WO2016139354A1 - System zur präsentation von peptiden auf der zelloberfläche - Google Patents

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WO2016139354A1
WO2016139354A1 PCT/EP2016/054682 EP2016054682W WO2016139354A1 WO 2016139354 A1 WO2016139354 A1 WO 2016139354A1 EP 2016054682 W EP2016054682 W EP 2016054682W WO 2016139354 A1 WO2016139354 A1 WO 2016139354A1
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PCT/EP2016/054682
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Daniel IVANUSIC
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Peter Und Traudl Engelhorn-Stiftung Zur Förderung Der Lebenswissenschaften
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Definitions

  • the present application relates to fusion proteins based on tetraspanin proteins, in which the extracellular loop is wholly or partially replaced by peptide sequences of a different composition and their preparation and use as transport vehicle.
  • the disclosed fusion proteins are anchored in the membrane of cells and can be used to present to them fused foreign peptides on the cell surface.
  • genes are DNA and can be found either in the genome or on extra-chromosomal elements. They express primary and secondary gene products, such as RNA and proteins. These can be ecologically modified in many ways.
  • the gene products are predominantly found in the cytosol. Some of the proteins are also found in the intracellular membranes of the compartments and in the outer cell membrane and possibly also the cell wall. Eukaryotes contain proteins and precursor RNAs in the nucleus. Proteins are sorted in intracellular membranes in the cytosol and distributed to cell compartments, but can also be exported by secretion out of the cell. Export proteins from the endoplasmic reticulum (ER) can also be glycosylated in the Golgi apparatus during transport.
  • ER endoplasmic reticulum
  • membrane-bound proteins are actively directed to the cell membrane and anchored there vertically to the membrane. Horizontally, however, they are flexible due to the membrane fluidity able to migrate within membrane. In part are Membrane proteins complexed with other heterologous membrane proteins in the composite. Thus, 80% of human proteins act in associated protein complexes 1 . Some species interact cooperatively with each other in the membrane and form stable structures there.
  • Membrane proteins control a variety of signal processes that allow the cell to interact with its environment. Membrane transport of proteins across the cell membrane in connection with secretion processes to the outside are also possible.
  • the immune system uses MHC membrane proteins on cells to identify potential invading pathogens in the cell. These physiological processes are usually very well established in the cell, and the proteins involved are highly specifically evolved towards this function, i. usually very specific to a specific function. Therefore, additional, artificial amino acid sequences can be expected to interfere with these functions.
  • Tetraspanins belong to a protein superfamily with 33 members in mammals. The main characteristic of tetraspanins are their 4 transmembrane domains TM1-4, which also led to the naming. Tetraspanins also contain a small and a large extracellular protein loop (small and large extracellular loop), also called SEL and LEL. The LEL contains a highly conserved CCG amino acid motif. Furthermore, an intracellular protein loop (small intracellular loop, SIL) is included. N- and C-terminus are located intracellularly 3 -36 . Tetraspanins organize themselves through lateral protein-protein interactions (PPIs) in tetraspanin-enriched microdomains (TEMs) 37 ⁇ 38 .
  • PPIs lateral protein-protein interactions
  • carrier proteins carriers
  • Suitable carrier proteins carriers
  • These should have sufficient electromotive force and be able to utilize the membrane potentials to ensure protein transport with high translocation efficiency across the membrane to the cell surface 2 8 .
  • so-called "display” systems have become known, generally membrane-bound proteins, which can be used as carrier proteins for the presentation of foreign proteins, by genetically modifying them.
  • phage protein One of the most well-known protein display systems provides the phage protein. It is used in the presentation of protein components on the surface of filamentous bacteriophages in the bacterial system 9 "12 .
  • the object of the present invention was based on this prior art to provide a new way to anchor any heterologous peptides in a plasma membrane and present on the cell surface.
  • tetraspanins are excellently suitable as vehicles and have a highly efficient transport performance for foreign peptides fused with them for anchoring and presentation on the surface of cells. They are able to conduct foreign peptides highly efficiently via the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus to the plasma membrane of mammalian cells.
  • Tetraspanin family proteins have a large extracellular loop (LEL) between wild-type TM3 and TM4 transmembrane domains.
  • this extracellular loop can be completely or partially replaced by peptide sequences of a different composition and it is thus possible to transport the inserted heterologous peptide via the tetraspanin carrier protein via a membrane and to anchor it in the membrane ,
  • the invention is based on the simplicity of a unitary molecular structure for flexible and variable sequence modulation in a modular protein expression system in conjunction with the function of a specific delivery vehicle over cellular membranes and their anchoring there.
  • the provided vector systems make it possible, by means of simple cloning strategies, to flexibly exchange or supplement protein components (for example, to add individual epitopes and also to create whole protein libraries).
  • the localization of the fusion proteins in the membrane is almost quantitative.
  • the tetraspanin proteins are translocated to the membrane very efficiently. This is by far not achieved in the already known systems in the form (e.g., EGFR receptor).
  • tetraspanin fusion proteins takes place comparatively quickly, as a rule already overnight, whereas expression in other transport systems usually takes place within two days.
  • stability of the fusion constructs and their lifetime in comparison with the known proteins with the seven transmembrane domains is better in comparison, since there is no accumulation of cytosolic degradation products (GPCR receptors are known recombinantly as unstable).
  • reaction partners of the fusion proteins on the membrane can now flexibly enter into specific reactions with the proteins or the glycosyl residues on the membrane from the surrounding solution.
  • a first subject of the present invention is therefore a fusion protein comprising a first domain (i), a second domain (ii) and a third domain (iii), wherein the second domain is located between the first and the third domain, wherein
  • a partial sequence of tetraspanin which includes transmembrane domain 1 (TM1), small extracellular loop (SEL), transmembrane domain 2 (TM2), small intracellular loop (SIL), and transmembrane domain 3 (TM3) comprises homologous sequence with a sequence identity of at least 70% over its entire length,
  • a peptide having a predetermined amino acid sequence which to the large extracellular loop (LEL) of a tetraspanin has a sequence identity of less than 70% over its entire length
  • a fusion protein according to the invention comprises on the one hand a first domain (i) which comprises a partial sequence of a tetraspanin with the transmembrane domains TM1-TM3 and, on the other hand, a domain (iii) which comprises a partial sequence of a tetraspanin with the transmembrane domain TM4 or homologous sequences thereto ,
  • tetraspanin refers to any proteins of the tetraspanin family, in particular the human tetraspanins, tetraspanins being able to interact with one another in a membrane, thereby promoting transport across the membrane and anchorage there
  • the preferred embodiment of tetraspanins according to the invention are CD63, CD9 CD82, CD81, CD151 and CD53 (DNA sequences and protein sequences) See Sequence Listing Particularly preferably, the partial sequences contained in a fusion protein according to the invention are derived from tetraspanin CD63 (DNA and protein sequences, see Sequence Listing).
  • the domain (i) preferably comprises the transmembrane domain TM1, the small extracellular loop (SEL), the transmembrane domain TM2, the small intracellular loop (SIL), and the transmembrane domain TM3 of a tetraspanin, with the distinct transmembrane domains and loops immediately following each other inserted between these additional heterologous sequence segments.
  • the partial sequence corresponds to the wild type of a tetraspanin without any deviations in the form of, for example, substitutions, insertions or deletions of one or more amino acids.
  • domain (i) modified partial sequences of a tetraspanin provided that they have a sequence identity of at least 70% over the entire length of the sequence, based on the wild-type tetraspanin. More preferably, the sequence identity is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% over the entire length of the partial sequence of a tetraspanin contained in domain (i).
  • the first domain (i) consists of the above-described partial sequence of a tetraspanin or a homologous sequence with a sequence identity of at least 70% (more preferably at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99 %) over the entire length.
  • the domain (iii) comprises a partial sequence of a tetraspanin comprising the transmembrane domain TM4 of a tetraspanin or a homologous sequence thereof with a sequence identity of at least 70% full length. More preferably, the sequence identity to the partial sequence of a tetraspanin wild-type is at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95% or 99% over the entire length. In a particularly preferred embodiment, the domain (iii) consists of previously described partial sequence of a tetraspanin or a homologous sequence.
  • the domain (ii) comprises a peptide having a predetermined amino acid sequence.
  • This is also called “foreign peptide” or “foreign protein” herein.
  • the amino acid sequence of the foreign peptide differs from the sequence of the large extracellular loop (LEL) of a wild type tetraspanin, in particular the tetraspanin (s) of domains (i) and (iii). Sequence identity over the entire length is less than 70%, preferably less than 50%, more preferably less than 40% or less than 30%, compared to the LEL of a wild-type tetraspanin.
  • a fusion protein of the invention may be anchored and presented on the surface of cells, particularly mammalian cells (e.g., HEK293T homo sapiens).
  • a "peptide” is understood to mean a compound of at least two amino acids which are linked to one another via peptide bonds,
  • the length of the peptide is in principle not limited to: Oligopeptides having up to 10 amino acids as well as polypeptides having
  • the size of the peptide is less than 100 kDa, preferably less than 50 kDa or less than 30 kDa, for example 10-30 kDa.
  • amino acid is preferably understood as meaning the amino acids found in twenty naturally occurring peptides, polypeptides and proteins, which are each L-isomers also analogues of amino acids and D-isomers of amino acids and their analogues.
  • the terms “peptide”, “polypeptide” and “protein” are each used interchangeably
  • the peptide is a protein having at least 50 amino acids, in which case it is preferred that the protein be a predetermined Folding, for example, is required for a desired function of the protein.
  • the peptide of predetermined amino acid sequence may comprise, for example, an antigen or an epitope of an antigen.
  • epitope is meant a region of an antigen to which an antibody or T cell receptor specifically binds, a single antigen may comprise one or more epitopes,
  • the peptide having a predetermined amino acid sequence comprises a plurality of epitopes. Examples of epitopes are cancer epitopes, HIV epitopes (eg, HIV- gp41), examples being V5-6xHis (SEQ ID NOs: 35, 36), or 2F5-4E10 (SEQ ID NOs: 37, 38).
  • the peptide having a predetermined amino acid sequence of the domain (ii) comprises a protein which has a desired function, for example an enzyme, e.g. a protease.
  • the second domain (ii) may further comprise, in addition to the peptide of predetermined amino acid sequence, one or more partial sequences of the tetraspanin LEL or homologous sequences thereof having a sequence identity of at least 70% full length.
  • the sequence identity is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least 99%.
  • the Partial sequences of the LEL of a tetraspanin may be located C- and / or N-terminal to the peptide having the predetermined amino acid sequence.
  • partial sequences of LEL in domain (ii) are from the same tetraspanin as the sequence portions of domains (i) and (iii).
  • “Homologous” as used herein describes the sequence similarity between two polypeptides, molecules or between two nucleic acids If a position in both of the two compared sequences is occupied by the same base or amino acid monomer subunit, the corresponding molecules are homologous at that position.
  • the percent homology between two sequences is the function of the number of matches or homologous positions that the two sequences share in common, divided by the number of positions compared times hundreds. For example, if 6 out of 10 positions in two sequences match or are homologous then The two sequences are 60% homologous,
  • a comparison is made when two sequences are aligned to maximize homology, and such alignment can be provided by, for example, the method of Niedelman et al. Biol. 48: 443-453, 1970, ex with the aid of computer programs.
  • homologous sequences share identical or similar amino acid residues, with similar amino acid residues representing conservative substitutions for corresponding amino acid residues or allowed point mutations of corresponding amino acid residues in an aligned reference sequence.
  • a "conservative substitution" of a residue in a reference sequence represents those substitutions that are physically or functionally similar to the corresponding reference residues, eg, a similar size, shape, electrical charge, chemical properties, including the ability, covalent bonds, or Hydrogen bonds and the like are particularly preferred are conservative substitutions those that meet the criteria for an accepted point mutation in Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, Chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington , DC, 1978, are defined.
  • the domains of a fusion protein of the invention are arranged in the order (i) - (ii) - (iii), respectively.
  • fusion refers to a co-linear coupling of domains across their individual peptide backbones.
  • domains (i), (ii) and (iii) can be done either directly or via flexible linkers.
  • domain (i) is immediately followed by domain (ii).
  • the domain (ii) is immediately followed by the domain (iii).
  • flexible linkers are arranged between the first and the second domain and / or between the second and the third domain.
  • the existing linkers may be the same or different.
  • Exemplary linkers for use in the fusion proteins of the invention include e.g. Glycine polymers (G) ", wherein n is an integer of at least 1, glycine-alanine polymers, and other flexible linkers known to those skilled in the art.
  • G Glycine polymers
  • serine and arginine-free linkers are preferred, and particularly preferred are serine and arginine-free linkers.
  • Very particularly preferred is the linker LQEFDIGGGG (corresponding to SEQ ID NOs: 41, 42). Further linkers are described in FIG. 2C (see also SEQ ID NOs: 39, 40).
  • the domain (ii) may further comprise one or more recognition sequences that can be cleaved by an enzyme.
  • recognition sites for specific proteases, nucleases or endoglycosidases are recognition sites for specific proteases, nucleases or endoglycosidases.
  • the recognition site may comprise a substrate recognition site for a specific hydrolase enzyme, eg phosphatase, glycosidase, amidase or esterase.
  • protease recognition sequence is used herein in summary to refer to any recognition sequences that can be enzymatically cleaved, which may be C- and / or N-terminal to the peptide having the predetermined amino acid sequence
  • the protease recognition sequences flank the peptide directly with the peptide
  • the second domain (ii) comprises, in addition to the peptide having a predetermined amino acid sequence, one or more partial sequences of the LEL of a tetraspanin, it is preferable to separate the protease recognition sequences in each case between the LEL partial sequence and the C-nucleus. or insert N-terminus of the peptide with a predetermined amino acid sequence.
  • a fusion protein according to the invention may additionally comprise a fourth domain (iv) at the N-terminus and / or a fifth domain (v) at the C-terminus of the fusion protein.
  • Domains (iv) and (v) may each be attached directly or via flexible linkers as defined above.
  • domain (iv) may be attached directly or via a flexible linker to the N-terminus of domain (i).
  • Domain (v) may be attached directly or via a flexible linker to the C-terminus of domain (iii).
  • protease recognition sequences as defined above between the domains (iv) and (i) and / or between the domains (iii) and (v) or, if present, between linkers and one or more of the domains (i) , (iii), (iv) and (v).
  • the C and N termini of tetraspanin are on the cytoplasmic side.
  • the fourth and fifth domains (iv) and (v) of a fusion protein of the invention may be selected to include a marker group or a so-called tag.
  • a "tag” is understood to mean a short peptide sequence, for example a protein tag for labeling and identification, eg a flash tag or the fluorescent reporter protein mCherry.
  • a fusion protein according to the invention which differs from a wild-type tetraspanin at least by the domain (ii), nevertheless folds correctly, analogously to a wild-type tetraspanin. This could be shown by the example of the fluorescent proteins CFP and YFP in the domain (ii) (see FIG. 3B). Epitopes between the transmembrane domain TM3 and TM4 can be detected with an extracellular orientation with the aid of scanning electron microscopy on the cell surface (FIG. 4).
  • a further subject of the present invention is a nucleic acid molecule which codes for a fusion protein according to the invention.
  • a nucleic acid molecule according to the invention comprises or consists of a sequence segment coding for an above-described fusion protein. This sequence section is also referred to herein as Particularly preferred is a nucleic acid molecule of the invention in isolated form.
  • nucleic acid molecule in the context of the invention refers to a sequence of naturally occurring nucleic acid bases, base analogs, base derivatives or mixed forms thereof.
  • the term particularly includes DNA and RNA as well as nucleic acids derived therefrom such as e.g. cDNA and mRNA with.
  • the nucleic acids also include nucleic acid analogs such as peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), or phosphothioate nucleic acid (PSNA). These nucleic acid analogs can in principle have the naturally occurring nucleic acid bases, which, however, are linked to one another in a different manner than, for example, in DNA or RNA.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • PSNA phosphothioate nucleic acid
  • Nucleic acids also include nucleic acids containing nucleic acid derivatives, e.g. Hypoxanthines, 2,5-diaminoporine and / or methylcytosine, and modified, in particular labeled, nucleic acids. These nucleic acid derivatives may, in addition to base derivatives, in principle also have the naturally occurring nucleic acid bases. Labels may be introduced at bases and / or backbones. The linkages may correspond to DNA or RNA or to the nucleic acid analogs.
  • the nucleic acids can be double-stranded or single-stranded, linear, branched or circular.
  • the present invention further relates to a vector comprising a nucleic acid molecule as described above.
  • the nucleic acid molecule is operably linked to an expression control sequence.
  • expression control sequence within the meaning of the invention encompasses both elements which regulate expression on the transcriptional level, such as enhancers or silencers, and elements which regulate expression on the posttranscriptional level (eg splicing, nuclear export or mRNA stability) also includes several elements that reduce expression to transcriptional or regulate posttranscriptional level, or combinations of transcriptional and posttranscriptional regulatory elements. Techniques and tools for identifying expression control sequences that result in increased expression and isolation thereof are routine techniques well known to those skilled in the art.
  • the expression control sequence may be a promoter, preferably a eukaryotic promoter, such as a CMV or SV40 promoter; a prokaryotic promoter or phage-specific promoter, such as an SP6 or a T7 promoter. Most preferably, the promoter is a CMV promoter.
  • the vector may additionally comprise a sequence section for the termination and / or polyadenylation of the nucleic acid molecule.
  • a vector of the invention further preferably contains a selection marker gene, i. a sequence section encoded for a selection marker.
  • selection markers are antibiotic resistance or auxotrophic markers.
  • an amplifiable selectable marker gene e.g. Dihydrofolate reductase, used.
  • the vector of the invention may further comprise an origin of replication.
  • the term "in operative linkage” describes a linkage of two or more nucleic acid sequences or partial sequences which are positioned so that they can perform their intended function
  • functionally linked sequences are in close proximity and, if two coding gene sequences are linked or, in the case of a secretory signal sequence, in the same reading frame functionally linked promoter generally upstream of the coding gene sequence, it does not necessarily have to be tight be adjacent.
  • Enhancers also need not be in close proximity as long as they favor transcription of the gene sequence. For this purpose, they could be present both upstream and downstream of the gene sequence, possibly even at some distance.
  • a polyadenylation site is operably linked to a gene sequence when positioned at the 3 'end of the gene sequence such that transcription proceeds through the coding sequence to the polyadenylation signal.
  • the linkage can be carried out by customary recombinant methods, for example by means of the PCR technique, by ligation at suitable restriction sites or by splicing. If suitable restriction sites are not present, synthetic oligonucleotide linkers or adapters may be used in a manner known per se. Preferably, the functional linkage does not occur via intron sequences.
  • a vector according to the invention is preferably suitable for at least one (host) cell, in particular for the replication of the vector in this cell and / or for the expression of a protein or peptide in this cell.
  • Replication can occur in a prokaryotic and / or eukaryotic cell.
  • Expression preferably takes place in a eukaryotic cell.
  • the vector may be a plasmid.
  • Vector constructions for the eukaryotic expression generally have a strong, possibly cell-type unspecific eukaryotic promoter (eg the CMV or SV40 promoter) and a sequence part responsible for transcriptional termination and polyadenylation (eg SV40 termination polyA ). Between these two elements is to be expressed CDS (coding sequence), led by a more or less pronounced Kozak sequence around the start codon around.
  • CDS coding sequence
  • the CDS to be expressed is a gene from the tetraspanin superfamily. Here are all Tetraspaningene from all organisms Species, the genes of this Gene superfamily, which provide the desired transport performance through the membrane according to the invention.
  • the fusion genes according to the invention are characterized in that they can possess at least one artificially introduced heterologous DNA sequence as internal and optionally terminal fusion.
  • Terminal CDS fusions are heterologous DNA sequences that encode 5 'proximal and / or 3' distal to tetraspan gene for a fusion protein or peptide.
  • TM3 and TM4 transmembrane domain internal, coding heterologous DNA sequences are inventively introduced.
  • the transmembrane domains of the tetraspanins are responsible, inter alia, for the transport of the heterologous coding sequences to the membrane, the translocation through the membrane and the anchoring there.
  • inventive vector constructions are particularly noteworthy here. These have instead of general eukaryotic promoters also bacterial and phage-specific, but also eukaryotic cell-type or organ-specific promoters, which allow a cell differentiation-dependent expression. One can use such types of promoters to use the gene constructs according to the invention, regardless of which application. Further embodiments of the vectors according to the invention may, for example, also comprise RNA polymerase promoters of phages in order to generate mRNA molecules highly efficiently in vitro or optionally in vivo.
  • phage promoters such as SP6- or T7-specific promoters for the production of mRNA molecules in vitro, in order to be able to optionally supply the fusion gene mRNA for therapeutic purposes and applications.
  • This variant is as a dosage form of regulators like because it is supposed to prevent the recombination of nucleic acids into the genome.
  • tetraspanigen derivatives in bacteria or yeasts can be used to isolate the fusion proteins and find use in artificial membranes.
  • eukaryotic differentiation or cell-specific expression for example in mucosa or muscle cells, can also be used to cell-specifically express DNA vaccines (see, for example, EP1390490 B1).
  • vector systems according to the invention have a specific design which allows the expression of multiple fusion proteins in the same cell by means of a single vector construct (see patent application DE 10 2013 006 487 A9). With this design, additional elements can be added in a simplified way.
  • the invention also relates to those nucleic acids and vectors which have a fusion protein coding portion as defined above, but instead of a sequence coding for the peptide having a predetermined amino acid sequence, only a multiple colonization site is present which clones one for any peptide With a predetermined amino acid sequence encoding gene allows recognition sequences for restriction endonucleases. In addition, multiple cloning sites in the 5 'and / or 3' position for N and / or C-terminal domains (iv) and (v) may be present.
