KR20170131478A - 세포 표면 상에 펩타이드를 제시하기 위한 시스템 - Google Patents

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Abstract

본원의 주요 과제는 테트라스파닌 단백질을 기초로 하는 융합 단백질 (여기서, 세포외 루프는 전체적으로 또는 부분적으로 상이한 조성의 펩타이드 서열에 의해 대체된다), 및 이의 제조 및 수송 비히클로서의 용도에 관한 것이다. 상기 기재된 융합 단백질은 세포의 막에 부착되고 세포 표면 상에 이와 융합되는 외래 펩타이드를 제시하는데 사용될 수 있다.

Description

세포 표면 상에 펩타이드를 제시하기 위한 시스템
본원의 주요 과제는 테트라스파닌(tetraspanin) 단백질을 기초로 하는 융합 단백질 (여기서, 세포외 루프는 전체적으로 또는 부분적으로 상이한 조성의 펩타이드 서열에 의해 대체된다) 및 또한 이의 제조 및 수송 비히클로서의 용도에 관한 것이다. 상기된 융합 단백질은 세포막에 부착(anchor)되며 세포 표면 상에 이와 융합된 외래 펩타이드를 제시(presenting)하는데 사용될 수 있다.
세포 및 이들의 생리학 체제는 유전자에 의해 암호화되어 있다. 상기 유전자는 DNA로 이루어지고 게놈내에 또는 염색체외 요소들 상에서 발견된다. 이들은 1차 및 2차 유전자 생성물, 예를 들어, RNA 및 단백질을 발현한다. 이들은 추가로 다양한 방식으로 효소적으로 변형된 상태로 존재할 수 있다.
상기 유전자 생성물은 주로 시토졸에서 발견된다. 상기 단백질은 또한 부분적으로 세포내 격실 막 및 외부 세포 막 및 또한 능히 세포 벽내에서 발견된다. 진핵세포의 경우에, 단백질 및 전구체 RNA는 세포 핵에서 발견된다. 단백질은 시토졸에서 세포내 막에 분류되어 있고 세포 격실로 분포되지만, 또한 분비에 의해 세포로부터 수송될 수 있다. 소포체 (ER)로부터 수송 단백질은 추가로 수송 동안에 골지체에서 당화될 수 있다.
특정 단백질 종인 막-부착된 단백질은 능동적으로 세포 막으로 지시되고 이들 자체를 상기 막에 수직으로 부착시킨다. 그러나, 수평적으로, 대조적으로, 이들은 유연하게 막 유동성으로 인해 막 내에서 이동할 수 있다. 일부 막 단백질은 다른 이종성 막 단백질과 클러스터로 복합체화된다. 따라서, 인간 단백질의 80 %는 연합된 단백질 복합체로 작용한다1. 일부 종은 막에서 서로 협력적으로 상호작용하여 거기에서 안정한 구조를 형성한다.
세포가 이의 환경과 상호작용하도록 하는 다수의 시그날 과정은 막 단백질에 의해 조절된다. 외향 분비 과정들과 연계된 세포 막에 의한 단백질의 막 수송이 또한 가능하다.
에피토프의 제시를 위해, 면역계는 세포내에서 잠재적 공격 병원체를 동정하기 위해 세포 상의 MHC 막 단백질을 사용한다. 이들 생리학적 과정은 대부분 세포내에서 매우 잘 확립되어 있고 관여된 단백질은 상기 기능을 위해 매우 특이적으로, 즉, 대부분 매우 특이적으로 특정 기능으로 지시되도록 발달하였다. 따라서, 당업자는 이들 기능을 방해하기 위한 추가의 인공적 아미노산 서열을 예상할 수 있다.
테트라스파닌은 포유동물에서 33개 구성원과 함께 단백질 슈퍼패밀리에 속한다. 테트라스파닌의 주요 특징은 이들의 4개 막관통 도메인 TM1-4이고 이들은 또한 명칭을 부여하였다. 테트라스파닌은 추가로 소형 및 대형 세포외 단백질 루프 (소형 및 및 대형 세포외 루프)를 함유하고 이는 또한 SEL 및 LEL로서 공지되어 있다. 상기 LEL은 고도로 보존된 CCG 아미노산 모티프를 함유한다. 추가로 세포내 단백질 루프 (소형 세포내 루프, SIL)는 여기에 함유되어 있다. N-말단 및 C-말단은 세포내에 위치한다34 -36. 측면 단백질-단백질 상호작용 (PPI)을 사용하여, 테트라스파닌은 테트라스파닌-집적된 마이크로도메인 (TEM)에서 이들 자체를 구성한다37,38.
의도적 방식으로 이종성 조성의 외래 단백질 및 에피토프를 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포의 표면으로 수송하고 거기에 이들을 제시하기 위해서는 특히 적합한 캐리어 단백질 (캐리어)이 요구된다. 이들은 충분한 기전력을 가져야만 하고 막 전위를 사용하여 막에 의한 세포 표면으로의 높은 전좌 효율과 함께 단백질 수송을 보장할 수 있어야 한다2 -8. 과거에“디스플레이”시스템이 알려지게 되었고 유전학적으로 변형시킴에 의한 외래 단백질의 제시를 위해 캐리어 단백질로서 사용될 수 있는, 일반적으로 막-부착된 단백질이다. 가장 널리 알려진 단백질 디스플레이 시스템 중 하나는 파아지 디스플레이다. 세균계에서 필라멘트성 박테리오파아지의 표면 상에 단백질 구성성분들의 제시에 사용된다9 -12. 그러나, 과거에, 이종성 단백질은 또한 그람-양성 및 그람-음성 세균의 경우에 파아지 디스플레의 사용 없이 최외곽 막 상에 성공적으로 제시되었다. 이에 대해, 세균 세포내 상이한 수송 기작을 활용하여 단백질을 세균 세포의 최외곽 막으로 지시하였다13 -20. 디스플레이 시스템에서의 추가의 발전은 재조합 단백질에서 단백질이 폴딩되고 예를 들어, N-당화와 같은 변형을 보장하기 위해 효모 및 곤충 세포와 같은 진핵세포 시스템에 집중되었다21 -29. 초기 디스플레이 시스템은 또한 포유동물 시스템에서의 사용을 위해 이미 개발되었다30-33.
본 발명의 목적은 상기 선행기술로부터 출발하여 임의의 목적하는 이종성 펩타이드를 세포질막내에 부착시키고 이들을 세포 표면 상에 제시하기 위한 새로운 가능성을 제공하는 것이다. 놀랍게도, 현재 테트라스파닌이 비히클로서 월등히 적합하고 세포 표면으로의 부착 및 제시를 위해 이들과 융합된 외래 펩타이드에 대한 고도의 효율적 수송 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들은 또한 외래 펩타이드를 소포체 및 골지체를 통해 포유동물 세포의 세포질막으로 매우 효율적으로 안내할 수 있다.
테트라스파닌 패밀리의 단백질은 야생형에서 막관통 도메인 TM3과 TM4 사이에 단백질 루프 (대형 세포외 루프, LEL)를 갖는다. 놀랍게도 본 발명의 프레임워크내에서 상기 세포외 루프가 전체적으로 또는 부분적으로 상이한 조성의 펩타이드 서열에 의해 대체될 수 있고 따라서 삽입된 이종성 펩타이드를 테트라스파닌 캐리어 단백질에 의해 막 상으로 수송하고 이를 상기 막에 부착시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 세포막 및 이들의 부착에 의한 특이적 수송 비히클의 기능과 연계하여 조절 단백질 발현 시스템에서 유연하고 가변적 서열 조절을 위한 균일한 분자 구조의 단순함을 기초로 한다.
제공된 벡터 시스템은 이것이 단순한 클로닝 전략 (예를 들어, 개별 에피토프를 부가하고 또한 전체 단백질 라이브러리를 생성하기 위해)에 의해 단백질 구성성분을 유연하게 대체하거나 부가할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 테트라스파닌 융합 구성체 (일시적으로 또는 안정하게 게놈으로 통합된)의 발현 후, 막내 융합 단백질의 위치 선정은 거의 정량적이다. 테트라스파닌 단백질은 막 상으로 매우 효율적으로 전좌된다. 이미 공지된 시스템은 임의의 위치에서 상기 형태로 (예를 들어, EGFR 수용체) 이를 성취하는데 근접하지 못한다.
본 발명에 따른 테트라스파닌 융합 단백질의 발현은 상대적으로 신속하게 정상적으로 밤새 일어나는 반면, 다른 수송 시스템의 발현은 일반적으로 2일에 걸쳐 발생한다.
이뿐만 아니라, 융합 작제물의 안정성 및 이들의 수명은 7개의 막관통 도메인을 갖는 공지된 단백질과 대비하여 보다 우수한데 그 이유는 시토졸 분해 생성물의 축적이 발견되지 않기 때문이다 (재조합 GPCR 수송체는 불안정한 것으로 공지되어 있다).
단지 4개의 막관통 도메인을 갖는 본 발명에 따른 시스템과 함께, 임의의 문제 없이 안정하게 세포 표면 상에 하나 이상의 단백질을 수송하고 예를 들어, 소분자, 추가의 단백질, 예를 들어, 항체, 및 또한 다른 단백질 (예를 들어, 촉매 효소), DNA, RNA 및 당 등과의 상호작용 실험에서 정체 파트너로서 이들을 고정시키고 고정화할 수 있다.
막 상의 융합 단백질의 반응물은 현재 주변 용액으로부터 유연하게 막 상의 단백질 및 글리코실 잔기와의 특정 반응으로 진입할 수 있다.
이들 반응을 위한 전제조건은 단백질의 기능적 형태이다. 이것은 본 발명에 따른 융합 단백질과 관련하여 완전하게 보장된다.
본 발명의 제1 주요 과제는 따라서 제1 도메인 (i), 제2 도메인 (ii) 및 제3 도메인 (iii)을 포함하는 융합 단백질이고, 여기서, 상기 제2 도메인은 제1 및 제3 도메인 사이에 배치되고, 여기서, 상기 융합 단백질은,
(i) 막관통 도메인 1 (TM1), 소형 세포외 루프 (SEL), 막관통 도메인 2 (TM2), 소형 세포내 루프 (SIL) 및 막관통 도메인 3 (TM3)을 함유하는 테트라스파닌의 부분적 서열을 포함하거나 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 포함하고,
(ii) 테트라스파닌의 대형 세포외 루프 (LEL)와 관련하여 전체 길이에 걸쳐 70 % 미만의 서열 동일성을 갖는 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하고,
(iii) 막관통 도메인 4 (TM4) 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성으로 이와 상동성인 서열을 포함하는, 테트라스파닌의 부분적 서열을 포함한다.
본 발명에서, 서열 TM1-3 및 TM4가 융합 단백질의 막 상으로의 부착에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 첫 번째로 막관통 도메인 TM1-TM3과 함께 테트라스파닌의 부분적 서열을 포함하는 제1 도메인 (i) 및 두번째로 막관통 도메인 TM4와 함께 테트라스파닌의 부분적 서열, 또는 이와 상동성인 서열을 포함하는 도메인 (iii)을 포함한다.
본 발명의 의미내에서, 용어 “테트라스파닌”은 테트라스파닌 패밀리의 임의의 목적하는 단백질, 보다 특히 33개의 인간 테트라스파닌을 기술한다. 테트라스파닌은 막에서 서로 특이적 상호작용으로 진입할 수 있다. 상기 거동은 막 상으로의 수송 및 거기에 부착시키기 위해 호의적이다. 상기 효과는, 또한 도메인 (ii)의 외래 펩타이드를 효과적으로 막 상으로 수송하고 이를 부착하기 위해 본 발명에 따른 융합 단백질에 사용될 수 있다. 본 발명의 의미내에서 테트라스파닌의 바람직한 예는 CD63, CD9, CD82, CD81, CD151 및 CD53이다 (DNA 서열 및 단백질 서열에 대한 서열 기록을 참조한다). 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 융합 단백질내 함유된 부분적 서열은 테트라스파닌 CD63으로부터 기원한다 (DNA 및 단백질 서열에 대한 서열 기록을 참조한다).
기본 원칙으로서, 도메인 (i)에 대한 제1 테트라스파닌의 부분적 서열을 선택하고 도메인 (iii)에 대한 또 다른 테트라스파닌의 부분적 서열을 선택할 수 있다. 바람직하게, 그러나, 모든 부분적 서열은 동일한 테트라스파닌으로부터 기원하고, 예를 들어, CD63, CD9, CD82, CD81, CD151 또는 CD53, 바람직하게는 CD63이다 (DNA 및 단백질 서열에 대한 서열 기록을 참조한다).
도메인 (i)은 바람직하게는 테트라스파닌의 막관통 도메인 TM1, 소형 세포외 루프 (SEL), 막관통 도메인 TM2, 소형 세포내 루프 (SIL) 및 막관통 도메인 TM3을 포함하고, 여기서, 상기 다양한 막관통 도메인 및 루프는 이들 사이에 임의의 추가의 이종성 서열 분절이 삽입된 것 없이 서로 직접적으로 이어져 있다. 특히 바람직하게, 상기 부분적 서열은 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 형태로 임의의 일탈 없이 야생형의 테트라스파닌에 상응한다. 그러나 원칙적으로 도메인 (i)에 대한 테트라스파닌의 변형된 부분적 서열을 사용할 수 있고, 단, 이들은 야생형 테트라스파닌과 관련하여 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는다. 보다 바람직하게, 서열 동일성은 전체 길이에 걸쳐 도메인 (i)에 함유된 테트라스파닌의 부분적 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 제1 도메인 (i)은 테트라스파닌의 상기 언급된 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 % (보다 바람직하게는 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %)의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열로 이루어진다.
상기 도메인 (iii)은 테트라스파닌의 막관통 도메인 TM4 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 포함하는, 테트라스파닌의 부분적 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 야생형 테트라스파닌의 부분적 서열과의 서열 동일성은 전체 길이에 걸쳐 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 도메인 (iii)은 테트라스파닌의 상기 언급된 부분적 서열 또는 이와 상동성인 서열로 이루어진다.
상기 도메인 (ii)는 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 본원에서 이것은 또한 소위 "외래 펩타이드" 또는 "외래 단백질"로 불리운다. 외래 펩타이드의 아미노산 서열은 야생형 테트라스파닌, 보다 특히 도메인 (i) 및 (iii)의 테트라스파닌(들)의 대형 세포외 루프 (LEL)의 서열과 상이하다. 야생형 테트라스파닌의 LEL과 대조적으로, 전체 길이에 걸친 서열 동일성은 70 % 미만, 바람직하게는 50 % 미만, 보다 바람직하게 40 % 미만 또는 30 % 미만이다.
도메인 (ii)내 아미노산 서열은 기본적으로 무작위로 선택될 수 있다. 외래 펩타이드 또는 도메인 (ii)의 서열과 상관없이, 본 발명에 따른 융합 단백질은 세포, 보다 특히 포유동물 세포 (예를 들어, HEK293T-호모 사피엔스)의 표면 상에 부착되고 제공될 수 있다.
