CN108368165A - 用于治疗颅内出血相关症状的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗颅内出血(ICH)患者的方法和组合物。所述方法包括使用如含有乳铁蛋白重组构建体的产物，以及乳铁蛋白和IgG的Fc结构域的融合蛋白的构建体。

Description

用于治疗颅内出血相关症状的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年6月24日提交的标题为“用于治疗颅内出血相关症状的方法和组合物”的美国临时专利申请No.62/184,049的优先权，其全部内容通过引用方式并入到本文中。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是由美国政府支持，并在美国国立卫生研究院授予的NS090650号批准下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及用于治疗颅内出血(ICH)及其相关病症的方法和组合物。
背景技术
颅内出血(ICH)是一个严重的公共健康问题，其在所有中风亚型和长期失能类疾病中死亡率最高，且没有FDA批准的有效疗法。在世界范围内，虽然颅内出血住院人数增加，但死亡率并没有下降。ICH引起瞬间质量效应，破坏周围脑组织，常常导致神经系统早期死亡，并且在蛛网膜下腔出血的情况下延迟脑缺血(DCI)和脑血管痉挛。颅内出血(ICH)由大脑内部或表面的血管破裂/病变导致的渗漏或爆裂引起，导致脑损伤和神经损伤。发生ICH后，沉积的血液首先通过压迫脑组织(质量效应)，然后通过脑组织(包括血管)血肿成分的有害化学作用造成损伤。血液沉积导致溶血产物(例如铁)的毒性，氧化应激，促炎反应，免疫细胞募集，蛋白水解酶介导的细胞外基质修饰，血脑屏障破坏和致命的脑水肿。由于ICH的多因素性，因此治疗该疾病的特定疗法难以实现。由于对ICH没有有效治疗方法，使得获得一种对ICH有效的治疗方法是一个长期而亟待解决的过程。
乳铁蛋白(LTF)也被称为乳铁传递蛋白，是一种众所周知的内源性糖蛋白，其具有抗微生物和免疫调节功能，能够抑制炎症反应并促进修复，同时由于LTF属于转铁蛋白家族的铁结合糖蛋白，因此还能有效的螯合游离铁。乳铁蛋白是一种保守的由约692个氨基酸残基组成的，单体分子量80-kDa的单链多肽链糖蛋白，广泛存在于各种分泌液中，如牛奶，唾液，眼泪，支气管，鼻腔分泌物，肠道分泌物以及中性粒细胞次级颗粒。乳铁蛋白也存在于粒细胞(多形核白细胞；PMN)的次级颗粒中，并由一些腺泡细胞分泌。可以从牛奶中纯化或以重组蛋白形式获得乳铁蛋白。乳铁蛋白是调节免疫应答的关键组分，特别是对于先天性与适应性组分之间的协调作用以及相关的应答反应。先天性组分的参与导致触发信号通路以促进炎症，当特异性免疫应答发生或上调时，以确保入侵病原体一直处于被检查的状态。而乳铁蛋白是参与上述过程的关键分子。
乳铁蛋白是一种高度保守的单体分子量80-kDa的单链多肽链糖蛋白，由两个高度同源的片段组成，命名为C端片段，每个片段都能结合单个三价铁离子(Fe3+)。在这方面，乳铁蛋白被认为是一种抗氧化剂，因为其结合铁的能力能够抑制铁催化下H2O2和·OH(42-45)的形成。最终，结合Fe3+的乳铁蛋白被安全地转运到巨噬细胞或其他细胞内在胞内被利用或储存。LTF还与过敏反应中的调节组分共同影响免疫调节功能，并保护机体免受线粒体功能障碍的影响。
众所周知，乳铁蛋白是一种具有抗微生物和免疫调节功能的内源性糖蛋白，能够抑制炎症反应并通过其与游离铁的有效螯合促进修复。然而，由于LTF在血液中半衰期短且难以穿透血脑屏障，其治疗潜力非常有限。
LTF可迅速从体循环中被清除(几分钟的半衰期)。因此，尽管乳铁蛋白具有上述的多种活性，仍然需要开发一种有效的乳铁蛋白构建体，其能够为治疗哺乳动物疾病提供一种有利的治疗方法。
最近，乳铁蛋白融合蛋白在现有技术中被公开，如PCT/JP2013/062685和美国专利US20150093382，然而，内源LTF需要进一步优化，从而使这种融合蛋白能进一步改善认知过程和神经功能，以及改变损伤区域的细胞反应，如改善小神经胶质细胞的抗炎反应，减少嗜中性粒细胞的浸润及降低神经元的死亡量。
发明内容
本文公开了用于有效预防和治疗与颅内出血(ICH)或其他相关病症相关的症状的组合物和方法。这些组合物包含多种形式的乳铁蛋白以及乳铁蛋白融合蛋白，包括但不限于人乳铁蛋白(hLTF)与IgG的Fc片段组成的新型融合蛋白(PRC14)。因此，为了优化乳铁蛋白的治疗能力并提高其稳定性和生物利用度，在一些实施例中，重组融合蛋白PRC14的获得延长了LTF的生物利用度，并且在另外的一些实施例中增加了LTF的治疗有效性。
本文一些实施例中，公开了包含乳铁蛋白编码序列和与乳铁蛋白编码序列融合的免疫球蛋白IgG Fc结构域编码序列的重组多肽。关于该多肽的一些实施例中，所述多肽进一步包含了IgG铰链编码序列，其中铰链编码序列位于乳铁蛋白编码序列和Fc结构域编码序列之间，在另一个实施例中，IgG Fc结构域编码序列为免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列，在又一个实施例中，IgG铰链编码序列是免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列。在一些实施例中，编码序列是人源的。在所述多肽的另一个实施例中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：2，在另一个实施例中，所述多肽糖基化从而形成糖基化多肽，并且在又一个实施例中，所述糖基化多肽是N-连接型。在一些实施例中，所述多肽进一步包含接头序列(linker sequence)，其中接头包含两个氨基酸，在另一个实施例中所述接头包含GS序列。
在本文的一些实施例中，公开了一种独立的重组多聚核苷酸分子，其包含一段核酸序列，所述核酸序列编码一段具有乳铁蛋白编码序列的多肽，以及与乳铁蛋白编码序列融合的免疫球蛋白IgG Fc结构域编码序列。在另一个实施例中，所述多聚核苷酸还包含IgG铰链编码序列，在又一个实施例中，IgG铰链编码序列为免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列。在一些实施例中，编码序列是人源的，并且在其他实施例中，核酸序列包含SEQ ID NO：1。在一些实施例中，人IgG亚型的核心序列包含IgG1(SEQ ID NO：3)；IgG2(SEQ ID NO：4)；IgG3(SEQ ID NO：5)；IgG4(SEQ ID NO：6)。
本文的其他实施例中，公开了一种表达载体，所述表达载体包含一段异源启动子序列，所述序列与编码权利要求2多肽的核酸序列相连接。在所述表达载体的一些实施例中，核酸序列包含SEQ ID NO：1。在进一步的实施例中，所述载体能够在哺乳动物细胞、CHO细胞、酵母细胞、或昆虫细胞中表达。在本文的一些实施例中公开了一种宿主细胞，其包含编码权利要求2多肽的多聚核苷酸分子，在进一步的实施例中，所述多核苷酸分子编码SEQID NO：2的多肽。在另一个实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、CHO细胞、酵母细胞或昆虫细胞。在本文的一个实施例中公开了一种组合物，所述组合物包含一种多肽，所述多肽包含乳铁蛋白编码序列和与乳铁蛋白编码序列融合的免疫球蛋白IgG Fc结构域编码序列，以及药学上可接受的载体。在所述组合物的另一个实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO：2，并且在所述组合物的其他实施例中，所述载体是水溶液，盐水或粉末。在又一个实施例中，所述组合物被冷冻或冻干。
另一个实施例，公开了用于治疗或预防受试者颅内出血或其相关病症的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的包含上述多肽的组合物，其中所述多肽包含乳铁蛋白编码序列和与乳铁蛋白编码序列相融合的免疫球蛋白IgG Fc结构域编码序列。在所述方法的一个实施例中，所述多肽通过鞘内，颊部，口服，局部，皮内，皮下，鼻内，肌内，静脉内，动脉内或直接进入组织部位等方式施用。在进一步的实施例中，相关病症是由于颅内出血导致的认知或神经功能障碍，炎症，感染，水肿或脑萎缩。在一些实施例中，优化内源性LTF包括改善认知过程和神经功能，以及改变损伤区域中的细胞反应，例如改变小胶质细胞的抗炎反应，减少嗜中性粒细胞的浸润和降低神经元死亡量。在一些实施例中，认知过程是允许执行复杂功能的大脑操作，诸如但不限于记忆，语言和对情绪的控制等。
附图的简要说明
图1描述了载体pUC57序列和限制酶图谱。通过重叠PCR制备人乳铁蛋白人IgG2Fc融合基因，并使用EcoRI和HindIII将其进一步亚克隆到pUC57中从而获得pKN009-LF-hFc。
图2描述了pKN009-LF-hFc表达载体的图谱。利用Hind III和EcoR I位点将乳铁蛋白-hIgG2-Fc融合蛋白的DNA序列设置于受CMV启动子的调控。
图3描述了纯化的乳铁蛋白-hIgG2-Fc融合蛋白(PRC14：LF-hG2)的SDS PAGE图。根据SDS PAGE的结果，终产物接近单一，且分子量约为120kD。
图4描述了通过HPLC分析的结果证明乳铁蛋白-hIgG2Fc融合蛋白的纯度高于97％。
图5是一种乳铁蛋白-hIgG2-Fc融合蛋白PRC 14的示意图。
图6描述了神经元细胞的免疫组化染色。图A：在置于RBC-裂解物24小时后，原代神经元-神经胶质共培养物中MAP2标记的神经元(绿色)与GFAP标记的星形胶质细胞(红色)。箭头表示肿胀和破碎的神经元胞体和树突。星形胶质细胞不易受到损伤。图B：置于在含有或不含LTF的RBC裂解物24h后，在神经元-神经胶质培养物中存活的NeuN+-神经元的数目。数据是平均值±标准差(n＝15)。*p≤0.05。
图7描述了大鼠神经元细胞的免疫组化染色。上部图：PKH26-标记的凋亡嗜中性粒细胞(ANs；红色)被清除之后，鬼笔环肽-FITC标记(Phalloidin-FITC-labeled)的大鼠小胶质细胞(MMΦ；绿色)。箭头表示被包裹的ANs。细胞核用DAP I染色(蓝色)。底部图：在置于PKH26-标记的ANs4小时后，ANs的清除指数(平均值±标准差，n＝3)。LTF(rhLTF)增强了ANs的清除作用。*p<0.05。
图8(左图)显示ICH后第7天用普鲁士蓝反应测定的脑血肿中残余三价铁(平均值±标准差)。右图：在ICH后24小时用10mg/kg rLTF处理的SD大鼠，其在ICH后的指定时间的NDS(神经功能障碍指数)值。*p<0.05，在指定时间点的两组之间；n＝9。
图9描述了C57/BL小鼠在ICH后3d的神经功能障碍评分(NDS)(神经功能障碍指标，通过放置反应实验、踩空实验和圆筒实验的评分获得)，所述C57/BL小鼠在ICH开始后24h，用rLTF，优化的LTF(PRC14)或PBS处理。*相对于媒介物，p<0.05，#相对于LTF，p<0.05，n＝9。
图10显示乳铁蛋白融合蛋白(FcLTF)对表格第1组(Network 1)中基因的激活。
图11：通过rhLTF对表格第1组中基因的激活，表明WBCs置于FcLTF导致IL1A(>50倍的增长)和IL17a二聚体的表达水平大幅提高，而WBCs置于rhLTF则抑制(<20倍)相同IL17a二聚体的表达。
图12显示全血细胞置于rhLTF增加IL6的表达，进而导致趋化因子的活化。然而，WBCs置于FcLTF导致IL6表达水平较低，使得趋化因子的表达水平也较低。
图13说明WBCs置于rhLTF增加了IL10表达(>3倍)，从而激活了MHC Class 1，TH1细胞因子，INFA1/IFNA13和IL17的表达。同时，WBCs置于FcLTF减少了IL-10的表达(减少1.5倍)，并似乎降低了同样基因(MHC Class 1，TH1细胞因子，INFA1/IFNA13和IL17)的表达。
图14描述了具有类似上调/下调控制模式的基因的表格组成。
图15显示基于每组、每个时间点的平均值，采用WinNonlin计算重组人乳铁蛋白(rhLTF)的药代动力学数据。通过从所有时间点中减去第0分钟时间点的值来对数据点进行校正。
图16显示了基于每组、每个时间点的平均值，采用WinNonlin计算重组乳铁蛋白融合蛋白(FcLTF：PRC14)的药代动力学数据。通过从所有时间点中减去第0分钟时间点的值来对数据点进行校正。
图17显示小鼠脑中的乳铁蛋白免疫荧光。在实验动物患ICH 6小时后，经静脉注射生理盐水(图A)或50mg/kg的PRC14(图B)的处理，并且在3小时后，使用免疫组化分析脑中是否含有乳铁蛋白。绿色表示含有乳铁蛋白的组织。在脑冠状切片中划线区域突出了受ICH影响的大脑。注射了PRC14(图B)的动物脑内含有大量的乳铁蛋白。这表明PRC14进入了受ICH影响的大脑。图C和图D是图B脑的高放大倍数图，显示经处理过的动物的脑中PRC14的含量。受ICH影响的脑区域乳铁蛋白存在于血管周围(标记为CD31；红色)。
图18显示了rhLTF和PRC14(优化的LTF)对ICH小鼠神经功能障碍(NDS)的影响。在治疗之前(第1日；黑色)和治疗之后3天(第3日；蓝色)评估Grand NDS(通过应用如下的一组行为测试来计算神经功能缺损评分：姿态弯曲实验，放置反应实验，踩空实验和圆筒实验)，治疗过程为静脉推注10mg/kg的rhLTF，PRC14或媒介物(生理盐水)，然后以1mg/kg的剂量在第2日和第3日进行口服。*p<0.05，与媒介物对照组在相同时间点ICH的比较(ICH后的第3日)。#p<0.05，在第3日与rhLTF组相比较。PRC14降低NDS的效果要优于rhLTF。