  • One aspect of the invention therefore relates to a nucleic acid molecule comprising a first sequence section (i), a second sequence section (ii) and a third sequence section (iii), the second sequence section is arranged between the first and the third sequence section, wherein
  • TM1 transmembrane domain 1
  • SEL small extracellular loop
  • TM2 transmembrane domain 2
  • SIL small intracellular loop
  • TM3 transmembrane domain 3
  • (iii) encodes a partial sequence of a tetraspanin comprising the transmembrane domain 4 (TM4) or a homologous sequence thereof with a sequence identity of at least 70% full length.
  • sequence sections (i) to (iii) are in this case preferably arranged from 5 'to 3'.
  • a "Multiple Cloning Site” or “multiple cloning site” comprises several contiguous restriction endonuclease restriction sites.
  • the multiple cloning site is particularly suitable for the integration of a nucleic acid molecule, wherein the integrated nucleic acid molecule in the reading frame with the first sequence section (i) and the third sequence section (iii) encodes a peptide to be presented.
  • the peptide preferably comprises a predetermined amino acid sequence which has a sequence identity of less than 70% full-length to the large extracellular loop (LEL) of a tetraspanin.
  • the present invention further relates to a vector comprising a nucleic acid molecule described above, preferably in operative association with an expression control sequence.
  • recognition sequences for a wide variety of restriction endonucleases and the restriction endonucleases associated therewith are known in the prior art.
  • sequences are used which consist of at least six nucleotides as the recognition sequence consist.
  • a list of suitable identification sequences can be found, for example, in Sambrook et al. (1989).
  • Specific sequence elements of a vector with multiple cloning site relate to the introduction of heterologous DNA sequences to the corresponding terminal and internal, functionally permissible positions of the tetraspanin genes (such as CD63) themselves.
  • Restriction interfaces repeatedly add new epitope-CDS or different genes and gene fragments in a cyclic reaction into existing vector constructs
  • Exemplary is the inventive vector pAE21 1 in Figure 2A, SEQ ID NO: 1) Restriction sites are at the position between the transmembrane domains This position has been shown experimentally to be particularly suitable for fusion with heterologous DNA sequences encoding a heterologous peptide because it does not interfere with the function of membrane transport, at which point there is a protein loop which is beyond the membrane, the sequence of which may be variable without substantially interfering with protein transport to the plasma membrane of the tetraspanin protein in cell cultures.
  • the 5-terminal CDS fusion to generate an N-terminal fusion protein can be introduced by means of two Nco ⁇ in the 5 'region of the CD63 gene such that the Kozak sequence is regenerated in the start region. This one is unique.
  • the potential 3 'terminal CDS fusion element which results in C-terminal protein fusion is inserted by means of the Type HS restriction endonuclease ⁇ sal which produces specific ends for Nde and Bell in the construct. These sites may also be used to insert 3'-terminal gene fusion elements, if desired.
  • the above-stated implementations of vector systems are exemplary, and any other methodology of modifying the vectors besides the restriction ligation methods described is also within the scope of the invention, such as the sequence modulation of the systems by suitable recombination systems, in vivo, as well as in vitro.
  • a further subject of the present invention is a cell which comprises a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention.
  • a cell is preferably a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, in particular a human cell.
  • suitable mammalian cells are rodent cell lines, e.g. Mouse, rat and hamster cells, or monkey cells.
  • a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention can be introduced into a cell, in particular a eukaryotic cell, by means of techniques known per se. Successful transfection results in transformed, genetically modified, recombinant or transgenic cells.
  • transfection of eukaryotic host cells with a nucleic acid molecule or a vector according to the invention is carried out by customary methods (Sambrook et al., 1989, Ausubel et al., 1994). Suitable transfection methods are, for example, the liposome mediated transfection, calcium phosphate coprecipitation, electroporation, polycations, (eg, DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, and viral infections.
  • the cells are obtained via stable transfection, whereby the constructs are integrated into either the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are stably episomally contained in the host cell.
  • any sequence or gene introduced into a host cell will be referred to as a "heterologous sequence” or “heterologous gene” with respect to the host cell, even if the sequence or gene to be introduced is identical to an endogenous sequence an endogenous gene of the host cell.
  • it can be cells of transgenic cell groups of different cell types in which a fusion gene according to the invention is also expressed in different cellular differentiation states. These cells can be generated ex vivo and, if appropriate, subsequently used therapeutically in vivo.
  • cells of cell groups of transgenic organisms whose cells have passed through the germ line and have developed into multicellular systems, preferably to vital organisms.
  • a cell according to the invention was further transformed or transfected with at least one further nucleic acid molecule or at least one further expression vector.
  • the further nucleic acid molecule or the further expression vector preferably contains a section which codes for a further predetermined protein.
  • the expression vector may likewise be a nucleic acid molecule according to the invention or an expression vector according to the invention, in which case a different peptide having a different predetermined amino acid sequence would be selected for the domain (ii).
  • the further nucleic acid molecule or the further expression vector contains a section which codes for an enzyme, for example for a protease.
  • both the peptide of the domain (ii) with a predetermined amino acid sequence and the further protein on the membrane surface are presented. If, for example, the peptide of domain (ii) is flanked by protease recognition sequences, then a protease expressed via the additional nucleic acid molecule could cut at these recognition sites and thus release the peptide.
  • the host cells are preferably established under serum-free conditions, adapted and cultivated, if appropriate in media which are free from animal proteins / peptides.
  • Another object of the present invention is a membrane preparation obtained from a cell according to the invention.
  • a membrane preparation according to the invention comprises at least one isolated membrane, more preferably an isolated cellular membrane, even more preferably an isolated cellular plasma membrane and / or an isolated cellular membrane of other cell organelles.
  • the term "membrane" in the sense of the present invention describes a self-contained system comprising at least one lipid and optionally at least one protein
  • the lipids of a membrane usually form a lipid bilayer
  • the membrane preparation preferably comprises membrane particles, more preferably membrane vesicles.
  • the membrane preparation can be obtained from a cell of the invention by methods known to those skilled in the art, preferably by lysing the cell (cell lysate), more preferably by lysing the cell and then isolating and optionally purifying the cellular membrane (isolated and optionally purified membrane).
  • surfactants such as Triton X-100 can be used to solubilize the membranes.
  • the method may additionally include a cell debris removal step.
  • the diameter of the membrane particles may be in the range of 1-1000 nm, preferably 50-500 nm, more preferably 75-200 nm. At least 80%, at least 90%, at least 95% or at least 98% of the membrane particles have a diameter in one of areas described herein.
  • a membrane preparation according to the invention is obtained from a cell according to the invention which comprises a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention.
  • the fusion protein according to the invention is expressed by the nucleic acid molecule or the vector.
  • a membrane preparation according to the invention therefore preferably comprises at least one isolated membrane and at least one fusion protein according to the invention.
  • the fusion protein according to the invention is hereby preferably anchored in the membrane, more preferably on the surface of the membrane, in particular on the extracellular side of the membrane.
  • the fusion protein according to the invention is presented on the membrane, preferably on the surface of the membrane, in particular on the extracellular side of the membrane.
  • the membrane preparation may optionally additionally comprise one or more wild-type tetraspanins.
  • the membrane systems according to the invention are the outer membrane of cells, for example of in vitro cell cultures, in which at least one inventive fusion protein is transiently expressed.
  • the present invention further relates to a synthetic membrane system comprising a membrane and a fusion protein, a nucleic acid molecule or a vector as described above.
  • the membrane may be a cellular (natural) or synthetic (artificial) membrane.
  • a cellular membrane is a cellular plasma membrane that is typically located on the surface (outer layer) of a cell.
  • a cellular membrane in the sense of the present invention may be part of a cell, or may have been isolated from a cell, i. an isolated, cellular membrane.
  • a cellular membrane is typically asymmetric and has a cytoplasm-facing side (plasmatic or intracellular side, inner side) and a cytoplasm-remote side (extraplasmic or extracellular side, outer side).
  • a synthetic membrane may comprise synthetic and / or isolated cellular membranes.
  • the synthetic lipid and / or protein composition may differ from the naturally occurring cellular membrane compositions.
  • a synthetic membrane is preferably not part of a cell and is particularly present as an isolated, synthetic membrane. The person skilled in the art can influence the properties of a synthetic membrane by choosing the lipids and / or proteins.
  • a synthetic membrane system comprising a nucleic acid molecule or a vector according to the invention additionally contains a system for expression of the nucleic acid molecule or of the vector, whereby the fusion protein can be expressed.
  • Systems for the expression of proteins are known in the art and are preferably cell-free.
  • the system for expression preferably comprises a system for translating a nucleic acid molecule, in particular an RNA or mRNA; and, optionally, a system for transcribing a nucleic acid molecule or a Vector, in particular to obtain an RNA or mRNA.
  • the fusion protein may be added directly to the membrane to obtain a membrane system according to the invention.
  • the expressed or added fusion protein is anchored in the membrane, preferably on the surface of the membrane, especially on the outer side of the membrane.
  • the fusion protein according to the invention is presented on the membrane, preferably on the surface of the membrane, in particular on the outer side of the membrane.
  • the fusion proteins according to the invention can be directed, translocated and anchored to the membrane surface.
  • fusion proteins can be obtained which are suitable for populating synthetic membranes and being anchored there.
  • Another aspect of the present invention is a method of presenting a peptide having a predetermined amino acid sequence on the surface of a cell, comprising the steps
  • the present invention further relates to a method for anchoring a peptide having a predetermined amino acid sequence to a membrane comprising the steps (a) providing a membrane, and
  • Another object of the invention is the use of a cell described above, a membrane preparation or a synthetic membrane system in a method for screening for interaction partners of the peptide, for the investigation of interactions of the peptide with interaction partners (eg antibodies), in a process for the preparation of the peptide, as an immunization reagent in a method for antibody production and / or as a detection reagent.
  • interaction partners eg antibodies
  • the present invention further relates to a cell, membrane preparation or synthetic membrane system as described above for use as a vaccine and / or as a medicament.
  • the fusion proteins are taken from the transfected, transiently or stably expressing cells, transgenic organisms or synthetic membrane systems to find use in research and development, as well as optionally supplied as part of a method or kit to a commercializable application. Examples are the production of bioanalytical diagnostic systems and therapeutics.
  • the membranes containing the fusion proteins are removed from the cells, transgenic or synthetic membrane systems in order to find use in research and development, as well as possibly as part of a Process or kits to be supplied to a commercializeable application. Examples are the production of bioanalytical diagnostic systems and therapeutics.
  • the expressed fusion proteins of the present invention are shown to be cell surface transfected cells as stationary reactants and can be used to analyze specific interactions with other molecules.
  • protein-protein interactions e.g., monoclonal or polyclonal antibodies - paratope-epitope interactions, coiled-coil interactions, etc., specific interactions of pharmaceutical-medical, especially molecular-mechanistic importance
  • Tetraspanin fusion molecules can also be used to analyze interactions with other molecules, such as mono- and polysaccharides, RNAs, DNA, and especially small chemical molecules such as natural products and chemical libraries.
  • a cell of the invention expresses a protein domain (A) capable of highly specific interaction with another protein domain (B).
  • the protein domain (A) in this case corresponds to the peptide having a predetermined amino acid sequence of the domain (ii) of a fusion protein according to the invention.
  • This external protein domain could then be linked to various functional further protein domains.
  • these protein domain modules one could make sure that, if they are of exogenous origin, they specifically bind to the domain (A) of the expressing cell and thus exchange the protein ligands which, in turn, could reconnect, thus demonstrating a co-existence of different protein modules on the cell surface mediated by specific interaction.
  • Proteins immobilized on surfaces can produce specific contacts to other proteins by means of special structures on the surface of the respective proteins.
  • These other proteins may be the protein building blocks of homo- or heteroprotein complexes, which can recognize each other mutually or else specific proteins, such as antibodies and single chains, which can specifically and specifically bind to specific protein surface structures.
  • Genomically encoded naturally occurring proteins that undergo specific interactions with other proteins perform many cellular functions, ranging from functions in the nucleus to diverse cytosolic and membrane functions.
  • PPIs protein-protein interactions
  • the immune system is designed for the sensitive responses to alteration of the surfaces within an organism and specializes in the optimization of surface interactions of antibodies and cytotoxicity in very short periods of time.
  • humoral immunity large amounts of epitope-specific polyclonal antibodies are produced in a short time.
  • the unique single chain antibodies of single-chain camelons and other naturally occurring immunogenic systems that develop highly specific protein interactions have become known.
  • these processes for the production of monoclonal antibodies have been technically implemented by means of cell culture technologies, thus enabling the generation of specific PPIs in vitro.
  • Antibody engineering uses artificial paratopes, which are based on display technologies (Ribosome Display, Phage Display, Yeast Display) and can specifically recognize epitopes for incorporation into antibody molecules.
  • display technologies Ribosome Display, Phage Display, Yeast Display
  • the efficient export functions for protein units of the tANCHOR system described here and their anchoring in the membrane are highly suitable for PPI analyzes.
  • proteins modified specifically with sugars can also be presented on cell surfaces by means of tANCHOR technology.
  • Detection systems that enable one of ordinary skill in the art to identify a specific PPI are commercially available as cell sorter systems (FACS), fluorescence or bioluminescence based imaging systems, as well as FRET photonic devices.
  • FACS cell sorter systems
  • FRET photonic devices FRET photonic devices
  • the tANCHOR system is particularly suitable for this purpose. This allows the integrity of protein structures to remain structurally intact while retaining, for example, structural epitopes, but also binding domains in the PPI of cellular regulatory proteins. Analysis of small molecules with tANCHOR constructs
  • the tANCHOR technology provides an excellent tool for this purpose, which provides protein expression with simultaneous anchoring of the proteins on the cell surfaces.
  • suitable protein pairs from a further expression source or optionally also through the co-expression of different tANCHOR molecules it is possible to establish test systems for the analysis of interactions of small molecules with protein complexes 1,40 48 .
  • portions of the fusion proteins of the present invention located at the cell surface could be specifically cleaved at a given site and thus solubilized by optionally inducible coexpression of highly specific cleaving secreted proteases (such as the TEV protease).
  • the defective fusion proteins could be steadily replaced in a membrane resynthesis cycle and thus also ensure a lasting overexpression.
  • Small molecules eg from extracts of secondary metabolite expressing organisms
  • the small molecules could thus bind to the proteins of the invention and identify them as a target.
  • the small molecules may either be bound specifically to the target peptides fixed on the cell surface or to the already cleaved target peptides which are in solution as carrier peptides.
  • the resulting complexes and thus the small molecules and their binding partners could then be identified by mass spectroscopy.
  • these could be isolated after isolation of the complexes in solution and destruction of the peptides, e.g. be identified by means of non-specific enzymatic proteolysis, etc., by means of mass spectroscopy.
  • applications involving antibodies in a particular format e.g. the standardized 96-well format for binding to tANCHOR-exposed epitopes.
  • a particular format e.g. the standardized 96-well format for binding to tANCHOR-exposed epitopes.
  • cells are seeded in microtiter plates with the 96-well format and the fusion constructs are expressed in a transiently transfected state.
  • this is possible with cell lines expressing stable fusion proteins.
  • FIG. 9 the use of the tANCHOR system for the detection of antibodies in ELISA experiments is shown (FIG. 9).
  • the fusion proteins are found on the cell surfaces and are presented there.
  • This artificial membrane configuration can be directly applied to the development and production of analytical and therapeutic applications.
  • analysis systems can be produced in which, for example, clinical sera are tested for appropriate blood sera corresponding to the respective application to be developed by patient cohorts.
  • immunodiagnostic and therapeutic agents in particular also for therapy-accompanying diagnostics, such systems can be used to qualitatively and quantitatively check the patient serum for the presence of antibodies and their binding properties.
  • microtiter plates and other formats in which transgenic cells have grown it is possible to fix microtiter plates and other formats in which transgenic cells have grown, to dry them to large scale to produce bio-analytical test systems and diagnostics and to produce them on a large scale.
  • membranes of transgenic organisms expressing tetraspanin-protein fusion products it is also possible to use and purify membranes of transgenic organisms expressing tetraspanin-protein fusion products.
  • artificial membranes containing fusion products of the invention may be delivered to such uses as described above.
  • the cleavage of membrane-bound protein expressed with tANCHOR can be cleaved from the membrane by amino acid sequence motif-specific proteinases.
  • the specific proteases can be exogenously supplied to the medium or endogenously coexpressed with the target protein. This approach may require the proform of a sequence-specific endoprotease that is activated in the medium.
  • the accumulation of specific target protein finally takes place in the medium, because the target protein released by tANCHOR is steadily replenished by the loss of integrity of the protein in the membrane.
  • the tANCHOR system In connection with differentiation-specific and / or species-specific promoters (eg in the veterinary field), which find their expression only in very specific target cells, the tANCHOR system due to the efficient membrane transport in a position to heterologous gene fusion elements in the intact cells of an organism express. These can be introduced exogenously into cells.
  • tetraspanin fusion constructs can be bombarded at high speed directly by means of so-called "gene guns” or “particle guns” and the transfected cells made to transiently express fusion protein.
  • These proteins may be antigens or subspecific antigenic determinants, epitopes, previously tested for their suitability. Both for the provision of this TANCHOR technology can be used for suitable diagnostic bioassays, as well as for therapeutic vaccination.
  • DNA could integrate into the genomes of cells struck with gene particles and be incorporated there by integration e.g. could possibly cause damage to a tumor repressor gene.
  • practice teaches that, in addition to the gene constructs according to the invention, very extensive homologous gene regions are necessary in order to genuinely produce a higher and more relevant integration rate. Such elements are not provided in the constructs of the invention. However, due to such association chains on the dangers of DNA vaccination by sensitive regulators, the mRNA vaccine come in the coming.
  • mRNA molecules which are optimized for expression in eukaryotic cells, stabilize them and fix them on nanobeads or into suitable micro to nanocompartments (virus-like particles, VLPs) ) and to deliver the mRNAs in this form to therapeutic applications.
  • VLPs virus-like particles
  • the expressed proteins Due to the specific properties of tetraspan infusions, the expressed proteins are transported to the cell membranes of the expressing cells and shown outwards.
  • the exposure of specific amino acid sequences can be recognized by the immune system and there corresponding desired immune reactions cause humoral or cytotoxic immune reactions.
  • the combination of expressed adjuvants which may optionally be coexpressed with multiple tANCHOR constructs in a cell, is a variant which is also within the scope of possibilities for improvement in the use of tANCHOR systems of the invention.
  • Another object of the invention is a kit comprising
  • kits according to the invention may contain various components, such as control plasmids, control proteins, etc., and specific plasmids for various applications.
  • Fig. 1 Schematic representation of the fusions according to the invention and localization of the fusion proteins.
  • the system according to the invention also referred to as TANCHOR system, consists of four transmembrane domains (4TM). Between TM3 and TM4, DNA sequences coding for epitopes or proteins can be cloned in. At the N-terminal end, the epitope FLAG-tag was exemplified and at the C-terminal end of CD63, for example, the fluorescence protein mCherry as transfection control was additionally implemented in the tANCHOR system by gene fusion (see also Fig. 2).
  • FIG. 2A Schematic structure of the exemplary tANCHOR vector system.
  • FIG. The first exemplary tANCHOR vector system is based on the modular multi-expression vector pA4E211 (SEQ ID NO: 1) and functional derivatives of this vector.
  • SEQ ID NO: 1 the modular multi-expression vector pA4E211
  • FIG. 2B an overview of the sequence arrangement of the CD63ALEL components as well as the N-terminal fusion of the FLAG epitope and C-terminal fusion of the fluorescent reporter protein such as mCherry or GFP from Pontellina plumata is shown.
  • TEV-Protease-site-1 Specific proteolytic site 1 106..1 126 HindIII R-site 127..1 132 BamH ⁇ R-site 1 133 .1 138 Psti R-site 1 139..1 144
  • TEV-Protease-site-2 Specific proteolytic site 1 163..1 183 c-myc epitopes Immune marker 1 184.1.1 197 EcoRV R-site (Integration site of fusion protein) 1214., 1219
  • PpGFP-Monomer_Adapt AM-CDS (-) Typical-non-blunt-palindromisc_feature 1376..2047
  • the wild-type CD63 protein sequence consists of 238 amino acids.
  • CD63ALEL the coding DNA sequence of the transmembrane domains 1 -3 and 4 (underlined sequence CD63 TM1 -3, CD63 TM4) was used.
  • the linker that does not contain the sequence for the LEL of CD63 (ALEL) is placed between the fragment CD63 TM1 -3 and CD63 TM4 (SEQ ID NO: 42).
  • the GGGG structural motif is inserted in the linker.
  • a gene sequence (SEQ ID NO: 45) for a linker with the amino acid sequence KLIDTVDLEK (SEQ ID NO: 46) may be included.
  • Table 2 of Figure 2A Linear organization of the modular Type I series tANCHOR kit vector systems: pA4E211
  • eGreen Fluorescent protein gene.
  • tANCHOR vector with, for example, a POI bioPeplD epitope (s) used for analysis (protein / peptide of interest) as an internal CD63 insert and with the C-terminal reporter eGFP (eGreen fluorescent protein gene), as well as (6) with additional reporter genes, such as YFP (Yellow Fluorescent Protein Gene) and with fusions of the protein of particular experimental interest (POI fusion). (7) with mergers of POI merger etc. depending on the experimental design.
  • bioPepID are Pep + D-type bio-peptide libraries (EP09000893.9). These can be used in the tANCHOR system.
  • Abs ⁇ -SgrD ⁇ and Asc ⁇ -MauB ⁇ as well as AsiSI-Pacl are nested and mutually compatible restriction endonucleases with an eight-mer recognition sequence for multiplexing the expression of multiple genes. Any other realization of the applications according to the invention is also covered by the patent.
