KR20140043780A - 포도당 의존성 인슐리노트로핀 폴리펩타이드 유사물질, 이의 약학적 조성물 및 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GIP(1-29, SEQ ID NO:1)에서 유래된 GIP유사물질을 제공하는 바, 여기서 GIP유사물질은 GLP-1의 아고니스트 활성과 GIPR자극 활성을 구비하고, 또한 하기 일반식I로 표시된 아미노산 서열:Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Lue-A27-A28-A29-Y를 포함한다. 본 발명은 GIP유사물질을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 응용에 대해서도 제공하였다.

Description

포도당 의존성 인슐리노트로핀 폴리펩타이드 유사물질, 이의 약학적 조성물 및 응용{GLUCOSE DEPENDENT INSULINOTROPIC POLYPEPTIDE ANALOGS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USE THEREOF}

본원 발명은 2011년 6월 10일에 제출한 중국출원번호: 201110156296.2의 우선권을 주장하고자 한다.

제2형당뇨병, T2D는 만성대사불균형질환의 일종이다. 그 주요한 특징으로는 간(肝)글리코겐생성증가, 췌장 β세포기능결함, 인슐린분비부족과 인슐린억제, 나아가 지속적인 고혈당증상으로 발전된다(Green등, Current Pharmaceutical Design, 2004, 10). T2D는 신부전, 실명과 사지절단의 주요원인으로도 되고, 아울러 세계적으로 신혈관에 의해 초래된 고사망위험과 밀접히 관계되기도 한다. 또한, 비만증의 신속한 증가에 따라, T2D는 더욱 유행되고, 이러한 증상은 발전도상 국가에서 더욱 뚜렷하다. 비록 많은 항당뇨병에 대한 치료가 이미 FDA(미국 식품의약국)의 허가를 받았지만, 아직도 새로운 치료수단으로 혈당과 체중에 대한 더욱 바람직한 제어가 필요하다.

1929년 La Barre는 인크레틴(incretin)의 개념(장관분비인슐린，intestinal secretion of insulin)에 대하여 제출하였다. 이 개념은 다년후 독특한 당뇨병치료방법을 개발하였다. 글루카곤 유사펩타이드-1(GLP-1, glucagon-like peptide-1)과 포도당 의존성 인슐리노트로핀 폴리펩타이드(GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide)는 지금까지 인체내에서 발견된 활성이 제일 강한 두가지 인크레틴이다. 지난 30년 간, 이 두가지 폴리펩타이드에 대해 광범위한 연구를 진행하였다(Baggio와 Drucker, Gastroenterology, 2007, 132, 2131-2157). GLP-1과 GIP는 각각 소장내피의 L세포와 K세포에서 분비된다. GLP-1은 30 또는 31개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드이다. 이는 이의 전구물질인 전구글루카곤이 번역후 유전자수식에 의해 산생된다(Orskov등, Endocrinology, 1986, 119, 1467-1475). 아울러, GIP는 42개 아미노산 폴리펩타이드의 형식으로 분비되고, GLP-1과 비하면 대략 68%의 서열동원성을 갖는다(Gallwitz 등, Regulatory Peptides, 1996, 63, 17-22).

GLP-1과 GIP는 모두 이의 특이적 수용체와 결합하여 상응한 생리적작용을 발생한다. 이는 각각 GLP-1수용체(GLP-1R) 및 GIP수용체(GIPR)와 결합한다. 이 두가지 수용체는 모두 G단백질 연관 수용체(G Protein-Coupled Receptors)패밀리에 속한다(Seino 등, Journal of Diabetes Investigation, 2010, 1, 8-23). GLP-1과 GIP는 모두 영양물질 흡수 후, 포도당 의존성 방식으로 인슐린의 분비를 촉진한다. 기타 전통적인 당뇨병치료방법과 비교하면, 예를 들어 인슐린 주사, 설폰요소(sulfonylurea) 및 메트포르민 경구투여 등등 치료방법과 비교하면, 이러한 포도당 의존성 작용방식은 저혈당이 발생할 가능성을 최대한도로 감소시킬 수 있다. 이밖에, 이러한 두가지 폴리펩타이드는 인슐린의 생물적 합성을 촉진할 수 있고, 췌장 β세포의 증식을 제고하며 β세포의 사멸을 억제할 수 있기에, 이는 잠재적으로 β세포의 기능을 보호할 수 있어, T2D의 발전을 늦출 수 있다(Green. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 2007, 21, 497-516). GLP-1과 GIP의 상기 특점은 이들을 매우 개발전도가 있는 T2D와 기타 대사불균형의 잠재적 치료제가 되도록 한다.

GLP-1과 GIP가 잠재적 항당뇨병활성이 있다하지만, 이들은 체내에서 디펩티딜　펩티다아제-IV(DPP-IV, dipeptidyl peptidase-IV)에 의해 신속하게 비활성형식[GLP-1(9-37 또는 9-36), 및 GIP(3-42)]로 분해되고, 체내순환과정에서 제거된다(Deacon 등, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1995, 80, 952-957). 이러한 효소는 특이적으로 N-말단 제2위치의 알라닌(alanine), 프롤린(Proline) 또는 히드록시프롤린(Hydroxyproline)을 분해한다. 따라서, 내원성 GLP-1과 GIP는 DPP-IV의 분해작용에 의해 인체내의 반감기가 매우 짧다(Deacon 등, Hormone and Metabolic Research, 2004, 36, 761-765). 이 또한 외원성 GlP-1과 GIP가 항당뇨병 치료에 직접 사용될 수 없는 원인이다.

수많은 연구조직에서는 모두 GLP-1과 GIP의 천연서열에 대해 구조적 수식을 진행하여, DPP-IV저항목적을 달성하도록 노력하여 왔다. 우선, 각각 GLP-1과 GIP의 히스티딘(histidine)⁷과 티로신(tyrosine)¹잔기에서 각종 화학관능기를 치환하여 N-말단을 확장한다(Green 등, Journal of Endocrinology, 2004, 180, 379-388; O'Harte 등, Diabetes, 1999, 48, 758-765). 이어서, GLP-1서열 중의 Ala⁸과 Glu⁹, 및 GIP서열 중의 Ala²과 Glu³는 각각 광범위하게 기타 아미노산 심지어는 일부 이상한 아미노산으로 교체된다(Green 등, Journal of Molecular Endocrinology, 2003, 31, 529-540; Biological Chemistry, 2003, 384, 1541-1551; Metabolism, 2004, 53, 252-259; Gault, et al. Journal of Endocrinology, 2003, 176, 133-141; Metabolism, 2003, 52, 679-687; Biochemical & Biophysical Research Communications, 2002, 290, 1420-1426; Diabetologia, 2003, 46, 222-230). 최종적으로, GLP-1과 GIP는 짧은 사슬이거나 긴 사슬의 지방산에 연결되어 체내의 순환시간 및 생체이용도를 연장시킨다(Holz와 Chepurny, Current Medicinal Chemistry, 2003, 10, 2471-2483; Irwin 등, Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48, 1244-1250; Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 49, 1047-1054). 이러한 구조의 개조는 상이한 생물적 활성을 갖는 많은 GLP-1과 GIP의 유사물질을 산생하는 동시에 이들이 DPP-IV분해작용에 대한 내성을 극대화로 제고하였다.

1992년 도마뱀 독약에서 최초로 분리 및 감정된 엑센딘-4(exendin-4)는 39개 아미노산으로 조성된 폴리펩타이드이다(Eng등, Journal of Biological Chemistry, 1992, 267, 7402-7405). exendin-4와 GLP-1는 대략 53%의 서열동원성을 갖는다. 실험에 따르면, exendin-4는 체내와 시험관내에서 모두 순수하고 강력한 GLP-1수용체 작동제(agonist)이다. 이는 천연적 GLP-1와 매우 비슷한 생리적작용을 발생하는 동시에 위배출, 인슐린분비, 음식섭취 및 글루카곤(glucagon)의 분비를 조절할 수 있다. Exendin-4는 정상적인 설치류동물 및 당뇨병에 걸린 마우스와 랫트실험모델에서 모두 혈당의 저하를 일으킬 수 있다(Raufman, Regulatory Peptides, 1996, 61, 1-18). 주요하게는 이의 약물동력학 성질이 제고되었기에, 이가 체내에서의 약물활성은 천역적 GLP-1보다 훨씬 우수하다. Exendin-4서열의 제2 위는 글리신(Glycine)치환으로서 이는 천연적 GLP-1서열의 동일한 위치상의 알라닌과 다르다. 따라서, Exendin-4는 DPP-IV분해에 대해 더욱 우수한 안정성이 있고, 체내에서의 반감기는 천연적 GLP-1보다 훨씬 길다. 화학적으로 합성된 exendin-4(exenatide, 익스에나티드)는 아밀린(Amylin)회사와 일라이릴리(Eli Lilly)회사가 합작하여 개발한 것이다. 이의 강력한 혈당저하특징과 상대적으로 긴 체내작용시간에 기반하여, 익스에나티드는 2005년에 FDA허가를 받고 출시하였고, 상품명은 바이에타(Byetta)이다. 현재 익스에나티드는 피하주사방식으로 하루에 두번 투여된다. 일주일에 한번 투여되는 장기효과성 exendin-4제제(exenatide-LAR으로 명명)는 동물모델과 사람을 통해 광범위한 연구를 거쳤다(Gedulin 등, Diabetologia, 2005, 48, 1380-1385; Drucker 등, Lancet, 2008, 372, 1240-1250).

익스에나티드의 거대한 성공에 힘을 입어, 노보노르디스크(Novo Nordisk)회사는 리라글루타이드(liraglutide)를 개발했는 바, 이는 인간GLP-1와 대략 97% 서열 동일성을 갖는 장기효과성 GLP-1유사물질이다. 천연적 GLP-1(7-37)의 서열에 기반하여, 리라글루타이드는34째 자리에 1개의 아르기닌(arginine)을 인입하여 치환하는 동시에26째 자리의 라이신(lysine)의 ε-아민(epsilon-amine)에서 하나의 γ-글루타모일(γ-Glutamoyl)에 의해 팔미토일(palmitoyl)과 연결되어, 스페이서(spacer)로 사용된다. 이에 의해, 팔미토일연결은 혈청알부민과의 결합 및 폴리펩타이드 자가응집에 의하여, 체내에서 DPP-IV를 보호하고 이가 체내에서 순환하는 속도를 현저하게 제고하였다(Malm-Erjefalt등, Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals, 2010, 38, 1944-1953). 리라글루타이드는 2009년과 2010년에 각각 EMA(유럽약품관리국)과 FDA의 허가를 받고 출시하여, 상품명은 빅토자(Victoza)인 바, 매일 한번씩 피하 주사하는 방식으로 T2D를 치료한다. 현재 여전히 리라글루타이드의 항비만증(비당뇨병 군중) 3기 임상 실험에 관한 탐색 연구를 진행하고 있다(Astrup등, Lancet, 2009, 374, 1606-1616). 기타의 GLP-1과 exendin-4유사물질, 예를 들어 taspoglutide(타스포글루티드), albiglutide(알비글루타이드) 및 lixisenatide(릭시세나타이드) 등등은 단일한 GLP-1수용체 작동제로서, 모두 임상 개발 후기에 처하고 있다.

GIP가 정상 개체에서 인크레틴 효과의 약 60%를 담당(Nauck등, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1986, 63, 492-498)한다고 해도, GIP유사물질을 항당뇨병 치료 약물로 응용하는 가능성은 모든 당뇨 환자가 그런 것은 아니지만 일부 당뇨 환자에서 GIP에 대한 췌장 β세포의 감수성이 감소하거나 현저하게 약화되는 현상 때문에 크게 제약을 받는다(Krarup등, Metabolism, 1987, 36, 677-682; Jones등, Hormone and Metabolic Research, 1989, 21, 23-26). 이 때문에 T2D환자 체내에 GIP를 정맥주사하여도 관찰되는 것은 감소한 인슐린 분비 작용이었다. 반대로, GLP-1은 다양한 T2D 피험체에서 인슐린의 분비를 효과적으로 자극한다는 것이 밝혀졌다(Nauck 등, Journal of Clinical Investigation, 1993, 91, 301-307).

GIP의 인슐리노트로핀 분비효과의 약화는 GIP수용체의 만성탈감작(desensitization)에 인해 초래된 것이거나(Tseng 등, American Journal of Physiology, 1996, 270, E661-666), 또는 GIP수용체가 T2D환자의 췌장 β세포에서의 발현이 감소됨에 따라 초래된 것으로 추측되었다(Holst등, Diabetologia, 1997, 40, 984-986). GIP에 관한 임상 응용 연구가 비교적 적지만, GIP가 T2D의 발병에 상당히 기여한다는 것이 입증되었다(Meier등, Regulatory Peptides, 2002, 107, 1-13). 최근 어느 문헌에 보고된 바로는, N-말단이 수식된 GIP유사물질은 비만이며 당뇨 증세가 있는 ob/ob마우스에서 포도당에 대한 인슐린 반응을 제고하고, 혈장 포도당 농도를 낮춘다(O'Harte등, Journal of Endocrinology, 2000, 165, 639-648).

또한, T2D에서 GIP 유도에 의한 인슐린 분비가 줄어드는 것이 간헐적 투여(pulsed administration)일 때는 정맥 점적 주사(intravenous infusion) 때만큼 두드러지지 않는다(Meier등, Diabetes, 2004, 53, S220-224). 그리고, 고혈당의 증상이 호전될 때, T2D 환자의 췌장 β세포는 내재성과 외래성의 GIP에 대한 반응성을 회복할 수 있다(Piteau등, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 362, 1007-1012). 따라서, GIP는 잠재적인 T2D치료방법으로서 또 다시 주목을 받게 되었다. 예를 들어, N-AcGIP는 단독적으로 응용되거나 exendin-4와 연합하여 사용할 때 음식에 의해 유도된 비만당뇨병 모델에 대해 모두 현저하게 혈당수준을 낮추고 포도당의 내성을 제고하였다(Irwin등, Regulatory Peptides, 2009, 153, 70-76).

GLP-1과 GIP이 유도하는 인슐린 자극 효과를 감안하였을 때, GLP-1과 GIP가 포도당 의존적으로 인슐린을 분비하고 세포내 cAMP의 생성을 자극하는 작용은 서로 부가적이며 상승 효과가 있다는 것이 증명되었다(Gallwitz등, Journal of Molecular Endocrinology, 1993, 259-268; Siegel등, European Journal of Clinical Investigation, 1992, 22, 154-157; Nauck 등, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1993, 76, 912-917). 많은 연구팀에서는 GLP-1R와 GIPR를 동시에 활성화시킬 수 있는 합성된 GLP-1/GIP혼성 펩타이드를 개발하는데 예의 노력해왔다.

Gallwitz등은 합성된 일부 GLP-1/GIP키메라펩타이드(chimeric peptide)에 대해 보도한 바가 있다. 이의 N-말단과 C-말단의 3분의 1의 서열은 그중 하나의 폴리펩타이드에서 유래되고, 중간부분은 또 다른 폴리펩타이드에서 유래되었다. 그리고, 폴리펩타이드서열의 13째 자리와 15째 자리에 별도의 단일한 변이체를 구비한 혼성 펩타이드 및 단지 C-말단의 3분의 1만 교환된 키메라펩타이드도 제조하였다. 그러나 N-말단의 22개 아미노산과 GIP-단편의 교체, 및 13째 자리와 15째 자리의 두개 위치의 개변은 모두 이러한 혼성 펩타이드와 GLP-1R의 결합친화력에 영향을 미친다(친화력이 280배로부터 1000배로 감소됨). GIP의 C-말단으로 GLP-1서열의 대응부분을 교체할 때에는 GLP-1R와의 친화성이 20배 좌우로만 감소되었다. 이러한 모든 혼성 펩타이드는 GIPR에서 모두 매우 약한 결합친화성을 갖고 있다(Gallwitz등, Endocrinology and Metabolism, 1995, 2, 39-46; Regulatory Peptides, 1996, 63, 17-22).

이미 알고있는 GIP생물적 활성부위의 기초상에서, Hinke도 5가지 GIP/GLP-1혼성 펩타이드에 대해 보도하였는 바, 이러한 폴리펩타이드로 GIP와 GLP-1의 결합 및 활성화 구조영역에 대해 명백히 밝히였다. 이러한 합성된 키메라펩타이드는 GLP-1_[1-14]/GIP_[15-30]NH2(CH1), GIP_[1-14]/GLP-1_[15-30]NH2(CH2), GLP-1_[1-11]/GIP_[12-30]NH2(CH3), GIP_[1-11]/GLP-1_[12-18]/GIP_[19-30]NH2(CH4) 및 GIP_[1-14]/GLP-1_[15-18]/GIP_{[19-30] NH2}(CH5)이다. GLP-1 아래에 첨자된 아미노산 번호는 일차 서열(primary sequence)에 따라 번호를 매긴 것이다(즉 GLP-1_[7-37]=GLP-1_[1-31]). GIPR과 GLP-1R를 이입한 CHO세포에서의 실험에 따르면, 이러한 키메라 펩타이드에 GLP-1을 첨가한 서열은 이들과 GIPR와의 친화력 또는 생물적 활성을 제고하지 못하였다(Hinke등, Life Sciences, 2004, 75, 1857-1870).

