JP2006503588A - 改変トランスフェリン融合タンパク質 - Google Patents

改変トランスフェリン融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

血清半減期または血清安定性が増大した、トランスフェリンと可溶性毒素受容体を含む治療タンパク質または治療ペプチドとの改変融合タンパク質が開示される。好ましい融合タンパク質には、トランスフェリン成分が、全くグリコシル化されないかグリコシル化が低下している、鉄に対して全く結合しないか結合が低下している、トランスフェリン受容体に対して全く結合しないか結合が低下している、の少なくともいずれかであるように改変された融合タンパク質が含まれる。

Description

関連出願
[0001] 本出願は、米国特許出願第１０／３７８，０９４号（２００３年３月４日出願）および米国仮特許出願第６０／４０６，９７７号（２００２年８月３０日出願）（これらを、その全体を参照として組み入れる）に対する優先権を主張する。
発明の分野
[0002] 本発明は、グリコシル化、鉄結合性およびトランスフェリン受容体結合性の低下または阻害をもたらすように改変されたトランスフェリン分子に融合または挿入された、高まった血清安定性またはインビボ循環半減期を有する治療タンパク質または治療ペプチドおよび可溶性毒素受容体フラグメントに関する。具体的には、本発明は、トランスフェリン分子または改変されたスフェリン分子に融合または挿入されたＩＦＮ−β、ＧＬＰ−１、ＥＭＰ１およびＴ−２０を含む。本発明はまた、トランスフェリン分子または改変されたスフェリン分子に融合または挿入されたシナプトタグミン１のフラグメントを含む抗毒素融合タンパク質を含む。
発明の背景
[0003] 治療タンパク質または治療ペプチドは、その本来の状態において、または組換え産生されたとき、典型的には、短い期間の血清安定性または短いインビボ循環半減期を示す不安定な分子である。また、これらの分子は、多くの場合、配合されたとき、特に、診断目的および治療目的のために水溶液に配合されたときには、極めて不安定である。
[0004] タンパク質性治療分子のインビボまたはインビトロでの安定性を高めるか、または促進するための、実用的な溶液は、ほとんど存在していない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質に結合して、タンパク質のより長期に作用する持続した活性をもたらすことができる物質である。タンパク質の活性が、ＰＥＧへの結合によって長くなる場合、そのタンパク質を投与するために必要とされる頻度を少なくすることができる。しかしながら、ＰＥＧの結合は、多くの場合、タンパク質の治療活性を低下させ、または破壊する。場合により、ＰＥＧの結合は、タンパク質の免疫原性を低下させことができることもあるが、免疫原性を増大させこともある。
[0005] 治療タンパク質または治療ペプチドはまた、治療タンパク質のインビボ循環半減期を高めることができるタンパク質に融合することによって安定化されている。例えば、アルブミンまたは抗体フラグメントに融合された治療タンパク質は、非融合状態の治療タンパク質と比較したとき、高まったインビボ循環半減期を示す場合がある。米国特許第５，８７６，９６９号および同第５，７６６，８８３号を参照されたい。
[0006] 別の血清タンパク質であるグリコシル化ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）もまた、治療タンパク質との融合体を作製して、細胞の内部への送達を標的化するために、または、血液脳関門を越えて薬剤を運ぶために使用されている。グリコシル化ヒトＴｆを含むこれらの融合タンパク質は、全長Ｔｆを薬剤に融合することによって、神経成長因子（ＮＧＦ）または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を、血液脳関門を越えて標的化するために使用されている。米国特許第５，６７２，６８３号および同第５，９７７，３０７号を参照されたい。これらの融合タンパク質において、分子のＴｆ部分はグリコシル化され、２原子の鉄に結合する。これは、Ｔｆが細胞のＴｆ受容体に結合するために必要であり、また、これらの特許の発明者らによれば、血液脳関門を越えてＮＧＦ成分またはＣＮＴＦ成分の送達を標的化するために必要とされる。トランスフェリン融合タンパク質はまた、Ｔｆ受容体を介した細胞の内部への標的化された送達のために別の形態のＴｆ融合をもたらすことができることを調べるために、ＨＩＶ−１プロテアーゼ標的配列をグリコシル化トランスフェリンの表面露出ループの中に挿入することによって作製されている（Ａｌｉら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３）。
[0007] 血清トランスフェリン（Ｔｆ）は、分子量が８０，０００ダルトンの単量体の糖タンパク質であり、循環において鉄と結合し、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介して様々な組織に鉄を輸送する（Ａｉｓｅｎら（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：３５７〜３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：３５４３〜３５５３；米国特許第５，０２６，６５１号）。Ｔｆは最も一般的な血清分子の１つであり、総血清タンパク質の約５〜１０％までを構成している。糖欠損トランスフェリンが、アルコール中毒者の血液中に高レベルで存在し、これはグリコシル化トランスフェリンの半減期（約７〜１０日）よりも長い半減期（約１４〜１７日）を示している。ｖａｎ Ｅｉｊｋら（１９８３）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１３２：１６７〜１７１；Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７：２０２９〜２０３７（１９９１）；Ａｒｎｄｔ（２００１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４７（１）：１３〜２７；Ｓｔｉｂｌｅｒら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｒｄｍａｎｎら編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、１９８８年、第７１巻、３５３頁〜３５７頁を参照されたい。
[0008] Ｔｆの構造は十分に特徴づけられており、受容体の結合、鉄の結合および放出、ならびに炭酸イオンの結合の機構が解明されている（米国特許第５，０２６，６５１号、同第５，９８６，０６７号、およびＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８（６）：３５４３〜３５４６）。
[0009] トランスフェリン、およびトランスフェリン受容体と結合する抗体もまた、ガンの治療として毒性薬剤を腫瘍細胞に送達または運搬するために使用されており（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９４）、また、トランスフェリンは、ＤＮＡを細胞に送達するために非ウイルス性遺伝子治療ベクターとして使用されている（Ｆｒａｎｋら、１９９４；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２）。トランスフェリン受容体を進入点として使用してタンパク質を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することができることが、ＣＤ４（Ｗａｌｕｓら、１９９６）、脳由来神経栄養因子（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９４）、グリア由来神経栄養因子（Ａｌｂｅｃｋら）、バソインテスティナルペプチドアナログ（Ｂｉｃｋｅｌら、１９９３）、β−アミロイドペプチド（Ｓａｉｔｏら、１９９５）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５）を含むいくつかのタンパク質およびペプチドを用いて明らかにされている。
[0010] しかしながら、トランスフェリン融合タンパク質は、Ｔｆ成分のグリコシル化の低下または阻害をもたらすことによって治療タンパク質または治療ペプチドのインビボ循環半減期を延ばし、またはバイオアベイラビリティを増大させるために、あるいは、鉄および／またはＴｆ受容体の結合を低下させ、または妨げるためには改変または操作されていない。
発明の概要
[0011] 以下においてより詳しく記載するように、本発明は、少なくとも１つの治療用のタンパク質実体またはポリペプチド実体またはペプチド実体を含む改変Ｔｆ融合タンパク質であって、分子のインビボ循環半減期またはバイオアベイラビリティを高めるためにＴｆ部分が操作されている改変Ｔｆ融合タンパク質を含む。本発明はまた、このような融合タンパク質を含む医薬製剤および医薬組成物、改変トランスフェリンへの融合によって治療タンパク質の血清安定性、インビボ循環半減期およびバイオアベイラビリティを高める方法、改変Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子などを含む。本発明の別の態様は、改変Ｔｆ融合タンパク質を用いて患者を治療する方法に関する。
[0012] 好ましくは、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質は、グリコシル化ならびに／または鉄結合性および受容体結合性の低下または防止をもたらすために改変されているヒトトランスフェリンＴｆ成分を含む。
[0013] 本発明は、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子に融合または挿入された治療タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明の治療タンパク質には、β−インターフェロン（β−ＩＦＮ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）ミメティックペプチド（ＥＭＰ１）およびＴ−２０が含まれる。
[0014] 本発明はまた、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子に融合または挿入された、毒素と結合する可溶性毒素受容体フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。可溶性毒素受容体にはシナプトタグミンＩを挙げることができ、その可溶性フラグメントはアミノ酸１〜５３（配列番号４）である。
詳細な説明
一般的記載
[0019] 本発明は、トランスフェリン、改変されたトランスフェリン、または、治療タンパク質の血清中の半減期を延ばすために十分なトランスフェリンもしくは改変されたトランスフェリンの一部に治療タンパク質を遺伝子融合することによって、治療タンパク質が安定化されて、そのインビボでの血清半減期および／または活性を延ばすことができるという本発明者らによる発見に部分的に基づいている。改変トランスフェリン融合タンパク質は、治療タンパク質または治療ペプチドに共有結合的に連結されたトランスフェリンタンパク質またはそのドメインを含み、この場合、トランスフェリン部分は、野生型トランスフェリン配列と比較したとき、１個以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含有するように改変されている。一実施形態において、Ｔｆ融合タンパク質は、Ｔｆ内またはＴｆドメイン内のグリコシル化を低下させるか、または妨げるために操作される。他の実施形態において、Ｔｆタンパク質またはＴｆドメインは、鉄イオンまたは炭酸イオンへの低下した結合を示すか、あるいは鉄イオンまたは炭酸イオンへの結合を示さないように、あるいはＴｆ受容体（ＴｆＲ）に対する低下した親和性を有するか、またはＴｆ受容体（ＴｆＲ）に結合しないように改変される。
[0020] 本発明によって意図される治療タンパク質には、ポリペプチド、抗体、ペプチド、あるいはそれらのフラグメントまたは変異体が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の治療タンパク質には、β−インターフェロン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ１）およびＴ−２０が含まれる。
[0021] 本発明ではまた、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合または挿入された可溶性毒素受容体フラグメントを含む抗毒素融合タンパク質が意図される。好ましくは、可溶性毒素受容体は特定の毒素と結合する。一実施形態において、可溶性毒素受容体はシナプトタグミン１のアミノ酸１〜５３（配列番号４）である。
[0022] したがって、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質、該融合タンパク質を含む治療組成物、および、該融合タンパク質を投与することによって疾患または障害を治療、予防または改善する方法を含む。本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、少なくとも治療タンパク質のフラグメントまたは変異体と、少なくとも改変トランスフェリンのフラグメントまたは変異体とを含み、それらは、好ましくは遺伝子融合（すなわち、治療タンパク質の全体または一部をコードするポリヌクレオチドが、改変トランスフェリンの全体または一部をコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結されている核酸の翻訳によって、トランスフェリン融合タンパク質が生じる）によって、あるいは相互の化学的コンジュゲート化によって相互に会合している。治療タンパク質およびトランスフェリンタンパク質は、トランスフェリン融合タンパク質の一部となったとき、トランスフェリン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」（例えば、「治療タンパク質部分」または「トランスフェリンタンパク質部分」）と言うことがある。
[0023] 一実施形態において、本発明は、治療タンパク質および改変された血清トランスフェリンタンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質、あるいは、治療タンパク質および改変された血清トランスフェリンタンパク質からなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療上活性なフラグメントと、改変された血清トランスフェリンタンパク質とを含むトランスフェリン融合タンパク質、あるいは、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療上活性なフラグメントと、改変された血清トランスフェリンタンパク質とからなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性な変異体および／または治療上活性な変異体と、改変された血清トランスフェリンタンパク質とを含むトランスフェリン融合タンパク質、あるいは、治療タンパク質の生物学的に活性な変異体および／または治療上活性な変異体と、改変された血清トランスフェリンタンパク質とからなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。更なる実施形態において、本発明は、治療タンパク質と、改変トランスフェリンの生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療上活性なフラグメントとを含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分は治療タンパク質の活性な形態である。
[0024] 別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または同等な方法および材料はどれも、本発明を実施または試験することにおいて使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。
定義
[0025] 本明細書中で使用される場合、トランスフェリン配列に「対応するアミノ酸」またはトランスフェリン配列における「等価なアミノ酸」は、第１のトランスフェリン配列と少なくとも第２のトランスフェリン配列との間における同一性または類似性を最大にするためのアラインメントによって同定される。第２のトランスフェリン配列における等価なアミノ酸を同定するために使用される数は、第１のトランスフェリン配列における対応するアミノ酸を同定するために使用される数に基づく。場合により、これらの表現は、ウサギの血清トランスフェリンにおける特定の残基と比較して、ヒトのトランスフェリンにおけるアミノ酸残基を記載するために使用されることがある。
[0026] 本明細書中で使用される用語「生物学的活性」は、生物学的環境において（すなわち、生物またはそのインビトロ複製環境において）治療用の分子またはタンパク質またはペプチドによって発揮される１つの機能または一組の活性を示す。生物学的活性には、特許請求の範囲に記載される融合タンパク質の治療分子部分の機能（これらに限定されない）を挙げることができ、例えば、限定されないが、応答性細胞株からの細胞外マトリックス分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、走化性の誘導、有糸分裂誘発の誘導、分化の誘導、または応答性細胞の細胞分裂の阻害などを挙げることができる。本発明の融合タンパク質または融合ペプチドは、治療タンパク質のその天然型対応体の１以上の生物学的活性を示すならば、生物学的に活性であると見なされる。
[0027] 本明細書中で使用される「結合剤」は、粘着特性を粉末化物に与えるために使用される薬剤である。結合剤、つまり、ときに知られている「造粒剤」は、粘着性を錠剤に与え、これにより、錠剤が圧縮成形の後も損なわれていないことが保証され、そしてまた、所望される硬さおよびサイズの顆粒の製剤化によって自由流動特性を改善することが保証される。結合剤として一般に使用されている物質には、デンプン；ゼラチン；スクロース、グルコース、デキストロース、糖蜜およびラクトースなどの糖；アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワル（ｐａｎｗａｒ）ゴム、ガッチ（ｇｈａｔｔｉ）ゴム、イサポル（ｉｓａｐｏｌ）皮の粘物質などの天然ゴムおよび合成ゴム；カルボキシメチルセルロース；メチルセルロース；ポリビニルピロリドン；Ｖｅｅｇｕｍ；微結晶セルロース；微結晶デキストロース；アミロース；カラマツのアラボガラクタンなどが含まれる。
[0028] 本明細書中で使用される用語「担体」は、組成物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビークルを示す。このような医薬用担体には、水およびオイルなどの無菌の液体を挙げることができ、石油、動物、植物または合成を起源とするオイルが含まれ、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。
[0029] 本明細書中で使用される「着色剤」は、より快い外見を錠剤に与え、そして更には、その調製時において製品を管理するために製造者を助け、また、製品を確認するために使用者を助ける薬剤である。承認されている保証された水溶性のＦＤ＆Ｃ色素、この混合物、またはそれらの対応するレーキはどれも、錠剤を着色するために使用することができる。有色レーキは、水溶性色素を重金属酸化物の水和物に吸着させ、色素の不溶性形態を生じさせることによる組合せである。
[0030] 本明細書中で使用される「希釈剤」は、製剤の体積を増大させて、錠剤を圧縮成形のための実用的なサイズにするために添加される不活性な物質である。一般に使用されている希釈剤には、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、粉糖およびシリカなどが含まれる。
[0031] 本明細書中で使用される「崩壊剤」（ｄｉｓｉｎｔｅｇｔｏｒまたはｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）は、投与後の錠剤の分解または崩壊を容易にする物質である。崩壊剤として使用されている物質は、化学的に分類すると、デンプン、粘土、セルロース、アルギンまたはゴムがある。他の崩壊剤には、Ｖｅｅｇｕｍ ＨＶ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材産物、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、アルギン酸、グアルゴム、柑橘類果肉、架橋ポリビニルピロリドンおよびカルボキシメチルセルロースなどが含まれる。
[0032] 用語「分散性」または用語「分散可能な」は、乾燥粉末が、約１０重量％（％ｗ）未満の水分含有量、通常は約５％ｗ未満の水分含有量、好ましくは約３％ｗ未満の水分含有量を有し、約１．０〜５．０μｍの質量メジアン直径（ＭＭＤ）の粒子サイズ、通常は１．０〜４．０μｍのＭＭＤの粒子サイズ、好ましくは１．０〜３．０μｍのＭＭＤの粒子サイズを有し、約３０％を越える送達用量、通常は４０％を越える送達用量、好ましくは５０％を越える送達用量、最も好ましくは６０％を越える送達用量を有し、かつ、１．０〜５．０μｍの質量メジアン空気力学的直径（ＭＭＡＤ）のエアロゾル粒子サイズ分布、通常は１．５〜４．５μｍのＭＭＡＤのエアロゾル粒子サイズ分布、好ましくは１．５〜４．０μｍのＭＭＡＤのエアロゾル粒子サイズ分布を有することを意味する。
[0033] 用語「乾燥（した）」は、粒子が、エアロゾルを形成させるために吸入デバイスにおいて容易に分散可能であるような水分含有量を組成物が有することを意味する。このような水分含有量は、一般には約１０重量％（％ｗ）未満であり、通常は約５％ｗ未満であり、好ましくは約３％ｗ未満である。
[0034] 本明細書中で使用される用語「有効量」は、何らかの医学的処置に伴う妥当な利益／リスク比で所望の局所的または全身的な効果および成績をもたらすために十分である、薬物または薬理学的に活性な薬剤の量を意味する。
[0035] 本明細書中で使用される「矯味矯臭剤」は、その化学的構造においてかなり異なっており、単純なエステル、アルコールおよびアルデヒドから、炭水化物および複雑な揮発油にまで及ぶ。現在では、ほとんど任意の所望されるタイプの合成香料を利用することができる。
[0036] 本明細書中で使用される用語「Ｔｆタンパク質のフラグメント」または用語「Ｔｆタンパク質」または用語「Ｔｆタンパク質の部分」は、天然に存在するＴｆタンパク質またはその変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列を示す。
[0037] 本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連する任意のＤＮＡセグメントを示す。したがって、遺伝子には、コード配列、および／またはその発現のために必要な調節配列が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含むことができる。遺伝子は、目的とする供給源からクローン化すること、または既知の配列情報もしくは予測された配列情報から合成することを含めて、様々な供給源から得ることができ、そして所望するパラメーターを有するように設計された配列を含むことがある。
[0038] 本明細書中で使用される「異種のポリヌクレオチド」または「異種の核酸」または「異種の遺伝子」または「異種の配列」または「外因性のＤＮＡセグメント」は、特定の宿主細胞に対して外来である供給源に由来するポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを示し、あるいは、同じ供給源に由来する場合、その元来の形態から改変されている。宿主細胞における異種の遺伝子には、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、改変されている遺伝子が含まれる。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメントを示すか、または、細胞に対して相同的であるが、その要素が通常の場合には見出されない宿主細胞の核酸の内部の位置にあるＤＮＡセグメントを示す。一例を挙げるならば、酵母細胞に対して生来的シグナル配列がヒトＴｆ配列に結合すると、それは異種である。
[0039] 本明細書中で使用される「単離された」核酸配列は、他の核酸配列を本質的には含まない核酸配列を示し、例えば、アガロースゲル電気泳動によって測定されたとき、少なくとも約２０％純粋（好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは約６０％純粋、更により好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、更に最も好ましくは約９５％純粋）である核酸配列を示す。例えば、単離された核酸配列は、核酸配列を、その天然の存在位置から、その核酸配列が再生産される異なる部位に再配置するための遺伝子工学において使用される標準的なクローニング手法によって得ることができる。このようなクローニング手法では、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望する核酸フラグメントの切り出しおよび単離、ベクター分子へのフラグメントの挿入、ならびに核酸配列の多数のコピーまたはクローンが複製される宿主細胞内への組換えベクターの取り込みが伴い得る。核酸配列は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ＲＮＡ起源、半合成起源、合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
[0040] 本明細書中で使用される場合、２つ以上のＤＮＡコード配列は、それらのＤＮＡコード配列の間におけるインフレーム融合の結果として、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳されるとき、「連結」または「融合」されていると言われる。Ｔｆ融合体に関する用語「融合」には、少なくとも１つの治療用のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをＴｆのＮ末端に結合すること、ＴｆのＣ末端に結合すること、および／またはＴｆ内において任意の２つのアミノ酸の間に挿入することが含まれるが、これらに限定されない。
[0041] 本明細書中で使用される「滑沢剤」は、錠剤造粒の流れ速度を改善すること、鋳型およびパンチの表面に対する錠剤物質の接着を防止すること、粒子間の摩擦を低下させること、そして、鋳型の穴からの錠剤の排出を促進することなどの、錠剤製造において多数の機能を果たす物質である。一般に使用されている滑沢剤には、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸および硬化植物油が含まれる。滑沢剤の典型的な量は約０．１重量％〜約５重量％の範囲である。
[0042] 本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用される「改変（された）トランスフェリン」は、野生型トランスフェリンと比較して、そのアミノ酸配列の少なくとも１つの改変を示すトランスフェリン分子を示す。
[0043] 本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用される「改変トランスフェリン融合タンパク質」は、改変されたトランスフェリンの少なくとも１分子（またはそのフラグメントもしくは変異体）を治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１分子に融合することによって形成されるタンパク質を示す。
[0044] 本明細書中で使用される用語「核酸」または用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかでのデキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを示す。具体的に限定されない限り、これらの用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログを含有する核酸を含む。別途示されない限り、ある特定の核酸配列ではまた、言うまでもなく、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドンの置換）、および相補的な配列が、明示的に示される配列と同様に含まれる。具体的には、縮重コドンの置換は、１つ以上の選択されたコドン（またはすべてのコドン）の３番目の位置が混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１〜９８）。核酸の用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
[0045] 本明細書中で使用されるＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的な関係に置かれているとき、「機能的に連結されている」と言う。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に連結されている。一方、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターまたはエンハンサーにより配列の転写が刺激される場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されているＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列または融合タンパク質の場合には、両者は連続し、かつ読み取り相が一致している。しかしながら、エンハンサーは、その転写がエンハンサーによって制御されるコード配列と連続している必要はない。これに関連して、連結は、都合のよい制限部位における連結によって、またはその代わりに挿入されているアダプターもしくはリンカーにおける連結によって達成される。
[0046] 本明細書中で使用される「医薬的に許容され得る」は、ヒトに投与されたとき、生理学的に耐えることができ、アレルギー反応または類似する不都合な反応（例えば、胃の不調や眩暈など）を典型的には生じさせない材料および組成物を示す。典型的には、本明細書中で使用される用語「医薬的に許容され得る」は、動物における使用について、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されていること、あるいは、米国薬局方または一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。
[0047] 本明細書中で使用される「生理学的に有効な量」は、所望される緩和効果または治療効果をもたらすために被験者に送達される量である。この量は、それぞれの薬物およびその最大承認投薬量レベルについて特有である。
[0048] 本明細書中で使用される用語「粉末」は、自由に流れ、かつ、吸入デバイスにおいて容易に分散され、続いて被験者によって吸引され、その結果、粒子が肺に到達して、肺胞内への浸透を可能にすることができる、細かく分散された固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、粉末は「呼吸可能」であると言われる。好ましくは、平均粒子サイズは、直径が約１０ミクロン（μｍ）未満であり、比較的均一な回転楕円体形状の分布を有する。より好ましくは、直径は約７．５μｍ未満であり、最も好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒子サイズ分布は直径が約０．１μｍ〜約５μｍの間であり、特に約０．３μｍ〜約５μｍである。
[0049] 本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して、転写を開始させることに関与するＤＮＡ領域を示す。
[0050] 本明細書中で使用される用語「組換え」は、遺伝子またはＤＮＡの新しい組合せによる形質転換を受けている細胞または組織または生物を示す。
[0051] 本明細書中で使用される用語「被験者」は、ヒト、哺乳動物または動物であり得る。治療されている被験者は、治療を必要としている患者である。
[0052] 本明細書中で使用される場合、標的物、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、特定の細胞タイプ［正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、ガン細胞）］に特異的に結合する分子を示し、したがって、Ｔｆ融合タンパク質または化合物（薬物または細胞傷害性薬剤）をその細胞タイプに特異的に標的化するために使用することができる。
[0053] 本明細書中で使用される「錠剤」は、適切な希釈剤を伴って、あるいは伴うことなく、薬物物質を含有し、当分野で周知の圧縮成形法または型成形法のいずれかによって調製される固体の医薬製剤の形態である。錠剤は１９世紀後半から広く使用されており、その人気は続いている。錠剤は、製造者にもたらされる利点（例えば、調製の簡便性および経済性、安定性、ならびに、パッケージング、運搬および分配における利便性）と、患者にもたらされる利点（例えば、投薬量の正確性、コンパクトであること、持ち運び可能であること、刺激的な味覚がないこと、および、投与が容易であること）との両方のために、製剤形態として依然人気を保っている。錠剤は形状が円盤状であることが非常に多いが、丸形、卵形、長円形、円筒形または三角形もまた可能である。錠剤は、存在する薬物物質の量および意図される投与方法に依存して、サイズおよび重量が非常に異なり得る。錠剤は下記の２つの一般的なクラスに分けられる：（１）圧縮成形錠剤および（２）型成形錠剤または錠剤粉砕物である。有効成分または治療用成分に加えて、錠剤は多数の不活性な物質または添加剤を含有する。このような添加剤の第１の群には、満足すべき圧縮成形特性を製剤に与えることを助けるこのような物質が含まれ、これには、希釈剤、結合剤および滑沢剤が含まれる。このような添加剤の第２の群は、更なる所望の物理的特性を仕上がった錠剤に与えることを助け、例えば、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤および甘味剤などである。
[0054] 本明細書中で使用される用語「治療上有効な量」は、それを必要とする被験者に投与されたとき、治療を達成するために十分な、治療分子を含むトランスフェリン融合タンパク質の量を示す。「治療上有効な量」を構成するトランスフェリン融合タンパク質の量は、使用される治療タンパク質、状態または疾患の重篤度、ならびに、治療される被験者の年齢および体重に依存して変化するが、自身の知識および本開示を考慮して当業者によって定法にしたがって決定することができる。
[0055] 本明細書中で使用される「治療タンパク質」は、１種以上の治療活性および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を示す。本発明に含まれる治療タンパク質には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体および生物製剤が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド、タンパク質およびポリペプチドのこれらの用語は本明細書中では交換可能に使用される。また、用語「治療タンパク質」は治療タンパク質の内因性相関体または天然に存在する相関体を示す場合がある。「治療活性」を示すポリペプチド、または「治療上活性」であるタンパク質により、例えば、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当分野で既知の治療タンパク質の１以上などの治療タンパク質に関連する１以上の既知の生物学的活性および／または治療活性を有するポリペプチドが意味される。非限定的な一例として、「治療タンパク質」は、疾患、状態または障害を治療、予防または改善するために有用であるタンパク質である。このような疾患、状態または障害はヒトに存在し得るか、または非ヒト動物に存在し得る（例えば、獣医学的使用）。
[0056] 本明細書中で使用される用語「毒素」は生物学的起源の有毒物質である。
[0057] 本明細書中で使用される用語「形質転換」は、細胞内への核酸（すなわち、ヌクレオチドポリマー）の移行を示す。本明細書中で使用される用語「遺伝的形質転換」は、細胞内へのＤＮＡ（特に、組換えＤＮＡ）の移行および取り込みを示す。
[0058] 本明細書中で使用される用語「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を示す。
[0059] 本明細書中で使用される用語「導入遺伝子」は、その機能を保証する様式で生物、宿主細胞またはベクターに挿入される核酸を示す。
[0060] 本明細書中で使用される用語「遺伝子組換えの」は、形質転換の様々な方法のいずれかによって、外来遺伝子または改変された遺伝子、具体的には、改変Ｔｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け取っている細胞、細胞培養物、生物、細菌、菌類、動物、植物および上記のいずれかの子孫を示す。この場合、外来遺伝子または改変された遺伝子は、外来遺伝子または改変された遺伝子を受け取っている生物の種と同じ種または異なる種に由来する。
[0061] 「変異体」は、参照核酸または参照ポリペプチドとは異なるが、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を示す。一般に、変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において参照核酸または参照ポリペプチドと同一である。本明細書中で使用される「変異体」は、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分であって、本来の治療タンパク質とは配列が異なるが、本明細書中に別記されるか、またはそうでない場合には当分野で既知である少なくとも１つのその機能的性質および／または治療的性質を保持している部分を言う。
[0062] 本明細書中で使用される用語「ベクター」は、広義には、外因性の核酸をコードする任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを示す。この用語はまた、ビリオン内または細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド化合物、非ファージミド化合物および非ウイルス化合物、例えば、ポリリシン化合物などを含むように解釈される。ベクターは、核酸またはその変異体を細胞に送達するための運搬体として好適であるウイルスベクターであり得るか、あるいは、ベクターは、同じ目的のために好適である非ウイルスベクターであり得る。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの様々な例が、当分野では十分に知られており、例えば、Ｍａら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２７４４〜１２７４６）に記載される。ウイルスベクターの例には、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルス（これらに限定されない）などが含まれる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：３０５７〜３０６３；国際公開公報第９４／１７８１０号（１９９４年８月１８日公開）；国際公開公報第９４／２３７４４号（１９９４年１０月２７日公開））。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。
[0063] 本明細書中で使用される用語「野生型」は、天然に存在するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示す。
トランスフェリンおよびトランスフェリン改変体
[0064] 本発明は、治療タンパク質または可溶性毒素受容体フラグメントと、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンとを含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明によって提供される治療タンパク質には、β−ＩＦＮ、ＧＬＰ−１、ＥＭＰ１およびＴ−２０が含まれる。好ましくは、可溶性毒素受容体フラグメントはシナプトタグミン１のアミノ酸１〜５３（配列番号４）である。任意のトランスフェリンを、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を作製するために使用することができる。
[0065] 任意のトランスフェリンを、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を作製するために使用することができる。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａ（グリコシル化を含めない）である６７９アミノ酸のタンパク質であり、遺伝子重複に由来すると考えられる２つの主要なドメイン、すなわち、Ｎドメイン（約３３０アミノ酸）およびＣドメイン（約３４０アミノ酸）を有する。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１０６３、同ＸＭ＿００２７９３、同Ｍ１２５３０、同ＸＭ＿０３９８４５、同ＸＭ＿０３９８４７および同Ｓ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）（これらはすべて、その全体を参照として本明細書中に組み入れる）、ならびに配列番号１、配列番号２および配列番号３を参照されたい。これらの２つのドメインは、時間の経過とともに異なってきているが、大きな程度の同一性／類似性を保持している（図１）。
[0066] ＮドメインおよびＣドメインはそれぞれが、更に２つのサブドメインに、すなわち、Ｎ１およびＮ２に、そしてＣ１およびＣ２に分けられる。Ｔｆの機能は、鉄を身体の細胞に輸送することである。このプロセスは、すべての細胞（特に、活発に成長している細胞）で発現するＴｆ受容体（ＴｆＲ）によって媒介される。ＴｆＲはＴｆの鉄結合型形態（１つの受容体あたり、その２分子が結合する）を認識し、その後、エンドサイトーシスが起こり、それにより、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、エンドソームにおいて、ｐＨの局所的な低下により、結合している鉄の放出がもたらされ、そして細胞表面へのＴｆＲ／Ｔｆ複合体の再循環、および（その鉄非結合型形態でのアポＴｆとして知られる）Ｔｆの放出がもたらされる。受容体の結合はＴｆのＣドメインを介して生じる。グリコシル化されていない鉄結合型Ｔｆは受容体と結合するので、Ｃドメインにおける２つのグリコシル化部位は、受容体の結合には関与していないようである。
[0067] 各Ｔｆ分子は２つの鉄イオン（Ｆｅ３＋）を運搬することができる。これらは、Ｎ１およびＮ２のサブドメインの間の空間ならびにＣ１およびＣ２のサブドメインの間の空間において複合体化され、分子の立体配座的変化をもたらしている。Ｔｆは、Ｔｆ受容体を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を越える。
[0068] ヒトトランスフェリンにおいて、鉄結合部位は、少なくとも、配列番号３のＡｓｐ６３（生来的なＴｆシグナル配列を含む配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４またはＴｙｒ５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）のアミノ酸から構成される。ヒンジ領域は、少なくとも、配列番号３のＮドメインのアミノ酸残基９４〜９６、アミノ酸残基２４５〜２４７および／またはアミノ酸残基３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、アミノ酸残基５８１〜５８２および／またはアミノ酸残基６５２〜６５８から構成される。炭酸イオン結合部位が、少なくとも、配列番号３のＴｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）のアミノ酸から構成される。
[0069] 本発明の一実施形態において、改変トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたヒトトランスフェリンを含む。しかし、任意の動物のＴｆ分子を、本発明の融合タンパク質を製造するために使用することができ、これには、ヒトＴｆ変異体、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、ならびに、ウシ、イヌおよびトリの他の種が含まれる。これらのＴｆ配列はすべてが、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の公開されているデータベースにおいて容易に得ることができる。ヒトＴｆヌクレオチド配列を得ることができ（配列番号１、配列番号２および配列番号３、ならびに、上記に記載され、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において利用することができるアクセション番号を参照されたい）、これを使用して、ＴｆまたはＴｆのドメインと選ばれた治療分子との間での遺伝子融合体を作製することができる。融合体はまた、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＮＭ＿００２３４３）またはメラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＮＭ＿０１３９００、マウスのメラノトランスフェリン）などの関連した分子からも作製することができる。
[0070] メラノトランスフェリンは、悪性メラノーマ細胞において高レベルで見出されるグリコシル化されたタンパク質であり、最初はヒトメラノーマ抗原ｐ９７と名付けられていた（Ｂｒｏｗｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３）。メラノトランスフェリンは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリンおよびトリトランスフェリンとの高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３；Ｒｏｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６、８３：１２６１〜１２６５）。しかしながら、これらの受容体とは異なり、細胞受容体はメラノトランスフェリンについては同定されていない。メラノトランスフェリンは鉄と可逆的に結合し、また、２つの形態で存在し、その一方がグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜に結合し、もう一方の形態は可溶性であり、かつ活発に分泌される（Ｂａｋｅｒら、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２９８：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙら、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２；Ｆｏｏｄら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：７０１１〜７０１７）。
[0071] ラクトフェリン（Ｌｆ）は、天然の鉄結合性防御タンパク質であり、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、抗新生物活性および抗炎症活性を有することが見出されている。このタンパク質は、正常なフローラに一般に曝される外分泌性分泌物、すなわち、乳汁、涙、鼻腔浸出液、唾液、気管支粘液、胃腸液、頸膣粘液および精液に存在する。また、Ｌｆは、循環している多形核好中球（ＰＭＮ）の二次的な特異的顆粒の主要な構成成分である。アポタンパク質が、敗血領域におけるＰＭＮの脱顆粒のときに放出される。Ｌｆの主要な機能は、体液および炎症領域における遊離の鉄を除去し、その結果、フリーラジカルにより媒介される損傷を抑制し、侵入中の微生物細胞および新生物細胞に対する金属の利用性を低下させるという機能である。成体における１２５Ｉ−Ｌｆの代謝回転速度を調べた研究において、Ｌｆが肝臓および脾臓によって迅速に取り込まれ、放射能が肝臓および脾臓に数週間にわたって持続したことが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９７９）、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）、５７：４５３〜４６０）。
[0072] 一実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分はトランスフェリンのスプライスバリアントを含む。一例において、トランスフェリンのスプライスバリアントはヒトトランスフェリンのスプライスバリアントであり得る。具体的な一実施形態において、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアントは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６１１４０のスプライスバリアントであり得る。
[0073] 別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分はラクトフェリンのスプライスバリアントを含む。一例において、ヒト血清ラクトフェリンのスプライスバリアントは好中球ラクトフェリンの新規なスプライスバリアントであり得る。具体的な一実施形態において、好中球ラクトフェリンのスプライスバリアントはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ５９４７９のスプライスバリアントであり得る。別の具体的な実施形態において、好中球ラクトフェリンのスプライスバリアントは、新規なスプライス−バリアンス領域を含む下記のアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号８）を含むことができる。
[0074] 別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分はメラノトランスフェリンの変異体を含む。
[0075] 改変Ｔｆ融合体は、任意のＴｆタンパク質、フラグメント、ドメイン、または操作されたドメインを用いて作製することができる。例えば、融合タンパク質を、全長のＴｆ配列を使用して製造することができ、これは本来のＴｆシグナル配列を有しても有していなくてもよい。Ｔｆ融合タンパク質はまた、単一のＴｆドメインを使用して、例えば、個々のＮドメインもしくはＣドメイン、または、２つのＮドメインもしくは２つのＣドメインを含む改変された形態のＴｆなどを使用して作製することができる（米国仮特許出願第６０／４０６，９７７号（２００２年８月３０日出願）を参照されたい。これをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）。いくつかの実施形態において、単一のＣドメインに対する治療タンパク質の融合体を製造することができ、この場合、Ｃドメインは、グリコシル化の低下または阻害または防止がもたらされるように変化している。他の実施形態では、Ｔｆのグリコシル化部位がＣドメインおよびＮドメインに存在するので、単一のＮドメインの使用が単独で好都合である。好ましい実施形態は、高レベルで発現する、Ｎドメインを１つだけ有するＴｆ融合タンパク質である。
[0076] 本発明において使用されるように、Ｎ様ドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたは葉部（ｌｏｂｅ）は、天然型または野生型のＮドメインまたは葉部のグリコシル化パターンまたは鉄結合特性と実質的に類似するグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変されている。好ましい実施形態において、Ｃドメインまたは葉部は、関係するＣドメインの領域またはアミノ酸を、天然型または野生型のＮドメインの対応する領域または部位に存在する領域またはアミノ酸に置換することによってグリコシル化および鉄との結合が生じないように改変される。
