JP2021528437A - 肥満を治療するための新規化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
「配列表」と題される配列表は、9676バイトであり、2018年5月23日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
化学物質7
「構築物」という用語は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、およびBBBに位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含み、化合物およびリガンドが、任意でリンカーを介して共有結合する化学物質(分子)を指す。
一実施形態では、構築物は、融合タンパク質である。
一実施形態では、構築物は、複合体である。
体重の調節に関与する脳内の領域の非限定的な例は、Bloemendaal et al、「Effects of glucagon−like peptide 1 on appetite and body weight:focus on the CNS」、Thematic Review、Journal of Endocrinology(2014)、221、T1−T16で言及され、例えばp.T8の図1を参照されたい。
一実施形態では、体重の調節は、体重の減少を指す。
体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物には、これらに限定されないが、栄養状態に関する食事関連情報を脳に伝達することによって、栄養調節の担い手として特定されている腸由来ホルモンが含まれる。
血液脳関門(BBB)内に位置する受容体は、脳毛細血管内皮で発現する内因性受容体である。
受容体の「オルソステリックリガンド」は、受容体の活性化を調節する内因性または一次的なリガンドである。オルソステリックリガンドが受容体と結合する部位は、受容体の「オルソステリック部位」と称される。
受容体作動薬は、受容体と結合し、天然リガンドに典型的な応答を誘発する化合物として定義され得る。完全作動薬は、天然リガンドと同じ度合いの応答を誘発する作動薬として定義され得る(例えば、「Principles of Biochemistry」、AL Lehninger、DL Nelson、MM Cox、第2版、Worth Publishers、1993年、763ページを参照されたい)。
本発明の構築物は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物を、BBB内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドと接続するリンカーを含み得る。言い換えれば、リンカーは、任意である。
アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに任意で側鎖と称されることが多い1つ以上の追加の基を含む化合物として定義され得る。アミン基は、例えば、一級または二級アミノ基であり得る。プロリンは、二級アミノ基を含むアミノ酸の非限定的な一例である。
本明細書で使用される「GLP−1ペプチド」という用語は、ヒトグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1(7〜37))を指し、その配列は配列番号16として列挙される配列、またはその類似体に含まれる。配列番号16の配列を有するペプチドはまた、「天然」GLP−1と称され得る。
本発明の構築物は、薬学的に許容可能な塩、アミド、またはエステルの形態であり得る。これはまた、その構築化合物およびリガンド部分も同様である。
本明細書に開示される対照Fab、抗TfR−Fab、およびGLP−1類似体のようなタンパク質およびペプチドの生成は、当技術分野で周知である。
一実施形態では、本発明の組成物は、医薬組成物である。
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載される。
1.構築物は、体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門(BBB)内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含み、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステルである。
2.実施形態1に記載の構築物は、化合物が、体重の調節に関与する脳内の経路を標的とする。
3.実施形態1または2に記載の構築物は、化合物が、体重の調節に関与する脳内の受容体を標的とする。0
4.実施形態1〜3のいずれか1つに記載の構築物は、化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。0
5.実施形態1〜4のいずれか1つに記載の構築物は、化合物が、ホルモンである。0
6.実施形態5に記載の構築物は、ホルモンが、エイコサノイド、ステロイド、およびアミノ酸/タンパク質誘導体からなる群から選択される。
7.実施形態5に記載の構築物は、ホルモンが、アミノ酸/タンパク質誘導体である。0
8.実施形態1〜7のいずれか1つに記載の構築物は、化合物が、腸由来ホルモンである。
9.実施形態1〜8のいずれか1つに記載の構築物は、化合物が、インスリン分泌剤である。
10.実施形態1〜9のいずれか1つに記載の構築物は、化合物が、GLP−1受容体作動薬(GLP−1RA)である。
11.実施形態1〜10のいずれか1つに記載の構築物は、BBB内に位置する受容体が、トランスフェリン受容体(TfR)である。
12.実施形態11に記載の構築物は、TfRと結合するアロステリックリガンドが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
