KR20070085224A - Ｇｌｐ-1을 포함하는 트랜스페린 융합 단백질을 사용하는혼합 요법 - Google Patents
Ｇｌｐ-1을 포함하는 트랜스페린 융합 단백질을 사용하는혼합 요법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 트랜스페린 융합 단백질 및 DPP-IV 억제제 및/또는 중성 엔도펩티다아제(NEP) 억제제를 포함하는 혼합 요법을 제공한다. 트랜스페린 융합 단백질은 당뇨병과 같은 질병의 치료에 효과적인 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다.
트랜스페린 융합 단백질
Description
본 출원은 전문이 참조로 포함된 2004년 8월3일에 출원된 미국 가출원 60/598,031의 우선권을 주장합니다.
본 출원은 전문이 참조로 포함된 2003년 3월4일에 출원된 미국출원10/378,094의 일부계속출원인 2003년 8월28일에 출원된 PCT/US03/26818의 일부계속출원에 관한 것이다.
본 발명은 생체내에서 증가된 유효한 치료 반감기를 가진 인슐린분비 펩타이드를 포함하는 트랜스페린 융합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 DPP-IV 억제제 및/또는 중성 엔도펩티다아제 억제제(NEP) 및 인슐린분비 펩타이드를 사용하는 혼합 용법에 관한 것이다.
프로테아제
단백질 가수분해 효소는 단백질 전환의 제어 및 가공에 의한 세포 확산, 분화 및 신호화 과정과 같은 생리적 과정을 제어하는데 중요한 역할을 한다. 단백질 가수분해 효소는 단배질 분해를 통해 중요한 구조 단백질, 효소 및 조절 단백질의 레벨을 제어한다. 증가 또는 감소된 제어되지 않은 단백질 효소 활성은 염증, 암, 동맥경화 및 퇴행성 질환을 포함하는 다양한 질병과 관련이 있다.
국제생화학연맹(IUBMB)은 펩타이드 결합 가수분해효소의 세브셋에 대해 "펩타다제"의 사용을 권고하였다(서브클래스 E.C 3.4). 널리 사용되는 용어 프로테아제는 펩티다아제와 동의어이다. 펩티다아제는 두 그룹의 효소: 단백질 내의 지점에 펩타이드 결합을 절단하여 각각 N 또는 C-말단기로부터 연속적으로 아미노산을 제거하는 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제를 포함한다. 프로테아제라는 용어는 엔도펩티다아제와 동의어이다. 단백질 분해효소는 이들의 효소 작용에 따라 분류된다. 네가지 작용 분류는 IUBMB에 의해 승인되었다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파라틱 프로테아제 및 메탈로프로테아제.
세린 프로테아제는 단백질 분해에 대한 활성 촉매 부위에 세린 잔기를 포함하는 단백질 분해효소의 큰 집단이다. 이들은 도체 존재하여 바이러스, 박테리아, 및 진핵생물에서 발견된다. 세린 프로테아제는 넓은 범위의 기질 특이성을 가지며 이런 특이성을 기초로 하부 집단으로 나눌 수 있다. 6개의 클랜(SA, SB, SC, SE, SF 및 SG)으로 분류된 20개 이상의 하부집단의 세린 프로테아제가 있다.
프롤일 올리고펩티다아제는 SC 클랜에 분류된 세린 프로테아제이다. 이것은 프롤린 잔기의 카복실기에 펩티들 함유하는 프롤린을 가수분해한다. 생각건대, 펩타이드 호르몬과 뉴로펩타이드의 성숙과 분해에 관여한다(Wilk et al. 1983 Life Sci. 33, 2149-2157). 프롤일 올리고펩티다제의 예들은 다이펩티딜 펩티다아제 IV(DPP-IV), 다이펩티딜 펩티다아제 II(DPP-II), 섬유아세포 활성 단백질 및 프롤일 올리고펩티다아제를 포함한다. 이런 효소들은 분명한 특이성을 가진다.
프롤린은 수많은 펩타이드 호르몬에 존재한다. 프롤린은 이런 펩타이드의 형상과 안정성과 같은 펩타이드의 소정의 구조 특성을 결정하여, 비특이적 프로테아제에 의한 분해를 예방한다. 프롤린 결합을 공격하는 여러 펩티다아제가 존재한다. 이런 펩티다아제는 X-Pro 또는 Pro-X 결합의 절단에 관여하는 것뿐만 아니라, 상응하는 알란일 결합의 분해에 관여하여, 활성을 감소시킨다. 프롤린-함유 서열에 매우 특이적인 작용을 갖는 펩티다아제는 이들의 일부가 천연 펩타이드 기질의 생화학적 활성의 변형과 관련이 있기 때문에 의약 화학의 매력적인 목표가 된다. 예를 들어, DPP-IV는 글루타콘-유사 펩타이드-1(GLP-1)의 레벨 제어를 통해 당뇨병의 치료와 관련이 있다. DPP-IV 활성은 류마티스 관절염, 그레이브스병 및 하시모토 갑상선염, 사르코이드증 및 암과 같은 다양한 질환에서 증가한다. DPP-IV 활성은 또한 AIDS, 다운증후군, 식욕부진/병적 과식욕, 임신과 저감마글로블린혈증에서 증가한다.
DPP
-
IV
를 포함하는
다이펩티딜
펩티다아제
다이펩티딜 아미노펩티다아제 활성은 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질의 N-말단기로부터 다이펩타이드의 제거를 촉매화하는 펩티다아제 활성이다. 일반적으로, 다이펩티딜 아미노펩티다아제는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 비치환된 N-말단 아미노기로부터 다이펩타이드 XY를 분해할 수 있고, X 및 Y는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다. 다이펩티딜 펩티다아제(DPPs)의 예들은 다이펩티딜 펩티다아제 I(DPP-I), 다이펩티딜 펩티다아제 II(DPP-II), 다이펩티딜 펩티다아제 III(DPP-III) 및 다이펩티딜 펩티다아제 IV(DPP-IV)를 포함한다.
케탭신 C로 알려진 DPP-I는 대부분 조직에서 발현되는 리소좀 시스테인 프로테아제이다. DPP-I는 활성된 세포독성 림프구의 과립에 배타적으로 발현된 중성 세린 프로테아제인 그랜자임(granzyme)의 처리에 관여한다. DPP-II는 리소좀에서 발견된 세린 프로테아제이다. DPP-IV와 같이, DPP-II는 펩타이드 결합을 함유하는 프롤린을 분해한다. 사실상, DPP-II는 DPP-IV에 대해 유사한 기질 특이성을 가지나 산성 pH에서만 활성이 있다. 다이펩티딜 펩티다아제 III(DPP-III)는 메탈로프로테아제이다.
DPP-IV는 세린 프로테아제 모티프 GWSYG를 포함하고 넓은 기질 특이성을 가진 세린 프로테아제이다. DPP-IV는 아미노산 말단기로부터 서열에 있는 펩타이드를 가수분해하여 아미노산을 제거한다. 그러나, 가수분해는 프롤린 뒤에 오는 아미노산 잔기에 도달할 때 종료된다. 그 결과, X-Pro-Y-(X 및 Y는 선택적 아미노산이다)의 결합을 가진 펩타이드는 분해되어 X-Pro 및 Y-를 생산한다. DPP-IV는 비록 프롤린을 가진 다이펩타이드보다는 덜 효과적이지만, 끝에서 두 번째 위치에 알라닌을 가진 다이펩타이드를 분해할 것이다(Yaron et al., 1993 Crit. Rev. Biochem. Mol.Biol.28:31-81). 효소는 다른 서열을 분해할 것이지만, 효율은 더 낮다.
DPP-IV는 펩타이드 기질의 N-말단 서열의 끝에서 두 번째 위치에 프롤린 또는 알라닌을 가진 생물학적으로 활성인 펩타이드의 N-말단기로부터 다이펩타이드를 분리하는데 매우 특이적인 것으로 나타냈다. DPP-IV에 대한 많은 수의 잠재적 펩타이드 기질이 동정되었다. DPP-IV 기질들은 펩타이드 호르몬과 케모카인을 포함한다. 일부 펩타이드 호르몬의 예들은 엔도모르핀-2, GLP-1, GLP-2, 이자 억제 펩타 이드(GIP), 뉴로펩타이드 Y, 성장 호르몬 배출 호르몬(GHRH) 및 기질 P이고 일부 케모카인의 예들은 RANTES, GCP-2, SDF-1α, SDF-2β, MDC, MCP-1, MCP-2 및 MCP-3이다. DPP-II는 DPP-IV에 대해 거의 동일한 기질 특이성을 가진다.
DPP
-
IV
및 당뇨병
인슐린-의존성 당뇨병(IDDM 또는 제 1 형 당뇨병)은 현재 환자에게 인슐린을 투여하여 치료한다. 인슐린-비의존성 당뇨병(NIDDM 또는 제 2 형 당뇨병)은 다이어트, 인슐린 분비를 자극하기 위한 설폰요소제(sulphonylurea)의 투여, 또는 당 흡수를 증가하기 위한 비구아니이드제(biguanide)로 치료한다. 인슐린 저항성인 사람은 인슐린 치료가 필요할 수 있다. 표준 치료법은 급성 증상을 치료할 인슐린의 일일 정맥 주사를 필요로 하나, 장기간의 치료는 심장 질환과 신경 손상을 초래한다. 장기 이식과 같은 현대적 방법들은 고가이고 위험한 수술을 필요로 한다. 따라서, 당뇨병 치료에 매우 효과적이고, 매우 저렴한 대체법을 개발할 필요가 있다.
최근에, 혈당의 레벨을 낮추기 위한 목표로 DPP-IV에 대한 관심이 증가하고 있다. 환자의 혈액에서 DPP-IV 효소 또는 DPP-IV-유사 효소 활성을 막기 위한 억제제의 사용은 GIP, GLP-1 또는 이의 유사체와 같은 내생적으로 또는 외생적으로 투여된 인슐린분비 펩타이드의 분해를 감소시킨다. 췌장에 의한 인슐린의 당-유발 분비를 자극하는 호르몬인 GIP 및 GLP-1는 DPP-IV의 기질이다. 구체적으로, DPP-IV는 GLP-1의 아미노-말단 His-Ala 다이펩타이드를 제거하여 랑게르한스섬으로부터 당-의존성 인슐린 분비를 일으킬 수 있는 GLP-1-(9-36)을 발생시키기 때문에, 생체내에서 이런 DPP-IV 또는 DPP-IV-유사 효소 활성의 억제는 포유류 유기체에서 병리적 상태에서 원치 않는 효소 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.
PCT/DE97/00820은 DPP-IV 또는 DPP-IV-유사 효소의 억제제로서 알라닐 파이롤리디드와 아이소루실 티아졸리디드를 개시한다. DD296075는 파이롤리디드와 염화 아이소루실 티아졸리디드를 개시한다. 미국특허 제 6,548,481호는 아미노산 및 티아졸리딘 또는 파이롤리딘 그룹 및 이의 염으로부터 형성된 다이펩타이드와 유사한 억제제를 개시한다. 비록 이들은 DPP-IV 활성의 기능성 억제제이지만, 특정 환자 또는 특정 형태의 질환에서 이런 억제제들을 사용하면 문제가 될 수 있는데, 이는 효소는 이런 넓은 범위의 생체활성 펩타이드의 활성화 또는 비활성화에 원인이 되기 때문인데, 즉, DPP-IV는 원하는 표적 GIP 및 GLP-1에 대한 특이성이 부족하다.
변형에 의한 치료 펩타이드의 보호
GIP 또는 GLP-1와 같은 치료 단백질 및 펩타이드가 단백질분해효소에 의해 분해되는 것을 막는 다른 방법은 단백질과 펩타이드 자체를 변형시켜 단백질분해효소에 노출되는 것을 막는 것이다. 단백질 변형은 치료 단백질의 안정성, 순환 시간 및 생물학적 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 아미노산과 펩타이드를 변형하는 일부의 일반적인 방법은 본 명세서에 참조로 포함된 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins -- A Survey of Recent Development(Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, Inc., publ., New York 1983)에 개시된다. 또한, 프랜시스의 리뷰 논문(1992 Focus on Growth Factors 3:4-10,(Mediscript, London))은 단백질 변형과 융합 단백질을 개시하며, 참조로 본 명세서에 포함된다.
재조합 DNA 기술과 자동화 기술의 발전에 따라, 누구나 쉽게 짧고, 중간이고 또는 긴 다량의 변형 폴리펩타이드를 쉽게 제조할 수 있다. 많은 수의 변형된 소형 폴리펩타이드 호르몬은 자동 펩타이드 합성기, 고체상 수지 기술 또는 재조합 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 다량의 다이펩티딜 펩티다아제의 변형 기질, 예를 들어, GLP-1, GIP, 뉴로펩타이드, Y 및 브라디키닌과 같은 DPP-IV의 기질은 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명은 프로테아제 분해에 민감한 치료 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 트랜스페린 융합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 프로테아제 분해에 민감하고, 저항성이 있고 또는 부분적으로 저항성이 있는 치료 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 트랜스페린 융합 단백질을 제공한다. 프로테아제는 DPP-IV 또는 중성 엔도펩티다아제(NEP)일 수 있다. 또한, 본 발명은 트랜스페린 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하고 DPP-IV 및/또는 NEP의 억제제에 한정되지 않는 보조제를 제공한다. 또한, 조성물은 다양한 질환의 치료에 사용되는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명은 다양한 질환의 치료에 트랜스페린 융합 단백질 및 적어도 하나의 보조제를 투여하는 것을 포함하는 혼합 요법을 제공한다. 트랜스페린 융합 단백질은 하나 이상의 보조제와 동시에 투여할 수 있다. 선택적으로, 트랜스페린 융합 단백질은 보조제의 투여 전 또는 후에 연속적으로 투여된다. 바람직하게는, 보조제는 DPP-IV 또는 NEP의 억제제이다.
본 발명의 GLP-1 펩타이드는 DPP-IV 분해와 같은 프로테아제 분해에 부분적으로 또는 완전히 저항성이 있도록 하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. GLP-1 펩타이드는 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:32) 또는 GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)일 수 있다. 예를 들어, 이런 펩타이드는 A8 내지 G 및/또는 K34A을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
도 1은 pREX0094의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 2는 플라스미드 pREX0198의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 3은 pSAC35의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 4는 플라스미드 pREX0240의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 5는 pREX0052의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 6은 pREX0367의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 7은 pREX0368의 제한 효소 지도를 도시한다.
도 8은 GLP-1 및 H-GLP-1 및 DPP-IV의 배양의 시간 코스를 도시한다. 그래프는 활성 GLP-1에 특이적인 ELISA에 의해 측정된 것처럼 잔존하는 활성 전장 펩타이드의 양을 도시한다.
1. 일반적 설명
본 발명은 당뇨병 치료에 대한 더욱 효과적이고, 저렴한 대체 방법을 개발할 필요에 부분적으로 기초한다. GLP-1과 같은 인슐린분비 펩타이드는 제 2 형 인슐린 비의존성 당뇨병뿐만 아니라 선당뇨병, 대사증후군 및 비만과 같은 관련 대사 질환 의 치료에 유망한 치료제이다. 다른 유용한 인슐린분비 펩타이드들은 엑센딘 3 및 엑센딘 4를 포함한다. 그러나, 이런 인슐린분비 펩타이드는 주로 빠른 혈청 제거와 단백질 분해 때문에 생체내에서 짧은 혈장 반감기를 가진다. GLP-1의 분해에 원인이 되는 효소인 DPP-IV를 억제하고 또는 생물학적 활성을 유지하면서 분해를 늦추는 것과 같은 방식으로 GLP-1를 변형하기 위한 막대한 연구가 수행되었다. 이런 막대한 연구에도 불구하고, 장시간 지속되는 활성 GLP-1를 생산하기 못했다. 따라서, 생체내에서 더 오랫동안 작용하면서 낮은 독성과 치료 장점을 유지하도록 하기 위해 GLP-1, 엑센딘 3, 엑센딘 4 및 다른 인슐린분비 펩타이드에 대한 변형이 필요하다.
2. 정의
본 명세서에 사용된 "유도체"라는 용어는 효소를 사용하거나 사용하지 않은 화학적 수단, 예를 들어, 알킬화, 아실화, 에스터 형성 또는 아마이드 형성에 의해 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "로부터 유도된"이란 용어는 모분자로부터 분자를 얻는 것과 같이 특정 소스로부터 분자를 얻는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "다이펩디딜 아미노펩티다아제 활성"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열의 N-말단으로부터 다이펩타이드를 분해하는 펩티다아제 활성을 의미한다. 일반적으로, 다이펩티딜 아미노펩티다아제는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 비치환 N-말단 아미노기로부터 다이펩타이드 XY를 분해할 수 있는데, X 또는 Y는 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹, 그러나 적어도 Ala, Arg, Asp 및/또는 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 바람직하게는, Y는 Pro 또는 Ala이다. 모든 X 및 Y는 다르거나 같을 수 있다. 다이펩디딜 아미노펩티다아제의 예들은 DPP-I, DPP-II, DPP-III 및 DPP-IV를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "글루카콘-유사 펩타이드-1(GLP-1)" 및 "GLP-1 유도체"라는 용어는 고혈당 현상이 일어나는 동안 인슐린 분비를 일반적으로 자극하고 글루카곤 분비를 억제하고, (프로)인슐린 생체합성을 자극하고 위 배출과 산 분비를 감소시키는 장 호르몬을 의미한다. 일부 GLP-1 및 GLP-1 유도체는 세포에 의한 당 흡수를 향상시키나 본 명세서에 참조로 포함된 미국 특허 제 5,574,008호에 개시된 것처럼 인슐린 발현을 자극하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "인슐린분비 펩타이드"라는 용어는 인슐린분비활성을 가진 펩타이드를 의미한다. 인슐린분비 펩타이드는 호르몬 인슐린의 자극, 합성 또는 발현을 자극하거나 일으킨다. 이런 펩타이드는 글라카곤-유사 펩타이드 1, 엑센딘 3 및 엑센딘 4와 같은 펩타이드 및 인슐린분비활성을 가진 다른 펩타이드의 전구체, 유사체, 절편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 사람에게 투여되었을 때 생리적으로 견딜 수 있고 통상적으로 위장 전도, 현기증 등과 같은 알레르기성 또는 유사한 부반응을 일으키지 않는 재료 및 조성물을 의미한다. 통상적으로, 본 명세서에 사용된 "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 동물, 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 감독국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "약학적 조성물"은 필요할 때 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 물질을 포함하는 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 첨가제는 약학적 화합물의 부작용이 최소화되고 화합물의 효능이 치료가 효과가 없을 정도로 사라지거나 억제되지 않도록 선택된다.
본 명세서에 사용된 "생리적으로 유효한 양"이란 용어는 원하는 완화 또는 치료 효과를 나타내도록 환자에 전달되는 양이다. 이런 양은 각 약물 및 이의 최대 승인 복용량 레벨에 대해 특이적이다.
본 명세서에 사용된 "치료적으로 유효한 양"이란 용어는 필요한 환자에게 투여될 때, 치료 효과를 나타내는데 충분한 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 양을 의미한다. "치료적으로 유효한 양"을 구성하는 변형 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 양은 사용된 치료 단백질. 질환 또는 질병의 심각성 및 치료할 환자의 나이 및 체중에 따라 변할 것이고, 자신의 지식과 상세한 설명에 대한 당업자들의 하나에 의해 일반적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "치료 단백질"은 하나 이상의 치료적 및/또는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 펩타이드 또는 절편 또는 이들의 변형체를 의미한다. 본 발명에 포함되는 치료적 단백질은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체 및 생물학적 약제를 의미하나 이에 한정되지 않는다. 용어 펩타이드, 단백질 및 폴리펩타이드는 본 명세서에서 교환해서 사용된다. 또한, 용어 "치료 단 백질"은 치료 단백질의 내인성 또는 자연적으로 발생하는 상관물(correlate)을 의미한다. "치료 활성"을 나타내는 폴리펩타이드 또는 "치료적으로 활성"인 단백질 또는 "치료적으로 활성"인 단백질은 본 명세서에 기술되거나 당해기술분야에서 공지된 하나 이상의 치료 단백질과 같은 치료 단백질과 관련된 하나 이상의 공지된 생물학적 및/또는 치료적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 한정하지 않는 실시예로서, "치료 단백질"은 질병, 질환 또는 질환을 치료, 예방 또는 완화하는데 유용한 단백질이다. 이런 질병, 질환 또는 질환은 인간 또는 수의과 사용과 같은 비-인간 동물에 있을 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료" 또는 "처리"라는 용어는 질병이 본 발명의 화합물의 투여를 의미하고 다음을 포함한다: (1) 병에 걸리기 쉬우나 질병의 병변 또는 증후를 아직 경험하지 않거나 나타내지 않는 동물에서 발생하는 것을 막는 단계; (2) 질병의 병변 또는 증후를 경험하고 나타내는 동물에서 질병을 억제하는 단계(즉, 병변 및/또는 증후의 추가 발전을 정지시킴); 또는 (3) 질병의 병변 또는 증후를 경험하고 나타내는 동물에서 질병을 완화하는 단계(즉, 병변 및/또는 증후를 후퇴시킴).
본 명세서에 사용된 "생물학적 활성"은 생물학적 작용을 매개하는 능력을 의미한다. "생물학적 활성"은 기능적 활성뿐만 아니라 구조적 활성을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "완화"라는 용어는 치료에 영향을 미치지 않으며 질환 또는 질병의 증상을 감소 또는 완화하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 질병 또는 질환을 치료하지 않으며 통증을 완화하는 물질이 완화제이다.
본 명세서에 사용된 "예방"이라는 용어는 질환 또는 질병에 대항하거나 막는 작용과 같은 보호 효과를 가지는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "정제된" 단백질 또는 핵산이란 용어는 세포 성분으로부터 분리된 단백질 또는 핵산을 의미한다. "정제된" 단백질 또는 핵산은 자연에서 발견되지 않는 순도의 레벨로 정제된다.
본 명세서에 사용된 "실질적으로 순수한" 단백질 또는 핵산은 모든 다른 세포 성분에서 부족한 단백질 또는 핵산 제제를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "치료적"이란 용어는 치료, 재생 또는 개선 효과를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, "치료제" 또는 "치료 조성물"은 치료 효과를 가진다.
3. 특정
실시예
다이펩티딜
펩티다아제
다이펩티딜 펩티다아제는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 비치환된 N-말단 아미노기로부터 다이펩타이드를 제거하는 가수분해효소이다. 다이펩티딜 펩타다아제의 예는 DDP-I, DPP-II, DPP-III, DPP-IV, 아트락틴(attractin) 및 섬유아세포 활성 단백질(FAP)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 종류 또는 다른 구조를 가지나 동일한 기능을 가진 새로운 효소가 발생하고 있다.
케탭신 C로 알려진 다이펩티딜 펩티다아제 I(DPP-I)는 파파인과에 속하는 리소좀 시스테인 프로테아제이다. DPP-I는 다양한 펩타이드와 기질의 자유 아미노 말단기로부터 다이펩타이드를 연속적으로 제거하여, 엑소펩티다아제(구체적으로 다이펩티딜 펩티다아제)모드로 작용한다. 만일 절편 결합이 프롤린 잔기의 각각에 있거 나 N-말단 잔기가 리신 또는 아르기닌인 경우 분해는 효과적이지 못하다.
DPP-II는 공지되지 않은 기능을 가진 리소좀에서 발견된 세린 프로테아제이다. DPP-IV와 같이, DPP-II는 펩타이드 결합을 함유하는 프로린을 주로 분해한다. 사실상, DPP-II는 DPP-IV에 대한 유사한 기질 특이성을 가지나 단지 산성 pH에서만 활성이다. 포유류 DPP-II 및 DPP-IV는 억제제인 프로마이신과 바시트라신을 사용하여 구별할 수 있다; 프로마이신은 DPP-II만 억제하는 반면 바시트라신은 DPP-IV만 억제할 것이다(1988 J. Biol. Chem. 263, 6613-6618). 다이펩티딜 펩티다아제 III(DPP-III)는 금속프로테아제이다. DPP-V는 N-말단 X-Ala, His-Ser 및 Ser-Tyr 다이펩타이드를 배출한다.
정지세포 프롤린 다이펩티다아제로 알려진 DPP-VII는 프롤린-특이적 다이펩티다아제이다. DPP-VII 및 DPP-II는 인간 DPP-VII 및 쥐 DPP-II의 서열 비교(78% 상동성)를 기초로 하여 동일한 프로테아제이다(Araki et al. 2001 J. Biochem. 129, 279-288)
DPP-VIII는 DPP-IV 및 FAP와 동일한 인간 포스트프롤린 다이펩티딜 아미노펩티다아제이다(Abbott, C.A. et al., 2000 European Journal of Biochemistry 267, 6140). DPP-IV와 유사한 DPP-III는 편재되어 있다. 전장 DPP-VIII cDNA는 DPP-IV 및 FAP와 약 27% 동일성과 51% 유사성을 가지나 막투과 도메인이 없고 N-연결 또는 O-연결 당화가 없는 882-아미노산 단백질을 암호화한다. 정제된 재조합 DPP-VIII는 DPP-IV 기질 Ala-Pro, Arg-Pro 및 Gly-Pro를 가수분해하였다. 따라서 재조합 DPP-VIII는 포스트프롤린 다이펩티딜 아미노펩티다아제 활성을 DPP-IV 및 FAP와 공유한 다. DPP-VIII 효소 활성은 비리소좀성이 되는 것과 일치하는 중성 pH 최적조건을 가졌다. 조직 발현 패턴과 기질에서 DPP-VII와 DPP-IV 사이의 유사성들은 T-세포 활성화에 잠재적 역할과 DPP-IV와 유사한 면역 기능을 나타낸다.
올슬렌 C. 등(2002 Gene 299, 185-93)은 다이펩티딜 펩티다아제-유사 단백질 DPP-IX로 불리는 신규 DPP-IV-유사 분자의 동정과 특징을 보고한다. DPP-IV와 같이, DPP-IX는 세린 프로테아제 모티프 GWSYG(SEQ ID NO:110)을 포함한다. 이런 모티프 및 DPP-IV에 촉매 3가 원소를 형성하는 Ser, Asp 및 His 잔기의 보존 순서와 간격의 존재 때문에 DPP-IX를 DPP-IV 유전자 과에 속하게 한다.
