JP2010502734A - 融合ペプチド治療用組成物 - Google Patents

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Abstract

エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）とペプチド活性治療剤とを含む融合タンパク質（ＦＰ）を含有する治療用組成物、ならびにそのような組成物および融合タンパク質を作製し使用する方法。このようなタイプの治療用組成物は、ペプチド活性治療剤単独と比較して、達成されるペプチド活性治療剤の効力を改善することを可能にする。治療用組成物中のペプチド活性治療剤の効力の増強は、ＥＬＰが付随していない同じペプチド活性治療剤を含有する対応する組成物と比較して改善された溶解性、生物学的利用性、生物学的利用不能性、半減期などを含んでよい。

Description

関連出願データ
本出願は、全体が本明細書に参照により組み込まれる、２００６年９月６日に出願された米国特許出願第６０／８４２，４６４号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。
本発明は、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）とペプチド活性治療剤とを含む融合タンパク質（ＦＰ）を組み込んだ、新しい世代の治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、ＥＬＰが付随していない同じペプチド活性治療剤を含有する対応する組成物と比較して、溶解性、生物学的利用性または生物学的利用不能性（biounavailability）、および投与されたペプチド活性治療剤の半減期の改善の達成を可能にする。
Ａｓｈｕｔｏｓｈ Ｃｈｉｌｋｏｔｉの名前で「ＦＵＳＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＩＳＯＬＡＴＡＢＬＥ ＢＹ ＰＨＡＳＥ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ」として２００５年２月８日に発行された米国特許第６，８５２，８３４号およびＡｓｈｕｔｏｓｈ Ｃｈｉｌｋｏｔｉの名前で「ＦＵＳＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＩＳＯＬＡＴＡＢＬＥ ＢＹ ＰＨＡＳＥ ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ」として２００５年２月８日にファイルされた米国特許出願第１１／０５３，１００号の開示は、すべての目的でそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
上記のＣｈｉｌｋｏｔｉの特許および特許出願は、ＥＬＰペプチドを含む、遺伝的にコード可能な環境に応答する融合タンパク質を開示している。このような融合タンパク質は、溶液環境の関数として調節できる物理化学的および機能的に独特の特性を示す。
本発明は、概して、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）とペプチド活性治療剤とを含む融合タンパク質（ＦＰ）治療用組成物に関する。
本発明のＦＰ治療用組成物において、少なくとも１つのペプチド活性治療剤は、対応する治療剤単独と比較して、ペプチド活性治療剤の効力の増強を達成するために、例えばＮまたはＣ末端にて共有結合している１つ以上のＥＬＰと結合している。ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、溶解性、生物学的利用性、生物学的利用不能性、治療量、タンパク質溶解抵抗性、投与されたペプチド活性治療剤の半減期などの種々の特性のいずれに関する効力も増強されている。
別の態様において、本発明は、発現制御エレメント、例えば適切なタイプのプロモーターに操作可能に連結している異種ヌクレオチド配列を含む融合遺伝子構築物であって、該異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのＥＬＰと結合した少なくとも１つのペプチド活性治療剤を含む融合タンパク質をコードする構築物に関する。
さらなる態様において、本発明は、ペプチド活性治療剤の効力を増強する方法に関する。該方法は、ペプチド活性治療剤を少なくとも１つのＥＬＰと結合させてＦＰ治療用組成物を形成することを含み、ここで、このようなＦＰ治療用組成物中のペプチド活性治療剤は、ペプチド活性治療剤単独と比較して、効力が増強している。一態様において、増強された効力は、ｉｎ ｖｉｖｏ効力である。
本発明の別の態様は、ペプチド活性治療剤を必要とする対象を治療する方法であって、患者に、（ｉ）少なくとも１つのＥＬＰと連結されたペプチド活性治療剤、または（ｉｉ）発現制御エレメントに操作可能に連結した、ペプチド活性治療剤と少なくとも１つのＥＬＰとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む治療用組成物を投与することを含む方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、治療剤がＥＬＰとコンジュゲートしている治療剤剤形に関する。
本発明のその他の種々の態様、特徴および実施形態は、以下の開示および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになる。
実施例１の発現および精製法を用いる、３７アミノ酸ペプチドの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 実施例１の方法から得られたペプチドの精製を確認するグラフである。 実施例６に記載のＢＦＰ、ＣＡＴ、およびＫ１−３のＩＴＣによる精製の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 （図４Ａ）ＰＢＳ緩衝液中における実施例８の各融合構築物について、温度の関数としての濁度の上昇を示すグラフである。（図４Ｂ）ＰＢＳ緩衝液中における実施例８の各融合構築物について、温度の関数としての濁度の上昇を示すグラフである。 実施例９に記載の１４Ｃで標識したＥＬＰの血中濃度の経時推移を示すグラフである。 実施例１０に記載のヌードマウスにおける１４Ｃで標識したＥＬＰ１−１５０および１４Ｃで標識したＥＬＰ２−１６０の生体内分布を示すグラフである。 実施例１０に記載のヌードマウスにおける１４Ｃで標識したＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］の生体内分布を示すグラフである。
本発明は、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）とペプチド活性治療剤とを含む融合タンパク質（ＦＰ）を組み込んだ治療組成物を提供する。
本発明の治療用組成物は、ＥＬＰが付随していない同じペプチド活性治療剤を含有する対応する組成物と比較して、ペプチド活性治療剤の効力の増強、例えば溶解性、生物学的利用性、生物学的利用不能性（蓄積および／または毒性、例えば心臓毒性を回避することが望まれる場合）、投与されたペプチド活性治療剤の半減期などの改善の達成を可能にする。
以下の論述において容易に参照するために、このような論述に現われる特定の用語の定義を以下に記載する。
用語「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのポリペプチドを含む一般的な意味で用いられる。
用語「ペプチド」は、本明細書で用いる場合、約１００００までの分子量を有するポリペプチド自体と、約１００００を超える分子量を有するタンパク質（ここで、分子量は、数平均分子量である）を共に含むと広く解釈されることを意図する。ある特定の態様において、約２〜約１００個のアミノ酸残基を有するペプチドは、本発明のペプチド治療用活性剤として特に好ましい。
本明細書で用いる場合、用語「結合した」は、特定の部分が互いに直接共有結合するか、またはブリッジ、スペーサーのような１つ以上の介在部分、または１つ以上の連結部分を介して互いに間接的に共有的に接続されるか、あるいはそれらが例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力などにより互いに非共有的に結合することを意味する。
本明細書で用いる場合、用語「半減期」は、活性剤の生物活性の５０％の減少が生じるために必要な期間を意味する。このような用語は、体内の活性剤の全体的な時間的持続期間である「残存率」、ならびに半減期および残存率の数値と相関関係があるまたはなくてもよい動的に変化する変数としての「クリアランス速度」と対比される。
単語「形質転換する」は、本明細書において、外因性ポリヌクレオチド配列を原核または真核細胞に、当該技術において知られる任意の手段（例えば細胞またはウイルス粒子からのポリヌクレオチド配列の直接の伝達および感染性ウイルス粒子による伝達を含む）により導入し、不死化もしくは非不死化細胞系における遺伝子型の永続的または一時的な変更をもたらすことを指すのに広く用いられる。
用語「機能的等価物」は、本明細書において、ネイティブなタンパク質の活性類似体、誘導体、断片、切断型アイソフォームなどであるタンパク質のことを指すのに用いられる。ポリペプチドは、対応するネイティブなポリペプチドの一部または全部の生物学的活性を保持する場合に活性である。
本明細書で用いる場合、本発明による製剤の「医薬的に許容される」成分（塩、担体、賦形剤または希釈剤など）は、（１）本発明のＦＰと、ＦＰの生物学的活性を失うことなく組み合わせることができる点で、製剤のその他の成分と適合し、（２）過度の有害副作用（毒性、刺激およびアレルギー応答など）なしで動物（ヒトを含む）への使用に適する成分である。副作用は、その危険性が医薬組成物により提供される利益を超える場合に「過度」である。医薬的に許容される成分の例は、限定されないが、リン酸緩衝塩溶液、水のような任意の標準的な医薬担体、油／水エマルジョン、マイクロエマルジョンのようなエマルジョン、および種々の湿潤剤を含む。
本明細書で用いる場合、タンパク質に関して用いられる用語「ネイティブ」は、タンパク質が天然で見出される対応するタンパク質のアミノ酸配列を有することを示す。
本明細書で用いる場合、用語「スペーサー」は、所定のＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物中のＥＬＰとペプチド活性治療剤との間に介在し得る任意の部分のことをいう。例えば、スペーサーは、ＥＬＰに一方の末端で共有結合し、ペプチド活性治療剤に他方の末端で共有結合する二価の基であってよい。よって、ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物が、ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物のその意図される目的のための効力を妨げない任意の追加の化学構造を含んでよい。スペーサーは、例えば、ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物の薬物動態を制御するために提供されるプロテアーゼ感受性スペーサー部分であってよいか、またはプロテアーゼ非感受性ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物であってよい。
本発明の融合タンパク質（ＦＰ）治療用組成物は、少なくとも１つのペプチド活性治療剤と結合した少なくとも１つのエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）を含む。組成物のＥＬＰ成分およびペプチド活性治療剤成分は、共有結合、イオン結合、会合性結合、錯体形成、またはペプチド活性治療剤がその意図する目的に有効であるようにし、かつ、結合したＥＬＰの存在が何らかの機能的、治療的または生理的な観点で組成物中のペプチド活性治療剤を増強し、そのことによりペプチド活性治療剤単独よりも有効になるように、ＥＬＰ成分とペプチド活性治療剤成分とを一体にするのに効果的な任意の他の結合様式を含む任意の好適な様式で互いに結合させることができる。
つまり、ＦＰ治療用組成物中のＥＬＰ結合ペプチド活性治療剤は、任意の他の特性、例えばその生物学的利用性、生物学的利用不能性、治療量、製剤適合性（formulation compatibility）、タンパク質溶解もしくは他の分解様式に対する抵抗性、溶解性、半減期もしくは投与後の体内残存率の他の指標、投与の後の身体からのクリアランス速度などを増強することができる。
本発明のＦＰ治療用組成物において、少なくとも１つのペプチド活性治療剤は、例えばＮ末端またはＣ末端に共有結合した１つ以上のＥＬＰと結合して、対応する治療剤単独と比較してペプチド活性治療剤の効力の増強を達成する。
本発明のＦＰ治療用組成物は、治療において直接投与することもでき、または発現制御エレメント、例えば適切なタイプのプロモーターに操作可能に連結している異種ヌクレオチド配列を含む、対応する融合遺伝子構築物からｉｎ ｖｉｖｏにて生成させることもでき、ここで、異種ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＥＬＰと結合した少なくとも１つのペプチド活性治療剤を含む融合タンパク質をコードする。
本発明は、ペプチド活性治療剤の効力を、例えばペプチド活性治療剤を少なくとも１つのＥＬＰと結合させてＦＰ治療用組成物を形成することにより増強することを可能にし、ここで、このようなＦＰ治療用組成物中のペプチド活性治療剤は、ペプチド活性治療剤単独と比較して効力が増強している。
本発明は、少なくとも１つのＥＬＰと結合した少なくとも１つのペプチド活性治療剤を含む任意の好適な治療用剤形を用いて実施することができる。
本発明は、ペプチド活性治療剤を少なくとも１つのＥＬＰと結合させてＦＰ治療用組成物を形成することにより、このような治療剤をタンパク質分解に対して安定化することを可能にする。
本発明のＦＰ治療用組成物は、１つ以上のＥＬＰ種と、１つ以上のペプチド活性治療剤とを含んでよい。上述したように、ＥＬＰ種とペプチド活性治療剤とは、互いに直接結合してよいし、またはこのような結合は、ＥＬＰとペプチド活性治療剤とを仲介するスペーサー部分を含む構築物において行うことができる。
本発明のＦＰ治療用組成物中で用いられるＥＬＰ種は、任意の好適なタイプのものでよい。ＥＬＰは、エラスチンタンパク質中に存在することが見出されている反復ペプチド配列である。これらの反復ペプチド配列としては、ポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド、ポリヘキサペプチド、ポリヘプタペプチド、ポリオクタペプチド、およびポリノナペプチドが挙げられる。
ＥＬＰは、可逆性の逆温度転移を受ける。これらは、転移温度（Ｔｔ）未満の水中では構造的に無秩序であり、高い可溶性であるが、温度がＴｔより上に上昇すると、鋭い（２〜３℃の範囲）無秩序から秩序への相転移を示して、ポリペプチドの脱溶媒和および凝集を導く。ＥＬＰ凝集体は、十分なサイズに達したときに、容易に回収でき、遠心分離により溶液から単離できる。このような相転移は可逆性であり、単離されたＥＬＰ凝集体は、温度をＥＬＰのＴｔ未満に戻すと、緩衝液中に完全に溶解できる。
本発明の実施において、ＥＬＰ種は、治療用組成物中のペプチド活性治療剤を安定化するか、または改良するように機能する。結合したペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物をペプチド活性治療剤を必要とする患者に投与した後に、ペプチド活性治療剤およびＥＬＰは互いに結合したままである一方で、ペプチド活性治療剤は、例えば疾患状態もしくは生理的状態の治療もしくは予防またはその他の治療上の介在に対して治療活性がある。
例えば、本発明の治療用組成物中のＥＬＰは、限定されないが以下のものを含む、種々の特徴的なテトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチドおよびノナペプチドのポリマーまたはオリゴマー反復で形成されるＥＬＰを含んでよい：
（ａ）テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＧ（配列番号１）；
（ｂ）テトラペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＧ（配列番号２）；
（ｃ）ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号３）、またはＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは、ポリマーまたはオリゴマー反復の間で任意選択により変動してよい）；
（ｄ）ペンタペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、またはＡＶＧＶＰ（配列番号４）；
（ｅ）ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＩＰＧＶＧ（配列番号５）；
（ｆ）ペンタペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＬＰＧＶＧ（配列番号６）；
（ｇ）ヘキサペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＶＡＰＧＶＧ（配列番号７）；
（ｈ）オクタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、またはＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号８）；
（ｉ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＦＧＶＧＡＧ（配列番号９）；および
（ｊ）ノナペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号１０）。
その他のサイズおよび構成の他の任意のポリマーまたはオリゴマー反復単位を、本発明の幅広い実施において有用に用い得る。
一実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中のＥＬＰは、ペンタペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、上記で定義される通りである）の反復単位を含み、ここで、ＥＬＰ中の他のアミノ酸残基に対するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙペンタペプチド単位の割合は、約７５％より大きく、より好ましくは約８５％より大きく、さらにより好ましくは約９５％より大きい。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、合成的に、例えば組換えにより製造してよい。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物において、ＥＬＰは、ペプチド活性治療剤のＣ末端および／またはＮ末端にて接続されてよく、任意選択により、スペーサー配列が、ＥＬＰをペプチド活性治療剤から分離するように存在してよい。
一態様において、本発明は、ＥＬＰをペプチド活性治療剤から分離する上記のスペーサー配列を任意選択により含む、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意図する。該ポリヌクレオチドは、発現ベクターの成分として提供されてよい。本発明は、このような発現ベクターにより形質転換されて、該融合タンパク質を発現する宿主細胞（原核または真核）も意図する。
合成または発現された後のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、相転移を行うことを含む方法、例えば温度を上昇させること、または別の様式では、単離されてない形で融合タンパク質を含有する媒体において融合タンパク質の相転移を生じさせることにより、単離できる。
例えば、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、相転移を示すペプチド活性治療剤−ＥＬＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを形成し、培養で融合タンパク質を発現させ、培養物由来の融合タンパク質含有物を分離（例えば遠心分離、膜分離などによる）および逆転移サイクリングを含む処理に供して、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ融合タンパク質を回収することを含む工程により、合成および回収してよい。
特定の一実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ融合タンパク質は、ＶＰＧＧ、ＩＰＧＧ、ＡＶＧＶＰ、ＩＰＧＶＧ、ＬＰＧＶＧ、ＶＡＰＧＶＧ、ＧＶＧＶＰＧＶＧ、ＶＰＧＦＧＶＧＡＧ、およびＶＰＧＶＧＶＰＧＧからなる群より選択されるポリペプチドのポリマーまたはオリゴマー反復を含むＥＬＰ部分を含む。
別の特定の実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ融合タンパク質は、ＬＰＧＸＧ（配列番号１１）、ＩＰＧＸＧ（配列番号１２）およびそれらの組合せ（式中、Ｘは、ＥＬＰ融合タンパク質の相転移を妨げないアミノ酸残基である）からなる群より選択されるポリマーまたはオリゴマー反復単位を含むＥＬＰ部分を含む。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、構築物に相転移の特徴を与えるアミノ酸配列を含む。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中のＥＬＰは、βターン成分を含み得る。βターン成分として用いるために適するポリペプチドの例は、Ｕｒｒｙら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６に記載される。あるいは、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中のＥＬＰは、βターン成分を欠くか、または異なる立体配座および／もしくは折り畳みの特徴を有する成分を含み得る。
上記のように、ＥＬＰは、限定されないが、ＶＰＧＧ、ＩＰＧＧ、ＶＰＧＸＧ、ＡＶＧＶＰ、ＩＰＧＶＧ、ＬＰＧＶＧ、ＶＡＰＧＶＧ、ＧＶＧＶＰＧＶＧ、ＶＰＧＦＧＶＧＡＧ、およびＶＰＧＶＧＶＰＧＧ（配列番号１から配列番号１０）を含む種々のテトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチドおよびノナペプチドのポリマーまたはオリゴマー反復を含み得る。相転移を示すか、または本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物において用いるための好適なＥＬＰ種を構成するために、ＥＬＰが、上記に列挙されるようなポリマーまたはオリゴマー配列のみからなる必要はないことが、当業者に認識されるだろう。
一実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（配列番号３）（式中、ゲスト残基Ｘは、ＥＬＰの相転移の特徴を失わせない任意のアミノ酸である）のポリマーまたはオリゴマー反復であるＥＬＰを含む。Ｘは、天然または非天然アミノ酸であってよい。例えば、Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されてよい。特定の実施形態において、Ｘはプロリンでない。
Ｘは、非古典的なアミノ酸であってよい。非古典的アミノ酸の例は、通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体を含む。
Ｘの同一特性の選択は、それぞれのＥＬＰ反復において独立している。選択は、Ｘ位の正または負に荷電している残基の考慮など、任意の所望の特徴に基づいてよい。Ｘ位において中性の値を有するＥＬＰが、より長い半減期を有し得ると考えてよい。
別の実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（配列番号１１）またはＬＰＧＸＧ（配列番号１２）（式中、Ｘは上記で定義される通りである）のポリマーまたはオリゴマー反復であるＥＬＰを含む。
ＥＬＰ配列のポリマーまたはオリゴマー反復は、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の全体的な相転移の特徴を失わせない１つ以上のアミノ酸残基により分けられてよい。特定の一実施形態において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物のＥＬＰ成分がペンタペプチドＶＰＧＸＧのポリマーまたはオリゴマー反復を含む場合、ＥＬＰの他のアミノ酸残基に対するＶＰＧＸＧ反復の割合は、約７５％より大きく、より好ましくは約８５％より大きく、さらにより好ましくは約９５％より大きく、最も好ましくは約９９％より大きい。
各反復において、Ｘは、独立して選択される。得られる異なるＥＬＰ種を、ここでは、ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］（式中、ｋは、ＥＬＰ反復単位の特定のタイプを示し、括弧内の大文字は、１文字アミノ酸コードであり、それらの対応する下付き文字は、反復単位中のそれぞれのゲスト残基Ｘの相対的割合を示し、ｎは、ペンタペプチド反復の数でのＥＬＰの合計の長さを示す）の表記法で区別する。例えば、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、相対的割合５：２：３のバリン、アラニンおよびグリシンである）の１０反復単位を含むポリペプチドを表し、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、相対的割合１：２：１のリジン、バリンおよびフェニルアラニンである）の４反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、相対的割合１：７：１のリジン、バリンおよびフェニルアラニンである）の４反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ１［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、バリンのみである）の５反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、ペンタペプチドＶＰＧＸＧ（式中、Ｘは、バリンのみである）の２０反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ２［５］は、ペンタペプチドＡＶＧＶＰの５反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ３［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＩＰＧＸＧ（式中、Ｘは、バリンのみである）の５反復単位を含有するポリペプチドを表し、ＥＬＰ４［Ｖ−５］は、ペンタペプチドＬＰＧＸＧ（式中、Ｘは、バリンのみである）の５反復単位を含有するポリペプチドを表す。
Ｕｒｒｙらによる以前の研究は、エラスチンペンタペプチド配列ＶＰＧＸＧ中の４番目の残基（Ｘ）が、βターンの形成を失うことなく変更され得ることを示した。これらの研究は、Ｔｔがゲスト残基の疎水性の関数であることも示した。ゲスト残基およびそのモル比を変動させることにより、０〜１００℃の範囲にわたって逆転移を示すＥＬＰを合成できる。
所定のＥＬＰの長さでのＴｔは、ＥＬＰ配列中に組み込む疎水性ゲスト残基の割合を大きくすることにより減少できる。好適な疎水性ゲスト残基の例は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。穏やかに疎水性であるチロシンも用いてよい。逆に、Ｔｔは、グルタミン酸、システイン、リジン、アスパラギン酸、アラニン、アスパラギン、セリン、スレオニン、グリシン、アルギニンおよびグルタミンからなる群より選択され、好ましくはアラニン、セリン、スレオニンおよびグルタミン酸から選択されるような残基を組み込むことにより、増大できる。
一実施形態におけるＥＬＰは、約１０〜約８０℃、より好ましくは約３５〜約６０℃、最も好ましくは約３８〜約４５℃の範囲のＴｔを与えるように選択される。
Ｔｔは、ＥＬＰ鎖長を変動することによっても変動できる。Ｔｔは、ＭＷが減少すると増加する。分子量が１００，０００を超えるポリペプチドについて、Ｕｒｒｙら（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５１８６）により開発された疎水性尺度が、特定のＥＬＰ配列のおおよそのＴｔを予測するために好ましい。
分子量が１００，０００未満のポリペプチドについて、Ｔｔは、以下の２次関数により決定されるのが好ましい：
Ｔｔ＝Ｍ０＋Ｍ１Ｘ＋Ｍ２Ｘ２
（式中、ＸはＦＰのＭＷであり、Ｍ０＝１１６．２１；Ｍ１＝−１．７４９９；Ｍ２＝０．０１０３４９）。
ＥＬＰのＴｔ、およびペプチド活性治療剤に連結したＥＬＰの構築物のＴｔは、ゲスト残基Ｘおよびその疎水性により影響を受けるが、構築物の付随的な特性も影響を受ける。そのような特性は、限定されないが、溶解性、生物学的利用性または生物学的利用不能性、ならびにＥＬＰ自体および構築物の半減期を含む。
以下の実施例の部分では、ＥＬＰと結合した活性治療剤は、治療剤の遊離のタンパク質形態と比較して有意な量の治療剤の生物学的活性を保持することがわかる。さらに、ＥＬＰが長い半減期を示すことも示される。それに応じて、ＥＬＰは、本発明に従って、治療剤の遊離（コンジュゲートされていない）形態の半減期と比較して、ＥＬＰとコンジュゲートされているので、治療剤の半減期を実質的に（特定の実施形態では、例えば１０％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％またはそれより多くを超えて）増加させるために用い得る。さらに、ＥＬＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与されたときに高血液含量器官を標的にすることが示され、ゆえに体内で分配されて、身体の種々の器官または領域のうちのあらかじめ決められた所望の身体的分布、または治療剤の所望の選択性もしくはターゲティングを提供できる。要するに、本発明により意図される活性ＥＬＰ−治療剤コンジュゲートは、半減期が延長された活性な部位特異的組成物として投与されるかまたはｉｎ ｖｉｖｏにて生成される。