图19显示了PRC14对ICH后小鼠神经功能障碍(NDS)和脑水肿的剂量反应。图A：在第3日和第10日的Grand NDS(单项测试的综合评分)，图B：在ICH后第10日，每个单独行为测试(姿态弯曲实验，放置反应实验，踩空实验和wire)表现的评分，图C：在脑水肿的第3日(受ICH影响的纹状体(Ipsi)和对侧纹状体(Contra)中的脑水含量，平均值±标准差，n＝5)。PRC14(0.1-20mg/kg)首先在ICH后3小时由静脉输液给药，然后在第1日和第2日通过腹腔注射给药。*p<0.05，与所示组相比。尽管在所有三组中，1，5和20mg/kg的PRC14是有效的，但是5mg/kg组似乎为神经功能恢复和脑水肿提供了最佳保护。
图20显示了施用PRC14(5mg/kg)对于ICH小鼠中NDS(图A和图B)和脑水肿(面板C)的减少效果，图例如图A所示。图A：在第1日，第3日，第7日和第10日时，Grand NDS受到的影响。图B：在ICH后的第10日，单独行为测试评分(姿态弯曲实验，放置反应实验，踩空实验和wire)受到的影响。图C：在第3日时脑水肿受到的影响(受ICH影响的同侧(Ipsi)纹状体和对侧(Contra)纹状体中的脑水含量，平均值±标准差，n＝5)。给予PRC14(5mg/kg)1)在3小时+24小时+48小时；仅在24小时；或(第2日后24小时，第3日后24小时，第4日后24小时，第5日后24小时)。*p<0.05，与同一时间点的载体对照组相比。
具体实施方式
本文公开的实施例中提供了用于治疗或预防受试者颅内出血(ICH)或相关病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的包含乳铁蛋白的组合物。
在多种实施例中，乳铁蛋白是重组多肽。在上述实施例中，乳铁蛋白被优化为包含重组多肽的融合蛋白，所述重组多肽包含乳铁蛋白编码序列和来自IgG的Fc受体的编码序列。
在其他实施例中，所公开的方法可用于治疗由脑水肿或神经功能障碍症状引起的病症。在一些实施例中，乳铁蛋白包含一个融合多肽，所述融合多肽包含乳铁蛋白编码序列和来自IgG2的Fc结构域的编码序列。例如，乳铁蛋白可以包含一个融合多肽，所述融合多肽包含人乳铁蛋白编码序列；和来自人IgG2的Fc结构域的编码序列；或乳铁蛋白可以包含一个多肽，所述多肽包含乳铁蛋白融合蛋白PRC14的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示(如以下实施例中所详述的)。在各种实施例中，乳铁蛋白可以是人源乳铁蛋白或是具有N-型多糖连接多肽链的完全人源重组乳铁蛋白。在其他实施例中，重组乳铁蛋白能够在细菌，昆虫或哺乳动物细胞的表达系统中表达。在又一些实施例中，重组乳铁蛋白的表达包括但不限于在细菌，昆虫或哺乳动物细胞中的表达，例如但不限于在中国仓鼠卵巢细胞或人细胞中的表达。
在进一步的实施例中，提供了一种多聚核苷酸分子，其包含编码本发明实施例的乳铁蛋白多肽的核酸序列。在一些实施例中，重组多肽包含乳铁蛋白编码序列和来自IgG2的Fc结构域的编码序列。在其他实施例中，所述多肽是包含人源乳铁蛋白编码序列和人源IgG2的Fc结构域编码序列的融合蛋白。在另外的实施例中，所述多肽包含编码如SEQ IDNO：2的核酸序列，或者所述多肽包含如SEQ ID NO：1的核酸序列。
在一些实施例中，编码多肽的核酸序列可操作地连接到一个启动子上。在某些实施例中，启动子可以是在哺乳动物，细菌或昆虫细胞中具有功能的启动子。在一些实施例中，多聚核苷酸分子可以是某一表达载体的一部分，如质粒、附加型表达载体或病毒表达载体。在其他实施例中，所述多聚核苷酸分子包含编码上述乳铁蛋白多肽的核酸序列，上述编码多肽的核酸序列可操作地连接在一个启动子上。在一些实施例中，所述启动子是指在哺乳动物细胞中具有功能的启动子，并且所述多聚核苷酸是表达载体的一部分，如质粒或病毒表达载体。
在又一个实施例中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本发明实施例中的乳铁蛋白多肽的多聚核苷酸分子。在一些实施例中，所述宿主细胞可以是细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些特定的实施例中，宿主细胞是人类细胞，诸如多能细胞。
在进一步的实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含本发明实施例中的多肽，所述多肽设置于一种药学上可接受的载体中。在各种实施例中，所述组合物可以被冷冻或冻干。在各种实施例中，所述载体可以是水溶液(例如但不限于生理盐水)或例如粉末。在各种实施例中，所述组合物通过口服、局部、皮内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鼻内或直接给药等方式被施用到组织部位。
在另一个实施例中，提供了一种用于治疗或预防受试者颅内出血或相关病症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述组合物包含上述实施例中的多肽、多聚核苷酸或细胞。如上所述的这种包含乳铁蛋白的组合物，通过口服、颊部、局部、皮内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鼻内、鞘内或直接给药等方式施用到受试对象的组织部位，所述受试对象包括但不限于共生动物(companion animal)或人。
在其他实施例中，公开了组合物，所述组合物包含为水溶液或粉末重组人乳铁蛋白，其中所述乳铁蛋白能够抑制人类ICH患者的神经功能障碍、水肿、脑萎缩，并改善患者的脑清除作用(除去死亡脑组织和血肿成分)。在另一个实施例中，所述乳铁蛋白是人乳铁蛋白。在其他实施例中，所述乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白。在一些实施例中，所述乳铁蛋白为具有与蛋白质链相连接的N-型多糖的完全人源化重组人乳铁蛋白。在另外的实施例中，所述重组人乳铁蛋白能够在哺乳动物表达系统中表达。在一些实施例中，所述哺乳动物表达系统使用人肾上皮细胞系。在其他实施例中，所述哺乳动物表达系统使用中国仓鼠卵巢细胞系。
在一些实施例中，本文公开了一种组合物，其包含人LTF与IgG的Fc结构域(LTF-hIgG-Fc)形成的的融合物,其为水溶液或粉末，其中重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白能够抑制由ICH引起的神经功能障碍、水肿和脑萎缩。在一些实施例中，重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白是人LTF和IgG的新生儿Fc受体的融合物。在一些实施例中，重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白能够在哺乳动物表达系统中表达。在一些实施例中，所述哺乳动物表达系统使用人肾上皮细胞系。在其他实施例中，所述哺乳动物表达系统使用中国仓鼠卵巢细胞系。
本文实施例中，还公开了一种方法，所述方法使用LTF为由ICH引起的神经功能障碍、水肿、脑清除和脑萎缩需要接受治疗的患者提供治疗。在其它实施例中使用重组LTF-Fc融合蛋白为由ICH引起的神经功能障碍、水肿、脑清除和脑萎缩需要接受治疗的患者提供治疗。在一些实施例中，公开了一种使用重组LTF治疗患有ICH的患者，以改善神经功能障碍、水肿、脑清除或脑萎缩的方法。在其他实施例中，公开了一种使用重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白治疗患有ICH的患者以改善相关的神经功能障碍、水肿、脑清除或脑萎缩的方法，在另外的实施例中是使用重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白来治疗需要此种治疗的患者的方法。在一些实施例中，是用重组LTF-hIgG-Fc融合蛋白治疗需要这种治疗的患者，以改善相关的神经功能障碍、水肿、脑清除或脑萎缩的方法。在一个优选的实施例中，所述患者是共生动物(companion animal)或人。
在另一个实施例中，公开了一种组合物，所述组合物包含为水溶液或粉末的乳铁蛋白，其中所述乳铁蛋白具有预防、抑制或减少ICH在人体内引起的神经功能障碍、水肿和脑萎缩的能力。在一个实施例中，乳铁蛋白是人乳铁蛋白。在另一个实施例中，乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白。在另一个实施例中，乳铁蛋白是具有与多肽链相连接的N-型多糖的完全人源化重组人乳铁蛋白。在又一个实施例中，重组人乳铁蛋白能够在哺乳动物表达系统中表达。在另一个实施例中，所述哺乳动物表达系统是人肾上皮细胞系。在另一个实施例中，所述哺乳动物表达系统是中国仓鼠卵巢细胞系。
在另一个实施例中，公开了一种组合物，所述组合物包含人乳铁蛋白与IgG的Fc结构域(Fc hLTF)形成的融合物，其为水溶液或粉末，其中所述重组Fc hLTF具有预防、抑制或减少ICH在人体内引起的神经功能障碍、水肿和脑萎缩的能力。在另一个实施例中，重组FchLTF是人乳铁蛋白和人IgG中Fc结构域的融合物。在另一个实施例中，重组Fc hLTF能够在哺乳动物表达系统中表达。在另一个实施例中，所述哺乳动物表达系统是人肾上皮细胞系。在另一个实施例中，所述哺乳动物表达系统是中国仓鼠卵巢细胞系。
在本文所述的实施例中，体外细胞培养系统与ICH啮齿动物模型的临床相关性被用于确定乳铁蛋白是否具有作为治疗ICH合适备选药物的生物学特性。在一些实施例中，LTF可有效地抵抗引起ICH发病的多种因素，并且在ICH的实验模型中提供了强有力的保护。在另外的实施例中，LTF-hIgG-Fc融合蛋白(PRC14)甚至比单独使用LTF的治疗更有效。因此，在另外的实施例中，与rhLTF相比，LTF-hIgG-Fc融合蛋白(PRC14)被认为具有更高的生物利用度，更好的治疗功效和更低的毒性。
在一些实施例中，本发明描述了PRC14的效果-一种基于rhLTF和IgG的新生儿Fc受体形成的新的多效融合蛋白-用于治疗颅内出血(ICH)。
在一些实施例中，公开了LTF具有多效性作用机制，所述作用机制可有效抵抗引起ICH发病的多种因素，在其他实施例中，LTF在ICH的实验模型中提供强有力的保护作用，并且在进一步的实施例中，与LTF相比，包含rhLTF与IgG的新生儿Fc受体(PRC14)的优化乳铁蛋白融合蛋白更有效。因此，相比较天然形式的LTF，本实施例具有多种优势。
在一些实施例中，与LTF相比，Fc-融合蛋白具有延长血浆半衰期、改善稳定性、改善生物膜透过性(包括血脑屏障(BBB))、更高性价比的纯化、并且可以提供免疫细胞更优的靶向性。因此，在一些实施例中，Fc融合蛋白提供了一种用于治疗患有ICH或ICH相关病症的患者的方法。
在本文的一些实施例中，公开了LTF多肽或融合蛋白(例如但不限于LTF-hIgG-Fc融合蛋白)的保守变体，其中“保守”氨基酸取代的含义是指氨基酸多肽中的某个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代后，如大小或电荷。在某些实施例中，多肽的某个保守氨基酸被取代后，依然保留着未取代多肽的至少一种活性。保守的氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成的方式而不是在生物系统合成中被引入。这些包括但不限于模拟肽以及氨基酸基团的其他翻转或转换形式。
在一些实施例中，天然存在的残基可以基于侧链性质分为：疏水性(Met，Ala，Val，Leu，Ile)；中性亲水性(Cys，Ser，Thr，Asn，Gln)；酸性(Asp，Glu)；碱性(His，Lys，Arg)；影响链取向的残基(Gly，Pro)；和芳香族(Trp，Tyr，Phe)。例如，非保守的取代可能涉及将其中一个类别的一个残基取代为另一个类别的一个残基。
在取代过程中，根据某些实施例，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数。根据疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被赋予一个亲疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在基于亲疏水性指数进行改变时，在某些实施例中，包括亲疏水性指数差值在±2范围内的氨基酸的取代。在某些实施例中，包括亲疏水性指数差值±1范围内的取代，在某些实施例中，包括亲疏水性指数差值±0.5范围内的取代。
本领域技术人员还应理解，基于亲水性可以有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在由此产生的具有生物功能的蛋白质或肽可用于免疫学实施例中的情况下，正如在本申请中这样。在某些实施例中，蛋白质的最大局部平均亲水性(greatest local averagehydrophilicity)由相邻氨基酸的亲水性决定，并与其免疫原性和抗原性相关，即，与该蛋白质的生物学性质相关。
亲水性值已被赋予下述氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在某些实施例中，包括亲水性值差值在±2范围内的氨基酸的取代，在某些实施例中包括差值在±1范围内的取代，并且在某些实施例中，包括差值在±0.5范围内的取代。