특허 WO 2010011439는 수식된 글루카곤 유사물질에 관한 것으로서, 이는 글루카곤 및/또는 GLP-1활성을 갖는 이외에, 매우 강한 GIP수용체 활성능력을 나타내었다. 이러한 혼성 펩타이드는 글루카곤 서열을 기반으로 개발하여 얻어진다. 글루카곤의 중간부분(17-19)은 GLP-1서열에 의해 교체되는 동시에 C-말단은 extendin-4의 잔기(30-39)에 의해 대체된다. 또한 상기 특허는, 2째 자리와 20째 자리에서 각각 α,α-이중치환된 아미노산 수식은 DPP-IV보호작용을 얻고 및 GLP-1R와 GIPR의 동시 활성화에 대해 매우 중요한 역할이 있음을 보도했다. GLP-1R/GIPR 이중작동제(dual agonist)는 음식에 의해 유도된 비만(DIO)마우스에서, 순수한 GLP-1작동제(예를 들어 exendin-4와 리라글루타이드)에 비해 더욱 우수한 혈당저하작용 및 체중저하작용을 나타내었다. 이러한 이중 작동제는 심지어 GLP-1R 녹아웃(knockout)된 동물모델에서 혈당저하와 체중저하를 일으킨다(DiMarchi와 Ma. WO 2010011439, 2009, 6월, 16).

흥미롭게도 GLP-1에 GIP를 더하는 단순한 공동 투여로는 T2D환자의 인슐린 분비 효과를 더 강화하지 못하고, 더 큰 혈당 저하를 이끌어 낼 수도 없다고 보고되었다(Mentis등, Diabetes, 2011, 60, 1270-1276). 이는 GLP-1과 GIP를 단순히 조합하는 것으로는 이들 각각이 임상적으로 유도하는 인슐린 자극 효능에서의 부가 효과나 상승 작용을 강화할 수 없다는 것을 가리키는 것일 수 있다. 이와 마찬가지로, Gaul도 하기와 같이 보도한 바가 있다. 즉 리라글루타이드 및 N-AcGIP 또는 양자의 간단한 펩타이드 조합과 비교할 시, 리라글루타이드-N-AcGIP 단일제제는 정상 수컷NIH Swiss TO 마우스 및 비만당뇨병(ob/ob)마우스에서 더욱 강한 혈당저하작용 및 인슐린 분비자극을 발생할 수 있다(Gault등, Clinical Science, 2011, 121, 107-117).

본 발명에 따르면, 공개된 GIP유사물질은 천연적 GIP서열(1~29, SEQ ID NO: 1)에 기반하고, 부분적으로, 이러한 폴리펩타이드는 현저한 GLP-1수용체 활성을 나타내는 동시에 GIPR자극활성을 갖고 있다. 또 본 발명은 상기 GIP유사물질을 사용하여 당뇨병과 비만과 같은 대사질환을 치료하는 약물을 제조하는 방법도 제공하였다.

본 발명의 한 측면에서는 GLP-1과 GIP의 이중활성을 지니는 GIP유사물질을 제공한다. GIP 및/또는 GLP-1의 활성은 당업자가 이 기술 분야에서 공지된 체내와 시험관내 방법으로 측정할 수 있다(Fan R, Kang Z, He L, Chan J, Xu G (2011) Exendin-4 Improves Blood Glucose Control in Both Young and Aging Normal Non-Diabetic Mice, Possible Contribution of Beta Cell Independent Effects. PLoS ONE 6(5): e20443. doi: 10.1371/journal.pone.0020443; David G. Parkes등, Insulinotropic Actions of Exendin-4 and Glucagon-Like Peptide- 1 In Vivo and In Vitro, Metabolism, Vol 50, No 5 (May), 2001 : pp 583-589; Jens Juul Hoist, The Physiology of Glucagon-like Peptide 1; Physiol Rev 87: 1409-1439, 2007; doi: 10.1152/physrev.00034.2006; 및 M. Shimoda등, The human glucagon-like peptide- 1 analogue liraglutide preserves pancreatic beta cells via regulation of cell kinetics and suppression of oxidative and endoplasmic reticulum stress in a mouse model of diabetes, Diabetologia (2011) 54: 1098-1108, DOI 10.1007/s00125-011-2069-9).

예를 들어, 매개 폴리펩타이드의 EC₅₀값은 통상적으로 cAMP유도시험에 의해 측정되었는 바(Meera Kumar등, A Bioluminescent-Based, HTS-Compatible Assay to Monitor G-Protein-Coupled Receptor Modulation of Cellular Cyclic AMP, ASSAY and Drug Development Technologies, Vol.5, No.2, 2007; Yuxin Yan등, Cell-Based High-Throughput Screening Assay System for Monitoring G Protein-Coupled Receptor Activation Using β-Galactosidase Enzyme Complementation Technology, Journal of Biomolecular Screening, Vol.7, No.5, 2002; Thomas C. Rich와 Jeffrey W. Karpen., High- Throughput Screening of Phosphodiesterase Activity in Living Cells, Methods in Molecular Biology, vol. 307: Phosphodiesterase Methods and Protocols; Jayne Hesley등, Stable, Sensitive, Fluorescence-Based Method for Detecting cAMP, Bio Techniques 33:691-694 (September 2002); 및 Christine Williams., cAMP Detection Methods FN HTS: Selecting the Best., Nature Reviews, Drug Discovery Vol.3, February 2004), 후술할 실시예8에 상세히 기재되었다.

일실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질(1~29, SEQ ID NO: 1)은 적어도 0.01%의 천연GLP-1가 GLP-1수용체에 대한 아고니스트활성을 갖고, 예를 들어 천연GLP-1의 GLP-1수용체아고니스트활성의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.5%, 0.8%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%), 및/또는 적어도 0.01%인 GIP가 GIP수용체에 대한 아고니스트활성을 갖고, 예를 들어 천연GIP(SEQ ID NO:1)의 GIP수용체 아고니스트활성의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.5%, 0.8%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%이고, 하기 실시예8에 따른 통용cAMP유도시험방법에 의해 측정된다.

GIP유사물질은 이하 기술된 적어도 한가지 수식에 의해 SEQ ID NO:1의 서열에서 유도된다.

(1) 7째 자리의 아미노산을 치환하여 이의 GLP-1수용체와 GIP수용체의 아고니스트활성을 유발한다;

(2) 13째 자리의 아미노산을 치환하여 이의 GLP-1과 GIP수용체의 능력을 제고시킨다;

(3) 22째 자리의 아미노산을 치환하여 이의 GLP-1과 GIP수용체의 능력을 제고시킨다;

또는, 유사물질은 이하 기술된 적어도 한가지 수식에 의해 SEQ ID NO:1의 서열에서 유도된다:

(1) 7째 자리의 아미노산을 치환하여 이의 GLP-1수용체와 GIP수용체의 아고니스트활성을 유발한다;

(2) 13째 자리의 아미노산을 치환하여 이의 GLP-1수용체 및 GIP수용체의 능력을 제고시킨다;

(3) C-말단에 계속하여 1~20개 아미노산을 연장시킨다.

본 발명에서, 상기의 아미노산 위치번호와 본문의 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열의 동일한 위치는 일치하다. 더욱 구체적으로, 위치는 서열과 본문의 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열을 비교대조하여 감정된 것이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 2째 자리는 Aib로 치환되고, SEQ ID NO:1의 서열과 대조하면, 상기 치환(Aib로 Ala를 치환)은 이렇게 얻어진 GIP유사물질의 DPP-IV효소에 대한 안정성을 제고하였다.

일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1의 서열과 대조하면, 본 발명의 GIP유사물질의 7째 자리의 아미노산은 Thr이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 13째 자리의 아미노산은 이의 측쇄에 아릴기를 함유한다. 측쇄에 아릴기를 함유하는 아미노산은 Tyr, Tyr의 유도체, Phe와 Phe의 유도체로부터 선택된다. 일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 대조하면, 본 발명의 GIP유사물질의 13째 자리의 아미노산은 Tyr이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 16째 자리의 아미노산은 양전하를 띤 아미노산인 바, 예를 들어 Lys 또는 Arg이지만 이에 한정되지 않는다.

일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 대조하면, 본 발명의 GIP유사물질의 17째 자리의 아미노산은 Glu이다.

일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 대조하면, 본 발명의 GIP유사물질의 19째 자리의 아미노산은 Val이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 20째 자리의 아미노산은 양전하를 띤 아미노산인 바, 예를 들어 Lys 또는 Arg이나 이에 한정되지 않는다. 일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 대조하면, 본 발명의 GIP유사물질의 20 째 자리의 아미노산은 Arg이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 22째 자리의 아미노산은 Phe 또는 Phe유도체에 의해 치환되는 바, 예를 들어 4-할로게노-페닐알라닌(4-halogeno -Phenylalanine), 4-니트로-페닐알라닌(4-nitro-Phenylalanine), 4-아미노페닐알라닌(4-amino Phenylalanine), 4-알킬 페닐알라닌(4-alkyl Phenylalanine), 4-메톡시페닐알라닌(4-methoxy Phenylalanine), 4-카르복실페닐알라닌(4-carboxyl Phenylalanine) 및 포화 또는 불포화 고리측쇄를 갖는 Cha, Chg및 Phg를 포함하는 유사물질과 같은 비천연아미노산으로 치환된다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 29째 자리 아미노산은 Gly 또는 Gln이다.

또 다른 실시 형태에서는, 전술한 수식 중 적어도 하나를 거쳐 SEQ ID NO:1의 서열로부터 유래한 GIP유사물질에 대하여 그 GLP-1 아고니스트 활성을 제고하기 위하여 추가로 수식을 할 수 있다.

일실시방식에 따르면, SEQ ID NO:1서열에 의해 유도되는 GIP유사물질의 N-말단영역(1-16)은 2, 7, 13째 자리 중의 하나 또는 복수의 자리에서 적어도 한가지 수식을 거쳐 GLP-1(SEQ ID NO:1) 또는 exendin-4(SEQ ID NO:99)의 중간단(17-20째 자리) 및 GLP-1(SEQ ID NO:1) 또는 exendin-4(SEQ ID NO:99)의 C-말단영역(21-29)과 융합된다.

일실시방식에 따르면, exendin-4의 중간단(SEQ ID NO:99의 17~20째 자리 아미노산잔기)은 본 발명의 GIP유사물질의 펩타이드 골격에 통합되어 GLP-1활성을 제고하고, GIP수용체 아고니스트활성을 보류하도록 한다.

일실시방식에 따르면, GLP-1_[7-37]의C-말단영역(SEQ ID NO:1의 27~35째 자리 아미노산잔기)은 본 발명의 GIP유사물질의 펩타이드 골격에 통합되어 GLP-1활성을 제고하고, GIP수용체 아고니스트활성을 보류하도록 한다.

또 하나의 실시 형태에서, GLP-1 및/또는 exendin-4의 영역과 융합되어 얻어진 GIP유사물질에 대하여 그 활성 및/또는 성질을 제고하기 위한 추가 수식을 할 수 있다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 C-말단은 exendin-4의 단편(30~-39째 자리), GPSSGAPPPS에 의해 연장된다.

일실시방식에 따르면, C-말단은 1~10개의 양전하를 띤 아미노산잔기로 연장된다. 양전하를 띤 아미노산잔기는 Lys 및/또는 Arg이고, Lys인 것이 바람직하다. 양전하를 띤 아미노산 잔기의 개수는 1~6인 것이 바람직하고, 1~4인 것이 더욱 바람직하며, 예를 들어 C-말단은 2개, 3개 또는 4개 또는 5개의 양전하를 띤 아미노산 잔기로 의해 연장된다. 바람직한 일 실시예에 따르면, GIP유사물질의 C-말단은 옥신토모듈린(oxyntomodulin)에서 유래된 매개 펩타이드(intervening peptide)(IP-1단편) KRNRNNIA에 의해 연장된다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 12째 자리와 16째 자리와 같은 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 염다리(salt bridge)를 형성한다. 이러한 실시방식에서, 12째 자리와 16째 자리 아미노산 중의 하나의 아미노산은 음전하를 띤 Glu와 같은 아미노산으로 치환되고, 또 다른 위치는 양전하를 띤, Lys와 같은 아미노산이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 12째 자리와 16째 자리와 같은 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 락탐고리(Lactam ring)를 형성한다. 이러한 실시방식에서, 12째 자리와 16째 자리의 아미노산 중의 하나의 아미노산은 음전하를 띤 Glu와 같은 아미노산으로 치환되고, 또 다른 위치는 양전하를 띤 Lys와 같은 아미노산이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 17째 자리와 20째 자리와 같은 j째 자리와 j+3째 자리의 아미노산 사이에 염교가 형성된다. 이러한 실시방식에서, 17째 자리와 20째 자리의 아미노산 중의 하나는 음전하를 띤 Glu와 같은 아미노산으로 치환되고, 또 다른 위치는 양전하를 띤 Lys와 같은 아미노산이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질의 17째 자리와 20째 자리와 같은 j째 자리와 j+3째 자리의 아미노산 사이에 락탐고리를 형성한다. 이러한 실시방식에서, 17째 자리와 20째 자리의 아미노산 중의 하나는 음전하를 띤 Glu와 같은 아미노산으로 치환되고, 또 다른 위치는 양전하를 띤 Lys와 같은 아미노산이다.

일실시방식에 따르면, GIP유사물질은 본 발명의 GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 측쇄사이에 위치하는 염교를 포함하되, 여기서 i는 12, 13, 16, 17, 20 또는 24이다.

일실시방식에 따르면, GIP유사물질은 본 발명의 GIP유사물질의 j째 자리와 j+3째 자리에 위치하는 염다리를 포함하되, 여기서 j는 17, 18, 19 또는 20이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 GIP유사물질에 함유되는 Lys의 ε-아민(epsilon-amine)은 지방산부위와 연결될 수 있는 바, 예를 들어 Lys¹⁶ 또는 Lys¹⁸이다. 지방산은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 콜린산으로부터 선택될 수 있다.

일실시방식에 따르면, ε-아미노기 (예를 들어 Lys, Orn, Dab 또는 Dap)는 본 발명의 GIP유사물질의 20, 24, 28, 32, 33 및/또는 37째 자리에 위치한다. 일실시방식에 따르면, 양전하를 띤 아미노산 잔기를 갖는 측쇄에 공유결합된 아실기는 30째 자리 내지 C-말단의 임의의 자리에 위치할 수 있다.

일실시방식에 따르면, 16째 자리의 Lys의 ε-아미노기는 지방산 아실화된다.

일실시방식에 따르면, 양전하를 띤 아미노산 잔기의 측쇄는 아실화된다.

일실시방식에 따르면, 아실기와 연결되는 아미노산은 40째 자리에 있는 것이 바람직하다.

일실시방식에 따르면, 펩타이드 사슬과 지방산부위 사이에 스페이서가 삽입된다. 스페이서는 1-10 아미노산잔기를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어 (Glu)_m이고, m는 0~3 사이의 정수이다.

일실시방식에 따르면, 스페이서는 하나의 아미노산이거나 혹은 γ-Glu-γ-Glu, D-Ala-D-Ala, D-Ala-γ-Glu, γ-Glu-D-Ala 또는 Glu-Glu로부터 선택된 디펩타이드이다.

일실시방식에 따르면, 아실기는 C8-C20의 지방아실이고, 팔미토일인 것이 가장 바람직하다.

일실시방식에 따르면, GIP유사물질과 친수성의 중합체는 30째 자리부터 C-말단의 임의의 아미노산 자리에서 공유결합되어, 약물동력학 특성을 현저하게 개선하도록 한다. 일실시방식에 따르면, 친수성 중합체는 GIP유사물질의 24째 자리의 아미노산과 공유결합된다.

일실시방식에 따르면, 친수성 중합체는 GIP유사물질의 Cys, 호모시스테인(homocysteine), Lys, Orn, Dab, Dap 또는4-아미노-페닐알라닌(4-Amino-Phenylalanine)의 측쇄와 결합된다.

일실시방식에 따르면, 친수성 중합체는 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol)이다.

일실시방식에 따르면, PEG의 분자량은 약 1,000 내지 약 40,000달톤(Dalton), 예를 들어 약 5,000 내지 약 40,000달톤이고, 약 1,000 내지 약 20,000달톤인 것이 바람직하다.

일실시방식에 따르면, PEG은 말레오일(maleoyl) 또는 포르밀(formyl)의 관능기를 포함한다.

일실시방식에 따르면, 펩타이드 사슬과 지방산 사이에 스페이서가 삽입된다. 스페이서는 1-10 아미노산잔기를 포함하는 펩타이드인 바, 예를 들어 (Glu)m이고, m는 0~3 사이의 정수이다.

일실시방식에 따르면, 스페이서는 하나의 아미노산이거나 혹은 γ-Glu-γ-Glu, D-Ala-D-Ala, D-Ala-γ-Glu, γ-Glu-D-Ala 또는 Glu-Glu으로부터 선택된 디펩타이드이다.

일실시방식에 따르면, GIP유사물질은 유리형의 카르복실산(carboxylic acid), 아미드(amide) 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형식으로 존재한다.

한편, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 GLP-1의 아고니스트활성을 갖는다. 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 GLP-1아고니스트활성과 GIPR자극활성을 갖는다.

일 실시방식에 따르면, 본 발명은 GIP(1-29, SEQ ID NO:1)에서 유래된 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 바, 여기서 GIP유사물질은 GLP-1아고니스트 활성과 GIPR자극활성을 갖고, 또한 이하 일반식I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며,

Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Leu-A27-A28-A29-Y

여기서,

A2는 Ala, Gly, 사르코신(Sarcosine), Aib, D-Ala 및 D-Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A3은 Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A7은 Thr, Ile 및 Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A12는 Ile, Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe(4-NH₂), Ala, Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐), Ala(4-피리딜) 및 페닐글리신(phenylglycine)으로부터 선택되며,

A14는 Met 또는 산화된 Met, Leu, Val, 노류신(norleucine) 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A15는 Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A17은 Ile, Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A18은 Ala 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A19는 Val, Ala, Leu, Gln 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A20은 Arg, Lys-Z, Gln, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A21은 Glu, Asp 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A22는 Phe, Phe(4-F), Phe(4-Cl), Tyr, Tyr(4-Me) 및 Nal으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A23은 Ile 및 Val으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A24는 Ala, Asn, Glu, Lys-Z 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A27은 Val, Leu, Ala 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A28은 Lys-Z, Ala, Arg 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A29는 Gly, Gln 및 Arg으로 구성된 군으로부터 선택되고,

Y는 A30 및 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재(absent)하며,

A30과 A40은 독립적으로 -(Lys)_n-Z 및 -Cys-Z로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴(Biotin) 및 -(Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하며,

n은 1~6으로부터 선택된 정수이고,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이며,

여기서, GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 선택적으로 락탐연결(lactam linkage)을 형성하고, i는 12~24로부터 선택된 정수이다.