  • Examples of different linker variants according to the invention in combination with CD63ALEL in the exemplary vector pAE211_C VP-GD63ALEL are possible for the insertion of several consecutive epitope units according to a cloning standard method as well as cloning methods for seamless cloning.
  • Seq (1) plus His6 tag (3) Seq (1) plus C- Myc epitopes, (4) Seq (1) plus His6 tag plus C-Myc (5) TEV proteolysis sites, including the central cloning sites to selectively harvest the expressed foreign protein.
  • (6) combines all the translated and untranslated molecular functional elements mentioned in (8) in one construct (SEQ ID NOs: 39, 40).
  • Minimal linker for transport to the cell surface SEQ ID NOs: 41, 42).
  • Fig. 3 Localization of fusion proteins on the surface of HEK293T cells by cLSM.
  • HEK293T cells were cotransfected with the respective vectors.
  • the vector pCMV-CD63-YFP served in the localization studies as a control for the expressed wild-type CD63-YFP protein.
  • CD63ALEL tANCHOR technology
  • mCherry protein without tANCHOR fusion is cytoplasmic, evenly distributed. It shows no predominance on the cell surface.
  • other proteins such as e.g. the glycoprotein gp41 from HIV with and without transmembrane domain (gp41ATM) are presented on the surface.
  • the detection of the epitope orientation was performed by scanning electron microscopy (SEM) on the surface of transfected HEK293T.
  • the proteins were bound by primary antibodies and visualized by means of conjugated secondary antibodies with gold particles (10 nm).
  • YFP, CFP, gp41 and gp41ATM bound antibodies could be visualized on the surface by immunogold particles (FIG. 5).
  • Fig. SA-D SEM image of gold particles (10 nm) on the surface of HEK293T cells.
  • the transfected HEK293T cells were examined for epitope orientation.
  • the respective epitopes were bound with specific primary antibodies and then detected with gold-conjugated secondary antibodies.
  • epitopes with the tANCHOR technology epitopes could be attributed an extracellular orientation. Length of the scale bar is 300 nm in all figures.
  • Fig. 6 Western blot analysis of transfected HEK293T cells with generated tANCHOR vectors.
  • the transfected HEK293T cells were subjected to Western blot analysis.
  • the expressed proteins in the separated cell lysates were detected by primary antibodies directed against the C-terminal reporter protein mCherry and against the N-terminal epitope FLAG. Tansfection with the pmCherry-N1 vector shows no band on incubation with anti-FLAG antibody since this vector does not contain a sequence for the FLAG epitope and serves as a control for specific detection of the expressed proteins.
  • Fig. 7 Schematic representation of the constructs for checking further tetraspanins for protein transport with internal fusion site with V5-6xHis linker.
  • expression vectors were generated which include an internal fusion V5-6xHis between the 3rd and 4th transmembrane domains according to the tAN CHO R -p rototy p constructs based on CD63ALEL .
  • the internal fusion V5-6xHis contains the linker between EcoR ⁇ and EcoRV (SEQ ID NOs: 35, 36).
  • N-terminal FLAG fusion is integrated, C-terminal are the fluorescent proteins YFP in wild-type tetraspanin constructs or mCherry was fused to ⁇ ELEL V5-6xHis constructs as reporter proteins.
  • Fig. 8 Localization of fusion proteins on the surface of
  • HEK293T cells were transformed with the generated vectors (A) pCMV-CD9-YFP / pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry, (B) pCMV-CD81-YFP / pCMV-CD81ALEL-V5-6xHis-mCherry, (C) pCMV -CD82-YFP / pCMV-CD82ALEL-V5-6xHis-mCherry and (D) pCMV-CD151 -YFP / pCMV-CD151 ALEL-V5-6xHis-mCherry cotransfected.
  • A pCMV-CD9-YFP / pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry
  • B pCMV-CD81-YFP / pCMV-CD81ALEL-V5-6xHis-mCherry
  • C pCMV -CD82-YFP
  • Fig. 9 Application of the tANCHOR system for the detection of antibodies
  • the linkers used are shown at the DNA and amino acid sequence level. Analysis of subcellular localization of the fusion proteins with two different linkers (SEQ ID NOs: 41, 42 and SEQ ID NOs: 43, 44, respectively) clearly demonstrates that the use of EcoRI / EcoRI flanking restriction sites results in high protein transport efficiency leads to the surface of the HEK293T cells and the fusion protein to the formed filopodia (white arrow) of the cells is detectable (B). The length of the scale bars is 10 pm in all images.
  • CD63-based model vectors were based on the use of the vector pCMV-Tag2B (Stratagene).
  • the respective DNA sequences were introduced via restriction cleavage sites into this vector by means of conventional cloning techniques 39 .
  • the control vector pCMV-CD63-YFP or designated pCMV-CD63-YFP-FLAG 9 which contains the full-length sequence of CD63 (amino acids 1 -238, GenBank accession no. KF998086), was used to pass through the restriction sites Xho ⁇ and Apa ⁇ introduce the DNA sequence from the red fluorescent reporter protein mCherry used using the primers ⁇ 1-0 / ⁇ 1 -02 and the template vector pmCherry-N1 (Clontech).
  • the partial sequence with the transmembrane domains TM1-3 was introduced via the restriction sites BamH ⁇ and Pst ⁇ using the primers PA1 -03 / PA1-04 and then the TM4 (amino acids 201- 238, GenBank accession no. KF998086) via EcoRV and Hind ⁇ using the primers PA1 -05 / PA1 -06 and the template vector pPR3-N-CD63 49 in the vector pCMV-Tag2B introduced.
  • the resulting vector contains the CD63 gene sequence without LEL (pCMV-CD63ALEL) ( Figure 2B).
  • the restriction sites Xho ⁇ and Apa ⁇ were used to ligate the restricted mCherry DNA fragment from the vector pCMV-CD63-mCherry into the restricted vector pCMV-CD63ALEL.
  • the vectors pCMV-CD63ALEL-CFP and pCMV-CD63AEL-YFP were generated via the restriction sites EcoRI and EcoRV using the primers PA1 -07 / PA1 -08 and the template vector pSCFP3A-C1 or pSYFP2-C1 50 , respectively.
  • the vectors pCMV-gp41ATM and pCMV-gp41 were amplified with the aid of the primers PA1-09 / PA1 -010 or PA1 -09 / PA1-1 1 and the template vector pNL4-3 51 , which contains the gene sequence of the gp41. Contains protein from HIV-1.
  • HEK293T human embryonic kidney cells 293T
  • HEK293T human embryonic kidney cells 293T
  • Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum, L-glutamine and penicillin 11 / streptomycin.
  • Metafectene ® PRO Biontex
  • the transfected cells were fixed in 2% paraformaldehyde in PBS, washed twice in PBS and in 90% glycerol in PBS with 0.1% p-phenylenediamine and DAPI (4 ', 6-diamidin-2-phenylindole) to Visualization of the nucleus was added.
  • the transfected cells were examined for subcellular localization with an LSM 780 inverse confocal laser microscope (Carl Zeiss) ( Figures 3A-3C).
  • the excitation and emission wavelength settings were selected using the Smart Setup option of the LSM 780 software ZEN 2010 for the CFP, YFP, and mCherry fluorescent proteins. 3.
  • the expressed proteins were detected by scanning electron microscopy of gold-immunoprecipitated proteins on the plasma membrane of HEK293T cells (Figure 4).
  • the transfected cells fixed in 2% paraformaldehyde in PBS were washed three times in PBS and blocked with 0.5% BSA / 0.1% gelatin in PBS.
  • the proteins CD63ALEL-CFP and CD63AEL-YFP were incubated with rabbit anti-GFP (ab6556, Abcam), washed and the primary antibodies detected with goat anti-rabbit with conjugated 10 nm gold particles. Immune labeling was followed by post fixation with glutaraldehyde (2.5% in HEPES 0.05M). This was followed by the raster preparation.
  • the samples were gradually dehydrated in ethanol stages (30%, 50%, 70%, 90%, 96%) for 15 min and left in absolute ethanol for 30 min, converted into HMDS (hexamethyldisilazane), dried from HMDS and the sample surface steamed with coal.
  • the gold particles were visualized with the Leo 1530 Gemini electron scanning microscope using a backscatter detector (Centaurus).
  • the gp41 protein was detected using the human anti-2F5 antibody (NIH) and using the goat anti-human antibody with conjugated IgG H & L 10 nm gold particles (BB International) (FIGS. 5A-5D ).
  • HEK293T cells were transfected with the vectors according to the manufacturer's instructions in 6-well format with METAFECTENE ® PRO. After 48 h, the medium was completely removed and added to each 6-well 100 ⁇ 2x Laemmli sample buffer and 25 U of an endonuclease from Serratia marcescens (Benzonase ®). The cells were lysed and added to the samples after about 10 minutes 5 ⁇ ß-mercaptoethanol was added and denatured at 95 ° C for 5 min.
  • expression vectors were generated according to the schematic illustration (FIG. 7) by means of gene synthesis 54 (ATG: Biosynthetics) as well as standardized cloning methods.
  • CD9 SEQ ID NO: 19
  • CD81 SEQ ID NO: 21
  • CD82 SEQ ID NO: 23
  • CD151 SEQ ID NO: 25
  • CD9ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 27
  • CD81ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 29
  • CD82ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 31
  • CD151ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO : 33
  • the linker V5-6xHis was isolated via EcoRI and EcoRV from the construct pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry and into the vector pCMV-CD63ALEL-mCherry via standard cloning methods as described in Section 1 Generation of CD63-based Model Vectors to Perform Localization experiments described, inserted. Also, epitopes 2F5 and 4E10 (HIV-1) were introduced into the vector pCMV-CD63ALEL-mCherry using primers PA1-12 / PA1 -13 and template vector pNL4-3 ( Figure 9B).
  • FIG. 9A For the detection of bound antibodies on the surface of (FIG. 9A) HEK293T, HEK293T cells or (FIG. 9C) HeLa cells were seeded in 96-well format with the plasmids pCMV-CD63ALEL-V5-6xHis-mCherry (FIG. Fig. 9A) or pCMV-CD63ALEL-2F5-4E10-mCherry (Fig. 9C) by means of
  • the primary antibodies were bound by means of rabbit anti-human HRP (DAKO) in a dilution of 1: 1000 and both ELISA variants with 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine as ELISA substrate (TMB) were used.
  • TMB ELISA substrate
  • Substrate Kit, Thermo Fisher Scientific according to the manufacturer's instructions and the OD values measured at 450 nm with the Multiscan TM GO 96-well plate-set spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).
  • the expression of the fusion proteins was determined using cLSM as described in Section 1 Generation of CD63-based Model vectors detected to perform localization experiments. 7. Increasing the efficiency of protein transport to the surface of human cells by using flanking EcoR ⁇ IEcoRV restriction sites in the tANCHOR system
  • flanking Ecof? L / EcoRV restriction sites in the tANCHOR system increases the transport efficiency to the cell surface.
  • Introduction of additional restriction sites into the minimal linker results in the translation of serine and arginine in the linker (GSSGRRSLQGGGG) between the 3rd and 4th transmembrane domains of CD63 ( Figure 10A).
  • the vectors with further cleavage sites were generated by gene synthesis 54 (ATG: Biosynthetics) and expressed in HEK293T cells as already described in Section 2 Transfection and Confocal Laser Scanning Microscopy (cLSM) and examined for subcellular localization (FIG. 10B).
  • SEQ ID NO: 1 DNA sequence of pA4E211 (CD63ALEL)
  • SEQ ID NO: 2 DNA sequence of CD63ALEL
  • SEQ ID NO: 3 Protein sequence of CD63ALEL
  • SEQ ID NO: 4 primer PA1-01
  • SEQ ID NO: 5 primer PA-02
  • SEQ ID NO: 6 primer PA1-03
  • SEQ ID NO: 7 primer PA1-04
  • SEQ ID NO: 8 primer PA1-05
  • SEQ ID NO: 10 primer PA1-07
  • SEQ ID NO: 12 primer PA1-09
  • SEQ ID NO: 15 primer PA1-12
  • SEQ ID NO: 16 primer PA1-13
  • SEQ ID NO: 17 CD63
  • SEQ ID NO: 18 Protein sequence of CD63
  • SEQ ID NO: 19 DNA sequence of CD9 (Genbank Accession No. NM_001769.3)
  • SEQ ID NO: 20 Protein sequence of CD9
  • SEQ ID NO: 21 DNA sequence of CD81 (Genbank accession no.
  • SEQ ID NO: 22 Protein sequence of CD81
  • SEQ ID NO: 23 DNA sequence of CD82 (Genbank Accession No. NM_002231 .3)
  • SEQ ID NO: 24 Protein sequence of CD82
  • SEQ ID NO: 25 DNA sequence of CD151 (Genbank Accession No. BT007397.1)
  • SEQ ID NO: 26 Protein sequence of CD151 SEQ ID NO: 27: DNA sequence of CD9AEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 28: Protein sequence of CD9ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 29: DNA sequence of CD81 ALEL V5-6xHis SEQ ID NO: 30: Protein sequence of CD81ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 31: DNA sequence of CD82ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 32: Protein sequence of CD82ALEL-V5-6xHis
  • SEQ ID NO: 33 DNA sequence of CD151ALEL-V5-6xHis
  • SEQ ID NO: 34 Protein sequence of CD151ALEL-V5-6xHis
  • SEQ ID NO: 35 DNA sequence of the V5-6xHis linker
  • SEQ ID NO: 36 Protein sequence of the V5-6xHis linker
  • SEQ ID NO: 37 DNA sequence of the 2F5-4E10 linker
  • SEQ ID NO: 38 Protein sequence of the 2F5-4E10 linker
  • SEQ ID NO: 39 DNA sequence of the linker version (8)
  • SEQ ID NO: 40 protein sequence of the linker version (8)
  • SEQ ID NO: 41 DNA sequence of the linker in the vector pCMV-CD63ALEL-mCherry (minimal linker (9))
  • SEQ ID NO: 42 protein sequence of the linker in the vector pCMV-CD63ALEL-mCherry (minimal linker (9))
  • SEQ ID NO: 43 DNA sequence of the linker in the vector pCMV-CD63ALEL-V2 mCherry
  • SEQ ID NO: 44 Protein sequence of the linker in the vector pCMV-CD63ALEL-V2-mCherry
  • SEQ ID NO: 45 DNA sequence of the linker between CD63ALEL and the fluorescent protein
  • SEQ ID NO: 46 Protein sequence of the linker between CD63ALEL and the fluorescent protein
  • a. modified on surfaces e.g. are glycosylated and / or b. can occupy a functional conformation on surfaces.
  • Molecules after 1. and 2. which are generated indirectly via coding matrices and which result from the fusion of at least partial units of at least one of the coding matrices and those from a combination of different sequences
  • Molecules 1, 2 and 3 the coding nucleic acid molecules according to the invention represent these in vivo and in vitro
  • RNA etc. In vivo by means of natural or non-naturally occurring nucleic acid molecules (RNA etc.) by means of circular or linear nucleic acid molecules or
  • Molecules 1 to 4 which, their gene products, transfected cells or parts of cells serve in bioassays structural, bioanalytical and (veterinary) diagnostic issues related to specific binding of different molecular species (small molecules (drug libraries, natural products), RNAs, proteins and DNA) and / or catalysis and to build bioanalysis systems (bioassay), diagnostics, if necessary accompanying therapy and / or therapies. Molecules after 1.
  • Molecules 1 to 4 which, whose gene products, transfected cells or parts of cells serve to solve problems in the field of immunoanalytics and immunodiagnostics to solve immunoanalytical and diagnostic issues and, where appropriate, to build therapies.
  • Molecules 1 to 4 whose gene products, transfected cells or parts of cells serve to develop or operate analytical high-throughput systems.
  • Molecules 1 to 4 which, whose gene products, transfected cells or parts of cells directly or indirectly serve to develop immunotherapeutics to be used directly (polyclonal or monoclonal antibodies or artificial molecules with similar uses).

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Fusionsproteine basierend auf Tetraspanin-Proteinen, bei denen die extrazelluläre Schleife ganz oder teilweise durch Peptidsequenzen anderer Zusammensetzung ersetzt ist sowie deren Herstellung und Verwendung als Transportvehikel. Die offenbarten Fusionsproteine werden in der Membran von Zellen verankert und können genutzt werden, um mit ihnen fusionierte Fremdpeptide auf der Zelloberfläche zu präsentieren.

Description

System zur Präsentation von Peptiden auf der Zelloberfläche
Beschreibung
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Fusionsproteine basierend auf Tetraspanin-Proteinen, bei denen die extrazelluläre Schleife ganz oder teilweise durch Peptidsequenzen anderer Zusammensetzung ersetzt ist sowie deren Herstellung und Verwendung als Transportvehikel. Die offenbarten Fusionsproteine werden in der Membran von Zellen verankert und können genutzt werden, um mit ihnen fusionierte Fremdpeptide auf der Zelloberfläche zu präsentieren.
Der strukturelle Bauplan von Zellen und deren Physiologie wird von Genen kodiert. Die Gene bestehen aus DNA und finden sich entweder im Genom, oder auf extra-chromosomalen Elementen. Sie exprimieren primäre und sekundäre Genprodukte, wie RNA und Proteine. Diese können vielseitig enzymatisch weiter modifiziert vorkommen.
Die Genprodukte finden sich vorwiegend im Cytosol. Die Proteine finden sich teilweise auch in den intrazellulären Membranen der Kompartimente und in der äußeren Zellmembran sowie gegebenenfalls auch der Zellwand wieder. Bei Eukaryoten finden sich Proteine und Vorläufer-RNAs im Zellkern. Proteine werden in intrazellulären Membranen im Cytosol sortiert und auf Zellkompartimente verteilt, können aber auch durch Sekretion aus der Zelle hinaus exportiert werden. Exportproteine aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) können zudem im Golgi-Apparat während des Transports glykosyliert werden.
Eine besondere Proteinspezies, die membranständigen Proteine werden aktiv an die Zellmembran geleitet und verankern sich dort vertikal zur Membran. Horizontal dagegen sind sie aber aufgrund der Membranfluidität flexibel in der Lage, innerhalb Membran zu migrieren. Zum Teil sind Membranproteine mit anderen heterologen Membranproteinen im Verbund komplexiert. So agieren humane Proteine zu 80% in assoziierten Proteinkomplexen 1. Manche Spezies interagieren kooperativ untereinander in der Membran und bilden dort stabile Strukturen.
Über Membranproteine wird eine Vielzahl von Signalprozessen gesteuert, die die Zelle mit ihrer Umwelt interagieren lassen. Membrantransporte von Proteinen über die Zellmembran im Zusammenhang mit Sekretionsprozessen nach außen sind ebenfalls möglich.
Zur Präsentation von Epitopen nutzt das Immunsystem MHC- Membranproteine auf Zellen, um potenzielle eingedrungene Pathogene in der Zelle zu identifizieren. Diese physiologischen Prozesse sind in der Zelle meist sehr gut etabliert und die involvierten Proteine sind hoch spezifisch auf diese Funktion hin evolviert, d.h. meist sehr spezifisch auf eine bestimmte Funktion hin ausgerichtet. Deshalb kann man erwarten, dass zusätzliche, artifizielle Aminosäuresequenzen diese Funktionen stören.
Tetraspanine gehören zu einer Protein-Superfamilie mit 33 Mitgliedern in Säugetieren. Das Hauptcharakteristikum der Tetraspanine sind ihre 4 Transmembrandomänen TM1-4, was auch zur Namensgebung geführt hat. Tetraspanine enthalten zudem eine kleine und eine große extrazelluläre Proteinschleife (small und large extracellular loop), auch als SEL und LEL bezeichnet. Der LEL enthält ein hoch konserviertes CCG-Aminosäure-Motiv. Des Weiteren ist eine intrazelluläre Proteinschlaufe (small intracellular loop, SIL) enthalten. N- und C-Terminus sind intrazellulär lokalisiert 3 -36. Tetraspanine organisieren sich durch laterale Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) in Tetraspanin angereicherten Arealen (tetraspanin enriched microdomains, TEMs) 37·38.
Um Fremdproteine und Epitope heterologer Zusammensetzung in beabsichtigter Weise, beispielsweise an die Oberfläche von Säugetierzellen, z.B. humanen Zellen, zu transportieren und dort zu präsentieren, werden besonders geeignete Trägerproteine (Carrier) benötigt. Diese sollten genügend elektromotorische Kraft besitzen und in der Lage sein, die Membranpotenziale zu nutzen, um einen Proteintransport mit einer hohen Effizienz der Translokation über die Membran hinweg zur Zelloberfläche zu gewährleisten 2 8. Es sind in der Vergangenheit sogenannte „Display"- Systeme bekannt geworden, im Allgemeinen membranständige Proteine, deren man sich als Carrierproteine für die Präsentation von Fremdproteinen bedienen kann, indem man diese gentechnisch modifiziert. Eines der bekanntesten Protein-Display-Systeme stellt das Phagen-Display dar. Es findet Verwendung in der Präsentation von Proteinbestandteilen auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen im bakteriellen System 9"12. Es konnten jedoch auch bei Gram-positiven sowie Gram-negativen Bakterien in der Vergangenheit erfolgreich heterologe Proteine auf der äußersten Membran ohne Verwendung des Phage-Displays präsentiert werden. Hierbei wurden unterschiedliche Transportmechnismen innerhalb der Bakterienzelle ausgenutzt, um Proteine zur äußersten Membran der Bakterienzelle zu leiten 13 20. Weitere Entwicklungen bei Display-Systemen bewegten sich hin zu eukaryotischen Systemen wie Hefen und Insektenzellen, um eine Proteinfaltung sowie Modifizierungen an rekombinanten Proteinen wie z.B. N-Glykosylierungen sicherzustellen 21"29. Auch für den Einsatz im Säugetier-System wurden bereits erste Display- Systeme entwickelt 30 33.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war ausgehend von diesem Stand der Technik die Bereitstellung einer neuen Möglichkeit, beliebige heterologe Peptide in einer Plasmamembran zu verankern und auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Tetraspanine sich hervorragend als Vehikel eignen und eine hocheffiziente Transportleistung für mit ihnen fusionierte Fremdpeptide zur Verankerung und Präsentation auf der Oberfläche von Zellen besitzen. Sie sind in der Lage, Fremdpeptide hocheffizient über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat zur Plasmamembran von Säugerzellen zu geleiten. Proteine der Tetraspanin-Familie weisen zwischen den Transmembrandomänen TM3 und TM4 im Wildtyp eine Proteinschleife (large extracellular loop, LEL) auf. Überraschenderweise konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden werden, dass diese extrazelluläre Schleife ganz oder teilweise durch Peptidsequenzen anderer Zusammensetzung ersetzt werden kann und es so möglich ist, das eingefügte heterologe Peptid über das Tetraspanin-Trägerprotein über eine Membran zu transportieren und in der Membran zu verankern.
