KR20240013295A - 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 - Google Patents

종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20240013295A
KR20240013295A KR1020247002478A KR20247002478A KR20240013295A KR 20240013295 A KR20240013295 A KR 20240013295A KR 1020247002478 A KR1020247002478 A KR 1020247002478A KR 20247002478 A KR20247002478 A KR 20247002478A KR 20240013295 A KR20240013295 A KR 20240013295A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
population
tils
seq
cells
Prior art date
Application number
KR1020247002478A
Other languages
English (en)
Inventor
아난드 비이라파트란
아이슈와라 고쿨다스
브라이언 라비노비치
미카엘 티. 롯체
Original Assignee
이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. filed Critical 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20240013295A publication Critical patent/KR20240013295A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70528—CD58
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/065—Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

일부 실시양태에서, 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포, 예컨대 MOLM-14 또는 EM-3 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL 및/또는 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고 골수성 세포를 CD86 및 4-1BBL 및/또는 OX40L 단백질을 발현하도록 형질도입하는 것인, 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 관한 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, aAPC로 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법, 및 aAPC로의 확장 후에 TIL을 사용하여 암을 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 {ENGINEERED ARTIFICIAL ANTIGEN PRESENTING CELLS FOR TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTE EXPANSION}
관련 출원에 대한 상호-참조
이 국제 출원은 2017년 4월 5일에 출원된 미국 가출원 제62/481,831호, 2017년 3월 22일에 출원된 미국 가출원 제62/475,053호, 2016년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/438,600호, 및 2016년 10월 31일에 출원된 미국 가출원 제62/415,274호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이들의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
종양 침윤 림프구의 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)가 개시된다.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 입양 자가 전달을 사용한 부피가 큰, 난치성 암의 치료는 빈약한 예측을 갖는 환자에 대한 요법에 대한 강력한 접근법을 대표한다. 문헌 [Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 다수의 TIL은 성공적인 면역요법에 요구되며, 왕성하고 신뢰성 있는 프로세스가 상업화에 필요하다. 이는 세포 확장과 관련된 기술적, 보급적, 및 조절적 쟁점 때문에 달성하는 데 있어 도전과제였다. IL-2-기재 TIL 확장, 이어서 "급속 확장 프로세스" (REP)는 그의 속도 및 효율 때문에 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되었다. 문헌 [Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54]; [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57]; [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39]; [Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41]; [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 그러나, REP는 14-일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 초래할 수 있지만, 이는 공급자 세포로서 종종 다수의 공여자로부터의 큰 과량 (예를 들어, 200배)의 방사선조사된 동종이형 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT-3) 및 고용량의 IL-2를 요구한다. 문헌 [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 그들의 높은 성능에도 불구하고, PBMC는 요구되는 다수의 동종이형 PBMC, 다수의 건강한 공여자로부터의 백혈구성분채집술에 의해 PBMC를 얻을 필요성, 냉동보존 후의 PBMC 생존성의 결과적인 공여자간 가변성 및 가변적인 TIL 확장 결과, 하류 환자 감염을 유발하는 비검출된 바이러스 병원체의 위험, 및 무균성 및 품질을 확인하고 (바이러스 오염물 시험을 포함함), 확장 특성을 시험하기 위한 각각의 개별적 공여자 세포 생성물의 광범위하고 고비용의 실험실 시험을 비롯한 다수의 단점을 갖는다.
불행하게도, TIL의 확장에 사용하기 위해 개발된 aAPC는 PBMC와 비교할 경우, 투입 TIL의 표현형적 특성의 변경, 뿐만 아니라 빈약한 확장 성능 및/또는 확장 결과에 있어서 높은 가변성을 비롯한 빈약한 성능에 시달렸다. aAPC로서 사용하기 위해 순응될 수 있는 다수의 잠재적 세포 및 적합한 후보를 확인하는 비예측가능성 때문에, 지금까지의 폴리클로날 TIL에 대한 aAPC의 개발의 초점은 단지 널리 확립된 K562 세포주에 있었다. 문헌 [Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209]. 예를 들어, 4-1BBL (CD137L)을 발현하도록 변형된 K562 세포를 REP전 배양 (그러나, REP 배양은 아님)에서 시험하여 종양 소화로부터의 TIL 확장의 향상을 측정하였지만, PBMC는 여전히 TIL 확장을 얻기 위해 K562 세포와 함께 사용될 것이 요구되었다. 문헌 [Friedman, et al., J. Immunother. 2011, 34, 651-661]. CD64, CD86, 및 4-1BBL을 발현하도록 변형된 다른 조작된 K562 세포를 시험하였고, 기껏해야 PBMC에 필적한, 및 필시 PBMC 미만인 TIL 확장을 달성하였으며, 또한 덜 바람직한 CD8+/CD4+ T 세포 비로의 폴리클로날 TIL 표현형의 왜곡에 시달렸다. 문헌 [Ye, et al., J. Translat. Med. 2011, 9, 131]. 최근, CD86, 4-1BBL (CD137L), 고친화도 Fc 수용체 (CD64) 및 막-결합된 IL-15를 발현하도록 변형된 K562 세포는 또한 PBMC 공급자에 비해 등가의 수로 TIL을 전파한 것으로 나타났지만 (REP후), 막-결합된 IL-15의 추가의 복잡성을 갖는다. 문헌 [Forget, et al., J. Immunother. 2014, 37, 448-60]. 개발된 다른 시스템은 중요한 공동자극 분자가 결여되었거나, 비바람직한 T 세포 표현형적 왜곡을 초래하였거나, 추가의 인터루킨 (예컨대 IL-21)을 요구하였다. 문헌 [Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209]. 전체적으로, K562 변형된 aAPC는 허용되는 가변성을 갖는 TIL의 일관된 확장을 제공하는 것으로 나타나지 않은 반면, 또한 전체적인 확장 세포 카운트를 비롯한 다른 척도에 있어서는 PBMC보다 더 양호하게 수행하였다. K562 세포 외의 대안적인 aAPC는 다른 세포 확장 방법에서 성공적이었지만, TIL을 구성하는 세포의 고유한 폴리클로날 하위세트를 갖는 PBMC와 동일한 성능을 달성하지 않았다. 문헌 [Maus, et al., Nat. Biotechnol. 2002, 20, 143-148]; [Suhoski, et al., Mol. Ther. 2007, 15, 981-988].
MOLM-14 인간 백혈병 세포주는 재발된 급성 단핵구 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 확립되었으며, 초기 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시하였다: CD4, CD9, CD11a, CD13, CD14, CD15, CD32, CD33, CD64, CD65, CD87, CD92, CD93, CD116, CD118, 및 CD155. 문헌 [Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77]. MOLM-14의 추가의 표현형적 특징화는 보다 높은 수준의 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, CD58, 및 보다 낮은 수준의 CD86을 밝혀내었다. MOLM-14 세포 및 가깝게 관련된 MOLM-13 세포는 종양 면역요법 적용을 위한 세포의 확장을 위한 유용한 aAPC로서 이전에 보고되지 않았다.
EM-3 인간 세포주는 필라델피아 염색체-양성 CML을 갖는 환자의 골수로부터 확립되었다. 문헌 [Konopka, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4]. EM-3 세포 및 가깝게 관련된 EM-2 세포주는 종양 면역요법 적용을 위한 세포의 확장을 위한 유용한 aAPC로서 이전에 보고되지 않았다. EM-3 세포의 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시한다: CD13, CD15, 및 CD33.
본 발명은 CD86 (B7-2), 4-1BBL (CD137L), 및 OX40L (CD134L)을 비롯한 추가의 공동자극 분자로 형질도입된 MOLM-13, MOLM-14, EM-3, 및 EM-2 세포를 비롯한 조작된 골수성 계통 세포가 마스터 세포 뱅크로부터 효율적으로 생산될 수 있는 aAPC를 사용하는 유익을 갖고, 최소의 가변성, 감소된 비용을 갖고, PBMC의 공급원으로서 인간 혈액 샘플에 대한 의존성이 없는 다수로의 TIL의 우수하고 매우 효율적인 확장을 제공한다는 예상치 않은 발견을 제공한다. CD86 및 4-1BBL은 T 세포 활성화를 위한 공동자극 신호를 제공하는 공동자극 분자이다. 추가의 공동자극 분자로 형질도입된 MOLM-14, MOLM-13, EM-3, 및/또는 EM-2 세포는 예를 들어, 암 면역요법 및 다른 요법에 사용하기 위한 TIL의 확장에 유용하다.
발명의 요약
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다.
한 실시양태에서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질의 각각은 인간 단백질이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 aAPC와 접촉된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC를 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, CD86을 코딩하는 핵산 분자는 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자와 상이한 바이러스 벡터 또는 동일한 바이러스 벡터에 포함될 수 있음이 명백할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 TIL의 집단을 약 3000 IU/mL의 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 aAPC와 접촉된 T 세포를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 막-결합된 IL-15가 본질적으로 없는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 EM-3 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 EM-2 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, CD86 단백질이 서열식별번호 (SEQ ID NO): 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, CD86을 코딩하는 핵산 분자가 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자가 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하는 aAPC와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, TIL의 집단이 확장되는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하는, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, APC의 집단이 TIL의 집단을 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 EM-3 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 EM-2 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 TIL 상의 적어도 2종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 2종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 2종의 공동-자극 리간드가 CD86 및 4-1BBL을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고;
골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입된 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)가 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입된 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고, 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고; 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고; 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비는 약 1 대 300이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하고,
골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-2 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 환자를 치료하는 단계;
(e) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
(f) 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 고-용량 IL-2 처방으로 환자를 치료하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 환자를 치료하는 단계;
(e) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
(f) 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 고-용량 IL-2 처방으로 환자를 치료하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고;
추가로, TIL의 집단이 비-골수절제 림프구고갈 처방과 조합으로 환자에게 투여하기 위한 것이고, 비-골수절제 림프구고갈 처방이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것인 시클로포스파미드, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것인 플루다라빈을 포함하고, 추가로, TIL의 집단이 고-용량 IL-2 처방과 조합으로 투여하기 위한 것이고, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여하기 위한 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, TIL의 집단은 고-용량 IL-2 처방 전에 및 비-골수절제 림프구고갈 처방에 후속적으로 투여하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다.
한 실시양태에서, TIL의 집단은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 초기 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 초기 확장 및/또는 급속 확장이 기체-투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 80 내지 1 대 400인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 80 내지 1 대 400인 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비는 약 1 대 300이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 aAPC를 포함하고, 어플리케이터 및 키트의 사용을 위한 지시 자료를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 aAPC가 렌티바이러스 벡터 (LV)를 사용하여 형질도입된 MOLM-14 세포 또는 EM-3 세포를 포함하고, LV가 알려진 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 알려진 공동-자극 분자와 상기 공동-자극 리간드의 결합이 T 세포를 자극하고 확장시키는 것인, 알려진 공동-자극 분자를 발현하는 종양 침윤 림프구의 증식을 특이적으로 유도하기 위한 키트를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 내인성 CD16 Fc 수용체를 발현하는 복수의 마우스 비만세포종 P815 세포를 제공하며, 여기서, P815 세포가 향상된 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불이 루시페라제에 기초한 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 것인 단계;
(b) 복수의 P815 세포 및 종양 침윤 림프구 (TIL)를 OKT-3과 함께 및 없이 공동-배양하여 T 세포 수용체 (TCR) 활성화 (특이적 살해) 또는 림포카인 활성화된 살해 (LAK, 비-특이적 살해)를 평가하는 단계;
(c) 4시간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 루시페린을 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하는 단계; 및
(f) 퍼센트 세포독성 및 생존을 계산하는 단계
를 포함하는, TIL의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
상기 요약, 뿐만 아니라 하기 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 방사선조사된 동종이형 PBMC 공급자 세포를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. 각각의 TIL 주 (M1015T 및 M1016T) (1.3 × 105개의 세포)를 T25 플라스크에서 7일 동안 46가지 상이한 방사선조사된 공급자 (1.3 × 107개의 세포), IL-2 (3000 IU/mL) 및 OKT-3 (30 ng/mL)과 공동-배양하였다. TIL에 대한 배수 확장 값을 제7일에 계산하였다. 도면은 시험된 46가지 상이한 공급자 로트로의 별개의 자극 실험에서 2가지 TIL 주에 대한 배수 확장의 수를 나타내며, PBMC 공급자 세포를 사용한 확장 결과의 가변성을 강조한다.
도 2는 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 3은 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 4-1BBL PCRP (폴리머라제 연쇄 반응 생성물) 부분의 도해를 예시한다.
도 4는 pLV430G 인간 CD86 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 5는 pLV430G 인간 CD86 벡터의 CD86 PCRP 부분의 도해를 예시한다.
도 6은 pDONR221 인간 CD86 공여자 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 7은 pDONR221 인간 4-1BBL 공여자 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 8은 pLV430G 비어있는 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 9는 pDONR221 비어있는 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 10은 렌티바이러스 제조를 위한 psPAX2 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
도 11은 렌티바이러스 제조를 위한 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
도 12는 조작된 MOLM-14 세포 상의 CD137 및 CD86의 발현을 확인시켜 주는, 렌티바이러스 형질감염 전의 ("비형질감염된") 및 형질감염 후의 ("형질감염된") MOLM-14 세포에 대한 유동 세포측정 실험의 결과를 예시한다.
도 13은 TIL 로트 M1032-T2에 대한 방사선조사된 모 비변형된 MOLM-14 세포 ("모 MOLM14"), 조작된 MOLM-14 세포 (CD86/4-1BBL, "조작된 MOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("공급자")를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. TIL을 PBMC 공급자 또는 모 또는 조작된 MOLM14 세포와 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제6일 및 제11일에 카운팅하고, 분할하였다. 각각의 점은 각각 제0일, 제6일, 제11일 및 제14일에 측정된 세포 수를 나타낸다. 로그 스케일이 사용된다.
도 14는 선형 스케일을 사용하여 나타낸, 도 13에 나타내어진 바와 같은 결과를 예시한다.
도 15는 로그 스케일을 사용한, 도 13에 주어진 바와 같은 다른 파라미터를 갖는 TIL 로트 M1033-T6에 대한 결과를 예시한다.
도 16은 선형 스케일을 사용하여 나타낸, 도 14에 나타내어진 바와 같은 결과를 예시한다.
도 17은 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 조작된 MOLM-14 세포 ("TIL + 조작된 MOLM14 (CD86/41BB) + OKT3") 또는 방사선조사된 PBMC 공급자 ("TIL + 공급자 + OKT3")를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. TIL을 PBMC 공급자 또는 조작된 MOLM-14 세포 (aMOLM14)와 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제6일 및 제11일에 카운팅하고, 분할하였다. 각각의 점은 제14일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 18은 TIL (2 × 104개)을 24-웰 G-렉스 (G-Rex) 플레이트의 웰에서 상이한 비 (1:10, 1:30, 및 1:100, 각각 "10", "30", 및 "100"으로 나타냄)의 모 MOLM-14 ("MOLM14") 세포, CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("PBMC+")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양한 실험의 결과를 예시한다. 대조군은 단지 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 사용하여 수행하였다 ("PBMC-"). 각각의 조건은 삼중으로 배양하였다. 배양물을 제4일 및 제7일에 신선한 배지 및 IL-2로 공급하였다. 생존성 세포를 제7일에 카운팅하였다. 여기에 제시된 막대 그래프는 제11일에 카운팅된 생존성 세포 수의 평균 더하기 표준 편차 (SD)를 나타낸다. p-값은 스튜던트 't' 검정에 의해 계산하였다.
도 19는 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:30, 1:100, 및 1:300, 각각 "30", "100", 및 "300"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 생존성 세포를 제11일에 카운팅하고, 플롯팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 20은 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:50, 1:100, 및 1:200, 각각 "50", "100", 및 "200"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 21은 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:100, 1:200, 1:400, 및 1:800, 각각 "100", "200", "400", 및 "800"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 세포를 제14일에 카운팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 22는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, T 세포 수용체 (TCR) α/β, CD4, CD8, CD27, CD28, 및 CD57 TIL의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 23은 aMOLM14 aAPC로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4, CD8, CD27, CD28, 및 CD57 TIL의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 24는 살아있는, TCR α/β+, CD4+, 또는 CD8+ TIL 상에 게이팅된 기억 하위세트 (CD45RA+/-, CCR7+/-)를 나타내는 유동 세포측정 등고선 플롯을 나타낸다.
도 25는 SPADE 트리를 사용한 CD3+ 세포 상에 게이팅된 T 세포 하위세트, CD4+ 및 CD8+ REP후 TIL (aMOLM14 aAPC로 확장됨)의 표현형적 특징화를 예시한다. 색상 구배는 LAG3, TIM3, PD1, 및 CD137의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다.
도 26은 SPADE 트리를 사용한 CD3+ 세포 상에 게이팅된 T 세포 하위세트, CD4+ 및 CD8+ REP후 TIL (aMOLM14 aAPC로 확장됨)의 표현형적 특징화를 예시한다. 색상 구배는 MFI CD69, CD154, KLRG1, 및 TIGIT에 비례한다.
도 27은 미토콘드리아 스트레스 시험 동안 측정된 공급자 또는 aMOLM14로의 확장 후의 TIL의 산소 소비 속도 (OCR)를 예시한다. 각각의 데이터 점은 삼중으로 측정된 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 28은 미토콘드리아 스트레스 시험 동안 측정된 공급자 또는 aMOLM14로의 확장 후의 TIL의 세포외 산성화 속도 (ECAR)를 예시한다. 각각의 데이터 점은 삼중으로 측정된 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 29는 목표 벡터 pLV4301G의 벡터 도해를 예시한다.
도 30은 공여자 벡터 1, pMK 7c12 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5의 벡터 도해를 예시한다.
도 31은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2의 벡터 도해를 예시한다.
도 32는 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그의 벡터 도해를 예시한다.
도 33은 목표 벡터 pLV4301G의 벡터 도해를 예시한다.
도 34는 공여자 벡터 1, pMK 8B3 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5의 벡터 도해를 예시한다.
도 35는 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2의 벡터 도해를 예시한다.
도 36은 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그의 벡터 도해를 예시한다.
도 37은 조작된 EM-3 세포 상의 CD137 및 CD86의 발현을 확인시켜 주는, 렌티바이러스 형질감염 전의 ("비형질감염된") 및 형질감염 후의 ("형질감염된") EM-3 세포에 대한 유동 세포측정 실험의 결과를 예시한다.
도 38은 TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 1:100의 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다.
도 39는 TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 1:100의 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다.
도 40은 TIL을 aEM3 또는 PBMC 공급자와 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께, OKT-3 (30 ng/mL)과 함께 또는 없이 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 막대 그래프는 제11일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 41은 상이한 TIL:aAPC 비로 EM-3 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다.
도 42는 EM-3 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aEM3 (삼중으로)과 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다.
도 43은 EM-3 aAPC 및 MOLM-14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aMOLM14 (삼중으로) 또는 aEM3 (또한 삼중으로)과 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다.
도 44는 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4+, 및 CD8+ TIL (TIL 배치 M1054)의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 45는 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4+, 및 CD8+ TIL (TIL 배치 M1055)의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 46은 CD3+ 세포를 사용한 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4+ 및 CD8+ SPADE 트리를 예시한다. 색상 구배는 LAG-3, TIM-3, PD-1, 및 CD137의 MFI에 비례한다.
도 47은 CD3+ 세포를 사용한 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4+ 및 CD8+ SPADE 트리를 예시한다. 색상 구배는 CD69, CD154, KLRG1, 및 TIGIT의 MFI에 비례한다.
도 48은 씨홀스 XF 미토 (Seahorse XF Mito) 스트레스 시험에 의해 측정된 여분 호흡 능력의 요약을 예시한다.
도 49는 씨홀스 XF 미토 스트레스 시험에 의해 측정된 당분해 예비력의 요약을 예시한다.
도 50은 살아있는 세포에서 미토콘드리아를 염색하고, 그에 대한 축적이 막 전위에 의존하는 미토트래커 (MitoTracker) 염료를 사용한 PBMC 또는 aEM3에 대해 확장된 살아있는 TIL의 미토콘드리아 염색을 예시한다. PBMC 또는 aEM3에 대해 확장된 TIL을 L/D 아쿠아 (Aqua), 이어서 미토트래커 적색 염료로 염색하였다. 나타내어진 데이터는 살아있는 집단 상에 게이팅된 미토트래커 양성 (MFI) 세포이다.
도 51은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 세포독성 효능 및 기능적 활성에 대한 P815 BRLA의 결과를 예시한다.
도 52는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 세포독성 효능 및 기능적 활성에 대한 P815 BRLA의 결과를 예시한다.
도 53은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 2가지 배치에 대한 IFN-γ 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 54는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 3가지 배치에 대한 IFN-γ 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 55는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 2가지 배치에 대한 그란자임 (Granzyme) B 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 56은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 3가지 배치에 대한 그란자임 B 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 57은 TIL 확장 및 치료 프로세스를 예시한다. 본 발명의 aAPC는 REP전 단계 (도면의 상부 반) 또는 REP 단계 (도면의 하부 반) 둘 다에 사용될 수 있으며, IL-2가 각각의 세포 배양물에 첨가되는 경우 첨가될 수 있다. 단계 1은 10개의 G-렉스 10 플라스크 내로의 4가지 종양 단편의 첨가를 지칭한다. 단계 2에서, 대략 40 × 106개 이상의 TIL을 수득한다. 단계 3에서, 분할이 REP에 대해 36개의 G-렉스 100 플라스크 내로 일어난다. TIL을 단계 4에서 원심분리에 의해 수확한다. 신선한 TIL 생성물을 단계 5에서 대략 43일의 총 프로세스 시간 후에 수득하며, 이 시점에서 TIL은 환자 내로 주입될 수 있다.
도 58은 aAPC로 확장된 TIL과 함께 사용하기 위한 치료 프로토콜을 예시한다. 수술 (및 종양 절제)은 시작에서 일어나고, 림프구고갈 화학요법은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 화학요법을 갖는 비-골수절제 림프구고갈을 지칭한다.
도 59는 개별적 이펙터:표적 비로 P815 클론 G6과 (항-CD3과 함께 또는 없이) 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1의 백분율 세포독성을 나타내는, 생물발광 재지정 용해 검정 (Bioluminescent Redirected Lysis Assay) (BRLA) 결과를 예시한다.
도 60은 상이한 비의 이펙터 대 표적 세포에 대해 방출된 IFN-γ의 양을 나타내는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터를 예시한다.
도 61은 4시간 및 24시간 공동-배양 동안 1:1 이펙터 대 표적 세포의 비로 항-CD3의 존재 하에서 P815 클론 G6과 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1에 의해 표현된 LAMP1 (％)을 예시한다.
도 62는 TIL 배치 M1030에 대한 BRLA 결과를 예시한다. BRLA에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 26 ± 16이다.
도 63은 TIL 배치 M1030에 대한 표준 크로뮴 방출 검정을 예시한다. 크로뮴 방출 검정에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 22이다.
도 64는 BRLA에 의한 TIL의 용해 단위를 70 ± 17로서 나타내는, TIL 배치 M1053에 대한 BRLA 결과를 예시한다.