本発明の一実施形態において、ＥＬＰの長さは、５〜約５００アミノ酸残基、より好ましくは約１０〜約４５０アミノ酸残基、さらにより好ましくは約１５〜約１５０アミノ酸残基である。ＥＬＰの長さは、目標Ｔｔを維持しながら、ＥＬＰ配列内に疎水性ゲスト残基をより大きい割合で取り込むことにより、低下させ得る。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中の活性治療剤は、任意の好適なタイプのものであり得る。好適なペプチドは、エリスロポエチン、マゲイニン、ベータ−デフェンシン、インターフェロン、インスリン、モノクローナル抗体、血液因子、コロニー刺激因子、成長ホルモン、インターロイキン、成長因子、治療用ワクチン、カルシトニン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、受容体拮抗物質、コルチコステロイド、および酵素などの治療用タンパク質を特に含む、医薬、農業、ならびに他の科学的および工業的分野において興味のあるものを含む。このようなペプチドの具体例は、限定されないが、補充療法で用いられる酵素；抗菌ペプチド；成長を促進するホルモン；および種々の用途に用いられる活性タンパク質様物質を含む。具体例は、限定されないが、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、グルタマーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼリボヌクレアーゼ、トリプシン、クロモトリプシン、パパイン、インスリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ソマトシン（somatosin）、ソマトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、およびバソプレシンを含む。
本発明の一実施形態において、ペプチド活性治療剤は、チオレドキシンである。
別の実施形態において、ペプチド活性治療剤は、テンダミスタット（tendamistat）である。テンダミスタット−ＥＬＰ融合タンパク質は、例えば膵炎の治療におけるα−アミラーゼ阻害剤として用いるための容易に単離できる活性型のテンダミスタットを提供する。この融合タンパク質は、医薬的に許容される担体を伴う医薬製剤の成分として適切に提供される。テンダミスタット−ＥＬＰ融合タンパク質は、遊離のテンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性のほとんどを保持しており、安定な構築物である。
一実施形態において、ペプチド活性治療剤は、インスリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレシン、非天然オピオイド、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、およびパパインからなる群より選択される生理的に活性なペプチドを含む。
本発明は、よって、治療（in vivo）用の種々の組成物であって、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物のペプチド成分が、生理的に活性、すなわち生物活性なペプチドである組成物を包含する。このようなペプチド含有組成物の好ましい形において、ペプチド成分のＥＬＰ種への結合は、直接的な共有結合または間接的な（好適なスペーサー基を介して）結合であり、ペプチド部分およびＥＬＰ部分は、互いのこのような直接的または間接的な共有結合を含む任意の好適な様式で、構造的に配置できる。つまり、広い多様性のペプチド種を、必要に応じて、または所定の治療用途において望まれるように、本発明の幅広い実施に適合できる。
一実施形態における本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中のペプチド活性治療剤として用いられるペプチドは、補充療法において用いられる酵素、および成長を促進するホルモンを含む。このような酵素としては、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、グルタマーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼリボヌクレアーゼ、シトシンデアミナーゼ、トリプシン、クロモトリプシンおよびパパインがある。ペプチドホルモンのうち、本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物において用いるのに適する特定の種は、限定されないが、インスリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトシン、ソマトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、およびバソプレシンを含む。
別の特定の態様において、ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物中のペプチド活性治療剤は、以下の種、ならびにそのような種のすべての変異型、断片および誘導体から選択される：アグーチ関連ペプチド、アミリン、アンジオテンシン、セクロピン、ボンベシン、ガストリン放出ペプチドを含むガストリン、ラクトフェリン、限定されないがマガイニンを含む抗菌ペプチド、ウロジラチン、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、コラーゲンペプチド、サバイビン、β−アミロイドを含むアミロイドペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ペプチドＹＹ、限定されないが神経ペプチドＹ、ダイノルフィン、エンドモルフィン、エンドセリン、エンケファリン、エキセンディン、フィブロネクチン、神経ペプチドＷおよび神経ペプチドＳを含む神経再生ペプチドおよび神経ペプチド、ペプチドＴ、メラノコルチン、アミロイド前駆体タンパク質、シートブレーカーペプチド、ＣＡＲＴペプチド、アミロイド阻害ペプチド、プリオン阻害ペプチド、クロロトキシン、コルチコトロピン放出因子、オキシトシン、バソプレシン、コレシストキニン、セクレチン、チモシン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、パンクレアスタチン、メラニン細胞刺激ホルモン、オステオカルシン、ブラディキニン、アドレノメデュリン、ペリネリン、メタスタチン、アプロチニン、ガラニン様ペプチドを含むガラニン、レプチン、限定されないがα-デフェンシンおよびβ-デフェンシンを含むデフェンシン、サリューシン、ならびに限定されないがコノトキシン、デコルシン、クルトキシン、イソギンチャク毒、タランチュラ毒を含む種々の毒；脳ナトリウム利尿ペプチド（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、またはＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチドおよびバソナトリンを含むナトリウム利尿ペプチド；ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ；ニューロメジン；ニューロテンシン；オレキシン、膵臓ポリペプチド、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、プロラクチン放出ペプチド、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ソマトスタチン、ＴＮＦ−α；グレーリン、プロテインＣ（Ｘｉｇｒｉｓ）、ＳＳ１（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８およびシュードモナス菌体外毒素タンパク質、アンチトロンビンＩＩＩおよび凝固因子ＶＩＩＡを含む凝固因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベータ、ウロキナーゼ、ベータグルコセレブロシダーゼおよびアルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファＬ−イズロニダーゼ、アルファ−１，４−グルコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、イズロネート−２−スルファターゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒト活性化タンパク質、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、黄体ホルモン、ソマトロピン、骨形成タンパク質、ネシリチド、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、ケラチノサイト成長因子、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２を含むインターロイキン、グリコプロテインＩＩＢ／ＩＩＩＡ、Ｂ型肝炎、ガンマグロブリン、ヴェノグロブリンを含む免疫グロブリン、ヒルジン、アプロチニン、アンチトロンビンＩＩＩ、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤、フィルグラスチム、ならびにエタネルセプト。
別の実施形態において、本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物のペプチド成分は、免疫療法またはその他の治療的介在に関連する任意の抗体または抗原であってよい。
インスリンＡペプチド、Ｔ２０ペプチド、インターフェロンアルファ２Ｂペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、小ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメイン、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン、Ｇタンパク質アルファＱ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチド、Ｇタンパク質アルファＳ、アンジオスタチン（Ｋ１−３）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、カルモジュリン（ＣａｌＭ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インターロイキン１受容体拮抗物質（ＩＬ−１Ｒａ）、ルシフェラーゼ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴｇ）、モルヒネ調節神経ペプチド（ＭＭＮ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシンＢ、レプチン、ＡＣＴＨ、カルシトニン、アドレノメデュリン（ＡＭ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、デフェンシンおよび成長ホルモンのような種々のその他のタンパク質およびペプチドを、異なるＥＬＰポリペプチドと融合させて、逆相転移挙動を示すＦＰを形成する。
活性治療剤として用いられるタンパク質およびペプチドは、それらの１次、２次、および３次構造、サイズ、分子量、溶解性、電荷分布、粘度および生物学的機能が著しく異なり得る。
本発明の範囲内には、合成の間またはその後に、例えばベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ＰＥＧ化、既知の保護基／遮蔽基による誘導体化、タンパク質溶解切断、抗体分子もしくはその他の細胞性リガンドへの連結などにより、異なって修飾されたＦＰを含む誘導体も含まれる。一実施形態において、ＦＰは、Ｎ末端においてアセチル化されているか、および／またはＣ末端においてアミド化される。別の実施形態において、ＦＰは、ポリマー、例えば経口送達を促進すること、酵素分解を低減させること、ポリペプチドの溶解性を増大させること、またはヒトもしくはその他の動物への投与のための治療用ポリペプチドの化学的特性を向上させることが当該技術において知られているポリマーにコンジュゲートされる。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、既知の組換え発現技術により得ることができる。ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を組換えにより製造するために、構築物をコードする核酸配列は、融合タンパク質をコードする核酸配列が、宿主細胞内で所望の融合ペプチドに転写および／または翻訳されるように好適なプロモーター配列に操作可能に連結している。好ましいプロモーターは、Ｔ７プロモーターのような大腸菌（E.coli）での発現に有用なものである。
例えば真核または原核系の任意の通常用いられる発現系を用いてよい。具体例は、酵母、ピキア、バキュロウイルス、哺乳動物、ならびに大腸菌およびカウロバクター（Caulobacter）のような細菌系を含む。
核酸配列を含むベクターは、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の発現のために細胞に導入され得る。ベクターは、保持されている遺伝子が転写されて所望のＲＮＡを生成する限りは、エピソームのままであるか、または染色体に組み込まれ得る。ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技法により構築できる。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス、または原核もしくは真核細胞での複製および発現に用いられる、当該技術において知られる任意のその他のタイプであり得る。プロモーターのような種々の転写シグナル、およびプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を調節するその他の配列を含む、当該技術において知られる多様な成分をこのようなベクターに含み得ることが、当業者に認識されるだろう。ベクターが発現される細胞内で有効であることが知られる任意のプロモーターを、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の最初の発現に用い得る。好適なプロモーターは、誘導性または構成性である。好適なプロモーターの例は、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列など、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられている以下の動物転写制御領域を含む：膵腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵ベータ細胞において活性があるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系細胞および肥満細胞で活性があるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域、肝臓で活性があるアルブミン遺伝子制御領域、肝臓で活性があるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓で活性があるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域、赤血球細胞で活性があるベータ−グロブリン遺伝子制御領域、脳のオリゴデンドロサイト細胞内で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性があるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域。
一実施形態において、哺乳動物は、その乳中にペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を生成するように遺伝子改変される。このような遺伝子改変を行う技術は、２０００年１月１１日に、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｏｖｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｉｌｋ ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｏｖｉｎｅｓ」として発行された米国特許第６，０１３，８５７号に記載される。トランスジェニック動物のゲノムは、乳腺プロモーターに操作可能に連結したペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物をコードするＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含むように改変される。ＤＮＡ配列の発現は、乳中のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の生成をもたらす。ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、次いで、トランスジェニック哺乳類から得られる乳から、相転移により単離できる。トランスジェニック哺乳類は、好ましくはウシである。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、逆転移サイクリング手順を用いて、例えばペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の温度依存性の溶解性を利用するか、または構築物を含有する媒体への塩の添加を利用して、他の混入タンパク質から高純度に分離できる。逐次的な逆相転移サイクルを用いて、高純度を得ることができる。
温度およびイオン強度の他に、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の逆転移を改変するために有用なその他の環境変数は、ｐＨ、無機および有機の溶質および溶媒の添加、側鎖のイオン化または化学的改変、ならびに圧力を含む。
本発明のある特定の例証となる実施形態において、１０ポリペンタペプチドＥＬＰ（ＥＬＰ １０マー）を構築する。ＥＬＰ １０マーは１８倍までオリゴマー化またはポリマー化されて、精密に特定された分子質量（１０マー、２０マー、３０マー、６０マー、９０マー、１２０マー、１５０マーおよび１８０マー）を有するＥＬＰのライブラリーを作り出す。ＥＬＰポリマーまたはオリゴマーは、次いで、ペプチド活性治療剤のＣ末端またはＮ末端に融合されて、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を形成してよい。第２のペプチド活性治療剤を、融合タンパク質構築物のＥＬＰ成分に融合させて、３元融合物を提供してよい。任意選択により、１つ以上のスペーサーを用いて、ＥＬＰ成分をペプチド活性治療剤から分離してよい。
よって、本発明は、ペプチド活性治療剤が、任意の多様な内因性分子の天然もしくは合成型、または天然に存在しないペプチド種、または上記のいずれかの機能的等価物であり得るペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を与える。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、非経口的に与えられた場合、すなわちペプチドが血漿プロテアーゼにより容易に代謝される場合のペプチド活性治療剤の主要な欠点を克服する。ペプチド活性治療剤の投与の経口経路は、さらにより問題が大きい。なぜなら、胃でのタンパク質溶解に加えて、胃の高い酸性が、このようなペプチド活性治療剤が意図する標的組織に到達する前にペプチド活性治療剤を破壊するからである。胃および膵臓の酵素の作用により生成されるペプチドおよびペプチド断片は、腸の刷子縁膜中のエキソペプチダーゼおよびエンドペプチドダーゼにより切断されて、ジペプチドおよびトリペプチドを産出し、そして膵臓酵素によるタンパク質溶解が回避されたとしても、ポリペプチドは、刷子縁ペプチダーゼにより分解される。胃を通る経路を生き延びるペプチド活性治療剤はいずれも、腸粘膜での代謝にさらに付され、ここでは浸透バリアが細胞への侵入を妨げる。本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、このような欠点を克服し、生物学的利用性、生物学的利用不能性、治療剤の半減期、分解補助などの効力が増強したペプチド活性治療剤の組成物形態を提供する。
よって、本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、経口および非経口の剤形、ならびにペプチド活性治療剤が非常に効率的な様式で用いられ得る種々のその他の剤形を可能にする。例えば、このような構築物は、高い粘膜吸収と、より低用量を用いるという付随する能力を達成して、最適治療効果を導き出す剤形を可能にする。
ＥＬＰ／ペプチド活性治療剤構築物は、構築物中の部分としてスペーサーも含んでよい。スペーサーは、任意の好適なタイプのものであってよく、ペプチドスペーサー、または非ペプチド化学的部分であってよい。
ペプチドスペーサーは、プロテアーゼ切断性（cleavable）または非切断性（non-cleavable）であってよい。例として、切断性ペプチドスペーサー種は、限定されないが、トロンビン、第Ｘａ因子、プラスミン（血液プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ、カテプシン（例えばＧＦＬＧなど）、およびその他の身体区画で見出されるプロテアーゼのような種々のタイプのプロテアーゼにより認識されるペプチド配列を含む。非切断性スペーサーは、同様に、例えば式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（式中、ｎは１〜４（端値を含む）であり、ｍは、１〜４（端値を含む）である）を有する非切断性スペーサー部分を含む任意の好適なタイプのものであってよい。
非ペプチド化学スペーサーは、さらに、例えば、それぞれの全体の開示が参照により本明細書に組み込まれるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．により出版、１９９５年に記載される機能的リンカー、およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Rockford、Illinois）から入手可能なＣｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されるものを含む任意の好適なタイプのものであり得る。例証の化学スペーサーは、Ｌｙｓのアミン基に結合できるホモ二官能性リンカー、および一方の末端でＣｙｓに、他方の末端でＬｙｓに結合できるヘテロ二官能性リンカー、および抗体のＦｃ領域にタンパク質を連結できるその他の二官能性リンカー（ここで、抗体の炭水化物はまず、ジオールまたはアルデヒドに酸化される）を含む。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、状態もしくは疾患状態の予防または治療において用いられる。このような構築物は、本明細書において、動物対象についての利用性を有するペプチド活性治療剤に関連して記載されるが、本発明は、植物系における状態もしくは疾患状態の予防または治療についての利用性を有するペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物も意図する。例として、このような植物利用性を有するペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物のペプチド成分は、殺虫性、除草性、殺真菌性および／または農薬の効力を有してよい。
本発明のさらなる態様は、任意の好適なタイプのベクター、例えばＡＡＶ、ワクシニア、ポックスウイルス、ＨＳＶ、レトロウイルス、リポフェクション、ＲＮＡトランスファーなどに関連する本発明の融合遺伝子治療用組成物を用いる遺伝子治療に関する。
治療上の使用において、本発明は、このような状態もしくは疾患状態を有するかまたは潜在的に感受性であってそのような治療を必要とする動物対象を治療する方法であって、そのような動物に上記の状態または疾患状態に治療上有効な本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の有効量を投与することを含む方法を意図する。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物により治療される動物対象は、ヒトおよび非ヒト動物（例えば鳥類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ）の対象を共に含み、好ましくは、哺乳動物対象であり、最も好ましくはヒト対象である。
対処しようとする特定の状態または疾患状態に応じて、動物対象に、本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を、本明細書の開示に基づいて過度の実験を行うことなく当業者により容易に決定されるような、任意の好適な治療上有効で安全な投与量で投与してよい。
一般的に、治療上の利点を達成するためのペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物中のペプチド活性治療剤の好適な用量は、例えば、１日当たりに受容者の体重１キログラム当たり１マイクログラム（μｇ）〜１００ミリグラム（ｍｇ）の範囲、好ましくは１日当たりに体重１キログラム当たり１０μｇ〜５０ｍｇの範囲、最も好ましくは１日当たりに体重１キログラム当たり１０μｇ〜５０ｍｇの範囲であり得る。所望の用量は、１日のうちに適切な間隔で投与される２回、３回、４回、５回、６回またはそれより多い細分用量（sub-dose）として与えられ得る。これらの細分用量は、単位剤形当たり例えば１０μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜５００ｍｇ、最も好ましくは５０μｇ〜２５０ｍｇの有効成分を含有する単位剤形で投与できる。あるいは、受容者の状態により要求されるのであれば、用量は、連続的注入として投与してよい。
投与の形態および剤形は、もちろん、所定の治療用途のために望まれ、かつ有効であるペプチド活性治療剤の治療量に影響する。
0 例えば、同じペプチド活性治療剤について、経口投与量は、非経口投与方法で用いられる投与量レベルの少なくとも２倍、例えば２〜１０倍であり得る。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、そのままで、また、医薬的に許容されるそれらのエステル、塩、および他の生理的に機能的な誘導体を含む構築物の形で投与してよい。
本発明は、本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を含む、獣医学的使用およびヒトの医療用の医薬製剤も意図する。
このような医薬および医療用製剤において、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、１つ以上の医薬的に許容される担体、および任意のその他の治療用成分と共に用いられ得る。担体は、製剤の他の成分と適合し、その受容者に過度に有害でないという意味で医薬的に許容されなければならない。ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物は、上記のように所望の薬理学的効果を達成するのに効果的な量で、かつ所望の１日用量を達成するのに適する量で提供される。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の製剤は、非経口および経口の投与に適するものを含み、特定の投与様式は、経口、直腸、頬側、局所、鼻、眼、皮下、筋内、静脈内、経皮、くも膜下腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ、膣、および子宮内の投与を含む。経口および非経口の投与に適する製剤が好ましい。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物が、溶液を含む製剤において用いられる場合、製剤は、経口または非経口により有利に投与され得る。ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物が、懸濁液製剤中で、または生体適合性担体製剤中の粉末として用いられる場合、製剤は、経口、直腸、または気管支で有利に投与してよい。
ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物が、粉末の固体の形で直接用いられる場合、活性剤は、経口で有利に投与され得る。あるいは、好適な噴霧器を含む呼吸回路から患者によって吸入される粉末の気体分散物を形成するためにキャリーガス中での粉末の噴霧化を介して、それを気管支に投与してよい。
本発明のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を含む製剤は、単位剤形で好都合に提供されてもよく、製薬分野で公知の任意の方法により調製してよい。このような方法は、通常、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を、１つ以上の付属の成分を構成する担体と混合する工程を含む。典型的には、製剤は、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を、液体担体、微細固体担体、またはその両方と均質にかつ完全に混合し、次いで、必要であれば生成物を所望の製剤の剤形に成型することにより調製される。
経口投与に適する本発明の製剤は、それぞれが所定量の有効成分を粉末または顆粒として含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤、またはロゼンジのような別々の単位として、あるいは水性の液体もしくはシロップのような非水性の液体中の懸濁剤、エリキシル、エマルジョンまたは頓服水剤（draught）であってよい。
錠剤は、任意選択により１つ以上の付属の成分と共に圧縮または成型により製造してよい。圧縮錠剤は、好適な機械で、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または排出剤と任意選択により混合された粉末または顆粒のような易流動性の形のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を用いて圧縮することにより製造してよい。粉末のペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物と好適な担体との混合物を含む成型錠剤は、好適な機械での成型により製造してよい。
