CN113267631A - 一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物领域，并提供—种检测TNF‑α的电化学试剂盒制备方法，所述TNF‑α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ I D NO.1所示的氨基酸序列，所述TNF‑α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ I D NO.5所示的氨基酸序列，TNF‑α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ I D NO.1所示的氨基酸序列，TNF‑α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ I DNO.5所示的氨基酸序列。本发明的TNF‑α单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性；包含有TNF‑α单克隆抗体的检测试剂盒具有检测方法简便、准确性强、成本低的优点，将TNF‑α单克隆抗体与TNF‑α多克隆抗体建立TNF‑α蛋白检测试剂盒可作为反复性流产的预警工具。

Description

一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法。
背景技术
肿瘤坏死因子TNF-α它是一种由157个氨基酸组成、相对分子质量为 17000的可溶性多肽，以二聚体、三聚体或五聚体的形式存在于溶液中，成熟型TNF-α的活性形式为三聚体。人类TNF-α基因大小为2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成，与MHC紧密连锁，定位于第6对染色体短臂上，小鼠的基因为2.78kb，与人的结构非常相似，定位于第17对染色体短臂上。TNF 按其结构分两型：TNF-α和TNF2β，其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和T 细胞产生的能使肿瘤坏死的因子称为TNF-α(旧称TNF)，又称恶病质因子(cachectin)，这是因为它能引起急性或慢性感染动物的恶液质状态。TNF-α是一个代表全身性炎症程度的标志物。临床发现TNF-α可作为复发性流产的筛查的重要指标，复发性流产患者及子痫前期患者外周血中肿瘤坏死因子-α水平较正常妊娠妇女明显升高，肿瘤坏死因子-α在高浓度时可以通过多种途径导致流产，血浆高水平的TNF-α被认为可以增加反复妊娠失败女性的流产风险。
TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。TNF-α在许多疾病，如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等的病理生理过程中起着重要的介质作用。 TNF-α在抗肿瘤中的作用，TNF-α除了对肿瘤细胞本身具有细胞毒性之外，它也能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退或消失。超过一定浓度的 TNF-α具有明显的抗新生血管形成作用。TNF-α能明显降低实体瘤周围间隙组织的压力，扩大肿瘤周围上皮组织的间隙，改变周围血管的通透性，使化疗的药物到达靶组织周围。另外，TNF-α通过对人体免疫系统的调节从而加强自身的抗肿瘤作用。
近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。
现有技术中针对复发性流产的监测和疗效评估指标还不多，同类产品其特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能，基于此，我们开发了一种 TNF-α检测试剂盒(电化学发光法)及其制备方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，由以下具体技术手段所达成：
本发明为实现技术目的采用如下技术方案：一种检测TNF-α的电化学试剂盒，TNF-α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，TNF-α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
优选的，TNF-α单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
优选的，TNF-α单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8 所示的氨基酸序列。
根据上述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，包含以下步骤：
S1、用磁珠稀释液，溶解链霉亲和素磁珠并稀释到规定浓度；
S2、TNF-α单克隆抗体加入生物素反应，反应后进行脱盐纯化，去除游离生物素；
S3、生物素抗体在含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制成生物素 TNF-α抗体反应液；
S4、用TNF-α蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成TNF-α校准品；
S5、将TNF-α多克隆抗体加入三联吡啶钌溶液，反应；
S6、反应完毕后取出，纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体；
S7、生物素TNF-α抗体中加入血清样本和校准品，再加入TNF-α吡啶钌标抗体，最后加入链霉亲和素磁珠结合生物素抗体，温育后即形成磁珠-抗体 -抗原-标记抗体复合物；