도 65은 또한 크로뮴 검정에 의한 TIL의 용해 단위를 14 ± 5로서 나타내는, TIL 배치 M1053에 대한 표준 크로뮴 방출 검정 결과를 예시한다. 이 결과와 도 64의 비교는 BRLA 및 크로뮴 방출 검정의 필적하는 성능을 나타낸다.
도 66은 TIL의 IFN-γ 방출 및 세포독성 잠재성 사이의 선형 관계를 예시한다.
도 67은 IFN-γ에 대한 엘리스폿 (ELISpot) 결과를 예시한다.
도 68은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다.
도 69는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다.
도 70은 M1053T 및 M1030T에 의한 그란자임 B 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 이 데이터는 BRLA에 의해 나타난 TIL의 효능을 확인시켜 준다.
도 71은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다.
도 72는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다.
도 73은 M1053T 및 M1030T에 의한 TNF-α 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 이 데이터는 BRLA에 의해 나타난 TIL의 효능을 확인시켜 준다.
도 74는 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다.
도 75는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다.
도 76은 이러한 세포의 집단을 FBS의 hAB 혈청 배지로의 이행 (weaning off)의 경우 aEM3 세포 (C712 (A) 및 8B5 (B))의 세포 집단의 변화를 예시한다.
도 77은 다양한 동결 배지에 현탁된 aEM3 세포 집단으로의 동결-해동-회수 주기 동안 세포 집단의 변화를 예시한다.
도 78은 8-일 시간 과정에 걸친 기체 투과성 세포 배양 플라스크에서의 aEM3 세포의 성장을 예시한다.
도 79는 aEM3 세포의 순도를 측정하기 위한 유동 패널 분석을 예시한다.
도 80은 aEM3 세포의 순도를 측정하는 데 사용된 유동 패널 분석의 결과를 예시한다.
도 81은 OKT3에 의해 자극된 aEM3 공급자 세포 및 PBMC 공급자 사이의 시토카인 발현의 차이를 예시한다.
도 82는 TIL이 혈청 무함유 배지 (즉, CTS 옵티마이저 (Optmizer))로 유리하게 확장되어 (REP전) CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공할 수 있음을 예시한다.
도 83 및 도 84는 TIL이 혈청 무함유 배지 (즉, CTS 옵티마이저)로 유리하게 확장되어 제11일 (REP전) (도 83) 및 제22일 (REP전 및 REP후) (도 84)에 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공할 수 있음을 예시한다.
도 85는 aAPC 세포 (즉, aEM3 세포)가 혈청 무함유 배지를 사용하여 성장될 수 있음을 예시한다. 구체적으로, CTS 옵타마이저 및 프라임 (Prime)-TCDM은 cDMEM (10％ h혈청)에 비해 aEM3을 성장시키는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 나타내어진 데이터는 5회의 개별적 실험의 평균 + SD이었다. p 값은 스튜던트 t-검정에 의해 계산하였다. *P < 0.05.
도 86 및 도 87은 냉동보존 후의 제3일에 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 급속 회수를 입증하는 2가지 실험의 결과를 예시한다. 도 86은 실험 1에 대한 총 세포 카운트를 예시하고, 도 87은 실험 2에 대한 총 세포 카운트를 예시한다.
도 88은 세포를 플레이팅하고, 9일 동안 성장시킨 냉동보존 후의 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 성장을 예시한다. 세포 카운트는 해동 후 3일마다 측정하였다.
도 89는 세포를 GREX 10 플라스크에 플레이팅하고, 8일 동안 성장시킨 냉동보존 후의 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 성장을 예시한다. 세포 카운트는 해동 후 4일마다 측정하였다.
도 90은 p렌티 (pLenti)-C-Myc-DDK 인간 OX40L 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 91은 aEM3과 함께 배양된 TIL이 CD8+ TIL 왜곡을 촉진시키는 것을 나타내는, aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 REP에서 확장된 TIL의 유동 세포측정 분석의 결과를 예시한다.
도 92는 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 생존성 세포의 수를 예시한다.
도 93은 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 CD3+ 세포의 수를 예시한다.
도 94는 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 CD3- 세포의 수를 예시한다.
도 95는 qPCR 방법을 사용한 텔로미어 길이 분석의 결과를 예시한다.
도 96은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
도 97은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
도 98은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
서열 목록의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 뮤로모납의 중쇄에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 2는 뮤로모납의 경쇄에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 3은 재조합 인간 IL-2에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 4는 알데스류킨에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 5는 재조합 인간 IL-7에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 6은 재조합 인간 IL-15에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 7은 재조합 IL-21에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 8은 인간 CD86의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 9는 인간 4-1BBL (CD137L)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 10은 인간 OX40L (CD134L)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 11은 인간 CD28의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 12는 인간 CTLA-4의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 13은 인간 4-1BB (CD137)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 14는 인간 OX40 (CD134)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 15는 pLV430G 4-1BBL 비어있는 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 16은 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 4-1BBL CoOP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 17은 4-1BBL PCRP에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 18은 pLV430G hCD86 비어있는 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 19는 pLV430G 인간 hCD86 벡터의 hCD86 CoOP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 20은 pLV430G 인간 hCD86 벡터의 hCD86 CoOP B1 B2 PCRP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 21은 pDONR221 hCD86 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 22는 pDONR221 4-1BBL 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 23은 pLV430G 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 24는 pDONR221 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 25는 렌티바이러스 제조를 위한 psPAX2 헬퍼 플라스미드에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 26은 렌티바이러스 제조를 위한 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 27은 mFc-7C12 scFv 클론의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 28은 mFc-8B3 scFv 클론의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 29는 mFC-7C12 scFv에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 30은 mFC-8B3 scFv에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 31은 목표 벡터 pLV4301G에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 32는 공여자 벡터 1, pMK 7c12 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 33은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 34는 렌티바이러스 제조를 위해 사용된 최종 벡터, pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 35는 목표 벡터, pLV4301G에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 36은 공여자 벡터 1, pMK 8B3 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 37은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 38은 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 39는 렌티바이러스 제조를 위한 p렌티-C-Myc-DDK OX40L 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 40은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 41은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-2b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 42는 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 43은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공동-투여", "공동-투여하는", "와 조합으로 투여되는", "와 조합으로 투여하는", "동시" 및 "공동"은 둘 다의 활성 제약 성분 및/또는 그들의 대사물이 동시에 인간 대상체에 존재하도록 인간 대상체에의 2종 이상의 활성 제약 성분의 투여를 포괄한다. 공동-투여는 별개의 조성물에서의 동시 투여, 별개의 조성물에서의 상이한 시간에서의 투여, 또는 2종 이상의 활성 제약 성분이 존재하는 조성물에서의 투여를 포함한다. 별개의 조성물에서의 동시 투여 및 둘 다의 작용제가 존재하는 조성물에서의 투여는 또한 본 발명의 방법에 포괄된다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있거나 죽은 세포가 채용되는 세포-기재 검정을 포괄하며, 또한 무손상 세포가 채용되지 않는 무세포 검정을 포괄한다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 처리하거나 절차를 수행하는 것을 포함하는 사건을 지칭한다. 적절히, 세포, 조직 및/또는 기관은 수술 또는 치료의 방법에서 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
용어 "항원"은 면역 반응을 유도하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가적으로 면역계에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 초래하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부의 경우, 이는 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결될 것을 요구할 수 있다. 항원은 또한 1개 이상의 에피토프 (예를 들어, B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바람직하게는 전형적으로 고도로 특이적 및 선택적 방식으로 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이며, 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않을 것이다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 질환 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 의도된 적용을 실행하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 인간 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 중량, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 투여의 방식 등에 따라 다양할 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서의 특정 반응 (예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 특정 화합물, 이어지는 투약 처방, 화합물이 다른 화합물과 조합으로 투여되는지 여부, 투여의 시기, 그것이 투여되는 조직, 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 다양할 것이다.
용어가 본원에 사용된 바와 같은 "치료 효과"는 인간 대상체에서의 치료 유익 및/또는 예방 유익을 포괄한다. 예방 효과는 질환 또는 상태의 출현을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태의 증상의 발병을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태의 진행을 감속시키거나, 중단시키거나, 반전시키는 것, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
"제약학적으로 허용되는 담체" 또는 "제약학적으로 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 제약 성분을 위한 이러한 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제의 용도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제가 활성 제약 성분와 비혼화성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 추가의 활성 제약 성분, 예컨대 다른 약물은 또한 기재된 조성물 및 방법 내로 혼입될 수 있다.
용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3배 (또는 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9배), 보다 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10배 (또는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90배), 또는 가장 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100배의 항원-특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 다수의 급속 확장 프로토콜이 본원에 기재되어 있다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류에 잔존하고, 종양 내로 이동된 백혈구로서 원래 얻어진 세포의 집단을 의미한다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 개요된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들이고 (때때로 본원에서 "신선하게 수확된" 또는 "TIL의 제1 집단"으로 지칭됨), "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL (적절할 경우 "REP TIL" 또는 "REP후 TIL", 또는 "TIL의 제2 집단" 또는 "TIL의 제3 집단")을 포함하나 이에 제한되지 않는, 본원에서 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 종양을 침윤시키고 치료를 실행하는 그들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 하기 바이오마커 중 1종 이상을 발현함으로써 범주화될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가적으로, 및 대안적으로, TIL은 환자 내로의 재도입 시 고형 종양을 침윤시키는 그들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
본원에서 "냉동보존된 TIL"은 TIL이 약 -150 ℃ 내지 -60 ℃의 범위에서 처리되고 저장된 것을 의미한다. 냉동보존을 위한 일반적 방법은 또한 실시예에서를 비롯한 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 명확성을 위해, "냉동보존된 TIL"은 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과는 구별된다.
본원에서 "해동된 냉동보존된 TIL"은 이전에 냉동보존되었고, 그 후 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는 실온 이상으로 복귀하도록 처리된 TIL의 집단을 의미한다.
본원에서 "세포의 집단" (TIL을 포함함)은 공통적인 특성을 공유하는 다수의 세포를 의미한다.
용어 "중심 기억 T 세포"는 인간에서 CD45R0+이고, CCR7 (CCR7hi) 및 CD62L (CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BCL-6, BCL-6B, MBD2, 및 BMI1을 포함한다. 중심 기억 T 세포는 주로 TCR 촉발 후에 이펙터 분자로서 IL-2 및 CD40L을 분비한다. 중심 기억 T 세포는 혈액에서 CD4 구획에 우세하며, 인간에서 림프절 및 편도에 비례적으로 풍부하다.
용어 "이펙터 기억 T 세포"는 중심 기억 T 세포와 마찬가지로, CD45R0+이지만, CCR7 (CCR7lo)의 구성적 발현을 소실하였으며, CD62L 발현 (CD62Llo)에 대해 이종이거나 낮은 인간 또는 포유동물 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 이펙터 기억 T 세포는 항원 자극 후에 인터페론-γ, IL-4, 및 IL-5를 비롯한 높은 수준의 염증성 시토카인을 급속하게 분비한다. 이펙터 기억 T 세포는 혈액에서 CD8 구획에 우세하며, 인간에서 폐, 간, 및 장에 비례적으로 풍부하다. CD8+ 이펙터 기억 T 세포는 다량의 퍼포린을 운반한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성", 및 "서열 퍼센트 동일성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬한 경우 (필요할 경우, 갭을 도입함), 동일하거나, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리듬을 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리듬 및 소프트웨어가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 측정하는 적합한 프로그램으로는 예를 들어 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 (U.S. Government's National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹 사이트로부터 이용가능한 BLAST 프로그램의 조를 들 수 있다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리듬 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크 (Genentech), 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코) 또는 DNASTAR로부터 이용가능한 멕얼라인 (MegAlign)은 서열을 정렬하는 데 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 정렬 소프트웨어에 의해 최대 정렬에 대한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴드 파라미터가 사용된다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 항원에의 항체의 또는 그의 리간드에의 단백질의 결합을 제거하지 않는 아미노산 서열 변형을 의미한다. 보존적 아미노산 치환은 한 부류의 아미노산의 동일한 부류의 아미노산에 의한 치환을 포함하며, 여기서, 부류는 예를 들어, 표준 데이호프 (Dayhoff) 빈도 교환 행렬 또는 BLOSUM 행렬에 의해 측정된 바와 같이, 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서의 공통적인 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6개의 일반적 부류가 범주화되었으며, 부류 I (Cys); 부류 II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III (Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV (His, Arg, Lys); 부류 V (Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI (Phe, Tyr, Trp)을 포함한다. 예를 들어, 또다른 부류 III 잔기, 예컨대 Asn, Gln, 또는 Glu에 대한 Asp의 치환은 보존적 치환이다. 따라서, 4-1BBL 또는 CD86 단백질에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 부류로부터의 또다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 또는 리간드 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187]; [Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999)]; 및 [Burks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417] 참조).
용어 "레트로바이러스"는 그들의 복제 주기 동안 역전사효소를 이용하는 RNA 바이러스를 지칭하며, 여기서, 레트로바이러스 게놈 RNA는 역전사효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다. 이중-가닥 DNA 형태는 감염된 세포의 염색체 내로 통합된다 ("프로바이러스"). 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 주형으로서 기능하며, 새로운 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 구조 단백질 및 효소를 코딩하는 RNA 분자의 발현을 지정한다. 프로바이러스의 각각의 말단에 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"로 지칭되는 구조가 있다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 비롯한 다수의 조절 신호를 함유한다. 시스터나바이러스 (Cisternavirus) A, 온코바이러스 (Oncovirus) A, 온코바이러스 B, 온코바이러스 C, 온코바이러스 D, 렌티바이러스 (Lentivirus), 감마레트로바이러스 (Gammaretrovirus), 및 스푸마바이러스 (Spumavirus)를 비롯한 몇몇 속은 레트로비리다에 (Retroviridae) 과 내에 포함된다. 레트로바이러스의 일부는 암유발성 (즉, 종양형성성)인 반면, 다른 것들은 그렇지 않다. 온코바이러스는 감수성 종에서 육종, 백혈병, 림프종, 및 유방 암종을 유도한다. 레트로바이러스는 폭넓게 다양한 종을 감염시키며, 수평적으로 및 수직적으로 둘 다 전파될 수 있다. 이들이 숙주 DNA 내로 통합되기 때문에, 이들은 세포에서 세포로 숙주 DNA의 서열을 전파할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터의 예로는 양생 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV-A)로부터 유래된 것들을 들 수 있으며, 이는 진입을 위해 세포 표면 포스페이트 수송체 수용체를 사용하고, 그 후 증식하는 세포 염색체 내로 영구적으로 통합된다. 양생 MLV 벡터 시스템은 널리 확립되었으며, 유전자 전달을 위한 대중적인 도구이다 (예를 들어, 문헌 [Gordon and Anderson, Curr. Op. Biotechnol., 1994, 5, 611-616] 및 [Miller, et al., Meth. Enzymol., 1993, 217, 581-599] 참조, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨).
용어 "렌티바이러스"는 HIV (인간 면역결핍 바이러스; HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2를 포함함), 양에서 뇌염 (비스나) 또는 폐렴 (마에디)을 유발하는 비스나-마에디, 염소에서 면역 결핍, 관절염, 및 뇌병증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가면역 용혈성 빈혈, 및 뇌병증을 유발하는 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소에서 림프절병증, 림프구증가증, 및 가능하게는 중추 신경계 감염을 유발하는 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 아인간 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함하는 속을 지칭한다. 이들 바이러스에 의해 유발되는 질환은 긴 인큐베이션 기간 및 지연된 과정을 특징으로 한다. 통상적으로, 바이러스는 단핵구 및 대식세포를 잠복성으로 감염시키며, 그로부터 이들은 다른 세포로 확산된다. HIV, FIV, 및 SIV는 또한 T 림프구 (즉, T 세포)를 용이하게 감염시킨다.
용어 "항-CD3 항체"는 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지정된 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 지칭하며, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 뮤로모납으로도 공지된 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3ε으로도 공지된 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체로는 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 및 비실리주맙을 들 수 있다.
용어 "OKT-3" (본원에서 "OKT3"으로도 지칭됨)은 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지정된, 인간, 인간화, 키메라, 또는 뮤린 항체를 비롯한 모노클로날 항체 또는 그의 변이체를 지칭하며, 시판되는 형태, 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 밀테니 바이오텍 게엠베하 (Miltenyi Biotec GmbH), 독일 버기쉬 글라드바흐) 및 뮤로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 뮤로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)에 주어진다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁되어 있으며, ATCC 수탁 번호 CRL 8001이 할당되어 있다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 또한 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐스 (European Collection of Authenticated Cell Cultures) (ECACC)에 기탁되어 있으며, 카탈로그 번호 86022706이 할당되어 있다.
<표 1>
뮤로모납의 아미노산 서열.
Figure pat00001
용어 "IL-2" (본원에서 "IL2"로도 지칭됨)는 인터루킨-2로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌 [Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88] 및 [Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 3)에 주어진다. 예를 들어, 용어 IL-2는 IL-2의 인간, 재조합 형태, 예컨대 알데스류킨 (프로류킨 (PROLEUKIN), 단일 사용 바이알 당 2200만 IU로 다수의 공급자로부터 시판됨), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포츠마우스에 소재하는 셀제닉스, 인코포레이티드 (CellGenix, Inc.) (셀그로 GMP (CELLGRO GMP)) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.) (카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매자로부터의 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비글리코실화된 인간 재조합 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 4)에 주어진다. 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코에 소재하는 넥타 테라퓨틱스 (Nektar Therapeutics)로부터 이용가능한 PEG화된 IL2 프로드러그 NKTR-214를 비롯한, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2의 PEG화된 형태를 포괄한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 PEG화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0328791 A1호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/065086 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 대안적 형태는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4,902,502호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "IL-7" (본원에서 "IL7"로도 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터루킨 7로 공지된 글리코실화된 조직-유래된 시토카인을 지칭한다. 문헌 [Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발달을 자극할 수 있다. IL-7은 흉선 내에서의 T 세포 발달 및 주변부 내에서의 생존에 중요한 일련의 신호인, IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 쇄 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (ThermoFisher Scientific, Inc.) (인간 IL-7 재조합 단백질, 카탈로그 번호 지브코 (Gibco) PHC0071)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 5)에 주어진다.
용어 "IL-15" (본원에서 "IL15"로도 지칭됨)는 인터루킨-15로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-15는 예를 들어, 문헌 [Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. IL-15는 IL-2와 β 및 γ 신호화 수용체 서브유닛을 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 12.8 kDa의 분자 질량을 갖는 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-15는 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 34-8159-82)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 6)에 주어진다.
용어 "IL-21" (본원에서 "IL21"로도 지칭됨)은 인터루킨-21로 공지된 다표현형발현 시토카인 단백질을 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-21의 모든 형태를 포함한다. IL-21은 예를 들어, 문헌 [Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. IL-21은 주로 자연 살해 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 생산된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자 질량을 갖는 132개의 아미노산을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (인간 IL-21 재조합 단백질, 카탈로그 번호 14-8219-80)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 7)에 주어진다.
<표 2>
인터루킨의 아미노산 서열.
Figure pat00002
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골수성 세포"는 골수성 계통의 또는 그로부터 유래된 세포를 지칭한다. 골수성 계통은 과립구 (호중구, 호산구, 및 호염기구), 단핵구, 대식세포, 적혈구, 거핵세포, 및 비만 세포의 상이한 하위세트를 비롯한 다수의 형태적으로, 표현형적으로, 및 기능적으로 별개의 세포 유형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 골수성 계통의 세포주로부터 유래된 세포이다.
"MOLM-14"는 재발된 급성 단핵구 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 확립된 인간 백혈병 세포주를 지칭하며, 초기 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시하였다: CD4, CD9, CD11a, CD13, CD14, CD15, CD32, CD33, CD64, CD65, CD87, CD92, CD93, CD116, CD118, 및 CD155. 문헌 [Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77]. MOLM-14의 추가의 표현형적 특징화는 보다 높은 수준의 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, CD58, 및 보다 낮은 수준의 CD86을 밝혀내었다. MOLM-14 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC777 하에 기탁되어 있다. 가깝게 관련된 MOLM-13 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC554 하에 기탁되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "MOLM-14 세포"는 MOLM-14 세포 및/또는 기탁된 MOLM-14 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "MOLM-13 세포"는 MOLM-13 세포 및/또는 기탁된 MOLM-13 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다.
"EM-3"은 필라델피아 염색체-양성 CML을 갖는 환자의 골수로부터 확립된 인간 세포주를 지칭한다. 문헌 [Konopka, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4]. EM-3 세포에 대한 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시한다: CD13, CD15, 및 CD33. EM-3 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC134 하에 기탁되어 있는 반면, 가깝게 관련된 EM-2 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC135 하에 기탁되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "EM-3 세포"는 EM-3 세포 및/또는 기탁된 EM-3 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD86 단백질"은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 8에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "4-1BBL" 또는 "CD137L"은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 9에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "OX40L" 또는 "CD137L"은 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 10에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
용어 "바이오시밀러"는 임상적으로 불활성 성분의 사소한 차이에도 불구하고 미국 허가된 참조 생물학적 생성물과 매우 유사하고, 생성물의 안전성, 순도, 및 효능의 관점에서 생물학적 생성물 및 참조 생성물 사이에 임상적으로 유의미한 차이가 없는, 모노클로날 항체 또는 융합 단백질을 비롯한 생물학적 생성물을 의미한다. 더욱이, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약품 기구 (European Medicines Agency)에 의해 이미 사용이 인가된 또다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국립 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 생성물 또는 생물학적 의약은 생물학적 공급원, 예컨대 박테리아 또는 효모에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 이들은 상대적으로 작은 분자, 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복잡한 분자, 예컨대 모노클로날 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 IL-2 단백질이 알데스류킨 (프로류킨)인 경우, 알데스류킨에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 단백질은 알데스류킨"에 대한 바이오시밀러"이거나, 알데스류킨의 "그의 바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 이미 사용이 인가된 또다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용을 위한 관련 법적 기초는 보정된 바와 같은 규칙 (EC) 제726/2004호의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4)이며, 따라서, 유럽에서, 바이오시밀러는 규칙 (EC) 제726/2004호의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4) 하에 인가되거나, 인가를 위해 승인되거나, 인가를 위한 적용의 대상일 수 있다. 이미 인가된 원래 생물학적 의약적 생성물은 유럽에서 "참조 의약적 생성물"로 지칭될 수 있다. 생성물이 바이오시밀러로 간주되기 위한 요건의 일부는 문헌 [CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products]에 개요되어 있다. 또한, 모노클로날 항체 바이오시밀러에 관한 지침을 비롯한 생성물 특이적 지침은 EMA에 의해 생성물 별 기초로 제공되며, 그의 웹사이트 상에 공개되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특징, 생물학적 활성, 작용의 메커니즘, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 의해 참조 의약적 생성물과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 동일한 상태를 치료하는 데 사용되거나, 사용하기 위해 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 품질 특징을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽에서 바이오시밀러는 EMA에 의해 인가된 참조 의약적 생성물과 비교된다. 그러나, 일부 예에서, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 구역 (European Economic Area) 외부에서 인가된 생물학적 의약적 생성물 (비-EEA 인가된 "비교자")과 비교될 수 있다. 이러한 연구는 예를 들어 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 인가된 비교자와 비교되었거나, 비교될 수 있는 생물학적 의약적 생성물에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의하게 영향을 미치지 않는 아미노산 구조의 사소한 변형 (예를 들어 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그의 참조 의약적 생성물의 아미노산 서열과 97％ 이상, 예를 들어, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 차이가 의약적 생성물의 안전성 및/또는 효능의 변화를 초래하지 않는 한, 참조 의약적 생성물의 번역후 변형과 상이한 1개 이상의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및/또는 말단절단 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 동일하거나 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 그러나 배타적이지는 않게, 바이오시밀러는 차이가 참조 의약적 생성물과 연관된 안전성 문제를 다루거나, 다루도록 의도되는 경우, 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 추가적으로, 바이오시밀러는 의약적 생성물의 안전성 및 효능이 손상되지 않는 경우, 예를 들어 그의 강도, 제약 형태, 제형, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약적 생성물로부터 벗어날 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물에 비해 예를 들어 약동학 (PK) 및/또는 약역학 (PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있지만, 여전히 인가되거나 인가에 적합한 것으로 간주되도록 참조 의약적 생성물과 충분히 유사한 것으로 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물에 비해 상이한 결합 특징을 나타내며, 여기서, 상이한 결합 특징은 규제 기관, 예컨대 EMA에 의해 유사한 생물학적 생성물로서의 인가를 위한 장벽이 아닌 것으로 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국립 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열 내의 또는 그에 인접한 특정 위치에서의 1개 이상의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 항체 또는 융합 단백질을 포괄하지만, 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열에 비해 그의 아미노산 서열에서 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 유사하게 하전되거나 비하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 참조 단백질 또는 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 용어 "변이체"는 또한 PEG화된 항체 또는 단백질을 포함한다.