본 발명의 의미내에서 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개의 아미노산의 조합을 지칭한다. 펩타이드의 길이는 기본적으로 제한되지 않는다. 10개 이하의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드, 10개 초과의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드 및 100개 초과의 아미노산을 갖는 마크로펩타이드가 모두 포함된다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드의 크기는 100 kDa 미만, 바람직하게는 50 kDa 미만 또는 30 kDa 미만, 예를 들어 10-30 kDa이다.
본 발명의 의미내에서 용어 "아미노산"은 바람직하게는 20개의 천연적으로 존재하는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에서 발견되는 아미노산을 지칭하고 이는 각각의 경우에 L-이성체이다. 그러나, 본 발명에 따라, 상기 용어는 또한 아미노산의 유사체 및 아미노산의 D-이성체 및 이들의 유사체를 포함한다.
본 발명의 의미내에서 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 각각 상호교환적으로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상기 펩타이드는 적어도 50개 아미노산을 갖는 단백질이다. 이를 위해, 단백질은 예를 들어, 단백질의 목적하는 기능을 위해 요구되는 소정의 폴딩을 채택하는 것이 바람직할 수 있다.
도메인 (ii)에서, 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 예를 들어, 항원 또는 항원의 에피토프를 포함할 수 있다. 여기서, "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체가 특이적으로 결합하는 항원 영역을 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 링커에 의해 함께 연결된 다수의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 이들은 항원의 다수의 에피토프일 수 있다. 에피토프의 예는 암 에피토프, HIV 에피토프 (예를 들어, HIV-1의 gp41)이다. 이들의 예는 V5-6xHis (서열번호 35, 36) 또는 2F5-4E10 (서열번호 37, 38)이다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 도메인 (ii)의 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 목적하는 기능을 갖는 단백질, 예를 들어, 프로테아제와 같은 효소를 포함한다.
소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 추가로, 제2 도메인 (ii)은 테트라스파닌의 LEL의 하나 이상의 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 서열 동일성은 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 99 %이다. 테트라스파닌의 LEL의 부분적 서열은 C-말단 및/또는 N-말단에 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 배치될 수 있다. 바람직하게는 도메인 (ii)에서 LEL의 부분적 서열은 도메인 (i) 및 (iii)의 서열 분절과 동일한 테트라스파닌으로부터 기원한다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성"은 2개의 폴리펩타이드들, 분자들 또는 2개의 핵산 들간의 서열 유사성을 기술한다. 2개의 비교된 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점령되는 경우, 상기 위치에서 상응하는 분자들은 상동성이다. 2개의 서열간의 % 상동성은 2개의 서열에 의해 공유된 매칭 또는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열내 10개의 위치 중 6개가 매칭되거나 상동성인 경우, 이어서 2개의 서열은 60 % 상동성이다. 일반적으로, 2개의 서열이 가장 크게 가능한 상동성이 수득되도록 정렬되는 경우 비교된다. 상기 정렬은 예를 들어, 컴퓨터 프로그램에 의해 간편하게 수행되는, 문헌 [참조: Niedelman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970]의 방법을 사용하여 제공될 수 있다.
상동성 서열은 동일하거나 유사한 아미노산 잔기를 공유하고, 여기서, 유사한 잔기들은 정렬된 표준 서열에서 상응하는 아미노산 잔기들에 대해 보존성 치환 또는 허용된 점 돌연변이이다. 이와 관련하여, 표준 서열에서 잔기의 "보존성 치환"은 예를 들어, 공유 결합 또는 수소 결합 등을 형성하는 능력을 포함하는 유사한 크기, 형태, 전하, 화학적 성질을 갖는 상응하는 표준 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 치환들이다. 특히 바람직한 보존성 치환은 문헌 [참조: Dayhoff et al., “Atlas of Protein Sequence and Structure”5: Suppl. 3, chap. 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C., 1978]에서 수용된 점 돌연변이에 대해 정의된 기준을 충족하는 것들이다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 도메인은 각각의 경우에 (i)-(ii)-(iii) 순서로 배치된다. 여기서, 용어 "융합"은 이들의 개별 펩타이드 골격에 의한 도메인의 동시 선형 커플링을 언급한다.
도메인 (i), (ii) 및 (iii)은 임의로 직접적으로 또는 유연한 (flexible) 링커에 의해 결합될 수 있다. 제1 구현예에서, 도메인 (ii)은 도메인 (i)에 직접적으로 인접해 있다. 대안적으로 또는 추가로, 도메인 (iii)은 직접적으로 도메인 (ii)에 인접해 있다.
추가의 구현예에서, 유연한 링커는 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 배치되고/되거나 제2 도메인과 제3 도메인 사이에 배치된다. 상기 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질에 사용하기 위한 예시적 링커는 예를 들어, 글라이신 중합체 (G)n (여기서, n은 적어도 1의 정수이다), 글라이신-알라닌 중합체 및 당업자에게 공지된 다른 유연한 링커이다. 필수적으로, 세린- 및 아르기닌-부재 링커가 바람직하고; 세린- 및 아르기닌-부재 링커가 특히 바람직하다. 매우 특히 바람직한 것은 링커 LQEFDIGGGG (서열번호 41, 42에 상응하는)이다. 추가의 링커는 도 2c에 기재되어 있다 (또한 서열번호 39, 40을 참조한다).
도메인 (ii)는 효소로부터 스플릿될 수 있는 하나 이상의 인지 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예는 특정 프로테아제, 뉴클레아제 또는 엔도글리코시다제에 대한 인지 부위이다. 대안적으로, 인지 부위는 특정 하이드롤라제 효소, 예를 들어, 포스파타제, 글리코시다제, 아미다제 또는 에스테라제에 대한 기질 인지 부위를 포함할 수 있다. 용어 "프로테아제 인지 서열"은 본원에서 효소적으로 스플릿될 수 있는 임의의 인지 서열에 대해 개요적으로 사용된다. 이들은 C-말단 및/또는 N-말단으로 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 배치될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 프로테아제 인지 서열은 직접적으로 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 플랭킹한다. 기본 원칙으로서, 임의의 목적하는 프로테아제 인지 서열은 이를 위해 적합하다. 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 외에도, 제2 도메인 (ii)이 또한 테트라스파닌의 LEL의 하나 이상의 부분적 서열을 포함하는 경우, 각각의 경우에 LEL 부분적 서열과 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단 사이에 프로테아제 인지 서열을 삽입하는 것이 바람직할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단 상에 제4 도메인 (iv) 및/또는 융합 단백질의 C-말단 상에 제5 도메인 (v)을 추가로 포함할 수 있다. 도메인 (iv) 및 (v)는 각각의 경우에 직접적으로 또는 상기 정의된 바와 같은 유연한 링커에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 도메인 (iv)는 도메인 (i)의 N-말단 상에 직접적으로 또는 유연한 링커에 의해 결합될 수 있다. 도메인 (v)는 도메인 (iii)의 C-말단 상에 직접적으로 또는 유연한 링커에 의해 결합될 수 있다. 더욱이 도메인 (iv)와 (i) 사이에 및/또는 도메인 (iii)과 (v) 사이에 및 존재하는 경우, 링커와 도메인 (i), (iii), (iv) 및 (v) 중 하나 이상의 사이에 상기 정의된 바와 같은 프로테아제 인지 서열을 배치할 수 있다.
세포의 세포질막에서 테트라스파닌의 부착과 관련하여, 테트라스파닌의 C-말단 및 N-말단은 세포질막 측면 상에 위치한다. 동일하게 본 발명에 따른 융합 단백질의 막 부착에 유사하게 적용된다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 제4 및 제5 도메인 (iv) 및 (v)는 예를 들어, 이들이 마커 그룹을 포함하거나 태그로서 공지된 것이도록 선택될 수 있다. 여기서, "태그"는 짧은 펩타이드 서열, 예를 들어, 마킹 및 동정을 위한 단백질 태그, 예를 들어, 플래시 태그 또는 형광성 리포터 단백질 mCherry를 지칭한다.
적어도 도메인 (ii)로 인해 야생형 테트라스파닌과 상이함에도 불구하고 본 발명에 따른 융합 단백질은 올바르게, 야생형 테트라스파닌과 유사하게 폴딩하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 도메인 (ii)에서 형광성 단백질 CFP 및 YFP의 예를 사용하여 입증되었다 (도 3b 참조). 막관통 도메인 TM3과 TM4 사이의 에피토프는 스캐닝 전자 현미경의 도움으로 세포외 배향을 갖는 세포 표면 상에서 검출될 수 있다 (도 4). 테트라스파닌의 TM3과 TM4 사이에 에피토프의 도입 및 세포외 배향 및 N-말단 및 C-말단 상의 에피토프를 갖는 세포 표면으로의 수송은 스캐닝 전자 현미경에 의해 예시적 CD63에 대해 입증되었다 (도 5a-5d). 형광성 단백질의 성공적인 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다. 여기서, 특정 밴드는 FLAG 및 mCherry 에피토프에 의해 각각의 융합 단백질에 대해 검출될 수 있다 (도 6). 세포 표면 상의 추가의 테트라스파닌 (CD9, CD81, CD82 및 CD151)에 대한 위치화를 나타내었다 (도 8). 추가로 낮은-세린 및 낮은-아르기닌 링커의 용도가 세포 표면 상의 위치화의 효율을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 10).
본 발명의 추가의 주요 과제는 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자이다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 상기 언급된 융합 단백질에 대한 암호화 서열 분절을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 상기 서열 분절은 본원에서 또한 "융합 유전자"로서 기재되어 있다. 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 핵산 분자는 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 의미내에서 "핵산 분자"는 천연적으로 존재하는 핵산 염기, 염기 유사체, 염기 유도체 또는 이들의 조합된 형태의 서열에 관한 것이다. 상기 용어는 보다 특히 DNA 및 RNA 및 또한 이들로부터 유래된 핵산, 예를 들어, cDNA 및 mRNA를 포함한다. 본 발명의 의미내에서, 상기 핵산 중에는 핵산 유사체, 예를 들어, PNA (펩타이드 핵산), LNA (잠겨진 핵산), PSNA (포스포티오에이트 핵산)가 또한 포함된다. 이들 핵산 유사체는 원칙적으로 천연적으로 존재하는 핵산 염기를 가질 수 있지만 상기 염기들은 상이한 방식으로, 예를 들어, DNA 또는 RNA 형태로 함께 연결되어 있다. 상기 핵산 중에 포함된 것은 또한 예를 들어, 하이포크산틴, 2,5-디아미노포린 및/또는 메틸시토신 및 변형된, 보다 특히 마킹된 핵산과 같은 핵산 유도체를 갖는 핵산이다. 염기 유도체 외에도, 이들 핵산 유도체는 원칙적으로 또한 천연적으로 존재하는 핵산 염기를 가질 수 있다. 마킹은 염기 및/또는 골격 상에 도입될 수 있다. 상기 링크는 DNA 또는 RNA 또는 핵산 유사체에 상응할 수 있다. 상기 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥, 선형, 측쇄 또는 환형일 수 있다.
본 발명은 추가로 상기된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는 핵산 분자는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
본 발명의 의미내에서 용어 "발현 조절 서열"은 전사 수준에서 발현을 조절하는, 예를 들어, 인핸서 또는 사일런서와 같은 2개의 요소 및 또한 전사 후 수준에 발현을 조절하는 요소들 (예를 들어, 스플라이싱, 핵 수송 또는 mRNA 안정성)을 포함한다. 상기 용어는 또한 전사 및 전사후 수준에서 발현을 조절하는 다수의 요소들 및 또한 전사 및 전사후 조절 요소들의 조합을 포함한다. 증가된 발현 및 이들의 단리를 유도하는 발현 조절 서열의 동정을 위한 기술 및 보조 기술은 아마도 당업자에게 널리 공지된 통상의 기술이다. 발현 조절 서열은 보다 특히 프로모터, 바람직하게는 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 SV40 프로모터; 원핵세포 프로모터 또는 파아지-특이적 프로모터, 예를 들어, SP6 또는 T7 프로모터일 수 있다. 특히 바람직하게, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 상기 벡터는 추가로 핵산 분자의 종결 및/또는 폴리아데닐화를 위한 서열 분절을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 추가로 바람직하게는 선택 마커 유전자, 즉, 선택 마커를 암호화하는 서열 분절을 함유한다. 선택 마커의 예는 항생제 내성 또는 영양요구성 마커이다. 바람직하게, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제와 같은 증폭가능한 선택 마커 유전자가 사용된다. 임의로 본 발명에 따른 벡터는 복제 오리진을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 의미내에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 이들이 이들의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 위치된 2개 이상의 핵산 서열 또는 부분적 서열의 링크를 기술한다. 예를 들어, 프로모터/인핸서는 이것이 시스 위치에서 연결된 유전자 서열의 전사를 제어하거나 조절할 수 있는 경우 암호화된 유전자 서열에 기능적으로 연결된다. 일반적으로, 필연적이지는 않더라도, 기능적으로 연결된 서열은 인접하게 위치되고 2개의 암호화 유전자 서열이 연결되는 경우 또는 분비 시그날 서열의 경우에 동일한 판독 프레임에 있다. 기능적으로 연결된 프로모터가 일반적으로 암호화 유전자 서열의 업스트림에 위치되어 있더라도, 이것은 필연적으로 밀접하게 인접하게 있을 필요가 없다. 인핸서는 또한 이들이 유전자 서열의 전사를 촉진시키는 한 밀접하게 존재할 필요는 없다. 이러한 목적을 위해, 이들은 능히 또한 일부 이격되어 유전자 서열의 업스트림 및 또한 다운스트림에 존재할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는 이것이 유전자 서열의 3' 말단에 위치되는 경우 전사 진행이 암호화 서열에 의해 폴리아데닐화 시그날로 진행되도록 기능적으로 유전자 서열에 연결된다. 상기 링크는 예를 들어, PCR 기술에 의해, 적합한 제한 부위에서의 연결 또는 스플라이싱에 의해 통상적 재조합 방법에 따라 일어날 수 있다. 어떠한 적합한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어댑터는 공지된 방식 자체로 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 기능성 링크는 인트론 서열에 의해 일어나지 않는다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 적어도 하나의 (숙주) 세포를 위해, 보다 특히 상기 세포에서 벡터의 복제를 위해 및/또는 상기 세포에서 단백질 또는 펩타이드의 발현을 위해 적합하다. 복제는 원핵세포 및/또는 진핵세포에서 일어날 수 있다. 발현은 바람직하게는 진핵 세포에서 일어난다. 벡터는 플라스미드일 수 있다.
선행 기술에 따른 진핵세포 발현을 위한 벡터 구성물은 통상적으로 가능한 한 세포 유형에 특이적이지 않은 강한 진핵세포 프로모터 (예를 들어, CMV 또는 SV40 프로모터) 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 (예를 들어, SV40 종결-폴리A)에 관여하는 서열 일부를 갖는다. 이들 2개 요소들 사이에 위치된 것은 개시 코돈 주변에 다소 명백하게 정의된 코작 서열에 의해 인도되어 발현될 CDS (암호화 서열)이다. 본 발명에 따른 벡터 구성물의 경우에, 발현될 CDS는 테트라스파닌 슈퍼패밀리로부터 기원하는 유전자이다. 여기서, 막 상에 목적하는 수송 능력을 제공하는 상기 유전자 슈퍼패밀리의 유전자를 갖는 모든 유기체 종 기원의 모든 테트라스파닌 유전자는 본 발명에 따른다. 그러나, 본 발명에 따른 융합 유전자는 내부 및 능히 말단 융합부로서 적어도 하나의 인공적으로 도입된 이종성 DNA 서열을 가질 수 있음을 특징으로 한다. 말단 CDS 융합부는 융합 단백질 또는 펩타이드에 대해 테트라스파닌 유전자에 대해 5'-인접하게 및/또는 3'-원거리의 부분을 암호화하는 이종성 DNA 서열이다. 본 발명에 따른 제3 (TM3) 및 제4 (TM4) 막관통 도메인 사이에, 내부 암호화 이종성 DNA 서열이 도입된다. 테트라스파닌의 막관통 도메인은 무엇보다 막을 통한 전좌 및 거기로의 부착으로 이종성 암호화 서열의 막으로의 수송에 관여한다.