S8、加入三丙胺化学发光底物液，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度
S9、根据反应曲线算出样品中TNF-α的含量
根据权利上述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种TNF-α的制备方法，包括以下步骤：
S1、TNF-α蛋白抗原的制备；
S2、TNF-α多克隆抗体的制备；
S3、TNF-α单克隆抗体的制备；
S4、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；
S5、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取。
优选的，杂交瘤中单克隆抗体基因的调取包含提取杂交瘤细胞的总RNA、以OligodT为引物，逆转录合成得到cDNA、以合成cDNA为模板，进行PCR扩增、获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，然后将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中，将获得的质粒转染感受态细胞中，最终收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得TNF-α单克隆抗体。
优选的，PCR扩增的条件为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后再于72℃延伸10min。
优选的，用PBS、tween-20清洗缓冲液。
优选的，用G-25脱盐柱纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体。
优选的，试剂盒在反复性流产患者物疗效检测试剂盒中的应用。
有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，具备以下有益效果：
1、本发明的TNF-α单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性；包含有TNF-α单克隆抗体的检测试剂盒具有检测方法简便、准确性强、成本低的优点。将TNF-α单克隆抗体与TNF-α多克隆抗体建立TNF-α蛋白检测试剂盒可作为反复性流产的预警工具。
2、本发明提供了TNF-α单克隆抗体、及其应用其制备的电化学发光检测试剂盒的制备方法和应用，本发明的TNF-α单抗与TNF-α多抗建立的TNF-α蛋白检测试剂盒可作为本试剂盒用于体外定量检测人血清中α-肿瘤坏死因子的浓度。主要用于对恶性肿瘤及患者进行动态监测和疗效评估，以及对反复性流产预警，从而降低孕妇流产率。
附图说明
图1为本发明两种TNF-α试剂盒检测数据的相对偏倚示意图；
图2为本发明两种TNF-α试剂盒检测数据的绝对偏倚示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，由以下具体技术手段所达成：
一种检测TNF-α的电化学试剂盒，TNF-α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，TNF-α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列。
根据上述技术方案，TNF-α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/ 或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
具体的，TNF-α单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
根据上述技术方案，TNF-α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经替换、缺失和/ 或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
具体的，TNF-α单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8 所示的氨基酸序列。
根据上述技术方案，TNF-α单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；TNF-α单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
具体的，根据上述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种检测 TNF-α的电化学试剂盒制备方法，包含以下步骤：
S1、用磁珠稀释液，溶解链霉亲和素磁珠并稀释到规定浓度；
S2、TNF-α单克隆抗体加入生物素反应，反应后进行脱盐纯化，去除游离生物素；
S3、生物素抗体在含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制成生物素 TNF-α抗体反应液；
S4、用TNF-α蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成TNF-α校准品；
S5、将TNF-α多克隆抗体加入三联吡啶钌溶液，反应；
S6、反应完毕后取出，纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体；
S7、生物素TNF-α抗体中加入血清样本和校准品，再加入TNF-α吡啶钌标抗体，最后加入链霉亲和素磁珠结合生物素抗体，温育后即形成磁珠-抗体 -抗原-标记抗体复合物；
S8、加入三丙胺化学发光底物液，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度
S9、根据反应曲线算出样品中TNF-α的含量