13.実施形態11または12に記載の構築物は、TfRと結合するアロステリックリガンドが、抗トランスフェリン受容体Fab(抗TfR−Fab)である。
14.実施形態1〜13のいずれか1つに記載の構築物は、融合タンパク質または複合体である。
15.実施形態1〜14のいずれか1つに記載の構築物は、リンカーをさらに含む。0
16.実施形態15に記載の構築物は、リンカーが、ペプチド性または非ペプチド性である。
17.実施形態1〜16のいずれか1つに記載の構築物は、GLP−1RAである。0
18.実施形態1〜17のいずれか1つに記載の構築物は、完全GLP−1RAである。0
19.実施形態1〜18のいずれか1つに記載の構築物は、実施例17のアッセイを使用して決定された、1000pM以下のEC50に対応するインビトロ効力を有する。0
20.実施形態1〜19のいずれか1つに記載の構築物は、GLP−1Rと結合することができる。
21.実施形態1〜20のいずれか1つに記載の構築物は、実施例18のアッセイを使用して決定された、100nM以下のIC50に対応するGLP−1R結合親和性を有する。
22.実施形態1〜21のいずれか1つに記載の構築物は、トランスフェリン受容体(TfR)と結合することができる。0
23.実施形態1〜22のいずれか1つに記載の構築物は、TfR標的抗体の取り込みを阻害することができる。0
24.実施形態23に記載の構築物は、実施例19のアッセイを使用して決定された、100nM以下のIC50に対応するTfR標的抗体の取り込みを阻害する。
25.実施形態24に記載の構築物は、IC50値が、同じGLP−1RAを組み込んでいるが、TfRと結合しないリガンドを組み込んだ対照構築物のIC50値よりも低くなり、ここで、両方のIC50値は、実施例19のアッセイを使用して決定される。
26.実施形態11〜25のいずれか1つに記載の構築物は、TfRと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構築物と比較して、GLP−1Rを発現する脳領域への増加した結合を示す。
27.実施形態26に記載の構築物は、GLP−1Rを発現する脳領域への結合が、蛍光標識した構築物のインビボイメージングを使用して決定される。0
28.実施形態27に記載の構築物は、GLP−1Rを発現する脳領域の少なくとも大部分において、対照構築物と比較してより高い蛍光シグナルをもたらし、GLP−1Rを発現する脳領域は、図16Aに示される通りである。0
29.実施形態28に記載の構築物は、蛍光シグナルが、GLP−1R発現脳領域において少なくとも50%、60%、70%、80%、または好ましくは少なくとも90%高い。0
30.実施形態26〜29のいずれか1つに記載の構築物は、GLP−1Rを発現する脳領域への結合が、本質的に実施例16に記載されるように決定される。
31.実施形態11〜30のいずれか1つに記載の構築物は、TfRと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構築物と比較して、BBBによって保護されるGLP−1R発現脳領域への増加した結合を示す。
32.実施形態31に記載の構築物は、GLP−1Rを発現するBBBで保護される脳領域の少なくとも大部分において、対照構築物と比較してより高い蛍光シグナルをもたらす。0
33.実施形態32に記載の構築物は、GLP−1Rを発現するBBBで保護される脳領域が、図16Cに示されるようにLS、DG、MH、およびPBである。0
34.実施形態32に記載の構築物は、GLP−1Rを発現するBBBで保護される脳領域が、ACB、DMH、LHA、およびLHである。0
35.実施形態32〜34のいずれか1つに記載の構築物は、蛍光シグナルが、GLP−1R発現脳領域において少なくとも50%、60%、70%、80%、または少なくとも90%高い。
36.実施形態32〜35のいずれか1つに記載の構築物は、蛍光シグナルが、対照構築物の蛍光シグナルよりも少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または少なくとも10倍高い。
37.実施形態32〜36のいずれか1つに記載の構築物は、BBBによって保護されるGLP−1R発現脳領域への結合が、本質的に実施例16に記載されるように決定される。
38.実施形態1〜37のいずれか1つに記載の構築物は、食物摂取量を低下させる。0
39.実施形態38に記載の構築物は、食物摂取量を従属的に低下させる。0
40.実施形態38または39に記載の構築物は、TfRと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構と比較して、より低い食物摂取量をもたらす。
41.実施形態38〜40のいずれか1つに記載の構築物は、食物摂取量が、24時間の期間にわたるgでの累積食物摂取量である。
42.実施形態38〜41のいずれか1つに記載の構築物は、食物摂取量が、本質的に実施例20、パートIまたはパートIIに記載されるように、除脂肪マウスにおける急性研究で決定される。
43.実施形態1〜42のいずれか1つに記載の構築物は、体重低下を引き起こす。0
44.実施形態43に記載の構築物は、TfRと結合しないリガンドを組み込むことだけが構築物と異なる対照構と比較して、より高い体重低下を引き起こす。
45.実施形態43または44に記載の構築物は、体重低下が、本質的に実施例20、パートIIIに記載されるように、DIOマウスにおける亜慢性研究で決定される。
46.組成物は、実施形態1〜45のいずれか1つに記載の構築物および少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。0
47.実施形態1〜45のいずれか1つに記載の構築物、または実施形態46の組成物は、医薬として使用するためのものである。