아트락신(DPPT-L)은 Gly-Pro를 가수분해하는 것으로 보고된 174-kDa 가용성 당단백질이다. 아트락신은 켈치 반복 도메인(kelch repeat domain)을 포함하며 DPP-IV 또는 다른 폴리펩티다아제와 현저한 서열 상동성을 공유하지 않는다. 섬유아세포 활성 단백질(FAP)는 조직 리모델링의 위치에서 발현되는 프로일 올리고펩티다아제 유전자 과의 세포 표면 결합 프로테아제이다.
프롤린 올리고펩티다아제(PO)로 불리는 프로일 엔도펩티다아제(PEP)는 왈터와 동료에 의해 인간 자궁에서 옥시토신-분해 효소로 처음 발견되었다(Walter et al., Science 173, 827-829(1971)). 효소는 서열 X-Pro-Y를 함유하는 펩타이드에서 프롤린의 카복시 부분에 있는 펩타이드 결합을 분해하는데, 상기 서열에서 X는 펩타이드 또는 N-말단 치환 아미노산이고 Y는 펩타이드, 아미노산, 아마이드 또는 알콜이다(Yoshimoto et al., J. Biol. Chem. 253, 3708-3716(1979)). 효소는 프롤린의 이미노 부분에 있는 펩타이드 결합의 트랜스-형태에 대해 높은 특이성을 가진 다(Lin & Brandts, Biochemistry 22, 4480-4485(1983)).
프로일 올리고펩티다아제는 안지오텐신(1-7)의 배출을 일으키는 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II를 가수분해한다. 안지오텐신(1-7)은 혈관확장제 활성을 가지며 바소프레신의 배출을 조절하고, 메모리의 쥐에 특이적 PEP 억제제를 주입하여 나타낸 것과 같이 기억 과정에 영향을 미칠 수 있다. 주사는 스코폴라민 유도 건망증을 호전시킨다. 이 실험은 효소에 대한 가능한 생리적 기능에 대한 증거를 제공할 뿐만 아니라, PEP는 기억 과정에 영향을 미치고, 치매를 치료할 수 있다는 가정에 이르게 한다(Yoshimoto et al. 1987 J. Pharmacobio-Dyn. 10, 730-735).
다이펩티딜
펩티다아제
(
DPP
-
IV
) 및 기질
DPP-IV는 여러 펩티다아제와 호르몬의 분해에 관여해온 편재하는 발현된 분자이다. 다양한 형태의 DPP-IV가 정제되었고 효소학적 특성이 밝혀졌다. 예를 들어, DPP-IV는 쥐 간(Hopsu-Havu V. K. et al., 1966 Histochem., 7:197-201), 돼지 신장(Barth A. et al., 1974 Biol. Med. Chem., 32:157-174), 소장(Svensson B. 1978 Eur. J. Biochem., 90:489-498), 간(Fukasawa K.M.et al. 1981 Biochim. Biophys. Acta, 657:179-189), 사람 턱밑샘(Oya H., et al., 1972 Biochem. Biophys. Acta, 258:591-599), 양 신장(Yoshimoto T. et al., 1977 Biochem. Biophys. Acta, 485:391-401; Yoshimoto T. et al., 1978 J. Biol. Chem., 253:3708-3716) 또는 미생물(Fukasawa K.M.et al. 1981 Biochim. Biophys., 210:230-237; Yoshimoto T. 1982 J. Biochem., 91:1899-1906(1982))로부터 분리되었다.
인간 면역 시스템에서, DPP-IV는 활성 림프구(T-, B-, 및 천연 킬러 세포)에 의해 발현되는 T-세포 표면 항원 CD26과 동일하다. CD26/DPP-IV는 고유 다이펩티딜 펩티다아제 IV 활성과 아데노신 탈아미노효소 제 1 형(ADA-1)과 결합하는 능력을 가진 제 2 형 막 당단백질이다. CD26/DPP-IV는 본질적으로 상피세포에서 발현되나, T 림프구에서는, 엄격한 세포성 제어하에서 발현되고, 발현은 세포 활성화에 따라 상향조절된다. CD26/DPP-IV는 세포외 도메인에서 다이펩티딜 펩티다아제 IV 활성을 나타내었고(Hegen et al., 1990 J. Immumol 144:2908-2914; Ulmer et al., 1990 Scand. J. Immunol. 31:429-435) 공자극 활성은 이 효소 활성에 부분적으로 의존하여 나타난다(Tanaka et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4586-4590). DPP-IV는 케모카인 기능의 제어에 관여하고 HIV 감염에 중요한 역할을 할 수 있다.
미국 특허 제 6,265,551호는 인간 혈청에서 분리된 순환하는,가용 형태의 DPP-IV/CD26를 개시한다. 혈청 형태는 편재하는 막 형태와 유사한 효소적 및 항원적 특성을 공유한다; 그러나, 여러 생화학적 태양에서, 뚜렷한 차이들이 있다. 특히, 순환하는 혈청 형태는 막 형태의 105kDa 분자량과 반대로, 175kDa의 분자량을 가지며, ADA-1과 결합하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 순환하는 형태는 기능성 다이펩티딜펩티다아제 IV 활성을 가지며 리콜 항원(recall antigen)에 대한 T 림프구를 공동자극하는 능력을 보유한다.
DPP-IV의 단백질분해 활성은 단백질의 C-말단에 위치한 대략 200개 아미노산의 범위에 존재한다. 촉매 잔기(Ser-629, Asp-708, His-740)은 키모트립신과 서브틸리신과 같은 전통적인 세린 프로테아제와 다른 독특한 순서로 배열된다. 프롤린 특이적 다이펩티딜 펩티다아제 활성은 다수의 생체활성 단백질과 다른 것들 중에서, GLP-1, 신경전달물질 P, 인간성장호르몬-배출 인자, 에리스로포이에틴, 인터루킨 2 및 여러 다른 것들을 포함하는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 변화시킨다. 유망한 DPP-IV 기질은 표 1, 2 및 3에 나열되어 있다. DPP-IV 분해에 영향을 미치는 이런 폴리펩타이드의 변형은 당뇨병, 염증, 심장질환, 자가면역질환, 다발성 경화증, 관절 질환 및 양성 및 악성 세포 변형과 관련된 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 임상 질환의 치료에 유용할 수 있다.
| 폴리펩타이드 | SEQ ID NO : | N-말단 서열 |
| 인터루킨-1. 베타 | 1 | Ala-Pro-Val-Arg-Ser- |
| 인터루킨-2 | 2 | Ala-Pro-Thr-Ser-Ser- |
| 인터루킨-5 | 3 | Ile-Pro-Thr-Glu-Ile- |
| 인터루킨-6 | 4 | Val-Pro-Gly-Gln-Gly- |
| 인터루킨-10 | 5 | Ser-Pro-Gly-Gln-Gly- |
| 인터루킨-13(재조합) | 6 | Ser-Pro-Gly-Pro-Val- |
| 보체 성분 C4a | 7 | Lys-Pro-Arg-Leu-Leu- |
| 과립구 화학주성 단백질 II | 8 | Gly-Pro-Val-Ser-Ala- |
| 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 | 9 | Ala-Pro-Ala-Arg-Ser- |
| 과립구 콜로니 자극 인자 | 10 | Thr-Pro-Leu-Gly-Pro- |
| 에리스리포이에틴 | 11 | Ala-Pro-Pro-Arg-Leu- |
| 이자 배출 펩타이드 성장 호르몬 | 12 | Phe-Pro-Thr-Ile-Pro- |
| 인터페론 유발 펩타이드 10(감마 IP10) | 13 | Val-Pro-Leu-Ser-Arg- |
| 인터페론 제어 인자 1(IRF-1) | 14 | Met-Pro-Ile-Thr-Leu- |
| 인터페론 제어 인자 2(IRF-2) | 15 | Met-Pro-Val-Glu-Arg |
| 인슐린-유사 성장 인자-1 | 16 | Gly-Pro-Glu-Thr-Leu- |
| 흑색종 성장 자극 활성 | 17 | Ala-Pro-Leu-Ala-Thr- |
| 이동 억제 인자 | 18 | Met-Pro-Met-Phe-Ile- |
| 단핵구 화학주성 단백질 I | 19 | Glu-Pro-Met-Phe-Ile- |
| 뉴로펩타이드 Y | 20 | Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro- |
| 췌장 폴리펩타이드 | 21 | Ala-Pro-Leu-Glu-Pro- |
| 펩타이드 YY | 22 | Try-Pro-Ile-Cys-Pro- |
| 프로락틴 | 23 | Leu-Pro-Ile-Cys-Pro- |
| RANTES | 24 | Ser-Pro-Tyr-Ser-Ser- |
| 폴리펩타이드 | SEQ ID NO : | N-말단 서열 |
| 물질 P | 25 | Arg-Pro-Lys-Pro-Gln- |
| 트롬보포이에틴 | 26 | Ser-Pro-Ala-Pro-Pro- |
| 변형 단백질(N-myc) 버전 1 | 27 | Met-Pro-Gly-Met-Ile- |
| 변형 단백질(N-myc) 버전 2 | 28 | Met-Pro-Ser-Cys-Ser- |
| 종양 괴사 인자. 베타. | 29 | Leu-Pro-Gly-Val-Leu- |
| 혈관 내피 성장 인자 | 30 | Ala-Pro-Met-Ala-Glu- |
| 아데노신 아미노분해효소 |
| 아넥신 |
| 유방 염기성 보존 단백질 |
| 코피린 |
| 천연 킬러 세포 강화 인자 b |
| α-인터페론의 전구체 |
| 인터루킨 1, α 및 1, β 및 인터루킨 13의 전구체 |
| 대식세포 염증 단백질-2-α및 2-β |
| 흑색종 자극 호르몬의 전구체 |
| 옥시토신-뉴로피신 1의 전구체 |
| 성장 호르몬 배출 호로몬 |
| β아밀로이드 단백질(1-28) |
| 흥분 펩타이드 |
| 프로-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin)의 결합 펩타이드 |
본 발명은 DPP 활성으로부터 기질을 보호하기 위해서 기질의 N-말단에 있는 하나 이상의 추가 아미노산을 포함하는 DPP의 변형 기질을 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 변형을 위한 바람직한 기질은 표 3(DPP-IV(CD26)분해를 위한 기질)에 개시하였다.
DPP
활성으로부터 보호되는 변형
폴리펩타이드
본 발명은 DPP 활성으로부터 폴리펩타이드 기질을 보호하기 위한 N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 포함하는 DPP의 변형 폴리펩타이드 기질과 같은 변형 폴리펩타이드를 제공한다. 한 실시예에서, 변형 폴리펩타이드는 자연형 폴리펩타이드와 비교하여 이들의 N-말단에 1개의 추가 아미노산을 가진다. 다른 실시예에서, 변형 폴리펩타이드는 이들의 N-말단에 5개의 추가 아미노산을 가진다. 선택적으로, 변형 폴리펩타이드는 N-말단에 1개 내지 5개 추가 아미노산을 가진다. 20개 아미노산들 중 어느 하나는 폴리펩타이드 기질의 N-말단에 첨가될 수 있고 또는 비천연 아미노산이 첨가될 수 있다.
투여 후에 순환에서 또는 생체내 어디에서 분해될 수 있는 펩타이드 결합을 가진 임의의 약학적 폴리펩타이드는 이는 본 발명에 의해 가능한 DPP 분해로부터의 보호 때문에, 본 발명에 따른 변형으로부터 이득을 얻을 수 있다.
본 발명의 태양에 따라, 다이펩티딜 펩티다아제 활성의 적어도 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%를 제거할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 다이펩티딜 아미노펩티다아제 활성을 완전히 제거하는 것이 가능하다.
마찬가지로, 다이펩티딜 펩티다아제 민감성의 적어도 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%를 제거할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 다이펩티딜 아미노펩티다아제 민감성을 완전히 제거하는 것이 가능하다.
비록 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 기질은 DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되지만, 변형 폴리펩타이드 기질은 이들의 기능적 활성 및 효력의 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70% 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 99%를 보유한다. 일부의 경우에, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 기질이 유용할 것이다. 예를 들어, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 증가된 혈청 안정성과 생체내 순환 반감기를 가진 융합 단백질을 형성하기 위해서, 트랜스페린과 같은 다른 폴리펩타이드와 융합될 때, 낮은 기능적 활성 또는 효능을 가진 변형 폴리펩타이드 기질이 사용될 수 있다.
다른 예에서, 변형된 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 비변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 비교하여 증가된 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 변형 폴리펩타이드 분자는 동일한 폴리펩타이드의 비변형 버젼과 비교하여 다이펩티딜 펩티다아제로부터 실질적으로 보호된다. 이런 실질적인 보호의 조건은 변형 대 비변형 폴리펩타이드를 비교하는데 사용하는 측정법에 의해 바뀔 수 있다. 그러나, 실질적인 보호를 나타내기 위해서, 변형 폴리펩타이드는 측정법에서 다이펩티딜 펩티다아제 분해에 대한 탐지가능한 레벨의 저항성을 나타낼 것이다. 이런 측정법은 도일 등(2002 Endocrinolgoy 142, 4462-4468), 오 하르트 등(1999, Diabetes 48, 758-765) 및 시겔 등(1999 Regulatory Peptides 79, 93-102)에 개시된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 DPP 안정화 폴리펩타이드 기질은 비안정화 폴리펩타이드 기질보다 생체내에서 DPP의 존재하에서 더욱 안정하다. DPP 안정화 치료 폴리펩타이드 기질은 일반적으로 동일한 서열의 비안정화 펩타이드와 비교하여 증가된 활성 반감기를 가진다. 펩티다아제 안정성은 혈청 또는 혈액에 있는 변형되지 않은 폴리펩타이드 기질의 반감기와 혈청 또는 혈액에 있는 변형된 대응하는 치료 펩타이드의 반감기를 비교하여 결정할 수 있다. 반감기는 변형 및 비변형 펩타이드를 투여한 후에 혈청 또는 혈액을 샘플링하고 펩타이드의 활성을 결정함으로써 결정할 수 있다. 활성을 결정하는 것 이외에, 폴리펩타이드 기질의 길이는 HPLC 또는 질량 분석기에 의해 측정할 수 있다.
또한 본 발명은 DPP 분해에 대해 보호하기 위해서 본 발명에 따라 변형된 아미노 말단기를 가지며 폴리펩타이드의 기능적 활성 또는 효능에 영향을 미치지 않는 내부 및/또는 C-말단 아미노산 변형을 갖는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제공한다. 비록 비보존성 치환을 고려할 수 있지만, 이런 변형 폴리펩타이드는 통상 보존성 아미노산 치환인 적은 아미노산 변화를 가질 수 있다.
본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 변형된 기능적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 증가된 기능적 활성을 가진 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 효과적일 수 있다. 선택적으로, 감소된 기능적 활성을 가진 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 기능적 활성 또는 효능에 영향을 미치지 않는 아미노산 변화를 포함한다. 예를 들어, 변형된 기능적 활성을 가진 GLP-1의 유사체는 DPP 분해에 대해 보호하기 위해 이의 아미노 말단에서 변형될 수 있다.
보존성 아미노산 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신,히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파라긴산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴 ), 소수성 아미노산(류신, 아이소류신, 발린), 방향족 아미노산(페닐아랄닌, 트립토판, 티로신) 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌)의 그룹 내의 동일한 그룹 내에 만들어진 치환이다.
비-보존성 치환은 다른 그룹의 아미노산에 의한 한 그룹에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 비-보존성 치환은 소수성 아미노산에 대한 극성 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 치환에 대한 일반적인 설명을 위해서는 포드 등(1991), Prot . Exp . Pur.2:95-107을 참조하기 바란다.
본 발명은 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 자연적으로 발생하는 성숙형, 폴리펩타이드의 대립 서열 변형체, 펩타이드의 자연적으로 발생하지 않는 재조합 유도 변형체 및 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 오르소로그(orthologs) 및 파라로그(paralogs)와 같은 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 아미노산 서열의 분명한 변형체를 제공한다. 이런 변형체들은 재조합 핵산 기술과 단백질 생화학 분야의 종래 기술을 사용하여 쉽게 제조할 수 있다. 이런 변형체들은 분자 기술과 서열 정보를 사용하여 쉽게 동정/제조할 수 있다. 또한, 이런 변형체들은 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 서열 및/또는 구조적 상동성을 기초로 하여 다른 펩타이드와 쉽게 구별될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 변형 펩타이드는 GLP-1이고 이들의 N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 포함하는 이의 유사체이다.
일부 예에서, DPP-IV와 같은 DPP는 분해를 통해 펩타이드를 불활성화하는 대신 활성화할 수 있다. 이런 예에서, 펩타이드의 변형은 펩타이드 활성화를 실질적으로 감소, 지연 또는 예방할 수 있다.
변형
폴리펩타이드를
암호화하는 핵산
본 발명은 DPP 분해로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되고 기능적 활성 및 효능을 가진 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자들을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명에 의해 제공된 핵산 분자들은 이들의 자연형인 변형되지 않은 폴리펩타이드와 비교하여 이의 N-말단에 적어도 하나의 아미노산을 가진 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드를 암호화한다. 다른 실시예에서, 핵산 분자들은 이들의 N-말단에 5개의 추가 아미노산을 갖는 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드를 암호화한다. 선택적으로, 핵산 분자들은 이들의 N-말단에 하나 내지 다섯 개의 아미노산을 가진 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드를 암호화한다. 바람직하게는, 변형 GLP-1를 암호화하는 핵산 분자는 이의 N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 암호화하는 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자들은 모두 단일-가닥 및 이중-가닥 디옥시리보핵산인 디옥시리보핵산(DNAs)을 포함한다. 그러나, 본 발명의 핵산 분자들은 리보핵산(RNAs)뿐만 아니라 혼성 RNA:DNA 이중-가닥 분자일 수 있다. 고려되는 핵산 분자들은 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스 분자를 포함한다. 또한 본 발명의 핵산 분자들은 변형 폴리펩타이드, 또는 이의 상보적 가닥을 암호화하는 천연 또는 합성 RNA, DNA 또는 cDNA를 포함한다.
DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되나 자연형인 변형되지 않은 폴리펩타이드와 비교하여 기능적 활성 및/또는 효능을 가지는 변형 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 자연형인 변형되지 않은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 출발점으로 사용되고 원하는 변형 폴리펩타이드를 암호화하기 위해 변형될 수 있다. 서열들을 추가하고 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키고 이런 변형 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 기능을 확인하기 위한 여러 방법들이 공지되어 있다.
또한 본 발명은 DPP 분해에 대한 보호를 위한 변형 아미노산 말단을 가지며 폴리펩타이드의 기능적 활성 또는 효능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 내부 및 C-말단 아미노산 변형을 갖는 폴리펩타이드 및 펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 비록 비보존성 치환을 고려할 수 있지만, 이런 변형 폴리펩타이드는 통상 보존성 아미노산 치환인 적은 아미노산 변화를 가질 수 있다. 특이자리 돌연변이(site-specific mutagenesis)를 수행하기 위한 기술을 사용하는 뉴클레오티드 치환은 당업계에 주지되어 있다. 바람직하게는, 핵산은 이들의 N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 가진 GLP-1 유사체를 암호화한다.
당해 기술분야에서 공지된 대로, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 사이의 "유사성"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 및 이의 보존된 뉴클레오티드 를 제 1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 치환체 또는 제 2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 또한 당해 기술분야에서 공지된 것은 이런 서열들의 2 줄 사이의 일치의 동일성을 결정함으로써 2개의 폴리펩티디드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 연관성의 정도를 의미하는 "동일성"이다. 동일성 및 유사성 모두는 쉽게 측정될 수 있다(Computational Molecular Biology, 레스크, 에이. 엠., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 스미스, 디. 더블유., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, 그리핀, 에이. 엠., 및 그리핀, 에이치. 지., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, 본 헤인지, 지., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, 그리브스코브, 엠. 및 데버렉스, 제이., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 다수의 방법이 있는 반면에, 용어 "동일성" 및 "유사성"은 당해 기술분야의 당업자에게 주지되어 있다(Sequence Analysis in Molecular Biology, 본 헤인지, 지., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, 그리브스코브, 엠. 및 데버렉스, 제이., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 카릴로, 에이치., 및 립맨, 디., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). 2개의 서열들 사이의 동일성 또는 유사성을 결정하는데 일반적으로 사용되는 방법은 Guide to Huge Computers, 마틴 제이. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 칼리오, 에이치., 및 립맨, 디., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)에 기술된 것에 포함된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 2개의 서열 사이에서 최대의 일치를 나타내도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 체계화된다. 2개 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함하나 이에 한정되지 않는다(데버럭스 등. Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (애트츨., 제이. Molec. Biol. 215:403 (1990)). 상기에 언급한 유사성 또는 동일성의 정도는 제 1 서열의 제 2 서열로부터의 유도를 나타내는 2개의 서열 사이의 동일성의 정도로서 결정된다. 2개의 핵산 서열 사이의 동일성의 정도는 GCG 프로그램 패키지에서 제공한 GAP와 같이 당해 기술분야에서 공지된 컴퓨터 프로그램에 의해 결정될 수 있다(니들맨 및 운스크(1970) Journal of Molecular Biology 48:443-453). 본 발명을 위한 2개의 핵산 서열 사이의 동일성의 정도를 결정하기 위하여, GAP는 다음의 환경으로 사용된다: 5.0의 GAP 크리에이션 패널티(creation penalty) 및 0.3의 익스텐션 패널티(extension penalty).
코돈 최적화
유전자 암호의 퇴화는 트랜스페린 단백질 및/또는 대상 치료 단백질의 뉴클오티드 서열의 변이를 일으키는 반면, 고유 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 생산한다. "코돈 최적화"로 공지된 방법(본 명세서에 전문이 포함된 미국 특허 제 5,547,871)은 변형 DNA 서열을 설계하는 방법을 제공한다. 코돈 최적화 유전자의 설계는 유기체에서의 코돈 사용의 주기, 최인접물 빈도(nearest neighbor frequencies), RNA 안정성, 제 2 구조 형성에 대한 잠재력, 합성 경로 및 그 유전자의 의도된 장래 DNA 조작을 포함하는 다양한 인자들을 고려하여야 한다. 특히, 이용가능한 방법은 코돈 효소 발현 시스템이 사용될 때 주어진 융합 단백질을 효모에 의해 가장 쉽게 인식되는 것으로 암호화하는 코돈을 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
유전 암호의 퇴화는 동일한 아미노산 서열이 암호화되게 하고 많은 다른 방식으로 번역되게 한다. 예를 들어, 루신, 세린 및 아르기닌는 6개의 다른 코돈에 의해 각각 암호화되는 반면, 발린, 프롤린, 트레오닌, 알라닌 및 글리신은 4개의 다른 코돈에 의해 각각 암호화된다. 그러나, 이런 동일 코돈의 사용 주기는 진핵 생물 및 원핵 생물 중에서 게놈에서 게놈으로 변한다. 예를 들어, 포유동물들 중에서 동형 코돈 선택 패턴은 매우 유사한 반면에, 효모(S. cerevisiae), 박테리아(E. coli) 및 곤충(D. melanogaster)과 같이 진화적으로 동떨어진 유기체는 명백히 다른 패턴의 게놈 코돈 사용 주기를 나타낸다(그램덤, 알., 등., Nucl. Acids Res., 8, 49-62 (1980); 그랜덤, 알., 등., Nucl. Acids Res., 9, 43-74 (1981); 마로야마, 티., 등., Nucl. Acids Res., 14, 151-197 (1986); 아오타, 에스., 등., Nucl. Acids Res., 16, 315-402 (1988); 와다, 케이., 등., Nucl. Acids Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); 컬랜드, 씨. 지., FEBS Letters, 285, 165-169 (1991)). 코돈-선택 패턴에서의 이런 차이는 펩타이드 신장률을 변조함으로써 개별 유전자의 전체 발현 단계에 영향을 미치는 것으로 보인다(컬랜드, 씨. 지., FEBS Letters, 285, 165-169 (1991); 페더슨, 에스., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); 소렌슨, 엠. 에이., 제이. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); 랜달, 엘. 엘., 등., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); 큐랜, 제이. 에프., 및 야루스, 엠., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); 베르넨, 에스., 등., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984), 베르넨, 에스., 등., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); 가렐, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); 이케무라, 티., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); 이케무라, 티., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).
합성 유전자를 위한 바람직한 코돈 사용 빈도는 재조합 단백질 발현, 특히 효모 종들의 재조합 단백질 발현에 사용될 세포/유기체의 정확한 게놈(또는 가능하면 근접하게 관련된 것)으로부터 유도된 핵 유전자의 코돈 사용 빈도를 반영해야 한다. 상기한대로, 한 바람직한 실시예에서 변형 폴리펩타이드는 상기한대로 돌연변이의 전 또는 후에 치료 단백질 뉴클레오티드 서열(들)일 수 있는 효모 발현에 대해 최적화된 코돈이다.
벡터
본 발명에서 사용하기 위한 발현 단위는 일반적으로 5'부터 3'방향으로 조작가능하게 연결된 전사 프로모터, 분비 신호 서열, 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열 및 전사 종결자를 포함한다. 상기한 대로, 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드의 임의의 배열은 본 발명의 벡터에 사용될 수 있다. 적절한 프로모터, 신호 서열 및 종결자의 선택은 당해 기술분야의 당업자에게 명백할 것이고 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
본 발명에서 사용하기 위한 적절한 효모 벡터는 미국 특허 제 6,291,212호에 기술되고 YRp7(스트률 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (브로치 등., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB249 및 pJDB219 (베기스, Nature 275:104-108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 및 이의 유도체를 포함한다 . 유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406, pRS413-416 및 미국, CA 92037, 라 졸라, 스트라다진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning Systems)으로부터 이용가능한 Pichia 벡터를 포함한다. 플라스마 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406는 효소 결합 플라스마(YIps)이고 효모 선택 메이커 HIS3, 7RPI, LEU2 및 URA3를 포함한다. 플라스미드 spRS413-416은 효모 동원체 플라스미드(Ycps)이다.