根据上述技术方案，提供一种所述的TNF-α检测试剂盒对恶性肿瘤及患者进行动态监测和疗效评估，以及对反复性流产预警。
具体的，根据权利上述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种 TNF-α的制备方法，包括以下步骤：
S1、TNF-α蛋白抗原的制备；
S2、TNF-α多克隆抗体的制备；
S3、TNF-α单克隆抗体的制备；
S4、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；
S5、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取。
根据上述技术方案，上述为TNF-α单克隆抗体的制备流程。
具体的，杂交瘤中单克隆抗体基因的调取包含提取杂交瘤细胞的总RNA、以OligodT为引物，逆转录合成得到cDNA、以合成cDNA为模板，进行PCR扩增、获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，然后将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中，将获得的质粒转染感受态细胞中，最终收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得TNF-α单克隆抗体。
根据上述技术方案，提供一种TNF-α检测试剂盒，含有所述的TNF-α单克隆抗体。
具体的，PCR扩增的条件为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃ 1min，共35个循环，最后再于72℃延伸10min。
根据上述技术方案，PCR扩增过程中需要严格控制温度。
具体的，用PBS、tween-20清洗缓冲液。
根据上述技术方案，上述用PBS、tween-20清洗缓冲液为本发明的一种优选方案。
具体的，用G-25脱盐柱纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体。
根据上述技术方案，上述用G-25脱盐柱纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体为本发明的一种优选方案。
具体的，试剂盒在反复性流产患者物疗效检测试剂盒中的应用。
根据上述技术方案，提供一种应用于临床的试剂盒从而可以对反复性流产患者进行实验。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
该实施例提供了一种TNF-α单克隆抗体的制备方法，TNF-α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
TNF-α单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
TNF-α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
TNF-α单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
以下为序列号：
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0003068506070000081
Figure BDA0003068506070000091
Figure BDA0003068506070000101
Figure BDA0003068506070000111
Figure BDA0003068506070000121
实施例2
该实施例提供了一种TNF-α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
TNF-α蛋白抗原的制备：
根据GenBank数据库中人TNF-α(GenBank:ATL37890.1)的序列设计一对引物：
上游引物为vF：5’-TGTGTGTGTGTGTCTGGGAGTGAGAA-3’；
下游引物为vR：5’-GGCGAGAAATAAAGTTTGCTTAGAAAAGAA-3’；
上游引物、下游引物的位点与哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG上的相应多克隆位点吻合；
通过全基因合成含有人TNF-α基因片段的克隆质粒，以质粒为模板，用 PyrobestDNA聚合酶进行TNF-α基因特异性扩增，PCR扩增的条件：95℃变性5min；94℃，1min；52℃，2min；72℃，1min，35个循环；72℃，延伸 10min；
扩增后的PCR产物进行凝胶回收、氯仿抽提产物、乙醇沉淀、TE溶解，得到pSec/WG质粒，备用；
回收的TNF-α基因与pSec/WG质粒分别进行Pci I和Xho I双酶切，凝胶电泳法回收；
再次分别纯化PCR酶切产物和载体的回收产物，TNF-α与pSec/WG按照 1:1的摩尔比混合，用TE溶解，于16℃反应12小时，置于70℃条件下10min 终止反应；
将上述反应产物连接DH-5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/mL)抗体筛选出阳性克隆，进行扩增，抽提重组TNF-α/pSec/WG质粒并经酶切、测序鉴定，备用；
采用脂质体试剂Lipofectamine 2000转染重组TNF-α/pSec/WG质粒到真核表达细胞系Flp-In CHO中，转染后将细胞置于含潮霉素的培养基中培养和筛选；