Die Erfindung begründet sich auf der Einfachheit einer einheitlichen, molekularen Struktur zur flexiblen und variablen Sequenzmodulierung in einem modularen Protein-Expressions-System in Verbindung mit der Funktion eines spezifischen Transportvehikels über zelluläre Membranen und deren dortige Verankerung.
Die bereitgestellten Vektorsysteme ermöglichen es mittels einfacher Klonierungsstrategien Proteinbestandteile flexibel auszutauschen oder zu ergänzen (z.B. einzelne Epitope zu addieren und auch ganze Proteinbibliotheken anzulegen).
Nach der Expression der erfindungsgemäßen Tetraspanin-Fusions- Konstruktionen (transient oder stabil ins Genom integriert) ist die Lokalisation der Fusionsproteine in der Membran nahezu quantitativ. Die Tetraspaninproteine werden sehr effizient auf die Membran transloziert. Dies ist bei den bereits bekannten Systemen in der Form bei Weitem nicht (z.B. EGFR-Rezeptor) erreicht.
Die Expression der erfindungsgemäßen Tetraspanin-Fusionsproteine erfolgt vergleichsweise schnell, in der Regel bereits über Nacht, wohingegen die Expression bei anderen Transportsystemen üblicherweise innerhalb von zwei Tagen erfolgt. Andererseits ist auch die Stabilität der Fusionskonstrukte und deren Lebensdauer im Vergleich mit den bekannten Proteinen mit den sieben Transmembran-Domänen im Vergleich besser, da man keine Anhäufung von cytosolischen Abbauprodukten findet (GPCR-Rezeptoren sind rekombinant als instabil bekannt).
Mit dem erfindungsgemäßen System, das nur vier Transmembrandomänen besitzt, kann man stabil und problemlos ein bis mehrere Proteine auf zellulären Oberflächen transportieren und dort beispielsweise als stationären Partner in Interaktionsexperimenten mit kleinen Molekülen, weiteren Proteinen wie Antikörpern, sowie anderen Proteinen (z.B. katalytischen Enzymen, DNAs, RNAs und Zuckern etc. fixieren bzw. immobilisieren.
Die Reaktionspartner der Fusionsproteine auf der Membran können nun flexibel aus der umgebenden Lösung heraus spezifische Reaktionen mit den Proteinen bzw. den Glycosylresten auf der Membran eingehen.
Die Voraussetzung für diese Reaktionen liegen in der funktionalen Konformation der Proteine. Diese ist bei den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen vollkommen gewährleistet.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Fusionsprotein, umfassend eine erste Domäne (i), eine zweite Domäne (ii) und eine dritte Domäne (iii), wobei die zweite Domäne zwischen der ersten und der dritten Domäne angeordnet ist, wobei
(i) eine Teilsequenz eines Tetraspanins, welche die Transmembrandomäne 1 (TM1 ), die kleine extrazelluläre Schleife (SEL), die Transmembrandomäne 2 (TM2), die kleine intrazelluläre Schleife (SIL) und die Transmembrandomäne 3 (TM3) einschließt, oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge umfasst,
(ii) ein Peptid mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz umfasst, die zu der großen extrazellulären Schleife (LEL) eines Tetraspanins eine Sequenzidentität von weniger als 70% über die gesamte Länge aufweist und
(iii) eine Teilsequenz eines Tetraspanins umfasst, welche die Transmembrandomäne 4 (TM4) oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70 % über die gesamte Länge umfasst.
In der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass für die Membranständigkeit des Fusionsproteins die Sequenzen TM1 -3 und TM4 verantwortlich sind. Daher umfasst ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein zum einen eine erste Domäne (i), die eine Teilsequenz eines Tetraspanins mit den Transmembrandomänen TM1 -TM3 umfasst und zum anderen eine Domäne (iii), welche eine Teilsequenz eines Tetraspanins mit der Transmembrandomäne TM4 umfasst, oder dazu homologe Sequenzen.
Der Begriff „ Tetraspanin" bezeichnet im Sinne der Erfindung beliebige Proteine der Tetraspanin-Familie, insbesondere die 33 humanen Tetraspanine. Tetraspanine können untereinander in einer Membran spezifische Wechselwirkungen eingehen. Dadurch wird der Transport über die Membran und die dortige Verankerung begünstigt. Dieser Effekt kann in den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen genutzt werden, um auch das Fremdpeptid der Domäne (ii) effektiv über die Membran zu transportieren und zu verankern. Bevorzugte Beispiele für Tetraspanine im Sinne der Erfindung sind CD63, CD9 CD82, CD81 , CD151 und CD53 (DNA-Sequenzen und Proteinsequenzen, siehe Sequenzprotokoll. Besonders bevorzugt stammen die in einem erfindungsgemäßen Fusionsprotein enthaltenen Teilsequenzen von dem Tetraspanin CD63 (DNA- und Proteinsequenzen, siehe Sequenzprotokoll).
Grundsätzlich ist es möglich, für die Domäne (i) eine Teilsequenz eines ersten Tetraspanins zu wählen und für die Domäne (iii) eine Teilsequenz eines anderen Tetraspanins zu wählen. Bevorzugt sind jedoch alle Teilsequenzen aus demselben Tetraspanin, beispielsweise CD63, CD9, CD82, CD81 , CD151 oder CD53, bevorzugt CD63 (DNA- und Proteinsequenzen, siehe Sequenzprotokoll).
Die Domäne (i) umfasst vorzugsweise die Transmembrandomäne TM1 , die kleine extrazelluläre Schleife (SEL), die Transmembrandomäne TM2, die kleine intrazelluläre Schleife (SIL) und die Transmembrandomäne TM3 eines Tetraspanins, wobei die verschiedenen Transmembrandomänen und -schleifen unmittelbar aufeinander folgen, ohne dass zwischen diesen zusätzliche heterologe Sequenzabschnitte eingefügt sind. Besonders bevorzugt entspricht die Teilsequenz dem Wildtyp eines Tetraspanins ohne jegliche Abweichungen in Form von beispielsweise Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren. Es ist jedoch grundsätzlich möglich, für die Domäne (i) modifizierte Teilsequenzen eines Tetraspanins zu verwenden sofern diese eine Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge der Sequenz aufweisen, bezogen auf das Wildtyp Tetraspanin. Weiter bevorzugt beträgt die Sequenzidentität mindestens 80%, 85%, 90%, 95% oder 99% über die gesamte Länge der in der Domäne (i) enthaltenen Teilsequenz eines Tetraspanins.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die erste Domäne (i) aus der vorstehend beschriebenen Teilsequenz eines Tetraspanins oder einer dazu homologen Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% (weiter bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95% oder 99%) über die gesamte Länge.
Die Domäne (iii) umfasst eine Teilsequenz eines Tetraspanins, welche die Transmembrandomäne TM4 eines Tetraspanins oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge umfasst. Weiter bevorzugt ist die Sequenzidentität zu der Teilsequenz eines Tetraspanin-Wildtyps mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95% oder 99% über die gesamte Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Domäne (iii) aus der vorstehend beschriebenen Teilsequenz eines Tetraspanins oder einer dazu homologen Sequenz.
Die Domäne (ii) umfasst ein Peptid mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz. Dieses wird hierin auch „Fremdpeptid" oder „Fremdprotein" genannt. Die Aminosäuresequenz des Fremdpeptids unterscheidet sich von der Sequenz der großen extrazellulären Schleife (LEL) eines Wildtyp-Tetraspanins, insbesondere des (der) Tetraspanin(e) der Domänen (i) und (iii). Im Vergleich zu der LEL eines Wildtyp- Tetraspanins beträgt die Sequenzidentität über die gesamte Länge weniger als 70%, bevorzugt weniger als 50%, weiter bevorzugt weniger als 40% oder weniger als 30%.
Die Aminosäureabfolge in der Domäne (ii) kann grundsätzlich beliebig gewählt werden. Unabhängig von der Sequenz des Fremdpeptids bzw. der Domäne (ii) kann ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein auf der Oberfläche von Zellen, insbesondere von Säugerzellen (z.B. HEK293T-Homo sapiens) verankert und präsentiert werden.
Unter einem „Peptid" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus mindestens zwei Aminosäuren verstanden, die untereinander über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Länge des Peptids ist dabei grundsätzlich nicht begrenzt. Es sind sowohl Oligopeptide mit bis zu 10 Aminosäuren als auch Polypeptide mit über 10 Aminosäuren und Makropeptide mit mehr als 100 Aminosäuren umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Größe des Peptids weniger als 100 kDa, bevorzugt weniger als 50 kDa oder weniger als 30 kDa, beispielsweise 10- 30 kDa.
Im Sinne der Erfindung werden unter dem Begriff „Aminosäure" vorzugsweise die in zwanzig natürlich vorkommenden Peptiden, Polypeptiden und Proteinen gefundenen Aminosäuren verstanden, die jeweils L-Isomere sind. Der Begriff umfasst erfindungsgemäß aber außerdem Analoga der Aminosäuren und D-Isomere der Aminosäuren und ihrer Analoga.
Im Sinne der Erfindung werden die Begriffe „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" jeweils austauschbar verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Peptid um ein Protein mit mindestens 50 Aminosäuren. Dabei ist es bevorzugt, dass das Protein eine vorbestimmte Faltung einnimmt, die beispielsweise für eine gewünschte Funktion des Proteins erforderlich ist.
In der Domäne (ii) kann das Peptid mit vorgestimmter Aminosäuresequenz beispielsweise ein Antigen oder ein Epitop eines Antigens umfassen. Unter einem„Epitop" wird dabei ein Bereich eines Antigens verstanden, an dem ein Antikörper oder T-Zell-Rezeptor spezifisch bindet. Ein einzelnes Antigen kann ein oder mehrere Epitope umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz mehrere Epitope, die durch Linker miteinander verknüpft sind. Beispielsweise handelt es sich um mehrere Epitope eines Antigens. Beispiele für Epitope sind Krebsepitope, HIV-Epitope (z.B. gp41 von HIV- ). Beispiele hierfür sind V5-6xHis (SEQ ID NOs: 35, 36) oder 2F5-4E10 (SEQ ID NOs: 37, 38).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz der Domäne (ii) ein Protein, welches eine gewünschte Funktion aufweist, beispielsweise ein Enzym wie z.B. eine Protease.
Die zweite Domäne (ii) kann neben dem Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz weiterhin ein oder mehrere Teilsequenzen der LEL eines Tetraspanins oder dazu homologe Sequenzen mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge umfassen. Bevorzugt beträgt die Sequenzidentität mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99%. Die Teilsequenzen der LEL eines Tetraspanins können C- und/oder N-terminal zu dem Peptid mit der vorbestimmten Aminosäuresequenz angeordnet sein. Vorzugsweise stammen Teilsequenzen der LEL in der Domäne (ii) von demselben Tetraspanin wie die Sequenzabschnitte der Domänen (i) und (iii).
„Homolog" wie hierin verwendet beschreibt die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, Molekülen oder zwischen zwei Nukleinsäuren. Wenn eine Position in beiden der zwei verglichenen Sequenzen durch die gleiche Basen- oder Aminosäure-Monomeruntereinheit besetzt ist, so sind die entsprechenden Moleküle an dieser Position homolog. Die prozentuale Homologie zwischen zwei Sequenzen ist die Funktion der Zahl von Übereinstimmungen oder homologen Positionen, welche die beiden Sequenzen gemeinsam haben, geteilt durch die Zahl der verglichenen Positionen mal Hundert. Wenn z.B. 6 von 10 Positionen in zwei Sequenzen übereinstimmen oder homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen zu 60% homolog. Im Allgemeinen wird ein Vergleich durchgeführt, wenn zwei Sequenzen so aneinander ausgerichtet werden, dass eine möglichst große Homologie erreicht wird. Ein solches Ausrichten kann bereitgestellt werden, indem z.B. das Verfahren von Niedelman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970, vorzugsweise unter Zuhilfenahme von Computerprogrammen, durchgeführt wird.
Homologe Sequenzen haben identische oder ähnliche Aminosäurereste gemeinsam, wobei ähnliche Aminosäurereste konservative Substitutionen für entsprechende Aminosäurereste oder erlaubte Punktmutationen von entsprechenden Aminosäureresten in einer ausgerichteten Referenzsequenz darstellen. In dieser Hinsicht stellt eine „konservative Substitution" eines Restes in einer Referenzsequenz diejenigen Substitutionen dar, die zu den entsprechenden Referenzresten physikalisch oder funktionell ähnlich sind, z.B. die eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit, kovalente Bindungen oder Wasserstoffbindungen zu bilden und dergleichen aufweisen. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind diejenigen, welche die Kriterien erfüllen, die für eine akzeptierte Punktmutation in Dayhoff et al.,„Atlas of Protein Sequence and Structure", 5: Suppl. 3, Kap. 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C., 1978, definiert sind.
Die Domänen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins sind in der Reihenfolge jeweils (i)-(ii)-(iii) angeordnet. Der Begriff „Fusion" bezieht sich dabei auf eine kolineare Kopplung der Domänen über ihre einzelnen Peptidgrundgerüste.
Die Anbindung der Domänen (i), (ii) und (iii) kann wahlweise direkt oder über flexible Linker erfolgen. In einer ersten Ausführungsform schließt sich an die Domäne (i) unmittelbar die Domäne (ii) an. Alternativ oder zusätzlich schließt sich an die Domäne (ii) unmittelbar die Domäne (iii) an.
In einer weiteren Ausführungsform sind flexible Linker zwischen der ersten und der zweiten Domäne und/oder zwischen der zweiten und der dritten Domäne angeordnet. Die vorhandenen Linker können gleich oder unterschiedlich sein. Beispielhafte Linker zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen umfassen z.B. Glycinpolymere (G)„, worin n eine ganze Zahl von mindestens 1 ist, Glycin-Alanin-Polymere und andere flexible Linker, die dem Fachmann bekannt sind. Bevorzugt sind im Wesentlichen Serin- und Arginin-freie Linker, besonders bevorzugt sind Serin- und Arginin-freie Linker. Ganz besonders bevorzugt ist der Linker LQEFDIGGGG (entspricht SEQ ID NOs: 41 , 42). Weitere Linker sind in Figur 2C beschrieben (siehe auch SEQ ID NOs: 39, 40).
Die Domäne (ii) kann weiterhin eine oder mehrere Erkennungssequenzen umfassen, die von einem Enzym gespalten werden können. Beispiele sind Erkennungsstellen für spezifische Proteasen, Nukleasen oder Endoglycosidasen. Alternativ kann die Erkennungsstelle eine Substraterkennungsstelle für ein spezifisches Hydrolaseenzym umfassen, z.G. Phosphatase, Glycosidase, Amidase oder Esterase. Der Begriff „Proteaseerkennungssequenz" wird hierin zusammenfassend für jegliche Erkennungssequenzen verwendet, die enzymatisch gespalten werden können. Diese können C- und/oder N-terminal zu dem Peptid mit der vorbestimmten Aminosäuresequenz angeordnet sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform flankieren die Proteaseerkennungssequenzen unmittelbar das Peptid mit der vorbestimmten Aminosäuresequenz. Grundsätzlich sind hierfür beliebige Proteaseerkennungssequenzen geeignet. Wenn die zweite Domäne (ii) neben dem Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz noch ein oder mehrere Teilsequenzen der LEL eines Tetraspanins umfasst, so ist es bevorzugt, die Proteaseerkennungssequenzen jeweils zwischen die LEL Teilsequenz und den C- bzw. N-Terminus des Peptids mit vorbestimmter Aminosäuresequenz einzufügen.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein zusätzlich eine vierte Domäne (iv) am N-Terminus und/oder eine fünfte Domäne (v) am C-Terminus des Fusionsproteins umfassen. Die Domänen (iv) und (v) können jeweils direkt oder über flexible Linker wie vorstehend definiert angebunden sein. Beispielsweise kann die Domäne (iv) direkt oder über einen flexiblen Linker am N-Terminus der Domäne (i) angebunden sein. Die Domäne (v) kann direkt oder über einen flexiblen Linker am C-Terminus der Domäne (iii) angebunden sein. Außerdem ist es möglich, Proteaseerkennungssequenzen wie vorstehend definiert zwischen die Domänen (iv) und (i) und/oder zwischen die Domänen (iii) und (v) anzuordnen bzw., sofern vorhanden, zwischen Linker und einer oder mehrerer der Domänen (i), (iii), (iv) und (v).
Bei einer Verankerung eines Tetraspanins in der Plasmamembran einer Zelle liegen die C- und N-Termini des Tetraspanins auf der cytoplasmatischen Seite. Entsprechendes gilt auch bei einer Membranverankerung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins. Die vierte und die fünfte Domäne (iv) und (v) eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins können beispielsweise so gewählt werden, dass sie eine Markergruppe oder einen sogenannten Tag umfassen. Unter einem„Tag" wird dabei eine kurze Peptidsequenz verstanden, beispielsweise ein Protein-Tag zur Markierung und Identifizierung, z.B. ein Flash-Tag oder das fluoreszierende Reporterprotein mCherry.
Es wurde gefunden, dass sich ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, welches sich von einem Wildtyp-Tetraspanin zumindest durch die Domäne (ii) unterscheidet, dennoch korrekt faltet, analog zu einem Wildtyp- Tetraspanin. Dies konnte am Beispiel der fluoreszierenden Proteine CFP und YFP in der Domäne (ii) gezeigt werden (siehe Figur 3B). Epitope zwischen der Transmembrandomäne TM3 und TM4 lassen sich mit einer extrazellulären Orientierung unter Zuhilfenahme der Rasterelektronenmikroskopie auf der Zelloberfläche nachweisen (Figur 4). Das Einführen von Epitopen zwischen der TM3 und der TM4 eines Tetraspanins und der Transport zur Zelloberfläche mit einer extrazellulären Orientierung und Epitopen am N- und C-Terminus wurde für das Beispiel CD63 mittels Rasterelektronenmikroskopie gezeigt (Figuren 5A-5D). Die erfolgreiche Proteinexpression der Fluoreszenzproteine konnte zusätzlich durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Dabei konnte für das jeweilige Fusionsprotein eine spezifische Bande über das FLAG sowie mCherry Epitop detektiert werden (Figur 6). Die Lokalisierung für weitere Tetraspanine (CD9, CD81 , CD82 und CD151) auf der Zelloberfläche wurde ebenfalls gezeigt (Figur 8). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Serin- und Arginin-armen Linkern die Effizienz der Lokalisierung auf der Zelloberfläche steigert (Figur 10).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodiert. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst einen für ein vorstehend beschriebenes Fusionsprotein kodierenden Sequenzabschnitt oder besteht aus diesem. Dieser Sequenzabschnitt wird hierin auch als „Fusionsgen" bezeichnet. Besonders bevorzugt liegt ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in isolierter Form vor.
Ein „Nukleinsäuremolekül im Sinne der Erfindung bezieht sich auf eine Abfolge von natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen, Basenanaloga, Basenderivaten oder Mischformen davon. Der Begriff schließt insbesondere DNA und RNA sowie davon abgeleitete Nukleinsäuren wie z.B. cDNA und mRNA mit ein. Zu den Nukleinsäuren gehören im Sinne der Erfindung auch Nukleinsäureanaloga wie PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), PSNA (phosphothioate nucleic acid). Diese Nukleinsäureanaloga können prinzipiell die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen, die allerdings in anderer Art und Weise miteinander verknüpft sind, als beispielsweise in DNA oder RNA. Zu den Nukleinsäuren gehören auch Nukleinsäuren, die Nukleinsäurederivate wie z.B. Hypoxanthine, 2,5- Diaminoporin und/oder Methylcytosin aufweisen, und modifizierte, insbesondere markierte, Nukleinsäuren. Diese Nukleinsäurederivate können neben Basenderivaten prinzipiell auch die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen. Markierungen können an Basen und/oder Rückgrat eingeführt sein. Die Verknüpfungen können DNA bzw. RNA oder den Nukleinsäureanaloga entsprechen. Die Nukleinsäuren können doppelsträngig oder einzelsträngig, linear, verzweigt oder zirkulär sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül wie vorstehend beschrieben umfasst. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" im Sinne der Erfindung umfasst sowohl Elemente, die die Expression auf Transkriptionsebene regulieren, wie beispielsweise Enhancer oder Silencer, als auch Elemente, die die Expression auf posttranskriptioneller Ebene regulieren (z.B. Splicing, Nuclear Export oder mRNA Stabilität). Der Begriff umfasst auch mehrere Elemente, die die Expression auf transkriptioneller bzw. posttranskriptioneller Ebene regulieren, bzw. Kombinationen von transkriptionellen und posttranskriptionellen Regulationselementen. Techniken und Hilfsmittel zur Identifizierung von Expressionskontrollsequenzen, die zu einer erhöhten Expression führen und zur Isolierung derselben sind dem Fachmann wohl bekannte Routinetechniken. Die Expressionskontrollsequenz kann insbesondere ein Promotor sein, bevorzugt ein eukaryotischer Promotor, wie z.B. ein CMV- oder ein SV40-Promotor; ein prokaryotischer Promotor oder Phagen- spezifischer Promotor, wie z.B. ein SP6- oder ein T7-Promotor. Besonders bevorzugt ist der Promotor ein CMV-Promotor. Der Vektor kann zusätzlich einen Sequenzabschnitt für die Termination und/oder Polyadenylierung des Nukleinsäuremoleküls umfassen.