일반적으로 이런 벡터는 우성 표현형을 나타내는 임의의 다수의 유전자의 하나일 수 있는 선택가능한 마커를 포함하고, 표현형 검사법은 형질변형체가 우성 표현형에 대해 선택될 수 있게 한다. 바람직한 선택가능한 마커는 숙주 세포 옥소트로피를 보충하고, 항균 내성을 제공하거나 세포가 특정 탄소 공급원을 활용하게 할 수 있고, LEU2(브로치 등. ibid.), URA3(보스테인 등., Gene 8: 17, 1979), HIS3(스트율 등., ibid.) 또는 POT1(가와사키 및 벨, EP 171,142)을 포함하는 것이다. 다른 적절한 선택가능한 마커는 클로람페니콜 내성을 효모 세포들에 부여하는 CAT 유전자를 포함한다. 효모에 사용하기 위한 바람직한 프로모터는 효모 해당 유전자(히트맨 등., J Biol. Chem. 225: 12073-12080, 1980; 알버 및 가와사키, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; 가와사키, 미국 특허 제 4,599,311) 또는 알콜 분해 유전자 (영 등., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, 홀란더 등., (eds.), p. 355, Plenum, N.Y., 1982; 아머러, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983) 프로모터를 포함한다. 이런 점에서, 특히 바람직한 프로모터는 TPI1 프로모터(가와사키, 미국 특허 제 4,599,311) 및 ADH2 -4 C [미국 특허 제 6,291,212]프로모터(레셀 등., Nature 304:652-654, 1983)이다. 발현 단위는 전사 종결자를 포함할 수 있다. 바람직한 전사 종결자는 TPI1 종결자(알버 및 가와사키, ibid)이다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 전문이 참조로 본 명세서에 포함된 EP 431880에 개시된 PRB1 프로모터이고 종결자는 EP 60057에 개시된 ADH1 종결자이다.
효모 이외에, 본 발명의 변형 융합 단백질은, 예를 들어, 곰팡이 Aspergillus의 균주와 같은 실모양 곰팡이에서 발현될 수 있다. 유용한 프로모터의 예는 ADH3 프로모터(맥나이트 등., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) 및 tpiA 프로모터와 같이 Aspergillus nidulans 해당 유전자로부터 유래된 것들을 포함한다. 적절한 종결자의 예는 ADH3 종결자(맥나이트 등., ibid.)이다. 이런 화합물을 사용하는 발현 단위는 Aspergillus 염색체 DNA 속에 삽입될 수 있는 벡터 속에 복제될 수 있다.
본 발명을 실행하는데 사용하기 위한 포유류 발현 벡터는 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드의 전사를 조절할 수 있는 프로모터를 포함한다. 바람직한 프로모터는 바이러스성 프로모터 및 세포성 프로모터를 포함한다. 바람직한 바이러스성 프로모터는 아데노바이러스 2(카프만 및 샤프, Mol.Cell.Biol.2: 1304-13199, 1982) 및 SV40 프로모터(수바라마니 등., Mol.Cell. Biol. 1:854-864, 1981)로부터의 주요 후기 프로모터(late promoter)를 포함한다. 바람직한 세포성 프로모터는 쥐 메탈로티오넨 1 프로모터(팔미터 등., Science 222:809-814,1983) 및 쥐 V.sub..kappa[미국 특허 제 6,291,212 참조] 프로모터(그랜트 등., Nuc. Acids Res. 15:5496, 1987)를 포함한다. 특히 바람직한 프로모터는 쥐 V.sub.H[미국 특허 제 6,291,212]프로모터(로 등.,ibid)이다. 이런 발현 벡터는 프로모터의 하부 및 트랜스페린 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 상부에 위치한 RNA 접합 부위의 세트를 포함할 수 있다. 바람직한 RNA 접합 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로블린 유전자로부터 얻을 수 있다.
발현 벡터에 포함된 것은 대상 암호 서열의 하부에 위치한 폴리아데닐화 신호이다. 폴리아데닐화 신호는 SV40(카푸만 및 샤프, ibid)로부터의 초기 또는 후기 폴리아데실화 신호를 포함하고, 아데노바이러스 5E1B 영역 및 인간 성장 호르몬 유전자 종결자(데노토 등., Nuc. Acids Res.9:3719-3730, 1981)로부터의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 특히 바람직한 폴리아데실화 신호는 V.sub.H[미국 특허 제 6,291,212 참조] 유전자 종결자(로 등., ibid)이다. 발현 벡터는 아데노바이러스 2 트라아파타트 리더(adenovirus 2 tripartite leader)와 같이 프로모터와 RNA 접합 부위 사이에 위치한 비암호 바이러스성 리더 서열을 포함한다. 바람직한 벡터는 인핸서 및 쥐. mu[미국 특허 제 6,291,212 참조]인핸서(길리스, 세포 33:717-728, 1983)와 같은 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 아데노바이러스 VA RNAs를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
또한 발현 벡터는 하기와 같이 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 반감기를 향상시키기 위해서, 제 2 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 융합된 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 예를 들어, 트랜스페린을 발현하는데 사용된다. 또한, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현 및 배출을 위한 태그 및/또는 분해 부위에 융합될 수 있다.
형질 변환
곰팡이를 형질변환하는 기술은 문헌에 공지되어 있고, 베기스(ibid.), 히넨 등.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978), 옐톤 등., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984), 및 러셀 (Nature 301: 167-169, 1983)에 기술되어 있다. 일반적으로 숙주 세포의 표현형은 발현 벡터에 존재하는 선택가능한 마커에 의해 보완되는 유전적 결함을 포함할 것이다. 특정 숙주 및 선택가능한 마커의 선택은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 수준 내에 있다.
본 발명의 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 복제된 DNA 서열은, 예를 들어, 인산칼슘 매개 트랜스펙션에 의해 배양된 포유류 세포 속으로 유도될 수 있다(위글러 등., 세포 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; 그라함 및 반데르 Eb, Virology 52: 456, 1973.) 복제된 DNA 서열을 전기충격법(electroporation)(뉴만 등., EMBO J. 1: 841-845, 1982) 또는 리포펙션(lipofection)과 같은 방법으로 포유류 세포 속으로 도입하는 기술이 사용될 수 있다. 복제된 DNA와 결합된 세포를 동정하기 위하여, 일반적으로 선택가능한 마커는 대상 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 속으로 유도된다. 배양된 포유류 세포에서 사용하기 위한 바람직한 선택가능한 마커는 네오미신, 히그로미신 및 메쏘트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 유전자들을 포함한다. 선택가능한 마커는 증폭가능하고 선택가능한 마커일 수 있다. 바람직하게 증폭가능하고 선택가능한 마커는 DHFR 유전자이다. 특히 바람직한 증폭가능한 마커는 DHFR.sup.r[미국 특허 제 6,291,212 참조]cDNA(시몬센 및 리빈슨, Proc.Natl.Adac.Sci.USA 80:2495-2499, 1983)이다. 선택가능한 마커는 틸리(Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.)에 의해 검토되었고 선택가능한 마커의 선택은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 수준 내에 있다.
숙주 세포
본 발명은 또한 세포, 바람직하게는 본 발명의 변형 트랜스페린 융합 단백질을 발현하기 위해 형질변환된 효모 세포를 포함한다. 형질변환된 숙주 세포 자신 이외에, 본 발명은 이런 세포의 배양조직, 바람직하게는 단클론(동형으로 복제됨)배양조직, 또는 영양 배지에서 단클론 배양조직으로부터 유도된 배양조직을 포함한다. 만일 폴리펩타이드가 분비되면, 배지는 세포들과 함께, 만일 여과되거나 원심분리된다면 세포들 없이 폴리펩타이드를 함유할 것이다.
본 발명의 실시에 사용하기 위한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환되거나 감염될 수 있고, 배양된 포유류, 곤충, 곰팡이, 식물 및 박테리아 세포와 같이 배양 조직에서 성장할 수 있는 진핵 세포를 포함하고, 어떤 경우에는 원핵 세포를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포에 주입되어 벡터는 염색체 구성요소로서 또는 자가 복제 염색체외성 벡터로서 유지된다. 핵산 서열이 세포에서 더욱 안정적으로 유지되기 때문에 통합은 일반적으로 장점으로 생각된다.
숙주 세포의 선택은 폴리펩타이드 및 이의 소스를 암호화하는 유전자에 크게 의존할 것이다. 숙주 세포는 단세포 미생물, 예를 들어, 원핵생물일 수 있고 또는 비단세포 미생물, 예를 들어, 진핵생물일 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물이 사용될 수 있다. 진핵성 숙주 세포로서, Escherichila coli 또는 Bacillus subtilis와 같은 일반적으로 사용된 세포들이 사용될 수 있다.
원핵 세포가 숙주 세포로 사용되는 경우, 숙주 세포에서 복제될 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 발현 플라스미드는 프로모터, SD 서열(Shine-Dalgarno sequence), 및 단백질 합성 개시에 필요한 개시 코돈(e.g. ATG)이 유전자의 발현을 용이하게 하도록 본 발명의 유전자의 벡터 상류에 제공되게 사용되는 것이 바람직할 수 있다. 상기 벡터의 예들은 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 등과 같은 대장균으로부터 유도된 일반적으로 사용되는 플라스미드를 포함한다. 그러나, 사용가능한 벡터는 이런 예들에 한정되지 않으며 여러 공지된 벡터가 사용될 수 있다. E. coli를 사용하는 발현 시스템에 상업적으로 사용가능한 벡터들의 예는 pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMA1-P2(New England Biolabs), pET21/lacq(Invitrogen), pBAD/His(Invitrogen) 등을 포함한다.
진핵 숙주 세포의 예들은 효모 세포 등을 포함한다. 바람직하게 사용되는 예들은 COS 세포(원숭이의 세포)(1981 Cell, 23,175), 중국 햄스터 난소 세포 및 이로부터 유도된 디하이드로폴산 환원효소 결핍 균주() 등을 포함하고, 바람직하게 사용되는 효모 세포들의 예는 Saccharomyces cerevisiae 등을 포함한다. 그러나, 사용되는 세포들은 이런 예들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 효모 세포는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하는데 사용된다.
효모(예를 들어, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp.)의 종을 포함하는 곰팡이 세포는 본 발명에서 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 실용적으로 유용한 것으로 생각되는 효모의 예시적 속(屬), 발현을 위한 숙주로서 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하기 위한 숙주의 예시적 속은 Pichia (이전에는 Hansenula로 분류됨), Saccharomyces , Kluyveromyces , Aspergillus, Candida , Torulopsis , Torulaspora , Schizosaccharomyces , Citeromyces, Pachysolen , Zygosaecharomyces , Debaromyces , Trichoderma , Cephalosporium , Humicola, Mucor , Neurospora , Yarrowia , Metschunikowia , Rhodosporidium , Leucosporidium, Botryoascus , Sporidiobolus , Endomycopyis,등이다. Saccharomyces spp의 예들은 S. crevisiae , S. italicus 및 S. rouxii이다. KIuyveromyces spp의 예들은 K. ftagilis , K. lactis 및 K. marxianus이다. 적절한 Toulasppra 종은 T. delbrueckii이다. Pichia (Hansenula) spp의 예들은 P. angusta (formerly H. polymorpha), P. anomala (종래는 H. anomala) 및 P. pastoris이다.
본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생산하기 위해 특히 유용한 숙주 세포는 메타노트래픽(methanoltrophic) Pichia pastoris (스테인레인 등. (1995) Protein Express. Purif . 6:619-624). Pichia pastoris는 그 알콜 산화제 프로모터가 분리되고 복제되기 때문에 외래 단백질의 생산을 위한 뛰어난 숙주로 개발되었다; 이것의 형질변환은 1985년에 처음 보고되었다. P. pastoris는 글루코오스가 없을 때에 탄소 공급원으로 메탄올을 사용할 수 있다. P. pastoris 발현 시스템은 메탄올-유래 알콜 산화제(AOX1) 프로모터를 사용할 수 있고, 이것은 알콜 산화제의 발현, 메탄올 대사의 첫 번째 단계를 촉매화하는 효소를 암호화하는 유전자를 제어한다. 이 프로모터는 특징화되었고 일련의 P. pastoris 발현 벡터 속에 포함되었다. 일반적으로 P.pastoris에 생산된 단백질은 정확하게 접히고 배지 내로 분비되기 때문에, 유전적으로 가공된 P. pastoris의 발효는 E. coli 발현 시스템에 대한 우수한 대안을 제공한다.
효모 Saccharmomyces cerevisiae의 균주는 다른 바람직한 숙주이다. 바람직한 실시예에서, 효모 세포 또는 보다 구체적으로는, 당단백질의 아스파라긴에 의한 당화에 필요한 유전자에서 유전적 결핍을 포함하는 Saccharmomyces cerevisiae 숙주 세포가 사용된다. 비록 많은 이용가능한 효모 균주가 당화 또는 하이퍼만노실레이션(hypermannosylation)을 막거나 감소시키도록 변형되지만, 이런 결점을 갖는 S. cerevisiae 숙주 세포는 돌연변이 및 선택의 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 발로우 등(J.Biol.Chem.255:5986-5991, 1980)은 아스파라긴-연결 당화에 영향을 주는 유전자 내의 결점인 만노단백질 생합성 돌연변이체의 분리를 기술한다.
이종 단백질의 생산을 최적화하기 위하여, 숙주 균주가 S.cerevisiae pep4 돌연변이(존, Genetics 85:23-33, 1977)와 같은 돌연변이를 가져서, 단백질 분해활성의 감소를 초래하는 것이 바람직하다. 아스파르틸 프로테아제 얍신 1(aspartyl protease yapsin)(YAP3)을 암호화하는 유전자 또는 얍신 2(MKC7)를 암호화하는 유전자 또는 모두(Copley et al. 1998 Biochem. J. 330, 1333-1340)를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 수행하는 숙주를 사용하는 것이 특이 유익한데, 그 결과 염기성 잔기에 대한 단백질분해 활성은 감소되거나 제거된다. 영역을 암호화하는 다른 프로타아제에 돌연변이를 함유하는 숙주 균주는 다량의 본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생산하는데 특히 유용하다.
본 발명의 DNA 구조를 함유하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장한다. 본 명세서에서 사용한 용어 "적절한 성장 배지"는 세포 성장에 필요한 영양분들을 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양분들이란 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 일반적으로 이 성장 배지는, 예를 들어, 약물 선택 또는 DNA 구조에 선택가능한 마커에 의해 보완되거나 DNA 구조로 공동 감염된 필수 영양분의 결핍에 의해 DNA 구조를 함유하는 세포를 선택할 것이다. 예를 들어, 효모는 비아미노산 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 필수 아미노산 보충제를 포함하는 화학적으로 규정된 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 배지의 pH는 2이상 및 8이하, 바람직하게는 6.5를 유지하는 것이 바람직하다. 안정한 pH를 유지하는 방법은 버퍼링 및 일정한 pH 조절, 바람직하게는 수산화나트륨의 첨가를 포함한다. 바람직한 완충제는 숙신산 및 비스-트리스(시그마 케미컬., St.Louis, Mo.)를 포함한다. 아스파리긴-연결 당화에 필요한 유전자에 결점을 갖는 효모 세포는 삼투 안정제를 함유하는 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 바람직한 삼투 안정제는 0.1 M 및 1.5M, 바람직하게는 0.5M 또는 1.0M 사이의 농도에서 배지에 채워진 소비톨이다.
일반적으로 배양된 포유류 세포는 상업적으로 이용할 수 있는 혈청을 포함하거나 없는 배지에서 성장한다. 사용된 특정 세포주에 적절한 배지를 선택하는 것은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 수준 내에 있다. 감염된 포유류 세포는 대상 DNA 서열(들)의 발현을 시작하기 위하여 일정 기간 동안, 일반적으로 1-2일 동안 성장하게 된다. 안정한 상태에서 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 선택하는데 약물 선택이 사용된다. 증폭가능하고 선택가능한 마커로 감염된 세포에 대해 약물 농도는 복제 서열들의 증가된 복제 수를 선택하기 위해 점자적으로 증가될 수 있고, 이를 통해 발현 단계를 증가시킨다.
본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생산하기 위하여 바쿨로바이러스(Baculovirus)/곤충 세포 발현 시스템이 사용될 수 있다. BacPAKTM 바쿨로바이러스(BD 바이오사이언스(클론테크)는 곤충 숙주 세포에서 높은 단계로 재조합 단백질을 발현한다. 표적 유전자는 수송 벡터에 삽입되고, 선형화된 BacPAK6 바이러스성 DNA에 의해 곤충 숙주 세포 속으로 공동 감염된다. BacPAK6 DNA는 바쿨로바이러스 게놈의 필수 부분을 잃어버린다. DNA가 벡터와 재조합될 때, 필수 성분은 보유되고 표적 유전자는 바쿨로바이러스 게놈으로 전달된다. 재조합 후에, 여러 바이러스 플레이그(plaque)가 발견되어 정화되고, 재조합은 표현형이 확인된다. 새롭게 분리된 재조합 바이러스는 증폭될 수 있고 다량의 원하는 단백질을 생성하기 위해 곤충 세포 배양액을 감염시키는데 사용될 수 있다.
분비성 신호 서열
"분비성 신호 서열" 또는 "신호 서열" 또는 "분비 리더 서열"라는 용어는 상호교환해서 사용되고, 예를 들어, 전문이 참조로 본 명세서에 첨부된 미국 특허 제 6,2 91,212 및 미국 특허 제 5,547,871에서 기술된다. 분비성 신호 서열 또는 신호 서열 또는 분비 리더 서열은 분비성 펩타이드를 암호화한다. 분비 펩타이드는 세포로부터 성숙 폴리펩타이드 또는 단백질의 분비를 유도하도록 작용하는 아미노산 서열이다. 일반적으로 분비성 펩타이드는 소수성 아미노산으로 특징지워지고 일반적으로(전적은 아님) 새로 합성된 단백질의 아미노 말단에서 발견된다. 분비성 펩타이드는 분비되는 동안 성숙 단백질로부터 자주 분리된다. 분비성 펩타이드는 분비 통로를 통과하는 동안 성숙 단백질로부터 신호 펩타이드의 분리를 허용하는 처리 부위를 포함할 수 있다. 처리 부위는 신호 펩타이드 내에 암호화될 수 있거나 예를 들어, 생체외 돌연변이에 의해 신호 펩타이드에 첨가될 수 있다.
분비성 펩타이드는 본 발명의 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드의 분비를 유도하는데 사용될 수 있다. 다른 분비성 펩타이드와 조합하여 사용될 수 있는 하나의 이런 분비성 펩타이드는 효모 문맥 단백질(yeast Barrier protein)의 제 3번째 도메인이다. 분비성 신호 서열 또는 신호 서열 또는 분비 리더 서열은 단백질의 분비를 초래하는 번역후 처리단계(post-translational processing steps)의 복잡한 과정을 요한다. 만일 손상되지 않은 신호 서열이 존재한다면, 발현되는 단백질은 조면 소포체의 루멘에 들어간 후에 골지체를 통해 분비성 소포(secretory vesicles)로 수송되어 최종적으로 세포 밖으로 수송된다. 일반적으로, 신호 서열은 최초 코돈을 즉시 따라가고 분비될 단백질의 아미노 말단에서 신호 펩타이드를 암호화한다. 대부분의 경우, 신호 서열은 신호 펩티다아제로 불리는 특이적 프로테아제에 의해 분열된다. 바람직한 신호 서열들은 바이러스, 포유류 또는 효모 발현 벡터를 사용하는 재조합 단백질 발현의 처리 및 수송 효율를 향상시킨다. 바람직한 신호 서열은 포유류 또는 인간 트랜스페린 신호 서열이다. 일부의 경우, 고유 기질 신호 서열은 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하고 분비하는데 사용될 수 있다. 신호 서열을 효과적으로 제거하기 위해서, 일부 경우에 신호 서열과 성숙 단백질 사이의 짧은 프로-펩타이드 서열을 포함하는 것이 바람직할 수 있는데 프로-펩타이드의 C-말단 부분은 효모 kex2p 프로테아제와 같은 프로테아제에 대한 재인식 부위를 포함한다. 바람직하게는, 프로-펩타이드 서열은 길이가 약 2-12 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 4-8 아미노산이다. 이런 프로-펩타이드의 예들은 Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg, Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg, Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg, 및 Arg-Ser-Leu-Glu-Arg-Arg(각각 SEQ ID NOS: 111-114)이다.
DPP
분해로부터 보호된 변형
폴리펩타이드
기질의 보호
DPP 활성에 부분적으로 또는 실질적으로 저항성이 있는 본 발명의 변형 폴리펩타이드는 표준 합성법, 재조합 DNA 기술 또는 펩타이드 및 융합 단백질의 임의의 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
고체상 펩타이드 합성법은 일반적으로 다음 참고문헌에 일반적으로 개시된다: Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 888:2149, 1963; Barany and Merrifield, In the Peptides, E. Gross and J. Meinenhofer, Eds., Academic Press, New York, 3:285(1980); S. B. Kent. Annu. Rev. Biochem., 57:957(1988). 고체상 펩타이드 합성 방법에 의해, 원하는 길이 및 서열의 펩타이드는 고체 수지 입자와 공유결합된 성장 펩타이드 사슬에 대한 아미노산의 단계적 첨가를 통해 생산할 수 있다. 자동 합성은 본 방법에 사용될 수 있다.
상기한 대로, 본 발명의 변형 폴리펩타이드는 이런 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 이용하는 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 이런 서열들은 RNA 또는 DNA일 수 있고 조절염기서열와 연결될 수 있고 및/또는 벡터에 삽입될 수 있다. 그런 후에 후자는 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아 속으로 감염된다. 벡터의 제조 및 이의 생산 또는 숙주 세포에서의 발현은 재조합 분자 생물학 및 유전공학 기술에 의해 수행된다.
또한, 본 발명의 변형 폴리펩타이드는 상업적으로 이용가능한 발현 시스템에서 쉽게 합성되는 DNA 서열을 사용하여 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 변형 폴리펩타이드는 (a) 폴리펩타이드의 생산에 도움이 되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩타이드를 회복하는 단계를 포함하는 재조합 수단에 의해 얻을 수 있다. 세포들은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 쉐이크 플라스크 배양, 적절한 배지에서 수행되는 실험용 또는 공업용 발효기에서의 소량 또는 다량 발효(연속적, 배치, 피드-배치, 또는 고체상 발효를 포함) 및 폴리펩타이드를 발현 및/또는 분리하는 조건하에서 배양될 수 있다. 배양은 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 탄소 및 질소 소스와 무기염을 포함하는 적절한 영양 배지에서 일어난다(bacteria and yeast; Bennett, J. W. and Lasure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, California, 1991). 적절한 배지는 상업용 공급업체로부터 구입할 수 있고 또는 발행된 조성물(예를 들어, 아메리칸형 배양 수집의 카달로그)에 따라 제조될 수 있다. 만일 변형 폴리펩타이드가 영양 배지 속에 분비된다면, 폴리펩타이드는 배지로부터 직접 회복될 수 있다. 만일 변형 폴리펩타이드가 분비되지 않으면, 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
예로서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 전문이 본 명세서에 포함되는 WO 0044772에 개시된 발효 방법에 의해 제조될 수 있다.
변형 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 특이적인 당업계에 공지된 방법을 사용하여 탐지될 수 있다. 이런 탐지 방법은 특이적 항체의 사용, 효소 생성물의 형성 또는 효소 기질의 소멸, 특이적 수용체에 대한 결합 또는 세포-기초 측정법에서 특이적인 수용체의 활성화 탐지를 포함한다. 예를 들어, 효소 측정법은 변형 폴리펩타이드의 활성을 결정하는데 사용될 수 있다. 얻은 변형 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어, 변형 폴리펩타이드는 원심분리, 여과, 추출, 스프레이-건조, 증발 또는 침전화를 포함하나 이에 한정되지 않는 종래의 방법에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화력, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기별 배제), 전기영동 방법(예를 들어, 제조용 등전 포커싱, 시차 용해도(예를 들어, 황산 암모늄 침전화), SDS-PAGE, 또는 추출법(예를 들어, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)을 포함하나 이에 한정되지 않는 종래의 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다.
융합 단백질 및 단백질 접합체
본 발명은 재조합 수단 또는 공유 결합을 통해 이형 분자에 부착된 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제공한다. 이형 분자, 예를 들어, 혈장 단백질에 대한 결합은 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 활성을 수 일부터 수 주까지 증가시킨다. 일부 실시예에서, 이런 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 단지 1회 투여는 이 기간 동안 주어질 필요가 있다. 활성 화합물은 큰 분자에 주로 결합할 것이기 때문에, 더 큰 특이성을 얻을 수 있고, 다른 생리적 방법을 방해하기 위해서 세포내에서 덜 흡수될 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 이형 서열에 부착되어 재조합 수단을 통해 키메라 또는 융합 단백질을 형성한다. 이런 키메라 또는 융합 단백질은 DPP 분해로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되며, 아미노산 서열을 가지나 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 실질적으로 동일하지 않은 이형 단백질에 조작가능하게 연결된 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다. "조작가능하게 연결된"이란 의미는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 및 이형 단백질이 인프레임 융합된다. 이형 단백질은 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
한 실시예에서, 융합 단백질은 본질적으로 본 발명의 변형 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 융합 단백질은, 베타-갈락토시다아제 융합 단백질, 효모 2개-혼성 GAL 융합 단백질, 폴리-His 융합 단백질, MYC-태그, HI-태그 및 Ig 융합 단백질과 같은 효소 융합 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이런 융합 단백질, 특히 폴리-His 융합 단백질은 재조합 변형 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 할 수 있다. 다른 실시예에서, 융합 단백질은 본 발명의 변형 펩타이드와 다른 모이어티 사이에 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 화학적 또는 효소적 분해에 의해 본 발명의 변형 펩타이드를 배출할 수 있는 인식 서열을 제공한다. 특정 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에서, 단백질의 발현 및/또는 분비는 이형 신호 서열을 사용하여 증가될 수 있다. 다른 실시예에서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 이의 혈청 안정성 또는 혈청 반감기를 연장시켜 줄 단백질과 같은 혈장 분자와 융합된다. 바람직하게는, 변형 폴리펩타이드 또는 단백질은 혈청 알부민, 면역글로블린, 또는 Fc 도메인과 같은 이의 일부에 융합된다. 더욱 바람직하게는, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 트랜스페린, 락토트랜스페린, 말레노트랜스페린 또는 이의 합성물에 융합된다. 이런 융합 단백질을 제조하는 방법은 전문이 참조로 본 명세서에 포함된 미국 출원 10/231,494 및 10/378,094 및 국제 출원 PCT/US03/26818에 제공된다.