48.実施形態1〜45のいずれか1つに記載の構築物、または実施形態46に記載の組成物は、肥満の予防または治療に使用するためのものである。00
49.肥満の予防または治療のための方法は、実施形態1〜45のいずれか1つに記載の構築物または実施形態46の組成物を投与することを含む。00
1.LC−MS法
このプロトコルは、プロトコルタイトルで表されるMS法を概説し、方法の説明を分析結果にリンクするために使用される。この方法は、試料のクロマトグラフィー分離によって分析対象物の純度を測定し、質量スペクトルおよび総イオン数(TIC)によって成分を同定および定量するために使用される。
抗TfR−Fabの一過性発現
本実施例は、図1A(配列番号3)に示される抗Tfr−Fabの一過性発現を説明する。
軽鎖(配列番号1):
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPS
RFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鎖(配列番号2):
EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGCLTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK
対照Fabの一過性発現
この実施例は、TfRと結合しない図2に示す対照Fabの一過性発現を説明する。図2の対照Fabは、配列番号5のアミノ酸配列を有する。
軽鎖(配列番号4):
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗TfR−Fabを発現する安定した細胞株の生成
本実施例は、図3に示される抗TfR−Fabを発現する安定細胞株の生成を説明する(図1A、配列番号3に示されるのと同じ)。
対照Fabを発現する安定した細胞株の生成
本実施例は、図4に示される対照Fabを発現する安定細胞株の生成を説明する(図2、配列番号5に示されるのと同じ)。
GLP−1抗TNP−Fab融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、対照FabおよびGLP−1類似体の図5(配列番号8)に示す融合タンパク質の発現を説明する。対照Fabは抗TNPFabであり、TNPは2,4,6−トリニトロフェノールを指す。
軽鎖(配列番号6):
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKGRPGGGSGGGSGGGSGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鎖(配列番号7):
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGYWNWIRQPPGKGLEWIGTISYSGDTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARYGSYVFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKHHHHHHHHHH
GLP−1抗TfR−Fab融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、抗TfR−FabおよびGLP−1類似体の図6(配列番号11)に示す融合タンパク質の発現を説明する。
軽鎖(配列番号9):
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKGRPGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
重鎖(配列番号10):
EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGHHHHHHHHHH
GLP−1対照Fab融合タンパク質の一過性発現
本実施例は、別の対照FabおよびGLP−1類似体の図7(配列番号12)に示す融合タンパク質の発現を説明する。
蛍光標識GLP−1抗TfR−Fab融合タンパク質の調製
本実施例は、実施例6(配列番号11)のGLP−1抗TfR−Fab融合タンパク質の蛍光標識を説明する。蛍光標識化化合物を図8に示す(示すように、標識化はN末端上だけではなく、ランダムに付着することに留意されたい)。
蛍光標識GLP−1対照Fab融合タンパク質の調製
本実施例は、実施例7(配列番号12)のGLP−1対照Fab融合タンパク質の蛍光標識を説明する。蛍光標識化化合物を図9に示す(示すように、標識化はN末端上だけではなく、ランダムに付着することに留意されたい)。
複合に使用したGLP−1ペプチドの合成
本実施例は、図10に示すGLP−1ペプチドの合成を説明する。
一晩静置し、撹拌した。濾過し、DMF(4x60ml)およびDCM(4x60ml)で洗浄した。
LCMS_34:Rt=2.37分、M/4=1378.3
GLP−1抗TfR−Fab複合体の合成
本実施例は、GLP−1ペプチドおよび抗TfR−Fabの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図11に示す。
TCEP溶液の調製:TCEP、0.5M、pH7、MW:286g/mol、
25uLの0.5M TCEP溶液を、2475uL緩衝液(20mM TEA、2mM EDTA、pH8.5緩衝液)で希釈した。約2〜3時間、または完全に減少するまで放置する。
カラム:Hiload 26/600、superdex 200pg SEC
緩衝液:PBS緩衝液、pH7.4
LCMS_36:Rt=3.52分、m/30=1751.4、m/32=1642.0
GLP−1対照−Fab複合体の合成
本実施例は、GLP−1ペプチドおよび対照Fabの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図12に示す。