Ein erfindungsgemäßer Vektor enthält weiterhin bevorzugt ein Selektionsmarkergen, d.h. einen Sequenzabschnitt der für einen Selektionsmarker kodiert. Beispiele für Selektionsmarker sind Antibiotikaresistenz oder Auxotrophie-Marker. Vorzugsweise wird ein amplifizierbares Selektionsmarkergen, wie z.B. Dihydrofolatreduktase, verwendet. Optional kann der erfindungsgemäße Vektor weiterhin einen Replikationsursprung umfassen.
Der Begriff„in operativer Verknüpfung" beschreibt im Sinne der vorliegenden Anmeldung eine Verknüpfung zweier oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen oder Teilsequenzen, die so positioniert sind, dass sie ihre beabsichtigte Funktion ausüben können. Beispielsweise ist ein Promoter/Enhancer funktionell mit einer kodierenden Gensequenz verknüpft, wenn er in cis- Stellung die Transkription der verknüpften Gensequenz kontrollieren oder modulieren kann. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, befinden sich funktionell verknüpfte Sequenzen in enger Nachbarschaft und, sofern zwei kodierende Gensequenzen verknüpft werden oder im Falle einer Sekretionssignalsequenz, im gleichen Leseraster. Obwohl sich ein funktionell verknüpfter Promoter im Allgemeinen stromaufwärts von der kodierenden Gensequenz befindet, muss er nicht notwendigerweise eng benachbart sein. Enhancer müssen ebenfalls nicht in enger Nachbarschaft vorliegen, solange sie die Transkription der Gensequenz begünstigen. Zu diesem Zweck könnten sie sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts von der Gensequenz vorliegen, ggf. auch in einigem Abstand. Eine Polyadenylierungsstelle ist funktionell mit einer Gensequenz verknüpft, wenn sie am 3'-Ende der Gensequenz derart positioniert ist, dass die Transkription über die kodierende Sequenz bis hin zum Polyadenylierungssignal fortschreitet. Die Verknüpfung kann nach üblichen rekombinanten Methoden erfolgen, z.B. mittels der PCR-Technik, durch Ligation an geeigneten Restriktionsschnittstellen oder durch Spleißen. Wenn keine geeigneten Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, können in an sich bekannter Weise synthetische Oligonukleotidlinker oder Adaptoren verwendet werden. Vorzugsweise erfolgt die funktionelle Verknüpfung nicht über Intron-Sequenzen.
Ein erfindungsgemäßer Vektor ist bevorzugt für mindestens eine (Wirts)zelle geeignet, insbesondere zur Replikation des Vektors in dieser Zelle und/oder zur Expression eines Proteins oder Peptids in dieser Zelle. Replikation kann in einer prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zelle erfolgen. Expression erfolgt bevorzugt in einer eukaryotischen Zelle. Der Vektor kann ein Plasmid sein.
Vektorkonstruktionen für die eukaryotische Expression nach Stand der Technik besitzen in der Regel einen starken, möglichst Zelltyp- unspezifischen eukaroytischen Promoter (z.B. den CMV- oder SV40- Promoter) und einen für die transkriptionale Termination und die Polyadenylierung verantwortlichen Sequenzteil (z.B. SV40-Termination- polyA). Zwischen diesen beiden Elementen befindet sich die zu exprimierende CDS (kodierende Sequenz), angeführt von einer mehr oder weniger gut ausgeprägten Kozak-Sequenz um das Startcodon herum. Im Falle der erfindungsgemäßen Ve kto r- Ko n stru kti o n ist die zu exprimierende CDS ein Gen aus der Superfamilie der Tetraspanine. Hierbei sind alle Tetraspaningene aus allen Organismenspezies, die über Gene dieser Gensuperfamilie verfügen, welche die gewünschte Transportleistung über die Membran erbringen, erfindungsgemäß. Allerdings sind die erfindungsgemäßen Fusionsgene dadurch charakterisiert, dass diese mindestens eine artifiziell eingeführte heterologe DNA-Sequenz als interne und ggf. terminale Fusion besitzen können. Terminale CDS-Fusionen sind heterologe DNA-Sequenzen, die 5'-proximal und/oder 3'-distal zum Tetraspaningen für ein Fusionsprotein bzw. ein Peptid kodieren. Zwischen der dritten (TM3) und der vierten (TM4) Transmembrandomäne sind erfindungsgemäß interne, kodierende heterologe DNA-Sequenzen eingeführt. Die Transmembrandomänen der Tetraspanine sind u.a. für den Transport der heterologen kodierenden Sequenzen zur Membran, die Translokation durch die Membran und die dortige Verankerung verantwortlich.
Ein durchschnittlicher Fachmann, der in der molekularen Biologie ausgebildet ist, wird in der Lage sein, funktionale DNA-Fusionskonstrukte gegebenenfalls mittels der Zuhilfenahme einschlägiger Literatur 39 herzustellen.
Weiterführende erfindungsgemäße Vektorkonstruktionen sind hier besonders hervorzuheben. Diese besitzen statt generellen eukaryotischen Promotoren auch bakterielle und phagen-spezifische, aber auch eukaryotische Zelltyp- bzw. organsspezifische Promotoren, die eine Zell- differenzierungsabhängige Expression ermöglichen. Man kann solche Promotortypen einsetzen, um die erfindungsgemäßen Genkonstrukte gleich welcher Anwendung zu verwenden. Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen der Vektoren können beispielsweise auch RNA- Polymerase-Promotoren von Phagen aufweisen, um hocheffizient in vitro oder gegebenenfalls in vivo mRNA-Moleküle zu erzeugen. Beispiele sind die Phagenpromotoren, wie SP6- oder T7-spezifische Promotoren für die Herstellung von mRNA-Molekülen in vitro, um gegebenenfalls die Fusionsgen-mRNA für therapeutische Zwecke und Anwendungen zuführen zu können. Diese Variante wird als Darreichungsform von Regulierern gerne gesehen weil sie die Rekombination von Nukleinsäuren ins Genom verhindern soll.
Die Expression von Tetraspaningen-Derivaten in Bakterien oder Hefen kann zur Isolierung der Fusionsproteine genutzt werden und in künstlichen Membranen Verwendung finden. Aber auch die eukaryotische differenzierungs- bzw. zellspezifische Expression beispielsweise in Mukosa- oder Muskelzellen kann genutzt werden, um DNA-Vakzine zellspezifisch zu exprimieren (s. z.B. EP1390490 B1 ).
In Zulassungsverfahren für Therapeutika sind Regulierungsvorschriften etabliert worden, die solche hochspezifischen Expressionseigenschaften zwingend fordern.
Weiterhin besitzen erfindungsgemäße Vektorsysteme ein spezifisches Design, das die Expression multipler Fusionsproteine in derselben Zelle mittels eines einzigen Vektor-Konstruktes erlaubt (s. Patentanmeldung DE 10 2013 006 487 A9). Mit diesem Design können zusätzliche Elemente vereinfacht hinzugefügt werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch solche Nukleinsäuren und Vektoren, die einen für ein Fusionsprotein kodierenden Abschnitt aufweisen, wie vorstehend definiert, wobei jedoch anstelle einer für das Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz kodierenden Sequenz lediglich eine multiple Kolonierungsstelle vorhanden ist, die die Klonierung eines für ein beliebiges Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz kodierenden Gens über Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen ermöglicht. Zusätzlich können auch multiple Klonierungsstellen in 5'- und/oder 3'- Position für N- und/oder C-terminale Domänen (iv) bzw. (v) vorhanden sein.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft daher ein Nukleinsäuremolekül umfassend einen ersten Sequenzabschnitt (i), einen zweiten Sequenzabschnitt (ii) und einen dritten Sequenzabschnitt (iii), wobei der zweite Sequenzabschnitt zwischen dem ersten und dem dritten Sequenzabschnitt angeordnet ist, wobei
(i) für eine Teilsequenz eines Tetraspanins, welche die Transmembrandomäne 1 (TM1 ), die kleine extrazelluläre Schleife (SEL), die Transmembrandomäne 2 (TM2), die kleine intrazelluläre Schleife (SIL) und die Transmembrandomäne 3 (TM3) einschließt, oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge, kodiert,
(ii) eine Multiple Cloning Site umfasst und
(iii) für eine Teilsequenz eines Tetraspanins kodiert, welche die Transmembrandomäne 4 (TM4) oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70 % über die gesamte Länge umfasst.
Die Sequenzabschnitte (i) bis (iii) sind hierbei bevorzugt von 5' nach 3' angeordnet. Eine „Multiple Cloning Site" oder „multiple Klonierungsstelle" umfasst mehrere, hintereinander liegende Restriktionsschnittstellen für Restriktionsendonukleasen. Die Multiple Cloning Site ist insbesondere zur Integration eines Nukleinsäuremolküls geeignet, wobei das integrierte Nukleinsäuremolekül im Leseraster mit dem ersten Sequenzabschnitt (i) und dem dritten Sequenzabschnitt (iii) für ein zu präsentierendes Peptid kodiert. Das Peptid umfasst bevorzugt eine vorbestimmte Aminosäuresequenz, die zu der großen extrazellulären Schleife (LEL) eines Tetraspanins eine Sequenzidentität von weniger als 70% über die gesamte Länge aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor umfassend ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Erkennungssequenzen für die verschiedensten Restriktionsendonukleasen sowie die hier zugehörigen Restriktionsendonukleasen bekannt. Bevorzugt werden Sequenzen verwendet, die aus zumindest sechs Nukleotiden als Erkennungssequenz bestehen. Eine Auflistung geeigneter Kennungssequenzen findet sich beispielsweise in Sambrook et al. (1989).
Spezifische Sequenzelemente eines erfindungsgemäsen Vektors mit multipler Klonierungsstelle betreffen die Einbringung von heterologen DNA- Sequenzen an die entsprechenden terminalen und internen, funktional zulässigen Positionen der Tetraspaningene (wie z. B. CD63) selbst. So kann man in die„uniquen", d.h. einzelnen, Restriktionsschnittstellen immer wieder neue Epitop-CDS bzw. verschiedene Gene und Genfragmente additiv in einer zyklischen Reaktion in bestehende Vektorkonstrukte einfügen. Beispielgebend ist der erfindungsgemäse Vektor pAE21 1 in Fig. 2A, SEQ ID NO: 1 ). Restriktionsstellen sind an der Position zwischen den Transmembrandomänen TM3 und TM4 positioniert. Für diese Position wurde experimentell gezeigt, dass sie für die Fusion mit heterologen DNA-Sequenzen, die für ein heterologes Peptid kodieren, besonders geeignet ist, weil sie die Funktion des Membrantransports nicht stört. An dieser Stelle befindet sich eine Proteinschleife, die über die Membran hinaus steht, deren Sequenz variabel sein kann, ohne mit dem Proteintransport zur Plasmamembran des Tetraspaninproteins in Zellkulturen wesentlich zu interferieren.
Die 5-terminale CDS-Fusion, um ein N-terminales Fusionsprotein zu erzeugen, kann mittels zweier Nco\ im 5'-Bereich des CD63-Gens derart eingebracht werden, dass die Kozak-Sequenz im Startbereich regeneriert wird. Diese ist unique.
Das mögliche 3'-terminale-CDS-Fusionselement, welches zu einer C-terminalen Proteinfusion führt, wird mittels der TypHS- Restriktionsendonuklease ßsal inseriert, die in dem Konstrukt spezifische Enden für Nde\ und Bell erzeugt. Auch diese Sites können gegebenenfalls zum Einfügen von 3'-terminalen Genfusionselementen Verwendung finden. Die oben angegebenden Realisierungen von Vektorsystemen sind beispielhaft und jede andere Methodik bzw. Technologie der Modifikation der Vektoren neben der beschriebenen Restriktion-Ligationsverfahren ist ebenso erfindungsgemäß, wie beispielsweise die Sequenzmodulation der Systeme mittels geeigneten Rekombinationssystemen, in vivo, wie auch in vitro.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, welche ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül bzw. der Vektor umfassend eine für ein Fusionsprotein kodierende Sequenz und geeignete genetische Kontrollfunktionen genomisch stabil integriert oder liegt extra-chromosomal in den Zellen vor und ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein wird dort konstitutiv oder induzier- oder reprimierbar exprimiert.
Bei einer Zelle im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich vorzugsweise um eine eukaryotische Zelle, bevorzugt um eine Säugerzelle wie insbesondere eine humane Zelle. Weitere Beispiele für geeignete Säugerzellen sind Zelllinien von Nagern wie z.B. Mäuse-, Ratten- und Hamsterzellen, oder Affenzellen. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor kann mithilfe von an sich bekannten Techniken in eine Zelle, insbesondere eine eukaryotische Zelle eingebracht werden. Die erfolgreiche Transfektion resultiert in transformierten, genetisch modifizierten, rekombinanten oder transgenen Zellen.
Die Transfektion von eukaryotischen Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor erfolgt nach üblichen Methoden (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Geeignete Transfektionsmethoden sind z.B. die Liposomen- vermittelte Transfektion, Kalziumphosphat-Kopräzipitation, Elektroporation, Polykationen, (z.B. DEAE-Dextran)-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und virale Infektionen. Erfindungsgemäß werden die Zellen vorzugsweise über eine stabile Transfektion erhalten, wobei die Konstrukte entweder in das Genom der Wirtszelle oder ein artifizielles Chromosom/Minichromosom integriert werden oder in stabiler Weise episomal in der Wirtszelle enthalten sind. Die Transfektionsmethode, die die optimale Transfektionsfrequenz und Expression des heterologen Gens in der jeweiligen Wirtszelle ermöglicht, ist dabei bevorzugt. Per Definition wird jede Sequenz oder jedes Gen, das in eine Wirtszelle eingebracht wird, im Bezug auf die Wirtszelle als„heterologe Sequenz" oder „heterologes Gen" bezeichnet, selbst dann, wenn die einzubringende Sequenz oder das einzubringende Gen identisch zu einer endogenen Sequenz oder einem endogenen Gen der Wirtszelle ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann es sich um Zellen von transgenen Zellverbänden verschiedener Zelltypen handeln, in denen ein erfindungsgemäßes Fusionsgen auch in unterschiedlichen zellulären Differenzierungszuständen exprimiert wird. Diese Zellen können ex vivo erzeugt werden und ggf. anschließend in vivo therapeutisch eingesetzt werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich um Zellen von Zellverbänden transgener Organismen, deren Zellen die Keimbahn durchlaufen haben und sich zu vielzelligen Systemen, vorzugsweise zu vitalen Organismen, entwickelt haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde eine erfindungsgemäße Zelle weiterhin mit mindestens einem weiteren Nukleinsäuremolekül oder mindestens einem weiteren Expressionsvektor transformiert oder transfiziert. Das weitere Nukleinsäuremolekül bzw. der weitere Expressionsvektor enthält vorzugsweise einen Abschnitt, welcher für ein weiteres vorbestimmtes Protein kodiert. Bei dem weiteren Nukleinsäuremolekül oder Expressionsvektor kann es sich gemäß einer Ausführungsform ebenfalls um ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor handeln, wobei in diesem Fall für die Domäne (ii) ein anderes Peptid mit einer anderen vorbestimmten Aminosäuresequenz gewählt würde. In einer anderen Ausführungsform enthält das weitere Nukleinsäuremolekül oder der weitere Expressionsvektor einen Abschnitt, der für ein Enzym kodiert, beispielsweise für eine Protease. Wenn in einer solchen Zelle das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül und das weitere Nukleinsäuremolekül exprimiert werden, werden sowohl das Peptid der Domäne (ii) mit vorbestimmter Aminosäuresequenz als auch das weitere Protein an der Membranoberfläche präsentiert. Wenn beispielsweise das Peptid der Domäne (ii) von Proteaseerkennungssequenzen flankiert wird, so könnte eine über das weitere Nukleinsäuremolekül exprimierte Protease an diesen Erkennungsstellen schneiden und so das Peptid freisetzen.
Erfindungsgemäß werden die Wirtszellen vorzugsweise unter serumfreien Bedingungen etabliert, adaptiert und kultiviert, ggf. in Medien, die frei von tierischen Proteinen/Peptiden sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Membranzubereitung, die aus einer erfindungsgemäßen Zelle erhalten wurde.
Eine Membranzubereitung im Sinne der Erfindung umfasst mindestens eine isolierte Membran, stärker bevorzugt eine isolierte, zelluläre Membran, noch stärker bevorzugt eine isolierte, zelluläre Plasmamembran und/oder eine isolierte, zelluläre Membran anderer Zellorganelle. Der Begriff„Membran" im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt ein in sich geschlossenes System umfassend mindestens ein Lipid und optional mindestens ein Protein. Die Lipide einer Membran bilden üblicherweise eine Lipiddoppelschicht. Die Membranzubereitung umfasst bevorzugt Membranpartikel, stärker bevorzugt Membranvesikel. Die Membranzubereitung kann aus einer erfindungsgemäßen Zelle durch dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden, bevorzugt durch Lyse der Zelle (Zelllysat), stärker bevorzugt durch Lyse der Zelle und anschließendes Isolieren und optional Reinigen der zellulären Membran (isolierte und optional gereinigte Membran). Optional können Tenside, wie z.B. Triton X-100, zur Solubilisierung der Membranen verwendet werden. Das Verfahren kann zusätzlich einen Schritt zum Entfernen von Zelltrümmern beinhalten. Der Durchmesser der Membranpartikeln kann im Bereich von 1 - 1000 nm sein, bevorzugt 50 - 500 nm, stärker bevorzugt 75 - 200 nm. Mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 98% der Membranpartikel weisen einen Durchmesser in einem der hierin beschriebenen Bereiche auf.
Eine erfindungsgemäße Membranzubereitung wird von einer erfindungsgemäßen Zelle erhalten, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst. In der Zelle wird das erfindungsgemäße Fusionsprotein durch das Nukleinsäuremolekül oder den Vektor exprimiert. Eine erfindungsgemäße Membranzubereitung umfasst daher bevorzugt mindestens eine isolierte Membran und mindestens ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein ist hierbei bevorzugt in der Membran verankert, stärker bevorzugt auf der Oberfläche der Membran, insbesondere auf der extrazellulären Seite der Membran. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein wird auf der Membran präsentiert, bevorzugt auf der Oberfläche der Membran, insbesondere auf der extrazellulären Seite der Membran. Die Membranzubereitung kann optional zusätzlich ein oder mehrere Wild-Typ Tetraspanine umfassen.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Membransystemen um die äußere Membran von Zellen, z.B. von in vitro Zellkulturen, in denen mindestens ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein transient exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein synthetisches Membransystem umfassend eine Membran und ein Fusionsprotein, ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor wie vorstehend beschrieben.
Bei der Membran kann es sich um eine zelluläre (natürliche) oder synthetische (künstliche) Membran handeln. Eine zelluläre Membran ist insbesondere eine zelluläre Plasmamembran, die sich typischerweise an der Oberfläche (Außenschicht) einer Zelle befindet. Eine zelluläre Membran im Sinne der vorliegenden Erfindung kann Teil einer Zelle sein, oder aus einer Zelle isoliert worden sein, d.h. eine isolierte, zelluläre Membran sein. Eine zelluläre Membran ist typischerweise asymmetrisch und weist eine dem Cytoplasma-zugewandte Seite (plasmatische oder intrazelluläre Seite, innere Seite) und eine dem Cytoplasma-abgewandte Seite auf (extraplasmatische oder extrazelluläre Seite, äußere Seite).
Eine synthetische Membran kann synthetische und/oder isolierte, zelluläre Membranen umfassen. Insbesondere kann sich die Lipid- und/oder Proteinzusammensetzung bei synthetischen Membranen von den natürlich vorkommenden Zusammensetzungen zellulärer Membranen unterscheiden. Eine synthetische Membran ist bevorzugt kein Teil einer Zelle und liegt insbesondere als isolierte, synthetische Membran vor. Der Fachmann kann die Eigenschaften einer synthetischen Membran durch die Wahl der Lipide und/oder Proteine beeinflussen.
In einer Ausführungsform enthält ein synthetisches Membransystem umfassend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor zusätzlich ein System zur Expression des Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors, wodurch das Fusionsprotein exprimiert werden kann. Systeme zur Expression von Proteinen sind im Stand der Technik bekannt und sind bevorzugt zellfrei. Das System zur Expression umfasst bevorzugt ein System zur Translation eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere einer RNA oder mRNA; und, optional ein System zur Transkription eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Vektors, insbesondere um eine RNA oder mRNA zu erhalten.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Fusionsprotein direkt zur Membran zugegeben werden, um ein erfindungsgemäßes Membransystem zu erhalten.
Bei einem Membransystem wird das exprimierte oder zugegebene Fusionsprotein in der Membran verankert, bevorzugt auf der Oberfläche der Membran, insbesondere auf der äußeren Seite der Membran. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein wird auf der Membran präsentiert, bevorzugt auf der Oberfläche der Membran, insbesondere auf der äußeren Seite der Membran.