이런 출원들에서 논의한 대로, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 결합되는 트랜스페린은 변형될 수 있다. 이 트랜스페린은 감소된 당화를 나타낼 것이다. 변형 트랜스페린 폴리펩타이드는 1개의 트랜스페린 N 도메인, 1개의 트랜스페린 C 도메인, 트랜스페린 N 및 C 도메인, 2개의 트랜스페린 N 도메인 및 2개의 트랜스페린 C 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
Tf의 C 도메인이 융합 단백질의 일부인 경우, 2개의 N-연결 당화 부위, SEQ ID NO: 3 N413및 N611에 상응하는 아미노산 잔기는 당화 또는 하이퍼마노실레이션( hypermmnosylation)을 막고 융합 단백질 및/또는 치료 단백질의 혈청 반감기를 증가시키기 위해(아시알로-(asialo-) 또는 일부 예에서, 모노시알로-Tf 또는 다이시알로-Tf) 효모 시스템에서의 발현을 위해 변형될 수 있다. N413 및 N611에 상응하는 Tf 아미노 산 이외에, 당화를 막거나 상당히 감소시키기 위해 N-X-S/T 당화 부위 내의 인접 잔기에 변형이 일어날 수 있다. 펑크 등의 미국 특허 제 5,986,067호 참조. Pichia pastoris에서 발현된 Tf의 N 도메인은 이런 당화를 막기 위해 돌연변이 또는 변형될 수 있는 S32에서 단일 6탄당과 O-연결 당화된다고 알려졌다.
따라서, 본 발명의 한 실시예에서, 트랜스페린 융합 단백질은 변형 트랜스페린 분자를 포함하고 트랜스페린은 Tf의 아시알로- 모노시알로- 및 다이시알로-형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 감소된 당화를 나타낸다. 다른 실시예에서, 트랜스페린 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 당화를 막도록 변형된 재조합 트랜스페린 돌연변이체를 포함한다. 다른 실시예에서, 트랜스페린 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 당화되는 재조합 트랜스페린 돌연변이체를 포함한다. 다른 실시예에서, 트랜스페린 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 당화를 막기 위해 돌연변이되는 재조합 인간 혈청 트랜스페린 돌연변이체를 포함하고, SEQ ID NO:3의 적어도 하나의 Asn413 및 Asn611은 당화를 허용하지 않는 아미노산으로 돌연변이된다. 다른 실시예에서, 트랜스페린 융합 단백질의 트랜스페린 부분은 당화를 막거나 상당히 감소시키기 위해 돌연변이되는 재조합 인간 혈청 트랜스페린 돌연변이체를 포함하고, 돌연변이는 N-X-S/T 당화 부위 내의 인접 잔기에 변형이 일어날 수 있다. 또한, 당화는 세린 또는 트레오닌 잔기를 돌연변이시킴으로써 감소 또는 예방될 수 있다. 또한, X를 프롤린으로 변화시키면 당화를 막는 것으로 알려져 있다.
키메릭 단백질 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 다른 단백질 서열을 암호화하는 DNA 절편은 통상적인 기술에 따라 인프레임에 함께 결찰된다. 다른 실시예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 선택적으로, 유전자 절편의 PCR 증폭은 키메릭 유전자 서열을 만들기 위해 연속적으로 강화 및 재증폭되는 2개의 보존성 유전자 절편들 사이에 보조 돌출부를 만드는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(Ausbel et al. 1992 Current Protocols in Molecular Biolgoy). 또한, 이미 융합 모이어티(예를 들어, GST 단백질)를 암호화하는 많은 발현 벡터들은 상업적으로 구입할 수 있다. 핵산을 암호화하는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 발현 벡터 속에 복제되어 융합 모이어티는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 인프레임으로 연결된다.
다른 실시예에서, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 이의 안정성과 DPP 활성으로부터의 보호를 증가시키기 위해서 공유 결합을 통해 이형 분자와 결합된 공유결합을 통해 접합된다.
예로서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 변형 펩타이드의 반응기와 혈액 성분 사이에 형성되고, 연결 그룹으로 또는 연결 그룹 없는 공유 결합을 통해 혈액 성분에 접합된다. 혈액 성분은 고정되거나 유동할 수 있다. 고정 혈액 성분의 예는 비유동 혈액 성분들이고 조직, 막 수용체, 틈새형 단백질, 피브린 단백질, 콜라겐, 혈소판, 혈관내피세포, 상피세포, 및 이들의 관련 막 및 막 수용체, 체세포, 뼈대근육세포 및 평활근 세포, 신경 성분, 골세포 및 파골세포 및 순환계 및 림프계와 관련된 모든 신체 조직을 포함한다. 유동 혈액 성분들의 예는 일반적으로 5분을 초과하지 않는 주로 1분의 연장된 기간 동안 고정된 위치를 갖지 않는 혈액 성분이다. 이런 혈액 성분들은 막 관련성이 아니고 연장된 소정의 기간 동안 혈액에 존재하고 적어도 0.1㎍/ml의 최소 농도로 존재한다. 유동 혈액 성분들은 혈청 알부민, 트랜스페린, IgM 및 IgG와 같은 면역글로블린, α1 프로테아제 억제제, 항트롬빈 III 및 α2 항플라스민을 포함한다. 유동 혈액 성분의 반감기는 적어도 약 12시간이다.
혈액 성분과 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드 사이의 공유 결합의 형성은 인 비보 또는 엑스 비보(in vivo 또는 ex vivo)로 일어날 수 있다. 엑스 비보 공유 결합의 경우에, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 혈액, 혈청 또는 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 IgG와 같은 혈액 성분을 함유하는 식염수에 첨가되어 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 혈액 성분 사이에 공유 결합이 형성되게 한다. 또한, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 말레이미드 또는 유사한 반응성 화학 그룹으로 변형될 수 있고 식염수에서 혈액 성분과 반응될 수 있다. 일단 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 혈액 성분과 반응하여 변형 폴리펩타이드 또는 펩탕드 접합체를 형성하며, 이 접합체는 환자에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 환자에게 직접 투여되어 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 혈액 성분 사이에 공유 결합을 생체내에서 형성된다. 또한, 동일한 반응이, 재조합 단백질, 예를 들어, 알부민으로 수행될 수 있다.
비특이적 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 화학적으로 반응성이 있는 그룹이 생체내에서 반응할 수 있는 다양한 부위는 세포들, 특히 적혈구(erythrocytes) 및 혈소판, 및 IgG 및 IgM, 혈청 알부민, 페리틴, 스테로이드 결합 단백질, 트랜스페린, 티록신 결합 단백질, α-2-거대글로빈 등을 포함하는 면역글로블린과 같은 단백질을 포함한다.
변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 티올과 결합하기 위한 반응 그룹을 함유하거나 함유하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜에 접합될 수 있다. 선택적으로, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜 변형 당지질 또는 폴리에틸렌 당 변형 지방산에 접합될 수 있다.
한 태양에서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 이의 안정상을 향시키기 위해 임의의 산 도는 지방산 유도체에 접합될 수 있다. 지방산의 예는 라우르산, 팔미트산, 올레산 및 스테아르산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 지방산 유도체의 예는 에틸 에스터, 프로필 에스터, 콜레스테릴 에스터, 조효소 A 에스터, 나이트로페닐 에스터, 나프틸 에스터, 모노글리세라이드, 다이글리세라이드 및 트라이글리세라이드, 지방 알콜, 아세트산 지방 알콜 등을 포함한다.
다른 태양에서, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 약물 친화 복합체(DACTM) 속으로 처리될 수 있다. 약물 친화 복합체는 세 부분을 가진다: 생물학적 활성을 담당하는 약물 부분; 약물 부분을 반응성 화학 그룹에 연결하는 커넥터; 및 구조물을 신체의 특정 표적 단백질에 영구적으로 결합하는 것을 담당하는 커넥터의 반대 말단에 있는 반응성 화학 그룹. 예를 들어, 킴 등(2003, Diabetes 52(3):751)은 GLP-1 알부민 약물 친화 복합체를 개시한다. 킴 등은 알부민-접합 DAC:GLP-1는 GLP-1 수용체(GP-1R)에 결합되고 수용체를 발현하는 이종 섬유아세포에서 cAMP 형성을 활성화한다는 것을 보여준다. 결과는 알부민-접합 DAC:GLP-1은 고유 GLP-1을 모방한다는 것을 나타낸다. 킴 등은 GLP-1R 시그널링의 연장된 활성화에 대한 새로운 방법을 제공한다.
변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 약물 친화 복합체는 피하 주사에 의해 투여되도록 설계되고 그런 후에 생체내에서 빠르고 선택적으로 알부민에 결합한다. 형성된 생체접합체는 내생적 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 동일한 치료 활성과 유사한 효력을 가지나 알부민의 약물 생체 반응학과 유사한 동물에서의 약물 생체 반응학 프로파일을 가진다.
약학적 조성물
본 발명은 DPP 분해로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되나 실질적으로 이들의 기능성 활성과 효력을 실질적으로 보유하는 변형 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이런 약학적 조성물은 경구, 정맥내IV), 동맥내(IA), 근육내(IM), 피하(SC), 복강내, 경피 등과 같은 비경구로 투여될 수 있다. 투여는 적절한 상황에서 수혈이 될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 구강, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸일 수 있고, 변형 폴리펩타이드는 혈관계로 전이된다. 예를 들어, 본 발명의 변형 폴리펩타이드과 트랜스페린 모이어티의 융합 또는 접합은 변형 폴리펩타이드를 혈관 시스템에 이동시키고 또는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 국제출원 PCT/US03/26778에 개시된 트랜스페린 수용체와의 결합을 통해 혈액-뇌 장벽을 통과한다. 만일 원한다면 비록 1회 이상의 주사가 사용될 수 있으나, 주로 1회 주사가 사용될 것이다. 변형 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 주사기, 투관침, 도뇨관 등을 포함하는 임의의 편리한 수단에 의해 투여될 수 있다. 투여의 특정한 방식은 투여되는 양, 하나의 환약, 또는 연속된 투여 등에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 투여는 정맥내로 이루어질 것이고, 주입 장소는 본 발명에 중요하지 않을지라도, 바람직하게는 정맥내, 말초 또는 중심 정맥과 같은 빠른 혈류가 있는 곳에서 주입될 것이다. 더욱 바람직하게는, 약학적 조성물은 피하로 투여될 것이다. 다른 경로들은 투여가 느린 배출 기술 또는 보호 매트릭스와 결합될 때 사용될 수 있다. 의도는 변형된 치료 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 혈액에 효과적으로 분배되어, 혈액 또는 조직 성분과 반응할 수 있도록 하는 것이다.
일반적으로, 본 발명은 본 발명의 유효량의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물과 함께 약학적으로 허용가능한 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 포함한다. 이런 조성물은 다양한 버퍼 성분(예를 들어, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석제; 세제 및 용해제(예를 들어, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타이아황산 나트륨), 방부제(예를 들어, 티메르솔, 벤질 알콜) 및 벌킹제(예를 들어, 락토오스, 만니톨)와 같은 첨가제를 포함하고; 이런 재료를 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 폴리머 화합물의 미립 제제 속에 혼합하는 것이 사용될 수 있고, 이것이 순환하는 동안 지속 기간을 향상시키는 효과를 가질 수 있다. 이런 조성물들은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 인비보 배출 속도, 및 인비보 제거의 속도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa 18042) 페이지 1435-1712 참조.
예를 들어, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는, 예를 들어, 탈이온수, 인산 완충용액(PBS), 함염물, 수용성 에탄올 또는 다른 알콜, 혈장, 단백질성 용액, 만니톨, 수용성 글루코오스, 알콜, 식물 오일 등과 같은 생리적으로 허용가능한 배지에서 투여될 수 있다. 포함될 수 있는 다른 첨가제들은 배지는 일반적으로 약 5 내지 10 범위의 pH에서 완충될 것이고, 버퍼는 일반적으로 약 50 내지 250mM로 변할 것이고, 염의 농도는 일반적으로 약 5 내지 500mM으로 변하는 버퍼들, 생리적으로 허용가능한 안정제 등을 포함한다. 특히 주사를 위한 생리적 버퍼의 예는 한크 용액(Hank's solution)과 링거 용액(Ringer's solution)을 포함한다. 경피 제제는 담즙산염 또는 푸시딘산과 같은 침투물을 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 정제 또는 당의정, 혀밑 정제, 향가루, 상자, 연 젤라틴 캡슐, 좌약, 크림, 연고, 피부겔, 피하 장치, 에어로졸, 음료용 및 주사용 앰플로 제조될 수 있다. 조성물은 유체 형태로 제조될 수 있고, 또는 저장과 수송이 편리한 동결 건조 형태와 같은 건조 분말일 수 있다. 이식가능한 서방출성 제제도 고려된다.
경구 복용 형태
한 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 참조로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences(1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa.18042에 일반적으로 개시된 경구 고체 복용 형태의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 고체 복용 형태는 정제, 캡슐, 알약, 구내정 또는 약용 박하 드롭스, 카셰 또는 펠렛을 포함한다. 또한, 리포솜 또는 유단백질 캡슐화는 본 발명의 조성물을 제제화하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제 4,925,673에 개시된 유단백질 미세구). 리포솜 캡슐화가 사용될 수 있고 리포솜은 다양한 폴리머에 의해 유도될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제 5,013,556호). 치료를 위한 가능한 고체 복용 형태는 본 명세서에 참조로 포함된 G.S.Banker 및 C.T.Rhodes에 의해 편집된 Chaptr 10 of Marshall, K., Modern Pharmaeutics(1979)에 주어진다. 일반적으로, 제제는 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드 및 위 상태에 대한 보호 및 장에서 생물학적으로 활성인 물질의 배출을 가능하게 하는 불활성 성분을 포함할 것이다.
필요한 경우, 경구 전달이 효과적이 되도록 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 적어도 하나의 모이어티를 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드 자체에 부착하는 것이고, 상기 모이어티는 복부 또는 장으로부터 혈류 속으로의 흡수를 허용한다. 또한 화합물의 전체 안정성을 증가시키고 신체에서 순환 시간을 증가시키는 것도 바람직하다. 본 발명에서 공유 결합된 부형제로서 유용한 모이어티는 이 목적을 위해서도 사용될 수 있다. 이런 모이어티의 예들은 PEG, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈 및 폴리프롤린을 포함한다. 예를 들어, 아부초스키와 데이비스의 Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs(1981), 호센베르그와 로버트의 eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., pp 367-83; 뉴마크 등.(1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9 참조. 사용될 수 있는 다른 폴리머들은 폴리-1,3-다이옥소란(poly-1,3-dioxolane)과 폴리-1,3,6-티옥소칸(poly-1,3,6-tioxocane)이다. 약학적 용도로 바람직한 것은 PEG 모이어티이다.
마찬가지로, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 전체 안정성을 증가시키거나 경구 전달력을 향상시키기 위해 다른 폴리펩타이드와 재조합으로 융합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 트랜스페린, 멜라노트랜스페린, 또는 락토페린에 융합될 수 있다. 이런 융합 단백질을 위한 방법은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국출원 10/378,094에 개시된다.
경구 전달 복용 형태의 경우에, 본 발명의 치료 화합물의 흡수를 향상시키 위한 부형제로서 나트륨 N-(8-[2-하이드록시벤조일]아미노)카프릴산염(SNAC)과 같은 변형 지방 아미노산의 염을 사용할 수 있다. SNAC를 사용하는 헤파린 제제의 임상적 효능은 에피스피어 테크놀러지에 의해 수행된 상 II 시험에서 증명되었다. 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 미국 특허 5,792,451 "Oral drug delivery composition and methods" 참조.
본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 약 1mm 입자 크기의 과립 또는 펠렛 형태로 고운 다중입자들로서 제제에 포함될 수 있다. 캡슐 투여를 위한 재료의 제제는 분말, 약간 가압된 플러그 또는 정제일 수 있다. 치료제는 압축에 의해 제조될 수 있다.
착색제 및 향신료는 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 제제화되고(예를 들어, 리포솜 또는 미세구 캡슐화) 그런 후에 착색제 및 향신료를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 추가로 함유될 수 있다.
불활성 물질로 본 발명의 약학적 조성물의 부피를 희석 또는 증가시킬 수 있다. 이런 희석제는 탄수화물, 특히, 만니톨, cc-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 특정 무기 염은 삼인산 칼슘, 탄산 마그네슘 및 염화 나트륨을 포함하는 충전제로서 사용될 수 있다. 일부 상업적으로 구입할 수 있는 희석제들은 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
붕괴제는 치료제의 제제를 고체 복용 형태의 제제에 포함될 수 있다. 정제 분해 물질로 사용된 재료는 전분, 엑스플로탭을 기초로 한 상업용 붕괴제를 포함한는 전분을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 글리콜산 전분 나트륨, 앰버라이트, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 울트라밀로펙틴, 알지산 나트륨, 젤라틴, 오렌지 필, 카복시메틸셀룰로오스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수 있다. 다른 형태의 붕괴제는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분쇄된 검은 붕괴제와 접합제로서 사용될 수 있고 이들은 한천, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸스(tragacanth)를 포함한다. 알기닌산과 이의 나트륨염은 붕괴제로서 유용하다.
접합제는 경질 정제를 형성하기 위해서 변형된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 함께 고정하는데 사용될 수 있고 아카시아, 트라가칸스, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 생성물로부터의 재료를 포함한다. 다른 것들은 메틸 셀룰로오스(MC), 에틸 셀룰로오스(EC) 및 카복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 포함한다. 폴리바이닐 파이롤리돈(PVP) 및 하이드록시메틸 셀룰로오스(HPMC)는 모두 치료제를 과립화하기 위해 알콜 용액에서 사용될 수 있다.
제제화 공정 동안 접착되는 것을 막기 위해 본 발명의 약학적 조성물의 제제에 감마재가 포함될 수 있다. 윤활재는 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드 및 다이월(die wall) 사이의 층으로 사용될 수 있고, 이들은 마그네슘 및 칼슘 염, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물유 및 왁스를 포함하는 스테아르산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가용성 윤활재는 황산 라우릴 나트륨, 황산 라우릴 마그네슘, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카보왁스 4000 및 6000 등이 사용될 수 있다.
제제화 동안 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 유동성을 향상시킬 수 있고 압축하는 동안 재배치를 돕는 유동화제가 첨가될 수 있다. 유동화제는 전분, 활석, 발열성 실리카 및 수화 실리코알루민산염을 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 수용성 환경 속으로 용해되는 것을 돕기 위해서, 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 황산 라우릴 나트륨, 설포숙신산 다이옥틸 나트륨 및 설폰산 다이옥틸 나트륨 등을 음이온성 세제를 포함한다. 양이온성 세제가 사용될 수 있고 염화 벤즈알코늄 또는 염화 벤즈토늄을 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제제에 포함될 수 있는 유효한 비이온성 세제의 목록은 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아르산염, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아르산염, 폴리소르베이트산염 40, 60, 65 및 80, 수크르오스 지방산 에스터, 메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스이다. 이런 계면활성제는 다른 비율로 단독 또는 혼합물로 단백질 또는 유도체의 제제에 존재할 수 있다.
변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 흡수를 향상시키기 위해 제제에 첨가제들이 포함될 수 있다. 이런 특성을 가진 유효한 첨가제는 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.
또한 방출 조절제도 바람직할 수 있다. 본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 확산 또는 여과 매커니즘에 의해, 예를 들어, 검을 배출시키는 불활성 매트릭스 속에 포함될 수 있다. 천천히 분해되는 매트릭스는 제제, 예를 들어, 알지네이트산염, 폴리사카라이드 속에 포함될 수 있다. 본 발명의 화합물의 다른 형태의 방출 조절은 오로스 치료 시스템(Alza Corp)를 기초로 하는 방법, 즉, 물을 통과시켜 삼투압에 의해 하나의 작은 구멍을 통해 약물을 밀어내는 반투과막으로 약물을 둘러싸는 방법이다. 일부 장 코팅제는 지연 배출 효과를 가진다.
다른 코팅제는 제제로서 사용될 수 있다. 이런 코팅제는 코팅팬에 사용될 수 있는 다양한 수크로오스를 포함한다. 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 필름 코팅 정제에 제공될 수 있고 이 예에서 사용된 재료는 두 그룹으로 나뉜다. 첫 번째 그룹은 비-장 재료(nonenteric material)이고 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시-에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필-메틸 셀룰로오스, 나트륨 카복시-메틸 셀룰로오스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두 번째 그룹은 보통 프탈산의 에스터인 장 재료(enteric material)로 이루어진다.
재료의 혼합물은 최적 필름 코팅제를 제공하기 위해 제공되는데 사용될 수 있다. 필름 코팅은 팬 코팅제 또는 유체층 또는 압축 코팅에 의해 수행될 수 있다.
폐 전달 형태
다른 실시예에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 흡입하는 동안 포유류의 폐에 전달되어 폐 상피 내막을 통과하여 혈류에 도달한다.
치료 제품의 폐 전달을 위해 설계된 다양한 기계 장치의 용도를 제공하고, 기계 장치는 분무기, 정량식 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하나 이에 한정되지 않고, 이 모든 것은 당업자에게 주지되어 있다. 본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 구입할 수 있는 장치의 특징적인 예는 미조리, 세인트루인스, 말린크로트사에 의해 제조된 울트라벤트 분무기; 콜로라도, 이글우드, 마퀘스트 메디컬 프러덕트에 의해 제조된 아콘 II 분무기; 뉴욕, 리서치 트라이앵글 파크, 글락소사에 의해 제조된 벤톨린 정량식 흡입기; 및 매사추세츠, 베드포드, 피슨사에 의해 제조된 스핀헤일러이다.
모든 장치들은 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 분배를 위해 적합한 제제의 사용을 필요로 한다. 통상적으로, 각 제제는 사용되는 장치의 형태에 독특하며 치료에 유용한 희석제, 보조제 및/또는 담체 이외에 적절한 추진 재료의 사용을 포함할 수 있다.
변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 말초 폐까지 가장 효과적으로 전달하기 위해서, 10㎛ 이하, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5㎛의 평균 입자 크기를 가진 과립 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다.
약학적으로 허용가능한 담체는 트레할로스, 만니톨, 자일리톨, 수크로오스, 락토오스 및 소르비톨과 같은 탄수화물을 포함한다. 제제에 사용하기 위한 다른 성분들은 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC를 포함할 수 있다. 천연 또는 합성 계면제가 사용될 수 있다. PEG가 사용될 수 있다(단백질 또는 유사체를 유도하는데 사용되는 것과는 별개). 사이클로덱스트란과 같은 덱스트란이 사용될 수 있다. 담즙산염 및 다른 관련 인핸서가 사용될 수 있다. 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체가 사용될 수 있다. 버퍼 제제에 사용하기 위한 것과 같이 아미노산이 사용될 수 있다.
또한, 리포솜, 미세캡슐 또는 미세구, 내포착 화합물, 또는 다른 형태의 담체의 사용이 고려된다.
분무기, 제트 또는 초음파와 함께 사용하는데 적합한 제제는 용액의 ml 당 약 0.1 내지 25mg의 생물학적으로 활성인 단백질의 농도로 물에 용해된 본 발명의 화합물을 포함한다. 제제는 버퍼를 포함할 수 있고 단순한 수크로오스(예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압의 제어)를 포함할 수 있다. 분무기 제제는 에어로졸을 형성하는데 용액의 원자화에 의해 발생된 단백질의 표면 유발 결합을 감소 또는 막기 위해서 계면활성제를 함유할 수 있다.
정량식 흡입기로 사용하기 위한 제제는 계면활성제의 도움으로 추진체에 현탁된 본 발명의 화합물을 함유하는 곱게 분리된 분말을 일반적으로 포함할 것이다. 추진체는 클로로플루오로탄소, 하이드로클로로플루오로탄소, 하이드로플루오로탄소 또는 트라이클로로플루오로메테인, 다이클로로다이플루오로메테인, 다이클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에테인 또는 이의 조합을 포함하는 탄화수소와 같은 이런 목적을 위해 사용된 임의의 통상적인 재료일 수 있다. 적절한 계면활성제는 트라이올레산 소르비탄 및 레시틴 소야를 포함한다. 올레산은 계면활성제로 유용할 수 있다.
분말 흡입기로부터 분산하기 위한 제제는 본 발명의 화합물을 함유하는 곱게 나뉜 건조 분말을 포함할 것이고 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양, 예를 들어, 제제의 약 50 내지 90중량%으로 락토오스, 소르비탈, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 자일리톨과 같은 벌킹제를 포함할 수 있다.
비강 전달 형태
본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 약학적 조성물의 비강 전달이 고려된다. 비강 전달은 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코에 투여한 후에, 제품을 폐에 증착시킬 필요 없이, 직접 혈류에 단백질을 통과시킨다. 비강 전달을 위한 제제는 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 가진 것들을 포함한다. 다른 점막을 통과하는 수송을 통한 전달도 개시된다.
복용량
상기한 질환의 치료를 위한 방법과 관련된 복용법은 약물을 작용을 변형하는 다양한 인자들, 예를 들어, 환자의 나이, 상태, 체중, 성별 및 식이 요법, 임의의 감염의 심각성, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여, 주치의가 결정하게 될 것이다. 일반적으로, 일일 섭생법은 체중의 kg 당 본 발명의 화합물의 0.01-1000 마이크그램의 범위, 바람직하게는 kg 당 0.1-150 마이크로그램의 범위이어야 한다.
변형된 치료 단백질에 의한 질환의 치료
본 발명은 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있는 다양한 트랜스페린 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 인슐린 저항성(insuline resistance), 고당증(hyperglycemia), 고인슐린증(hyperinsulinemia), 또는 유리 지방산 또는 글리세롤의 상승된 혈액 레벨, 고지질증(hyperlipidemia), 비만, 신드롬 X, 대사증후군(dysmetabolic syndrome), 감염, 당뇨 복합증, 손상된 글루코오스 항상성(impaired glucose homeostasis), 제 2 형 당뇨병, 전 당뇨병(prediabetes), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 신경계 장애, 울혈성 심부전(congestive heart failure), 소화 불량(dyspepsia) 및 과민성 장증후군(irritable bowel syndrome)을 포함하나 이에 한정되지 않는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 변형 폴리펩타이드 및 펩타이드는 CNS를 활성화하기 위해 CNS에 항불안 효과를 일으키는데 사용될 수 있고 수술 후 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드는 트랜스페린 또는 변형 트랜스페린에 융합되고 또는 DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호되기 때문에 변형되지 않는 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드보다 생체내에서 더욱 안정해진다. 따라서, 효과적인 치료를 위해서 더 작은 양의 분자들이 투여될 수 있다. 일부 경우에 더 낮은 복용량이 부작용을 감소시킬 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드는 진정제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하여 중추 또는 말초 신경계의 활성을 증가시키는 비정상을 가진 포유류 환자를 진정시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에 진정 효과 또는 항불안 효과를 일으키는데 충분한 양으로 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 내대뇌정맥(intracerebroventriculary), 경구, 피하, 근육내, 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 이런 방법은 불안, 운동 장애, 공격성, 정신 이상, 발작, 공포 발작, 히스테리 및 수면 장애와 같은 신경계 질환을 치료 또는 완화하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 환자에 대한 활성 효과를 일으키는데 충분한 양으로 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유류 환자의 활성을 증가시키는 방법을 포함한다. 환자는 중추 또는 말초 신경계의 활성을 감소시키는 질환을 가진다. 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 우울증, 정신분열정동증(schizoaffective disorder), 수면무호흡(sleep apnea), 낮은 집중력을 가진 주의력 결핍증, 기억력 손실, 건망증 및 수면발작의 치료 또는 완화에 유용하며, 중추 신경 시스템의 각성이 바람직할 수 있는 약간의 질환을 예로 들었다.