LCMS_36:Rt=3.01分、m/29=1832.1、m/31=1713.9
複合に使用したGLP−1ペプチドの合成
本実施例は、図13のGLP−1ペプチド誘導体の合成を説明する。
LCMS_34:Rt=2.45分、M/3=1328.2
GLP−1対照Fab複合体の合成
本実施例は、GLP−1ペプチドおよび対照Fabの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図14に示す。
LCMS_36:Rt=3.14分、m/30=1720.0、m/32=1612.6
本実施例は、GLP−1ペプチドおよび抗TfR−Fabの複合体の合成を説明する。複合体の構造を図15に示す。
LCMS_36:Rt=3.55分、m/30=1700.4、m/32=1594.2
実施例16:
蛍光標識したGLP−1 TfR融合タンパク質のインビボイメージング
本実施例は、「活性」および「不活性」GLP−1−Fab融合タンパク質(TfRと結合するという意味では「活性」、TfRと結合しないという意味では「不活性」)の脳の様々なGLP−1受容体発現領域へのアクセスを検討する。2つの融合タンパク質は、1つの同じGLP−1受容体作動薬化合物を含むが、Fab部分が異なる。これは、血液脳関門(BBB)によって保護される脳領域へのアクセスにおいて、活性融合タンパク質と不活性融合タンパク質との間に実質的な差があるかどうかを判断するためのものである。本研究は、マウスを用いた急性研究である。
マウス(C57BL/6J、雄、Taconic、n=4/群)は、実施例8、120nmol/kgの蛍光標識GLP−1抗TfR−Fab融合タンパク質(「GLP−1−活性TfR」)、または実施例9、120nmol/kgの蛍光標識GLP−1対照Fab融合タンパク質(「GLP−1不活性TfR」)の静脈内単回用量を受けた。化合物の投与後6時間(「6H」)イソフルランでマウスを麻酔し、10mlのヘパリン化(10U/ml)生理食塩水、続いて10mlの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で経心臓灌流により安楽死させた。脳を摘出し、10%NBFに浸し、さらに処理するまで4℃で一晩保存した。
脳を脱水し、ジベンジルエーテル(DBE)で飽和させて、水の除去および屈折率の一致によるスキャン中の光の散乱を最小化した。脳組織を、脱塩H2O(w/v)50/80/96/99%/2x100%で希釈した段階的テトラヒドロフラン(THF)中で、各ステップについて6〜12時間室温で脱水した。次に、各ステップで6〜12時間、3xDBEで室温で脳を浄化した。
UltraMicroscope II LSFMシステム(Lavision Biotec、Bielefeld、Germany)を使用して、10.32μmの等方性解像度で脳試料をスキャンした。データ収集を、自家蛍光をイメージングするための620/60nm励起フィルターおよび680/30nm発光フィルター、ならびに特定のシグナルをイメージングするための710/75nm励起フィルターおよび780/40nm発光フィルターを使用して実行した。
画像は、z平面(2D)の単一平面画像である。提示された特定のシグナルの画像における組織の自家蛍光の寄与を最小化するために、スペクトルのアンミキシングを実施した。アンミキシングは、インポートしたtiffファイル上のImaris(Release7.6.5、Zurich、Switzerland)で実施した。特定チャネル内の推定自家蛍光の寄与は、非特定記録内の選択されたボクセルと特定チャネル内の対応するボクセルとの間のボクセル強度の比率に基づいて計算され、除去した。比率は、非特定記録のヒストグラムに基づいて選択された40セットのボクセルについて計算した。アンミキシングアルゴリズムはMatlab(Release 2012b、MathWorks、Natick、Massachusetts、United States)で記述され、ImarisのXTプラグインとして適用した。
画像分析の結果を図16A、16B、16C、および16Dに示す。
BBBによって保護される脳構造に見られる活性TfR化合物と不活性TfR化合物との間のシグナル強度の明瞭かつ顕著な差(図16C)は、GLP−1R作動薬の抗TfR Fabへのカップリングが、GLP−1R作動薬がGLP−1R作動薬によって容易にアクセスできない脳の領域にGLP−1R作動薬を標的化する手段として使用できることを示す。ACB、DMH、LHA、およびLHなどのこれらの領域の一部は、体重の調節および食物摂取量に関連する行動において重要であることが示されている。
本実施例の目的は、本明細書で開示される活性および不活性GLP−1融合体ならびに複合体のGLP−1活性を試験することである(活性/不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体(TfR)と結合する/結合しない能力を指す)。GLP−1活性は、GLP−1インビトロ効力として決定され、全細胞アッセイにおけるヒトGLP−1受容体活性化の尺度である。
インビトロ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトGLP−1受容体の応答を測定することによって決定した。アッセイは、ヒトGLP−1受容体を発現し、プロモーターと結合したcAMP応答要素(CRE)のDNAおよびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)の遺伝子を含む安定にトランスフェクトされたBHK細胞株において行った。ヒトGLP−1受容体が活性化される場合、cAMPの生成をもたらし、これは順に、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了した時に、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を追加し、酵素がルシフェリンをオキシルシフェリンに変換して、生物発光を生じる。発光はアッセイの読み取り値として測定される。