未转染的Flp-In CHO细胞系在Hams F12完全培养基中培养(含10％FBS、 2mM L-谷氨酰胺)，其中添加1％青/链霉素和100μg/mL Zeocin转染了重组质粒TNF-α/pSec/WG的Flp-In CHO细胞，因为TNF-α基因插入使宿主细胞基因组中的zeocin抗性基因失活，但同时带入了潮霉素抗性基因(Hyg+)，因此，转染了重组质粒的宿主细胞可以在含潮霉素的培养基中培养，而未转染的宿主细胞在此条件下不能存活；在含800μg/mL的潮霉素的Hams F12完全培养基中培养，6-7天可以筛选出相应的重组基因表达克隆；
将转染了TNF-α/pSec/WG重组质粒的Flp-In CHO细胞在UltraCHO无血清培养基中培养，每隔3-4天收集细胞培养上清液1次；
收集的培养上清液10000r/min离心5分钟，去除沉淀；上清液中加入 0.02％NaN3，并通过0.22μm滤膜过滤除去所有可能的细胞碎片；
在柱子中填装l.0mL树脂，并用大约10体积的PBS(pH 7.2)平衡；将含目的蛋白的上清液过Protein G-Sepharose 4B柱2次；20-30体积的PBS(pH 7.2)洗柱；预先在每支收集小管中加入28μL的1.25M Tris-HCl(pH 8.0)；再用100mM Glycine-HCl(pH 3.0)洗脱液洗脱，按每管1.0rnl收集于收集小管中，使洗脱液能在收集小管中立即被中和；通常蛋白在第3-10管被洗脱下来，峰值大约在3、4、5管；收集所有A280＞0.01的洗脱液，再用UltraFree15(MWCO 10000，Millipore)的离心过滤柱浓缩；表达水平为50mg/L，进行 SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后的TNF-α蛋白纯度大于98％；蛋白定量后，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，贮存于-20℃备用；
TNF-α多克隆抗体的制备
用雄性大耳兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物，使用TNF- α蛋白作为免疫抗原一周后开始免疫；足下4-6点皮下注射，使用弗氏完全佐剂作为免疫佐剂，分四次免疫动物；每次取1mg TNF-α蛋白将等量的弗氏完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内充分乳化1小时，进行足皮下注射，每次间隔两周；
取耳静脉血ELISA法检测效价，达到1:40000进行颈动脉放血，5000rpm 离心取血清，利用DEAE离子交换纯化，得到血清粗提多克隆抗体，备用；
血清粗提多克隆抗体用0.5mol/L PBS(pH 7.5)稀释至1mg/mL，配置 CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶3mL，用偶联剂偶联10mg TNF-α蛋白抗原，室温反应4小时，制成TNF-α抗体亲和层析柱，将血清粗提多克隆抗体上柱纯化，洗脱收集，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50％甘油置于-20℃可长期保存；
TNF-α单克隆抗体的制备
培养上述获得稳定表达的TNF-α/pSec/WG重组质粒Flp-In CHO细胞，免疫5只雌性BALA/c小鼠，每只BALB/c小鼠皮下注射1×107细胞，连续免疫4次，每次间隔2周；免疫7天后取血，用ELISA法检测血清效价，选择效价最高的小鼠，脾内注射1×106个细胞加强免疫，3天后取小鼠脾脏，研磨，并对脾细胞计数备用；
取脾细胞与骨髓细胞Sp2/0按细胞计数5:1的比例融合，PEG1200诱导，融合后加到含有饲养层的96孔板中培养，一周后用HAT培养基半量换液，观察融合后细胞状态；
用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，选择1株TNF-αAb持续分泌阳性率98％以上的杂交瘤细胞(6A2)进行扩大培养准备腹腔注射小鼠，小鼠1 周前腹腔注射500μL液体石蜡；
离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至 1×109/L，开始接种小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL，1周后对腹部明显肿胀小鼠抽取腹水，所得腹水3000r/min离心3分钟，收集上清液；
protein G纯化柱纯化腹水；用0.02mol/L PB缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用0.1mol/L甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.7)进行洗脱，EP管收集， 0.05mol/LPB透析，浓缩得到TNF-α单克隆抗体，置于-20℃冻存；
单克隆抗体筛选
包被制备好的TNF-α单克隆抗体，以0.5mol/L PBS稀释抗体至2～5μg/mL； 100μL/孔加入酶标板中包被，2-8℃过夜后，0.9％NaCl洗3次，加入含有1％ BSA的封闭液，150μL/孔封闭，2-8℃过夜后晾干备用；
筛选最优单克隆抗体：稀释制备好的TNF-α蛋白抗原，按比例稀释8个梯度(0、10、50、100、200、400、1000、2000pg/mL)，依次加入前述制备好的酶标中，每孔50μL，再加入生物素化多克隆抗体及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃温育1小时，PBST洗涤5次，加入显色底物液，用酶标仪检测OD值；
以TNF-α浓度为横坐标X值，OD值为纵坐标Y值，建立剂量反应曲线(见图1所示)。可以看出，TNF-α检测试剂盒所建立的剂量反应曲线，线性系数 R>0.99，检测范围可达0-1000pg/ml，试剂盒的分析性能优越。最终挑选评价指标最好的TNF-α单克隆抗体；单克隆抗体作为夹心法ELISA检测方法的评价标准应同时满足S0 OD值＜0.1，S7/S1(P/N)最大，剂量反应曲线相关系数大于0.99，30例质控血清检出率大于90％；