"PEG화"는 전형적으로 1개 이상의 PEG 기가 항체, 항체 단편, 또는 단백질에 부착되는 조건 하에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체, 또는 그의 단편, 또는 단백질을 지칭한다. PEG화는 예를 들어, 항체 또는 단백질의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 형태 중 임의의 것, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. PEG화되는 항체 또는 단백질은 비글리코실화된 항체일 수 있다. 예를 들어 유럽 특허 제EP 0154316호 및 제EP 0401384호에 기재된 바와 같이, PEG화를 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 항체 및 단백질에 적용될 수 있다.
용어 "약" 및 "대략"은 통계적으로 유의미한 범위의 값 내를 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 내, 바람직하게는 50％ 내, 보다 바람직하게는 20％ 내, 보다 바람직하게는 여전히 10％ 내, 및 보다 더 바람직하게는 5％ 내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 변형은 연구 하의 특정 시스템에 의존하며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 수 있다. 더욱이, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 및 다른 양 및 특징이 정확하지 않으며 그럴 필요는 없지만, 바람직할 경우, 대략적이고/거나 더 크거나 더 작을 수 있으며, 이는 내성, 전환 인자, 라운딩 오프, 측정 오차 등, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 인자를 반영한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 또는 다른 양 또는 특징은 이러한 것으로 명백하게 언급되든지 그렇지 않든지 "약" 또는 "대략적"이다. 매우 상이한 크기, 형상 및 치수의 실시양태는 기재된 배열을 채용할 수 있음이 주목된다.
전이적 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 원래 및 보정된 형태로 첨부된 청구범위에 사용되는 경우, 존재하는 경우 비인용된 추가의 청구항 요소 또는 단계가 청구항(들)의 범위로부터 배제되는 것에 관하여 청구항 범위를 한정한다. 용어 "포함하는"은 포함적 또는 개방-말단인 것으로 의도되며, 임의의 추가의, 비인용된 요소, 방법, 단계 또는 물질을 배제하지 않는다. 용어 "로 이루어진"은 청구항에 구체화된 것들 외의 임의의 요소, 단계 또는 물질을 배제하며, 후자의 예에서, 구체화된 물질(들)과 통상적으로 연관된 불순물을 배제한다. 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위를 구체화된 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기재된 모든 조성물, 방법, 및 키트는 대체적 실시양태에서 전이적 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진", 및 "로 이루어진" 중 임의의 것에 의해 보다 구체적으로 한정될 수 있다.
인공 항원 제시 세포
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, 및 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하는 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, MOLM-14 또는 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC는 OX40L 및 4-1BBL 둘 다를 발현하도록 변형될 수 있음이 이해될 것이다.
인간 CD86, 인간 4-1BBL (CD137L), 및 인간 OX40L (CD134L)에 대한 서열은 표 3에 주어진다.
<표 3>
인간 CD86, 인간 4-1BBL, 및 인간 OX40L에 대한 아미노산 서열.
Figure pat00003
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
인간 CD86이 결합하는 리간드 (CD28 및 CTLA-4), 인간 4-1BBL이 결합하는 리간드 (4-1BB), 및 인간 OX40L이 결합하는 리간드 (OX40)에 대한 서열은 표 4에 주어진다.
<표 4>
인간 CD28, 인간 CTLA-4, 인간 4-1BB, 및 인간 OX40에 대한 아미노산 서열.
Figure pat00004
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하며, 여기서, aAPC가 EM-3 모 세포주로부터 유래된 것인 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하는 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 도 96에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 97에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 98에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하는 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 도 96에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 97에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 98에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC는 OX40L 및 4-1BBL 둘 다를 발현하도록 변형될 수 있음이 이해된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하며, 여기서, aAPC가 K562-계통 모 세포주로부터 유래된 것인 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, K562 계통 모 세포주는 수탁 번호 ATCC CCL-243 하에, 및 또한 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐즈에 기탁되어 있다 (ECACCECACC 89121407).
한 실시양태에서, 본 발명은 CD58을 발현하는 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, K562-계통 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
인공 항원 제시 세포를 제조하는 방법
한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 CD86 및 4-1BBL의 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 렌티바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Levine, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77]; [Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75]; [Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71], 및 미국 특허 제6,627,442호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달의 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 트랜스포사제의 장기 발현이 트랜스제닉 세포에서 일어나지 않도록 트랜스포사제가 DNA 발현 벡터로서 또는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되는, 예를 들어 트랜스포사제가 mRNA (예를 들어, 캡 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 mRNA)로서 제공되는 시스템을 포함한다. 연어과-유형 Tel-유사 트랜스포사제 (SB 또는 잠자는 미녀 (Sleeping Beauty) 트랜스포사제), 예컨대 SB10, SB11, 및 SB100x, 및 증가된 효소적 활성을 갖는 조작된 효소를 비롯한 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 예를 들어, 문헌 [Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83] 및 미국 특허 제6,489,458호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 CD86 및 4-1BBL의 일시적 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 전기천공의 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306], 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0227237 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 인산칼슘 형질감염의 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법 (인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅, 및 세포내이입)은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467]; [Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376]; 및 [Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752]; 및 미국 특허 제5,593,875호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 리포솜 형질감염의 단계를 포함한다. 리포솜 형질감염 방법, 예컨대 여과수 중 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 디올레오일 포스포티딜에탄올아민 (DOPE)의 1:1 (w/w) 리포솜 제형을 채용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525] 및 [Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417] 및 미국 특허 제5,279,833호; 제5,908,635호; 제6,056,938호; 제6,110,490호; 제6,534,484호; 및 제7,687,070호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 미국 특허 제5,766,902호; 제6,025,337호; 제6,410,517호; 제6,475,994호; 및 제7,189,705호에 기재된 방법을 사용한 형질감염의 단계를 포함하며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 또한 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, aAPC를 먼저 게이트웨이 (Gateway) 클로닝 방법 (써모피셔, 인코포레이티드로부터 시판됨)을 사용함으로써 형질도입하여 렌티바이러스 형질도입을 위한 벡터를 제조하고, 이어서 벡터 및 1종 이상의 연관된 헬퍼 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스 형질도입을 한다. 게이트웨이 클로닝 방법에서, 유전자를 선택하고 (예컨대 CD86), 그 후 프라이머를 제공하고, attB 태그부착된 프라이머 쌍의 도움으로 PCR 기술을 사용하여 증폭시킨다. 그 후, PCR 단편을 attP 부위를 포함하는 공여자 벡터 (pDONR, 예컨대 pDONR221)와 조합하여 BP 반응을 사용하여 엔트리 클론을 제공한다. attB 및 attP 부위 사이의 통합 반응은 PCR 단편을 공여자 벡터와 조합한다. 생성된 엔트리 클론은 attL 부위에 의해 플랭킹된 관심의 유전자를 함유한다. 그 후, LR 반응을 사용하여 엔트리 클론을 목표 벡터와 조합하여 발현 벡터를 제조한다. LR 반응에서, 재조합 반응은 attL 및 attR 부위 및 클로나제 효소를 사용하여 엔트리 클론을 목표 벡터 (예컨대 pLV430G)와 연결시키는 데 사용된다. attL 부위는 이미 엔트리 클론에서 발견되는 반면, 목표 벡터는 attR 부위를 포함한다. LR 반응을 수행하여 관심의 서열을 동시 반응에서 1종 이상의 목표 벡터 내로 전달한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청-기재 배지 및/또는 혈청 무함유 배지 하에서 성장되고 유지될 수 있다. 예시적인 방법에 따르면, aAPC를 24 웰 플레이트에서 웰 당 약 1 × 106 세포의 세포 밀도로 3 내지 5일 동안 배양할 수 있다. 그 후, 세포를 단리하고/거나 원심분리에 의해 세척하고, 배지에 재현탁시키거나, 적절한 냉동보존 배지 (예를 들어, 크리오스토르 (CryoStor) 10 (바이오라이프 솔루션즈 (BioLife Solutions))에서 냉동보존하고, -80 ℃ 냉동고에서 저장한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC를 인간 혈청 (h혈청) 함유 배지 (예를 들어, 10％ h혈청을 갖는 cDMEM)를 포함하는 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장된 aAPC는 aMOLM-13 세포, aMOLM-14 세포, 및 aEM3 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보 (Xvivo)-20 (론자 (Lonza)), 프라임 T 세포 CDM (어바인 (Irvine)), XFSM (메센컬트 (MesenCult)) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 성장된 aAPC는 aMOLM-13 세포, aMOLM-14 세포, 및 aEM3 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
종양 침윤 림프구 및 T 세포를 확장시키는 방법
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 TIL의 집단을 본원에 기재된 aAPC와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 aAPC가 TIL의 세포 표면 상에 발현되는 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 상기 공동-자극 분자와 상기 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292]에 기재된 바와 같은 단계를 포함하는, 본 개시내용의 aAPC 중 임의의 것을 사용하여 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 종양을 효소 배지에 정치하고, 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킬 수 있다. 그 후, 혼합물을 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션한 후, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴시킨다. 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서의 인큐베이션 후, 종양을 대략 1분 동안 3번째 기계적으로 파괴시킬 수 있다. 제3 기계적 파괴 후, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우, 1 또는 2회의 추가의 기계적 해리를 37 ℃에서 5％ CO2에서의 추가의 30분의 인큐베이션과 함께 또는 없이 샘플에 적용할 수 있다. 최종 인큐베이션의 종료 시, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, 피콜 (Ficoll)을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. TIL 배양을 24-웰 플레이트 (코스타 (Costar) 24-웰 세포 배양 클러스터, 평저; 코닝 인코포레이티드 (Corning Incorporated), 미국 뉴욕주 코닝)에서 개시하였으며, 각각의 웰을 IL-2 (6000 IU/mL; 키론 코포레이션 (Chiron Corp.), 미국 캘리포니아주 에머리빌)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM)에서 1×106개의 종양 소화 세포 또는 크기가 대략 1 내지 8 mm3인 1개의 종양 단편으로 시딩할 수 있다. CM은 10％ 인간 AB 혈청, 25 mM 헤페스 (Hepes), 및 10 mg/mL 겐타미신으로 보충된 글루타맥스 (GlutaMAX)를 갖는 RPMI 1640으로 이루어진다. 배양을 40 mL 용량 및 10 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (G-렉스 10; 윌슨 울프 매뉴팩처링 (Wilson Wolf Manufacturing), 뉴 브링톤)에서 개시할 수 있으며, 각각의 플라스크를 IL-2를 갖는 10 내지 40 mL의 CM에서 10 내지 40×106개의 생존성 종양 소화 세포 또는 5-30개의 종양 단편으로 로딩할 수 있다. G-렉스 10 및 24-웰 플레이트를 습화된 인큐베이터에서 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 배양 개시 후 5일에 배지의 반을 제거하고, 신선한 CM 및 IL-2로 대체할 수 있으며, 제5일 후에, 배지의 반을 2 내지 3일마다 교환할 수 있다. TIL의 급속 확장 프로토콜 (REP)은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 aAPC를 사용하여, T-175 플라스크 및 기체-투과성 백 또는 기체-투과성 G-렉스 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. T-175 플라스크에서의 REP를 위해, 1×106개의 TIL을 각각의 플라스크에서 150 mL의 배지에 현탁시킬 수 있다. TIL을 본 개시내용의 aAPC와 함께 본원에 기재된 비로 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 (50/50 배지)에서 배양할 수 있다. T-175 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 배지의 반을 제5일에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교환할 수 있다. 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3L 백에서 합하고, 5％ 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V를 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가할 수 있다. 각각의 백 중의 세포의 수를 매일 또는 2일마다 카운팅할 수 있으며, 신선한 배지를 첨가하여 0.5 내지 2.0×106개 세포/mL의 세포 카운트를 유지할 수 있다. 100 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 플라스크 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 G-렉스 100, 윌슨 울프 매뉴팩처링)에서의 REP를 위해, 5×106 또는 10×106개의 TIL을 aAPC와 함께 본원에 기재된 비 (예를 들어, 1 대 100)로 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 배양할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 제거하고, 원심분리 병 내로 정치하고, 1500 rpm (491 g)에서 10분 동안 원심분리할 수 있다. 수득된 TIL 펠릿을 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 50/50 배지로 재현탁시키고, G-렉스 100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 G-렉스 100 플라스크에서 일련적으로 확장된 경우, 제7일에 각각의 G-렉스 100 중 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁시키고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취액으로 나눌 수 있으며, 이를 사용하여 3개의 G-렉스 100 플라스크를 시딩할 수 있다. 그 후, 5％ 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 약 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. 그 후, G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후, 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 G-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 그 후, 배양의 제14일에 세포를 수확함으로써 REP를 완결할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, TIL은 유리하게는 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL 확장 방법은 혈청-기재 배지 (예를 들어, 완전 배지 또는 CM1)라기 보다는 혈청 무함유 배지의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL 확장 방법은 혈청-기재 배지라기 보다는 혈청 무함유 배지를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보-20 (론자), 프라임 T 세포 CDM (어바인) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하는, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, APC의 집단이 TIL의 집단을 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 EM-3 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 TIL 상의 적어도 2종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 2종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 2종의 공동-자극 리간드가 CD86 및 4-1BBL을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, aAPC는 4-1BBL 외에도 OX40L을 추가로 포함할 수 있거나, 4-1BBL 대신 OX40L을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 암을 확장시키거나 치료하는 방법은 TIL이 환자 종양 샘플로부터 수득되는 단계를 포함한다. 환자 종양 샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, TIL은 샤프한 절개로부터의 효소적 종양 소화물 및 종양 단편 (크기가 약 1 내지 약 8 mm3)으로부터 배양될 수 있다. 이러한 종양 소화물은 효소적 배지 (예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute) (RPMI) 1640 완충제, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 겐타미신, 30 단위/mL의 DN아제 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)에서의 인큐베이션, 이어서 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기를 사용하여)에 의해 생성될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소적 배지에 정치하고, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시키고, 이어서 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션하고, 이어서 단지 작은 조직 조각이 존재할 때까지 상기 조건 하에서 기계적 해리 및 인큐베이션의 반복된 주기에 의해 생성될 수 있다. 이 프로세스의 종료 시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, 피콜 분지형 친수성 다당류를 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 미국 특허 출원 공개 제2012/0244133 A1호에 기재된 것들이 사용될 수 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 상기 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대해 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, REP는 기체 투과성 용기에서 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 인터루킨-2 (IL-2) 또는 인터루킨-15 (IL-15)의 존재 하에서 급속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T 세포 수용체 자극은 예를 들어, 약 30 ng/mL의 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT-3, 모노클로날 항-CD3 항체 (미국 뉴저지주 라리탄에 소재하는 오르토-맥네일 (Ortho-McNeil), 또는 미국 캘리포니아주 오번에 소재하는 밀테니 바이오테크 (Miltenyi Biotech)로부터 시판됨) 또는 UHCT-1 (미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 바이오레전드 (BioLegend)로부터 시판됨)을 포함할 수 있다. TIL은 임의로 T 세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에서, 임의로 벡터, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)로부터 발현될 수 있는, 암의, 그의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들)를 비롯한 1종 이상의 항원으로의 시험관내에서 TIL의 추가의 자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원으로는 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원성 부분을 들 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄싱된 암의 동일한 항원(들)으로의 재-자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어,방사선조사된 자가 림프구로 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이형 림프구 및 IL-2로 추가로 재-자극될 수 있다.
한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 5000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배양 배지, 약 5000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 5800 mL 내지 약 8700 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 1000 mL 내지 약 2000 mL의 세포 배지, 약 2000 mL 내지 약 3000 mL의 세포 배양 배지, 약 3000 mL 내지 약 4000 mL의 세포 배양 배지, 약 4000 mL 내지 약 5000 mL의 세포 배양 배지, 약 5000 mL 내지 약 6000 mL의 세포 배양 배지, 약 6000 mL 내지 약 7000 mL의 세포 배양 배지, 약 7000 mL 내지 약 8000 mL의 세포 배양 배지, 약 8000 mL 내지 약 9000 mL의 세포 배양 배지, 약 9000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 약 10000 mL 내지 약 15000 mL의 세포 배양 배지, 약 15000 mL 내지 약 20000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 20000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 1종 이하의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어, AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 술페이트, 및 10 μM 겐타미신 술페이트) 세포 배양 배지 (인비트로젠 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스버드)가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명 방법은 유리하게는 배지의 양 및 TIL의 수를 확장시키는 데 요구되는 배지의 유형의 수를 감소시킨다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 3일마다 또는 4일마다 이하의 빈도로 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기에서 세포의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는 데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 간소화한다.
한 실시양태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다. 이러한 실시양태는 세포 집단이 약 5 × 105개 세포/cm2로부터 10 × 106 내지 30 × 106개 세포/cm2로 확장되는 것을 허용한다. 한 실시양태에서, 이 확장은 공급 없이 일어난다. 한 실시양태에서, 이 확장은 배지가 기체-투과성 플라스크에 약 10 cm의 높이로 잔류하는 한, 공급 없이 일어난다. 한 실시양태에서, 이는 공급 없이, 그러나 1종 이상의 시토카인의 첨가와 함께이다. 한 실시양태에서, 시토카인은 시토카인을 배지와 혼합할 임의의 필요 없이 볼루스로서 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치, 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, TIL을 확장시키는 데 사용되었으며, 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0377739 A1호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2014/210036 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2013/0115617 A1호, 국제 공개 제WO 2013/188427 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2011/0136228 A1호, 미국 특허 제8,809,050호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2011/072088 A2호, 미국 특허 출원 공개 제US 2016/0208216 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2012/0244133 A1호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/129201 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2013/0102075 A1호, 미국 특허 제8,956,860호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/173835 A1호, 및 미국 특허 출원 공개 제US 2015/0175966 A1호에 기재된 것들을 포함하며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 이러한 프로세스는 또한 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 10 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 10 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 1억 내지 3억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 450 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 1000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교환 없이 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100L 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교환 없이 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 24 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 2 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 8 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 웰 당 2000만 내지 6000만개의 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 6 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 10 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 웰 당 1억 내지 3억개의 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 비여과된다. 비여과된 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 간소화할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올 (BME)이 결여된다.
한 실시양태에서, 포유동물로부터의 종양 조직 샘플을 수득하고; 종양 조직 샘플을 그 안의 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 배양하고; 종양 조직 샘플로부터 TIL을 수득하고; TIL의 수를 aAPC를 사용하여 그 안의 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 약 14일 내지 약 42일, 예를 들어, 약 28일의 지속기간 동안 확장시키는 것을 포함하는 방법의 지속기간.
한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 109 내지 약 1 × 1011개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 109개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 1010개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 1011개의 aAPC를 사용한다.
한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:105, 1:110, 1:115, 1:120, 1:125, 1:130, 1:135, 1:140, 1:145, 1:150, 1:155, 1:160, 1:165, 1:170, 1:175, 1:180, 1:185, 1:190, 1:195, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 및 1:500으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:90이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:95이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:100이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:105이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:110이다.
한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL 내지의 IL-2를 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, TIL에 대한 급속 확장 프로세스는 이전에 기재된 바와 같이 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) 또는 기체 투과성 배양장치 (G-렉스 플라스크, 미국 미네소타주 뉴 브링톤에 소재하는 윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션으로부터 시판됨)를 사용하여 수행될 수 있다. T-175 플라스크에서의 TIL 급속 확장을 위해, 150 mL의 배지에 현탁된 1 × 106개의 TIL을 각각의 T-175 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL을 aAPC와 함께 1 TIL 대 100 aAPC의 비로 배양할 수 있으며, 세포를 mL 당 3000 IU (국제 단위)의 IL-2 및 ml 당 30 ng의 항-CD3 항체 (예를 들어, OKT-3)로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양하였다. T-175 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 배양할 수 있다. 배지의 반을 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 제5일에 교환할 수 있다. 제7일에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 리터 백에서 합하고, 5％ 인간 AB 혈청을 갖는 300 mL의 AIM V 및 mL 당 3000 IU의 IL-2를 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가하였다. 각각의 백 중의 세포의 수를 매일 또는 2일마다 카운팅하고, 신선한 배지를 첨가하여 세포 카운트를 0.5 내지 2.0 × 106개 세포/mL로 유지하였다.
한 실시양태에서, 100 cm 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 기체 투과성 플라스크 (G-렉스 100, 미국 미네소타주 뉴 브링톤에 소재하는 윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션으로부터 시판됨)에서의 TIL 급속 확장을 위해, 5 × 106 또는 10 × 106개의 TIL을 aAPC와 함께 1 대 100의 비로 5％ 인간 AB 혈청, mL 당 3000 IU의 IL-2 및 mL 당 30 ng의 항-CD3 (OKT-3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 배양할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 제거하고, 원심분리 병 내로 정치하고, 1500 rpm (분 당 회전수; 491 × g)으로 10분 동안 원심분리할 수 있다. TIL 펠릿을 5％ 인간 AB 혈청, mL 당 3000 IU의 IL-2로 보충된 150 mL의 신선한 배지로 재-현탁시키고, 원래 G-렉스 100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 G-렉스 100 플라스크에서 일련적으로 확장되는 경우, 제7일에 각각의 G-렉스 100 중의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁시킬 수 있고, 세포 현탁액을 3개의 G-렉스 100 플라스크를 시딩하는 데 사용될 수 있는 3개의 100 mL 분취액으로 나눌 수 있다. 그 후, 5％ 인간 AB 혈청 및 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후에 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 G-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 세포를 배양의 제14일에 수확할 수 있다.