[0077] 本発明において使用されるように、「２つのＮドメインまたは葉部」を含むＴｆ成分には、生来的なＣドメインまたは葉部を天然型もしくは野生型のＮドメインもしくは葉部または改変されたＮドメインもしくは葉部で置き換えるために改変されるＴｆ分子、あるいは、野生型Ｎドメインまたは改変されているＮドメインと実質的に類似するように機能するために改変されているＣドメインを含有するＴｆ分子が含まれる。
[0078] ２つのドメインを重ねること（Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ３．７ｂ２、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍａｇｉｃ Ｆｉｔ）および直接的なアミノ酸アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメント）による２つのドメインの分析により、これらの２つのドメインが時間とともに分岐してきたことが明らかにされる。アミノ酸アラインメントでは、４２％の同一性および５９％の類似性が２つのドメインの間に示される。しかしながら、Ｎドメインの約８０％が構造的等価性のためにＣドメインと一致する。Ｃドメインはまた、Ｎドメインと比較して、更に数個のジスルフィド結合を有する。
[0079] ＮドメインおよびＣドメインに対する分子モデルのアラインメントにより、下記の構造的等価が明らかにされる：
Figure 2006503588
２つのドメインに対するジスルフィド結合が下記のようにアラインメントされる：
Figure 2006503588
[0080] 一実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分はトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を含む。更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を含む。
[0081] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８およびＨｉｓ２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基における変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を含むか、または、このような変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を備えるか、または、このような変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部からなる。
[0082] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６およびＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリンＮ末端葉部変異体を含む。
[0083] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含むか、または、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を備えるか、または、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部からなる。更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含む。
[0084] 更なる実施形態において、Ｃ末端葉部変異体は更に、グリコシル化されない、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも１つの変異を含む。
[0085] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属と結合する能力を保持している。代替の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属と結合する能力が低下している。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属と結合する能力を保持しておらず、Ｎドメインと実質的に類似する機能を有する。
[0086] いくつかの実施形態において、ＴｆまたはＴｆ部分は、非融合状態の治療タンパク質または治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体のインビボ循環半減期、血清安定性、インビトロ溶液安定性またはバイオアベイラビリティと比較して、治療タンパク質または治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体のインビボ循環半減期、血清安定性、インビトロ溶液安定性またはバイオアベイラビリティを増大させるために十分な長さである。安定性または血清半減期またはバイオアベイラビリティのこのような増大は、融合されていない治療タンパク質または治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体を上回る、約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の増大であり得る。場合により、改変されたトランスフェリンを含むトランスフェリン融合タンパク質は、約１０〜２０日もしくはそれ以上、約１２〜１８日または約１４〜１７日の血清半減期を示す。
[0087] ＴｆのＣドメインが融合タンパク質の一部であるとき、２つのＮ結合型グリコシル化部位（配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基）を、グリコシル化または過マンノシル化を妨げ、融合タンパク質および／または治療タンパク質の血清半減期を延ばすために、酵母システムにおける発現のために変異させることができ（これにより、アシアロ−Ｔｆ、または場合によりモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆを製造することができ）る。Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆのアミノ酸に加えて、グリコシル化を妨げるか、または実質的に低下させるために、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に対して変異を行うことができる。米国特許第５，９８６，０６７号（Ｆｕｎｋら）を参照されたい。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させたＴｆのＮドメインは、Ｓ３２において１つだけのヘキソースによるＯ結合型グリコシル化を受けることもまた報告されており、この部位もまた、このようなグリコシル化を妨げるために変異または改変することができる。
[0088] したがって、本発明の一実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリンが、低下したグリコシル化を示す改変されたトランスフェリン分子を含み、このような分子には、限定されないが、Ｔｆのアシアロ形態、モノシアロ形態およびジシアロ形態が含まれる。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるために変異させられている組換えトランスフェリン変異体を含む。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化されている組換えトランスフェリン変異体を含む。更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるために変異させられている組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも１つが、グリコシル化されないアミノ酸に変異している。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるか、または実質的に低下させるために変異させられている組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に対して変異が行われ得る。その上、グリコシル化は、このセリン残基またはトレオニン残基を変異させることによって低下または防止することができる。更に、グリコシル化を阻害するために、Ｘをプロリンに変化させることが既知である。
[0089] 以下に詳しく論じるように、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質はまた、鉄と結合しないように、かつ／またはＴｆ受容体と結合しないように操作することができる。本発明の他の実施形態において、鉄の結合は保持されており、また、Ｔｆの鉄結合能を、上皮もしくは内皮の細胞膜を越え、かつ／またはＢＢＢを越えて治療タンパク質または治療ペプチドを細胞の内部に送達するために使用することができる。鉄および／またはＴｆ受容体と結合するこれらの実施形態では、多くの場合、グリコシル化を低下させ、またはグリコシル化を妨げて、治療タンパク質の血清半減期を延ばすために操作される。Ｎドメインは単独では、鉄が負荷されたとき、ＴｆＲに結合せず、鉄と結合したＣドメインはＴｆＲと結合するが、その親和性は完全な分子とは同じではない。
[0090] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持していない。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
[0091] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持していない。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
[0092] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに結合する能力を保持していない。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
[0093] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持している。別の実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体であり、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体であり、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持していない。
[0094] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する（米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい。これをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は金属イオンと結合しない。
[0095] 利用可能な技術はいずれも、本発明の融合タンパク質を作製するために使用することができ、これには限定されないが、一般に利用可能な様々な分子技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に開示される技術が含まれる。当分野で周知の、部位特異的変異誘発を達成するための技術を使用してヌクレオチド置換を行うとき、コードされるアミノ酸の変化は、好ましくは、影響が大きくないものであり、すなわち、保存的アミノ酸置換である。しかし、非保存的な他の置換もまた、Ｔｆ融合タンパク質の改変されたトランスフェリン部分を製造するときには特に、例えば、低下したグリコシル化、低下した鉄の結合などを示す改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するときには考えられる。特に考えられるのは、典型的には、１アミノ酸〜約３０アミノ酸のアミノ酸置換、小さい欠失または挿入；トランスフェリンドメイン間での挿入；小さいアミノ末端伸長またはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、あるいは、トランスフェリンドメイン間に存在するか、またはトランスフェリンタンパク質および治療タンパク質もしくは治療ペプチドもしくは可溶性毒素受容体を連結する、５０残基未満、４０残基未満、３０残基未満、２０残基未満または１０残基未満の小さいリンカーペプチドなど、あるいは、精製を容易にする小さい伸長（例えば、ポリヒスチジン部分、抗原性エピトープまたは結合性ドメインなど）である。
[0096] 保存的アミノ酸置換の例は、同じグループの中で行われる置換であり、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジンなど）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸など）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギンなど）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど）、および小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンなど）のグループ内で行われる置換である。
[0097] 非保存的な置換には、１つのグループにおけるアミノ酸を別のグループにおけるアミノ酸によって置換することが含まれる。例えば、非保存的な置換には、疎水性アミノ酸を極性アミノ酸に置換することが含まれる。ヌクレオチド置換の一般的な記載については、例えば、Ｆｏｒｄら（１９９１）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．、２：９５〜１０７を参照されたい。非保存的な置換、欠失および挿入は、鉄の結合を全く示さないか、もしくは低下した鉄の結合を示し、かつ／またはＴｆ受容体に対する融合タンパク質の結合を全く示さないか、もしくはＴｆ受容体に対する融合タンパク質の低下した結合を示し、かつ／またはグリコシル化を全く示さないか、もしくは低下したグリコシル化を示す本発明のＴｆ融合タンパク質を製造するために特に有用である。
[0098] 鉄の結合および／または受容体の結合を、ＴｆのＮドメインの残基（配列番号３のＡｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９）および／またはＣドメインの残基（配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／またはＨｉｓ５８５）の１個以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。鉄の結合はまた、配列番号３のＬｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２のアミノ酸に対する変異によって影響を受けることがある。炭酸イオンの結合は、ＴｆのＮドメインの残基（配列番号３のＴｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７）および／またはＣドメインの残基（配列番号３のＴｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／またはＧｌｙ４５９）の１個以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。炭酸イオンの結合の低下または破壊は鉄および／または受容体の結合に悪影響を及ぼし得る。
[0099] Ｔｆ受容体に対する結合を、鉄の結合について上に記載したＴｆのＮドメインの残基の１個以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。
[00100] 先に論じたように、グルコシル化を、Ｃドメインの残基（Ｎ４１３および／またはＮ６１１）に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位付近のＴｆのＣドメインの残基の１個以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または防止することができる（米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい）。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１をＧｌｕ残基に変異させることができる。
[00101] 本発明のＴｆ融合タンパク質が、グリコシル化、鉄の結合、炭酸イオンの結合および／または受容体の結合を妨げるために改変されていない場合、グリコシル化、鉄イオンおよび／または炭酸イオンを融合タンパク質から取り去ることができ、または融合タンパク質から取り除くことができる。例えば、入手可能なデグリコシラーゼを、融合タンパク質からグリコシル化残基（特に、Ｔｆ部分に結合している糖残基）を切断するために使用することができ、かつ／またはグリコシル化酵素欠損酵母を、グリコシル化を妨げるために使用することができ、かつ／または組換え細胞を、グリコシル化を妨げる薬剤（例えば、ツニカマイシン）の存在下で増殖させることができる。
[00102] 融合タンパク質における糖もまた、融合タンパク質をデグリコシラーゼで処理することによって酵素的に低下または完全に除去することができる。様々なデグリコシラーゼが当分野では周知である。デグリコシラーゼの例には、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼおよびＥｎｄｏＨデグリコシラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
[00103] ところが、ある状況では、融合タンパク質のＴｆ部分が完全にグリコシル化されることは経口送達のために好ましい場合がある。
[00104] 更なる変異を、Ｔｆの三次元構造を変化させるためにＴｆに関して行うことができ、例えば、鉄の結合およびＴｆ受容体の認識のために必要とされる立体配座変化を妨げるためのヒンジ領域に対する改変などを行うことができる。例えば、変異を、Ｎドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８において、あるいはそれらの近くにおいて行うことができる。また、変異を、Ｔｆの構造および機能を変化させるためにこれらの部位の隣接領域またはその近くにおいて行うことができる。
[00105] 本発明の１つの態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、治療タンパク質の半減期またはバイオアベイラビリティを延ばすためのキャリアタンパク質として、ならびに、場合により、細胞の内部に、かつ／または血液脳関門を越えて治療タンパク質を送達するキャリアタンパク質として機能し得る。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、血液脳関門を越える能力をトランスフェリンが保持していない改変されたトランスフェリン分子を含む。
[00106] 別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して治療ペプチドを細胞の内部に輸送する能力を保持している。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して治療ペプチドを細胞の内部に輸送する能力を保持していない。
[00107] 更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して治療ペプチドを細胞の内部に輸送する能力を保持し、また、血液脳関門を越える能力を保持している。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、血液脳関門を越える能力を保持するが、トランスフェリン受容体に結合して治療ペプチドを細胞の内部に輸送する能力を保持していない。
改変トランスフェリン融合タンパク質
[00108] 本発明のタンパク質の融合は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に結合した１コピー以上の治療タンパク質または治療ポリペプチドまたは可溶性毒素受容体を含有することができる。いくつかの実施形態において、治療タンパク質または治療ポリペプチドまたは可溶性毒素受容体はＴｆタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に結合させられ、融合タンパク質は治療タンパク質または治療ポリペプチドの１つ以上の等価体をＴｆのいずれかの末端または両末端に含有することができる。他の実施形態において、治療タンパク質または治療ポリペプチドは、Ｔｆタンパク質の既知のドメインの中に、例えば、Ｔｆのループの１つ以上の中に挿入される（Ａｌｉら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３を参照されたい）。実際、治療タンパク質または治療ポリペプチドは、治療タンパク質が結合する抗原または受容体または標的化分子に対する増大した結合力を有する五価分子を作製するために、トランスフェリンの５つのループのすべてに挿入することができる。他の実施形態において、治療タンパク質または治療ポリペプチドはＴｆのＮドメインとＣドメインとの間に挿入される。あるいは、治療タンパク質または治療ポリペプチドは、トランスフェリン分子のどこにでも挿入される。
[00109] 一般に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、１つの改変トランスフェリン由来領域と、１つの治療タンパク質領域とを有し得る。しかしながら、それぞれのタンパク質の多数の領域を、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができる。同様に、２つ以上の治療タンパク質を、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができ、それにより、多機能性の改変Ｔｆ融合タンパク質が製造される。
[00110] 一実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子またはその一部に融合された治療タンパク質または治療ポリペプチドまたはその一部あるいは可溶性毒素受容体を含有する。別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＮ末端に融合された治療タンパク質または治療ポリペプチドを含有する。別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＣ末端に融合された治療タンパク質または治療ポリペプチドを含有する。更なる実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、治療タンパク質または治療ポリペプチドのＮ末端に融合されたトランスフェリン分子を含有する。別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、治療タンパク質または治療ポリペプチドのＣ末端に融合されたトランスフェリン分子を含有する。
[00111] 別の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、改変されたトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合された治療タンパク質を含有する。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された治療タンパク質は同じ治療タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された治療タンパク質は異なる治療タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端に融合された治療タンパク質は、同じ疾患または障害または状態を治療または予防するために使用され得る異なる治療タンパク質である。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された治療タンパク質は、患者において同時によく生じることが当分野で既知の疾患または障害を治療または予防するために使用され得る異なる治療タンパク質である。
[00112] 改変トランスフェリン部分が治療タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されている本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質に加えて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、目的とする治療タンパク質または治療ポリペプチド（例えば、本明細書中に開示されるような治療タンパク質または治療ペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体）を改変されたトランスフェリンの内部領域に挿入することによって製造することができる。改変されたトランスフェリンの内部領域には、鉄結合部位、ヒンジ領域、重炭酸イオン結合部位、または受容体結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
[00113] 改変トランスフェリン分子のタンパク質配列の内部には、ジスルフィド結合によって安定化される多数のループまたはターンが存在する。これらのループは、特異的な生物学的活性を有する改変トランスフェリン分子を作製するための、治療上活性なペプチド（特に、機能的であるために二次構造を要求するペプチド）または治療タンパク質の挿入または内部融合のために有用である。
[00114] 治療タンパク質がＴｆ分子の少なくとも１つのループに挿入されるか、または、治療タンパク質により、Ｔｆ分子の少なくとも１つのループが置き換えられるとき、挿入は、Ｔｆの他の領域に加えて、表面に露出したループ領域のいずれかにおいて行うことができる。例えば、挿入を、Ｔｆのアミノ酸３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０および２８８〜２８９を含む各ループにおいて行うことができる（Ａｌｉら、上記）（図３参照）。上述したように、挿入はまた、以下でより詳しく述べるように、鉄および重炭酸イオンが結合するための部位、ヒンジ領域、ならびに受容体結合ドメインなどのＴｆの他の領域において行うことができる。タンパク質またはペプチドを挿入するために改変／置換が容易であるＴｆタンパク質配列内のループもまた、ランダムペプチド挿入体のスクリーニング可能なライブラリーを開発するために使用することができる。任意の手法を使用して、利用可能なファージディスプレーシステムおよびバクテリアディスプレーシステムを含むペプチドライブラリーを作製するための核酸挿入体を製造することができ、その後、Ｔｆドメインへのクローニングおよび／またはＴｆの両端への融合を行うことができる。
[00115] ＴｆのＮ末端は分子の本体に拘束されておらず、分子の本体から離れるように向いている。したがって、Ｎ末端におけるタンパク質またはペプチドの融合は好ましい実施形態であり得る。このような融合体は、治療タンパク質をＴｆから隔てるために、ポリグリシンストレッチ（これに限定されない）などのリンカー領域を含むことができる。リーダー配列との間の接合、リーダー配列の選択、およびコドン操作／最適化によるｍＲＮＡの構造（リボソームの進行を阻害する大きなステムループが存在しないこと）に対する注意は、分泌を増大させ、そして標準的な組換えタンパク質技術を使用して容易に達成することができる。
[00116] ＴｆのＣ末端は、より多くが埋没し、また、ジスルフィド結合の６アミノ酸によりＣ末端から固定されているようである。ヒトＴｆにおいて、Ｃ末端アミノ酸はプロリンであり、このプロリンは、ヒトＴｆが配向する経路に依存して、融合体を分子の本体から離れるように向かわせるか、または分子の本体の中に向かわせるかのいずれかである。Ｃ末端におけるリンカー成分またはスペーサー成分を本発明のいくつかの実施形態において使用することができる。Ｎ末端の近くにもまたプロリンが存在する。本発明の１つの態様において、Ｎ末端および／またはＣ末端におけるプロリンは変化させられ、除くことができる。本発明の別の態様において、Ｃ末端のジスルフィド結合は、Ｃ末端を自由にするために除去することができる。
[00117] 更に別の実施形態において、小分子の治療剤を、細胞の内部への送達およびＢＢＢを越える送達のために、鉄と複合体化させて、改変Ｔｆ融合タンパク質に負荷することができる。標的化ペプチド、または例えば、一本鎖抗体（ＳＣＡ）の付加を使用して、負荷物を特定の細胞タイプ（例えば、ガン細胞）に対して標的化することができる。
治療タンパク質および治療ペプチド
[00118] 任意の治療分子を、本発明の方法および組成物にしたがってＴｆに対する融合パートナーとして使用することができる。本発明において使用されるように、治療分子は、典型的には、有益な生物学的効果をインビトロまたはインビボで発揮することができるタンパク質またはペプチドであり、これには、正常な恒常性、生理学または疾患状態に関連する有益な作用を発揮するタンパク質またはペプチドが含まれる。治療分子には、マーカーまたはタンパク質精製補助剤（例えば、細菌のガラクトシダーゼなど）として一般に使用されている融合パートナーは含まれない（例えば、米国特許第５，９８６，０６７号；Ａｌｄｒｅｄら（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２２：９６０〜９６５を参照されたい）。例えば、疾患状態に関係づけられるような有益な作用には、治療を受ける被験者にとって好都合である任意の作用が含まれ、これには、疾患の予防、疾患の安定化、疾患症状の軽減または緩和、あるいは、治療された被験者にとって有益な作用をもたらすための、根底にある欠陥の調節、緩和または治療が含まれる。
[00119] 本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は、少なくとも治療タンパク質のフラグメントまたは変異体と、少なくとも改変血清トランスフェリンのフラグメントまたは変異体とを含み、この場合、これらは、好ましくは遺伝子融合によって相互に結合している。
[00120] 一実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、神経医薬的薬剤に連結された改変トランスフェリン分子を含む。別の実施形態において、改変トランスフェリン融合タンパク質は、アミノ末端における神経医薬的薬剤に連結されて、カルボキシル末端においてトランスフェリンを含む。別の実施形態において、改変トランスフェリン融合タンパク質は、カルボキシル末端における神経医薬的薬剤に連結されて、アミノ末端においてトランスフェリンを含む。具体的な実施形態において、神経医薬的薬剤は神経成長因子または毛様体神経栄養因子のいずれかである。
[00121] 更なる実施形態において、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は治療タンパク質のフラグメントまたは変異体を少なくとも含有することができる。更なる実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質はタンパク質または抗体のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含有することができ、この場合、変異体またはフラグメントは少なくとも１つの生物学的活性または治療活性を保持している。トランスフェリン融合タンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端に融合されたか、あるいは改変トランスフェリンにおいて挿入されたか、あるいは改変トランスフェリンのループの中に挿入された、少なくとも約４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、または少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約５５アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、または少なくとも約７０アミノ酸、またはそれ以上の長さのペプチドフラグメントまたはペプチド変異体であり得る治療タンパク質を含有することができる。
[00122] 本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は１種以上のペプチドを含有することができる。ペプチドの数が増大すると、トランスフェリンに融合されたペプチドの機能、およびトランスフェリン融合タンパク質全体の機能が増強される。ペプチドは、多数の機能を有するペプチドドメインまたはタンパク質ドメインを含むことによって二機能または多機能の融合タンパク質を作製するために使用することができる。例えば、多機能の融合タンパク質を、治療タンパク質と、融合タンパク質を特定の標的に対して標的化するための第２のタンパク質とを用いて作製することができる。他のペプチドを、細胞系の免疫応答を誘導するために、または、抗ウイルス応答、抗菌応答もしくは抗病原性応答を誘導するために使用することができる。
[00123] 別の実施形態において、改変トランスフェリン融合分子は、１つ以上の残基がアミノ酸配列のアミノ末端から欠失しているポリペプチドだけでなく、全長タンパク質を含む治療タンパク質のフラグメントであり得る治療タンパク質部分を含有する。
[00124] 別の実施形態において、改変トランスフェリン融合分子は、１つ以上の残基がアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失しているポリペプチドだけでなく、全長タンパク質を含む治療タンパク質のフラグメントであり得る治療タンパク質部分を含有する。
[00125] 別の実施形態において、改変トランスフェリン融合分子は、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から欠失された１つ以上のアミノ酸を有し得る治療タンパク質部分を含有する。
[00126] 別の実施形態において、改変トランスフェリン融合分子は、本明細書中に示される参照治療タンパク質に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する治療タンパク質部分、またはそのフラグメントを含有する。更なる実施形態において、トランスフェリン融合分子は、上述したようにＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する治療タンパク質部分を含有する。
[00127] 別の実施形態において、改変トランスフェリン融合分子は、例えば、治療タンパク質の天然型または野生型のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する治療タンパク質部分を含有する。これらのポリペプチドのフラグメントもまた提供される。
[00128] 本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質（例えば、細胞表面タンパク質または分泌タンパク質など）は、１つ以上のオリゴ糖基を結合させることによって改変することができる。グリコシル化として示されるこの改変はタンパク質の物理的性質に著しい影響を及ぼし得るし、また、タンパク質の安定性、分泌および局在化において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置において生じる。通常、２つの大きなタイプのグリコシル化が存在する：セリン残基またはトレオニン残基に結合するＯ結合型オリゴ糖により特徴づけられるグリコシル化；および、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸であり得る）におけるアスパラギン残基に結合するＮ結合型オリゴ糖により特徴づけられるグリコシル化。タンパク質構造および細胞タイプなどの変数は、異なるグリコシル化部位における鎖内の炭水化物ユニットの数および性質に影響を及ぼす。グリコシル化異性体もまた、所与の細胞タイプにおける同じ部位において一般的である。例えば、数タイプのヒトインターフェロンがグリコシル化されている。
[00129] 本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質、ならびに、そのアナログおよび変異体は、１つ以上の部位におけるグリコシル化が、発現される宿主細胞によるその核酸配列の操作の結果として、または、その発現の他の条件のために、変化するように改変することができる。例えば、グリコシル化異性体を、例えば、アスパラギンのグルタミンへの置換などのアミノ酸残基の置換または欠失により、グリコシル化部位を無効化または導入することによって産生させることができ、あるいは、タンパク質をグリコシル化しない宿主細胞（例えば、グリコシル化欠損酵母）においてタンパク質を発現させることによって、グリコシル化されていない組換えタンパク質を産生させることができる。これらの方法は当分野では既知である。
[00130] 様々な治療タンパク質およびそれらの核酸配列が当分野では広く知られており、これらは、ケミカルアブストラクツサービスデータベース（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑなどの公開データベースにおいて入手することができる。下記において示されるアクセション番号および配列はその全体を参照として本明細書中に組み入れる。
[00131] 他の実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、本出願において別記される治療タンパク質の治療活性および／または生物学的活性に対応する治療活性および／または生物学的活性が可能である。更なる実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療上活性なタンパク質部分は、本明細書中に示された参照配列のフラグメントまたは変異体である。
[00132] 本発明は更に、本明細書中に記載される治療タンパク質のフラグメントを含む改変Ｔｆ融合タンパク質に関する。タンパク質のＮ末端から１以上のアミノ酸を欠失することにより、治療タンパク質部分の１以上の生物学的活性の改変または喪失が生じる場合でさえ、他の治療活性および／または機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化能、リガンド結合能）は依然として保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟型形態を認識する抗体を誘導し、かつ／またはこのような抗体に結合する、Ｎ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、一般に、完全なポリペプチドの残基の大部分がＮ末端から除かれないならば保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を有しない特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される日常的な方法、および、そうでない場合には、当分野で既知の日常的な方法によってアッセイすることができる。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失した変異体が何らかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得ることは考えられないことではない。実際、６アミノ酸もの少数から構成されるペプチドにより、多くの場合、免疫応答が誘発され得る。
[00133] また、上述したように、治療タンパク質のＮ末端またはＣ末端から１以上のアミノ酸を欠失することにより、タンパク質の１以上の生物学的機能の改変または喪失が生じる場合でさえ、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化能、リガンド結合能）および／または治療活性は依然として保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟型形態を認識する抗体を誘導し、かつ／またはこのような抗体に結合する、Ｃ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、一般に、完全なポリペプチドまたは成熟型ポリペプチドの残基の大部分がＣ末端から除かれないならば保持される。参照ポリペプチドのＮ末端残基および／またはＣ末端残基を有しない特定のポリペプチドが治療活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される日常的な方法、および／または、そうでない場合には、当分野で既知の日常的な方法によって容易に測定することができる。
[00134] 治療タンパク質のペプチドフラグメントは、アミノ酸配列がそのフラグメントである治療タンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含むフラグメント、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるフラグメントであり得る。
[00135] 治療タンパク質のペプチドフラグメントはタンパク質のＮ末端およびＣ末端のみを含むことができ、すなわち、治療タンパク質の中心部分が欠失している。あるいは、ペプチドフラグメントは、治療タンパク質の中心部分の非隣接部分および／または隣接部分を含むことができる。
[00136] 他のポリペプチドフラグメントは生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明において使用される治療タンパク質の活性と類似する活性を示すフラグメントであるが、活性は必ずしも同一である必要はない。フラグメントの生物学的活性には、改善された所望する活性、または、低下した望ましくない活性が含まれ得る。
[00137] 一般に、タンパク質の変異体は全体的に非常に類似しており、多くの領域において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの変異体をコードする核酸もまた本発明に含まれる。
[00138] 本発明において使用され得る更なる治療ポリペプチドは、当業者に既知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他偏、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）のもとで、治療タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
[00139] ポリペプチドが、本発明の照会アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有することにより、対象とするポリペプチド配列が照会アミノ酸配列の各１００アミノ酸について５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列が照会配列と同一であることが意図される。言い換えれば、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一的なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象とする配列において５％までのアミノ酸残基が挿入され得るか、または欠失され得るか、または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置、またはこれらの末端の位置の間の任意の場所に存在し得るか、あるいは、それぞれが参照配列の残基の間に点在するか、または、参照配列内の１以上の連続する群に点在し得る。
[00140] 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のトランスフェリン融合タンパク質またはそのフラグメント（例えば、トランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分またはトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分など）のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、従来、既知のコンピュータープログラムを使用して決定することができる。照会配列（本発明の配列）と対象配列との間における最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、全域配列アラインメントとも言われるが、Ｂｒｕｆｉａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．、２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定することができる。
[00141] 本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域または両方の領域において様々な変化を含有することができる。サイレントな置換、付加、または欠失をもたらし、しかし、コードされたポリペプチドの性質または活性を変化させない変化を含有するポリヌクレオチド変異体を、改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するために使用することができる。遺伝暗号の縮重性によるサイレントな置換によってもたらされるヌクレオチド変異体を利用することができる。更に、約５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５個〜５０個、５個〜２５個、５個〜１０個、１個〜５個、または１個〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換または欠失または付加されるポリペプチド変異体もまた利用することができる。様々なポリヌクレオチド変異体を、様々な理由のために、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために（上述したように、ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを酵母や大腸菌などの宿主によって好まれるコドンに変化させるために）作製することができる。
[00142] 他の実施形態において、治療タンパク質成分は、野生型配列と比較した場合、保存的置換を有する。「保存的置換」により、脂肪族つまり疎水性のアミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の置換；ヒドロキシル残基（ＳｅｒおよびＴｈｒ）の置換；酸性残基（ＡｓｐおよびＧｌｕ）の置換；アミド残基（ＡｓｎおよびＧｌｎ）の置換；塩基性残基（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）の置換；芳香族残基（Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）の置換；および小型アミノ酸（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙ）の置換などのグループ内での交換が意図される。表現型がサイレントであるアミノ酸置換体を作製する方法に関する指針が、例えば、Ｂｏｗｉｅら、「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する寛容性」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に示される。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載される治療タンパク質および／または血清トラスフェリンならびに本発明の改変トランスフェリンタンパク質のアミノ酸配列のフラグメントまたは変異体を含むか、あるいはそれらからなるが、この場合、フラグメントまたは変異体は、参照アミノ酸配列と比較したとき、１個〜５個、５個〜１０個、５個〜２５個、５個〜５０個、または５０個〜１５０個のアミノ酸残基の付加および／または置換および／または欠失を有する。更なる実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸もまた本発明に含まれる。
[00143] 本発明の改変融合タンパク質は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって相互に連結されたアミノ酸から構成され得るし、また、遺伝子によりコードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することがある。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、または、当分野で周知の化学的修飾技術によって改変することができる。このような改変は、基本的な教科書、およびより詳しい専門書、ならびに多数の研究文献に十分に記載されている。
[00144] 改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むポリペプチド内のどこででも行うことができる。同じタイプの改変を所与のポリペプチド内のいくつかの部位において同じ程度または様々な程度で存在させることができることが理解される。また、所与のポリペプチドは多くのタイプの改変を含有することができる。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝型にすることができ、また、分枝を伴う、または伴わない環状にすることができる。環状ポリペプチド、分枝したポリペプチド、および分枝した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスから生じ得るか、または合成的方法によって作製され得る。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的結合、ヘム成分の共有結合的結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的結合、脂質または脂質誘導体の共有結合的結合、ホスファチルジルイノシトールの共有結合的結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解的プロセシンング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、転移ＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加（アルギニル化など）、およびユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１頁〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら（１９９０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２：６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３：４８〜６２を参照されたい）。
[00145] 本発明の治療タンパク質には、ポリペプチド、ペプチド、抗体、またはそれらのフラグメントおよび変異体が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の治療タンパク質には、β−インターフェロン（β−ＩＦＮ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ１）、Ｔ−２０、および可溶性毒素受容体（例えば、シナプトタグミンＩなど）が含まれる。
β−インターフェロン
[00146] β−ＩＦＮを含めて、ほとんどのサイトカインは、局所的かつ一時的に作用するためにインビボで産生されるので、比較的短い循環半減期を有する。β−ＩＦＮを効果的な全身性の治療剤として使用するためには、比較的大きい用量を頻繁に投与する必要がある。頻繁な非経口投与は不便であり、かつ苦痛である。更に、様々な毒性副作用がβ−ＩＦＮの投与には伴っており、これらは非常に重篤であるので、一部の多発性硬化症患者はその治療に耐えることができない。これらの副作用は、恐らくは、高用量の投与に関連している。
[00147] 本発明は、増大した半減期を有するβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質、および、増大した安定性を有するこのような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。このような融合タンパク質は、より低用量で患者に投与することができ、したがって、β−ＩＦＮに関連する毒性副作用を減らすことができる。本発明では、β−ＩＦＮに関連する様々な疾患および状態（例えば、限定されないが、多発性硬化症、脳腫瘍および皮膚ガンを含むガン、ならびに、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などのウイルス感染など）を治療するためにβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質を使用することが意図される。好ましくは、β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質は、多発性硬化症に罹患している被験者を治療するために使用される。