杂交瘤中单克隆抗体基因的调取
用Trizol试剂提取5×106的选中杂交瘤细胞(6A2)的总RNA；
再以OligodT为引物，AMV逆转录酶逆转录温度37℃、时间15分钟，合成得到cDNA；
以合成cDNA为模板，针对RNA序列的引物和基因特异性引物GSP进行巢式PCR扩增，PCR的条件均为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；最后再于72℃延伸10min；
将PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取并回收目的凝胶条带，调取目的基因，连接到pGEM-T载体中，EcoRI酶切鉴定阳性的重组质粒，进行 DNA序列的测定，分别获得编码重链可变区基因序列，编码轻链可变区基因序列；
将获得重链和轻链可变区基因序列和抗体的恒定区一起进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中；质粒分别提取150μg的量，并去内毒素(＜1 EU/mg)，将获得的2种质粒1:1共转染到50mL体积的悬浮的感受态TG1细胞中，转染试剂采用PEI，质粒和PEI的比值为1:2；
转染3-7天后，收集细胞上清液，SDS-PAGE检测抗体表达是否正确， ProteinA柱纯化，浓缩后获得合格的TNF-α单克隆抗体，纯度大于98％。
实施例3
该实施例提供了一种TNF-α检测试剂盒，含有实施例1所述的TNF-α单克隆抗体。
实施例4
该实施例提供了一种TNF-α检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
磁珠制备：以链霉亲和素磁珠作为反应支持物，用含有0.5％BSA、1％蔗糖、0.15％Tween-20、5％小牛血清、0.1％ProClin300的0.01Mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释至0.45g/L。
生物素抗体制备：将本发明单抗TNF-αa223，按摩尔比10:1加入生物素，搅拌1小时，上G25柱脱盐后，用10％BSA，0.02M磷酸盐稀释抗体浓度至 2.0ug/ml。
吡啶钌标记抗体制备：将TNF-α单抗用0.02M的磷酸盐缓冲液在2-8℃透析过夜；称取4mg六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌，配制浓度为4mg/mL的六水合三(2,2-联吡啶)氯化钌溶液。按照4-6ul/mg IgG的量加入抗体溶液。室温下(18-26℃)混匀仪搅拌，标记0.5-1小时，幅度控制，避免出现气泡。超滤管2-8℃离心，收集液体至1ml左右。使用OD280测定蛋白浓度。
校准品：用10％BSA，0.02M磷酸盐稀释制备的TNF-α抗原按比例稀释6 个梯度(0、10、50、100、300、600、1000pg/m)得到校准品，可建立计量反应曲线。
利用eCL8000电化学发光免疫分析仪检测化学发光强度(RLU)。将试剂测试设置为：在反应杯中加入100μl生物素标记抗体、50μl样本和/或校准品、100μl吡啶钌标记抗体，后于37℃下温浴5min，加入50μl链霉亲和素磁珠37℃下温浴5min最后进行清洗并加入三丙胺化学发光底物液各50ul测试发光值。检测累计时间2s各孔的发光强度(RLU)。样品的RLU值随TNF-α浓度的增加而升高，根据反应曲线即可算出样品中TNF-α的含量。
实验例五
检测TNF-α检测试剂盒的性能，包含TNF-α检测试剂盒的分析性能。
准确度：用试剂盒检测国际标准品(500±50pg/mL)，每个浓度检测3孔，计算测定浓度均值与标示浓度的比值，准确度应在0.90-1.10范围内。
精密度：平行测定质控品1(197±37.5pg/mL)和质控品2(580± 70.5pg/mL)各10孔，TNF-α检测试剂盒的批内变异系数(CV)不大于10％；批间变异系数(CV)不大于15％。
灵敏度(最低检出限)：平行测定20孔零参考品(0pg/mL)的相对发光强度，计算发光值平均值(x和标准偏差SD，用剂量-反应曲线计算发光值为(x+2×SD时对应的浓度值即为最低检出限，试剂盒最低检出限不大于 15pg/mL。
特异性：在正常人血清中分别加入人成肿瘤坏死因子β(TNF-β)和干扰素(IFN-γ)，配制成含400ng/mL的TNF-β样本和300ng/mL的IFN-γ样本，进行检测，一定浓度特异性物质(TNF-β、IFN-γ)检测结果不大于 15pg/mL。
线性范围：在0-1000pg/mL浓度范围内，线性相关系数r不小于0.9900。
TNF-α检测试剂盒的临床性能
开展125例临床样本检测，74例正常人，110例各个肿瘤分期的肝癌患者样本。试剂盒正常参考值0-180pg/ml，试剂盒检测结果如下：
符合率及其置信区间
本专利试剂盒*临床诊断交叉制表
计数
Figure BDA0003068506070000181
符合率及其置信区间
Figure BDA0003068506070000182
对称度量
Figure BDA0003068506070000191
a.不假定零假设。
b.使用渐进标准误差假定零假设。
一致性系数Kappa(K)值为：1.000。
·相对偏倚图和绝对偏倚图
选择西门子公司已上市的α肿瘤坏死因子测定试剂盒(化学发光法) IMMULITE1000TNFα试剂盒作为对照测试试剂，对选定临床样本检测并做统计，结果如图1，图2。
·回归分析
相关性分析
相关性
Figure BDA0003068506070000192
相关性
Figure BDA0003068506070000201
**.在.01水平(双侧)上显著相关。
由SPSS输出表格可以看出，两种试剂检测结果的相关系数为0.997，对相关系数进行的假设检验的结果为P＜0.05，表明两种试剂检测结果之间有直线相关关系；相关系数r接近最大的可能值1，表明两种试剂检测结果间具有很强的相关性。