또한, 특정한 형태의 수술, 선택적 복부 수술 후의 인슐린 저항성은 수술 후 첫날에 가장 많이 발견되고 적어도 5일 동안 지속하고 정상화되는데 3주가 필요하다. 따라서, 수술을 마친 환자는 수술의 외상 이후에 일정 시간 동안 본 발명의 변형된 인슐린분비 폴리펩타이드의 투여를 필요로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 수출 후 치료에 사용할 수 있다. 환자는 수술을 실시하기 전에, 수술 중에, 및 수술 후에 약 5일 동안 약 1-16시간 동안 본 발명의 변형된 인슐린분비 펩타이드가 필요하다.
또한, 인슐린분비 펩타이드와 같은 본 발명의 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 수술 후 치료에서 이들의 사용과 독립되게 인슐린 저항성을 치료하는데 사용될 수 있다. 인슐린 저항성은 인슐린과 세포-표면 수용체에 대한 결합의 감소 또는 세포내 신진대사의 변형 때문일 수 있다. 인슐린 민감성의 감소를 특징으로 하는 제 1 형은 통상적으로 인슐린 농도를 증가시킴으로써 치료될 수 있다 인슐린 반응성의 감소를 특징으로 하는 제 2 형은 다량의 인슐린으로 치료되지 않는다. 외상 이후의 인슐린 저항성은 인슐린 저항성의 정도에 비례하는 양의 인슐린으로 치료될 수 있고 인슐린 민감성의 감소에 의해 분명히 일어난다.
바람직하게는, 본 발명은 글루코오스-의존성, 인슐린-의존성 및 인슐린 비의존성 메카니즘을 통해 고당증을 정상화시키기 위해 변형 인슐린분비 펩타이드를 제공한다. 이와 같이, 변형 인슐린분비 펩타이드는 당뇨병, 특히 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 주요 물질로 유용하다. 본 발명은 펩타이드의 작용이 혈액의 글루코오스 농도에 의존하며 고당증 부작용의 위험이 현재 치료 방법을 사용하여 위험을 크게 감소시킨다는 점에서 제 1 형 및 제 2 형의 당뇨병을 가진 환자들의 치료에 특히 적합하다.
환자의 혈당 레벨을 정상화하는데 효과적인 변형 인슐린분비 펩타이드의 복용량은 여러 인자에 의존할 것인데, 인자들은 환자의 성별, 체중 및 연령, 혈당 제어 불능의 심각성, 혈당 제어 불능의 주요 원인, 글루코오스 또는 다른 탄수화물 소스가 동시에 투여되는 여부, 투여 경로와 생체이용률, 신체에서의 저항성, 제제 및 효과를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 인슐린분비 펩타이드와 같은 본 발명의 변형된 치료 펩타이드는 손상된 글루코오스 내성, 당뇨, 고지질증, 대사산증, 당뇨병, 당뇨신경병증, 및 신경장애의 치료에 사용된다. 더욱 바람직하게는, 변형 펩타이드는 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 변형 GLP-1 및 이의 유사체이다.
변형된 치료
폴리펩타이드
및
펩타이드의
존재의 관찰
변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드는 기능성 활성, HPLC-MS 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 항체를 결정하기 위한 측정법을 사용하여 관찰될 수 있다. 예를 들어, 포유류 숙주의 혈액은 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 활성 및/또는 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 존재를 위해 관찰될 수 있다. 여러 번 숙주의 혈액의 일부 또는 샘플을 취함으로써, 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 치료적으로 활성이 되는 충분한 양으로 수명이 긴 혈액 성분에 결합하는지를 결정하고, 그런 후에, 혈액에서 변형된 치료 펩타이드 또는 펩타이드의 레벨을 결정할 수 있다. 원한다면, 변형 인슐린분비 펩타이드와 같은 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 결합하는 혈액 성분을 결정할 수 있다.
예로서, 인슐린분비 활성을 위한 측정법은 본 발명의 변형 인슐린분비 펩타이드를 관찰하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 변형된 인슐린분비 펩타이드는 변형되지 않은 인슐린분비 펩타이드의 인슐린분비 활성과 적어도 동일한 인슐린분비 활성을 가진다. 변형 인슐린분비 펩타이드의 인슐린분비 특성은 변형 펩타이드를 동물 세포에 제공하거나 이 펩타이드를 동물 속에 주입하고 배지 또는 동물의 순환계 속에서 면역반응성 인슐린의 배출을 관찰하여 결정할 수 있다. 면역반응성 인슐린의 존재는 인슐린을 특이적으로 탐지하는 방사선면역측정법을 사용하여 탐지된다. 비록 IRI의 존재를 탐지할 수 있는 임의의 면역측정법이 사용될 수 있지만, 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 알바노, 제이.디.엠 등(1972 Acta Endocrinol. 70:487-509)의 측정법의 변형된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 인슐린분비 특성은 췌장 주입에 의해 결정될 수 있다(참조로 본 명세서에 포함된 Penhos, J.C., et al. 1969 Diabetes 18:733-738). 뇌관류(perfusion)가 수행되고, 변형되고 분석되는 방식은 본 명세서에 참조로 포함된 위어, 쥐.씨.등(J. Clin. Investigat. 54:1403-1412(1974))의 방법을 따르는 것이 바람직하다.
질량분석기(MS)와 결합된 HPLC는 변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드의 존재를 측정하는데 사용될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. 0.1% TFA/물 및 0.1% TFA/아세토나이트릴과 같이 통상적으로 두 개의 이동상을 사용한다. 컬럼 온도 및 구배 상태는 변할 수 있다.
변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드의 존재를 관찰하기 위한 다른 방법은 변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드에 특이적인 항체를 사용하는 것이다. 특정 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이성을 가지며, 단클론 또는 다클론인 항체의 사용은 어떠한 이런 문제를 중재하는데 도움이 될 수 있다. 항체는 특정 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 물질의 면역성 절편으로 면역화된 숙주 또는 물질의 항원결정부위에 상응하는 합성 면역원으로부터 발생하거나 유도될 수 있다. 바람직한 항체는 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 높은 특이성과 친화력를 가질 것이다. 이런 항체들은 효소, 형광색소 또는 식별용 방사선 동위원소로 식별화될 수 있다.
항체들은 혈류에서 변형된 치료 폴리펩타이드 및 펩타이드의 존재를 관찰하는데 사용될 수 있다. 혈액 및/또는 혈청 샘플은 SDS-PAGE와 웨스턴 블러팅에 의해 분석될 수 있다. 이런 기술은 혈액 또는 혈청의 분석하여 변형된 치료 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 혈액 성분에 대한 결합을 결정하게 한다.
글루카콘
-유사
펩타이드
-1(
GLP
-1)
재조합 DNA 기술은 증가된 안정성과 생물학적 활성을 가진 새로운 분자들을 만드는데 사용되고 있다. 이런 분자들은 생물학적으로 활성인 단백질과 면역글로불린 Fc 부분, 알부민 및 트랜스페린과 같은 자연적으로 반감기가 긴 안정화 단백질과 융합된 펩타이드의 조합이다. 이런 융합 분자들은 자연적이고 비융합된 단백질 또는 펩타이드 대응체보다 휠씬 더 긴 약물에 대한 신체 반응을 가진 활성 모이어티의 생물학적 활성을 보유한다. 약물에 대한 신체 반응의 증가는 생물학적 활성을 증가시키고, 원치 않은 부반응을 감소시키고 환자에 대한 편리함을 증가시킨다. 인터페론-알부민, 인터페론-Fc, BNP-알부민, GLP-1-알부민, GLP-1-트랜스페린과 같은 융합 단백질의 여러 예들이 있다.
비록 융합 단백질은 안정하고 분해에 저항성이 있지만, 활성 모이어티를 분해하는 주요 프로테아제 메카니즘은 분자의 불활성화를 늦출 수 있다. 구체적으로, GLP-1, 다이노르핀(dynorphin)(Berman YL, Julinao L, Devi LA J Biol Chem. 1995 Oct 6;270:23845-50), 엔키팔린(enkephalin)(Gu ZF, Menozzi D, Okamoto A, Maton PN, Bunnett NW Exp Physiol. 1993 Jan; 78:35-48), BNP, ANP, 안지오텐신(angiotensin), 브레디키닌(bradykinin) 및 PYY와 같은 많은 펩타이드는 다이펩티딜-펩티다아제 IV, 중성 엔도펩티다아제와 같은 프로테아제에 영향을 받기 매우 쉽다. 이런 프로테아제는 개별적으로 또는 조합해서 순환에서 펩타이드의 빠른 불활성화를 일으킨다. 펩타이드와 알부민, Fc 및 트랜스페린과 같은 거대 단백질의 융합은 프로테아제에 현저한 저항성을 부여한다. 그러나, 프로테아제에 의한 불활성화 효과를 완전히 제거할 수 없다. 따라서, 융합 단백질과 프로테아제 억제제의 조합은 융합 단백질 단독보다 더 우수한 PK 및 PD를 가질 수 있다.
본 발명은 프로테아제에 저항성이 있는 치료 펩타이드를 포함하는 트랜스페린 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 변형된 치료 펩타이드는 DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호된 변형 인슐린분비 펩타이드이다. 더욱 바람직하게는, 변형 인슐린분비 펩타이드는 변형 GLP-1 펩타이드 및 유사체 및 이의 절편이다. 변형 GLP-1 펩타이드 및 유사체 및 이의 절편은 당뇨병, 특히 제 2 형 당뇨병 치료에 효과가 있다. 자연형 GLP-1의 N-말단 서열은 His-Ala-Glu이고; 본 발명의 변형 GLP-1 폴리펩타이드는 His-His-Ala-Glu(SEQ ID NO:115), Gly-His-Als-Glu(SEQ ID NO:116), His-Gly-Glu, His-Ser-Glu, His-Ala-Glu, His-Gly-Glu, His-Ser-Glu, His-His-Als-Glu(SEQ ID NO:82), His-His-Gly-Glu(SEQ ID NO:83), His-His-Ser-Glu(SEQ ID NO:84), Gly-His-Ala-Glu(SEQ ID NO:85), Gly-His-Gly-Glu(SEQ ID NO:86), Gly-His-Ser-Glu(SEQ ID NO:87), His-X-Ala-Glu, His-X-Gly-Glu 및 His-X-Ser-Glu로 이루어진 그룹으로부터 선택된 N-말단 서열을 포함할 수 있으며, X는 임의의 아미노산이다. 하기한 대로, 다른 변형물은 프로테아제 분해를 감소하고 예방할 수 있으며 이런 분자들은 본 발명의 방법과 조성물에서 사용될 수 있다. 또한, 임의의 GLP-1 모이어티 또는 GLP-1 유사체, 유도체 또는 모방체는 본 발명의 방법과 조성물에서 (융합 단백질로) 사용될 수 있다.
GLP-1의 N-말단에 아미노산을 첨가하면 입체 장애 때문에 다이펩티딜 펩티다아제가 GLP-1의 제 2 아미노산에서 분해되는 것을 막을 수 있다. 따라서, GLP-1는 기능적으로 활성인 체로 존재할 것이다. 20개 아미노산의 임의의 하나 또는 비천연 아미노산이 GLP-1의 N-말단에 첨가될 수 있다. 또한 히스티딘은 바람직한 아미노산이다. 일부 예에서, 전하가 없거나 양으로 하전된 아미노산이 사용될 수 있고 바람직하게는 글리신과 같은 더 작은 아미노산이 첨가된다. 추가 아미노산을 가진 변형 GLP-1는 트랜스페린에 융합되어 융합 단백질을 만들 수 있다. 한 실시예에서, GLP-1 펩타이드는 이의 아미노 말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 함유하도록 변형된다. 다른 실시예에서, GLP-1 펩타이드는 이의 아미노 말단에 적어도 다섯 개의 추가 아미노산을 함유하도록 변형된다. 선택적으로, GLP-1 펩타이드는 이의 아미노 말단에 하나 내지 다섯 개의 추가 아미노산을 함유하도록 변형된다.
글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)은 소위 엔트라-인슐라 축(enteroinsular axis)에 속하는 인슐린 분비를 제어하는 위장 호르몬이다. 엔트라-인슐라 축은 장에서 영양분의 존재 및 흡수에 반응하여 위장 점막으로부터 배출된 호르몬의 그룹을 지정하며, 인슐린의 초기 및 잠재적 배출을 향상시킨다. 인슐린 분비에 대한 증가 효과인 인크레틴 효과는 아마도 정상적인 글루코오스 내성에 필수적이다. GLP-1은 인크레틴 효과를 담당하기 때문에 생리적으로 중요한 인슐린분비 호르몬이다.
GLP-1은 프로글루카곤 유전자의 생성물이다(Bell, et al., 1983, 304:368-371). GLP-1은 두 개의 주요 분자 형태인 GLP-1(7-36) 아마이드 및 GLP-1(7-37)로 소장 내분비 세포에서 합성된다. 1980초에 프로글르카곤에 대한 cDNA 및 유전자의 복제 이후에 펩타이드가 최초로 동정되었다.
전장 펩타이드 GLP-1(1-37 및 1-36아마이드)에 대해 행해진 최초 연구는 더 큰 GLP-1 분자는 생물학적 활성이 없는 것으로 결론내렸다. 1987년에, 3개의 독립된 연구 단체가 처음 6개의 아미노산을 제거하면 향상된 생물학적 활성을 가진 GLP-1 분자를 생성한다는 것을 증명하였다.
GLP-1의 아미노산 서열은 쉬미드 등에 의해 개시되었다(1985 Diabetologia 28 704-707). 인간 GLP-1은 회장(distal ileum), 췌장 및 뇌에 있는 L-세포에서 합성되는 프리프로글루카곤으로부터 유래된 37개의 아미노산 잔기 펩타이드이다. 프리프로글루카콘의 GLP-1(7-36) 아마이드, GLP-1(7-37) 및 GLP-2로의 처리는 주로 L-세포에서 발생한다. GLP-1(7-37)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:32(X=Gly)이다:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln- Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
GLP-1(7-36) 아마이드에서, 말단 Gly는 NH2로 교체된다.
GLP-1 유사 분자들은 제 2 형 당뇨병(인슐린-비의존성 당뇨병(NIDDM) 및 일부 경우에, 제 1 형 당뇨병을 앓고 있는 인간 환자에서 항-당뇨 활성을 가진다. GLP-1에 의한 치료는 글루코오스 레벨이 증가하면, 증가된 인슐린 분비 및 생합성, 감소된 글라카곤 분비, 지연된 장 배출과 같은 효과를 나타내어, 인슐린 또는 설포닐 우레아보다 효과적으로 더 안전한 치료를 제공한다. 환자의 식후 및 글루코오스 레벨은 적절한 GLP-1 치료에 의해 정상 레벨로 이동할 수 있다. GLP-1 유사 분자는 제 2 형 환자에서 췌장 베타 세포 기능을 보호하고 심지어 회복하는 능력을 갖는 것으로 주장하는 논문들이 있다.
임의의 GLP-1 서열은 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37)을 포함하는 아미노산 말단에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 변형될 수 있다. 또한 GLP-1은 위장관에 강력하게 작용한다. 생리적 양으로 융합된 GLP-1은 펜타가스트린-유발 위산뿐만 아니라 음식-유발 위산 분비를 효과적으로 억제한다(Schholdager et al., Dig. Dis. Sci. 1989, 35:703-708; Wettergren et al., Dig Dis Sci 1993; 38:665-673). 또한 위장 배출 속도와 췌장 효소 분지를 억제한다(Wettergren et al., Dig Dis Sci 1993; 38:665-673). 위장 및 췌장 분비 및 유동성에 대한 유사한 억제 효과는 탄수화물 또는 지질 함유 용액에 의한 회장의 뇌관류에 의해 사람에게 일어날 수 있다(Layer et al., Dig Dis Sci 1995, 40:1074-1082; Layer et al., Digestion 1993, 54:385-38). 동시에, GLP-1 분비는 크게 자극되어, GLP-1은 소위 "회장-브레이크 효과(ileal-brake effect)에 적어도 부분적인 원인이 되는 것으로 생각된다(Layer et al., Digestion 1993; 54:385-38). 사실상, 최근 연구는 생리학적으로, GLP-1의 회장-브레이크 효과는 췌장 섬세포에 대한 이의 효과보다 더욱 중요한 것으로 주장한다. 따라서, 복용 반응 연구에서 GLP-1은 섬세포 분비에 영향을 미치는데 필요한 양 정도로 낮은 주입 속도로 위장 배출 속도에 영향을 미친다(Nauck et al., Gut 1995;37(suppl.2): A124).
GLP-1은 음식 섭취에 대한 효과를 갖는 것 같다. GLP-1의 심실내 투여는 쥐의 음식 흡수를 완전히 억제한다(Schick et al., in Ditschuneit et al.(eds.), Obesity in Europe, John Libbey & Company ltd, 1994; pp. 363-367; Turton et al., Nature 1996, 379:69-72). 이런 효과는 매우 특이적인 것으로 보인다. 따라서, N-말단이 연장된 GLP-1(1-36아마이드)은 불활성이고 적절한 양의 GLP-1 길항제, 엑신딘 9-39은 GLP-1의 효과를 없앤다(Tang-Christensen et al., Am. J. Physiol., 1996, 271(4 Pt 2):R848-56). GLP-1의 급격한 말초 투여는 쥐에서 음식 흡수를 급격하게 억제하지 않는다(Tang-Christensen et al., Am. J. Physiol., 1996, 271(4 Pt 2): R848-56; Turton et al., Nature 1996,379:69-72). 그러나, 소장 L-세포로부터 분비된 GLP-1은 포만상태 신호로서 작용할 수 있다.
당뇨 환자에서, GLP-1의 인슐린분비 효과 및 위장관에 대한 GLP-1의 효과는 보존되어(Willms et al, Diabetologia 1994;37, suppl.1:A118), 음식 유발 글루코오스 증대를 억제할 수 있으나, 더욱 중요하게는, 음식 흡수에 영향을 미칠 수 있다. 연속해서 1주일 동안 정맥으로 투여된 후, 4ng/kg/min의 GLP-1는 현저한 부작용 없이 NIDDM 환자에서 현저하게 향상된 혈당 제어를 나타내었다(Larsen et al., Diabetes 1996; 45, suppl. 2:233A).
DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호된 변형 GLP-1 및 변형 GLP-1 유사체는 제 1 형 및 제 2 형 당뇨병과 비만의 치료에 효과적이다.
본 명세서에 사용된 "GLP-1 분자"라는 용어는 GLP-1, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유도체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "GLP-1 유사체"라는 용어는 GLP-1과 비교하여 하나의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 첨가를 가진 분자로 정의된다. 많은 GLP-1 유사체들이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Val8-GLP-1(7-37), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37) 및 Lys18-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:72)를 포함한다. 미국특허 제 5,118,666호는 GLP-1(7-34) 및 GLP-1(7-35)와 같은 GLP-1 유사체의 예를 개시한다.
"GLP-1 유도체"라는 용어는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 가지나, 하나 이상의 이의 아미노산 측쇄기, α-탄소 원자, 말단 아미노기 또는 말단 카복실기의 화학적 변형을 추가로 갖는 분자로 정의된다. 화학적 변형은 화학적 모이어티의 첨가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 모이어티의 제거를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "GLP-1 관련 화합물"이란 용어는 GLP-1, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유도체 정의 내에 해당하는 임의의 화합물을 의미한다.
WO 91/11457은 GLP-1 모이어티로 유용할 수 있는 활성 GLP-1 펩타이드 7-34, 7-35, 7-36, 및 7-37의 유사체를 개시한다.
EP 0708179-A2(Eli Lilly & Co)는 N-말단 이미다졸기 및 선택적으로 위치 34의 리신 잔기에 부착된 가지 없는 C6-C10 아실기를 포함하는 유도체를 개시한다.
EP 0699686-A2(Eli Lilly & Co)는 생물학적으로 활성인 것으로 보고된 GLP-1의 N-말단 절단 절편을 개시한다.
미국특허 5,545,618G는 필수적으로 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) 또는 GLP-1(7-37) 또는 이의 아마이드 형태 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 GLP-1 분자를 개시하며, 다음 그룹을부터 선택된 적어도 하나의 변형을 가진다: (a) 위치 26 및/또는 위치 34에 있는 리신의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아르기닌, 또는 D-리신에 의한 치환; 또는 위치 36에 있는 아르기닌의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 타이로신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 리신 또는 D-아르기닌에 의한 치환(SEQ ID NO:73); 위치 31에 있는 트립토판의 산화-저항성 아미노산에 의한 치환(SEQ ID NO:74); (c) 위치 16에 있는 발린의 티로신에 의한 치환; 위치 18에 있는 세린의 리신의 치환; 위치 21에 있는 글루탐산의 아스파르트산에 의한 치환; 위치 22에 있는 글리신의 세린에 의한 치환; 위치 23에 있는 글루타민의 아르기닌에 의한 치환; 위치 24에 있는 알라닌의 아르기닌에 의한 치환 및 위치 26에 있는 리신의 글루타민에 의한 치환 중 적어도 하나의 치환(SEQ ID NO:75); 및 (d) 글리신, 세린 또는 위치 8에 있는 알라닌의 글리신, 세린 또는 시스테인에 의한 치환; 위치 9에 있는 글루탐산의 아스파르트산, 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 타이로신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 또는 페닐알라닌에 의한 치환; 위치 10에 있는 글리신의 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 타이로신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌 또는 페닐알라닌에 의한 치환; 및 위치 15에 있는 아스파르트산의 글루탐산에 의한 치환 중 적어도 하나의 치환 및 (e) 위치 7에 있는 히스티딘의 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 타이로신, 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 메티오닌, 또는 페닐알라닌 또는 D- 또는 N-아실화 또는 알킬화 형태의 히스티딘에 의한 치환(SEQ ID NO:77); 여기서 치환은 (a), (b), (d) 및 (e)이고, 치환된 아미노산은 선택적으로 D-형태일 수 있고 위치 7에서 치환된 아미노산은 선택적으로 N-아실하 또는 N-알킬화 형태일 수 있다.
미국특허 제 5,118,666호는 인슐린분비 활성을 갖는 GLP-1 분자를 개시한다. 이런 분자는 아미노산 서열 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(GLP-1, 7-34, SEQ ID NO:32 참조) 또는 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(GLP-1, 7-35, SEQ ID NO:32 참조)를 가진 펩타이드 및 상기 펩타이드의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 상기 펩타이드는 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 산 첨가염; 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 카복실산염; 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 저급 알킬에스터; 및 상기 아마이드, 저급 알킬 아마이드, 및 저급 다이알킬 아마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 아마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
미국특허 제 6,277,819호는 환자에 GLP-1, GLP-1 유사체, 및 GLP-1 유도체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 심근경색증(myocardial infarction) 후 사망자수와 사망률을 감소시키는 방법을 교시한다. GLP-1 유사체는 다음 구조식(SEQ ID NO: **)로 나타내어진다: R1-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X2-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X3-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2(SEQ ID NO:78) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 여기서 R1은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데사아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 베타-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, 알파-플루오로메틸-히스티딘 및 알파-메틸-히스티딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; X1은 Ala, Gly, Val, Thr, Ile 및 알파-메틸-Ala로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; X2는 Glu, Gln, Ala, Thr, Ser 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; X3는 Glu, Gln, Ala, Thr, Ser 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; R2는 NH2 및 Gly--OH로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; GLP-1 유사체가 약 6.0 내지 약 9.0 범위의 등전점을 가지며 R1이 His이고, X1이 Ala이고, X2는 Glu이고 X3는 Glu이면, R2는 NH2이어야 한다.
리젤 등(Journal of Endocrinology, 1998, 159:93-102)은 GLP-1 유사체, 두 번째 N-말단 알라닌이 세린으로 치환된 [Ser8]GLP-1를 개시한다. 변형은 펩타이드의 인슐린분비 작용을 손상시키지 않으나, GLP-1과 비교하여 증가된 혈장 안정성을 가진 유사체를 생산한다.
미국특허 6,429,197호는 급성 발작 또는 출혈 후 GLP-1의 치료, 바람직하게는 정맥 투여는 인슐린 분지를 최적화하고, 뇌 동화작용을 증가시키고, 글루카곤을 억제하여 인슐린 효과를 증가시키며 정상혈당 또는 심한 저혈당증의 위험이 없고 또는 다른 부작용이 없는 가벼운 저혈당증을 유지하기 위한 수단을 제공하기 때문에 이상적인 치료가 될 수 있다고 교시한다. 본 발명은 인슐린 분지를 최적화하고, 뇌 동화작용을 증가시키고, 글루카곤을 억제하여 인슐린 효과를 증가시키며 정상혈당 또는 심한 저혈당증의 위험이 없고 또는 다른 부작용이 없는 가벼운 저혈당증을 유지하기 위해서, 급성 발작 또는 출혈 후 GLP-1 또는 이의 생물학적으로 활성인 유사체로 허혈성 뇌(ischemic brain) 또는 재관류뇌(reperfused brain)의 치료 방법을 제공한다.
미국특허 제 6,277,819호는 GLP-1, GLP-1 유사체, GLP-1 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 혈당을 정상화하는데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하여 심근경색증 후에 사망자수와 사망률을 감소시키는 방법을 제공한다.