[00148] β−インターフェロン（β−ＩＦＮ）は、見かけの分子量（ＭＷ）が約２３キロダルトンの糖タンパク質である。β−ＩＦＮをコードする遺伝子は第９染色体に位置する。１６６残基を含有するそのアミノ酸配列がＫ．Ｈｏｓｏｉら（Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、８、３７５頁〜３８４頁（１９８８））によって決定され、そのグリコシド配列がＹ．Ｋａｇａｗａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１７５０８頁〜１７５１５頁（１９８８））によって報告された。
[00149] β−ＩＦＮは、ウイルスまたは細菌の感染に応答して、あるいは外来の細胞、高分子またはＲＮＡに対する曝露に応答して繊維芽細胞によって分泌される。特に、β−ＩＦＮは感染細胞の増殖を阻害し、免疫系を刺激する。同種のＨｕ−β−ＩＦＮの特異的な抗ウイルス活性は３×１０８〜１×１０９ｉｕ／ｍｇ（国際単位／ミリグラム総タンパク質）の間であると考えられている（米国特許第４，２８９，６８９号および欧州特許第９４６７２号を参照されたい）。
[00150] 「インターフェロン−ベータ」（ＩＦＮ−β）または「ベータ−インターフェロン」（β−ＩＦＮ）には、ＩＦＮ−β−１ａおよびＩＦＮ−β−１ｂとして一般に知られているＩ型インターフェロンと同じ医薬的特徴または類似する医薬的特徴を示す天然型または組換え型のＩ型インターフェロンが含まれる。
[00151] 任意のβ−ＩＦＮ配列を、本発明のＴｆ融合タンパク質を調製するために使用することができる。例えば、米国特許第４，７３８，９３１号には、ヒト染色体ＤＮＡに由来するヒトβ−ＩＦＮ遺伝子が開示される。ヒトβ−ＩＦＮをコードする核酸を含有する、大腸菌に導入された１．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントが、アクセション番号ＡＴＣＣ３１９０５で大腸菌ＣＩ４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国）に寄託されている。ヒトβ−ＩＦＮアミノ酸配列のアミノ酸配列に対するＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はＡＡＡ７２５８８である。β−ＩＦＮはまた、野生型分子または天然型分子の１７位に通常は存在するシステイン（Ｃｙｓ）が中性アミノ酸（例えば、セリンまたはアラニンなど）によって置換されている米国特許第４，５８８，５８５号に記載されるような変異タンパク質（ミューテイン）であり得る。Ｃｙｓ１７がセリンに変化したとき、このＩＦＮがβ−ＩＦＮと同じスペクトルの生物学的活性（例えば、抗細胞活性および抗増殖活性、ＮＫ細胞の活性化、ならびに抗ヒトＩＮＦ抗体の中和など）を示したことをＭａｒｋら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：５６６２〜５６６６（１９８４））は示した。この変異タンパク質はまた、７０℃でインキュベーションされたとき、天然型ヒト（Ｈｕ）β−ＩＦＮよりも高い安定性を示した。
[00152] その活性のために、β−ＩＦＮは、ヘルペス、インフルエンザなどのウイルス性疾患の治療および予防においてだけでなく、脳腫瘤および白血病などの腫瘍性状態の治療においてもまた有効な成分であると見なされている。β−ＩＦＮは、多発性硬化症、脳腫瘍、皮膚ガン、ならびにＢ型肝炎およびＣ型肝炎を治療するために使用されている。本発明のβ−ＩＦＮ融合タンパク質は、これらの疾患のいずれかを治療するために使用することができる。
[00153] ヒトβ−ＩＦＮはまた、外科的治療の後での血管傷害部位における冠状動脈平滑筋細胞の増殖を選択的に阻害し、その一方で、その治療の後での冠状動脈内皮細胞の正常な増殖に対する阻害作用を全く有しないことによって、ヒトにおける冠状動脈再狭窄を治療することにおいても効果的である。米国特許第５，６８１，５５８号には、β−ＩＦＮを患者に投与するステップを含む、再狭窄を治療する方法が開示される。したがって、本発明のβ−ＩＦＮ融合タンパク質は、再狭窄を治療するために使用することができる。
[00154] β−ＩＦＮは、赤血球の産生が非常に低いいくつかの疾患に罹患している個体から得られた前駆細胞の成長に対する赤血球形成促進作用を有している。また、β−ＩＦＮは、バースト形成を増大させ、そして同様に、正赤芽球および更に後期の網状赤血球へのより迅速な成熟を促進させる。米国特許第５，１０４，６５３号には、赤血球への前駆血液細胞の成熟化の欠如によって特徴づけられる障害に罹患している患者における赤血球形成を刺激するための方法で、赤血球形成に効果的な量のヒトβ−ＩＦＮを患者に投与するステップを含む方法が開示される。したがって、本発明のβ−ＩＦＮ融合タンパク質は、赤血球形成を刺激するために使用することができる。
[00155] β−ＩＦＮは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２を介して作用しており、抗ウイルスの免疫応答にそのほとんどが関与する広範囲の様々な遺伝子をアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションすることが周知である。ほとんどのＩＦＮ応答はｄｓＲＮＡの存在によって誘導されるが、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスはともに、β−ＩＦＮの作用に対して感受性である（Ｂｉｒｏｎ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０：３８３〜３９０（１９９８））。
[00156] β−ＩＦＮは、通常、ウイルス感染に応答して産生される。インターフェロンβ−ＩＦＮは、ヒト細胞の表面における特異的な受容体に結合することによってその作用を発揮する。この結合により、インターフェロンにより誘導される数多くの遺伝子産物およびマーカー（例えば、２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ、ｂ２−ミクログロブリンおよびネオプテリン）の発現をもたらす細胞内事象の複雑なカスケードが開始される。
[00157] （２’−５’）−オリゴアデニル酸シンセターゼおよびｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼは、ＩＮＦ−βにより誘導される最も良く知られている２つのタンパク質である（Ｂｉｒｏｎ、１９９８、上記）。（２’−５’）−オリゴアデニル酸シンセターゼは２’−５’という特有の様式でＡＴＰを重合する（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、第４版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、３８５頁〜３８６頁（１９９９））；生じるオリゴマーはＲＮａｓｅＬを活性化し、これがｍＲＮＡを切断する（Ｂｉｒｏｎ、１９９８、上記）。ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼはｅｌＦ２（転写開始因子）をリン酸化し、これを不活性化する。（２’−５’）−オリゴアデニル酸シンセターゼおよびｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼはともに、ｄｓＲＮＡの存在下でのみ、すなわち、ウイルス感染細胞において作用する。これら２つのタンパク質の作用の正味の結果は、タンパク質翻訳を阻害することであり、これにより、ウイルスの複製が遅れる（Ｂｉｒｏｎ、１９９８、上記）。
[00158] β−ＩＦＮに依存したＴＡＰ（抗原プロセシングに関連する輸送因子）、Ｌｍｐ２およびＬｍｐ７のアップレギュレーションは、ＣＤ８Ｔ細胞による感染細胞の認識および破壊を容易にするために、ＭＨＣクラスＩ分子によるウイルスペプチドの提示を増大させるために役立つ。ＴＡＰは、ＥＲにおいてペプチドフラグメントをＭＨＣクラスＩ分子に負荷することを担う分子である；Ｌｍｐタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ提示のためにタンパク質を特異的に切断するプロテアソームの成分である（Ｊａｎｅｗａｙら、１９９９、上記）。
[00159] β−ＩＦＮは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においていくらかの増殖を活性化および誘導することが知られている（Ｊａｎｅｗａｙら、１９９９、上記）。しかしながら、インターフェロン自身は分裂促進因子ではない。ＮＫ細胞の増殖は、ＩＦＮ−βにより誘導される中間のサイトカインによって恐らくは引き起こされる（Ｂｉｒｏｎ、１９９８、上記）。ＮＫ細胞は、不定型のパターンのＭＨＣクラスＩ発現を示す細胞を殺すことができる；このような細胞は、通常はウイルスが感染している（Ｊａｎｅｗａｙら、１９９９、上記）。
[00160] うまく感染を食い止めた最後に、免疫系は恒常性による均衡状態に戻るので、Ｔ細胞はアポトーシスによって死滅するが、一部のＴ細胞はアポトーシスを回避し、Ｇ０／Ｇ１記憶状態に入って免疫学的記憶を保存しなければならない。これらの記憶Ｔ細胞は、β−ＩＦＮおよびいくらかのＩＦＮ−αを分泌する間質細胞と相互作用することによってアポトーシスから救われる（Ｐｉｌｌｉｎｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９：１０４１〜１０５０（１９９９））。Ｔ細胞のアポトーシスは、サイトカインの欠乏または細胞表面におけるＦａｓの結合のいずれかによって誘導され得るが、β−ＩＦＮは両方のアポトーシス経路を阻止することができる。前者のアポトーシス経路は、Ｂｃｌ−ｘ（アポトーシス阻害剤）のβ−ＩＦＮ依存的アップレギュレーションによって阻止される。Ｆａｓ結合により誘導されるアポトーシスはあまりにも迅速に生じるので、遺伝子のアップレギュレーションによって阻止することができず、したがって、β−ＩＦＮは、異なる手段によってそのアポトーシス経路を阻止しているにちがいない（Ｓｃｈｅｅｌ−Ｔｏｅｌｌｎｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２９：２６０３〜２６１２（１９９９））。別の阻止メカニズムの存在が、Ｍａｒｒａｃｋら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１８９：５２１〜５２９（１９９９））の結果によって裏付けられており、Ｔ細胞のアポトーシスがＢｃｌ−ｘの増大した産生を伴うことなくβ−ＩＦＮによって妨げられることを彼らは発見した
[00161] Ｄｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１５６２３〜１５６２８（１９９８））は、β−ＩＦＮが、ヒト線維肉腫細胞において１００をはるかに越えるタンパク質の転写を増大させることを見出した。誘導されたタンパク質は、機能において、チトクロームおよび細胞足場タンパク質から、補体成分などの免疫学的に活性なタンパク質およびｄｓＲＮＡアデノシンデアミナーゼまで及んでいた。これらの結果は、β−ＩＦＮが、真の多面的効果（その多くは完全には理解されていない）を有することを示している。
[00162] β−ＩＦＮに関する多くの臨床的研究は、現在、多発性硬化症（ＭＳ）に対する治療としてのその使用に集中している。ＭＳは、中枢神経系のグリア細胞において自己のミエリン抗原に対する免疫応答をＴ細胞が上昇させる自己免疫疾患である（Ｇｏｏｄｋｉｎ、１９９９、多発性硬化症：再発・寛解性および二次的進行の多発性硬化症の患者に対する治療の選択肢、<http://www.msnews.org/goodkin1_99.html>）。１９９３年に、ＦＤＡは、ＭＳを治療するためのＩＦＮ−β１ｂの皮下注射剤を承認した（Ｒｅｖｅｌｌａ Ｍ．、１９９３、ＦＤＡはＩＦＮ−β１ｂを認可する（<http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00424.html>））。β−ＩＦＮ１ｂは、大腸菌で製造された非グリコシル化形態のＩＦＮ−βである（Ａｒｄｕｉｎｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、８：１８６７〜１８７７（１９９９））。β−ＩＦＮ１ｂ治療に関連する有害な経験には、注射部位での反応（炎症、痛み、過敏性および壊死）およびインフルエンザ様症状群（発熱、悪寒、不安および錯乱）が含まれる。これらの有害な副作用は、実際には、上述したようにβ−ＩＦＮ１ｂをトランスフェリンに融合することによって軽減または緩和することができる。
[00163] 現在、β−ＩＦＮ１ａ（真核生物、グリコシル化形態）もまた利用することができる（Ｇｏｏｄｋｉｎ、１９９９、上記）。β−ＩＦＮ１ａは組換えＤＮＡ技術によって製造される。インターフェロンβ−１ａは１６６アミノ酸の糖タンパク質であり、予測分子量は約２２，５００ダルトンである。インターフェロンβ−１ａは、ヒトＩＦＮ−β遺伝子が導入されている哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）により製造される。β−ＩＦＮ１ａのアミノ酸配列は天然型ヒトβ−ＩＦＮのアミノ酸配列と同一であり、本発明のＴｆ融合タンパク質を作製するために使用することができる。
[00164] β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質による治療はまた、サプレッサーＴ細胞の機能を回復させることによって自己免疫発作を改善することができる；ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸との同時治療は、理由はわからないが、この回復作用を増大させるようである（Ｑｕら、１９９８、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸はインターフェロンβ−１ｂの能力を増強する（<http://members.tripod.com/~ThJuland/ra-beta1b.html>）。β−ＩＦＮはまた、ＩＬ−１およびＩＦＮ−γによる誘導型一酸化窒素合成酵素（ＩＮＯＳ）の発現誘導を阻害することができる。星状細胞におけるＩＮＯＳによる一酸化窒素の産生は、ＭＳの単為発生における一因として関係づけられている（Ｈｕａら、１９９８、β−インターフェロンは一酸化窒素／ペルオキシ硝酸塩が中枢神経系を損傷することを妨げる（<http://members.tripod.com/~ThJuland/nitric-oxide_beta.html>）。
[00165] １つの態様において、本発明は、β−ＩＦＮに関連する様々な疾患を治療するために治療上有効であるβ−ＩＦＮアナログの使用で、β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質を作製するための使用を含む。
[00166] 別の態様において、本発明は、上に記載した方法におけるβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質の使用で、様々な細胞プロセスを阻害または刺激するための使用、ならびに、上に記載した様々な疾患および状態の治療および予防のための使用を含む。特に、β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質は、多発性硬化症、ヘルペス、インフルエンザ、脳腫瘍および皮膚ガンを治療するために使用することができる。
[00167] 本発明のβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質は、周知の様々な方法によって医薬組成物に製剤化することができる。例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（これを参照として本明細書中に組み入れる）を参照されたい。これには様々な適切な製剤が記載される。本発明のβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質の医薬組成物は、液体形態、ゲル形態、凍結乾燥形態または任意の他の適切な形態を含む様々な形態で配合することができる。好ましい形態は、治療されている特定の適用に依存しており、当業者には明らかである。
[00168] β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質は純粋な形態または適切な医薬組成物で投与することができる。投与は、容認されているいかなる様式によって行うことができる。したがって、投与は、固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体の投薬形態物において、例えば、錠剤、坐薬、ピル、柔軟な弾力性カプセルおよびハードゼラチンカプセル、粉末剤、溶液剤、懸濁物またはエアロゾルなどにおいて、好ましくは、正確な投薬量の簡便な投与のために適切な単位投薬形態物において、例えば、経口投与、鼻腔投与、非経口投与、局所投与、経皮投与または直腸投与により行うことができる。組成物は、従来の医薬担体または賦形剤と、活性な薬剤としてのβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質とを含み、そして更に、他の医療用薬剤、医薬的薬剤、担体、補助剤などを含むことができる。
[00169] 一般に、意図された投与様式に依存して、医薬的に許容され得る組成物は、約１重量％〜約９９重量％のβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質と、９９重量％〜１重量％の適切な医薬的賦形剤とを含有する。組成物は約５重量％〜７５重量％がβ−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質で、残りが適切な医薬的賦形剤であり得る。
[00170] 投与経路は、治療される疾患（好ましくは多発性硬化症）の重症度にしたがって調節され得る都合のよい毎日の投与計画を使用し、非経口的であり得る。このような非経口投与の場合、β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質を含有する医薬的に許容され得る組成物は、米国特許第４，４６２，９４０号、同第４，５８８，５８５号および同第４，９９２，２７１号に開示される方法によって形成され得る。
[00171] あるいは、β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与または皮下投与によって、あるいは任意の他の許容され得る様式で投与することができる。好ましい投与様式は、治療されている特定の適用に依存しており、当業者には明らかである。
[00172] 米国特許第６，３３３，０３２号には、温血脊椎動物における疾患（例えば、多発性硬化症など）を治療するためにβ−ＩＦＮを使用する効果的な方法が記載される。多発性硬化症の治療では、β−ＩＦＮを、１日あたり０．０１ＩＵ／ｌｂ〜約５ＩＵ／ｌｂの投薬量で、インターフェロンの上記投薬量と上記動物の口内粘膜および咽頭粘膜との接触を促進させるために適合化された投薬形態物で投与することが含まれる。インターフェロンの投薬量は１日あたり０．１ＩＵ／ｌｂ〜約４．０ＩＵ／ｌｂであり得るか、または、１日あたり０．５ＩＵ／ｌｂ体重〜約１．５ＩＵ／ｌｂ体重であり得る。
[00173] 本発明では、上記投薬形態物におけるインターフェロンと、治療を受けているヒトまたは動物の口内粘膜および咽頭粘膜との最大限の接触を確実にするために適合化された投薬形態物でβ−ＩＦＮを投与することが意図される。インターフェロンと粘膜との接触は、口腔および咽頭腔における治療液の滞留時間を最大にすることによって高めることができる。したがって、最も良い結果が、インターフェロンの上記溶液を一定の時間にわたって口内に保持することが患者に求められたとき、ヒト患者において達成されるようである。インターフェロンと口内粘膜および咽頭粘膜との接触、およびその後、治療されているヒトまたは動物のリンパ系との接触は、免疫療法量のインターフェロンを投与する最も効率的な方法であることは疑いのないことである。
[00174] 更に、本発明では、β−ＩＦＮに関連する疾患の治療のために有用である医薬品を製造するための、β−ＩＦＮ／トランスフェリンタンパク質の使用が意図される。本発明によって意図される疾患には、上述した疾患が含まれるが、それらに限定されない。
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）
[00175] グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、いわゆるエンテロインスラーアクシス（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ ａｘｉｓ）に属する、インスリン分泌を調節する胃腸ホルモンである。エンテロインスラーアクシスは、腸における栄養分の存在および吸収に応答して胃腸粘膜から放出される一群のホルモンを示し、これらのホルモンにより、インスリンの初期放出および増強された放出が促進される。インスリン分泌に対する増強作用であるインクレチン作用は、恐らくは、正常なグルコース耐性のためには不可欠である。ＧＬＰ−１は、インクレチン作用を担っているので、生理学的に重要なインスリン分泌性ホルモンである。
[00176] ＧＬＰ−１はプログルカゴンの産物である（Ｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８３、３０４：３６８〜３７１）。ＧＬＰ−１は、２つの主要な分子形態、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミドおよびＧＬＰ−１（７〜３７）として、腸の内分泌細胞において合成される。このペプチドは、最初、１９８０年代初期におけるプログルカゴンに対するｃＤＮＡおよび遺伝子のクローニングの後に同定されていた。
[00177] 全長ペプチドＧＬＰ−１（１〜３７）およびＧＬＰ−１（１〜３６アミド）について行われた初期の研究では、これらのより大きいＧＬＰ−１分子は生物学的活性を有していないと結論付けられた。１９８７年に、３つの独立した研究グループが、最初の６アミノ酸の除去により、生物学的活性が増強されたＧＬＰ−１分子が生じることを明らかにした。
[00178] ＧＬＰ−１のアミノ酸配列がＳｃｈｍｉｄｔら（１９８５、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２８、７０４〜７０７）によって開示されている。ヒトＧＬＰ−１は、回腸遠位部のＬ細胞、膵臓および脳で合成されるプレプログルカゴンに由来する３７アミノ酸残基のペプチドである。ＧＬＰ−１（７〜３６アミド）、ＧＬＰ−１（７〜３７）およびＧＬＰ−２へのプレプログルカゴンのプロセシングが主にＬ細胞において行われる。ＧＬＰ−１（７〜３６アミド）およびＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列は下記の通りである（配列番号６）：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ
（ここで、ＸはＧＬＰ−１（７〜３６アミド）の場合にはＮＨ２であり、ＸはＧＬＰ−１（７〜３７）の場合にはＧｌｙである）。
[00179] ＧＬＰ−１様分子は、ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））に罹患しているヒト被験者において、そして場合により、Ｉ型糖尿病に罹患しているヒト被験者においてさえも、抗糖尿病活性を有する。ＧＬＰ−１による治療は、増大したインスリン分泌および生合成、低下したグルカゴン分泌、胃の内容物排出の遅れなどの活性を、グルコースレベルが上昇したときにだけ誘発し、したがって、インスリンまたはスルホニルウレアよりも潜在的にはるかに安全な治療を提供する。患者における食後のグルコースレベルを適正なＧＬＰ−１治療によって正常なレベルの方に移動させることができる。ＧＬＰ−１様分子が、ＩＩ型患者において、膵臓のβ細胞の機能を維持し、さらに回復させる能力さえも有することを示唆する報告もまたなされている。
[00180] 任意のＧＬＰ−１配列を、本発明のＴｆ融合タンパク質を作製するために使用することができ、これらには、ＧＬＰ−１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）およびＧＬＰ−１（７〜３７）が含まれる。ＧＬＰ−１はまた、消化管に対して強力な作用を有する。生理学的な量で注入されたとき、ＧＬＰ−１は、ペンタガストリン誘導による胃酸分泌ならびに食事誘導による胃酸分泌を強力に阻害する（Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒら、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．、１９８９、３５：７０３〜７０８；Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎら、Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ、１９９３、３８：６６５〜６７３）。ＧＬＰ−１はまた、胃内容物排出速度および膵臓酵素分泌を阻害する（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎら、Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ、１９９３、３８：６６５〜６７３）。胃および膵臓の分泌および運動性に対する類似した阻害作用が、回腸を炭水化物含有溶液または脂質含有溶液で潅流したときにヒトにおいて誘発され得る（Ｌａｙｅｒら、Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ、１９９５、４０：１０７４〜１０８２；Ｌａｙｅｒら、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、１９９３、５４：３８５〜３８）。同時に、ＧＬＰ−１の分泌が非常に刺激される。そして、ＧＬＰ−１は、このいわゆる「回腸ブレーキ」作用を少なくとも部分的に担い得ることが推測されている（Ｌａｙｅｒら、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、１９９３、５４：３８５〜３８）。実際、最近の研究では、生理学的には、ＧＬＰ−１の回腸ブレーキ作用は、膵臓の島に対するその作用よりも重要であり得ることが示唆されている。したがって、用量応答研究において、ＧＬＰ−１は、島分泌に影響を及ぼすために要求される用量と少なくとも同じくらい低い注入速度で、胃の内容物排出速度に影響を及ぼしている（Ｎａｕｃｋら、Ｇｕｔ、１９９５、３７（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ａ１２４）。
[00181] ＧＬＰ−１は、食物摂取に対する作用を有するようである。ＧＬＰ−１の心室内投与はラットにおいて食物摂取を非常に阻害する（Ｓｃｈｉｃｋら、Ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ（Ｄｉｔｓｃｈｕｎｅｉｔら編））、Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ ｌｔｄ、１９９４、３６３頁〜３６７頁；Ｔｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３７９：６９〜７２）。この効果は非常に特異的であるようである。例えば、Ｎ末端を伸張させたＧＬＰ−１（ＰＧ７２〜１０７）アミドは不活性であり、適量のＧＬＰ−１アンタゴニスト（エクセンジン９〜３９）により、ＧＬＰ−１の効果が無効になる（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６、２７１（４Ｐｔ２）：Ｒ８４８〜５６）。ＧＬＰ−１の急性末梢投与はラットにおいて食物摂取を急には阻害しない（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６、２７１（４Ｐｔ２）：Ｒ８４８〜５６；Ｔｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３７９：６９〜７２）。しかしながら、腸のＬ細胞から分泌されたＧＬＰ−１はまた満腹シグナルとして作用し得ることが依然として考えられる。
[00182] 糖尿病患者では、ＧＬＰのインスリン分泌性作用、および消化管に対するＧＬＰ−１の作用が保たれており（Ｗｉｌｌｍｓら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、１９９４、３７、ｓｕｐｐｌ．１：Ａ１１８）、このことは、食事により誘導されるグルコース可動域を縮小することに役立ち得るが、より重要なことには、食物摂取にもまた影響を及ぼし得る。１週間にわたり継続して静脈内投与されたとき、４ｎｇ／ｋｇ／分でのＧＬＰ−１は、著しい副作用を伴うことなく、ＮＩＤＤＭ患者において血糖制御を劇的に改善することが明らかにされている（Ｌａｒｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９６、４５、ｓｕｐｐｌ．２、２３３Ａ）。
[00183] ＧＬＰ−１およびそのフラグメントの少なくとも１つのアナログを含むＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質は、１型および２型の糖尿病ならびに肥満の治療において有用である。
[00184] 本明細書中で使用される用語「ＧＬＰ−１分子」は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログまたはＧＬＰ−１誘導体を意味する。
[00185] 本明細書中で使用される用語「ＧＬＰ−１アナログ」は、ＧＬＰ−１と比較して、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、反転または付加を有する分子として定義される。多くのＧＬＰ−１アナログが当分野では知られており、これらには、例えば、ＧＬＰ−１（７〜３４）、ＧＬＰ−１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ１（７〜３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７〜３７）、およびＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７〜３７）が含まれる。他のアナログには、ペプチドのＮ末端が保護されている、ＧＬＰ−１のジペプチジルペプチダーゼ抵抗型が含まれる。このようなアナログには、更なるアミノ酸を有するＧＬＰ−１、例えば、ヒスチジン残基がＮ末端端部に付加されているか、または、Ｎ末端アミノ酸（ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）におけるアミノ酸７またはアミノ酸８）の中に置換されているＧＬＰ−１などが含まれるが、これらに限定されない。これらのアナログにおいて、Ｎ末端は、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕの残基（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むことができる。米国特許第５，１１８，６６６号には、ＧＬＰ−１（７〜３４）およびＧＬＰ−１（７〜３５）などのＧＬＰ−１アナログの例が開示されている。
[00186] 用語「ＧＬＰ−１誘導体」は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログのアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側鎖基、α−炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基の１つ以上の化学的修飾を更に有する分子として定義される。化学修飾には、化学的成分を付加すること、新しい結合を作製すること、および化学的成分を除くことが含まれるが、これらに限定されない。
[0187] 本明細書中で使用される用語「ＧＬＰ−１関連化合物」は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログまたはＧＬＰ−１誘導体の定義に含まれる任意の化合物を示す。
[00188] 国際公開公報第０１／１１４５７号には、ＧＬＰ−１成分としてもまた有用であり得る、活性なＧＬＰ−１ペプチド７〜３４、ＧＬＰ−１ペプチド７〜３５、ＧＬＰ−１ペプチド７〜３６およびＧＬＰ−１ペプチド７〜３７の様々なアナログが開示される。
[00189] 欧州特許出願公開第０７０８１７９号（イーライリリー社）には、Ｎ末端イミダゾール基と、非分枝Ｃ６〜Ｃ１０アシル基を有していてもよい３４位のリシン残基とを含む様々なＧＬＰ−１アナログおよびＧＬＰ−１誘導体が開示される。
[00190] 欧州特許出願公開第０６９９６８６号（イーライリリー社）には、生物学的に活性であると報告される、ＧＬＰ−１のいくつかのＮ末端短縮フラグメントが開示される。
[00191] 米国特許第５，５４５，６１８号には、ＧＬＰ−１（７〜３４）、ＧＬＰ１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）、あるいはそれらのアミド形態、およびそれらの医薬的に許容され得る塩から本質的になるＧＬＰ−１分子で、下記の置換（ａ）〜置換（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１つの置換を有するＧＬＰ−１分子が開示される：（ａ）２６位および／または３４位におけるリシンの、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニンまたはＤ−リシンへの置換；あるいは、３６位におけるアルギニンの、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、リシンまたはＤ−アルギニンへの置換；（ｂ）３１位におけるトリプトファンの、酸化抵抗性アミノ酸への置換；（ｃ）１６位におけるバリンのチロシンへの置換、１８位におけるセリンのリシンへの置換、２１位におけるグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、２２位におけるグリシンのセリンへの置換、２３位におけるグルタミンのアルギニンへの置換、２４位におけるアラニンのアルギニンへの置換、および、２６位におけるリシンのグルタミンへの置換の少なくとも１つ；（ｄ）８位におけるアラニンの、グリシン、セリンまたはシステインへの置換、９位におけるグルタミン酸の、アスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニンへの置換、１０位におけるグリシンの、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニンへの置換、および、１５位におけるアスパラギン酸のグルタミン酸への置換の少なくとも１つ；ならびに、（ｅ）７位におけるヒスチジンの、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、または、Ｄ−ヒスチジン、Ｎ−アシル化ヒスチジンもしくはＮ−アルキル化ヒスチジンへの置換、この場合、（ａ）、（ｂ），（ｄ）および（ｅ）の置換において、置換されたアミノ酸は場合によりＤ型であり得るし、また、７位で置換されるアミノ酸は場合によりＮ−アシル化形態またはＮ−アルキル化形態であり得る。
[00192] 米国特許第５，１１８，６６６号には、インスリン分泌活性を有するＧＬＰ−１分子が開示される。このような分子は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号７）またはＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）のアミノ酸配列を有するペプチド、および上記ペプチドの誘導体からなる群から選択され、ここで、上記ペプチドは、上記ペプチドの医薬的に許容され得る酸付加塩、上記ペプチドの医薬的に許容され得るカルボン酸塩、上記ペプチドの医薬的に許容され得る低級アルキルエステル、ならびに、アミド、低級アルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドからなる群から選択される上記ペプチドの医薬的に許容され得るアミドからなる群から選択される。
[00193] 米国特許第６，２７７，８１９号には、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログおよびＧＬＰ−１誘導体を患者に投与するステップを含む、心筋梗塞後の死亡率および罹病率を減少させる方法が教示される。この場合、ＧＬＰ−１アナログは、下記の構造式（配列番号９）：Ｒ１−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘ３−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ２、および、その医薬的に許容され得る塩によって表され、式中、Ｒ１は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチル−ヒスチジンからなる群から選択され、Ｘ１は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅおよびα−メチル−Ａｌａからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群から選択され、Ｒ２は、ＮＨ２およびＧｌｙ−−ＯＨからなる群から選択され、ただし、ＧＬＰ−１アナログは等電点を約６．０〜約９．０の範囲に有し、更には、Ｒ１がＨｉｓであり、Ｘ１がＡｌａであり、Ｘ２がＧｌｕであり、Ｘ３がＧｌｕであるとき、Ｒ２はＮＨ２でなければならない。
[00194] Ｒｉｔｚｅｌら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１５９：９３〜１０２）は、ＧＬＰ−１アナログの［Ｓｅｒ８］ＧＬＰ−１（Ｎ末端の２番目のアミノ酸（アラニン）がセリンで置換されている）を開示する。この改変は、ペプチドのインスリン分泌作用を損なわないが、ＧＬＰ−１と比較して、増大した血漿安定性を有するアナログをもたらした。
[00195] 米国特許第６，４２９，１９７号には、急性の発作または出血の後におけるＧＬＰ−１治療は、好ましくは静脈内投与であるが、インスリン分泌を最適化し、脳の同化作用を増大させ、グルカゴンを抑制することによりインスリン有効性を高め、かつ、重篤な低血糖または他の有害な副作用の危険性を全く伴うことなく正常血糖または軽度の低血糖を維持するための手段を提供するので、理想的な治療であり得ることが教示される。本発明は、インスリン分泌を最適化し、グルカゴンの拮抗作用を抑制することによりインスリン有効性を高め、かつ、重篤な低血糖の危険性を全く伴うことなく正常血糖または軽度の低血糖を維持するために、急性の発作または出血の後、虚血した脳または再潅流後の脳をＧＬＰ−１またはその生物学的に活性なアナログで治療する方法を提供する。
[00196] 米国特許第６，２７７，８１９号には、心筋梗塞後の死亡率および罹病率を減少させる方法で、その必要性のある患者に、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１誘導体およびその医薬的に許容され得る塩からなる群から選択される化合物を、血中グルコースを正常化するために効果的な用量で投与するステップを含む方法が教示される。
[00197] 米国特許第６，１９１，１０２号には、体重減少を必要とする被験者において、被験者に、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチドアナログ（ＧＬＰ−１アナログ）、グルカゴン様ペプチド誘導体（ＧＬＰ−１誘導体）またはその医薬的に許容され得る塩を含む組成物を、体重の減少を生じさせるために十分な用量で、体重低下をもたらすために効果的な期間（期間は少なくとも４週間である）にわたって投与することによって、体重を減少させる方法が開示される。
[00198] ＧＬＰ−１は、皮下投与後も完全に活性であるが（Ｒｉｔｚｅｌら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、１９９５、３８：７２０〜７２５）、主にジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素による分解のために迅速に分解される（Ｄｅａｃｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、１９９５、８０：９５２〜９５７；Ｄｅａｃｏｎら、１９９５、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４４：１１２６〜１１３１）。したがって、残念なことに、ＧＬＰ−１および多くのそのアナログはヒトにおいて短い血漿半減期を有する（Ｏｒｓｋｏｖら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９３、４２：６５８〜６６１）。したがって、ＧＬＰ−１（７〜３７）に対して延長された作用プロフィルを有する、ＧＬＰ−１またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質を提供することは本発明の目的の１つである。ＧＬＰ−１（７〜３７）よりも低いクリアランスを有するＧＬＰ−１の誘導体およびそのアナログを提供することは本発明の更なる目的である。その上、改善された安定性を有するＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質またはＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物を提供することは本発明の目的である。また、本発明は、ＧＬＰ−１に関連する疾患（例えば、限定されないが、上述の疾患）を治療するための、ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質またはＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質の使用を含む。
[00199] 本発明の１つの態様において、ＧＬＰ−１ペプチド／トランスフェリン融合タンパク質およびＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物を、医薬組成物を製剤化する確立された方法のいずれかによって、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５）に記載されるように製剤化することができる。組成物は、全身的な注射または注入のために適した形態にすることができ、そして、このようなものとして、適切な液体ビークル（例えば、無菌水または等張性の生理的食塩水もしくはグルコース溶液など）を用いて製剤化することができる。組成物は、当分野で周知の従来の滅菌技術によって滅菌することができる。得られる水溶液は使用のためにパッケージングされ得るか、または、無菌条件下でろ過され、そして凍結乾燥され得る。凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水溶液と一緒にされる。組成物はまた、適切な生理学的状態に対して要求されるような医薬的に許容され得る補助物質（例えば、緩衝化剤および張性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含有し得る。
[00200] 本発明のＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質およびＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質はまた、鼻腔投与、経皮投与、肺投与または直腸投与のために適合化され得る。組成物において用いられる医薬的に許容され得る担体または希釈剤は任意の従来の固体担体であり得る。固体キャリアの例には、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシオウムおよびステアリン酸がある。同様に、担体または希釈剤には、当分野で既知の任意の徐放（持続放出）材料、例えば、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなど（これらは単独であるか、または、ワックスと混合される）が含まれ得る。
[00201] 本発明の組成物を徐放製剤の形態で提供することは特に好都合であり得る。そのため、組成物は、適切な医薬的に許容され得る生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、または乳酸／グリコール酸共重合体など）によりカプセル化されたか、またはこのような生分解性ポリマーに分散されたＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質またはＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質を含有するマイクロカプセルまたはマイクロ粒子として配合され得る。
[00202] 鼻腔投与の場合、製剤は、エアロゾル適用のための液体担体（特に、水性担体）に溶解または懸濁されたＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質またはＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質を含有することができる。担体は、可溶化剤（例えば、プロピレングリコール）、界面活性剤、吸収促進剤（例えば、レシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリンなど）、または保存剤（例えば、パラベン類など）などの添加物を含有することができる。
[00203] 一般に、本発明の化合物は、単位投薬あたり０．５ｍｇ〜５００ｍｇの融合タンパク質を医薬的に許容され得る担体と一緒に含む単位投薬形態物で分配される。
[00204] その上、本発明では、上昇したグルコースレベルに関連する疾患（例えば、限定されないが、上述した疾患など）の治療において使用され得る医療用製剤を製造するための、ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質およびＧＬＰ−１アナログ／トランスフェリン融合タンパク質の使用が意図される。具体的には、本発明では、ＩＩ型糖尿病を含む糖尿病、肥満、重度の火傷、ならびに、鬱血性心不全および急性冠状動脈症候群を含む心不全を治療するための、ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質の使用が意図される。
[00205] ＧＬＰ−１のＮ末端は通常、アミド化される。酵母では、アミド化は起こらない。本発明の１つの態様において、酵母では起こらないＮ末端におけるアミド化を補うために、余分なアミノ酸がＧＬＰ−１のＮ末端において付加される。ＧＬＰ−１のＮ末端に対するアミノ酸の付加は、立体的障害のために、ジペプチジルペプチダーゼがＧＬＰ−１の２番目のアミノ酸で切断することを妨げることができる。したがって、ＧＬＰ−１は機能的に活性な状態のままである。２０個のアミノ酸のいずれか１つをＧＬＰ−１のＮ末端に付加することができる。場合により、非荷電アミノ酸または正荷電アミノ酸を使用することができ、好ましくは、より小さいアミノ酸（例えば、グリシンなど）が付加される。余分なアミノ酸を有するＧＬＰ−１は、その後、トランスフェリンに融合される。したがって、付加されたアミノ酸を有するＧＬＰ−１がＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質のＮ末端において融合される。
[00206] ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドまたはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドをジペプチジルペプチダーゼによる切断に対してより抵抗性にする一実施形態において、Ｈｉｓ残基がＧＬＰ−１のＮ末端において付加されるか、または、ＧＬＰ−１のＮ末端におけるＨｉｓ残基の後に挿入され、その結果、ＧＬＰ−１のＮ末端はＨｉｓ−Ｈｉｓで始まるようにされる。
[00207] 本発明の別の実施形態において、ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドまたはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチド（配列番号６）におけるＮ末端から２番目の残基が別のアミノ酸で置換される。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドまたはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドにおけるＮ末端から２番目の残基におけるＡｌａ残基を、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌまたは別のアミノ酸で置換することができる。
２型糖尿病を治療するためのＧＬＰ−ｍＴｆ融合タンパク質
[00208] 先に論じたように、ＧＬＰ−１は体内の重要な内分泌ホルモン系を活性化および調節し、グルコース代謝において極めて重要な管理的役割を果たしている。市場にあるすべての他の糖尿病治療とは異なり、ＧＬＰ−１は、Ｂ細胞に対する増殖因子として作用することによって、したがって、インスリンを分泌する膵臓の能力を改善することによって回復させる潜在的能力を有しており、そしてまた、感受性を改善し、かつ、グルコースレベルをより良好に安定化することによって、存在するインスリンのレベルをより効率的に作用させる潜在的能力を有している。このことは、グルコースレベルを毎日モニターすることに対する負担を軽減させ、また、糖尿病による血中グルコースの変動により引き起こされる重大な長期間にわたる副作用の遅れを潜在的にはもたらす。更に、ＧＬＰ−１は食欲を低下させ、体重を減少させることができる。肥満は、グルコース代謝の制御が悪いことの本来的な結果であり、これは、糖尿病状態を悪化させるために作用するだけである。
[00209] 天然型ＧＬＰ−１の臨床的適用は、循環において迅速に分解されるので制限される（半減期が数分である）。循環において治療レベルを維持することには、ポンプまたはパッチデバイスを使用して高用量を絶えず投与することが要求され、このことは治療費用を増大させる。これは、糖尿病を治療するためのそれ以外の薬物療法のすべてとの連携では特に、長期間にわたる常習的な使用のために不便であり、また、グルコースレベルをモニターするために不便である。ＧＬＰ−１融合タンパク質はＧＬＰ−１の活性を保持しており、しかし、トランスフェリン（ｍＴｆ）の長い半減期（１４〜１７日）、溶解性および生体分布特性を有している。これらの特性は、低コストで、小さい体積での毎月のｓ．ｃ．（皮下）注射をもたらすことができ、このタイプの製品は長期間にわたる常習的な使用のためには絶対的に必要とされる。
インスリン
[00210] ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖として知られている２つのペプチド鎖を含有し、それらは、長さがそれぞれ２１アミノ酸および３０アミノ酸であり、２つのシスチンジスルフィド架橋により連結されている。このペプチドは分子量が約６ｋＤａである。インスリンの直前の前駆体は、Ｃペプチドとして知られている約３１アミノ酸の接続ペプチドに塩基性残基の隣接対により連結されたＢ鎖およびＡ鎖から構成される単一鎖ペプチドであるプロインスリンである。プロインスリン分子におけるこれら３つのペプチドの構成は、アミノ末端から始めると、下記の通りである：Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃペプチド−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ鎖。しかしながら、ｍＲＮＡに翻訳されるとき、プレプロインスリンが産生され、これは、長さが２４アミノ酸の非常に疎水性のシグナルペプチドにそのアミノ末端において繋がったプロインスリンを含有する。
