서 사용한 Buffer는 표 7과 같이 조제한 후, pH를 7.4로 조정하였다.
Figure pct00008
hLF나 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 1 ㎎/㎖가 되도록 본 Buffer에 서스펜드하였다.
［소화효소 내성 시험］
150 ㎕의 1 ㎎/㎖ hLF 또는 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)을 Buffer 120 ㎕와 혼합하여 37℃에서 5분간 정치하였다. 그 후 16.7 ㎍/㎖의 키모트립신 용액 30 ㎕를 첨가하여 37℃에서 정치 반응하였다. 경시적으로 반응 샘플 36 ㎕를 회수하고, 사전에 준비해 둔 Sample Buffer(0.1M Tris-HCl(pH 6.8), 4% SDS, 20% Glycerol, BPB 소량) 12 ㎕에 첨가하여 소화반응을 정지시켰다. 그 후 반응액은 10% SDS-PAGE로 영동 후(15 ㎕/레인 사용), CBB 염색하였다.
왼쪽부터 순서대로 분자량 마커, hLF의 키모트립신을 첨가하지 않고 37℃에서 정치 반응시킨 샘플, hLF의 키모트립신을 첨가하여 37℃에서 정치 반응시킨 샘플, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)의 키모트립신을 첨가하지 않고 37℃에서 정치 반응시킨 샘플, 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)의 키모트립신을 첨가하여 37℃에서 정치 반응시킨 샘플의 영동결과를 도 20에 나타낸다.
각 밴드의 농도를 ImageJ에 의해 해석하였다. 키모트립신을 첨가하지 않는 밴드 농도의 평균값을 100%로 하여 그래프화하였다(도 21). 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 거의 분해되지 않았으나, 대조인 hLF는 30초에서 분해가 일어나 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)의 키모트립신에 대한 소화 내성이 나타내어졌다.
또한 표 7에 나타내는 Buffer에 용해한 hLF 및 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)을 겔 칼럼크로마토그래피 분석한 바 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 호모다이머로서 존재하는 것을 알 수 있었다(도 22).
도 22 패널 B는 용출시간과 단백 분자량의 상관성을 나타내는 그래프이다. 크로마토그래프(도 22 패널 A)로, 청색 곡선(「hLF/dhIgG Fc」)은 2량체를 형성하기 위한 영역(힌지영역)을 포함하는 힌지 부가형 hLF/hIgG Fc 융합 단백질의 결과이다. 한편 녹색 곡선(「hLF/mhIgG Fc」)은 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)의 결과이다. hLF/mhIgG Fc 및 hLF/dhIgG Fc를 겔여과하면 양자의 용출시간에 거의 차가 없는 것이 판명되었다. 이 사실로부터 힌지 결손형 융합 단백질(hLF/mhIgG Fc)은 용액 중에서는 다이머를 형성하고 있는 것이 나타내어졌다.
본 발명은 개량된 특성을 갖는 락토페린 융합 단백질, 그의 용도 및 그의 제조방법을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> NRL PHARMA, INC. <120> Lactoferrin-Fusion Protein and Method for Producing the Same <130> PCT13-0023 <150> JP 2012-098085 <151> 2012-04-23 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer S_LFex_XhoI_ATG <400> 1 ctcgagatga aacttgtctt cctcgtc 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AS_LFex_TAA _XbaI <400> 2 tctagattac ttcctgagga attcac 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 aattcctcag gaaggatcct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 ctagaggatc cttcctgagg 20 <210> 5 <211> 946 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hLF-hFc (Hinge-CH2-CH3) <400> 5 Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 20 25 30 Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 35 40 45 Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 50 55 60 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 65 70 75 80 Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 85 90 95 Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 115 120 125 Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 130 135 140 Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 165 170 175 Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 180 185 190 Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 195 200 205 Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 210 215 220 Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 245 250 255 Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 260 265 270 His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 275 280 285 Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 290 295 300 Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320 Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 355 360 365 Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 370 375 380 Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 385 390 395 400 Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 405 410 415 Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430 Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 435 440 445 Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 450 455 460 Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 485 490 495 Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 500 505 510 Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 515 520 525 Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 530 535 540 Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 545 550 555 560 Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 565 570 575 Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 580 585 590 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 595 600 605 Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 610 615 620 Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 625 630 635 640 Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 645 650 655 Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 660 665 670 Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 675 680 685 Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 690 695 700 Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys Asp Pro Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp 705 710 715 720 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 725 730 735 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 740 745 750 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 755 760 765 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 770 775 780 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 785 790 795 800 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 805 810 815 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 820 825 830 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 835 840 845 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 850 855 860 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 865 870 875 880 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 885 890 895 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 900 905 910 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 915 920 925 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 930 935 940 Gly Lys 945 <210> 6 <211> 930 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hLF-hFc (CH2-CH3) <400> 6 Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 20 25 30 Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 35 40 45 Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 50 55 60 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 65 70 75 80 Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 85 90 95 Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 115 120 125 Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 130 135 140 Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 165 170 175 Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 180 185 190 Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 195 200 205 Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 210 215 220 Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 245 250 255 Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 260 265 270 His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 275 280 285 Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 290 295 300 Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320 Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 355 360 365 Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 370 375 380 Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 385 390 395 400 Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 405 410 415 Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430 Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 435 440 445 Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 450 455 460 Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 485 490 495 Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 500 505 510 Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 515 520 525 Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 530 535 540 Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 545 550 555 560 Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 565 570 575 Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 580 585 590 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 595 600 605 Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 610 615 620 Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 625 630 635 640 Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 645 650 655 Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 660 665 670 Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 675 680 685 Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 690 695 700 Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys Asp Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 705 710 715 720 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 725 730 735 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 740 745 750 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 755 760 765 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 770 775 780 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 785 790 795 800 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 805 810 815 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 820 825 830 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 835 840 845 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 850 855 860 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 865 870 875 880 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 885 890 895 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 900 905 910 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 915 920 925 Gly Lys 930