シロップ剤は、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を、任意の付属の成分を加えてもよい糖類、例えばスクロースの濃縮水溶液に加えることにより製造してよい。このような付属の成分は、香料、好適な防腐剤、糖類の結晶化を遅延させる剤、およびポリヒドロキシアルコール、例えばグリセロールまたはソルビトールのような任意のその他の成分の溶解性を増大させる剤を含んでよい。
非経口投与に適する製剤は、受容者の血液と好ましくは等張である（例えば生理的塩溶液）、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の滅菌水性調製物を含むことが簡便である。このような製剤は、懸濁化剤および増粘剤、またはペプチド活性治療剤を血液成分または１つ以上の器官に指向させるように設計されたその他の微粒子系を含んでよい。製剤は、単位投与形態または複数投与形態であってよい。
鼻噴霧製剤は、ペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の精製水溶液を、防腐剤および等張剤と共に含む。このような製剤は、鼻粘膜に適合するｐＨと等張状態に調整されていることが好ましい。
直腸投与用の製剤は、カカオ脂、硬化油、または水素添加脂肪性カルボン酸のような好適な担体を含む坐剤であってよい。
眼用製剤は、ｐＨおよび等張性因子が、好ましくは眼のものに合致するように調整されていること以外は、鼻噴霧と同様の方法により調製される。
局所製剤は、鉱物油、石油、ポリヒドロキシアルコール、または局所医薬製剤に使用される他の基剤などの１つ以上の媒体中に溶解または懸濁されたペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を含む。
上記の成分に加えて、本発明の製剤は、希釈剤、緩衝剤、香料、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）などから選択される１つ以上の付属の成分をさらに含んでよい。
本発明の特徴および利点は、以下の限定しない実施例に関してより十分に示される。
本発明の特徴は、各種の異なるＥＬＰ配列に融合させた、チオレドキシン、テンダミスタット、インスリン、Ｔ２０タンパク質、インターフェロン、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、小ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体、アンドロゲン受容体リガンド結合タンパク質、グルココルチコイド受容体リガンド結合タンパク質、エストロゲン受容体リガンド結合タンパク質、Ｇタンパク質、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、アンジオスタチン（Ｋ１−３）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、カルモジュリン（ＣａｌＭ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インターロイキン１受容体拮抗物質（ＩＬ−１Ｒａ）、ルシフェラーゼ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴｇ）、モルヒネ調節神経ペプチド（ＭＭＮ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシンＢ、レプチン、ＡＣＴＨ、カルシトニン、アドレノメデュリン（ＡＭ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、デフェンシン、および成長ホルモンなど各種の異なる組換えタンパク質を含有する融合タンパク質の発現を伴う実験への例示的な参照により、さらに完全に示される。
（実施例１）
タンパク質および長鎖ペプチドの産生および精製
提示される事例研究では、ＥＬＰ−（ＴＥＶ）−ペプチド／タンパク質構築物を含有する大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ菌株（Invitrogen社製）を、抗生剤を補足した培地で、誘導なしに３７℃で２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０および１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。細胞は、氷上における超音波破壊により溶解させた。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。２５℃の溶解物に１．５Ｍの最終濃度までＮａＣｌを添加することにより、逆温度転移を誘導した後、２５℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離した。結果として得られるペレットは、ＥＬＰ−（ＴＥＶ）−ペプチド／タンパク質融合およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。ペレットは、４０ｍｌの氷冷緩衝液中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離し、非特異的な不溶性タンパク質を除去した。温度転移サイクルをさらに３回繰り返し、ＥＬＰ−ＴＥＶ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を５ｍｌ未満に減少させた。
ＥＬＰからのペプチド／タンパク質の分離は、ＥＬＰ−ＴＥＶプロテアーゼを添加し、２５℃で１８時間にわたりインキュベートすることにより達成した。切断されたペプチド／タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＣｌの存在下における最終温度転移を用いて、ＥＬＰおよびＥＬＰ−ＴＥＶプロテアーゼからさらに精製された後、室温、１０，０００ｇで遠心分離を行った。ＮａＣｌにより転移したＥＬＰ、ＥＬＰ−ＴＥＶプロテアーゼ、および未切断のＥＬＰ−ペプチド／タンパク質が不溶性画分中に見出されるのに対し、ペプチド／タンパク質は可溶性画分中にとどまった。ＨＰＬＣ法および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＣ）法を実施して、ＴＥＶがＥＬＰ−（ＴＥＶ）−ペプチド／タンパク質を切断する正確度、およびペプチド／タンパク質の最終純度を調べた。ＥＬＰ−（ＴＥＶ）−ペプチド／タンパク質、ＥＬＰ、および精製されたペプチド／タンパク質の濃度は、ＥｘＰＡＳｙツールＰｒｏｔＰａｒａｍにより計算された減衰係数を用いる分光光度法により決定された（19th Annual American Peptide Symposium, June 2005;ポスター発表）。
３７アミノ酸ペプチドの産生
上述の系（deltaPhase（商標））を用いて、３７アミノ酸ペプチドを発現させ精製した。数ラウンドの転移により、発現したＥＬＰ−ペプチド融合体を精製した。精製された融合体は、ＴＥＶプロテアーゼと共にインキュベートし、ペプチドを切断した。ＴＥＶプロテアーゼは、インキュベーション後に切断されたＥＬＰと共に溶液から除去させる別の実験において、ＥＬＰ融合体として調製された。結果を図１に示すが、ここで、Ｍは分子量マーカー、Ｓは超音波分解後における溶解物、Ｐは遠心分離（転移前）から得られるペレット、Ｌは可溶性溶解物、Ｔｎはｎ回目の転移から得られるペレットである。
ＬＣ−ＭＳによる分子量および純度を確認した結果のグラフである図２に見られる通り、結果として得られるペプチドは、脱アミド化された少量の不純物を含む、９０％を超える純度を有した。
ペプチド変異体系列の迅速な産生
次いで、ペプチド系列に可能なスループットおよび純度を決定した。表１に示す結果は、ペプチド系列を通じて一貫した成果物を産生する能力を示す。かつては、化学合成の限界により、ペプチド産生は３〜６週間ごとに１ペプチドに制限され、これによりペプチド最適化の速度が制限された。前出のｄｅｌｔａＰｈａｓｅ（商標）系を用いたところ、以下の６つのペプチドを２週間未満で産生することができた。この系を並行処理できるようになって、スループットは、数週間で容易に数百倍に増大した。
Figure 2010502734
 （実施例２）
チオレドキシンおよび／またはテンダミスタットを含有する融合タンパク質
チオレドキシンおよびテンダミスタットは、（１）ペプチド活性治療剤が、高レベルで過剰発現し、高い可溶性である（チオレドキシン）、および（２）ペプチド活性治療剤が、大部分、不溶性の封入体として発現する（テンダミスタット）という、タンパク質発現の２つの限界的シナリオを例示する。
チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質が、遊離ＥＬＰと比較してＴｔのごくわずかな上昇（１〜２℃）を示したのに対し、テンダミスタット融合体は、１５℃というＴｔのより劇的な低下を示した。この変化が、三元構築物（チオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット）および二元構築物（ＥＬＰ−テンダミスタット）のいずれについても同一であったことは、Ｔｔの変化が、テンダミスタットと特異的に関連することを示した。これらの観察結果は、Ｔｔの低下が、ＥＬＰ鎖と溶媒に曝露されたテンダミスタットの疎水性領域との間の相互作用によるという結論と符合するのに対し、高い可溶性のチオレドキシンの場合、これらの疎水性相互作用は無視できるものであった。さらに、高い可溶性のタンパク質では、ＥＬＰタグとの融合の際に導入されるＴｔの摂動は、遊離ＥＬＰと比較してごくわずかである可能性が高い。
原理的な概念を示すために、ＥＬＰ配列をコードする遺伝子を合成し、２つの融合タンパク質構築物内に連結した。第１の構築物では、ＥＬＰ配列を、標的組換えタンパク質の可溶性を上昇させる担体として通常用いられる１０９残基のタンパク質である、大腸菌チオレドキシンのＣ末端に融合させた。第２のより複雑な構築物では、７７残基のα−アミラーゼ阻害剤タンパク質であるテンダミスタットを、チオレドキシン−ＥＬＰ融合体のＣ末端に融合させ、三元融合体を形成した。
Ｕｒｒｙらによる以前の研究は、２つのＥＬＰ特異的変数である、ゲスト残基の組成（すなわち、ＶＰＧＸＧモノマーにおけるＸの同一特性およびモル画分）およびＥＬＰの鎖長が、転移温度に大きく影響を及ぼし、それにより、Ｔｔによりペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物を特徴づけることを可能とすることを示している。
ゲスト残基としてバリン、アラニン、およびグリシンを５：２：３の比率で有し、水中において約４０℃の予測Ｔｔを有するＥＬＰ配列（配列番号１３）をコードする遺伝子を合成した。１０回のＶＰＧＸＧペンタペプチド反復（「１０マー」）をコードする合成遺伝子を最大で１８倍にオリゴマー化し、３．９〜７０．５ｋＤａの範囲の正確に指定した分子量（ＭＷ）を有するＥＬＰをコードする遺伝子ライブラリーを作製した。チオレドキシンは、１０マー、２０マー、３０マー、６０マー、９０マー、１２０マー、１５０マー、および１８０マーのＥＬＰ配列とのＮ末端融合体として発現させ、テンダミスタットは、チオレドキシン／９０マーＥＬＰへのＣ末端融合体として発現させた。
ＦＰは、大腸菌内において発現させ、融合タンパク質中に存在する（ヒスチジン）６タグを用いる固定化金属アフィニティ−クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）法か、または、逆転移サイクリング（以下に述べる）により、細胞溶解物から精製した。精製されたＦＰは、トロンビンにより切断して、ＥＬＰから標的タンパク質を遊離させた。次いで、もう１ラウンドの逆転移サイクリングにより、ＥＬＰを標的タンパク質から分離する結果として、純標的タンパク質を得た。各構築物について、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により、精製されたＦＰ、標的タンパク質、およびＥＬＰを特徴づけ、これにより、タンパク質純度を確認し、トロンビン切断の完全性を検証し、各タンパク質の移動が、その予測サイズと符合することを示した（結果は示さない）。
このようにして形成された融合タンパク質の逆転移は、ＥＬＰ含有融合タンパク質が転移を経る際の凝集による溶液の濁度を、温度の関数としてモニターすることにより、分光光度的に特徴づけることができる。温度が臨界温度まで上昇しても、溶液は透明なままである。さらに温度が上昇すると、約２℃の範囲にわたって濁度が急上昇し、最大値（約２．０のＯＤ３５０）に達する。分光光度的に観察された転移の中間点における温度として定義されるＴｔは、この過程を記述するのに好適なパラメータである。
ＰＢＳ中における遊離ＥＬＰ、チオレドキシン−ＥＬＰ融合体、ＥＬＰ−テンダミスタット融合体、およびチオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット三元融合体の逆転移を調べた。Ｔｔが遊離ＥＬＰでは５１℃、チオレドキシン融合体では５４℃であったことは、Ｔｔが、チオレドキシンへの融合によりわずかに影響を受けるに過ぎないことを示す。テンダミスタット三元融合体からの切断により産生されたチオレドキシン−ＥＬＰが、直接に産生されたチオレドキシン−ＥＬＰと比較してより高温のＴｔを有した（５４℃に対して６０℃）ことは、おそらく、ＥＬＰ配列にじかに隣接するリーダーアミノ酸配列およびトレーラーアミノ酸配列の違いによると思われる。ＥＬＰ−テンダミスタットおよびチオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタットの転移プロファイルはほぼ同一であり、３４℃のＴｔを有した。ＦＰの凝集は可逆的であり、凝集物は、温度をＴｔ未満に低下させると、完全に再溶解させた。しかし、再溶解の反応速度は、ＥＬＰ−テンダミスタット融合体およびチオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット融合体の場合の方が遅く、遊離ＥＬＰおよびチオレドキシン−ＥＬＰの場合のわずか数秒に対して、通常５〜１０分間を要した。チオレドキシン対照およびテンダミスタット対照が、温度を上昇させても吸光度の変化を示さなかったことは、融合タンパク質について観察された熱誘導凝集が、ＥＬＰ担体の逆転移に起因したことを示す。通常、融合タンパク質の逆転移は、また、遊離ＥＬＰの場合よりも若干広範囲にわたり、その濁度プロファイルにおいて、小さな高低の肩も観察された。
Ｕｒｒｙらによる研究において、鎖長の増大と共にＴｔの低下が観察され、ＦＰの逆転移に対するＥＬＰ ＭＷの効果もまた探索された。チオレドキシン−ＦＰセットのＴｔは、１２．６〜７１．０ｋＤａの範囲にあるＥＬＰ担体のＭＷの関数として決定された。高ＭＷ融合タンパク質のＴｔが、デザイン目標温度の４０℃（７１ｋＤａ ＥＬＰの場合で４２℃）であるのに対し、低ＭＷ融合体のＴｔは、著明に高温であった（例えば、１２．６ｋＤａ ＥＬＰの場合で７７℃）。
Ｔｔに影響を及ぼすＥＬＰ特異的変数（すなわち、ゲスト残基の組成およびＭＷ）に加え、溶媒、ＥＬＰ濃度、およびイオン強度の選択など複数の外因的因子により、所与のＥＬＰに対するＴｔをさらに調節することができる。特に、イオン強度の制御は、５０℃の範囲にわたってＴｔを調節し、これにより、所与のＥＬＰのＴｔを特定の適用に最適化する好適な方法を提供する。溶液の温度およびイオン強度の操作は、また、（１）所与のイオン強度におけるＴｔより高温に溶液温度を上昇させる、（２）イオン強度を等温的に上昇させて、Ｔｔを溶液温度未満に低下させる、（３）溶液温度およびイオン強度を同時に変化させるという複数の方法により、特定のＥＬＰに対して逆転移を誘導する際の実験的な柔軟性も提供する。
インスリン還元アッセイにより決定されたチオレドキシン／６０マーＦＰの比活性が、市販の大腸菌チオレドキシンの比活性と同一であった（結果は示さない）ことは、ＥＬＰが、Ｔｔ未満ではチオレドキシン活性に対して効果を及ぼさなかったことを示す。チオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット三元融合体の場合、α−アミラーゼ阻害アッセイは、チオレドキシン／９０マーＥＬＰ担体が、テンダミスタットのα−アミラーゼ阻害活性を２分の１に低下させる（結果は示さない）ことを示した。しかし、トロンビンによりチオレドキシン−ＥＬＰ担体からテンダミスタットを切断し精製した後において、精製されたテンダミスタットの活性は、ＩＭＡＣ法により独立に精製された組換えテンダミスタットと区別できなかった。
タンパク質精製への逆転移サイクリングの適用は、ＥＬＰの相転移が、標的タンパク質を変性させないことを必要とする。したがって、１．５Ｍ ＮａＣｌ中での熱サイクリングにおけるチオレドキシン／６０マーＥＬＰ融合体の凝集、再溶解、および機能活性をモニターした。１．５Ｍ ＮａＣｌは、実験に好適な温度である２４℃と３５℃との間の各熱サイクルにおいてＦＰが逆転移を経るよう、Ｔｔを単に低下させる（水中における６２℃から２７℃に）ために緩衝液に添加した。熱サイクリングの開始前において、２４℃の溶液温度は、チオレドキシン−ＦＰのＴｔ未満であり、タンパク質溶液は、検出可能な濁度を示さなかった。融合タンパク質のチオレドキシン活性をまずこの温度において調べることにより、ベースラインを確立した。温度を３５℃に上昇させると、融合タンパク質が凝集し、結果として濁度が上昇した（約２．０のＯＤ３５０）。温度を２４℃に低下させた後に溶液が完全に透明化したことは、融合タンパク質が再溶解されたことを示す。一定量を採取し、チオレドキシン活性について調べたところ、当初の値と同一であった。この熱サイクリング過程を２回繰り返した。各熱サイクル後の２４℃において活性の変化が観察されなかったことは、わずかな温度変化および結果として生じる凝集／再溶解が、タンパク質の安定性および機能に影響を及ぼさないことを確認した。加えて、凝集した融合タンパク質の再溶解および回収は、温度を２４℃に低下させた後において定量的かつ完全であった。
転移温度を上下に往復する条件（すなわち、ＮａＣｌ濃度および温度）において遠心分離を反復することにより達成される逆転移サイクリングにより、各融合タンパク質がＣ末端における３０マー、６０マー、９０マー、１２０マー、１５０マー、または１８０マーのＥＬＰタグを含有する６つのチオレドキシン−ＦＰ、およびチオレドキシン／９０マーＥＬＰ／テンダミスタット融合タンパク質を細胞溶解物から精製した。
精製前に、誘導した大腸菌を遠心分離により培地から回収し、低濃度塩緩衝液（通常はＰＢＳ）中に再溶解させ、超音波破壊により溶解させた。高速遠心分離により不溶性物質を除去した後、溶解物にポリエチレンイミンを添加してＤＮＡを沈殿させ、可溶性溶解物を得た。次いで、ＮａＣｌの添加および／または溶液温度の上昇により逆転移サイクリングを開始してＦＰの逆転移を誘導し、ＦＰの凝集の結果として溶液を混濁させた。凝集した融合タンパク質を、Ｔｔより高温における遠心分離により溶液から分離すると、遠心分離管の底部に半透明のペレットが形成された。混入大腸菌タンパク質を含有する上清は、除去および廃棄した。ペレットは、ＥＬＰのＴｔ未満の温度における低イオン強度緩衝液中で再溶解させ、低温で遠心分離して、残存する不溶性物質を除去した。さらなるラウンドの逆転移サイクリングを企図したが、１ラウンドの逆転移サイクリング後に、混入タンパク質レベルがＳＤＳ−ＰＡＧＥ法の検出限界未満となった。
チオレドキシン／ＥＬＰ融合タンパク質の各精製段階におけるチオレドキシン比活性の研究のほか、ＢＣＡアッセイにより推定される総タンパク質量の決定も、可溶性溶解物（１）中における総タンパク質量の約２０％が、逆転移による精製（３）の第１ラウンドにおいて沈殿することを示したので、残存する可溶性タンパク質は、除去および廃棄した（２）。上清中（その一部は、ネイティブな大腸菌チオレドキシンが寄与する）において測定した低度のチオレドキシン活性によって、この画分が混入宿主タンパク質を主に含有することが確認された。再溶解されたタンパク質のチオレドキシン比活性は、市販のチオレドキシン比活性に近く（データは示さない）、これは、１ラウンドの逆転移サイクリングが、完全な精製をもたらすことを確認した。精製の第２ラウンドは、チオレドキシン比活性の検出可能な上昇をもたらさなかった（データは示さない）。複数ラウンドの逆転移による精製後における総チオレドキシン活性が、細胞溶解物の比活性と実験的に区別できなかったことは、除去した上清中における標的タンパク質の消失が無視できることを示す。これらの結果は、チオレドキシン−ＦＰの高純度および高効率回収を確認し、チオレドキシンの機能活性が、複数ラウンドの逆転移サイクリングを経た後においても完全に保持されることをさらに示した。
チオレドキシン融合構築物のタンパク質収量は通常、培養物リットル当たりの精製融合タンパク質５０ミリグラムを超えた。融合タンパク質の重量による総収量は、ＥＬＰ長の増大と共に減少し、３０マー（ＭＷ＝１２．６ｋＤａ）では平均約７０ｍｇ／Ｌ、１８０マー（ＭＷ＝７１．０ｋＤａ）では平均約５０ｍｇ／Ｌであった。可溶性テンダミスタットの発現レベルは、そのチオレドキシンのみとの融合体（１０ｍｇ／Ｌのチオレドキシン−テンダミスタット融合体、４ｍｇ／Ｌのテンダミスタット）と比較して、チオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット三元融合体（４５ｍｇ／Ｌの三元融合体、または、７ｍｇ／Ｌのテンダミスタット）の場合の方がわずかに高かった。
本明細書において前述の通り、環境応答的なＥＬＰ配列に融合させた２つの組換えタンパク質である、チオレドキシンおよびテンダミスタットを発現させ、ＥＬＰ配列の逆転移を用いることにより、穏やかに、かつ１段階で、他の可溶性大腸菌タンパク質からこれらの融合タンパク質を分離した。チオレドキシンおよびテンダミスタットは、（１）標的タンパク質が、高レベルで過剰発現し、高い可溶性である（チオレドキシン）、および（２）該タンパク質が、大部分、不溶性封入体として発現される（テンダミスタット）という、可溶性タンパク質発現の２つの限界的なシナリオを例示するため、これらを標的タンパク質として選択した。しかし、この後者のクラスを代表するタンパク質は、逆転移サイクリングにより精製すべき可溶性タンパク質として、一定レベルの発現を示さなければならない。
チオレドキシンは、大腸菌における高レベルの可溶性タンパク質として発現し、したがって、ＥＬＰタグの可逆性可溶−不溶逆転移が融合タンパク質中でも保持されるかどうかを判定するのに好適な候補物質である。これに対し、テンダミスタットは、大部分、封入体中における不溶性タンパク質として発現するので、他の試験タンパク質として選択された。チオレドキシンとの融合は、標的タンパク質の可溶性発現を促進するが、過剰発現したチオレドキシン−テンダミスタット融合タンパク質の５〜１０％が、可溶性で機能的に活性なタンパク質として回収されたに過ぎない。
標的組換えタンパク質の熱誘導による相分離に用いられるＥＬＰポリペプチドタグは、哺乳動物のエラスチン中に見出されるポリペプチド反復に由来した。ＥＬＰの相転移が、逆転移サイクリングによるタンパク質精製の原理的な基礎であるため、転移温度を特定することが、ＥＬＰタグのデザインにおける主要な目標となる。
Ｕｒｒｙらによるかつての研究は、ポリペンタペプチドＶＰＧＸＧ配列中の第４残基（Ｘ）を、逆転移に有利な構造であるβターンの形成を排除することなく変更し得ることを示した。これらの研究は、また、Ｔｔが、ゲスト残基の疎水性の関数であることをも示した。したがって、ゲスト残基の同一特性およびそのモル画分を変化させることによって、０〜１００℃の範囲にわたって逆転移を示すＥＬＰコポリマーを合成し得る。これらの結果に基づき、ＥＬＰ担体が、培養時の大腸菌内では可溶性を保つが、細胞溶解後におけるわずかな温度上昇により凝集し得るよう、水中で約４０℃の予測Ｔｔをもたらすアミノ酸配列を選択した。
アミノ酸配列に加え、ＥＬＰ鎖長によってもＴｔは変化することが知られる。したがって、設計により、体系的に変化する分子量を有するＥＬＰライブラリーを合成し得るよう、遺伝子オリゴマー化の戦略による分子量の正確な制御を組み込んだ。高分子量ＥＬＰのＴｔは、目標温度に近づき、チオレドキシン／１８０マー融合体（ＰＢＳ中に２５μＭ）の場合、４２℃の実験観察Ｔｔを有した。しかし、Ｔｔは、ＭＷの減少と共に劇的に上昇した。低イオン強度緩衝液中において、低分子量ＥＬＰのＴｔは、タンパク質精製には高すぎ、その結果、Ｔｔを有用な温度に低下させるには高濃度のＮａＣｌを必要とする。ＥＬＰ鎖長は、また、タンパク質収量の点でも重要である。ＥＬＰ担体のＭＷが増大するにつれ、ＥＬＰ ＭＷの上昇と共に観察される発現融合タンパク質の総収量の減少に加え、ＥＬＰに対する標的タンパク質の重量百分率も低下する。したがって、精製用ＥＬＰタグのデザインは、ＥＬＰ配列中に疎水性ゲスト残基のより大きな画分を組み込むことにより、目標Ｔｔを４０℃付近に保持する一方で、ＥＬＰ分子量を最小化することにより標的タンパク質発現を最大化することが好ましい。
本明細書におけるチオレドキシン−ＥＬＰ融合体が、遊離ＥＬＰと比較してごくわずかなＴｔの上昇（１〜２℃）を示したのに対し、テンダミスタット−ＥＬＰ融合体は、１５℃というより劇的なＴｔの低下を示した。この変化が、三元構築物（チオレドキシン−ＥＬＰ−テンダミスタット）および二元構築物（ＥＬＰ−テンダミスタット）のいずれについても同一であったことは、Ｔｔの変化が、テンダミスタットと特異的に関連することを示した。これらの観察結果は、Ｔｔの低下が、ＥＬＰ鎖とテンダミスタット中の溶媒に曝露された疎水性領域との間の相互作用によるのに対し、高い可溶性のチオレドキシンの場合、これらの疎水性相互作用が無視できることを示唆した。Ｔｔのこの変化は、曝露される疎水性領域の無視できない画分を含有するタンパク質の逆転移による精製用のＥＬＰ担体のデザインに複雑性を付加したが、高い可溶性のタンパク質の場合、ＥＬＰタグとの融合において導入されるＴｔの摂動は、遊離ＥＬＰと比較してごくわずかである可能性が高い。
遺伝子合成およびＥＬＰタグのオリゴマー化には、標準的な分子生物学のプロトコールを用いた。１０マーのポリペンタペプチドであるＶＰＧＸＧ ＥＬＰ用の合成遺伝子は、サイズが８６〜９７塩基の範囲にある、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された４つの合成オリゴヌクレオチド（Integrated DNA Technologies社製）から構築した。オリゴヌクレオチドをアニールして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有するＥＬＰ遺伝子域にわたる２本鎖ＤＮＡを形成した。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより直鎖化し脱リン酸化したｐＵＣ−１９（ＮＥＢ社製）内に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。化学的にコンピテントな大腸菌細胞（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を、連結混合物により形質転換し、アンピシリン含有寒天プレート上でインキュベートした。コロニーは、まず、ブルーホワイトスクリーニング法により、次いで、コロニーＰＣＲ法によりスクリーニングし、挿入物の存在を検証した。推定挿入物のＤＮＡ配列は、ダイターミネーター法ＤＮＡシークェンシング（ＡＢＩ３７０型ＤＮＡシークエンサー）により検証した。
まず、１０マーＥＬＰ遺伝子を、同じ１０マーＥＬＰ遺伝子を含有するベクター内に連結することにより、２０マーＥＬＰ遺伝子を作製した。２０マー遺伝子をもとの１０マー遺伝子と同様に組み合わせることにより、３０マー遺伝子を形成させた。この組合せ過程を繰り返して、１０マーポリペンタペプチド〜１８０マーポリペンタペプチドの範囲のＥＬＰをコードする遺伝子ライブラリーを作製した。典型的なポリマー化またはオリゴマー化の場合、ベクターは、ＰｆｌＭＩにより直鎖化し、酵素的に脱リン酸化した。挿入物は、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩにより二重に消化し、アガロースゲル電気泳動法（Qiagen社製、Qiaex IIゲル抽出キット）により精製し、直鎖化したベクター内にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結し、化学的にコンピテントな大腸菌細胞内に形質転換した。形質転換細胞は、コロニーＰＣＲ法によりスクリーニングし、ＤＮＡシークェンシングによりさらに確認した。
チオレドキシン融合タンパク質用には、ｐＥＴ−３２ｂ発現ベクター（Novagen社製）を、ＳｆｉＩ制限部位と、チオレドキシン遺伝子の下流にある転写終止コドンとを含むように改変した。テンダミスタット三元融合体用には、チオレドキシン−テンダミスタット融合体用の遺伝子を含有する、既に構築したｐＥＴ−３２ａに基づくプラスミドを、トロンビン認識部位の上流または下流の２つの代替位置にＳｆｉＩ制限部位を含有するように改変した。次いで、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩでの消化により産生されたＥＬＰ遺伝子セグメントを、各改変発現ベクターのＳｆｉＩ部位内に連結した。クローニングは、コロニーＰＣＲ法およびＤＮＡシークェンシングにより確認した。
発現ベクターは、発現菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）（チオレドキシン融合体用）またはＢＬ２１−ｔｒｘＢ（ＤＥ３）（テンダミスタット融合体用）（Novagen社製）内に形質転換した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補った２倍希釈のＹＴ培地を有するシェーカーフラスコに形質転換した細胞を接種し、振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートし、イソプロピルα−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して１ｍＭの最終濃度とすることにより、０．８のＯＤ６００で誘導した。培養物をさらに３時間インキュベートし、４℃での遠心分離により回収し、低イオン強度緩衝液（培養物容量の約１／３０）中で再溶解させ、４℃での超音波破壊により溶解させた。溶解物は、４℃、約２０，０００×ｇで１５分間遠心分離して、不溶性物質を除去した。ポリエチレンイミンの添加（０．５％の最終濃度）により核酸を沈殿させた後、これを４℃、約２０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。次いで、細胞溶解物の可溶性画分および不溶性画分を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により特徴づけた。