根据某些实施例，氨基酸的取代有如下所述几种：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成的蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和/或(4)赋予或修饰所述多肽的其他物理化学或功能性质。
根据某些实施例，在天然存在的序列中可以进行单个或多个氨基酸取代(在(保守性氨基酸取代)的情况下)，并且在某些实施例中，所述取代在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中进行。在某些实施例中，保守氨基酸取代通常可能不会在实质上改变参考序列的结构特征(例如，在某些实施例中，取代的氨基酸不应破坏参考序列的螺旋结构，或破坏参考序列特征其他类型的二级结构)。
一些实施例公开了一种核酸，其包含编码LTF或LTF融合蛋白功能结构域的核苷酸序列。在一些实施例中，所述核酸编码SEQ ID NO：2或其片段中至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,75,100,125,150,175,200,205,210,215,220,225,228,229,230,235,240250,255,260,265,270,275,280,285,290,295,300,305,310,315,320,325,350,375,400,500,600,700,800,900个或更多的连续的氨基酸。此外，在一些实施例中，是上述任意取值点之间衍生出的任一大小的核酸。
在其他实施例中，本发明提供了一种多肽或编码一种多肽核酸，在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO:2或其活性片段的氨基酸具有约70％至约75％的氨基酸一致性(或同源性)；在进一步的实施例中，该一致性(或同源性)介于约75％与约80％之间；在进一步的实施例中，该一致性(或同源性)介于约80％至90％之间；或甚至更进一步的，该一致性(或同源性)介于约90％和约99％之间。
本文根据相关氨基酸序列的长度确定一致性(或同源性)百分比。因此，如果本发明的多肽包含在一个更大的多肽内，则所述一致性同源性百分比仅考虑对应于本发明多肽的多肽部分而不是相对于全部较大多肽同源性百分比。关于核酸序列的“一致性百分比”或“一致性％”，是指使用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)比对至少两个多聚核苷酸序列之间相同核苷酸的百分比。
在一些实施例中，不管编码序列本身的长度如何，核算片段可以与其它DNA序列如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、额外的限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码片段及类似片段相连接。在一些实施例中，例如，重组核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2氨基酸序列或其片段的核苷酸序列，可操作地连接至异源启动子上。
在某些实施例中，本发明提供了一种核酸，所述核酸通过使用适当的引物从模板核酸上扩增得到，所述引物可与SEQ ID NO：1(编码乳铁蛋白融合蛋白PRC14的核酸序列)共同使用。
在一些实施例中，公开了包含本文所述的核酸序列之一的重组宿主细胞。在一些实施例中，公开了包含本文公开的多肽之一的蛋白质组合物。
在一些实施例中，LTF或LTF融合蛋白具有SEQ ID NO：2的全部或部分氨基酸序列，或保留LTF或LTF融合蛋白的生物学活性的生物学活性片段，或所述LTF或LTF融合蛋白是SEQ ID NO：2或其片段经生物学活性保守氨基酸分子取代后获得的变体。
在一些实施例中，表达载体包含AAV病毒载体。在一些实施例中，启动子是组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子是CMV启动子或CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子杂合体(CAG)的启动子。在其他实施例中，所述的启动子是一个诱导型启动子和/或细胞类型特异性启动子。
氨基酸序列：上述多种实施例中所用的肽氨基酸序列包括如本文所述的LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14)的氨基酸序列，及其类似物和衍生物，以及功能片段，所述的功能片段例如但不限于视紫红质域(rhodopsin domain)。事实上，在一些实施例中，可以使用由特定核苷酸序列编码任何预想的肽氨基酸序列，因为可以使用任何一种多聚核苷酸序列编码所需肽氨基酸的全部或任何部分序列。遗传密码的简并性是众所周知的，因此，编码LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14)肽氨基酸的核苷酸序列通常以公知的核酸“三联体”密码子为代表，或在不同条件下可以编码氨基酸的密码子。因此，如本文所公开的，当组合这些遗传密码时(参见例如“Molecular Cell Biology”，109页表4-1(Darnell etal.,eds.,W.H.Freeman&Company,New York,NY,1986))，所述的LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14)的肽氨基酸序列，通常是编码这些氨基酸序列的核酸序列的所有多种排列和组合。
这种功能等同的肽氨基酸序列(保守取代)包括但不限于，在由核苷酸序列编码的氨基酸序列内氨基酸残基的添加或取代，其结果为沉默变化，从而产生在功能上等同的基因产物。氨基酸取代可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行取代。例如：非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
可以根据氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)选择性地进行保守氨基酸的取代。跟据其疏水性和电荷特性(如上所述)，每种氨基酸都被赋予一个亲疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在本领域中，使用亲水氨基酸指数评价蛋白质相互作用的生物学功能是已知的(Kyte and Doolittle,J.Mol.Biol.157:105-132,1982)。已知在某些情况下，某些氨基酸可被具有相似亲疏水性指数或数值的其他氨基酸取代，并仍保持相似的生物学活性。在基于亲疏水性指数进行改变时，某些实施例中，包括亲疏水性指数差值在±2内的氨基酸的取代，而在其他实施例中，包括差值在±1内的氨基酸取代，并且在另外的实施例中，包括差值在±0.5内的氨基酸取代。
在一些实施例中，保守性氨基酸的取代可以基于亲水性进行，特别是在由此产生的具有生物功能的蛋白质或肽用于免疫学实施例中的情况下。在某些实施例中，蛋白质的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸的亲水性决定，这与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。下述的亲水性值(hydrophilicity values)被赋予给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在某些实施例中，包括亲水性值差值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施例中包括差值在±1内的取代，并且在某些实施例中包括差值在±0.5内的取代。
融合蛋白：融合蛋白为多肽或肽或删除或突变的肽与其无关的蛋白质、多肽或肽的融合，并且可以基于期望的肽的编码核酸和/或本文所述的氨基酸序列设计融合蛋白。此类融合蛋白包括但不限于：IgG Fc融合物(如本文所述的PRC14)，其使蛋白质或肽更稳定并延长体内半衰期；可与能够使融合蛋白锚定于细胞膜的任何氨基酸序列融合；可与提供标记功能的酶、荧光蛋白或发光蛋白融合。
在某些实施例中，可以通过利用抗体来选择性结合被表达的融合蛋白以对融合蛋白进行纯化。在备选的实施例中，可以通过将编码肽的核酸序列亚克隆到重组质粒或其一部分中进行融合蛋白的纯化，在翻译中所述融合蛋白的氨基末端(N-末端)或羧基末端(C-末端)融合有六个组氨酸残基组成的标签(a"His-tag"；see,e.g.,Janknecht et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-8976,1991)。将表达这种构建体的细胞提取物加载到Ni2+次氮基乙酸-琼脂糖柱上，用含咪唑的缓冲液选择性洗脱带有组氨酸标记的蛋白质。
重组表达：虽然如一些实施例中所描述的肽氨基酸序列可以是化学合成的，但是也可以使用重组DNA技术制备较大的多肽序列，所述重组DNA技术为本领域所熟知的用于表达包含编码所需肽的核酸序列的核酸的一种技术。这样的方法可以用于构建表达载体，该表达载体含有编码肽的核苷酸序列以及适当的转录和翻译控制信号。所述方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组技术(参见例如，"Molecular Cloning,ALaboratory Manual,"和"Current Protocols in Molecular Biology,")。或者，在一些实施例中，编码所需肽编码核苷酸序列的RNA和/或DNA可使用化学合成的方法获得，例如合成仪(参见例如"Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach"(Gait,ed.,IRLPress,Oxford,United Kingdom,1984))。
在一些实施例中，多种宿主表达载体系统可用于表达编码肽的核苷酸序列。当所需的肽或多肽是可溶性的或是一种可溶性衍生物时，可以从宿主细胞培养物中获得，例如，在肽或多肽未分泌的情况下从宿主细胞中获得，以及在肽或多肽被宿主细胞分泌的情况下从培养基中获得。然而，合适的表达系统也包括工程宿主细胞，所述工程宿主细胞表达能够锚定在细胞膜上的所需多肽或功能等价物。可以使用合适的去污剂和脂质胶束以及本领域技术人员熟知的方法，从上述表达系统中纯化或富集所需的肽。此外，这样的工程宿主细胞还可以用于下述情况：在保持肽的结构和功能特征的同时，还可评估其生物活性，例如，在某些药物的筛选试验中。
在某些应用中，需要瞬时表达系统。但是，对于重组蛋白质或肽的长期、高产生产而言，通常优选稳定表达。例如，可以稳定表达所需蛋白质、多肽、肽或融合蛋白的细胞系，可用于工程化。相比于包含病毒复制起点的表达载体，在一些实施例中，可以将由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)，和选择性标记控制的DNA转入宿主细胞。在一些实施例中，在引入外源DNA之后，可使工程化细胞在富集培养基中生长约1-2天，然后转移至选择性培养基。重组质粒中的选择标记具有选择性抗性，并可以使细胞稳定地将质粒整合到其染色体中并形成整合体，进而可被克隆并扩增成为细胞系。该方法可用于构建表达所需基因产物或其某部分的细胞系。此类工程细胞系在筛选和评估影响所需蛋白质、多肽或肽的内源活性的化合物中可能特别有效。
多种选择系统可以被采用，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler etal.,Cell 11:223-232,1977)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska andSzybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026-2034,1962)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817-823,1980)基因，它们可分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。抗代谢物抗性也可以作为选择下列基因的基础：二氢叶酸还原酶(dhfr)，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567-3570,1980,and O’Hare etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527-1531,1981)；鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan and Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072-2076,1981)；新霉素磷酸转移酶(neo)，赋予氨基糖苷G-418的抗性(Colbere-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1-14,1981)；以及潮霉素B磷酸转移酶(hpt)，赋予潮霉素的抗性(Santerre et al.,Gene 30:147-156,1984)。