Claims (15)

  1. FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드와 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드의 융합 단백질로서,
    Figure pct00009

    〔식중, LF는 락토페린 또는 락토페린의 생물활성 단편 또는 펩티드, Y는 FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드, s는 0~10개의 임의의 아미노산의 서열, n은 1~10의 정수를 나타낸다〕
    으로 표시되는 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  2. 제1항에 있어서,
    FcRn 결합영역을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 IgG, IgG의 중쇄, IgG의 중쇄 Fc영역, Fc영역의 CH2 도메인 및 CH3 도메인, Fc영역의 CH2 도메인, 알부민 또는 알부민의 FcRn 결합영역 중 어느 하나를 포함하는, 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    융합 단백질이 단량체 또는 2량체(n=1 또는 2)인 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    융합 단백질이 단량체인 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 천연 또는 유전자 재조합형 락토페린의 50% 이상의 철킬레이트능을 유지하고 있는 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질은 락토페린 수용체, IgG 수용체 및 알부민 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 수용체를 매개로 흡수되는 것인 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질은 천연 또는 유전자 재조합형 락토페린과 비교하여 키모트립신 내성이 향상된 것인 융합 단백질 또는 그의 개변체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체를 코드하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주세포.
  11. 제8항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 비인간 유전자 재조합 동물.
  12. 제8항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 유전자 재조합 식물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체를 포함하는, 락토페린에 의해 개선되는 질환의 치료제.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체 및 담체를 포함하는 의약품 조성물.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 그의 개변체의 제조방법으로서, 이 융합 단백질 또는 그의 개변체를 코드하는 유전자를 포함하는 숙주세포를 배양하여 융합 단백질을 발현시키고, 이 숙주세포 또는 그의 배지로부터 융합 단백질 또는 그의 개변체를 회수하는 것을 포함하는 방법.
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