[00211] プレプロインスリンは、膵臓全体に散らばっているランゲルハンス島の中に存在する膵臓β細胞において合成される。シグナルペプチドの除去が粗面小胞体において行われ、生じるプロインスリンが、その後、ゴルジ装置に輸送されて分泌顆粒内へ充填される。折り畳まれたプロインスリンはジスルフィド結合により安定化されている。分泌顆粒のプロセシングのとき、折り畳まれたプロインスリン分子は、対になった塩基性残基において特異的なプロテアーゼによって切断されて、インスリンおよびＣペプチドが遊離する。
[00212] 糖尿病は、合衆国では約１７００万人（すなわち、人口の６．２％）が罹っている疾患である。２０歳を越える約１００万人が毎年、糖尿病と診断されており、糖尿病は合衆国における主要な死因の６番目である（http://www.niddk.nih.gov/health/diabetes/pubs/dmstats/dmstats.htm#7）。糖尿病患者の約９０％〜９５％が２型（かつては成人期発症糖尿病と呼ばれていた）であり、これはインスリン抵抗性（身体の細胞がインスリンを適正に使用することができない）として始まり、進行するに従い、膵臓がインスリンを産生できなくなる。１型糖尿病（若年性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病とかつては呼ばれていた）は糖尿病患者の残る５％〜１０％を占める。１型糖尿病では、身体の免疫系により、インスリンを製造する膵臓内のβ細胞が破壊される。
[00213] ヒトインスリンは、５１個のアミノ酸残基を含有するだけであるので、組換え技術によって容易に作製され、また、非常に多数のインスリンアナログおよび変異体が調製されている。これらのアナログまたは変異体はどれも、本発明のｍＴｆ融合タンパク質を作製するために使用することができる。
[00214] 糖尿病では、典型的には、インスリン置換療法を必要とし、これには、皮下注射による１日あたり１回または数回の薬物の服用が伴う。しかしながら、注射による治療は、技術的熟練が要求されるだけでなく、心理的および肉体的の双方に苦痛であり、多くの糖尿病患者は、注射を施す際に助けを必要としている。しかしながら、このペプチドは、消化管の酸性環境において、特に胃において迅速に分解されるので、インスリンの経口製剤はこれまで成功していない。それにも関わらず、注射に対する様々な代替法、例えば、経口製剤、鼻腔製剤および局所製剤などが試みられている。米国特許第５，８２４，６３８号（Ｂｕｒｎｓｉｄｅら）には、インスリンが親水性の相（例えば、水、生理的食塩水または水混和性アルコール）に溶解され、疎水性の相（例えば、長鎖脂肪酸または長鎖脂肪酸エステルなど）に界面活性剤とともに分散されている経口エマルション製剤が記載される。エマルションはインスリンを分散させたままに保つが、ペプチドを胃の過酷な条件から保護することができない。インスリンをエアロゾルで肺に送達する鼻腔調製物が米国特許第６，４２７，６８１号（Ｇｏｎｄａら）に開示され、その一方で、局所製剤が米国特許第６，３９９，５６６号（Ｄａｒｄａｉら）に開示されている。
[00215] 活性を高めるか、または分解を阻害するか、またはペプチドの凝集を阻害するためにアミノ酸置換またはグリコシル化残基を含有する注射用の改変型インスリンもまた開発されている（米国特許第４，４７８，７４６号（Ｋｉｍら、グリコシル化されたインスリン誘導体）；米国特許第４，９９２，４１８号（Ｋａｔｓｏｙａｎｉｓら、増大させた活性のためのＡｓｐ１０含有インスリン（Ｂ鎖））；米国特許第５，７１６，９２７号（Ｂａｌｓｃｈｍｉｄｔら、凝集および低下した活性を防止するための、Ｂ鎖の２８位におけるＬｙｓもしくはＡｒｇ、または、Ａｓｎから改変されたＡ１８、Ａ２１もしくはＢ３、または、Ｂ鎖のＣ末端端部における他の修飾）を参照されたい）。アシル化され得るので、より長い活性相をもたらす更なるアミノ酸置換体が米国特許第５，７５０，４９７号（Ｈａｖｅｌｕｎｄら）に開示される。Ａ２１、Ｂ３およびＢ３０を、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＣｙｓを除く任意のアミノ酸によって置換することができる。Ｂ１を欠失させることができ、また、Ｂ３０を１０個〜２４個の炭素原子の親油性の鎖によって置換することができる。インスリンの改善された組換え製造のための様々な融合タンパク質（より高い収量、可溶性、正しい折り畳みを可能にすること）が米国特許第６，５３４，２８８号（Ｈａｂｅｒｍａｎｎら）に記載されている。これらのペプチドはＢ鎖のアミノ末端端部に融合部分を含有し、その後にはアミノ酸ＲＤＶＰ−Ｙｎ−Ａ鎖（式中、Ｙは長さが２アミノ酸〜５０アミノ酸のペプチドである）が続き、塩基性アミノ酸で終わる。
[00216] 本発明は、トランスフェリンと、インスリンタンパク質またはインスリンペプチドとを含む融合タンパク質を含む。一実施形態において、融合タンパク質は経口送達のために製剤化される。したがって、本発明はまた、その必要性のある患者に、特に糖尿病患者に、本発明のインスリン融合タンパク質を経口投与する方法を含む。
[00217] 一実施形態において、本発明は、一本鎖インスリンアナログ（Ｌｅｅら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０８：４８３）を含むトランスフェリン融合タンパク質を含む。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質におけるインスリンは、部位が消化管において１以上の酵素によって認識されるように、消化管または消化管の特定の部分に対して特異的なプロテアーゼ切断部位を含有することができる。プロインスリンはこの様式で活性化され得る。切断部位を、Ａ鎖およびＢ鎖を連結するペプチドに存在させることができる。
ＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ）
[00218] エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆体細胞の有糸分裂的細胞分裂および分化を刺激するために哺乳動物の腎臓において合成される糖タンパク質ホルモンである。したがって、ＥＰＯは、赤血球の産生を刺激および調節するように作用する。赤血球形成におけるその役割のために、ＥＰＯは、低い赤血球産生または不完全な赤血球産生によって特徴づけられる血液障害の診断および治療の両方において有用である。
[00219] 様々な研究により、ＥＰＯ療法の効力が、血液学的異常の様々な疾患状態、障害および状態（例えば、β−サラセミア）において（Ｖｅｄｏｖａｔｏら（１９８４）、Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、７１：２１１〜２１３）；嚢胞性線維症において（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙら（１９８４）、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ、１０５：１５〜２１）；妊娠異常および月経異常において（Ｃｏｔｅｓら（１９８３）、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅａｃｏｌ．、９０：３０４〜３１１）；未熟児の早期貧血において（Ｈａｇａら（１９８３）、Ａｃｔａ Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ．、７２：８２７〜８３１）；脊髄傷害において（Ｃｌａｕｓ−Ｗａｌｋｅｒら（１９８４）、Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．、６５：３７０〜３７４）；宇宙飛行において（Ｄｕｎｎら（１９８４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、５２：１７８〜１８２）；急性の血液喪失において（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８２）、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、５２：５４５〜５９０）；老化において（Ｕｄｕｐａら（１９８４）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１０３：５７４〜５８８）；異常な赤血球生成が付随する様々な腫瘍性疾患状態において（Ｄａｉｎｉａｋら（１９８３）、Ｃａｎｃｅｒ、５：１１０１〜１１０６）；また、腎不全において（Ｅｓｃｈｂａｃｈら（１９８７）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６：７３〜７８）示されている。この１５年間に、ＥＰＯは、造血系悪性腫瘍における貧血、骨髄移植後および自家血液献血の治療のためだけでなく、腎不全の貧血、関節リウマチに関連する慢性疾患、炎症性腸疾患、ＡＩＤＳおよびガンの貧血を治療するために使用されてきている。
[00220] ＥＰＯの活性はその受容体によって媒介される。ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）は、リガンドにより誘導されるタンパク質二量体化によって活性化される増殖因子型受容体のクラスに属する。他のホルモンおよびサイトカイン、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびインスリンなどは２つの受容体を橋かけし、２つの細胞質テールの並置を生じさせることができる。二量体化により活性化されるこれらの受容体は多くが、二量体化したときに付近のテールをリン酸化するプロテインキナーゼドメインを細胞質テール内に有している。一部の細胞質テールは固有的なキナーゼ活性を有していないが、これらはプロテインキナーゼとの会合により機能する。ＥＰＯ受容体は後者のタイプである。それぞれの場合において、リン酸化はシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
[00221] ＥＰＯの効能を有する分子模倣がますます注目されている。例えば、天然型ＥＰＯまたは合成されたＥＰＯミメティックペプチド（ＥＭＰ）のいずれかの存在下でのエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）の二量体化は、受容体および下流のシグナル伝達事象の活性化をもたらす細胞外の事象である。一般には、ＥＰＯと等価な効能を有するミメティック（模倣体）を得ることに関心がある。
[00222] Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３）は、任意の様々なペプチドを繊維状ファージのコートタンパク質表面に露出させることができるファージディスプレーを用いた。ランダムペプチド−ファージのライブラリーは、スクリーニングシステムにおいて、ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインに結合することができ、その後、細胞外ドメインから溶出した。彼らは弱い結合システムを使用して、ＥＰＯドメインと弱く（１０ｍＭのＫｄ）結合するＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣ（配列番号１０）をコンセンサス配列として最初に探り出した。その結果、ＥＰＯに対する２００ｐＭと比較して、２００ｎＭの親和性（Ｋｄ）を有する２０アミノ酸のペプチドＥＭＰ１（ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ、配列番号１１）が単離されたが、その配列は、実際には、天然型ＥＰＯには存在していない。このミメティックアゴニストとＥＰＯ受容体の細胞外ドメインとの複合体の２．８Åの分解能での結晶構造により、ペプチド二量体がペプチド受容体のほとんど完全な二つ折り二量体化を誘導することが解明された（Ｌｉｖｎａｈら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３（２７４）：４６４〜４７１）。この２０アミノ酸ペプチドはｂ−シート構造を有しており、Ｃ−Ｃジスルフィド結合によって安定化されている。
[00223] ＥＭＰ１の生物学的活性は、ＥＭＰ１がＥＰＯのミメティックとして作用し得ることを示している。例えば、ＥＭＰ１は、受容体結合アッセイにおいてＥＰＯと競合して、ＥＰＯに対して応答性であるように操作された細胞株の細胞増殖を生じさせる（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３）。ＥＰＯおよびＥＭＰ１はともに、ＥＰＯ応答細胞においてリン酸化事象および細胞周期進行の類似するカスケードを誘導する（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３）。更に、ＥＭＰ１は、発生期の赤血球産生の２つの異なるインビボアッセイによってモニターされたとき、マウスにおいて著しい赤血球生成効果を示す（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：４５８〜４６３）。
[00224] Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：３６９９〜３７１０）は、ＥＰＯ模倣作用に対するアッセイにおいて活性を保持する最小ペプチドを同定した。Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失を使用して、Ｊｏｈｎｓｏｎらは、最小の活性なペプチドが、ＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（配列番号１２）の配列（すなわち、ＥＭＰ１のアミノ酸４〜アミノ酸１６）を有するＥＭＰ２０であることを見出した。彼らはまた、ＥＭＰ１のＴｙｒ４およびＴｒｐ１３は模倣作用のために非常に重要であることを見出した。
[00225] 本発明は、増大した半減期を有するＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質、および、このような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。任意のＥＭＰ１配列を、１以上のＣ残基が欠失または置換されているＥＭＰ１配列を含めて、ＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができる。これらの配列は、その後、三次元構造を融合タンパク質のＥＭＰ１領域にもたらすために、ｍＴｆのループの中に挿入することができる。本発明では、ＥＰＯに関連する様々な疾患および状態（例えば、限定されないが、上述の疾患および状態など）を治療するための融合タンパク質の使用が意図される。
[00226] 本発明の一実施形態において、ＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物は、医薬組成物を製剤化する確立された方法のいずれかによって、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５）に記載されるように製剤化することができる。組成物は、全身的な注射または注入のために適した形態にすることができ、そして、このようなものとして、適切な液体ビークル（例えば、無菌水または等張性の生理的食塩水もしくはグルコース溶液など）を用いて製剤化することができる。これらの医薬組成物は、組成物を安定化するために、またはトランスフェリン融合タンパク質の送達を助けるために、緩衝剤、塩および他の賦形剤を含有することができる。
[00227] 好ましい実施形態において、本発明は、ＥＰＯに関連する障害を治療するための方法を提供する。この方法は、障害の症状を緩和するために十分な期間および条件のもとで、すなわち、ＥＰＯ受容体の二量体化または生物学的活性化を達成するために十分な期間および条件のもとで、本明細書で提供されるＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質を投与するステップを含む。ＥＰＯの場合、このような方法論は、末期の腎不全／透析；貧血、特に、ＡＩＤＳまたは慢性的な炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび慢的な腸炎症など）に関連する貧血；自己免疫疾患の治療において有用であり、また、必要な時には、例えば、手術前に、または輸血に対する前処置として、患者の赤血球カウントを上昇させるために有用である。ＥＰＯアゴニストとして挙動する本発明のＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質は、巨核球を活性化するために使用することができる。
[00228] ＥＰＯは、血管内皮細胞に対する有糸分裂促進作用および走化性作用、ならびに中枢神経のコリン作動性ニューロンに対する作用を有することが示されているので（Ａｍａｇｎｏｓｔｏｕら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：５９７８０５９８２；Ｋｏｎｉｓｈｉら（１９９３）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、６０９：２９〜３５）、本発明の化合物もまた、様々な血管障害、例えば、創傷治癒を促進すること、側副冠血管（例えば、心筋梗塞後に生じ得る血管など）の成長、外傷、および血管移植治療後などを治療するために、また、他の神経刺激性物質（例えば、神経伝達物質）と比較して、アセチルコリンの低い絶対的レベルまたはアセチルコリンの低い相対的レベルにより通常特徴づけられる様々な神経学的障害を治療するために使用することができる。
[00229] したがって、本発明は、医薬的な担体または希釈剤と一緒に、本発明のＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物を含む。本発明のＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質は、経口投与経路、非経口投与経路（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射または皮下注射）、経皮投与経路（受動的、または、イオン導入法もしくはエレクトポレーションを使用することのいずれか）、または経粘膜（鼻腔、膣、直腸または舌下）投与経路によって、それぞれの投与経路について適切な投薬形態物で投与することができる。
[00230] 経口投与される固体の投薬形態物には、カプセル、錠剤、ピル、粉末剤および顆粒剤が含まれる。このような固体の投薬形態物において、活性な化合物は、少なくとも１つの不活性な医薬的に許容され得る担体（例えば、スクロース、ラクトースまたはデンプンなど）と混合される。このような投薬形態物はまた、その通常的な実施として、不活性な希釈剤とは異なる更なる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含むことができる。カプセル、錠剤およびピルの場合において、これらの投薬形態物はまた、緩衝剤を含むことができる。錠剤およびピルはさらに、腸溶性コーティング剤を用いて調製することができる。
[00231] 経口投与される液体の投薬形態物には、医薬的に許容され得るエマルション、溶液剤、懸濁物、シロップが、当分野では一般に使用されている不活性な希釈剤（例えば、水など）を含有するエリキシル剤とともに含まれる。このような希釈剤のほかに、組成物はまた、補助剤、例えば、湿潤化剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤および芳香剤などを含むことができる。
[00232] 非経口投与される本発明による製剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物またはエマルションが含まれる。非水性の溶媒またはビークルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油およびコーン油など）、ゼラチン、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）がある。このような投薬形態物はまた、補助剤、例えば、保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散化剤などを含有することができる。このような投薬形態物は、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、または、殺菌剤を組成物に配合することによって、または、組成物に放射線照射することによって、または、組成物を加熱することによって滅菌することができる。このような投薬形態物はまた、滅菌水または何らかの他の滅菌された注射用媒体を使用して、使用直前に製造することができる。
[00233] 直腸投与または膣投与される組成物は、好ましくは、活性な物質に加えて賦形剤（例えば、カカオ脂または坐薬ワックスなど）を含有し得る坐薬である。鼻腔投与または舌下投与される組成物はまた、当分野で周知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
[00234] 本発明の組成物における有効成分の投薬量は変化し得る。しかしながら、有効成分の量は、適切な投薬形態物が得られるようにしなければならないことが必要である。選択された投薬量は、所望される治療効果、投与経路、および所望される治療の持続時間に依存する。一般には、１日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の投薬量レベルが哺乳動物に対して投与される。
[00235] その上、本発明ではまた、低い赤血球産生または不完全な赤血球産生に関連する疾患の治療において使用され得る医薬製造物を製造するための、ＥＭＰ１またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質の使用が意図される。このような疾患の例には、上述の疾患があるが、これらに限定されない。
Ｔ−２０およびＴ−１２４９
[00236] ＨＩＶの感染は世界的に流行しており、ＨＩＶ関連疾患が主要な世界的健康問題となっている。効果的な治療の設計の完成に相当の努力が注がれているが、現在、ＡＩＤＳに対する治療的な抗レトロウイルス薬は存在していない。このような薬物を開発する様々な試みにおいて、ＨＩＶの生活環のいくつかの段階が治療的介入のための標的として検討されている（Ｍｉｔｓｕｙａ，Ｈ．他、１９９１、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、５：２３６９〜２３８１）。例えば、ウイルスによりコードされる逆転写酵素が薬物開発の１つの焦点となっている。２’，３’−ジデオキシヌクレオシドアナログ（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄｃおよびｄ４Ｔなど）を含む多数の逆転写酵素標的薬物が開発され、これらは、ＨＩＶに対して活性であることが示されている（Ｍｉｔｓｕｙａ，Ｈ．他、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５３３〜１５４４）。有益である一方で、これらのヌクレオシドアナログは、恐らくは薬物耐性ＨＩＶ変異株がすぐに出現するために、治療的ではない（Ｌａｎｄｅｒ，Ｂ．他、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１７３１〜１７３４）。また、これらの薬物は、多くの場合、骨髄抑制、嘔吐および肝機能異常などの毒性副作用を示す。
[00237] 進入阻害剤は、ＨＩＶと闘う既存の薬物クラスとは異なる。他の薬物は感染細胞の内部で機能する。ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴおよびアバカビルなど）および非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ネビラピンおよびエファビレンツなど）はすべて、ＨＩＶが細胞の内部に入って、ＨＩＶが自身を複製するために使用する逆転写酵素を停止させることによって作用する。プロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶが菌体外送出のために自身をパッケージングするために使用するウイルスプロテアーゼ酵素を停止させる。対照的に、進入阻害剤は、細胞の外膜に対するウイルスの最初の攻撃に関与するプロセスを妨害する薬物である。
[00238] Ｔ−２０は、すべての進入阻害剤の中で最も研究されているものであり、融合阻害剤クラスの最初のメンバーである。細胞の内側で機能し、かつ、ウイルスの複製に関与するウイルス酵素を標的とするする既存のＡＩＤＳ薬物とは異なり、Ｔ−２０は、ウイルスが細胞に進入し、その複製プロセスを始める前に、ＨＩＶと宿主細胞との融合を阻害する。Ｔ−２０はｇｐ４１の２つのらせんドメインの１つに結合する。ｇｐ４１は、ＣＤ４がＨＩＶのｇｐ−１２０に結合したときに活性化されるスプリングロード（ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ）ＨＩＶ−１タンパク質である。ｇｐ４１の融合作用は、その２つのらせんドメインが一緒に折り畳むことができない場合に阻害される。Ｔ−２０はｇｐ４１に結合し、これにより、効果的に、タンパク質が機能しないようにする。初期の比較対照をおかない臨床研究（single-arm clinical studies）では、ウイルス負荷量における１／１０以下の減少を単独でもたらすことによってプロテアーゼ阻害剤と同じくらい強力であること、および、他の抗レトロウイルス剤との組合せにおいて安全であることが示されている。
[00239] 米国特許第５，４６４，９３３号には、３６アミノ酸の合成ペプチドとしてのＴ−２０（ペンタフュシド、ＤＰ−１７８）が開示される。この薬物はペプチドであるので、経口投与することができない。ペプチドが消化系によって容易に分解されるからである。皮下注射によって投与されたとき、Ｔ−２０は、抗ＨＩＶ活性を有するために血中において十分なレベルを達成する。Ｔ−２０は１日に２回の皮下注射によって投与される。しかしながら、患者は注射部位に皮膚反応を生じさせる。最も頻繁に報告されている、治療に関係した有害事象は、軽度〜中程度の局所的な注射部位での反応である。これらは、軽度の痛み、一時的な腫れ、および注射部位での赤斑からなる。
[00240] 米国特許第６，４７９，０５５号には、抗膜融合能、抗ウイルス活性（例えば、非感染のＣＤ−４＋細胞へのＨＩＶ伝播を阻害する能力など）、または、コイルドコイルペプチド構造を伴う細胞内プロセスを調節する能力を示す、ＤＰ−１７８のペプチドアナログ（ＨＩＶ−１ＬＡ１の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８〜６７３に対応するペプチド）が開示される。更に、この特許は、抗融合性または抗ウイルス性の化合物として、あるいは、コイルドコイルペプチド構造を伴う細胞内事象の阻害剤としての、ＤＰ−１７８ならびにＤＰ−１７８部分および／またはＤＰ−１７８アナログの使用に関する。更に、この特許では、診断薬としてのこれらのペプチドの使用が教示される。例えば、ＤＰ１７８ペプチドをＨＩＶサブタイプに特異的な診断薬として使用することができる。
[00241] Ｔ−１２４９はＴ−２０の姉妹化合物である。Ｔ−２０と同様に、Ｔ−１２４９は、ＨＩＶがＣＤ４細胞に結合するために使用するｇｐ４１として知られているＨＩＶの糖タンパク質を標的とする。Ｔ−１２４９は、動物研究および研究室での研究において強力な抗ＨＩＶ作用を示している。ヒトにおける安全性、服用および効力の予備的な研究では、進行中の研究に対する支持がもたらされている。
[00242] Ｔ−１２４９は、現在、１日に１回または２回の皮下（皮膚の下への）注射によって投与されている。ヒトで行われたＴ−１２４９の最初の安全性研究では、過敏性反応（口腔潰瘍、斑丘疹の発疹、発熱）および重篤な好中球減少の２つの重大な有害事象が見出された。被投与者の４０パーセントが注射部位での反応を生じさせたが、これらは軽症であると見なされた。めまい、下痢、頭痛および発熱もまた、被投与者によって報告されている。用量を制限する毒性は何ら認められず、より高い用量を用いた実験が可能であると考えられる。
[00243] Ｔ−１２４９は、Ｉ／ＩＩ相での安全性および服用の研究が完了したところである。初期の結果は、より高い用量により、平均して１．３ ｌｏｇのウイルス負荷量低下がもたらされることが示された。
[00244] ＨＩＶ ＲＮＡの用量依存的な減少が報告されている。Ｔ−１２４９の研究では、ベースラインからの平均的減少が０．２９〜１．９６のｌｏｇ（コピー数／ｍｌ）の範囲であった（Ｇｕｌｉｃｋ、２００２）。
[00245] 本発明は、増大した半減期を有する、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質、および、このような融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、治療目的のために、これらのトランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明では、ヒトレトロウイルスおよび非ヒトレトロウイルスの、特にＨＩＶの、伝播の阻害剤としての、このような融合タンパク質の使用が意図される。本発明のペプチドによってその伝播が阻害され得るヒトレトロウイルスには、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ならびにヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）のすべての株が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドによってその伝播が阻害され得る非ヒトレトロウイルスには、ウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、サル肉腫ウイルス、サル白血病ウイルスおよびヒツジ進行性肺炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
[00246] ＨＩＶに関して、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含む本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、ＡＩＤＳの治療における治療剤として使用することができる。これらのトランスフェリン融合タンパク質は、当業者に周知の技術を使用して投与することができる。好ましくは、これらのトランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物が製剤化され、全身投与される。配合および投与のための様々な技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ）に見出され得る。適切な経路には、少し例を挙げると、経口投与、直腸投与、経粘膜投与または腸管投与；非経口送達（筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、ならびに、クモ膜下腔内注射、直接的な心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が含まれ得る。最も好ましくは、投与は静脈内である。注射の場合、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス液、リンゲル液または生理的食塩水緩衝液など）に製剤化される。このような経粘膜投与の場合、浸透すべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は当分野では一般に知られている。
[00247] また、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質は、ＨＩＶウイルスに対する急性曝露の後の、以前には感染していない個体における予防的措置として使用することができる。ペプチドのこのような予防的使用の例には、母親から乳児へのウイルス伝播の予防、および、例えば、作業者がＨＩＶを含有する血液にさらされる健康管理環境における事故などの、ＨＩＶ伝播の可能性が存在する他の状況が含まれ得るが、これらに限定されない。Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含む本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、このような場合では、予防ワクチンの役割を果たすことができ、この場合、宿主は本発明の融合タンパク質に対する抗体を惹起させ、次いで、その抗体は、例えば、更なるＨＩＶ感染を阻害することによって、ＨＩＶウイルスを中和するために役立つ。したがって、予防ワクチンとしての本発明のトランスフェリン融合タンパク質の投与は、例えば、細胞に感染するＨＩＶの能力を阻害することによって、ＨＩＶを中和するために十分である免疫応答を生じさせることにおいて有効な濃度のトランスフェリン融合タンパク質を宿主に投与するステップを含む。正確な濃度は、投与されるトランスフェリン融合タンパク質における特定のペプチドに依存するが、当業者に周知の、免疫応答の発達をアッセイするための標準的な技術を使用することによって決定することができる。ワクチンとして使用されるトランスフェリン融合タンパク質は、通常、筋肉内投与される。
[00248] Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質の投与される効果的な投薬量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性のようなパラメーターを検討する、当業者に周知の様々な手法によって決定することができる。下記の第６節に示されるデータを仮定すると、例えば、ＤＰ−１７８は、１０ｎｇ／ｍｌのペプチドの循環レベルを達成するために要求される用量でインビボで有効であることが判明し得る。
[00249] 更に、本発明では、ウイルスの伝播に関連する疾患の治療のための医療用製剤を製造するための、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９またはそのアナログを含むトランスフェリン融合タンパク質の使用が意図される。
可溶性毒素受容体
[00250] 本発明は、可溶性毒素受容体およびトランスフェリンまたは改変トランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される用語「毒素」は、生物学的起源の毒性物質を示す。可溶性毒素受容体を含む融合タンパク質は、毒素に関連する疾患に罹患している患者を治療するために使用することができる。このような融合タンパク質はまた、診断目的のために使用することができる。
[00251] 毒素の例には、シュードモナスの外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シガトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、αコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、αチツストキシン、サキシトキシン、アノトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスホリアチン毒素Ａ、エクスホリアチン毒素Ｂ、エンテロトキシン、毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）毒素、ガス壊疽毒素などが含まれるが、これらに限定されない。これらの毒素のいくつかが引き起こす疾患の重大さ、および、それらのいくつかを生物兵器のために得ることの容易さのために、低コストで大量の強力な抗毒素を得るための方法を開発することが求められている。
[00252] 本発明では、様々な毒素に関連する疾患の治療および予防のための、抗毒素としての可溶性毒素受容体の使用が意図される。毒素受容体は、特定の毒素に結合する分子である。可溶性毒素受容体は、溶解させることができる毒素受容体である。通常、受容体のペプチドまたはフラグメントは可溶性である。本発明は、特定の毒素と結合する毒素受容体の可溶性のペプチドまたはフラグメントに関する。
[00253] 先で論じた他のペプチドと同様に、これらのペプチドは半減期が短い。本発明は、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合された毒素受容体の可溶性ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。得られる融合タンパク質は、可溶性の毒素受容体ペプチドと比較して、増大した半減期を有する。融合タンパク質はまた、組換え手段によって大量に製造することが容易である。可溶性ペプチドの結合特性は変化していないので、可溶性ペプチドは、循環している毒素と結合し、毒素が標的受容体に結合することを妨げ、したがって、毒素を不活性化する。したがって、融合タンパク質は強力な抗毒素である。
[00254] 一実施形態において、本発明は、トランスフェリンまたは改変トランスフェリンに融合された可溶性毒素受容体と、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、毒素に関連した疾患または状態の治療または予防のための医薬品を製造するための、可溶性毒素受容体を含むトランスフェリン融合タンパク質の使用を提供する。
[00255] 大量に製造することが困難であり、かつ、費用がかかる抗体とは異なり、本発明のトランスフェリン／抗毒素融合タンパク質は非常に強力であり、製造にあまり費用がかからない。また、免疫化は、バイオテロ行為の後の集団曝露の場合において保護するために要求される抗体力価を維持するとは期待されない。集団を、曝露を見越して大規模に免疫化することは非現実的である。
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素受容体
[00256] 炭疽毒素は、炭疽菌に由来する生物兵器のよく知られている作用因である。炭疽菌は、適切に組み合わせられたときに２つの強力な毒素（まとめて炭疽毒素と呼ばれる）を形成する３つのタンパク質を産生する。保護抗原（ＰＡ、８２，６８４Ｄａ（ダルトン））および浮腫因子（ＥＦ、８９，８４０Ｄａ）が一緒になって浮腫毒素（ＥＴ）を形成し、一方で、ＰＡおよび致死因子（ＬＦ、９０，２３７Ｄａ）が一緒になって致死毒素（ＬＴ）を形成する（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ｈ．、Ａｌｏｕｆ，Ｊ．Ｅ．およびＦｒｅｅｒ，Ｊ．Ｈ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２７７〜３０２、１９９１）。ＥＴおよびＬＴはそれぞれがＡＢ毒素モデルと一致しており、この場合、ＰＡが標的細胞結合（Ｂ）機能を提供し、ＥＦまたはＬＦがエフェクター成分または触媒作用成分（Ａ）として作用する。これらの毒素の特異な特徴は、ＬＦおよびＥＦは、明らかに真核生物細胞の細胞質ゾルに進入することができないので、ＰＡの非存在下では毒性を有しないということである。
[00257] 最近、致死因子（ＬＦ）の標的の２つが細胞において同定された。ＬＦは、Ｍｅｋ１タンパク質およびＭｅｋ２タンパク質（すなわち、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の一部であるキナーゼ）を特異的に切断するメタロプロテアーゼである。ＬＦのタンパク質分解活性は、有糸分裂促進因子により活性化されるプロテインキナーゼのキナーゼ１またはキナーゼ２（ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）の切断によってＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を不活性化する（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ａ．、Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ（Ｊ．Ｅ．ＡｌｏｕｆおよびＪ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ編、第２版）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；２４３頁〜２６３頁）。
[00258] ＰＡは多くのタイプの細胞の表面に結合することができる。ＰＡが感受性細胞の表面の特定の受容体（Ｌｅｐｐｌａ、上記、１９９１）に結合した後、ＰＡは細胞表面のプロテアーゼ（恐らくはフリン）によって一カ所だけが切断されて、受容体／ＰＡ複合体から放出されるアミノ末端の１９ｋＤａフラグメントをもたらす（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１９１０３〜１９１０７、１９８９）。このフラグメントがＰＡから除去されることにより、受容体に結合した６３ｋＤａのカルボキシル末端フラグメント（ＰＡ６３）におけるＬＦおよびＥＦに対する高親和性の結合部位が露出する。ＰＡ６３およびＬＦまたはＥＦの複合体が細胞の中に進入し、恐らくは、酸性化されたエンドソームを通過して細胞質ゾルに到達する。
[00259] ＰＡ（毒素の、非毒性の細胞結合性成分）は、現在利用可能なヒトワクチンの必須成分である。ワクチンは通常、炭疽菌のＳｔｅｒｎｅ株（これは無毒性であるが、クラスＩＩＩの病原体として取り扱われることが依然として要求される）のバッチ培養から製造されている。ＰＡに加えて、ワクチンは、少量の炭疽毒素成分（浮腫因子および致死因子）、ならびに様々な培養由来のタンパク質を含有する。これらの因子はすべてが、一部の個体におけるワクチンの記録された反応原性の一因である。ワクチンは高価であり、４回のワクチン接種からなる６ヶ月の経過期間を必要とする。更に、現在の明白な事実により、このワクチンは、特定の菌株を用いた吸入による抗原刺激に対して効果的でないことがあることが示唆されている（Ｍ．Ｇ．Ｂｒｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ａｎｔｈｒａｘ、１９８９年４月１１日〜１３日、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ ｍｅｄ Ｂｕｌｌ Ｓｕｐｐｌ、第６８号（１９９０）、９１〜９２）。
[00260] Ｂｒａｄｌｅｙら（Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１４：２２５〜２２９）は、ＰＡに結合するヒト炭疽受容体のクローニングを開示する。受容体ＡＴＲ（炭疽毒素受容体）は、３６８個のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質である。このタンパク質は、２７アミノ酸の予測されるシグナルペプチド、３つの推定されるＮ結合型グリコシル化部位を含有する２９３アミノ酸の細胞外ドメイン、２３アミノ酸の推定される膜貫通領域、および、２５アミノ酸の短い細胞質テールを有する。ＡＴＲの特筆すべき特徴は、細胞外ドメインが、タンパク質−タンパク質の相互作用において重要であることが既知のフォンウィルブランド因子タイプＡ（ＶＷＡ）ドメインからなるということである。このＶＷＡドメインはアミノ酸４４〜２１６に存在する。アミノ酸４１〜２２７を含むＡＴＲの可溶性型は炭疽毒素と結合することが示された。したがって、ＡＴＲのＶＷＡドメインはＰＡに直接的に結合する。
[00261] 本発明は、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合されたＡＴＲの細胞外ドメインを含む炭疽抗毒素を提供する。本発明ではまた、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合されたＰＡと結合するＡＴＲの細胞外メインのそのフラグメントを含む融合タンパク質が意図される。更に、本発明では、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合されたＰＡと結合するＡＴＲの細胞外ドメインの小分子ミメティックを含む融合タンパク質が意図される。好ましくは、本発明は、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合されたＡＴＲのアミノ鎖４１〜２２７を提供する。
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素
[00262] クロストリジウムの神経毒は最も有毒な物質である。ヒトは、創傷の結果として、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）により産生される神経毒（破傷風毒素）にさらされる。破傷風毒素は、世界中の開発途上国では、依然として重大な公衆健康問題の１つであるが、西洋社会では、ほぼ全員が、小児期の免疫化の結果として、破傷風毒素から保護されている。ヒトは、通常、食中毒によって、ボツリヌス菌により産生される神経毒（ボツリヌス毒素）と接触する。しかしながら、創傷ボツリヌス中毒の発生、および幼児ボツリヌス症として知られる新生児の定着性感染の発生は希である。ボツリヌス中毒は希であるので、一般住民の免疫化は、費用、およびワクチンに対する有害反応の予想率に基づいて認可されていない。したがって、ヒトはボツリヌス毒素から保護されてない。また、これらの毒素は比較的、製造が容易である。その結果、ボツリヌス毒素は格好の生物兵器作用因である。
[00263] 論じたように、嫌気性グラム陽性細菌のボツリヌス菌は、ヒト致死量がナノグラム範囲にあることが知られている最も有毒な生物学的神経毒を産生する。毒素の作用は、大腸の破壊を生じさせ得る下痢性の疾患から、死を生じさせ得る麻痺性の作用にまで及ぶ。ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見出されており、また、多くのボツリヌス中毒事例の原因である、自家製缶詰の不適切に滅菌および密封された食品容器において増殖し得る。ボツリヌス中毒の症状は、典型的には、ボツリヌス菌の培養物または胞子が感染した食物を食べた後１８〜３６時間で現れる。ボツリヌス毒素は、明らかに、腸の内張層を弱毒化されずに通過し、末梢運動神経細胞を攻撃する。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、燕下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にまで進行し得る。
[00264] ボツリヌス中毒疾患は、毒素の血流内への移入方法に基づいて４つのタイプに類別することができる。食品媒介のボツリヌス中毒が、ボツリヌス毒素を含有する不適切に保存され、不十分に加熱された食品を摂取することから生じている（すなわち、毒素が摂取前に既に産生されている）。創傷により誘導されるボツリヌス中毒が、ボツリヌス菌が外傷を受けた組織に侵入し、血流に吸収される毒素を産生することから生じている。１９５０年以降、３０例の創傷ボツリヌス中毒が報告されている（Ｓｗａｒｔｚ、「嫌気性の胞子形成桿菌：クロストリジウム属細菌」、６３３頁〜６４６頁［Ｄａｖｉｓら（編）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．（１９９０）］）。吸入ボツリヌス中毒が、毒素を吸入したときに生じている。吸入ボツリヌス中毒が、実験室での事故による曝露の結果として報告されており（Ｈｏｌｚｅｒ、Ｍｅｄ．Ｋｌｉｎ．、４１：１７３５［１９６２］）、これは、毒素が生物兵器の作用因として使用された場合には潜在的に危険である（Ｆｒａｎｚら、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ、ＤａｓＧｕｐｔａ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９３］、４７３頁〜４７６頁）。感染性の幼児ボツリヌス中毒が、ボツリヌス菌が幼児の腸に定着し、毒素の産生および血流内へのその吸収が生じることから生じている。
[00265] ボツリヌス菌の異なる菌株がそれぞれ、Ａ〜Ｇの文字によって示される抗原的に異なる毒素を産生する。血清型Ａの毒素が食品ボツリヌス中毒事例の２６％に関係している；Ｂ型、Ｅ型およびＦ型もまた、食品ボツリヌス中毒事例のより小さい割合に関係している（Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４：４１９（１９８０））。創傷ボツリヌス中毒は、報告によれば、Ａ型毒素またはＢ型毒素だけによって引き起こされている（Ｓｕｇｉｙａｍａ、同上）。幼児ボツリヌス中毒のほぼすべての事例が、Ａ型毒素またはＢ型毒素のいずれかを産生する細菌によって引き起こされている（例外的に、１つのニューメキシコ事例が、Ｆ型毒素を産生するボツリヌス菌によって引き起こされ、別の１例が、Ｂ型Ｆ型のハイブリッドを産生するボツリヌス菌によって引き起こされた）（Ａｒｎｏｎ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．、３：４５（１９８１））。Ｃ型毒素は、水鳥、ウシ、ウマおよびミンクを冒す。Ｄ型毒素はウシを冒し、Ｅ型毒素はヒトおよび鳥類の両方を冒す。
[00266] ボツリヌス菌の神経毒は神経終末に作用して、アセチルコリンの放出を阻止する。神経毒が膜受容体にその重鎖を介して結合することが、毒素作用のその様式における最初の必須段階である。Ｌｉら（Ｊ Ｎａｔ Ｔｏｘｉｎｓ、１９９８、７（３）：２１５〜２６）は、神経毒アフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて、ラットの脳シナプトソームからＥ型ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ／Ｅ）またはＡ型ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ）を精製した。０．５ＭのＮａＣｌを用いてアフィニティーカラムから溶出されたタンパク質画分には、５７ｋＤａのタンパク質が主要な溶出物として含有された。溶出物を抗シナプトタグミン抗体で免疫ブロットすることにより、５７ｋＤａのタンパク質はシナプトタグミンＩであることが明らかにされた。ラットのシナプトタグミンＩは、ラット脳におけるＢｏＮＴ／Ｂに対する受容体として示唆されている（Ｎｉｓｈｉｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１０４９８〜１０５０３、１９９４）。Ｌｉらは、マイクロタイタープレートに基づく方法によってシナプトタグミンＩに対するＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅの結合を調べた。プレートにコーティングされたＢｏＮＴ／Ａに対するシナプトタグミンＩの結合は、このタンパク質をＢｏＮＴ／Ｅをプレインキュベーションしたとき、競合的に低下した。このことは、受容体に対するＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅの競合的な結合を示唆している。まとめると、これらの結果は、同じタンパク質受容体が、試験された３つのＢｏＮＴ血清型のすべてに結合することを示唆している。
[00267] シナプトタグミンＩは、ボツリヌス菌神経毒の血清型Ａ、血清型Ｂおよび血清型Ｅ、そして恐らくは血清型Ｃ、血清型Ｄ、血清型Ｆおよび血清型Ｇの広範囲作用受容体である。シナプトタグミンＩは運動神経細胞に存在する。シナプトタグミンＩのＮ末端フラグメント（アミノ酸１〜５３；配列番号４）は、様々な神経毒血清型に対する結合を担っている。結合により、神経毒の細胞内への移動が媒介され、神経伝達物質の放出が阻止され、その結果、麻痺および極端な場合には死がもたらされる。Ｎ末端フラグメントは組換え手段によって産生させることができ、また、循環している神経毒と結合させるために使用することができる。フラグメントが神経毒に結合することにより、神経毒がその標的受容体と結合することが妨げられ、その結果、毒素の中和がもたらされる。
[00268] 本発明の目標は、組換え産生された５３アミノ酸フラグメントと比較して著しく増大した半減期を有し、その結果、神経毒が循環に進入したとき、抗毒素が神経毒を見つけ、その神経毒と結合するための十分な時間を有する、ボツリヌス菌抗毒素を提供することである。本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合されたシナプトタグミンＩのＮ末端の５３アミノ酸フラグメントを含み、それにより、フラグメントの半減期を、フラグメントの結合特性を変化させることなく増大させる融合タンパク質を提供する。あるいは、フラグメントは、循環寿命を延ばすために化学的にＰＥＧ化することができる。抗毒素の半減期が長くなると、施された投与がより効果的になる。抗体とは異なり、本発明の抗毒素融合タンパク質は広範囲に作用し、かつ、いくつかの神経毒血清型、特に、Ａ型、Ｂ型およびＥ型の神経毒に結合する。
[00269] 好ましい実施形態において、融合タンパク質は、バイオテロ行為における集団曝露の後の集団を治療するために妥当なコストで多量の抗毒素を提供し得る高効率の微生物産生システムで製造される。この融合タンパク質はまた、曝露に先立つ予防的様式で使用することができる。