일 실시방식에 따르면, 본 발명은 일반식I로 표시되는 GIP유사물질을 제공하는 바,

여기서,

A3은 Glu이고,

A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고, 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe(4-NH₂), Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,

A15는 Glu이고,

A18은 Ala이며,

A19는 Val 및 Ala으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A20은 Arg, Lys-Z, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A21은 Glu 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A22는 Phe이며,

A23은 Ile이고,

A27은 Val 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A28은 Lys-Z 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되고, 또한

A29는 Gly이며,

Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

m은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 GIP(1-29, SEQ ID NO:1)에서 유래된 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 바, 여기서 GIP유사물질은 GLP-1아고니스트활성과 GIPR자극활성을 갖고, 또한 이하 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며:

Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20-A21-Phe-Ile-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly-Y

여기서,

A2는 Ala, Gly, 사르코신, Aib, D-Ala 및 D-Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A7은 Thr, Ile 및 Ser으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A12는 Ile, Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe-(4-NH₂), Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,

A14는 Met 또는 산화된 Met, Leu, Val, 노류신(norleucine) 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A17은 Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A19는 Val 및 Ala으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A20은 Arg, Lys-Z, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A21은 Glu 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A24는 Ala, Asn, Glu, Lys-Z 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A27은 Val 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A28은 Lys-Z 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되며,

Y는 A30 및 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

A30과 A40은 독립적으로 -(Lys)_n-Z 및 Cys-Z로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하며,

Z는 (Glu)_m-PEG, (Glu)_m-바이오틴 및 (Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

n은 1~6으로부터 선택된 정수이며,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이고,

여기서, GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 선택적으로 락탐연결을 형성하고, i는 12~24로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서,

Y는 A30 또는 부존재하고,

A30은 -(Lys)_n-Z 및 -Cys-Z로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하며,

Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

n은 1~6으로부터 선택된 정수이며,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서:

Y는 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40이고,

A40은 -(Lys)n-Z 및 -Cys-Z로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하며,

Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하고,

n은 1~6으로부터 선택된 정수이며,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서:

Z는 (Glu)_m-PEG, (Glu)_m-바이오틴 및 (Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고, m은 0~3으로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서 Y는 부존재한다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명은 GIP(1-29, SEQ ID NO:1에서 유래된 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 바, 여기서 GIP유사물질은 GLP-1아고니스트 활성과 GIPR자극활성을 갖고, 또한 이하 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며:

Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20-A21-Phe-Ile-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly

여기서,

A2는 Ala, Gly, 사르코신, Aib, D-Ala 및 D-Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A7은 Thr, Ile 및 Ser으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A12는 Ile, Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe-(4-NH₂), Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,

A14는 Met 또는 산화된 Met, Leu, Val, 노류신(norleucine) 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A17은 Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A19는 Val 및 Ala으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A20은 Arg, Lys-Z, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A21은 Glu 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A24는 Ala, Asn, Glu, Lys-Z 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A27은 Val 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A28은 Lys-Z 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되며,

Z는 (Glu)_m-PEG, (Glu)_m-바이오틴 및 (Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이며,

여기서, GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 선택적으로 락탐연결을 형성하고, i는 12~24로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: Y는 Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser이다.

이러한 실시방식에 따르면, 본 발명은 GIP(1-29, SEQ ID NO:1)에서 유래된 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 바, 상기 GIP유사물질은 GLP-1아고니스트 활성과 GIPR자극활성을 갖고 있고, 또한 이하 일반식으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며,

Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20-A21-Phe-Ile-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

여기서,

A2는 Ala, Gly, 사르코신, Aib, D-Ala 및 D-Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A7은 Thr, Ile 및 Ser으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A12는 Ile, Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe-(4-NH₂), Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,

A14는 Met 또는 산화된 Met, Leu, Val, 노류신(norleucine) 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A17은 Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A19는 Val 및 Ala으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A20은 Arg, Lys-Z, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A21은 Glu 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A24는 Ala, Asn, Glu, Lys-Z 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,

A27은 Val 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되고,

A28은 Lys-Z 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되며,

Z는 (Glu)_m-PEG, (Glu)_m-바이오틴 및 (Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이며,

여기서, GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 선택적으로 락탐연결을 형성하고, i는 12~24로부터 선택되는 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A7는 Thr이고,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A2는 Aib이며,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A13은 Tyr이고,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A17은 Glu이며,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A19는 Val이고,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A20은 Arg이며,

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: A24는 Cys-Z이고,

Z는 -(Glu)_m-PEG이며,

m는 0~3으로부터 선택된 정수이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서,

A30과 A40은 독립적으로 (Lys)_n-Z으로부터 선택되고,

Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 이루어지는 군에서 선택하거나 부존재하며,

n은 1~6으로부터 선택된 정수이고,

m은 0~3으로부터 선택된 정수이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서:

Z는 -(Glu)_m-PEG 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,

m은 0~2로부터 선택된 정수이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서,

Z는 -(Glu)_m-PEG이고,

m은 0~2로부터 선택된 정수이다.

일실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서:

Z는 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,

m은 0~2로부터 선택된 정수이다.

예를 들어, -(Glu)_m는 γ-Glu 또는 γ-Glu-γ-Glu일 수 있다.

일부 실시방식에 따르면, 본 발명에 의해 제공된 GIP유사물질은 일반식I로 표시되는 바, 여기서: 락탐연결은 GIP유사물질의 i째 자리 및 i+4째 자리의 아미노산 사이에 형성되고, i는 12, 16 및 24로부터 선택된 정수이다.

일부 실시방식에 따르면, 지방산은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 콜린산으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시방식에 따르면, PEG의 분자량은 5kDa~40kDa인 바, 예를 들어 20kDa, 30kDa 또는 40kDa이다.

일부 실시방식에 따르면, GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 포함된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 65, 2~64 및 66~98로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시방식에 따르면, GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 포함된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3, 18, 19, 20, 21, 35, 45, 52, 63, 65, 72, 74, 80, 97 및 98으로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 실시방식에 따르면, GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 포함된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 52, 72 및 74로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 이러한 서열은 20째 자리, 24째 자리 및/또는 C-말단에 연결된 적어도 하나의 지방산부위를 갖는다.

일부 실시방식에 따르면, GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 포함된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 65, 74 및 98로 표시되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되고, 이러한 서열은 20째 자리, 24째 자리 및/또는 C-말단에 연결된 적어도 하나의 PEG부위를 갖는다.

일부 실시방식에 따르면, GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 SEQ ID NO:74로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 24째 자리에 연결된 PEG부위와 C-말단에 연결된 지방산부위를 갖는다.

본 발명에 따른 GIP유사물질은 모두 당업자가 숙지하고 있는 방법에 의해 합성 및 수식을 거쳐 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 GIP유사물질의 펩타이드골격은 표준적 고상펩타이드 합성방법(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Chan, Weng C; White, Peter D., OXFOR University press, 2000, 41-72) 또는 이하 실시예1-7에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다. GIP유사물질은 또한 재조합DNA기술 또는 기타 펩타이드 제조와 융합단백질의 방법에 의해 제조될 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 상기의 GIP유사물질, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

일실시방식에 따르면, 약학적 조성물은 한가지 또는 여러가지 항당뇨병제를 더 포함할 수 있는데, 상기 항당뇨병제는 인슐린계, 비구아니드계, 설폰요소계, 로지클리타존 또는 피오글리타존, α-글루코시다아제 억제제 및 아미노디펩티다아제 IV 억제제로부터 선택된다.

일실시방식에 따르면, 약학적 조성물은 주사제 또는 동결건조분말 형식으로 제조될 수 있다.

본 발명에 사용된, "약학적 조성물"은 본 발명에 따른 치료효능을 갖는 제제를 의미한다.

본 발명의 조성물을 제조하기 위한 방법과 응용에서, 유효성분의 치료유효량에 대해서도 제공하였다. 치료유효량은 의료 또는 수의과 작업자가 예를 들어 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증 및 본 기술분야에 공지된 기타 질환 등과 같은 환자의 특정에 따라 측정할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 임의의 비경구투여경로로 투여되고, 유효성분을 포함하는 약학적 조성물의 형식으로, 무독유기산, 무기산 또는 염기부가염의 형식을 임의로 선택하고, 약학적으로 허용가능한 용량의 형식은 치료할 질환과 환자 및 투여경로에 의존하는데 상이한 용량으로 조성물을 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복막내, 척수강내, 심실내, 흉골내, 두개골내, 근육내 또는 피하경로와 같은 비경구투여경로로 투여할 수 있거나, 또는 점적기술로 투여할 수 있다. 약학적 조성물은 멸균주사액 형식으로 사용하는 것이 바람직하고, 이는 예를 들어 충분한 염 또는 포도당과 같은 기타물질을 더 포함할 수도 있는데 이는 주사액과 혈액의 등장성(isotonic)을 확보하기 위한 것이다. 수요에 의해, 주사액은 적합한 완충체계(pH값는 3~9로 조절되는 것이 바람직함)를 필요로 할 수도 있다. 당업자는 공지된 표준제약기술에 따라, 무균조건하에서 비경구투여제제를 제조할 수 있다.

비경구투여에 적합한 약학적 조성물에는 수성과 비수성 무균주사제가 포함되는데, 이는 산화방지제, 완충제, 세균억제제 및 제제가 목표접수자의 혈액등장성에 도달되도록 하는 용해물을 포함할 수 있고; 아울러, 수성과 비수성 무균혼탁물은 현탁제와 증점제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 단일용량 또는 다용량의 용기에 넣을 수 있는 바, 예를 들어 밀봉된 앰플과 약물병에 넣을 수 있고; 동결건조된(lyophilised) 분말형태로 저장할 수도 있으며, 사용전에 주사용수와 같은 무균액체담체를 첨가하기만 하면, 바로 용해시켜 사용할 수 있다.

인간환자의 경구투여와 비경구투여에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물의 하루 투여량 수준은 통상적으로 0.1㎍ 내지 100㎍인 바, 예를 들어1㎍~100㎍, 10㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 60㎍, 70㎍, 80㎍, 90㎍ 또는 100㎍/성인/일, 일회 또는 다수회 투여한다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 0.1㎍ 내지 100㎍의 유효성분을 포함하는 것이 바람직한 바, 예를 들어 1㎍~100㎍, 10㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 60㎍, 70㎍, 80㎍, 90㎍ 또는 100㎍의 유효성분을 포함하고, 필요에 따라 일회 투여에 하나 또는 두개 또는 다수개를 사용한다.

일실시방식에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량범위는 0.1㎍ 내지 100㎍인 바, 예를 들어 1㎍~100㎍, 10㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 60㎍, 70㎍, 80㎍, 90㎍ 또는 100㎍이며, 투여빈도는 예를 들어 하루에 한번 또는 두번이나 이에 한정되지 않는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 GIP유사물질이 대사이상(Metabolic disorders)을 치료 또는 예방하는데 있어서의 응용에 관한 것이다.

다른 또 하나의 측면에서, 본 발명은 대사이상을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로서, 이는 이를 수요로 하는 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 대사질환은 당뇨병, 비만증 및 골다공증을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 또 하나의 측면에서, 본 발명은 체내 및/또는 시험관내에서 GIP 및 GLP-1수용체를 활성화시키는 방법에 관한 것으로서, 이는 본 발명에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 GIP 및 GLP-1수용체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 체내 또는 시험관내에서 모두 실현가능하다.

도1은 정상ICR마우스에서 유사물질023, 024, 025 및 026(3nmol/kg)에 대해 복강내당부하시험(ipGTT, Intraperitoneal glucose tolerance test)을 진행하되, 엑센딘-4(exendin-4)(1nmol/kg)를 대조 화합물로 하는 도면이다. 상기 화합물은 각각 -30분의 시점에서 피하주사로 투여되고, 0분인 시점에서 포도당(3g/kg)을 투입한다.
도2는 유사물질023, 024, 025 및 026에 대한 ipGTT의 곡선하면적(AUC, Area Under The Curve)이다. AUC데이터에 의하면, 유사물질024이 더욱 우수한 시험관내 활성을 갖는다 해도, 유사물질023은 이러한 유사물질 중에서 가장 효과적이다. 따라서, 유사물질023은 활성화합물(hit compound)로 선택된다.
도3은 정상ICR마우스에서 유사물질051(1nmol/kg)에 대해 ipGTT를 진행하되, 같은 용량의 exendin-4를 대조 화합물로 하는 도면이다. 화합물은 각각 -30분의 시점에서 피하주사로 투여되고, 0분과 240분의 시점에서 포도당(3g/kg)을 투입한다.
도4는 유사물질051에 대한 ipGTT의 AUC이다. AUC 데이터에 의하면, 포도당을 두번 연속 투입한 후, 유사물질051 및 exendin-4는 같은 용량의 수준에서 상당히 비슷한 혈당저하작용을 갖는다.
도5는 유사물질088 및 089가 중국 햄스터 난소(CHO, Chinese hamster ovary)세포계에서 진행한, hGLP-1R에 의해 매개된 cAMP유도시험이다. 유사물질088(20k 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol)화된 펩타이드)은 유사물질089(40k PEG화된 펩타이드)와 근접한 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1, glucagon-like peptide-1)활성을 나타낸다.
도6은 유사물질088 및 089가 CHO세포계에서 진행한, hGIPR에 의해 매개된 cAMP유도시험이다. 유사물질088(20k PEG화된 펩타이드)은 유사물질089(40k PEG화된 펩타이드)와 근접한 GIP활성을 나타낸다.
도7은 유사물질089에 대하여 db/db마우스에서 투여량 조절(dose titration) 형식으로 얻은 0~49일 동안의 비공복혈당수준을 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 혈당저하활성이 관찰되었다.
도8은 유사물질089에 대하여 db/db마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻은 당화혈색소(HbA1C, hemoglobin A1c)의 제 42일째 농도를 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 HbA1C저하활성이 관찰되었다.
도9는 유사물질089에 대하여 db/db마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻은 혈청TG의 제 50일째 농도를 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 혈청TG저하활성이 관찰되었다.
도10은 유사물질089에 대하여 식이유도비만(DIO, diet-induced obesity)마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻어진 0~28일 동안의 체중 수준을 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 한 것이다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 체중 저하 활성이 관찰되었다.
도11은 유사물질089에 대하여 DIO마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻은 혈청TG의 제 28일째 농도를 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 혈청TG저하활성이 관찰되었다.
도12는 유사물질089에 대하여 DIO마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻은 CHO의 제 28일째 혈청 농도를 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 모든 유사물질089군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력한 혈청CHO 저하 활성이 관찰되었다.
도13은 유사물질089에 대하여 DIO마우스에서 투여량 조절 형식으로 얻은 혈청 고밀도지단백질(HDL, high density lipoprotein, HDL)/저밀도지단백질(LDL, low-density lipoprotein)의 제 28일째의 농도를 나타내는 바, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 유사물질089의 모든 시험군에서 리라글루타이드보다 더욱 강력하게 혈청HDL/LDL비율을 개선하는 활성이 발견되었다.
도14는 유사물질089의 정상 마우스 중에서의 약물 동태학 연구를 나타낸다. 유사물질089를 17nmol/kg정맥주사할 때 반감기는 15시간, 17nmol/kg, 50nmol/kg 및 150nmol/kg의 투여량으로 피하주사할 때 반감기는 각각 11.9시간, 19.9시간 및 25.2시간이다. 생체이용률은 약 30%이다.

정의

본 발명에서, 이하의 용어들은 아래의 용어에 대한 해석과 일치하다.

본 발명에서 사용한 용어 "유사하다" 또는 "근접하다"는 일정한 수치 또는 수치범위보다 10% 크거나 작지만, 임의의 수치 또는 수치범위가 이의 더욱 광범위한 정의에만 속한다고 규정한 것은 아니다. 용어 "유사하다" 또는 "근접하다"로 서술된 매개 수치 또는 수치범위는 일정한 절대치 또는 수치범위도 포함한다.

본 발명에서 사용한 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 예를 들어 인산염인 생리식염수완충액, 물과 같은 임의의 표준약물담체, 오일/물 또는 물/오일과 같은 유제, 및 각종 습윤제를 포함한다.

본 발명에서 사용한 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 모체화합물의 생물적 활성을 유지하는 화합물의 염, 및 생물적 활성이 없거나 또는 기타 비수요활성의 염을 의미한다. 본 발명에서 서술한 많은 화합물은 아미노기 및/또는 카르복실기 혹은 이와 유사한 관능기에 의해 산 및/또는 염기의 염을 형성할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염기부가염은 무기염기와 유기염기에 의해 제조될 수 있다. 무기염기를 통해 얻어진 염은 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘염만 포함한다. 유기염기를 통해 얻어진 염은 일급 아민(primary amine), 이급 아민(secondary amine) 및 삼급 아민(tertiary amine)의 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

약학적으로 허용가능한 산부가염은 무기산과 유기산에 의해 제조될 수 있다. 무기산을 통해 얻어진 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 및 유사물을 포함한다. 유기산을 통해 얻어진 염은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산(glycolic acid), 피루브산, 옥살산, 사과산(malic acid), 말론산(malonic acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 신남산(cinnamic acid), 만델산(mandelic acid), 메탄설폰산, 에탄설폰산, 파라톨루엔설폰산, 살리실산 및 기타 유사한 산류를 포함한다.