（Ｈｉｓ）６タグを含有したチオレドキシン−ＥＬＰ融合体は、ニッケルキレート化したニトリロ三酢酸誘導体化樹脂（Novagen社製）を用いる固定化金属アフィニティ−クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）法か、あるいは、逆転移サイクリングにより精製した。テンダミスタット−ＥＬＰ融合体は、逆転移サイクリングのみによって精製した。逆転移サイクリングによる精製用に、細胞溶解物の温度を約４５℃まで上昇させることにより、かつ／または、ＮａＣｌを約２Ｍの濃度まで添加することによりＦＰを凝集させた。凝集した融合タンパク質は、３５〜４５℃、１０，０００×ｇ〜１５，０００×ｇで１５分間の遠心分離により溶液から分離した。上清を除去および廃棄し、融合タンパク質を含有するペレットは、低温で低イオン強度の緩衝液中に再溶解させた。次いで、再溶解されたペレットを４℃で遠心分離し、任意の残存する不溶性物質を除去した。
ＥＬＰ融合体溶液の３５０ｎｍにおける吸光度は、マルチセル熱電式温度制御装置を装備した、Ｃａｒｙ ３００型紫外可視光分光光度計において、４〜８０℃の範囲でモニターした。Ｔｔは、１．５℃分−１の速度での加熱または冷却時における温度の関数としての、ＦＰの凝集による３５０ｎｍにおける吸光度変化の中間点から決定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、不連続緩衝系を有する、プレキャストで勾配１０〜２０％のＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎゲル（BioRad社製）を用いた。融合タンパク質の濃度は、減衰係数の計算値を用いて、分光光度法により決定した。総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce社製）により決定した。チオレドキシン活性は、比色法インスリン還元アッセイにより決定した。テンダミスタット活性は、比色法α−アミラーゼ阻害アッセイ（Sigma社製）により決定した。
ＥＬＰ−ＧＦＰ融合タンパク質もまた合成し、ＥＬＰの９０マーおよび１８０マーを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体である青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）に、Ｎ末端融合またはＣ末端融合した。すべての融合ポリペプチドは、温度の関数としての濁度の紫外可視光分光光度法による測定によって特徴づけられた可逆性逆転移のほか、温度依存的な蛍光測定値も示した。ＧＦＰ−ＥＬＰ融合体およびＢＦＰ−ＥＬＰ融合体の逆転移を用いて、ＩＴＣによりこれらの融合タンパク質を均質まで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびクーマシー染色法により検証した。
標準的な分子生物学のプロトコールをさらに用いて、ＥＬＰ分子量の低いＥＬＰ遺伝子の合成およびポリマー化／オリゴマー化を行った（Ausubel, et al.）。本実施例では、２つのＥＬＰ配列のモノマー遺伝子を用いた。
第１のＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、Ｘａａが、それぞれ５：２：３の比率でＶａｌ、Ａｌａ、およびＧｌｙである、１０回のＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ反復（配列番号１３）をコードした。第２のモノマーであるＥＬＰ１［Ｖ−５］（配列番号１４）は、５回のＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙペンタペプチド（すなわち、Ｘａａは、Ｖａｌのみ）をコードした。ＥＬＰ１［Ｖ−５］モノマー遺伝子のコード配列は、５’−ＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＴＡＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧ ＧＴＧＴＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣ−３’（配列番号１５）であった。該モノマー遺伝子は、化学的に合成された５’リン酸化オリゴヌクレオチド（アイオワ州、コーラルビル、Integrated DNA Technologies社製）から構築され、ｐＵＣ１９に基づくクローニングベクター内に連結した。モノマー遺伝子合成についての詳細な説明は、他の箇所に示す。
ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］およびＥＬＰ１［Ｖ−５］の両ＥＬＰ配列のモノマー遺伝子共に、ＥＬＰ分子量が増大するライブラリーをコードするタンデム反復により、切れ目なくオリゴマー化された。「再帰的有向連結（recursive directional litigation)」と称する方法を用いる遺伝子オリゴマー化に関する詳細な説明は、他の箇所に示す。略述すると、ＥＬＰ遺伝子セグメント（最初はモノマー遺伝子であり、後のラウンドではモノマーの大型複合体）を、そのベクターに由来する制限消化により切断し、精製し、同じまたは異なるＥＬＰ遺伝子セグメントを含有する第２のクローニングベクター内に連結し、これによって、２つの遺伝子セグメントを連鎖させた。この過程は再帰的に反復することができ、ラウンドごとに遺伝子長を倍増させる。
本明細書では、ｋが特定のタイプのＥＬＰ反復単位を示し、角括弧内の大文字が一文字式のアミノ酸コードであり、その対応する添え字が反復単位中の各ゲスト残基Ｘの相対比率を示し、ｎがペンタペプチド反復回数により総ＥＬＰ長を記載する、ＥＬＰｋ［ＸｉＹｊ−ｎ］表記法を用いて、異なるＥＬＰ構築物を区別する。本実施例にとって中心的な２つのＥＬＰ構築物は、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］（３５．９ｋＤａ）（配列番号１６）およびＥＬＰ１［Ｖ−２０］（９．０ｋＤａ）（配列番号１７）である。
チオレドキシン融合タンパク質を産生するため、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］およびＥＬＰ１［Ｖ−２０］をコードする遺伝子を、その各クローニングベクターから切断し、チオレドキシン遺伝子、（Ｈｉｓ）６タグ、およびトロンビンプロテアーゼ切断部位に対して３’側に位置する固有のＳｆｉＩ部位を導入するよう既に改変しておいたｐＥＴ−３２ｂ発現ベクター（ウィスコンシン州、マジソン、Novagen社製）内に個別に連結した。ＥＬＰタグを有さない遊離チオレドキシン（「チオレドキシン（Ｈｉｓ６）」）をコードする改変ｐＥＴ−３２ｂベクターと、各融合タンパク質（「チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］」および「チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］」）をコードする２つの発現ベクターとを、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）菌株（Novagen社製）内に形質転換した。
タンパク質発現レベルおよび精製収量の定量的な比較のため、３つの構築物各々を発現させ、並行して精製した。各試料（チオレドキシン（Ｈｉｓ６）、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の各々につき４つずつの試料）につき、２ｍｌずつの出発培地（カリフォルニア州、カールスバード、Qbiogene社製、CircleGrow培地、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足）に、新たに画線培養した寒天プレート上の１つのコロニーから採取したスタブを接種し、３００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。次いで、培地からβ−ラクタマーゼを除去するため、５００μｌの一晩おいたコンフルエント培地から、遠心分離（４℃、２０００×ｇ、１５分間）により細胞をペレット化し、新鮮な培地洗浄液中に再懸濁させ、再ペレット化した。新鮮な培地中における２回目の再懸濁後、該細胞を用いて、２５０ｍｌフラスコ内における５０ｍｌの発現培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するCircleGrow培地）に接種した。
培地フラスコは、３００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。増殖は、６００ｎｍにおける光学濃度によりモニターし、イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して１ｍＭの最終濃度とすることにより、ＯＤ６００＝１．０でタンパク質発現を誘導した。さらに３時間の培養後、遠心分離（４℃、２０００×ｇ、１５分間）により４０ｍｌから細胞を回収し、チオレドキシン（Ｈｉｓ６）の場合は２ｍｌのＩＭＡＣ結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）中、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の場合はＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中に再懸濁させ、精製されるまで−２０℃で凍結させ保存する。回収時の培地密度は、新鮮な緩衝液中における１：１０の希釈後に、ＯＤ６００において測定した。回収時のプラスミドＤＮＡ量は、紫外可視光分光光度法の後、プラスミド単離法（カリフォルニア州、バレンシア、Qiagen社製、プラスミドminiprepスピンキット）により定量した。
チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質のＩＴＣによる精製に対する対照として、標準的なＩＭＡＣプロトコールを用いて、遊離チオレドキシンを精製した。略述すると、解凍した細胞を氷冷した１５ｍｌの遠心分離管に移し、超音波破壊（マイクロチップを用いるFisher Scientific社製５５０型Sonic Dismembrator）により溶解させた。１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管に移した後、大腸菌溶解物を遠心分離（４℃、１６，０００×ｇ、３０分間）して、不溶性細胞破砕物を除去した。５ｍｌの５０ｍＭ ＮｉＳＯ４で満たした１ｍｌのニトリロ三酢酸樹脂ベッドを充填したカラムへの重力流により、１ｍｌの可溶性細胞溶解物を投入した。
１５ｍｌのＩＭＡＣ結合緩衝液によるカラムの洗浄後、２５０ｍＭイミダゾールを補足した６ｍｌのＩＭＡＣ結合緩衝液中にチオレドキシン（Ｈｉｓ６）を溶出させた。イミダゾールは、３，５００ ＭＷＣＯ膜を用いる低濃度塩緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に対する一晩の透析により、溶出液から除去した。ＩＭＡＣ法による精製は、不連続緩衝系を有する、プレキャストで勾配１０〜２０％のゲル（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、BioRad社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターした。
精製されたチオレドキシン（Ｈｉｓ６）の収量は、Ｃ末端タグに存在する単独のＴｒｐ残基による吸収を含むよう改変したチオレドキシンのモル減衰係数（ＥＬＰ分子量に依存せず、チオレドキシン（Ｈｉｓ６）およびすべてのチオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質について、ε２８０＝１９８７０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて、分光光度法により決定した。
ＩＴＣによる典型的な精製では、解凍した細胞を氷冷した１５ｍｌの遠心分離管に移し、超音波破壊（マイクロチップによるFisher Scientific社製５５０型Sonic Dismembrator）により溶解させた。１．５ｍｌのマイクロ遠心分離管に移した後、大腸菌溶解物を４℃で３０分間遠心分離して、不溶性細胞破砕物を除去した（ＩＴＣによる精製時におけるすべての遠心分離工程は、Eppendorf社製５４１５Ｃ型マイクロ遠心分離機により、１６，０００×ｇで実施した）。
細胞溶解物の除去後上清にポリエチレンイミンを添加（０．５％ ｗ／ｗ）して核酸を沈殿させ、さらに４℃で２０分間の遠心分離によりこれを除去した。上清を保持し、ＮａＣｌ濃度を１．３Ｍまで上昇させることによりＥＬＰ相転移を誘導した。凝集した融合タンパク質は、３３℃で５分間にわたる遠心分離により溶液から分離し、これが、遠心分離管底部における半透明ペレットの形成をもたらした。
上清を除去および廃棄し、融合タンパク質を含有するペレットは、４℃で等量のＰＢＳ中に再溶解させた。残存する任意の不溶性物質は、４℃で１５分間にわたる最終遠心分離工程により除去し、精製された融合タンパク質を含有する上清を保持した。ＩＭＡＣ法による精製について上述した通り、融合タンパク質精製の進行は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターし、タンパク質濃度は、分光光度法により決定した。
チオレドキシンとＥＬＰタグとの間に位置する認識部位において融合タンパク質を切断するトロンビンプロテアーゼ（Novagen社製）を用いて、チオレドキシンをそのＥＬＰ融合パートナーから分離した。通常は約１００μＭの濃度である融合タンパク質μモル当たり約１０単位のトロンビンを用いるＰＢＳ中において、室温で一晩にわたりトロンビンによるタンパク質分解反応を進行させた。次いで、今度は、生成物であるチオレドキシンを含有する上清を保持する、さらに１ラウンドのＩＴＣにより、切断されたチオレドキシンから遊離ＥＬＰを分離した。
臨界点を超える温度の上昇は、ＥＬＰ凝集のために、約２℃の範囲にわたる濁度の急激な上昇をもたらし最大値（約２．０のＯＤ３５０）に至るという事実を利用して、温度の関数としての溶液濁度を光度法的に測定することによりモニターすることができる。最大濁度の５０％時の温度であるＴｂは、凝集過程を定量的にモニターするのに好適なパラメータである。
チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質の温度依存的な凝集挙動は、温度の関数としての３５０ｎｍにおける光学濃度を測定することにより特徴づけられた。タンパク質精製時における大腸菌溶解物中に見出される場合に典型的な濃度（チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の場合が１６０μＭで、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の場合が４０μＭ）での融合タンパク質を、熱電式温度制御マルチセルホルダーを装備したＣａｒｙ Ｂｉｏ−３００紫外可視光分光光度計（カリフォルニア州、ウォルトナットクリーク、Varian Instruments社製）内において、１℃分−１の一定速度で加熱または冷却した。実験は、追加のＮａＣｌを各濃度で補足したＰＢＳ中で実施した。ＥＬＰ Ｔｔは、光学濃度が、３５０ｎｍにおける最大光学濃度の５％に達した時の温度として定義した。
動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いて、温度およびＮａＣｌ濃度の関数としてのチオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質の粒子サイズ分布をモニターした。試料は、上記の濁度測定において用いたタンパク質および溶媒の組成を反映するよう調製し、４℃および１６，０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離して、気泡および不溶性破砕物を除去した。粒子サイズ測定の前に、Ｔｔ未満の温度で、２０ｎｍのＷｈａｔｍａｎ社製Ａｎｏｄｉｓｃフィルターにより、試料を濾過した。
Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御ユニットを装備したＤｙｎａＰｒｏ−ＬＳＲ動的光散乱測定器（バージニア州、シャーロットビル、Protein Solutions社製）を用いて、自己相関関数を採集した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｓｉｏｎｓ社製のＤｙｎａｍｉｃｓソフトウェアバージョン５．２６．３７の球形粒子用の正則化解析（regularization analysis）を用いて、解析を行った。溶液を２０℃〜６０℃に熱しながら、規則的な温度間隔（１℃または２℃）で光散乱データを採集した。セルを対象温度まで上昇させ、少なくとも１分間にわたり試料温度を平衡させ、各測定値に５秒間の採集時間を伴う１０個の測定値を採集することにより、各温度においてデータを採集した。
溶液中における各チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質の逆転移は、温度の関数としての３５０ｎｍにおける光学濃度をモニターすることにより特徴づけた。ＩＴＣによる精製時において異なるＮａＣｌ溶液を通常用いてＴｔを低下させる、または、逆転移を等温的に開始させるので、ＰＢＳ中、ならびに追加の１Ｍ、２Ｍ、および３Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中における、４０μＭチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］および１６０μＭチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］について濁度プロファイルを得た。
チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質溶液について、温度の関数としての３５０ｎｍにおける光学濃度を評価した。１℃分−１の速度で加熱しながら、ＰＢＳ中、ならびに追加の１Ｍ、２Ｍ、および３Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中における、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］（実線）およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］（破線）について濁度プロファイルを得た。４種類の各ＰＢＳ溶液中におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の濃度は４０μＭ、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の同濃度は１６０μＭであり、ＩＴＣによる精製時における可溶性細胞溶解物中の各タンパク質の典型的な濃度と符合した。すべての溶液は、Ｔｔを経て加熱するとき濁度の急速な上昇を示したが、Ｔｔを超えて熱し続けたところ、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］溶液が濁度を最終的に低下させるのに対し、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］溶液は一貫して濁度を保持した。チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］のすべての溶液は、Ｔｔ未満に冷やすと、完全に透明化した。しかし、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］溶液が、約５５℃より高温に加熱しない場合に限り可逆的に透明化したことは、チオレドキシン融合タンパク質の熱変性が、この温度より高温で生じたことを示唆する。
タンパク質濃度は、ＩＴＣによる精製時においてＥＬＰ逆転移が初めて誘導される段階である、大腸菌溶解物の可溶性画分における各融合タンパク質について得られる濃度に典型的な濃度として選択した。１Ｍおよび２ＭのＮａＣｌを補足した大腸菌の可溶性細胞溶解物において直接に得られた濁度プロファイルは、前出の段落において述べたチオレドキシン融合タンパク質について決定された、対応するプロファイルと区別できなかった。（ＥＬＰ融合タンパク質の凝集から生じる濁度とは区別し得ない、大腸菌タンパク質の熱変性から生じる濁度の可能性のため、大腸菌溶解物では、通常の濁度プロファイルが得られなかった。）濁度プロファイルは、また、下記のＩＴＣによる精製について用いられる条件と符合する、１．３Ｍの塩を有するＰＢＳ中における各融合タンパク質についても得られた。
ＩＴＣによる精製において用いられる溶液条件に対する加熱および冷却の濁度プロファイルは、発現および精製の定量的な比較に用いられるＩＴＣ条件に対応する、１．３Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中の溶解物タンパク質濃度におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］溶液（実線）およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］溶液（破線）について決定した。これらの条件は、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］溶液の最大濁度が、３３℃の遠心分離温度において生じるよう選択した。溶液は、１℃分−１で加熱および冷却した。加熱曲線と冷却曲線との間に観察されたわずかな経路差は、Ｔｔより高温における凝集物の経時的に緩慢な沈殿、および、溶液がＴｔ未満に冷却されるときの凝集に対する脱凝集のより緩慢な反応速度に主に起因した。
チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の熱誘導凝集挙動は、遊離ＥＬＰの場合と同様であった。チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］溶液の温度を上昇させたところ、４種類の塩濃縮物はすべて、濁度が急激に上昇する点であるＥＬＰ Ｔｔに達するまでは透明を保った。これは、それぞれ、０、１、２、および３ＭのＮａＣｌを添加したＰＢＳ中の５１、３１、１５、および４℃において生じた。遊離チオレドキシン対照溶液が、この温度範囲にわたる温度上昇により濁度変化を示さなかったことは、観察された熱誘導凝集が、ＥＬＰタグの逆転移に起因したことを示す（結果は示さない）。Ｔｔを超えてさらにこれらの溶液を加熱しても、濁度レベルは基本的に一定であり、経時的な凝集物の沈殿によりわずかに低下するのみであった。Ｔｔ未満まで冷却すると、凝集物が再溶解され、光学濃度がゼロに戻ったことは、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］融合タンパク質の逆転移が、完全に可逆的であったことを示す。ＮａＣｌ濃度を上昇させるとＴｔが著明に低下する一方で、塩は、最大光学濃度、濁度プロファイルの全般的な形状、または、凝集の可逆性に対して測定可能な影響を及ぼさない。
これに対して、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の相転移挙動は、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］融合タンパク質および遊離ＥＬＰの場合よりもはるかに複雑であった。Ｔｔ（それぞれ、１、２、および３ＭのＮａＣｌを補足したＰＢＳ中において３３、１７、および４℃）における濁度の最初の急速な上昇は、他のＥＬＰ構築物と同様であったが、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の各溶液について観察される最大濁度は、塩濃度の上昇と共に上昇した。さらに、Ｔｔを超えての温度の上昇は、最終的に濁度の著明な低下をもたらした。この低下は可逆的であり、濁度が低下する点まで加熱した後に溶液を冷却した場合、濁度は再び上昇した。透明化現象は、温度の可逆的関数であるため、Ｔｔにおける最初のＥＬＰ凝集事象の後に、温度の上昇と共に、熱力学的に駆動される第２の分子再配置が生じると結論された。
チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］濁度プロファイルに固有の別な特徴は、チオレドキシンの不可逆性熱変性から生じる凝集に起因している可能性がある、約５５℃で開始する濃度の第２の上昇であった。５５℃未満に加熱される試料が、Ｔｔ未満に冷却されると可逆的に透明化したのに対し、塩濃度が１Ｍ以上の場合、５５℃より高温に加熱される試料は、Ｔｔ未満に冷却されても混濁を保った（図示しない）。遊離チオレドキシン溶液、およびより大型のＥＬＰへのその融合タンパク質溶液は、はるかに高温まで安定であったので、この現象は、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］融合タンパク質に固有であると思われる（結果は示さない）。６０℃未満のＰＢＳ中におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］には逆転移が観察されなかったが、塩を添加したところ、ＰＢＳ＋１、２、および３ＭのＮａＣｌ溶液における変性温度未満で逆転移が生じるようＴｔが低下した。
温度の関数としてのＤＬＳを用いて融合タンパク質粒子のサイズを測定し、ＰＢＳ、ＰＢＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ、およびＰＢＳ＋２Ｍ ＮａＣｌ中における４０μＭチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の粒子サイズ分布（水和半径、Ｒｈ）に対する温度および塩の影響を判定した。ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＣｌを添加したＰＢＳ、および２Ｍ ＮａＣｌを添加したＰＢＳ中におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］粒子のサイズは、Ｔｔにおける濁度の急激な上昇が、５．９±３．９ｎｍの流体力学半径（Ｒｈ）を有するモノマーの、１８０±６２ｎｍのＲｈを有する凝集物への転換から生じることを示した。これらの凝集物は、転移開始を約６℃上回る温度において、２．２±３．８μｍの安定的なＲｈに達するまで、温度と共に成長した。ＴｔはＮａＣｌの添加により低下したが、モノマーおよび完全に形成された凝集物いずれのサイズも、（Ｔｔに近接する範囲の外において）塩濃度または温度によってさほど影響を受けなかったことから、逆転Ｔｔより高温おける定常状態濁度の根拠が与えられる。大型の凝集物形成の開始時における温度は、対応する溶液条件に対する濁度測定により決定されるＴｔと厳密に符合した。
検討された各塩濃度に対して、各粒子型に帰属する散乱強度の、対応する定量分析も行った。所与の温度範囲にわたり２つ以上の相が共存する場合、これらのデータは、相対的な粒子集団の変化を示す。粒子集団に帰属する該強度は、集団の質量と直線的に相関せず、複合粒子の相対質量の計算が、逆相転移に伴う可能性が高い充填密度の変化により複雑化したことに注目すべきである。ＥＬＰおよびＥＬＰ融合タンパク質の充填密度に対して、温度がどのように影響を及ぼすかについてのより詳細な理解なしに、各粒子型に帰属する質量の妥当な推定を行うことは不可能であった。これらの定量的な限界を踏まえるにもかかわらず、このデータは、モノマーの消失により、凝集物に帰属する散乱光の量がＴｔにおいて劇的に増大することを示した。
データは、また、同定されない小粒子（高度に可変的であるが、見かけのＲｈ＝１７±３１ｎｍ）、および、２μｍの凝集物と共存する極めて大型の凝集物（見かけのＲｈ＝７４±５５μｍ）両者の偶発的な存在も反映した。小粒子が、凝集物懸濁液の真の成分である可能性は低く、むしろ、その存在は、自己相関関数におけるノイズから生じる、正則化アルゴリズムにおけるアーチファクトを反映する。分析アーチファクトとしての評価は、小粒子の高度に可変的なサイズ、および、転移よりも高温においてはふさわしくないその存在により裏付けられる。同様に、その見かけのサイズがＤＬＳ測定器により識別できるよりもはるかに大きいため、データ解析から予測される極めて大型の凝集物が、懸濁液中における真の粒子種を代表した可能性も低い。むしろ、この粒子種に帰属する散乱は、より小型の粒子からなるネットワークの統合的で緩慢な動きから生じ得る。
チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］と異なり、より小型のチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］融合タンパク質は、そのより複雑な濁度プロファイルと符合する、より複雑な温度依存的粒子サイズ分布を示した。
ＰＢＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ、およびＰＢＳ＋２Ｍ ＮａＣｌ中におけるＥＬＰ１［Ｖ−２０］の粒子サイズ分布に対する温度の影響を調べた。温度がＴｔを超えて上昇した場合の濁度の消失は、大型の凝集物から新規のより小型の粒子（Ｒｈ＝１２ｎｍ）への質量の移動と符合する。
粒子Ｒｈの分布に対する塩および温度の影響、ならびに、１Ｍおよび２ＭのＮａＣｌを添加したＰＢＳ中における１６０μＭチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の散乱強度に対する各粒子集団の対応する寄与についても調べた。１Ｍの塩を添加したチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の場合、Ｔｔにおける濁度の急速な上昇に先立つ小さな肩に対応して、５．９±５．１ｎｍのＲｈを有するモノマーが、３０℃において１４０±７９ｎｍのＲｈを有する凝集物に転換された。３０℃より高温では、凝集物が温度の上昇と共に成長し（４０℃におけるＲｈ＝１．５±０．９８μｍまで）、これは、３３℃から観察された濁度の急速な上昇と符合した。大型融合タンパク質の凝集挙動と同様に、４０℃よりも高温において、１Ｍ ＮａＣｌを添加したＰＢＳ中におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、より小型の粒子からなるネットワークの統合的で緩慢な動きを反映し得る、極めて大型の凝集物（見かけのＲｈ＝６４±６７μｍ）の存在を示した。
しかし、より大型の融合タンパク質と異なり、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、また、４０℃より高温ではかつて観察されなかった小型粒子の一貫した存在も示した。この粒子は、モノマーＲｈの約２倍である、１２±４．９ｎｍのＲｈを有した。しかし、その平均Ｒｈと比較して、そのばらつきは、モノマーの場合の半分に過ぎなかった。４０℃より高温におけるこの粒子のサイズ、一貫性、および持続的な存在は、自己相関関数におけるノイズから生じる分析アーチファクトでもなく、再溶媒和したモノマーでもないことを示した。１２ｎｍの粒子が存在するとき、より大型の凝集物（Ｒｈ＝２００±２１０ｎｍ）のサイズが減少し散乱強度が低下することにより裏付けられる通り、１２ｎｍの粒子は、Ｔｔより高温において当初存在する凝集物における質量の消失により形成されると思われた。