[00270] 本発明ではまた、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合されたシナプトタグミンＩのアミノ酸１〜５３のペプチドフラグメントまたはシナプトタグミンＩのアミノ酸１〜５３の小分子ミメティックを含む抗毒素が意図される。
[00271] 融合タンパク質はまた、市民集団における食品汚染または空気汚染によるボツリヌス中毒拡大を阻止するために使用することができる。
[00272] 本発明の１つの態様において、抗毒素融合タンパク質は、片頭痛、ジストニーおよび多汗症などの様々な疾患の治療の後の、ボツリヌス菌神経毒の薬物使用および偶発的な過剰投与から生じる創傷ボツリヌス中毒を治療するために使用される。
[00273] 本発明の別の態様において、抗毒素融合タンパク質は、食中毒に由来するボツリヌス中毒を治療するために使用される。
ジフテリア毒素受容体
[00274] ジフテリアは、典型的には粘膜を冒す細菌であるジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって引き起こされる：鼻および喉が、感染が生じる格好な場所であるが、眼または生殖器の粘膜にもまた感染し得る。この細菌は、最初の感染があった部位において、また、毒素が血流を介して広がると、身体の他の部分において組織に対する損傷を生じさせる毒素を産生する。ジフテリア毒素の最も重大な作用は、心臓に対する作用（ポンプ能力の喪失をもたらす筋肉損傷）、腎臓に対する作用、および神経系に対する作用である。
[00275] ジフテリアは、細菌を殺すペニシリンまたは他の抗生物質を与えることによって、そして、体内の遊離毒素を排除する抗毒素を与えることによって治療することができる。しかしながら、抗毒素は、細胞に既に結合し、細胞に損傷を与え始めている毒素を排除しない。より良好な方法は、毒素に対する免疫性を刺激するためにトキソイドを与えることであり、したがって、これにより、毒素が現れるとすぐに、身体は毒素を排除することができる。ジフテリア毒素（ＤＴ）など細菌毒素に対する免疫性は、感染の経過時に自然に獲得され得るか、または、毒素の無毒化された形態（すなわち、トキソイド）を注射することによって人為的に獲得され得る（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ編、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、Ｆｌａ、１９８４）。トキソイドは、昔から、天然の毒素を非毒性にし、その一方で、ワクチン接種された動物を天然の毒素によるその後の抗原刺激から保護する抗原性を保持する天然毒素の化学的修飾（例えば、ホルマリンまたはホルムアルデヒドを用いて）によって調製されている（Ｌｉｎｇｏｏｄら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．、４４：１７７、１９６３）。化学的に不活化されたＤＴの一例が、ＭｉｃｈｅｌおよびＤｉｒｋｘ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４９１：２８６〜２９５、１９７７）に記載されており、これは、フラグメントＡのＴｒｐ−１５３が修飾残基である。トキソイドは、最初は２ヶ月、４ヶ月および６ヶ月のときに、再び１８ヶ月および５歳のときに、そしてその後は１０年毎に定期的に与えられる。
[00276] ここ数年、ジフテリアはもはや主要な公衆衛生の脅威ではなくなったと思われていた。しかしながら、最近では、以前のソ連邦の新独立国家、エクアドル、タイ、アルジェリアおよび他の国々においてジフテリアが復活している。ジフテリア患者は、結合していない毒素を中和するウマの抗毒素で治療されるが、生存患者は、多くの場合、血清病、すなわち、免疫複合型疾患を発症している。したがって、ジフテリア患者のためのより良好な治療を開発することが求められている。
[00277] ＤＴ分子は、５３５アミノ酸の単鎖ポリペプチドとして産生されるが、それは容易にスプライシングされて、残基１９０、１９２または１９３における切断の結果として、ジスルフィド結合により連結された２つのサブユニットであるフラグメントＡ（約２１ＫｄａのＮ末端）およびフラグメントＢ（約３７ＫｄａのＣ末端）を形成する（Ｍｏｓｋａｕｇら、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６４：１５７０９〜１５７１３、１９８９；Ｃｏｌｌｉｅｒら、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２４６：１４９６〜１５０３、１９７１）。フラグメントＡはＤＴの触媒活性な部分である。フラグメントＡは、伸張因子２（ＥＦ−２）と名付けられたタンパク質合成因子を特異的に標的とし、それにより、ＥＦ２を不活性化し、細胞におけるタンパク質合成を停止させる、ＮＡＤ依存性ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。フラグメントＡはジフテリア毒素のＣドメインからなる。フラグメントＡは、ポリペプチドループによってジフテリア毒素のフラグメントＢに連結される。ＤＴのフラグメントＢは受容体結合ドメイン（Ｒドメイン）を有しており、これにより、毒素分子が認識され、多くのタイプの哺乳動物細胞の表面に見出される特定の受容体構造に結合する。ＤＴがこの受容体構造を介して細胞に結合すると、受容体／ＤＴの複合体が、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞によって取り込まれる。フラグメントＢにおける第二の機能的な領域（Ｔドメイン）が作用して、エンドサイト小胞の膜を越えてＤＴを移動させ、それにより、触媒活性なフラグメントＡを細胞の細胞質ゾル内に放出させる。１分子のフラグメントＡが、細胞におけるタンパク質合成装置を不活性化するために十分である。
[00278] Ｎａｇｌｉｃｈら（Ｃｅｌｌ、１９９２、６９：１０５１〜１０６１）は、毒素高感受性のサルＶｅｒｏ細胞からのジフテリア毒素受容体の発現クローニングを記載している。受容体のアミノ酸配列は、細胞表面に発現するヘパリン結合性の上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の前駆体（プロＨＢ−ＥＧＦ）のアミノ酸配列と同一であることが見出された。プロＨＢ−ＥＧＦは切断され、可溶性の成熟型ＨＢ−ＥＧＦとして放出されるが（Ｇｏｉｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１９９５、６：９６７〜９８０）、著しい量のプロＨＢ−ＥＧＦが細胞表面に留まり、ジャクスタクリンな増殖因子として機能し（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：９２９〜９３８）、また、ＤＴ受容体として機能する（Ｉｗａｍｏｔｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９４、１３：２３２２〜２３３０；Ｎａｇｌｉｃｈら、Ｃｅｌｌ、１９９２、６９：１０５１〜１０６１）。
[00279] Ｈｏｏｐｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９５、２０６：７１０〜７１７）は、残基６３〜１４８（細胞外ドメインまたは成熟した増殖因子）からなる組換え成熟型ヒトＨＢ−ＥＧＦが毒素受容体保有細胞に対する放射能標識されたＤＴの結合を強く阻害することを示している。この結果から、ジフテリア患者を成熟型ＨＢ−ＥＧＦ（血清病を生じさせない天然型増殖因子）で治療することが可能であることが示唆される。しかしながら、成熟型ＨＢ−ＥＧＦは、その増殖因子活性のために副作用を生じさせ得る。
[00280] Ｃｈａら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００２、７０（５）：２３４４〜２３５０）は、ヒトＤＴ受容体／ＨＢ−ＥＧＦ前駆体に基づく治療を開発した。Ｃｈａらは、残基１０６〜１４９からなり、かつ、ヘパリン結合性ドメインのほとんどを有さず、細胞に対する放射性ヨウ素化ＤＴの結合を阻害することができる組換え短縮型ＨＢ−ＥＧＦを教示している。その上、Ｃｈａらは、これが、組換え成熟型ＨＢ−ＥＧＦよりも効果的なＤＴ結合阻害剤であることを示した。更に、研究者らは、組換え短縮型ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインにおいていくつかの残基を変異させて、その分裂促進作用の一部を破壊した。受容体アナログ（Ｉ１１７Ａ／Ｌ１４８Ａ）が低い分裂促進作用を示すことが明らかにされた。短縮型（Ｉ１１７Ａ／Ｌ１４８Ａ）ＨＢ−ＥＧＦタンパク質は大きいＤＴ結合親和性を保持していた。Ｃｈａらの研究では、短縮型（Ｉ１１７Ａ／Ｌ１４８Ａ）ＨＢ−ＥＧＦタンパク質はＥＧＦ受容体に対する安全な抗毒素であり得ることが示唆される。
[00281] 本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合された短縮型（Ｉ１１７Ａ／Ｌ１４８Ａ）ＨＢ−ＥＧＦタンパク質を含む抗毒素融合タンパク質を提供する。本発明はまた、ＤＴと結合し、かつ、最小限の分裂促進活性を有する短縮型（Ｉ１１７Ａ／Ｌ１４８Ａ）ＨＢ−ＥＧＦタンパク質のそのフラグメントを含むトランスフェリン／抗毒素融合タンパク質を提供する。更に、本発明は、ＤＴと結合し、かつ、最小限の分裂促進活性を有する短縮型ＨＢ−ＥＧＦタンパク質のアナログを含むトランスフェリン／抗毒素融合タンパク質を提供する。
他の毒素受容体
[00282] 細菌バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、ＢＴ）は、限られた範囲の昆虫（大部分が鱗翅目、鞘翅目および双翅目である）に対して毒性である殺菌性タンパク質を産生する。Ｂｔ毒素は、バチルス・チューリンギエンシスを植物に付けることによって、または、植物自体を形質転換し、その結果、植物がその遺伝子組換え形質により毒素を産生することによって、害虫を駆除するために使用されている。毒素そのものは、Ｈｏｆｔｅ，Ｈ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（１９８９）、５３：２４２）によって記載されるように、ｃｒｙ遺伝子の糖タンパク質産物である。米国特許第５，６９３，４９１号には、バチルス・チューリンギエンシス毒素と結合するタバコスズメガ幼虫由来の糖タンパク質受容体をコードするｃＤＮＡが開示される。このｃＤＮＡが利用できることにより、相同的な受容体をコードするＤＮＡを他の昆虫および生物から見つけ出すことが可能であり、そして同様に、潜在的な殺虫剤の細胞毒性および結合親和性についてのアッセイの設計、ならびに、天然の相同的な受容体および／または導入された相同的な受容体を操作するための方法、したがって、標的の細胞、組織および／または生物を殺すための方法の開発が可能である。
[00283] コレラ毒素（ＣＴ）をコードするｃｔｘＡ遺伝子を欠失することによって構築されたコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ワクチン候補物はほとんどが、大きな抗体応答を誘発することができるが、このようなワクチンの半分以上は依然として軽度の下痢を生じさせている（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６（１）：１６１〜１６７（１９８８））。ＣＴの非存在下で誘導される下痢の大きさを考えると、コレラ菌は、ｃｔｘＡ配列欠失株に依然として存在する他の腸毒素原性因子を産生することが仮定された（Ｌｅｖｉｎｅら、上記）。結果として、コレラ菌により作られ、残る下痢の一因である第２の毒素である、zonula occludens toxin（以降、「ＺＯＴ」）が発見された（Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８：５２４２〜５２４６（１９９１））。ｚｏｔ遺伝子はｃｔｘ遺伝子のすぐ隣に位置する。コレラ菌株の間におけるｚｏｔ遺伝子とｃｔｘ遺伝子との高い割合の同時性（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、３１／３：７３２〜７３３（１９９３）；Ｋａｒａｓａｗａら、ＦＥＢＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０６：１４３〜１４６（１９９３））は、コレラの典型的な急性脱水性下痢を引き起こすことにおけるＺＯＴの相乗的作用が考えられることを示唆している。ｚｏｔ遺伝子はまた、他の腸内病原体においても同定されている（Ｔｓｃｈａｐｅ、腸チフスおよび他のサルモネラ症に関する第２回アジア太平洋シンポジウム、４７（Ａｂｓｔｒ．）（１９９４））。米国特許第５，８６４，０１４号には、zonula occludens toxinに対する精製された受容体が開示される。
[00284] 下痢は、様々な病原性細菌により産生される小さい熱安定性のペプチド毒素（ＳＴ）によって引き起こされ得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．、１９８７、Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．、６、１０３〜１１６）。開発途上国では、このような毒素は、報告された下痢症例の５０％〜８０％の原因であり得る（Ｇｉａｎｎｅｌｌａ，Ｒ．Ａ．、１９８１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、３２、３４１〜３５７）。ＳＴはまた、研究室動物および家畜における下痢の主要な原因である（Ｂｕｒｇｅｓｓら、１９７８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２１、５２６〜５３１）。熱に安定なエンテロトキシンが腸において細胞表面の受容体に結合し、その後、グアニリルシクラーゼの活性化をもたらすことが示されている（Ｆｉｅｌｄら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５、２８００〜２８０４；Ｇｕｅｒｒａｎｔら、１９８０、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１４２、２２０〜２２８）。環状ＧＭＰの上昇は、その後、体液分泌を刺激し、それにより下痢を引き起こす。ＳＴ受容体は、界面活性剤により可溶化されたＳＴ結合性タンパク質がグアニリルシクラーゼ活性からクロマトグラフィーにより部分的に分離されることに基づいて、グアニリルシクラーゼとは明らかに異なるタンパク質であることが報告されている（Ｋｕｎｏら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、１４７０〜１４７６；Ｗａｌｄｍａｎら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５１、３２０〜３２６）。米国特許第５，２３７，０５１号には、熱に安定なエンテロトキシンを認識し、かつ、グアニリルシクラーゼ活性を有する腸受容体をコードする核酸のクローニングが開示される。データは、受容体がエンテロトキシンと結合し、環状ＧＭＰセカンドメッセンジャー系を介して正常にシグナル伝達することを示している。
[00285] 敗血症は、毒素により誘導される感染または外傷によって最も一般的に引き起こされる。敗血症の最初の症状は、典型的には、悪寒、おびただしい汗、不規則な弛緩熱、衰弱など、それに続く、持続した発熱、ショックをもたらす低血圧、好中球減少、白血球減少、汎発性血管内凝固、成人呼吸窮迫症候群および多臓器不全が含まれる。敗血症を誘導する毒素は、病原性細菌、ウイルス、植物および毒液と関連することが見出されている。詳しく記載されている細菌毒素には、グラム陰性細菌のエンドトキシンまたはリポ多糖（ＬＰＳ）がある。これらの分子は、すべてのグラム陰性細菌の外膜に遍在する糖脂質である。膜に固定されたＣＤ１４が、タンパク質と結合したエンドトキシン（ＬＰＳ）複合体に対する受容体として作用し、エンドトキシンの細胞作用を媒介することが報告されている（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１４３１）。アミノ酸７１で短縮化された可溶性ＣＤ１４（Ｎ７１）はリポ多糖結合配列を含有する。Ｎ７１は、循環ＬＰＳを中和すること、すなわち、エンドトキシンアンタゴニストとして作用することが示されている（Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、７０：１０３）。
抗毒素融合タンパク質の送達方法
[00286] 一実施形態において、本発明の抗毒素融合タンパク質は、２つの連続したチャンバーを備える単ピストンシリンジにパッケージングされる。第１のチャンバーは希釈剤を含有し、第２のチャンバーは、凍結乾燥された抗毒素融合タンパク質を含有する。プランジャーが押し下げられると、希釈剤が隣のチャンバーに送り出され、抗毒素融合タンパク質を溶解し、抗毒素融合タンパク質が直接的な筋肉内送達のためのニードルを通って押し出される。希釈剤は、凍結条件において作用するために、グリセロールなどの凍結防止剤を含有することができる。凍結乾燥された製造物は熱帯の状態でも安定なままである。
[00287] 本発明では、毒素にさらされる危険性が高い戦闘状況に入る兵士にこの様式で本発明の抗毒素融合タンパク質を送達することが意図される。本発明の抗毒素融合タンパク質は戦場での緊急治療のために使用することができ、また、戦場に行く前に予防剤として使用することができる。
核酸
[00288] 本発明はまた、治療タンパク質（好ましくは、治療タンパク質）に共有結合的に連結または結合されたトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含むトランスフェリン融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。以下で詳細に論じるように、任意の治療タンパク質を使用することができる。融合タンパク質は、リンカー領域、例えば、約５０アミノ酸残基未満、４０アミノ酸残基未満、３０アミノ酸残基未満、２０アミノ酸残基未満または１０アミノ酸残基未満のリンカーを更に含むことができる。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部および治療タンパク質（好ましくは、治療タンパク質）に対して、また、トランスフェリンタンパク質またはその一部および治療タンパク質（好ましくは、治療タンパク質）の間で共有結合的に連結することができる。本発明の核酸分子は精製されてもよく、または未精製であってもよい。
[00289] 核酸分子を複製するための宿主細胞およびベクター、ならびに、コードされた融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターもまた提供される。任意のベクターまたは宿主細胞、それらが原核生物由来または真核生物由来であっても、使用することができるが、真核生物発現システム（特に、酵母発現システム）が好ましい場合がある。多くのベクターおよび宿主細胞がこのような目的のために当分野で知られている。所望する適用のために適切な組合せを選択することは十分に当分野の技術の範囲内である。
[00290] トランスフェリン、トランスフェリンの一部、および目的とする治療タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、当分野で既知の様々なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。プローブに基づく方法を使用してこのようなＤＮＡ配列を単離するための技術は、従来技術であり、当業者には周知である。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公表されたＤＮＡ配列またはタンパク質配列に基づくことができる（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）、種々の種に由来するトランスフェリン配列の比較、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６Ｂ／１：２０３〜２１８、およびそれに引用されるすべての参考文献を参照されたい；これらをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）。あるいは、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）（これらを参照として本明細書中に組み入れる）によって開示されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することができる。このようなＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
[00291] 当分野では周知のように、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間における「類似性」が、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列およびその保存されたヌクレオチド置換またはアミノ酸置換を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間における配列関連性の程度を意味する「同一性」もまた当分野では知られており、これは、このような配列の２つの鎖の間における一致の同一性によって決定される。同一性および類似性はともに容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
[00292] 多数の方法が、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間における同一性および類似性を測定するために存在するが、用語「同一性」および用語「類似性」は当業者には周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８））。２つの配列の間における同一性または類似性を決定するために一般に用いられる方法には、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４）；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が含まれるが、それらに限定されない。
[00293] 同一性を決定するための好ましい方法は、調べられている２つの配列の間において最大の一致をもたらすように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法はコンピュータープログラムに記述されている。２つの配列の間における同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ編、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。上述の類似性または同一性の程度は２つの配列の間における同一性の程度として決定され、これにより、多くの場合、第１の配列が第２の配列に由来することが示される。２つの核酸配列の間における同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３（１９７０））などの当分野で既知のコンピュータープログラムによって決定することができる。本発明のために２つの核酸配列の間における同一性の程度を決定する目的のためには、ＧＡＰは下記の設定で使用される：ＧＡＰ生成ペナルティー：５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー：０．３。
コドンの最適化
[00294] 遺伝暗号の縮重性は、トランスフェリンタンパク質および／または目的とする治療タンパク質のヌクレオチド配列の様々な変化を可能にし、その一方で、生来的なＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを依然としてもたらす。「コドンの最適化」として知られる手法（これは米国特許第５，５４７，８７１号（これをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に記載される）により、このような変化したＤＮＡ配列を設計する手段が提供される。コドンが最適化された遺伝子の設計では、生物におけるコドン使用の頻度、隣接頻度、ＲＮＡ安定性、二次構造形成に対する可能性、合成経路、およびその遺伝子の意図された将来のＤＮＡ操作を含む様々な要因を考慮に入れなければならない。具体的には、利用可能な方法を使用して、酵母発現システムが使用されるときの酵母によって最も容易に認識されるコドンを用いて、所与の融合タンパク質をコードするコドンを変化させることができる。
[00295] 遺伝暗号の縮重性は、同じアミノ酸配列を多くの異なる様式でコードおよび翻訳させることができる。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンはそれぞれが、６つの異なるコドンによってコードされ、一方、バリン、プロリン、トレオニン、アラニンおよびグリシンはそれぞれが、４つの異なるコドンによってコードされる。しかしながら、このような同義的コドンの使用頻度は真核生物および原核生物の間でゲノム毎に異なる。例えば、哺乳動物の間における同義的コドンの選択パターンは非常に類似しており、その一方で、進化的に離れている生物、例えば、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、細菌（例えば、大腸菌など）および昆虫（例えば、キイロショウジョウバエなど）などでは、ゲノムでのコドン使用頻度の明らかに異なるパターンが明らかにされている（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、８、４９〜６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、９、４３〜７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９増刊、１９８１〜１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１））。コドン選択パターンにおけるこれらの違いは、ペプチド伸長速度を調節することによって個々の遺伝子の全体的な発現レベルに寄与するようである（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、３、２８９５〜２８９８（１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．およびＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９（１９８１））。
[00296] 合成遺伝子に対する好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現のために使用されることが意図される細胞／生物の正確なゲノム（またはできる限り近い関係にあるゲノム）、特に、酵母種のゲノムに由来する核遺伝子のコドン使用を反映させなければならない。先に論じたように、好ましい一実施形態において、ヒトＴｆ配列は、治療タンパク質のヌクレオチド配列（１つまたは複数）がコドン最適化され得るように、酵母発現のために本明細書中に記載されるような改変の前またはその後で、コドン最適化が行われる。
ベクター
[00297] 本発明において使用される発現ユニットは、一般に、下記のエレメントを５’から３’の向きで機能的に連結されて含む：転写プロモーター、分泌シグナル配列、目的とする治療タンパク質または治療ペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合された、トランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含む改変Ｔｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーター。先に論じたように、Ｔｆタンパク質もしくはＴｆタンパク質内に融合された治療タンパク質または治療ペプチドの任意の配置を本発明のベクターにおいて使用することができる。適切なプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定され、当業者には明かであり、そして、より具体的には以下に論じる。
[00298] 本発明において使用される適切な酵母ベクターが米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、これには、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１０３５〜１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ、８：１２１〜１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：１０４〜１０８、１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４およびそれらの誘導体が含まれる。有用な酵母プラスミドベクターにはまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７、米国）から入手可能なｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ベクターが含まれる。ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６のプラスミドは、酵母組込型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカー（ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３）を含む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
[00299] このようなベクターは一般には選択マーカーを含み、このような選択マーカーは、形質転換体が選択されることを可能にするために、それに対する表現型アッセイが存在する優性な表現型を示す多数の遺伝子の１つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補するマーカー、抗生物質抵抗性をもたらすマーカー、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするマーカーであり、これらには、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈら、同上）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ、８：１７、１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同上）、またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、欧州特許第１７１，１４２号）が含まれる。他の適切な選択マーカーには、クロラムフェニコール抵抗性を酵母細胞に付与するＣＡＴ遺伝子が含まれる。酵母において使用される好ましいプロモーターには、酵母の解糖系遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２５：１２０７３〜１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：４１９〜４３４、１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０１：１９２〜２０１、１９８３）が含まれる。これに関連して、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３０４：６５２〜６５４、１９８３）である。発現ユニットはまた転写ターミネーターを含むことができる。好ましい転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、同上）である。酵母発現システムの他の好ましいベクターおよび好ましい成分（例えば、プロモーターおよびターミネーターなど）が欧州特許第０２５８０６７号、同第０２８６４２４号、同第０３１７２５４号、同第０３８７３１９号、同第０３８６２２２号、同第０４２４１１７号、同第０４３１８８０号および同第１００２０９５号；欧州特許公開第０８２８７５９号、同第０７６４２０９号、同第０７４９４７８号および同第０８８９９４９号；ＰＣＴ国際公開公報第００／４４７７２号および同第９４／０４６８７号；ならびに米国特許第５，７３９，００７号、同第５，６３７，５０４号、同第５，３０２，６９７号、同第５，２６０，２０２号、同第５，６６７，９８６号、同第５，７２８，５５３号、同第５，７８３，４２３号、同第５，９６５，３８６号、同第６，１５０，１３３号、同第６，３７９，９２４号および同第５，７１４，３７７号（これらをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に開示される。
[00300] 酵母に加えて、本発明の改変融合タンパク質は、糸状菌類において、例えば、アスペルギルス属菌類の菌株において発現させることができる。有用なプロモーターの例には、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の解糖遺伝子に由来するプロモーター、例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：２０９３〜２０９９、１９８５）およびｔｐｉＡプロモーターが含まれる。適切なターミネーターの例には、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同上）がある。このような構成成分を利用する発現ユニットを、例えば、アスペルギルス属の染色体ＤＮＡの中への挿入を可能にするベクターにクローン化することができる。
[00301] 本発明を実施する際に使用される哺乳動物発現ベクターは、改変Ｔｆ融合タンパク質の転写を行わせることができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターには、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが含まれる。好ましいウイルスプロモーターには、アデノウイルス２に由来する主要後期プロモーター２（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２：１３０４〜１３１９９、１９８２）、およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１：８５４〜８６４、１９８１）が含まれる。好ましい細胞プロモーターには、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２：８０９〜８１４、１９８３）およびマウスＶκ（米国特許第６，２９１、２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：５４９６、１９８７）が含まれる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｌｏｈら、同上）である。このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流で、かつ、トランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置する一組のＲＮＡスプライス部位を含有することができる。好ましいＲＮＡスプライス部位をアデノウイルス遺伝子および／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
[00302] 発現ベクターにはまた、目的とするコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルが含有される。ポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来する初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同上）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、ならびにヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、９：３７１９〜３７３０、１９８１）が含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルはＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２を参照されたい）遺伝子のターミネーター（Ｌｏｈら、同上）である。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コード性のウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス２の三成分リーダーなど）を含むことができる。好ましいベクターはまた、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサーおよびマウスのμ（米国特許第６，２９１，２１２を参照されたい）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ、３３：７１７〜７２８、１９８３）などを含むことができる。発現ベクターはまた、アデノウイルスＶＡのＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
形質転換
[00303] 菌類を形質転換するための様々な技術が文献では広く知られており、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同上）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９〜１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１７４０〜１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ、３０１：１６７〜１６９、１９８３）に記載される。クローン化されたＤＮＡ配列を菌類細胞に導入するための他の技術、例えば、エレクトポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９４：１８２〜１８７、１９９１）などを使用することができる。宿主細胞の遺伝子型は、一般には、発現ベクターに存在する選択マーカーによって補完される遺伝的欠陥を含有する。特定の宿主および選択マーカーの選択は十分に当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
[00304] 本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を含むクローン化されたＤＮＡ配列は、培養された哺乳動物細胞に、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、１９７３）によって導入することができる。クローン化されたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入するための他の技術、例えば、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１〜８４５、１９８２）またはリポフェクションなどもまた使用することができる。クローン化されたＤＮＡが組込まれている細胞を同定するために、選択マーカーが、一般には、目的とする遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞において使用される好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲｒ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）のｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｄａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２４９５〜２４９９、１９８３）である。選択マーカーがＴｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ．）によって総説されており、選択マーカーの選択は十分に当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
宿主細胞
[00305] 本発明はまた、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質を発現させるために形質転換されている細胞、好ましくは酵母細胞を含む。形質転換された宿主細胞そのものに加えて、本発明はまた、栄養培地におけるこのような細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローン的に均一な）培養物、またはモノクローナル培養物に由来する培養物を含む。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、ポリペプチドを細胞とともに、または、細胞がろ過もしくは遠心分離によって除かれた場合には細胞を伴うことなく含有する。
[00306] 本発明を実施する際に使用される宿主細胞には、外因性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションされ、培養で増殖させることができる真核生物細胞および場合により原核生物細胞、例えば、培養された哺乳動物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、植物細胞および細菌細胞などが含まれる。
[00307] 酵母の様々な種（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）を含む菌類細胞を本発明において宿主細胞として使用することができる。本発明のトランスフェリン融合タンパク質を発現させるための宿主として本発明の実施において有用であると考えられる酵母を含む菌類の例には、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（この一部は以前にはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属として分類されていた）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、メツチュニコウイア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）属、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、およびエンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属などがある。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．の例には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ．ｒｏｕｘｉｉがある。ＫＩｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．の例には、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓがある。適切なトルラスポラ属種はＴ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．の例には、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前にはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前にはＨ．ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓがある。
[00308] 本発明のＴｆ融合タンパク質を製造するための特に有用な宿主細胞はメタノール資化性ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）である（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、６：６１９〜６２４）。ピキア・パストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローン化されていたので、外来タンパク質を製造するための優れた宿主にするために開発されてきた；その形質転換が１９８５年に初めて報告された。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓは、グルコースが存在しないとき、メタノールを炭素源として利用することができる。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ発現システムでは、アルコールオキシダーゼ（メタノール代謝における最初の段階を触媒する酵素）の発現のためにコードする遺伝子を制御する、メタノールにより誘導されるアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは特徴づけられており、一連のＰ．ｐａｓｔｒｉｓ発現ベクターに取り込まれている。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓで産生されるタンパク質は、典型的には、正しく折り畳まれ、培地に分泌されるので、遺伝子操作されたＰ．ｐａｓｔｒｉｓの発酵により、大腸菌発現システムに代わる優れた方法が提供される。破傷風毒素フラグメント、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）パータクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームを始めとする多数のタンパク質が、このシステムを使用して製造されている。
[00309] 酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は別の好ましい例である。好ましい実施形態において、酵母細胞、または、より具体的には、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化のために要求される遺伝子に遺伝的欠陥を含有するサッカロミセス・セレビシエ宿主細胞が使用される。このような欠陥を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、変異および選択の標準的な技術を使用して調製することができる。しかし、多くの利用可能な酵母菌株が、グリコシル化または過マンノシル化を妨げ、または低下させるために改変されている。Ｂａｌｌｏｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：５９８６〜５９９１、１９８０）は、アスパラギン結合型グリコシル化に影響を及ぼす遺伝子が不完全であるマンノプロテイン生合成変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：４８１〜４８１、１９９７）は、酵母においてタンパク質のＯ−グリコシル化における最初の段階を担う酵素をコードする少なくとも６つの遺伝子（ＰＭＴ１〜６）からなるファミリーを記載している。これらの遺伝子の１つ以上が欠損している変異体は、低下したＯ結合型グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化の変化した特異性を示す。
[00310] 異種タンパク質の製造を最適化するために、宿主菌株が、低下したタンパク質分解活性をもたらす変異、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｅｐ４変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３〜３３、１９７７）を有することもまた好ましい。他のプロテアーゼコード領域に変異を含有する宿主菌株は、本発明のＴｆ融合タンパク質を大量に製造するために特に有用である。
[00311] 本発明のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞は適切な増殖培地において増殖させられる。本明細書中で使用される用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖のために要求される栄養分を含有する培地を意味する。細胞増殖のために要求される栄養分には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が含まれ得る。増殖培地は一般には、ＤＮＡ構築物を含有する細胞について、例えば、薬物選択によって、または、ＤＮＡ構築物に存在する選択マーカー、もしくはＤＮＡ構築物と同時にトランスフェクションされる選択マーカーにより補完される必須栄養分における欠乏によって選択される。例えば、酵母細胞は好ましくは、炭素源（例えば、スクロース）、非アミノ酸窒素源、無機塩、ビタミンおよび必須アミノ酸補充物を含む化学的に規定された培地において増殖させられる。培地のｐＨは、好ましくは、２よりも大きく、かつ８未満のｐＨで維持され、好ましくはｐＨ５．５〜６．５で維持される。安定したｐＨを維持するための方法には、緩衝化および一定したｐＨ制御が含まれる。好ましい緩衝化剤には、コハク酸およびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）が含まれる。アスパラギン結合型グリコシル化のために要求される遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定化剤を含有する培地において増殖させられる。好ましい浸透圧安定化剤は、０．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度で、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍで培地に補充されるソルビトールである。
[00312] 培養されている哺乳動物細胞は、通常、市販の血清含有培地または無血清培地において増殖させられる。使用される特定の細胞株に対して適切な培地の選択は当分野における通常の技術レベルの範囲内である。トランスフェクションされた哺乳動物細胞は、目的とするＤＮＡ配列の発現を開始させるために、一定の期間にわたって、典型的には１日〜２日の期間にわたって増殖させることができる。その後、薬物選択が、選択マーカーを安定した様式で発現している細胞の増殖について選択するために加えられる。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクションされている細胞の場合、薬物の濃度を、増大したコピー数のクローン化された配列について選択するために段階的な様式で増大させることができ、それにより発現レベルを増大させることができる。
[00313] バキュロウイルス／昆虫細胞の発現システムもまた、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するために使用することができる。ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）は組換えタンパク質を昆虫宿主細胞において高レベルで発現させる。標的遺伝子が伝達ベクターに挿入され、その後、伝達ベクターが、線状化されたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡとともに昆虫宿主細胞にコトランスフェクションされる。ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡはバキュロウイルスゲノムの必須部分を有していない。ＤＮＡがベクターとの組換えを起こしたとき、必須エレメントが元に戻り、標的遺伝子がバキュロウイルスのゲノムに移される。組換え後、少数のウイルスプラークが選択され、精製され、そして組換え表現型が確認される。新しく単離された組換えウイルスは、その後、増幅され、そして、昆虫細胞培養物に感染させて、大量の所望するタンパク質を製造するために使用することができる。
[00314] 本発明のＴｆ融合タンパク質はまた、遺伝子組換え植物および遺伝子組換え動物を使用して製造することができる。例えば、ヒツジおよびヤギは治療タンパク質をその乳汁に作製することができる。あるいは、タバコ植物はタンパク質をその葉に含むことができる。遺伝子組換え植物および遺伝子組換え動物によるタンパク質製造ではともに、融合タンパク質をコードする新しい遺伝子を生物のゲノムに加えることが含まれる。遺伝子組換え生物は、新しいタンパク質を産生することができるだけでなく、この能力をその子孫に伝えることもできる。