미국특허 제 6,191,102호는 체중 감소를 일으키는데 효과적인 적어도 4주 동안의 시간 동안 체중의 감소를 일으키는데 충분한 양으로 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩타이드 유사체(GLP-1 유사체), 글루카곤-유사 펩타이드 유도체(GLP-1 유도체) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하여 체중 감소가 필요한 환자의 체중을 감소하는 방법을 제공한다.
GLP-1은 피하 투여 후에 완전히 활성화되지만(Ritzel et al., Diabetologia 1995; 38:720-725), 다이펩디틸 펩티다아제 IV-유사 효소에 의한 분해 때문에 주로 빠르게 분해된다(Deacon et al., J Clin Endocrinol Metab 1995, 80:952-957; Deacon et al., 1995, Diabetes 44:1126-1131). 따라서, 불행히도, GLP-1 및 많은 이의 유사체는 인간에서 짧은 혈장 반감기를 가진다(Orskov et al., Diabetes 1993; 42:658-661). 따라서, 본 발명의 목적은 GLP-1(7-37)에 대한 연장된 작용 형태를 가진 변형 GLP-1 또는 이의 유사체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 GLP-1(7-37)보다 더 낮은 제거율을 갖는 GLP-1 유도체 및 이의 유사체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 향상된 안정성을 가진 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명은 상기한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 GLP-1과 관련된 질환을 치료하기 위한 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 용도를 포함한다.
본 발명의 한 태양에서, 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, Remington's Pharmaceutial Sciences, 1985에 개시된 대로, 약학적 조성물을 제제화하는 임의의 기정된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 조성물은 전신성 주사 또는 주입에 적합한 형태일 수 있고 살균수 또는 등장액 또는 글루코오스 용액과 같은 적절한 액체 부형제로 제제화될 수 있다. 조성물은 당업계 주지된 통상적인 살균 기술에 의해 살균될 수 있다. 최종 수용액은 무균 상태하에서 사용하거나 여과하기 위해 포장될 수 있고 동결건조된 제제는 투여되기 전에 살균 수용액과 혼합된다. 조성물은 완충제, 강직성 조절제 등과 같이 유사한 생리적 상태에 대해 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체는 비강, 경피, 폐 또는 직장 투여에 적합할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 통상의 담체일 수 있다. 고체 담체의 예는 락토오스, 백토(terra alba), 수크로오스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산 마그네슘 및 스테아르산이다. 유사하게는, 담체 또는 희석제는 모노스테이르산 글리세릴 또는 다이스테아르산 글리세릴 단독 또는 왁스와 혼합된 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 서방출성 재료를 포함한다.
서방출성 제제 형태로 본 발명의 조성물을 제공하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 이와 같이, 조성물은 폴리락트산, 폴리글리콜산, 또는 락트산/글리콜산 코폴리머와 같은 적절한 약학적으로 허용가능한 생분해성 고분자에 의해 캡슐화되거나 분산된 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 함유하는 미세캡슐 또는 미세입자로 제제화될 수 있다.
비강 투여를 위해서, 제제는 에어로졸 용도를 위한 액체 담체, 특히 수용성 담체에 용해되거나 현탁된 변형 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 함유할 수 있다. 담체는 프로필렌 글리콜과 같은 용해제, 계면활성제, 레시틴(포스파티딜클로린) 또는 사이클로덱스트린과 같은 흡수 증가제 또는 파라벤과 같은 방부제와 같은 첨가제를 함유할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 복용량 당 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 복용 형태로 현탁된다.
또한, 본 발명은 상기한 것과 같은 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 상승된 글루코오스 레벨과 관련된 질환(대사 질환)의 치료에 사용될 수 있는 의료 제품의 제조를 위해 변형 GLP-1 및 GLP-1의 사용을 고려한다. 구체적으로, 본 발명은 제 2 형 당뇨병을 포함하는 당뇨병, 비만, 심한 화상 및 울혈성 심부전 및 급성관동맥 증후군(Acute coronary syndrome)과 같은 심부전의 치료에 변형 GLP-1 및 GLP-1 유사체의 사용을 고려한다.
본 발명은 DPP 활성으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 보호된 변형 엑센딘-3 및 엑센딘-4 펩타이드를 제공한다. 엑센딘-3 및 엑센딘-4은 GLP-1과 대략 53% 유사성을 가진 39개의 아미노산(잔기 2 및 3에서 다름)을 포함하는 인슐린자극 펩타이드이다. 엑센딘-3 서열은 HSDGTFTSDLSKQMEEEA VRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:79)이고 엑센딘-4 서열은 HGEGTFTSDLSKQMEEEA VRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS(SEQ ID NO:80)이다. 본 발명은 엑센딘-4(1-31)HGEGTFTSDLSKQMEEA VR LFIEWLKNGGPY(SEQ ID NO:81)과 같은 아미노산 서열을 포함하는 변형 엑센딘-4 절편을 포함한다. 추가로, 본 발명은 엑센딘-3 및 엑센딘-4 펩타이드의 변형 유사체를 포함한다.
당뇨병,
전당뇨병
또는 비만 치료를 위한
GLP
-1 융합 단백질 또는 접합체
변형 GLP-1은 생체내에서 증가된 전체 안정성을 위해 이형 분자에 융합될 수 있다. 변형 GLP-1은 당업계에 주지된 재조합 수단에 의해 이형 분자에 융합될 수 있거나 당업계에 주지된 방법에 의해 이형 분자에 공유 결합될 수 있다. 변형 GLP-1은 혈청 알부민 또는 트랜스페린, 면역글로불린 또는 Fc 도메인과 같은 이의 부분과 같은 혈장 단백질에 융합 또는 공유결합될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 트랜스페린, 락토트랜스페린 또는 멜라노트랜스페린에 융합된다. 이런 융합 단백질의 제조 방법은 본 명세서에 참조로 포함된 미국출원 10/378,094에 의해 제공된다.
GLP-1 분자는 더 큰 물리적 분리를 제공하고 융합 단백질을 사이의 공간 이동성을 더 허용하여, 예를 들어, 이의 동족 수용체에 결합하기 위해, 치료 단백질의 접근성을 최대화하기 위해 가변 길의 링커를 통해 이종 단백질에 부착될 수 있다. 링커 펩타이드는 유연하거나 또는 더욱 강한 아미노산으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리-글리신 전분과 같은 링커가 사용될 수 있다. 링커는 약 50, 40, 30, 20 또는 10 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 이종 단백질과 GLP-1에 공유결합되고 이들 사이에 공유결합될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 하나의 Ser 잔기, 두 개의 Ser 잔기, 펩타이드 Ser-Ser-Gly, 펩타이드 PEAPTD, 펩타이드(PEAPTD)2, IgG 힌지 링커와 조합된 펩타이드 PEAPTD, IgG 힌지 링커와 조합된 펩타이드(PEAPTD)2일 수 있다.
변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 부착되는 트랜스페린은 변형될 수 있다. 이것이 당화를 감소시킬 수 있다. 변형 트랜스페린 폴리펩타이드는 하나의 트랜스페린 N 말단, 하나의 트랜스페린 C 도메인, 트랜스페린 N 및 C 도메인, 두 개의 트랜스페린 N 도메인 및 두 개의 트랜스페린 C 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기한 대로, GLP-1은 신체에서 중요 내분비 호르몬을 활성화하고 제어하며 글루코오스의 대사에 중요한 제어 역할을 한다. 판매되는 다른 당뇨 치료제와 달리 GLP-1은 인슐린을 분비하고 민감성과 글루코오스 레벨을 더욱 안정시켜 현재 인슐린 레벨에 더욱 효과적으로 작용하기 위해서 β-세포에 대한 성장 인자로서 작용하여 인슐린을 분비하는 췌장의 능력을 향상시켜 회복되는 효과를 가진다. 이것이 글루코오스 레벨의 매일 관찰하는 부담을 줄여주며 당뇨병에 의한 혈당의 변동에 의해 발생된 심각한 장기간 부작용의 지연을 효과적으로 제공한다. 또한, GLP-1은 식욕과 체중을 감소시킬 수 있다. 비만은 글루코오스 대사의 제어를 잘하지 못한 본질적 결과이며 비만은 당뇨 질환을 가중시키는 역할만 한다.
천연 GLP-1의 임상적 용도는 순환에서 빠르게 분해되기 때문에(반감기는 수분이다) 제한된다. 순환에서 치료적 레벨을 유지하는 것은 치료 비용을 증가시키는 펌프 또는 패치 장치를 사용하는 다량의 일정한 투여를 필요로 한다. 이것은 당뇨병을 치료하고 글루코오스 레벨을 관찰하기 위한 모든 다른 변형과 공동으로 장기간 만성적 사용에 불편하다. 변형 GLP-1 융합 단백질은 GLP-1 활성을 보유하나 긴 반감기(14-17일), 용해도, 트랜스페린의 생체내 분포를 가진다. 이런 특성은 비용을 낮추며, 부피를 작게 하며, 월 1회 s.c.(피하) 주사를 하게 하며 이런 형태의 제품은 장기간 만성적 사용에 절대 필요하다.
변형 GLP-1은 이의 안정성을 증가시키기 위해 혈액 성분에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 변형 GLP-1은 혈청 알부민, 트랜스페린, 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 공유 결합될 수 있다. 한 실시예에서, 변형 GLP-1은 지방산 또는 지방산 유도체에 부착될 수 있다. 다른 실시예에서, 변형 GLP-1은 약물 친화 복합체(DAC) 속으로 처리될 수 있다. 상기한 대로, 킴 등(2003, Diabetes 52(3):751)은 GLP-1-알부민 약물 친화 복합체를 개시한다. 킴 등은 알부민-접합 DAC:GLP-1은 고유 GLP-1를 모방한다는 것을 보여준다. 킴 등은 GLP-1R 신호화의 연장된 활성화를 위한 새로운 방법을 제공한다.
피하 투여하자마자, DAC:변형 GLP-1은 생체내에서 빠르고 선택적으로 알부민에 결합한다. 형성된 생접합체는 내인성 CLP-1과 동일한 치료 활성과 동일한 효과를 가지나 알부민과 유사한 약물 생체 반응 형태를 가진다.
다른 치료제와 조합된 변형
GLP
-1 및 이의 융합 단백질
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 변형 GLP-1 펩타이드 및 이의 융합 단백질, 예를 들어, GLP-1-Tf 트랜스페린 단백질은 제 2 형 당뇨병, 비만, 및 비정상적인 글루코오스 레벨과 관련된 다른 질환 또는 질병을 치료하기 위해 글루코파아지®(염산 메트포르민 정제) 또는 글루코파아지® XR(염산 메트포르민 연장된 배출 정제)와 같은 적어도 하나의 보조 치료 분자와 조합해서 사용된다.
글루코파아지® 및 글루코파아지® XR은 제 2 형 당뇨병의 치료를 위한 구강 혈당강하제이다. 글루코파아지® XR은 글루코파아지의 연장된 배출 제제이다. 따라서, 글루코파아지® XR은 복용 형태로부터 천천히 배출되기 때문에 하루 1회 섭취될 수 있다. 글루코파아지®는 신체가 간으로부터 글루코오스를 적게 생산하는 것을 돕는다. 따라서, 글루코파아지®는 환자의 혈당 레벨을 제어하는데 효과적이다. 글루코파아지®는 신체가 더 많은 인슐린을 생산하게 하지 않기 때문에 저혈당(hypoglycemia)을 거의 일으키지 않는다.
글루코파아지®는 또한 제 2 형 당뇨병인 사람에게서 매우 높은 지방 혈액 성분, 트라이글리세라이드 및 콜레스테롤을 낮추는 것을 돕는다. 메트포르민은 식욕을 감소시키고 약을 섭취하기 시작할 때 수 파운드의 체중을 줄이는 것을 돕는다.
메트포르민은 설포닐우레아, 또는 인슐린에 의한 치료 또는 단일치료(그 자체)에 승인되어 있다. 메트포르민은 인슐린 저항성 환자에서 고혈압(WO 9112003-Upiohn), 혈액 덩어리의 용해(t-PA-유도체아 조합해서)(WO 9108763, WO 9108766, WO 9108767 및 WO 9108765-베링거 만니헤임), 빈혈 및 조직 무산소증(EP 283369-Lipha), 아테로마성 동맥경화증(DE 1936274-Brunnengraber & Co., DE 2257875-Hurka 및 미국특허 제 4,205,087-ICI)과 같은 다양한 심장 질환의 치료에 사용되는 것을 주장되었다. 또한, 관상동맥확장기 및 혈압을 낮추기 위해서 프로스타글란딘-유사체 사이클로펜테인 유도체와 조합해서 메트포르민을 사용하는 것이 제안되었다(미국특허 제 4,182,772호-호체스트). 메트포르민은 또한 2-하이드록시-3,3,3-트라이플루오로프로피온산 유도체(미국특허 제 4,107,329-ICI), 1,2-다이아릴에틸렌 유도체(미국특허 제 4,061,772-호체스트), 치환된 아릴옥시-3,3,3-트라이플루오로-2-프로피온산, 에스터 및 염(미국특허 4,055,595-ICI), 치환된 하이드록시페닐-파이페리돈(미국특허 제 4,024,267-호체스트), 및 부분적으로 수소첨가된 1H-인데노-[1,2B]-파이리딘 유도체(미국특허 제 3,980,656-호체스트)와 조합해서 사용될 때 콜레스테롤을 낮추는데 사용되는 것으로 주장되었다.
몬타나리 등(Pharmacological Research, Vol. 25 No. 1,1992)은 하루에 2회로(b.i.d) 500mg의 양의 메트포르민을 사용하면 하루 3회(t.i.d) 850mg 메트포르민과 유사한 방식으로 빈혈 후 혈액양을 증가시킨다는 것을 개시한다. 서토리 등(J. Cardiovas. Pharm., 6:914-923, 1984)는 하루 3회로(t.i.d) 850mg의 양으로 메트포르민은 말초 심장 질환을 가진 환자의 동맥 유량을 증가시킨다는 것을 개시한다.
본 발명은 메트포르민과 같은 하나 이상의 치료제와 조합해서 본 발명의 변형 GLP-1 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 다양한 질환의 치료법을 제공한다. 한 실시예에서, 메트포르민과 조합된 변형 GLP-1 또는 이의 융합 단백질은 당뇨병과 같은 비정상적인 글루코오스 레벨과 관련된 질환 및 질병을 치료하는데 사용된다. 바람직하게는, 메트포르민과 조합된 GLP-1/mTf 융합 단백질은 제 2 형 당뇨병 또는 비만을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 변형 GLP-1 또는 이의 융합 단백질과 조합해서 사용될 수 있는 다른 치료제는 설포닐우레아 및 설포닐우레아-유사 물질, 타이졸리딘디온(thiaxolidinediones), 퍼록시좀 증식기-활성화 수용체(PPAR) 감마 변형제, PPAR 알파 변형제, 단백질 타이로신 포스포타아제-1B 억제제, 인슐린 수용체 타이로신 키나아제 활성제, 11베타-하이드록시스테로이드 디하이드로지나아제 억제제, 글리코겐 포스폴릴라제 억제제, 글루코키나아제 활성제, 베타-3-아드레날린 길항제, 및 글루카곤 수용체 길항제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
DPP
-
IV
억제제
DPP-IV의 억제제는 DPP-IV에 의해 매개되는 다양한 질환의 치료에 효과가 있는 것을 보였다. 예를 들어, DPP-IV의 억제제는 글루코오스 알레르기의 치료 및 제 2 형 당뇨병 또는 비만과 같은 과당증과 관련된 질환의 치료 방법에 매우 효과적이다. 또한, DPP-IV는 이식 거부(Transplantation 1997, 63(10):1495-1500)와 같은 면역 반응에 부분적으로 작용하는 것을 보여진다. 따라서, DPP-IV는 이식 거부의 예방에 효과적일 수 있다. 또한, DPP-IV의 억제제는 암의 치료 및 암전이의 예방에 효과적일 수 있는데, 이는 폐의 내피 DPP-IV과 암세포의 피브로넥틴의 결합은 이런 세포들의 전이를 향상시키기 때문이다(J. Biol.Chem.1998,273(37:24207-24215). DPP-IV는 치주염(periodontitis)의 발병에 중요한 역할을 하며(Infect. Immum. 2000, 68(2), 716-724) 및 주요 절제 후에 장이 회복을 빠르게 하는 인자, GLP-2의 불활성화의 원인이 되는 것으로 생각된다(J. Surg. Res. 1999, 87(1), 130-133). 따라서, DPP-IV 억제제는 장의 회복에 잠재적으로 유효하다.
WO 95/15309는 DPP-IV의 억제제이고 따라서 여러 DPP-IV 매개 과정의 치료에 효과적인 특정 펩타이드 유도체를 개시한다. WO 95/13069는 천연 또는 내인성 성장 호르몬의 배출을 자극하는데 효과적인 특정 고리 아민 화합물을 개시한다. 유럽특허 제 555,824호는 트롬빈 시간을 연장하고 트롬빈 및 세린-관련 프로테아제를 억제하는 특정 벤즈이미다졸일 화합물을 개시한다. 생화학 및 생물리학의 공문서, Vol. 323, No.1, pgs. 148-154(1995)는 DPP-IV 억제제로 효과적인 아미노아실파이롤리딘-2-나이트릴을 개시한다. 신경화학저널, Vol 66, pgs. 2105-2112(1996)은 프로일 올리고펩티다아제를 억제하는데 효과적인 특정 Fmoc-아미노아실파이롤리딘-2-나이트릴을 개시한다. 일본화학회 게시판, Vol. 50, No.7, pgs. 1827-1830(1977)은 아미노헥사펩타이드, viz., Z-Val-Val-lmpro-Gly-Phe-Phe-OMe 및 이의 관련 아미노펩타이드의 합성을 개시한다. 또한, 상기 화합물의 항균성을 검사하였다. WO 90/12005는 프롤리렌도펩티다아제 활성을 억제하여 치매 또는 건망증 치료에 효과적인 특정 아미노산 화합물을 개시한다. 더원트 요약서 95:302548는 크롤린에스테라아제 활성을 낮추기 때문에 질환 치료에 효과적인 향상된 말초 선택성을 가진 콜린에스테라아제 활성자인 특정 N-(아릴(알킬)카본일)치환 이형고리 화합물을 개시한다. 화학 요약집 84:177689는 안지오텐신 변환 효소(ACE) 억제 활성을 나타내는 프롤린 화합물의 중간체로서 효과적인 특정 1-아실-파이롤리돈-2-카보나이트릴 화합물을 개시한다. 화학 요약집 96:116353은 다양한 암성 또는 골수성 백혈병을 치료하는데 효과적인 라스 파네실-트랜스페라아제 억제제인 특정 3-아미노-2-머캡토-프로필-프롤린 화합물을 개시한다. WO 95/34538은 DPP-IV를 억제하여 DPP-IV 억제에 의해 완화되는 질환을 치료하는데 효과적인 특정 파이롤리디데스(pyrrolidides), 포스포네이트, 아즈티딘(azetidines), 펩타이드 및 아자프롤린을 개시한다. WO 95/29190은 다중 표현(multiple presentation)을 가능하게 하는 펩타이드 매트릭스에 의해 수행되는 복수의 KPR-형 반복 패턴을 특징으로 하며 효소 DPP-IV에 대한 친화력을 가지는 특정 화합물을 개시하며, 이런 화합물은 HIV가 세포 속에 들어가는 것을 억제하는 능력을 나타낸다. WO 91/16339는 IL-2 억제에 의해 매개되는 자가면역 질환 및 질병을 치료하는데 효과적인 DPP-IV 억제제인 특정 폴리펩타이드 붕산을 개시한다. WO 95/11689는 HIV가 세포 속으로 들어가는 것을 막는데 효과적인 DPP-IV 억제제인 테트라펩타이드 붕산을 개시한다. 동독 특허 158109는 특히, DPP-IV 억제제로 효과적인 특정 N-보호 펩티딜-하이드록시아민산 및 나이트로벤조일옥시아마이드를 개시한다. WO 95/29691은 특히, 면역 시스템 이상의 치료에 효과적인 DPP-IV 억제제인 특정 다이펩타이드 프롤린 포스포네이트를 개시한다. 독일 특허 DD 296075은 DPP-IV를 억제하는 특정 아미노산 아마이드를 개시한다. Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1293, pgs. 147-153은 DPP-IV 및 PEP-촉매 가수분해에 대한 측쇄 변형의 영향을 연구하기 위해서 특정 다이- 및 트라이-펩타이드 p-나이트로아닐리데스(p-nitroanilides)의 제조를 개시한다. 생체유기 및 의약 화학 레터, Vol. 6, No.10, pgs. 1163-1166(1996)은 DPP-IV의 억제제인 특정 2-사이아노파이롤리딘을 개시한다. J. Med. Chem., Vol.39,pgs.2087-2094(1996)은 DPP-IV의 억제제인 특정 프롤린붕산-함유 다이펩타이드를 개시한다. Diabetes, Vol. 44, pgs. 1126-1131(96년9월)는 GLP-1은 당뇨 및 비당뇨 환자에게 피하 또는 정맥 경로로 투여될 때 빠르게 분해되는 것을 증명하는 연구에 관한 것이다.
미국특허 6,727,261호는 당뇨병, 특히 인슐린 비의존성 당뇨병 및 손상된 글루코오스 내성과 같은 DPP-IV와 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 효과적인 신규한 DPP-IV 억제제로 파이리도[2,1-a]아이소퀴놀린 유도체를 제공한다. 또한 이런 화합물은 장 질환, 급성 대장염, 위염, 비만 및/또는 대사장애의 치료 및/또는 예방에 효과적이다.
미국특허 제 6,716,843호는 DPP-IV 억제제로서 효과적인 알파-아미노산 설포닐 화합물을 제공한다.
미국특허 제 6,645,995호는 2-치환 불포화 이형고리 화합물을 개시하는데, 이형 고리에 있는 질소 원자는 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합을 통해 아미노산 또는 아미노산 유도체에 부착된다. 이런 화합물은 효과적이며 DPP-IV의 선택적 억제제이며, DPP-IV의 억제를 통해 제어되거나 정상화될 수 있는 질환을 치료하는데 효과적이다.
미국특허 제 6,617,340호는 N-(치환 글리실)-파이롤리딘 및 DPP-IV를 억제하는데 상기 화합물의 용도를 개시한다. 미국특허 제 6,124,305호는 DPP-IV를 억제하는 N-(치환 글리실)-2-사이아노파이롤리딘을 개시한다. 이런 화합물들은 DPP-IV에 의해 매개되는 질환을 치료하는데 효과적이다.
노바티스 화합물 1-[[[2-[(5-사이아노파이리딘-2-일)아미노]에틸]아미노]아세틸]-2-사이아노-(S)-파이롤리딘(NVP DPP728)을 제 2 형 당뇨병을 가진 93명의 환자(평균 HbA1c 7.4%)에게 4 주 동안 투여하면 4주 연구 기간 동안 혈장 글루코오스, 인슐린 및 HbA1c를 감소시켰다(Diabetes Care 2002, 25(5):869-875).
DPP
-
IV
의 억제제를 사용하는 혼합요법
한 태양에서, 본 발명은 다양한 질환을 치료하기 위해서 하나 이상의 DPP-IV의 억제제와 조합해서 치료 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 트랜스페린 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 트랜스페린 융합 단백질 및 하나 이상의 DPP-IV의 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 미국출원 No. 10/378,094에 개시된 대로, 치료 단백질, 폴리펩타이드 ,또는 펩타이드에 부착된 트랜스페린은 변형될 수 있다. 이것이 당화를 감소시킬 수 있다. 변형 트랜스페린 폴리펩타이드는 하나의 트랜스페린 N 말단, 하나의 트랜스페린 C 도메인, 트랜스페린 N 및 C 도메인, 두 개의 트랜스페린 N 도메인 및 두 개의 트랜스페린 C 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 트랜스페린에 부착된 치료 단백질 또는 펩타이드는 천연 또는 변형 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 트랜스페린 융합 단백질은 미국출원 No.10/378,094에 개시된 대로, 변형 트랜스페린 분자에 연결된 치료 펩타이드로서 GLP-1을 포함한다. 또 한, 본 발명의 혼합 요법은 GLP-1/mTf 융합 단백질, 하나 이상의 DPP-IV 억제제 및 다른 치료 분자를 포함한다. 이런 분자는 글루코파이지® 또는 글루코파이지®XR일 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 다이펩티딜 프로테아제 분해에 저항성이 있는 변형 단백질 또는 펩타이드 또는 하나 이상의 DPP-IV 억제제와 조합된 이의 융합 단백질의 용도를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 DPP-IV 억제제와 조합해서 변형 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 바람직하게는 변형 펩타이드는 변형 GLP-1이고 융합 단백질은 변형 GLP-1/mTf 단백질이다. 또한, 본 발명의 혼합 요법은 변형 GLP-1 또는 변형 GLP-1/mTf 단백질, 하나 이상의 DPP-IV 억제제, 및 글루코파이지® 또는 글루코파이지®XR과 같은 다른 치료 분자를 포함한다.
DPP-IV 억제제는 임의의 관련 질환을 치료하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 GLP-1-트랜스페린 융합 단백질은 전당뇨병, 당뇨병, 비만 또는 당뇨 증상을 치료하기 위해서 1-[[[2-[(5-사이아노파이리딘-2-일)아미노]에틸]아미노]아세틸]-2-사이아노-(S)-파이롤리딘(NVP DPP728)과 같은 DPP-IV 억제제와 결합될 수 있다. 이런 치료제들은 연속적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
트랜스페린 융합 단백질은 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:32) 또는 GLP-1(7-36)펩타이드(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, GLP-1(7-36) 펩타이드 또는 GLP-1(7-36) 펩타이드는 A8 내지 G 및 K34 내지 A 돌연변이를 포함한다. 트랜스페린 단백질은 GLP-1(7-37) 펩타이드 또는 GLP-1(7-36) 내지 트랜스페린 분자 사이에 링커를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 (PEAPTD)2 펩타이드이다.
엔도펩티다아제
억제제를 사용하는 혼합 요법에 의한 융합 단백질의 약동학 및
약력학의
향상
또한 본 발명은 천연 엔도펩티다아제(NEP) 억제제 및 트렌스페린 융합 단백질을 사용하는 혼합 요법을 제공한다. 또한, 본 발명은 NEP 및 DPP-IV 억제제 및 융합 단백질을 사용하는 혼합 요법을 포함한다. NEP 및 DPP-IV 억제제는 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 게다가, 억제제 및 트랜스페린 융합 단백질은 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 억제제는 트랜스페린 융합 단백질의 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다.