ＮａＣｌ濃度が２Ｍまで上昇した場合にも、同様の１２ｎｍ粒子が観察された。このＮａＣｌ濃度では、濁度測定により決定される通り、Ｔｔは１７度まで低下した。この温度範囲は、試料キュベットにおける水蒸気凝結により下限が定められた。したがって、２０℃と３０℃との間において、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、２．４±１．７μｍの平均Ｒｈを有する安定的な凝集物に既に転移していた。約３６℃を超えて試料を加熱したところ、凝集物のＲｈは２３０±１７０ｎｍにまで徐々に減少し、１２ｎｍの粒子（Ｒｈ＝１２±４．７ｎｍ）が出現した。１２ｎｍ粒子に帰属する散乱光の百分率もまた、より大型の凝集物の縮小により徐々に増大した。
チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］は、各々、溶解された大腸菌培養物の可溶性画分からＩＴＣにより精製し、チオレドキシン（Ｈｉｓ６）は、ＥＬＰタグを有さない対照として、ＩＭＡＣ法により精製した。逆転移は、１．３Ｍ ＮａＣｌの添加により誘導し、３３℃で遠心分離を実施した。ＩＴＣにより融合タンパク質を均質にまで精製するのに小型のＥＬＰ１［Ｖ−２０］タグを用いることが成功し、従来のアフィニティ−クロマトグラフィー法により精製された遊離チオレドキシンの場合と同様の収量および純度が得られた。
ＥＬＰタグは、クーマシー法により染色されず、したがって、融合タンパク質のチオレドキシン部分のみが、染色されたゲル中において可視的であったことに注目されたい。チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］についての、可溶性細胞溶解物中における発現レベルの定性的な比較は、ＥＬＰタグのサイズを３６ｋＤａから９ｋＤａに縮小することにより、チオレドキシンの発現収量が大幅に向上することを明確に示した。さらに、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、遊離チオレドキシンの場合と定性的に同等なレベルまで発現した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析もまた、任意の標的タンパク質について、細胞溶解物の不溶性画分に検出可能な消失は見られないことを示した（結果は示さない）。
ＩＴＣによる精製では、１．３Ｍの追加ＮａＣｌを添加し、約３３℃より高温に溶液温度を上昇させることにより、ＥＬＰの相転移が開始された。細胞溶解物は、チオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質の凝集の結果として混濁し、次いで、これが、約３３℃における遠心分離により溶液から分離され、遠心分離管底部における半透明ペレットを形成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、最も混入的な大腸菌タンパク質が、除去された上清中に保持されることを示した。ペレットは、約４℃のＰＢＳ中に溶解させ、低温（約１２℃）で遠心分離して、任意の残存する不溶性物質を除去した。精製されたチオレドキシン−ＥＬＰ融合タンパク質を含む上清を保持した。最後に、チオレドキシンとＥＬＰタグとの間に位置するコードされた認識部位における、各融合タンパク質のトロンビンによる切断に続き、ＩＴＣの第２ラウンドによりＥＬＰタグを溶液から除去した後に、精製された遊離チオレドキシンを得た。ここで、トロンビンは、（クーマシー染色法の検出限界未満ながら）上清中の標的チオレドキシンと共に保持されたが、遊離ＥＬＰと共に切断後に除去されるトロンビン−ＥＬＰ融合体を作製することができた。
クーマシー染色法により確認される通り、これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法の結果は、より短い９ｋＤａのＥＬＰ１［Ｖ−２０］を用いて、ＩＴＣによりチオレドキシンを均質にまで精製し得ることを明確に示した。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により定性的に確認される通り、これらの条件下における２つのＥＬＰ融合タンパク質の精製効率には差が観察された。ＩＴＣによる可溶性細胞溶解物からのチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の回収が基本的に完全であったのに対し、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の小型だが無視できない画分は、除去される上清中にとどまった。ＩＭＡＣ法による精製では、カラムのフロースルー中に標的タンパク質の検出可能な消失が認められなかったが、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］タグでは、ＩＴＣにより得られる純度レベルが、遊離チオレドキシンのＩＭＡＣ法での精製により得られる場合と同等かそれ以上に良好であった。
紫外可視光分光光度法を用いて、ＩＴＣまたはＩＭＡＣ法での精製により回収される各タンパク質の収量を定量した。これらのデータは、精製後に回収されたタンパク質量を記したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による結果は、この量が、可溶性溶解物における発現収量にほぼ等しいことを示唆した。この解析のため、３つのタンパク質構築物の各々について、同一の条件下で、４つずつの培養物を並行して培養した。実験上の便宜のため、５０ｍｌの培養物についてこれらのデータを得、培養物リットル当たりの収量に外挿した。個別の１リットル培養物の精製は、実際の収量が、外挿された値とほぼ符合することを確認した（データは示さない）。
５０ｍｌ試験培養物からのチオレドキシン（Ｈｉｓ６）、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］、およびチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の総収量を決定し、培養物リットル当たりのミリグラム数に外挿した（平均±ＳＤ、ｎ＝４）。融合タンパク質の各質量画分を用いて計算される、収量に対するＥＬＰタグおよびチオレドキシンの個別の寄与も、比較のために決定された。他のすべての実験条件が同一である場合、ＥＬＰタグを３６ｋＤａ（チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］）から９ｋＤａ（チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］）に短縮すると、標的チオレドキシンの収量がほぼ４倍増加した。
データは、ＥＬＰタグの分子量を縮小すると、チオレドキシンの収量を劇的に増加させ得ることを示した。大腸菌培養物に対する同一の実験条件下において、ＥＬＰタグサイズを、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］における３６ｋＤａからチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］における９ｋＤａに縮小すると、融合タンパク質の収量が７０％増大した（それぞれ、８２±１２ｍｇ／Ｌ対１３７±２１ｍｇ／Ｌ；Ｐ＜０．００５、対応のないｔ検定）。さらに、ＥＬＰタグのサイズを縮小すると、融合タンパク質中におけるその質量画分が低下したので、標的タンパク質であるチオレドキシン（すなわち、トロンビン切断部位において融合タンパク質から分離される場合）は、融合タンパク質収量においてより大きな質量画分を占めた。こうして、チオレドキシン収量は、より小型のタグを用いたところ、３６５％増大した（大型および小型のタグに対して、それぞれ、２３±３．３ｍｇ／Ｌ対８３±１２ｍｇ／Ｌ；Ｐ＜０．０００１）。９ｋＤａタグを用いてＩＴＣにより得られたこのチオレドキシン収量は、ＥＬＰタグを用いずに発現し、ＩＭＡＣ法により精製されたチオレドキシンについて得られた収量（９３±１３ｍｇ／Ｌ；Ｐ＞０．２５）と統計学的に区別できなかった。
チオレドキシンの相対収量が、細胞溶解物中で観察される発現レベルと相関したので、これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による結果を裏付けた。ＥＬＰタグの収量は、いずれの融合タンパク質についても同等であった（チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］について５９±８．６ｍｇ／Ｌ、および、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］について５４±８．１ｍｇ／Ｌ；Ｐ＞０．４）。これは、チオレドキシン融合タンパク質中におけるＥＬＰタグの重量による収量が、２４〜７２ｋＤａの範囲のＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチドファミリー内におけるＥＬＰ分子量に対して基本的に一定であるというかつての観察と符合した。
精製効率とＩＴＣにおける溶液条件との間の関係を裏付けるため、塩濃度と遠心分離温度との異なる組合せを用いて、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］融合タンパク質のＩＴＣによる精製を繰り返した。
ＮａＣｌ濃度および遠心分離温度がＩＴＣによるチオレドキシン−ＥＬＰ［Ｖ−２０］の精製に及ぼす影響について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した（ＳＬ＝可溶性細胞溶解物；Ｓ＝融合タンパク質の逆転移、および、遠心分離による凝集した標的タンパク質の除去後における上清；ならびにＰ＝ＰＢＳ中での溶解後において、精製された融合タンパク質を含有する再溶解ペレット）。各精製に対するＮａＣｌモル濃度および遠心分離温度に注目した。各場合において高レベルの純度が達成されたが、適切なＮａＣｌ濃度および遠心分離温度が、完全な精製効率を達成するのに極めて重要である。
１Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳを４９℃における遠心分離と組み合わせて、ＩＴＣによる精製に用いたところ、標的融合タンパク質の大部分は、除去される上清中に消失した。ＰＢＳに２Ｍ ＮａＣｌを加えて３３℃の遠心分離温度を用いたところ、標的タンパク質の半分超が、遠心分離により捕獲された。最後に３Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳおよび１２℃における遠心分離を用いたところ、標的タンパク質の極めて大部分が精製に成功した。これらの例の各々において、標的タンパク質は均質まで精製されたが、これらの結果は、塩濃度および温度の選択が、ＩＴＣによる精製の効率に影響を及ぼす重要な因子であることを示した。
本実施例の目的は、かつて報告した場合と比較してサイズが縮小される、ＩＴＣによる精製用のＥＬＰタグを産生し、発現レベルおよび精製効率に対するこの縮小の影響を特徴づけることであった。かつての試みにおいて、第１世代のＥＬＰ精製タグは、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］モノマー配列に基づいて開発された。この配列を再帰的にオリゴマー化して、４ｋＤａ（ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］）〜７１ｋＤａ（ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］）の範囲の分子量を有するＥＬＰをコードする合成遺伝子ライブラリーを作製した。この特定のゲスト残基組成は、Urry et al.のかつての研究に基づいて選択し、この組成を有するＥＬＰは、水中において約１００ｋＤａの分子量に対して約４０℃のＴｔを示すことが予測された。融合タンパク質が、３７℃での培養時に可溶性であり続けるが、塩濃度または溶液温度のわずかな上昇によるＥＬＰ相転移を介して可逆性凝集を誘導し得るよう、４０℃のＴｔを目標とした。
より分子量の高い構築物のＴｔは、４０℃に近かった（２５μＭのＰＢＳ中において、ＭＷＥＬＰ＝７１ｋＤａを有するチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］の場合、Ｔｔ＝４２℃）が、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］融合タンパク質のＴｔは、分子量を低下させると劇的に上昇した（同じ条件下において、ＭＷＥＬＰ＝１３ｋＤａを有するチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−３０］の場合、Ｔｔ＝７７℃）。低分子量ＥＬＰの高Ｔｔは、そのＴｔを有用な温度（例えば、２０〜４０℃）に低下させるのに、極めて高濃度のＮａＣｌ（＞３Ｍ）の添加を必要とし、このことが、標的タンパク質の塩誘導変性の可能性のために、これらをＩＴＣによる精製用に一般的に用いることを不可能とした。より大型のＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］ポリペプチドが、チオレドキシンおよび第２のモデル標的タンパク質であるテンダミスタットの精製に用いることに成功したが、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］鎖長が長くなると共に、融合タンパク質の収量が著明に減少することが観察された。
これらの観察結果は、より低分子量のＥＬＰタグが、より適度なＮａＣｌ濃度で４０℃に近いＴｔを示すよう、上記の実験におけるＥＬＰ発現タグの再デザインにより、そのＴｔも低下させながら、ＥＬＰ発現タグのサイズを縮小することを動機づけた。本研究のために新たに合成された第２のモノマー遺伝子は、４番目のゲスト残基がＶａｌに限る、５回のペンタマーＥＬＰ配列（ＥＬＰ１［Ｖ−５］）をコードした。ＥＬＰ１［Ｖ］に存在するＶａｌは、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］に存在するＡｌａおよびＧｌｙよりも疎水性であるので、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ］融合タンパク質は、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］融合体よりも低いＥＬＰ分子量で４０℃のＴｔを有すると予測された。
ＥＬＰ１［Ｖ−２０］配列（ＥＬＰ１［Ｖ−５］遺伝子の４回のタンデム反復）は、適度（１Ｍ）のＮａＣｌを有する溶解物タンパク質濃度において、４０℃に近いそのＴｔが実験的に観察されているため、ＩＴＣによる精製におけるさらなる特徴づけのために、ＥＬＰ１［Ｖ−５］オリゴマーライブラリーから選択された。本実施例では、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］構築物（ＭＷＥＬＰ＝９ｋＤａ）、および、かつて記載されたチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］構築物（ＭＷＥＬＰ＝３６ｋＤａ）の２つの融合タンパク質が、各ＮａＣｌ濃度に対する溶解物条件において極めて類似するＴｔを有したので、これらを比較した。すなわち、これらは、ＩＴＣによる精製タグ用に所望の上述されたＴｔ特性を満たす２つのライブラリーの各々に由来する熱的類似体である。
かつての観察結果は、ＥＬＰサイズを縮小すると、融合タンパク質全体の発現レベルを高める可能性が高いことを示唆したが、タグサイズの縮小が、ＩＴＣによるＥＬＰ融合タンパク質の精製に有害な影響を及ぼすか否か、先験的には明らかでなかった。したがって、標的タンパク質の発現レベルに対するその影響に加えて、ＩＴＣによる精製後における標的タンパク質の精製効率（すなわち、回収度）および純度に対するＥＬＰタグ長の影響を探索した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法および分光光度法による結果は、ＥＬＰ分子量を３６ｋＤａから９ｋＤａに低下させると、融合タンパク質の発現が４倍近く増強され、逆転移を誘導するのに用いられる任意の溶液条件（すなわち、ＮａＣｌ濃度および温度）下における最終タンパク質の純度に有害な影響を及ぼさないことを示した。ＥＬＰ［Ｖ−２０］タグによる発現レベルが、遊離チオレドキシンの場合と同等であることは、ＥＬＰタグのさらなる短縮が、チオレドキシン収量を増大させることはないと予測されることを示す。
ＥＬＰタグ長が短縮されるのに応じて観察されるチオレドキシン収量の増大に対する可能な１つの説明は、所与の培養条件に対し、細胞によって発現され得るＥＬＰ質量が、ＥＬＰ鎖長には依存せずに制限されることである。これは、各分子量の他のＥＬＰによる結果ならびに観察によっても裏付けられた。こうした制限は、おそらく、不十分なｔＲＮＡプールおよび／または高度に反復的なＥＬＰ配列に起因するアミノ酸枯渇による代謝的因子により生じる可能性が高い。ＥＬＰの質量による収量が制限因子であるならば、これは、ＥＬＰ［Ｖ−２０］タグによるチオレドキシン収量増加の根拠を提供する。ＥＬＰの所与の重量による収量に対し、ＥＬＰ鎖長を短縮させると、融合タンパク質のモル収量が増大し、したがって、標的タンパク質の収量が増大する。さらに、このことは、また、例えば、培養時における特定のＥＬＰ関連アミノ酸の補足により、ＥＬＰの重量による収量を増加させれば、融合タンパク質収量改善の別の可能な経路がもたらされることを示唆する。
より短いＥＬＰ１［Ｖ−２０］タグにより標的タンパク質の収量が増加したが、この利益は、より複雑な転移挙動を伴った。このタグによる回収効率が、ＩＴＣに用いる溶液条件に依存するのに対し、より大型のＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］タグでは、融合タンパク質の回収が、すべての溶液条件下において完全であった（結果は示さない）。こうして、短縮されたＥＬＰ１［Ｖ−２０］タグは、ＩＴＣによりチオレドキシンを均質にまで精製することを可能としたが、精製の効率は、逆転移を誘導するのに選択される特異的な条件に対して高感度であった。
濁度およびＤＬＳ法によるデータは、より小型のＥＬＰ１［Ｖ−２０］タグの精製効率が溶液条件に対して示す感度への洞察をもたらした。チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］溶液が、Ｔｔより高いすべての温度において混濁を保つ一方で、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の濁度プロファイルは、Ｔｔにおける最初の急速な上昇の後、Ｔｔより高温におけるさらなる加熱と共に透明化し始めた。温度上昇に伴うこの透明化現象は、本発明者の知る限り、他のＥＬＰまたはＥＬＰ融合タンパク質ではかつて観察されなかった。この複雑な凝集挙動を研究するため、温度の関数としての動的光散乱を用いて、融合タンパク質粒子のサイズを測定し、２つの融合タンパク質の著明に異なる濁度プロファイルの構造的基礎を決定した。
温度上昇と共に、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］モノマーは、急激で不連続的な相転移を経て、約２μｍの定常状態Ｒｈを有し、Ｔｔより高いすべての温度において残存する凝集物を形成した。凝集物がＴｔより高温で安定なため、凝集タンパク質は、そのＴｔより高い任意の温度（または、Ｔｔが溶液温度未満にまで低下する任意のＮａＣｌ濃度）において、遠心分離により完全に回収することができた。
チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］もまた、凝集物を形成する急激な相転移を示したが、これらの凝集物は、その相転移温度より高いすべての温度では安定でなかった。温度がＴｔを超えて上昇するのに応じて、やはり温度上昇と共にサイズの縮小を示したより大型の凝集物における質量の消失により、約１２ｎｍのＲｈを有する小型の凝集物が形成された。これは、Ｔｔより高温で観察された、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の濁度の低下に対する構造的な根拠を提供する。Ｔｔより高温（１Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳではＴｔより約１０℃高い温度に始まる、また、２Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳではＴｔより約１５℃高い温度に始まる）まで加熱すると、より大型の散乱中心が、光の散乱効率がより低い小型の粒子に転換された。大型凝集物の消失によるこれらの１２ｎｍ粒子の形成は、遠心分離による可溶性溶解物からの融合タンパク質の不完全な回収をもたらした。こうして、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］（および、潜在的に、他の小型ＥＬＰタグ）を融合タンパク質の精製に用いた場合、遠心分離により容易に分離できるより大型の凝集物のみが懸濁液中に存在するよう、ＮａＣｌ濃度および補完的な溶液温度を選択することが、完全なタンパク質の回収には肝要であった。
サイズのみに基づくなら、１２ｎｍ粒子の正確な構造は予測できなかった。しかし、該粒子は、溶媒和したチオレドキシンドメインが、崩壊した疎水性のＥＬＰドメインを粒子の核に包み込むよう凝集する、少数の融合タンパク質分子（おそらく、４０〜６０個のオーダー）を含有するミセル様の構造であり得る。チオレドキシンの親水性「ヘッド」の直径が約３ｎｍ、２０ペンタマーＥＬＰの疎水性「テール」の長さが約７ｎｍであったので、観察された粒子のサイズ（約１２ｎｍのＲｈ）は、こうした構造と符合する。
こうしたミセル構造において必要とされるチオレドキシン分子の近接性は、また、約５５℃より高温で観察される不可逆性凝集を説明し得る。この低温における変性は、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］に融合したチオレドキシンおよび１Ｍ以上のＮａＣｌ濃度についてのみ観察された。また、１２ｎｍ粒子が観察されたのはこれらの条件の場合のみであった。チオレドキシン分子間で少量のＥＬＰが緩衝する、該ミセルの溶媒和した親水性外殻におけるチオレドキシンの極めて高い有効濃度は、熱的安定性の低下が観察されたことと符合する。
ＮａＣｌ濃度および溶液温度の適切な選択が、ＩＴＣを効率的に実施するのに適する。マイクロ遠心分離機を４℃の冷却実験用キャビネット内に置いた場合の１２℃、２２℃の実験用ベンチ上に置いた場合の３３℃、および３７℃の静置用インキュベータ内に置いた場合の４９℃（すべての試料温度は、１０分間の遠心分離後において、熱電対により直接測定した）の３つの遠心分離温度を、実験に好適な温度として選択した。ＮａＣｌ濃度は、Ｔｔを各遠心分離温度未満のある点まで低下させるよう、１Ｍずつ上昇させて選択した。
最初の２つの温度例の場合、遠心分離温度およびＮａＣｌ濃度のこれらの組合せにおいて、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］は、より大型の凝集物が１２ｎｍ粒子と共存する２相挙動を示したため、回収は不完全であった。質量が小さいため、１２ｎｍ粒子は、遠心分離時に懸濁を保ち、より大型の凝集物相中に含有される融合タンパク質画分のみが遠心分離により除去され、再溶解ペレット中に回収された。４９℃では、１Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中におけるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の濁度プロファイルが、その最大値から著明に低下し、データは、散乱強度の大部分が、１２ｎｍ粒子に由来することを示した。これに対応して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるデータは、存在する融合タンパク質のごくわずか画分が、ＩＴＣによる精製時に遠心分離により捕獲されることを示した。２Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中における３３℃では、やはりその最大値を下回るものの、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の濁度は、そのピーク値に近づき、データは、１２ｎｍ粒子に帰属する散乱強度がはるかに小さいことを示した。１２ｎｍ粒子に起因する上清中の消失はやはり小さくなかったが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認された通り、ＩＴＣによる精製が融合タンパク質の大半を捕獲したことは、これらの観察と符合した。
３Ｍ ＮａＣｌを有するＰＢＳ中における１２℃の遠心分離温度を用いたところ、再溶解ペレット中における融合タンパク質の回収は、ほぼ完全であった。これらの条件下において、溶液濁度は、その最大値に極めて近かった。濁度を、低い塩濃度について確立された粒子サイズ分布の傾向と組み合わせると、これらの条件を有するＩＴＣにより得られる完全な回収が、これらの溶液条件では、大型の凝集物のみの存在により説明されることが示唆される。
これらの例は、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］のＩＴＣによる効率的な精製、および、潜在的には、小型のＥＬＰタグを有する他の可溶性融合タンパク質には、濁度プロファイルにおける最高点を達成するよう、ＮａＣｌ濃度および遠心分離温度を選択すべきであることを示す。温度制御のないマイクロ遠心分離機の場合、遠心分離試料温度を決定し、次いで、塩の正確な添加により融合タンパク質のＴｔを調整することにより、温度制御が最も実際的に達成される。冷却システムを装備するより大型の遠心分離機の場合、ＮａＣｌ濃度および遠心分離温度の統合的な変更により、回収効率を最大化することができる。逆転移を誘導する温度および塩濃度の任意の組合せを用いて完全に回収できるチオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］の場合に対して、チオレドキシン−ＥＬＰ１［Ｖ−２０］の場合は、ＩＴＣ時における溶液条件の制御に必要とされる精度が、標的タンパク質収量の４倍増に必要な代価である。
ＥＬＰ精製タグ長を３６ｋＤａから９ｋＤａに短縮すると、モデル標的タンパク質である大腸菌チオレドキシンの発現レベルが４倍に増加した。９ｋＤａタグによる発現レベルは、ＥＬＰタグなしに発現させた遊離チオレドキシンの場合と同様であり、したがって、ＥＬＰタグサイズのさらなる縮小は、さらなる利益をもたらさない可能性が高い。ＥＬＰの短縮は、最終タンパク質生成物の純度に有害な影響を及ぼさなかったが、ＩＴＣによる精製時におけるより大型の凝集物の形成を助長する、塩濃度および溶液温度の適切な組合せを選択することが重要である。
（実施例３）
ＥＬＰタグを用いる組換えタンパク質のハイスループット精製
５ポリペンタペプチドであるＥＬＰのＶＰＧＶＧ配列遺伝子は、ＰｆｌＭＩ適合末端およびＨｉｎＤＩＩＩの適合末端を有する２本鎖標準ＤＮＡを産出する、２つの５’側リン酸化合成オリゴヌクレオチド（アイオワ州、コーラルビル、Integrated DNA Technologies社製）をアニールすることにより構築した。この遺伝子を、ＰｆｌＭＩ／ＨｉｎＤＩＩＩにより直鎖化し脱リン酸化した改変ｐＵＣ−１９ベクター（マサチューセッツ州、ビバリー、New England Biolabs社製）中に挿入し、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩを有する再帰的有向連結を用いてポリマー化し（Meyer, 1999; Meyer, 2000）、２０ポリペンタペプチドのＥＬＰ配列遺伝子を産生した。次いで、このＥＬＰ遺伝子を、ＰｆｌＭＩおよびＢｇｌＩにより切断し、ゲル精製し（カリフォルニア州、バレンシア、Qiagen社製、QIAquickゲル抽出キット）、ＳｆｉＩにより直鎖化し脱リン酸化した改変ｐＥＴ３２ｂベクター（ウィスコンシン州、マジソン、Novagen社製；Meyer, 1999）内に挿入した。次いで、この発現ベクターを、ＢＬＲ（ＤＥ３）（Novagen社製）大腸菌発現菌株内に形質転換した。
上記の細胞は、凍結された（ＤＭＳＯ）ストックから採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した寒天プレート上で画線培養し、一晩増殖させた。マルチチャネルピペッターを用いて、２００マイクロリットルの増殖培地（カリフォルニア州、カールスバード、Qbiogene社製；Circlegrow培地中に１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）を、標準的な９６ウェルマイクロプレート（ニューヨーク州、コーニング、Corning社製、Costar）の各ウェルに注入した。２００μｌのピペットチップを用いて、マイクロプレートの各ウェルに、上記の寒天プレート上のコロニーに由来する細胞のピンヘッドサイズの凝集を接種した。覆いをかぶせたマイクロプレートを、３７℃、２７５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。マイクロプレートホルダーを適宜用いて、シェーカー内の適所にマイクロプレートを保持した。マイクロプレートリーダー（カリフォルニア州、サニーベール、Molecular Devices社製；Thermomax）を用いて測定した培養物の大半について、ＯＤ６５０が０．６５−この光学濃度は、紫外可視光分光光度計（島津製作所、ＵＶ−１６０１）を用いて測定された２．０のＯＤ６５０に対応する−に達した時に、１ｍＭの最終濃度までイソプロピルα−チオガラクトピラノシドを添加することにより、培養物を誘導した。誘導後４時間にわたり、培養物を振盪しながらインキュベートし、次いで、重量整合マイクロプレート担体アダプター（カリフォルニア州、パロアルト、Beckman Instruments社製）を用いて、４℃、１１００ｇで４０分間にわたる遠心分離により回収した。培地を除去し、細胞ペレットは、精製の準備ができるまで、マイクロプレート内において−８０℃で凍結させた。