分泌シグナル配列
[00315] 用語「分泌シグナル配列」または用語「シグナル配列」または用語「分泌リーダー配列」は交換可能に使用され、例えば、米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第５，５４７，８７１号（これらをともにその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列により、分泌ペプチドがコードされる。分泌ペプチドは、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質の細胞からの分泌を行わせるために作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、疎水性アミノ酸のコアによって一般には特徴づけられ、典型的には（しかし、絶対的ではないが）、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見出される。非常に多くの場合、分泌ペプチドは分泌途中で成熟タンパク質から切断される。分泌ペプチドは、分泌経路を通過しているときに成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能にするプロセシング部位を含有する場合がある。プロセシング部位はシグナルペプチド内にコードされ得るか、または、例えば、インビトロ変異誘発法によってシグナルペプチドに付加され得る。
[00316] 分泌ペプチドは、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質の分泌を行わせるために使用することができる。他の分泌ペプチドとの組合せで使用され得る１つのこのような分泌ペプチドとして、α接合因子のリーダー配列がある。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌を生じさせる複雑な一連の翻訳後プロセシング工程のために要求される。完全なシグナル配列が存在する場合、発現途中のタンパク質は粗面小胞体の内腔に進入し、その後、ゴルジ装置を通って分泌小胞に輸送され、最終的には細胞外に輸送される。一般に、シグナル配列は、そのすぐ後には開始コドンが続き、分泌されるタンパク質のアミノ末端端部においてシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切断される。好ましいシグナル配列は、ウイルス発現ベクター、哺乳動物発現ベクターまたは酵母発現ベクターを使用する組換えタンパク質発現のプロセシング効率および細胞外輸送効率を改善する。場合により、生来的なＴｆシグナル配列を、本発明の融合タンパク質を発現および分泌させるために使用することができる。
リンカー
[00317] 本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質のＴｆ成分および治療タンパク質は直接的に融合させることができ、または、より大きい物理的分離を融合されたタンパク質の間にもたらし、かつより大きな空間移動性を融合されたタンパク質の間で可能にし、したがって、例えば、その同系受容体に対する結合のために治療タンパク質の接近性を最大にするために、様々な長さのリンカーペプチドを使用して融合させることができる。リンカーペプチドは、柔軟であるアミノ酸、または、より剛直であるアミノ酸から構成され得る。例えば、ポリグリシンストレッチ（これに限定されない）などのリンカーである。リンカーは、約５０アミノ酸残基未満、４０アミノ酸残基未満、３０アミノ酸残基未満、２０アミノ酸残基未満または１０アミノ酸残基未満であり得る。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部および治療タンパク質に対して、また、トランスフェリンタンパク質またはその一部と治療タンパク質との間に共有結合的に連結することができる。
Ｔｆ融合タンパク質の検出
[00318] 生物学的に活性な改変トランスフェリン融合タンパク質を検出するためのアッセイには、ウエスタントランスファーフィルター、タンパク質ブロットフィルターまたはコロニーフィルター、ならびに、トランスフェリンおよび治療タンパク質を含む融合タンパク質を検出する活性に基づくアッセイを挙げることができる。ウエスタントランスファーフィルターは、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：４３５０〜４３５４、１９７９）によって記載される方法を使用して調製することができる。簡単に記載すると、サンプルがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動される。ゲル中のタンパク質がニトロセルロースペーパーに電気泳動的に転写される。タンパク質ブロットフィルターは、例えば、マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｈ．）を使用してニトロセルロースフィルターで上清サンプルまたは濃縮物をろ過することによって調製することができる。コロニーフィルターは、適切な増殖培地を覆って置かれているニトロセルロースフィルターの上でコロニーを増殖させることによって調製することができる。この方法では、固体培地が好ましい。細胞は、少なくとも１２時間、フィルター上で増殖させられる。細胞が、フィルターに結合したタンパク質を除かない適切な緩衝液で洗浄することによってフィルターから除かれる。好ましい緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）、２０％メタノールを含む。
[00319] 本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、インビボ診断の目的のために、放射性同位体または他のイメージング剤で標識することができる。好ましい放射性同位体画像化剤には、ヨウ素−１２５およびテクネチウム−９９が含まれ、テクネチウム−９９が特に好ましい。タンパク質−放射性同位体のコンジュゲートを製造するための様々な方法が当分野では広く知られており、例えば、Ｅｃｋｅｌｍａｎら（米国特許第４，６５２，４４０号）、Ｐａｒｋｅｒら（国際公開公報第８７／０５０３０号）およびＷｉｌｂｅｒら（欧州特許第２０３，７６４号）によって記載される。あるいは、トランスフェリン融合タンパク質はスピン標識増強剤に結合することができ、また、磁気共鳴（ＭＲ）画像法のために使用することができる。適切なスピン標識増強剤には、安定な立体障害型フリーラジカル化合物（例えば、ニトロキシドなど）が含まれる。リガンドをＭＲ画像法のために標識するための方法が、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎら（米国特許第４，６５６，０２６号）よって開示される。
[00320] 本発明のトランスフェリン融合タンパク質の検出は、治療タンパク質を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれる。適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
[00321] 一実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質が、抗体に結合させるための抗原と結合または抗原と競合する能力についてアッセイされている場合、当分野で知られている様々な免疫測定法を使用することができ、これらには、放射性免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射測定法、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散測定法、インサイチュー免疫測定法（例えば、金コロイドまたは酵素または放射性同位体の標識が使用される）、ウエスタンブロット、沈殿反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法および免疫電気泳動測定法などの技術を使用する競合的アッセイシステムおよび非競合的アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質の結合が、トランスフェリン融合タンパク質上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン融合タンパク質と相互作用する二次抗体または二次的な試薬の結合を検出することによって検出される。更なる実施形態において、二次抗体または二次的な試薬が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおいて結合を検出することについて当分野では知られており、このような手段は本発明の範囲内である。
[00322] 本発明の融合タンパク質はまた、治療タンパク質成分の活性についてアッセイすることによって検出することができる。具体的には、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、当業者に周知のアッセイを使用して、機能的活性（例えば、生物学的活性または治療活性）についてアッセイすることができる。また、当業者は、周知のアッセイを使用して、活性について、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質のフラグメントを定法にしたがってアッセイすることができる。更に、当業者は、当分野で周知のアッセイを使用して、活性について、改変トランスフェリンタンパク質のフラグメントを定法にしたがってアッセイすることができる。
[00323] 例えば、一実施形態において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質が、抗治療ポリペプチド抗体および／または抗トランスフェリン抗体に結合させるための治療タンパク質と結合または競合する能力についてアッセイされている場合、当分野で周知の様々な免疫測定法を使用することができ、これらには、放射性免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射測定法、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散測定法、インサイチュー免疫測定法（例えば、金コロイドまたは酵素または放射性同位体の標識が使用される）、ウエスタンブロット、沈殿反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法および免疫電気泳動測定法などの技術を使用する競合的アッセイシステムおよび非競合的アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、抗体の結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体が、一次抗体に対する二次抗体または二次的な試薬の結合を検出することによって検出される。更なる実施形態において、二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫測定法において結合を検出することについて当分野では知られており、このような手段は本発明の範囲内である。
[00324] 更なる実施形態において、治療タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）が同定されている場合、その治療タンパク質を融合体の治療タンパク質部分として含有するトランスフェリン融合タンパク質によるその結合パートナーに対する結合を、例えば、当分野で周知の手段によって、例えば、還元下および非還元下でのゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングなどによってアッセイすることができる。他の様々な方法が当業者には知られており、これらは本発明の範囲内である。
融合タンパク質の製造
[00325] 本発明は更に、本明細書中に記載される核酸分子を使用して本発明の改変融合タンパク質を製造するための方法を提供する。一般的に言えば、タンパク質の組換え形態の製造は、典型的には下記の工程を伴う：
[00326] 本発明のトランスフェリン融合タンパク質をコードする核酸分子が最初に得られる。その後、核酸分子は、好ましくは、タンパク質のオープンリーディングフレームを含有する発現ユニットを形成するために、上述したように、適切な制御配列との機能的な連結状態に置かれる。発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために使用され、形質転換された宿主は、組換えタンパク質の産生を可能にする条件のもとで培養される。必要に応じて、組換えタンパク質が培地または細胞から単離される。タンパク質の回収および精製は、いくつかの不純物が許容され得る場合には必ずしも必要とされ得ない。
[00327] 上記工程のそれぞれを様々な方法で行うことができる。例えば、様々な宿主において作動可能な発現ベクターの構築が、上で示したように、適切なレプリコンおよび制御配列を使用して行われる。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞のタイプに依存し、以前、詳しく論じられており、また、そうでない場合には、当業者には既知である。適切な制限部位を、通常の場合に利用できないならば、これらのベクターに挿入するための切り出し可能な遺伝子が得られるようにコード配列の端部に加えることができる。当業者は、本発明の核酸分子とともに使用される当分野で既知の任意の宿主／発現システムを、所望する組換えタンパク質を産生させるために容易に適合させることができる。
[00328] 先に論じたように、任意の発現システムを使用することができ、それらには、酵母、細菌、動物、植物、真核生物および原核生物でのシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、酵母システム、哺乳動物細胞培養システム、および遺伝子組換え動物または遺伝子組換え植物での製造システムが好ましい。他の実施形態では、酵母の生来的なグリコシル化活性、過グリコシル化活性またはタンパク質分解活性を低下させるために改変されている酵母システムを使用することができる。
改変トランスフェリン融合タンパク質の単離／精製
[00329] 分泌された生物学的に活性な改変トランスフェリン融合タンパク質を、生物学的に活性な融合タンパク質の分泌を可能にする条件のもとで増殖させた宿主細胞の培地から単離することができる。細胞物質が培養培地から除かれ、生物学的に活性な融合タンパク質が、当分野で既知の様々な単離技術を使用して単離される。適切な単離技術には、沈殿化、ならびに、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフェニティークロマトグラフィーを含む様々なクロマトグラフィー的方法による分画化が含まれる。
[00330] 特に好ましい精製方法は、鉄結合カラムまたは金属キレート化カラムでのアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、ポリペプチド融合体のトランスフェリンまたは治療タンパク質に対する抗原を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーである。抗原は、好ましくは、固体の担体または基体に固定化または結合される。特に好ましい基質はＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）である。この方法によって、培地は、結合を生じさせることができる条件のもとで抗原／基体と一緒にされる。複合体は、非結合物を除くために洗浄することができ、そしてトランスフェリン融合タンパク質が、複合体形成に好ましくない条件の使用によって放出または溶出される。特に有用な溶出方法には、ｐＨの変化、この場合、固定化されている抗原は、第１のｐＨにおいてトランスフェリン融合タンパク質に対して大きい親和性を有し、第２のｐＨ（より高いｐＨまたはより低いｐＨ）において低下した親和性を有する；ある種のカオトロピック剤の濃度の変化；または界面活性剤の使用によることが含まれる。
細胞の内部への薬物もしくは治療タンパク質の送達および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた薬物もしくは治療タンパク質の送達
[00331] 本発明の範囲内において、改変トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリンの三価鉄イオンに対して複合体化された分子または小分子治療剤を細胞の内部に送達するためのキャリアとして、または、Ｔｆ受容体を生来的に発現するか、もしくはＴｆ受容体を発現させるために操作されている任意の細胞タイプの細胞膜を越えることを含めて、血液脳関門もしくは他のバリアを越えてこのような分子または小分子治療剤を送達するためのキャリアとして使用することができる。これらの実施形態において、Ｔｆ融合タンパク質は、典型的には、融合タンパク質部分および／または治療タンパク質部分の血清半減期を延ばすためにグリコシル化を阻害または防止または除去するために操作または改変される。標的化ペプチドの付加は、Ｔｆ融合タンパク質を特定の細胞タイプ（例えば、ガン細胞）に対して更に標的化するために特に意図される。
[00332] 一実施形態において、鉄を含有する抗貧血薬である三価鉄−ソルビトール−クエン酸塩複合体が本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質に負荷される。三価鉄−ソルビトール−クエン酸塩（ＦＳＣ）は、マウスの様々なガン細胞の増殖をインビトロで阻害し、また、腫瘍の退行をインビボで生じさせ、その一方で、非悪性細胞の増殖に対する作用を何ら有しないことが示されている（Ｐｏｌｊａｋ−Ｂｌａｚｉら（２０００年６月）、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（合衆国）、１５／３：２８５〜２９３）。
[00333] 別の実施形態において、抗悪性腫瘍薬アドリアマイシン（登録商標）（ドキソルビシン）および／または化学療法薬ブレオマイシン（これらはともに、三価鉄イオンとの複合体を形成することが知られている）が本発明のＴｆ融合タンパク質に負荷される。他の実施形態において、薬物の塩（例えば、クエン酸塩または炭酸塩）を調製して、Ｔｆにその後で結合させられる三価鉄イオンと複合体化することができる。腫瘍細胞は、多くの場合、鉄についてより速い代謝回転速度を示すので、少なくとも１つの抗腫瘍剤を運搬するように改変されたトランスフェリンは、腫瘍細胞に対する薬剤の曝露または負荷を増大させる手段を提供し得る（Ｄｅｍａｎｔ，Ｅ．Ｊ．、（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３７／（１−２）：１１３〜１１８；Ｐａｄｂｕｒｙら（１９８５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０／１３：７８２０〜７８２３）。
医薬製剤および治療方法
[00334] 本発明の改変されたトランスフェリンを含む改変融合タンパク質は、標準的な投与プロトコルを使用してその必要性のある患者に投与することができる。例えば、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質は、単独で、または組合せで、または、特定の病理学的プロセスを調節する他の薬剤との連続した組合せで与えることができる。本明細書中で使用されるように、２種の薬剤が同時に投与されるとき、または、２種の薬剤が同時もしくはほぼ同時に作用するような様式で独立して投与されるとき、２種の薬剤は組合せで投与されると言われる。
[00335] 本発明の融合タンパク質は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路および頬側経路によって投与することができる。例えば、薬剤をマイクロ注入によって傷害部位に局所的に投与することができる。あるいは、同時に、投与は、経口経路、吸入経路、鼻腔経路または肺経路のいずれかによって非侵襲的であり得る。投与される投薬量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、同時に行われる治療の種類（行われる場合）、治療頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
[00336] 任意の投与方法を、本発明のｍＴＦ融合タンパク質を送達するために使用することができる一方で、経口による投与または送達は、融合タンパク質の特定のクラスについては好ましい実施形態であり得るか、または、特定の状態を治療するための好ましい実施形態であり得る。
[00337] 本発明は更に、本発明の融合タンパク質を１以上含有する組成物を提供する。個々の必要性は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲を決定することは当分野の技術の範囲内である。典型的な投薬量は約１ｐｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。全身投与のための好ましい投薬量は約１００ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。マイクロ注入による部位への直接的な投与のための好ましい投薬量は約１ｎｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重を含む。直接的な注射またはマイクロ注入によって投与されるとき、本発明の改変された融合タンパク質は、部分的には限局的な鉄毒性を防止するために、鉄の低下した結合を示すか、または鉄の結合を全く示さないように操作することができる。
[00338] 薬理学的に活性な融合タンパク質に加えて、本発明の組成物は、活性な化合物を作用部位への送達のために医薬的に使用され得る製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な医薬的に許容され得るキャリアを含有することができる。非経口投与される適切な製剤には、水溶性形態（例えば、水溶性塩）にある活性な化合物の水溶液が含まれる。また、活性な化合物の懸濁物を適切な油状の注射懸濁物として投与することができる。適切な親油性の溶媒またはビークルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が含まれる。水性の注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質を含有することができ、これには、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよびデキストランが含まれる。必要に応じて、懸濁物はまた安定化剤を含有していてもよい。リポソームもまた、細胞内への送達のために薬剤をカプセル化するために使用することができる。
[00339] 本発明による全身投与用の医薬製剤は、経腸投与、非経口投与または局所投与のために製剤化され得る。実際、３タイプの製剤のすべてが、有効成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。経口投与される適切な製剤には、ハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセル、ピル、錠剤（コーティング錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁物、シロップまたは吸入物およびその徐放形態が含まれる。
[00340] 本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルのような単位投薬形態物にすることができる。このような形態において、組成物は、適量の有効成分を含有する単位用量に分割される。単位投薬形態物は、パッケージングされた組成物、例えば、小包にされた粉末、バイアル、アンプル、事前に充填されたシリンジ、または、液体を含有する小袋であり得る。単位投薬形態物は、例えば、カプセル自体または錠剤自体であり得るか、あるいは、適する数の任意のこのような組成物がパッケージ形態にあるものであり得る。治療において使用される投薬量は医師により主観的に決定されるに違いない。
[00341] 本発明の方法を実施する際、本発明の融合タンパク質は、単独で、または組合せで、または他の治療剤もしくは診断剤との組合せで使用することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、一般に容認されている医療行為にしたがってこれらの状態について典型的に処方される他の化合物と一緒に同時に投与することができる。本発明の化合物は、インビボで、通常は、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物において、またはインビトロで使用することができる。
経口用医薬組成物および送達方法
[00342] 本発明において、Ｔｆ融合タンパク質は、改変Ｔｆ融合タンパク質（これに限定されない）を含めて、経口送達のために製剤化され得る。特に、いくつかのクラスの疾患または医学的状態を治療するために使用される本発明のいくつかの融合タンパク質は、経口製剤または経口送達が特に容易であり得る。このようなクラスの疾患または状態には、急性、慢性および再発性の疾患が含まれるが、これらに限定されない。慢性または再発性の疾患には、ウイルス性疾患、ウイルス感染症、ガン、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主病、全身的な細菌感染、貧血、心血管疾患、精神病、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の障害、内分泌系疾患、生殖系疾患、消化管疾患が含まれるが、これらに限定されない。これらのクラスの疾患の例には、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶ感染症、ＨＩＶ感染症、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎およびアルツハイマー病が含まれる。多くの慢性疾患において、本発明のＴｆ融合タンパク質の経口製剤およびその投与方法は、長期間にわたる患者の介護および治療を、注射剤の治療プロトコルまたは薬物プロトコルに頼ることなく、自宅での経口投与によって可能にするので、特に有用である。
[00343] 本発明のＴｆ融合タンパク質を含む経口製剤および経口送達方法は、部分的には、消化管（ＧＩ）上皮を越えるトランスフェリン受容体媒介のトランスサイトーシスを利用している。Ｔｆ受容体はヒトＧＩ上皮に高密度で見出され、トランスフェリンはトリプシン消化およびキモトリプシン消化に対して非常に抵抗性であり、また、Ｔｆの化学的コンジュゲートは、ＧＩ上皮を越えてタンパク質およびペプチドを問題なく送達するために使用されている（Ｘｉａら（２０００）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００；Ｘｉａら（２００１）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５；Ｓｈａｈら（１９９６）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ．、８５（１２）：１３０６〜１３１１；これらはすべて、その全体を参照として本明細書中に組み入れる）。ＧＩ上皮を越えて輸送されると、本発明のＴｆ融合タンパク質は血清中での延長された半減期を示す。すなわち、Ｔｆに結合されたか、またはＴｆ内に挿入された治療タンパク質または治療ペプチドは、非融合状態にある治療タンパク質または治療ペプチドと比較して、延長された血清半減期を示す。
[00344] 本発明のＴｆ融合タンパク質の経口製剤は、ＧＩ上皮への輸送のために、また、胃におけるＴｆ融合タンパク質成分および他の活性な成分の保護のために好適であるように調製され得る。このような製剤は、キャリア成分および分散剤成分を含むことができ、エアロゾル（経口送達または肺送達の場合）、シロップ、エリキシル剤、錠剤（咀嚼錠を含む）、ハードカプセル、ソフトカプセル、トローチ、ドロップ、水性懸濁物、油性懸濁物、エマルション、カシェー顆粒、ペレット顆粒、ならびに分散粉末剤を含む任意の適切な形態にすることができる。好ましくは、Ｔｆ融合タンパク質製剤は、正確な投薬量の簡便な、好ましくは経口投与による投与のために適切な固体投薬形態物で用いられる。経口投与される固体投薬形態物は、好ましくは、錠剤またはカプセルなどである。
[00345] 錠剤またはカプセルの形態での経口投与の場合、組成物は、十分な有効成分が、効果的な応答を生じさせるために宿主によって吸収されることを確保するために注意しなければならない。したがって、例えば、Ｔｆ融合タンパク質の量は、理論的に必要とされる量よりも多くすることができ、あるいは、他の既知の措置（例えば、コーティングまたはカプセル化など）を、ポリペプチドを胃における酵素作用から保護するために取ることができる。
[00346] 従来的には、ペプチド薬物およびタンパク質薬物は、非経口的に投与されたとき、および、特に経口投与されたとき、バイオアベイラビリティが悪いために、注射によって投与されている。これらの薬物は、化学的および立体配座な不安定性を受けやすく、多くの場合、胃における酸性条件によって、そして同様に、胃および消化管における酵素によって分解される。これらの送達問題に答えて、経口送達のためのいくつかの技術が開発されており、例えば、薬物キャリアとして疎水性骨格および親水性分枝を有するポリマーから構成されるナノ粒子におけるカプセル化、マイクロ粒子におけるカプセル化、エマルションにおけるリポソーム内への挿入、および他の分子に対するコンジュゲート化などがある。これらはすべてが、本発明のＴｆ融合分子とともに使用することができる。
[00347] ナノ粒子の例には、キトサンおよびＣａｒｂｏｐｏｌでコーティングされた粘膜付着性ナノ粒子（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、４７（１）：３９〜５４、２００１）、そして、ポリ（２−スルホブチル）ビニルアルコールおよびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクティック−コ−グリコール酸）の荷電型混合ポリエステルを含有するナノ粒子（Ｊｕｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、５０（１）：１４７〜１６０、２０００）が含まれる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド領域およびカチオン性ポリビニルアミン基を有する表面ポリマーを含有するナノ粒子は、ラットに経口投与されたとき、サケカルシトニンの改善された吸収を示した。
[00348] アルギン酸塩およびペクチンから構成され、ポリリシンで補強された薬物送達粒子は、酸および塩基に対して比較的抵抗性であり、薬物のためのキャリアとして使用することができる。これらの粒子は、生体付着性、増強された吸収および徐放の利点を併せ持つ（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５１（２）：１４１〜１４９、１９９９）。
[00349] また、合成ソマトスタチンなどのペプチドのＮ末端およびＣ末端にコンジュゲート化されたリポアミノ酸基およびリポ糖類基は、両親媒性の界面活性剤をもたらすが、生物学的活性を保持する組成物をもたらすことが示された（Ｔｏｔｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２（１９）：４０１０〜４０１３、１９９９）。
[00350] 他のペプチド送達技術の例には、目的とするペプチドと、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンおよびカルボポール、またはタウロコール酸およびカルボポールのいずれかとを含有する、カルボポールでコーティングされた粘膜付着性エマルションが含まれる。これらは、ラットに経口投与されたとき、血清カルシウム濃度を低下させるために効果的であることが示された（Ｏｇｉｓｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４（６）：６５６〜６６１、２００１）。ホスファチジルエタノール（これはホスファチジルコリンに由来する）が、インスリンのキャリアとしてホスファチジルエタノールを含有するリポソームを調製するために使用された。これらのリポソームは、ラットに経口投与されたとき、活性であることが示された（Ｋｉｓｅｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、２１６（１−２）：１０５〜１１４、２００１）。
[00351] インスリンはまた、インスリンおよびプロテアーゼ阻害剤（例えば、アプロチニンまたはバシトラシンなど）を含有するポリ（ビニルアルコール）ゲルスフェアに製剤化されている。これらのゲルスフェアのグルコース低下特性が、インスリンのほとんどが下部腸において放出されたラットにおいて明らかにされている（Ｋｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９（６）：８９７〜９００、１９９６）。
[00352] インスリンの経口送達はまた、油相に界面活性剤とともに分散された、ポリ（シアノアクリル酸アルキル）から作製されたナノ粒子（Ｄａｍｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８６（１２）：１４０３〜１４０９、１９９７）を使用して、また、キトサンでコーティングされたアルギン酸カルシウムゲル（Ｏｎａｌら、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０（３）：２２９〜２３７、２００２）を使用して研究されている。
[00353] 他の方法において、ペプチドのＮ末端およびＣ末端が、ポリエチレングリコールに連結され、次いでアリル鎖に連結され、酵素分解に対する改善された抵抗性およびＧＩ壁を通過する改善された拡散を有するコンジュゲート体を形成する（ｗｗｗ．ｎｏｂｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
[00354] ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）はカチオン性の脂質混合物であり、これはペプチドと非共有結合的に相互作用して、保護的な被覆または層を生じさせる。このペプチド−脂質複合体は細胞の形質膜に融合することができ、ペプチドが細胞内に内在化される（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。
[00355] リポソームを出発物質として使用するプロセスにおいて、渦巻き形状の粒子が医薬的ビークルとして開発されている。ペプチドが、主に負荷電の脂質を含有するリポソームの懸濁物に加えられる。カルシウムの添加により、リポソームの崩壊、および脂質二重層から構成される大きなシート内へのその融合が生じ、その後、シートは自発的に丸くなるか、または渦巻き形に積み重なる（米国特許第５，８４０，７０７号；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｌｉｖｅｒｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）。
[00356] 経口使用のために意図される、Ｔｆ融合タンパク質を含む組成物は、医薬組成物の製造について当分野で既知の任意の方法にしたがって調製することができ、このような組成物は、医薬的に品のよい、口当たりのいい調製物を提供するために、甘味剤からなる群から選択される１以上の薬剤を含有することができる。例えば、経口送達可能な錠剤を調製するために、Ｔｆ融合タンパク質は少なくとも１つの医薬的キャリアと混合され、固体の製剤は、消化管への送達のために、既知の方法にしたがって錠剤を形成するために圧縮成形される。錠剤組成物は、典型的には、様々な添加物とともに、例えば、糖類もしくはセルロースキャリア、結合剤（例えば、デンプンペーストまたはメチルセルロースなど）、充填剤、崩壊剤、または、医薬製剤の製造において典型的に通常的に使用されている他の添加剤などとともに製剤化される。経口送達可能なカプセルを調製するために、ＤＨＥＡが少なくとも１つの医薬的賦形剤と混合され、固体の製剤は、消化管への送達のために適切なカプセル状の容器に入れられる。Ｔｆ融合タンパク質を含む組成物は、一般にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、１９９０）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１８０４２）の第８９章（これを参照として本明細書中に組み入れる）に記載されるように調製することができる。
[00357] 上述のように、本発明の経口用製剤の多くは、胃の環境からの保護および生物学的に活性な物質の腸における放出を可能にする不活性な成分を含有することができる。このような製剤、すなわち、腸溶性コーティング剤は当分野では周知である。例えば、錠剤を製造するために好適である非毒性の医薬的に許容され得る賦形剤との混合でＴｆ融合タンパク質を含有する錠剤を使用することができる。これらの賦形剤は、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；ならびに、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。
[00358] 錠剤は非コーティングであってもよく、または、消化管における崩壊および吸収を遅らせるために、そしてそれにより、持続した作用を長期間にわたって提供するために、既知の技術を用いてコーティングされることがある。例えば、時間遅延物質を用いることができ、例えば、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどを単独で、またはワックスと一緒に用いることができる。
[00359] 経口使用される製剤はまた、有効成分が不活性な固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されているハードゼラチンカプセルとして、または、有効成分が水性媒体または油性媒体（例えば、落花生油、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油）と混合されているソフトゼラチンカプセルとして提供され得る。
[00360] 水性懸濁物は、水性懸濁物を製造するために適切な賦形剤との混合でＴｆ融合タンパク質を含有することができる。このような賦形剤には、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムがある。分散化剤または湿潤化剤には、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、または、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアラート）、または、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデシルエチルオキシセタノール）、または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなど）、または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）を挙げることができる。水性懸濁物はまた、１以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）、１以上の着色剤、１以上の矯味矯臭剤、および１以上の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリンなど）を含有することができる。
[00361] 油性懸濁物（oily suspensions）は、有効成分を植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィンなど）に懸濁することによって製剤化することができる。油懸濁物（oil suspensions）は、増粘剤（例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコール）を含有することができる。甘味剤（例えば、上述の甘味剤など）、および矯味矯臭剤を、口当たりのいい経口調製物を提供するために加えることができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤を加えることによって保存することができる。
[00362] 水を加えることによって水性懸濁物を調製するために適切な分散可能な粉末および顆粒は、有効成分を、分散化剤または湿潤化剤、懸濁化剤、および１以上の保存剤との混合で提供する。適切な分散化剤または湿潤化剤および懸濁化剤が、既に上述したものによって例示される。更なる賦形剤（例えば、甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤）もまた存在させることができる。
[00363] Ｔｆ融合タンパク質を含有する医薬組成物はまた、水中油型エマルションの形態にすることができる。油相は、植物油（例えば、オリーブ油または落花生油）または鉱油（例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズレシチン）、ならびに、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレアート）、ならびに、同じエステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。エマルションはまた、甘味剤および矯味矯臭剤を含有することができる。
[00364] Ｔｆ融合タンパク質を含有するシロップおよびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセロール、ソルビトールまたはスクロース）とともに製剤化され得る。このような製剤はまた、緩和剤、保存剤および矯味矯臭剤および着色剤を含有することができる。医薬組成物は、例えば、無菌の注射可能な水性懸濁物または油性懸濁物のような無菌の注射可能な調製物の形態にすることができる。このような懸濁物は、上述のこのような適切な分散化剤または湿潤化剤および懸濁化剤を使用して、既知の技術にしたがって製剤化され得る。無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液のような、非毒性の非経口投与に許容され得る希釈剤または溶媒における無菌の注射可能な溶液または懸濁物であり得る。用いることができる許容され得るビークルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌のフィックスオイルが、従来的には、溶媒または懸濁化媒体として用いられる。この目的のために、任意の無刺激性のフィックスオイルを用いることができ、これらには、合成モノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。また、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において有用である。
[00365] 医薬組成物はまた、ポリエステルマイクロスフェア、ゼインマイクロスフェア、プロテノイドマイクロスフェア、ポリシアノアクリル酸マイクロスフェアおよび脂質型システムを使用して経口送達のために製剤化され得る（例えば、ＤｉＢａｓｅおよびＭｏｒｒｅｌ、マイクロカプセル化されたタンパク質の経口送達、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎｄｅｒｓおよびＨｅｎｄｒｅｎ（編）、２５５頁〜２８８頁（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７））。
[00366] キャリアおよび／または他の物質に対する医薬的に活性なＴｆ融合タンパク質の割合は約０．５重量％〜約１００重量％（重量パーセント）の範囲であり得る。経口使用の場合、医薬製剤は、一般には、約５重量％〜約１００重量％の活性な物質を含有する。他の使用の場合、製剤は、一般には、約０．５重量％〜約５０重量％の活性な物質を有する。
[00367] 本発明において用いられるＴｆ融合タンパク質製剤は、個体に投与されるとき、有効量のＴｆ融合タンパク質を提供する。これに関連して使用される、Ｔｆ融合体の「有効量」は、疾患の症状を改善するために有効である量である。
[00368] 本発明のＴｆ融合タンパク質組成物は、症状を改善するために効果的な量で毎日投与することができるが、必ずしも毎日投与する必要はない。一般に、１日の総投薬量は、１日あたり、少なくとも約５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約１００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約２００ｍｇであり、かつ、好ましくは５００ｍｇ以下であり、例えば、５０ｍｇのＴｆ融合タンパク質をそれぞれが含有する４個のカプセルまたは錠剤で経口投与される。経口送達されるカプセルまたは錠剤は、好都合には、１日の経口用量全量（例えば、２００ｍｇまたはそれ以上）までを含有することができる。
[00369] 特に好ましい実施形態において、Ｔｆ融合タンパク質を含む経口用医薬組成物は、緩衝化された液体形態に配合され、その後、ソフトゼラチンカプセルまたはハードコーティングゼラチンカプセルにカプセル化され、その後、カプセルは適切な腸溶性コーティング剤でコーティングされる。本発明の経口用医薬組成物の場合、放出場所は、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸を含む消化系のどこででもあり得る。
[00370] 他の実施形態において、本発明の経口用組成物は、既知の遅延放出製剤を使用して、本発明のＴｆ融合タンパク質を始めとする有効成分を消化系においてゆっくり放出させるために製剤化される。
[00371] 経口送達される本発明のＴｆ融合タンパク質は、消化管上皮に見出されるＴｆ受容体に結合することができる。この結合および受容体を媒介した輸送を促進させるために、本発明のＴｆ融合タンパク質は、典型的には、鉄をＴｆ成分に結合させ、また、場合により炭酸イオンをＴｆ成分に結合させて製造される。本発明の融合タンパク質組成物のＴｆ成分に鉄および炭酸イオンを負荷させるための様々な処理および方法が当分野では既知である。
[00372] 本発明のいくつかの医薬組成物において、Ｔｆ融合タンパク質のＴｆ成分は、鉄に対するＴｆ成分の親和性または結合力を増大させるために改変することができる。このような方法は当分野では既知である。例えば、変異誘発法を、天然型トランスフェリンよりも強く鉄と結合する変異型トランスフェリン成分を作製するために使用することができる。ヒト血清トランスフェリンにおいて、金属イオンとのキレート化のためのリガンドであるアミノ酸には、配列番号３のＮ側葉部のアミノ酸のＡｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７およびＨｉｓ２４９、ならびに配列番号３のＣ側葉部のアミノ酸のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５が含まれるが、これらに限定されない（アミノ酸の横の数字は、成熟タンパク質のバリンが位置１として表される一次アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を示す）。米国特許第５，９８６，０６７号（これを参照として本明細書中に組み入れる）を参照されたい。一実施形態において、Ｎ側葉部内のＬｙｓ２０６およびＨｉｓ２０７の残基がＧｌｎおよびＧｌｕでそれぞれ置換される。
[00373] 本発明のいくつかの医薬組成物において、Ｔｆ融合タンパク質は、治療タンパク質または治療ペプチドとＴｆ成分との間に切断部位を含有するように操作される。このような切断可能な部位またはリンカーは当分野では既知である。
[00374] 本発明の医薬組成物および本発明の方法で、消化管上皮を越える融合タンパク質の移動を容易にするためにトランスサイトーシス増強剤を加えることを含む。このような増強剤は当分野では既知である。Ｘｉａら（２０００）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００；Ｘｉａら（２００１）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５を参照されたい。
[00375] 本発明の好ましい実施形態において、経口用医薬製剤は、上述したように、インスリンまたはＧＬＰ−１のタンパク質またはペプチドにＮ末端で融合された、低下したグリコシル化を示すか、またはグリコシル化を示さない改変されたＴｆ成分を含むＴｆ融合タンパク質を含む。このような医薬組成物は、融合タンパク質の有効な用量を含む医薬組成物の経口投与によって、糖尿病などのグルコース不均衡障害を治療するために使用することができる。
[00376] 融合タンパク質の効果的な用量は、患者における特定の疾患状態に関連する症状（例えば、糖尿病の症状など）を緩和するために計算された投薬量を含めて、数多くの方法によって測定することができる。他の製剤において、投薬量は、患者における血中グルコースレベルの検出可能な変化を誘導するために有効量の融合タンパク質を含むように計算される。血中グルコースのこのような検出可能変化には、約１％〜９０％の間または約５％〜約８０％の間での血中グルコースレベルの減少が含まれ得る。血中グルコースレベルのこれらの減少は、治療されている疾患状態に依存し、したがって、医薬組成物または投与方法は、それぞれの患者について所望される結果を達成するために変更することができる。他の場合においては、患者における治療タンパク質または治療ペプチドの活性レベルの増大（例えば、インスリンまたはＧＬＰ−１の活性の検出可能な増大）を検出するために、医薬組成物が製剤化され、投与方法が変更される。このような製剤および方法により、約１ｐｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１μｇ〜約１ｇの融合タンパク質、約１０μｇ〜約１００ｍｇの融合タンパク質、または約１０ｍｇ〜約５０ｍｇの融合タンパク質が送達され得る。製剤はまた、治療タンパク質の活性のユニット測定を使用して計算することができ、例えば、約５ユニット〜約５００ユニットのヒトインスリンまたは約１０ユニット〜約１００ユニットのヒトインスリンなどであり得る。重量または活性による測定値は、Ｔｆに融合されたそれぞれの治療タンパク質または治療ペプチドについて、既知の標準品を使用して計算することができる。
[00377] 本発明はまた、本発明の医薬組成物を経口投与する方法を含む。このような方法では、患者または介護者によって組成物を経口投与する工程（これに限定されない）が含まれ得る。このような投与工程は、Ｔｆ融合タンパク質、疾患もしくは患者の状態、または個々の患者に依存して、１日に１回または２回などの間隔での投与を含むことができる。このような方法ではまた、個々のＴｆ融合タンパク質の様々な投薬量を投与することが含まれる。例えば、医薬組成物の最初の投薬量は、血中グルコースレベルの低下などの所望される効果を誘導するために、より高いレベルにすることができる。その場合、その後の投薬量は、所望される効果が達成されると、減少させることができる。投与プロトコルに対するこれらの変更または改変は主治医または医療従事者によって行うことができる。場合により、投与プロトコルの変更は、患者が血中グルコースレベルをモニターし、本発明のｍＴｆ−インスリン経口用組成物またはｍＴｆ−ＧＬＰ−１経口用組成物を投与しているときなどでは、個々の患者によって行うことができる。
[00378] 本発明はまた、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与可能な形態物に製剤化するステップを含む本発明の経口投与される組成物または薬用組成物を製造する方法を含む。他の場合において、本発明は、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与のために適切な形態物に製剤化するステップを含む、本発明の組成物または薬用組成物を製造する方法を含む。
[00379] その上、本発明はＴｆ融合タンパク質製剤の肺送達を含む。肺送達は、他の投与経路によって送達することが困難である高分子を送達するために特に有望である。このような肺送達では、肺に送達された薬物が肺胞領域を介して直接的に血液循環に容易に吸収されるので、全身送達および肺の疾患を治療するための局所的な送達に、有効であり得る。