Es wurde gefunden, dass auch in einem synthetischen Membransystem die erfindungsgemäßen Fusionsproteine zur Membranoberfläche dirigiert, translociert und dort verankert werden können. In diesem Fall ist es möglich, in vivo oder in vitro artifizielle, nicht-kanonische Aminosäuren in die erfindungsgemäßen Fusionsproteine einzubauen. Mittels zellfreier Proteinsynthese könne Fusionsproteine gewonnen werden, die geeignet sind, auch synthetische Membranen zu besiedeln und dort verankert vorzuliegen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Präsentation eines Peptids mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz auf der Oberfläche einer Zelle umfassend die Schritte
(a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Zelle wie vorstehend beschrieben, und
(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen bei denen ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Verankerung eines Peptids mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz an einer Membran umfassend die Schritte (a) Bereitstellen einer Membran, und
(b) Inkontaktbringen der Membran mit einem Fusionsprotein wie vorstehend beschrieben unter Bedingungen, bei denen eine Verankerung des Fusionsproteins in der Membran erfolgt oder
Inkontaktbringen der Membran mit einer Nukleinsäure wie vorstehend beschrieben oder einem Vektor wie vorstehend beschrieben unter Bedingungen, bei denen das Fusionsprotein exprimiert und in der Membran verankert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer vorstehend beschriebenen Zelle, einer Membranzubereitung oder eines synthetischen Membransystems in einem Verfahren zum Screening nach Interaktionspartnern des Peptids, zur Untersuchung von Wechselwirkungen des Peptids mit Interaktionspartnern (z.B. Antikörpern), in einem Verfahren zur Herstellung des Peptids, als Immunisierungsreagenz in einem Verfahren zur Antikörperherstellung und/oder als Nachweisreagenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle, Membranzubereitung oder ein synthetisches Membransystem wie vorstehend beschrieben zur Verwendung als Vakzin und/oder als Medikament.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Fusionsproteine von den transfizierten, transient oder stabil exprimierenden Zellen, transgenen Organismen oder sythetischen Membransystemen entnommen, um in Forschung und Entwicklung Verwendung zu finden, wie auch ggf. als Bestandteil eines Verfahrens oder Kits einer kommerzialisierbaren Anwendung zugeführt zu werden. Beispiele sind die Herstellung von bioanalytisch-diagnostischen Systemen und Therapeutika.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Membranen, welche die Fusionsproteine enthalten, den Zellen, transgenen oder synthetischen Membransystemen entnommen, um in Forschung und Entwicklung Verwendung zu finden, wie auch ggf. als Bestandteil eines Verfahrens oder Kits einer kommerzialisierbaren Anwendung zugeführt zu werden. Beispiele sind die Herstellung von bioanalytisch-diagnostischen Systemen und Therapeutika.
Die exprimierten Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden auf der Zelloberfläche transfizierte Zellen als stationäre Reaktionspartner gezeigt und können für die Analyse spezifischer Interaktionen mit anderen Molekülen verwendet werden. Einerseits sind hier Protein-Protein- Interaktionen (z.B. mono- oder polyklonale Antikörper - Paratop-Epitop Wechselwirkungen, Coiled-Coil Wechselwirkungen u.v. spezifischen Interaktionen von pharmazeutisch-medizinischer, insbesondere auch molekular-mechanistischer Bedeutung) interessant. Auch für die Analyse von Wechselwirkungen mit anderen Molekülen, wie Mono- und Polysacchariden, RNAs, DNA und insbesondere mit kleinen chemischen Molekülen wie Naturstoffen und chemischen Substanzbibliotheken können Tetraspanin-Fusionsmoleküle in Anspruch genommen werden.
Die Expression von multiplen Tetraspanin-Fusionsmolekülen oder Proteinvarianten einer Proteinspezies in einer Zelle ist für bestimmte experimentelle Ansätze genauso interessant wie die kombinatorische Nutzung von verschiedenen interagierenden Proteinen.
In einer Ausführungsform der Erfindung exprimiert eine erfindungsgemäße Zelle eine Proteindomäne (A), die zur hochspezifischen Wechselwirkung mit einer anderen Proteindomäne (B) in der Lage ist. Die Proteindomäne (A) entspricht hierbei dem Peptid mit vorbestimmter Aminosäuresequenz der Domäne (ii) eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.
Diese externe Proteindomäne könnte dann mit verschiedenen funktionalen weiteren Proteindomänen verbunden sein. Für alle diese Proteindomänmodule könnte man sicher stellen, dass diese, wenn sie exogenen Ursprungs sind, an die Gegendomäne (A) der exprimierenden Zelle spezifisch binden und damit die Proteinliganden ausgetauscht werden können, die ihrerseits wieder in Verbindung treten könnten und somit eine durch spezifische Interaktion vermittelte Ko-existenz verschiedener Proteinmodule auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden könnte.
Bevorzugte Beispiele für die Anwendung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine, Vektoren, Zellen und Membransysteme sollen nachfolgend ausführlicher beschrieben werden.
Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI)
Zugänglich an Oberflächen fixierte Proteine können mittels besonderer Strukturen auf der Oberfläche der jeweiligen Proteine spezifische Kontakte zu weiteren Proteinen herstellen. Diese weiteren Proteine können die Proteinbausteine von Homo- bzw. Heteroproteinkomplexen sein, die sich wechselseitig erkennen können oder aber auch spezifische Proteine, wie Antikörper und Single chains, die spezifisch und zielgerichtet an bestimmte Protein-Oberflächenstrukturen binden können. Genomisch kodierte natürlich vorkommende Proteine, die spezifische Interaktionen mit anderen Proteinen eingehen, üben viele zelluläre Funktionen aus - von Funktionen im Zellkern bis hin zu vielfältigen cytosolischen und Membranfunktionen. Diese spezifischen und funktionalen Protein-Protein-Interaktionen (PPI) sind im Verlauf der Evolution entstanden und sind für die Integrität der zellulären Funktion maßgeblich verantwortlich. Zielgerichtete PPI wird durch zelluläre Prozesse und die Selektion von Proteinvariante vermittelt, die eine spezifische Interaktion mit Oberflächen besitzen. Das Immunsystem ist auf die sensiblen Reaktionen gegen die Veränderung der Oberflächen innerhalb eines Organismus ausgelegt und auf die Optimierung von Oberflächeninteraktionen von Antikörpern und Cytotoxizität in sehr kurzen Zeiträumen spezialisiert. In der humoralen Immunität werden große Mengen Epitop-spezifische, polyklonale Antikörper in kurzer Zeit produziert. Auch die besonderen Einzelkettenantikörper von Kamelartigen (single chains) und anderen natürlich vorkommenden immunogenen Systemen, die hochspezifische Proteininteraktionen entwickeln, sind bekannt geworden. ln der medizinischen Forschung hat man diese Prozesse zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern technisch mittels Zellkulturtechnolgien umgesetzt und damit die Erzeugung von spezifischen PPI in vitro ermöglicht.
Antikörperengineering nutzt künstliche, mittels Displaytechnologien (Ribosome Display, Phagedisplay, Yeast Display) hergestellte Paratope, die Epitope spezifisch erkennen können, um diese in Antikörpermoleküle einzubauen. Die effizienten Exportfunktionen für Proteineinheiten des hier beschriebenen tANCHOR-Systems und deren Verankerung in der Membran sind in hohem Maße für PPI-Analysen geeignet. Ferner sind auch mit Zuckern spezifisch modifizierte Proteine mittels der tANCHOR-Technologie auf Zelloberflächen präsentierbar.
Detektionssysteme, mit denen der durchschnittlich qualifizierte Fachmann in der Lage ist, eine spezifische PPI zu identifizieren, werden als Zellsortersysteme (FACS), Fluoreszenz- oder Biolumineszenzbasierte Imaging-Systeme aber auch als FRET-photonische Gerätschaften im Handel angeboten. Auch die massenspektroskopische Analyse kommt hier als Analysewerkzeug in hervorragender Weise in Frage.
Alleine das zur Verwendung kommende zelluläre System macht die Qualität der zu erzeugenden Daten und den entscheidenden Unterschied. Es ist, vergleichbar mit der Auflösung in der Optik, der alle weiteren Prozessschritte entscheidende Parameter, der die Qualität der erhaltenen Daten am Ende der Prozesskette festlegt.
Displayfunktionen für bioanalytisch-diagnostische Anwendungen wie auch für Therapeutika bereitzustellen, dazu ist das tANCHOR-System in besonderer Art und Weise geeignet. Mit diesem kann die Integrität von Proteinstrukturen unter Erhalt von beispielsweise strukturellen Epitopen, aber auch die von Bindedomänen bei der PPI von zellulären Regulatorproteinen untereinander, strukturell intakt bleiben. Analyse von kleinen Molekülen mit tANCHOR-Konstrukten
Mittels strukturell intakten Proteinstrukturen ist es zusätzlich möglich, Wechselwirkungsstudien der Bindung von, aber auch der Verdrängung aus, einer PPI-Bindung durch die kleinen Moleküle mit den auf den Zellen präsentierten Proteinen durchzuführen. Solche Wechselwirkungen kleiner Moleküle sind interessant, die mit PPIs interferieren und bei denen bestimmte Proteinaggregate unter dem Einfluss der kleinen Moleküle wieder aufgelöst werden könnten identifiziert werden. PPI-Analysen sind für die Entdeckung und die Entwicklung von kleinen Molekülwirkstoffen besonders gut geeignet.
Die tANCHOR-Technologie bietet hierfür ein hervorragendes Werkzeug, das eine Proteinexpression mit gleichzeitiger Verankerung der Proteine auf den Zelloberflächen zur Verfügung stellt. In Verbindung mit geeigneten Proteinpaaren aus einer weiteren Expressionsquelle oder auch gegebenenfalls durch die Ko-expression von verschiedenen tANCHOR- Molekülen kann man daraus Testsysteme für die Analyse von Wechselwirkungen kleiner Moleküle mit Proteinkomplexen etablieren1,40 48.
Darüber hinaus könnten die an der Zelloberfläche lokalisierten Abschnitte der erfindungsgemäßen Fusionsproteine mittels ggf. induzierbarer Co-Expression von hochspezifisch spaltenden sekretierten Proteasen (wie z.B. der TEV-Protease) spezifisch an einer vorgegebenen Stelle gespalten und so in Lösung gebracht werden. Die defekten Fusionsproteine könnten in einem Resynthesezyklus in der Membran stetig ersetzt werden und somit auch für eine dauerhafte Überexpression sorgen.
Kleine Moleküle (z.B. aus Extrakten von Sekundärmetabolite exprimierenden Organismen) könnten so an die erfindungsgemäßen Proteine binden und diese als Target identifizieren. In den resultierenden Komplexen aus kleinen Molekülen und erfindungsgemäß präsentierten Proteinabschnitten, können die kleinen Moleküle entweder spezifisch an die an der Zelloberfläche fixierten Target- Peptide oder an die bereits abgespaltenen, als Carrier-Peptide in Lösung befindlichen Target-Peptide gebunden sein.
Die resultierenden Komplexe und somit die kleinen Moleküle und deren Bindepartner könnten dann mittels Massenspektroskopie identifiziert werden. Beispielsweise könnten im Fall nicht-peptidischer kleiner Moleküle diese nach Isolierung der in Lösung befindlichen Komplexe und Zerstörung der Peptide, z.B. mittels unspezifischer enzymatischer Proteolyse etc., mittels Massenspektroskopie identifiziert werden.
Entwicklung und Produktion von Immundiagnostika
Entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung sind beispielsweise Anwendungen interessant, bei denen Antikörper in einem bestimmten Format, z.B. dem standardisierten 96-Well-Format, auf die Bindung mit tANCHOR exponierten Epitopen getestet werden sollen. Mittels des erfindungsgemäßen Systems werden beispielsweise Zellen in Mikrotiterplatten mit dem 96-Well-Format ausgesät und die Fusionskonstrukte in transient transfiziertem Zustand exprimiert. Ebenso ist dies mit stabilen Fusionsproteine exprimierenden Zelllinien möglich.
Beispielhaft wird die Verwendung des tANCHOR-Systems zur Detektion von Antikörpern in ELISA-Experimenten gezeigt (Figur 9).
Die Fusionsproteine finden sich auf den Zelloberflächen und werden dort präsentiert. Diese artifizielle Konfiguration der Membran kann direkt zur Entwicklung und Produktion von analytischen und therapeutischen Anwendungen umgesetzt werden. Auf diese Weise können Analysesysteme hergestellt werden, in denen z.B. für klinische Studien geeignete, der jeweiligen zu entwickelnden Anwendung entsprechende Blutseren von Patientenkohorten getestet werden. Für die Entwicklung von Immundiagnostika und Therapeutika, insbesondere auch für die therapiebegleitende Diagnostik, kann mit solchen Systemen das Patientenserum auf die Anwesenheit von Antikörpern und deren Bindungseigenschaften qualitativ wie quantitativ überprüft werden.
Darüber hinaus ist es möglich, Mikrotiterplatten und andere Formate, in denen transgene Zellen gewachsen sind, zu fixieren, einzutrocknen um in großem Umfang damit bio-analytische Testsysteme und Diagnostika zu herzustellen und diese in großem Umfang zu produzieren.
Außerdem ist es auch möglich, Membranen von transgenen Organismen, die Tetraspanin-Protein-Fusionsprodukte exprimieren, zu nutzen und diese aufzureinigen. Ebenso können künstliche Membranen, die erfindungsgemäße Fusionsprodukte beinhalten, solchen Verwendungen, wie sie oben beschrieben sind, zugeführt werden.
Die Kostenersparnis ist hier immens, da ein vergleichsweise teures Beschichten (coating) mit Peptiden bzw. exprimierten und gereinigten Proteinen entfällt.
Gewinnung von reinem Protein
In Forschung und Entwicklung, sowie auch in der höher-skalierten Produktion, ist die Gewinnung von hinreichenden Mengen Zielproteinen mit hoher spezifischer Aktivität mittels deren Expression immer noch eine Herausforderung, insbesondere, wenn man die Proteine in einem funktionalen Faltungszustand und gegebenenfalls modifiziert aufreinigen möchte. Hierzu ist es vorteilhaft, das erfindungsgemäße System zu verwenden. Dies kann von großem Vorteil sein, weil die Lokalisation des gewünschten Zielproteins außerhalb der Zelle, im Medium, ein sehr viel weniger komplexes Milieu darstellt als es das Cytosol innerhalb der Zellen darstellt. Dementsprechend ist es leichter anzureichern und zu isolieren. Normalerweise sind die exprimierten Proteine intrazellulär zu finden und werden aus dem Cytosol aufgereinigt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform dieser Verwendung kann die Abspaltung membranständigen Proteins, das mit tANCHOR exprimiert wurde, mittels Aminosäure-Sequenzmotiv-spezifischen Proteinasen von der Membran abgespalten werden. Die spezifischen Proteasen können einerseits exogen dem Medium zugeführt oder endogen mit dem Zielprotein ko-exprimiert werden. Dieses Vorgehen würde eventuell die Proform einer sequenzspezifischen Endoprotease erfordern, die im Medium aktiviert wird. In einer zeitlich andauernden Kultivierung der Zellen mit dem Ziel der Isolierung des Proteins erfolgt die Anreicherung von spezifischem Zielprotein schließlich im Medium, weil das von tANCHOR freigesetzte Zielprotein durch den Integritätsverlust des Proteins in die Membran stetig nachgeliefert wird.
DNA-Vakzinierung als therapeutische Anwendung
In Verbindung mit differenzierungs-spezifischen und/oder speziesspezifischen Promotoren (u.a. im Veterinärbereich), die nur in ganz bestimmten Zielzellen ihre Expression finden, ist das tANCHOR-System aufgrund des effizienten Membrantransports in der Lage, heterologe Genfusionselemente auch in den intakten Zellen eines Organismus zu exprimieren. Diese können exogen in Zellen eingebracht werden. Man kann zur Impfung mit DNA- oder auch RNA-Molekülen Tetraspaningen- Fusionskonstrukte direkt mittels sogenannter „Gene Guns" oder auch „Particle Guns" mit hoher Geschwindigkeit Zellen beschießen und die getroffenen transfizierten Zellen zur transienten Expression von Fusionsprotein veranlassen. Diese Proteine können Antigene oder subspezifische antigene Determinanten, Epitope, darstellen, die zuvor auf ihre Eignung hin getestet wurden. Sowohl für die Bereitstellung von zu diesem Zweck geeigneten diagnostischen bioAssays, wie auch für die therapeutische Vakzinierung kann die tANCHOR-Technologie eingesetzt werden.
Es wird diskutiert, dass DNA in die Genome von mit Genpartikeln getroffenen Zellen integrieren könnten und dort durch die Integration z.B. in ein Tumorrepressorgen gegebenenfalls Schäden verursachen könnten. Die Praxis lehrt aber, dass flankierend zu den erfindungsgemäßen Genkonstrukten sehr ausgedehnte homologe Genbereiche notwendig sind, um wirklich eine höhere und relevante Intergrationsrate zu erzeugen. Solche Elemente sind in den erfindungsgemäßen Konstrukten nicht vorgesehen. Allerdings sind aufgrund solcher Assoziationsketten über die Gefährlichkeit von DNA-Vakzinierungen seitens sensibler Regulatoren die mRNA-Vakzine im kommen. So ist es erfindungsgemäß auch möglich, beispielsweise mittels in vitro Transkription mRNA-Moleküle zu erzeugen, die für die Expression in eukaryotischen Zellen optimiert sind, diese zu stabilisieren und diese auf Nanobeads zu fixieren oder in geeignete Mikro-bis Nanokompartimente (virus like particles, VLPs) zu verpacken und die mRNAs in dieser Form therapeutischen Anwendungen zuzuführen.
Durch die spezifischen Eigenschaften der Tetraspaninfusionen werden die dabei exprimierten Proteine auf die Zellmembranen der exprimierenden Zellen transportiert und dort nach außen gezeigt.
Die Exposition von spezifischen Aminosäuresequenzen kann von dem Immunsystem erkannt werden und dort entsprechende, gewünschte Immunreaktionen humorale oder cytotoxische Immunreaktionen hervorrufen.
Therapeutische Applikationen unter Verwendung isolierter Zellen bzw. Zellmembranen
Zusätzlich ist es möglich, idealerweise wegen der HLA Inkompatibilitätsgruppen und damit verbunden möglichen unerwünschten Immunreaktionen, auch körpereigene Zellen nach der Entnahme ex vivo, gegebenenfalls nach oder während einer Zwischenkultivierungsphase, in vitro zu transfizieren. Die Transfektion körpereigener Zellen von Probanden (z.B. Menschen aber auch Tiere) mit DNA-Konstrukten basierend auf dem tANCHOR-System wird es ermöglichen, diese in autologen bzw. autogenen Vakzinierungen in Verwendung zu bringen. Dabei ist der Einsatz von intakten und auf Qualität geprüften autologen Zellen, wie auch der von isolierten Zellmembranen aus solchen Zellen möglich. Diese können beispielsweise durch Dichtegradienen Ultrazentrifugation gewonnen werden. Dabei kann das Verhältnis von Epitop zu Gesamtprotein verbessert werden und damit zur Erhöhung der spezifischen Aktivität einer Immunreaktion beitragen. Unspezifische Begleitreaktionen und Autoimmunreaktionen werden vermindert.
Die Verbindung von exprimierten Adjuvantien, die gegebenenfalls mit multiplen tANCHOR-Konstruktionen in einer Zelle ko-exprimiert werden können, ist eine Variante, die ebenfalls im Bereich der Möglichkeiten einer Verbesserung in der Anwendung von erfindungsgemäßen tANCHOR- Systemen liegt.
Die Ko-expression von verschiedenen, die physiko-chemischen Eigenschaften, wie z.B. die Löslichkeit von Membranen verbessernden Proteine könnte die aus den Zellen isolierten Membranen für eine Vakzinierung wesentlich verbessern. Auch natürliche Adjuvantien könnten bei einer Koexpression mit CD63-Antigen/Epitop-Fusionen die Impfantwort verbessern helfen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit umfassend
(i) ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor wie vorstehend beschrieben und
(ii) eine Zelle oder Membran. Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer Kit abhängig von der beabsichtigten Anwendung verschiedene Komponenten wie z.B. Kontrollplasmide, Kontrollproteine o.a. und spezielle Plasmide für verschiedene Applikationen enthalten.
Die vorliegende Erfindung soll durch durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele ausführlicher beschrieben werden.
Figuren und Tabellen
Fig. 1 : Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Fusionen und Lokalisation der Fusionsproteine.
(A) Positionen, die nach Stand der Technik mit Fusionen und Insertionen verschiedenen applikativen Lösungsansätzen dienen können. Das erfindungsgemäße System, auch als tANCHOR-System bezeichnet, besteht aus vier Transmembrandomänen (4TM). Zwischen TM3 und TM4 können für Epitope bzw. Proteine kodierende DNA-Sequenzen einkloniert werden. Am N-terminalen Ende wurde exemplarisch das Epitop FLAG-Tag und am C- terminalen Ende von CD63 wurde beispielsweise das Fluoreszenzprotein mCherry als Transfektionskontrolle zusätzlich im tANCHOR-System durch Genfusion implementiert (s. auch Fig. 2). (B) Mit dem zum STATUS QUO entwickelten tANCHOR-System sind von humanen Zellen exprimierte Epitope bzw. Antigene vernehmlich auf der Plasmamembran lokalisiert zu finden. Das tANCHOR-System ist in der Lage die Fusionsproteine mit einer hohen Effizienz zur Plasmamembran zu leiten und dort zu verankern.
