JP2018508237A - 細胞表面上にペプチドを提示するためのシステム - Google Patents
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Abstract
Description
(i)は膜貫通ドメイン1(TM1)、小型細胞外ループ(SEL)、膜貫通ドメイン2(TM2)、小型細胞内ループ(SIL)および膜貫通ドメイン3(TM3)を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列を含み、
(ii)はテトラスパニンの大型細胞外ループ(LEL)に関して全長にわたって70%未満の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、
(iii)は膜貫通ドメイン4(TM4)を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列を含む、
融合タンパク質である。
(i)は膜貫通ドメイン1(TM1)、小型細胞外ループ(SEL)、膜貫通ドメイン2(TM2)、小型細胞内ループ(SIL)および膜貫通ドメイン3(TM3)を含むテトラスパニンの部分配列、または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードし、
(ii)はマルチクローニングサイトを含み、
(iii)は膜貫通ドメイン4(TM4)を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードする、
核酸分子に関する。
(a)上記の本発明による細胞を用意するステップと、
(b)本発明による融合タンパク質が発現する条件下で細胞を培養するステップと
を含む方法である。
(a)膜を用意するステップと、
(b)融合タンパク質の固定が膜で起こる条件下で、膜を上記の融合タンパク質と接触させる、または融合タンパク質が発現し、膜に固定される条件下で、膜を上記の核酸または上記のベクターと接触させるステップと
を含む方法に関する。
表面上の利用可能な固定タンパク質は、それぞれのタンパク質の表面上の特定の構造によってさらなるタンパク質との特異的接触を確立することができる。これらのさらなるタンパク質は、互いを認識することができる同種および異種タンパク質複合体のタンパク質構築ブロックであり、または抗体や単鎖などの特異的タンパク質でもあり得、これは特定のタンパク質表面構造に特異的におよび標的化された様式で結合することができる。他のタンパク質との特異的相互作用に入るゲノムでコードされた天然起源のタンパク質は多くの細胞機能−細胞核での機能から多様なサイトゾルおよび膜機能までを行う。これらの特異的および機能的タンパク質−タンパク質相互作用(PPI)は進化の過程で現れたものであり、重要な程度に細胞機能の完全性を担っている。標的化PPIは表面との特異的相互作用を有するタンパク質変異体の細胞過程および選択によって媒介される。免疫系は、生物の表面の変化に対する敏感な反応のために設計され、極めて短期間での抗体の表面相互作用および細胞傷害性の最適化において特殊化される。体液性免疫では、大量のエピトープ特異的ポリクローナル抗体が短時間で産生される。ラクダ科の特定の単鎖抗体(単鎖)および高度に特異的なタンパク質相互作用を発達する他の天然起源の免疫原性システムが知られるようになった。
構造的に無傷のタンパク質構造によって、細胞上に提示されたタンパク質により小分子によるPPI結合の結合とPPI結合からの変位の相互作用試験をさらに行うことが可能である。小分子の興味深い相互作用はPPIに干渉するものであり、そこでは一定のタンパク質凝集体が小分子の影響下で再度溶解することができるだろう。PPI分析は、小分子有効成分の発見および開発に特によく適している。
本発明の一実施形態によると、興味深い用途は、抗体を、tANCHORを用いて露出したエピトープとの結合について、一定のフォーマット、例えば標準化96ウェルフォーマットで試験するものである。例えば、本発明によるシステムによって、細胞を96ウェルフォーマットのマイクロタイタープレートに播種し、融合構築物を一過的にトランスフェクトされた状態で発現させる。これは融合タンパク質を発現する安定な細胞株でも可能である。