[00380] 本発明は、様々な状態または疾患を治療するために経口吸入（肺送達）される薬物分散物を形成するために適切な組成物を提供する。Ｔｆ融合タンパク質製剤は、液体ネブライザー、エアロゾルに基づく計量用量吸入器（ＭＤＩ）、および乾燥粉末分散デバイスなどの種々の方法によって送達することができる。肺送達用の組成物を製剤化する際には、表面活性剤または界面活性剤および増量用担体を含む医薬的に許容され得る担体が、一般には、安定性、分散性、粘稠性および／または充填特性をもたらして、被験者への組成物の均一な肺送達を高めるために加えられる。
[00381] 表面活性剤または界面活性剤は、粘膜または裏打ち層を介するポリペプチドの吸収を促進させる。有用な表面活性剤または界面活性剤には、脂肪酸およびその塩、胆汁酸塩、リン脂質またはアルキル糖類が含まれる。脂肪酸およびその塩の例には、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）およびミリスチン酸（Ｃ１４）のナトリウム塩、カリウム塩およびリシン塩が含まれる。胆汁酸塩の例には、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸およびウルソデオキシコール酸が含まれる。リン脂質の例には、単鎖リン脂質、例えば、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルセリンなど；または、二本鎖リン脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジルセリンなどが含まれる。アルキル糖類の例には、アルキルグリコシドまたはアルキルマルトシド、例えば、デシルグリコシドおよびドデシルマルトシドなどが含まれる。
[00382] 担体として有用である医薬的賦形剤には、安定化剤、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）など；増量剤、例えば、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなど；ｐＨ調節剤または緩衝剤；塩、例えば、塩化ナトリウムなど；その他が含まれる。これらの担体は結晶性形態または無定形（アモルファス）形態であり得るか、あるいは、これら２つの混合物でもよい。
[00383] 増量剤として使用される炭水化物の例には、単糖類、例えば、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えば、ラクトース、トレハロースなど；シクロデキストリン類、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど；多糖類、例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど；アルジトール、例えば、マンニトール、キシリトールなどが含まれる。増量剤として使用されるポリペプチドの例には、アスパルテームが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
[00384] 様々な添加剤（これらは組成物の微量成分である）が、スプレー乾燥時の立体配座安定性のために、また、粉末の分散性を改善するために含まれ得る。これらの添加剤には、疎水性アミノ酸、例えば、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなどが含まれる。
[00385] 適切なｐＨ調節剤または緩衝剤には、有機酸および有機塩基から調製される有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
[00386] 肺送達されるＴｆ融合組成物は、治療上有効な量の組成物が単位用量物容器（例えば、ブリスターパックまたはゼラチンカプセルなど）に存在する単位用量物としてパッケージングされ得る。ブリスターパックまたはゼラチンカプセルの製造は、典型的には、パッケージングの技術分野で一般的に広く知られている方法によって行われる。
[00387] 米国特許第６，５２４，５５７号には、（ａ）ＨＦＡ噴射剤、（ｂ）噴射剤に分散され得る医薬的に活性なポリペプチド、および（ｃ）Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸もしくはその塩、胆汁酸塩、リン脂質またはアルキル糖類である界面活性剤（このような界面活性剤は下部気道におけるポリペプチドの全身吸収を高める）を含む医薬用エアロゾル製剤が開示される。この発明はまた、このような製剤を製造する方法、および、患者を治療することにおけるこのような製剤の使用を提供する。
[00388] 粉末薬物を肺送達するための１つの方法では、加圧ガス源を提供するためのハンドポンプを有する手持ち型デバイスが利用される。加圧されたガスは、ベンチュリノズルなどの粉末分散デバイスを介して急に放出され、分散された粉末が患者による吸入のために利用可能になる。
[00389] 様々な乾燥粉末分散デバイスがいくつかの特許に記載される。米国特許第３，９２１，６３７号には、粉末化された薬からなる１個のカプセルに突き刺すためのニードルを備える手動ポンプが記載される。投薬の多容器ディスクまたは多容器ストリップの使用が、欧州特許出願第０４６７１２２号、国際公開公報第９１／０２５５８号および同第９３／０９８３２号、米国特許第４，６２７，４３２号、同第４，８１１，７３１号、同第５，０３５，２３７号、同第５，０４８，５１４号、同第４，４４６，８６２号、同第５，０４８，５１４号および同第４，４４６，８６２号に記載される。
[00390] タンパク質治療剤のエアロゾル化が欧州特許出願第０２８９３３６号に開示される。治療用エアロゾル製剤が国際公開公報第９０／０９７８１号に開示される。
[00391] 本発明は、経口吸入のためにＴｆ融合タンパク質を配合することを提供する。この製剤は、Ｔｆ融合タンパク質と、肺送達のための適切な医薬的賦形剤とを含む。本発明また、経口吸入を介して、その必要性のある被験者にＴｆ融合タンパク質組成物を投与することを提供する。
遺伝子組換え動物
[00392] 増大した血清半減期、増大した血清安定性、または増大したバイオアベイラビリティを有する本発明の改変トランスフェリン融合構築物を含有する遺伝子組換え非ヒト動物の作製が本発明の一実施形態において意図される。いくつかの実施形態において、ラクトフェリンが融合タンパク質のＴｆ部分として使用され、その結果、融合タンパク質が乳汁中に産生および分泌される。
[00393] 遺伝子組換え非ヒト動物の成功した作製が多数の特許および刊行物に記載されている（例えば、米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日発行）；米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日発行）；および米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日発行）など。これらの内容を、その全体を参照として本明細書中に組み入れる）。
[00394] 動物、例えば、乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシおよびヒツジを含む家畜化された哺乳動物などの遺伝子構成を変化させることができることにより、多くの商業的適用が可能である。これらの適用には、容易に採集される形態（例えば、乳汁中または血液中への発現）で多量の外因性タンパク質を発現する動物の作製、増大した体重増加、給餌効率、肉組成、乳汁生産または乳汁含有量、疾患抵抗性および特定の微生物による感染に対する抵抗性を有する動物の作製、そして成長速度または繁殖成績が高められた動物の作製が含まれる。外因性ＤＮＡ配列をそのゲノムに含有する動物を遺伝子組換え動物という。
[00395] 遺伝子組換え動物を作製するための最も広範に使用されている方法は、ＤＮＡを受精胚の前核に顕微注入することである（Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：１１３［１９９２］）。遺伝子組換え動物を作製するための他の方法には、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによる胚の感染が含まれる。野生型レトロウイルスまたは組換えレトロウイルスのいずれかによる着床前および着床後の両方のマウス胚の感染が報告されている（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３：１２６０［１９７６］；Ｊａｎｅｎｉｃｈら、Ｃｅｌｌ、２４：５１９［１９８１］；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１５１［１９８４］；Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６９２７［１９８５］；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６１４８〜６１５２［１９８５］；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３８３〜３８８［１９８７］）。
[00396] レトロウイルスを胚に感染させるための代わりの手段は、マウス胚の胞胚腔の中にウイルスまたはウイルス産生細胞を注入することである（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．他、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：６２３［１９８２］）。マウスの生殖系列への導入遺伝子の導入が、妊娠中期のマウス胚の子宮内でのレトロウイルス感染を使用して報告されている（Ｊａｈｎｅｒら、上記［１９８２］）。遺伝子組換え動物を作製するためのレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによるウシ胚およびヒツジ胚の感染が報告されている。これらのプロトコルでは、レトロウイルス粒子、またはレトロウイルス粒子を放つ成長停止させた（すなわち、マイトマイシンＣ処理された）細胞を受精卵または初期胚の卵黄周囲隙に顕微注入することが包含される（ＰＣＴ国際公開公報第９０／０８８３２号［１９９０］；ＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、４０：３８６［１９９５］）。ＰＣＴ国際公開公報第９０／０８８３２号には、２細胞期〜８細胞期のヒツジ胚の卵黄周囲隙への野生型ネコ白血病ウイルスＢの注入が記載される。注入された胚に由来する胎児は、多数の組込み部位を含有することが示された。
[00397] 米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日発行）には、分裂中の細胞に形質導入するレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ］に由来するベクター）を使用して、外因性ＤＮＡを未成熟な卵母細胞および成熟した未受精の卵母細胞（すなわち、受精前の卵母細胞）に導入することによる遺伝子組換え動物の作製が記載される。この特許にはまた、様々な組換えタンパク質のサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動される発現ならびにマウス乳腫瘍ＬＴＲによる発現のための方法および組成物が記載される。
[00398] 米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日発行）には、胚性幹細胞を使用して遺伝子組換え動物を作製するための方法が記載される。簡単に記載すると、胚性幹細胞が、遺伝子組換え動物を作製するために、桑実胚との混合細胞同時培養において使用される。外来遺伝物質が、例えば、エレクトロポレーション、顕微注入またはレトロウイルス送達によって、同時培養の前に胚性幹細胞に導入される。この様式でトランスフェクションされたＥＳ細胞が、ネオマイシンなどの選択マーカーによって遺伝子の組込みについて選択される。
[00399] 米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日発行）には、始原生殖細胞の単離、これらの細胞を培養して始原生殖細胞由来の細胞株を作製すること、始原生殖細胞および培養された細胞株の両方を形質転換すること、そして、これらの形質転換された細胞および細胞株を使用して遺伝子組換え動物を作製するステップを含む方法を使用した遺伝子組換え動物の作製が記載される。遺伝子組換え動物が作製される効率が大きく増大するので、げっ歯類以外の遺伝子組換え動物種を作製することにおける相同的組換えの使用が可能になる。
遺伝子治療
[00400] 改変されたトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンドメインが治療タンパク質または治療ペプチドに連結されている遺伝子治療用の改変トランスフェリン融合構築物の使用が、本発明の一実施形態において意図される。増大した血清半減期または血清安定性を有する本発明の改変トランスフェリン融合構築物は、遺伝子治療による治療に理想的に適している。
[00401] 可溶性の融合タンパク質を発現させるための遺伝子治療の成功した使用が記載されている。簡単に記載すると、細胞傷害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分からなる可溶性の融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを注入することによる遺伝子治療が、最近、Ｉｊｉｍａら（（２００１年６月１０日）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（合衆国）１２／９：１０６３〜７７）において示された。遺伝子治療のこの適用において、ＩＩ型コラーゲンで誘導された関節炎のマウスモデルがベクターの関節内注入による治療に成功した。
[00402] 遺伝子治療はまた、米国特許第６，２２５，２９０号（２００１年５月１日発行）、米国特許第６，１８７，３０５号（２００１年２月１３日発行）および米国特許第６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１日発行）を含む多数の米国特許に記載されている。
[00403] 米国特許第６，２２５，２９０号では、所望される治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を機能的に組み込むために哺乳動物の被験者の腸上皮細胞を遺伝的に変化させる方法および構築物が提供される。腸細胞の形質転換は、主として裸のＤＮＡ（ネーキッドＤＮＡ）から構成される製剤の投与によって達成され、ＤＮＡは経口投与することができる。経口投与経路または他の消化管内投与経路は簡単な投与方法をもたらし、その一方で、裸の核酸の使用により、遺伝子治療を達成するためのウイルスベクターの使用に関連する面倒な事態が回避される。発現したタンパク質は、直接、消化管および／または血流に分泌されて、タンパク質の治療的血中レベルをもたらし、それにより、そのタンパク質を必要としている患者が治療される。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患、またはタンパク質の過剰発現による治療に従う疾患に対する短期または長期の治療法をもたらす。
[00404] 米国特許第６，１８７，３０５号では、脊椎動物起源の細胞（特に、哺乳動物起源の細胞）における遺伝子標的化方法またはＤＮＡ標的化方法が提供される。簡単に記載すると、ＤＮＡが、ＤＮＡの相同的組換えまたは標的化を介して脊椎動物起源の初代細胞または二次細胞に導入され、これにより、ＤＮＡが、事前に選択された部位において初代細胞または二次細胞のゲノムＤＮＡに導入される。
[00405] 米国特許第６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１日発行）には、レトロウイルス遺伝子治療ベクターが記載される。開示されたレトロウイルスベクターは、目的とする遺伝子に対する挿入部位を含み、そして広範囲の様々なトランスフェクションされた細胞タイプにおいて、目的とする遺伝子に由来するタンパク質を高レベルに発現させることができる。選択マーカーを有しないレトロウイルスベクターもまた開示され、このことは、このようなレトロウイルスベクターを、抗生物質などのマーカー産物の同時発現を伴わない様々な疾患状態の治療におけるヒトの遺伝子治療のために好適にする。これらのレトロウイルスベクターは、ある種のパッケージング細胞株における使用に対して特に適している。哺乳動物細胞のゲノムに挿入するレトロウイルスベクターの能力により、レトロウイルスベクターは、ヒトおよび動物における遺伝病の遺伝子治療において使用される特に有望な候補になっている。遺伝子治療では、典型的には、（１）インビボで患者の細胞に新しい遺伝物質を加えること、または（２）患者の細胞を身体から取り出し、新しい遺伝物質をその細胞に加えて、その細胞を体内に再導入すること（すなわち、インビトロ遺伝子治療）が伴う。レトロウイルスベクターを使用して様々な細胞において遺伝子治療を行なう方法に関する議論を、例えば、米国特許第４，８６８，１１６号（１９８９年９月１９日発行）および同第４，９８０，２８６号（１９９０年１２月２５日発行）（上皮細胞）、国際公開公報第８９／０７１３６号（１９８９年８月１０日公開）（肝細胞）、欧州特許第３７８，５７６号（１９９０年７月２５日公開）（繊維芽細胞）、ならびに国際公開公報第８９／０５３４５号（１９８９年６月１５日公開）および同第９０／０６９９７号（１９９０年６月２８日公開）（内皮細胞）において見出すことができる（それらの開示を本明細書中に参照として組み入れる）。
トランスフェリン融合タンパク質を含有するキット
[00406] 更なる実施形態において、本発明は、例えば、治療用途または非治療用途のために使用され得る、トランスフェリン融合タンパク質を含有するキットを提供する。キットは、ラベル付きの容器を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、上述した用途などの治療用途または非治療用途のために有効なトランスフェリン融合タンパク質を含む組成物を収容する。組成物における活性な薬剤は治療タンパク質である。容器上のラベルにより、組成物が特定の治療用途または非治療用途のために使用されることが示され、また、上述した指示などの、インビボまたはインビトのいずれかでの使用についての指示が示されることがある。
[00407] 本発明のキットは、典型的には、上述した容器と、商業的な観点および使用者の観点から望ましい物質（例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および、使用に関する指示を伴う添付文書）を含む１以上の他の容器とを含む。
[00408] 更なる記載を要することなく、当業者は、上述の説明および下記の例示的な実施例を使用して、本発明を行ない、かつ利用することができ、そして特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。例えば、当業者は、生物学的活性を、本発明の融合タンパク質構築物についてインビトロおよびインビボの両方で、その非融合状態での治療的成分の比較可能な活性と比較して容易に決定することができる。同様に、当業者は、本発明による構築物の血清半減期および血清安定性を容易に決定することができる。したがって、下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示しており、いかなる点においても開示の残り部分を限定するものとして解釈してはならない。
実施例１：Ｔ−２０／トランスフェリン融合タンパク質
[00409] Ｔ−２０は、以下のアミノ酸配列を有するＨＩＶ融合阻害剤ペプチドである：ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号１７）。本発明は、Ｔ−２０ペプチドと、増大した半減期を有する改変されたトランスフェリン（ｍＴｆ）とを含む融合タンパク質、ならびに、ウイルスの伝播に関連する疾患を治療するためのこのような融合タンパク質の医薬組成物を提供する。下記の実施例はまた、Ｔ−２０ペプチドのアナログとのトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができる。
[00410] 抗ＨＩＶ活性を有する本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエを使用して、Ｔ−２０を改変トランスフェリン（ｍＴｆ）に融合することによって作製された。それによれば、最初の工程において、配列番号１７が、サッカロミセス・セレビシエのために最適化されたＤＮＡコドンに逆翻訳され、そして、ｍＴｆのＮ末端またはＣ末端におけるＴ−２０の融合構築物を作製するために使用された。
５’での融合
[00411] 一例として、Ｔ−２０が、適切なベクターへの連結のための制限部位突出部、例えば、ＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位などを両端に有する重なるプライマーを使用して、ｍＴｆの５’末端に融合される。あるいは、他の制限部位突出部を有する重なるプライマーを作製することができ、または、このようなプライマーは、特別に設計されたベクターへの連結のための適切な制限部位突出部を有するアダプターにアニーリングすることができる。
[00412] ベクターは、ｍＴｆのＮ末端内への治療分子の融合を可能にするために、ＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位などの制限部位を伴って特別に設計される。プライマーはアニーリングされ、改変トランスフェリン（ｍＴｆ）ベクターの５’末端におけるＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位または他の適切な制限部位を使用してこのベクターにクローン化される。その後、Ｔ−２０／ｍＴｆ融合タンパク質をコードするカセットがベクターから取り出され、タンパク質発現のために酵母ベクターにクローン化される。
[00413] 具体的には、制限突出部を有する以下の重複プライマーが、５’でのＴ−２０融合体を作製するために設計される。
Figure 2006503588
重複プライマーは以下の配列を有する：
P0038:
CTAGAGAAAAGGTACACTAGCTTAATACAC（配列番号１８）
P0039:
TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTACCTTTTCT（配列番号１９）
P0040:
TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG（配列番号２０）
P0041:
TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT（配列番号２１）
P0042:
AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTGTAC（配列番号２２）
P0043:
AAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC（配列番号２３）
[00414] これらのプライマーを６５℃でアニーリングし、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで切断された、特別に設計されたベクターｐＲＥＸ０００４に連結して、ｐＲＥＸ００１６が作製される。配列決定によって正しいクローンであることが確認された後、正しいクローンを増幅し、そして、ＰｓｉＩおよびＡｇｅＩなどの別の１対の適切な制限酵素で消化して、Ｔ−２０／ｍＴｆ融合タンパク質をコードするカセットをｐＲＥＸ００１６から取り出す。このカセットを、ＰｓｉＩおよびＡｇｅＩで切断されたｐＳＡＣ３などの酵母ベクターに連結する。Ｔ−２０／ｍＴｆのＮ末端融合タンパク質を含有するｐＳＡＣ３が、その後、タンパク質製造のために酵母にエレクトポレーションされる。
３’での融合
[00415] 同じ様式で、Ｔ−２０融合体が、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたは他の適切な制限酵素などの制限部位突出部を両端に有する重なるプライマーを使用してＴ−２０の３’末端に融合される。アニーリングされると、このフラグメントは、ＳａｌＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位などの制限部位を使用して、特別に設計されたベクターｐＲＥＸ０００１にクローン化される。配列決定によって正しいクローンであることが確認された後、プラスミドはＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、フラグメントが、ｍＴｆのＣ末端への治療タンパク質の融合を可能にするためにＳａｌＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ１つだけ伴って特別に設計されているｐＲＥＸ０００４にサブクローン化される。得られるプラスミドがｐＲＥＸ００１７である。ｐＲＥＸ００１７は、その後、ＰｓｉＩおよびＡｇｅＩなどの適切な酵素で切断されて、Ｔ−２０／ｍＴｆカセットがベクターから取り出される。Ｔ−２０／ｍ−Ｔｆカセットが、酵母における発現のために、ｐＳＡＣ３などの酵母ベクターにサブクローン化される。
[00416] 具体的には、制限突出部を有する下記の重複プライマーが、ｍＴｆのＣ末端に対するＴ−２０融合体を作製するために設計される。
Figure 2006503588
重複プライマーは以下の配列を有する：
P0044:
TCGACCTTACACTAGCTTAATACAC（配列番号２４）
P0045:
TGCGATTCTTCAATTAAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAAGG（配列番号２５）
P0040:
TCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATG（配列番号２６）
P0041:
TAATTCCAATAATTCTTGTTCATTCTTTTCTTGCTGGTTT（配列番号２７）
P0046:
AACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTTAATA（配列番号２８）
P0047:
AGCTTATTAAAACCAATTCCACAAACTTGCCCATTTATC（配列番号２９）
[00417] これらのプライマーを６５℃でアニーリングして、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された、特別に設計されたベクターに連結する。配列決定によって正しいクローンであることが確認された後、正しいクローンを増幅し、そして、ＰｓｉＩおよびＡｇｅＩなどの別の１対の適切な制限酵素で消化して、Ｔ−２０／ｍＴｆのＣ末端融合タンパク質をコードするカセットをベクターから取り出す。このカセットを、ＰｓｉＩおよびＡｇｅＩで切断されたｐＳＡＣ３などの酵母ベクターに連結する。Ｔ−２０／ｍＴｆ融合タンパク質を含有するｐＳＡＣ３が、その後、タンパク質製造のために酵母にエレクトポレーションされる。
Ｃ末端での改変
[00418] 融合体の発現レベルの増大、Ｔ−２０融合体の活性の増大、および／またはｍＴｆのＣ末端におけるペプチドの可動性の改善をもたらすかどうかを決定するために、様々な改変がｍＴｆの３’末端において行われる。
ＲＲＰの欠失
[00419] 最初の工程において、ｍＴｆの３’末端におけるプロリンが除去される。プロリンに加えて、潜在的なＫｅｘ２プロテアーゼ切断部位を提示し得るので、隣接する２つのアルギニン残基が除去される。欠失された配列が、改変されていない３’Ｔ−２０ｍＴｆ融合インサート（ｐＲＥＸ００１７、配列番号３１）と、ＲＲＰの欠失を伴う３’Ｔ−２０ｍＴｆ融合インサート（ｐＲＥＸ００３２、配列番号３０）との下記のアラインメントにおいて示される：
Figure 2006503588
[00420] 具体的には、ＲＲＰ配列が、この配列の隣接する領域に対して相同的なプライマーを使用して欠失される。欠失を作製するために使用されたプライマーは以下の通りである：
[00421]
P0060:
TCATCACTCCTGGAAGCCTGCACTTTCTACACTAGCTTAATACACTCCTT（配列番号３２）
P0061:
AAGGAGTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTGCAGGCTTCCAGGAGTGATGA（配列番号３３）
[00422] 変異誘発ＰＣＲ反応が、ＲＲＰをコードする９塩基を欠いた生成物を作製するために、外部プライマーと、テンプレートとしてｐＲＥＸ００１７とを使用して行われる。その後、この生成物はＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、ＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＲＥＸ００１７にクローン化されて、ｐＲＥＸ００３２が作製される。ｐＲＥＸ００３２は、その後、ＡｇｅＩ／ＰｓｉＩで切断され、ｐＳＡＣ３などの酵母ベクターにサブクローン化され、タンパク質発現のために酵母に形質転換される。
Ｃ４０２−Ｃ６７４ジスルフィドの除去
[00423] 次の工程において、ｍＴｆ分子においてＣｙｓ４０２とＣｙｓ６７４との間にまたがるジスルフィド結合が除去される。これは、両方のシステイン残基をグリシン残基に変異させることによって達成される。最初に、変異誘発プライマーを使用して、Ｃｙｓ４０２がＧｙｌに変異させられる。変異誘発プライマーは以下の通りである：
P0064:
TTGTCTACATAGCGGGCAAGGGTGGTCTGGTGCCTGTCTTG（配列番号３４）
P0065:
CAAGACAGGCACCAGACCACCCTTGCCCGCTATGTAGACAA（配列番号３５）
[00424] ＰＣＲ反応が、所望される変異を有する生成物を作製するために、外部プライマーと、テンプレートしてｐＲＥＸ００１７とを使用して行われる。その後、この生成物はＨｐａＩ／ＰｓｔＩで切断され、ｐＲＥＸ００１７に再びクローン化されて、Ｇｌｙ４０２中間体ｐＲＥＸ００３９が作製される。次いで、Ｃｙｓ６７４が、テンプレートとしてｐＲＥＸ０００４と、以下のプライマーとを使用して、同じ手順にしたがってＧｌｙ６７４に変異させられる：
P0068:
TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGTACTTTCCGTCGACCTTAA（配列番号３６）
P0069:
CTTATTAAGGTCGACGGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGTGG（配列番号３７）
[00425] 得られる生成物をＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、新しいＧｌｙ４０２中間体ｐＲＥＸ００３９にサブクローン化して、ｐＲＥＸ００３８が作製される。このプラスミドはＴ−２０ペプチドを含有せず、そのため、他のｍＴｆ融合体のために将来有用になる。Ｔ−２０ペプチドをｐＲＥＸ００３８に挿入するために、ｐＲＥＸ００１７のＳａｌＩ／ＡｇｅＩフラグメントがクローン化されて、ｐＲＥＸ００３４が形成される。その後、ｐＲＥＸ００３４はＡｇｅＩ／ＰｓｉＩで切断された。カセットが、ｐＳＡＣ３などの酵母ベクターにサブクローン化され、タンパク質発現のために酵母に形質転換される。これらの変異は、非改変の３’Ｔ−２０ｍＴｆ融合プラスミドインサート（ｐＲＥＸ００１７）と、Ｃ４０２−Ｃ６７４ジスルフィド欠失を有する３’Ｔ−２０ｍＴｆ融合インサートとの以下のアラインメントに示される：
Figure 2006503588
ジスルフィド欠失およびＲＲＰ欠失の組合せ
[00426] ３番目の工程において、ＲＲＰ欠失およびＣ４０２−Ｃ６７４ジスルフィド欠失が組み合わせられる。はじめに、中間プラスミドｐＲＥＸ００４１が、Ｃｙｓ６７４変異がプライマーに存在したことを除いて、ｐＲＥＸ００３２のような様式で作製される。下記のプライマーが使用される：
P0066:
TCCACCTCATCACTCCTGGAAGCCGGCACTTTCTACACTAGCTTAATA（配列番号４２）
P0067:
GTGTATTAAGCTAGTGTAGAAAGTACCGGCTTCCAGGAGTGATGAGGT（配列番号４３）
[00427] その後、ｐＲＥＸ００４１をＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＲＥＸ００３９にサブクローン化して、ｐＲＥＸ００３３が作製される。その後、ｐＲＥＸ００３３はＡｇｅＩ／ＰｓｉＩで切断される。カセットが、ｐＳＡＣ３などの酵母ベクターにサブクローン化され、その後、タンパク質発現のために酵母に形質転換される。ｐＲＥＸ００３３のｍＴｆ３’Ｔ−２０融合体と、ｐＲＥＸ００１７との以下のアラインメントは、得られる生成物の変異を示している。
Figure 2006503588
ウサギにおけるｍＴｆ−Ｔ２０の薬物動態学
[00428] Ｔ２０が、ｍＴｆ−Ｔ−２０融合タンパク質を作製するために、上記方法によってｍＴｆのＣ末端に融合された。５０μｇのｍＴｆ−Ｔ２０融合タンパク質を示した時間（図４参照）でニュージーランドホワイトラビットに静脈内注射し、３ｍｌの血液を取り出し、血漿を分離され、凍結した。血漿サンプルを、その後、ヒトトランスフェリンについて特異的な、内因性のウサギトランスフェリンとは交差反応しないＥＬＩＳＡアッセイで分析した。注射後２時間で測定されたｍＴｆ−Ｔ２０の濃度が、通常、最も高く、１００％とされた。他の濃度はすべて、２時間目のサンプルの濃度と比較された。排除半減期が、４４±２時間であると計算された。図４に、２羽のウサギにおけるｍＴｆ−Ｔ２０の薬物動態学を示す。
[00429] ｍＴｆは、半減期がヒトでは約１４日であり、ウサギでは６０時間である。したがって、ヒトにおけるｍＴｆ−Ｔ２０について７日を越える半減期が予想され、これは、Ｔ２０について報告された２時間よりも著しく長い。
実施例２：ＥＭＰ１／トランスフェリン融合タンパク質
[00430] ＥＭＰ１（配列番号１１）は、ＥＰＯ受容体の二量体化を生じさせることによってＥＰＯ活性を模倣することが示されている。このペプチドは環状であり、ＥＰＯに対する相同性を有していない。活性になるためには、このペプチドは、２コピーの受容体が十分に近くに接近して活性な複合体を形成するように、もう一つのペプチドと協調して、すなわち、二量体として作用しなければならない。多くのペプチドの場合のように、このペプチド二量体は、半減期が短いという難点を有しており、トランスフェリンに対する融合がもたらす長寿命から利益を受ける。本発明は、ＥＰＯミメティック活性を有する融合タンパク質を提供する。一例として、本発明の融合タンパク質は、ＥＭＰ１ペプチド（配列番号１１）と、増大した半減期を有する改変されたトランスフェリン（ｍＴｆ）とを含む。本発明はまた、低い赤血球産生または不完全な赤血球産生に関連する疾患を治療するための、このような融合タンパク質の医薬組成物を提供する。
ＥＭＰ１−ｍＴｆ融合体および挿入体
[00431] ｍＴｆに対する最初の融合体は、ｍＴｆのＮ末端に対する融合、ｍＴｆのＣ末端に対する融合、ならびに、ｍＴｆのＮ末端およびＣ末端に対する融合を含む。個々の融合体は受容体と結合するが、受容体の活性化を生じさせない。二重の融合は、その一方が、再組換えを防止するためにもう一方とは異なるコドン組成でなければならないが、受容体に結合することを可能し、活性化を生じさせる。
[00432] ヒトＴｆ（ＰＤＢ識別子１Ａ８Ｅ）のＮドメインおよび完全なＴｆモデルＡＡＡａｏＴｆｗｏ（これは、ウサギモデル１ＪＮＦをテンプレートとして用いてＥｘＰａｓｙ Ｓｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｅｒｖｅｒを使用して作製された）を調べることにより、直接的、または多数の残基の置換のいずれかによってペプチドを挿入するための多数の潜在的な部位が明らかにされる。これらの部位は、Ｃドメインにおけるそれらの等価な部位によって重複する。
Figure 2006503588
[00433] これらのループの２つが、ＥＭＰ１ペプチドが挿入され得る好ましい部位である：Ｎ１のＨｉｓ２８９（２８６〜２９２）およびＮ２のＡｓｐ１６６（１６２〜１７０）。これらの位置は、ＥＰＯ受容体の２つの半部分に対する結合のために要求される正しい配向を与える。挿入部位がＮドメインのＮ１ドメインおよびＮ２ドメインに存在するので、それらはこれらの２つのサブドメインの間においてヒンジの柔軟性を有し、これにより、それらが受容体の中に進むことが可能になる。
[00434] ＮドメインおよびＣドメインの間における構造的類似性のために、Ｃドメイン上の等価な挿入部位（Ｃ１ ４８９〜４９５、Ｃ２ ６２３〜６２８）もまた、分子多価体を作製するために使用することができる。これは、まさにＮドメインもしくはＣドメインにおいて、または、両ドメインにおける部位の組合せによって、上に示した様々な潜在的挿入部位を使用して行われる。
Figure 2006503588
ＥＭＰ１／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するための工程
[00435] 本実施例では、２つのＥＭＰ１ペプチド（配列番号１１）が、ＥＭＰ１ペプチドおよびｍＴｆのコード核酸を使用して操作され、トランスフェリンの骨格の中に入れられる。
Figure 2006503588
[00436] １つのＥＭＰ１ペプチドが操作されて、Ｈｉｓ２８９とＧｙｌ２９０との間でｍＴｆの中に入れられる。トランスフェリン分子に固有な重複は、２つのドメインが互いに鏡に映すように反映されるので、第２のＥＭＰ１ペプチドを操作して、Ｇｌｕ６２５とＴｈｒ６２６との間でＣドメインの重複領域に入れることを可能にする。
Figure 2006503588
[00437] 一例として、それぞれの挿入のために、２つの重複変異誘発プライマーが合成される（下記参照）。ｍＴｆをコードする核酸を含有するベクター（例えば、ｐＲＥＸ００１０など）をテンプレートとして使用して、各変異誘発プライマー、およびＴｆのｃＤＮＡの５’または３’に由来する外部プライマーを用いて反応が行われる。これらの２つの反応から得られる生成物が、その後、混合され、更なる反応が、２つの生成物を一緒に連結するために外部プライマーを用いて行われた。Ｈｉｓ２８９−Ｇｌｙ２９０インサートＰＣＲ産物がＸｂａＩおよびＨｐａＩで消化され、ＸｂａＩ／ＨｐａＩで消化されたｐＲＥＸ００１０に連結される。得られるベクターが、その後、ＨｐａＩおよびＳａｌＩで消化され、ＨｐａＩ／ＳａｌＩで消化されたＧｌｕ６２５−Ｔｈｒ６２６インサートＰＣＲ産物と連結される。
Figure 2006503588
[00438] ＥＭＰ１／ｍＴｆ融合タンパク質を含有するカセットが、適切な制限酵素を用いてベクターから切り出され、ｐＳＡＣ３５などの酵母ベクターに連結される。ｐＳＡＣ３５はタンパク質発現のために酵母に形質転換される。
[00439] ＥＰＯミメティックペプチドまたは任意の他のペプチドを挿入するための代わりの点は、Ｎ４１３およびＮ６１１においてトランスフェリンのＣドメインに存在する２つのグリコシル化部位である。これらの部位の利点は、挿入が達成されると、グリコシル化が、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の破壊により妨げられるということである。
実施例３：ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質
[00440] ＧＬＰ−１は、インスリン分泌を調節するペプチドである。ＧＬＰ−１は、糖尿病（特にＩＩ型糖尿病）に罹患しているヒトにおいて抗糖尿病活性を有する。他のペプチドと同様に、ＧＬＰ−１はヒトにおいて血清半減期が短い。本発明は、増大した半減期を有するｍＴｆに融合されたＧＬＰ−１との融合タンパク質、および、異常なグルコースレベルに関連する疾患を治療するための、このような融合タンパク質を含む医薬組成物で、経口投与することができる医薬組成物を提供する。
[00441] 本発明はまた、ＧＬＰ−１アナログおよびｍＴｆを含む融合タンパク質を提供する。本発明の一実施形態において、ＧＬＰ−１アナログは更なるＨｉｓ残基をＮ末端に含む。このＨｉｓ残基はＧＬＰ−１のＮ末端に加えることができ、または、ＧＬＰ−１のＮ末端におけるＨｉｓ残基の後に挿入することができる。別の実施形態において、ＧＬＰ−１アナログはアミノ酸置換を２位に含む。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドまたはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチド（配列番号６）におけるＡｌａが別のアミノ酸で置換される。
[00442] 本実施例では、ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するための工程が記載される。同じ工程を、ＧＬＰ−１ペプチドのアナログとのトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができる。
[00443] ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するために、ＧＬＰ−１（７〜３６）ペプチドおよびＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列を使用することができる。
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr（配列番号４８）
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg（配列番号６４）
[00444] 例えば、ＧＬＰ−１（７〜３７）のペプチド配列を、酵母のために最適化されたＤＮＡおよびコドンに逆翻訳することができる。
Figure 2006503588
[00445] プライマーが、アニーリング後に５’のＸｂａＩ粘着末端および３’のＫｐｎＩ粘着末端を形成するために、かつ、リーダー配列の末端のすぐ５’側で、ｍＴｆのＮ末端におけるＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断のｐＲＥＸ００５２への直接的な連結を可能にするために特別に設計された。あるいは、他の粘着末端を他のベクターへの連結のために操作することができる。
Figure 2006503588
[00446] アニーリングおよびライゲーションの後、クローンを配列決定して、正しい挿入を確認した。このベクターはｐＲＥＸ００９４と名付けられた。カセットを、ＮｏｔＩを用いてｐＲＥＸ００９４から切り出し、ＮｏｔＩで切断された酵母ベクターｐＳＡＣ３５にサブクローン化して、ｐＲＥＸ０１００を作製した。
[00447] その後、このプラスミドを宿主のサッカロミセス酵母株にエレクトロポレーションして、形質転換体を、最小培地プレートにおけるロイシン原栄養体について選択した。発現が、液体最小培地における増殖、ならびに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる上清の分析によって明らかにされた。
実施例４：β−ＩＦＮ／トランスフェリン融合タンパク質
[00448] β−ＩＦＮは、多発性硬化症、脳腫瘍、皮膚ガン、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎（これらに限定されない）などの様々な疾患の治療に有効である。ほとんどのサイトカインのように、β−ＩＦＮは循環半減期が短い。本発明は、患者における増大した半減期および効力を有する、ｍＴｆに融合されたβ−ＩＦＮを含む融合タンパク質を提供する。本実施例では、経口投与することができるβ−ＩＦＮ／ｍＴｆ融合タンパク質を作製する際の工程が記載される。
[00449] 本実施例において、ＩＮＦβ−１が改変トランスフェリンにＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて融合される。ＩＮＦβ−１クローンはＡＴＣＣ（Ｎｏ．３９５１７）から入手した。特別に設計されたプライマーが、ＩＮＦβ−１クローンのＤＮＡ配列を確認するために使用された。これらのプライマーは、ＩＮＦβ−１のＤＮＡ配列の外側であり、クローンの全長配列が得られるようにベクターから読み込むために設計された。使用されたプライマーは以下の通りであった：
P0070 GCTATGACCAACAAGTGTCTC（配列番号５３）
P0071 CGCACCTGTGGCGCCGGTGATG（配列番号５４）
Ｎ末端での融合
[00450] ＤＮＡ配列が確認されると、プライマーが、ＩＮＦβ−１をｍＴｆに融合させるために設計された。Ｎ末端融合は２段階プロセスであった。ＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位を有するプライマーを使用する直接的な融合では、ＫｐｎＩ部位が破壊され、ｍＴｆの開始部が削られる。リンカー、つまり、プライマーＰ００８２（配列番号５５のヌクレオチド１８〜４８）およびＰ００８３（配列番号５６のヌクレオチド１７〜３９）が、Ｔ〜Ｇ（太字）へのｂｐ４８６の単一サイレント変異によって、また、５’のＸｂａＩ突出端と、ＫｐｎＩ部位とアニーリングする３’のＧＡＴＣとを伴って、内部のＫｐｎＩ部位をＩＮＦβ−１の３’末端に作製するために設計された。突出端は、ｐＲＥＸ００５２内の存在するＫｐｎＩ部位を破壊した。リンカーをアニーリングして、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断されたｐＲＥＸ００５４に連結して、操作されていないｍＴｆと、ＩＮＦβ−１遺伝子をｍＴｆのＮ末端で融合させるために使用され得るＫｐｎＩ部位とを有する中間ベクターを作製した。
Figure 2006503588
[00451] 第２の一組のプライマー、すなわち、Ｐ００８４（配列番号６０）およびＰ００８５（配列番号６１）が、ＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位を介した中間ベクターへのその後の挿入のために、変異誘発ＰＣＲによって、ＩＮＦβ−１遺伝子の両端を調整するために設計された。この調整された遺伝子のＸｂａＩ／ＫｐｎＩ消化により、ＩＮＦβ−１の最後の５個のアミノ酸が除かれた。しかしながら、これらは中間ベクターの中に既に操作されて入れられていた。得られる構築物ｐＲＥＸ００４８は、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断されたＩＮＦβ−１遺伝子をＸｂａＩ／ＫｐｎＩ切断の中間ベクターに連結することによって作製された。
Figure 2006503588
[00452] ｐＲＥＸ００４８構築物を作製した後、ｐＲＥＸ００４８構築物を配列決定して、正しい挿入を確認した。その後、発現カセットをＮｏｔＩフラグメントとして、ＮｏｔＩ切断の酵母ベクターｐＳＡＣ３５にサブクローン化して、ｐＲＥＸ００５０を作製した。
Ｃ末端での融合
[00453] 特別に設計されたプライマーのＰ００８６（配列番号６２）およびＰ００８７（配列番号６３）を使用して、元のクローンをＰＣＲ増幅し、かつ、更には、ＳａｌＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を５’末端および３’末端にそれぞれ有するようにＩＮＦβ−１の両端を調整した。新しく調整された生成物をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＲＥＸ００５２に連結して、ｐＲＥＸ００４９を作製した。
Figure 2006503588
[00454] ｐＲＥＸ００４９構築物を作製した後、ｐＲＥＸ００４９構築物を配列決定して、正しい挿入を確認した。その後、発現カセットはＮｏｔＩフラグメントとして、ＮｏｔＩ切断の酵母ベクター（例えば、ｐＳＡＣ３５など）にサブクローン化され、ｐＲＥＸ００５１が作製される。
[00455] 本発明の一実施形態において、β−ＩＦＮ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２１７６、配列番号６５）は、Ｃｙｓ１７（成熟型タンパク質において）をＳｅｒに変異させることによって、より安定かつ可溶性にされる。Ｃｙｓ１７からＳｅｒへの変異は、特別に設計されたプライマーと、テンプレートとしてのβ−ＩＦＮ−１をコードする核酸とを使用する変異誘発ＰＣＲ反応などの日常的な変異誘発反応によって行うことができる。
[00456] 更に、β−ＩＦＮ−１は、Ｎ結合型グリコシル化部位のＮＥＳ（配列番号６５の残基８０〜８２）／Ｔを改変することによってグリコシル化を妨げるために改変される。一例として、ＮをＱに変異誘発することができ、また、Ｓ／ＴをＡｌａまたは他のアミノ酸に変異誘発することができる。このような変異誘発法は、特別に設計されたプライマーと、テンプレートとしてのβ−ＩＦＮ−１をコードする核酸とを使用する変異誘発ＰＣＲ反応を用いて行うことができる。
実施例５：インスリン−トランスフェリン融合タンパク質
[00457] インスリンは、膵臓のランゲルハンス島によって分泌され、かつ、炭水化物および脂肪の代謝（特に、グルコースのグリコーゲンへの変換）を調節するペプチドホルモンである。インスリンは、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病に罹患しているヒト、ならびに糖尿病動物に対して投与される。現在、インスリンは、皮下注射によって投与されなければならず、ヒトにおける血漿半減期が短い。本発明は、増大した半減期を有する、ｍＴｆに融合されたインスリンの融合タンパク質、および、異常なグルコースレベルに関連する疾患を治療するための、このような融合タンパク質の医薬組成物で、経口投与することができる医薬組成物を提供する。
[00458] 本実施例では、インスリン／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するための工程が記載される。類似する工程にしたがって、インスリンペプチドのアナログとのトランスフェリン融合タンパク質を作製することができる。
[00459] サッカロミセスにおける発現のために、Ｎ末端融合のための５’のＸｂａＩ／ＫｐｎＩ部位間のインサートまたはＣ末端融合のための３’のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位間のインサートのいずれかとして、酵母におけるｍＴｆの発現のためのカセットを有する大腸菌クローニングベクターを含む基礎ベクターｐＲＥＸ００５２において、様々な構築物が最初に作製された。
Figure 2006503588
[00460] これらの構築物は、（５’から３’に）酵母のＰＲＢ１プロモーター、増殖培地への分泌を行わせるリーダー配列、（Ｎ末端融合）、ｍＴｆ配列、（Ｃ末端融合）、終止コドンおよびＡＤＨ１ターミネーター配列を有する発現カセットを形成する。構築されると、発現カセットがＮｏｔＩフラグメントとして回収され、ＮｏｔＩで消化されたｐＳＡＣ３５（大腸菌／酵母シャトルベクター）に挿入された。
[00461] 使用されたインスリン配列は、下記に示されるように、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００２０７の配列、すなわち、配列番号７１（ＤＮＡ）および配列番号７２（タンパク質）に対応する。
Figure 2006503588
[00462] 上記配列に対するｃＤＮＡは、数多くの方法で、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡプールから、または、重複する合成オリゴヌクレオチドによって作製することができる。ｃＤＮＡプールからクローンを作製するために、２つのプライマーが、ＰＣＲプライマーとして合成され、使用された。
５’プライマー 5'-tttgtgaaccaacacctgtgcggc-3'（配列番号７３）
３’プライマー 3'-gacgagggagatggtcgacctcttgatgacgttg-5'（配列番号７４）
[00463] Ｎ末端インサートを作製するために、５’の変異誘発プライマーが、最初のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して第２のＰＣＲ産物を作製するために使用された。このプライマーにより、リーダー配列の最後の５個のアミノ酸と、ＸｂａＩ部位とが挿入された。ＫｐｎＩ部位はこの方法により挿入することができない。アミノ酸の変化がＫｐｎＩ部位の作製より生じるからである。その代わり、ＰＣＲ産物がＸｂａＩ／ＰｖｕＩＩで消化された。その後、リンカーを、ＰｖｕＩＩの５’末端と、ＫｐｎＩ消化のｐＲＥＸ００５２におけるＫｐｎＩ突出端に連結される３’突出端とを有する２つの重複するオリゴから作製した。このリンカーをアニーリングして、消化されたＰＣＲフラグメントに連結し、得られた生成物をＸｂａＩ／ＫｐｎＩ消化のｐＲＥＸ００５２に連結した後、プラスミドｐＲＥＸ００５２Ｎ−インスリン（配列番号７５および配列番号７６、それぞれＤＮＡおよびタンパク質）を作製した。
Figure 2006503588