한 실시양태에서, TIL을 하기와 같이 제조할 수 있다. 2 mm3 종양 단편을 2 mM 글루타민 (미디아테크, 인코포레이티드 (Mediatech, Inc.), 미국 버지나아주 마나사스), 100 U/mL 페니실린 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈 (Invitrogen Life Technologies)), 100 μg/mL 스트렙토마이신 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈), 5％ 열-불활성화된 인간 AB 혈청 (밸리 바이오메디칼, 인코포레이티드 (Valley Biomedical, Inc.), 미국 버지니아주 윈체스터) 및 600 IU/mL rhIL-2 (키론 (Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌)로 보충된 AIM-V 배지 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 구성된 완전 배지 (CM)에서 배양한다. 고형 종양의 효소적 소화를 위해, 종양 시편을 RPMI-1640 내로 다이싱하고, 세척하고, 800 rpm에서 5분 동안 15 내지 22 ℃에서 원심분리하고, 효소적 소화 완충제 (RPMI-1640 중 0.2 mg/mL 콜라게나제 및 30 단위/mL의 DN아제)에 재현탁시키고, 이어서 실온에서 밤새 회전시킨다. 단편으로부터 확립된 TIL을 CM에서 3 내지 4주 동안 성장시키고, 10％ 디메틸술폭시드 (DMSO)를 갖는 열-불활성화된 HAB 혈청에서 신선하게 또는 냉동보존하여 확장시키고, 연구의 시간까지 -180 ℃에서 저장할 수 있다. 복수 집합물로부터 수득된 종양 연관된 림프구 (TAL)를 CM에서 24 웰 플레이트의 3 × 106개 세포/웰로 시딩하였다. TIL 성장을 약 2일마다 저-전력 반전 현미경을 사용하여 조사하였다.
한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 용기에서 확장된다. 기체-투과성 용기는 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2005/0106717 A1호에 기재된 것들을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 방법, 조성물, 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장시키는 데 사용되었다. 한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 백에서 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 주리 세포 확장 시스템 (Xuri Cell Expansion System) W25 (GE 헬스케어 (GE Healthcare))를 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 주리 세포 확장 시스템 W5 (GE 헬스케어)로도 공지된 웨이브 바이오리액터 시스템 (WAVE Bioreactor System)을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 11 L, 약 12 L, 약 13 L, 약 14 L, 약 15 L, 약 16 L, 약 17 L, 약 18 L, 약 19 L, 약 20 L, 약 25 L, 및 약 30 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 50 내지 150 mL, 150 내지 250 mL, 250 내지 350 mL, 350 내지 450 mL, 450 내지 550 mL, 550 내지 650 mL, 650 내지 750 mL, 750 내지 850 mL, 850 내지 950 mL, 및 950 내지 1050 mL로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 1 L 내지 2 L, 2 L 내지 3 L, 3 L 내지 4 L, 4 L 내지 5 L, 5 L 내지 6 L, 6 L 내지 7 L, 7 L 내지 8 L, 8 L 내지 9 L, 9 L 내지 10 L, 10 L 내지 11 L, 11 L 내지 12 L, 12 L 내지 13 L, 13 L 내지 14 L, 14 L 내지 15 L, 15 L 내지 16 L, 16 L 내지 17 L, 17 L 내지 18 L, 18 L 내지 19 L, 및 19 L 내지 20 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 0.5 L 내지 5 L, 5 L 내지 10 L, 10 L 내지 15 L, 15 L 내지 20 L, 20 L 내지 25 L, 및 25 L 내지 30 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 및 약 28일의 로킹 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 30분 내지 1시간, 1시간 내지 12시간, 12시간 내지 1일, 1일 내지 7일, 7일 내지 14일, 14일 내지 21일, 및 21일 내지 28일의 로킹 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2 록 (rock)/분, 약 5 록/분, 약 10 록/분, 약 20 록/분, 약 30 록/분, 및 약 40 록/분의 로킹 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2 록/분 내지 5 록/분, 5 록/분 내지 10 록/분, 10록/분 내지 20 록/분, 20 록/분 내지 30 록/분, 및 30 록/분 내지 40 록/분의 로킹 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2°, 약 3°, 약 4°, 약 5°, 약 6°, 약 7°, 약 8°, 약 9°, 약 10°, 약 11°, 및 약 12°의 로킹 각도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2° 내지 3°, 3° 내지 4°, 4° 내지 5°, 5° 내지 6°, 6° 내지 7°, 7° 내지 8°, 8° 내지 9°, 9° 내지 10°, 10° 내지 11°, 및 11° 내지 12°의 로킹 각도를 이용한다.
한 실시양태에서, aAPC를 사용하여 TIL을 확장시키는 방법은 TIL이 우수한 종양 반응성을 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법이 우수한 종양 반응성을 위한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. TIL의 확장에 대해 기재된 본 발명의 상기 실시양태 중 임의의 것은 또한 T 세포의 확장에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 CD8+ T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 CD4+ T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 키메라 항원 수용체 (CAR-T)로 형질도입된 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 변형된 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. CAR-T 세포는 관련 기술분야에, 예를 들어, 이들의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,070,995호; 제7,446,190호; 제8,399,645호; 제8,916,381호; 및 제9,328,156호에 기재된 바와 같이, CD19를 비롯한 임의의 적합한 항원에 대해 표적화될 수 있다. 변형된 TCR 세포는 관련 기술분야에, 예를 들어, 이들의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,367,804호 및 제7,569,664호에 기재된 바와 같이, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원성 부분을 비롯한 임의의 적합한 항원에 대해 표적화될 수 있다.
암 및 다른 질환을 치료하는 방법
본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 과다증식성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 이들은 또한 본원에 및 하기 단락에 기재된 바와 같은 다른 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 TIL, 그의 집단 및 조성물은 질환의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL, 집단 및 조성물은 과다증식성 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종, 췌장암, 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 확산 거대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 소포 림프종, 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및 (c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 제1 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 제1 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 10배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계; (c) 제2 세포 배양 배지에서 aAPC의 제2 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고, 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계; (d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다. 한 실시양태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 10배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계; (c) 제2 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고, 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계; (d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 환자가 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리학적 허용될 때까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
지시된 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 예방하고/거나, 관리하는 데 있어서 본원에 기재된 화합물 및 화합물의 조합의 효능은 인간 질환의 치료에 대한 지침을 제공하는 관련 기술분야에 공지된 다양한 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 난소암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92]; 및 [Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12]에 기재되어 있다. 췌장암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 문헌 [Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294]에 기재되어 있다. 유방암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212]에 기재되어 있다. 흑색종에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60]; 및 [Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32]에 기재되어 있다.
화학요법으로의 비-골수절제 림프구고갈
한 실시양태에서, 본 발명은 환자가 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 TIL의 집단이 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료된 환자를 치료하기 위한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 TIL의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리학적 허용될 때까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2 (알데스류킨, 프로류킨으로서 시판됨)의 정맥내 주입을 받는다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프구고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ("시토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 있어서 핵심적 역할을 함을 지시한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 aAPC-확장된 TIL의 도입 전에 환자에 대한 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 이용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈 또는 시클로포스파미드 (마포스파미드로 지칭되는 활성 형태) 및 이들의 조합의 투여를 사용하여 달성된다. 이러한 방법은 문헌 [Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85], [Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681], [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239], 및 [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL 내지 10 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 2 내지 7일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 4 내지 5일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 4 내지 5일 동안 25 mg/kg/일로 투여된다.
일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/ml 내지 10 μg/ml의 농도로 얻어진다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 얻어진다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 정맥내로 (i.v.) 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 2 내지 7일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 4 내지 5일 동안 250 mg/m2/일로 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 4일 동안 250 mg/m2/일로 정맥내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈은 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 함께 환자에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 25 mg/m2/일로 정맥내로 투여되고, 시클로포스파미드는 250 mg/m2/일로 정맥내로 4일에 걸쳐 투여된다.
한 실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
제약 조성물, 투여량, 및 투약 처방
한 실시양태에서, 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 확장된 TIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 확장된 TIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, TIL은 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속되는 단일 주입, 예컨대 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여된다. 다른 적합한 투여 경로로는 복강내, 경막내, 및 림프내 투여를 들 수 있다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 특히 암이 흑색종인 경우, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010개의 TIL이 투여되며, 평균은 약 7.8×1010개의 TIL이다. 한 실시양태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010개의 TIL이 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013개이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013개이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 예를 들어, 제약 조성물의 100％, 90％, 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 19％, 18％, 17％, 16％, 15％, 14％, 13％, 12％, 11％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 0.4％, 0.3％, 0.2％, 0.1％, 0.09％, 0.08％, 0.07％, 0.06％, 0.05％, 0.04％, 0.03％, 0.02％, 0.01％, 0.009％, 0.008％, 0.007％, 0.006％, 0.005％, 0.004％, 0.003％, 0.002％, 0.001％, 0.0009％, 0.0008％, 0.0007％, 0.0006％, 0.0005％, 0.0004％, 0.0003％, 0.0002％ 또는 0.0001％ w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 90％, 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 19.75％, 19.50％, 19.25％, 19％, 18.75％, 18.50％, 18.25％, 18％, 17.75％, 17.50％, 17.25％, 17％, 16.75％, 16.50％, 16.25％, 16％, 15.75％, 15.50％, 15.25％, 15％, 14.75％, 14.50％, 14.25％, 14％, 13.75％, 13.50％, 13.25％, 13％, 12.75％, 12.50％, 12.25％, 12％, 11.75％, 11.50％, 11.25％, 11％, 10.75％, 10.50％, 10.25％, 10％, 9.75％, 9.50％, 9.25％, 9％, 8.75％, 8.50％, 8.25％, 8％, 7.75％, 7.50％, 7.25％, 7％, 6.75％, 6.50％, 6.25％, 6％, 5.75％, 5.50％, 5.25％ 5％, 4.75％, 4.50％, 4.25％, 4％, 3.75％, 3.50％, 3.25％, 3％, 2.75％, 2.50％, 2.25％, 2％, 1.75％, 1.50％, 125％, 1％, 0.5％, 0.4％, 0.3％, 0.2％, 0.1％, 0.09％, 0.08％, 0.07％, 0.06％, 0.05％, 0.04％, 0.03％, 0.02％, 0.01％, 0.009％, 0.008％, 0.007％, 0.006％, 0.005％, 0.004％, 0.003％, 0.002％, 0.001％, 0.0009％, 0.0008％, 0.0007％, 0.0006％, 0.0005％, 0.0004％, 0.0003％, 0.0002％ 또는 0.0001％ w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.0001％ 내지 약 50％, 약 0.001％ 내지 약 40％, 약 0.01％ 내지 약 30％, 약 0.02％ 내지 약 29％, 약 0.03％ 내지 약 28％, 약 0.04％ 내지 약 27％, 약 0.05％ 내지 약 26％, 약 0.06％ 내지 약 25％, 약 0.07％ 내지 약 24％, 약 0.08％ 내지 약 23％, 약 0.09％ 내지 약 22％, 약 0.1％ 내지 약 21％, 약 0.2％ 내지 약 20％, 약 0.3％ 내지 약 19％, 약 0.4％ 내지 약 18％, 약 0.5％ 내지 약 17％, 약 0.6％ 내지 약 16％, 약 0.7％ 내지 약 15％, 약 0.8％ 내지 약 14％, 약 0.9％ 내지 약 12％ 또는 약 1％ 내지 약 10％ w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.001％ 내지 약 10％, 약 0.01％ 내지 약 5％, 약 0.02％ 내지 약 4.5％, 약 0.03％ 내지 약 4％, 약 0.04％ 내지 약 3.5％, 약 0.05％ 내지 약 3％, 약 0.06％ 내지 약 2.5％, 약 0.07％ 내지 약 2％, 약 0.08％ 내지 약 1.5％, 약 0.09％ 내지 약 1％, 약 0.1％ 내지 약 0.9％ w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 실시양태의 제약 조성물에 제공되는 TIL은 폭넓은 투여량 범위에 걸쳐 유효하다. 정확한 투여량은 투여의 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료되는 대상체의 성별 및 연령, 치료되는 대상체의 체중, 담당 의사의 선호도 및 경험에 의존할 것이다. TIL의 임상적으로-확립된 투여량은 또한 적절할 경우 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여되는 제약 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 상태의 중증도, 투여의 경로, 활성 제약 성분의 성향 및 처방하는 의사의 재량에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 1년 당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투약은 1개월에 1회, 2주마다 1회, 1주에 1회, 또는 2일마다 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 길게 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013개이다. 일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013개의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
TIL의 유효량은 단일 또는 다중 용량으로, 비내 및 경피 경로, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 비롯한 유사한 유용성을 갖는 작용제의 투여의 수용되는 투여 방식 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
실시예
본원에 포함된 실시양태를 이하 하기 실시예를 참고로 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본원에 포함된 개시내용은 어떤 식으로도 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에서 제공된 교시사항의 결과로서 명백하게 되는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1 - PBMC 공급자 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장의 가변성
PBMC 공급자 세포의 사용에 의해 얻어진 TIL 확장의 가변성은 환자로부터 수득된 TIL의 동일한 주에 대한 다수의 TIL 확장의 결과를 비교함으로써 입증될 수 있다. 도 1은 방사선조사된 동종이형 PBMC 공급자 세포 (PBMC 공급자)를 사용한 TIL의 급속 확장의 전형적인 결과를 예시한다. M1015T 및 M1016T로 표지된 2가지 TIL 주 (1.3 × 105개의 세포)를 46가지 상이한 방사선조사된 공급자 세포 로트 (1.3 × 107개), IL-2 (3000 IU/mL, 재조합 인간 IL-2 (예를 들어, 알데스류킨 또는 등가물), 셀제닉스, 인코포레이티드, 미국 뉴햄프셔주 포츠마우스) 및 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 밀테니 바이오텍 게엠베하, 독일 버기쉬 글라드바흐)과 함께 T25 플라스크에서 7일 동안 공동-배양하였다. TIL에 대한 배수 확장 값을 제7일에 계산하였다. 도면은 별개의 자극 실험에서의 2가지 TIL 주에 대한 배수 확장의 수를 나타낸다. 각각의 TIL 주에 대해, 46가지 상이한 PBMC 공급자 로트를 시험하였다. 결과는 각각의 TIL 주에 대해 100배 초과에 걸친 범위이며, PBMC 공급자 세포를 사용한 확장 결과의 가변성을 강조한다. 본 발명의 aAPC는 하기 실시예에 나타난 바와 같이, PBMC 공급자에 비해 확장 성능의 감소된 가변성, 뿐만 아니라 다른 이점을 제공한다.
실시예 2 - aAPC 개발을 위한 골수성 세포의 선택
표현형적 특징화를 다양한 골수성-계통 세포주에 대해 수행하여 TIL 확장을 위한 aAPC로의 추가의 변형을 위한 잠재적 후보를 확인하였다. 결과를 표 5에 요약한다. MOLM-14 세포주는 CD64의 내인성 발현을 나타내었으며, 추가의 개발을 위해 선택되었다. EM-3 세포주는 ICOS-L의 내인성 발현의 관찰 (동일한 환자로부터 취했음에도 불구하고, EM-2 세포주에 대해서는 관찰되지 않았음)에 기초하여 선택되었다.
<표 5>
aAPC에 대한 후보 세포주 상에 내인적으로 발현된 공동자극 분자의 요약. CML은 만성 골수성 백혈병을 지칭하고, AML은 급성 골수성 백혈병을 지칭한다. "Pop"은 마커를 발현하는 것으로 관찰된 세포의 집단을 지칭한다 (1/2 pop = 50％).
Figure pat00005
실시예 3 - MOLM-14 인공 항원 제시 세포 (aMOLM14 aAPC)의 제조
MOLM-14 세포를 라이프니츠-인스티투트 DSMZ-도이치 삼룽 본 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로부터 얻었다. MOLM-14 기재 aAPC를 개발하기 위해, MOLM-14 세포를 공동자극 분자 CD86 및 4-1BBL (CD137L)로 조작하였다. 인간 CD86 (hCD86) 및 인간 4-1BBL (h4-1BBL) 유전자를 시판되는 PLV430G 내로 클로닝하고, 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 PDONR221 벡터 (인비트로젠/써모 피셔 사이언티픽, 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 공동-형질감염시켰다. 게이트웨이 클로닝 방법을 문헌 [Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589]에 기재된 바와 같이 사용하여, hCD86 및 hCD137L 유전자를 PLV430G 및 PDONR221 벡터 상으로 클로닝하였다. 293T 세포주 (거대 T 항원으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포)를 렌티바이러스 제조에 사용하고, MOLM-14 세포에 형질도입하였다. 형질감염된 세포를 APC-접합된 CD86 및 PE-접합된 CD137L을 사용하여 분류하여 (S3e 세포 분류기, 바이오-래드 (Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘레스) 세포를 단리하고 풍부화하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다.
클로닝에 사용된 벡터 및 그의 부분은 도 2 내지 도 11에 나타내고, 각각의 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열은 표 6에 주어진다. pLV430G 인간 4-1BBL 벡터는 도 2에 예시하고, 폴리머라제 연쇄 반응 생성물 (PCRP) 부분은 도 3에 나타낸다. pLV430G 인간 CD86 벡터는 도 4에 예시하고, PCRP 부분은 도 5에 나타낸다. pDONR221 인간 CD86 공여자 및 인간 4-1BBL 공여자 벡터는 각각 도 6 및 도 7에 나타낸다. 게이트웨이 클로닝 방법을 위한 비어있는 pLV430G 목표 벡터 및 비어있는 pDONR221 공여자 벡터의 도해는 각각 도 8 및 도 9에 나타낸다. 도 10 및 도 11은 렌티바이러스 제조에 사용된 psPAX2 및 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
<표 6>
aAPC의 형질도입을 위한 렌티바이러스의 제조를 위한 뉴클레오티드 서열.
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
조작된 MOLM-14 aAPC (본원에서 aMOLM14 aAPC로도 지칭됨) 상의 CD86 및 4-1BBL의 발현을 유동 세포측정 (칸토 (Canto) II 유동 세포측정기, 벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니 (Becton, Dickinson, and Co.), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 사용하여 확인하였으며, 결과를 도 12에 나타낸다. aMOLM-14 aAPC를 100 Gy에서 γ-선조사하고, 동결시켰다.
실시예 4 - MOLM-14 인공 항원 제시 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장
조작된 MOLM-14 세포를 100 Gy에서 감마-선조사한 후, TIL과 공동-배양하였다. TIL을 방사선조사된, 조작된 MOLM-14 세포와 함께 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 함유하는 CM2 배지에서 14일 동안 배양함으로써 REP를 개시하였다. REP 수확 시, TIL 확장 속도, 활성화 및 분화 단계 마커에 대한 표현형, 대사 속도, 세포독성 및 재-급속 확장 프로토콜 (재-REP) 검정을 측정하였다.
결과를 도 13, 도 14, 도 15, 및 도 16에 나타내며, 여기서, 환자 TIL의 2개의 세트에 대한 2개의 확장을 비교한다. CD86/4-1BBL 변형된 MOLM-14 세포 ("TIL + 조작된 MOLM14 + OKT3"으로 표지됨)로의 결과는 PBMC 공급자 ("TIL + 공급자 + OKT3"으로 표지됨)와 필적한다.
제14일에서의 결과를 도 17에서 비교하며, 여기서, 2개의 추가의 환자 TIL로부터의 결과를 나타낸다. 결과는 CD86 및 4-1BBL로 조작된 MOLM-14 세포가 동종이형 공급자 세포와 비교할 경우 급속 확장 프로토콜에서 유사한 TIL 확장을 나타내었음을 지시한다. 그러나, 모 MOLM-14와 함께 배양된 TIL은 확장되지 않았다.
또한, MOLM-14에 대해 확장된 TIL은 TIL 표현형을 유지하였고, BRLA를 사용하여 측정된 바와 같이 P815 세포를 살해하는 효능을 나타내었으며, 이는 실시예 9에 상세하게 기재한다. 간략하게, 루시페린-형질도입된 P815 표적 세포 및 관심의 TIL을 항-CD3과 함께 및 없이 공동-배양하여 TIL의 종양 반응성이 TCR 활성화 (특이적 살해) 또는 비-특이적 살해를 통해서인지 여부를 측정하였다. 4시간의 인큐베이션 후, 루시페린을 웰에 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하였다. 백분율 세포독성 및 백분율 생존을 하기 식을 사용하여 계산하였다: ％ 생존 = (실험적 생존-최소)/ (최대 신호-최소 신호) × 100 또는 ％ 세포독성 = 100 - (％ 생존).
도 18에서, TIL 대 MOLM-14 aAPC의 낮은 비로 수행된 확장의 결과를 PBMC 공급자로의 확장의 결과와 비교하여 나타낸다. TIL (2 × 104개)을 상이한 TIL 대 aAPC 또는 PBMC 비 (1:10, 1:30, 및 1:100, 각각 "10", "30", 및 "100"으로 나타내어짐)로, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 갖는 모 MOLM-14 ("MOLM14") 세포, CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("PBMC+")와 함께 24-웰 G-렉스 플레이트에서 배양하였다. 대조군을 단지 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 사용하여 수행하였다 ("PBMC-"). 각각의 조건을 삼중으로 배양하였다. 배양물을 제4일 및 제7일에 신선한 배지 및 IL-2로 공급하였다. 생존성 세포를 제7일에 카운팅하였다. 도 18은 제11일에 카운팅된 생존성 세포 수의 평균 더하기 표준 편차 (SD)를 나타내며, p-값은 스튜던트 t-검정에 의해 계산된다. 추가의 대조군 실험을 TIL 단독, PBMC 단독, 및 aMOLM-14 세포 단독을 사용하여 수행하였으며, 이들 모두는 비검출가능한 세포 수를 초래하였다 (데이터는 나타내지 않음). 결과는 OKT-3 및 IL-2를 갖는 1:100 (TIL:aMOLM14)의 비가 OKT-3 및 IL-2를 갖는 PBMC 공급자와 비교할 경우 유사한 확장을 생성함을 나타낸다 (p = 0.0598).
도 19에서, TIL 대 MOLM-14 aAPC의 보다 높은 비로 수행되고, 그렇지 않다면 도 18에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행된 확장의 결과를 PBMC 공급자로의 확장의 결과와 비교하여 나타낸다. 1:300의 비에서, OKT-3 및 IL-2를 갖는 CD86/4-1BBL 변형된 MOLM-14 aAPC는 OKT-3 및 IL-2를 갖는 PBMC 공급자를 유의하게 능가한다. 이들 결과는 도 20 및 도 21에 나타낸 반복 실험에서 상이한 TIL 배치를 사용하여 확인되었다. 특히, 도 21에서 보여지는 바와 같이, 1:200의 TIL 대 aMOLM14 비는 동일한 조건 하에서 PBMC 공급자에 비해 향상된 TIL 확장을 나타낸다. 이들 결과는 aMOLM14 aAPC가 특히 1:200 내지 1:300의 TIL:aMOLM14 비를 사용한 경우 PBMC보다 TIL 수를 확장시키는 관점에서 예상치 않게 우수함을 확인시켜 준다.