研究および開発において、ならびに大規模製造においても、特にタンパク質を機能的に折りたたまれた状態およびおそらくは修飾された形態で精製することを望む場合に、発現によって高い特異的活性を有する十分な量の標的タンパク質を獲得することは、依然として困難な課題である。このため、本発明によるシステムを使用することは有利である。培地中、細胞の外側の所望の標的タンパク質の局在は、細胞内のサイトゾルよりもはるかに複雑でない環境であるので、これは大いに有利となり得る。したがって、濃縮および単離することが容易である。通常、発現したタンパク質は細胞内に見出され、サイトゾルから精製される。
極めて特異的な標的細胞中でのみ発現を見出す分化特異的および/または種特異的プロモーター(獣医学分野を含む)と合わせて、tANCHORシステムは、効率的な膜輸送のために、生物のインタクトな細胞中でさえ異種遺伝子融合要素を発現することができる。これらは細胞内に外因的に運ばれ得る。DNAまたはRNA分子の接種のために、「遺伝子銃」または「粒子銃」として知られているものによって、テトラスパニン融合構築物を高速で細胞に直接発射し、打たれたトランスフェクト細胞が融合タンパク質を一過的に発現するように誘導することが可能である。これらのタンパク質は、その適合性について事前に試験された抗原または亜種抗原決定基、エピトープであり得る。tANCHOR技術を、この目的に適した診断生物検定の提供と治療的ワクチン接種の両方のために使用することができる。
さらに、理想的には、HLA不適合性基およびおそらくはそれに関連する有害な免疫応答のために、生体外抽出後、おそらくは中期培養期後または中にインビトロで、自己細胞にトランスフェクトさせることさえ可能である。tANCHORシステムに基づくDNA構築物による試験対象(例えば、ヒトであるが、動物も)の自己細胞のトランスフェクションによって、これらを自己または自家ワクチン接種に使用させることが可能になる。この点について、品質について試験したインタクトな自己細胞およびこのような細胞から単離した細胞膜の使用も可能である。これらは、例えば、密度勾配超遠心法により得ることができる。ここで、エピトープと全タンパク質の比を改善し、それによって、免疫応答の特異的活性の増加に寄与することができる。非特異的随伴応答および自己免疫応答が減らされる。
(i)上記の核酸分子またはベクターと、
(ii)細胞または膜と
を含むキットである。
(A)先行技術により、融合および挿入により種々の実用的な課題解決手法を果たすことができる位置。tANCHORシステムとも記載される本発明によるシステムは、4つの膜貫通ドメイン(4TM)からなる。エピトープまたはタンパク質をコードするDNA配列をTM3とTM4との間にクローニングすることができる。例として、エピトープFLAGタグをN末端上に実施し、例えば、蛍光タンパク質mCherryを、遺伝子融合によりtANCHORシステムでCD63のC末端上にトランスフェクション対照としてさらに実施した(図2も参照)。(B)開発されたtANCHORシステムにより、ヒト細胞によって発現されたエピトープまたは抗原が形質膜上に局在していることを明確に見出すことができる。tANCHORシステムは、高い効率で、融合タンパク質を形質膜に向け、そこでこれらのタンパク質を固定することができる。
第1の代表的なtANCHORベクター系は、モジュラーマルチ発現ベクターpA4E211(配列番号1)およびこのベクターの機能的誘導体をもとにする。CD63ΔLEL成分(図2B)およびFLAGエピトープのN末端融合体および例えば、mCherryまたはポンテリナ・プルマタ(Pontellina plumata)のGFPなどの蛍光レポータータンパク質のC末端融合の配列アレンジメントの概要をさらに表す。
野生型CD63タンパク質配列は238個のアミノ酸からなる。CD63ΔLELを作製するために、膜貫通ドメイン1〜3および4のコードDNA配列(下線を付した配列CD63 TM1〜3、CD63 TM4)を使用した。CD63のLEL(ΔLEL)の配列を含まないリンカーをフラグメントCD63 TM1〜3とCD63 TM4との間に置く(配列番号42)。さらに、リンカー中のGGGG構造モチーフを挿入する。アミノ酸配列KLIDTVDLEK(配列番号46)を有するリンカーについての遺伝子配列(配列番号45)を、遺伝子配列CD63ΔLELと蛍光タンパク質についての遺伝子配列との間に含めることができる。