Fig. 2A: Schematischer Aufbau des beispielhaften tANCHOR- Vektorsystems. Das erste beispielhafte tANCHOR-Vektor-System baut auf dem modularen multi-Expressionsvektor pA4E211 (SEQ ID NO: 1 ) und funktionalen Derivaten dieses Vektors auf. Zusätzlich ist eine Übersicht der Sequenzanordnung der CD63ALEL Bestandteile (Figur 2B) sowie die N-terminale Fusion des FLAG-Epitops sowie C-terminale Fusionierung des fluoreszierenden Reporterproteins wie z.B. mCherry oder GFP aus Pontellina plumata dargestellt. Tabelle 1 zur Fig. 2A. Liste der Sequenzmerkmale des tANCHOR- Basis-Systems pA4E211 :
Merkmal/Name Merkmal/Typ Position \osl(Xhol) R-sites 1..B Primer-tBoX PCR-Primer sequence 1 1..31
5'-IR ariner-tnpase IR-3' Recombination site 33..59 >4scI(BssHII) R-sites 63..70 CMV-enhancer Eukaryotic transcriptional enhancer 71 ..429 CMV-promoter Eukaryotic transcriptional promoter 436..633 Sac\ R-site 634..639
/Vcol-1 -START R-site 732..737 FLAG Immune marker/ Proteolytic site 738..761
Ncol-2-START R-site 762..767 tANCHOR-1 CD63(TM-1..3) Transmembrane domain 1 -3 of CD63 767..1099 EcoR R-site (Integration Site of fusion protein) 1100-1105
TEV-Protease-site-1 Specific proteolytic site 1 106..1 126 Hindlti R-site 127..1 132 BamH\ R-site 1 133 .1 138 Psti R-site 1 139..1 144
His6-tag R-site 1 145..1 162
TEV-Protease-site-2 Specific proteolytic Site 1 163..1 183 c-myc-Epitope Immune marker 1 184..1 197 EcoRV R-site (Integration site of fusion protein) 1214., 1219
4 x glycin spacer improves membrane
4xG-Spacer
translocation, Insertion and folding 1220..1230 tANCHOR- CD63(TM-4) Transmembrane domain 4 of CD63 1220..1345
Putative lysosomal- GYEVM-motive-3'-tANCHOR targeting/internalisation motive of CD63 1331..1345 C/al R-site 1352..1357
(+)SPACER bw. CD63, PpGFP SPACER sequence 1361..1369
PpGFP-Monomer_AdaptMA -CDS
Translational START codon 1373 1375
START
Bell sensitive methylation R-slte 2045..2047
PpGFP-Monomer_Adapt AM-CDS (-)Typell-non-blunt-palindromisc_feature 1376..2047
PpGFP-Monomer_AdaptMAM_STOP Translational STOP codon 2045..2047
BspHI R-site 2048..2053
Pmel R-site 2056..2063
BGH-polyA Polyadenylation site 2076..2300 Sgfl R-site 2309..2312
Mauei(BssHII) R-site 2307..2314 LoxP Lox_recombination site 2323..2356
SgrDI(Sall) R-sites 2365..2372
Promoter Fragment DNA fragment with promoter 2373..2475
AmpR-Promoter - 35 Promoter funetion 2476..2481
AmpR-Promoter -10 Promoter funetion 2494..2502
Leader-AmpR Transcriptional leader sequence 2507..2634
AmpR-gene Translational START codon 2635..2637
AmpR-CDS_mod Resistance gene AmpR 2638..3492
AmpR-gene STOP Translational STOP codon 3493..3495
AmpR_term transcriptional terminator 3495..3640 \s SI(Pvul), R-site 3641..3648
3'-IR mariner tnpase Recombination site 3652..3678
Pacl R-site 3681 , .3688
5'-R6Kgamm1/2 Split Ori (for cloning) 3689..3953 Split o Ori (composed of two ori) 3954..4569
ColElori-var.-pXPG pXPGderivative ori 3954..4569 R6Kgamma1/2-3' Split Ori (for cloning) 4570..4832 Fig. 2B: Ableitung der CD63ALEL-Sequenz (SEQ ID NO: 3) aus der kodierenden wildtypischen (WT) Sequenz von CD63 (SEQ ID NO: 17).
Die wildtypische CD63-Proteinsequenz besteht aus 238 Aminosäuren. Für die Generierung von CD63ALEL wurde die kodierende DNA-Sequenz der Transmembrandomänen 1 -3 sowie 4 (unterstrichene Sequenz CD63 TM1 -3, CD63 TM4) verwendet. Der Linker, der die Sequenz für den LEL von CD63 nicht enthält (ALEL), wird zwischen dem Fragment CD63 TM1 -3 und CD63 TM4 platziert (SEQ ID NO: 42). Zusätzlich ist das GGGG-Strukturmotiv im Linker eingefügt. Zwischen der Gensequenz CD63ALEL und der Gensequenz für das Fluoreszenzprotein kann eine Gensequenz (SEQ ID NO: 45) für einen Linker mit der Aminosäure-Sequenz KLIDTVDLEK (SEQ ID NO: 46) umfasst sein.
Tabelle 2 zu Fig. 2A: Lineare Organisation der modular aufgebauten tANCHOR-Kit-Vektorsysteme der Typ-I-Serie: pA4E211
(0) A<bsMscl-|FLAG|CDXX;Epitop |Reporter |-MauBI-SgrDI- SELEKTOREN -AsiS\-Pac\
(1 ) /4<6sl-Ascl-|FLAG|— : | |-Mat/BI-Sgrt)l-Puromycin R -AsiS\-Pac\
(2) Absl-Ascl-|FLAG|CD63: | |-/WauBI-SgrtDI-Puromycin R -AsiS\-Pac\
(3) Absl-/\scl-|FLAG|CD63: gp41 | |- aivBI-Sg/t)l-Puromycin R -AsiS\-Pac\
(4) Absl-Ascl-|FLAG|CD63: eYFP |eGFP-Gen |- at/BI-Sg/OI-Puromycin R -AsiS\-Pac\
(5) \0sl-/Ascl-|FLAG|CD63:bioPeplD|eGFP-Gen |-MaiyBI-SgrDI-Puromycin R -AsiS\-Pac\
(6) Absl-/\scl-|FLAG|CD63:bioPo/'ID| YFP-Gen |-MauBI-SgrDI-Puromycin R -AsiSI-Pacl
(7) Absl- Ascl-|FLAG|CD63:bioPo/'ID|POI-Fusion|-/Wat/BI-Sg OI-Puromycin R -AsiS\-Pac\
Positive und negative Kontrollvektoren für das tANCHOR-CD63 Protein- Präsentationssystem (Display-System). (0) Formale Darstellung der funktionalen Elemente der tANCHOR-Technologie: CDXX- ^verschiedene Tetraspanin Proteinspezies) CDS (=kodierende Sequenz) (1 ) tANCHOR- Vektor ohne CD63-Gen, der internen CD63-lnsertion und dem terminalen Reporter (2) tANCHOR-Vektor mit dem CD63-Gen, ohne interne CD63- Insertion und terminalen Reporter des tANCHOR-Vektors mit CD63-Gen und mit z.B. FLAG-Tag-Epitop als interne CD63-lnsertion und keinen terminalen Reporter (3) tANCHOR-Vektor mit dem CD63-Gen, und dem gp41 -Epitop als interne CD63-lnsertion sowie dem terminalen Reporter des tANCHOR-Vektors mit CD63-Gen (4) tANCHOR-Vektor mit z.B. CD63-Gen und dem YFP-Epitop als interne CD63-lnsertion und mit dem C-terminalen Reporter GFP (eGreen-Fluorescent-Protein-Gen). (5) tANCHOR-Vektor mit z.B. einem zur Analyse eingesetzten POI-bioPeplD-Epitope(s) (Protein/Peptide of interest) als interne CD63-lnsertion und mit dem C- terminalen Reporter eGFP (eGreen-Fluorescent-Protein-Gen), wie auch (6) mit zusätzlichen Reportergenen, wie YFP (Yellow-Fluorescent-Protein-Gen) und mit Fusionen des Proteins des jeweiligen experimentellen Interesse (POI-Fusion). (7) mit Fusionen des POI-Fusion etc. je nach dem experimentellen Design. bioPepID sind bioPeptid-Bibliotheken des Pep\D- Typs (EP09000893.9). Diese können im tANCHOR-System verwendet werden. Abs\-SgrD\ und Asc\-MauB\ wie auch AsiSI-Pacl sind verschachtelte und untereinander kompatible Restriktionsendonukleasen mit acht-meriger Erkennungssequenz für das Multiplexing der Expression von multiplen Genen. Jede andere Realisierung der erfindungsgemäßen Anwendungen ist ebenso von der Patenschrift abgedeckt.
Fig. 2C: Beispiele verschiedener erfindungsgemäßer Linkervarianten in Kombination mit CD63ALEL in dem beispielhaften Vektor pAE211_C V-P-GD63ALEL. Die Restriktionsschnittstellen EcoR\, EcoRV, Hind\\\, BamH\ und Ps sind für die Insertion von mehreren hintereinander folgenden Epitop-Einheiten nach einem Klonierungsstandardverfahren aber auch Klonierungsverfahren zur nahtlosen Klonierung möglich. (1 ) Seq1 , nur die erfindungsgemäßen und auf Funktion hin getesteten Restriktionsschnittstellen (R-sites) EcoRI und EcoRV und n*N=Abstandshaltersequenz (2) Seq(1 ) plus His6-Tag, (3) Seq(1 ) plus C- Myc Epitope, (4) Seq(1) plus His6-Tag plus C-Myc (5) TEV- Proteolysestellen, die zentralen Klonierungs stellen einschließend, um das exprimierte Fremdprotein selektiv abzuernten. (6) alle in (8) genannten translatierten und nicht-translatierten molekularen Funktionselemente in einem Konstrukt vereint (SEQ ID NOs: 39, 40). (9) Minimalinker zur für den Transport zur Zelloberfläche (SEQ ID NOs: 41 , 42). Fig. 3: Lokalisierung von Fusionsproteinen auf der Oberfläche von HEK293T-Zellen mittels cLSM.
(A)HEK293T-Zellen wurden mit den jeweiligen Vektoren kotransfiziert. Der Vektor pCMV-CD63-YFP diente bei den Lokalisationsstudien als Kontrolle für das exprimierte wildtypische CD63-YFP Protein. Für alle Proteine, die die tANCHOR-Technologie (CD63ALEL, Fig. 2B) enthielten, konnte eine prädominante Lokalisierung auf der Zelloberfläche durch das fusionierte Reporterprotein mCherry detektiert werden. Das mCherry-Protein ohne tANCHOR-Fusion ist cytoplasmatisch, gleichmäßig verteilt. Es zeigt keine Prädominanz auf der Zelloberfläche. Zusätzlich können weitere Proteine wie z.B. das Glykoprotein gp41 von HIV- mit und ohne Transmembrandomäne (gp41ATM) auf der Oberfläche präsentiert werden. (B) Die Proteinfaltung wurde durch CFP und YFP Lokalisation auf der Oberfläche überprüft. Beide Fluoreszenzproteine können nach Anregung durch den Dioden/Argon-Laser bei 405 nm (CFP) bzw. 514 nm (YFP) eines für das Fluorophor spezifischen Emissionswellenlänge detektiert werden. (C) Das exprimierte Protein mCherry, welches normalerweise verteilt im Cytosol vorkommt, wird durch das tANCHOR-System in die Plasmamembran mit hoher Effizienz geleitet. Das mCherry mit implementierter tANCHOR-Technologie wird dadurch sogar in den Filopodien (weißer Pfeil) der HEK293T-Zellen wie beim wildtypischen CD63-YFP detektierbar. Länge der Maßstabsbalken beträgt in den Fig. en 3A,3B = 10 μιη bzw. bei der Fig. 3C = 1 pm.
Fig. 4: Schematische Darstellung der extrazellulären Orientierungsüberprüfung der Epitope
Die Detektion der Epitoporientierung wurde mittels Rasterelekronenmikoskopie (REM) auf der Oberfläche von transfizierten HEK293T durchgeführt. Die Proteine wurden mittels Primärantikörper gebunden und mittels konjugierter Sekundärantikörper mit Goldpartikel (10 nm) visualisiert. Bei den Modellepitopen YFP, CFP, gp41 und gp41ATM konnten gebundene Antikörper auf der Oberfläche durch Immunogold- Partikel visualisiert werden (Fig. 5). Fig. SA-D: REM Aufnahme von Gold-Partikeln (10 nm) auf der Oberfläche von HEK293T-Zellen.
Die transfizierten HEK293T-Zellen wurden jeweils auf Epitoporientierung hin untersucht. Hierbei wurden die jeweiligen Epitope mit spezifischen Primärantikörpern gebunden und diese dann mit Gold-konjugierten Sekundärantikörpern nachgewiesen. Für alle Epitope mit der tANCHOR- Technologie konnte den Epitopen eine extrazelluläre Orientierung zugeschrieben werden. Länge der Maßstabsbalken beträgt in allen Figuren 300 nm.
Fig. 6: Western-Blot-Analyse von transfizierten HEK293T-Zellen mit generierten tANCHOR-Vektoren.
Die transfizierten HEK293T-Zellen wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Die exprimierten Proteine in den aufgetrennten Zelllysaten wurden mittels Primärantikörper gerichtet gegen das C-terminale Reporterprotein mCherry und gegen das N-terminale Epitop FLAG nachgewiesen. Die Tansfektion mit dem Vektor pmCherry-N1 zeigt keine Bande bei der Inkubation mit anti-FLAG Antikörper, da dieser Vektor keine Sequenz für das FLAG-Epitop enthält und dient als eine Kontrolle für den spezifischen Nachweis der exprimierten Proteine.
Fig. 7: Schematische Darstellung der Konstrukte zur Überprüfung weiterer Tetraspanine auf Proteintransport mit interner Fusionsstelle mit V5-6xHis-Linker.
Zur Überprüfung der Gültigkeit des Proteintransport unabhängig der großen extrazellulären Schleife innerhalb der Tatraspanin-Superfamilie wurden Expressionsvektoren generiert, die eine interne Fusion V5-6xHis zwischen der 3. und 4. Transmembrandomäne gemäß der tAN C H O R- P rototy p- Konstrukte basierend auf CD63ALEL beinhalten. Die interne Fusion V5- 6xHis beinhaltet den Linker zwischen EcoR\ und EcoRV (SEQ ID NOs: 35, 36). N-terminal ist eine FLAG-Fusion integriert, C-terminal sind die Fluoreszenzproteine YFP bei wildtypische Tetraspanin-Konstrukten bzw. mCherry bei ÄLEL-V5-6xHis-Konstrukten als Reporterproteine fusioniert. Fig. 8: Lokalisation von Fusionsproteinen auf der Oberfläche von
HEK293T-Zellen wurden mit den generierten Vektoren (A) pCMV-CD9- YFP/pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry, (B) pCMV-CD81 -YFP/pCMV- CD81ALEL-V5-6xHis-mCherry, (C) pCMV-CD82-YFP/pCMV-CD82ALEL-V5- 6xHis-mCherry und (D) pCMV-CD151 -YFP/ pCMV-CD151 ALEL-V5-6xHis- mCherry kotransfiziert. Alle exprimierten Proteine können mittels Fluoreszenz des Reporterproteins mCherry dominant auf der Zelloberfläche detektiert werden. Das Konstrukt, welches die interne Fusion mit dem Linker V5-6xHis zwischen der 3. und 4. Transmembrandomäne (Fig. 7) der Tetraspanine CD9, CD81 , CD82 und CD151 beinhalten, kolokalisieren mit den entsprechenden exprimierten wildtypischen Tetraspaninen mit der Fusion des Fluoreszenzproteins YFP. Länge der Maßstabsbalken beträgt in allen Abbildungen 10 pm.
Fig. 9: Anwendung von des tANCHOR-Systems zur Detektion von Antikörpern
(A) Ergebnisse der ELISA-Experimente53 mittels tANCHOR-System im 96- Well-Format. Das V5-Epitop auf der Zelloberfläche von HEK293T-Zellen wurde mit HRP-konjugierten anti-V5 Antikörpern detektiert. Die Proteinexpression der tANCHOR-Proteine kann konzentrationsabhängig und signifikant durch anti-V5-HRP Antikörper detektiert werden. (B) Schematische Abbildung der Linker 2F5-4E10 zwischen der 3. Und 4. Transmembrandomäne von CD63 (SEQ ID NOs: 37, 38). Die Linker wurden in den Vektor pCMV-CD63ALEL eingeführt. (C) Die HIV-1 neutralisierenden Antikörper anti-2F5 und anti-4E10 wurden bei einer konstanten DNA-Menge von 0,6 pg per Well transfizierten HeLa-Zellen primer an das 2F5- bzw. 4E10-Epitop gebunden. Die gebundenen anti-2F5 bzw. anti-4E10 Antikörper konnten signifikant detektiert werden, (E) exprimierte Fusionsproteine CD63ALEL-V5-6xHis sowie CD63ALEL-2F5-4E10 konnten zu Kontrolle dominant auf der Oberfläche von HEK293T-Zellen lokalisiert werden. Die Länge der Maßstabsbalken beträgt in allen Abbildungen 10 pm. Fig. 10 Effizienzsteigerung durch Verwendung von serin- und argininarmen Linkern.
(A) Die verwendeten Linker sind auf DNA- und Aminosäure-Sequenz Ebene dargestellt. Die Analyse der subzellulären Lokalisation der Fusionsproteine mit zwei verschiedenen Linkern (SEQ ID NOs: 41 , 42 bzw. SEQ ID NOs: 43, 44) zeigt deutlich, dass die Verwendung von EcoR\/EcoR\/ flankierenden Restriktionsschnittstellen zu einer hohen Effizienz des Proteintransport zur Oberfläche der HEK293T-Zellen führt und das Fusionsprotein an den ausgebildeten Filopodien (weißer Pfeil) der Zellen detektierbar ist (B). Die Länge der Maßstabsbalken beträgt in allen Abbildungen 10 pm.
1. Generierung von CD63-basierten Modelvektoren zur Durchführung von Lokalisationsexperimenten
Die Generierung von CD63-basierten Modellvektoren basierte auf der Verwendung des Vektors pCMV-Tag2B (Stratagene). In diesen Vektor wurden mittels gängiger Klonierungstechniken die jeweiligen DNA- Sequenzen über Restriktionsschnittstellen eingebracht 39. Der Kontrollvektor pCMV-CD63-YFP bzw. als pCMV-CD63-YFP-FLAG bezeichnet 9 , der die Volllängensequenz von CD63 enthält (Aminosäuren 1 -238, GenBank accession no. KF998086) wurde verwendet, um über die Restriktionsschnittstellen Xho\ und Apa\ die DNA-Sequenz von dem verwendeten rot fluoreszierenden Reporterproteins mCherry mittels der Primer ΡΑ1-0 /ΡΑ1 -02 und dem Matrizen-Vektor pmCherry-N1 (Clontech) einzuführen. Die Teilsequenz mit den Transmembrandomänen TM1 -3 (Aminosäuren 1 -1 10 GenBank accession no. KF998086) wurde über die Restriktionsschnittstellen BamH\ und Pst\ mit Hilfe der Primer PA1 -03/PA1- 04 eingebracht und anschließend wurde die TM4 (Aminosäuren 201 -238, GenBank accession no. KF998086 ) über EcoRV und Hind\\\ mithilfe der Primer PA1 -05/PA1 -06 sowie dem Matrizen-Vektor pPR3-N-CD63 49 in den Vektor pCMV-Tag2B eingebracht. Der resultierende Vektor enthält die CD63 Gensequenz ohne LEL (pCMV-CD63ALEL) (Fig. 2B). Zur vereinfachten Detektion der Proteine wurde über die Restriktionsschnittstellen Xho\ und Apa\ das restringierte mCherry-DNA- Fragment vom Vektor pCMV-CD63-mCherry in den restringierten Vektor pCMV-CD63ALEL ligiert. Die Vektoren pCMV-CD63ALEL-CFP und pCMV- CD63ÄLEL-YFP wurden über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und EcoRV mit Hilfe der Primer PA1 -07/PA1 -08 sowie dem Matrizen-Vektor pSCFP3A-C1 bzw. pSYFP2-C1 50, generiert. In gleicher Weise wurden die Vektoren pCMV-gp41ATM und pCMV-gp41 mit Hilfe der Primer PA1 - 09/PA1 -010 bzw. PA1 -09/PA1 -1 1 und des Matrizen-Vektors pNL4-351, welcher die Gensequenz des gp41 -Proteins von HIV-1 enthält, generiert.