분자 생물학에 숙련된 통상의 당업자는 능히 관련 문헌의 도움으로 기능성 DNA 융합 작제물을 생성할 수 있다39.
특히 여기서, 본 발명에 따른 보다 진보된 벡터 구성물이 강조되어야 한다. 일반적인 진핵 세포 프로모터 대신, 이들은 또한 세포 분화에 의존하여 발현할 수 있는 진핵 세포-유형-특이적 및 기관-특이적 프로모터 뿐만 아니라 세균 및 파아지-특이적 프로모터를 갖는다. 상기 프로모터 유형은 적용과는 상관 없이 본 발명에 따른 유전자 작제물을 사용하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 본 발명에 따른 벡터 구현예는 또한 예를 들어, 시험관내에서 매우 효율적으로 또는 능히 생체내에서 mRNA 분자를 생성하기 위해 파아지의 RNA 폴리머라제 프로모터를 가질 수 있다. 이의 예는 파아지 프로모터, 예를 들어, 시험관내 mRNA 분자의 제조를 위한 SP6- 또는 T7-특이적 프로모터이고, 따라서, 융합 유전자 mRNA는 능히 치료학적 목적 및 적용을 위해 공급될 수 있다. 상기 변이체는 약제학적 형태의 조절제로서 환영받는데 그 이유는 핵산의 게놈으로의 재조합을 차단하는 것으로 나타나기 때문이다.
세균 또는 효모에서 테트라스파닌 유전자 유도체의 발현은 융합 단백질을 단리시키기 위해 사용될 수 있고 인조 막에 사용될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 점막 또는 근육 세포에서 진핵세포 분화- 및 세포-특이적 발현은 또한 세포-특이적으로 DNA 백신을 발현하기 위해 사용될 수 있다 (문헌참조: 예를 들어, EP1390490 B1).
치료제에 대한 공식 허가 과정에서 조절이 확립되었고 이는 상기 고도의 특이적 발현 성질이 의무적 요건이도록 한다.
추가로, 본 발명에 따른 벡터 시스템은 특이적 디자인을 소유하여 동일한 세포에서 단일 벡터 작제물에 의해 다중 융합 단백질이 발현되도록 한다 (문헌참조: 특허 출원 DE 10 2013 006 487 A9). 상기 디자인과 함께, 추가의 요소들은 단순화된 방식으로 부가될 수 있다.
본 발명의 주요 과제는 또한 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 분절을 갖는 핵산 및 벡터에 관한 것이고, 여기서, 그러나 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 대한 암호화 서열 대신, 단지 다수의 클로닝 부위가 존재하고 이는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열에 의해 소정의 아미노산 서열을 갖는 임의의 목적하는 펩타이드를 암호화하는 유전자의 클로닝을 가능하게 한다. 추가로, 다수의 클로닝 부위는 N-말단 및/또는 C-말단 도메인 (iv) 및 (v)에 대한 5' 및/또는 3' 위치에 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면은 제1 서열 분절 (i), 제2 서열 분절 (ii) 및 제3 서열 분절 (iii)을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서, 제2 서열 분절은 제1 서열 분절과 제3 서열 분절 사이에 배치되고, 여기서,
(i) 테트라스파닌의 부분적 서열은 막관통 도메인 1 (TM1), 소형 세포외 루프 (SEL), 막관통 도메인 2 (TM2), 소형 세포내 루프 (SIL) 및 막관통 도메인 3 (TM3)을 포함하거나 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 암호화하고,
(ii) 다수의 클로닝 부위를 포함하고,
(iii) 막관통 도메인 4 (TM4)를 포함하는 테트라스파닌의 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 암호화한다.
여기서, 서열 분절 (i) 내지 (iii)은 바람직하게는 5'에서 3'로 배치된다. "다수의 클로닝 부위"는 제한 엔도뉴클레아제에 대해 전후에 위치하여 다수의 제한 부위를 포함한다. 다수의 클로닝 부위는 보다 특히 핵산 분자의 통합을 위해 적합하고, 여기서, 판독 프레임내 상기 통합된 핵산 분자는, 제시되어야만 하는 펩타이드에 대해 제1 서열 분절 (i) 및 제3 서열 분절 (iii)을 암호화한다. 상기 펩타이드는 바람직하게는 테트라스파닌의 대형 세포외 루프 (LEL)와 관련하여 전체 길이에 걸쳐 70 % 미만의 서열 동일성을 갖는 소정의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로, 바람직하게는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 상기 언급된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
선행 기술 분야에서, 인지 서열은 대부분의 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및 또한 여기서 관련된 제한 엔도뉴클레아제에 대해 공지되어 있다. 바람직하게, 인지 서열로서 적어도 6개의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열이 사용된다. 적합한 동정 서열의 목록은 예를 들어, 문헌 [참조: Sambrook et al. (1989)]에서 발견될 수 있다.
다수의 클로닝 부위를 갖는 본 발명에 따른 벡터의 특이적 서열 요소들은 테트라스파닌 유전자 (예를 들어, CD63과 같은) 자체의 상응하는 말단 및 내부, 기능적으로 수용되는 위치 상으로의 이종성 DNA 서열의 도입에 관한 것이다. 따라서, 때때로 새로운 에피토프 CDS를 기존의 벡터 작제물로의 사이클릭 반응으로 부가적으로 "독특한" 즉, 개별 제한 부위 또는 다양한 유전자들 및 유전자 단편으로 삽입할 수 있다. 하나의 예는 본 발명에 따른 벡터 pAE211에 의해 도 2a의 서열번호 1로 제공된다. 제한 부위는 막관통 도메인 TM3 및 TM4 사이의 위치에 위치된다. 상기 위치에 대해, 이것이 특히 이종성 펩타이드를 암호화하는 이종성 DNA 서열과의 접합을 위해 적합한 것으로 실험적으로 입증되었는데 이는 막 수송 기능을 방해하지 않기 때문이다. 상기 부위에서, 막 상에서 돌출된 단백질 루프가 위치되고 상기 루프의 서열은 세포 배양에서 테트라스파닌 단백질의 세포질막으로의 단백질 수송을 유의적으로 방해하는 것 없이 다양할 수 있다.
N-말단 융합 단백질을 생성하기 위한 5-말단 CDS 융합부는 CD63 유전자의 5' 영역에서 2개의 Ncol에 의해 도입될 수 있어 코작 서열은 개시 영역에 재생된다. 이것은 독특하다.
C-말단 단백질 융합부를 유도하는 가능한 3'-말단 CDS 융합 요소는 유형-IIS 제한 엔도뉴클레아제 Bsal에 의해 삽입되고, 이는 작제물에서 Ndel 및 Bc/l에 대한 특이적 말단을 생성시킨다. 이들 부위는 또한 능히 3'-말단 유전자 융합 요소를 삽입하기 위해 사용될 수 있다.
벡터 시스템의 상기 실행은 일례이고 벡터를 변형시키기 위한 임의의 다른 방법 또는 기술은 상기된 제한-연결 방법 외에도 예를 들어, 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 적합한 재조합 시스템에 의한 시스템의 서열 조절과 같이 균등하게 본 발명에 따른다.
본 발명의 추가의 주요 과제는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포이다.
본 발명에 따른 구현예에서, 융합 단백질 및 적합한 유전학적 제어 기능을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 벡터는 안정하게 게놈적으로 통합되거나 세포에서 염색체 외적으로 존재하고 본 발명에 따른 융합 단백질은 거기에서 항상성으로 또는 유도성으로 또는 억제적으로 발현된다.
본 발명의 의미내에서 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어, 보다 특히 인간 세포이다. 적합한 포유동물 세포의 추가의 예는 예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터 세포와 같은 설치류의 세포주 또는 유인원 세포이다. 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터는 공지된 기술 자체의 도움으로 세포, 보다 특히 진핵 세포로 도입될 수 있다. 성공적인 형질감염은 형질전환된, 유전학적으로 변형된, 재조합 또는 유전자전이 세포를 유도한다.
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 형질감염은 통상적인 방법에 따라 일어난다 (문헌참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). 적합한 형질감염 방법은 예를 들어, 리포좀-매개된 형질감염, 인산칼슘 동시-침전, 전기천공, 다가양이온, (예를 들어, DEAE-덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 미세주사 및 바이러스 감염이다. 본 발명에 따라, 세포는 바람직하게는 안정한 형질감염에 의해 수득되고, 여기서, 상기 작제물은 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/소형-염색체로 통합되거나 숙주 세포에서 에피좀적으로 안정한 방식으로 함유된다. 각각의 숙주 세포에서 이종성 유전자의 최적의 형질감염 빈도 및 발현을 가능하게 하는 형질감염 방법이 이를 위해 바람직할 수 있다. 정의에 의해 숙주 세포로 도입된 각각의 서열 또는 각각의 유전자는 심지어 도입된 서열 또는 도입된 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일한 경우에도 숙주 세포와 관련하여 "이종성 서열" 또는 "이종성 유전자"로서 기술된다.
본 발명에 따른 구현예에서, 상기 세포는 다양한 세포 유형의 유전자전이 세포 연합의 세포일 수 있고, 여기서, 본 발명에 따른 상기 융합 유전자는 또한 상이한 세포 분화 상태로 발현된다. 이들 세포는 생체외에서 제조될 수 있고 이후 능히 생체내에서 치료학적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추가의 구현예에서, 상기 세포는 유전자전이 유기체의 세포 유니온의 세포이고 이들 세포는 생식선을 통해 전개되어 다세포 시스템, 바람직하게는 생존 유기체로 발달시켰다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 추가로 적어도 하나의 추가의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 추가의 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시켰다. 추가의 핵산 분자 또는 추가의 발현 벡터는 바람직하게는 추가의 소정의 단백질을 암호화하는 분절을 함유한다. 추가의 핵산 분자 또는 발현 벡터는 하나의 구현예에 따라 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 발현 벡터일 수 있고, 이 경우에 또 다른 소정의 아미노산 서열을 갖는 또 다른 펩타이드는 도메인 (11)에 선택되었다. 또 다른 구현예에서, 상기 추가의 핵산 분자 또는 추가의 발현 벡터는 효소, 예를 들어, 프로테아제를 암호화하는 분절을 함유한다. 상기 세포에서, 본 발명에 따른 핵산 분자 및 추가의 핵산 분자가 발현되는 경우, 소정의 아미노산 서열을 갖는 도메인 (ii)의 펩타이드 및 또한 추가의 단백질 둘 다는 막 표면 상에 제공된다. 예를 들어, 도메인 (ii)의 펩타이드가 프로테아제 인지 서열에 의해 플랭킹되어 있는 경우, 추가의 핵산 분자에 의해 발현되는 프로테아제는 이들 인지 부위를 절단함에 따라 펩타이드를 방출시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 숙주 세포는 바람직하게는 무혈청 조건하에서, 능히 동물 단백질/펩타이드가 없는 배지에서 확립되어 있고 채택되고 배양된다.
본 발명의 추가의 주요 과제는 본 발명에 따른 세포로부터 수득되었던 막 제제이다.
본 발명의 의미내에서 막 제제는 적어도 단리된 막, 보다 바람직하게는 단리된 세포 막, 보다 더 바람직하게는 단리된 세포질 막 및/또는 다른 세포 기관의 세포막을 포함한다. 본 발명의 의미내에서 용어 "막은 적어도 하나의 지질 및 임의로 적어도 하나의 단백질을 포함하는 자가-함유된 시스템을 기재한다. 막의 지질은 일반적으로 지질 이중층을 형성한다. 상기 막 제제는 바람직하게는 막 입자, 보다 바람직하게는 막 비히클을 포함한다.
상기 막 제제는 당업자에게 공지된 방법, 바람직하게, 세포의 용해 (세포 용해물)에 의해, 보다 바람직하게는 세포의 용해 및 세포막의 후속적 단리 및 임의로 세정 (단리되고 임의로 세정된 막)에 의해 본 발명에 따른 세포로부터 수득될 수 있다, 예를 들어, 트리톤 X-100과 같은 임의의 계면활성제는 막을 가용화시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 추가로 세포 파쇄물을 제거하기 위한 단계를 포함할 수 있다. 막 입자의 직경은 범위 1 내지 1000 nm, 바람직하게는 50 내지 500 nm, 보다 바람직하게는 75 내지 200 nm일 수 있다. 막 입자의 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 %는 본원에 기재된 범위 중 하나의 직경을 갖는다.
본 발명에 따른 막 제제는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 본 발명에 따른 세포로부터 수득된다. 상기 세포에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 핵산 분자 또는 벡터에 의해 발현된다. 따라서 본 발명에 따른 막 제제는 바람직하게는 적어도 단리된 막 및 적어도 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다. 여기서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 막에, 보다 바람직하게는 상기 막의 표면 상에, 보다 특히 막의 세포외 측면 상에 부착된다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 막 상에, 바람직하게는 막의 표면 상에, 보다 특히 막의 세포외 측면 상에 제공된다. 막 제제는 임의로, 추가로 하나 이상의 야생형 테트라스파닌을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 막 시스템은 세포의, 예를 들어, 시험관내 세포 배양물의 외막이고, 여기서, 본 발명에 따른 적어도 융합 단백질은 일시적으로 발현된다.
본 발명은 추가로 막 및 상기된 바와 같은 융합 단백질, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 합성 막 시스템에 관한 것이다.
상기 막은 세포 (천연) 또는 합성 (인조) 막일 수 있다. 세포막은 보다 특히 전형적으로 세포의 표면 (외표면) 상에 위치된 세포 세포질막이다. 본 발명의 의미내에서 세포막은 세포의 일부일 수 있거나 세포로부터 단리된 것, 즉, 단리된 세포막일 수 있다. 세포막은 전형적으로 비대칭이고 세포질을 향해 대면해 있는 측면 (세포질 또는 세포내 측면, 내부 측면) 및 세포질로부터 외면하는 측면 (세포질외 또는 세포외 측면, 외측면)을 갖는다.