制限部位EcoRI、EcoRV、HindIII、BamHIおよびPstIが標準的なクローニング法またはシームレスクローニングのためのクローニング法による複数の連続エピトープユニットの挿入に可能である。(1)配列1、本発明による制限部位のみであり、機能(R部位)EcoRIおよびEcoRVおよびn*N=スペーサー配列に関して試験した(2)配列(1)+His6−タグ、(3)配列(1)+CMycエピトープ、(4)配列(1)+His6−タグ+C−Myc(5)発現した外来タンパク質を選択的に収穫するために、中心クローニング部位を含む、TEVタンパク質分解部位。(6)構築物に合わせられた(8)で命名されている全ての翻訳および非翻訳分子機能的要素(配列番号39、40)。(9)細胞表面に輸送するための最小リンカーzur(配列番号41、42)。
(A)HEK293T細胞にそれぞれのベクターでコトランスフェクトした。局在化試験では、ベクターpCMV−CD63−YFPが発現した野生型CD63−YFPタンパク質についての対照とした。tANCHOR技術を含む全てのタンパク質(CD63ΔLEL、図2B)について、細胞表面上の顕著な局在を融合レポータータンパク質mCherryによって検出した。tANCHOR融合体を含まないmCherryタンパク質は細胞質内で、均等に分布している。これは細胞表面上への顕著性を示さない。さらに、例えば、膜貫通ドメイン(gp41ΔTM)を含むおよび含まないHIV−1の糖タンパク質gp41などのさらなるタンパク質が表面上に提示され得る。(B)タンパク質折りたたみを、表面上のCFPおよびYFP局在によってチェックした。発蛍光団に特異的な発光波長である405nm(CFP)または514nm(YFP)のダイオード/アルゴンレーザーによって励起した後、両蛍光タンパク質を検出することができる。(C)通常はサイトゾルに分散して生じる発現タンパク質mCherryが、tANCHORシステムによって極めて効率的に形質膜に向けられる。このようにして、実施したtANCHOR技術を含むmCherryが、野生型CD63−YFPの場合のように、HEK293T細胞の糸状仮足(白色矢印)中でさえ検出可能である。スケールバーの長さは、図3A及び3Bでは10μmであり、図3Cでは1μmである。
エピトープ配向の検出を、トランスフェクトされたHEK293Tの表面上で走査電子顕微鏡法(SEM)によって行った。タンパク質に一次抗体を結合し、金粒子(10nm)とのコンジュゲート二次抗体によって可視化した。モデルエピトープの場合、YFP、CFP、gp41およびgp41ΔTM結合抗体を免疫金粒子によって表面上で可視化することができた(図5)。
トランスフェクトされたHEK293T細胞を、それぞれエピトープ配向に関して調べた。このために、それぞれのエピトープに特異的一次抗体を結合し、次いで、これらを金コンジュゲート二次抗体で検出した。tANCHOR技術を含む全てのエピトープについて、細胞外配向を有するエピトープとし得た。全ての図面のスケールバーの長さは300nmである。
トランスフェクトされたHEK293T細胞をウエスタンブロット解析に供した。分離した細胞溶解物中の発現タンパク質を、C末端レポータータンパク質mCherryに対する一次抗体によって整列させ、N末端エピトープFLAGに対して検出した。ベクターpmCherry−N1によるトランスフェクションは、このベクターがFLAGエピトープについての配列を含まないために、抗FLAG抗体とのインキュベーションに関してバンドを示さず、発現タンパク質の特異的検出のための対照とする。
テトラスパニンスーパーファミリー内の大型細胞外ループと独立したタンパク質輸送の妥当性を調べるために、CD63ΔLELに基づくtANCHOR原型構築物による第3の膜貫通ドメインと第4の膜貫通ドメインとの間に内部融合V5−6xHisを含む発現ベクターを作製した。内部融合V56xHisはEcoRIとEcoRVとの間にリンカーを含む(配列番号35、36)。FLAG融合体をN末端で組み込み;C末端で、レポータータンパク質として、野生型テトラスパニン構築物の場合、蛍光タンパク質YFPを融合し、ΔLEL−V5−6xHis構築物の場合、mCherryを融合する。