본 발명에서 사용한 용어 "치료"는 구체적인 장애 또는 상황의 예방이거나, 혹은 구체적인 장애 또는 상황과 관련된 증상의 완화, 및/또는 상기한 증상을 방지 또는 해소하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용한 용어 "당뇨병치료"는 통상적으로 혈당수준을 정상범위내로 개변하는 것을 의미하되, 일정한 정황에 따라 혈당수준을 높히거나 낮추는 것이 포함된다.

본 발명에서 제기된 GIP유사물질의 "유효량" 또는 "치료유효량"은 무독이지만 예기하는 치료효과에 도달할 수 있는 펩타이드의 량을 의미한다. 예를 들어, 일종의 예기하는 치료효과는 고혈당을 예방 또는 치료하는 것이고, 혈당저하수준으로 평가하는 것을 의미한다. 다른 예기하는 치료효과는 체중을 줄이거나 제중증가를 방지하는 것이고, 체중저하로 평가하는 것을 포함한다. "유효적"투여량은 개체의 년령과 자가상황, 관리모드 및 유사상황이 개변됨에 따라 개변된다. 따라서, 정확한 "유효적 투여량"을 확정하는 것은 불가능하다. 그러나 매 사람에게 사용되는 적합한 "유효적" 투여량은 본 기술분야의 당업자들이 통상적인 시험을 거쳐 확정할 수 있다.

본 발명에서 제기된 용어 "정제" 및 이와 유사한 용어는 분자 또는 화합물에 대한 분리를 의미하는데, 이로써 천연적이거나 자연환경에서 통상적으로 상기 분자 또는 화합물과 공존하는 오염물을 기본상에서 포함하지 않도록 하는 것이다. 본 발명에서 제기된 용어 "정제"는 절대적인 순수를 요구하는 것이 아니고; 반대로, 이는 상대적인 정의이다. 본 발명에서 제기된 용어 "정제된 폴리펩타이드"는 기타 화합물에서 분리된 폴리펩타이드를 의미하고, 상기 기타 화합물은 핵산분자, 지질체 및 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "분리"는 원시환경에서 상기 물질을 분리하는 것을 의미하고, 예를 들어, 활동체에 존재하는 천연적인 폴리뉴클레오티드는 분리될 수 없으나, 같은 종류의 폴리뉴클레오티드는 일부분 또는 전체 자연계의 공존물질에서 분리된다.

본 발명에서 제기된 용어 "펩타이드"는 3개 또는 더욱 많은, 50개 미만의 전형적인 아미노산의 서열을 포함하는 것을 의미하고, 여기서 이러한 아미노산은 천연적이거나 비천연적인 아미노산일 수 있다. 비천연적인 아미노산은 체내에 존재하지 않지만, 본 발명에서 서설한 펩타이드 구조 중의 아미노산을 포함될 수 있다.

본 발명에서 제기된 용어 "GIP유사물질"은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열의 임의의 유사물질을 포함하는 임의의 펩타이드이고, 이는 펩타이드의 아미노산의 치환, 첨가, 결실 또는 번역후 수식(예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 알킬화, 판토텐산화, 분자내공유결합:예를 들어 락탐연결 형성, 폴리에틸렌글리콜화 등)을 포함하되, 여기서 상기 유사물질은 GIPR과 GLP-1R가 활성화되도록 자극할 수 있고, 예를 들어 실시예에 따른 cAMP유도시험에 의해 측정된다.

본 발명에서 제기된 아미노산의 "수식"은 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 의미하고, 치환 또는 첨가된 20가지 천연아미노산 중의 어느 하나를 포함한다. 본 발명에서, 특정된 아미노산 위치번호(예를 들어 24째 자리)는 모두 천연GIP(SEQ ID NO: 1) 또는 이의 임의의 유사물질 중의 상응한 아미노산위치를 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "천연GLP-1"은 인간GLP-1(7-36 또는 7-37)서열을 포함하는 펩타이드를 의미하고, 용어 "천연 GIP"는 인간GIP서열(1-42)을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 사용한 용어 "GLP-1" 또는 "GIP"는 별도로 표시하지 않는 한, 각각 천연GLP-1 또는 천연GIP를 의미한다.

본 발명에서 제기된 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산잔기가 다른 아미노산잔기로 치환되는 것을 의미한다.

본 발명에서 제기된 일반용어 "폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 에틸렌옥시드(ethylene oxide)와 물의 축합중합체의 혼합물을 의미하고, 이는 직쇄 또는 측쇄의 형식으로 존재하며, 일반식H(OCH₂CH₂)_nOH로 표시되고, 여기서 n는 최소로 9와 같다. 추가적인 설명이 없는 한, 이러한 용어는 평균 총분자량이 5,000 내지 40,000달톤 사이에서 선택되는 에틸렌글리콜의 중합체를 포함한다. "폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 하나의 수치 뒤에 함께 사용되어 이의 대략적인 평균 분자량을 표시한다. 예를 들어, PEG-5000은 약 5000달톤의 평균분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "PEG화" 또는 이와 유사한 용어는 화합물천연상태에서 펩타이드에 PEG사슬을 연결하여 수식된 것이다. "PEG화의 펩타이드"는 PEG사슬이 공유결합으로 펩타이드와 결합되는 펩타이드이다.

본 발명에서 제기된 용어 "지방산"은 긴 지방족꼬리(사슬)를 갖는 카르복실산을 의미하고, 이는 포화 또는 불포화된 것일 수 있다. 본 발명에서, 지방산은 C4-C30의 직쇄 또는 측쇄의 지방족기를 갖는 카르복실산을 의미한다. 바람직한 지방산은 미리스트산, 팔미트산 및 스테아르산으로부터 선택된다.

본 발명에서 제기된 펩타이드의 일반적인 정의는 수식된 아미노말단과 카르복실말단을 갖는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 아미드기로 말단의 카르복실기를 치환한 아미노산사슬도 천연아미노산으로 명명된 아미노산 서열내에포함된다.

본 발명에서 제기된 "스페이서"(spacer)는 결합(bond), 분자 또는 분자의 작용기를 의미하고, 이는 두개의 분리된 실체를 서로 연결시킨다. 스페이서는 두개 실체의 공간구조를 최적화할 수 있거나 또는 두개 실체를 서로 분리되게 하는 쉽게 변화가능한 결합물을 제공할 수 있다. 쉽게 변하는 결합물은 광분해기, 산에 불안정한 부위, 염기에 불안정한 부위 및 효소분해기를 포함한다.

본 발명에서 제기된 "전하를 띤 아미노산"은 생리적 pH값의 수용액에서, 음전하(즉, 탈양성자화) 또는 양전하(즉 양성자화)를 띤 측쇄를 포함하는 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 음전하를 띤 아미노산은 Asp, Glu, 시스테인(cysteine), 호모시스테인 및 호모글루타민산(Homoglutamic acid)을 포함하고, 양전하를 띤 아미노산은 Arg, Lys 및 His를 포함한다. 양전하를 띤 아미노산은 20가지 천연아미노산과 비천연아미노산 중의 전하를 띤 아미노산을 포함한다.

본 발명에서 제기된 용어 "산성아미노산"은 제2산성기를 포함하는 아미노산을 의미하고, 예를 들어 카르복실산기 또는 황산기를 포함한다.

본 발명에서 제기된 펩타이드의 "GIP활성"은 천연GIP가 GIPR에서의 EC₅₀값과 상기 펩타이드가 GIPR에서의 EC₅₀값의 비율을 의미한다.

본 발명에서 제기된 펩타이드의 "GLP-1 활성"은 천연GLP-1가 GLP-1R에서의 EC₅₀값과 상기 펩타이드가 GLP-1R에서의 EC₅₀값의 비율을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "알킬"은 지정된 개수의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소화합물을 의미한다. 예시적인 알킬기는 메틸(methyl), 에틸(ethyl) 및 노말프로필(n-propyl)을 포함한다.

본 발명에서 제기된 용어 "헤테로알킬"은 지정된 수량의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소화합물을 의미하고, 여기서 상기 구조의 골격에는 적어도 하나의 헤테로원자가 포함된다. 본 발명에 적용된 헤테로원자는 N, S 및 O를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 제기된 용어 "시클로알킬"은 지정된 수량의 탄소원자를 갖는 고리형 탄화수소화합물을 의미하고, 예를 들어, 시클로프로필(cyclopropyl), 시클로부틸(cyclobutyl), 시클로헥실(cyclohexyl) 및 시클로펜틸(cyclopentyl)이다.

본 발명에서 제기된 용어 "헤테로시클로알킬"은 지정된 수량의 탄소원자와 1개 내지 3개의 헤테로원자를 갖는 고리형 탄화수소화합물을 의미하고, 여기서 헤테로원자는 독립적으로 O, N 및 S로부터 선택된다. 비제한성 헤테로시클로알킬의 예에는 피페리딘, 테트라히드로푸란(Tetrahydrofuran), 테트라히드로피란(tetrahydropyrane), 디히드로푸란(dihydrofuran), 모르폴린(Morpholine), 티오펜(thiophene) 등이 포함된다.

본 발명에서 제기된 용어 "아릴기"는 단일고리 또는 다중고리 아릴을 의미하고, 바람직하게는 페닐 또는 나프틸(naphthyl)과 같은, 지정된 개수의 탄소원자를 갖는 단일고리 또는 다중고리 아릴을 포함한다. 특별한 설명이 없는 한, 아릴기는 미치환되거나 또는 치환된 것일 수 있다.

본 발명에서 제기된 용어 "Aib"는 α-아미노이소부틸산(α-aminoisobutyric acid)을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "Phe(4-F)"는 페닐알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 페닐의 파라자리(para-position)는 불소원자로 치환된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Phe(4-NO₂)"는 페닐알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 페닐의 파라자리는 니트로(nitro)로 치환된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Phe(4-NH₂)"는 페닐알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 페닐의 파라자리는 아미노기로 치환된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Ala(2-티에닐)"은 알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 β-메틸은 2-티에닐기로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Ala(벤조티에닐)"은 알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 β-메틸은 벤조티에닐기로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Nal"은 알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 β-메틸은 나프틸기로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Ala(4-피리딜)"은 알라닌의 유사물질을 의미하고, 이의 β-메틸은 4-피리딜기로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "페닐글리신"은 글리신의 유사물질을 의미하고, 이의 메틸렌은 페닐로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Tyr(4-Me)"는 티로신(Tyrosine)의 유사물질을 의미하고, 이의 히드록시의 수소원자는 메틸로 치환된다.

본 발명에서 제기된 용어 "사르코신"은 글리신의 유사물질을 의미하고, 이의 아미노기는 메틸로 수식된다.

본 발명에서 제기된 용어 "Orn"는 2,5-디아미노펜탄산(2,5-diaminopentanoic acid)을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "Dab"는 2,4-디아미노부탄산(2,4-diaminobutanoic acid)을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "Dap"는 2,3-디아미노프로피온산(2,3-diaminoPropionic Acid)을 의미한다.

본 발명에서 제기된 용어 "노류신(norleucine)"은 2-아미노카프로산(2-aminocaproic acid)을 의미한다.

천연GIP(1-42)는 GLP-1R는 아고니스트활성이 전혀 없고(Moon등, Molecular Cells, 2010, 30, 149-154), 이의 GIP(1-29)단편은 더 말할 나위가 없다. 그러나, 연구개황에 따르면, GIP(1-29)단편은 전장GIP(1~42)에 상당한 시험관내 GIPR아고니스트활성을 유지할 수 있다. 따라서, 혼성화(hybridization) 개념에 의해, GIP(1~29)서열에 기반하여 부위돌연변이를 거쳐 새로운 GIP유사물질을 구축할 수 있다. GLP-1, exendin-4 및 리라글루타이드서열 중의 일부 아미노산잔기를 도입하여 GLP-1활성을 유도한다. 이러한 GIP유사물질은 등효적이거나 심지어 천연GIP를 초과하는 강력한 GIPR아고니스트활성을 가질 뿐만아니라, 시험관내에서 등효적이거나 심지어 천연GLP-1(7~36 또는 7~37)를 초과하는 강력한 GLP-1R아고니스트활성을 가진다.

특이 자리 돌연변이는 GLP-1활성을 유발

각 자리별로 GLP-1과 GIP의 N-말단 서열들을 대조하였을 때, His⁷/Tyr¹이외에 가장 두드러진 치환은 Thr¹³/Ile⁷이다. 최근 보도에 따르면, 매가닥 펩타이드의 N-말단 부분, 특히 7째 자리(매가닥 펩타이드의 일차서열번호)의 아미노산 잔기는 리간드의 선택성에 있어서 핵심적인 역할을 한다(Moon등, Molecular Cells, 2010, 30, 149-154). 이 때문에 본 발명자들의 연구 방향에서는, GIP(1-29) 서열을 토대로 우선적으로 Thr⁷를 도입하여 GLP-1R아고니스트 활성을 유발한다. 그리고, 이어서 Tyr¹³ 와 Glu¹⁵를 치환하여 GLP-1의 활성을 강화시키고, Aib²를 치환하여 DPP-IV안정성을 부여한다.

이렇게 하여 얻은 GIP유사물질(SEQ ID NO: 3)은 CHO/hGLP-1R세포 분석에서 천연 GLP-1와 비교하면 거의 0.2% 의 GLP-1R아고니스트활성을 나타내었는데, 이는 최초의 구조 골격(SEQ ID NO: 1)보다 훨씬 향상된 것이며, 한편으로, CHO/hGIPR 세포 분석에서, 천연 GIP와 비교하면, 이는 77.7%의 GIPR아고니스트 활성을 나타낸다. 이는 GIPR가 상기 자리의 치환에 잘 허용함을 가리킨다. 비록 이 GIP 유사물질의 GLP-1R에서의 활성은 매우 낮았지만, 추가적인 수식을 통해 GLP-1R자극 활성을 제고시키는 동시에 GIP의 활성을 유지하는 것은 더 연구할 가치가 있었다.

두번째 수식은 유사물질003의 골격에 기반하고, 또한 주요하게는 13째 자리와 22째 자리에 각각 집중되었다. Tyr¹³에 있어서, 이의 4' 히드록시기를 플루오르기로 치환하고(SEQ ID NO:4), 니트로기로 치환하며(SEQ ID NO: 5, 8 및 15); 또는 Tyr¹³ 를 Phe¹³로 치환하고(SEQ ID NO: 7 및 11), 페닐글리신 잔기¹³로 치환하였다(SEQ ID NO: 9). 아울러, Phe²²에 있어서, 각각 이 부위에서 Tyr잔기로 치환하였고(SEQ ID NO: 12), Tyr(4-Me)잔기로 치환하며(SEQ ID NO: 13), Phe(4-F)잔기로 치환하였다(SEQ ID NO: 14). 수동 조작 고상 펩타이드 합성에서, 산소가 개입됨에 따라 산화된 Met¹⁴(SEQ ID NO: 4, 5, 6 및 7)이 간혹 발견되었다. 수동 조작 과정에서의 산화를 피하기 위하여, 나중에 Met의 생물등입체물질(bioisostere)인 노류신으로 Met(SEQ ID NO: 8~13, 14 및 16~17)를 치환하였다. 그러나, 이렇게 수식된 모든 유사물질의 시험관내 GLP-1활성은 모두 유사물질003보다 낮고, 일부 수식된 유사물질은 심지어 비교적 낮은 GIP활성을 갖는다는 것이 관찰되었다.

17째 자리~19째 자리를 Glu-Ala-Glu 및 Glu-Ala-Gln으로 치환(SEQ ID NO: 16)하여도 더욱 높은 GLP-1활성(천연GLP-1에 비해, 아고니스트활성이 여전히1%보다 작다)을 일으키지 못하였다. 이밖에, 리라글루타이드에서 유래된 일부 아미노산잔기 Val²⁷와 Arg²⁸의 치환(SEQ ID NO: 17)은 확실히 GLP-1활성을 증가시키고, 천연GLP-1에 비해 대략 5%의 활성을 가지지만; 이의 GIP활성은 천연GIP에 비해 21%까지 감소되었다. 따라서, 반드시 새로운 방법을 탐색하여, 더욱 많은 GLP-1특징의 아미노산잔기를 인입하여 만족스런 시험관내 GLP-1R 및 GIPR활성을 얻도록 해야 한다.

GLP - 1특징성 부위를 도입하여 추가 수식

GLP-1서열과 exendin-4서열의 중단과 C-말단에서 유래된 확정 아미노산잔기를 바람직한 골격(SEQ ID NO: 3)에 병합시킨다. 또한 수용체식별을 감안하여, N-말단영역(1-16째 자리)을 고도유지영역으로 한다. 설계된 혼성 펩타이드(SEQ ID NO: 18, 19, 20 및 21)의 서열의 비교는 하기와 같다. 본 발명에 대한 설명을 도모하기 위하여, GLP-1 아래에 첨자된 아미노산 명칭은 가공된 펩타이드의 일차서열번호에 따른 것이다(즉, GLP-1_[7-36] = GLP-1_[1-30]).

CHO/hGLP-1R 및 CHO/hGIP-1R 세포 속에서 분석을 통하여 상기 4개의 키메라 펩타이드(Chimeric peptide)를 천연 리간드인 GLP-1과 GIP)와 나란히 비교하였다. 시험관내 데이터는 표1에 표시된 바와 같다. GLP-1의 특징적 아미노산 잔기들을 중간 영역[17~20]과 C-말단 영역[21~29]에 추가 도입함으로써, GLP-1의 활성은 현저하게 증가하였고, 심지어 천연GLP-1을 초과했다.