このアッセイで使用した細胞(クローンFCW467−12A/KZ10−1)は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞を、ヒトGLP−1受容体を発現するクローン(FCW467−12A)に由来し、CREルシフェラーゼでのさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得た。細胞は、細胞培養培地中、5%CO2で培養した。それらをアリコートし、液体窒素中に保存した。各アッセイ前に、アリコートを、PBS中で吸収し、2回洗浄した後、アッセイ特異的緩衝液中の所望濃度で懸濁した。96ウェルプレートの場合、5x103細胞/ウェルの最終濃度になるように懸濁液を作製した。
以下の化学物質をアッセイで使用した:Pluronic F−68(10%v/v)(Gibco 2404)、ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A9511)、オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッドなしのDMEM(Gibco 11880−028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax 100x(Gibco 35050)、およびsteadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
細胞培養培地は、10%w/v FBS(ウシ胎児血清、Invitrogen 16140−071)、1mg/ml G418(Invitrogen 15140−122)、240nM MTX(メトトレキサート、Sigma M9929)、および1%w/v pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン、Invitrogen 15140−122)を有するDMEM培地からなる。
1.細胞ストックを37℃水浴で解凍した。
2.細胞をPBSで3回洗浄した。
3.細胞をカウントし、アッセイ培地中に5x103細胞/50μl(1x105細胞/ml)に調整した。細胞の50μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに移した。
4.試験化合物のストックを、0%HSA CREルシフェラーゼアッセイについては0%アッセイ緩衝液中に、および1%HSA CREルシフェラーゼアッセイについては1%アッセイ緩衝液中に0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍希釈して、2x10−7M、2x10−8M、2x10−9M、2x10−10M、2x10−11M、2x10−12M、2x10−13M、および2x10−14Mの濃度を得た。
5.化合物またはブランクの50μlアリコートを希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物は、1x10−7M、1x10−8M、1x10−9M、1x10−10M、1x10−11M、1x10−12M、1x10−13M、および1x10−14Mの最終濃度で試験した。
6.アッセイプレートを5% CO2のインキュベーター中、37℃で3時間インキュベートした。
7.アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間放置した。
8.steadyliteの100μlアリコート+試薬をアッセイプレートの各ウェルに加えた(試薬は感光性であった)。
9.各アッセイプレートをアルミホイルで覆って遮光し、室温で30分間振盪した。
10.各アッセイプレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
プレートリーダーからのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに転送した。ソフトウェアは、非線形回帰を実行した(log(作動薬)対 応答)。ソフトウェアによって計算し、pMで報告されたEC50を以下の表1に示す。別々のアッセイプレートで各試料について最低2つの複製を測定した。報告された値は複製の平均である。いくつかの例では、複数のアッセイが実行され、この場合、報告されたデータは平均化された複製の平均である。
本実施例の目的は、本明細書で開示される活性および不活性GLP−1融合体ならびに複合体のインビトロでのGLP−1受容体結合活性を試験することである(活性/不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体(TfR)と結合する/結合しない能力を指す)。受容体結合は、ヒトGLP−1受容体への化合物の親和性の尺度である。
ヒトGLP−1受容体との結合は、競合結合アッセイで測定した。このタイプのアッセイでは、標識リガンド(この場合は125I−GLP−1)が受容体と結合される。各試験化合物を一連の濃度でヒトGLP−1受容体を含む単離した膜に添加し、標識したリガンドの置換をモニタリングした。受容体結合は、標識したリガンドの半分が受容体から置換された濃度として報告され、IC50値であった。誘導体のアルブミンとの結合を試験するために、アッセイは、血清アルブミンのかなり低い濃度(最大0.001%(w/v)最終アッセイ濃度)、および血清アルブミンのかなり高い濃度(2.0%(w/v)の最終アッセイ濃度)の存在下で実行され得る。血清アルブミンの存在下でのIC50値の増加は、血清アルブミンとの親和性を示す。