HEK293T細胞を作製したベクター(A)pCMV−CD9−YFP/pCMV−CD9ΔLEL−V5−6xHis−mCherry、(B)pCMV−CD81−YFP/pCMV−CD81ΔLEL−V5−6xHis−mCherry、(C)pCMV−CD82−YFP/pCMV−CD82ΔLEL−V5−6xHis−mCherryおよび(D)pCMV−CD151−YFP/pCMV−CD151ΔLEL−V5−6xHis−mCherryによりコトランスフェクトした。全ての発現タンパク質を細胞表面上でレポータータンパク質mCherryの蛍光によって優位に検出することができる。テトラスパニンCD9、CD81、CD82およびCD151の第3の膜貫通ドメインと第4の膜貫通ドメインとの間にリンカーV5−6xHisとの内部融合体を含む構築物(図7)が蛍光タンパク質YFPの融合体を含む対応する発現野生型テトラスパニンと共存する。全ての図のスケールバーの長さは10μmである。
(A)96ウェルフォーマット中のtANCHORシステムによるELISA実験53の結果。HEK293T細胞の細胞表面上のV5エピトープをHRPコンジュゲート抗V5抗体で検出した。tANCHORタンパク質のタンパク質発現を抗V5−HRP抗体によって濃度依存的にかつ有意に検出することができる。(B)CD63の第3の膜貫通ドメインと第4の膜貫通ドメインとの間のリンカー2F5−4E10(配列番号37、38)の概略図。リンカーをベクターpCMV−CD63ΔLELに導入した。(C)HIV−1中和抗体抗2F5および抗4E10を、トランスフェクトされたHeLa細胞プライマー1ウェル当たり0.6μgの一定DNA量で2F5および4E10エピトープに結合させた。結合した抗2F5および抗4E10抗体を有意に検出することができた。(E)発現融合タンパク質CD63ΔLEL−V5−6xHisおよびCD63ΔLEL−2F5−4E10も対照に対してHEK293T細胞の表面上に顕著に局在化させることができた。全ての図のスケールバーの長さは10μmである。
CD63系モデルベクターの作製は、ベクターpCMV−Tag2B(Stratagene)の使用に基づいた。確立されたクローニング技術によって、それぞれのDNA配列を、制限部位を介してこのベクターに導入した39。CD63の全長配列(アミノ酸1〜238、GenBank受入番号KF998086)を含む、pCMV−CD63−YFP−FLAG49としても記載される対照ベクターpCMV−CD63−YFPを使用して、制限部位XhoIおよびApaIを介して、プライマーPA1−01/PA1−02および鋳型ベクターpmCherry−N1(Clonteeh)によって、使用した赤色蛍光レポータータンパク質、mCherryのDNA配列を導入した。膜貫通ドメインTM1〜3(アミノ酸1〜110 GenBank受入番号KF998086)を含む部分配列を、プライマーPA1−03/PA1−04を用いて制限部位BamHIおよびPstIを介して導入し、その後、TM4(アミノ酸201〜238、GenBank受入番号KF998086)を、プライマーPA1−05/PA1−06および鋳型ベクターpPR3−N−CD6349を用いてEcoRVおよびHindIIIを介してベクターpCMV−Tag2Bに導入した。得られたベクターはLELを含まないCD63遺伝子配列(pCMV−CD63ΔLEL)を含む(図2B)。
発現した融合タンパク質の局在を調べるために、実施例1で作製したプラスミドを、トランスフェクション試薬によってHEK293T細胞にトランスフェクトした。このために、HEK293T(ヒト胚腎臓細胞293T)細胞をibiTreat8ウェルに播種し、10%ウシ胎児血清、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約50%コンフルエンスで、細胞に、製造業者の指示にしたがって、作製したプラスミドをMetafectene(登録商標)PRO(Biontex)によってトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクトされた細胞をPBS中2%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中で2回洗浄し、0.1%p−フェニレンジアミンおよびDAPI(4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール)を含むPBS中90%グリセロールにマウントして核を可視化した。トランスフェクトされた細胞を、細胞内の局在に関して、逆共焦点レーザー顕微鏡LSM780(Carl Zeiss)で調べた(図3A〜図3C)。励起および発光波長の設定は、LSM780ソフトウェアZEN2010のSmart Setupオプションによって、蛍光タンパク質CFP、YFPおよびmCherry用に選択した。