합성 막은 합성 및/또는 단리된 세포막을 포함할 수 있다. 보다 특히, 합성 막의 지질 및/또는 단백질 조성은 세포막의 천연 조성물과 상이할 수 있다. 합성 막은 바람직하게는 세포의 일부가 아니고 보다 특히 단리된 합성 막으로서 존재한다. 당업자는 지질 및/또는 단백질의 선택을 통해 합성 막의 성질에 영향을 줄 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 합성 막 시스템은 추가로 핵산 분자 또는 벡터의 발현을 위한 시스템을 함유하고, 이에 의해 융합 단백질이 발현될 수 있다. 단백질의 발현을 위한 시스템은 당업계에 공지되어 있고 바람직하게는 세포 부재이다. 발현용 시스템은 바람직하게는 핵산 분자, 보다 특히 RNA 또는 mRNA의 해독을 위한 시스템; 및 임의로 핵산 분자 또는 벡터의 전사를 위한, 보다 특히 RNA 또는 mRNA를 수득하기 위한 시스템을 포함한다.
대안적 구현예에서, 상기 융합 단백질은 본 발명에 따른 막 시스템을 수득하기 위해 직접 막에 부가될 수 있다.
막 시스템의 경우에, 발현되거나 부가된 융합 단백질은 상기 막에, 바람직하게는 막의 표면 상에, 보다 특히 막의 외측면 상에 부착된다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 막 상에, 바람직하게는 막의 표면 상에, 보다 특히 막의 외측면 상에 제공된다.
또한 합성 막 시스템에서 본 발명에 따른 융합 단백질은 표면으로 지시되고 전좌될 수 있고 거기에 부착될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 경우에, 생체내 또는 시험관내에서 인공, 비-정규 아미노산을 본 발명에 따른 융합 단백질에 혼입할 수 있다. 세포-부재 단백질 합성을 사용하여 또한 합성 막을 집적하고 존재하도록 적합한 융합 단백질을 수득하여 거기에 부착되도록 할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 하기의 단계를 포함하는 세포 표면 상에 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공하기 위한 방법이다:
(a) 상기된 바와 같이 본 발명에 따른 세포를 제공하는 단계, 및
(b) 본 발명에 따른 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 세포를 배양하는 단계.
본 발명은 추가로 하기의 단계를 포함하는 막 상에 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 부착 방법에 관한 것이다:
(a) 막을 제공하는 단계, 및
(b) 융합 단백질의 부착이 막에서 일어나거나 상기된 바와 같이 핵산 또는 상기된 바와 같이 벡터와 막을 접촉시키는 조건하에서, 융합 단백질이 막에서 발현되고 부착되는 조건하에서 막을 상기된 바와 같은 융합 단백질과 접촉시키는 단계.
본 발명의 추가의 주요 과제는 펩타이드와 상호작용 파트너 (예를 들어, 항체)의 상호작용의 연구를 위한 펩타이드의 상호작용 파트너에 대한 스크리닝 방법에서, 항체 제조를 위한 방법에서 면역화 시약 및/또는 검출 시약으로서 펩타이드의 제조를 위한 방법에서 상기 언급된 세포, 막 제제 또는 합성 막 시스템의 용도이다.
본 발명은 추가로 백신 및/또는 의약처치로서 사용하기 위한 상기된 바와 같은 세포, 막 제제 또는 합성 막 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따른 양태에서, 상기 융합 단백질은 연구 및 개발에 사용하기 위해 또한 능히 상업적 응용을 위한 방법의 일부 또는 키트로서 공급하기 위해 형질감염된 일시적으로 또는 안정하게 발현하는 세포, 유전자 전이 유기체 또는 합성 막 시스템으로부터 제거된다. 예는 생분석학적-진단 시스템 및 치료제의 제조이다.
본 발명에 따른 추가의 구현예에서, 융합 단백질을 함유하는 막은 연구 및 개발에 사용하기 위해 또한 능히 상업화 응용을 위한 방법 또는 키트로서 공급하기 위해 세포, 유전자 전이 또는 합성 막 시스템으로부터 제거한다. 예는 생분석학적-진단적 시스템 및 치료제의 제조이다.
본 발명의 발현된 융합 단백질은 정체 반응물로서 형질감염된 세포의 세포 표면 상에 나타내고 다른 분자와 특정 상호작용의 분석을 위해 사용될 수 있다. 여기서, 우선 단백질-단백질 상호작용 (예를 들어, 모노- 또는 폴리클로날 항체 파라토프-에피토프 상호작용, 코일된-코일 상호작용 및 약제-의학적, 보다 특히 또한 분자-기계론적 유의성의 많은 특이적 상호작용)이 관심 대상이다. 테트라스파닌 융합 분자는 또한 다른 분자, 예를 들어, 모노- 및 폴리사카라이드, RNA, DNA와의 상호작용 및 보다 특히 천연 물질 및 화학적 물질 라이브러리와 같은 소형 화학적 분자와의 상호작용의 분석을 위해 사용될 수 있다.
세포에서 다중 테트라스파닌 융합 분자 또는 단백질 종의 단백질 변이체는 단지 다양한 상호작용 단백질의 조합 용도와 같이 특정 실험적 제제를 위해 흥미롭다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 또 다른 단백질 도메인 (B)와 매우 특이적으로 상호작용할 수 있는 단백질 도메인 (A)를 발현한다. 여기서, 단백질 도메인 (A)은 본 발명에 따른 융합 단백질의 도메인 (ii)의 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 상응한다.
상기 외부 단백질 도메인은 이어서 다양한 기능성의 추가의 단백질 도메인과 결합될 수 있다. 모든 이들 단백질 도메인 모듈을 위해, 이들이 외인성 유래인 경우 이들이 발현 세포의 카운터-도메인 (A) 상에 특이적으로 결합하고 따라서 단백질 리간드가 다시 결합할 수 있는 이들 부분으로 대체될 수 있어 특정 상호작용에 의해 매개된 다양한 단백질 모듈의 공존이 세포 표면 상에 검출될 수 있는지를 확신할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질, 벡터, 세포 및 막 시스템의 적용의 바람직한 예는 하기에 보다 상세하게 기재된다.
단백질-단백질 상호작용 ( PPI )의 분석
표면 상에 접근 가능한 고정된 단백질은 각각의 단백질의 표면 상에 특정 구조에 의해 추가의 단백질과 특정 접촉을 확립할 수 있다. 이들 추가의 단백질은 서로 인지할 수 있는 동종 및 이종 단백질 복합체 또는 또한 특이적으로 및 표적화된 방식으로 특정 단백질 표면 구조물에 결합할 수 있는 항체 및 단일쇄와 같은 특정 단백질의 단백질 빌딩 블록일 수 있다. 다른 단백질과 특정 상호작용에 진입하는 게놈적으로 코딩된 천연의 단백질은 세포 핵에서의 기능에서 다양한 시토졸 및 막 기능까지의 많은 세포 기능을 수행할 수 있다. 이들 특이적 및 기능적 단백질-단백질 상호작용 (PPI)은 진화 과정 상에서 출현하였고 중요하게 세포 기능의 통합에 관여한다. 표적화된 PPI는 표면과 특정 상호작용을 하는 세포 과정 및 단백질 변이체의 선택에 의해 매개된다. 상기 면역계는 유기체 내 표면의 변화에 대한 민감한 반응을 위해 디자인되고 항체의 표면 상호작용의 최적화 및 매우 짧은 기간에서의 세포독성에 특수화되어 있다. 체액성 면역에서, 대량의 에피토프-특이적 폴리클로날 항체는 단기간에 제조된다. 낙타 (단일쇄), 및 고도로 특이적 단백질 상호작용을 나타내는 다른 천연적으로 존재하는 면역원성 시스템의 특정 단일쇄 항체는 공지되었다.
의학적 연구에서, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 이들 과정은 기술적으로 세포 배양 기술에 의해 수행되었고 이러한 방식으로, 시험관내 특이적 PPI의 제조가 가능하게 되었다.
항체 가공은 에피토프를 특이적으로 인지하여 이들을 항체 분자에 혼입할 수 있는 디스플레이 기술 (리보솜 디스플레이, 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이)에 의해 제조된 인조 파라토프를 사용한다. 본원에 기재된 tANCHOR 시스템의 단백질 유닛에 대한 효율적 수송 기능 및 막에서의 이들의 부착은 고도로 PPI 분석을 위해 적합하다. 추가로, 당과 특이적으로 변형된 단백질은 tANCHOR 기술에 의해 세포 표면 상에 제공될 수 있다.
평균 자격이 부여된 당업자가 특이적 PPI를 동정할 수 있는 검출 시스템은 세포 분류 시스템 (FACS), 형광- 또는 생발광-기반 이미지화 시스템으로서 및 또한 FRET 포토닉 장비로서 상업적으로 제공된다. 질량 분광측정 분석은 또한 분석학적 도구로서 우수한 가능성일 것이다.
사용되는 유일한 세포 시스템은 데이타의 질이 생성되도록 하고 결정적 차이를 만든다. 연쇄 공정의 말기에 수득된 데이타의 질을 한정하는 모든 추가의 공정 단계를 위한 결정적 파라미터인 광학 해상도에 상응한다.
상기 tANCHOR 시스템은 특정 방식으로 생분석학적-진단적 적용을 위해 및 또한 치료제를 위해 디스플레이 기능을 제공하기에 적합하다. 상기 시스템을 사용하여, 단백질 구조의 통합성은 구조적으로 예를 들어, 서로 간에 세포 조절인자 단백질의 PPI에서 결합 도메인의 에피토프일 수 있는 구조적 에피토프를 보유하면서 구조적으로 온전한 상태로 남아 있을 수 있다.
tANCHOR 작제물과 함께 소형 분자의 분석
구조적으로 온전한 단백질 구조에 의해, 추가로 세포 상에 제공된 단백질과 소형 분자에 의한 결합의 상호작용 연구 및 또한 PPI 결합으로부터의 대체를 수행할 수 있다. 소형 분자의 흥미로운 상호작용은 PPI를 방해하는 작용이고 여기서, 특정 단백질 응집체는 소형 분자의 영향하에 다시 용해되고 동정될 수 있다. PPI 분석은 특히 소형 분자 활성 성분의 발견 및 개발을 위해 매우 적합하다.
tANCHOR 기술은 이를 위해 우수한 도구를 제공하고 단백질 발현이 세포 표면 상에 단백질의 동시 부착과 함께 가능하게 한다. 추가의 발현 공급원으로부터 또는 능히 또한 다양한 tANCHOR 분자의 동시 발현을 통해 적합한 단백질 쌍과 연계하여, 이로부터 소형 분자와 단백질 복합체의 상호작용 분석을 위해 시험 시스템으로부터 확립할 수 있다1 ,40-48.
추가로, 세포 표면 상에 위치된 본 발명에 따른 융합 단백질의 분절은 고도로 특이적 절단 분비된 프로테아제 (예를 들어, TEV 프로테아제)의 능히 유도성 동시 발현에 의해 지정된 부위에서 특이적으로 절단될 수 있고 따라서 용액과 접촉하게 된다. 결함 융합 단백질은 막에서 재합성 사이클로 일정하게 대체될 수 있고 이로써 또한 지속적 과발현을 보장한다.
소형 분자 (예를 들어, 2차 대사물을 발현하는 유기체의 추출물로부터)는 따라서 본 발명에 따른 단백질 상에 결합할 수 있고 이들을 표적으로서 동정할 수 있다.
본 발명에 따른 소형 분자 및 제공된 단백질 분절의 수득한 복합체에서, 소형 분자는 세포 표면 상에 고정된 표적 펩타이드 또는 캐리어 펩타이드로서 용액 중에 존재하는 이미 절단된 표적 펩타이드에 특이적으로 결합될 수 있다.
수득한 복합체 및 이로써 소형 분자 및 이들의 결합 파트너는 이어서 질량 분광측정에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 비-펩타이드 소형 분자의 경우에, 이들은 용액 중에 존재하는 복합체의 단리 후 및 예를 들어, 비-특이적 효소적 단백질 용해 등에 의한 펩타이드의 파괴 후 질량 분광측정에 의해 동정될 수 있다.
면역진단학적 장치의 개발 및 제조
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 흥미로운 응용은 항체가 특정 포맷, 예를 들어, tANCHOR로 노출된 에피토프와의 결합을 위해 표준화된 96-웰 포맷으로 시험되어야만 하는 응용이다. 본 발명에 따른 시스템에 의해, 예를 들어, 세포는 96웰 포맷으로 미세역가 플레이트에 씨딩 아웃하고 융합 작제물은 일시적으로 형질감염된 상태로 발현된다. 이것은 또한 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주와 가능하다.
하나의 예로서 tANCHOR 시스템의 사용은 ELISA 실험에서 항체의 검출을 위해 나타낸다 (도 9).
융합 단백질은 세포 표면 상에서 발견되고 거기에 제공된다. 막의 상기 인공 형태는 직접적으로 분석적 및 치료적 응용의 개발 및 제조를 위해 수행될 수 있다.
상기 방식으로, 분석적 시스템이 제조될 수 있고, 여기서, 예를 들어, 개발될 특정 응용에 적당한 환자 코호트의 적합한 혈장은 임상적 연구를 위해 시험될 수 있다. 면역진단학적 장치 및 치료제의 개발을 위해, 보다 특히 또한 동반 진단을 위해, 상기 시스템으로 항체의 존재 및 이들의 결합 성질에 대해 정량적으로 및 정성적으로 환자 혈청을 조사할 수 있다.
추가로, 이들과 함께 대규모로 생분석적 시험 시스템 및 진단적 장치를 제조하기 위해서 및 이들을 대규모로 제조하기 위해 유전자전이 세포가 증식된 미세역가 플레이트 및 다른 포맷을 고정시키고 건조시킬 수 있다.
더욱이, 또한 테트라스파닌 단백질 융합 생성물을 발현하는 유전자전이 미생물의 막을 사용하고 이들을 정제할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 융합 생성물을 함유하는 인조 막은 또한 상기된 바와 같은 상기 용도로 공급될 수 있다.
여기서 절감 비용은 엄청난데 그 이유는 펩타이드 또는 발현되고 정제된 단백질을 사용한 비교적 고가의 코팅이 없기 때문이다.
순수 단백질의 수득
연구 및 개발에서, 및 또한 대량 생산에서, 이들의 발현에 의한 고특이적 활성을 갖는 표적 단백질의 충분한 정량의 수득은 여전히 과제이고 보다 특히 기능성 폴딩 상태 및 능히 변형된 형태로 정제하고 싶은 경우의 과제이다. 이를 위해, 본 발명에 따른 시스템을 사용하는 것이 유리하다. 이것은 크게 이로울 수 있는데 배지에서 세포 외부의 목적하는 표적 단백질의 위치화가 세포내 시토졸 보다 훨씬 덜 복잡한 환경이기 때문이다. 따라서, 집적시키고 단리시키기가 보다 용이하다. 정상적으로 발현된 단백질은 세포내에서 발견되어야만 하고 시토졸 외부로 정제되어야만 한다.
본 발명에 따른 상기 용도의 하나의 구현예에서, tANCHOR을 사용한 발현된 막-부착된 단백질의 절단은 아미노산 서열 모티프에 특이적으로 프로테이나제에 의해 막으로부터 절단 제거될 수 있다. 한편 특이적 프로테아제는 외인성으로 배지에 공급되거나 내인성으로 표적 단백질과 동시 발현될 수 있다. 상기 과정은 아마도 배지내에서 활성화된 서열-특이적 엔도프로테아제의 수행을 요구한다. 단백질의 단리를 목적으로 하는 세포의 지속적 배양에서, 특이적 표적 단백질의 집적은 최종적으로 배지에서 일어나는데 그 이유는 tANCHOR에 의해 방출된 표적 단백질이 단백질의 통합성 상실로 인해 막으로 일정하게 계속 공급되기 때문이다.