유사물질024는 GLP-1R와 GIPR에서 모두 제일 높은 활성을 갖고, 이의 GLP-1R에서의 활성은 천연GLP-1의 300% 이상이고, GIPR에서의 활성은 천연GIP의 약500%이다. 유사물질025와 026도 천연GLP-1보다 더욱 훌륭한 GLP-1활성(각각 131%와 288%)을 나타냈지만, 이들의 GIP활성이 천연GIP보다 차하다(각각 단지 33.3%와 11.9%). 총괄하면, 유사물질023과 024는 더욱 균형된 시험관내GLP-1R와 GIPR의 이중 아고니스트활성을 나타내고, 또한 GLP-1활성에 비해, GIP활성이 주도적이다.

시험관내에서 동시에 GLP-1R와 GIPR에 대한 아고니스트 활성을 지닌다는 것에 고무되어 본 발명자들은 이어서 체내 활성도 확인하고자 하였다. 체내활성은 주로 정상 ICR마우스에서 포도당 복강 주사 부하 시험(ipGTT)을 통해 평가하였다. exendin-4를 양성대조군으로 하고, ipGTT를 통하여 우선 유사물질023를 평가하여 적합한 약제투여량 수준을 탐색하도록 한다.

포도당 투여후, exendin-4는 1nmol/kg의 투여량에서 뚜렷한 혈당저하작용을 나타냈지만, 유사물질023은 동일한 투여량에서 exendin-4보다 매우 차한 혈당저하작용을 나타냈다. 포도당이 존재할 경우, 유사물질023은 3nmol/kg의 투여량에서 거의 최대인 혈당저하활성을 나타내고, 투여량 수준(6nmol/kg 및 9nmol/kg)을 제고해도 이의 활성은 완전히 차이가 나지 않는다. AUC에 따르면, exendin-4(1nmol/kg)군과 유사물질023(3nmol/kg, 6nmol/kg, 및 9nmol/kg)군은 통계학적으로 유의적 차이가 나지 않는다.

이어서, 여전히 exendin-4(1nmol/kg)를 참조로 하고, 3nmol/kg의 투여량으로 ipGTT를 진행하여, 순차적으로 유사물질023, 024, 025 및 026을 평가하였다. 예비시험과 비교하면, exendin-4는 매우 유사한 혈당저하활성을 나타냈다. 대조군과 비교해도, GIP유사물질은 모두 뚜렷한 혈당저하활성을 나타내였고, 모든 유사물질 중에서 유사물질023만이 체내 활성이 제일 강하였다(도1과 도2를 참조바람). 상기 관찰에 따르면, exendin-4에서 유래된 [17~20]아미노산잔기와 GLP-1에서 유래된 [21~29]아미노산잔기가 시험관내, 체내 이중아고니스트활성을 얻는 최적의 치환조합일 것으로 판단되었다. 따라서 연구과정에서, 유사물질023은 활성화합물로 선용되었다.

지방산 결합(conjugation)을 통해 추가로 수식

리라글루타이드 구조의 계발을 받아, 지방산도 유사물질023와의 결합에 응용되어, 시험관내와 체내의 활성을 증가하도록 한다. 팔미토일은 28 째 자리의 Lys의 ε-아미노기와 직접 결합되고, 아무런 스페이서(SEQ ID NO: 31)도 첨가하지 않는다. 그러나, 지방산을 결합한 유사물질 046은 천연GLP-1과 비교하면 단지 14.7%의 GLP-1R아고니스트 활성만 나타내고, 천연GIP와 비교하면 단지 8.5%의 GIPR아고니스트 활성만 나타낸다. 시험관내에서 비교적 낮은 활성은 GLP-1R와 GIPR가 활성화합물 서열의 28째 자리에서의 지방산결합에 내성이 없다는 것을 표명한다.

팔미토일의 연결위치를 20째 자리로 개변할 경우, 리라글루타이드와 마찬가지로, Lys²⁰으로 유의적으로 활성화합물서열의 Arg²⁰를 치환한다(SEQ ID NO: 42). 지방산도 Lys²⁰의 ε-아미노기와 직접 결합하고, 아무런 스페이서(SEQ ID NO: 51)도 첨가하지 않는다. 유사물질067은 유사물질046과 매우 유사한 시험관내 활성 결과를 나타냈고, 천연GLP-1과 비교하면 단지 13.9%의 GLP-1활성이 있고, 천연GIP와 비교하면 단지 4.6%의 GIP활성이 있다. 유사물질046과 067의 관찰 결과에 기반하여, 연구 과정에서, 지방산을 결합하여 GLP-1R와 GIPR 이중활성을 증가하는 책략은 잠시 미루도록 한다.

락탐결합을 형성하여 α-나선 배열을 안정시키도록 추가로 수식

천연GLP-1과 GIP의 중간영역에 α-나선 배열이 존재한다는 것이 이미 증명되었고, 이는 이와 부동한 수용체와 결합된다(Parthier등, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104, 13942-13947; Underwood등, Journal of Biological Chemistry, 2010, 285, 723-730). 증강된 α-나선 배열형의 성질은 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase)에 대한 안정성을 개선할 수 있고, 더욱 좋은 활성을 유발할 수 있다(Murage등, Journal of Medicinal Chemistry, 2010, 53, 6412-6420).

활성화합물(즉 유사물질023)의 서열에 기반하여, 중간영역(11~20)의 i째 자리와 i+4째 자리에 의도적으로 락탐결합을 인입하여 α-나선형을 안정화시켰다 . 락탐연결을 형성하기 위하여, 각각 Glu으로 Ile¹²와 Arg²⁰(SEQ ID NO: 36과 38)를 치환하였다. 결합제를 이용하여, 12째 자리와 16째 자리의 아미노산의 측쇄를 아미드 결합으로 이어 공유결합을 맺었다(SEQ ID NO: 37). 동일한 합성 조작을 통해, 16째 자리와 20째 자리사이에 락탐연결(SEQ ID NO: 39)을 제조하였다.

이 유사물질들에 대하여서도 시험관내 GLP-1R와 GIPR의 cAMP유도로써 효능을 평가하였다. 예비적 데이터에 따르면, 12째 자리와 16째 자리 사이에 락탐결합을 형성한 유사물질과 활성화합물을 비교해보면, 시험관내 활성이 매우 근접한 바, 즉 천연GLP-1에 비하면 132.8%의 GLP-1R 아고니스트 활성을 갖고; 천연GIP에 비하면 146.8%의 GIPR아고니스트 활성을 갖는다. 그러나 16째 자리와 20째 자리에 락탐결합을 형성하면 GLP-1R와 GIPR 모두에 대하여 활성 화합물에 견주어 아고니스트 활성의 감소를 유발하였다(천연GLP-1에 비하여 단지 37%의 GLP-1활성이 있고, 천연GIP에 비하여 단지 35.4%의 활성이 있음).

C-말단을 연장하여 추가로 수식

연구과정에서, 활성화합물(SEQ ID NO: 18)의 서열에 기반하여, C-말단의연장을 통한 추가 수식에 대해서도 점검하였다. 30~34째 자리에 우선 5개의 연속된 Lys를 인입하여 C-말단(SEQ ID NO: 45)을 연장시켰다. 활성화합물과 비교하면, C-말단에 양전하를 띤 아미노산을 추가하면 GLP-1R와 GIPR 모두에서 활성이 낮아졌다(천연GLP-1에 비해 단지 36.8%의 GLP-1활성이 있고, 천연GIP에 비해 단지 8.4%의 GIP활성이 있음).

Exendin-4의 C-말단 아미노산 잔기(30~39), 즉 GPSSGAPPPS는 CEX으로 명명되고, 이어서 활성화합물의 서열에 인입되어, 유사물질이 GLP-1(SEQ ID NO: 35)에 더욱 접근되도록 한다. 하기 도면에 도시된 바와 같이, 새로운 GIP/GLP-1 혼성 펩타이드의 서열에 대해 상세히 설명하였다.

유사물질051은 활성화합물과 유사한 시험관내 활성을 가지는 바, 즉 천연GLP-1에 비하여 159.8%의 GLP-1R아고니스트활성을 가지고, 천연GIP에 비하여 89.5%의 GIPR아고니스트활성을 가진다. GLP-1활성은 GIP활성에 비해 더욱 주도적이다.

exendin-4를 참조화합물로 하고, 정상ICR마우스에 대한 ipGTT를 통하여 유사물질051에 대해 체내활성을 평가하였다. Exendin-4와 유사물질051은 동일한 투여량(1nmol/kg)하에서, 첫번째로 포도당을 투여한 후, 현저하고 유사한 혈당저하활성을 나타낸다. 3시간 후, 두번째로 포도당을 투여하면, 유사물질51은 exendin-4보다 더욱 좋은 혈당저하활성을 나타낸다(도3과 도4를 참조바람). C-말단에 CEX를 병합하는 연장에 의하면 체내활성을 현저하게 증가할 수 있다는 것을 표명한다. 유사물질051이 매우 높은 체내효능을 가지므로, 상기 화합물을 상기 연구의 선도화합물로 선택하였다.

선도화합물과 친수성 부위의 결합

일반적으로, 친수성 부위는 활성단백질과 결합되어 순환주기를 연장하고 용해도를 증가할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 공지된 친수성 부위로서, 제약분야에 광범위하게 적용된다. 따라서, 연구과정에서, PEG를 사용하여 선도화합물, 즉 유사물질051과 결합시킨다. PEG콘주게이트를 얻는 기본 반응은 말레이미드기와 유리 티올(free thiol) 사이에서 일어나는 마이클(Michael)부가반응이다. 말레이미드기에 의해 활성화된 PEG를 사용하여 티올과 반응시켜 티오에테르(thioether)를 함유하는 하기와 같은 PEG화된 펩타이드를 얻었다.

연구과정에서, 분자량이 약 20,000과 40,000달톤이고, 말레이미드기에 의해 활성화된 PEG부위를 각각 사용하여 PEG화된 폴리펩타이드를 형성하였다. 이밖에, 40째 자리에 유의적으로 하나의 Cys를 인입하여 치환하여 하나의 프리티올을 제공하도록 한다. 하기의 도면에 도시된 바와 같이, PEG화된 펩타이드의 서열에 대해 상세히 설명하였다.

GLP-1R와 GIPR에 의해 유도된 cAMP를 통하여, 유사물질088과 089에 대해 시험관내 테스트를 진행하였다. 선도화합물과 비교하면, 이 두가지 PEG화된 펩타이드는 GLP-1R와 GIPR에서 더욱 낮은 활성을 나타냈다. 천연GLP-1와 비교하면, 유사물질088은 단지 11%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면, 단지 4.9%의 GIP활성을 가지며; 유사물질089와 천연GLP-1을 비교하면, 단지 18.3%의 GLP-1수용체 아고니스트활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면, 단지 3.4%의 GIP수용체 아고니스트활성을 가진다(도5와 도6을 참조바람). 시험관내 활성의 약화는 GLP-1R, 특히는 GIPR가 리간드PEG화에 대해 매우 민감하다는 것을 표명한다.

또한 정상ICR마우스에서도 유사물질088과 089의 체내활성을 평가하여, 이들의 혈당저하와 체중저하의 효능을 연구하도록 한다. PEG 결합을 통하여 체내 약물대사동력을 현저하게 개선할 수 있다. 이 두가지 화합물은 각각 0일째 날과 3일째 날에 피하주사로 투여되고, 투여량은 모두 40nmol/kg이다. 대조군과 비교하면, 유사물질088과 089는 유사한 혈당저하활성을 가지는 동시에 유사물질089의 체중저하활성은 유사물질088보다 우수하고, 특히는 두번째로 투여된 후에 더욱 현저하다.

선도화합물에 기반한 C-말단 연장 및 지방산 결합의 추가 수식

유사물질051은 C-말단에서 양전하를 띤 아미노산, 예를 들어 Lys를 이용하여 연장되었다. 유사물질051의 서열에 기반해보면, 이의 40째 자리에 단지 하나의 Lys를 인입하여 교환하면 유사물질066을 얻을 수 있다. C-말단에 연속적인 6개의 Lys를 인입하면 유사물질071을 얻을 수 있다. GLP-1R와 GIPR에 의해 유도된 cAMP를 통하여, 유사물질066과 071에 대해 시험관내 활성을 평가한다. 그러나, 선도화합물(유사물질051)과 비교하면, C-말단에 양전하를 띤 아미노산 잔기를 인입했을 때는 더 좋은 시험관내 활성을 나타내지 못하였다. 천연GLP-1과 비교하면, 유사물질066은 단지 43.7%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면, 단지 50%의 GIP활성을 가지며;아울러, 유사물질071은 천연GLP-1을 비교하면 단지 25.1%의 GLP-1수용체 아고니스트활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면 단지 22.1%의 GIP수용체 아고니스트활성을 가진다. 이는 더욱 긴 C-말단 꼬리가 시험관내 활성을 낮춘다는 것을 표명한다.

선도화합물(유사물질051)의 서열을 기반으로, i째 자리와 i+4째 자리 사이에 락탐연결을 형성하여 α-나선 형태가 안정되도록 한다. Ile¹²가 Glu¹²에 의해 유의적으로 치환되면, 12째 자리와 16째 자리 사이에 락탐연결을 형성하여, 유사물질081을 얻었다. 이와 비슷하게, Arg²⁰와 Ala²⁴가 각각 Lys²⁰와 Glu²⁴에 의해 치환된 후, 20째 자리와 24째 자리 사이에 락탐고리를 형성하여, 유사물질085를 얻었다. 유사물질081은 유사물질052-2와 매우 근접한 시험관내 활성을 나타내는 바, 즉 천연GLP-1과 비교하면 124%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면, 250%의 GIP활성을 가진다. 이는 12째 자리와 16째 자리 사이에 락탐연결을 형성함으로써 더욱 좋은 시험관내 활성을 유지할 수 있다는 것을 나타낸다.

지방산을 결합하여 선도화합물(유사물질051)의 활성을 높이는 것이 재차 고려되었다. 유사물질066와 071의 서열을 기반으로, 팔미토일기는 C-말단Lys의 ε-아미노 (각각 Lys⁴⁰와 Lys⁴⁴)에 결합되어, 각각 유사물질068과 078을 얻었다. 이하 도면에 도시된 바와 같이, 새로운 GIP/GLP-1 혼성 펩타이드의 서열에 대해 상세히 설명하였다.

유사물질023이 지방산에 결합한 경우와 달리, 유사물질068과 078은 모두 훨씬 더 나은 시험관내 활성을 나타내었는데, 특히 GLP-1R활성에 있어서 그러하였다. 천연GLP-1과 비교하면, 유사물질068은 566%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면, 319%의 GIP활성을 가지며; 아울러, 천연GLP-1과 비교하면, 유사물질078은 754%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP와 비교하면 352%의 GIP활성을 가진다. 이로써 GLP-1의 활성이 GIP의 활성보다 더욱 강함을 명확히 알 수 있다. 유리(遊離) 펩타이드와 비교하면, 지방산과 선도화합물(유사물질051)의 결합은 시험관내 활성을 대폭적으로 제고시켰다.

유사물질068도 리라글루타이드와 시험관내에서 일대일로 비교하였다. 유사물질068이 GLP-1R와 GIPR에 대하여 시험관내 활성을 지님이 확인되었다. 아울러, 리라글루타이드는 GLP-1R에서의 활성이 유사물질068보다 덜하였지만, 천연GLP-1보다는 더 강한 GLP-1R 활성화를 나타내었다. 앞에서 예상한 바와 같이, 리라글루타이드는 GIPR를 전혀 활성화하지 못하였는데, 이는 농도를 1μM로 높이더라도 마찬가지였다. 이러한 모든 시험관내 관찰 결과는 GLP-1R와 GIPR를 동시에 활성화하면 어떠한 단일 GLP-1R아고니스트와 비교하더라도 더 나은 활성을 이끌어내는데 현저하게 유리하다는 것을 증명하였다.

양호한 시험관내활성에 기반하여, 이어서 정상ICR마우스에서 ipGTT를 통하여 유사물질068과 078에 대해 체내 활성을 평가하되, 리라글루타이드를 대조 화합물로 하였다. 40nmol/kg의 투여량 수준에서, 포도당을 투여할 경우, 유사물질068은 리라글루타이드에 비해 더욱 많이 혈당을 저하시키되, 특히는 5시간 후의 제2차 당부하시험과정에서 더욱 그러하다. 비록 유사물질078이 제1차 포도당투여과정에서 유사물질068과 매우 비슷한 혈당 저하 효과를 나타내지만, 제2차 당부하시험에서, 이의 활성은 대폭적으로 저하되었다. 이로써, 더욱 긴 C-말단꼬리는 더욱 좋은 체내효능을 얻지 못하였다. 따라서, 유사물질068의 매우 우수한 시험관내 및 체내활성에 기반하여, 상기 화합물은 후보화합물로 선택되었다.

후보화합물을 기반으로 스페이서를 삽입하는 추가 수식

γ-Glu스페이서도 펩타이드 사슬과 지방산부위 사이에 삽입되고, 방식은 리라글루타이드와 비슷하다. 리라글루타이드를 합성할 때와 마찬가지로, 스페이서의 γ-카르복실기는 우선 40째 자리의 Lys의 ε-아미노기와 결합된 후, 스페이서의 α-아미노기는 팔미트산에 의해 카르복실화된다. 때문에, 스페이서의 α-카르복실기는 최종적으로 유리된 것이다. 스페이서는 더욱 많은 수량의 γ-Glu를 인입하여 더 연장될 수 있다. 이하의 도면에 도시된 바와 같이, 스페이서인 γ-Glu를 함유하는 결합 지방산의 유사물질의 서열에 대해 상세히 설명하였다.