発現したタンパク質を、HEK293T細胞の形質膜上の金で免疫標識されたタンパク質について走査電子顕微鏡法によって検出した(図4)。このために、トランスフェクトされ、PBS中2%パラホルムアルデヒドで固定された細胞をPBS中で3回洗浄し、PBS中0.5%BSA/0.1%ゼラチンでブロッキングした。タンパク質CD63ΔLEL−CFPおよびCD63ΔLEL−YFPを、ウサギ抗GFP(ab6556、Abcam)と共にインキュベートし、洗浄し、ヤギ抗ウサギにより一次抗体をコンジュゲート10nm金粒子で検出した。免疫標識に続いて、グルタルアルデヒド(HEPES0.05M中2.5%)で後固定した。これに続いて、スキャンの準備をした。このために、試料を、各場合で15分間、エタノール段階(30%、50%、70%、90%、96%)で段階的に乾燥させ、無水エタノール中で30分間静置し、HMDS(ヘキサメチルジシラザン)中に移し、HMDSで完全に乾燥させ、試料表面を蒸発カーボンでコーティングした。金粒子を、後方散乱検出器(Centaurus)によって、Leo1530 Gemini走査電子顕微鏡で可視化した。同様に、gp41タンパク質を、ヒト抗2F5抗体(国立衛生研究所、NIH)、さらにコンジュゲートIgG H&L 10nm金粒子を含む抗ヒトヤギ抗体(BBInternational)を使用して検出した(図5A〜図5D)。
タンパク質発現を調べるため、トランスフェクトされたHEK293T細胞の細胞溶解物をウエスタンブロット解析に供した。このために、ベクターでHEK293T細胞を、製造業者の指示にしたがって、METAFECTENE(登録商標)PROを用いて6ウェルフォーマット中で、トランスフェクトした。48時間後、培地を完全に除去し、100μlのLaemmli試料緩衝液2×および25Uのセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)由来のエンドヌクレアーゼ(Benzonase(登録商標))をそれぞれの6ウェルに加えた。細胞を溶解し、約10分後、β−メルカプトエタノール5μlを試料に添加し、95℃で5分間変性させた。これらの細胞溶解物をSDS−PAGEによって分離し、PVDF膜に移し、マウス抗mCherry(ab125096、Abcam)またはヤギ抗FLAG(NB600−344、NovusBio)抗体およびHRPコンジュゲート抗マウス/抗ヤギ抗体(Dako)で検出し、そして結合したHRPコンジュゲート抗体をPierce ECLウエスタンブロット基質(Thermo Fisher Scientific)によって検出した。PVDF膜をRoti(登録商標)−Free Stripping Buffer 2.2plus(Carl Roth)で処理したので、同タンパク質をさらなる一次抗体で検出することができた(図6)。
テトラスパニンスーパーファミリー内の細胞表面上のペプチドの提示を調べるために、遺伝子合成54(ATG:Biosynthetics)および標準化されたクローニング法によって、発現ベクターを概略図(図7)にしたがって作製した。