ＥＬＰ１［Ｖ−２０］／チオレドキシンタンパク質は、マイクロプレート内の細胞培養物から、以下の通りに精製した。１μｌのリソザイム溶液（ミズーリ州、セントルイス、Sigma社製；グレードＶＩ；２５ｍｇ／ｍｌ）および２５ｕｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を各ウェルに添加することにより、細胞を溶解させた。次いで、オービタルシェーカーを用いて、４℃で２０分間にわたりマイクロプレートを振盪した。２μｌの１．３５％（質量による）デオキシコール酸ナトリウム溶液を各ウェルに添加し、マイクロプレートを４℃で５分間にわたり振盪した。２μｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ溶液（１００単位／ｕｌ、Type II、ミズーリ州、セントルイス、Sigma社製）を各ウェルに添加し、マイクロプレートを４℃で１０分間にわたり振盪した。次いで、重量整合マイクロプレート担体アダプター（カリフォルニア州、パロアルト、Beckman Instruments社製）を用いて、マイクロプレートを４℃、１１００ｇで２０分間にわたり遠心分離し、細胞微粒子および不溶性タンパク質をペレット化した。２μｌの１０％（質量による）ポリエチレンイミン溶液を各ウェルに添加し、マイクロプレートを４℃で１５分間にわたり振盪した。次いで、マイクロプレートを４℃、１１００ｇで２０分間にわたり遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。上清は、新たなマイクロプレートのウェルに移し、古いマイクロプレートは廃棄した。ＥＬＰ１［Ｖ−２０］／チオレドキシンの凝集を誘導するため、２０μｌの飽和ＮａＣｌ溶液を各ウェルに添加したところ、濁度の著明な上昇が、標的タンパク質の凝集を示した。凝集タンパク質をペレット化するため、マイクロプレートを３０℃、１１００ｇで４０分間にわたり遠心分離した。タンパク質ペレットを３０μｌのリン酸緩衝液中に再溶解させた後、マイクロプレートを４℃、１１００ｇで２０分間にわたり遠心分離して、不溶性脂質を除去した。最後に、精製したタンパク質上清を新たなマイクロプレートのウェルに移し、４℃で保管した。ＩＴＣにより精製されたＥＬＰ１［Ｖ−２０］／チオレドキシン融合タンパク質に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を行った。
あるいは、以下のプロトコールに従う市販の抽出試薬を用いて、複数のＥＬＰ／ＥＬＰ融合タンパク質を精製することができる。２５マイクロリットルのＮｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬を各マイクロプレートウェルに添加することにより、細胞を溶解させる。マイクロプレートを、室温で１５分間にわたり、シェーカー速度２のＦｉｓｈｅｒ社製Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ（あるいは、最大速度のオービタルシェーカー）上に置く。マイクロプレートアダプターを用い、摂氏４度で２０分間にわたり遠心分離（ＪＳ４．２ローター用のBeckman社製アダプターの場合、２３００ｒｐｍ、１７００×ｇ）を行い、ペレットを形成する。２マイクロリットルのポリエチレンイミンをウェルに（０．６６％まで）添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅまたはシェーカーを用いて５分間にわたり振盪する。氷上で１０分間にわたりインキュベートし、場合によって振盪する。マイクロプレートアダプターを用い、摂氏４度、最大速度で２５分間にわたり遠心分離する。上清を未使用のマイクロプレートに移し、使用済みのマイクロプレートをペレットと共に廃棄する。ＮａＣｌ（結晶）を添加し、かつ／または、溶液温度を上昇させて、ＥＬＰ凝集を誘導する。振盪のみにより混合する−ピペッティングは、ピペットチップにＥＬＰを凝集させる。溶液は、ある程度まで混濁する。転移温度より高温で遠心分離する（摂氏３５〜４０度、２３００ｒｐｍ、１７００ｇで４５分間）。上清を廃棄し、ウェルの底部および壁面全体で繰り返しピペッティングすることにより、３０マイクロリットルの低温の選択緩衝液（ＰＢＳ）中に、ペレット（通常は不可視または極小のペレット）を再懸濁させる。遠心分離（摂氏４度、２３００ｒｐｍ、１７００×ｇで２０分間）して、脂質などの不溶性不純物をスピンアウトする。上清を別のマイクロプレートに移す。精製されたＥＬＰは、使用準備ができるまで、摂氏−８０度で凍結保存してよい。（融合体の場合、凍結が融合タンパク質に適することを確認しなければならない。）本技法において用いられる適切なＮａＣｌ濃度および温度は、ＥＬＰ、融合パートナー、およびＥＬＰ濃度に依存する。目的は、有効ＥＬＰ転移温度を、溶液温度よりも少なくとも３〜５度低下させることである。融合タンパク質により忍容されるならば、より高温を用いてもよいが、摂氏２５〜３０度の有効転移温度および摂氏３５〜４０度の温熱遠心分離を用いるのが有用であった。
タンパク質濃度は、Ａ２８０を測定（島津製作所、ＵＶ−１６０１）し、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］／チオレドキシンのモル減衰係数（ε＝１９，８７０）を用いることにより決定したが、これは、ＥＬＰ１［Ｖ−２０］／チオレドキシンタンパク質試料がタンパク質およびＤＮＡ不純物を含有しないことを仮定する。チオレドキシン活性は、インスリン還元アッセイ（Holmgren, 1984）により決定した。
融合タンパク質の構築には、既に公表されたＴｔの理論データ（Urry, 1991）を用いて、約７０℃のＴｔを有する小型のＥＬＰタグをデザインした。ＥＬＰタグの特徴づけは、Ｔｔが７６．２℃であることを示し、Ｔｔが指定されたＥＬＰタグを合理的にデザインすることが可能であることを確認した。ＥＬＰ／チオレドキシン融合タンパク質の場合、低濃度の塩緩衝液、１Ｍの塩溶液、および２Ｍの塩溶液中におけるＴｔは、それぞれ、６８℃、３７℃、および１８℃であり、ＥＬＰタグへの可溶性タンパク質の融合がＴｔに及ぼす影響は最小限であることを確認し、塩濃度を調整することにより、広範にわたってＴｔを操作し得ることを示した。
前述に基づき、ＥＬＰ配列および切断部位により連結されたポリリンカー領域（この内部に標的タンパク質を挿入する）を含有するプラスミド発現ベクターファミリーを作製することにより、各種タンパク質の発現を促進することができる。こうしたプラスミドファミリー中に埋め込まれたＥＬＰ配列は、異なる転移温度を有し得る（ゲスト残基の同一特性を変更することによる）。特定の標的タンパク質用の発現ベクターは、該タンパク質の表面疎水性特性に基づき選択するのが望ましい。次いで、精製時における溶液の塩濃度を調整して、所望のＴｔを得る。
マイクロプレートウェル内における細胞培養物の増殖を含むタンパク質発現の場合、約２のＯＤ６００で細胞培養物を誘導し、誘導後４時間にわたり増殖させることが望ましい。マイクロプレートにおける増殖のための誘導時における細胞密度は、従来のタンパク質発現プロトコールにより達成される密度の２〜３倍である。これらの高細胞密度においても、ウェル内で増殖する場合、容量に対する高い表面積率を特徴とする培養物の通気により、マイクロプレートウェルにおいて急速かつ健全な細胞増殖を維持することができる。誘導後の増殖時間が長い細胞培養物は、標的タンパク質の収量増加が最小限であり、過剰発現プロトコール（Guda, 1995）を用いる増殖は、融合タンパク質の増加は最小限で混入タンパク質がはるかに増加した（約１０倍）。マイクロプレートウェル中の細胞増殖物の容量に対する高い表面積率における細胞培地の蒸発を回避するため、増殖時において適切な覆いによりマイクロプレートを覆い、誘導時において細胞増殖培地に追加の培地を注入する必要があった。リットル当たりベースにおいて、マイクロプレートウェル内で増殖させた培地は、従来のプロトコールにより増殖させた培地よりも高レベルの融合タンパク質発現を有した。
細胞を市販の非イオン性タンパク質抽出製剤により溶解させたところ、ＩＴＣを用いるハイスループットタンパク質精製が成功した。細胞溶解後、ポリエチレンイミンの添加により、遠心分離直後の未加工溶解物の可溶性画分から、核酸および高分子量タンパク質を除去した。融合タンパク質および可溶性溶解物の塩濃度において、融合タンパク質のＴｔは、約６５℃であった。融合タンパク質の凝集を誘導するこの温度より高温で可溶性溶解物を加熱すると、可溶性混入タンパク質のほか、標的タンパク質自体も変性し沈殿する。さらに、この温度は、遠心分離時における遠心分離機チャンバー内で維持することができなかった。したがって、可溶性溶解物に約２Ｍまで塩を添加したところ、これが融合タンパク質のＴｔを約１８℃まで低下させ、室温での融合タンパク質の凝集を可能とした。この塩濃度は、混入タンパク質を沈殿させず、最終精製タンパク質生成物の機能性も変化させなかった。
ＩＴＣを用いるハイスループットタンパク質精製は、有効かつ効率的であった。発現した融合タンパク質のうち、細胞溶解物の不溶性タンパク質画分中に消失したのは約１５％であった。融合タンパク質凝集後における試料の遠心分離は、タンパク質を有効に分離し、融合タンパク質の９０％がペレット化したのに対し、融合タンパク質の１０％は、すべての可溶性混入タンパク質と共に上清中にとどまった。全体で発現タンパク質の約７５％が、ＩＴＣによる精製を用いて抽出され、精製された生成物中の大腸菌による混入タンパク質レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により検出可能なレベルを下回った。遠心分離速度を上昇させることにより、精製過程を速め、精製効率を上昇させることができ、高速の遠心分離速度は、遠心分離時間を短縮させ、高速の遠心分離速度（５０００ｇ）においては、融合タンパク質のすべてが、凝集後の遠心分離時においてペレット化する。トロンビンの添加は、融合タンパク質を完全に切断し、ＩＴＣの第２ラウンドは、チオレドキシンの消失なしに、チオレドキシン標的タンパク質からＥＬＰタグを分離した。
吸光度測定（Ａ２８０、ε＝１９，８７０）を用いて決定されたウェル当たりの平均精製融合タンパク質量は、８．５ｕｇの標準偏差を伴う３３ｕｇであった。値は、ウェル当たり１９．７ｕｇと４８．３ｕｇとの間に均等に分散した。精製タンパク質収量の大きなばらつきは、ＩＴＣ過程の精製効率のばらつきよりも、タンパク質の発現量がウェルごとに異なることに起因した。細胞培養物ごとに様々な量のタンパク質が発現したのは、１）接種の圧痕は、細胞培養物が、初発において様々な量の細胞を有することを意味し、２）あらゆる可能性において、より豊富な通気により、周縁部のウェル内における細胞培養物の方が、より迅速に増殖し、より高度な定常状態細胞密度に達する傾向があったためである。作業を簡便化するため、細胞培養物ごとに誘導および回収するのでなく、すべての細胞培養物を同時に誘導し、次いで、回収した。
チオレドキシン標的タンパク質の酵素活性は、インスリン還元アッセイを用いて測定した。こうした酵素活性に基づいて決定された、ウェル当たりの平均融合タンパク質量は、８．０ｕｇの標準偏差を伴う３５．７ｕｇであった。ここでも、値は、ウェル当たり２４．６ｕｇの最小値と５０．８ｕｇの最大値との間に均等に分散した。チオレドキシンは、ＥＬＰタグに付着したままであるにもかかわらず、酵素的に活性であったことが重要である。このハイスループットＩＴＣ法を用いて発現し精製されたチオレドキシンは、単位質量当たりの酵素活性が、市販のチオレドキシン（Sigma社製）の場合よりも平均で１０．３％大きく、ＩＴＣ過程の穏やかさおよびこれにより達成された純度の裏付けとなった。
平均して、ハイスループットＥＬＰ／チオレドキシンタンパク質による発現および精製は、増殖物リットル当たり約１６０ｍｇのタンパク質を産生した。これは、従来のタンパク質発現およびＩＴＣ精製法を用いて得られるＥＬＰ／チオレドキシン収量（タンパク質１４０〜２００ｍｇ／増殖物Ｌ）と同等である。
マイクロプレートおよび逆転移サイクリングを用いるハイスループットタンパク質精製段階に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル法を上述の手順により実施し、ここで、文書化されたプロトコールを用い、ＥＬＰ／チオレドキシン融合タンパク質を精製した。ゲル試料は、ＳＤＳにより変性させ、ベータ−メルカプトエタノールにより還元し、勾配１０〜２０％のトリス−ＨＣｌゲル上において２００Ｖで４５分間にわたり電気泳動させた。
吸光度測定（Ａ２８０、ε＝１９，８７０）を用いて決定されたウェル当たりの総融合タンパク質量に関するヒストグラム（ｎ＝２０、μ＝３２．９７、σ＝８．４８）、および市販のチオレドキシン（Sigma社製）と比較した、試料ごとの融合タンパク質の機能性／純度に関するヒストグラム（ｎ＝２０、μ＝１１０．３７％、σ＝１６．５４％）を含め、精製されたタンパク質試料の定量化にはヒストグラムを用いた。
こうしたハイスループットタンパク質発現法および精製法については、ニッケルキレート化マルチウェルプレートが、ウェル当たりわずかに１ｎｇのＨｉｓタグ付きタンパク質を精製し得るのに対し、ＩＴＣを用いるハイスループット精製の能力は、ウェル中で増殖させる培養物により発現し得るタンパク質量のみによって制限され、ＥＬＰタグ付きタンパク質の場合、タンパク質発現レベルは、数十マイクログラムの範囲である。
こうして、ＩＴＣを用いるハイスループット精製は、高収量を提供し、治療用組成物の有効成分を産生するペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物の精製に十分な融合タンパク質を産生する。精製されたミリグラムレベルの融合タンパク質は、他の容器において細胞培養物を増殖させ、再懸濁させた細胞ペレットを精製過程用のマルチウェルプレートに移すことにより得ることができる。最後に、こうしたハイスループット精製法が必要とする精製中間生成物の未使用のマルチウェルプレートへの移動は１回だけなので、現在行われる従来の市販ハイスループット精製法よりも技術的に簡便で廉価である。
（実施例４）
各種ＥＬＰ遺伝子発現系列の構築
細菌の菌株とプラスミド
クローニング工程は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ −，ｍｋ ＋）、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ［Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺцΔＭ１５、Ｔｎ１０（ＴｅｔＩ）］）（カリフォルニア州、ラジョラ、Stratagene社製）内で行った。ＥＬＰ構築物のクローニングベクターとしては、ｐＵＣ１９（マサチューセッツ州、ビバリー、ＮＥＢ社製）を用いた（Meyer and Chilkoti, 1999）。ｐＥＴ１５ｂベクターおよびｐＥＴ２４ｄベクターの改変形態（Novagen社製）を用いて、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株（Ｆ’’、ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳＢ（ｒＢ −ｍＢ −）、ｇａｌ、ｄｃｍ、ｒｎｅｌ３１、（ＤＥ３））（カリフォルニア州、カールスバード、Invitrogen社製）、または、ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｆ’’、ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳＢ（ｒＢ −ｍＢ −）、ｇａｌ、ｄｃｍ、Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｃＲ）（ＤＥ３））（ウィスコンシン州、マジソン、Novagen社製）内においてＥＬＰおよびＥＬＰ融合タンパク質を発現した。合成ＤＮＡオリゴは、アイオワ州、コーラルビル、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。すべてのベクター構築物は、標準的な分子生物学プロトコールを用いて作製した（Ausubel, et al., 1995）。
ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］系列とは、Ｘが、５：２：３の相対比率でバリン、アラニン、およびグリシンである、ペンタペプチドＶＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］系列モノマーであるＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された４つの合成オリゴをアニールして、ＥｃｏＲ１適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端（Meyer and Chilkoti, 1999）を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。該オリゴは、加熱ブロック内で９５℃とした５０μｌの１倍濃度リガーゼ緩衝液（Invitrogen社製）中における４つのオリゴの１μＭ混合物中でアニールし、次いで、該ブロックを室温までゆっくりと冷ました。ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］／ＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡセグメントを、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＡＰ（Invitrogen社製）で脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクター内に連結し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］を形成した。ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］系列ライブラリーの構築は、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］に由来するＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇｌＩ断片を、ＰｆｌＭＩにより直鎖化し、ＣＩＡＰにより脱リン酸化したｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］内に挿入して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］を作製することにより開始した。次いで、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］は、ＰｆｌＭＩで消化したｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］内に、それぞれ、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇｌＩ断片またはＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−２０］ＰｆｌＭＩ／ＢｇｌＩ断片を連結することにより、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−３０］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−４０］に構築された。この手順を用いてＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］系列を拡張し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］遺伝子、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］遺伝子、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］遺伝子を作製した。
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列とは、Ｘが、１：２：１の相対比率でリジン、バリン、およびフェニルアラニンである、ペンタペプチドＶＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列モノマーであるＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］（配列番号１８）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された２つの合成オリゴをアニールして、ＥｃｏＲ１適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端（Meyer and Chilkoti, 1999）を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。該オリゴは、加熱ブロック内で９５℃とした５０μｌの１倍濃度リガーゼ緩衝液（Invitrogen社製）中における４つのオリゴの１μＭ混合物中でアニールし、次いで、該ブロックを室温までゆっくりと冷ました。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］／ＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡセグメントを、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＡＰ（Invitrogen社製）で脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクター内に連結し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］を形成した。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列ライブラリーの構築は、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］に由来するＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］ＰｆｌＭＩ／ＢｇｌＩ断片を、ＰｆｌＭＩにより直鎖化し、ＣＩＡＰにより脱リン酸化したｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］内に挿入して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−８］を作製することにより開始した。同じ手順を用いて、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−４］系列は、連結するごとに２倍化し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１６］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−３２］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］を形成した。
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］系列とは、Ｘが、１：７：１の相対比率でリジン、バリン、およびフェニルアラニンである、ペンタペプチドＶＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１］系列モノマーであるＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］（配列番号１９）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された４つの合成オリゴをアニールして、ＰｆｌＭＩ適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。次いで、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］ＤＮＡセグメントを、ＰｆｌＭＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した脱リン酸化ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ベクター内に連結し、これにより、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］をＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］に置換して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］モノマーを形成した。ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−９］系列は、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列と同じ形で拡張し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１８］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−３６］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］を作製した。
ＥＬＰ１［Ｖ］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ１［Ｖ］系列とは、Ｘがバリンに限る、ペンタペプチドＶＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ１［Ｖ］系列モノマーであるＥＬＰ１［Ｖ−５］（配列番号１４）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された２つの合成オリゴをアニールして、ＥｃｏＲ１適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。次いで、ＥＬＰ１［Ｖ−５］ＤＮＡセグメントを、ＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクター内に連結し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−５］モノマーを形成した。ＥＬＰ１［Ｖ］系列は、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３］系列と同じ形で作製し、最終的には、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−５］をｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］に拡張した。
ＥＬＰ２遺伝子系列の構築
ＥＬＰ２系列とは、ペンタペプチドＡＶＧＶＰの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ２系列モノマーであるＥＬＰ２［５］（配列番号２０）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された２つの合成オリゴをアニールして、ＥｃｏＲ１適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。次いで、ＥＬＰ２［５］ＤＮＡセグメントを、ＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクター内に連結し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［５］モノマーを形成した。ＥＬＰ２系列は、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列と同じ形で拡張し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［３０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１２０］を作製した。
ＥＬＰ３［Ｖ］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ３［Ｖ］系列とは、Ｘがバリンに限る、ペンタペプチドＩＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ３［Ｖ］系列モノマーであるＥＬＰ３［Ｖ−５］（配列番号２１）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された２つの合成オリゴをアニールして、ＰｆＬＭＩアミノ末端の適合末端、および、好適なカルボキシル末端制限部位を欠くためにＧＧＣカルボキシル末端の適合末端を有するが、やはりモノマーの切れ目のない付加を可能とする、２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。次いで、ＥＬＰ３［Ｖ−５］ＤＮＡセグメントを、ＰｆｌＭＩ／ＢｇｌＩで消化した脱リン酸化ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−５］ベクター内に連結し、これにより、ＥＬＰ４［Ｖ−５］をＥＬＰ３［Ｖ−５］に置換して、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ３［Ｖ−５］モノマーを形成した。ＥＬＰ３［Ｖ］系列は、ＰｆｌＭＩで消化したｐＵＣ１９−ＥＬＰ３［Ｖ−５］内に、アニールしたＥＬＰ３オリゴを連結することにより拡張した。連結のたびに、ＥＬＰ３［Ｖ］系列は５倍ずつ拡張され、ＥＬＰ３［Ｖ−１０］、ＥＬＰ３［Ｖ−１５］などを作製した。
ＥＬＰ４［Ｖ］遺伝子系列の構築
ＥＬＰ４［Ｖ］系列とは、Ｘがバリンに限る、ペンタペプチドＬＰＧＸＧの多数回反復単位を含有するポリペプチドを指す。
ＥＬＰ４［Ｖ］系列モノマーであるＥＬＰ４［Ｖ−５］（配列番号２２）は、５’側がリン酸化され、ＰＡＧＥ法により精製された２つの合成オリゴをアニールして、ＥｃｏＲ１適合末端およびＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成することにより作製した。次いで、ＥＬＰ４［Ｖ−５］ＤＮＡセグメントを、ＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した脱リン酸化ｐＵＣ１９ベクター内に連結し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−５］モノマーを形成した。ＥＬＰ４［Ｖ］系列は、ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１］系列と同じ形で拡張し、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−３０］、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］を作製した。