트랜스페린 융합 단백질은 GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:32) 또는 GLP-1(7-36)펩타이드(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, GLP-1(7-36) 펩타이드 또는 GLP-1(7-36) 펩타이드는 A8 내지 G 및 K34 내지 A 돌연변이를 포함한다. 트랜스페린 단백질은 GLP-1(7-37) 펩타이드 또는 GLP-1(7-36) 내지 트랜스페린 분자 사이에 링커를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 (PEAPTD)2 펩타이드이다.
엔케프탈리나아제, 넵프릴신 및 아트리오펩티다아제로 알려진 중성 엔도펩티다아제(NEP)는 뇌, 신장, 폐, 위장관, 심장 및 말초신경을 포함하는 많은 조직에서 발견되는 막-결합 아연 메탈로엔도펩티다아제이다. NEP는 순환성 나트륨 이뇨펩타이드(natriuretic peptide)를 퇴화시켜 나트륨 이뇨펩타이드의 제거에 중요한 역할을 하여, 혈관확장, 혈압 및 부피에 대한 이들의 효과를 예방한다. 나트륨 이뇨펩타이드의 퇴화 및 불활성화에 의한 NEP는 고혈압, 심부전 및 신부전과 관련이 있다.
순환성 나트륨 이뇨펩타이드를 퇴화시키는 것 이외에, NEP는 또한 순환성 브라다키닌; 아드레노메듈린, 신장 혈관확장 및 나트륨 이뇨성-이뇨성 펩타이드; 및/또는 ANP의 신장 형태인 유로달라틴을 포함하는 다른 혈관확장 물질을 퇴화한다.
또한 NEP는 내피 아이소폼 ET-1, 혈관수축제의 퇴화에 관여하고, ET-1의 형성에 관여할 수 있다(Brunner-La Rocca etal., Cardiovascular Research 51(2001)510-520). 또한 NEP는 안지오텐신 II, 잠재적인 혈관수축제, 엔도모르핀, 및 바라디키닌, GLP-1(Hupe-Sodamann, K., Goekem R., Geoke, B et al., Regualtory Peptides 1995;58:149-56, Hupe-Sodmannm, K, Goeke R., Goeke, B et al Peptide 1997; 18:625-32), PYY(Medeiros MD, Turner AJ., Endocrinolgoy. 1994 May;134(5):2088-94) 및 글루카곤(Terbbien R et al Am J Physiol Endocrino Metab. 2004 Sep;287(3):E431-8)과 같은 신진대사에 관여하는 다수의 펩타이드를 퇴화시킨다
포스포르아미돈과 같은 여러 NEP 억제제 또는 NEP/ACE 억제제(미국특허 제 5,508,272에 개시된 오마파트릴레이트(omapatrilat), 미국특허 제 5,552,397에 개시된 점파트릴레이트(gempatrilat), 미국특허 제 5,430,145에 개시된 샘파트릴레이트(samptrilat) 및 MDL100240을 포함)은 예를 들어, 고혈압 및 심부전의 단일치료적 치료에 효과적인 것으로 문헌에 보고되었다. 나트수완 등 " A Review of Vasopeptidase Inhibitors: A New Modality in the Treatment of Hypertension and Chronic Heart Failure," Pharmacotheraphy, Vol. 22(1), pp. 27-42(2002). 칸독사트릴(candoxatril) 및 에카도트릴(ecadotril)은 심부전에 대한 장래의 약물로서 현재 시험을 진행하는 NEP의 두 개의 고 특이적 억제제이다. 두 화합물은 동종체를 활성화하기 위해 신체에서 대사되는 프리드럭이다. 칸독사트릴은 간에서 칸독사트릴로 활성화되고, 에카도트릴은 이의 활성 동족체, S-티오판으로 변환된다.
ACE/NEP 억제제의 일부 예들은 미국특허 제 5,508,272, 5,362,727, 5,366,973, 5,225,401, 4,722,810, 5,223,516, 5,552,397, 4,749,688, 5,504,080, 5,612,359, 및 5,525,723 및 유럽특허출원 0481,522,0534363A2, 534,396 및 534,492에 개시된다.
본 발명은 다양한 질병 또는 질환을 치료하기 위한 트랜스페린 융합 단백질 및 DPP-IV 억제제 및/또는 ACE/NEP 억제제를 포함하는 혼합 요법을 제공한다. 이런 질병 또는 질환은 바람직하게는 제 2 형 당뇨병, 울혈성 심부전, 비만, 고혈압 및 과민성 장 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
형질변환 동물(
Transgenic
Animals
)
DPP 활성으로부터 보호된 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하는 형질변환 비인간 동물(non-human animal)들의 생산이 본 발명의 한 실시예에서 고려된다. 일부 실시예들에 있어서, 증가된 안정성을 갖는 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 형질변환 비인간 동물이 고려된다.
형질변환 비인간 동물들의 성공적인 생산이, 예컨대 미국특허 제6,291,740호(2001년 9월 18일 등록), 미국특허 제6,281,408호(2001년 8월 28일 등록), 및 미국특허 제6,271,436호(2001년 8월 7일 등록)과 같은 다수의 특허 및 공보에서 설명되고 있는데, 상기 문헌들의 내용은 그 전체로 본 명세서에 포함된다.
젖소, 돼지, 염소, 말, 소, 및 양을 포함하는 가축 포유 동물과 같은 동물들의 유전자 구성(genetic make-up)을 변경할 수 있는 능력은 다수의 상업적 응용을 가능하게 한다. 이러한 응용에는, 용이하게 생산되는 형태로 다량의 외인성 단백질(exogenous protein)을 발현(예컨대, 우유 또는 혈액으로의 발현)하는 동물들의 생산, 향상된 체중 증가, 사료 효율(feed efficiency), 육질 구성(carcuss composition), 우유 생산 또는 함량, 질병 내성 및 특정 미생물에 의한 감염 내성을 갖는 동물의 생산, 및 향상된 성장률 또는 재생산 능력을 갖는 동물의 생산이 포함된다. 게놈 내에 외인성 DNA 서열(exogenous DNA sequence)들을 갖는 동물들은 형질변환 동물들로 일컬어진다.
형질변환 동물들의 생산을 위해 가장 널리 사용되는 방법은 수정된 배아의 전핵으로의 DNA의 미세주입(월 등, 셀 생화학 저널. 49:113 [1992])이다. 형질변환 동물 생산의 다른 방법들은 레트로바이러스들 또는 레트로바이러스 벡터들에 의한 배아의 감염을 포함한다. 자연형 또는 재조합 레트로바이러스들에 의한 착상전 및 착상후 쥐 배아들의 감염이 보고되었다(야네니히, 국립 아카데미 과학 학회지 USA 73:1260 [1976]; 야네니히 등, 셀 24:519 [1981]; 스튤만 등, 국립 아카데미 과학 학회지 USA 81:7151 [1984]; 야너 등, 국립 아카데미 과학 학회지 USA 82:6927 [1985]; 판 데어 푸텐 등, 국립 아카데미 과학 학회지 USA 82:6148-6152 [1985]; 스튜어드 등, 엠보 저널 6:383-388 [1987]).
배아를 레트로바이러스로 감염시키는 또 다른 방법은 쥐 배아의 주머니배공간 내에 바이러스 또는 바이러스 생산 세포를 주입하는 것이다(야너, D. 등, 네어처 298:623 [1982]). 임신중 쥐 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염을 이용한 전이유전자(transgene)들의 쥐 배아계열(germline)로의 유입이 보고되었다(야너 등, 수프라 [1982]). 형질변환 동물을 만들기 위한 소 및 양의 배아들의 레트로바이러스들 또는 레트로바이러스 벡터들에 의한 감염이 보고되었다. 이들 프로토콜들은, 레트로바이러스 입자들을 수정된 난자 또는 초기 배아의 난황주위공간 속으로 흘리는 레트로바이러스 입자들 또는 성장 정지 (즉, 미토마이신 C 처리된) 세포들의 미세주입을 포함한다(PCT 국제출원 제WO90/08832호 [1990]; 및 하스켈 및 보벤, Mol. Reprod. Dev. 40:386 [1995]). PCT 국제 출원 제WO90/08832호는 2 내지 8 세포 단계에서 양 배아들의 난황주위공간 속으로 자연형 고양이 백혈병 바이러스 B의 주입을 기술한다. 주입된 배아로부터 도출된 태아는 다수의 통합 부위(multiple site of integration)를 포함하는 것으로 나타났다.
미국특허 제 6,291,740호(2001년 9월 18일 등록)는 미성숙 난모 세포 및 분할 세포들을 변환시키는 레트로바이러스 벡터들(예컨대, 쥐 백혈병 바이러스[MLV]에서 도출된 벡터들)을 사용하는 성숙의 미수정 난모 세포(즉, 미수정 난모 세포)로의 외인성 DNA의 유입에 의한 형질변환 동물들의 생산에 대해 설명한다. 상기 특허는 또한 거대세포바이러스 프로모터 유도를 위한 방법 또는 조성물뿐만 아니라 다양한 재조합 단백질의 쥐 유방암 LTR 발현에 대해 설명한다.
미국특허 제 6,281,408호(2001년 8월 28일 등록)는 배아 줄기 세포들을 사용하는 형질변환 동물들을 생산하는 방법에 대해 설명한다. 간단히 말하자면, 배아 줄기 세포들은 형질변환 동물들을 생산하기 위해 상실배아와의 혼합 세포 공동 배양액에서 사용된다. 외래 유전자 물질은 예컨대 전기충격요법(electroporation), 미세주입 또는 레트로바이러스 배달에 의해 공동 배양(co-culturing) 이전에 배아 줄기 세포로 유입된다. 이러한 방식으로 전달감염된 ES 셀들은 네오마이신과 같은 선택 마커를 통한 유전자의 통합을 위해 선택된다.
미국특허 제 6,271,436호(2001년 8월 7일 등록)는, 원시 종자 세포의 분리 단계, 원시 종자 세포 유래 세포계들을 생산하기 위해 상기 세포들을 배양하는 단계, 원시 종자 세포 및 배양된 세포계 모두를 형질변환시키는 단계, 및 형질변환 동물들을 생산하기 위해 상기 형질변환된 세포들 및 세포계들을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 사용하는 형질변환 동물들의 생산에 대해 기술한다. 형질변환 동물들이 생산되는 효율이 매우 향상되어서, 형질변환 비설치류 동물종(non-rodent animal species)의 생산에 있어 동종 재조합(homologous recombination)의 사용이 가능하도록 한다.
유전자 치료
유전자 치료를 위해 변형 폴리펩타이드 또는 펩타이드 구조체의 사용이 본 발명의 한 실시예에서 고려된다. 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 N-말단에 하나 이상의 아미노산의 첨가에 의해 DPP 활성으로부터 보호되도록 변형된다. 예를 들어, N-말단에 추가 His 잔기를 포함하는 GLP-1을 암호화하는 핵산 구조체가 유전자 치료를 위해 제공된다. 또한, 변형 GLP-1/트랜스페린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구조체가 유전자 치료를 위해 제공된다. 본 발명의 변형 GLP-1 구조체는 DPP 활성으로부터 보호되며 더욱 안정하고; 따라서 유전자 치료에 이상적으로 적합하다.
간단히 말하자면, 세포독성 림프구 항원 4 (CTLA4) 및 인체 면역 글루불린 G1의 Fc부분으로 이루어진 가용성 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 주입을 통한 유전자 치료가 최근에 이지마 등(2001년 6월 10일)의 인체 유전자 치료(미국) 12/9:1063-77에 개시되었다. 유전자 치료의 상기 응용에 있어서, 제 2 형 아교질 유도 관절염의 쥐 모델이 벡터의 관절 내부 주입을 통해 성공적으로 치료되었다.
유전자 치료는 또한 미국특허 제6,225,290호(2001년 5월 1일 등록); 미국특허 제6,187,305호(2001년 2월 13일 등록); 미국특허 제6,140,111호(2000년 10월 31일 등록)을 포함하는 다수의 미국특허에서 개시되어 있다.
미국특허 제 6,225,290호는, 대상 포유류의 장 상피 세포가 소망의 치료 효과를 가지는 단백질을 발현하는 유전자를 유효하게 포함하도록 유전적으로 변화되는 방법 또는 구조체를 제공한다. 장 세포 변형은 주로 네이키드(naked) DNA로 구성되는 제제의 투여에 의해 달성되고, DNA는 구강으로 투여될 수 있다. 구강 또는 다른 위창자 투여 루트는 간단한 투여 방법을 제공하는 반면, 네이키드 핵산의 사용은 유전차 치료를 달성하기 위한 바이러스 벡터들의 사용과 연관된 복잡성을 피하게 한다. 발현된 단백질은 치료 혈액 레벨의 단백질을 얻기 위해 위창자 경로 및/또는 혈관으로 바로 분비되어, 단백질을 필요로 하는 환자를 치료한다. 변형된 장 상피 세포들은 특정 단백질에서의 결핍과 연관되거나 단백질의 과다발현에 의한 치료로 다룰 수 있는 질병들에 대해 단기간 또는 장기간 치료를 제공한다.
미국특허 제 6,187,305호는 척추류, 특히 포유류의 세포들 내에서의 유전자 또는 DNA 표적화 방법을 제공한다. 간단히 설명하자면, DNA는, 사전 선택된 사이트(site)에서 1차 또는 2차 세포들의 게놈 DNA로 이입되는, DNA의 동종 재조합 또는 타겟팅을 통해 척추류 기원의 1차 또는 2차 세포들로 이입된다.
미국특허 제 6,140,111호(2000년 10월 31일 등록)는 레트로바이러스 유전자 치료 벡터들에 대해 개시한다. 개시된 레트로바이러스 벡터들은 해당 유전자들에 대한 삽입 부위를 포함하고, 매우 다양한 전달감염 세포 타입들에서 해당 유전자들로부터 도출된 높은 레벨의 단백질을 발현할 수 있다. 또한, 선택 가능한 마커를 결여한 레트로바이러스 벡터들이 개시되어 있는데, 이들은 항생제와 같은 마커 제품의 공동 발현없이 다양한 질병 상태 처리에 있어서의 인체 유전자 치료에 적합하다. 이들 레트로바이러스 벡터들은 임의의 패키지 세포 계열에서의 사용에 특히 적합하다. 포유류 세포의 게놈으로 삽입하는 레트로바이러스의 능력은 이들이 인체 및 동물에서의 유전적 질병의 유전적 치료에서의 사용에 특히 유망하게 한다. 유전자 치료는 일반적으로 (1) 생체 내에서 환자 세포에 새로운 유전적 물질을 가하는 것 또는 (2) 신체로부터 환자 세포들을 떼어내고 새로운 유전적 물질을 세포 내에 가하고 이들을 신체 내에 재유입하는 것 즉 생체 외 유전자 치료를 포함한다. 레트로바이러스 벡터를 사용한 다양한 세포에서의 유전자 치료를 수행하는 방법에 관한 논의는 1989년 9월 19일에 등록된 미국특허 제4,868,116호, 및 1990년 12월 25일에 등록된 미국특허 제4,980,286호(상피 세포), 1989년 8월 10일에 공개된 WO89/07136(간 세포), 1990년 7월 25일에 공개된 EP378,576(섬유모 세포), 및 1989년 6월 15일에 공개된 WO89/05345, 및 1990년 6월 28일에 공개된 WO90/06997(내피 세포)에서 찾아볼 수 있고, 상기 문헌들은 본 명세서에 전체로 참고된다.
더 이상 설명이 없더라도, 본 기술분야의 당업자는 전술한 설명 및 후술하는 실시예들을 이용하여 본 발명을 이용하고 청구범위에 기재된 방법을 실시할 수 있을 것이다. 예를 들면, 당업자는 융합되지 않은 상태에서의 치료 모이어티의 필적할만한 활성과 비교할 때 생체 내 및 생체 외 모두에서 본 발명의 융합 단백질 구조체에 대한 생물학적 활성을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 유사하게, 본 기술 분야의 당업자는 본 발명에 따른 구조체의 혈청 반감기 및 혈청 안정성을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 후술되는 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 특정적으로 나타내기 위한 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예
실시예1
:
디펩티딜
-
펩티다아제
Ⅳ보호를 갖는 변형된
GLP
-1
이 예는 DPP-Ⅳ활성으로부터 보호되는 변형된 GLP-1 펩티드를 기술하고 있다. 하기의 텝티드는 표준 고체상 Fmoc 화학을 사용하여 합성되었고 C18 컬럼을 사용하여 역위상 HPLC에 의해 정화되었고 220㎚에서의 흡수도에 의해 정량화되었다. 정화된 펩티드는 질량분석기(MALDI-TOF)에 의해 분석되었다:
디펩티딜펩티다아제
-Ⅳ 치료
각 펩티드(6μM)의 등몰농도(equimolar concentration)는 25mM Tris-Cl(pH 8.0)내 2㎍의 재조합 인간 DPP-Ⅳ(1㎍/μL, R&D 시스템, 미네아폴리스, MN)로 처리되었다. DPP-Ⅳ를 제외한 대조표준 반응은 각 펩티드에 대해 병행하여 설정되었다. 소화물들은 2시간 동안 실온에서 배양되었고, 이때 반응들은 1mM 3-이소부틸-1-메칠산틴(IBMX, Calbiochem, 산디에고, CA)로 보충된 크렙스-링거(Krebs-Ringer) 버퍼(바이오소스 인터내셔널(Biosource International), Camarillo, CA)에 10배 희석되었다. 그런 후 펩티드는 후술되는 바와 같이 잔여 GLP-1 리셉터 활동 활성을 결정하기 위해 분석되었다.
싸이클릭
AMP
시뮬레이션 분석시험
4개의 96웰 조직배양판들에 처리 하루전 RPMI/10% FBS 배지내 2×104 셀/웰 밀도로 (몬트로제-라피자데(Montrose-Rafizadeh) 등의 1997, J. Biol, Chem. 272, 21201-21206) CHO-GLP1R 셀들이 뿌려졌다. 다음 날, 나타난 셀들은 대략 60-80 퍼센트의 포화도(confluency)로 균일하게 분포된다. 배양판들에 뿌린지 하루 후, 셀들은 크렙스-링거 버퍼(KRB)로 2회 세척한 후 37℃에서 1시간동안 KRB에 배양하여 cAMP의 세포내 레벨을 떨어뜨렸다. 이런 후 KRB/IBMX에 10분간 배양하여 cAMP를 파괴하는 세포내 효소들을 억제시켰다. 각 테스트 화합물의 희석은 KRB/IBMX에서 제조되었고 CHO-GLP1R 셀들의 3중 웰들은 37℃에서 정확하게 20분간 웰당 50㎕의 테스트 화합물로 처리되었다. 처리는 얼음처럼 차가운 포스페이트 버퍼 함염물로 배양을 2회 세척하여 중지되었다. 리세이트(lysate)는 실온에서 10분간 0.1㎖ 용해 버퍼 1B(아머샴 바이오사이언스 cAMP 바이오트랙 EIA 키트)를 추가하여 만들어졌다. 키트 지침에 따라 cAMP 바이오트랙 효소면역측정 시스템(Biotrack Enzyme Immunoassay System)(아머샴 바이오사이언스 회사, 피스카터웨이(Piscataway), NJ, 제품코드 RPN225)을 사용하여 cAMP 농도를 결정하기 위해 각 셀 추출물의 전체 양이 측정되었다. 본 발명의 펩티드는 변형되지 않은 형태보다 더 DPP-Ⅳ에 내성이 있는 것이 발견되었다.
활성
GLP
-1 특이
ELISA
대안으로, 본 발명의 GLP-1 및 GLP-1 유도체의 DPP-Ⅳ 분해는 온전한 활성 GLP-1에 대해 특이적이고 N말단의 2개 아미노산들이 DPP-Ⅳ(200ng/μL, R&D 시스템, 미네아폴리스, MN)의 작용으로 인해 제거된 GLP-1, 즉, GLP-1(9-36 또는 9-37)을 인식하지 못하는 ELLISA 시스템(Glucagon-Like 펩티드-1[활성] ELISA 키트[링코 리서치사, 세인트 찰스(St, Charles), MO])을 사용하여 분석시험되었다. GLP-1의 등몰농도와 H-GLP-1(1200pM)은 25mM Tris-Cl(pH 8.0)에 재조합 인간 DPP-Ⅳ(200ng/μL, R&D 시스템, 미네아폴리스, MN)을 사용하여 처리되었고, 반응은 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 키트를 사용하여 보충된 분석버퍼(assay buffer)에 희석하여 중단되었다.
키트는 항-GLP-1 단클론 항체로 코팅된 96웰 마이크로 플레이트(microtitre plate)를 구비한다. 플레이트는 세척되고(플레이트 와셔(plate waser)내 25mM 보레이트 버퍼 함염물 x4. 써모랩시스템 울트라와쉬 플러스(thermoLabsystem Ultrawash Plus)), 실온에서 3시간동안 펩티드 샘플(플레이트 아래로 300pM 및 10배의 연속희석)들을 사용하여 배양되었다. 상술한 바와 같은 세척 후, 플레이트는 실온에서 2시간동안 (키트의 즉석 구성요소로서 공급되는) 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 결합된 항-GLLP-항체를 사용하여 배양되었다. 세척 후, 50mM에 4-메틸움벨리페릴 포스페이트(4-Methylumbelliferyl-Phospate, MUP) 기질들(50mM 보레이트 pH 9.5에 1:2000 희석)이 모든 웰에 적용되고, 30분간 실온에서 어둠속에 배양되었다. 플레이트는 스펙트라맥스 제미니(SpectraMax Gemini) EM 형광플레이트 리더(reader)상에서 355 여기 및 460㎚ 방출파장에서 읽어진다. H-GLP-1은 GLP-1 자체보다 단클론 항체에 용이하게 접합되지 않기 때문에, DPP-Ⅳ 처리후 남아있는 활성 H-GLP-1의 농도는 H-GLP-1 표준곡선을 사용하여 결정되었다. 도 8은 H-GLP-1이 GLP-1보다 DPP-Ⅳ의 활동에 대해 상당히 내성이 더 큰 것을 나타내고 있다.
실시예2
: 변형된
GLP
-1 융합 단백질
이 예는 변형된 트랜스페린(transferrin) 분자에 융합된 DPP-Ⅳ 활성으로부터 부호되는 변형된 GLP-1을 포함하는 융합 단백질을 기술하고 있다.
트랜스페린 분비물(transferrin secretion) 리더(leader) 다음에 트랜시페린의 GLP-1 및 N 말단부를 부호화하는 시퀀스를 구성하기 위해, 다음의 중복 프라이머들이 설계되었다:
이들 프라이머의 위치들이 아래에 도시되어 있다.
이들 프라이머들의 위치들이 아래에 도시되어 있다.
(SEQ ID NO:104는 부호화된 가닥; SEQ ID NO:105는 부호화된 단백질이다)
프라이머(20p몰농도의 8μL)들이 재조합되어 5분간 65℃로 가열된 후, 어닐링 반응이 실온으로 천천히 냉각시키기 위해 허용되었다.
T4 DNA 리가아제를 어닐링 반응에 첨가하여 실온에서 2시간 더 배양한 후, 1μL의 반응이 제거되었고 외부 프라이머 P0236 및 P0251을 사용하여 환성된 삽입물을 증폭시키기 위해 PCR 반응에 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같다:
94℃에서 5분; 및
94℃에서 30초/50℃에서 30초/72℃에서 1분/72℃에서 7분/4℃ 유지의 25 싸이클.
최종생성된 PRC 제품은 AfⅢ 및 KpnI로 소화되었고, 이전에 AfⅢ 및 KpnI로 소화되었던 pREX0094(도 1)에 결찰되었다. 결찰(ligation)은 E.coli를 전달하기 위해 사용되었다. 최종생성된 클론들의 DNA가 시퀀스되었고 AfⅢ/KpnI 삽입물의 클론의 정확한 길이가 선택되었고 pREX0198(도 2)을 지정하였다. 다음으로, pREX0198은 pREX0240을 만들기 위해 pSAC35(도 3)에 삽입된다(도 4).
자연적인 트랜스페린 분비물 리더 다음에 변형된 트랜스페린(mTf)에 융합되는 H-GLP-1(7-36)을 부호화하는 플라스미드를 생성하기 위해, 프라이머 P0424 및 P0425의 중첩은 여분의 N말단 히스티딘을 pREX0198에 의해 부호화된 시퀀스에 추가하도록 설계되었다.
P0424 5' 에서 3'
CTGTGTCTGGCGCATCATGCTGAAG (SEQ ID NO: 106)
P0425 5' 에서 3'
CTTCAGCATGATGCGCCAGACACAG (SEQ ID NO: 107)
pREX0198은 별개의 반응으로, 2개의 중첩 돌연변이 프라이머와 2개의 외부 프라이머, 즉, P0424 더하기 P0012 및 P0425 더하기 P0025를 사용하여 초기 PCR 반응을 위한 템플레이트로서 사용되었다. 그런 후, 이들 반응의 산물들은 함께 결합시키기 위해 외부 프라이머, 즉, P0012 및 P0025와 함께 PCR의 제 2 과정에서 템플레이트로서 사용되었다. PCR의 양 순환들에 대한 반응조건은 1분간 1×94℃, 30초간 20×94℃, 30초간 50℃, 1분간 72℃, 및 마지막으로 7분간 1×72℃였다.
최종 반응에서 나온 PCR 산물은 AfⅢ 및 KpnI로 소화되었고, pREX0367(도 6)을 만들기 위해 AfⅢ/KpnI 소화된 pREX0052(도 5)에 결찰되었다. 상기 구성은 여분의 히스티딘에 대한 코돈의 삽입을 확실히 하기 위해 시퀀스된 DNA이다.
그런 후, pREX0367은 NotI 및 PvuI(PvuI는 암피실린 내성유전자를 파괴함)으로 소화되었고 pREX0368을 만들기 위해 NotI를 사용하여 이전에 소화된 pSAC35에 결찰되었다(도 7).
pREX0368은 전기영동에 의해 숙주 사카로미세스 세레비시아(saccharomyces ccerevisiae) 균주로 변형되고 버퍼 최소 배지판상에 류신 프로토트로피(leucine prototrophy)에 선택된 군체(colonies)로 변형되었다. 단일 군체의 선택 후, 효모 형질변환체가 40% 트레할로오스에 두어졌고 -70℃로 저장하였다. 발현은 pH6.5 로 버퍼된 액체 최소배지내 성장 및 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의한 상충액 분석에 의해 측정되었다.