CD9(配列番号19)、CD81(配列番号21)、CD82(配列番号23)およびCD151(配列番号25)の遺伝子配列を、ベクターpCMV−CD63−YFP中で置き換え、CD9ΔLEL−V5−6xHis(配列番号27)、CD81ΔLEL−V5−6xHis(配列番号29)、CD82ΔLEL−V5−6xHis(配列番号31)およびCD151ΔLEL−V5−6xHis(配列番号33)の遺伝子配列を、制限部位NotI/XhoIを介してCD63のテトラスパニン配列を含むベクターpCMV−CD63−mCherry(1:局在化実験を行うためのCD63系モデルベクターの作製を参照)中で置き換え、野生型遺伝子配列の以下の発現ベクターpCMV−CD9−YFP、pCMV−CD81−YFP、pCMV−CD82−YFP、pCMV−CD151−YFP、ならびに大型細胞外ループの欠失突然変異体(ΔLEL)を、第2節のトランスフェクションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法(cLSM)に記載されるように内部リンカーV5−6xHis−pCMV−CD9ΔLEL−V5−6xHis−mCherry、pCMV−CD81ΔLEL−V5−6xHis−mCherry、pCMV−CD82ΔLEL−V5−6xHis−mCherryおよびpCMV−CD151ΔLEL−V5−6xHis−mCherryを用いてトランスフェクトし、細胞内の局在に関してcLSMによって調べた(図8)。
tANCHORシステムによる融合タンパク質の極めて効率的な表面発現は、提示されたペプチド上の結合抗体の検出に適している。モデルとして、第1節の局在化実験を行うためのCD63系モデルベクターの作製に記載されるように、リンカーV5−6xHisを、EcoRIおよびEcoRVにより構築物pCMV−CD9ΔLEL−V5−6xHis−mCherryから単離し、標準的なクローニング法によりベクターpCMV−CD63ΔLEL−mCherryに挿入した。同様に、プライマーPA1−12/PA1−13および鋳型ベクターpNL4−3によって、エピトープ2F5および4E10(HIV−1)をベクターpCMV−CD63ΔLEL−mCherryに挿入した(図9B)。(図9A)HEK293Tの表面上の結合抗体を検出するために、HEK293T細胞および(図9C)HeLa細胞を96ウェルフォーマットに播種し、製造業者の指示にしたがって、Metafectene(登録商標)PROによって、プラスミドpCMV−CD63ΔLEL−V5−6xHis−mCherry(図9A)およびpCMV−CD63ΔLEL−2F5−4E10−mCherry(図9C)をトランスフェクトした。24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド(Carl Roth)で20分間固定し、PBSで2回洗浄し、3%ウシ血清アルブミン等級V(Carl Roth)および2%鶏卵アルブミン(Carl Roth)の溶液で一晩ブロッキングした。その後、細胞をPBSで1回洗浄し、1:3000希釈の希釈抗体(図9A)抗V5−HRP(Invitrogen)および(図9C)ヒト抗2F5/ヒト抗4E10(NIH)と共に1時間インキュベートした。図9Cの場合、一次抗体を1:1000希釈のノウサギ抗ヒトHRP(DAKO)によって結合させ、ELISA基質として3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB Substrate Kit、Thermo Fisher Scientific)を伴う改変ELISAを製造業者の指示にしたがっていずれも使用し、OD値を96ウェルプレートインサート(Thermo Fisher Scientific)にてMultiscan(商標)GO分光光度計を用いて450nmで測定した。第1節の局在化実験を行うためのCD63系モデルベクターの作製のように、cLSMによって融合タンパク質の発現を検出した。
tANCHORシステムにおける隣接EcoRI/EcoRV制限部位の使用により、細胞表面への輸送効率が増加する。最小リンカー(LQEFDIGGGG)へのさらなる制限部位の導入は、CD63の第3の膜貫通ドメインと第4の膜貫通ドメインとの間のリンカー中にセリンおよびアルギニンの翻訳(GSSGRRSLQGGGG)をもたらす(図10A)。第2節のトランスフェクションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法(cLSM)で既に記載されているように、さらなる部位を有するベクターを、遺伝子合成54(ATG:Biosynthetics)により作製し、HEK293T細胞中で発現させ、細胞内の局在に関して調べた(図10B)。
配列番号1:pA4E211(CD63ΔLEL)のDNA配列
配列番号2:CD63ΔLELのDNA配列
配列番号3:CD63ΔLELのタンパク質配列