以下の化学物質をアッセイで使用した:ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A1653)、フェノールレッドなしのDMEM(Gibco 11880−028)、Pen/strep(Invitrogen 15140−122)、G418(Invitrogen 10131−027)、1M HEPES(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575−038)、PBS(Invitrogen 14190−094)、ウシ胎児血清(Invitrogen 16140−071)、EGTA、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、Tween 20(Amresco 0850C335)、SPA粒子(小麦胚芽凝集素(WGA) SPAビーズ、Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]−GLP−1]−(7−36)NH2(自社生成)、OptiPlate(商標)−96(Packard 6005290)。
このアッセイで使用した細胞(クローンFCW467−12A)は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞はヒトGLP−1受容体を発現する。細胞を、5% CO2、DMEM中10%w/v胎児仔ウシ血清、および1%w/vPen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)で増殖させた。膜調製物を作るために、細胞を約80%のコンフルエンスまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、回収した。細胞を短時間の遠心分離を用いてペレット化し、細胞ペレットを氷上に保持した。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液1(例えば、10ml)中で20〜30秒間、ULTRA−THURRAX(商標)分散装置でホモジネートした。ホモジネートを15分間遠心分離した。ペレットを10mlの緩衝液2に再懸濁(ホモジネートした)し、遠心分離した。このステップをもう一度繰り返した。得られたペレットを緩衝液2に再懸濁し、タンパク質濃度を測定した。膜をアリコートし、マイナス80℃で保存した。
1.低HSA(0.001%)の存在下での受容体結合アッセイでは、50μlのアッセイ緩衝液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイはステップ3で継続した。
2.高HSA(2.0%)の存在下での受容体結合アッセイでは、50μlの8%アルブミンストックをアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイはステップ3で継続した。
3.試験化合物を連続希釈して、8x10−7M、8x10−8M、8x10−9M、8x10−10M、8x10−11M、8x10−12M、および8x10−13Mの濃度を得た。25μlをアッセイプレート中の適切なウェルに添加した。
4.細胞膜のアリコートを解凍し、作業濃度に希釈した。50ulをアッセイプレート中の各ウェルに添加した。
5.WGA SPAビーズを、20mg/mlのアッセイ緩衝液中に懸濁した。懸濁液を、アッセイプレートに添加する直前に、アッセイ緩衝液中で10mg/mlに希釈した。50ulをアッセイプレート中の各ウェルに添加した。
6.アッセイプレートの各ウェルに25ulの480pMの[125I]−GLP−1]−(7−36)NH2の溶液を添加してインキュベートを開始した。合計数/ウェルを測定するために、25μlのアリコートを保留した。
7.アッセイプレートを30℃で2時間インキュベーした。
8.アッセイプレートを10分間遠心分離した。
9.アッセイプレートをPackard TopCount NXT装置で読み取った。
TopCount装置からのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに転送した。ソフトウェアは複製の値を平均化し、非線形回帰を実行した。IC50値をソフトウェアによって計算し、nMで報告した。
以下の結果が得られた。
本実施例の目的は、本明細書で開示される例示的な活性および不活性GLP−1融合体ならびに複合体のインビトロでのトランスフェリン受容体結合活性を試験することである(活性/不活性という用語は、それぞれトランスフェリン受容体(TfR)と結合する/結合しない能力を指す)。トランスフェリン受容体結合は、マウストランスフェリン受容体への化合物の親和性の尺度である。
トランスフェリン受容体標的抗体の取り込みを阻害する実施例11〜12および14〜15の複合体の能力を、競合取り込みアッセイで測定した。Fab複合体の各セット(実施例11および12、ならびに実施例15および14)中の2つの化合物は、同じGLP−1R作動薬部分を含むが、TfRへの結合に関して、それぞれ「活性」および「不活性」であるFab部分に関しては異なる。
蛍光標識したFab断片の調製:
蛍光標識したFab断片を、実施例1の抗TfR−FabのCy5標識によって作製した。Cy5標識抗したTfR−Fabを図1Bに示し、Cy5色素がCysの377位に付着していることが示されている。