도 22 및 도 23에서, aMOLM14 또는 PBMC로 확장된 TIL을 유동 세포측정 분석에 의해 비교하여 TIL이 유사한 표현형을 나타내었으며, 환자 내로의 재주입 시 유사하게 수행할 것으로 예상될 것임을 확인하였다. 간략하게, TIL을 먼저 L/D 아쿠아로 염색하여 생존성을 측정하였다. 다음으로, 세포를 TCR α/β PE-Cy7, CD4 FITC, CD8 PB, CD56 APC, CD28PE, CD27 APC-C7, 및 CD57-PerCP-Cy5.5로 표면 염색하였다. 10,000 내지 100,000개의 세포를 전방 광 산란 (FSC)/측방 광 산란 (SSC)에 따라 칸토 II 유동 세포측정기 (벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 게이팅함으로써 표현형 분석을 수행하였다. 데이터를 시토뱅크 (Cytobank) 소프트웨어에 의해 분석하여 선버스트 도해 및 SPADE (밀도 정규화된 사건의 스패닝 트리 수열 (Spanning Tree Progression of Density Normalized Event)) 분석을 생성하였다. 게이트를 형광 마이너스 원 (FMO) 대조군에 기초하여 설정하였다. aMOLM14에 대해 확장된 TIL은 PBMC 공급자와 비교할 경우 CD8+ TIL을 증가시킨다. 이론에 구애되지는 않지만, 이 향상된 CD8+ TIL 백분율은 MOLM14에 대해 조작된 4-1BBL의 존재에 기인할 수 있다. CD28, CD57, 및 CD27 분화 마커의 발현의 차이는 없다. 추가의 유동 세포측정 데이터는 도 24에 나타내어지고, 살아있는, TCR α/β+, CD4+ 또는 CD8+ TIL 상에 게이팅된 기억 하위세트 (CD45RA+/-, CCR7+/-)를 나타내는 유동 세포측정 등고선 플롯을 나타내며, 이는 PBMC 공급자로 얻어진 기억 하위세트가 aMOLM14 aAPC에 의해 복제됨을 지시한다.
CD3+ 세포를 사용하여 aMOLM14 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4 및 CD8 SPADE 트리를 도 25 및 도 26에 나타낸다. 색상 구배는 LAG3, TIL3, PD1 및 CD137 또는 CD69, CD154, KLRG1 및 TIGIT의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다. 이론에 구애되지는 않지만, 결과는 aMOLM14에 대해 확장된 TIL의 2개의 배치가 확성화를 겪었지만, aMOLM14 aAPC 및 PBMC 공급자 사이에 MFI의 차이는 없었음을 나타내며, 이는 aMOLM14 aAPC가 PBMC 공급자로 얻어진 TIL 표현형적 결과를 효과적으로 복제함을 지시한다.
aMOLM14 또는 PBMC에 대해 확장된 TIL을 또한 대사 프로파일에 대해 분석하였다. 방사선조사된 PBMC 공급자 또는 aMOLM14 aAPC로의 확장 후의 TIL의 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포외 산성화 속도 (ECAR)를 이중 미토콘드리아-당분해 스트레스 시험을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 세포를 pH 7.4에서 10 mM 글루코스, 1 mM 피루브산나트륨, 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 검정 배지 (XF 검정 배지 (XF Assay Medium), 애질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라)에서 세척한 후, 1 × 105개의 생존성 세포를 접착체-코팅된 (셀-탁 (Cell-Tak)™ 코닝) XFp 세포 배양 마이크로플레이트 상으로 플레이팅하였다. 플레이트를 스핀하여 세포를 플레이트에 접착시킨 후, 세포 대사의 분석 전에 37 ℃에서 습화된, 비-CO2 인큐베이터에서 평형화시켰다. 미토콘드리아 및 당분해 스트레스 시험 실험을 하기 화합물을 세포의 미토콘드리아 및 당분해 호흡의 동시 분석을 위한 특정된 간격에서 순차적으로 주사하는 씨홀스 XFp 애널라이저 (Seahorse XFp Analyzer) (애질런트 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 수행하였다: 1 μM 올리고마이신; 0.5 μM FCCP; 50 mM 2-데옥시글루코스; 및 0.5 μM 각각의 로테논 및 안티마이신 A. 결과를 WAVE v2.3.0 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 및 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) v6.07 그래핑 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 도 27 및 도 28에 나타내며, 여기서, 점은 삼중으로 측정된 평균 ± SEM을 나타낸다. aMOLM14 aAPC 및 PBMC 공급자와 함께 성장된 TIL 둘 다는 유사한 산화적 인산화 및 당분해 거동을 나타낸다. 이 데이터는 aMOLM14가 PBMC 공급자와 비교할 경우 TIL의 대사 프로그래밍을 변경하지 않음을 시사한다.
실시예 5 - EM-3 인공 항원 제시 세포 (aEM3 aAPC)의 제조
EM-3 세포를 크리에이티브 바이오어레이, 인코포레이티드 (Creative Bioarray, Inc.) (미국 뉴욕주 셜리)로부터 얻었다. EM-3 기재 인공 APC를 개발하기 위해, EM-3 세포주를 CD86, 4-1BBL, 및 IgG Fc 영역에 대한 항체 (클론 7C12 또는 클론 8B3)로 조작하였다. 인간 CD86 및 인간 4-1BBL/CD137 유전자를 시판되는 PLV430G 내로 클로닝하고, 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 PDONR221 벡터 (인비트로젠)와 공동-형질감염시켰다. 게이트웨이 클로닝 방법을 문헌 [Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589]에 기재된 바와 같이 사용하여, hCD86 및 hCD137L 유전자를 PLV430G 및 PDONR221 벡터 상으로 클로닝하였다. 293T 세포주를 렌티바이러스 제조에 사용하고, EM-3 세포주에 대해 형질도입하였다. 형질감염된 세포를 APC-접합된 CD86 및 PE-접합된 CD137L을 사용하여 분류하여 (S3e 세포 분류기, 바이오래드, 미국 캘리포니아주 허큘레스) 세포를 단리하고 풍부화하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다. 7C12 및 8B3으로 지정된 단일-쇄 Fv (scFv) 항체 클론을 마우스 IgG1, IgG2a 및 IgG2b (비바 바이오테크 리미티드 (Viva Biotech Ltd.), 미국 일리노이주 시카고)의 Fc에 대해 생성하였다. 이들 scFv 클론의 아미노산 서열은 표 7 (서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28)에 주어진다. 생성된 scFv 클론을 OKT-3에 대한 Fc 결합 효율에 대해 스크리닝하고, 공동-리포터로서 eGFP를 함유하는 pLV4301G에 대해 조작하여 렌티바이러스를 제조하였다. 293T 세포주를 패키징 및 렌티바이러스 제조에 사용하였다. 조작된 EM-3 (CD86/CD137L) 세포를 렌티바이러스 시스템을 사용하여 형질도입하고, eGFP를 사용하여 분류하였다. EM37C12CD86CD137L 및 EM38B3CD86CD137L을 유동 세포측정에 의해 각각의 형질도입된 분자의 일관된 발현에 대해 규칙적으로 평가하였다.
<표 7>
scFv 클론 7C12 및 8B3의 아미노산 서열.
Figure pat00020
또한 aMOLM14 aAPC와 함께 사용하기 위해 순응될 수 있는 aEM3 aAPC의 제조를 위한 비-제한적 프로토콜을 하기 단락에 설명한다.
관심의 플라스미드의 분자 클로닝은 하기와 같이 수행될 수 있다. DONR 벡터를 생성하기 위해, 하기 칵테일을 사용할 수 있다: B 부위 플랭킹된 PCR 생성물 또는 목표 벡터 (예를 들어, 게이트웨이-순응된 렌티벡터) 50 내지 100 μg; DONR 벡터 (예를 들어, pDONR222) 50 내지 100 μg; BR 클로나제 II (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies)) 1 μL; 및 TE 완충제 (1 mM 트리스 (Tris), 0.1 mM EDTA, pH 8.0, 5 μL의 부피를 가져오는 충분량). 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 열 충격 방법 또는 전기천공에 의해 박테리아 형질전환을 수행한다. 목표 벡터를 생성하기 위해, 하기 칵테일을 사용할 수 있다: 재조합된 pDONR 벡터 (예를 들어, pDON222-유전자X) 50 내지 100 μg, 목표 벡터 (예를 들어, 게이트웨이 순응된 렌티벡터) 50 내지 100 μg, LR 클로나제 II (라이프 테크놀로지즈) 1 μL, 및 TE 완충제 (1 mM 트리스, 0.1 mM EDTA, pH 8.0, 5 μL의 부피를 가져오는 충분량). 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 화학 적격 형질전환/열 충격 방법에 의해 박테리아 형질전환을 수행한다.
형질전환 및 클로닝된 플라스미드의 선택은 하기와 같이 수행될 수 있다. 화학 적격 형질전환 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 선택을 위한 항생제를 갖는 영양 한천 플레이트 (LB-레녹스 (Lennox) 또는 YT)를 제조한다. 회수 배지 (Recovery Medium) (미국 위스콘신주 미들톤에 소재하는 루시젠 (Lucigen)에 의해 공급됨)는 실온에서 용이하게 이용가능하다. 임의로, 멸균 배양 튜브를 얼음 상에서 냉각시킬 수 있다 (예를 들어, 17 mm × 100 mm 튜브 (14 mL 튜브), 각각의 형질전환 반응에 대해 1개의 튜브). -80 ℃ 냉동고로부터 이. 클로니 (E. cloni) 세포 (루시젠)를 제거하고, 젖은 얼음 상에서 완전히 해동시킨다 (5 내지 15분). 임의로, 40 μL의 이. 클로니 세포를 냉각된 배양 튜브에 첨가한다. 1 내지 4 μL의 DNA 샘플을 40 μL의 세포에 첨가한다. 손가락으로 플리크한다 (공기 방울을 도입하고, 세포를 가온할 수 있는 상하로 피펫팅하여 혼합하지 않음). 세포/DNA 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 배양 튜브를 42 ℃ 수조에 45초 동안 정치함으로써 세포를 열 충격시킨다. 1.7 mL 튜브 또는 배양 튜브를 얼음에 2분 동안 복귀시킨다. 350 μL 실온 회수 배지를 세포에 또는 960 μL의 실온 회수 배지를 배양 튜브 중의 세포에 첨가한다. 튜브를 진탕 인큐베이터에 250 rpm에서 1시간 동안 37 ℃에서 정치한다. 100％ 이하의 형질전환 혼합물을 적절한 항생제를 함유하는 LB-레녹스 또는 YT 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 플레이팅 부피는 DNA에 따라 최적화될 필요가 있을 수 있다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한다. 형질전환된 클론을 임의의 풍부 배양 배지 (예를 들어, LB 또는 TB)에서 추가로 성장시킬 수 있다.
미니프렙 (Miniprep) (퀴아젠, 인코포레이티드 (Qiagen, Inc.), 미국 캘리포니아주 발렌시아)을 위한 콜로니는 하기와 같이 성장시킬 수 있다. 콜로니가 DNA 조작의 회수된 형질전환 반응 (예를 들어 LR 반응)을 플레이팅하는 것으로부터 형성된 후, 1 mL 바람직한 TB/항생제를 천공된 캡을 갖는 바람직한 수의 2 mL 에펜도르프 (Eppendorf) 마이크로튜브 내로 첨가한다. 바람직한 수의 콜로니를 ART LTS 20 μL 소프트 피펫 팁 (VWR 89031-352) 또는 10 μL 덴빌 (Denville) 팁을 사용하여 피킹한다. 팁을 천공된 캡을 갖는 2 mL 에펜도르프 마이크로튜브에 정치한다. 팁을 그것이 튜브에 적합하도록 커팅하고, 캡을 닫고, 튜브를 진탕기 (VWR 브랜드 15 mL 튜브를 갖는 자주색 15 mL 튜브 홀더) 상에 정치한다. 225 rpm/37 ℃에서 밤새 (16시간 이하 동안) 진탕한다. 밤새 인큐베이션 후, 각각의 팁을 그 안에 멸균수를 갖는 덴빌로부터의 클레이브팩 (ClavePak) 96 플레이트 중의 1 mL 튜브에 정치한다 (플라스미드를 스크리닝하고, 선택한 후에, 박테리아 스톡 생산을 만들기 위한 팁을 저장하기 위해). 미니프렙을 퀴아젠 미니 (Qiagen Mini) 프렙 키트 프로토콜 (퀴아젠, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 발렌시아)에 따라 수행한다. 플라스미드가 용리되면, 제한 소화를 수행하여 올바른 클론을 선택한다. 플라스미드를 선택한 후, 동일한 플라스미드 클론으로부터 저장된 팁을 사용하여 박테리아 스톡을 만드는 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 (E. coli)를 성장시킨다.
렌티바이러스 제조는 하기와 같이 수행될 수 있다. 하기 배지 조성물을 제조한다: 500 mL DMEM/F12 (시그마 (Sigma)); 25 mL FBS 열 불활성화된 (Heat Inactivated) (HI) (하이클론 (Hyclone)); 10 mM 헤페스 (라이프 테크놀로지즈); 1X 프리모신 (Primocin) (인비보젠 (Invivogen)); 1X 플라스모신 (Plasmocin) (인비보젠); 및 1X 2-머캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈). 90％ 융합성 293T 세포를 함유하는 T75 플라스크 (써모 피셔 사이언티픽)를 수확한다. 배지를 흡인한다. 10 ml PBS를 첨가하고, 부드럽게 세정하고, 흡인 제거한다. 2 mL 트립LE 익스프레스 (TrypLE Express) (라이프 테크놀로지즈)를 첨가하고, 이를 세포 층 상에 고르게 분포시키고, 37 ℃에서 3 내지 5분 동안 놓아 둔다 (세포 배양 인큐베이터). 10 mL 배지를 첨가하고, 세포를 상하로 피펫팅함으로써 분산시킨다. 다수의 플라스크가 있는 경우 합한다. 세포를 카운팅한다. 혈구계를 사용하여 농도를 측정하는 경우, 세포/mL = (카운팅된 세포의 수 × 희석율 × 104). T75 플라스크 내로 다시 분할하기 위해, 세포가 충분히 융합하는 데 필요한 시간을 측정하고, 그에 따라 희석한다. (세포는 16 내지 18시간마다 배가되며, 따라서 3일 = 1/27 희석). 일반적으로, 융합도가 2×105개 세포/cm2인 경우, 1일 당 2.5의 증배율이 사용될 수 있다. 부피를 배지의 25 mL까지 가져온다. 스톡의 적정을 위해 플레이팅하기 위해, 검정의 각각의 웰은 0.4 mL의 배지에서 5×104개의 세포를 요구한다. 293T 세포를 배지에서 2×104개 세포/mL로 조정한다. 24 웰 플레이트에 웰 당 1 mL를 플레이팅한다. 예를 들어, 월요일에 플레이팅된 세포는 화요일에 감염되고, 금요일에 유동 세포측정기 상에 구동될 수 있고, 목요일에 플레이팅된 세포는 금요일에 감염되고, 월요일에 유동 세포측정기 상에 구동된다. 패키징 형질감염을 위해 플레이팅하기 위해, T75 플라스크를 형질감염 1일 전에 6.8×106개의 세포로, 또는 형질감염의 아침에 1.7×106개의 세포로 시딩한다. (형질감염의 일에 시딩하는 것은 형질감염 효율의 변이를 감소시킬 수 있음). 플라스크 중의 부피를 배지로 25 mL까지 가져온다. 예를 들어, 월요일에 셋업된 플라스크는 화요일에 형질감염되고, 바이러스는 목요일 및 금요일에 수집된다. 일부의 경우 (예를 들어, 고 적정 구축물), 제2 수집은 생략될 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 패키징하기 위해, 각각의 T75 플라스크 형질감염은 2 μg 바쿨로 (Baculo) p35 플라스미드 (임의적; 단지 사멸 유전자를 패키징하는 경우에만 필요함), 2 μg VSV.G env 플라스미드 (예를 들어, pMD2.G 또는 PCIGO VSV-G); 4.7 μg Gag/폴리머라제 플라스미드 (예를 들어, psPAX2 또는 pCMV-델타R8.91), 및 2.3 μg의 상기 기재된 렌티바이러스 벡터를 요구한다. 모든 샘플에 필요한 VSV 및 R8.2/9.1 (+/-바쿨로) 플라스미드의 양을 측정한다 (많은 샘플을 제조하는 경우, 이들 DNA의 혼합물을 제조함). 각각의 T75 형질감염은 2 mL 옵티 (Opti)-MEM 배지 (써모 피셔 사이언티픽) 중 90 μL 리포펙타민 (LipofectAmine) 2000 (써모 피셔 사이언티픽)을 요구한다. 모든 샘플에 대해 충분한 옵티-Mem 및 리포펙타민 2000을 함유하는 믹스를 제조한다. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 놓아두고, 튜브 A로서 표지한다. 각각의 형질감염을 위해, 패키징 DNA 및 특이적 렌티바이러스 벡터 DNA를 500 μL 실온 옵티-MEM 배지에 마이크로튜브에 첨가하고, 혼합하고, B로서 표지한다. 튜브 B로부터의 500 μL의 DNA를 튜브 A 중의 2 mL의 리포펙타민 2000 믹스에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션한다. 배지를 패키징 플라스크로부터 흡인한다. 2.5 mL의 DNA/리포펙타민 복합체를 5 mL 옵티-MEM 배지에 첨가하고, 세포에 첨가한다 (293T 세포는 단지 반 부착성이기 때문에, 세포 상에 직접적으로 피펫팅하지 않음). 플레이트를 건조를 회피하기 위해 작은 군에서 프로세싱한다. 밤새 인큐베이션하고, 다음날 아침에 배지를 교환한다. 배지 교환의 24시간 후에 상청액을 수집한다. 상청액은 형질감염 후 48시간에 단일 수집으로, 또는 형질감염 후 48 및 72시간에 2개의 수집으로서 수확될 수 있다 (이 경우, 수확물은 풀링함). 이중 수집이 바람직한 경우, 제1일에 상청액을 피펫에 의해 수집하고, 20 mL의 신선한 배지로 대체한다. 플라스크 건조를 회피하기 위해, 한 번에 단지 5개의 플라스크로 작업한다. 수집된 상청액을 다음날 풀링할 때까지 4 ℃에서 유지한다. 상청액을 다음날 다시 냉각시키고, 적절할 경우 풀링한다. 상청액을 2000 rpm에서 5분 동안 스핀하여 임의의 오염성 293T 세포를 침전시킨다. 수확된 상청액을 프리-필터 디스크를 함유하는 0.45 μm 또는 0.8 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 여과 속도가 상대적으로 빠르도록 큰 충분한 여과 유닛을 사용한다. 농축할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 저장한다.
바이러스를 -80 ℃에서의 장기 저장을 위해 PEG-잇 방법 (시스템 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 (System Biosciences, Inc.), 미국 94303 캘리포니아주 팔로 알토)을 사용하여 농축시킬 수 있다. 상청액을 형질감염 플레이트로부터 수집한다. 상청액 중의 세포 데브리스를 스핀 다운시킨다. 상청액을 또한 여과하여 임의의 패키징 세포를 완전히 제거할 수 있다. 상청액의 부피의 1/4과 동등한 PEG-잇 용액의 양을 상청액에 첨가한다. 현탁액을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한다. 3500 rpm (1500 g)에서 4 ℃에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 3500 rpm에서 4 ℃에서 5분 동안 원심분리한다. 남아있는 상청액을 제거한다. 바이러스를 바람직한 양의 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 재현탁시키고, 분취액을 -80 ℃에서 동결시킨다.
렌티바이러스를 사용한 세포주의 형질도입은 하기와 같이 수행될 수 있다. 세포를 24 웰 플레이트에 웰 당 1×106 현탁액 세포 (형질도입 당 1 웰) 또는 24 웰 플레이트에서 부착 세포에 대해 50％ 융합도 (형질도입 당 1 웰)로 형질도입되도록 조정한다. 현탁된 세포에 대해, 세포의 농도를 1×107개 세포/mL로 조정하고, 24 웰 플레이트에 웰 당 100 μL를 플레이팅한다 (형질도입 당 1 웰). 부착 세포에 대해, 세포/cm2에 기초하여 형질도입의 일에 50％ 융합도를 달성하도록 플레이팅한다 (예를 들어, 293T 세포에 대해, 융합도 = 2×105개 세포/cm2). 웰 당 형질도입의 총 부피는 3 내지 10 μg/mL 폴리브렌 (Polybrene) (헥사디메트린 브로마이드, 시그마-알드리치 컴퍼니 (Sigma-Aldrich Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 갖는 대략 500 μL이어야 한다. 첨가된 농축된 바이러스의 양은 바람직한 MOI (감염의 다중도)에 의존할 것이다. 전형적인 MOI는 10:1이지만, 이는 세포 유형에 따라 다양할 수 있다. 형질감염 웰은 1×106개의 현탁액 세포 또는 50％ 융합성 세포를 함유하는 100 μL의 표준 배지를 함유해야 한다. 10:1의 MOI를 위해 (예를 들어, 바이러스 활성은 1×108 IU/mL이고, 표적은 1×106개의 세포를 감염시키는 경우, 1×107개의 비리온 또는 100 μL의 바이러스가 필요함). 표준 배지를 500 μL로 첨가한다. 폴리브렌을 3 μg/mL (1차 세포) 내지 10 μg/mL (종양 세포주)로 첨가한다. 플레이트(들)를 1800 rpm에서 1.5 내지 2시간 동안 30 ℃에서 스핀시킨다. 플레이트(들)를 37 ℃/5％ CO2에서 조직 배양 인큐베이터를 사용하여 5시간 동안 내지 밤새 인큐베이션한다. 배지를 교환한다. 형질도입의 72시간 후, 충분한 세포가 이용가능한 경우, 유동 세포측정 분석을 수행하여 형질도입 효율을 시험한다.
aAPC의 분류는 하기와 같이 수행될 수 있다. 세포를 상기 기재된 배지에서 세포 카운트가 최소 1000만 내지 2000만에 도달할 때까지 배양한다. 각각의 조건에 대해 1×106개의 세포를 취하고, 형질도입된 단백질에 대한 항체로 염색한다. 세포를 세척하고, 유동 세포측정에 의해 분석하여 형질도입의 안정성을 시험한다. 관심의 단백질의 발현이 분석되고 확인되면, 세포의 나머지를 분류를 위해 준비한다. 세포를 S3 분류기에서 관심의 마커 상에 게이팅함으로써 분류한다. 분류된 세포를 상기 언급된 배지를 사용하여 배양한다. 바이알을 동결시키기 전에, 관심의 단백질 발현의 안정성을 시험한다. 회수 세포 배양 동결 배지 (인비트로젠)를 사용하여 동일한 세포의 세포 뱅크를 제조한다. 세포를 각각의 형질도입 및 분류 절차 후에 뱅킹할 수 있다.