在一些实施例中，可用于提供所公开方法中的组合物的宿主细胞/表达系统，包括但不限于，用含有编码所需肽的核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtiiis))；用含有编码所需肽的核苷酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))；用含有编码所需肽的核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染、或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统，所述表达载体含有编码所需肽的核苷酸序列；或用包含一个重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述重组表达构建体包含编码所需肽的核苷酸序列和来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5K启动子)。
在一些实施例中，可以根据表达的所需基因产物的用途，选择有利的细菌体系和多种不同的表达载体。例如，当需要生产大量的所述蛋白质时，如为了获得包含所需肽的药物组合物，或为了产生针对蛋白质的抗体，则需要一种能够指导易被纯化的融合蛋白质产物的高水平表达的载体。所述的载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther andMuller-Hill,EMBO J.2:1791-1794,1983)，其中肽编码序列可以单独地连接到具有lacZ编码区的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye and Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3110,1985,and Van Heeke and Schuster,J.Biol.Chem.264:5503-5509,1989)；等等。也可以使用pGEX载体(GE Healthcare,Piscataway,NJ)表达融合蛋白，所述融合蛋白由所需的肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)组成。通常，所述的融合蛋白是可溶的，并且可以很容易地从裂解细胞中通过谷胱甘肽-琼脂糖纯化柱吸附进行纯化，随后在游离的谷胱甘肽下进行洗脱来实现。pGEX载体在设计时包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便克隆编码所需肽的基因的产物可从GST部分被释放。
在一些实施例中，公开了一种示例性的昆虫系统，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)，用作表达所需肽的编码序列的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可将编码所需肽的序列单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并受AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控。成功地插入编码所需肽的序列将导致多角体蛋白基因失活并产生非包涵体重组病毒(即，缺乏多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳的病毒)。然后用重组病毒感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，从而使插入的多聚核苷酸在其中表达(参见例如Smith et al.,J.Virol.46:584-593,1983,和美国专利No.4,215,051)。
在一些实施例中，大量基于病毒的表达系统，可以用于哺乳动物宿主细胞。在用腺病毒作为表达载体的情况下，可将编码所需肽的核苷酸序列连接到一个腺病毒转录/翻译控制复合物上，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合序列插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如区域E1或E3)将获得能自主复制且能够在被感染的宿主中表达所需肽产物的重组病毒(参见例如Logan and Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655-3659,1984)。插入的编码所需肽的核苷酸序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。所述信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况下，也可提供外源的翻译控制信号，所述的翻译控制信号可能包括，ATG起始密码子。此外，起始密码子应与编码所需肽的序列具有同相的阅读框，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，如天然的和合成的。表达效率可以通过包含适当的转录增强子元件，转录终止子等来增强(参见例如Nevins,CRCCrit.Rev.Biochem.19:307-322,1986)，并且在一些实施例中，在酵母中，可以使用大量含有组成型或诱导型启动子的载体。
在植物相关的一些实施例中，可以使用多种不同的植物表达载体，并且编码所需肽的序列的表达可由多种启动子中的任何一种启动子驱动。例如，可以使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA或19S RNA启动子(Brisson et al.,Nature 310:511-514,1984)，或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu et al.,EMBO J.6:307-311,1987)。或者，可以使用植物启动子如RUBISCO的小亚基的启动子(Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1679,1984,andBroglie et al.,Science 224:838-843,1984)或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley et al.,Mol.Cell.Biol.6:559-565,1986)。可以使用例如Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射或电穿孔将这些构建体导入植物细胞。
在其他实施例中，可以选择宿主细胞，所述的宿主细胞能够调控插入的编码所需肽的序列的表达，或在预期的形态下，能够修饰和加工编码所需肽的核酸序列。蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可能影响蛋白质的某些功能。对于蛋白质和肽的翻译后进行的加工和修饰，不同的宿主细胞具有特有的特征和特定的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保所需蛋白质、多肽或肽按照正确或所需的修饰和加工方式进行表达。为此，可以使用真核宿主细胞，所述的真核宿主细胞具有对初级转录本按照所期待进行加工的细胞机制，以及对编码所需肽的核酸序列进行糖基化和/或磷酸化能力。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、VERO细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、HeLa细胞、猴肾细胞(COS)、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞、WI38细胞、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)以及U937细胞。
作为治疗剂的组合物：LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14)或其活性片段可用作治疗剂。在某些实施例中，目前公开的组合物可用于改善与ICH相关病症或相关的疾病，并有助于颅内出血(ICH)或ICH相关病症的诊断、预防和/或治疗。在某些实施例中，本发明公开的组合物可以与一种或多种其他的化合物或制剂(“其他的活性药剂”)组合施用，用于治疗、控制和/或预防颅内出血(ICH)或ICH相关病症以外的疾病，并为这种疾病及其症状提供治疗。上述治疗可以以有效治疗剂量施用于患者，以治疗或改善颅内出血(ICH)或ICH相关病症，并用于治疗上述疾病及其症状。治疗有效剂量是指化合物的量足以导致疾病症状的任何发作延迟、改善或延缓。
在其他实施例中，组合物的毒性和治疗有效性可以通过细胞培养物或实验动物的标准制药程序(standard pharmaceutical procedures)确定，例如测定LD50(50％致死的剂量)和ED50(50％治疗有效的剂量)。治疗指数是指毒性和产生治疗效果之间的剂量比，用LD50/ED50的比率表示。优选治疗指数较大的组合物。在某些实施例中可以使用有毒副作用的化合物，但是通常应当注意设计递送系统，从而将所述组合物优先靶向递送到受感染组织部位，以使对未感染细胞的潜在损害最小化，从而减少副作用。
在一些实施例中，本文公开了从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可推算到人用剂量范围。这种组合物的剂量优选处于包括少毒或无毒ED50的循环浓度范围。剂量可以根据所使用的剂型和使用的给药途径在上述范围内变化。对于任何一种组合物，治疗有效剂量最初由细胞培养试验进行推算。根据细胞培养中确定的剂量推算动物模型中的剂量以获得包括IC50在内的循环血浆浓度范围(即被测组合物达到症状半数最大抑制的浓度)。这样的信息可以用于更准确地确定人体中的有效剂量。例如，可以通过高效液相色谱测定血浆中的浓度。
在一些实施例中，针对颅内出血(ICH)或ICH相关病症以外的病症，并为这种疾病及其症状提供治疗时，也可以通过动物研究来确定适当的剂量，以确定受试者每千克体重生物活性剂的最大可耐受剂量或MTD。一般而言，至少对一种哺乳动物进行试验。
此外，在一些实施例中，生物活性剂可以与多种已知的组合物或结构(structures)组合或复合，所述组合物或结构具有例如增强生物活性剂的稳定性、或者增强其药理学性质(例如增加体内半衰期，减少毒性等)的特性。
这样的治疗剂可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法施用，包括但不限于吸入、皮下(sub-q)、静脉内(i.v.)、鼻内(i.n.)，腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)或鞘内注射，或局部施用(透皮、软膏、乳膏、药膏、滴眼液等)，下文会有更详细的描述。
药物组合物：与目前描述的组合物共同使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。
在一些实施例中，药物组合物可以包含用于改变、维持或保持所述组合物例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透等性质的材料。合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸)；填充剂(例如甘露醇和甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；粘合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖，二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；抗成盐离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇和山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20和聚山梨醇酯80)、曲通(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙星)；稳定增强剂(例如蔗糖和山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物(例如氯化钠或氯化钾)、甘露醇和山梨糖醇)；传递载体；稀释剂；辅料；和药物佐剂。
另外，在一些实施例中，所描述的治疗性肽可以与延长半衰期的载体连接。本领域已知某些示例性的半衰期延长载体，包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和右旋糖酐(dextran)(参见例如PCT专利申请公开号WO 99/25044)。
在其他实施例中，可以将这些药剂配制通过注射方式(例如通过团注或连续输注)进行非胃肠道施用。用于注射的制剂可以以单位剂量形式呈现，例如在安瓿中或在多剂量容器中，并添加防腐剂。所述组合物在油性或水性载体中呈悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用隋性载体(例如无菌无热原水)配制。