DMEM(Gibco 31966−026)、Pen/strep(Invitrogen 15140−122)、G418 (Invitrogen 10131−027)、1M HEPES(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575−038)、ウシ胎児血清(Invitrogen 16140−071)、PFA 4%(Chem Cruz Sc−281692)、ヒト血清アルブミン(Sigma A9511)、コラーゲンコーティングされたイメージングプレート(Becton Dickinson 734−0319)、DAPI Hoechst 33342(Sigma B2261)、小麦胚芽凝集素−Alexa488(Invitrogen W32464)、HBSS(Gibco 14025)。
1.細胞プレートに播種する前に、MEF−1細胞を、DMEM中の5%CO2、10%w/v胎児仔ウシ血清、および1%w/vペニシリン/ストレプトマイシンで増殖させた。各アッセイの前日に、細胞を5000細胞/ウェルに播種した。
2.アッセイ日に、細胞を0.1%(w/v)HSAを含有するHBSSで洗浄した。
3.試験化合物を連続希釈して、2x10−6M、2x10−7M、2x10−8M、2x10−9M、2x10−10M、2x10−11M、2x10−12M、および2x10−13Mの濃度を得た。100μlの各々をアッセイプレート中の適切なウェルに添加した。
4.各ウェルに蛍光標識したFab断片を5nMの最終濃度で添加した。
5.プレートを37℃で15分間インキュベートした。インキュベーション後、緩衝液を除去し、細胞を0.1%(w/v)HSAを含有するHBSSで洗浄した。
6.50μlの冷4%PFAをヒュームフード内で添加した。プレートを室温で10分間インキュベートした後、PFAを除去した。
7.50μlの標識溶液をプレートに添加し、10分間インキュベートした。標識溶液には、1:200(v/v;10mg/mlストックから)のDAPIおよび1:200(v/v;5mg/mlストックから)のWGA−Alexa488が含まれた。アッセイプレートを室温で10分間インキュベートした。
8.アッセイプレートを100μlのHBSSで3回洗浄し、洗浄ステップ後に100μlのHBSSを各ウェルに添加した。
9.アッセイプレートを、ハイコンテンツメージング装置(IN Cell 2200装置、GE)で読み取った。
IN Cell装置からのデータを、装置に付属のソフトウェアを使用して解析した。核をDAPI染色した核を使用して定義し、細胞境界をWGA−Alexa488染色に基づいて構築した。内在化される蛍光の量は、装置のCy5チャネルで視認可能な顆粒を定義し、内在化Cy5標識Fab断片に対応することによって計算した。各細胞における顆粒の数および強度を計算した。さらなる計算に使用した装置からの読み取り値は、顆粒の総面積を各取得フィールドの細胞数で割ったものであった。典型的な実験には、ウェルあたり20倍の顕微鏡対物レンズを使用した32個のフィールドが含まれた。データをGraphPad Prismソフトウェアに転送し、X軸にlog M(Mは試験化合物のモル濃度)、y軸に細胞あたりの総顆粒面積を含む濃度応答曲線としてプロットした。ソフトウェアは、非線形回帰を実行した。IC50値をソフトウェアによって計算し、nMで報告した。
以下の結果が得られた:
本実施例の目的は、肥満関連の特徴に焦点を当てて、GLP−1抗TfR−Fab複合体がインビボで生物学的に活性であるかを評価することである。
研究デザイン:
雄のC57Bl6Jマウス(Taconic、Denmark)に、実施例11のGLP−1抗TfR−Fab複合体を24時間にわたって静脈内に急性投与し(0〜100nmol/kg)、biodaq自動モニタリングシステム(Research Diets、New Brunswick、NJ、USA)を用いて、食物摂取量を研究した。簡潔に述べると、マウスを食物(Altromin、カタログ番号1314、Lippe、Germany)および水道水を適宜利用できる状態で、12時間の明暗サイクル下で維持した。投与前に、マウス(群当たりn=4〜6)を体重が均等に一致する5つの治療群のうちの1つに割り当て、試験および取扱い手順に適応させるために、投与の8日前にbiodaqシステムに配置した。実験の日に、マウスに、以下の表に従って、時間0で、ビヒクルまたは実施例11の化合物のいずれかを静脈内に投与した:
24時間後、血液試料を、血漿分析中にペプチドを安定化することを目的とした50ml Trasylol、10.000KIU(カリクレイン不活化剤単位)、0.5ml 20mMVal−Pyr(16.48mg Val−pyr/4ml H2OのpHは1M HClによって7.4に調整される)に溶解したプロテアーゼ阻害剤カクテルFluka03665(3.097g K3EDTA(MW 406.53)を含むEDTAチューブに、舌下神経叢を介して採取した。その後、麻酔下で放血とそれに続く頸椎脱臼により動物を安楽死させた。血液試料を氷上に保持し、4℃で30分以内に遠心分離(4分x4000g)した。次に、50μlの血漿を適切にラベル化したチューブに分注し、ドライアイス上に置き、分析までマイナス80℃で保存した。
アクセプタビーズ/ビオチン化抗体およびドナービーズの両方の作業溶液をLOCI緩衝液で調製した。
最後に、プレートをEnvisionで読み取った。
定量下限(LoQ)を40pmol/Lと決定した。定量上限(ULoQ)を25.000pMと決定した。不精密性(CV)は、12回の連続分析で3つの試料を測定し、同じ分析で3つの試料のそれぞれを21回測定することにより評価した。全体のCVは<10%であった。
試薬:
LOCI緩衝液:25mM Hepes(Sigma H−3375)、50mM NaCl(Merck 8.22184)、10mM K−EDTA(Fluka 03664)、2mg/ml Dextran(Pharmacosmos 551005009007)、0.5% ovalbumin OA(Sigma−A 5573)、0.05% BGG(Sigma G−7516)、0.1% Tween20(Merck 8.22184)、0.01% Proclin 300(Sigma−Aldrich 48912−U)、0.01% Gentamycin(Biol.Indust.03−035−1)、0.2mg/ml HBR1(Scan.Lab.3KC533)、pH7.4