GLP-1/mTf(pREX0100) 및 H-GLP-1/mTf를 부호화하는 플라스미드는 2003년 3월4일자로 출원된 미국 특허출원 10/378,094에 기술된 바와 같이 구성되었으며, 상기 참조문헌은 본 명세서에 그 전체가 합체되어 있다. GLP-1/mTf 융합 단백질을 제조하기 위해, GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-37)의 아미노산 시퀀스가 사용될 수 있다.
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr (SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg (SEQ ID NO:32)
예컨대, GLP-1(7-36)의 펩티드 시퀀스는 효모에 대해 최적화된 DNA 및 코돈으로 다시 번역될 수 있다.
(SEQ ID NO:117)
(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)
프라이머들은 특히 어닐링 후 5'XbaI 및 3'KpnI 점착성 말단부를 형성하고 리더 시퀀스의 5' 단부 및 mTf의 N 말단에서 XbaI/KpnI 절단된 pREX0052에 직접 결찰을 가능하도록 설계되었다. 대안으로, 다른 점착성 단부들도 다른 벡터들로 결찰을 위해 설계될 수 있다.
어닐링과 결찰 후에, 클론들은 정확한 삽입을 확인하기 위해 시퀀스되었다. 이 벡터를 pREX0094라 한다. 카세트가 NotI를 사용하여 pREX0094에서 잘려지고 pREX0100을 만들기 위해 NotI 절단 효모 벡터인 pSAC35로 서브클론되었다.
그런 후, 이 플라스미드는 최소 배지 플레이트상에 류신 프로토트로피용으로 선택된 숙주 사카로미세스 효모 균종 및 변형물(transformants)에 전기영동되었다. 발현은 액체 최소배지내 성장 및 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의한 상충액 분석에 의해 측정되었다.
GLP-1/mTf 및 H-GLP-1/mTf가 발현되었고 발효 배양조직들로부터 정화되었으며, 양이온 교환 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 표준조건하에서 성장되었다.
디펩티딜펩티다아제
-Ⅳ 처리
GLP-1/mTf 및 H-GLP-1/mTf(2μM)의 등몰 농도가 25mM Tris-Cl(pH 8.0) 용액에 재조합 인간 DPP-Ⅳ(1㎍/μL, R&D 시스템)을 사용하여 처리되었다. DPP-Ⅳ를 제외한 제어반응은 각 융합 단백질에 대해 병행하여 설정되었다. 소화물들은 2시간동안 실온에서 배양되었고, 이때 반응물들은 1mM IBMX(칼바이오켐)으로 보충된 크렙스-링거 버퍼(바이오소스 인터내셔널)에 20배 희석되었다.
싸이클릭
AMP
시뮬레이션 분석
조직배양판들(24웰)에 처리 하루전 RPMI/10% FBS 배지내 1×105 셀/웰 밀도로 CHO-GLP1R 셀들이 뿌려졌다. 다음 날, 나타난 셀들은 대략 60-80 퍼센트의 포화도(confluency)로 균일하게 분포된다. 배양판들에 뿌린지 하루 후, 셀들은 크렙스-링거 버퍼(KRB)로 2회 세척한 후 37℃에서 1시간동안 KRB에 배양하여 cAMP의 세포내 레벨을 떨어뜨렸다. 이런 후 KRB/IBMX에 10분간 배양하여 cAMP를 파괴하는 세포내 효소들을 억제시켰다. 각 테스트 화합물의 희석은 KRB/IBMX에서 제조되었고 CHO-GLP1R 셀들의 3중 웰들은 37℃에서 정확하게 50분간 웰당 0.15㎖의 테스트 화합물로 처리되었다. 처리는 얼음처럼 차가운 포스페이트 버퍼 함염물로 조직배양물을 2회 세척하여 중지되었다. 리세이트(lysate)는 실온에서 10분간 0.2㎖ 용해 버퍼 1B(아머샴 바이오사이언스 cAMP 바이오트랙 EIA 키트)를 추가하여 만들어졌으며, 그런 후 키트 지침에 따라 cAMP 바이오트랙 효소면역측정 시스템(아머샴 바이오사이언스)을 사용하여 cAMP 농도를 결정하기 위해 각 셀 추출물의 100㎕가 분석되었다. H-GLP-1/mTf는 GLP-1/mTf보다 더 DPP-Ⅳ에 내성이 있는 것이 발견되었다.
실시예3
: 당뇨 치료용의 변형된
GLP
-1/
mTf
이 예에서, 본 발명의 변형된 GLP-1/mTf는 당뇨병을 치료하기 위한 치료제로서 사용된다. 변형된 GLP-1/mTf가 제 2 형 당뇨병에 대한 표준 동물모델인 쥬커 쥐(Zucker rat)에 투여되었다. 쥬커 쥐는 비정상적으로 큰 혈당수치를 갖고 있다. GLP-1을 갖는 이들 동물들의 치료는 인슐린 분비를 유도하고 혈당을 낮추는 것으로 나타났다.
쥬커 쥐는 하룻밤동안 금식되었고 H-GLP-1, 또는 트랜스페린에 융합된 H-GLP-1(H-GLP-1/mTf)으로 치료하였다. H-GLP-1 또는 H-GLP-1/mTf의 피하주사후 30분에, 동물들은 당부하 검사(Glucose Tolerance Test, GTT)를 받았다. 이 테스트에서, 금식된 동물들에 혈당용액(1.5mg/g 체중)이 공급되었고 혈당은 적절한 시간 간격으로 측정되었다. 당을 투여하자 마자, 치료되지 않은 동물의 혈당수치는 높아졌다 기저선을 향해 천천히 떨어진 반면에, H-GLP-1 또는 H-GLP-1/mTf가 주사된 동물들은 GLP-1의 인슐린분비 효과(Insulinotropic effects)로 인해 혈당수치의 빠른 정상화를 나타낸다.
또 다른 실험에서, 변형된 H-GLP-1 또는 H-GLP-1/mTf는 당을 투여하지 않고도 쥬커 쥐의 빠른 공복혈당을 정상화시키는데 사용된다. 혈당수치가 치료되지 않은 동물들에서 높게 유지되는 반면에, 상당한 하강이 H-GLP-1 또는 H-GLP-1/mTf가 치료된 동물들에 보인다.
실시예4
:
디펩티딜
-
펩티다아제
Ⅳ 단백질을 갖는 변형된 글루카곤
이 예는 DPP-Ⅳ 활성으로부터 보호된 변형된 글루카곤(glucagon) 분자들을 기술하고 있다.
하기의 펩티드들은 표준 고체상 Fmoc 화학을 사용하여 합성되었고 C18 컬럼을사용한 역위상 HPLC에 의해 정화되었으며 220㎚에서 흡수도에 의해 정량화되었다. 정화된 펩티드들은 질량분석기(MALDI-TOF)에 의해 분석되었다:
글루카곤
H-글루카곤
펩티드들은 상술한 바와 같은 DPP-Ⅳ로 사전 처리된 후, 클론 클루카곤 리셉터를 발현하는 재조합 셀라인을 사용하여 글루카곤 리셉터를 활성화하는 능력에 대해 분석되었다.
실시예
5:
디펩티딜
-
펩티다아제
Ⅳ 단백질을 갖는 변형된
GIP
이 예는 DPP-Ⅳ 활성으로부터 보호되는 변형된 GIP 분자들을 제공한다.
하기의 펩티들은 표준 고체상 Fmoc 화학을 사용하여 합성되었고 C18 컬럼을사용한 역위상 HPLC에 의해 정화되었으며 220㎚에서 흡수도에 의해 정량화되었다. 정화된 펩티드들은 질량분석기(MALDI-TOF)에 의해 분석되었다:
GIP
Y-GIP
펩티드들은 상술한 바와 같은 DPP-Ⅳ로 사전 처리된 후, 클론 GIP 리셉터를 발현하는 재조합 셀라인을 사용하여 GIP 리셉터를 활성화하는 능력에 대해 분석되었다.
상기 논의 및 예들은 단지 소정의 바람직한 실시예들의 상세한 설명을 나타낸 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 다향한 변형 및 균등물도 본 발명의 기술사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백해진다. 본 특허 출원서에 다루어진 모든 잡지 논문들, 다른 참조문헌들, 특허 및 특허 출원들은 전체가 참조로써 합체되어 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
SEQUENCE LISTING
<110> Sadeghi, Homayoun
Prior, Christopher P.
Ballance, David J.
<120> Combination Therapy Using Transferrin Fusion Proteins Comprising
GLP-1
<130> 054710-5012-WO
<150> US 60/598,031
<151> 2004-08-03
<160> 119
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Val Arg Ser
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Thr Ser Ser
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ile Pro Thr Glu Ile
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Val Pro Pro Gly Glu
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Pro Gly Gln Gly
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ser Pro Gly Pro Val
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Lys Pro Arg Leu Leu
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Pro Val Ser Ala
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ala Pro Ala Arg Ser
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Thr Pro Leu Gly Pro
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Pro Pro Arg Leu
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Phe Pro Thr Ile Pro
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Val Pro Leu Ser Arg
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Pro Ile Thr Arg
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Pro Val Glu Arg
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Gly Pro Glu Thr Leu
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ala Pro Leu Ala Thr
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Pro Met Phe Ile
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Pro Asp Ala Ile
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Tyr Pro Ser Lys Pro
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Ala Pro Leu Glu Pro
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Tyr Pro Ile Lys Pro
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Leu Pro Ile Cys Pro
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ser Pro Tyr Ser Ser
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Arg Pro Lys Pro Gln
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ser Pro Ala Pro Pro
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Pro Gly Met Ile
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Pro Ser Cys Ser
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Leu Pro Gly Val Leu
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ala Pro Met Ala Glu
1 5
<210> 31
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
<210> 32
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 31 = G or -NH2.
<400> 32
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210> 34
<211> 44
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210> 35
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
His Ala Asp Gly Val Phe Thr Ser Asp Phe Ser Lys Leu Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Lys Lys Tyr Leu Glu Ser Leu Met
20 25
<210> 37
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
65 70 75 80
Met Pro Lys Ala Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly
85 90 95
Ser Ala Gly Asn Lys Thr Tyr
100
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met
1 5 10
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu
1 5 10 15
Ala Phe Pro Leu Glu Phe
20
<210> 41
<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp
1 5 10 15
Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr
20 25 30
Arg Gln Arg Tyr
35
<210> 42
<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu
1 5 10 15
Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr
20 25 30
Arg Gln Arg Tyr
35
<210> 43
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu
20 25 30
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg
35 40 45
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile
100 105 110
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu
115 120 125
Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn
130 135 140
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp
145 150 155 160
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg
165 170 175
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg
180 185 190
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys
195
<210> 44
<211> 92
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asp Pro
1 5 10 15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asp His Thr
65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90
<210> 45
<211> 145
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu
1 5 10 15
Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr
20 25 30
Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val
35 40 45
Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asn Val Arg Phe
50 55 60
Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val
65 70 75 80
Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser
85 90 95
Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp
100 105 110
Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
115 120 125
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Lys Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
130 135 140
Gln
145
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Pro Gly Pro Arg
1 5
<210> 47
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro
1 5 10 15
Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met
20 25
<210> 48
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 49
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys
1 5 10 15
Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln
20 25 30
Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln
35 40 45
Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
115 120 125
Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145 150
<210> 50
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Tyr Pro Phe Phe
1
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Tyr Pro Leu Gly
1
<210> 52
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala
1 5 10 15
Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala
35 40 45
Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala
50 55
<210> 53
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala
1 5 10 15
Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly
20 25 30
Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln
35 40 45
Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser
50 55 60
Leu Glu Met Ser
65
<210> 54
<211> 246
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Asn Pro Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu Asn
20 25 30
Ser Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly
35 40 45
Gly Ser Leu Ile Asn Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys Tyr
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Glu Val Leu
65 70 75 80
Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His Pro
85 90 95
Gln Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu
100 105 110
Ser Ser Arg Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu Pro
115 120 125
Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly
130 135 140
Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gln Cys Leu
145 150 155 160
Asp Ala Pro Val Leu Ser Gln Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro Gly
165 170 175
Lys Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys
180 185 190
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln
195 200 205
Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys
210 215 220
Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp Ile Lys Asn
225 230 235 240
Thr Ile Ala Ala Asn Ser
245
<210> 55
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe
1 5 10 15
Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser
20 25 30
Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr
35 40 45
Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser
50 55 60
Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn
85 90 95
Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala
100 105 110
Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr
115 120 125
Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln
130 135 140
Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro
165 170 175
Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg Val
180
<210> 56
<211> 77
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala
20 25 30
Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu
50 55 60
Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro
65 70 75
<210> 57
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg
1 5 10 15
Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Leu Thr Lys Leu Ala Lys Asp
35 40 45
Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Tyr Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr
50 55 60
Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro
65 70
<210> 58
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr
20 25 30
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met
50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro
65 70
<210> 59
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile
1 5 10 15
Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly
35 40 45
Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro
65 70 75
<210> 60
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met
50 55 60
Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu
65 70 75
<210> 61
<211> 77
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg
1 5 10 15
Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe
20 25 30
Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys
35 40 45
Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys
50 55 60
Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn
65 70 75
<210> 62
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
1 5 10 15
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
20 25 30
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
35 40 45
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys
50 55 60
Ala Leu Asn Lys
65
<210> 63
<211> 72
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
1 5 10 15
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
20 25 30
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
35 40 45
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys
50 55 60
Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met
65 70
<210> 64
<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr
1 5 10 15
Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr
20 25 30
Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu
50 55 60
Asn Lys Leu Ser Gln
65
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Tyr Pro Phe Val Glu Pro Ile
1 5
<210> 66
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Ala Pro Gly Pro Arg Gly Ile Ile Ile Asn Leu Glu Asn Gly Glu Leu
1 5 10 15
Cys Met Asn Ser Ala Gln Cys Lys Ser Asn Cys Cys Gln His Ser Ser
20 25 30
Ala Leu Gly Leu Ala Arg Cys Thr Ser Met Ala Ser Glu Asn Ser Glu
35 40 45
Cys Ser Val Lys Thr Leu Tyr Gly Ile Tyr Tyr Lys Cys Pro Cys Glu
50 55 60
Arg Gly Leu Thr Cys Glu Gly Asp Lys Thr Ile Val Gly Ser Ile Thr
65 70 75 80
Asn Thr Asn Phe Gly Ile Cys His Asp Ala Gly Arg Ser Lys Gln
85 90 95
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
His Ser Asp Gly Ile Phe
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser
1 5
<210> 72
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 2 = V or S; X at position 3 = Gln, D-Gln or Asp; X
at position 10 = T or G; X at position 12 = K or A.
<400> 72
His Xaa Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 73
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 20 = G, S, C, T, N, Q, Y, A, V, I, L, M, F, A,
d-Lys or K; X at position 28 = G, S, C, T, N, Q, Y, A, V, I, L,
M, F, A, d-Lys or K; X at position 30 = G, S, C, T, N, Q, Y, A,
V, I, L, M, F, K, R, d-Arg or -OH.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 29 = G or -OH; X at position 31 = G or -OH.
<400> 73
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 74
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 25 = oxidation-resistant amino acid; X at position
29 = G or -OH; X at position 30 = R or -OH; X at position 31 = G
or -OH.
<400> 74
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Xaa Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 75
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 10 = Y or V; X at position 12 = K or S; X at
position 15 = D or E; X at position 16 = S or G; X at position 17
= R or Q; X at position 18 = R or A; X at position 20 = Q or K.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 29 = G or -OH; X at position 30 = R or -OH; X at
position 31 = G or -OH.
<400> 75
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 76
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 2 = G or S or C or A; X at position 3 = D or G or S
or C or T or N or Q or Y or A or V or I or L or M or F or E; X at
position 4 = S or C or T or N or Q or Y or A or V or I or L or M
or F or G; X at position 9 = E or D.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 29 = G or -OH; X at position 30 = R or -OH; X at
position 31 = G or -OH.
<400> 76
His Xaa Xaa Xaa Thr Phe Thr Ser Xaa Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 77
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 1 = G or S or C or T or N or Q or Y or A or V or I
or L or M or F or d-His or alkylated His or acylated His; X at
position 29 = G or -OH; X at position 30 = R or -OH; X at
position 31 = G or -OH.
<400> 77
Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 78
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> substituted GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 1 = l- or d-His, desamino-His, 2-amino-His,
beta-hydroxy-His, homohistidine, alpha-fluoromethyl-His, and
alpha-methyl-His; X at position 2 = A, G, V, T, I or
alpha-methyl-Ala; X at positions 15 and 21 = E, Q, A, T, S or G.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X at position 31 = Gly or NH2.
<400> 78
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210> 79
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 80
<211> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 81
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified exendin-4
<400> 81
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr
20 25 30
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 82
His His Ala Glu
1
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 83
His His Gly Glu
1
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 84
His His Ser Glu
1
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 85
Gly His Ala Glu
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 86
Gly His Gly Glu
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 N-terminus
<400> 87
Gly His Ser Glu
1
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1
<400> 88
His His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> X = an amino acid other than l- or d-Lys
<400> 89
His His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 90
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> A8G modified GLP-1
<400> 90
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 91
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 with additional N-terminal His
<400> 91
His His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 92
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 with additional N-terminal His and A8G
<400> 92
His His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 93
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 with 2 additional N-terminal His residues
<400> 93
His His His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 94
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GLP-1 with additional N-terminal Gly
<400> 94
Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 95
<211> 40
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified exendin-4 with additional N-terminal His
<400> 95
His His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu
1 5 10 15
Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 96
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 96
ttcccataca aacttaagag tccaattagc ttcatcgcca 40
<210> 97
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 97
ggtttagctt gtttttttat tggcgatgaa gctaattgga ctcttaagtt tgtatgggaa 60
<210> 98
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 98
ataaaaaaac aagctaaacc taattctaac aagcaaagat gaggctcgcc gtgggagccc 60
<210> 99
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 99
caggacggcg cagaccagca gggctcccac ggcgagcctc atctttgctt gttagaatta 60
<210> 100
<211> 70
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 100
tgctggtctg cgccgtcctg gggctgtgtc tggcgcatgc tgaaggtact tttacttctg 60
atgtttcttc 70
<210> 101
<211> 80
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 101
aattctttag cagcttgacc ttccaaataa gaagaaacat cagaagtaaa agtaccttca 60
gcatgcgcca gacacagccc 80
<210> 102
<211> 70
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 102
ttatttggaa ggtcaagctg ctaaagaatt tattgcttgg ttggttaaag gtagggtacc 60
tgataaaact 70
<210> 103
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 103
agttttatca ggtaccctac ctttaaccaa ccaagcaata 40
<210> 104
<211> 300
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> sequence encoding modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<220>
<221> CDS
<222> (109)..(300)
<400> 104
ccaatgttac gtcccgttat attggagttc ttcccataca aacttaagag tccaattagc 60
ttcatcgcca ataaaaaaac aagctaaacc taattctaac aagcaaag atg agg ctc 117
Met Arg Leu
1
gcc gtg gga gcc ctg ctg gtc tgc gcc gtc ctg ggg ctg tgt ctg gcg 165
Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu Ala
5 10 15
cat gct gaa ggt act ttt act tct gat gtt tct tct tat ttg gaa ggt 213
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
20 25 30 35
caa gct gct aaa gaa ttt att gct tgg ttg gtt aaa ggt agg gta cct 261
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Val Pro
40 45 50
gat aaa act gtg aga tgg tgt gca gtg tcg gag cat gag 300
Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu
55 60
<210> 105
<211> 64
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sequence encoding modified GLP-1-modified Tf fusion protein
<400> 105
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
35 40 45
Arg Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu
50 55 60
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing plasmid with natural Tf secretion signal
<400> 106
ctgtgtctgg cgcatcatgc tgaag 25
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer for constructing plasmid with natural Tf secretion signal
<400> 107
cttcagcatg atgcgccaga cacag 25
<210> 108
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified glucagon with additional N-terminal His
<400> 108
His His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Val Leu Asp
1 5 10 15
Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25 30
<210> 109
<211> 43
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> modified GIP with additional N-terminal Tyr
<400> 109
Tyr Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp
1 5 10 15
Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly
20 25 30
Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> dipeptidyl peptidase serine protease motif
<400> 110
Gly Trp Ser Tyr Gly
1 5
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> transferrin secretion signal sequence
<400> 111
Arg Ser Leu Asp Lys Arg
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> transferrin secretion signal sequence
<400> 112
Arg Ser Leu Asp Arg Arg
1 5
<210> 113
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> transferrin secretion signal sequence
<400> 113
Arg Ser Leu Glu Lys Arg
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> transferrin secretion signal sequence
<400> 114
Arg Ser Leu Glu Arg Arg
1 5
<210> 115
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> DPP-resistant N-terminus
<400> 115
His His Ala Glu
1
<210> 116
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> DPP-resistant N-terminus
<400> 116
Gly His Ala Glu
1
<210> 117
<211> 90
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DNA sequence encoding GLP-1(7-36)
<400> 117
catgctgaag gtacttttac ttctgatgtt tcttcttatt tggaaggtca agctgctaaa 60
gaatttattg cttggttggt taaaggtaga 90
<210> 118
<211> 118
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> site of pREX0052 with GLP-1 insert
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(117)
<400> 118
agg tct cta gag aaa agg cat gct gaa ggt act ttt act tct gat gtt 48
Arg Ser Leu Glu Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
tct tct tat ttg gaa ggt caa gct gct aaa gaa ttt att gct tgg ttg 96
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
gtt aaa ggt agg gta cct gat a 118
Val Lys Gly Arg Val Pro Asp
35
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> site of pREX0052 with GLP-1 insert
<400> 119
Arg Ser Leu Glu Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Val Pro Asp
35
Claims (52)
- 유효량의 트랜스페린(Tf) 융합 단백질 및 적어도 하나의 보조제를 투여하는 것을 포함하여 환자의 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 보조제는 DPP-IV 억제제 및 중성 엔토펩티다아제(NEP) 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 DPP-IV 제거에 영향을 받기 쉬운 방법.
- 제 1 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 DPP-IV 제거에 민감하고, 저항성이 있고 또는 부분적으로 저항성이 있는 방법.
- 제 1 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 Tf 분자에 융합된 하나 이상의 GLP-1 펩타이드를 포함하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 링커를 더 포함하는 방법.
- 제 6 항에 있어서,링커는 PEAPTD 또는 (PEAPTD)2인 방법.
- 제 5 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 융합 단백질의 N-말단에 있는 방법.
- 제 5 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 SEQ ID NO:32 또는 GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)을 가진 GLP-1(7-37)인 방법.
- 제 9 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 A8 내지 G를 돌연변이시킴으로 변형되는 방법.
- 제 9 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 K34 내지 A를 돌연변이시킴으로 변형되는 방법.
- 제 9 항에 있어서,GLP-1은 A8 내지 G 및 K34 내지 A를 돌연변이시킴으로 변형되는 방법.
- 제 12 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 링커(PEAPTD)2를 통해 Tf 분자에 연결되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 완전히 당화된 Tf 분자와 비교하여 감소된 당화를 나타내도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 당화를 나타내지 않도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 당화를 예방하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 자연형 Tf 분자와 비교하여 트랜스페린 수용체(TfR)에 대한 감소 된 친화력을 갖도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 TfR과 결합하지 않도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 자연형 Tf 분자와 비교하여 철에 대한 감소된 친화력을 갖도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 철과 결합하지 않도록 변형되는 방법.
- 제 5 항에 있어서,Tf 분자는 락토페린 또는 멜라노트랜스페린인 방법.
- 제 1 항에 있어서,질병은 대사 질병인 방법.
- 제 22 항에 있어서,대시 질병은 전당뇨병, 당뇨병 또는 비만인 방법.
- 제 23 항에 있어서,당뇨병은 제 2 형 당뇨병인 방법.
- 제 1 항에 있어서,질병은 울혈성 심부전인 방법.
- 제 1 항에 있어서,질병은 과민성 장 증후군 또는 소화불량인 방법.
- 제 1 항에 있어서,2개의 보조제가 존재하는 방법.
- 제 27 항에 있어서,2개의 보조제는 DPP-IV 억제제 및 NEP 억제제인 방법.
- 제 29 항에 있어서,2개의 보조제는 동시에 투여되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 29 항에 있어서,트랜스페린 융합 단백질 및 하나 이상의 보조제는 연속적으로 투여되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 29 항에 있어서,트랜스페린 융합 단백질 및 하나 이상의 보조제는 동시에 투여되는 방법.
- 트랜스페린(Tf) 융합 단백질 및 적어도 하나의 보조제를 포함하는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,보조제는 DPP-IV 억제제 및 중성 엔도펩티다아제(NEP) 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 DPP-IV 제거에 영향을 받기 쉬운 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 DPP-IV 제거에 민감하고, 저항성이 있고 또는 부분적으로 저항성이 있는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 Tf 분자에 융합된 하나 이상의 GLP-1 펩타이드를 포함하는 조성물.
- 제 36 항에 있어서,Tf 융합 단백질은 링커를 더 포함하는 조성물.
- 제 37 항에 있어서,링커는 PEAPTD 또는 (PEAPTD)2인 조성물.
- 제 36 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 융합 단백질의 N-말단에 있는 조성물.
- 제 36 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 SEQ ID NO:32 또는 GLP-1(7-36)(SEQ ID NO:32의 아미노산 1-30)을 가진 GLP-1(7-37)인 조성물.
- 제 40 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 A8 내지 G를 돌연변이시킴으로 변형되는 조성물.
- 제 40 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 K34 내지 A를 돌연변이시킴으로 변형되는 조성물.
- 제 40 항에 있어서,GLP-1은 A8 내지 G 및 K34 내지 A를 돌연변이시킴으로 변형되는 조성물.
- 제 43 항에 있어서,GLP-1 펩타이드는 링커(PEAPTD)2를 통해 Tf 분자에 연결되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 완전히 당화된 Tf 분자와 비교하여 감소된 당화를 나타내도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 당화를 나타내지 않도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 당화를 예방하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 자연형 Tf 분자와 비교하여 트랜스페린 수용체(TfR)에 대한 감소된 친화력을 갖도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 TfR과 결합하지 않도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 자연형 Tf 분자와 비교하여 철에 대한 감소된 친화력을 갖도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 철과 결합하지 않도록 변형되는 조성물.
- 제 32 항에 있어서,Tf 분자는 락토페린 또는 멜라노트랜스페린인 조성물.
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