在一些实施例中，所述制剂还可以配制成用于直肠给药的组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，如含有常规栓剂的基质，如可可脂或其他甘油酯。
除了之前描述的制剂之外，还可以将制剂配制成长效制剂。上述长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射方式施用。例如，制剂可以采用合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)，离子交换树脂或微溶衍生物(例如作为一种微溶盐)配制。如果需要，组合物可以存在于包装或分配装置中，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以包括例如金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以附有给药说明。
活性组合物可以通过控释装置或通过本领域普通技术人员熟知的递送装置给药。这些剂型可以用于提供一种或多种活性成分的缓释或控释，通过例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、PEG微球或它们的组合形式，以提供不同比例的所需释放曲线。示例性的持续释放基质包括但不限于聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer et al.,)以及聚-D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物可以包括脂质体，其可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制备。本领域普通技术人员已知的适宜的控释制剂(包括本文所述的那些)可任意选择以用于本发明公开的组合物。某些实施例包含适用于口服给药的单一单位剂型，例如但不限于，适用于控释的片剂、胶囊、软胶囊和囊片。
在一些情况下，所公开的方法和组合物的活性成分优选不同时或通过不同的施用途径施用于患者。因此，在一些实施例中可以是试剂盒，当医师使所述试剂盒时，可以简化向患者施用适当量活性成分的过程。
在一些实施例中，典型的试剂盒包含一种或多种公开的治疗制剂的单一单位剂型，单独或与另一种制剂的单一单位剂型组合，所述另一种制剂可以与公开的组合物一同使用。披露的试剂盒可以进一步包含用于施用活性成分的装置。所述装置包括但不限于，注射器、滴液袋、贴剂和吸入器。
所披露的试剂盒进一步包含可用于施用一种或多种活性成分药学上可接受的载体。例如，如果活性成分呈固体形式，必须进行配制以用于非胃肠给药，则该试剂盒可以包含含有合适载体的密封容器，使得活性成分可以被溶解以形成无微粒的无菌溶液，从而适合非胃肠给药。药学上可接受的载体的实例包括但不限于：USP注射用水；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏(Ringer’s)注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸林格氏(Ringer’s)注射液；可与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。然而，在特定的实施例中，公开的配方中不含有任何醇类或其他共溶剂，油类或蛋白质。
核酸序列：LTF或LTF融合蛋白核酸序列，用于所公开的方法和组合物中，本发明公开的LTF或LTF融合蛋白的活性部分，例如但不限于编码PRC14的核酸序列(SEQ ID NO：1；和SEQ ID NO：2)。
在一些实施例中，目前公开了LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14)的活性部分的应用，包括本文所述的全部或部分序列(和包含其的表达载体)，以及另外的编码本文公开的LTF或LTF-融合蛋白一个连续的活性部分的核酸序列应用，例如，但不限于PRC14，与LTF或LTF融合物蛋白质(例如但不限于本文所述的高度严格条件下的PRC14)的互补序列杂交的开放阅读框(ORF)，例如在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中，65℃下与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃、0.1x SSC/0.1％SDS下洗涤，("Current Protocols inMolecular Biology,"Vol.1 and 2(Ausubel et al.,eds.,Green PublishingAssociates,Incorporated,and John Wiley&Sons,Incorporated,New York,NY,1989))，并编码一个功能等价的LTF或LTF融合蛋白(或其活性部分)、基因产物或其活性部分。另外公开了在中等严格条件下，例如在0.2x SSC/0.1％SDS中，42℃下洗涤("CurrentProtocols in Molecular Biology,")，编码LTF或LTF-融合蛋白氨基酸序列的DNA序列的互补序列杂交的任何核苷酸序列的应用，但仍编码功能等同的LTF或LTF融合蛋白产物。与LTF或LTF融合蛋白的功能等同物包括但不限于存在于其他物种(直系同源物和同源物)中的LTF或LTF融合蛋白的天然存在形式，及LTF或LTF融合蛋白的突变形式，以及上述物质的天然存在形式或改造形式(通过定点诱变、基因改组或定向进化、如在例如美国专利号5,837,458中所述)或其活性部分。本发明公开还包括使用与LTF或LTF-融合蛋白等同的多聚核苷酸序列的简并核酸变体(由于遗传密码的冗余性)。
另外公开了多聚核苷酸序列编码的LTF或LTF-融合蛋白ORF或其功能等同物的应用，所述功能等同物由与所述LTF或LTF融合蛋白的相应区域具有99％，95％，90％，85％相似性的多聚核苷酸序列所编码(通过使用BLAST序列比较分析，例如使用威斯康星大学GCG序列分析软件包的默认参数进行(SEQUENCHER 3.0,Gene Codes Corporation,Ann Arbor,Ml))。
在某些实施例中，本发明包含编码一个蛋白质或肽的核酸片段和重组载体，如其鉴定及克隆，例如但不限于PRC14(SEQ ID NO：2)，所述蛋白质或肽包含LTF或LTF融合蛋白或其功能部分或变体氨基酸序列，。在一些实施例中，LTF或LTF融合蛋白的一部分，以及几乎不含有和全长LTF或LTF融合蛋白的氨基酸不一致、或生物学功能不同的氨基酸。术语“功能等价物”在本领域中是众所周知的。因此，氨基酸序列具有约70％至约80％与鉴定和克隆的LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14(SEQ ID NO：2))一致或功能等同；或更优选约85％至约90％与鉴定和克隆的LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14(SEQ ID NO：2))一致或功能等同；或甚至更优选约90至95％至约99％之间与鉴定和克隆的LTF或LTF融合蛋白(例如但不限于PRC14(SEQ ID NO：2))一致或功能等同。
无论编码序列本身的长度如何，本发明所述的核酸片段可以与其他序列如启动子、聚腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、或其他编码片段等组合，以至于它们的总长度可能会有很大变化。因此公开了可以使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选要考虑预期重组DNA的易制备性和其使用性。例如，可以制备核酸片段，其包括与编码SEQID NO：2多肽的核酸互补的短序列，其碱基对长度接近或达到，例如约10至15或20或30或40或50或100或200或300或400或500或600个核苷酸。总长约2837、2500、2000、1000、500、200、100和约50个碱基对的DNA片段也被公开，且可以被应用。
在一些实施例中，编码LTF或LTF融合蛋白或其片段氨基酸的核酸以及含有编码LTF或LTF融合蛋白或肽的核酸序列的重组载体，它们都包含有与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，纯化的核酸片段编码LTF或LTF-融合蛋白或其片段蛋白质，所述重组载体可进一步定义为包含与编码LTF或LTF融合蛋白的核酸片段有效连接的启动子的表达载体。
在另外的实施例中，公开与重组载体进行重组的宿主细胞，所述重组载体包含编码LTF或LTF-融合蛋白的核酸片段。重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。如本文所使用的，术语“工程化”或“重组”细胞是指已经导入了重组基因(例如编码LTF或LTF融合蛋白的基因)的细胞。因此，工程细胞与不含重组导入基因的天然细胞是可被区分的。因此，工程化细胞是具有一个或多个被人类导入基因的细胞。重组导入的基因将以基因组基因或cDNA基因的拷贝形式存在，或者包括一个临近启动子位置的基因，该启动子并非天然地与特定导入基因相关联。在一些实施例中，具有由连续核苷酸段组成的序列区的核酸分子，与编码LTF或LTF-融合蛋白的核酸序列相同或互补，所述的连续核苷酸段长约14,15-20,30,40,50或甚至约100至约200个核苷酸左右。如果没有进一步的阐述，相信本领域技术人员可以使用这里的描述来最大限度地利用本发明。这里描述的实施例被解释为说明性的，而不对本发明的其余部分以任何方式进行限制。例如，虽然所描述的实施方式说明了本发明组合物和方法在实验室动物中的用途，但是本领域技术人员将容易认识到，这些方法和组合物也可以应用于人类和兽医用药。
以下示例部分提供了关于各种实施例的示例的进一步细节。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表由发明人发现的功能良好的技术和/或组合物。然而，本领域技术人员根据本发明公开内容应理解，在所公开的具体实施方式中可以做出许多改变，并且仍然可以获得相同或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。这些例子是对本文描述的方法和系统的说明，并非意在限制本发明的范围。这样的非限制性示例包括但不限于下文所提供的这些。
实施例
实施例1
乳铁蛋白-higg2-fc融合蛋白(LTF-hIgG2-Fc：PRC14)的制备和纯化：使用无血清培养基在CHO DG44细胞中制备人LTF-human lgG2Fc融合蛋白(LTF-hIgG2-Fc)，经两步纯化后，去除内毒素和冻干。LTF-融合蛋白(PRC14)的构建：采用重叠PCR技术，制备LTF-hlgG2-Fc融合体，然后使用Freestyle max试剂(Invitrogen,Cat.No 16447,CA USA)将其亚克隆到稳定表达质粒中(图1)，所述质粒可转染于CHO-DG44细胞，以获得LTF-hIgG2-Fc融合构建体。将转染的CHO-DG44细胞在含有甲硫氨酸亚砜(MSX)选择培养基的96孔板中培养，将最佳表达克隆扩增到24孔板，T-25瓶，最后放大到摇瓶系统中以生产初始量的LTF-hIgG2-Fc融合蛋白。收集含有LTF-IgG Fc融合蛋白的培养基，离心，然后用Mabselect Sure(GE)protein-A亲和柱进行纯化。富集的LTF-hIgG2-Fc融合蛋白在专用缓冲液下在阳离子交换柱上进一步纯化。使用内毒素去除树脂(ToxinEraserTM)对PRC14(LTF-hIgG2-Fc)的中试批次进行最终纯化。此构建过程的更详细说明记载在下面的段落中。
质粒构建：通过重叠PCR产生LTF-hIgG2-Fc融合基因，并使用EcoRI和Hindlll将其进一步亚克隆到pUC57中以获得pKN009-LTF-hFc(图1)。表达质粒(图2)。产生的核酸序列(SEQ ID NO：1)包括克隆到载体中的核酸序列(以扩大的粗体红色字体表示)。氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。含有LTF-hIgG2-Fc序列的哺乳动物表达质粒被提取，并进一步用乙醇沉淀，用于DNA的脂质体转染。
蛋白质表达：为了制备融合蛋白质，使用Freestyle max试剂(Cat.No 16447,invitrogenTM,Grand Island,NY,USA)，将表达质粒pKN009-LF-hFc转染至从稳定的CHO-DG44细胞库中获得细胞中(图2)。转染的CHO-DG44细胞在具有MSX选择培养基的96孔板中培养，三周后，使用SDS-PAGE鉴定表达的lactoferrin-hlgG2-Fc融合蛋白，以对每孔中的细胞进行筛选(图3)。优的克隆首先扩增到24孔板中，然后放入T-25瓶中，最后放大到摇瓶系统以制备融合蛋白。培养基是CD CHO培养基(invitrogenTMGrand Island，NY，USA)，这是一种无蛋白质、无血清、且化学成分确定的培养基，以优化CHO细胞的生长及重组蛋白在悬浮培养液中的表达。