치료학적 응용으로서 DNA 백신접종
매우 특이적 표적 세포에서만 이들의 발현이 발견되는 분화-특이적 및/또는 종-특이적 프로모터 (수의과 섹터에서 포함하는)와 연계하여, tANCHOR 시스템은 효율적 막 수송으로 인해 심지어 유기체의 온전한 세포에서도 이종성 유전자 융합 요소들을 발현시킬 수 있다. 이들은 외인성으로 세포에 도입될 수 있다. DNA 또는 RNA 분자와의 접종을 위해, 테트라스파닌 융합 작제물을 직접 세포에 고속으로 "유전자 건(gene gun)" 또는 "입자 건"으로서 공지된 것에 의해 발사하여 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 형질감염된 세포 히트를 유도할 수 있다. 이들 단백질은 이들의 적합성에 대해 이전에 시험되었던 항원 또는 준특이적 항원 결정인자인, 에피토프일 수 있다. tANCHOR 기술은 상기 목적을 위해 적합한 진단적 생검정의 제공 및 또한 치료학적 백신 접종 둘 다를 위해 사용될 수 있다.
DNA는 유전자 입자를 사용한 세포 히트의 게놈으로 통합시킬 수 있고 통합을 통해, 예를 들어, 종양 리프레서 유전자로의 통합을 통해 능히 손상을 유발할 수 있는 것으로 논의된다. 관행은 그러나 본 발명에 따른 유전자 작제물을 수반하는 매우 광범위한 상동성 유전자 영역이 실제로 보다 높고 적절한 통합율을 생성하기 위해 필요함을 교시한다. 상기 요소들은 본 발명에 따른 작제물에 고려되지 않는다. 그러나, 상기 mRNA 백신은 민감한 조절제의 일부에 대한 DNA 백신 접종의 위험과 관련된 상기 연쇄적 연합으로 인해 진행중에 있다. 따라서, 본 발명에 따라 또한 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 진핵 세포에서 발현을 위해 최적화된 mRNA 분자를 생성시키고, 이들을 안정화시키고, 이들을 나노비드 상에 고정화시키거나 이들을 적합한 미세 내지 나노 격실 (바이러스형 입자, VLP)로 팩킹하고 치료학적 응용을 위해 상기 형태로 mRNA를 공급할 수 있다.
테트라스파닌 융합의 특이적 성질 때문에, 이와 같이 발현된 단백질은 발현 세포의 세포막 상으로 수송되고 거기에서 외부로 나타난다.
특이적 아미노산 서열의 노출은 면역계에 의해 인지될 수 있고 상응하는 목적하는 면역 반응 체액성 또는 세포독성 면역 반응을 유발할 수 있다.
단리된 세포 또는 세포막을 사용한 치료학적 응용
추가로 이상적으로 HLA 불화합성 그룹 및 이들과 심지어 생체외 추출 후, 능히 중간 배양 단계 후 또는 동안에 시험관내 자가 세포를 형질감염시키는 것과 관련된 가능한 부작용 면역 반응 때문에 가능하다. tANCHOR 시스템을 기반으로 하는 시험 대상체 (예를 들어, 인간, 그러나 또한 동물)의 DNA 작제물을 사용한 자가 세포의 형질감염은 이들이 자가 또는 자기 백신 접종에 사용될 수 있게 한다. 이와 관련하여, 질에 대해서 시험된 온전한 자가 세포 및 또한 상기 세포로부터 분리된 세포막의 사용이 가능하다. 이들은 예를 들어, 밀도 구배 초원심분리를 통해 수득될 수 있다. 여기서, 총 단백질에 대한 에피토프의 비율이 개선될 수 있고 이로써 면역 반응의 특이적 활성을 증가시키는데 기여한다. 비-특이적 동시 반응 및 자가 면역 반응은 감소된다.
다수의 tANCHOR 작제와 함께 세포에서 능히 동시 발현될 수 있는 발현된 보조제의 조합은 또한 본 발명에 따른 tANCHOR 시스템의 적용에서 개선을 위한 가능성의 범위내에 있는 변이체이다.
물리 화학적 성질, 예를 들어, 막의 용해도를 개선시키는 다양한 단백질의 동시 발현은 백신 접종을 위해 세포로부터 단리된 막을 상당히 개선시킬 수 있다. 천연 보조제는 또한 CD63 항원/에피토프 융합과의 동시 발현을 통해 백신 접종 반응의 개선을 도와줄 수 있다.
본 발명의 추가의 주요 과제는 다음을 포함하는 키트이다:
(i) 상기된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터 및
(ii) 세포 또는 막.
추가로, 의도된 응용에 의존하여, 본 발명에 따른 키트는 예를 들어, 제어 플라스미드, 제어 단백질 또는 유사한 항목 및 다양한 응용을 위한 특수 플라스미드와 같은 다양한 성분들을 함유할 수 있다.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예를 통해 보다 상세하게 기재된다.
도면 및 표
도 1: 본 발명에 따른 융합 및 융합 단백질의 위치화의 도식적 제공
(A) 선행 기술에 따라 융합 및 삽입과 함께 다양한 응용적 문제점 해결 방법을 제공할 수 있는 위치. 본 발명에 따른 시스템은 또한 tANCHOR 시스템으로서 기재되어 있고 4개의 막관통 도메인 (4TM)으로 이루어져 있다. 에피토프 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 TM3 및 TM4 사이에 클로닝될 수 있다. 하나의 예로서, 에피토프 FLAG 태그는 N-말단 상에서 수행되었고 예를 들어, 형광성 단백질 mCherry이 추가로 유전자 융합을 통해 tANCHOR 시스템에서 CD63의 C-말단 상에 형질감염 대조군으로서 수행되었다 (또한 도 2 참조). (B) STATUS QUO를 위해 개발된 tANCHOR 시스템과 함께, 인간 세포에 의해 발현된 에피토프 또는 항원은 명백하게세포질막 상에 위치하고 있는 것으로 발견될 수 있다. tANCHOR 시스템은 고효율로 상기 융합 단백질을 세포질막으로 지시하고 이들을 거기에 부착시킬 수 있다.
도 2a: 예시적 tANCHOR 벡터 시스템의 도식적 구조
제1 예시적 tANCHOR 벡터 시스템은 모듈 다중-발현 벡터 pA4E211 (서열번호 1) 및 상기 벡터의 기능성 유도체 상에 구축한다. 추가로 CD63ΔLEL 성분 (도 2b) 및 또한 FLAG 에피토프의 N-말단 융합부 및 또한 폰텔리나 플루마타 (Pontellina plumata) 기원의 mCherry 또는 GFP와 같은 형광성 리포터 단백질의 C-말단 융합부의 서열 배열에 대한 개요가 추가로 제공된다.
[표 1]
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

도 2b: CD63의 암호화 야생형 (WT) 서열 (서열번호 17)로부터 CD63ΔLEL 서열 (서열번호 3)의 유도.
야생형 CD63 단백질 서열은 238개 아미노산으로 이루어진다. CD63ΔLEL의 제조를 위해, 막관통 도메인 1-3 및 4 (밑줄 쳐진 서열 CD63 TM1-3, CD63 TM4)의 암호화 DNA 서열을 사용하였다. CD63 (ΔLEL)의 LEL에 대한 서열을 함유하지 않는 링커는 단편 CD63 TM1-3과 CD63 TM4 (서열번호 42)에 위치시킨다. 추가로 링커 내 GGGG 구조 모티프를 삽입한다. 아미노산 서열 KLlDTVDLEK (서열번호 46)를 갖는 링커에 대한 유전자 서열 (서열번호 45)은 유전자 서열 CD63ΔLEL과, 형광성 단백질에 대한 유전자 서열 사이에 포함될 수 있다.
표 2 내지 도 2a: 모듈적으로 구조화된 tANCHOR 키트 벡터 시스템, I형 시리즈: pA4E211의 선형 구조화
(0) Absl-Ascl-|FLAG|CDXX:에피토프|리포터|-MauBI-SgrDI-SELECTORS-AsiSI-Pacl
(1) Absl-Ascl-|FLAG|----:------ |---------|-MauBI-SgrDl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(2) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:------- |--------- |-MauBI-SgrDl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(3) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:gp41|--------- |-MauBI-SgrDl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(4) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:eYFP|eGFP-유전자|-MauBI-SgrDl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(5) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:bioPepID|eGFP-유전자|-MauBI-SgrDl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(6) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:bioPoiID|YFP-유전자|-MauBI-SgrDI-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
(7) Absl-Ascl-|FLAG|CD63:bioPoiID|POI-융합l-MauBI-SgrOl-푸로마이신 R -AsiSI-Pacl
tANCHOR CD63 단백질 제공 시스템 (디스플레이 시스템)에 대한 양성 및 음성 대조군 벡터. (0) tANCHOR 기술의 기능적 요소들의 정식 제공: CDXX- (= 다양한 테트라스파닌 단백질 종) CDS (= 암호화 서열) (1) CD63 유전자, 내부 CD63 삽입 및 말단 리포터가 없는 tANCHOR 벡터 (2) CD63 유전자가 있고, CD63 유전자가 있는 tANCHOR 벡터의 내부 CD63 삽입 및 말단 리포터가 없고, 예를 들어, 내부 CD63 삽입으로서 FLAG 태그 에피토프가 있고 어떠한 말단 리포터가 없는 tANCHOR 벡터 (3) CD63 유전자, 및 내부 CD63 삽입으로서 gp41 에피토프 및 또한 CD63 유전자가 있는 tANCHOR 벡터의 말단 리포터가 있는 tANCHOR 벡터 (4) 예를 들어, CD63 유전자 및 내부 CD63 삽입으로서 YFP 에피토프를 갖고 C-말단 리포터 GFP (e. 녹색 형광 단백질 유전자)를 갖는 tANCHOR 벡터. (5) 예를 들어, 내부 CD63 삽입으로서 분석을 위해 사용되는 POI- bioPepID 에피토프 (들) (목적하는 단백질/ 펩타이드 ) 및 C-말단 리포터 eGFP (e. 녹색 형광 단백질 유전자) 및 (6) YFP (황색 형광 단백질 유전자)와 같은 추가의 리포터 유전자를 갖고 관련 실험적 관심 대상의 단백질 융합 ( POl 융합)을 갖는 tANCHOR 벡터. (7) 실험적 디자인에 의존하여 POl 융합 등의 융합을 가짐. bioPeplD는 PeplD 유형의 바이오펩타이드 라이브러리 (EP09000893.9)이다. 이들은 tANCHOR 시스템에 사용될 수 있다. Abs l - Sgr Dl 및 Asc l - Mau BI 및 AsiSI - Pacl은 서로 상용성인 상호 잠겨진 제한 엔도뉴클레아제이고 다중 유전자들의 발현의 다중복합체화를 위한 8량체 인지 서열을 갖는다. 본 발명에 따른 응용의 임의의 다른 실현은 균등하게 특허 문헌에 의해 보호된다.
도 2c: 예시적 벡터 pAE211 _CMV-P- CD63ΔLEL에서 CD63ΔLEL과 조합된 본 발명에 따른 다양한 링커 변이체의 예. 제한 부위 EcoRI, EcoRV, HindIll, BamHI 및 Pstl은 표준 클로닝 방법 또는 무결절성 클로닝을 위한 클로닝 방법에 따른 다중 연속 에피토프 유닛의 삽입을 위해 가능하다. (1) Seq1, 본 발명에 따른 유일한 제한 부위 및 기능 (R 부위) EcoR I 및 EcoR V 및 n*N=스페이서 서열과 관련하여 시험됨 (2) Seq(1) 플러스 His6 -Tag, (3) Seq(1) 플러스 CMyc 에피토프 , (4) Seq (1) 플러스 His6 -Tag 플러스 C- Myc (5) TEV 단백질용해 부위, 발현된 외래 단백질을 선택적으로 수거하기 위해 중앙 클로닝 부위를 포함함. (6) 작제물 (서열번호 39, 40)로 조합된 ( 8)에서 호칭된 해독되고 비해독된 분자 기능성 요소들. (9) 세포 표면으로의 수송을 위한 최소 링커 zur (서열번호 41,42).
도 3: cLSM에 의한 HEK293T 세포의 표면 상에 융합 단백질의 위치화 .
(A) HEK293T 세포는 각각의 벡터로 동시에 형질감염시켰다. 위치화 연구에서, 벡터 pCMV-CD63-YFP는 발현된 야생형 CD63-YFP 단백질에 대한 대조군으로서 사용하였다. tANCHOR 기술을 함유하는 모든 단백질에 대해 (CD63ΔLEL, 도 2b), 세포 표면 상의 주요 위치화는 융합된 리포터 단백질 mCherry에 의해 검출하였다. tANCHOR 융합 없는 mCherry 단백질은 고르게 분포된 세포질성이다. 이것은 세포 표면 상에 어떠한 우세를 보여주지 않는다. 추가로 예를 들어, 막관통 도메인 (gp41ΔTM)을 갖고 갖지 않는 HIV-1의 당단백질 gp41과 같은 추가의 단백질은 표면 상에 제공될 수 있다. (B) 단백질 폴딩은 표면 상의 CFP 및 YEP 위치화에 의해 검사하였다. 형광성 단백질 둘 다는 형광단을 위해 특이적 여기 파장인 405 nm (CFP) 또는 514 nm (YFP)에서 다이오드/아르곤 레이저에 의해 여기 후 검출될 수 있다. (C) 정상적으로 시토졸에 분포된 발현된 단백질 mCherry는 tANCHOR 시스템에 의한 고효율로 포질막으로 지시된다. 상기 방식에서, 수행된 tANCHOR 기술을 사용하여 mCherry는 야생형 CD63-YFP의 경우에서와 같이 HEK293T 세포의 사상위족 (백색 화살표)에서도 검출될 수 있다. 스케일 막대의 길이는 도 3a, 3b에서 10 ㎛이고 도 3c에서 1 ㎛이다.
도 4: 에피토프의 세포외 배향 검사의 도식적 제공
에피토프 배향의 검출은 형질감염된 HEK293T의 표면 상에 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 의해 수행하였다. 상기 단백질은 1차 항체에 의해 결합되었고 골드 입자 (10 nm)와 접합된 2차 항체에 의해 가시화되었다. 모델 에피토프 YFP, CFP, gp41 및 gp41ΔTM의 경우에 결합된 항체는 면역골드 입자에 의해 표면 상에 가시화될 수 있다 (도 5).
도 5a-d: HEK293T 세포의 표면 상에 골드 입자 ( 10 nm )의 SEM 이미지.
형질감염된 HEK293T 세포는 각각 에피토프 배향과 관련하여 조사하였다. 이를 위해, 각각의 에피토프는 특이적 1차 항체와 결합되었고 이들은 이어서 골드-접합된 2차 항체로 검출되었다. tANCHOR 기술을 사용한 모든 에피토프에 대해 세포외 배향이 에피토프로 인한 것일 수 있다. 모든 도면에서 스케일 막대의 길이는 300 nm이다.
도 6: 생성된 tANCHOR 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포의 웨스턴 블롯 분석.