유사물질090과 091이 시험관내에서 높은 활성을 나타냈지만, 양자 사이에는 유의적인 차이가 없다. 유사물질090은 천연GLP-1에 비해 568%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP에 비해 1311%의 GIP활성을 가지며; 아울러, 유사물질091은 천연GLP-1에 비해 921%의 GLP-1활성을 가지고, 천연GIP에 비해 287%의 GIP활성을 가진다. 후보화합물(유사물질068)과 비교하면, 상기와 마찬가지로 유의적인 차이가 없다.

이어서, 정상ICR마우스에서 ipGTT를 통하여 유사물질090과 091의 체내활성을 평가하되, 유사물질068을 참조화합물로 하였다. 40nmol/kg의 투여량 수준으로, 두번의 연속적인 포도당부하시험에서, 세개의 모든 유사물질은 모두 유의적이고도 유사한 혈당저하활성을 나타냈다. 상기 유사한 시험관내, 체내 활성은, 현재의 연구에서 스페이서의 인입은 아무런 우월성도 나타내지 못함을 표명하고 있다.

유사물질051의 서열에서 Arg²⁰가 Lys에 의해 치환될 때, Lys²⁰의 ε-아미노기는 팔미토일과 결합되고, γ-Glu와 γ-Glu-γ-Glu를 스페이서로 하여, 각각 유사물질092와 093을 얻었다. 유사물질051서열에서 Lys²⁸의 ε-아미노기는 팔미토일과 결합되고, γ-Glu를 스페이서로 하여, 유사물질094를 얻었다. 유사물질090과 091의 구조와 비교할 때, 지방산부위는 바람직한 서열의 중간부분에 위치하여 있고, C-말단에 위치하는 것이 아니다.

세개의 모든 유사물질은 모두 GLP-1R와 GIPR에 의해 유도된 cAMP를 통하여 시험관내 활성을 측정하였다. 상기 세개의 유사물질 모두가 매우 유사하고, 천연GLP-1보다 더욱 강한 GLP-1활성을 나타냈지만, 유사물질090과 091에 비해, 이들의 활성은 비교적 차하다. GLP-1R의 활성은 대략 10배로 저하된다. GIPR측정과정에서의 정황도 이와 매우 비슷하고, 유사물질093이외에, 이들의 GIPR자극활성은 천연GIP와 유사물질090, 091에 비해 많이 차하다. 유사물질093은 천연GIP와 거의 같은 GIPR자극활성을 나타냈다.

친수성 부위를 후보화합물에 결합

친수성 PEG부위도 화합물에 연결되어 체내약물대사동력학성질을 제고하도록 한다. 말레이미드기와 프리티올 사이에서 Michael부가반응을 진행하여 후보화합물과 PEG부위를 연결한다. 후보화합물(유사물질068)의 서열에 근거하여, 24째 자리의 Ala는 Cys에 의하여 치환되어, 측쇄가 유리된 티올을 제공하도록 한다. 이어서 유사물질096을 얻었다. 말레이미드에 의해 활성화된 PEG시약(40k타입)은 약염기성 완충액에서 티올과 쉽게 반응한다. 상기 서열에 대해 상세히 설명하기 위하여, Cys²⁴로 치환된 유사물질 및 PEG와 연결된 유사물질은 이하 도면에 도시된 바와 같다.

GLP-1R와 GIPR에서의 시험관내cAMP유도시험을 통해, 유사물질096과 098의 활성을 평가하였다. 일반적으로, 유사물질096과 098은 활성이 매우 근접하지만, GLP-1R에서의 활성이 천연GLP-1활성보다 더욱 강하다(각각, 천연GLP-1에 비해, GLP-1활성의 404.7%와 463.3%를 가진다). 그러나 후보화합물과 비교하면, 이들의 활성은 약간 덜하였다. 천연GIP와 비교하면, 유사물질096은 단지 42%의 GIPR활성을 가졌고; 아울러, 천연GIP와 비교하면, 유사물질098은 150%의 GIPR활성을 나타내었는데, 이는 거의 후보화합물에 상당한 것이었다. 이러한 예비적 시험관내 활성이 가리키는 바는 Cys²⁴치환이 이 두 수용체에 대하여 약간 낮지만 받아들일 수 있는 활성을 유발하였고, 24째 자리에 PEG를 연결하면 높은 시험관내 활성, 특히 GIPR 활성을 유지할 수 있었다는 점이다.

db/db마우스로 후보화합물의 항당뇨병능력에 대해 평가

리라글루타이드를 대조 화합물로 하여, db/db마우스에서 후보화합물(유사물질068)의 항당뇨병성질에 대해서도 평가하였다. 유사물질068과 리라글루타이드의 투여방식은 모두 피하주사이고, 매일 한번씩 투여한다.

각각 제0일째 날, 제14일째 날과 제28일째 날의 비공복혈당수준을 측량한다. 제0일째 날에, 리라글루타이드군과 유사물질068군에서 모두 혈당이 저하되었음이 발견되었다. 그러나, 유사물질068은 저투여량이라 할지라도 리라글루타이드군보다 혈당저하효과가 더욱 뚜렷한 바, 특히는 첫번째 주사후 24시간내에 뚜렷하였다. 유사물질068의 투여량 의존성은 뚜렷하지 않았다. 제14일째 날에, 시작혈당수준은 두주의 치료를 거친 후 명확하게 달라졌다. 유사물질068군은 리라글루타이드군에 비해 더욱 높은 활성을 나타내었고, 유사물질068의 중투여량과 고투여량 사이에는 통계학적인 차이가 없었다. 제28일째 날에, 유사물질068군은 리라글루타이드군에 비해, 비교적 낮은 혈당수준을 유지하였다. 조합된 데이터(제0일째 날, 제14일째 날 및 제28일째 날)를 일일히 비교하여, 유사물질068의 항당뇨병 개황을 구축하도록 한다.

첫번째 주일의 관찰에서, 체중과 평균누적식이섭취량의 정황에 대해서도 기록하였다. 대조군과 비교해보면, 유사물질068은 저투여량수준에서도 리라글루타이드의 체중저하효과보다 더욱 뚜렷하고, 또한 유사물질068의 투여량 의존성은 매우 양호하다. 리라글루타이드군과 비교해보면, 유사물질068군은 더욱 좋은 식이섭취억제능력을 갖는다. 체중저하효과와 식이섭취량의 감소가 일치한 것은 분명하였다.

이어서 제8일째 날에, 혈중 지질 파라미터를 측량하였다. 흥미있는 것은, 유사물질068가 트리글리세리드를 감소하는 효과가 리라글루타이드보다 강한 바, 특히는 유사물질068의 저투여량군이 강하였다. 콜레스테롤 수준에 있어서, 대조군과 비교해보면, 유사물질068과 리라글루타이드는 비슷한 콜레스테롤 저하효과가 있다. 제21일째 날에, 모든 군의 고밀도지질단백(HDL) 콜레스테롤과 저밀도지질단백(LDL) 콜레스테롤 수준도 측량하였다. 대조군과 비교하면, 비록 유사물질068의 고투여량군이 HDL콜레스테롤 수준을 약간 증가시킬 수 있지만, 유사물질068과 리라글루타이드는 모두 HDL콜레스테롤 수준을 개변시킬 수 없었다. 그리고, 대조군과 비교하면, 유사물질068의 LDL콜레스테롤 저하 유도는 리라글루타이드보다 우수하였다.

제21일째 날에, 모든 군에게 외래성 인슐린을 투여하였는데, 즉 인슐린 내성시험(ITT, insulin tolerance test)을 진행하였다. 대조군은 여전히 인슐린 저항성을 유지하였고, 혈당 수준의 저하도 발견되지 않았다. 그러나, 유사물질068은 리라글루타이드에 비해 인슐린 투여에 반응하여 혈당이 저하하는 효과가 더욱 뚜렷하였다. 유사물질068 시험군의 인슐린 저항성이 더욱 많이 개선되였음이 분명하다.

제35일째 날에, 별도로 ipGTT를 통해 유사물질068과 리라글루타이드의 활성을 평가하였다. 유사물질068은 저투여량군을 예외로 할 때, 리라글루타이드보다 더욱 우수하게 외래성 포도당의 투여에 저항하는 혈당 저하 효과를 가진다.

db/db마우스에서의 유사물질068에 대한 평가 결과는 GLP-1R와 GIPR의 이중작동제의 뚜렷한 이점을 증명하였다.

또한 유사물질089의 db/db마우스와 DIO마우스에서의 체내 활성 연구를 상응하게 진행하였다(도7 내지 도13을 참조 바람). 유사물질089는 유사물질068보다 더욱 많은 우세를 갖는다는 것이 뚜렷하다. 이는 PEG결합이 매주 한번의 투여빈도를 확보할 수 있기 때문이다. 항체에 기반한 ELISA를 통해, 마우스, 랫트 및 원숭이에 대해 유사물질089에 관한 PK연구를 진행하였다. 이 부분은 도면의 간단한 설명부분과 실시예를 참조하여 상세한 정보를 얻을 수 있다.

본 발명에서 기술한 GIP유사물질에 대한 모든 수식은 단독으로 이루어지거나 여러 수식을 조합할 수도 있는데, 상기 수식은 GIP수용체 활성 및 GLP-1수용체 아고니스트활성(천연GLP-1과 등가적이거나 더욱 강함)을 유지시키거나 증가시킬 수도, 안정성을 증가시키거나 분해를 감소시킬 수도 있다. 일부 실시예에서, GIP유사물질은 물이나 PBS에서 적어도 2mg/mL의 농도의 용해도를 지닐 수 있고, 또한 4℃에서 24시간(pH=7.4) 후에도 원형 펩타이드의 적어도 92%가 존재한다.

본 발명에서는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 무균 약학적 조성물과 장치를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에서는 체중 저하를 충분히 유도하거나 체중 증가를 충분히 예방할 수 있는 투여량으로 이를 필요로 하는 피험자에게 전술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 체중 저하를 유도하거나 체중 증가를 예방하는 방법을 개시한다. 본 발명에서는 당뇨병의 치료방법에 대해 제공하였고, 상기 방법은 혈당저하를 충분히 유도할 수 있는 투여량으로 이를 수요로 하는 피험자에게 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 기술하는 모든 치료방법, 약학적 조성물, 키트 및 본 발명에 따른 기타 유사한 범례에서는 폴리펩타이드, 아고니스트, 이중 아고니스트 또는 유사물질이라는 용어를 사용할 때에 약학적으로 허용가능한 이들의 모든 염 또는 에스테르까지 포함하는 것을 염두에 두고 있다.

전술한 내용이 본 발명의 모든 형태를 망라하고 있다는 것은 본 발명자들이 의도하는 바가 아니며, 기타 부분, 예를 들어 발명의 실시를 위한 구체적인 형태에서도 별도의 실시예를 서술하였다. 본 발명자들의 의도는 이 문서 전체로서 하나의 완결된 개시를 이루고, 본 발명에 따른 모든 특징의 가능한 조합은 비록 동일한 구절, 동일한 단락 또는 동일한 부분에 동시에 나타나지 않았다 할 지라도 모두 본 발명에 포함되어야 한다고 이해해야 할 것이다.

실시예

본 발명의 GIP유사물질은 표준적 펩타이드 고상 합성 방법, 재조합DNA기술 또는 폴리펩타이드와 융합 단백질을 제조하는 기타 임의의 방법에 의해 얻어진다. 일부 비천연아미노산은 표준 재조합DNA기술에 의해 발현되지 못하지만, 현재 이러한 아미노산을 제조하는 기술도 개발되었다. 본 발명의 비펩타이드 부분을 함유하는 GIP유사물질은 표준 펩타이드 합성방법에 의해 얻어지는 이외에, 표준적 유기화학반응에 의해 합성될 수도 있다.

실시예1 선형 펩타이드 합성의 일반방법

N-말단 Fmoc-보호 방법을 이용한 표준적 고상 펩타이드 합성방법에 의해 펩타이드를 제조하였다. 표준적 Fmoc규정에 따라 수동으로 펩타이드 사슬의 조립합성을 진행한다. 천진남개합성과학기술유한회사(Tianjin Nankai Hecheng Sci. & Tech Co Ltd)에서 구매한 Fmoc Rink-Amide수지(1% DVB, 100-200메쉬, 치환도0.34-0.44mmol/g)를 고상담체로 사용한다. 이하 사용된 측쇄가 보호된 아미노산은 상해GL바이오유한회사(GL Biochem (Shanghai) Ltd.)에서 제공된다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pfb)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly(Allyl)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Aib-OH. 모든 화학품(시그마-올드리치(Sigma-Aldrich), J&K유한회사, 상해GL바이오유한회사를 포함한 상이한 공급업체에서 공급됨)은 모두 합성등급이다.

합성완료후, 폴리펩타이드는 고상중합체 담체로부터 절단되고, 또한 모든 측쇄에 대해 탈보호를 진행한다. 트리플루오로아세트산(TFA)으로 2시간 처리하면 이 과정을 완성할 수 있고, 트리플루오로아세트산에 2.5%의 물과 2.5%의 1,2-에탄디티올(EDT, 1,2-Ethanedithiol)을 첨가하여 측쇄 보호기를 제거하도록 한다. 펩타이드-TFA용액을 수지로부터 여과하고, 대부분의 TFA를 제거한 후, 냉각된 에틸에테르를 첨가하여 펩타이드를 침전시킨다. 펩타이드를 원심분리하고, 에틸에테르로 세척한 다음, 아세토니트릴 완충액에 용해시킨다.

수지로부터 절단한 후, 미정제 펩타이드 추출물은 분석 등급 역위상HPLC로 분석하였다. 분석용 분리는 Waters Xterra@MS 시스템에서 C18컬럼(50×2.1mm)을 사용하여 0.1% TFA의 아세토니트릴 구배에서 진행된다(1mL/min, 214 nm, A 완충액 = 0.1% TFA, B완충액 = 0.1%TFA/90%아세토니트릴, 구배는 15 분내에 10%에서 90%로 됨). 분석용으로 분리후, 미정제 추출물을 Vydac C4 또는 C8컬럼(2.2×25cm), 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴 구배를 이용하여 예비 제조용(semi-preparative) 크로마토그래피로 정제한다. 순수물을 액체 크로마토그래피 질량분석기(LC-MS, Liquid chromatography-mass spectrometry)에 의해 측정한 다음, 동결건조시켜 목표 펩타이드를 얻는다.

실시예2 Aib²-GIP(1~29)-Cys³⁰및 그와 유사한 Cys 단일치환 유사물질의 합성

0.05mmol의 Fmoc Rink-Amide수지를 10mL의 반응용기에 넣고, 이하의 서열에 따라 표준적인 Fmoc-화학고상펩타이드 합성과정을 진행하되, 디이소프로필카르보디이미드/히드록시벤조트리이졸(DIC/HOBt, diisopropylcarbodiimide/ Hydroxybenzotrizole)을 결합시약으로 한다.

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Ala-Gln-Cys

이하의 측쇄가 보호된 아미노산을 사용한다: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

모든 합성순환이 완료된 후, 20%피페리딘(Piperidine)/디메틸포름아미드(dimethylformamide)용액으로 폴리펩타이드가 연결된 수지를 처리하여 N-말단의 Fmoc기를 제거하고, 이어서, 최후의 절제시약(95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% EDT)으로 2시간 처리한다. 고체수지를 여과하고, 얻어진 여액에 질소기체를 불어넣어 농축시킨다. 냉각된 에틸에테르로 펩타이드를 침전시켜, 원심분리를 거쳐 조생성물을 얻는다. 폴리펩타이드 조생성물을 아세토니트릴완충액에 용해시키고, 반제조역위상컬럼에 샘플링된다. Waters HPLC시스템으로 아세토니트릴 구배 용출을 진행한다. 적합한 부분은 LC-MS에 의해 측정된 후 병합하여 함께 동결건조시킨다. HPLC분석에 따르면, 얻어진 산물의 순도가 90%를 초과함을 나타내고, ESI-MS는 목표펩타이드의 원하는 신호를 증명하였다.

유사물질028, 087과 096는 유사한 방법을 사용하여 제조된다.

실시예3 유사물질046과 지방산이 연결된 유사펩타이드의 합성

0.05mmol의 Fmoc Rink-Amide수지를 10mL의 반응용기에 넣고, 이하의 서열에 따라 표준적인 Fmoc-화학고상펩타이드 합성과정을 진행하되, DIC/HOBt을 결합시약으로 한다.

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Tyr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met-Glu-Lys-Glu-Ala-Val-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(palmitoyl)-Gly

이하의 측쇄가 보호된 아미노산을 사용한다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

모든 합성순환이 완료된 후, 우선 Pd(PPh3)4/디클로로메탄으로 폴리펩타이드가 연결된 수지를 1시간 처리하여 Alloc보호기를 제거하고, 팔미트산을 첨가하여 28째 자리의 Lys의 ε-아미노기와 결합된다. 이어서 20%피페리딘(Piperidine)/디메틸포름아미드(dimethylformamide)용액으로 수지를 처리하여 N-말단의 Fmoc기를 제거한 후, 최후의 절제시약(95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% EDT)으로 2시간 처리한다. 고체수지를 여과하고, 얻어진 여액에 질소기체를 불어넣어 농축시킨다. 냉각된 에틸에테르로 펩타이드를 침전시켜, 원심분리를 거쳐 조생성물을 얻는다. 폴리펩타이드 조생성물은 아세토니트릴완충액에 용해되고, 반제조역위상컬럼에 샘플링된다. Waters HPLC시스템으로 아세토니트릴 구배 용출을 진행한다. 적합한 부분은 LC-MS에 의해 측정된 후 병합하여 함께 동결건조시킨다. HPLC분석에 따르면, 얻어진 산물의 순도가 90%를 초과한다는 것을 나타내고, ESI-MS는 목표펩타이드의 원하는 신호를 증명하였다.

유사물질047은 유사한 방법을 사용하여 제조된다.