ＥＬＰ遺伝子は、また、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６、およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１などの他のベクター内にも挿入された。ｐＥＴベクター系列は、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｎｏｖａｇｅｎ社から入手できる。
ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０ベクターは、マルチクローニング制限部位（Ｓａｃ１−Ｎｄｅ１−Ｎｃｏ１−Ｘｈｏ１−ＳｎａＢ１−ＢａｍＨ１）を含有する、ＳＤ０ ２本鎖ＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂベクターを改変することにより形成した。ＳＤ０ ２本鎖ＤＮＡセグメントは、Ｘｂａ１適合末端およびＢａｍＨ１適合末端を有し、Ｘｂａ１／ＢａｍＨ１により直鎖化され５’側が脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ内に連結され、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０ベクターを形成した。
ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターは、マルチクローニング部位（Ｎｄｅ１−Ｎｃｏ１−Ｘｈｏ１−ＳｎａＢ１−ＢａｍＨ１）が後続するヒンジ領域−トロンビン切断部位の上流にあるＳｆｉ１制限部位を含有する、ＳＤ３ ２本鎖ＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０ベクターを改変することにより形成した。ＳＤ３ ２本鎖ＤＮＡセグメントは、Ｓａｃ１適合末端およびＮｄｅ１適合末端を有し、Ｓａｃ１／Ｎｄｅ１により直鎖化され５’側が脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ０内に連結され、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターを形成した。
ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５ベクターは、ヒンジおよびマルチクローニング部位（Ｎｄｅ１−Ｎｃｏ１−Ｘｈｏ１−ＳｎａＢ１−ＢａｍＨ１）が後続するトロンビン切断部位の上流にあるＳｆｉ１制限部位を含有する、ＳＤ５ ２本鎖ＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターを改変することにより形成した。ＳＤ５ ２本鎖ＤＮＡセグメントは、Ｓｆｉ１適合末端およびＮｄｅ１適合末端を有し、Ｓｆｉ１／Ｎｄｅ１により直鎖化され５’側が脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３内に連結され、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５ベクターを形成した。
ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６ベクターは、マルチクローニング部位（Ｎｄｅ１−Ｎｃｏ１−Ｘｈｏ１−ＳｎａＢ１−ＢａｍＨ１）が後続するリンカー領域−ＴＥＶ切断部位の上流にあるＳｆｉ１制限部位を含有する、ＳＤ６ ２本鎖ＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３ベクターを改変することにより形成した。ＳＤ６ ２本鎖ＤＮＡセグメントは、Ｓｆｉ１適合末端およびＮｄｅ１適合末端を有し、Ｓｆｉ１／Ｎｄｅ１により直鎖化され５’側が脱リン酸化されたｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３内に連結され、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６ベクターを形成した。
ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１ベクターは、Ｎｃｏ１適合末端およびＮｈｅ１適合末端を有するＳＤ２１ ２本鎖ＤＮＡセグメントを用いて、ｐＥＴ２４ｄベクターを改変することにより形成した。ＳＤ２１ ２本鎖ＤＮＡセグメントは、Ｎｃｏ１／Ｎｈｅ１により直鎖化され５’側が脱リン酸化されたｐＥＴ２４ｄ内に連結され、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１ベクターを形成し、これが、Ｓｆｉ１部位の直後に、最小限数の追加アミノ酸を有するＥＬＰの挿入および発現のための２つの終止コドンを有する、新たなマルチクローニング部位であるＮｃｏＩ−ＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１−ＳａｃＩ−ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩを含有した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］プラスミド、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］プラスミド、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］プラスミドを、ＰｆｌＭ１およびＢｇｌ１で消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３発現ベクターのＳｆｉ１部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ３−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、およびｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］プラスミド、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］プラスミド、ｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］プラスミド、およびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］プラスミドを、ＰｆｌＭ１およびＢｇｌ１で消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５発現ベクターのＳｆｉ１部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］、およびｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ−６０］、およびｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ１［Ｖ−１２０］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］プラスミドを、ＰｆｌＭ１およびＢｇｌ１で消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６発現ベクターのＳｆｉ１部位内に連結し、ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ６−ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］プラスミドおよびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］プラスミドを、ＰｆｌＭ１およびＢｇｌ１で消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＳｆｉ１部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−６４］およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ２Ｆ１−１２８］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］プラスミドおよびｐＵＣ１９−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］プラスミドを、ＰｆｌＭ１およびＢｇｌ１で消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＳｆｉ１部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−７２］およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ１［Ｋ１Ｖ７Ｆ１−１４４］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［６０］プラスミドおよびｐＵＣ１９−ＥＬＰ２［１２０］プラスミドを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ２［６０］およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ２［１２０］を作製した。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で産生されたｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］プラスミドおよびｐＵＣ１９−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］プラスミドを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥＬＰ含有断片を、本明細書で上述したｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１発現ベクターのＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位内に連結し、それぞれ、ｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ４［Ｖ−６０］およびｐＥＴ２４ｄ−ＳＤ２１−ＥＬＰ４［Ｖ−１２０］を作製した。
（実施例５）
各種融合タンパク質の構築、単離、および精製
以下の融合タンパク質が、特定の組合せにおける各種のペプチド活性治療剤およびＥＬＰ種を例示することに注意されたい。
これらの融合タンパク質は、各ペプチド活性治療剤とＥＬＰ部分との間の切断部位を伴ってデザインされたが、さらなる研究用にペプチド活性治療剤およびＥＬＰ部分を産生する切断反応において用いる場合、ペプチド活性治療剤をＥＬＰに直接結合する簡便法により、プロテアーゼもしくは他の分解作用物質、または、その投与後のｉｎ ｖｉｖｏにおいて該構築物が遭遇し得る状態による切断を受けやすい切断群または部分の介在なしに、こうした切断部位を欠く、対応するペプチド活性治療剤−ＥＬＰ構築物が容易に産生される。
ＥＬＰ含有融合タンパク質の形成、および、こうした融合タンパク質により示される相転移挙動において、各種の標的タンパク質（ペプチド活性治療剤）の使用を示す実験を行った。具体的に、本明細書に上記の教示および開示と符合する、既知の組換え発現技法を用いることにより、以下の３６のＥＬＰ含有融合タンパク質：
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、インスリンＡペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号２３）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、インスリンＡペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号２４）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、インスリンＡペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号２５）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、インスリンＡペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号２６）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号２７）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号２８）；
間にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号２９）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号３０）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号３１）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号３２）；
間にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（ＱＳ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号３３）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＳ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号３４）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＳ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号３５）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＹ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号３６）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＹ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号３７）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＹ残基間の切断）を有する、Ｔ２０ペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号３８）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、インターフェロンアルファ２Ｂタンパク質およびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号３９）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、タバコエッチウイルスプロテアーゼおよびＥＬＰ１［Ｖ−６０］ポリペプチド（配列番号４０）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、タバコエッチウイルスプロテアーゼおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号４１）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、タバコエッチウイルスプロテアーゼおよびＥＬＰ１［Ｖ−１２０］ポリペプチド（配列番号４２）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、タバコエッチウイルスプロテアーゼおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号４３）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、小ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体およびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号４４）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号４５）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号４６）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号４７）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］ポリペプチド（配列番号４８）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号４９）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号５０）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＧ残基間の切断）を有する、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号５１）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｇタンパク質アルファＱおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号５２）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｇタンパク質アルファＱおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号５３）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−６０］ポリペプチド（配列番号５４）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号５５）；
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−１８０］ポリペプチド（配列番号５６）；
間にＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＱＧ残基間の切断）を有する、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチドおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号５７）；および
間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有する、Ｇタンパク質アルファＳおよびＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］ポリペプチド（配列番号５８）
を大腸菌内において形成した。
上に列挙した３６のＥＬＰ含有融合タンパク質のすべてが、対応するＥＬＰタグの逆相転移挙動を保持し、以下の実験手順により、逆転移サイクリング（ＩＴＣ）法を用いることにより、単離および精製に成功した。
インスリンＡペプチド（ＩｎｓＡ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）菌株（Novagen社製）の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）を補足した５ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら５時間にわたり増殖させた。次いで、５ｍｌの培養物を５００ｍｌの培養液に接種し、２５℃で１６時間にわたり増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧにより２５℃で４時間にわたり誘導した。培養物を回収し、４０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、そこで１．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した２０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−ＩｎｓＡ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を０．５ｍｌに減少させた。
Ｔ２０ペプチド（Ｔ２０）を含有する融合タンパク質の単離および精製
各ＥＬＰ−Ｔ２０融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）菌株（Novagen社製）の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および完全プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、そこで１．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−Ｔ２０融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−Ｔ２０融合タンパク質の純度を高め、最終容量を５ｍｌに減少させた。
インターフェロンアルファ２Ｂペプチド（ＩＦＮＡ２）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ＥＬＰ−ＩＦＮＡ２融合タンパク質およびＣｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ−ＲＩＬプラスミド（Stratagene社製）を含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＴｒｘＢ菌株（Novagen社製）の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）、２５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、２７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間にわたりインキュベートした。培養物を回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、１．５Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、ＥＬＰ−ＩＦＮＡ２融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．４および５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、ＥＬＰ−ＩＦＮＡ２融合タンパク質の純度を高め、最終容量を５ｍｌに減少させた。
タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ｐＥＴ１５ｂ−ＳＤ５−ＥＬＰ−ＴＥＶ構築物およびＣｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ−ＲＩＬプラスミド（Stratagene社製）を含有する大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ菌株またはＢＲＬ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）、２５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、２７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間にわたりインキュベートした。培養物を回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、および１ｍＭ ＰＭＳＦ中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、１．５Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−ＴＥＶ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−ＴＥＶ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を１ｍｌに減少させた。
小ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体（ＳＨＰ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ＥＬＰ−ＳＨＰ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）および１０％スクロースを補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、２７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＫＣＬ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、１．５Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、ＥＬＰ−ＳＨＰ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＫＣＬ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ Ｎ−オクチルグルコシド中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、非特異的な不溶性タンパク質を除去した。温度転移サイクルをさらに２回繰り返し、ＥＬＰ−ＳＨＰ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を２ｍｌに減少させた。
アンドロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＡＲ−ＬＢＤ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ＥＬＰ−ＡＲ−ＬＢＤ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）および１０μＭ ＤＨＴを補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、２７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌの５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｎ−オクチルグルコシド、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１μＭ ＤＨＴ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性超音波分解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、２．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−ＡＲ−ＬＢＤ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｎ−オクチルグルコシド、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、および１μＭ ＤＨＴ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−ＡＲ−ＬＢＤ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を２５ｍｌに減少させた。
グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン（ＧＲ−ＬＢＤ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ＥＬＰ−ＧＲ−ＬＢＤ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．１％ ＣＨＡＰＳ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、２．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、ＥＬＰ−ＧＲ−ＬＢＤ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．１％ ＣＨＡＰＳ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、ＥＬＰ−ＧＲ−ＬＢＤ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を１０ｍｌに減少させた。
エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲα−ＬＢＤ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
各ＥＬＰ−ＥＲα−ＬＢＤ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）、１０％スクロース（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、２７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＫＣＬ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、１．５Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−ＥＲα−ＬＢＤ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、４０ｍｌの氷冷した５０ｍＭトリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＫＣＬ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−ＥＲα−ＬＢＤ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を１０ｍｌに減少させた。