配列番号4:プライマーPA1−01
配列番号5:プライマーPA−02
配列番号6:プライマーPA1−03
配列番号7:プライマーPA1−04
配列番号8:プライマーPA1−05
配列番号9:プライマーPA1−06
配列番号10:プライマーPA1−07
配列番号11:プライマーPA1−08
配列番号12:プライマーPA1−09
配列番号13:プライマーPA1−10
配列番号14:プライマーPA1−11
配列番号15:プライマーPA1−12
配列番号16:プライマーPA1−13
配列番号17:CD63、GenBank受入番号KF998086
配列番号18:CD63のタンパク質配列
配列番号19:CD9のDNA配列(GenBank受入番号NM_001769.3)
配列番号20:CD9のタンパク質配列
配列番号21:CD81のDNA配列(GenBank受入番号NM_004356.3)
配列番号22:CD81のタンパク質配列
配列番号23:CD82のDNA配列(GenBank受入番号NM_002231.3)
配列番号24:CD82のタンパク質配列
配列番号25:CD151のDNA配列(GenBank受入番号BT007397.1)
配列番号26:CD151のタンパク質配列
配列番号27:CD9ΔLEL−V5−6xHisのDNA配列
配列番号28:CD9ΔLEL−V5−6xHisのタンパク質配列
配列番号29:CD81ΔLEL−V5−6xHisのDNA配列
配列番号30:CD81ΔLEL−V5−6xHisのタンパク質配列
配列番号31:CD82ΔLEL−V5−6xHisのDNA配列
配列番号32:CD82ΔLEL−V5−6xHisのタンパク質配列
配列番号33:CD151ΔLEL−V5−6xHisのDNA配列
配列番号34:CD151ΔLEL−V5−6xHisのタンパク質配列
配列番号35:V5−6xHisリンカーのDNA配列
配列番号36:V5−6xHisリンカーのタンパク質配列
配列番号37:2F5−4E10リンカーのDNA配列
配列番号38:2F5−4E10リンカーのタンパク質配列
配列番号39:リンカーバージョン(8)のDNA配列
配列番号40:リンカーバージョン(8)のタンパク質配列
配列番号41:ベクターpCMV−CD63ΔLEL−mCherry中のリンカー(最小リンカー(9))のDNA配列
配列番号42:ベクターpCMV−CD63ΔLEL−mCherry中のリンカー(最小リンカー(9))のタンパク質配列
配列番号43:ベクターpCMV−CD63ΔLEL−V2−mCherry中のリンカーのDNA配列
配列番号44:ベクターpCMV−CD63ΔLEL−V2−mCherry中のリンカーのタンパク質配列
配列番号45:CD63ΔLELと蛍光タンパク質との間のリンカーのDNA配列
配列番号46:CD63ΔLELと蛍光タンパク質との間のリンカーのタンパク質配列
1.
a.少なくとも部分的に、例えば、ヒト遺伝子CD63、CD9、CD82、CD81、CD151、CD53などのテトラスパニンのタンパク質クラスのメンバーの配列からなることができるが、
b.少なくとも部分的に、他の生物の配列相同テトラスパニンからもなることができ、
c.a.およびb.によると、その融合産物が、適当なシステムで、これらと結合した天然または人工ペプチドおよびタンパク質ユニットを
i.1つまたは複数の表面に向け、
ii.表面上にこれらを輸送し、
iii.これらを表面に堅く固定し、
iv.これらを表面上に永続的に提示する
ことができる分子を作製する、
間接的に、少なくとも部分的に鋳型分子からコードされている、または完全に合成的である意図した人工アミノ酸配列を有するタンパク質/ペプチドを使用する方法。
2.
a.表面上で修飾される、例えばグリコシル化される、および/または
b.表面上で機能的コンフォメーションを採用することができる
タンパク質ユニットを産生するのに間接的に役立つ、1.に記載の天然および/または人工アミノ酸組成を有するキメラタンパク質分子。
3.
a.インビボで、
b.インビトロで、
コード鋳型を介して間接的に産生され、コード鋳型の少なくとも1つの少なくとも部分的なユニットの融合体から現れ、および種々の配列の組合せから、産生され、おそらく濃縮および単離され、おそらくその間に処理もされ得る、1.および2.に記載の分子。
4.