실시예4 유사물질065와 말레이미드(Maleimide)가 연결된 유사펩타이드의 합성

0.05mmol의 Fmoc Rink-Amide수지를 10mL의 반응용기에 넣고, 이하의 서열에 따라 표준적인 Fmoc-화학고상펩타이드 합성과정을 진행하되, DIC/HOBt을 결합시약으로 한다.

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Tyr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met-Glu-Lys-Glu-Ala-Val-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(3-말레이미도프로피오닐)-Gly

이하의 측쇄가 보호된 아미노산을 사용한다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

모든 합성순환이 완료된 후, 우선 Pd(PPh_{3 )4}/디클로로메탄으로 폴리펩타이드가 연결된 수지를 1시간 처리하여 Alloc보호기를 제거하고, 3-말레이미드프로피온산(3-Maleimidopropionic acid)을 첨가하여 28째 자리의 Lys의 ε-아미노기와 축합시킨다. 이어서 20%피페리딘/디메틸포름아미드 용액으로 수지를 처리하여 N-말단의 Fmoc기를 제거한 후, 최후의 절제시약(95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% EDT)으로 2시간 처리한다. 고체수지를 여과하고, 얻어진 여액에 질소기체를 불어넣어 농축시킨다. 냉각된 에틸에테르로 펩타이드를 침전시켜, 원심분리를 거쳐 조생성물을 얻는다. 펩타이드 조생성물은 아세토니트릴완충액에 용해되고, 반제조역위상컬럼에 샘플링된다. Waters HPLC시스템으로 아세토니트릴 구배 용출을 진행한다. 적합한 부분은 LC-MS에 의해 측정된 후 병합하여 함께 동결건조시킨다. HPLC분석에 따르면, 얻어진 산물의 순도가 90%를 초과한다는 것을 나타내고, ESI-MS는 목표펩타이드의 원하는 신호를 증명하였다.

유사물질069와 079는 유사한 방법으로 제조된다.

실시예5 유사물질052-2와 락탐연결을 포함하는 유사펩타이드의 합성

0.05mmol의 Fmoc Rink-Amide수지를 10mL의 반응용기에 넣고, 이하의 서열에 따라 표준적인 Fmoc-화학고상펩타이드 합성과정을 진행하되, DIC/HOBt을 결합시약으로 한다.

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Tyr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Glu-Tyr-Met-Glu-Lys-Glu-Ala-Val-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(Glu¹²와 Lys¹⁶사이에 락탐연결을 형성함)

이하의 측쇄가 보호된 아미노산을 사용한다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH.

모든 합성순환이 완료된 후, 우선 Pd(PPh₃₎₄/디클로로메탄으로 폴리펩타이드가 연결된 수지를 1시간 처리하여 Alloc/OAll보호기를 제거하고, 결합시약PyBOP(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)/DIEA작용하에 락탐연결을 생성한다. 이어서, 20%피페리딘(Piperidine)/디메틸포름아미드(dimethylformamide)용액으로 수지를 처리하여 N-말단의 Fmoc기를 제거한 후, 최후의 절제시약(95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% EDT)으로 2시간 처리한다. 고체수지를 여과하고, 얻어진 여액에 질소기체를 불어넣어 농축시킨다. 냉각된 에틸에테르로 펩타이드를 침전시켜, 원심분리를 거쳐 미정제 펩타이드를 얻었는다. 이 미정제 펩타이드를 아세토니트릴완충액에 용해한 후, 예비 제조용(semi-preparative) 역위상컬럼에 가하였다. Waters HPLC시스템으로 아세토니트릴 구배 용출을 진행한다. 적합한 부분은 LC-MS에 의해 측정된 후 병합하여 함께 동결건조시킨다. HPLC분석에 따르면, 얻어진 산물의 순도가 90%를 초과한다는 것을 나타내고, ESI-MS는 목표 펩타이드의 원하는 신호를 나타내었다.

유사물질053-2, 081, 084 및 085는 유사한 방법으로 제조된다.

실시예6 유사물질090과 γ-Glu를 스페이서로 하는 유사펩타이드의 합성

0.05mmol의 Fmoc Rink-Amide수지를 10mL의 반응용기에 넣고, 이하의 서열에 따라 표준적 Fmoc-화학고상펩타이드 합성과정을 진행하되, DIC/HOBt을 결합시약으로 하였다.

Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Tyr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met-Glu-Lys-Glu-Ala-Val-Arg-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(γ-Glu-팔미토일)

이하의 측쇄가 보호된 아미노산을 사용한다: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH.

최후의 순환은 Boc-Tyr(tBu)-OH 결합에 의해 완성된다. 모든 합성순환이 완료된 후, 우선 Pd(PPh₃)₄/디클로로메탄으로 폴리펩타이드가 연결된 수지를 1시간 처리하여 Alloc보호기를 제거하고, 이어서 γ-글루타밀(γ-glutamyl)을 40째 자리 Lys의 ε-아미노기에 결합하였다. 이어서 20% 피페리딘(Piperidine)/디메틸포름아미드 용액으로 수지를 처리하여 N-말단의 Fmoc기를 제거한 후, 이어서 팔미트산을 스페이서의 α-아미노기에 결합시켰다. 최종적으로, 수지를 절단 시약(95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% EDT)으로 2시간 처리하였다. 이 고체 수지를 여과하고, 얻어진 여액에 질소기체를 불어넣어 농축시킨다. 냉각된 에틸에테르로 펩타이드를 침전시켜, 원심분리를 거쳐 미정제 펩타이드를 얻었다. 이 미정제 펩타이드를 아세토니트릴완충액에 용해한 후, 예비 제조용역위상컬럼에 가하였다. Waters HPLC시스템으로 아세토니트릴 구배 용출을 진행하였다. 적합한 분획은 LC-MS로 특성 분석한 후 병합하여 함께 동결건조하였다. HPLC분석에 따르면, 얻은 생성물의 순도가 90%를 초과한다는 것을 나타내었고, ESI-MS는 목표 펩타이드의 원하는 신호를 나타내었다.

유사물질091, 092, 093, 094 및 095는 유사한 방법으로 제조된다.

실시예7 　PEG화의 일반방법(Cys-말레이미드)

통상적으로, Cys치환기를 포함하는 GIP유사물질87을 인산염완충액(~10 mg/mL)에 용해시키고, 말레이미드에 의해 활성화된 같은 당량의 메톡시PEG시약을 첨가하여, 실온에서 교반하여 반응시키는 동시에 분석형 HPLC로 반응진도를 검측하였다. 10-24h 후, 반응혼합물을 산화시켜 제조형 역위상 컬럼에 샘플링하여 정제하고, 0.1%TFA/아세토니트릴(acetonitrile)구배를 사용한다. 적합한 부분을 병합하여 동결건조시켜 원하는 PEG화 폴리펩타이드를 얻는다.

유사물질088 및 089는 유사한 방법으로 제조된다.

하기 서열목록은 본 발명에서 합성된 모든 GIP유사물질에 관한 것이다.

펩타이드 특징 정보는 표2에 표시한 바와 같다.

실시예8 일반적인 cAMP유도시험 방법

시험원리:

샘플 또는 표준용액 중의 cAMP와 서양 고추냉이 과산화효소(HRP, horseradish peroxidase)로 표지된 cAMP콘주게이트(conjugate)는 항-cAMP항체에 있는 결합 자리를 놓고 경쟁한다. cAMP가 없을 때에는 대다수의 HRP-cAMP콘주게이트는 항체와 결합하고 있다. cAMP 농도를 늘리면 결합된 콘주게이트의 양을 경쟁적으로 감소시킴으로써, 측정된 HRP활성을 저하한다.

재료와 장치

테스트 키트: CatchPoint^TM Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit (Molecular Devices, Product # R8088)

세포주:CHO hGLP-1R 및 CHO hGIPR;

성장배지:α-MEM (Gibco, 12561-056), 10% FBS(Gibco, 10099), 1mg/mL G418(Invitrogen, 10031035) 및 10nM MTX(Sigma, M4010) 첨가;

시약:이소부틸메틸잔틴(IBMX, isobutylmethylxanthine)(시그마(Sigma), I5879);포스콜린(forskolin)(Sigma, F6886); 크렙스 링거 중탄산염(KRB, Krebs-Ringer bicarbonate)완충액(Sigma, P/NK4002+15mM 탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate)); 둘베코즈 인산완충식염수(DPBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)(GIBCO, REF 14190-136); 3％ H₂O₂(북경세기); 디메틸설폭시드(DMSO, Dimethyl sulfoxide)(Sigma, D2650); 트립신(Trypsin)(Gibco, 15400); 증류수 또는 탈이온수, 96웰판(Falcon, 353072);천연리간드(GLP-1 및 GIP)는 상해GL Biochem회사에서 구매된다.

장치:클린벤치(clean bench)(ESCO, SVE-4A1); C02배양조(thermo, 3111); 자동세포계수기(Invitrogen CoutessTM); 미량피펫(micropipet)(에펜도르프(Eppendorf)); 마이크로플레이트 와류믹서기(Microplate vortex mixer)(TAITEC, M.BR-022UP); 정밀여과기를 구비한 마이크로플레이트리더: 여기(excitation) 530 nM, 방출590 nM(Teacon, infinite F200)

시험단계:

세포접종: CHO hGLPIR 또는 CHO hGIPR의 세포로 한다: 10,000세포/웰/100μL를 37℃의 5％ CO₂에서 밤을 지새운다.

세포용해물의 제조:

배양액을 조심스레 흡수하고 100μL/웰의 KRBG완충액으로 그 세포를 세척한다.

KRBG를 조심스레 흡수하고, 웰당 100μL씩 1.5×자극완충액(0.75mN IBMX의 KRBG포함, 실험 당일에 새로 제조)을 첨가하여, 실온에서 평판에서 10분 배양한 후, 50μL/웰의 3×최종농도의 테스트샘플(5000nM로부터5배씩 연속 희석)을 포함하는 KRBG를 첨가하고 37℃의 5% CO2에서 30분 배양시킨다.

웰당 50μL의 용해액을 넣고, 이어서 진탕기에 옮겨 10분 진탕시킨다.

cAMP검출과 데이터분석

40μL 샘플을 적당한 웰에 넣고 분석한다. 제조사 설명서에 따라 각 샘플의 cAMP농도를 조사한다.

여기: 490 nm와 방출: 530nm에서 형광신호를 검출한다. cAMP 표준곡선을 이용하여 FI신호를 cAMP농도로 변환한다. 투여량-반응 곡선과 EC₅₀값은 Origin 8을 이용하여 로지스틱 곡선 맞춤(logistic fitting)으로 구하였다.

모든 합성된 GIP유사물질들은 모두 상기 규정에 따른 시험관내의 GLP-1R와 GIPR에 의해 매개된 cAMP유도시험을 통해 평가를 받았는 바, 매 종류의 폴리펩타이드의 EC₅₀값은 표3에 표시된 바와 같다.

실시예9 ICR마우스 평가의 일반규정

동물

수컷ICR마우스(23-25g)는 북경유통리화실험동물기술유한회사(VRL)에서 구매했다. 그리고 북경한미약품유한회사의 실험동물 사양사용지침원칙에 따라 동물을 사양했다. 마우스는 12시간 동안 주기적으로 명암교체시키는 환경속에서 사양하였다. 과오협력식품유한회사에서 구매한 표준사료로 동물을 사양하고 자유롭게 물을 마시게 했다. 정식 실험전, 마우스를 랜덤으로 대조군 및 약물처리군으로 나눈다.

재료

포도당을 천진복진화학시약공장에서 구매하고; 혈당기(ACCU-CHEK® Active) 및 혈당측정시험지를 라씨(상해)유한회사에서 구매했다.

포도당 복강주사 부하실험(ipGTT):

마우스는 밤을 새워 금식(16시간)시킨 후, 혈당을 측정하고(-30min), 이어서 샘플 펩타이드(최고 1000nM) 또는 담체를 피하주사방식으로 투여했다. 투여30분 후, 0min혈당을 측정했다. 이러서 복강주사방식으로 포도당을 3g/kg 투여했다. 그리고 포도당 투여 후 15, 30, 60 및 120분에 혈당을 측정했다. 혈당측정후, 데이터를 수집했다. AUC(mmol/L*h)=(BG_-30+BG₀)×30/2/60+(BG₀+BG₁₅)×15/2/60+(BG₁₅+BG₃₀)×15/2/60+(BG₃₀+BG₆₀)×30/2/60+(BG₆₀+BG₁₂₀)×60/2/60(BG_-30, BG₀는 각각 포도당 투여전 30분 및 0분일 때의 혈당이고; BG₁₅, BG₃₀, BG₆₀ 및 BG₁₂₀는 포도당 투여후 15, 30, 60 및 120분일 때의 혈당이다).

실시예10　db/db마우스 중의 일반평가규정

동물

수컷BKS.Cg-Dock7^m +/+ Lepr^db/J마우스(db/db, 6-8주령)는 남경대학 모델동물연구소에서 구매했다. 그리고 북경한미약품유한회사의 실험동물사양사용지침에 따라 동물을 사양했다. 마우스를 주기적으로 조명환경속에서 12시간 동안, 어두운 환경에서 12시간 사양하고, 정식실험전 10일간 적응성 사양을 하였다. 마우스에게 과오협력사료유한회사에서 구매된 표준사료를 먹이고 자유롭게 물을 마시게 했다. 실험전 마우스를 랜덤으로 대조군 및 약물처리군으로 나눈다.

재료와 방법

포도당을 천진복진화학시약공장에서 구매하였다. 휴물린^®R(Humulin^®R)는 Lilly에서 구매하였다. 혈당기(ACCU-CHEK^® Active) 및 혈당측정시험지를 라씨(상해)유한회사에서 구매하였다. 혈중 콜레스테롤(Blood cholesterol), 트리글리세리드(Triglyceride), 고밀도지질단백콜레스테롤(HDL-c) 및 저밀도지질단백콜레스테롤(LDL-c) 측정키트는 북경 중생북공 바이오과학기술유한회사에서 구매하였다.

비공복혈당

아침 9시 30분에 마우스0min혈당을 측정한다. 이어서, 마우스에게 피하주사방식으로 샘플 펩타이드(대략 1000 nM)를 투여한다. 투여후 10시간내에 2시간에 한번씩 혈당을 측정한다. 투여후24시간에, 최후 시점의 혈당을 측정한다.

복강포도당부하실험(ipGTT)

마우스를 실험전 12시간 금식시킨다. 투여30분 후에 0min혈당을 측정한다. 이어서, 마우스에게 복강주사방식으로 1g/kg투여량의 포도당을 투여하고, 포도당 주사 후 15, 30, 60 및 120분에 혈당을 측정한다.

인슐린부하실험(ITT)

마우스를 아침에 4시간 금식시킨 후, 0min혈당을 측정한다. 이어서, 동물에게 피하주사방식으로 휴물린^®R(Humulin^®R)0.4 U/kg를 투여하고, 주사후 15, 30, 60 및 120분에 혈당을 측정한다.

혈지정황검출

혈중 콜레스테롤, 트리글리세리드, 고밀도지질단백콜레스테롤(HDL-c) 및 저밀도지질단백콜레스테롤(LDL-c)은 측정키트를 사용하여 설명서 방법에 의해 측정된다.

실시예11 　바이오틴으로 표지된 항GLP-1/GIP단일클론항체의 일반규정

재료

시약:바이오틴 표지 키트(Roche Appiled Science, 11418165001); 항GLP-1/GIP단일클론항체(Cowin Biotech, 20120129)

장치:마이크로웰 플레이트 진동기(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 4625-1CEQ); 분광광도계(시마즈(Shimadzu), UV-2450)

단계

용액조제:

블록킹액(Blocking Solution): 블록킹 시약병속의 물질을 300mL증류수로 용해시킨다. 이 시약을 완전히 용해시킨다.

PBS용액: PBS병속의 물질을 1L증류수로 용해시킨다. 이 시약을 완전히 용해시킨다.

바이오틴-7-NHS용액: 이용액은 반드시 표지전에 신선하게 조제한다. 250uL DMSO를 바이오틴-7-NHS를 함유하는 병속에 투입하고, 용액을 여러번 진탕한다. 얻어진 바이오틴-7-NHS용액농도는 20mg/mL이다.

바이오틴-7-NHS으로 표지된 단백질:

1mL항GLP-1/GIP항체용액(1mg/mL, PBS제제)을 취하여 1.5mL 에펜도르프(EP, eppendorf)관에 넣는다. 10uL 바이오틴-7-NHS용액(20mg/mL)을 DMSO으로 1:10되도록 희석한다. 15uL 바이오틴-7-NHS용액(2mg/mL)을 취하여 1ml항GLP-1/GIP항체용액이 담겨져 있는 에펜도르프관속에 넣는다. 알루미늄호일로 시험관을 잘 포장하여 해빛을 차단시킨다. 실온조건에서, 수평마이크로웰 플레이트 진동기에서 2시간 시험관을 배양시키고, 진동속도를 500rpm±50rpm으로 설정한다.

Sephadex G-25컬럼의 제조:

항GLP-1/GIP항체와 바이오틴-7-NHS를 배양시키는 동시에 Sephadex G-25컬럼을 제조한다. 철 거치대로 컬럼을 고정시키고, 컬럼의 밑에 적어도 100mL의 비커를 놓는다. 컬럼 밑단의 출구를 컷팅하고, 컬럼 최상단의 덮개를 제거하여 컬럼속의 물체가 유출되도록 한다. 5mL블록킹액을 컬럼에 투입하고 블록킹액이 유출되도록 한다. 이어서 총 30mL(5mL×6회)PBS용액으로 컬럼을 세척하고 PBS용액이 유출되도록 한다. 그러나 컬럼속의 액체가 다 흘러버리는 것은 피면한다. 세파덱스(Sephadex) G-25컬럼은 현재 사용가능하다.