蛋白质纯化：首先将收集的上清液10000rpm离心，去除细胞碎片，然后采用MabSelectTM SuReTM(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA，USA)protein-A亲和柱对其纯化(图3，图A)，之后将富集的LTF-hIgG2-Fc融合蛋白置于低盐0.1M NaAc(pH 5.5)缓冲液中，并通过阳离子交换柱(TOSOH：TOYOPEARL GigaCap S-650M)中进一步纯化(图3，图B)。加载和用0.1M NaAc(pH5.5)平衡后，LTF-hIgG2-Fc融合蛋白用含5％海藻糖、1M NaCl的PB缓冲液洗脱。将融合蛋白在PBS(0.15M NaCl，5％海藻糖)中稀释5倍，并且在阳离子交换层析之后，将纯化的Ab加入至高容量内毒素去除亲和柱(目录号：88270；ThermoScientific Pierce,Grand Island,NY,USA)中，并将流通量调整至2.5mg/ml以用于最终的冻干(采用乳铁蛋白UV280摩尔消光系数计算，该系数为1.15)。HPLC分析显示LTF-hIgG2-Fc融合蛋白的纯度大于97％(图4)。
内毒素分析：为了确定纯化产物中是否存在内毒素，FDA批准了试剂盒(#PSD10，灵敏度0.25EU/ml)快速检测内毒素方法(Cape Cod，Inc.，East Falmouth，MA，USA)，其检测过程要遵循制造商的指导。将纯化的融合蛋白用无内毒素水调至0.25mg/ml，并使用PSD10试剂盒确定是否存在内毒素。确保纯化后的融合蛋白制剂中内毒素的含量小于1EU/mL。
实施例2：
乳铁蛋白治疗脑出血(ICH)相关症状体外支持证据。为了表征rhLTF响应于溶血产物以增强脑细胞存活的能力，使用体外“ICH-样”损伤模型。所述模型基于向原代神经元-神经胶质共培养物(由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成的混合脑细胞培养物)中添加RBC-裂解物。如预期的那样，RBC-裂解物对神经元造成损伤(体细胞和树突肿胀，然后裂解)，并且引人注目的是，能够确定LTF(rhLTF)(10μg/ml)的生理学相关浓度极大地减少了由溶血产物引起的神经损伤(更多的NeuN阳性细胞存活)(如图6所示)。
为了表征LTF对小胶质细胞/巨噬细胞(MMΦ)的功能和表型的作用，将rhLTF加入到含有或不含AN(凋亡PMN；细胞凋亡目标-凋亡细胞的吞噬作用)的大鼠初级MMΦ培养基中，并评估rhLTF对细胞增殖过程的影响。通过将新鲜分离的血液PMN在43℃下培养1小时，然后在37℃，5％CO2培养箱中孵育16小时以制备ANs这导致超过95％的PMNs经凋亡而死，并且这些ANs不再含有LTF。确定了MMΦ能够吞噬ANs已经被证实，并且1-100μg/ml的rhLTF以剂量依赖性的方式增强了该过程。用10g/kg处理的结果示于图7中，并且证明了LTF增强了ANs吞噬作用。乳铁蛋白控制的吞噬作用与MMΦ中mRNA表达的下述变化相一致：(1)清道夫受体(scavenger receptors)(例如CD91，CD36-脑清除过程的重要介质)的增加，(2)核因子-红细胞E2-相关因子2(Nrf2)的增加，(3)抗炎因子(精氨酸酶-1，IL-1Ra和TGF)的增加和(4)促炎因子(TNFα，IL-1β，NOX1和MMP9)的减少。这种基因谱总体上代表了MMΦ对“愈合”M2样表型的极化，众所周知，该表型在组织修复过程中起重要作用。因此，LTF可诱导MMΦ分化成促细胞吞噬和抗炎M2表型。Nrf2是抗氧化和解毒反应的转录因子和主调控子，其对于自我保护、其他细胞的保护以及MΜΦ置于“发炎”环境时的清除功能是至关重要的。
实施例3：
使用LTF治疗。啮齿动物ICH的自体血液注射模型：基于纹状体内注射自体血液的小鼠临床相关ICH模型(参见例如71，72，79)。总之，在异氟醚麻醉下将随机选择的雄性小鼠(体重约30g)固定在立体定位框上。在颅骨中钻出一个钻孔，插入31型钢套管，以进行全部新鲜血液(12μl；来自股动脉)输注。手术过程中及术后3小时，核心体温维持在37±0.5℃。
运动功能障碍分析：所有感觉运动测试均在光周期期间进行。预先测试动物。采用一组感觉运动测试。在这个模型中，这些测试对由ICH和局部缺血造成的损伤十分敏感，并且已在发明人的实验室中成功地使用了二十年。为了检测神经学不同方面(运动、反射、平衡和体感)的结果，评估了五项功能结果(粘合剂去除测试、前肢放置测试、圆筒实验、转角测试和食物缺乏测试)(adhesive removal test,forelimb placing test,cylindertest,corner test and food fault test)，并为持续性治疗的效果提供了很大信心。
脑水肿：使用湿重/干重法测量脑水肿。用PBS灌注后，取出脑并将其冷冻。从三个冠状脑切片(40pm)中收集脑组织，以表示针轨迹(needle track)(血液注射部位)的水平，头尾针轨迹间相距0.25mm。在80℃烘箱中干燥，在干燥之前和之后测定组织重量。
血肿大小测量：通过测量ICH后第7天，受血肿影响的脑中剩余的血红蛋白(Hb)量来评估血肿的程度。
功效和数据分析：对于所有的实验，初始功效分析基于a＝0.05和β＝0.2。对于所有的行为测试，我们取n＝10。对于其他的测试取n＝5。根据实验室经验和初步研究，这应该足以检测到20-25％的差异。统计分析将使用Prism和InStat数据分析程序进行。用Bonferroni post-hoc test的重复双向方差分析评估组间和时间的差异。其余的数据将使用单因素方差分析(ANOVA)进行分析。Newman-Keuls验后比较将用于多个测试。当只比较两组数据时，也可使用非配对t检验。其他的方法学细节可以在以下出版物中找到(71,79,89,92-94,96,97,99-119)。
LTF的疗效是通过减轻患有ICH大鼠体内的症状来确定，所述症状包括脑水肿、铁沉积和神经功能障碍。在幼年的啮齿类动物大脑中通常存在有少量的LTF，并且在正常情况下和在患有ICH之后，脑中的LTF mRNA表达水平也可以忽略不计。结果表明LTF在体外具有有益作用，预示LTF治疗对体内ICH相关症状如脑水肿、铁沉积和神经功能障碍具有有益效果。事实上，在ICH后30分钟(使用ICH的临床相关的自体血液注射模型)，静脉注射给药10mg/kg剂量的rhLTF，在ICH后3日后为受试者提供了强有力的保护，通过减少脑水肿(脑水含量76.4％对78.1％；P<0.05；与空白对照(naive control)相比减少了40.5％)以及降低了27.4％的神经功能障碍(NDS)(14.3比19.7；p<0.05)。NDS是来自5个经过良好验证的各项行为测试的复合神经功能障碍评分：姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验、圆筒实验和转圈实验。单项测试均显示了rhLTF治疗后症状显着改善。在另外的研究中，在ICH发作后，rhLTF(10mg/kg，静脉注射)的治疗延迟了24小时。即使延迟了24小时(见图8)，LTF依然显著降低了23.8％(第3天)、45.7％(第7天)和57.8％(第14天)的NDS；这些功能性改善与第7天血肿清除率(43.6％)和ICH沉积铁(39.6％)的改善相符(见图8)。此外，在ICH后第3日，检测受ICH影响的大脑，显示治疗剂量的LTF减少了47％的4-羟基壬烯醛(4-HNE；脂质过氧化指数)的形成，证明LTF在ICH后减少氧化损伤的治疗功效。
实施例4：
乳铁蛋白融合蛋白比乳铁蛋白更为有效。相比于LTF，使用LTF-人IgG Fc-融合蛋白(LTF-hIgG-Fc：PRC14)治疗对于减轻ICH后的症状和神经功能障碍方面更有效。为比较LTF与LTF-人IgG2Fc融合蛋白((LTF-hIgG-Fc：PRC14：图9)的治疗能力，在小鼠患有ICH24h后，将其随机分为3个治疗组。第1组接受10mg/kg rhLTF治疗。第2组：接受10mg/kg LTF-融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc：图9)的治疗。第3组只接受盐水载体。所有治疗均经静脉输注，2天后(ICH后3天)进行行为学评估。与载体对照相比，使用LTF和LTF融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc)治疗显著降低了由ICH和相关症状引起的神经功能障碍，然而，使用诸如放置反应实验、踩空实验或圆筒实验，单独或作为综合评分，LTF-融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc)的治疗效果均要显著强于用LTF治疗后观察到的效果。
LTF多效性的作用模式似乎有效地解决了ICH的多因素病理生物学，如(1)改善铁螯合，(2)细胞保护，(3)减少促炎症反应，和(4)改善清除过程(血肿再吸收/再溶解)。此外，新型LTF融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc)似乎比rhLTF更有效。表明LTF-人IgG Fc-融合蛋白(LTF-hIgG-Fc：PRC14)是一种有效治疗ICH的方法。
实施例5：
用不同形式的LTF处理将导致特定的基因表达模式：人全血培养中的基因表达模式：将单个血库供体静脉血(在EDTA Vacutainer中收集)在无血清RPMI 1640(+L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，Cat#R8758:Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)中稀释到1/5，并加入2-巯基乙醇(5mL/100mL)。使用无菌容器，制备单细胞悬液以分配到10ml细胞培养基中用于不同的处理。
在无菌的50ml锥形管中建立全血细胞(WBC)培养，并将细胞用溶于PBS的rhLTF或PRC14(LTF-hIgG-Fc)融合蛋白处理2小时，所述PBS也用作溶剂对照(vehicle control)。从用rhLTF和PRC14(LTF-hIgG-Fc)融合蛋白或单独的等体积PBS处理的细胞培养液中提取RNA。使用人类先天免疫与适应性免疫反应RT2ProfilerTMPCR芯片(PAHS-052Z)对RNA进行分析，所述涵盖了参与宿主免疫反应的84个基因如趋化因子、细胞因子和受体的表达。
人类先天免疫与适应性免疫反应RT2ProfilerTMPCR芯片涵盖了参与宿主对细菌感染和败血症应答的84个基因的表达。该芯片包括涉及IL-1R和Toll样受体(TLR)信号通路的基因，所述基因包括涉及病原体检测的IL-1R和TLR基因，以及与先天免疫和模式识别相关的基因：受体：DDX58(RIG-I)、NLRP3、NOD1(CARD4)、NOD2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9；细胞因子：CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CSF2(GM-CSF)、CXCL10、IFNA1、IFNB1、IL18、IL1A、IL1B、IL2、IL8、TNF；其他基因：APCS、C3、CASP1(ICE)、CD14、CD4、CD40(TNFRSF5)、CD40LG(TNFSF5)、CD8A、CRP、HLA-A、HLA-E、IL1R1、IRAKI、IRF3、IRF7、ITGAM、LY96(MD-2)、LYZ、MAPK1(ERK2)、MAPK8(JNK1)、MBL2、MPO、MX1、MYD88、NFKB1、NFKBIA(I/Ba/Mad3)、STAT1、TICAM1(TRIF)、TRAF6。与适应性免疫相关的：Th1标记/免疫应答：CCR5、CD80、CXCR3、IFNG、IL18、IL23A、SLC11A1、STAT4、TBX21、TLR4和TLR6。与Th2标记/免疫应答相关的：CCR4、CCR8、CD86、GATA3、IFNB1、IL10、IL13、IL18、IL4、IL5、IL6、NOD2、STAT6；与Th17标记相关的：CCR6，IL17A、RORC、STAT3；与Treg标记相关的：CCR4、CCR8、FOXP3和IL10。与T细胞活化相关的：CD80、CD86、ICAM1、IFNG、IL23A、IL6和SLC11A1；细胞因子：CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CSF2(GM-CSF)、CXCL10(INP10)、IFNA1、IFNG、IL10、IL13、IL17A、IL18、IL2、IL23A、IL4、IL5、IL6、IL8、TNF；以及其他基因：CD4、CD40(TNFRSF5)、CD40LG(TNFSF5)、CD8A、CRP、FASLG(TNFSF6)、HLA-A、IFNAR1、IFNGR1、IL1B、IL1R1、IRF3、IRF7、ITGAM、JAK2、MAPK8(JNK1)、MBL2、MX1、NFKB1、RAG1和STAT1。与体液免疫相关的：C3、CCL2(MCP-1)、CCR6、CRP、IFNB1、IFNG、IL6、MBL2、NOD2和TNF。那些与炎症反应相关的：APCS、C3、CCL5(RANTES)、CRP、FOXP3、IL1A、IL1B、IL4、IL6、MBL2、STAT3和TNF。与细菌防御反应相关的：IFNB1、IFNG、IL23A、IL6、LYZ、MBL2、MYD88、NOD1(CARD4)、NOD2、SLC11A1、TLR1、TLR3、TLR4、TLR6、TLR9和TNF。与病毒引起的反应相关的：CD4、CD40(TNFRSF5)、CD86、CD8A、CXCL10(INP10)、DDX58(RIG-I)、HLA-A、IFNAR1、IFNB1、IL23A、IL6、IRF3、NLRP3、TICAM1(TRIF)、TLR3、TLR7、TLR8和TYK2。