형질감염된 HEK293T 세포는 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 분리된 세포 용해물에서 발현된 단백질은 C-말단 리포터 단백질 mCherry에 대한 1차 항체에 의해 정렬시키고 N-말단 에피토프 FLAG에 대해 검출하였다. 벡터 pmCherry-N1을 사용한 형질감염은 상기 벡터가 FLAG 에피토프에 대한 서열을 함유하지 않고 발현된 단백질의 특이적 검출을 위한 대조군으로서 사용하기 때문에 항-FLAG 항체와의 항온처리와 관련하여 어떠한 밴드를 보여주지 않는다.
도 7: V5- 6xHis 링커를 갖는 내부 융합 부위를 갖는 단백질 수송과 관련하여 추가의 테트라스파닌을 조사하기 위한 작제물의 도식적 제공.
테트라스파닌 슈퍼-패밀리 내 대형 세포외 루프와 독립적으로 단백질 수송의 유효성을 조사하기 위해, CD63ΔLEL을 기초로 하는 tANCHOR 원형 작제물에 따라 3번째 및 4번째 막관통 도메인 사이에 내부 융합 V5-6xHis를 함유하는 발현 벡터를 제조하였다. 내부 융합 V56xHis는 EcoRI과 EcoRV (서열번호 35, 36) 사이에 링커를 함유한다. FLAG 융합은 N-말단에 통합되고; C-말단에서 형광 단백질 YFP는 야생형 테트라스파닌 작제물의 경우에 융합되고 mCherry는 리포터 단백질로서 ΔLEL-V5-6xHis 작제물의 경우에 융합된다.
도 8: HEK293T 세포의 표면 상에 융합 단백질의 위치화 .
HEK293T 세포는 제조된 벡터 (A) pCMV-CD9-YFP/pCMV-CD9ΔLEL-V5-6xHis-mCherry, (B) pCMV-CD81-YFP/pCMV-CD81ΔLEL-V5-6xHis-mCherry, (C) pCMV-CD82-YFP/pCMV-CD82ΔLEL-V5-6xHis-mCherry 및 (D) pCMV-CD151-YFP/pCMV-CD151ΔLEL-V5-6xHis-mCherry로 동시 형질감염시켰다. 모든 발현된 단백질은 세포 표면 상에 리포터 단백질 mCherry의 형광성에 의해 우성으로 검출될 수 있다. 테트라스파닌 CD9, CD81, CD82 및 CD151의 3번째와 4번째 막관통 도메인 (도 7) 사이의 링커 V5-6xHis를 갖는 내부 융합을 함유한 작제물은 형광성 단백질 YEP의 융합을 갖는 상응하는 발현된 야생형 테트라스파닌과 함께 동시 위치화시킨다. 모든 도면에서 스케일 막대의 길이는 10 ㎛이다.
도 9: 항체를 검출하기 위한 tANCHOR 시스템의 적용
(A) 96웰 포맷의 tANCHOR 시스템에 의한 ELISA 실험53의 결과. HEK293T 세포의 세포 표면 상의 V5 에피토프는 HRP-접합된 항-V5 항체로 검출하였다. tANCHOR 단백질의 단백질 발현은 항-V5-HRP 항체에 의해 농도 의존적으로 및 유의적으로 검출될 수 있다. (B) CD63 (서열번호 37, 38)의 3번째 및 4번째 막관통 도메인 사이에 링커 2F5-4E10의 도식적 제공. 링커는 벡터 pCMV-CD63ΔLEL에 도입하였다. (C) HIV-1 중화 항체 항-2F5 및 항-4E10은 형질감염된 HeLa 세포 프라이머의 웰 당 0.6㎍의 일정한 DNA 양으로 2F5 및 4E10 에피토프에 결합시켰다. 결합된 항-2F5 및 항-4E10 항체는 유의적으로 검출될 수 있고, (E) 발현된 융합 단백질 CD63ΔLEL-V5-6xHis 및 또한 CD63ΔLEL-2F5-4E10은 대조군을 위한 HEK293T 세포의 표면 상에 우세하게 위치화될 수 있다. 모든 도면에서 스케일 막대의 길이는 10 ㎛이다.
도 10: 저-세린 및 저-아르기닌 링커의 사용을 통한 효율에서의 증가 .
(A) 사용되는 링커는 DNA 및 아미노산 서열 수준으로 제공된다. 2개의 상이한 링커 (서열번호 41, 42 및 서열번호 43, 44)를 갖는 융합 단백질의 준세포 위치화의 분석은 명백하게 EcoRI/EcoRV 플랭킹 제한 부위의 사용이 HEK293T 세포의 표면으로 고효율의 단백질 수송을 유도하고 융합 단백질은 세포 (B) 상에 형성된 사상위족 (백색 화살표) 상에 검출될 수 있음을 명백하게 보여준다. 모든 도면에서 스케일 막대의 길이는 10 ㎛이다.
1. 위치화 실험의 수행을 위한 CD63-기반 모델 벡터의 제조
CD63-기반 모델 벡터의 제조는 벡터 pCMV-Tag2B (Stratagene)의 사용을 기반으로 하였다. 확립된 클로닝 기술에 의해, 각각의 DNA 서열은 제한 부위에 의해 상기 벡터로 도입되었다39. CD63의 전장 서열 (아미노산 1-238, GenBank 승인 번호 KF998086)을 함유하는 pCMV-CD63-YFP-FLAG49로서 기재된 대조군 벡터 pCMV-CD63-YFP는 프라이머 PA1-01/PA1-02에 의해 사용된 적색 형광 리포터 단백질의 DNA 서열 및 제한 부위 XhoI 및 ApaI에 의해 주형 벡터 pmCherry-N1 (Clonteeh)을 도입하기 위해 사용하였다. 막관통 도메인 TM1-3 (아미노산 1-110 GenBank 승인번호 KF998086)을 갖는 부분적 서열을 프라이머 PA1-03/PA1-04의 도움으로 제한 부위 BamHI 및 Pstl에 의해 도입하고 이후 TM4 (아미노산 201-238, GenBank 승인 번호 KF998086)는 프라이머 PA1-05/PA1-06 및 또한 주형 벡터 pPR3-N-CD63의 도움으로 EcoRV 및 HindIll에 의해 벡터 pCMV-Tag2B로 도입하였다49. 상기 수득한 벡터는 LEL (pCMV-CD63ΔLEL)이 없는 CD63 유전자 서열을 함유한다 (도 2b).
단백질의 단순화된 검출을 위해, 벡터 pCMV-CD63-mCherry의 제한된 mCherry DNA 단편은 제한 부위 Xhol 및 Apal에 의해 제한된 벡터 pCMV-CD63ΔLEL에 연결하였다. 상기 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-CFP 및 pCMV-CD63ΔLEL-YFP는 프라이머 PA1-07/PA1-08 및 또한 주형 벡터 pSCFP3A-C1 또는 pSYFP2-C1의 도움으로 제한 부위 EcoRI 및 EcoRV에 의해 제조하였다50. 동일한 방식으로, 벡터 pCMV-gp41ΔTM 및 pCMV-gp41은 HIV-1의 gp41 단백질의 유전자 서열을 함유하는, 프라이머 PA1-09/PA1-010 및 PA1-09/PA1-11 및 주형 벡터 pNL4-3의 도움으로 제조하였다51.
2. 형질감염 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 ( cLSM )
발현된 융합 단백질의 위치화를 조사하기 위해, 실시예 1에서 제조된 플라스미드는 형질감염 시약에 의해 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 이를 위해 HEK293T (인간 배아 신장 세포 293T) 세포는 ibiTreat 8-웰에서 씨딩 아웃하고 10 % 태아 소 혈청, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 듈베코 변형 이글 배지에서 배양하였다. 대략 50 %의 컨플루언스에서, 세포는 제조업자의 지침에 따라 제조된 플라스미드로 Metafectene®PRO (Biontex)에 의해 형질감염시켰다. 24시간 후 형질감염된 세포는 PBS 중 2 % 파라포름알데하이드에 고정시키고 PBS 중에서 2회 세척하고 0.1 % p-페닐렌디아민 및 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)를 사용하여 PBS 중 90 % 글리세롤에 탑재하여 핵을 가시화하였다. 형질감염된 세포는 준세포 위치화 (도 3a-3c)와 관련하여 역위, 공초점 레이저 현미경 LSM 780 (Carl Zeiss)으로 조사하였다. 여기 및 방출 파장의 세팅은 LSM 780 소프트웨어 ZEN 2010의 스마트 셋업 옵션에 의해 형광성 단백질 CFP, YFP 및 mCherry를 위해 선택하였다.
3. 스캐닝 전자 현미경에 의한 HEK293T 세포의 표면 상에 에피토프의 배향 분석
발현된 단백질은 HEK293T 세포의 세포질막 상에 골드로 면역 마킹된 단백질의 스캐닝 전자 현미경에 의해 검출하였다 (도 4). 이를 위해, PBS 중 2% 파라포름알데하이드 중에서 형질감염시키고 고정화된 세포는 PBS 중에서 3회 세척하였고 0.5 % BSA/0.1 % 젤라틴으로 차단하였다. 단백질 CD63ΔLEL-CFP 및 CD63ΔLEL-YFP는 토끼 항-GFP (ab6556, Abcam)로 항온처리하고, 세척하고 염소 항-토끼의 1차 항체는 접합된 10 nm 골드 입자로 검출하였다. 면역 마킹에 이어서 글루타르알데하이드 (HEPES 0.05 M 중 2.5%)로 후고정화시켰다. 이것에 이어서 스캐닝을 위해 제조하였다. 이를 위해, 샘플은 각각의 경우에 15분 동안 에탄올 단계 (30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 96 %)에서 단계적으로 건조시키고 절대 에탄올 중에서 30분 동안 방치하고 HMDS (헥사메틸디실라잔)로 이전시키고, HMDS를 건조 제거하고 샘플 표면은 증발된 탄소로 코팅시켰다. 골드 입자는 Leo 1530 Gemini 스캐닝 전자 현미경과 함께 백스캐터 검출기 (backscatter detector) (Centaurus)에 의해 가시화하였다. 동일한 방법으로, gp41 단백질은 인간 항-2F5 항체 (National Institutes of Health, NIH) 및 또한 접합된 IgG H&L 10 nm 골드 입자(BBInternational)와 함께 염소 항-인간 항체를 사용하여 검출하였다 (도 5a-5d).
4. 발현된 형광성 단백질의 웨스턴 블롯 분석
단백질 발현을 조사하기 위해, 형질감염된 HEK293T 세포의 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 이를 위해, 벡터를 갖는 HEK293T 세포는 6-웰 포맷에서 제조업자의 지침에 따라 METAFECTENE®PRO를 사용하여 형질감염시켰다. 48시간 후 배지는 완전히 제거하고 100 ㎕의 Laemmli 샘플 완충액 2x 및 세라티아 마르세슨스 (Serratia marcescens (Benzonase®)로부터의 25U의 엔도뉴클레아제를 각각의 6-웰에 첨가하였다. 상기 세포는 용해시키고 약 10분 후, 5 ㎕의 β-머캅토에탄올을 샘플에 첨가하고 95 ℃에서 5분 동안 변성시켰다. 이들 세포 용해물은 SDS-PAGE에 의해 분리하고 PVDF 막으로 이전시키고 마우스 항-mCherry (ab125096, Abcam) 또는 염소 항-FLAG (NB600-314, NovusBio) 항체 및 또한 HRP-접합된 항-마우스/항-염소 항체 (Dako)로 검출하였고 결합된 HRP-접합된 항체는 Pierce ECL 웨스턴 블롯 기질 (Thermo Fisher Scientic)로 검출하였다. PVDF 막은 Roti®-Free 스트리핑 완충액 2.2 플러스 (Carl Roth)로 처리하여 동일한 단백질은 추가의 1차 항체로 검출될 수 있다 (도 6).
5. 테트라스파닌 슈퍼- 패밀리로부터 테트라스파닌 -기반 하이브리드 단백질의 준세포 위치화의 조사
테트라스파닌 슈퍼-패밀리 내 세포 표면 상의 펩타이드 제공을 조사하기 위해, 발현 벡터는 도식 (도 7)에 따라 유전자 합성 54 (ATG:Biosynthetics) 및 또한 표준화된 클로닝 방법에 의해 제조하였다. CD9 (서열번호 19), CD81 (서열번호 21), CD82 (서열번호 23) 및 CD151 (서열번호 25)의 유전자 서열은 벡터 pCMV-CD63-YFP에서 대체하고 CD9ΔLEL-V5-6xHis (서열번호 27), CD81ΔLEL-V5-6xHis (서열번호 29), CD82ΔLEL-V5-6xHis (서열번호 31) 및 CD151ΔLEL-V5-6xHis (서열번호 33)에 대한 유전자 서열은 벡터 pCMV-CD63-mCherry (섹션 1: Generation of CD63-based model vectors for the carrying out of localisation experiments)에서 제한 부위 Notl/Xhol에 의해 CD63의 테트라스파닌 서열 및 야생형 유전자 서열 pCMV-CD9-YFP, pCMV-CD81-YFP, pCMV-CD82-YFP, pCMV-CD151-YFP의 발현 벡터로 대체하고 또한 대형 세포외 루프 (ΔLEL)의 결실 돌연변이체는 내부 링커 V5-6xHis-pCMV-CD9ΔLEL-V5-6xHis-mCherry, pCMV-CD81ΔLEL-V5-6xHis-mCherry, pCMV-CD82ΔLEL-V5-6xHis-mCherry 및 pCMV-CD151ΔLEL-V5-6xHismCherry로 (섹션 2 형질감염 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (cLSM))에 기재된 바와 같이 형질감염시키고, 준세포 위치화와 관련된 cLSM에 의해 조사하였다 (도 8).
6. tANCHOR 시스템의 ELISA 방법에 의한 항체의 검출로의 적용 53
tANCHOR 시스템에 의한 융합 단백질의 고도로 효율적인 표면 발현은 제공된 펩타이드 상에 결합된 항체의 검출을 위해 적합하다. 모델로서 링커 V5-6xHis는 EcoRI 및 EcoRV에 의해 작제물 pCMV-CD9ΔLEL-V5-6xHis-mCherry로부터 단리시키고 (섹션 1: Generation of CD63-based model vectors for the carrying out of localisation experiments)에 기재된 바와 같이 표준 클로닝 방법에 의해 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-mCherry에 삽입하였다. 또한, 에피토프 2F5 및 4E10 (HIV-1)은 프라이머 PA1-12/PA1-13 및 주형 벡터 pNL4-3에 의해 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-mCherry에 삽입하였다 (도 9b). (도 9a) HEK293T의 표면 상에 결합된 항체를 검출하기 위해, HEK293T 세포 및 (도 9c) HeLa 세포를 96웰 포맷에서 씨딩 아웃하고 플라스미드 pCMV-CD63ΔLEL-V5-6xHis-mCherry (도 9a) 및 pCMV-CD63ΔLEL-2F5-4E10-mCherry (도 9c)로 제조업자의 지침에 따라 Metafectene®PRO에 의해 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 4 % 파라포름알데하이드 (Carl Roth)로 20분 동안 고정화시키고 PBS로 2회 세척하고 3 % 소 혈청 알부민 등급 V( Carl Roth) 및 2 % 닭 달걀 알부민 (Carl Roth) 용액으로 밤새 차단시켰다. 이후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 1:3000의 희석에서 희석된 항체 (도 9a) 항-V5-HRP (Invitrogen) 및 (도 9c) 인간 항-2F5/인간 항-4E10 (NIH)과 1시간 동안 항온처리하였다. 도 9c의 경우에, 1차 항체는 1:1000 희석으로 토끼 항-인간 HRP (DAKO)에 의해 결합시키고 ELISA 기질 (TMB 기질 키트, Thermo Fisher Scientific)로서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 사용한 2개의 ELISA 변이체를 제조업자의 지침에 따라 사용하고 OD 값은 96웰 플레이트 삽입을 갖는 MultiscanTM GO 분광측정기(Thermo Fisher Scientific)로 450 nm에서 측정하였다. 융합 단백질의 발현은 (섹션 1: Generation of CD63-based model vectors for the carrying out of localisation experiments)에서와 같이 cLSM에 의해 검출하였다.