7C12 및 8B3 scFv 클론 (서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30) 및 그들의 렌티바이러스 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열 정보는 표 8에 주어진다. pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그 벡터의 생성에 사용된 서열은 서열식별번호: 31 내지 서열식별번호: 34로서 제공되며, 도 29 내지 도 32에 나타낸다. pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그 벡터의 생성에 사용된 서열은 서열식별번호: 35 내지 서열식별번호: 38로서 제공되며, 도 33 내지 도 36에 나타낸다.
<표 8>
aAPC의 형질도입을 위한 렌티바이러스의 제조를 위한 뉴클레오티드 서열.
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
본원에 기재된 실험에 사용된 조작된 EM-3 aAPC (본원에서 aEM3 aAPC로도 지칭됨)의 제조에서, CD86 및 4-1BBL의 발현을 유동 세포측정 (칸토 II 유동 세포측정기, 벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 사용하여 확인하였으며, 결과를 도 37에 나타낸다. aEM3 aAPC를 100 Gy에서 γ선-조사하고, 동결시켰다.
상기 기재된 바와 같이, CD86, IgG Fc 영역에 대한 항체, 및 4-1BBL (또는 임의로 4-1BBL 없이)을 발현하도록 이전에 형질도입된 aEM-3 세포를 유사한 렌티바이러스 형질도입 접근법을 사용하여 공동-자극 인간 OX-40L로 유전자 조작하였다. 인간 OX-40L을 함유하는 렌티바이러스를 생성하기 위해, VSV-G 외피 플라스미드 (pCIGO-VSV.G)와 함께 p렌티-C-Myc-DDK OX40L (PS100064, 오리진 (Origene), 서열식별번호: 39, 도 90) 벡터를 폴리제트 (PolyJet) (시그나젠 래버러토리즈 (Signagen Laboratories), 미국 매릴랜드주 록빌)를 사용하여 피닉스 (Phoenix)-GP (ATCC CRL-3215) 세포주 내로 공동-형질감염시켰다. 상청액을 60시간 후에 수확하고, 울트라셀 (Ultracel)-100 막을 갖는 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 유닛 (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)을 사용하여 농축시켰다. 그 후, aEM-3 세포를 농축된 렌티바이러스로 감염시키고, 5일 동안 추가로 확장시켰다. 세포를 PE-접합된 항-인간 OX40L, 브릴란트 바이올렛 (Brilliant Violet) 421-접합된 항-인간 CD137L (4-1BBL이 사전 aEM-3 세포에 포함되는 경우), 및 PE/Cy7 접합된 항-인간 CD86으로 염색하고, GFP, OX40L, CD137L (포함되는 경우), 및 CD86의 발현에 기초하여 S3e 세포 분류기 (바이오-래드, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 분류하였다. 분류된 세포의 순도를 유동 세포측정을 사용하여 추가로 확인하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다.
실시예 6 - EM-3 인공 항원 제시 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장
TIL을 확장시키는 EM-3 aAPC (aEM3)의 능력을 시험하기 위한 실험을 수행하였다. TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 함께 1:100 비로 OKT-3 (30 mg/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다. 결과를 도 38 및 도 39에서 TIL의 2개의 배치에 대해 플롯팅한다. 또한, TIL을 aEM3 또는 PBMC 공급자와 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 OKT-3 (30 mg/mL)과 함께 또는 없이 공동-배양하였다. 결과를 도 40에 플롯팅하며, 여기서, 막대 그래프는 제11일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 41은 상이한 TIL:aAPC 비에서의 EM-3 aAPC (aEM3)로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. 결과는 aEM3 aAPC가 특히 1:200의 비에서 보다 긴 배양 시간 (14일)에서, PBMC에 필적하게, 및 일부의 경우 그보다 더 양호하게 수행함을 나타낸다.
도 42는 PBMC 공급자에 비해 EM-3 aAPC (aEM3)로의 TIL 확장으로부터의 세포 카운트의 낮은 가변성을 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aEM3 (삼중으로)과 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다. 도 43은 EM-3 aAPC 및 MOLM-14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 비교하여, TIL (2 × 104개)에 비해 aEM3 및 aMOLM14 둘 다에 대한 세포 카운트의 가변성이 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aMOLM14 (삼중으로) 또는 aEM3 (또한 삼중으로)과 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였음을 예시한다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였으며, 그래프는 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다. aEM3 및 aMOLM14 결과는 훨씬 더 큰 일관성이 종래 기술에서 선호되는 PBMC 공급자 접근법에 비해 둘 다의 aAPC로 얻어질 수 있음을 지시한다.
aEM3 또는 PBMC 공급자에 대해 확장된 TIL을 4개의 상이한 패널 (분화 패널 1 및 2, T 세포 활성화 패널 1 및 2)을 사용한 유동 세포측정 분석에 사용하였다. 간략하게, TIL을 먼저 L/D 아쿠아로 염색하여 생존성을 측정하였다. 다음으로, 세포를 분화 패널 1에 대해 TCR α/β PE-Cy7, CD4 FITC, CD8 PB, CD56 APC, CD28 PE, CD27 APC-Cy7, 및 CD57-PerCP-Cy5.5; 분화 패널 2에 대해 CD45RA PE-Cy7, CD8a PerCP/Cy5, CCR7 PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, CD38 APC, 및 HLA-DR PB; T 세포 활성화 패널 1에 대해 CD137 PE-Cy7, CD8a PerCP-Cy5.5, Lag3 PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, PD1 APC, 및 Tim-3 BV421; 또는 T 세포 활성화 패널 2에 대해 CD69 PE-Cy7, CD8a PerCP/Cy5.5, TIGIT PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, KLRG1 ALEXA 647, 및 CD154 BV421로 표면 염색하였다. 10,000 내지 100,000개의 세포를 칸토 II 유동 세포측정기를 사용하여 FSC/SSC에 따라 게이팅함으로써 표현형 분석을 수행하였다. 데이터를 시토뱅크 소프트웨어 (시토뱅크, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 분석하여 선버스트 도해 및 SPADE (밀도-정규화된 사건의 스패닝-트리 수열 분석) 플롯을 생성하였다. 게이트를 형광 마이너스 원 (FMO) 대조군에 기초하여 설정하였다. SPADE 플롯을 세포의 군으로 생성하고, 표면 마커의 발현 수준에 기초하여 관련된 노드의 형태로 특징화하였다. CD4+ 및 CD8+ TIL 하위세트를 CD3+ 게이팅에 기초하여 측정하고, 트리를 생성하였다. 선버스트 시각화를 도 44 및 도 45에 나타낸다. 도 44는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 TIL이 PBMC 공급자에 대해 확장된 동일한 TIL과 비교할 경우 CD8+ 표현형을 유지하였음을 나타낸다. 도 45는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 상이한 환자로부터의 TIL의 제2 배치의 결과를 나타내며, 여기서, CD8+ 세포의 명확한 증가 (65.6％)가 PBMC 공급자를 사용한 확장으로부터의 결과 (25％)에 비해 나타난다.
CD3+ 세포를 사용하여 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4 및 CD8 SPADE 트리를 도 46 및 도 47에 나타낸다. 색상 구배는 LAG3, TIL3, PD1 및 CD137 또는 CD69, CD154, KLRG1 및 TIGIT의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다. 이론에 구애되지는 않지만, 결과는 aEM3 aAPC로 확장된 TIL이 활성화를 겪었지만, aEM3 aAPC 및 PBMC 공급자 사이에 MFI의 차이가 없었음을 나타내며, 이는 aEM3 aAPC가 PBMC 공급자로 얻어진 표현형적 결과를 효과적으로 복제함을 지시한다.
여분 호흡 능력 (SRC) 및 당분해 예비력을 또한 PBMC 공급자에 비해 aEM3 aAPC로 확장된 TIL에 대해 평가하였으며, 결과를 도 48 및 도 49에 나타낸다. 씨홀스 XF 세포 미토 스트레스 시험은 미토콘드리아에서의 전자 수송 쇄의 성분을 표적화하는 호흡의 조정인자를 사용하여, 세포의 산소 소비 속도 (OCR)를 직접적으로 측정함으로써 미토콘드리아 기능을 측정한다. 시험 화합물 (하기 기재된 올리고마이신, FCCP, 및 로테논 및 안티마이신 A의 믹스)을 일련적으로 주사하여 ATP 생성, 최대 호흡, 및 비-미토콘드리아 호흡을 각각 측정하였다. 그 후, 양성자 누출 및 여분 호흡 능력을 이들 파라미터 및 기저 호흡을 사용하여 계산한다. 각각의 조정인자는 전자 수송 쇄의 특이적 성분을 표적화한다. 올리고마이신은 ATP 신타제 (복합체 V)를 억제하고, 올리고마이신의 주사 후의 OCR의 감소는 세포 ATP 생성과 연관된 미토콘드리아 호흡과 상관된다. 카르보닐 시아나이드-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존 (FCCP)은 양성자 구배를 붕괴시키고, 미토콘드리아 막 전위를 파괴하는 비커플링제이다. 그 결과, 전자 수송 쇄를 통한 전자 유동은 비억제되고, 산소는 복합체 IV에 의해 최대로 소비된다. 그 후, FCCP-자극된 OCR을 사용하여 최대 호흡 및 기저 호흡 사이의 차로서 정의되는 여분 호흡 능력을 계산할 수 있다. 여분 호흡 능력 (SRC)은 증가된 에너지 요구에 반응하는 세포의 능력의 척도이다. 제3 주사는 로테논, 복합체 I 억제제, 및 안티마이신 A, 복합체 III 억제제의 믹스이다. 이 조합은 미토콘드리아 호흡을 폐쇄하며, 미토콘드리아 외부에서의 프로세스에 의해 유도된 비미토콘드리아 호흡의 계산을 가능하게 한다.
도 50은 PBMC 공급자 또는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 살아있는 TIL의 미토콘드리아 염색을 예시한다. 미토트래커 염료는 살아있는 세포에서 미토콘드리아를 염색하며, 그의 축적은 막 전위에 의존한다. PBMC 공급자 또는 aEM3에 대해 확장된 TIL을 L/D 아쿠아, 이어서 미토트래커 적색 염료로 염색하였다. 데이터는 살아있는 집단 상에 게이팅된 미토트래커 양성 (MFI) 세포를 나타낸다.
실시예 7 - 조작된 MOLM-14 (aMOLM14) 및 EM-3 (aEM3) aAPC의 비교
이전의 실시예에 기재된 바와 같이, PBMC 공급자 및 aMOLM14 및 aEM3 aAPC로 확장된 TIL을 세포독성 효능에 대해 BRLA를 사용하여 기능적 활성에 대해 평가하였다. P815 BRLA는 실시예 9에 상세하게 기재한다. 결과는 도 51 및 도 52에 나타내며, aAPC로 확장된 TIL이 PBMC 공급자로 확장된 것들과 유사한 기능적 특성 (및 예상되는 임상적 효능)을 가짐을 나타낸다.
상기 기재된 바와 같은 PBMC 공급자 및 aMOLM14 및 aEM3 aAPC로 확장된 TIL로부터의 IFN-γ 방출 및 그란자임 B 방출을 또한 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로의 밤샘 자극 후에 평가하였다. IFN-γ 방출 결과를 도 53 및 도 54에 나타내고, 그란자임 B 방출 결과를 도 55 및 도 56에 나타낸다. IFN-γ 방출 및 그란자임 B 방출의 유의하고 놀라운 증가가 PBMC 공급자로 확장된 것들에 비해 aEM3 aAPC로 확장된 TIL에 대해 관찰되었으나, aMOLM14 aAPC에 의해 확장된 TIL에 대해서는 관찰되지 않았다. 이론에 구애되지는 않지만, 이는 aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL이 암 요법으로서 생체내에서 보다 활성일 수 있음을 시사한다. 관찰된 대부분의 다른 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
aEM3 및 aMOLM14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 표 9에 요약한다.
<표 9>
aAPC로의 TIL 확장 결과의 요약.
Figure pat00036
실시예 8 - aEM3 및 aMOLM14 aAPC에 대한 마스터 세포 뱅크의 제조
aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 하기 배지 조성물에서 성장시켜 마스터 세포 뱅크를 제조할 수 있으며, 이를 aAPC의 공급을 위해 이 배지에서 추가로 성장시킬 수 있다: 500 mL의 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMEM/F12 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스), 50 mL 소 태아 혈청 (FBS) 열 불활성화된 (HI) (하이클론); 10 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (헤페스 완충제) (라이프 테크놀로지즈); 1X 프리모신 (인비보젠); 1X 플라스모신 (인비보젠), 및 1X 2-머캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈).
aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 비롯한 본원에 기재된 aAPC를 또한 세포의 성장에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 마스터 세포 뱅크로부터 성장시킬 수 있다. 한 실시양태에서, aAPC를 해동한 후, 80 내지 90％ RPMI 1640 + 10 내지 20％ h.i. FBS (소 태아 혈청) 배지에서, 포화된 배양물을 1:2 내지 1:3으로 2 내지 3일마다 분할하고, 24-웰 플레이트에서 약 0.5 내지 1×106개 세포/mL로 시딩하고, 37 ℃ 및 5％ CO2에서의 인큐베이션과 함께 약 0.5 내지 1.5×106개 세포/mL에서 유지함으로써 확장시킨다.
인간 요법의 생성에서 본 발명의 특정 실시양태의 aAPC를 사용하는 데 채용될 수 있는 추가의 단계는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 세포주 특징화 (HLA 고해상도 타이핑); 시토카인 방출 시험; aAPC를 성장시키는 FBS를 대체하는 인간 혈청의 시험; aAPC를 동결시키는 동결 배지의 시험; 마스터 세포 뱅킹 (원료 시험 및 안정성 시험을 포함함); 방사선조사의 표준화 (방사선조사 용량 (1000, 3000, 5000, 10000, 15000 rad), 신선한 대 동결된 aAPC, 및 TIL과 함께/없이를 포함함); aAPC의 안정성; aAPC의 오염을 평가하기 위한 패널의 개발; 분자 생물학 검정 (qPCR, DNA 시퀀싱)의 개발; 흑색종, 자궁경부암, 및 두경부암을 비롯한 상이한 종양 유형으로부터의 TIL 확장의 시험 (G-렉스 5M을 사용함); 효능, 순도, 및 동일성 시험; 미코플라스마 및 무균성 검정; 미생물학적 시험 (USP/EP 무균성, 미생물오염도 및 내독소 검정); 및 우발적인 바이러스제 시험을 포함한다.
실시예 9 - TIL을 확장시키는 방법 및 확장된 TIL로 암을 치료하는 방법
TIL은 본 발명의 특정 실시양태의 aAPC, 예컨대 aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 사용하여, 본원에 기재된 확장 방법 중 임의의 것을 사용하여 확장될 수 있다. 예를 들어, TIL을 확장시키는 방법을 도 57에 나타낸다. aAPC를 사용한 TIL의 확장은 본원에 기재된 환자에서 암을 치료하는 임의의 방법과 추가로 조합될 수 있다. 확장이 aAPC (aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 포함함)를 사용하는 것인 TIL을 확장시키고, 확장된 TIL로 환자를 치료하는 방법을 도 58에 나타낸다.
실시예 10 - P815 생물발광 재지정 용해 검정
이 실시예에서, 생물발광 재지정 용해 검정 (BRLA)에서 TIL의 용해 잠재성을 평가하기 위한 대리 표적 세포주의 개발을 설명한다. BRLA는 자가 종양 세포의 부재 하에서의 T 세포 매개된 살해의 평가를 가능하게 한다. 세포용해 활성을 1 내지 4시간에 T 세포 수용체의 결속과 함께 및 없이 평가할 수 있으며, 이는 T 세포 수용체에 결속하면서, 및 소위 림포카인 활성화된 살해 활성 (LAK) 없이 T 세포 살해를 평가한다.
내인성 CD16 Fc 수용체를 발현하는 마우스 비만세포종 P815 세포는 항-CD3ε (OKT-3)에 결합하여, 표적 세포주로서 강력한 TCR 활성화 신호를 제공한다. P815 클론 G6을 eGFP 및 반딧불이 루시페라제에 기초하여 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 분류하고, BD FACS아리아 (FACSAria) II를 사용하여 클로닝하였다. 클론 G6을 인텔리시트 아이큐 스크리너 (Intellicyt iQue Screener)를 사용하여 분석된 eGFP 강도에 기초하여 선택하였다. 표적 세포 및 관심의 TIL을 +/- OKT-3 공동-배양하여 TCR 활성화 (특이적 살해) 또는 비-특이적 (림포카인 활성화된 살해, LAK)을 각각 평가하였다. 4시간의 인큐베이션 후, 반딧불이 루시페린 ((4S)-2-(6-히드록시-1,3-벤조티아졸-2-일)-4,5-디히드로티아졸-4-카르복실산, 다수의 공급원으로부터 시판됨)을 웰에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션하였다. 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하였다. 퍼센트 세포독성 및 생존을 하기 식을 사용하여 계산하였다: ％ 생존 = (실험적 생존 - 최소)/(최대 신호 - 최소 신호) × 100; ％ 세포독성 = 100 - (％ 생존). 공동-배양된 TIL의 배지 상청액에서의 인터페론 감마 방출을 ELISA에 의해 분석하고, TIL 상의 LAMP1 (CD107a, 클론 eBioH4A3) 발현을 유동 세포측정기 상에서 분석하여 TIL의 세포독성 효능을 평가하였다.
결과를 도 59 내지 도 75에 나타낸다. 도 59는 BRLA에 의한 개별적 이펙터:표적 비에서 P815 클론 G6 (항-CD3과 함께 및 없이)과 공동-배양된 TIL 배치 M1033T-1의 퍼센트 독성을 예시한다. 도 60은 상이한 비의 이펙터 대 표적 세포에 대해 방출된 IFN-γ의 양을 나타내는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터를 예시한다. 도 61은 항-CD3의 존재 하에서 1:1 이펙터 대 표적 세포의 비로 4시간 및 24시간 공동-배양 동안 P815 클론 G6과 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1에 의해 발현된 LAMP1 (％)을 예시한다.
결과를 TIL 배치 M1030에 대한 BRLA를 예시하는 도 62에 나타낸 바와 같은 제2 TIL 배치를 사용하여 확인하였다. BRLA에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 26 ± 16이다. 도 63은 TIL 배치 M1030에 대한 표준 크로뮴 방출 검정의 결과를 예시한다. 크로뮴 방출 검정에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 22이다.
결과를 제3 TIL 배치를 사용하여 추가로 확인하였다. 도 64는 TIL 배치 M1053에 대한 BRLA 결과를 예시하며, 이는 BRLA에 의한 TIL의 용해 단위를 70 ± 17로서 나타낸다. 도 65는 TIL 배치 M1053에 대한 표준 크로뮴 방출 검정의 결과를 예시하며, 이는 크로뮴 검정에 의한 TIL의 용해 단위를 14 ± 5로서 나타낸다. 2가지 검정 결과의 비교는 크로뮴 방출 검정 결과에 대한 BRLA 결과의 필적하는 성능을 나타낸다.
도 66은 IFN-γ 방출 및 TIL의 세포독성 잠재성 사이의 선형 관계를 예시한다. 도 67은 IFN-γ에 대한 엘리스폿 결과를 예시한다. 도 68은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다. 도 69는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다. 도 70은 M1053T 및 M1030T에 의한 그란자임 B 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 도 71은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다. 도 72는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다. 도 73은 M1053T 및 M1030T에 의한 TNF-α 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 도 74는 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다. 도 75는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다. 도 66 내지 도 76에서의 데이터는 또한 BRLA에 의해 나타내어진 바와 같이 TIL의 이들 배치의 효능을 확인시켜 준다.
결론적으로, BRLA는 방사성핵종을 요구하지 않으며, 전통적인 세포독성 검정만큼 효율적이고 민감성이다. 개별적 시점에서의 TIL의 Lamp 1 발현의 유동 세포측정 평가는 BRLA에 의해 나타난 효능에 비해 세포독성 T 세포의 탈과립화를 입증한다. BRLA는 표준 크로뮴 방출 검정보다 유사하거나 더 양호한 효능을 입증한다. BRLA는 또한 TIL 용해 활성의 효능의 평가를 가능하게 한다. BRLA과 크로뮴 방출 검정의 비교는 BRLA의 효율 및 신뢰성을 나타낸다. BRLA는 TIL에 의한 IFNγ 방출과 선형 관계를 갖는다. 엘리스폿에 의한 IFN-γ, TNFα 및 그란자임 B의 방출 검정은 BRLA에 의해 평가된 TIL의 세포독성 효율과 일치한다.
실시예 11 - EM3 세포를 FBS로부터 hAB 혈청으로 이행하기 위한 프로세스
반응성을 회피하기 위해, 일부 세포주는 한 배지로부터 또다른 배지로 이행될 필요가 있을 수 있다. 여기서, EM3 세포를 FBS로부터 hAB 혈청으로 이행하여 반응성을 회피하였다. 도 76에 나타낸 바와 같이, aEM3 세포는 FBS로부터 hAB 혈청으로 성공적으로 이행하였다.
실시예 12 - 동결 배지 제형 최적화
본원에 기재된 바와 같이 배양된 EM3 세포를 크리오뱅킹하기 위해, 방법은 동결 배지 제형을 최적화하였다. 도 77에 나타난 바와 같이, 3가지 동결 배지를 사용하고, 세포 수에 대한 그들의 효과를 카운팅하였다. 이용된 세포 배지는 크리스토르 (CryStor) 10 (바이오라이프 솔루션즈 (CS10)) (A), hAB [90％] 및 DMSO [10％] (B), 및 DMSO [10％] 및 cDMEM2 [70％]를 갖는 hAB [20％] (C)를 포함하였다. 도 77은 인간 AB 혈청 (90％) 및 DMSO (10％)의 제형이 3일의 회수 후에 예상치 않게 증가된 EM3 세포 수를 제공하였음을 입증한다.
실시예 13 - GREX 플라스크에서의 aEM3 세포의 성장
aEM3 세포를 기체 투과성 세포 배양 플라스크 (즉, GREX 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링))에서 배양하고, 세포 배가 시간에 대한 효과를 8일 시간 과정에 걸쳐 관찰하였다. 도 78에 나타난 바와 같이, GREX 플라스크는 aEM3 세포의 급속 성장을 제공하였다.
실시예 14 - aEM3 세포 순도를 측정하기 위한 유동 패널 분석
본원에 기재된 프로세스에 따라 배양된 세포의 순도를 측정하기 위해, 유동 패널 분석을 사용하여 aEM3 aAPC의 순도를 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 79 및 80에 기재한다. 도 80에 나타난 바와 같이, 분류하기 전에 aEM3 세포 집단은 aEM3 7C12 및 aEM3 8B5 세포에 대해 각각 53.5％ 및 43.2％ eGFP+였다. 분류후, 세포 집단은 aEM3 7C12 및 aEM3 8B5 세포에 대해 각각 96.8％ 및 96.3％ eGFP+로 개선되었다 (도 80).