i.インビボで、組換え的に、ゲノム内で、(TN7系)または
ii.インビボで、染色体外遺伝要素(ベクター)によって、または
iii.インビボで、環状または直鎖状核酸分子によって天然または非天然起源の核酸分子(RNA等)によって、
あるいは
iv.インビトロで、共役転写または翻訳系で、
v.インビボで、人工アミノ酸の組込みによって、
本発明によりインビボおよびインビトロでコード核酸分子を発現するコード核酸分子を表す、1.、2.および3.に記載の分子。
5.天然細胞の天然起源の細胞膜または人工膜系を表す、1.から3.に記載の分子を固定するための表面。
7.免疫分析および免疫診断の分野の問題を解決するため、免疫分析および診断の問題を解決し、おそらくそれに対する治療を構築するために、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、1.から4.に記載の分子。
8.分析的ハイスループットシステムを開発するためまたはこれらを操作するために、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、1.から4.に記載の分子。
9.直接的に使用される免疫療法剤(同様の可能な用途を有するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または人工分子)を開発するために、直接的または間接的に、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、1.から4.に記載の分子。
10.使用および利用のために発酵/生物生産から大量に第三者に提供される、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、1.から3.に記載の分子。
Claims (21)
- 第1のドメイン(i)と、第2のドメイン(ii)と、第3のドメイン(iii)とを含む融合タンパク質であって、前記第2のドメインは前記第1のドメインと前記第3のドメインとの間に配置されており、
(i)は膜貫通ドメイン1(TM1)、小型細胞外ループ(SEL)、膜貫通ドメイン2(TM2)、小型細胞内ループ(SIL)および膜貫通ドメイン3(TM3)を含むテトラスパニンの部分配列、または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列を含み、
(ii)はテトラスパニンの大型細胞外ループ(LEL)に関して全長にわたって70%未満の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、
(iii)は膜貫通ドメイン4(TM4)を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列を含む、
融合タンパク質。 - 可撓性リンカーが前記第1のドメインと前記第2のドメインとの間および/または前記第2のドメインと前記第3のドメインとの間に配置されている、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のドメイン(ii)が、所定のアミノ酸配列を有するペプチドに対してC末端および/またはN末端で配置されている、テトラスパニンの前記LELの1つもしくは複数の部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列をさらに含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のドメイン(ii)が、所定のアミノ酸配列を有するペプチドに対してC末端および/またはN末端で配置されている、1つまたは複数のプロテアーゼ認識配列をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ペプチドがエピトープ、タンパク質、抗原または酵素から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質のN末端に第4のドメイン(iv)および/または融合タンパク質のC末端に第5のドメイン(v)をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第4および/または第5のドメインがタグ、例えばアフィニティータグまたは蛍光タグを含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- 好ましくは発現制御配列と作動可能に連結している、請求項8に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項8に記載の核酸分子または請求項9に記載のベクターを含む細胞。
- 真核細胞、好ましくは、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である、請求項10に記載の細胞。
- 少なくとも1個のさらなる核酸分子または少なくとも1個のさらなる発現ベクターでさらに形質転換またはトランスフェクトされた、請求項10または11に記載の細胞。
- 請求項10から12のいずれか一項に記載の細胞から得られた膜調製物。
- 膜と、請求項1から7のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、請求項8に記載の核酸分子または請求項9に記載のベクターとを含む、合成膜系。
- 細胞表面上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを提示する方法であって、
(a)請求項10から12のいずれか一項に記載の細胞を用意するステップと、
(b)請求項1から7のいずれか一項に記載の融合タンパク質が発現する条件下で前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 膜上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを固定する方法であって、
(a)膜を用意するステップと、
(b)融合タンパク質の固定が前記膜で起こる条件下で、前記膜を請求項1から7のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる、または請求項1から7のいずれか一項に記載の融合タンパク質が発現し、前記膜に固定される条件下で、前記膜を請求項8に記載の核酸または請求項9に記載のベクターと接触させるステップと
を含む方法。 - −ペプチドの相互作用対をスクリーニングする方法における、
−ペプチドと相互作用対の相互作用を試験するための、
−ペプチドを産生する方法における、
−抗体産生方法における免疫化試薬としての、または
−検出試薬としての、
請求項10から12のいずれか一項に記載の細胞、請求項13に記載の膜調製物または請求項14に記載の合成膜系の使用。 - ワクチンまたは医薬品として使用するための、請求項10から12のいずれか一項に記載の細胞、請求項13に記載の膜調製物または請求項14に記載の合成膜系。
- 第1の配列セグメント(i)と、第2の配列セグメント(ii)と、第3の配列セグメント(iii)とを含む核酸分子であって、前記第2の配列セグメントは前記第1の配列セグメントと前記第3の配列セグメントとの間に配置されており、
(i)は膜貫通ドメイン1(TM1)、小型細胞外ループ(SEL)、膜貫通ドメイン2(TM2)、小型細胞内ループ(SIL)および膜貫通ドメイン3(TM3)を含むテトラスパニンの部分配列、または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードし、
(ii)はマルチクローニングサイトを含み、
(iii)は膜貫通ドメイン4(TM4)を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも70%の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードする、
核酸分子。 - 好ましくは発現制御配列と作動可能に連結している、請求項19に記載の核酸分子を含むベクター。
- (i)請求項8もしくは19に記載の核酸分子または請求項9もしくは20に記載のベクターと、
(ii)細胞または膜と
を含むキット。
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