研究表明，根据乳铁蛋白的形式，人WBC基因表达谱不同，具体地，用LTF-融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc)或LTF处理可以对所表达的基因产生非常不同的影响，根据WBC置于LTF-融合蛋白PRC14(LTF-hIgG-Fc：图10)或乳铁蛋白(LTF：图11)的结果所表现出的。
图12说明当人细胞置于LTF-融合蛋白PRC14或rhLTF时，CD80、IFNG、IL1A、IL1B、IL6、TNF、TLR9、CXCL10、TLR7和CD40LG基因表达模式相似，但在表达程度上不同。
图13说明当WBC置于LTF-融合蛋白PRC14或rhLTF时，该基因的表达模式与其正常的表达模式相反。
为了确定这些基因表达模式是否指示特定代谢途径的激活或抑制，将这些表达模式按如图14中的表格(network)分组。
通过LTF融合蛋白PRC14或rhLTF，激活表格第1组中的基因，表明人细胞置于LTF融合蛋白PRC14并未刺激IL17a二聚体或IL-1R基因表达的大量增加(<20倍)，但人细胞置于rhLTF时，会使IL1A和IL17a二聚体的表达水平大幅提高(>50倍的增长)。
通过LTF-融合蛋白PRC14或rhLTF激活表格第2组中的基因，表明相比于将WBCs置于rhLTF(导致IL6的表达增加和趋化因子以及半胱天冬酶的激活)，人类细胞置于LTF-融合蛋白PRC14导致IL6表达水平更低，使得趋化因子和半胱天冬酶的表达水平也更低。
置于LTF-融合蛋白PRC14导致不同的基因表达模式。置于LTF-融合蛋白PRC14降低了IL-10的表达(约1.5倍)并似乎降低了相同基因(MHC 1类、TH1细胞因子、INFA1/IFNA13和IL17)的表达，这些基因在置于rhLTF时表达量会增加，rhLTF增加IL10的表达(>3倍)并且可以激活MHC 1类、TH1细胞因子、INFA1/IFNA13和IL17的表达。
在表格第1组基因中，另一种基因的不同表达模式是由于其暴露在LTF-融合蛋白PRC14和rhLTF下而产生的。将人细胞培养物置于rhLTF会增加IL13的表达，并导致TLR5和Janus激酶(JAK)表达量的降低。相反，置于LTF融合蛋白PRC14会降低IL13的表达同时激活TLR5和JAK的表达。
实施例6：
乳铁蛋白与乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的药代动力学。在一项研究中，通过向Wistar大鼠单次静脉注射CHO-表达的rhLTF和LTF-融合蛋白PRC14，比较两者的药代动力学。本实验中的所有程序均符合“动物福利法”，“实验动物护理和使用指南”和“实验动物福利办公室”的规定。
测试系统：从Harlan实验室(Indianapolis，IN，USA)获得230-250克重的雄性和雌性Wistar大鼠。在由动物房接收后，由经过培训的人员对大鼠进行检查，以确保其健康状况可被接受。
每笼饲养1只大鼠。笼子尺寸达到或超过了ILAR实验室动物护理和使用指南的要求。将大鼠饲养在室温64至84°F(22-24℃)，湿度为40至70％的房间中。房间的光源为日光灯，以12小时光照，12小时黑暗为周期。对于所有大鼠，可以随意食用标准的啮齿类动物饮食(Purina LabDiet 5001)和水。通过供应商提供的营养信息和特定杂质的含量对饲料进行分析。
测试材料：测试材料由PharmaReview Corp.提供，将CHO表达的重组人乳铁蛋白(rhLTF)放置在含有5mg测试材料的玻璃瓶中。将LTF-融合蛋白PRC14放置在塑料小瓶中，且每瓶中含有0.5mg冻干蛋白。测试样品按PharmaReview公司提供的配方说明进行配制。将冻干制剂用细胞培养用水(Cat#17-724Q(Lonza Group Ltd.，Basel，Switzerland))复溶后，进行给药。
rhLTF储备液的制备：将5mg rhLTF溶于5ml去离子的无菌水中(如有需要，可以进行分装)，然后冷冻更长的储存期(数周/数月)。在4摄氏度的环境下储存一或两个星期，其依然是有活性的。
制备LTF-融合蛋白PRC14的储备液：为了说明LTF-融合蛋白PRC14和rhLTF的分子结构的差异，将LTF-融合蛋白PRC14的浓度归一化为1mg/ml。
储存条件：所有测试材料均在4℃储存直至配制。在配制期间，配制的材料在实验室温度下储存。将约100μL的每种配制的测试样品进行冷冻以用于ELISA测试。
测试样品的给药方式：对每只动物称重，测试导管的通畅性，并获取给药前血液样品。按1mL/kg的注射量，根据个体体重以计算剂量。受试动物被限制在Broome-style限制器中进行给药，在此期间，将尾巴在～40℃的水浴中浸泡大约10秒以加热。用酒精浸泡过的纱布擦拭尾巴，并且将静脉内推注剂量递送到每只动物的侧尾静脉中。
采样：在选定的采集时间点(给药前，1、5、10、20、40、80、160和320分钟)，通过已插入每只大鼠的颈静脉导管采集血液。在从导管移除针头之后，从导管抽吸大约100μL材料并处理，然后收集约250μL的血液用于测试。然后在每次血液采集之后用200μL盐水冲洗导管。将血液样品置于K2EDTA试管中并翻转10次，然后置于冰上，在4℃以8000rpm离心5分钟。将血浆移入标记的Eppendorf管并在-80℃下冷冻直至ELISA检测。
ELISA检测：使用AssayPro人乳铁蛋白ELISA试剂盒(Catalog#EL201 1-V.ASSAYPRO LLP,St.Charles,MO,USA)，根据制造商的操作流程测定血浆样品的乳铁蛋白浓度，使用的是血浆样品的稀释液。将血浆样品以1:1200稀释(1份血浆加入至1,199份样品缓冲液中)，测试样品1：500000比例稀释(1份测试样品至499999份样品缓冲液中)。
药代动力学结果：使用WinNonlin计算药代动力学数据，并基于每组、每个时间点的平均值。所有时间点均通过减去0分钟时间点的值来校正数据点，如图15和图16。
表1说明了用rhLTF或LTF-融合蛋白PRC14处理的动物在0-320分钟时间点之间LTF水平提高。该表显示半衰期、曲线下面积(AUC)、最大浓度(Cmax)、平均保留时间(MRT)、体积分布(Vd)和清除率(CL)。与LTF相比，LTF融合蛋白PRC14的半衰期和平均保留时间(MRT)显著增加。
表1
实施例7：
治疗有效的体内证据。在动物患有ICH后6小时，接受静脉内注射盐水(图17A)或50mg/kg优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14：图17B)，并在治疗3小时后，将动物处死并收集脑，使用免疫组化技术分析乳铁蛋白的含量。绿色荧光指示组织中含有人乳铁蛋白(指示存在PRC14；该抗人乳铁蛋白抗体不识别小鼠乳铁蛋白)，红色破折线区域包括了冠状脑切片上受ICH影响的脑区域。可以看出，注射了优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的动物脑切片中含有大量的乳铁蛋白，如图17B所示。在更高的放大倍数下，图17B示出了经优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)处理过的动物的脑实质(血管外)中乳铁蛋白的含量。这些结果表明，注射了优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的动物脑中含有大量的乳铁蛋白。图17C和图17D是图17B脑切片中所示的感兴趣区域的较高放大倍数图像。可以看到用优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)处理的动物的大脑中的大量绿色荧光(乳铁蛋白)。正如所料，似乎这些乳铁蛋白沉积发生在血管区域(使用红色标记的CD31鉴定)。这些发现表明，静脉注射注入的优化乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)进入受ICH影响的大脑并沉积乳铁蛋白。
一项研究旨在比较乳铁蛋白(重组人乳铁蛋白：rhLTF)和优化乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)对ICH小鼠的治疗效果。为了评价对ICH治疗效果，通过使用一组行为测试如姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和圆筒实验确定由一系列测试组合而成的复合神经功能障碍评分(NDS)，也被称为Grand NDS。将小鼠(每组9只)分配到各组，并在治疗前和治疗后第1天(d1；黑色)和第3天(d3；蓝色)进行评估。治疗包括静脉推注10mg/kg乳铁蛋白(rhLTF)，10mg/kg优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)或载体(生理盐水)，然后在d2和d3分别按1mg/kg的剂量口服。
图18说明，尽管经过乳铁蛋白或优化的乳铁蛋白融合蛋白处理后，在第1日(*p>0.05，ICH后在相同时间点与载体对照组相比)到第3日会明显减少所观察到的症状，但优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)疗法比乳铁蛋白(rhLTF)更为有效。
为了确定所需的剂量，基于神经功能障碍评分(NDS：如图19的图A所示)对优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的治疗进行剂量反应研究。通过每个各项行为测试(姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和wire实验，示于图19的图B中)，以及ICH小鼠中的脑水肿(显示在图19的图C中)进行评分。
优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)疗法为：首先在ICH(临床相关延迟)后3小时通过静脉输注优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)，然后在第1天和第2天通过腹膜内(i.p.)注射。将0mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg，5mg/kg和20mg/kg的剂量施用到不同的动物组中(n＝10，n＝10，n＝10，n＝10和n＝3)。结果如图19所示，图A表征了在ICH之后第3天和第10天获得的不同治疗剂量对Grand NDS(各项测试的综合评价)结果的影响。结果如图19所示，图B表征了在ICH之后第10日，不同治疗剂量对每个个体各项行为测试(姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和wire实验)表现评分的影响。结果如图19所示，图C表征了在ICH后第3日，不同治疗剂量对脑水肿的影响(ICH-影响的纹状体(同侧/Ipsi)和对侧纹状体(对侧/Contra)中的脑水含量，数据表征为平均值+/-标准差(n＝5)，与所示组相比，*P>0.05)。
虽然用优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)三种剂量(1、5和20mg/kg)处理具有显著降低ICH症状的作用，但是用5mg/kg进行处理似乎可以对功能性神经恢复和脑水肿提供最优保护。
为了确定理想的治疗给药方案，针对优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)治疗，进行神经功能障碍评分(NDS：如图20的图A所示)研究。通过对患有ICH小鼠的每个个体，进行各项行为测试表现(姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和wire实验，如图20图B中所示)和脑水肿的评分。
将优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)疗法以5mg/kg的剂量给予四组患有ICH的小鼠。第一组(n＝10只小鼠)只接受生理盐水处理(未处理的对照组)；第二组(n＝10只小鼠)在3小时、24小时和48小时接受优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的处理；第三组(n＝12只小鼠)仅在24小时接受优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)处理；和第四组(n＝12只小鼠)分别在24小时(第1天)、第2天、第3天、第4天和第5天接受优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)的处理。
结果如图20所示，图A表示各种治疗方案各时间点对Grand NDS(各个测试的组合)的影响。结果如图20所示，图B表示在ICH之后第10日，各个治疗方案在各时间点对每个个体各项行为测试(姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和wire实验)(Postural Flexing,Forward Placing,Footfaults and Wire)的表现评分的影响。结果如图20所示，图C表征了在ICH后第3日，不同实施例的各时间点对脑水肿的影响(ICH-影响的纹状体(同侧)和对侧纹状体(对侧)中的脑水含量，数据表征为平均值+/-标准差(n＝5)，与所示组相比，*P>0.05)。