실시예 15 - PBMC 공급자에 대한 대안으로서 aEM3 공급자 세포
본원에 기재된 바와 같이, aEM3 세포는 PBMC 공급자에 대한 대안으로서 사용될 수 있으며, 이는 TIL 확장 프로세스 및 생성된 TIL 둘 다에 대한 예상치 않은 상이한 특성을 초래한다. 시토카인 발현의 차이를 비교하기 위해, PBMC 및 aEM3 세포를 OKT-3으로의 처리에 의해 자극하였다. 도 81에 나타난 바와 같이, aEM3 세포는 PBMC에 비해 비교적 상이한 시토카인 발현 프로파일을 나타내었다. 놀랍게도, 본 발명의 aEM3 세포는 통상적인 PBMC로 확장된 TIL의 동일한 시토카인 분비 특성을 재현하지 않고, 효율적인 TIL (본원에 나타난 바와 같음)을 제공한다.
실시예 16 - 완전 배지 및 혈청 무함유 배지 TIL 확장 사이의 비교
TIL 확장 프로토콜을 최적화하기 위해, 몇몇 TIL 확장 실험을 본원에 기재된 바와 같이, 그러나 완전 배지 (CM1)라기 보다는 혈청 무함유 배지로 수행하였다.
한 실험에서, 조직 단편을 300 IU/mL의 IL-2를 갖는 CM1 또는 다양한 혈청 무함유 배지로 단일 웰에서 배양하였다. 그 후, 세포를 제11일에 카운팅한 후, REP를 개시하였다. 사용된 다양한 혈청 무함유 배지는 프라임 CDM (어바인), CTS 옵티마이저 (써모피셔), 및 엑스비보-20 (론자)을 포함하였다. 도 82에 나타난 바와 같이, CTS로의 TIL 확장 (REP전)은 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공하였다.
추가적으로, 조직 단편을 제11일까지 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 CM1 또는 다양한 혈청 무함유 배지로 배양하였다. 그 후, REP를 제11일에 PBMC 공급자, OKT-3, 및 IL-2를 사용하여 개시하고, 배양물을 제16일에 분할하였다. 그 후, 배양을 제22일의 종료 시에 종결시켰다. 사용된 다양한 혈청 무함유 배지는 프라임 CDM (어바인), CTS 옵티마이저 (써모피셔), 및 엑스비보-20 (론자)을 포함하였다. 도 83 및 도 84에 나타낸 바와 같이, 제11일 및 제22일에 각각 세포를 카운팅한 경우, 프라임 CDM으로의 TIL 확장 (REP전)은 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공하였다.
실시예 17 - 혈청-기재 배지에 비해 혈청 무함유 배지에서의 aAPC의 성장
혈청의 부재 하에서의 aAPC 성장 및 유지 프로토콜을 최적화하기 위해, aEM3 세포를 다양한 혈청 무함유 배지를 사용하여 배양하였다.
aEM3 세포를 24 웰 플레이트에서 웰 당 1 ×106 세포로 3일 동안, 한 군의 세포는 혈청-기재 배지 (cDMEM (10％ h혈청))를 제공하고, 다른 군의 세포는 혈청 무함유 배지를 제공한 것을 제외하고는 본원에 기재된 바와 같은 일반적 세포 배양 프로토콜을 사용하여 배양하였다. 연구에 이용된 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보 20 (론자), 프라임-TCDM (어바인), 및 XFSM (메센컬트) 배지를 포함하였다. 그 후, 세포를 제3일에 카운팅하였다.
도 85에 나타낸 바와 같이, CTS 옵티마이저 및 프라임-TCDM 혈청 무함유 배지는 혈청-기재 배지 (즉, cDMEM (10％ h혈청))에 필적한 세포 성장을 제공하였다. 따라서, 혈청 무함유 배지는 혈청-기재 배지에 비해 aAPC를 성장시키고 유지하기 위한 효과적인 대안이다.
실시예 18 - aAPC의 번식, 유지, 및 냉동보존
이 실시예에서, aAPC의 제조 및 보존을 위한 절차가 제공된다. 구체적으로, TIL-Rs3으로 지정된 세포주로부터의 aEM3 세포를 번식시키고, 냉동보존하였다.
aEM3 세포의 해동 및 회수는 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 냉동보존된 aEM3 세포를 CTS 옵티마이저 베이셜 배지 (써모 피셔), CTS 옵티마이저 세포 보충물 (써모 피셔), 겐타미신 (론자), 및 글루타맥스 (라이프 테크놀로지즈)로부터 제조된 예비-가온된 배지 (37 ℃)에서 서시히 가온시켰다. 그 후, 현탁된 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 생성된 상청액을 버리고, 나머지 aEM3 세포를 상기 배지에 재현탁시키고, 플레이팅하였다 (6 웰 플레이트의 웰 당 5 × 106개 세포 / 10 mL).
aEM3 세포의 번식은 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 배지의 분취액을 기체 투과성 세포 배양 플라스크 (즉, GREX 10 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링))에서 제조한다. 플레이팅된 aEM3 세포를 원심분리 (즉, 1500 rpm, 5분 동안 4 ℃에서)에 의해 세척하고, 배지에 재현탁시키고, GREX 플라스크에 1 내지 2 × 106개 세포/mL의 세포 밀도로 첨가하였다. aEM3 세포 현탁액을 30 mL의 배지로 희석한 후, GREX 플라스크를 3 내지 4일 동안 37 ℃에서 CO2 하에서 인큐베이션하였다. 3 내지 4일 후, GREX 플라스크를 인큐베이터로부터 제거하고, 생물학적 안전성 캐비넷 (BSC)에 정치하였다. 배양된 aEM3 세포를 피펫에 의해 GREX 플라스크로부터 주의깊게 추출하고, 생성된 추출물을 원심분리하여 증가된 수의 aEM3 세포를 제공하고, 이를 GREX 10 플라스크 당 10 내지 20 × 106 세포의 세포 밀도로 재현탁시킬 수 있다.
aEM3 세포의 대안적 냉동보존은 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. aEM3 세포를 함유하는 상기 GREX 10 플라스크를 인큐베이터로부터 제거하고, BSC에 정치한다. 배양된 aEM3 세포를 피펫에 의해 GREX 플라스크로부터 주의깊게 추출하고, 생성된 추출물을 원심분리하여 증가된 수의 aEM3 세포를 제공하고, 이를 크리스토르 10 (바이오라이프 솔루션즈)의 부피에 재현탁시켜 크리오바이알 중 10 내지 100 × 106개 세포/바이알의 농도를 제공한다. aEM3 세포 현탁액을 동결 용기에 정치하고, -80 ℃ 냉동고로 옮길 수 있다.
실시예 19 - 냉동보존 후의 aEM3 세포의 급속 회수의 입증
TIL-R3 세포주 (1 내지 2 × 106개의 세포)로부터의 aEM3 세포를 실시예 18에 제시된 절차에 따라 CS-10 냉동보존 배지를 사용하여 냉동보존하였다. 그 후, 이러한 세포의 바이알을 해동시키고, 세포를 카운팅하였다. 세포 카운트를 동결전, 해동후, 및 해동 후 3일 (즉, 해동후 회수)에 취하였다. 도 86 및 도 87에 나타낸 바와 같이, 총 살아있는 세포 카운트는 2회의 별개의 실험에서 해동후 급속하게 회수되었다.
TIL-R3 세포 (1 × 106개의 세포)를 해동시키고 (해동후 제3일), 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 0.5 × 106개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 제0일 및 제3일에, 생존성 세포를 카운팅하고, 기록하였다. 제1 계대 시 (제6일), 세포를 2 × 106개 세포/cm2 또는 0.5 × 106개 세포/cm2의 밀도로 분할하였다. 제1 계대의 종료 시, 세포 카운트를 수행하였다. 생성된 세포 카운트를 도 88에 나타내며, 이는 해동후 회수 상 및 성장 상 둘 다를 입증한다.
더욱이, TIL-R3 세포 (20 × 106개의 세포)를 실시예 18에 기재된 절차에 따라 GREX 10 플라스크에서 2 × 106개 세포/cm2의 밀도로 배양하였다. 제4일 및 제8일에, 살아있는 세포를 카운팅하고, 기록하였다. 생성된 세포 카운트를 도 89에 나타내며, 이는 세포가 13.9 ×106개 세포/cm2의 밀도에 도달한 경우 제4일 및 제8일 사이에 플라토에 도달하는 냉동보존 후의 세포의 성장 상을 입증한다.
실시예 20 - aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL의 CD8 왜곡, 확장 성능, 및 CD3 오염
15가지 상이한 REP전 TIL 주 (0.4 × 105개의 세포)를 aEM3 aAPC (상기 기재된 바와 같음) 또는 PBMC 공급자 (10 × 106개), OKT3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하고, 배양물을 제5일에 6 웰 Grex 플레이트를 사용하여 분할하였다. 배양물을 제11일에 샘플링하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CD8+ 세포의 상대 비를 식 (CD8％ aEM3)/(CD8％ PBMC)에 의해 계산하였다. 도 91에 나타낸 결과는 aEM3 세포와 함께 배양된 TIL이 놀랍게도 CD8+ 왜곡 및 개선된 TIL 생성물을 촉진시킴을 지시한다. 이들 실험의 추가의 결과를 도 92, 도 93, 및 도 94에 나타내며, 여기서, 결과는 aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL이 PBMC 공급자와 함께 배양된 TIL에 비해 필적하는 확장 및 더 적은 비-CD3+ 세포 오염을 나타내었음을 나타낸다.
실시예 21 - 텔로미어 길이 측정
게놈 DNA를 qPCR (정량적 폴리머라제 연쇄 반응) 검정을 위해 REP전 또는 REP후 (CD3+에 대해 분류된 자기 비드) TIL로부터 단리하여 텔로미어 길이를 측정하였다. 실시간 qPCR 방법은 문헌 [Cawthon, Nucleic Acids Res. 2002, 30(10), e47]; 및 [Yang, et al., Leukemia, 2013, 27, 897-906]에 기재되어 있다. 간략하게, 텔로미어 반복 카피 수 대 단일 유전자 카피 수 (T/S) 비를 96-웰 형식에서 PCR 열 시클러 (바이오-래드 래버러토리즈, 인코포레이티드 (Bio-Rad Laboratories Inc.))를 사용하여 측정하였다. 10 ng의 게놈 DNA를 텔로미어 또는 헤모글로빈 (hgb) PCR 반응에 사용하였으며, 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
Tel-1b 프라이머 (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT) (서열식별번호: 40);
Tel-2b 프라이머 (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT) (서열식별번호: 41);
hgb1 프라이머 (GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC) (서열식별번호: 42); 및
hgb2 프라이머 (CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) (서열식별번호: 43).
모든 샘플을 텔로미어 및 헤모글로빈 반응 둘 다에 의해 분석하였으며, 분석을 동일한 플레이트 상에서 삼중으로 수행하였다. 시험 샘플 외에도, 각각의 96-웰 플레이트는 1301 인간 T-세포 백혈병 세포주 (시그마 및 ATCC로부터 이용가능함)로부터 단리된 게놈 DNA를 사용한 0.08 ng 내지 250 ng의 5-점 표준 곡선을 함유하였다. 각각의 샘플에 대한 T/S 비 (-dCt)를, 중위 텔로미어 Ct 값으로부터 중위 헤모글로빈 역치 주기 (Ct) 값을 뺌으로써 계산하였다. 상대 T/S 비 (-ddCt)를 각각의 미지의 샘플의 T/S 비로부터 10.0 ng 표준 곡선 점의 T/S 비를 뺌으로써 측정하였다.
결과를 도 95에 나타낸다. 나타내어진 각각의 데이터 점은 상대 T/S 비의 중위 측정이다. 결과는 aEM3과 함께 배양된 TIL이 그들의 텔로미어 길이를 유지함을 지시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. <120> ENGINEERED ARTIFICIAL ANTIGEN PRESENTING CELLS FOR TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTE EXPANSION <130> 116983-5002-WO <150> 62/415,274 <151> 2016-10-31 <150> 62/438,600 <151> 2016-12-23 <150> 62/475,053 <151> 2017-03-22 <150> 62/481,831 <151> 2017-04-05 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab light chain <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-2 <400> 3 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 85 90 95 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 115 120 125 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aldesleukin <400> 4 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 120 125 Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-7 <400> 5 Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 35 40 45 Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 50 55 60 Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 65 70 75 80 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 85 90 95 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 130 135 140 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-15 <400> 6 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser 115 <210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-21 <400> 7 Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 1 5 10 15 Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 20 25 30 Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 50 55 60 Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 85 90 95 Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 100 105 110 Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 115 120 125 Ser Glu Asp Ser 130 <210> 8 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD86 <400> 8 Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly 1 5 10 15 Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu 20 25 30 Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val 35 40 45 Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu 50 55 60 Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile 85 90 95 Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr 100 105 110 Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 115 120 125 Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn 130 135 140 Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro 145 150 155 160 Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr 165 170 175 Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp 180 185 190 Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met 195 200 205 Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile 225 230 235 240 Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val 245 250 255 Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn 260 265 270 Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln 275 280 285 Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala 290 295 300 Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp 305 310 315 320 Thr Cys Phe <210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL <400> 9 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 10 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human OX40L <400> 10 Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 85 90 95 Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 100 105 110 Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 115 120 125 Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 11 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD28 <400> 11 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 12 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CTLA-4 <400> 12 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 13 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BB <400> 13 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 14 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human OX40 <400> 14 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 15 <211> 7569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLV430G human 4-1BBL vector <400> 15 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttcg ccaccatgga atacgcctct gatgccagcc 2760 tggaccccga agctccttgg cctcctgccc ctagagccag agcctgtaga gtgctgcctt 2820 gggctctggt ggctggcctt ctccttctgc tgctgctggc cgctgcctgc gctgtgtttc 2880 tggcttgtcc ttgggccgtg tcaggcgcca gagcttctcc tggatctgcc gccagcccca 2940 gactgagaga gggacctgag ctgagccccg atgatcctgc cggactgctg gatctgagac 3000 agggcatgtt cgcccagctg gtggcccaga acgtgctgct gatcgatggc cccctgagct 3060 ggtacagcga tcctggactg gctggcgtgt cactgacagg cggcctgagc tacaaagagg 3120 acaccaaaga actggtggtg gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttt cagctggaac 3180 tgcggagagt ggtggccggc gaaggatccg gctctgtgtc tctggcactg catctgcagc 3240 ccctgagatc tgctgcaggc gctgctgcac tggccctgac agtggacctg cctccagcct 3300 ctagcgaggc cagaaactcc gcattcgggt ttcaaggcag actgctgcac ctgtctgccg 3360 gccagagact gggagtgcat ctgcacacag aggccagagc cagacacgcc tggcagctga 3420 cacagggcgc tacagtgctg ggcctgttca gagtgacccc cgaaattcca gccggcctgc 3480 ccagccctag aagcgagtag gacccagctt tcttgtacaa agtggtgatt cgagttaatt 3540 aagctagcct agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt 3600 cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt 3660 taccgctgtt accaattttc ttttgtcttt gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa 3720 gagatggggt tactctctaa attttatggg ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc 3780 acaagaacac atcatacaaa aaatcaaaga atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc 3840 tattgattgg aaagtatgtc aacgaattgt gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac 3900 acaatgtggt tatcctgcgt tgatgccttt gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt 3960 cactttctcg ccaacttaca aggcctttct gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt 4020 tgcccggcaa cggccaggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg 4080 cttggtcatg ggccatcagc gcatgcgtgg aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac 4140 tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac 4200 tgataactct gttgtcctat cccgcaaata tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc 4260 tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc 4320 ggacgaccct tctcggggtc gcttgggact ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg 4380 accgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc 4440 ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac 4500 caaatattgc ccaaggtctt acataagagg actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc 4560 gaccttgagg catacttcaa agactgtttg tttaaagact gggaggagtt gggggaggag 4620 attaggttaa aggtctttgt actaggaggc tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca 4680 ccatggcgca atcactagag cggggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta 4740 gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca ctcccaacga 4800 agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg 4860 gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg 4920 cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc 4980 ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat 5040 ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat 5100 aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 5160 cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta 5220 tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5280 cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccggatcc cttgagtggc 5340 tttcatcctg gagcagactt tgcagtctgt ggactgcaac acaacattgc ctttatgtgt 5400 aactcttggc tgaagctctt acaccaatgc tgggggacat gtacctccca ggggcccagg 5460 aagactacgg gaggctacac caacgtcaat cagaggggcc tgtgtagcta ccgataagcg 5520 gaccctcaag agggcattag caatagtgtt tataaggccc ccttgttaat tcttgaagac 5580 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 5640 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 5700 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 5760 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 5820 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5880 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5940 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 6000 gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 6060 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 6120 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 6180 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 6240 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 6300 agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 6360 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 6420 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 6480 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 6540 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 6600 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 6660 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 6720 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 6780 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6840 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6900 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 6960 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 7020 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 7080 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 7140 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 7200 attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 7260 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 7320 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 7380 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 7440 ggcctttttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca 7500 acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc 7560 ctcgcgtcg 7569 <210> 16 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BBL CoOP <400> 16 atggaatacg cctctgatgc cagcctggac cccgaagctc cttggcctcc tgcccctaga 60 gccagagcct gtagagtgct gccttgggct ctggtggctg gccttctcct tctgctgctg 120 ctggccgctg cctgcgctgt gtttctggct tgtccttggg ccgtgtcagg cgccagagct 180 tctcctggat ctgccgccag ccccagactg agagagggac ctgagctgag ccccgatgat 240 cctgccggac tgctggatct gagacagggc atgttcgccc agctggtggc ccagaacgtg 300 ctgctgatcg atggccccct gagctggtac agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg 360 acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg 420 tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg ccggcgaagg atccggctct 480 gtgtctctgg cactgcatct gcagcccctg agatctgctg caggcgctgc tgcactggcc 540 ctgacagtgg acctgcctcc agcctctagc gaggccagaa actccgcatt cgggtttcaa 600 ggcagactgc tgcacctgtc tgccggccag agactgggag tgcatctgca cacagaggcc 660 agagccagac acgcctggca gctgacacag ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg 720 acccccgaaa ttccagccgg cctgcccagc cctagaagcg agtag 765 <210> 17 <211> 832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BBL PRCP <400> 17 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccaccatg gaatacgcct ctgatgccag 60 cctggacccc gaagctcctt ggcctcctgc ccctagagcc agagcctgta gagtgctgcc 120 ttgggctctg gtggctggcc ttctccttct gctgctgctg gccgctgcct gcgctgtgtt 180 tctggcttgt ccttgggccg tgtcaggcgc cagagcttct cctggatctg ccgccagccc 240 cagactgaga gagggacctg agctgagccc cgatgatcct gccggactgc tggatctgag 300 acagggcatg ttcgcccagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgag 360 ctggtacagc gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga 420 ggacaccaaa gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga 480 actgcggaga gtggtggccg gcgaaggatc cggctctgtg tctctggcac tgcatctgca 540 gcccctgaga tctgctgcag gcgctgctgc actggccctg acagtggacc tgcctccagc 600 ctctagcgag gccagaaact ccgcattcgg gtttcaaggc agactgctgc acctgtctgc 660 cggccagaga ctgggagtgc atctgcacac agaggccaga gccagacacg cctggcagct 720 gacacagggc gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgaaattc cagccggcct 780 gcccagccct agaagcgagt aggacccagc tttcttgtac aaagtggtcc cc 832 <210> 18 <211> 7776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLV430G human CD86 vector <400> 18 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttcg ccaccatggg cctgagcaac atcctgttcg 2760 tgatggcctt cctgctgtcc ggagccgccc ctctgaagat ccaggcctac ttcaacgaga 2820 ccgccgacct gccctgccag ttcgccaaca gccagaacca gagcctgagc gaactggtgg 2880 tgttctggca ggaccaggaa aacctggtcc tgaacgaggt gtacctgggc aaagaaaagt 2940 tcgacagcgt gcacagcaag tacatgggcc ggaccagctt cgacagcgac agctggaccc 3000 tgcggctgca caacctgcag atcaaggaca agggcctgta ccagtgcatc atccaccaca 3060 agaaacccac cggcatgatc agaatccacc agatgaacag cgagctgtcc gtgctggcca 3120 acttcagcca gcccgagatc gtgcccatca gcaacatcac cgagaacgtg tacatcaacc 3180 tgacctgcag cagcatccac ggctaccccg agcccaagaa aatgagcgtg ctgctgcgga 3240 ccaagaacag caccatcgag tacgacggcg tgatgcagaa aagccaggac aacgtgaccg 3300 agctgtacga cgtgagcatc agcctgagcg tgagcttccc cgacgtgacc agcaacatga 3360 ccatcttttg catcctggaa accgacaaga cccggctgct gtccagcccc ttcagcatcg 3420 agctggaaga tccccagccc cctcccgacc acatcccctg gatcaccgcc gtgctgccca 3480 ccgtgatcat ctgcgtgatg gtgttctgcc tgatcctgtg gaagtggaag aagaagaagc 3540 ggcctaggaa cagctacaag tgcggcacca acaccatgga acgggaggaa agcgagcaga 3600 ccaagaagcg ggagaagatc cacatccccg agcggagcga cgaggcccag cgggtgttca 3660 agagcagcaa gaccagcagc tgcgacaaga gcgacacctg cttctaggac ccagctttct 3720 tgtacaaagt ggtgattcga gttaattaag ctagcctagt gccatttgtt cagtggttcg 3780 tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat tgggggccaa 3840 gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt tgtctttggg 3900 tatacattta aaccctaaca aaacaaagag atggggttac tctctaaatt ttatgggtta 3960 tgtcattgga tgttatgggt ccttgccaca agaacacatc atacaaaaaa tcaaagaatg 4020 ttttagaaaa cttcctatta acaggcctat tgattggaaa gtatgtcaac gaattgtggg 4080 tcttttgggt tttgctgccc cttttacaca atgtggttat cctgcgttga tgcctttgta 4140 tgcatgtatt caatctaagc aggctttcac tttctcgcca acttacaagg cctttctgtg 4200 taaacaatac ctgaaccttt accccgttgc ccggcaacgg ccaggtctgt gccaagtgtt 4260 tgctgacgca acccccactg gctggggctt ggtcatgggc catcagcgca tgcgtggaac 4320 cttttcggct cctctgccga tccatactgc ggaactccta gccgcttgtt ttgctcgcag 4380 caggtctgga gcaaacatta tcgggactga taactctgtt gtcctatccc gcaaatatac 4440 atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc ctgcgcggga cgtcctttgt 4500 ttacgtcccg tcggcgctga atcctgcgga cgacccttct cggggtcgct tgggactctc 4560 tcgtcccctt ctccgtctgc cgttccgacc gaccacgggg cgcacctctc tttacgcgga 4620 ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctgcacgt 4680 cgcatggaga ccaccgtgaa cgcccaccaa atattgccca aggtcttaca taagaggact 4740 cttggactct cagcaatgtc aacgaccgac cttgaggcat acttcaaaga ctgtttgttt 4800 aaagactggg aggagttggg ggaggagatt aggttaaagg tctttgtact aggaggctgt 4860 aggcataaat tggtctgcgc accagcacca tggcgcaatc actagagcgg ggtaccttta 4920 agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 4980 ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 5040 ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 5100 aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 5160 tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt 5220 agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt 5280 gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 5340 ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 5400 gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 5460 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 5520 aggccgaggc cggatccctt gagtggcttt catcctggag cagactttgc agtctgtgga 5580 ctgcaacaca acattgcctt tatgtgtaac tcttggctga agctcttaca ccaatgctgg 5640 gggacatgta cctcccaggg gcccaggaag actacgggag gctacaccaa cgtcaatcag 5700 aggggcctgt gtagctaccg ataagcggac cctcaagagg gcattagcaa tagtgtttat 5760 aaggccccct tgttaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 5820 ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 5880 gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 5940 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 6000 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 6060 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 6120 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 6180 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc 6240 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 6300 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 6360 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 6420 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 6480 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa 6540 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 6600 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 6660 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 6720 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 6780 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 6840 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 6900 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 6960 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 7020 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 7080 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 7140 gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 7200 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 7260 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 7320 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 7380 ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 7440 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 7500 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 7560 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 7620 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc ctttttgaag ctgtccctga tggtcgtcat 7680 ctacctgcct ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa 7740 gaatcataat ggggaaggcc atccagcctc gcgtcg 7776 <210> 19 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 CoOP <400> 19 atgggcctga gcaacatcct gttcgtgatg gccttcctgc tgtccggagc cgcccctctg 60 aagatccagg cctacttcaa cgagaccgcc gacctgccct gccagttcgc caacagccag 120 aaccagagcc tgagcgaact ggtggtgttc tggcaggacc aggaaaacct ggtcctgaac 180 gaggtgtacc tgggcaaaga aaagttcgac agcgtgcaca gcaagtacat gggccggacc 240 agcttcgaca gcgacagctg gaccctgcgg ctgcacaacc tgcagatcaa ggacaagggc 300 ctgtaccagt gcatcatcca ccacaagaaa cccaccggca tgatcagaat ccaccagatg 360 aacagcgagc tgtccgtgct ggccaacttc agccagcccg agatcgtgcc catcagcaac 420 atcaccgaga acgtgtacat caacctgacc tgcagcagca tccacggcta ccccgagccc 480 aagaaaatga gcgtgctgct gcggaccaag aacagcacca tcgagtacga cggcgtgatg 540 cagaaaagcc aggacaacgt gaccgagctg tacgacgtga gcatcagcct gagcgtgagc 600 ttccccgacg tgaccagcaa catgaccatc ttttgcatcc tggaaaccga caagacccgg 660 ctgctgtcca gccccttcag catcgagctg gaagatcccc agccccctcc cgaccacatc 720 ccctggatca ccgccgtgct gcccaccgtg atcatctgcg tgatggtgtt ctgcctgatc 780 ctgtggaagt ggaagaagaa gaagcggcct aggaacagct acaagtgcgg caccaacacc 840 atggaacggg aggaaagcga gcagaccaag aagcgggaga agatccacat ccccgagcgg 900 agcgacgagg cccagcgggt gttcaagagc agcaagacca gcagctgcga caagagcgac 960 acctgcttc 969 <210> 20 <211> 1039 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD86 PCRP <400> 20 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccaccatg ggcctgagca acatcctgtt 60 cgtgatggcc ttcctgctgt ccggagccgc ccctctgaag atccaggcct acttcaacga 120 gaccgccgac ctgccctgcc agttcgccaa cagccagaac cagagcctga gcgaactggt 180 ggtgttctgg caggaccagg aaaacctggt cctgaacgag gtgtacctgg gcaaagaaaa 240 gttcgacagc gtgcacagca agtacatggg ccggaccagc ttcgacagcg acagctggac 300 cctgcggctg cacaacctgc agatcaagga caagggcctg taccagtgca tcatccacca 360 caagaaaccc accggcatga tcagaatcca ccagatgaac agcgagctgt ccgtgctggc 420 caacttcagc cagcccgaga tcgtgcccat cagcaacatc accgagaacg tgtacatcaa 480 cctgacctgc agcagcatcc acggctaccc cgagcccaag aaaatgagcg tgctgctgcg 540 gaccaagaac agcaccatcg agtacgacgg cgtgatgcag aaaagccagg acaacgtgac 600 cgagctgtac gacgtgagca tcagcctgag cgtgagcttc cccgacgtga ccagcaacat 660 gaccatcttt tgcatcctgg aaaccgacaa gacccggctg ctgtccagcc ccttcagcat 720 cgagctggaa gatccccagc cccctcccga ccacatcccc tggatcaccg ccgtgctgcc 780 caccgtgatc atctgcgtga tggtgttctg cctgatcctg tggaagtgga agaagaagaa 840 gcggcctagg aacagctaca agtgcggcac caacaccatg gaacgggagg aaagcgagca 900 gaccaagaag cgggagaaga tccacatccc cgagcggagc gacgaggccc agcgggtgtt 960 caagagcagc aagaccagca gctgcgacaa gagcgacacc tgcttctagg acccagcttt 1020 cttgtacaaa gtggtcccc 1039 <210> 21 <211> 3526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDONR221 CD86 vector <400> 21 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240 tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300 gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360 acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420 caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480 gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540 aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600 ctgttcgttg caacacattg atgagcaatg cttttttata atgcacaagt ttgtacaaaa 660 aagcaggctt cgccaccatg ggcctgagca acatcctgtt cgtgatggcc ttcctgctgt 