雌のマウス血漿(C57BL/6)をBioreclamation、K2 EDTA、カタログ番号MSEPLEDTA2−C57−Fから入手した。
Perkin Elmer、PPN 6005359。
Graph Pad(登録商標)ソフトウェアをすべての分析に使用した。データを平均値として示した。統計分析を、2元配置分散分析とそれに続くすべての群を比較するボンフェローニの多重比較検定を使用して実行した。
結果を図17に示し、図17Aは、gでの累積食物摂取量(FI)を示し、図17Bは、投与の24時間後に測定したpMでの血漿曝露レベルを示す。データを平均値として示す。
実施例11のGLP−1抗TfR−Fab複合体のTfRアームが、上記で決定されたように食物摂取量の低下能力に寄与したかを決定するために、実施例12のGLP−1対照−Fab複合体を用いてヘッドトゥーヘッドの比較を行い、ここでは同じGLP−1R作動薬が不活性なFabと結合し、対照化合物として機能する。
Graph Pad(登録商標)ソフトウェアをすべての分析に使用した。データを平均値として示した。統計分析を、2元配置分散分析とそれに続くすべての群を比較するボンフェローニの多重比較検定を使用して実行した。
結果を図18に示し、図18Aは、gでの累積食物摂取量(FI)を示し、図18Bは、24時間にわたって測定した血漿曝露レベル(pMでの血漿濃度)を示す。
急性食物摂取量の低下の減少が肥満の前臨床モデルにおける体重低減につながるかを決定するために、次に、19日間亜慢性的に治療したDIOマウスで上記のパートIおよびIIで使用した化合物を比較した。簡潔に述べると、雄のC57Bl6Jマウス(Charles River、France)(n=79)は、約4週齢で開始した60%高脂肪食(D12492、Research Diets、New Brunswick、NJ、USA)で維持された。約20週齢で肥満マウスを試験施設に輸送し、温度および湿度が制御された環境、ケージあたりn=10、12〜12時間の明暗サイクル(午後11:00に消灯)で飼育した。4日後、高脂肪食給餌群のマウスを60%〜45%の高脂肪食(HFD D12451、Research Diets、New Brunswick、NJ、USA)に切り替えて、粉々になるのを防ぎ、より正確に食物摂取量を測定した。すべてのマウスをこの時点で単独で飼育し、さらに2週間、それらの新しい環境に順応させた。食物および水はいつでも適宜利用できた。
結果を図19に示し、図19Aは、平均体重低下(%)を示し、図19Bは、19日目の投与の2時間後に測定した平均血漿濃度(pM)を示す。
Claims (14)
- 体重の調節に関与する脳内の領域を標的とする化合物、および血液脳関門(BBB)内に位置する受容体に対するアロステリックリガンドを含む構築物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステルであって、
前記化合物が、GLP−1受容体作動薬(GLP−1RA)であり、前記血液脳関門内に位置する受容体が、トランスフェリン受容体(TfR)である、構築物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミドもしくはエステル。 - 前記化合物が、体重の調節に関与する脳内の経路を標的とする、請求項1に記載の構築物。
- 前記化合物が、体重の調節に関与する脳内の受容体を標的とする、請求項1または2に記載の構築物。
- 前記化合物が、腸由来ホルモンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の構築物。
- TfRと結合する前記アロステリックリガンドが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の構築物。
- 融合タンパク質または複合体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の構築物。
- リンカーをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記リンカーが、ペプチド性または非ペプチド性である、請求項7に記載の構築物。
- 食物摂取量を低下させる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の構築物。
- 体重低下を引き起こす、請求項1〜9のいずれか一項に記載の構築物。
- TfRと結合しないリガンドを組み込むことだけが前記構築物と異なる対照構築物と比較して、BBBによって保護されるGLP−1R発現脳領域への増加した結合を示し、GLP−1Rを発現するBBB保護脳領域が、(i)外側中隔核(LS)、歯状回(DG)、内側手綱(MH)、および傍小脳脚核(PB)から、ならびに/または(ii)側坐核(ACB)、視床下部の背内側核(DMH)、外側視床下部野(LHA)、および外側手綱(LH)から選択される1つ以上の領域である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の構築物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の構築物および少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の構築物、または請求項12に記載の組成物。
- 肥満の予防または治療に使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の構築物、または請求項12に記載の組成物。
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