7. tANCHOR 시스템에서 플랭킹 EcoR I/ EcoR V 제한 부위의 사용을 통해 인간 세포의 표면으로 단백질의 수송 효율의 증가
tANCHOR 시스템에서 플랭킹 EcoRI/EcoRV 제한 부위의 사용은 세포 표면으로 수송 효율을 증가시킨다. 추가의 제한 부위의 최소 링커 (L Q E F D I G G G G)의 도입은 CD63의 3번째 및 4번째 막관통 도메인 사이에 링커 (G S S G R R S L Q G G G G)에서 세린 및 아르기닌의 해독을 유도한다 (도 10a). 추가의 부위를 갖는 벡터는 유전자 합성54 (ATG:Biosynthtics)을 통해 제조하고 이미 섹션 2 Transfection 및 confocal laser scanning microscopy (cLSM))에 기재된 바와 같이 HEK293T 세포에서 발현시키고 준세포 위치화로 조사하였다 (도 10b).
서열 기록
서열번호 1: pA4E211의 DNA 서열 (CD63ΔLEL)
서열번호 2: CD63ΔLEL의 DNA 서열
서열번호 3: CD63ΔLEL의 단백질 서열
서열번호 4: 프라이머 PA1-01
서열번호 5: 프라이머 PA-02
서열번호 6: 프라이머 PA1-03
서열번호 7: 프라이머 PA1-04
서열번호 8: 프라이머 PA1-05
서열번호 9: 프라이머 PA1-06
서열번호 10: 프라이머 PA1-07
서열번호 11: 프라이머 PA1-08
서열번호 12: 프라이머 PA1-09
서열번호 13: 프라이머 PA1-10
서열번호 14: 프라이머 PA1-11
서열번호 15: 프라이머 PA1-12
서열번호 16: 프라이머 PA1-13
서열번호 17: CD63, GenBank 승인 번호 KF998086
서열번호 18: CD63의 단백질 서열
서열번호 19: CD9의 DNA 서열(GenBank 승인 번호 NM_001769.3)
서열번호 20: CD9의 단백질 서열
서열번호 21: CD81의 DNA 서열 (GenBank 승인 번호 NM_004356.3)
서열번호 22: CD81의 단백질 서열
서열번호 23: CD82의 DNA 서열(GenBank 승인 번호 NM_002231.3)
서열번호 24: CD82의 단백질 서열
서열번호 25: CD151의 DNA 서열 (GenBank 승인 번호 BT007397.1)
서열번호 26: CD151의 단백질 서열
서열번호 27: CD9ΔLEL-V5-6xHis의 DNA 서열
서열번호 28: CD9ΔLEL-V5-6xHis의 단백질 서열
서열번호 29: CD81ΔLEL-V5-6xHis의 DNA 서열
서열번호 30: CD81ΔLEL-V5-6xHis의 단백질 서열
서열번호 31: CD82ΔLEL-V5-6xHis의 DNA 서열
서열번호 32: CD82ΔLEL-V5-6xHis의 단백질 서열
서열번호 33: CD151ΔLEL-V5-6xHis의 DNA 서열
서열번호 34: CD151ΔLEL-V5-6xHis의 단백질 서열
서열번호 35: V5-6xHis 링커의 DNA 서열
서열번호 36: V5-6xHis 링커의 단백질 서열
서열번호 37: 2F5-4E10 링커의 DNA 서열
서열번호 38: 2F5-4E10 링커의 단백질 서열
서열번호 39: 링커 버젼의 DNA 서열 (8)
서열번호 40: 링커 버젼의 단백질 서열(8)
서열번호 41: 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-mCherry에서 링커 (최소 링커 (9))의 DNA 서열
서열번호 42: 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-mCherry에서 링커 (최소 링커 (9))의 단백질 서열
서열번호 43: 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-V2-mCherry에서 링커의 DNA 서열
서열번호 44: 벡터 pCMV-CD63ΔLEL-V2-mCherry에서 링커의 단백질 서열
서열번호 45: CD63ΔLEL과 형광성 단백질 사이의 링커의 DNA 서열
서열번호 46: CD63ΔLEL과 형광성 단백질 사이의 링커의 단백질 서열
본 발명의 바람직한 양상은 하기에 요약된다:
1. 적어도 부분적으로 주형 분자로부터 간접적으로 암호화되거나 완전히 합성인 의도된 인공 아미노산 서열을 갖는 단백질/펩타이드의 사용 방법으로서, 이는
a. 예를 들어, 인간 유전자 CD63, CD9, CD82, CD81, CD151, CD53과 같은 적어도 부분적으로 테트라스파닌의 단백질 부류의 구성원의 서열
b. 또한 적어도 부분적으로 다른 유기체의 서열-상동성 테트라스파닌 및
c. a. 및 b.에 따라, 적합한 시스템에서 이들과 연결된 천연 또는 인공 펩타이드 및 단백질을
i. 하나 이상의 표면으로,
ii. 표면 상으로 이들을 수송하기 위해, 및
iii. 표면에 이들을 단단히 부착시키기 위해
iv. 이들을 표면 상에 영속적으로 제공하기 위해
지시할 수 있는 분자를 생성하는 융합 생성물로 이루어질 수 있는, 방법.
2.
a. 표면 상에 변형된, 예를 들어, 당화된 또는/및
b. 표면 상에 기능성 형태를 채택할 수 있는
단백질 유닛을 생성하기 위해 간접적으로 작용하는, 1에 따른 천연 및/또는 인공 아미노산 조성을 갖는 키메라 단백질 분자.
3. 1 및 2에 있어서, 암호화 주형에 의해 간접적으로 생성되고 암호화 주형 중 적어도 하나의 적어도 부분적 유닛의 융합으로부터 발생되고 다양한 서열의 조합으로부터 생성될 수 있고 능히 집적될 수 있고 단리될 수 있고 능히 또한
a. 생체내
b. 시험관내
가공될 수 있는, 분자.
4. 1, 2 및 3에 있어서,
i. 생체내 재조합적으로, 내부-게놈적으로, (TN7 시스템) 또는
ii. 생체내 염색체외 유전학적 요소 (벡터)에 의해 또는
iii. 시험관내 환형 또는 선형 핵산 분자에 의한 천연 또는 비-천연 핵산 분자 (RNA 등)에 의해 또는
iv. 시험관내 커플링된 전사 또는 해독 시스템
v. 생체내 인공 아미노산의 혼입으로
본 발명에 따라 이들을 생체내 및 시험관내 발현하는 암호화 핵산 분자를 나타내는 방법.
5. 천연 세포 또는 인공 막 시스템의 천연의 세포 막을 나타내는 1 내지 3에 따른 분자를 부착시키기 위한 표면.
6. 1 내지 4에 있어서, 다양한 분자 종 (소분자 (활성-성분 라이브러리, 천연 물질), RNA, 단백질 및 DNA) 및/또는 생검정에서 촉매와 관련하여 구조적, 생분석학적 및 (척추동물-) 진단적 문제점을 해결하고 생분석 시스템 (생검정), 진단 장치, 능히 컴파니온 진단 장치 및/또는 상기 결과 상의 치료요법을 빌딩하기 해 이들의 유전자 생성물, 형질감염된 세포 또는 세포의 일부를 제공하는 분자.
7. 1 내지 4에 있어서, 면역분석학 및 면역진단학 분야에서 문제점을 해결하고, 면역학적 및 진단학적 문제점을 해결하기 위해 및 능히 이에 대한 치료를 빌딩하기 위해 이들의 유전자 생성물, 형질감염된 세포 또는 세포의 일부를 제공하는 분자.
8. 1 내지 4에 있어서, 분석학적 고속 시스템을 개발하거나 이들을 작동하기 위해 이들의 유전자 생성물, 형질감염된 세포 또는 세포의 일부를 제공하는 분자.
9. 1 내지 4에 있어서, 직접적으로 사용되는 면역치료학적 제제 (폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 유사한 가능한 용도를 갖는 인공 분자)를 개발하기 위해 이들의 유전자 생성물, 형질감염된 세포 또는 직접적으로 또는 간접적으로 세포의 일부를 제공하는 분자.
10. 1 내지 3에 있어서, 이들의 유전자 생성물, 형질감염된 세포 또는 세포의 일부를 제공하고 사용 및 활용을 위해 발효/생물생성으로부터 대량으로부터 제3 파티에게 제공되는 분자.
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SEQUENCE LISTING <110> Peter und Traudl Engelhorn-Stiftung zur Foerderung der Lebenswissenschaften <120> SYSTEM FOR PRESENTING PEPTIDES ON THE CELL SURFACE <130> IPA170938-DE <150> DE102015002851.0 <151> 2015-03-05 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4832 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> pA4E211(CD63delLEL); k?stliche Sequenz als Shuttle Vektor von E. coli nach Eukaryotischen Zellen (hier: S?getierzellen) <400> 1 cctcgaggaa ggctactacg cctaagctac cgacaggttg gctgataagt ccccggtctc 60 aaggcgcgcc tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 120 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 180 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 240 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 300 atcatctgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 360 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 420 tcgctattac cacggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 480 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 540 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 600 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 660 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag gaagccgcca cctgctagca 720 atttatagcc accatggatt acaaggatga cgacgataag cccatggcgg tggaaggagg 780 aatgaaatgt gtgaagttct tgctctacgt cctcctgctg gccttttgcg cctgtgcagt 840 gggactgatt gccgtgggtg tcggggcaca gcttgtcctg agtcagacca taatccaggg 900 ggctacccct ggctctctgt tgccagtggt catcatcgca gtgggtgtct tcctcttcct 960 ggtggctttt gtgggctgct gcggggcctg caaggagaac tattgtctta tgattacgtt 1020 tgccatcttt ctgtctctta tcatgttggt ggaggtggcc gcagccattg ctggctatgt 1080 gtttagagat aagctgcaag aattcgagaa tctgtacttt cagtcgaagc ttggatccct 1140 gcagcatcac catcaccatc acgaaaacct ctatttccag agcgaacaga aactgatatc 1200 cgaagaagat ctggatatcg gaggcggagg caaaaatgtg ctggtggtag ctgccgcagc 1260 ccttggaatt gcttttgtcg aggttttggg aattgtcttt gcctgctgcc tcgtgaagag 1320 tatcagaagt ggctacgagg tgatgaaact tatcgatacc gtcgatctcc atatgccagc 1380 catgaagata gaatgcagga ttacaggcac cctgaatggc gtggagttcg agctggtcgg 1440 gggtggagaa ggaacacctg agcagggccg aatgacgaac aagatgaaga gcaccaaagg 1500 agccctgaca tttagcccct atctcctctc tcatgttatg ggctacggct tttatcactt 1560 cgggacttac ccaagcggat atgaaaaccc tttccttcac gccataaaca atgggggtta 1620 caccaacacc cggattgaga aatatgagga cggtggcgtg ttgcatgtct ccttcagcta 1680 cagatatgag gctggtcgcg tgatcggaga ttttaaggtt gtgggcacag gctttccaga 1740 agactccgta atcttcaccg acaagatcat tcggtctaat gccacggtgg agcatcttca 1800 ccctatgggc gataatgtcc tcgtcgggag ctttgccaga actttttcac tgagggatgg 1860 gggatactat tcattcgtcg tagactccca catgcacttt aaatccgcaa tccacccatc 1920 aatcctgcaa aacggagggc ctatgtttgc gttcagacgt gtagaggagc tgcattctaa 1980 cactgaactc ggaatcgttg aataccagca cgctttcaaa actcccattg cattcgctgg 2040 gccctgatca tgagagttta aacataaagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 2100 tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 2160 ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 2220 gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 2280 ggatgcggtg ggctctatgg aaaaaacgcg cgcggatata atataacttc gtataatgta 2340 tgctatacga agttatatat aatgcgtcga cgcactcaac cctatctcgg tctattcttt 2400 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 2460 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg 2520 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2580 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2640 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 2700 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcccgagtg 2760 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 2820 cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 2880 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 2940 tattcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 3000 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gattggagga 3060 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 3120 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3180 gcaatggcaa caacgttgcg taaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3240 caacaattga tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 3300 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg ttctcgcggt 3360 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 3420 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3480 attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3540 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct tatgaccaaa 3600 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc gcgatcgcag cagaccgggg 3660 acttatcagc caacctgtcg ttaattaacc atgtcagccg ttaagtgttc ctgtgtcact 3720 caaaattgct ttgagaggct ctaagggctt ctcagtgcgt tacatccctg gcttgttgtc 3780 cacaaccgtt aaaccttaaa ggctttaaaa gccttatata ttcttttttt tcttataaaa 3840 cttaaaacct tagaggctat ttaagttgct gatttatatt aattgaagag cattatacca 3900 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 3960 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatatgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 4020 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 4080 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 4140 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 4200 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 4260 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 4320 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 4380 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 4440 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 4500 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 4560 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct catattagct 4620 cttcaaattt tattgttcaa acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg 4680 ttagccatga gagcttagta cgttagccat gagggtttag ttcgttaaac atgagagctt 4740 agtacgttaa acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg tactatcaac 4800 aggttgaact gctgatcttc agatcatata at 4832 <210> 2 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetische DNA Sequenz des humanen CD63 Gens (CD63delLEL); Eukaryotische Zellen, hier: S?getierzellen); kodierende Sequenz von SEQ ID NO:1; Synthetisches CD63 - Codonen <220> <221> misc_feature <222> (1)..(330) <223> TM1-TM3 <220> <221> misc_feature <222> (331)..(360) <223> Minimallinker <220> <221> misc_feature <222> (361)..(474) <223> TM4 <400> 2 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300 gccattgctg gctatgtgtt tagagataag ctgcaggaat tcgatatcgg aggaggagga 360 aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 420 attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatg 474 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CD63delLEL; K?stliche Sequenz im Shuttle Vektor - E. coli - Baculovirus/Insekten Zellen; translatierte Sequenz von SEQ ID NO:2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(110) <223> TM1-TM3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(120) <223> Minimallinker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (121)..(158) <223> TM4 <400> 3 Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly 20 25 30 Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu 50 55 60 Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val 85 90 95 Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Leu Gln 100 105 110 Glu Phe Asp Ile Gly Gly Gly Gly Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala 130 135 140 Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met 145 150 155 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-01; konstruktiv s. Patenttext <400> 4 tttttctcga gatggtgagc aagggcgagg 30 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-02; konstruktiv s. Patenttext <400> 5 tttttgggcc catcttgtac agctcgtcca tg 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-03; konstruktiv s. Patenttext <400> 6 ttttttggat ccatggcggt ggaaggagga atg 33 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-04; konstruktiv s. Patenttext <400> 7 tttttctgca gcttatctct aaacaca 27 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-05; konstruktiv s. Patenttext <400> 8 tttttgatat cggaggagga ggaaaaaatg tgctgg 36 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-06; konstruktiv s. Patenttext <400> 9 ttttttaagc ttcatcacct cgtagccact tct 33 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-07; konstruktiv s. Patenttext <400> 10 tttttgaatt catggtgagc aagggcgagg a 31 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-08; konstruktiv s. Patenttext <400> 11 tttttgatat cctttctgag tccggacttg t 31 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-09; konstruktiv s. Patenttext <400> 12 tttttgaatt cctgacggta caggccagac 30 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-10; konstruktiv s. Patenttext <400> 13 tttttgatat cgttaaacca attccacaaa c 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-11; konstruktiv s. Patenttext <400> 14 tttttgatat cctgcctaac tctattcact 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-12; konstruktiv s. Patenttext <400> 15 tttttgaatt cattgaagaa tcgcaaaacc 30 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PA1-13; konstruktiv s. Patenttext <400> 16 tttttgatat cttttatata ccacagccaa t 31 <210> 17 <211> 714 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Startkodon <400> 17 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300 gccattgctg gctatgtgtt tagagataag gtgatgtcag agtttaataa caacttccgg 360 cagcagatgg agaattaccc gaaaaacaac cacactgctt cgatcctgga caggatgcag 420 gcagatttta agtgctgtgg ggctgctaac tacacagatt gggagaaaat cccttccatg 480 tcgaagaacc gagtccccga ctcctgctgc attgatgtta ctgtgggctg tgggattaat 540 ttcaacgaga aggcgatcca taaggagggc tgtgtggaga agattggggg ctggctgagg 600 aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 660 attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatg 714 <210> 18 <211> 238 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(238) <223> CD63; translatierte Sequenz zu SEQ ID NO:17 (Genbank Accession No: KF998086) <400> 18 Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly 20 25 30 Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu 50 55 60 Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val 85 90 95 Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val Met 100 105 110 Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro Lys 115 120 125 Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe Lys 130 135 140 Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser Met 145 150 155 160 Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asp Val Thr Val Gly 165 170 175 Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys Val 180 185 190 Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala 210 215 220 Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met 225 230 235 <210> 19 <211> 771 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> Startkodon <400> 19 gctagcgcgg ccgccaccat ggattacaag gatgacgacg ataagagccc gggcggatcc 60 atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 120 ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 180 accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 240 tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 300 gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 360 gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 420 gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 480 gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 540 cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 600 tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 660 atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 720 atccgcagga accgcgagat ggtcaagctt atcgataccg tcgacctcga g 771 <210> 20 <211> 257 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Startmethionin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(257) <223> CD9; translatierte Sequenz zu SEQ ID NO:19 (Genbank Accession No: NM_001769.3) <400> 20 Ala Ser Ala Ala Ala Thr Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr 20 25 30 Leu Leu Phe Gly Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val 35 40 45 Leu Ala Ile Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile 50 55 60 Phe Glu Gln Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val 65 70 75 80 Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu 85 90 95 Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe 100 105 110 Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile 115 120 125 Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe 130 135 140 Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg 145 150 155 160 Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala 165 170 175 Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val 180 185 190 Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val 195 200 205 Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala 210 215 220 Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala 225 230 235 240 Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu 245 250 255 Glu <210> 21 <211> 795 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (18)..(21) <223> Startkodon <400> 21 gctagcgcgg ccgccaccat ggattacaag gatgacgacg ataagagccc gggcggatcc 60 atgggagtgg agggctgcac caagtgcatc aagtacctgc tcttcgtctt caatttcgtc 120 ttctggctgg ctggaggcgt gatcctgggt gtggccctgt ggctccgcca tgacccgcag 180 accaccaacc tcctgtatct ggagctggga gacaagcccg cgcccaacac cttctatgta 240 ggcatctaca tcctcatcgc tgtgggcgct gtcatgatgt tcgttggctt cctgggctgc 300 tacggggcca tccaggaatc ccagtgcctg ctggggacgt tcttcacctg cctggtcatc 360 ctgtttgcct gtgaggtggc cgccggcatc tggggctttg tcaacaagga ccagatcgcc 420 aaggatgtga agcagttcta tgaccaggcc ctacagcagg ccgtggtgga tgatgacgcc 480 aacaacgcga aggctgtggt gaagaccttc cacgagacgc ttgactgctg tggctccagc 540 acactgactg ctttgaccac ctcagtgctc aagaacaatt tgtgtccctc gggcagcaac 600 atcatcagca acctcttcaa ggaggactgc caccagaaga tcgacgacct cttctccggg 660 aagctgtacc tcatcggcat tgctgccatc gtggtcgctg tgatcatgat cttcgagatg 720 atcctgagca tggtgctgtg ctgtggcatc cggaacagct ccgtgtacaa gcttatcgat 780 accgtcgacc tcgag 795 <210> 22 <211> 265 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Startmethionin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(265) <223> CD81; translatierte Sequenz zu SEQ ID NO: 21 (Genbank Accession No: NM_004356.3) <400> 22 Ala Ser Ala Ala Ala Thr Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Met Gly Val Glu Gly Cys Thr Lys Cys Ile Lys Tyr 20 25 30 Leu Leu Phe Val Phe Asn Phe Val Phe Trp Leu Ala Gly Gly Val Ile 35 40 45 Leu Gly Val Ala Leu Trp Leu Arg His Asp Pro Gln Thr Thr Asn Leu 50 55 60 Leu Tyr Leu Glu Leu Gly Asp Lys Pro Ala Pro Asn Thr Phe Tyr Val 65 70 75 80 Gly Ile Tyr Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala Val Met Met Phe Val Gly 85 90 95 Phe Leu Gly Cys Tyr Gly Ala Ile Gln Glu Ser Gln Cys Leu Leu Gly 100 105 110 Thr Phe Phe Thr Cys Leu Val Ile Leu Phe Ala Cys Glu Val Ala Ala 115 120 125 Gly Ile Trp Gly Phe Val Asn Lys Asp Gln Ile Ala Lys Asp Val Lys 130 135 140 Gln Phe Tyr Asp Gln Ala Leu Gln Gln Ala Val Val Asp Asp Asp Ala 145 150 155 160 Asn Asn Ala Lys Ala Val Val Lys Thr Phe His Glu Thr Leu Asp Cys 165 170 175 Cys Gly Ser Ser Thr Leu Thr Ala Leu Thr Thr Ser Val Leu Lys Asn 180 185 190 Asn Leu 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100 105 110 Tyr Phe Ile Leu Leu Leu Ile Ile Phe Leu Leu Glu Ile Ile Ala Gly 115 120 125 Ile Leu Ala Tyr Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Phe Gly Lys 130 135 140 Gly Pro Arg Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His Asp Ile Gly Gly 165 170 175 Gly Gly Leu Arg Val Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Cys Val 180 185 190 Gln Val Phe Gly Met Ile Phe Thr Cys Cys Leu Tyr Arg Ser Leu Lys 195 200 205 Leu Glu His Tyr Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu 210 215 220 <210> 35 <211> 102 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V5-6xHis-Linker in Tetraspanin delLEL-V5-6xHis Konstrukten <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (97)..(102) <223> EcoRV Schnittstelle <400> 35 gaattcggaa agggcccgcg gttcgaaggt aagcctatcc ctaaccctct cctcggtctc 60 gattctacgc gtaccggtca tcatcaccat caccatgata tc 102 <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> V5-6xHis-Linker in Tetraspanin delLEL-V5-6xHis Konstrukten: translatierte Sequenz <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(23) <223> V5-Epitop <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> 6xHis-Epitop <400> 36 Glu Phe Gly Lys Gly Pro Arg Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro 1 5 10 15 Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His 20 25 30 Asp Ile <210> 37 <211> 126 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 2F5-4E10-Linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (121)..(126) <223> EcoRV Schnittstelle <400> 37 gaattcattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta 60 gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa 120 gatatc 126 <210> 38 <211> 42 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 2F5-4E10-Linker: translatierte Sequenz <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(24) <223> 2F5-Epitop <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(33) <223> 4E10-Epitop <400> 38 Glu Phe Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Glu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile 20 25 30 Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Asp Ile 35 40 <210> 39 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker version (8) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (7)..(26) <223> TEV-Proteolyse-I <220> <221> misc_feature <222> (27)..(33) <223> HindIII Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (34)..(39) <223> BamHI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (40)..(46) <223> PstI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (46)..(63) <223> His6-Tag <220> <221> misc_feature <222> (64)..(84) <223> TEV-Proteolyse-II <220> <221> misc_feature <222> (85)..(97) <223> c-Myc-Epitope1 <220> <221> misc_feature <222> (103)..(114) <223> c-Myc-Epitope2 <220> <221> misc_feature <222> (115)..(120) <223> EcoRV Schnittstelle <400> 39 gaattcgaga atctgtactt tcagtcgaag cttggatccc tgcagcatca ccatcaccat 60 cacgaaaacc tctatttcca gagcgaacag aaactgatat ccgaagaaga tctggatatc 120 <210> 40 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker version (8), translatierte Sequenz <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(8) <223> TEV-Proteolysis-I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(21) <223> His6-Tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(28) <223> TEV-Proteolysis-I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(33) <223> c-Myc-Epitope1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(38) <223> c-Myc-Epitope2 <400> 40 Glu Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Lys Leu Gly Ser Leu Gln His 1 5 10 15 His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Gln Lys Leu 20 25 30 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp Ile 35 40 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Linker im Vektor pCMV-CD63delLEL-mCherry (Minimallinker (9)) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> PstI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (7)..(12) <223> EcoRI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (13)..(18) <223> EcoRV Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> 4x Glycin <400> 41 ctgcaggaat tcgatatcgg aggagga 27 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Linker im Vektor pCMV-CD63delLEL-mCherry: translatierte Sequenz (Minimallinker (9)) <400> 42 Leu Gln Glu Phe Asp Ile Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Linker im Vektor pCMV-CD63delLEL-V2-mCherry <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> BamHI Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (18)..(23) <223> BglIII Schnittstelle <220> <221> misc_feature <222> (24)..(29) <223> PstI Schnittstelle <400> 43 ttggatccag cggccgcaga tctctgcagg gaggcggagg c 41 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Linker im Vektor pCMV-CD63delLEL-V2-mCherry: translatierte Sequenz (Linker) <400> 44 Gly Ser Ser Gly Arg Arg Ser Leu Gln Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker zwischen CD63delLEL und Fluoreszenzprotein <400> 45 aagcttatcg ataccgtcga cctcgagaaa 30 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker zwischen CD63delLEL und Fluoreszenzprotein; translatierte Sequenz <400> 46 Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu Lys 1 5 10

Claims (21)

  1. 제1 도메인 (i), 제2 도메인 (ii) 및 제3 도메인 (iii)을 포함하는 융합 단백질로서, 여기서, 상기 제2 도메인은 제1 도메인과 제3 도메인 사이에 배치되고, 여기서,
    (i) 막관통 도메인 1 (TM1), 소형 세포외 루프 (SEL), 막관통 도메인 2 (TM2), 소형 세포내 루프 (SIL) 및 막관통 도메인 3 (TM3)을 포함하는 테트라스파닌의 부분적 서열을 포함하거나 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 포함하고,
    (ii) 테트라스파닌의 대형 세포외 루프 (LEL)와 관련하여 전체 길이에 걸쳐 70 % 미만의 서열 동일성을 갖는, 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하고,
    (iii) 막관통 도메인 4 (TM4)을 포함하는 테트라스파닌의 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 유연한 링커가 제1 도메인과 제2 도메인 사이에 및/또는 제2 도메인과 제3 도메인 사이에 배치되는, 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 도메인 (ii)이 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 C- 및/또는 N-말단으로 배치된, 테트라스파닌의 LEL의 하나 이상의 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인 (ii)이 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 C- 및/또는 N-말단으로 배치된, 하나 이상의 프로테아제 인지 서열을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 에피토프, 단백질, 항원 또는 효소로부터 선택되는, 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 N-말단 상에 제4 도메인 (iv) 및/또는 상기 융합 단백질의 C-말단 상에 제5 도메인 (v)을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제4 및/또는 제5 도메인이 태그, 예를 들어, 친화성 태그 또는 형광성 태그를 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  9. 바람직하게는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 제8항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 제8항에 따른 핵산 분자 또는 제9항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포, 바람직하게는 예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포인, 세포.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 추가의 발현 벡터로 추가로 형질전환되거나 형질감염되는, 세포.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포로부터 수득되는 막 제제.
  14. 막 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제8항에 따른 핵산 분자 또는 제9항에 따른 벡터를 포함하는, 합성 막 시스템.
  15. 세포 표면 상에 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제시하는 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하는 단계,
    (b) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 막 상에 소정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 부착시키기 위한 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 막을 제공하는 단계 및
    (b) 융합 단백질의 부착이 막에서 일어나는 조건하에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질과 상기 막을 접촉시키거나, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이 상기 막에서 발현되고 부착되는 조건하에서 제8항에 따른 핵산 또는 제9항에 따른 벡터를 상기 막과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. - 펩타이드의 상호작용 파트너를 스크리닝하는 방법에서,
    - 펩타이드와 상호작용 파트너의 상호작용 연구를 위한 방법에서,
    - 펩타이드의 제조를 위한 방법에서,
    - 항체 제조를 위한 방법에서 면역화 시약으로서, 또는
    - 검출 시약으로서,
    제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제13항에 따른 막 제제 또는 제14항에 따른 합성 막 시스템의 용도.
  18. 백신으로서 또는 의약으로서 사용하기 위한 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포, 제13항에 따른 막 제제 또는 제14항에 따른 합성 막 시스템.
  19. 제1 서열 분절 (i), 제2 서열 분절 (ii) 및 제3 서열 분절 (iii)을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서, 상기 제2 서열 분절은 제1 서열 분절과 제3 서열 분절 사이에 배치되고, 여기서,
    (i) 막관통 도메인 1 (TM1), 소형 세포외 루프 (SEL), 막관통 도메인 2 (TM2), 소형 세포내 루프 (SIL) 및 막관통 도메인 3 (TM3)을 포함하는 테트라스파닌의 부분적 서열, 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 암호화하고,
    (ii) 다중 클로닝 부위를 포함하고,
    (iii) 막관통 도메인 4 (TM4)를 포함하는 테트라스파닌의 부분적 서열 또는 전체 길이에 걸쳐 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 이와 상동성인 서열을 암호화하는, 핵산 분자.
  20. 제19항에 따른 핵산 분자를 포함하고, 바람직하게는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되는 벡터.
  21. (i) 제8항 또는 제19항에 따른 핵산 분자 또는 제9항 또는 제20항에 따른 벡터 및
    (ii) 세포 또는 막
    을 포함하는 키트.
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