两种试剂的回归方程及方程斜率b的95％置信区间
系数a
Figure BDA0003068506070000202
a.因变量：本试剂
由SPSS输出的上图可以看出临床试验试剂盒检测结果与对比试剂检测结果之间的回归方程为Y＝0.987x+1.277，方程斜率b在95％置信区间内。
交叉表
计数
Figure BDA0003068506070000203
Figure BDA0003068506070000211
符合率及其置信区间
Figure BDA0003068506070000212
对称度量值
Figure BDA0003068506070000213
a.没有假定空假设。
b.使用渐近标准错误假定空假设。
一致性系数Kappa(K)值为：0.962。
肿瘤坏死因子(TNF-α)化学发光检测试剂盒对复发性流产患者检测结果与同类试剂盒的符合率为98％，能够作为监测复发性流产的有效临床指标。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种检测TNF-α的电化学试剂盒，其特征在于：所述TNF-α单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述TNF-α单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，其特征在于：所述TNF-α单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，其特征在于：所述TNF-α单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3氨基酸序列分别为SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
S1、用磁珠稀释液，溶解链霉亲和素磁珠并稀释到规定浓度；
S2、TNF-α单克隆抗体加入生物素反应，反应后进行脱盐纯化，去除游离生物素；
S3、生物素抗体在含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制成生物素TNF-α抗体反应液；
S4、用TNF-α蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成TNF-α校准品；
S5、将TNF-α多克隆抗体加入三联吡啶钌溶液，反应；
S6、反应完毕后取出，纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体；
S7、生物素TNF-α抗体中加入血清样本和校准品，再加入TNF-α吡啶钌标抗体，最后加入链霉亲和素磁珠结合生物素抗体，温育后即形成磁珠-抗体-抗原-标记抗体复合物；
S8、加入三丙胺化学发光底物液，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度
S9、根据反应曲线算出样品中TNF-α的含量。
5.根据权利要求1所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，现提出一种TNF-α的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、TNF-α蛋白抗原的制备；
S2、TNF-α多克隆抗体的制备；
S3、TNF-α单克隆抗体的制备；
S4、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；
S5、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取。
6.根据权利要求5所述的一种TNF-α的制备方法，其特征在于：所述杂交瘤中单克隆抗体基因的调取包含提取杂交瘤细胞的总RNA、以OligodT为引物，逆转录合成得到cDNA、以合成cDNA为模板，进行PCR扩增、获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；所述重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，然后将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中，将获得的质粒转染感受态细胞中，最终收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得TNF-α单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的一种TNF-α的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：95℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后再于72℃延伸10min。
8.根据权利要求4所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，其特征在于：用PBS、tween-20清洗缓冲液。
9.根据权利要求4所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒制备方法，其特征在于：用G-25脱盐柱纯化，得到TNF-α吡啶钌标记抗体。
10.根据权利要求1所述的一种检测TNF-α的电化学试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在反复性流产患者物疗效检测试剂盒中的应用。
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