컬럼 크로마토그래피법:

배양혼합물에서 바이오틴으로 표지된 항GLP-1/GIP항체를 정제시키되, 하기와 같다.

반응혼합물을 컬럼에 투입하고 이를 유출되도록 한다.

1.5mL PBS용액을 컬럼에 투입하고 이를 유출되도록 한다.

3.5mL PBS용액을 컬럼에 더 투입하여 표지된 항 GLP-1/GIP항체를 용출시킨다.

처음 10방울의 용액은 유출시킨다.

11-20방울을 새로운 1.5mL 에펜도르프관에 수집한다. 이 부분은 바이오틴으로 표지된 항GLP-1/GIP항체이다.

20방울의 액체를 수집한 후, Sephadex G-25컬럼을 제거해야 한다.

농도측정:

PBS용액으로, 표지된 단백질을 5배로 희석한다(예를 들어, 20μL의 표지된 단백질을 80μL의 PBS용액에 투입한다. 정밀한 체적과 분광광도계의 큐벳(cuvette)체적은 정비례된다). 280nm의 흡광도값을 검출한다(라스틱 큐벳을 사용해서는 아니 된다). 분광광도계는 반드시 PBS용액을 공백군으로 하여 교정해야 한다.

표지된 항GLP-1/GIP항체농도(농도는:O.D. 280nm/1.35×5(희석도)=X mg/mL)를 측정한다. 1.35는 항GLP-1/GIP항체의 소광계수값이다.

실시예12 디곡신으로 항GLP-1/GIP다클론항체를 표지하는 일반규정

재료

시약:디곡시제닌-3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산- N히드록시숙신이미드 에스터(Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-ε-aminocaproic acid- N-hydroxysuccinimide ester) (Roche Appiled Science, 11333054001), 바이오틴표지키트(Roche Appiled Science, 11418165001), 항GLP-1/GIP다클론항체(Cowin Biotech, 20111104)

장치:마이크로웰 플레이트 진동기(Thermo Scientific, 4625-1CEQ), 분광광도계(Shimadzu, UV-2450)

단계

용액조제:

블록킹액:블록킹시약병속의 물질을 300mL증류수로 용해시킨다. 이 시약을 완전히 용해시킨다.

PBS용액: PBS병속의 물질을 1L증류수로 용해시킨다. 이 시약을 완전히 용해시킨다.

디곡신-7-NHS용액: 250μL DMSO으로 디곡시제닌-3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산- N히드록시숙신이미드 에스터를 용해시키고, 용액을 여러번 보텍스한다. 얻어진 디곡신-NHS용액농도는 20mg/mL이다.

디곡신-7-NHS표지단백질:

1mL항GLP-1/GIP항체(1mg/mL, PBS제제)를 취하여 1.5mL 에펜도르프관에 투입한다. 11μL 디곡신-NHS(20mg/mL)을 취하여 1mL항GLP-1/GIP항체용액이 담긴 에펜도르프관에 투입한다. 알루미늄 호일로 시험관을 포장하여 차광한다. 실온조건에서, 수평마이크로웰 플레이트 진동기에서 2시간 시험관을 배양시키고, 진동속도는 500rpm±50rpm으로 설정한다.

Sephadex G-25컬럼의 제조:

항GLP-1/GIP항체와 디곡신-NHS를 배양하는 동안 Sephadex G-25컬럼을 제조한다. 클램프를 써서 스탠드에 컬럼을 고정하고, 이 컬럼의 밑에 적어도 100mL의 비커를 놓는다. 컬럼의 출구를 컷팅하고, 컬럼 최상단의 덮개를 제거하여 컬럼속의 물체가 유출되도록 한다. 5mL블록킹 용액을 컬럼에 투입하고 블록킹 용액이 유출되도록 한다. 이어서 총30mL(5mL×6차례)PBS용액으로 컬럼을 세척하고 PBS용액이 유출되도록 한다. 그러나 컬럼이 말라버리도록 놓아 두어서는 아니된다. Sephadex G-25컬럼은 이제 사용가능하다.

컬럼 크로마토그래피법:

배양혼합물에서 디곡신으로 표지된 항GLP-1/GIP항체를 정제시키되, 하기와 같다.

반응혼합물을 컬럼에 투입하고 이를 유출되도록 한다.

1.5mL PBS용액을 컬럼에 투입하고 이를 유출되도록 한다.

3.5mL PBS용액을 컬럼에 더 투입하여 표지된 항GLP-1/GIP항체를 용출한다.

처음 10방울의 용액을 유출시킨다.

11-20방울을 새로운 1.5mL 에펜도르프관에 수집한다. 이 분획은 디곡신으로 표지된 항GLP-1/GIP항체이다.

20방울의 액체를 수집한 후, Sephadex G-25컬럼은 제거해야 한다.

농도측정:

PBS용액으로, 표지된 단백질을 5배로 희석한다(예를 들어, 20μL의 표지된 단백질을 80μL의 PBS용액에 투입한다. 정밀한 체적과 분광광도계의 큐벳체적은 정비례된다). 280nm의 흡광도값을 검출한다(플라스틱 큐벳을 사용해서는 아니 된다). 분광광도계는 반드시 PBS용액을 공시험군(blank)으로 하여 보정해야 한다.

표지된 항GLP-1/GIP항체농도(농도:O.D. 280nm/1.35×5(희석도)=X mg/mL)를 측정한다. 1.35는 항GLP-1/GIP항체의 소광계수값이다.

실시예13 마우스PK연구

수컷C57BL/6마우스(23~25g)는 북경유통리화실험동물기술 유한회사(VRL)에서 구매했다. 그리고 북경한미약품유한회사 실험동물 사양사용 지침원칙에 따라 동물을 사양했다. 마우스는 각각 12시간씩의 명암 주기에 놓았다. 북경과오협력식품유한회사에서 구매한 표준사료로 마우스에 먹이를 주하고 자유롭게 물을 마시게 했다. 이들 마우스에게 17nmol/kg 투여량의 유사물질089를 정맥주사하거나, 또는 17nmol/kg, 50nmol/kg 및 150nmol/kg 투여량의 유사물질089를 피하주사하였다. 정맥투여 5분min, 15분, 30분, 1, 3, 6, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 288시간후 또는 피하투여1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 288, 360시간후의 시점별로 0.3mL의 혈액샘플을 수집한다. 안와정맥 얼기(orbital venous plexus)에서 채혈한 다음 혈액을 EDTA를 함유하는 원심분리관에 투입한다. 12000rpm에서 5분 원심분리하여 혈장을 얻는다. 혈장을 -20℃에서 저장하여 분석하는데 사용한다. 혈장 중의 GIP유사물질 농도는 샌드위치(sandwich) 효소결합 면역흡수 분석(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay)방법에 의해 검출되는 바, 그 검출단계는 하기와 같다.

스트렙타비딘(streptavidin) 피복 ELISA판(Roche Applied Science, cat# 11645692001)을 25℃의 인큐베이터(incubator)에 넣고 4℃부터 시작하여 이를 예열한다.

바이오틴화된 항GLP-1/GIP단클론항체(1㎍/mL)를 검출완충액-1으로 희석하고, 웰당 100μL씩 넣고, 25℃에서 30분 배양한다.

세척완충액(300μL/웰)으로 5회 세척한다.

웰당 300μL씩 블로킹완충액을 넣고, 25℃에서 1 시간 배양한다.

세척완충액(300μL//웰)으로 5회 세척한다.

웰당 100μL씩 검정 물질과 측정 시료를 넣고, 25℃에서 1 시간 배양한다.

세척완충액(300μL/웰)으로 5회 세척한다.

디곡신화된 항GLP-1/GIP다클론항체(0.5㎍/mL)를 검출완충액-2으로 희석하고, 웰당 100μL씩 넣어, 25℃에서 1시간 배양한다.

세척완충액(300μL/웰)으로 5회 세척한다.

항DIG-POD (75mU/mL, Roche Applied Science, cat# 11633716001)를 검출완충액2로 희석하고, 웰당 100μL씩 넣어, 25℃에서 1 시간 배양한다.

세척완충액(300μL/웰)으로 5회 세척한다.

100μL 테트라메틸벤지딘(TMB, tetramethylbenzidine)용액(BD biosciences, cat# 555214)을 넣어, 25℃에서 플레이트가 10분동안 발색하게 한다.

100μL의 1 M H₂SO₄용액(북경흥청홍정밀화학품과기유한회사)을 넣어 발색을 중지시킨다.

15분내에 마이크로플레이트리더(MicroplateReader)(BioTek Instruments, ELX-808)로 450nm에서의 흡광도를 계측한다.

SEQUENCE LISTING <110> Tao, Ma Shusen, Xu Zhijun, Liu Bo, Zhang Ning, Shen Hai, Yang Wei, Zhang Yuhua, Li Sunghwan, Moon Maengsup, Kim <120> GLUCOSE DEPENDENT INSULINOTROPIC POLYPEPTIDE ANALOGS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USE THEREOF <130> 121911CN07 <150> 201110156296.2 <151> 2011-06-10 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 2 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 3 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 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GIP analogy <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = phenyl glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa = Nle <400> 9 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Xaa Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa = Nle <400> 10 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Xaa Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa = Nle <400> 11 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Phe Xaa Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 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Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 21 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 20 25 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 22 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 23 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Cys Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 24 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 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Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa = 4-chloro-Phe <400> 28 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Asp Xaa Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = Pal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa = 4-chloro-Phe <400> 29 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Met Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Xaa Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 20 25 <210> 30 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa = 4-chloro-Phe <400> 30 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Ile His Gln 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chains at positions 20 and 24 <400> 62 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 63 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 63 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 64 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Cys(20kDa PEG) <400> 64 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 65 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 84 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa = Lys(palmitoyl) <400> 84 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 85 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa = Lys(palmitoyl) <400> 85 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 86 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa = Cys(40kDa PEG) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa = Lys(palmitoyl) <400> 86 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 87 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa = Cys(40kDa PEG) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa = Lys(palmitoyl) <400> 87 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Xaa 35 <210> 88 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Lys(palmitoyl) <400> 88 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 89 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 89 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 90 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 90 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 91 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Cys(40kDa PEG) <400> 91 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 92 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Cys(40k PEG) <400> 92 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 93 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <400> 93 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 94 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Cys(40kDa PEG) <400> 94 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 95 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Lys(40kDa PEG) <400> 95 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 96 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa = Cys(palmitoyl) <400> 96 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40 <210> 97 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa = Lys(Biontin) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = Lys(Biontin) <400> 97 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Xaa 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 98 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIP analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa = Cys(40kDa PEG) <400> 98 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Met Glu Lys 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 99 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 100 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30

Claims (34)

1. GIP(1~29, SEQ ID NO:1)에서 유래된 GIP유사물질로서, 상기 GIP유사물질은 GLP-1의 아고니스트 활성과 GIPR자극 활성을 갖고, 이하 일반식I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며，
   Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Lue-A27-A28-A29-Y (일반식I)
   여기서，
   A2는 Ala, Gly, 사르코신, Aib, D-Ala 및 D-Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A3은 Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A7은 Thr, Ile 및 Ser으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A12는 Ile, Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe(4-NH₂), Ala, Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐), Ala(4-피리딜) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,
   A14는 Met 또는 산화된 Met, Leu, Val, 노류신 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A15는 Glu 및 Asp으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A17은 Ile, Glu 및 Gln으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A18은 Ala 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A19는 Val, Ala, Leu, Gln 및 Ile으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A20은 Arg, Lys-Z, Gln, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A21은 Glu, Asp 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A22는 Phe, Phe(4-F), Phe(4-Cl), Tyr, Tyr(4-Me) 및 Nal으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A23은 Ile 및 Val으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A24는 Ala, Asn, Glu, Lys-Z 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A27은 Val, Leu, Ala 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A28은 Lys-Z, Ala, Arg 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A29는 Gly, Gln 및 Arg으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   Y는 A30 및 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하며,
   A30과 A40은 독립적으로 -(Lys)_n-Z 및 -Cys-Z 또는 결실로 구성된 군으로부터 선택되고,
   Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하며,
   n은 1~6으로부터 선택된 정수이고,
   m은 0~3으로부터 선택된 정수이며,
   여기서, 선택적으로 상기 GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산 사이에 락탐연결(lactam linkage)이 형성될 수 있고, i는 12~24로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
2. 제1항에 있어서,
   일반식I에서,
   A3은 Glu이고,
   A13은 아릴기를 갖는 아미노산잔기로 구성된 군으로부터 선택되고, 또한 Tyr, Phe, Phe(4-F), Phe(4-NO₂), Phe(4-NH₂), Ala(2-티에닐), Ala(벤조티에닐) 및 페닐글리신으로부터 선택되며,
   A15는 Glu이고,
   A18은 Ala이며,
   A19는 Val 및 Ala으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A20은 Arg, Lys-Z, Glu, Asp 및 Cys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A21은 Glu 및 Leu으로 구성된 군으로부터 선택되고,
   A22는 Phe이며,
   A23은 Ile이고,
   A27은 Val 및 Lys-Z으로 구성된 군으로부터 선택되며,
   A28은 Lys-Z 및 Asn으로 구성된 군으로부터 선택되고, 또한
   A29는 Gly이며,
   Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하고,
   m은 0~3으로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
3. 제1항 내지 제2항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서,
   Y는 A30이거나 부존재하고,
   A30은 -(Lys)_n-Z 및 -Cys-Z로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하며,
   Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하고,
   n은 1~6으로부터 선택된 정수이며,
   m은 0~3으로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
4. 제1항 내지 제2항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서,
   Y는 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40이고,
   A40은 -(Lys)_n-Z 및 -Cys-Z로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하며,
   Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하고,
   n은 1~6으로부터 선택된 정수이며,
   m은 0~3으로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서 Y는 부존재하는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
6. 제1항, 제2항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서 Y는 -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서 A7은 Thr인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서 A2는 Aib인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
   일반식I에서 A13은 Tyr인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서 A17은 Glu인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서 A19는 Val인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서 A20은 Arg인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서
    A24는 Cys-Z이고,
    Z는 -(Glu)_m-PEG이며,
    m은 0~3으로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서
    A30과 A40은 독립적으로 -(Lys)_n-Z이고,
    Z는 -(Glu)_m-PEG, -(Glu)_m-바이오틴 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되거나 부존재하며,
    n은 1~6으로부터 선택된 정수이고,
    m은 0~3으로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서
    Z는 -(Glu)_m-PEG 및 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    m은 0~2로부터 선택된 정수이고,
    예를 들어 Glu는 γ-Glu인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서
    Z는 -(Glu)_m-PEG이고,
    m은 0~2로부터 선택된 정수이며,
    예를 들어 Glu는 γ-Glu인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
17. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서
    Z는 -(Glu)_m-지방산으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    m은 0~2로부터 선택된 정수이며,
    예를 들어 Glu는 γ-Glu인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서,
    일반식I에서,
    상기 GIP유사물질의 i째 자리와 i+4째 자리의 아미노산사이에 락탐연결을 형성하고, i는 12, 16 및 24로부터 선택된 정수인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서,
    지방산은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 콜린산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서,
    PEG의 분자량은 5kDa~40kDa으로부터 선택되는 바, 예를 들어 20kDa, 30kDa 또는 40kDa인 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
21. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 GIP유사물질은 SEQ ID NO: 65, 2~64 및 66~98로 이루어지는 군에서 선택하는 아미노산 서열 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 GIP유사물질은 SEQ ID NO: 3, 18, 19, 20, 21, 35, 45, 52, 63, 65, 72, 74, 80, 97 및 98로 이루어지는 군에서 선택하는 아미노산 서열 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
23. 제1항, 제2항 및 제4 항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기GIP유사물질은 SEQ ID NO: 52, 72 및 74로 이루어지는 군에서 선택하는 아미노산 서열 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 여기서 상기 서열은 20째 자리, 24째 자리 및/또는 C-말단에 연결된 적어도 하나의 지방산부위를 갖는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
24. 제1항, 제2항 및 제4 항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기GIP유사물질은 SEQ ID NO: 65, 74 및 98로 이루어지는 군에서 선택하는 아미노산 서열 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 여기서 상기 서열은 20째 자리, 24째 자리 및/또는 C-말단에 연결된 적어도 하나의 PEG부위를 갖는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
25. 제1항, 제2항 및 제4 항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 GIP유사물질은 SEQ ID NO: 74로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 상기 서열은 24째 자리에 연결된 PEG부위와 C-말단에 연결된 지방산부위를 갖는 것을 특징으로 하는 GIP유사물질.
26. 유효량의 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제 및 선택적 구성 요소로서 항당뇨병제를 포함하고, 상기 항당뇨병제는 인슐린계, 비구아니드계, 설폰요소계, 로지클리타존 또는 피오글리타존, α-글루코시다아제 억제제 및 아미노 디펩티다아제IV(aminodipeptidase IV) 억제제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
27. 제26항에 있어서,
    약학적 조성물의 형식은 주사제 또는 동결건조분말 형식인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
28. 대사질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 제26항 또는 제27항에 따른 약학적 조성물.
29. 상기 대사질환은 당뇨병, 비만증 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 제26항 또는 제27항에 따른 약학적 조성물.
30. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 제26항 또는 제27항에 따른 약학적 조성물을 이용하여 대사 질환을 치료하는 약물을 제조하기 위한 용도.
31. 제30항에 있어서,
    상기 대사질환은 당뇨병, 비만증 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
32. 대사질환의 치료 및/또는 예방을 수요로 하는 피험자에게 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 혹은 제26항 또는 제27항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대사질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
33. 제32항에 있어서,
    상기 대사질환은 당뇨병, 비만증 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 GIP유사물질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 GIP 및 GLP-1수용체와 접촉시키는 단계를 포함하는 체내 및/또는 시험관내에서 GIP 및 GLP-1수용체를 함께 활성화시키는 방법.

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