Ｇタンパク質アルファＱ（Ｇαｑ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
各ＥＬＰ−Ｇαｑ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）および１μＭ ＧＤＰを補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌの５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＧＤＰ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、２．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−Ｇαｑ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、３０ｍｌの氷冷した５０ｍＭヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＧＤＰ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり再遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−Ｇαｑ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を５ｍｌに減少させた。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
各ＥＬＰ−ＤＸＲ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）、１ｍＭ ＭｎＣｌ２（ＶＷＲ社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌの０．１ＭトリスｐＨ７．６、１ｍＭ ＤＴＴ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、２．０Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、各ＥＬＰ−ＤＸＲ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、２０ｍｌの氷冷した０．１ＭトリスｐＨ７．６、１ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、各ＥＬＰ−ＤＸＲ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を５ｍｌに減少させた。
Ｇタンパク質アルファＳ（Ｇαｓ）を含有する融合タンパク質の単離および精製
ＥＬＰ−Ｇαｓ融合タンパク質を含有する大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）菌株の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma社製）を補足した５００ｍｌのＣｉｒｃｌｅＧｒｏｗ培地（カリフォルニア州、サンディエゴ、Q-BIOgene社製）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら２４時間にわたり増殖させた。培養物を回収し、４０ｍｌのＰＢＳ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、および完全ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤ペレット１個（イリノイ州、インディアナポリス、Roche社製）中に懸濁させた。細胞は、３０秒間の冷却間隔を挟み、３５％出力で１０秒間の破壊からなる、氷上で３分間にわたる超音波破壊により溶解させた。可溶性溶解物中のＤＮＡおよびＲＮＡは、２μｌベンゾナーゼ（Novagen社製）を添加し、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることによりさらに分解した。細胞破砕物は、４℃、２０，０００ｇで３０分間にわたる遠心分離により除去した。
室温での細胞溶解物にＮａＣｌを添加することにより逆相転移を誘導し、１．５Ｍの最終濃度を達成した後、室温、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離を行った。得られたペレットは、ＥＬＰ−Ｇαｓ融合タンパク質およびＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を含有した。
ペレットは、１０ｍｌの氷冷したＰＢＳ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁させ、４℃、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離して、ＮａＣｌによる非特異的な沈殿タンパク質を除去した。逆転移サイクルをさらに２回繰り返し、ＥＬＰ−Ｇαｓ融合タンパク質の純度を高め、最終容量を１ｍｌに減少させた。
（実施例６）
クロマトグラフィー法によらない１０個のタンパク質の産生
前出の実施例１に記載のｄｅｌｔａＰｈａｓｅ（商標）系法により、１０個のタンパク質の発現および精製を試験することに成功した。表２、および、３つのタンパク質について図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図に示した結果は、多様なタンパク質が、＞９５％の純度まで精製できることを明確に示す。ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］との融合タンパク質および固定化金属アフィニティ−クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）法による精製用タグとの融合タンパク質として発現した、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、カルモジュリン（ＣａｌＭ）、およびアンジオスタチン（Ｋ１−３）を完全に特徴づけることにより、ＥＬＰ融合タンパク質の発現および精製に対する体系的な評価を行った。発現は、大腸菌内で行った。ＥＬＰ融合タンパク質の精製に対して得られた収量を、表２で一覧にする。
Figure 2010502734
図３は、ＢＦＰ、ＣＡＴ、およびＫ１−３のＩＴＣによる精製に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図は、可溶性の大腸菌溶解物（Ｌ）、融合タンパク質のＴｔより高温での遠心分離後における上清（Ｓ）、および精製タンパク質（Ｓ）を含む。第２のゲルは、Ｔｒｘ（Ａ）、ＢＦＰ（Ｂ）、ＣＡＴ（Ｃ）、Ｋ１−３（Ｄ）、ＧＦＰ（Ｅ）の精製ＥＬＰ［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］融合体を示す。
（実施例７）
医薬的に有意義な１０ペプチドの産生
前出の実施例１に記載のｄｅｌｔａＰｈａｓｅ（商標）系を用いて、サイズが２．０〜６．２ｋＤａの範囲にあり、等電点が４．１１〜１２．３の範囲にある、医薬的に有意義な１０ペプチドを発現させ精製した。以下の表３に示す通り、多数の発現条件および精製条件を変化させる広範な作業の後、９０％を超える純度およびリットル当たり１７〜２３ｍｇの収量を有する６つのペプチドを、発現させ精製することに成功した。
Figure 2010502734
産生された融合タンパク質は、ＥＬＰ４−６０−ＭＭＮ、ＥＬＰ４−６０−ＮＰＹ、ＥＬＰ４−６０−オレキシンＢ、ＥＬＰ４−６０−レプチン、ＥＬＰ４−６０−ＡＣＴＨ、ＥＬＰ４−６０−ＧＨ、およびＥＬＰ１−９０−カルシトニンを含んだ。
４つのペプチドは、大量に産生するのがより困難であると分かった。これは、サイズ、溶解性、タンパク質溶解の傾向を含むペプチドの多様な性質を踏まえれば、驚くべきことではない。困難なペプチドによる融合タンパク質である、ＥＬＰ−アドレノメデュリン（ＡＭ）、ＥＬＰ−副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＥＬＰ−デフェンシン、およびＥＬＰ−成長ホルモンを産生することに成功した。しかし、対象ペプチドからのＥＬＰの切断後において、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）による切断系が不十分であるか、またはペプチドが不溶性であった。ＥＬＰ−成長ホルモンの切断は、部分的に達成されただけであり、ＥＬＰ−ＡＭ、ＥＬＰ−ＰＴＨ、およびＥＬＰ−デフェンシンの切断後にはペプチドが残らなかった。これらの結果は、医薬的に有意義なペプチドのクロマトグラフィー法によらない精製に対して、ＥＬＰ系が有する柔軟性および広範な適用を実証する。
（実施例８）
融合タンパク質の活性
融合ペプチドによる治療用タンパク質は、以下の４つのタンパク質：青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、およびインターロイキン１受容体拮抗物質（ＩＬ−１Ｒａ）を用いて産生した。各組成物は、ＥＬＰ１［Ｖ５Ａ２Ｇ３−９０］を用いて、ＥＬＰ／タンパク質およびタンパク質／ＥＬＰの両方の配向で産生された。
８つの融合構築物のリンカー：
ＣＡＴ／ＥＬＰ ＣＡＴ−ＶＥＮＬＹＦＱＧＧＭＧ（配列番号５９）−ＥＬＰ
ＥＬＰ／ＣＡＴ ＥＬＰ−ＶＰＧＷＰＳＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＨ（配列番号６０）−ＣＡＴ
Ｔｒｘ／ＥＬＰ Ｔｒｘ−ＧＳＧＳＧＨＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＫ（配列番号６１）−ＥＬＰ
ＥＬＰ／Ｔｒｘ ＥＬＰ−ＶＰＧＷＰＳＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＨ（配列番号６２）−Ｔｒｘ
ＢＦＰ／ＥＬＰ ＢＦＰ−ＶＤＫＬＡＡＡＬＤＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＫ（配列番号６３）−ＥＬＰ
ＥＬＰ／ＢＦＰ ＥＬＰ−ＶＰＧＷＰＳＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＨ（配列番号６４）−ＢＦＰ
ＩＬ−１Ｒａ／ＥＬＰ ＩＬ−１Ｒａ−ＬＥＮＬＹＦＱＧＧＭＧ（配列番号６５）−ＥＬＰ
ＥＬＰ／ＩＬ−１Ｒａ ＥＬＰ−ＶＰＧＷＰＳＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＨ（配列番号６６）−ＩＬ−１Ｒａ
８つのタンパク質融合構築物すべてをＢＬＲ（ＤＥ３）細胞内に形質転換し、５０ｍＬ ＴＢ培地においてトリプリケートで増殖させ、ＩＴＣにより精製した。ＩＴＣの１ラウンド中において、ＮａＣｌを添加することにより相転移を誘導してＴｔを低下させ、遠心分離により大型のミクロンサイズの凝集物を回収する。低イオン強度の緩衝液中にペレットを再懸濁させた後、低温でのスピンによりＥＬＰ融合タンパク質ペレット中に捕獲された不溶性混入物質を除去する。各融合構築物は、３〜５回ずつ相転移を繰り返し通過し、純タンパク質を得た。
すべての構築物について、タンパク質／ＥＬＰ融合体の収量は、ＥＬＰ／タンパク質構築物の収量よりも高量であったが、２つの配向による収量間の比率は、標的タンパク質のサイズに依存する（表４）。ＥＬＰ／タンパク質配向において、小型タンパク質であるＴｒｘおよびＩＬ−１Ｒａについて得られる収量は、大型タンパク質であるＣＡＴおよびＢＦＰの収量よりも著明に高量である。
Figure 2010502734
Ｔｒｘ／ＥＬＰおよびＢＦＰ／ＥＬＰについては、非融合の遊離標的タンパク質と比較した活性の著明な変化が観察されていない（Trabbic-Carlson K, et al. Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17:57-66; Meyer DE, Chilkoti A, Nat. Biotechnol. 1999, 17:1112-1115）のに対し、ＣＡＴ／ＥＬＰは、遊離ＣＡＴと比較して約１５％のわずかな活性の低下を示す。既に、ＩＬ−１Ｒａ／ＥＬＰ活性が、遊離ＩＬ−１Ｒａと比較して１００倍を超えて低下することが判明しており、これが、これらのＥＬＰ融合タンパク質について観察された最大の差である（Shamji, Setton et al.、報道記事に収載）。
２つの融合構築物におけるＴｒｘ活性は、Ｈｏｌｍｇｒｅｎにより記載されたインスリン還元アッセイ（11. Holmgren A., J. Biol. Chem. 1979, 254:9627-9632; Holmgren A., Bjornstedt M., Methods Enzymol. 1984, 107:295-300）により測定した。実質的な酵素反応において、インスリン中のジスルフィド結合が還元される一方、ＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に酸化され、これは、３４０ｎｍにおける分光光度法により追跡される。各実験において、初期速度は２５℃で測定し、比活性に換算した。３つの精製バッチの各々に対し、３回ずつアッセイを実施した。２つの融合構築物のＵ／融合タンパク質ｍｇ単位による比活性を、表４に示す（Ｔｒｘアッセイにおける１Ｕは、１分間当たり１ｎモルの基質の変換である）。２つのＴｒｘ構築物の間で比活性の差が観察されており、ＥＬＰ／Ｔｒｘの比活性は、Ｔｒｘ／ＥＬＰ活性の約６０％にまで低下している。
２つの異なる配向においてＥＬＰに融合したＣＡＴの活性を、基質である１−デオキシクロラムフェニコールの酵素的なアセチル化により決定した。活性は、３回の精製の各々について、トリプリケートで測定した。残存する基質および形成された産物は、薄層クロマトグラフィーにより分離した後で、両者の蛍光強度を測定した。２つのＣＡＴ構築物の比活性は、Ｕ／ｍｇ単位で表４に記録する（１Ｕは、１分間当たり１ｎモルの基質の変換である）。ここで、ＥＬＰ／ＣＡＴ構築物の比活性が、ＣＡＴ／ＥＬＰと比較して低下していることがわかる。著明な低下が観察され、ＥＬＰ／ＣＡＴ融合タンパク質においては、約３７％の活性が残存するに過ぎない（表４）。
ＩＬ−１Ｒａは、インターロイキン１受容体をめぐりインターロイキン１（ＩＬ−１）と競合し、該拮抗物質の効力は、活性ＩＬ−１Ｒａが細胞の増殖を阻害する細胞増殖アッセイにより測定される。ＥＬＰ融合体の形態または非融合の市販拮抗物質の形態におけるＩＬ−１Ｒａの存在および不在下で、７２時間にわたり、ヒト末梢血白血球ＲＰＭＩ１７８８を増殖させた。増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイにより測定した。２つの融合構築物の活性を、表４で一覧にする。ＣＡＴおよびＴｒｘと同様に、ＩＬ−１Ｒａもまた、ＥＬＰ／タンパク質配向において活性の低下を示し、ＩＬ−１Ｒａ／ＥＬＰは、ＥＬＰ／ＩＬ−１Ｒａよりも４倍強力である。非融合ＩＬ−１Ｒａと比較して、遊離ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１Ｒａ／ＥＬＰよりも約３００倍高活性である（ＩＬ−１ＲａのＥＣ５０は、１．６ｎｇ／ｍｌ）。
ＢＦＰは、生物活性タンパク質ではなく、近紫外領域において発光する。蛍光発光は、タンパク質の３次構造変化について高感度の測定法であり、ここでは、２つのＢＦＰ融合構築物間における構造的差異を評価するのに用いる。各ＢＦＰ構築物の蛍光スペクトルは、３８５ｎｍでの励起後における４３０〜６００ｎｍから採集されている。曲線を統合し、曲線下面積をタンパク質質量で規格化した。結果を表４で一覧にする。蛍光測定についてＢＦＰ／ＥＬＰと同じ範囲において濃度を得るために、これらの実験で用いられたＥＬＰ／ＢＦＰは、２種類の１Ｌ培養液から増殖させた。タンパク質質量による規格化の後、２つのＢＦＰ構築物間には蛍光の著明な差が観察されない。
融合タンパク質の転移温度（Ｔｔ）は、アクセス可能な表面積の疎水性／親水性比率に対して高感度である。ＥＬＰ／タンパク質構築物は、ＢＦＰ構築物を除いて逆配向の融合体ほど活性でなく、この活性の低下が主要な構造的な変化のためであるとすれば、転移温度が変化するであろう。各構築物の光学濃度の変化が、３５０ｎｍでの１５〜９０℃において追跡され、Ｔｔは、転移の中間点として導かれた（図４および表４）。各融合タンパク質の濃度は２μＭであり、これは、一部のＥＬＰ／タンパク質構築物の極めて低い収量のために選択された。図４は、ＰＢＳ緩衝液における、Ａ．Ｔｒｘ／ＥＬＰ（黒丸）、ＥＬＰ／Ｔｒｘ（白丸）、ＩＬ−１Ｒａ／ＥＬＰ（黒逆三角）、およびＥＬＰ／ＩＬ−１Ｒａ（白逆三角）、ならびに、Ｂ．ＢＦＰ／ＥＬＰ（黒四角）、ＥＬＰ／ＢＦＰ（白四角）、ＣＡＴ／ＥＬＰ（黒三角）、ＥＬＰ／ＣＡＴ（白三角）の各２μＭ融合構築物について、温度の関数としての濁度の上昇を示す。Ｔｔは、各転移曲線の中間点として計算し、表４に示す。
ＥＬＰ／ＴｒｘおよびＥＬＰ／ＩＬ−１Ｒａの転移温度は、そのタンパク質／ＥＬＰ対応物よりも転移温度が高い。Ｔｒｘ構築物およびＩＬ−１Ｒａ構築物が、それぞれ５．６℃および２．８℃ずつ異なるのに対し、２つのＣＡＴ構築物の間の差は、ほとんど無視できる（図４ＡおよびＢ、表４）。ＥＬＰ／ＢＦＰが、１種類の転移を示し、６２．４℃において大型の凝集物を形成するのに対し、ＢＦＰ／ＥＬＰ構築物は、全く異なるパターンを示す。この融合タンパク質は、ＥＬＰ／ＢＦＰとほぼ同じ温度で凝集物を形成し始めるが、温度が上昇するにつれ凝集物は分解され、代わって、ＢＦＰ／ＥＬＰ構築物はミセル様の構造を形成する。ミセル様構造形成の転移温度もまた、曲線の中間点として記録され、ＢＦＰ／ＥＬＰの第２の転移温度として表４に示される。
ＮａＣｌを添加することにより誘導した凝集相を繰り返し通過した後で遠心分離工程を行い、最後に得られたペレットを緩衝液中に再懸濁させる、逆転移サイクリングにより８つの構築物すべてを精製した。精製過程後のＥＬＰ／タンパク質融合体の最終収量は、それら各々のタンパク質／ＥＬＰ構築物と比較して低いが、より小型の標的タンパク質は、比較的高収量を有する。低収量は、精製時における多量の消失によるのではなく、翻訳時における標的タンパク質のミスフォールディングによる可能性が極めて高い、ＥＬＰ／タンパク質の発現レベルの低下の結果である。精製ＥＬＰ／タンパク質は、標的タンパク質のネイティブな折り畳みとやや異なる形で折り畳まれると推定され、ＢＦＰを除いて、いずれの比活性も、ＥＬＰ／タンパク質配向における方が低い。加えて、ＥＬＰ／タンパク質構築物について測定された転移温度は、やはりＢＦＰの場合を除き、タンパク質／ＥＬＰ構築物と比較してやや高い。転移温度が、融合タンパク質の疎水性／親水性比率に依存することは、ＥＬＰ／タンパク質構築物が、ネイティブな折り畳みとは異なる形で折り畳まれていることを示す。
（実施例９）
ＥＬＰ１の半減期
ＥＬＰ１の薬物動態は、脚部／脇腹にＦａＤｕ異種移植を有するヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）に［１４Ｃ］ＥＬＰ１を静脈内投与し、投与後の各時間経過後に血液試料を採取することにより決定した。血液濃度の経時推移および血漿半減期（初期ｔ１／２αおよび終末ｔ１／２β）を図５に示す。血中薬物動態は、高分子に対する特徴的な分布および排出応答を示し、これは、二重指数関数過程により十分に記載された。
図５における血漿濃度の経時推移曲線は、排出応答および分布応答（図５に実線で示す）を共に近似する２区画モデル（2 compartment model）の解析解に適合し、関連する薬物動態パラメータを表５に示す。ＥＬＰの分布容積（１．３３８μｌ）が、仮説的な血漿容積である１．３６３μｌとほぼ同一であった（Barbee, R.W., et al., Am. J. Physio. 263(3)(1992) R728-R733）ことは、ＥＬＰが、投与直後に特定の器官および組織へと急速に分布または結合しなかったことを示す。ＡＵＣは、中枢区画または血漿中におけるＥＬＰへの累積的な曝露の測定量である。体内クリアランスは、体内におけるＥＬＰ排出の、その血漿濃度と比較した比率として定義され、腎臓、肝臓などを含むすべての器官を通してのクリアランスの総和である。長い終末半減期（ｔ１／２β＝８．３７時間）および低い分布容積（すなわち、血漿容積とほぼ等しい）など、これらの薬物動態パラメータは、充実性腫瘍および潜在的には他の疾患部位への治療剤の送達に好適であると考えられる。これは、こうした値が、他の奏効する薬剤担体に見られる場合（R. Duncan, Nat. Rev. Drug. Discov. 2(5)(2003) 347-360）と同様の形でＥＰＲ効果を利用するのに適する特性をＥＬＰが有することを示すからである。
Figure 2010502734
物質移動速度定数は、標準的な２区画モデルに由来する（ｋ１、中枢区画から抹消区画へ；ｋ２、抹消区画から中枢区画へ；およびｋｅ、中枢区画からの排出）。分布容積（Ｖｄ）、中枢区画濃度の経時推移曲線下面積（ＡＵＣ）、および体内クリアランス（ＣｌＢ）を示す。データは、平均値（ｎ＝５、Ｖｄを除き、初期血漿濃度（Ｃ０）は、ｎ＝３を有する類似のコホートから計算した）として示す。
（実施例１０）
ヌードマウスにおけるＥＬＰの血中分布
１４Ｃで標識したＥＬＰ１−１５０および／または１４Ｃで標識したＥＬＰ２−１６０
ＦａＤｕ腫瘍を有するヌードマウスに、１４Ｃで標識したＥＬＰ１−１５０および／または１４Ｃで標識したＥＬＰ２−１６０を投与した（平均±ＳＤ、ｎ＝６）。腫瘍は、ＥＬＰの投与後に４１．５℃の水浴中で加熱した。図６に見られる通り、分布は、最高血液含量器官である、肝臓、腎臓、脾臓、および肺において最高である。
１４Ｃで標識したＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］
１５μＭの血漿濃度で、ヌードマウスに１４Ｃで標識したＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］（Ｔｔ＞６０℃）を投与した。ＥＬＰ濃度は、ヌードマウスの右後脚に位置する、植え込んだＦａＤｕ腫瘍の１時間の加熱（４１℃）後に決定した。データは、平均に９５％信頼区間を加えて示す（Ｎ＝６）。
結果は、組織型に対する組織グラム（ｇ）当たりの注入用量（ＩＤ）百分率グラフの形で、図７に示す。ＥＬＰ濃度は、１４Ｃで標識したＥＬＰ２−［Ｖ１Ａ８Ｇ７−１６０］の全身投与後１．５時間において測定した。最高の分布は、最高血液含量器官である、肝臓、腎臓、脾臓、および肺において見られる。
本明細書では、本発明の特定の態様、特徴、および例示的実施形態について本発明を記載してきたが、本発明の利用性は、このように限定されるのでなく、むしろ、本発明分野における当業者に示唆される通り、本明細書の開示に基づく他の多数の変更、改変、および代替的実施形態に拡張され、これらを包括することを理解されたい。
これに対応して、以下に特許請求の範囲が主張される本発明は、その意図および範囲内にあるすべてのこうした変更、改変、および代替的実施形態を含むものとして、広く理解および解釈されることを意図する。

Claims (22)

  1. 少なくとも１つのペプチド活性治療剤と結合した少なくとも１つのエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）を含む、融合タンパク質（ＦＰ）治療用組成物。
  2. 前記ＥＬＰが、Ｎ末端またはＣ末端にて前記ペプチド活性治療剤と共有結合している、請求項１に記載のＦＰ治療用組成物。
  3. 少なくとも２つのペプチド活性治療剤を含み、一方のペプチド活性治療剤がＮ末端にて前記ＥＬＰと共有結合し、他方のペプチド活性治療剤がＣ末端にて前記ＥＬＰと共有結合している、請求項１に記載のＦＰ治療用組成物。
  4. 前記ペプチド活性治療剤が、前記ＥＬＰと結合していない対応するペプチド活性治療剤と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ効力が増強されていることを特徴とする、請求項１に記載のＦＰ治療用組成物。
  5. 前記ｉｎ ｖｉｖｏ効力の増強が、溶解性、生物学的利用性、生物学的利用不能性、有効治療量、製剤適合性、タンパク質溶解抵抗性、投与されたペプチド活性治療剤の半減期、投与後の体内での残存率、および投与後の身体からのクリアランス速度からなる群より選択される特徴の増強を含む、請求項４に記載のＦＰ治療用組成物。
  6. 前記ＥＬＰと前記ペプチド活性治療剤との間にスペーサー部分をさらに含む、請求項１に記載のＦＰ治療用組成物。
  7. 前記スペーサー部分が、前記組成物の薬物動態を制御する部分、プロテアーゼ非感受性部分、非ペプチド化学的部分、トロンビン、第Ｘａ因子、血液プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、カテプシン、Ｌｙｓのアミン基に付着できるホモ二官能性リンカー、一方の末端にてＣｙｓに付着でき、他方の末端にてＬｙｓに付着できるヘテロ二官能性リンカー、およびタンパク質を抗体のＦｃ領域に連結できる二官能性リンカーからなる群より選択される、請求項６に記載のＦＰ治療用組成物。
  8. 前記スペーサー部分が、式［（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ］ｍ（式中、ｎは１〜４（端値を含む）であり、ｍは１〜４（端値を含む）である）を有する非切断性スペーサー部分からなる群より選択される部分を含む、請求項６に記載のＦＰ治療用組成物。
  9. 前記ＥＬＰが、反復ペプチド配列を含み、前記反復ペプチド配列が、ポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド、ポリヘキサペプチド、ポリヘプタペプチド、ポリオクタペプチドおよびポリノナペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載のＦＰ治療用組成物。
  10. 前記ＥＬＰが、ポリマー反復またはオリゴマー反復を含み、前記反復が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される、請求項９に記載のＦＰ治療用組成物。
  11. 前記ペプチド活性治療剤が、インスリンＡペプチド、Ｔ２０ペプチド、インターフェロンアルファ２Ｂペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、小ヘテロダイマーパートナーオーファン受容体、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメイン、グルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン、Ｇタンパク質アルファＱ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼペプチド、Ｇタンパク質アルファＳ．アンジオスタチン、青色蛍光タンパク質、カルモジュリン、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、インターロイキン１受容体拮抗物質、ルシフェラーゼ、組織トランスグルタミナーゼ、モルヒネ調節神経ペプチド、神経ペプチドＹ、オレキシンＢ、レプチン、ＡＣＴＨ、カルシトニン、アドレノメデュリン、副甲状腺ホルモン、デフェンシンおよび成長ホルモンからなる群より選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載のＦＴ治療用組成物。
  12. 前記ＥＬＰが、ペンタペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＧｌｙまたはＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、任意の天然または非天然のアミノ酸残基であり、Ｘは、ポリマー反復またはオリゴマー反復の間で任意選択により変動してもよい）のオリゴマー反復を含む、請求項１に記載のＦＴ治療用組成物。
  13. 前記ポリマー反復またはオリゴマー反復のＸ成分が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン残基からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 少なくとも１つのエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）と連結された少なくとも１つのペプチド活性治療剤を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子治療用組成物。
  15. 前記ヌクレオチド配列が、発現制御エレメントに操作可能に連結している、請求項１４に記載の融合遺伝子治療用組成物。
  16. 前記発現制御エレメントが、プロモーターを含む、請求項１５に記載の融合遺伝子治療用組成物。
  17. ペプチド活性治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ効力を増強する方法であって、前記ペプチド活性治療剤を少なくとも１つのエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）と結合させて、融合ペプチド治療用組成物を形成することを含み、前記ペプチド活性治療剤は、ＥＬＰと結合していない対応するペプチド活性治療剤と比較してｉｎ ｖｉｖｏ効力が増強されていることを特徴とする方法。
  18. 前記ｉｎ ｖｉｖｏ効力の増強が、タンパク質分解に対するペプチド活性治療剤の安定化である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｉｎ ｖｉｖｏ効力の増強が、ペプチド活性治療剤の生物学的利用性の増大である、請求項１７に記載の方法。
  20. ペプチド活性治療剤を必要とする対象を治療する方法であって、前記患者に、（ｉ）少なくとも１つのＥＬＰと連結されたペプチド活性治療剤、または（ｉｉ）発現制御エレメントに操作可能に連結した、ペプチド活性治療剤と少なくとも１つのＥＬＰとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む治療用組成物を投与することを含む方法。
  21. 治療剤がＥＬＰとコンジュゲートしている、治療剤剤形。
  22. 経口または非経口投与用に適合されている、請求項２０に記載の治療剤剤形。
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