该研究结果显示，对于患有ICH的小鼠，在3小时、24小时和48小时的给药方案中，以5mg/kg的剂量施与经优化的乳铁蛋白融合蛋白(PRC14)获得了最好的效果并显著减少与ICH有关的症状，特别是减少Grand ND评分，在第10天获得了每个个体各项行为测试(姿态弯曲实验、放置反应实验、踩空实验和wire实验)的最佳表现以及在ICH后小鼠脑水肿的最好水平。
定义
应当理解的是，前面的一般性描述和下面的详细描述仅仅是示例性和说明性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另有特别说明，单数的使用包括复数，词语“一”或“一个”意指“至少一个”，并且“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式(诸如“包括”和“包含”)的使用不是限制性的。而且，除非另有明确说明，诸如“元件”或“组件”之类的术语涵盖包括一个单元的元件或组件以及包括多于一个单元的元件或组件。
如本文所使用的，术语“约”与百分比或其他数量一起使用时，是指百分比的正负10％或其它数量。例如，术语“约80％”将包括80％±8％。
这里使用的章节标题仅用于编辑目的，并不被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或部分文件(包括但不限于专利，专利申请，文章，书籍和专著)均以其全部内容可用于任何目的的，通过引用方式整体并入本文。如果所纳入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请中的术语的定义相矛盾，则以本文的解释为准。
如本文所用，除非另有说明，否则术语颅内出血(ICH)或ICH相关病症包括但不限于外伤引起的脑内出血(脑内出血)，血管破裂引起的非创伤性颅内出血或脑血管疾病(包括但不限于淀粉样血管病和血管畸形)。还包括原发性和继发性(抗凝血剂诱导的)脑内出血，例如但不限于可能由不充分的血压控制导致的，或者在某些情况下由于使用抗凝血剂、溶解血栓剂和抗血小板药物或任何引起高血压诱导的出血的药物，引发的出血性中风，以及导致脑水肿或神经功能障碍的其他病症。
如本文所用，除非另外指出，否则术语“处理”，“治疗”和“疗法”意为当患者患有ICH或ICH相关疾病时，对该患者的处理。
在文中允许的情况下，术语“处理”，“治疗”和“疗法”也指为确保个体，在ICH、ICH相关疾病或患有与ICH相关的症状(例如但不限于脑内出血，脑水肿或神经缺陷)的患病风险提高时采取的行动，能够在ICH或ICH相关病症发作之前接受适当的手术和/或其他医学干预。能够在如本文所用，除非另外指出，否则术语“防止”，“预防”和“阻止”披露了在患者开始患有ICH或ICH相关病症之前采取的行动，该行动延迟了ICH或ICH相关病症和症状(例如但不限于脑水肿或神经缺陷)的发作，和/或抑制或降低了ICH或ICH相关病症和症状的严重程度。
如本文所用，除非另外指出，术语“控制”，“处理”和“治疗”包括预防、延迟或降低ICH或ICH相关病症和症状患者(例如但不限于脑水肿或神经缺陷)的复发严重程度，所述患者曾经经历过该病症或状态。该术语包括调节ICH或ICH相关病症的阈值、发展和/或持续时间，或改变患者对ICH或ICH相关病症的反应。
如本文所用，且除非另外指明，化合物的“治疗有效量”是足以在治疗或控制ICH或ICH相关病症中提供任何治疗益处的量，或延迟或最小化一种或多种与ICH或ICH相关疾病(例如但不限于脑水肿或神经缺陷)的量。化合物的治疗有效量是指化合物的量单独或与一种或多种在治疗或控制ICH或ICH相关病症或症状中提供任何治疗益处的其它疗法和/或治疗剂的组合。术语“治疗有效量”可以包括减轻ICH或ICH相关病症，改善或减少ICH或ICH相关病症，改善总体疗法或增强另一种治疗剂治疗功效的量。
如本文所用，除非另有说明，有效量的化合物是足以限制/预防或延迟ICH或ICH相关病症，或一种或多种与ICH或ICH相关疾病相关的症状(例如但不限于脑水肿或神经功能缺陷)，或者预防或延迟其复发。化合物的预防有效量是指化合物单独或与一种或多种在预防ICH或ICH相关病症中提供预防益处的其它治疗和/或预防剂组合的量。术语“预防有效量”包括限制/预防ICH或ICH相关病症，改善总体预防或增强另一种预防剂预防功效的量。预防有效量可以在例如ICH或ICH相关病症发展之前进行指定。
如本文所用，“患者”或“受试者”包括能够患有本文所述的ICH或ICH相关病症的哺乳动物生命体，例如人类和非人类哺乳动物，例如但不限于啮齿动物、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、伴侣动物如狗和猫、以及家畜，例如羊、牛、马等。
如本文所用，“乳铁蛋白(LTF)”是一种其氨基酸序列衍生自天然存在乳铁蛋白的多肽，因此如本文所用，乳铁蛋白还包括重组表达的天然和非天然蛋白质和功能变体，例如但不限于以下专利、专利申请和专利公开文本中描述的那些：US6066469；US6277817；US6440690；US6455687；US6569831；US6613741；US7691809；US7354902；US8334254；US20030229925；US20030203839；US20110092411；W01991013982；W01995030339；W01998050543；US20150093382；EP0603187；EP0644899；EP0871724和EP1028977.
如本文所用，“乳铁蛋白融合蛋白”是一种乳铁蛋白，其已被显著修饰以改善活性，例如但不限于提高溶解度、生物利用度、延长体内半衰期和/或提供其他的功能，例如通过与提供标记或酶功能的肽(核酸)融合。实施例包括但不限于已知的乳铁蛋白融合蛋白，诸如将人LTF与新生儿Fc受体(FcRn)的IgG的Fc片段组合的重组融合蛋白，如美国专利公开文本US20150093382中所述的重组融合蛋白，以及本文所述的重组人LTF-hIgG2-Fc融合蛋白(命名为PRC14)。
如本文所用，术语“保守性取代”通常是指保留蛋白质或多肽结构和功能特性的氨基酸置换。这样的功能等同(保守取代)的肽的氨基酸序列包括但不限于导致沉默变化的核苷酸序列编码的氨基酸序列内氨基酸残基的添加或取代，从而产生功能等同的基因产物。基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性，可以进行保守氨基酸取代。例如：非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
没有进一步详述，相信本领域技术人员可以使用本文描述的最大程度地利用本发明。这里描述的实施例被解释为说明性的，而不对本发明的其余部分以任何方式进行限制。虽然已经示出和描述了优选实施例，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明精神和教导的情况下对其进行多种变化和修改。因此，保护范围不受以上阐述的描述限制，而仅由随后的权利要求限制，该范围包括权利要求主题的所有等同物。另外，将每个权利要求作为本发明公开实施例，并入到说明书中。因此，权利要求是对本发明公开实施例的进一步描述和补充。参考文献的讨论并不是承认它是本公开的现有技术，尤其是其公开日期在本申请的优先权日之后的任何参考文献。本文引用的所有专利、专利申请和专利公开文本中的公开内容通过引用形式并入本文，其引用程度在于它们提供的对本文所公开内容所补充的示例性、程序性或其他细节。

Claims (34)

1.一种重组多肽，其包含：乳铁蛋白编码序列；和与所述乳铁蛋白编码序列融合的免疫球蛋白IgG Fc结构域编码序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：包含IgG铰链编码序列，其中所述铰链编码序列位于所述乳铁蛋白编码序列和所述Fc结构域编码序列之间。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：其中所述IgG Fc结构域编码序列是免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：其中所述IgG铰链编码序列是免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：其中所述编码序列是人源的。
6.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于：其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：2。
7.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：其中所述多肽被糖基化以形成糖基化多肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，其特征在于：其中所述糖基化多肽是N-连接的。
9.一种包含编码如权利要求1所述多肽的核酸序列的重组多聚核苷酸分子。
10.根据权利要求9所述的多聚核苷酸，其特征在于：还包含IgG铰链编码序列。
11.根据权利要求10所述的多聚核苷酸，其特征在于：其中所述IgG铰链编码序列是免疫球蛋白G2(IgG2)编码序列。
12.根据权利要求9所述的多聚核苷酸，其特征在于：其中所述编码序列是人源的。
13.根据权利要求12所述的多聚核苷酸，其特征在于：其中所述核酸序列包含SEQ IDNO：1。
14.一种表达载体，所述表达载体包含编码权利要求2所述多肽的核酸序列，以及其连接的异源启动子序列。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于：其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：1。
16.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于：其中所述载体在哺乳动物细胞中表达。
17.根据权利要求16所述的表达载体，其特征在于：其中所述载体在CHO细胞中表达。
18.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于：其中所述载体在酵母细胞中表达。
19.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于：其中所述载体在昆虫细胞中表达。
20.一种宿主细胞，其包含编码权利要求2所述多肽的多聚核苷酸分子。
21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于：所述多聚核苷酸分子编码SEQ IDNO：2的多肽。
22.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于：其中所述细胞是哺乳动物细胞。
23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于：其中所述细胞是CHO细胞。
24.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于：其中所述细胞是酵母细胞。
25.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于：其中所述细胞是昆虫细胞。
26.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的多肽，以及其药学上可接受的载体。
27.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于：其中所述多肽包含SEQ ID NO：2。
28.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于：其中所述载体是水溶液，盐水或粉末。
29.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于：其中所述组合物被冷冻或冻干。
30.一种治疗或预防受试者颅内出血或相关病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含权利要求2所述多肽的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：其中所述多肽经鞘内、颊部、口服、局部、皮内、皮下、鼻内、肌内、静脉内、动脉内或直接施用进入组织部位。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：其中所述相关病症是由颅内出血导致的认知或神经缺陷、炎症、感染、水肿或脑萎缩。
33.根据权利要求1所述的多肽，其还包含接头序列，其中所述接头包含两个氨基酸。
34.根据权利要求33所述的多肽，其特征在于：所述接头包含GS序列。
CN201680048991.8A 2015-06-24 2016-06-24 用于治疗颅内出血相关症状的方法和组合物 Pending CN108368165A (zh)

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