2. Transfektion und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (cLSM)
Zur Überprüfung der Lokalisation exprimierter Fusionsproteine wurden die in Beispiel 1 generierten Plasmide in HEK293T-Zellen mittels Transfektionsreagenz transfiziert. Hierbei wurden HEK293T (human embryonic kidney cells 293T) Zellen in ibiTreat 8-Wells ausgesät und in Dulbecco's modified Eagle's Medium, komplementiert mit 10% fötalem Kälber Serum, L-Glutamin und Pen ici 11 i n/Streptomycin , kultiviert. Bei einer ca. 50%igen Konfluenz wurden die Zellen mittels Metafectene®PRO (Biontex) mit den generierten Plasmiden nach Herstelleranweisung transfiziert. Nach 24 h wurde die transfizierten Zellen in 2% Paraformaldehyd in PBS fixiert, in PBS zweimalig gewaschen und in 90%igem Glycerin in PBS mit 0,1 % p-Phenylenediamin und DAPI (4',6- Diamidin-2-phenylindol) zur Visualisierung des Nukleus aufgenommen. Die transfizierten Zellen wurden mit einem inversen, konfokalen Lasermikroskop LSM 780 (Carl Zeiss) auf subzelluläre Lokalisation hin untersucht (Fig. 3A- 3C). Die Einstellungen der Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden mittels Smart-Setup-Option der LSM 780 Software ZEN 2010 für die Fluoreszenzproteine CFP, YFP und mCherry gewählt. 3. Orientierungsanalyse der Epitope auf der Oberfläche von HEK293T- Zellen mittels Rasterelektronenmikroskopie
Die exprimierten Proteine wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie von Gold-immunmarkierten Proteinen auf der Plasmamembran von HEK293T- Zellen nachgewiesen (Fig. 4). Hierzu wurden die transfizierten und in 2% Paraformaldehyd in PBS fixierten Zellen dreimalig in PBS gewaschen und mit 0,5% BSA/0, 1 % Gelatine in PBS geblockt. Die Proteine CD63ALEL-CFP und CD63ÄLEL-YFP wurden mit Kaninchen anti-GFP (ab6556, Abcam) inkubiert, gewaschen und die Primärantikörper mit Ziege anti-Kaninchen mit konjugierten 10 nm Gold-Partikel detektiert. Der Immunmarkierung schloss sich eine Nachfixierung mit Glutaraldehyd (2,5% in HEPES 0,05M) an. Es folgte die Rasterpräparation. Dazu wurden die Proben in Ethanolstufen (30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 96 %) für jeweils 15 min schrittweise entwässert und in absoluten Ethanol für 30 min belassen, in HMDS (Hexamethyldisilazan) überführt, aus HMDS getrocknet und die Probenoberfläche mit Kohle bedampft. Die Goldpartikel wurden mit dem Leo 1530 Gemini Elektronenrastermikroskop mittels Rückstreudetektor (Centaurus) visualisiert. In gleicher Weise wurde das gp41 -Protein mittels Human anti-2F5 Antikörpers (National Institutes of Health, NIH) sowie unter Verwendung des Antikörpers Ziege anti-Human mit konjugierten IgG H&L 10 nm Gold-Partikel (BBInternational) detektiert (Fig. 5A-5D).
4. Western Blot-Analyse exprimierter Fluoreszenzproteine
Zur Überprüfung der Proteinexpression wurden Zelllysate transfizierter HEK293T-Zellen einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Hierbei wurden HEK293T-Zellen mit den Vektoren nach Herstelleranweisung im 6-Well- Format mit METAFECTENE®PRO transfiziert. Nach 48 h wurde das Medium vollständig entfernt und in jedes 6-Well 100 μΙ Laemmli-Probenpuffer 2x sowie 25 U einer Endonuklease aus Serratia marcescens (Benzonase®) zugegeben. Die Zellen wurden lysiert und nach etwa 10 min zu den Proben 5 μΙ ß-Mercaptoethanol zugegeben und bei 95 °C für 5 min denaturiert. Diese Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF- Membran transferiert und mit Maus anti-mCherry (ab125096, Abcam) bzw. Ziege anti-FLAG (NB600-344, NovusBio) Antikörpern sowie HRP- konjugierten anti-Maus/anti-Ziege Antikörpern (Dako) und die gebundenen HRP-konjugierte Antikörper mittels Pierce ECL-Western-Blot-Substrat (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen. Die PVDF-Membran wurde mit Roti®-Free Stripping Buffer 2.2 plus (Carl Roth) behandelt um dieselben Proteine mit einem weiteren primären Antikörper detektieren zu können (Fig. 6).
5. Überprüfung der subzellulären Lokalisation Tetraspanin-basierter Hybridproteine aus der Tetraspanin-Superfamilie
Zur Überprüfung der Peptidpräsentation auf der Zelloberfläche innerhalb der Tetraspanin-Superfamilie wurden Expressionsvektoren gemäß der schematischen Abbildung (Fig. 7) mittels Gensynthese54 (ATG:Biosynthetics) sowie standardisierten Klonierungsmethoden generiert. Die Gensequenzen von CD9 (SEQ ID NO: 19), CD81 (SEQ ID NO: 21 ), CD82 (SEQ ID NO: 23) und CD151 (SEQ ID NO: 25) wurden in den Vektor pCMV-CD63-YFP bzw. die Gensequenzen für CD9ALEL-V5-6xHis (SEQ ID NO: 27), CD81ALEL- V5-6xHis (SEQ ID NO: 29), CD82ALEL-V5-6xHis (SEQ ID NO: 31 ) und CD151ALEL-V5-6xHis (SEQ ID NO: 33) in den Vektor pCMV-CD63-mCherry (siehe 1 : Generierung von CD63-basierten Modell Vektoren zur Durchführung von Lokalisationsexperimenten) über die Restriktionsschnittstellen Notl/Xhol gegen die Tetraspaninsequenz von CD63 ausgetauscht und die folgenden Expressionsvektoren wildtypischer Gensequenz pCMV-CD9-YFP, pCMV- CD81 -YFP, pCMV-CD82-YFP, pCMV-CD151 -YFP sowie Deletionsmutanten der großen extrazellulären Schleife (ALEL) mit dem internen Linker V5-6xHis pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry, pCMV-CD81 ALEL-V5-6xHis-mCherry, pCMV-CD82ALEL-V5-6xHis-mCherry und pCMV-CD151ALEL-V5-6xHis- mCherry wie im Absatz 2 Transfektion und konfokale Laser-Scanning- mikroskopie (cLSM) beschrieben, transfiziert und mittels cLSM auf subzelluläre Lokalisation hin untersucht (Fig. 8).
6. Anwendung des tANCHOR-Systems zur Detektion von Antikörpern mittels ELISA-Verfahrens53
Die hocheffiziente Oberflächenexpression von Fusionsproteinen mittels tANCHOR-Systems eignet sich zur Detektion von gebundenen Antikörpern an präsentierten Peptiden. Als Modell wurde der Linker V5-6xHis über EcoRI und EcoRV aus dem Konstrukt pCMV-CD9ALEL-V5-6xHis-mCherry isoliert und in den Vektor pCMV-CD63ALEL-mCherry über Standard Klonierungsmethoden wie im Abschnitt 1 Generierung von CD63-basierten Modellvektoren zur Durchführung von Lokalisationsexperimenten beschrieben, eingefügt. Ebenfalls wurden die Epitope 2F5 und 4E10 (HIV-1 ) in den Vektor pCMV-CD63ALEL-mCherry mittels der Primer PA1-12/PA1 -13 und den Matrizen Vektor pNL4-3 eingeführt (Fig. 9B). Zur Detektion von gebundenen Antikörpern auf der Oberfläche von (Fig. 9A) HEK293T wurden hierfür HEK293T-Zellen bzw. (Fig. 9C) HeLa-Zellen im 96-well-Format ausgesät mit den Plasmide pCMV-CD63ALEL-V5-6xHis-mCherry (Fig. 9A) bzw. pCMV-CD63ALEL-2F5-4E10-mCherry (Fig. 9C) mittels
Metafectene®PRO nach Herstelleranweisung transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 h mit 4% Paraformaldehyd (Carl Roth) für 20 min fixiert, 2 mal mit PBS gewaschen und über Nacht mit einer Lösung aus 3% Bovines Serumalbumin Grade V (Carl Roth) und 2% Hühnerei-Albumin (Carl Roth) geblockt. Danach wurden die Zellen 1 x mit PBS gewaschen und mit verdünnten Antikörper (Fig. 9A) anti-V5-HRP (Invitrogen) bzw. (Fig. 9C) Human anti-2F5/Human anti-4E10 (NIH) in einer Verdünnung von 1 :3000 für 1 h inkubiert. Bei der Figur 9C wurden die primären Antikörper mittels Hase anti-Human-HRP (DAKO) in einer Verdünnung von 1 : 1000 gebunden und beide ELISA-Varianten mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin als ELISA- Substrat (TMB-Substrat Kit, Thermo Fisher Scientific) nach Herstelleranweisung verwendet und die OD-Werte bei 450 nm mit dem Spektralphotometer Multiscan™GO mit 96-Well-Platteneinsatz (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Die Expression der Fusionsproteine wurde mittels cLSM wie im Abschnitt 1 Generierung von CD63-basierten Modellvektoren zur Durchführung von Lokalisationsexperimenten detektiert. 7. Effizienzsteigerung des Proteintransports zur Oberfläche von humanen Zellen durch Verwendung von flankierenden EcoR\IEcoRV- Restriktionsschnittstellen beim tANCHOR-System
Der Einsatz von flankierenden Ecof?l/EcoRV-Restriktionsschnittstellen beim tANCHOR-System erhöht die Transporteffizienz zur Zelloberfläche. Das Einbringen von weiteren Restriktionsschnittstellen in den Minimallinker (L Q E F D I G G G G) führt zur Translation von Serin und Arginin im Linker (G S S G R R S L Q G G G G) zwischen der 3. und 4. Transmembrandomäne von CD63 (Fig. 10A). Die Vektoren mit weiteren Schnittstellen wurde durch Gensynthese54 (ATG:Biosynthetics) erzeugt und in HEK293T-Zellen wie bereits im Abschnitt 2 Transfektion und konfokale Laser-Scanning- mikroskopie (cLSM) beschrieben, zur Expression gebracht und auf subzelluläre Lokalisation hin untersucht (Fig. 10B).
Sequenzprotokoll
SEQ ID NO: 1: DNA-Sequenz von pA4E211 (CD63ALEL)
SEQ ID NO: 2: DNA-Sequenz von CD63ALEL
SEQ ID NO: 3: Proteinsequenz von CD63ALEL
SEQ ID NO: 4: Primer PA1-01
SEQ ID NO: 5: Primer PA-02
SEQ ID NO: 6: Primer PA1-03
SEQ ID NO: 7: Primer PA1-04
SEQ ID NO: 8: Primer PA1-05
SEQ ID NO: 9: Primer PA1-06
SEQ ID NO: 10: Primer PA1-07
SEQ ID NO: 11: Primer PA1-08
SEQ ID NO: 12: Primer PA1-09
SEQ ID NO: 13: Primer PA1-10
SEQ ID NO: 14: Primer PA1-11
SEQ ID NO: 15: Primer PA1-12
SEQ ID NO: 16: Primer PA1-13 SEQ ID NO: 17: CD63, Genbank Accsession No. KF998086 SEQ IN NO: 18: Proteinsequenz von CD63
SEQ ID NO: 19: DNA-Sequenz von CD9 (Genbank Accession No. NM_001769.3)
SEQ ID NO: 20: Proteinsequenz von CD9
SEQ ID NO: 21 : DNA-Sequenz von CD81 (Genbank Accession No.
NM_004356.3)
SEQ ID NO: 22: Proteinsequenz von CD81
SEQ ID NO: 23: DNA-Sequenz von CD82 (Genbank Accession No. NM_002231 .3)
SEQ ID NO: 24: Proteinsequenz von CD82
SEQ ID NO: 25: DNA-Sequenz von CD151 (Genbank Accession No. BT007397.1 )
SEQ ID NO: 26: Proteinsequenz von CD151 SEQ ID NO: 27: DNA-Sequenz von CD9ÄLEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 28: Proteinsequenz von CD9ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 29: DNA-Sequenz von CD81 ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 30: Proteinsequenz von CD81ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 31 : DNA-Sequenz von CD82ALEL-V5-6xHis SEQ ID NO: 32: Proteinsequenz von CD82ALEL-V5-6xHis
SEQ ID NO: 33: DNA-Sequenz von CD151ALEL-V5-6xHis
SEQ ID NO: 34: Proteinsequenz von CD151ALEL-V5-6xHis
SEQ ID NO: 35: DNA-Sequenz des V5-6xHis-Linkers
SEQ ID NO: 36: Proteinsequenz des V5-6xHis-Linkers
SEQ ID NO: 37: DNA-Sequenz des 2F5-4E10-Linkers
SEQ ID NO: 38: Proteinsequenz des 2F5-4E10-Linkers
SEQ ID NO: 39: DNA-Sequenz der Linkerversion (8)
SEQ ID NO: 40: Proteinsequenz der Linkerversion (8)
SEQ ID NO: 41 : DNA-Sequenz des Linkers im Vektor pCMV-CD63ALEL- mCherry (Minimallinker (9))
SEQ ID NO: 42: Proteinsequenz des Linkers im Vektor pCMV-CD63ALEL- mCherry (Minimallinker (9))
SEQ ID NO: 43: DNA-Sequenz des Linkers im Vektor pCMV-CD63ALEL-V2- mCherry
SEQ ID NO: 44: Proteinsequenz des Linkers im Vektor pCMV-CD63ALEL- V2-mCherry
SEQ ID NO: 45: DNA-Sequenz des Linkers zwischen CD63ALEL und dem Fluoreszenzprotein SEQ ID NO: 46: Protein-Sequenz des Linkers zwischen CD63ALEL und dem Fluoreszenzprotein
Im Folgenden werden bevorzugte Aspekte der Erfindung zusammengefasst:
1. Verfahren zur Verwendung von Proteinen/Peptiden mit beabsichtigter artifizieller Aminosäureabfolgen, die mittelbar, mindestens teilweise von Matrizenmolekülen kodiert, oder vollständig synthetisch sind, die a. mindestens teilweise aus den Sequenzabfolgen von Mitgliedern der Proteinklassen der Tetraspanine, wie exemplarisch die humanen Gene CD63, CD9, CD82, CD81 , CD151 , CD53 b. aber auch mindestens teilweise aus sequenz- homologen, Tetraspaninen von anderen Organismen bestehen können und c. nach a. und b., deren Fusionsprodukte Moleküle erzeugen, die in der Lage sind, die mit ihnen verbundenen natürlichen oder artifiziellen Peptid- bzw. Proteineinheiten in geeigneten Systemen i. zu einer oder mehreren Oberflächen hin zu dirigieren, diese ii. über die Oberflächen hinweg zu transportieren, und diese iii. in den Oberflächen fest zu verankern
iv. diese auf den Oberflächen dauerhaft zu präsentieren . Chimäre Proteinmoleküle mit natürlicher und/oder artifizieller Aminosäurezusammensetzung nach 1., die mittelbar dazu dienen Proteineinheiten zu generieren, die
a. auf Oberflächen modifiziert, z.B. glykosyliert sind oder/und b. auf Oberflächen eine funktionale Konformation einnehmen können. . Moleküle nach 1 . und 2., die mittelbar über kodierende Matrizen erzeugt werden und die aus der Fusion von mindestens Teileinheiten mindestens einer der kodierenden Matrizen hervorgehen und die aus einer Kombination von verschiedenen Sequenzen
a. in vivo
b. in vitro
erzeugt und ggfls. angereichert und isoliert ggfls. auch währenddessen prozessiert werden können. Moleküle nach 1., 2. und 3., die kodierende Nukleinsäuremoleküle darstellen die diese erfindungsgemäß in vivo und in vitro
i. In vivo rekombinant, intra-genomisch, (TN7-System) oder ii. In vivo mittels extra-chromosomaler genetischer Elemente (Vektoren) oder
iii. In vivo mittels natürlichen oder nicht-natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekülen (RNA etc.) mittels zirkulären oder linearen Nukleinsäuremolekülen oder
iv. In vitro in gekoppelten Transkriptions- bzw. Translationssystemen v. In vivo unter dem Einbau von artifiziellen Aminosäuren exprimieren. Oberflächen für die Verankerung von Molekülen nach 1. bis 3. die natürlich vorkommende Zellmembranen natürlicher Zellen oder artifizielle Membransysteme darstellen. Moleküle nach 1. bis 4., die, deren Genprodukte, transfizierte Zellen oder Teile von Zellen dazu dienen in Bioassays strukturelle, bioanalytische und (Veterinär-) diagnostische Fragestellungen in Bezug zu spezifischer Bindung von verschiedenen Molekülspezies (kleine Moleküle (Wirkstoffbibliotheken, Naturstoffe), RNAs, Proteine und DNA) und/ oder Katalyse zu lösen und auf den Ergebnissen Bioanalysesysteme (Bioassay), Diagnostika gegebenenfalls therapiebegleitend und oder Therapien aufzubauen. Moleküle nach 1 . bis 4., die, deren Genprodukte, transfizierte Zellen oder Teile von Zellen dazu dienen Fragestellungen im Bereich der Immunoanalytik und Immunodiagnostik zu lösen, immunanalytische und diagnostischen Fragestellungen zu lösen und gegebenenfalls darauf Therapien aufzubauen. 8. Moleküle nach 1. bis 4., die, deren Genprodukte, transfizierte Zellen oder Teile von Zellen dazu dienen analytische high-throughput Systeme zu entwickeln oder diese zu betreiben. 9. Moleküle nach 1. bis 4., die, deren Genprodukte, transfizierte Zellen oder Teile von Zellen direkt oder indirekt dazu dienen Immunotherapeutika zu entwickeln, die direkt eingesetzt zu werden (polyklonale oder monoklonale Antikörper oder artifizielle Moleküle mit ähnlichen Nutzungsmöglichkeiten).
10. Moleküle nach 1 . bis 3., die, deren Genprodukte, transfizierte Zellen oder Teile von Zellen in großen Mengen aus der Fermentation/Bioproduktion zur Nutzung und zum Gebrauch Dritten bereitgestellt werden.
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Claims

Ansprüche
1 . Fusionsprotein, umfassend eine erste Domäne (i), eine zweite Domäne (ii) und eine dritte Domäne (iii), wobei die zweite Domäne zwischen der ersten und der dritten Domäne angeordnet ist, wobei
(i) eine Teilsequenz eines Tetraspanins, welche die Transmembrandomäne 1 (TM1 ), die kleine extrazelluläre Schleife (SEL), die Transmembrandomäne 2 (TM2), die kleine intrazelluläre Schleife (SIL) und die Transmembrandomäne 3 (TM3) einschließt, oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge umfasst,
(ii) ein Peptid mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz umfasst, die zu der großen extrazellulären Schleife (LEL) eines Tetraspanins eine Sequenzidentität von weniger als 70% über die gesamte Länge aufweist und
(iii) eine Teilsequenz eines Tetraspanins umfasst, welche die Transmembrandomäne 4 (TM4) oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70 % über die gesamte Länge umfasst.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1 , wobei zwischen der ersten und der zweiten Domäne und/oder zwischen der zweiten und der dritten Domäne flexible Linker angeordnet sind.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zweite Domäne (ii) weiterhin ein oder mehrere Teilsequenzen der LEL eines Tetraspanins oder dazu homologe Sequenzen mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge umfasst, welche C- und/oder N-terminal zu dem Peptid mit der vorbestimmten Aminosäuresequenz angeordnet sind.
4. Fusionsprotein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die zweite Domäne (ii) weiterhin eine oder mehrere Proteaseerkennungssequenzen umfasst, welche C- und/oder N- terminal zu dem Peptid mit der vorbestimmten Aminosäuresequenz angeordnet sind.
5. Fusionsprotein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid ausgewählt ist aus einem Epitop, einem Protein, einem Antigen, oder einem Enzym.
6. Fusionsprotein nach einem der vorherigen Ansprüche, weiterhin umfassend eine vierte Domäne (iv) am N-Terminus des Fusionsproteins und/oder eine fünfte Domäne (v) am C-Terminus des Fusionsproteins.
7. Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei die vierte und/oder fünfte Domäne einen Tag, beispielsweise einen Affinitätstag oder fluoreszierenden Tag umfasst.
8. Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-7 kodiert.
9. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
10. Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder einen Vektor nach Anspruch 9.
1 1 . Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle, bevorzugt eine Säugerzelle wie z.B. eine humane Zelle ist.
12. Zelle nach Anspruch 10 oder 1 1 , welche weiterhin mit mindestens einem weiteren Nukleinsäuremolekül oder mindestens einem weiteren Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde.
13. Membranzubereitung, die aus einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 -12 erhalten wurde.
14. Synthetisches Membransystem, umfassend eine Membran und ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 -7, ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder einen Vektor nach Anspruch 9.
15. Verfahren zur Präsentation eines Peptids mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz auf der Oberfläche einer Zelle, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Zelle nach einem der Ansprüche 10-12,
(b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, bei denen das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert wird.
16. Verfahren zur Verankerung eines Peptids mit einer vorbestimmten Aminosäuresequenz an einer Membran, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Membran, und
(b) Inkontaktbringen der Membran mit einem Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 unter Bedingungen, bei denen eine Verankerung des Fusionsproteins in der Membran erfolgt, oder Inkontaktbringen der Membran mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder einem Vektor nach Anspruch 9, unter Bedingungen bei denen das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimiert und in der Membran verankert wird.
17. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12, einer Membranzubereitung nach Anspruch 13 oder eines synthetischen Membransystems nach Anspruch 14 in einem Verfahren zum Screening nach Interaktionspartnern des Peptids,
zur Untersuchung von Wechselwirkungen des Peptids mit Interaktionspartnern
in einem Verfahren zur Herstellung des Peptids
als Immunisierungsreagenz in einem Verfahren zur
Antikörperherstellung oder
als Nachweisreagenz.
18. Zelle nach einem der Ansprüche 10 bis 12, Membranzubereitung nach Anspruch 13 oder synthetisches Membransystems nach Anspruch 14, zur Verwendung als Vakzin oder als Medikament.
19. Nukleinsäuremolekül, umfassend einen ersten Sequenzabschnitt (i), einen zweiten Sequenzabschnitt (ii) und einen dritten Sequenzabschnitt (iii), wobei der zweite Sequenzabschnitt zwischen dem ersten und dem dritten Sequenzabschnitt angeordnet ist, wobei
(i) für eine Teilsequenz eines Tetraspanins, welche die Transmembrandomäne 1 (TM1 ), die kleine extrazelluläre Schleife (SEL), die Transmembrandomäne 2 (TM2), die kleine intrazelluläre Schleife (SIL) und die Transmembrandomäne 3 (TM3) einschließt, oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70% über die gesamte Länge, kodiert,
(ii) eine Multiple Cloning Site umfasst und
(iii) für eine Teilsequenz eines Tetraspanins kodiert, welche die Transmembrandomäne 4 (TM4) oder eine dazu homologe Sequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 70 % über die gesamte Länge umfasst.
20. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 19, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz. Kit, umfassend
(i) ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder19 oder einen Vektor nach Anspruch 9 oder 20 und
(ii) eine Zelle oder Membran.
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