[00464] Ｃ末端インサートを作製するために、５’および３’の変異誘発プライマーが、最初のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して第２のＰＣＲ産物を作製するために使用された。その後、この生成物をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＲＥＸ００５２に連結した。これにより、プラスミドｐＲＥＸ００５２Ｃ−インスリン（配列番号８０および配列番号８１）が得られた。
Figure 2006503588
[00465] Ｎ末端インサートおよびＣ末端インサートに対するＤＮＡ配列が調べられ、確認されると、プラスミドｐＲＥＸ００５２Ｎ−インスリンおよびプラスミドｐＲＥＸ００５２Ｃ−インスリンをＮｏｔＩで消化し、発現カセットを回収した。その後、これらをＮｏｔＩ消化のｐＳＡＣ３５に連結して、ｐＳＡＣ３５Ｎ−インスリンおよびｐＳＡＣ３５Ｃ−インスリンを得た。その後、これらのプラスミドを宿主のサッカロミセス酵母株にエレクトロポレーションして、形質転換体を、最小培地プレートにおけるロイシン原栄養体について選択した。発現が、液体最小培地における増殖、ならびに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅによる上清の分析によって明らかにされた。
[00466] これらの融合構築物は、トランスフェリンに結合したプロインスリンの産生をもたらした。酵母内のプロテアーゼにより、プロインスリンは、作製および分泌されているとき、インスリンに転換され得る。しかし、最終的な発現産物はプロインスリンのみを含有するだけであり得る。その場合、プロインスリンは、適切な精製プロテアーゼを使用して、翻訳後、インスリンに変換することができる。
インスリン／改変トランスフェリン融合タンパク質のラットへの経口投与
[00467] インスリン／ｍＴｆ融合タンパク質のインスリン活性を試験するために、糖尿病ラットが最初に準備される。メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２４時間絶食させ、その血中グルコースレベルが、ベースラインを明らかにするために測定される。その後、ラットには、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）が６０ｍｇ／ｋｇの投薬量で腹腔内注射される。ＳＴＺのｉ．ｐ．注射は更に４日間続けられ、絶食時の血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを越えるラットが糖尿病ラットとして選択される。
[00468] 融合タンパク質の溶液およびインスリン単独の溶液が、ラットに投与されたとき、７ユニット／ｋｇ〜８０ユニット／ｋｇのインスリンの投薬量をもたらすように、ＰＢＳまたは炭酸水素ナトリウムにおいて調製される。コントロールとして、ラットはまた、ＰＢＳ単独で処理される。これらの溶液またはＰＢＳが、１２時間の絶食後、経口胃管法によってラットに投与され、血液サンプルが、０分後、３０分後および６０分後、および、その後は２時間間隔で尾から採取される。投薬後０時間、０．５時間、１時間、３時間、５時間、７時間、９時間および１１時間での血中グルコースレベルが、糖尿病のために設計された血中グルコースモニタリング装置を用いて測定され、ラットには、投薬後１１時間目に再び餌が与えられる。
[00469] インスリンの活性は、血中グルコースレベルの経時的な減少を測定し、ＰＢＳのみのサンプルにおける何らかの増大または減少によるその減少を補正することによって明らかにされる。非融合インスリンに対する融合タンパク質のインスリン活性が比較される。
[00470] 腸粘膜におけるトランスフェリン受容体による融合タンパク質の取り込みを調べるために、融合タンパク質、およびコントロールとしての非融合タンパク質が、上記の糖尿病誘導ラットに投与され、輸送が、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡおよび血清サンプルを使用して測定される。あるいは、１２５Ｉで標識された融合タンパク質、または１２５Ｉで標識された非融合タンパク質が、上記のように、経口胃管法によって８０Ｕインスリン／ｋｇの投薬量で糖尿病誘導ラットに投与される。血液サンプルが、これもまた上記で記載されたように、０分後、３０分後および６０分後、および、その後は２時間間隔で尾から採取され、血清サンプルが、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムを使用し、サンプルをＰＢＳで溶出するＨＰＬＣによって分析される。１２５Ｉで標識されたトランスフェリン、１２５Ｉで標識されたインスリン、および１２５Ｉで標識された融合タンパク質を含有する標準品もまた、そのピーク溶出時間および画分番号を明らかにするために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムで処理される。各画分の放射能が、ガンマカウンターを用いて測定され、各画分のタンパク質含有量が２８０ｎｍにおける吸光度によって測定される。融合タンパク質で治療されたラットから得られた血清サンプルは、数時間の遅延が存在し得るように、融合タンパク質の出現を直ちに示さないことがある。
実施例６ 増大した鉄親和性を有する治療用ｍＴｆ融合タンパク質の調製
[00471] 増大した鉄親和性を有する治療用ｍＴｆ融合タンパク質を調製することができる。増大した鉄結合の結合力を有する改変トランスフェリン融合タンパク質を調製するための一例として、上記の実施例５における手順を下記の改変とともに行うことができる。これらの融合タンパク質は、消化管上皮を越える融合タンパク質の取り込みおよび移動を容易にするために使用することができる。
[00472] ｍＴｆ配列を含有するクローニングベクター（例えば、上記のｐＲＥＸ００５２など）が、ｍＴｆ遺伝子の部分を取り出すために制限酵素または１対の制限酵素で切断される。当分野における標準的な技術を使用して、このフラグメントは、その後、配列番号１のヌクレオチド７２３に対応する位置に変異を導入し、これにより、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）のコドンをＣＡＧ（Ｇｌｎ）またはＧＡＧ（Ｇｌｕ）に変換するプライマーを使用する部位特異的変異誘発法に供される。同様に、配列番号１のヌクレオチド７２６およびヌクレオチド７２８に対応する位置に変異を導入し、これにより、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）のコドンをＣＡＧ（Ｇｌｎ）またはＧＡＧ（Ｇｌｎ）に変換するプライマーが使用される。変異を３つのヌクレオチド位置のすべてに導入し、これにより、２つの隣接アミノ酸の置換を生じさせるプライマーもまた使用することができる。これらのヌクレオチド位置は、リーダー配列とともにコードされるタンパク質のアミノ酸２２５およびアミノ酸２２６に対応し、また、成熟型タンパク質のアミノ酸２０６およびアミノ酸２０７に対応する。その後、変異処理されたフラグメントがＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、クローニングベクターに再連結される。このような変異を含有するこのベクターが、治療タンパク質をコードするＤＮＡ分子を導入するためのその後の工程において使用される。上記の実施例５で記載されたように、ｍＴｆ融合タンパク質配列は、タンパク質発現のために、酵母発現ベクターに導入することができ、かつ、サッカロミセスまたは他の酵母に形質転換することができる。
[00473] 既に議論したように、他のアミノ酸もまた、増大した鉄親和性を有する治療用ｍＴｆタンパク質を得るために変異させることができる。
実施例７：可溶性毒素受容体／トランスフェリンタンパク質
[00474] クロストリジウム神経毒は有毒物質である。シナプトタグミン１はボツリヌス菌神経毒の様々な血清型の広範囲作用受容体である。シナプトタグミン１のアミノ酸１〜５３（配列番号４）は、様々な神経毒血清型に対する結合を担っている。他のペプチドのように、可溶性の毒素受容体（例えば、アミノ酸１〜５３など）は半減期が短い。本発明は、配列番号１〜５３を有する可溶性の毒素受容体と比較して、増大した半減期を有する、ｍＴｆと融合されたアミノ酸１〜５３を含む融合タンパク質を提供する。
[00475] 本発明は、抗毒素活性および増大した半減期を有する融合タンパク質を提供する。具体的には、本実施例では、改変Ｔｆと、シナプトタグミン１のアミノ酸１〜５３（配列番号４）からなるペプチドとを含む融合タンパク質が、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の１コピーまたは複数コピーをＴｆのヌクレオチド配列に融合して、ペプチドがＴｆのＮ末端またはＣ末端に融合された融合タンパク質を作製することによって作製される。
[00476] 配列番号４をコードする配列を挿入するために、改変トランスフェリンのｃＤＮＡを有するベクターｐＲＥＸ００１０が、５’末端での挿入のために制限酵素ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化され、また、３’末端での挿入のために制限酵素ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化される。
[00477] ５’での挿入のために、配列番号４をコードする核酸の５’末端でＸｂａＩ突出端を形成するオリゴと、３’末端でＫｐｎＩ突出端を形成するオリゴとの２つの重なるオリゴが合成される。その後、これらのオリゴは一緒にアニーリングされ、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化されたｐＲＥＸ００１０ベクターに連結される。
[00478] 形質転換、選択および発現が、その後、酵母において行われる。
[00479] 本発明は、上記の実施例を参照して詳細に記載されているが、様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが理解される。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定されるだけである。本明細書中において参照される引用された特許および特許出願および刊行物はすべて、その全体を参照として本明細書中に組み入れる。
ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）（配列番号３）のＮドメインおよびＣドメインのアラインメント（配列比較）を示す。類似部分および同一部分はハイライトになっている。 様々な種から得られるトランスフェリン配列のアラインメントを示す。明るい陰影は類似部分を、暗い陰影は同一部分を表す（配列番号８４〜９０）。 様々な種から得られるトランスフェリン配列のアラインメントを示す。明るい陰影は類似部分を、暗い陰影は同一部分を表す（配列番号８４〜９０）。 治療用のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドのための、Ｔｆ表面に露出した多数の挿入部位の位置を示す。 ２羽のウサギにおけるｍＴｆ−Ｔ２０の薬物動態を示す。

Claims (89)

  1. 治療タンパク質または治療ペプチドに融合された改変トランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、Ｔｆタンパク質が、低下したグリコシル化、低下した金属の結合、または低下した受容体の結合を示す、融合タンパク質。
  2. 治療タンパク質または前記治療ペプチドが、β−インターフェロン（ＩＦＮ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、エリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ１）、Ｔ−２０、インスリンおよび可溶性毒素受容体からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 可溶性毒素受容体がシナプトタグミンＩである、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 治療タンパク質もしくは治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体が、ＴｆのＣ末端に融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 治療タンパク質もしくは治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体が、ＴｆのＮ末端に融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 治療タンパク質もしくは治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体が、Ｔｆの少なくとも１つのループの中に挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. Ｔｆタンパク質がトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する低下した親和性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  8. Ｔｆタンパク質がラクトフェリンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  9. Ｔｆタンパク質がＴｆＲと結合しない、請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. Ｔｆタンパク質が鉄に対する低下した親和性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  11. Ｔｆタンパク質が鉄と結合しない、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. Ｔｆタンパク質がグリコシル化を妨げる変異を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  13. Ｔｆタンパク質がラクトフェリンである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. ツニカマイシンの存在下で発現される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  15. Ｔｆタンパク質が、Ｔｆタンパク質のＮドメインの一部、架橋ペプチド、およびＴｆタンパク質のＣドメインの一部を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  16. 架橋ペプチドにより治療タンパク質または治療ペプチドがＴｆに連結される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. 治療タンパク質または治療ペプチドが、Ｔｆタンパク質のＮドメインとＣドメインとの間に挿入される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  18. Ｔｆタンパク質が、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加をヒンジ領域に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  19. ヒンジ領域が、配列番号３の９４残基目付近〜９６残基目付近、配列番号３の２４５残基目付近〜２４７残基目付近、配列番号３の３１６残基目付近〜３１８残基目付近、配列番号３の４２５残基目付近〜４２７残基目付近、配列番号３の５８１残基目付近〜５８２残基目付近、および配列番号３の６５２残基目付近〜６５８残基目付近からなる群から選択される、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. Ｔｆタンパク質が、Ａｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、Ｈｉｓ５８５、Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８およびＧｌｙ４５９からなる群から選択される配列番号３内の位置における、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  21. 治療タンパク質または治療ペプチドにより、Ｔｆの少なくとも１つのループが置き換えられる、請求項６に記載の融合タンパク質。
  22. グリコシル化部位が、配列番号３のアミノ酸Ｎ４１３および配列番号３のアミノ酸Ｎ６１１に対応するアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  23. Ｔｆが、Ａｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、Ｈｉｓ５８５、Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８およびＧｌｙ４５９からなる群から選択される配列番号３内のアミノ酸に対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を含む、請求項７または９に記載の融合タンパク質。
  24. ＴｆのＣ末端のプロリン残基が欠失している、請求項４に記載の融合タンパク質。
  25. ＴｆのＣ末端のシステインループが欠失している、請求項４に記載の融合タンパク質。
  26. 治療タンパク質または治療ペプチドの血清半減期が、非融合状態の治療タンパク質もしくは治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体の血清半減期よりも増大している、請求項１に記載の融合タンパク質。
  27. Ｔｆタンパク質がＴｆＲと結合しない、請求項１に記載の融合タンパク質。
  28. Ｔｆタンパク質が低下したグリコシル化を示すか、またはグリコシル化を全く示さない、請求項１に記載の融合タンパク質。
  29. グリコシル化を妨げる変異を少なくとも１つ含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. 請求項１に記載される融合タンパク質をコードする核酸分子。
  31. 請求項３０に記載される核酸分子を含むベクター。
  32. 請求項３１に記載されるベクターを含む宿主細胞。
  33. 請求項３０に記載される核酸分子を含む宿主細胞。
  34. コードされる融合タンパク質を発現させる条件のもとで、請求項３２に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
  35. コードされる融合タンパク質を発現させる条件のもとで、請求項３３に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
  36. 原核生物または真核生物である、請求項３２に記載の宿主細胞。
  37. 原核生物または真核生物である、請求項３３に記載の宿主細胞。
  38. 酵母細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
  39. 酵母細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
  40. 請求項３０に記載される核酸分子を含む遺伝子組換え動物。
  41. 請求項４０に記載される遺伝子組換え動物から融合タンパク質を単離することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を製造する方法。
  42. Ｔｆ融合タンパク質がラクトフェリンを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 融合タンパク質が遺伝子組換え動物から得られる生物学的液体から単離される、請求項４２に記載の方法。
  44. 液体が血清または乳汁である、請求項４２に記載の方法。
  45. 請求項１に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、患者の疾患または疾患症状を治療する方法。
  46. Ｔｆタンパク質がＮ末端ドメインをタンパク質の各末端に有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  47. 治療タンパク質もしくは治療ペプチドまたは可溶性毒素受容体が、Ｔｆタンパク質の各Ｎ末端ドメインに融合される、請求項４６に記載の融合タンパク質。
  48. 可溶性毒素受容体が毒素に特異的に結合する、請求項２に記載の融合タンパク質。
  49. 治療タンパク質または治療ペプチドが、β−ＩＦＮ、ＧＬＰ−１、エリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ１）、Ｔ−２０、インスリンまたは可溶性毒素受容体のアナログであり、前記アナログは疾患、状態または障害を治療、予防または改善に効果的である、請求項２に記載の融合タンパク質。
  50. 請求項１、２または３に記載される融合タンパク質と、担体とを含む医薬組成物。
  51. 治療上有効な量の請求項１に記載の融合タンパク質を被験者に投与するステップを含む、被験者を治療する方法。
  52. 被験者が多発性硬化症、脳腫瘍、皮膚ガン、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎に罹患しており、融合タンパク質がβ−ＩＦＮまたはそのアナログを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記被験者が多発性硬化症に罹患している、請求項５２に記載の方法。
  54. 健常者と比較して被験者はグルコースレベルの上昇がみられ、融合タンパク質がＧＬＰ−１またはそのアナログを含む、請求項５１に記載の方法。
  55. グルコースレベルの上昇が糖尿病に関連する、請求項５４に記載の方法。
  56. 糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項５５に記載の方法。
  57. 健常者と比較して、被験者は低赤血球産生か不完全な赤血球産生がみられ、融合タンパク質がＥＭＰ１またはそのアナログを含む、請求項５１に記載の方法。
  58. 低赤血球産生または不完全な赤血球産生が、貧血、β−サラセミア、妊娠障害、月経障害、関節リウマチ、ＡＩＤＳおよびガンに関連する、請求項５７に記載の方法。
  59. 被験者がレトロウイルスの感染により引き起こされる疾患に罹患しており、治療ペプチドがウイルス進入の阻害剤である、請求項５１に記載の方法。
  60. レトロウイルスがヒトレトロウイルスである、請求項５９に記載の方法。
  61. ヒトレトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヒトＴリンパ球ウイルスＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＨＴＬＶ−ＩＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. レトロウイルスが非ヒトレトロウイルスである、請求項５９に記載の方法。
  63. 非ヒトレトロウイルスが、ウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、サル肉腫ウイルス、サル白血病ウイルスおよびヒツジ進行性肺炎ウイルスからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 阻害剤がＴ−２０、Ｔ−１２４９またはそれらのアナログである、請求項５９に記載の方法。
  65. 疾患がＡＩＤＳである、請求項５９に記載の方法。
  66. 治療上有効な量の、可溶性毒素受容体に融合された改変Ｔｆタンパク質を含む融合タンパク質を被験者に投与することを含む、毒素に関連する疾患または状態を予防または治療する方法であって、改変Ｔｆタンパク質が、低下したグリコシル化、低下した金属の結合、または低下した受容体の結合を示す、方法。
  67. 可溶性毒素受容体が、炭疽菌毒素受容体、ボツリヌス毒素受容体およびジフテリア毒素受容体からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 可溶性ボツリヌス毒素受容体がシナプトタグミンのアミノ酸１〜５３（配列番号４）である、請求項６７に記載の方法。
  69. 治療タンパク質または治療ペプチドがトランスフェリンの１つ以上のループに挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  70. 治療タンパク質が５つのトランスフェリンのループのそれぞれに挿入される、請求項６９に記載の融合タンパク質。
  71. ＧＬＰ−１が１つの付加アミノ酸をＮ末端に更に含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  72. 前記アミノ酸がＧｌｙである、請求項７１に記載の融合タンパク質。
  73. ＧＬＰ−１アナログがＮ末端において改変トランスフェリンタンパク質に融合される、請求項７１に記載の融合タンパク質。
  74. 被験者のグルコースレベルを調節する方法であって、治療上有効な量の、ＧＬＰ−１またはそのアナログと融合された改変Ｔｆタンパク質を含む融合タンパク質を被験者に投与することを含み、改変Ｔｆタンパク質が、低下したグリコシル化、低下した金属の結合、または低下した受容体の結合を示す、方法。
  75. 治療タンパク質または治療ペプチドが、Ａｓｐ３３、Ａｓｎ５５、Ａｓｎ７５、Ａｓｐ９０、Ｇｌｙ２５７、Ｌｙｓ２８０、Ｈｉｓ２８９、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ１０５、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１６６、Ｇｌｎ１８４、ａｓｐ１９７、Ｌｙｓ２１７、Ｔｈｒ２３１およびＣｙｓ２４１からなる群から選択される配列番号３内の１以上の部位において、ｍＴｆのＮドメインの中に挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  76. 治療タンパク質または治療ペプチドが、Ａｓｐ３３、Ａｓｎ５５、Ａｓｎ７５、Ａｓｐ９０、Ｇｌｙ２５７、Ｌｙｓ２８０、Ｈｉｓ２８９、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ１０５、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１６６、Ｇｌｎ１８４、ａｓｐ１９７、Ｌｙｓ２１７、Ｔｈｒ２３１またはＣｙｓ２４１に対応する配列番号３内の１以上の部位において、ｍＴｆのＣドメインの中に挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  77. 治療タンパク質または治療ペプチドが、Ａｓｐ３３、Ａｓｎ５５、Ａｓｎ７５、Ａｓｐ９０、Ｇｌｙ２５７、Ｌｙｓ２８０、Ｈｉｓ２８９、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ１０５、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１６６、Ｇｌｎ１８４、ａｓｐ１９７、Ｌｙｓ２１７、Ｔｈｒ２３１またはＣｙｓ２４１に対応する配列番号３内の１以上の部位において、ｍＴｆの中に更に挿入される、請求項７５に記載の融合タンパク質。
  78. 治療ペプチドがＥＭＰ１であり、ＥＭＰ１が、配列番号３のＨｉｓ２８９および配列番号３のＡｓｐ１６６からなる群から選択される１以上の部位においてｍＴｆのＮドメインの中に挿入される、請求項２に記載の融合タンパク質。
  79. 治療ペプチドがＥＭＰ１であり、ＥＭＰ１が、配列番号３のＨｉｓ２８９または配列番号３のＡｓｐ１６６に対応する１つ以上の部位においてｍＴｆのＣドメインの中に挿入される、請求項２に記載の融合タンパク質。
  80. 治療ペプチドがＥＭＰ１であり、ＥＭＰ１が、配列番号３のＨｉｓ２８９または配列番号３のＡｓｐ１６６に対応する１つ以上の部位においてｍＴｆのＣドメインの中に更に挿入される、請求項７８に記載の融合タンパク質。
  81. ｍＴｆがＣ末端Ｐｒｏの欠失によって更に改変される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  82. ｍＴｆがＣ末端Ｐｒｏに隣接するＡｒｇ−Ａｒｇの欠失によって更に改変される、請求項８１に記載の融合タンパク質。
  83. ｍＴｆが配列番号３のＣｙｓ４０２とＣｙｓ６７４との間のジスルフィド結合を除くことによって更に改変される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  84. ジスルフィド結合が配列番号３のＣｙｓ４０２およびＣｙｓ６７４をＧｌｙ残基に変異させることによって除かれる、請求項８３に記載の融合タンパク質。
  85. ｍＴｆが配列番号３のＣｙｓ４０２およびＣｙｓ６７４をＧｌｙ残基に変異させることによって更に改変される、請求項８２に記載の融合タンパク質。
  86. 治療タンパク質または治療ペプチドが、Ｎ１（２８６〜２９２）、Ｎ２（１６２〜１７０）、Ｃ１（４８９〜４９５）およびＣ２（６２３〜６２８）からなる群から選択される配列番号３内の１以上のループに挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  87. 改変Ｔｆタンパク質がＮ末端ドメインを１つ含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  88. 健常者と比較して被験者はグルコースレベルの上昇がみられ、融合タンパク質がインスリンまたはそのアナログを含む、請求項５１に記載の方法。
  89. グルコースレベルの上昇が糖尿病に関連する、請求項８８に記載の方法。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009544301A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション エキセンディン融合タンパク質
JP2010502734A (ja) * 2006-09-06 2010-01-28 フェーズバイオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 融合ペプチド治療用組成物
JP2015224327A (ja) * 2014-05-29 2015-12-14 花王株式会社 繊維製品用洗浄剤組成物
US9328154B2 (en) 2005-12-20 2016-05-03 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of growth hormone and elastic peptides
JP2016527188A (ja) * 2013-08-12 2016-09-08 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 経皮送達を促進するためのペプチド
US9821036B2 (en) 2008-06-27 2017-11-21 Duke University Therapeutic agents comprising a GLP-2 peptide and elastin-like peptides
US10258700B2 (en) 2005-12-20 2019-04-16 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
JP2020534277A (ja) * 2017-09-14 2020-11-26 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP2021510162A (ja) * 2018-01-10 2021-04-15 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． トランスフェリン受容体結合ポリペプチド及びその使用

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005508623A (ja) * 2001-08-30 2005-04-07 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション 改変されたトランスフェリン融合タンパク質
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
US20070031440A1 (en) * 2001-08-30 2007-02-08 Prior Christopher P Modified transferin-antibody fusion proteins
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US20060205037A1 (en) * 2003-08-28 2006-09-14 Homayoun Sadeghi Modified transferrin fusion proteins
US20070275871A1 (en) * 2003-08-28 2007-11-29 Biorexis Technology, Inc. Epo Mimetic Peptides and Fusion Proteins
JP2008509153A (ja) * 2004-08-03 2008-03-27 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション Ｇｌｐ−１を含むトランスフェリン融合タンパク質用いた併用療法
CA2610931A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-28 Biorexis Pharmaceutical Corporation Anchored transferrin fusion protein libraries
WO2007139767A2 (en) * 2006-05-22 2007-12-06 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the delivery of nitric oxide
CN101088502B (zh) * 2006-06-16 2012-11-21 中国科学院化学研究所 一种含有转铁蛋白和槲皮素的结合物的混合溶液及其用途
JP5670634B2 (ja) 2006-07-13 2015-02-18 アッパートン リミティド タンパク質性物質の粒子の製造方法
AU2007331195A1 (en) 2006-12-12 2008-06-19 Biorexis Pharmaceutical Corporation Transferrin fusion protein libraries
KR20110139292A (ko) * 2009-04-20 2011-12-28 화이자 인코포레이티드 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법
WO2011046983A2 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Smith Holdings, Llc Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
CN107188970A (zh) * 2010-06-04 2017-09-22 株式会社蒂奥姆生物 具有因子vii活性的融合蛋白质
ES2631356T3 (es) 2010-11-30 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-receptor de transferrina de baja afinidad y su uso para transferir scFv terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica
US9603897B2 (en) 2012-03-12 2017-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apolipoprotein D
JP6401702B2 (ja) 2012-09-07 2018-10-10 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー オブ・アルバータ 炎症性肝疾患の診断のための方法および組成物
US9708406B2 (en) * 2013-05-20 2017-07-18 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
JP6449272B2 (ja) * 2013-07-08 2019-01-09 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッドＮａｎｊｉｎｇ Ｌｅｇｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． タンパク質の血清半減期を増加する組成物及び方法
KR102058864B1 (ko) * 2013-12-16 2019-12-24 주식회사 티움바이오 인자 vii의 융합 단백질을 포함하는 안정성이 개선된 약학적 조성물
MX2016008190A (es) * 2014-01-06 2016-10-21 Hoffmann La Roche Modulos de lanzadera de barrera cerebral sanguinea monovalente.
US11130815B2 (en) 2015-06-24 2021-09-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion proteins containing a BDNF and an anti-human transferrin receptor antibody
CN114031689A (zh) * 2015-10-02 2022-02-11 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AU2017321883B2 (en) 2016-09-02 2022-07-07 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Stabilized group 2 influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
CA3052936A1 (en) * 2016-12-26 2018-07-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion protein of bdnf and anti-transferrin receptor antibody
HRP20221505T1 (hr) * 2017-02-17 2023-02-17 Denali Therapeutics Inc. Proizvedeni polipeptidi za vezanje receptora transferina
CN106967171B (zh) * 2017-02-23 2021-04-27 郑州大学 一种全人源重组CD40L单抗Fab片段及其制备方法
CN107010616B (zh) * 2017-04-13 2019-04-02 浙江理工大学 一种具有靶向传递功能的纳米药物载体的制备方法
JP7189211B2 (ja) * 2017-10-11 2022-12-13 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド 血清中のタンパク質の半減期を増加させるための組成物及び方法
US11753455B2 (en) 2018-06-21 2023-09-12 Novo Nordisk A/S Compounds for treatment of obesity
CN109180819A (zh) * 2018-09-14 2019-01-11 苏州康宇生物科技有限公司 一种胰岛素衍生物的制备方法
EP3880829A4 (en) * 2018-11-13 2022-08-24 Denovo Biopharma LLC RECOMBINANT VECTORS INCLUDING GENES FOR BINDING DOMAINS AND SECRETABLE PEPTIDES
CN111948388B (zh) * 2020-08-18 2022-03-22 山东农业大学 一种检测腐败梭菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN112661862B (zh) * 2020-12-25 2023-03-31 深圳大学 一种融合蛋白及其制备方法和应用
CN113267631A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 江苏普若维生物技术有限责任公司 一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法
WO2023142109A1 (zh) * 2022-01-30 2023-08-03 领诺(上海)医药科技有限公司 一种长效重组人生长激素及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986067A (en) * 1991-02-08 1999-11-16 The University Of Vermont And State Agricultural College Recombinant transferrins, transferrin half-molecules and mutants thereof
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4289689A (en) * 1980-03-14 1981-09-15 Hoffmann-La Roche Inc. Preparation of homogeneous human fibroblast interferon
DE3273787D1 (en) * 1981-02-04 1986-11-20 Japan Found Cancer Human interferon-beta gene
US4816449A (en) * 1984-08-09 1989-03-28 Immunetech Pharmaceuticals Immunotherapeutic anti-inflammatory peptide agents
US5026651A (en) * 1985-04-25 1991-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the production of human transferrin
US5262177A (en) * 1986-02-07 1993-11-16 Oncogen Recombinant viruses encoding the human melanoma-associated antigen
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
GB8901778D0 (en) 1989-01-27 1989-03-15 Univ Court Of The University O Manipulatory technique
US5571691A (en) * 1989-05-05 1996-11-05 Baylor College Of Medicine Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US6066469A (en) * 1990-03-08 2000-05-23 Ferro Dynamics, Inc. Cloning, expression, and uses of human lactoferrin
US5723286A (en) * 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
AU2029192A (en) * 1991-05-31 1993-01-08 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Human lactoferrin
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ZA932568B (en) * 1992-04-24 1993-11-12 Baylor College Midecine A Non Production of recombinant human lactoferrin
EP0599303A3 (en) * 1992-11-27 1998-07-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Peptide conjugate
EP0708658A4 (en) 1993-04-16 1997-05-21 Wistar Inst VACCINE CONTAINING A RECOMBINANT CYTOMEGALOVIRUS
US5455933A (en) * 1993-07-14 1995-10-03 Dell Usa, L.P. Circuit and method for remote diagnosis of personal computers
US5843882A (en) * 1995-04-27 1998-12-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antiviral proteins and peptides
US5817789A (en) * 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US5849293A (en) * 1996-01-11 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Use of human transferrin in controlling insulin levels
US7235627B2 (en) * 1996-08-30 2007-06-26 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6458924B2 (en) * 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
FR2762843B1 (fr) * 1997-04-30 1999-12-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux derives de cyclosporine, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6329336B1 (en) * 1999-05-17 2001-12-11 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
US6380362B1 (en) * 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
US6420346B1 (en) * 2000-02-07 2002-07-16 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Polynucleotides encoding MIP-1α, MCP-1, MIP-1β, Rantes and TNF-α, and methods for treating rheumatoid arthritis
JP2002247847A (ja) * 2001-02-20 2002-08-30 Internatl Business Mach Corp <Ibm> Ａｃアダプタ、電源供給装置、電気機器、および電源供給装置の制御方法
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
JP2005508623A (ja) * 2001-08-30 2005-04-07 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション 改変されたトランスフェリン融合タンパク質
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US20060105387A1 (en) * 2002-08-30 2006-05-18 Prior Christopher P Transferrin fusion proteins libraries
ATE314289T1 (de) * 2002-10-11 2006-01-15 Habasit Ag Förderbandmodul mit einer reibungsoberfäche
US20060205037A1 (en) * 2003-08-28 2006-09-14 Homayoun Sadeghi Modified transferrin fusion proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986067A (en) * 1991-02-08 1999-11-16 The University Of Vermont And State Agricultural College Recombinant transferrins, transferrin half-molecules and mutants thereof
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9328154B2 (en) 2005-12-20 2016-05-03 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of growth hormone and elastic peptides
US10258700B2 (en) 2005-12-20 2019-04-16 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
JP2009544301A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレーション エキセンディン融合タンパク質
JP2010502734A (ja) * 2006-09-06 2010-01-28 フェーズバイオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 融合ペプチド治療用組成物
US9821036B2 (en) 2008-06-27 2017-11-21 Duke University Therapeutic agents comprising a GLP-2 peptide and elastin-like peptides
US10596230B2 (en) 2008-06-27 2020-03-24 Duke University Methods of increasing nutrient absorption in the intestine using therapeutic agents comprising GLP-2 and elastin-like peptides
US11103558B2 (en) 2008-06-27 2021-08-31 Duke University Therapeutic agents comprising a BMP-9 peptide and eleastin-like peptides
JP2016527188A (ja) * 2013-08-12 2016-09-08 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 経皮送達を促進するためのペプチド
JP2015224327A (ja) * 2014-05-29 2015-12-14 花王株式会社 繊維製品用洗浄剤組成物
JP2020534277A (ja) * 2017-09-14 2020-11-26 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP7403441B2 (ja) 2017-09-14 2023-12-22 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP2021510162A (ja) * 2018-01-10 2021-04-15 デナリ セラピューティクス インコーポレイテッドＤｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． トランスフェリン受容体結合ポリペプチド及びその使用

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