720 ccggagccgc ccctctgaag atccaggcct acttcaacga gaccgccgac ctgccctgcc 780 agttcgccaa cagccagaac cagagcctga gcgaactggt ggtgttctgg caggaccagg 840 aaaacctggt cctgaacgag gtgtacctgg gcaaagaaaa gttcgacagc gtgcacagca 900 agtacatggg ccggaccagc ttcgacagcg acagctggac cctgcggctg cacaacctgc 960 agatcaagga caagggcctg taccagtgca tcatccacca caagaaaccc accggcatga 1020 tcagaatcca ccagatgaac agcgagctgt ccgtgctggc caacttcagc cagcccgaga 1080 tcgtgcccat cagcaacatc accgagaacg tgtacatcaa cctgacctgc agcagcatcc 1140 acggctaccc cgagcccaag aaaatgagcg tgctgctgcg gaccaagaac agcaccatcg 1200 agtacgacgg cgtgatgcag aaaagccagg acaacgtgac cgagctgtac gacgtgagca 1260 tcagcctgag cgtgagcttc cccgacgtga ccagcaacat gaccatcttt tgcatcctgg 1320 aaaccgacaa gacccggctg ctgtccagcc ccttcagcat cgagctggaa gatccccagc 1380 cccctcccga ccacatcccc tggatcaccg ccgtgctgcc caccgtgatc atctgcgtga 1440 tggtgttctg cctgatcctg tggaagtgga agaagaagaa gcggcctagg aacagctaca 1500 agtgcggcac caacaccatg gaacgggagg aaagcgagca gaccaagaag cgggagaaga 1560 tccacatccc cgagcggagc gacgaggccc agcgggtgtt caagagcagc aagaccagca 1620 gctgcgacaa gagcgacacc tgcttctagg acccagcttt cttgtacaaa gtggtcatta 1680 taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa 1740 tcattatttg ccatccagct gatatcccct atagtgagtc gtattacatg gtcatagctg 1800 tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa atctctgatg ttacattgca caagataaaa 1860 taatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta 1920 tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt 1980 tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgct 2040 tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca 2100 atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga 2160 ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg 2220 gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg 2280 cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca 2340 gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg 2400 cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc 2460 ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata 2520 accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg 2580 cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat 2640 tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt 2700 ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat cagaattggt taattggttg taacactggc 2760 agagcattac gctgacttga cgggacggcg caagctcatg accaaaatcc cttaacgtga 2820 gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 2880 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 2940 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 3000 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 3060 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 3120 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 3180 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 3240 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 3300 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 3360 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 3420 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 3480 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgtt 3526 <210> 22 <211> 3319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDONR221 4-1BBL vector <400> 22 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240 tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300 gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360 acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420 caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480 gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540 aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600 ctgttcgttg caacacattg atgagcaatg cttttttata atgcacaagt ttgtacaaaa 660 aagcaggctt cgccaccatg gaatacgcct ctgatgccag cctggacccc gaagctcctt 720 ggcctcctgc ccctagagcc agagcctgta gagtgctgcc ttgggctctg gtggctggcc 780 ttctccttct gctgctgctg gccgctgcct gcgctgtgtt tctggcttgt ccttgggccg 840 tgtcaggcgc cagagcttct cctggatctg ccgccagccc cagactgaga gagggacctg 900 agctgagccc cgatgatcct gccggactgc tggatctgag acagggcatg ttcgcccagc 960 tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgag ctggtacagc gatcctggac 1020 tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa gaactggtgg 1080 tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga gtggtggccg 1140 gcgaaggatc cggctctgtg tctctggcac tgcatctgca gcccctgaga tctgctgcag 1200 gcgctgctgc actggccctg acagtggacc tgcctccagc ctctagcgag gccagaaact 1260 ccgcattcgg gtttcaaggc agactgctgc acctgtctgc cggccagaga ctgggagtgc 1320 atctgcacac agaggccaga gccagacacg cctggcagct gacacagggc gctacagtgc 1380 tgggcctgtt cagagtgacc cccgaaattc cagccggcct gcccagccct agaagcgagt 1440 aggacccagc tttcttgtac aaagtggtca ttataagaaa gcattgctta tcaatttgtt 1500 gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat ttgccatcca gctgatatcc 1560 cctatagtga gtcgtattac atggtcatag ctgtttcctg gcagctctgg cccgtgtctc 1620 aaaatctctg atgttacatt gcacaagata aaataatatc atcatgaaca ataaaactgt 1680 ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtcga 1740 ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata 1800 atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gcttgtatgg gaagcccgat gcgccagagt 1860 tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac 1920 taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg 1980 atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggaaaaac agcattccag gtattagaag 2040 aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc 2100 attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg 2160 cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg 2220 gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt 2280 cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa 2340 taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc 2400 tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 2460 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 2520 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 2580 gcgcaagctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttacgc gtcgttccac tgagcgtcag 2640 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 2700 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 2760 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 2820 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 2880 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 2940 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 3000 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 3060 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 3120 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 3180 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 3240 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 3300 ggccttttgc tcacatgtt 3319 <210> 23 <211> 8449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLV430G vector <400> 23 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 cacaagtttg tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt 2760 aaattagatt ttgcataaaa aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc 2820 actatggcgg ccgcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 2880 gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag 2940 aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt 3000 gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg 3060 gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt 3120 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg 3180 gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt 3240 tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa 3300 gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg 3360 tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat 3420 atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 3480 gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 3540 agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaaacgcgt 3600 ggatccggct tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga tttttgcggt 3660 ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtat gctatgaagc 3720 agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca tatatgatgt 3780 caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc tgcgtgccga 3840 acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta ttgaaatgaa 3900 cggctctttt gctgacgaga acaggggctg gtgaaatgca gtttaaggtt tacacctata 3960 aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgcccg 4020 ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg 4080 aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg 4140 ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg 4200 acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc tcccttatac 4260 acagccagtc tgcaggtcga ccatagtgac tggatatgtt gtgttttaca gtattatgta 4320 gtctgttttt tatgcaaaat ctaatttaat atattgatat ttatatcatt ttacgtttct 4380 cgttcagctt tcttgtacaa agtggtgatt cgagttaatt aagctagcct agtgccattt 4440 gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg 4500 tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt accaattttc 4560 ttttgtcttt gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa gagatggggt tactctctaa 4620 attttatggg ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc acaagaacac atcatacaaa 4680 aaatcaaaga atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc 4740 aacgaattgt gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac acaatgtggt tatcctgcgt 4800 tgatgccttt gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt cactttctcg ccaacttaca 4860 aggcctttct gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt tgcccggcaa cggccaggtc 4920 tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cttggtcatg ggccatcagc 4980 gcatgcgtgg aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt 5040 gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac tgataactct gttgtcctat 5100 cccgcaaata tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg 5160 ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct tctcggggtc 5220 gcttgggact ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg gggcgcacct 5280 ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt 5340 cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc ccaaggtctt 5400 acataagagg actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa 5460 agactgtttg tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa aggtctttgt 5520 actaggaggc tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatggcgca atcactagag 5580 cggggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa 5640 agaaaagggg ggactggaag ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc 5700 ttgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 5760 gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 5820 tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 5880 ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg 5940 aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 6000 tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 6060 caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc 6120 atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 6180 tttatttatg cagaggccga ggccggatcc cttgagtggc tttcatcctg gagcagactt 6240 tgcagtctgt ggactgcaac acaacattgc ctttatgtgt aactcttggc tgaagctctt 6300 acaccaatgc tgggggacat gtacctccca ggggcccagg aagactacgg gaggctacac 6360 caacgtcaat cagaggggcc tgtgtagcta ccgataagcg gaccctcaag agggcattag 6420 caatagtgtt tataaggccc ccttgttaat tcttgaagac gaaagggcct cgtgatacgc 6480 ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 6540 cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 6600 ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 6660 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 6720 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 6780 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 6840 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 6900 gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 6960 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 7020 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 7080 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 7140 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 7200 gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 7260 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 7320 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 7380 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 7440 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 7500 ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 7560 aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 7620 aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 7680 ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 7740 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 7800 actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 7860 caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 7920 gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7980 ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 8040 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag cgccacgctt 8100 cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 8160 acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 8220 ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 8280 gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggcctttttg aagctgtccc 8340 tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg 8400 ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcg 8449 <210> 24 <211> 4761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDONR221 vector <400> 24 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240 tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300 gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360 acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420 caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480 gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540 aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600 ctgttcgttg caacacattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660 agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa 720 aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatgaa tcaactactt 780 agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct 840 gccaacttag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttctc aaacggaatc gtcgtatcca 900 gcctactcgc tattgtcctc aatgccgtat taaatcataa aaagaaataa gaaaaagagg 960 tgcgagcctc ttttttgtgt gacaaaataa aaacatctac ctattcatat acgctagtgt 1020 catagtcctg aaaatcatct gcatcaagaa caatttcaca actcttatac ttttctctta 1080 caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt 1140 ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat 1200 attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca 1260 gccacttctt ccccgataac ggagaccggc acactggcca tatcggtggt catcatgcgc 1320 cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac gggagacttt atctgacagc 1380 agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc 1440 tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat aggtgtaaac cttaaactgc 1500 atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc atttcaataa accgggcgac 1560 ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg gcacgcagac gacgggcttc 1620 attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca tcatatatgc cttgagcaac 1680 tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct tcatagcata cctctttttg 1740 acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat 1800 acgcatactg ttatctggct tttagtaagc cggatccacg cggcgtttac gccccgccct 1860 gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac 1920 agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat 1980 atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa 2040 aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt 2100 tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa 2160 actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat 2220 ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg 2280 ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat 2340 aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg 2400 tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc 2460 attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag 2520 ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt 2580 gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg 2640 gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca 2700 caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttagtc gactacaggt 2760 cactaatacc atctaagtag ttgattcata gtgactggat atgttgtgtt ttacagtatt 2820 atgtagtctg ttttttatgc aaaatctaat ttaatatatt gatatttata tcattttacg 2880 tttctcgttc agctttcttg tacaaagttg gcattataag aaagcattgc ttatcaattt 2940 gttgcaacga acaggtcact atcagtcaaa ataaaatcat tatttgccat ccagctgata 3000 tcccctatag tgagtcgtat tacatggtca tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt 3060 ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaataat atcatcatga acaataaaac 3120 tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt 3180 cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg 3240 ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc gatgcgccag 3300 agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca 3360 gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 3420 ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggaaa aacagcattc caggtattag 3480 aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 3540 tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 3600 aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 3660 atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca ttctcaccgg 3720 attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 3780 taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 3840 tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 3900 atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 3960 tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg 4020 acggcgcaag ctcatgacca aaatccctta acgtgagtta cgcgtcgttc cactgagcgt 4080 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 4140 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 4200 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 4260 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 4320 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 4380 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 4440 cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 4500 agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 4560 gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 4620 atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 4680 gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 4740 gctggccttt tgctcacatg t 4761 <210> 25 <211> 10703 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psPAX2 plasmid <400> 25 aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 60 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 120 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 180 atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 240 ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 300 cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 360 agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 420 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 480 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 540 agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 600 gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 660 gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 720 ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 780 tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 840 tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 900 gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 960 caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 1020 atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggt 1080 cgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 1140 ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 1200 aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 1260 actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 1320 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 1380 tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 1440 ttagtcatcg ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 1500 ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 1560 gatgggggcg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 1620 gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 1680 cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 1740 gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 1800 ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 1860 gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1920 ttaaagggct ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg 1980 tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 2040 ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg 2100 tgccccgcgg tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg 2160 ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc 2220 tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc 2280 ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc 2340 gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt 2400 cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga 2460 cttcctttgt cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta 2520 gcgggcgcgg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg 2580 tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac 2640 ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 2700 tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 2760 gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcgggccggc cgcgttgacg 2820 cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt 2880 aagcggggga gaattagatc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa 2940 atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc 3000 tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct 3060 tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt 3120 gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca 3180 aaacaaaagt aagaaaaaag cacagcaagc agcagctgac acaggacaca gcaatcaggt 3240 cagccaaaat taccctatag tgcagaacat ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc 3300 acctagaact ttaaatgcat gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca gcccagaagt 3360 gatacccatg ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct 3420 aaacacagtg gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga 3480 agctgcagaa tgggatagag tgcatccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat 3540 gagagaacca aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg 3600 atggatgaca cataatccac ctatcccagt aggagaaatc tataaaagat ggataatcct 3660 gggattaaat aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggaca taagacaagg 3720 accaaaggaa ccctttagag actatgtaga ccgattctat aaaactctaa gagccgagca 3780 agcttcacaa gaggtaaaaa attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc 3840 agattgtaag actattttaa aagcattggg accaggagcg acactagaag aaatgatgac 3900 agcatgtcag ggagtggggg gacccggcca taaagcaaga gttttggctg aagcaatgag 3960 ccaagtaaca aatccagcta ccataatgat acagaaaggc aattttagga accaaagaaa 4020 gactgttaag tgtttcaatt gtggcaaaga agggcacata gccaaaaatt gcagggcccc 4080 taggaaaaag ggctgttgga aatgtggaaa ggaaggacac caaatgaaag attgtactga 4140 gagacaggct aattttttag ggaagatctg gccttcccac aagggaaggc cagggaattt 4200 tcttcagagc agaccagagc caacagcccc accagaagag agcttcaggt ttggggaaga 4260 gacaacaact ccctctcaga agcaggagcc gatagacaag gaactgtatc ctttagcttc 4320 cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 4380 gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgaa tttgccagga 4440 agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtagg acagtatgat 4500 cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca 4560 cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gctgcacttt aaattttccc 4620 attagtccta ttgagactgt accagtaaaa ttaaagccag gaatggatgg cccaaaagtt 4680 aaacaatggc cattgacaga agaaaaaata aaagcattag tagaaatttg tacagaaatg 4740 gaaaaggaag gaaaaatttc aaaaattggg cctgaaaatc catacaatac tccagtattt 4800 gccataaaga aaaaagacag tactaaatgg agaaaattag tagatttcag agaacttaat 4860 aagagaactc aagatttctg ggaagttcaa ttaggaatac cacatcctgc agggttaaaa 4920 cagaaaaaat cagtaacagt actggatgtg ggcgatgcat atttttcagt tcccttagat 4980 aaagacttca ggaagtatac tgcatttacc atacctagta taaacaatga gacaccaggg 5040 attagatatc agtacaatgt gcttccacag ggatggaaag gatcaccagc aatattccag 5100 tgtagcatga caaaaatctt agagcctttt agaaaacaaa atccagacat agtcatctat 5160 caatacatgg atgatttgta tgtaggatct gacttagaaa tagggcagca tagaacaaaa 5220 atagaggaac tgagacaaca tctgttgagg tggggattta ccacaccaga caaaaaacat 5280 cagaaagaac ctccattcct ttggatgggt tatgaactcc atcctgataa atggacagta 5340 cagcctatag tgctgccaga aaaggacagc tggactgtca atgacataca gaaattagtg 5400 ggaaaattga attgggcaag tcagatttat gcagggatta aagtaaggca attatgtaaa 5460 cttcttaggg gaaccaaagc actaacagaa gtagtaccac taacagaaga agcagagcta 5520 gaactggcag aaaacaggga gattctaaaa gaaccggtac atggagtgta ttatgaccca 5580 tcaaaagact taatagcaga aatacagaag caggggcaag gccaatggac atatcaaatt 5640 tatcaagagc catttaaaaa tctgaaaaca ggaaaatatg caagaatgaa gggtgcccac 5700 actaatgatg tgaaacaatt aacagaggca gtacaaaaaa tagccacaga aagcatagta 5760 atatggggaa agactcctaa atttaaatta cccatacaaa aggaaacatg ggaagcatgg 5820 tggacagagt attggcaagc cacctggatt cctgagtggg agtttgtcaa tacccctccc 5880 ttagtgaagt tatggtacca gttagagaaa gaacccataa taggagcaga aactttctat 5940 gtagatgggg cagccaatag ggaaactaaa ttaggaaaag caggatatgt aactgacaga 6000 ggaagacaaa aagttgtccc cctaacggac acaacaaatc agaagactga gttacaagca 6060 attcatctag ctttgcagga ttcgggatta gaagtaaaca tagtgacaga ctcacaatat 6120 gcattgggaa tcattcaagc acaaccagat aagagtgaat cagagttagt cagtcaaata 6180 atagagcagt taataaaaaa ggaaaaagtc tacctggcat gggtaccagc acacaaagga 6240 attggaggaa atgaacaagt agatgggttg gtcagtgctg gaatcaggaa agtactattt 6300 ttagatggaa tagataaggc ccaagaagaa catgagaaat atcacagtaa ttggagagca 6360 atggctagtg attttaacct accacctgta gtagcaaaag aaatagtagc cagctgtgat 6420 aaatgtcagc taaaagggga agccatgcat ggacaagtag actgtagccc aggaatatgg 6480 cagctagatt gtacacattt agaaggaaaa gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt 6540 ggatatatag aagcagaagt aattccagca gagacagggc aagaaacagc atacttcctc 6600 ttaaaattag caggaagatg gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc 6660 accagtacta cagttaaggc cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt 6720 ccctacaatc cccaaagtca aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt 6780 ataggacagg taagagatca ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc 6840 atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta 6900 gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa 6960 aattttcggg tttattacag ggacagcaga gatccagttt ggaaaggacc agcaaagctc 7020 ctctggaaag gtgaaggggc agtagtaata caagataata gtgacataaa agtagtgcca 7080 agaagaaaag caaagatcat cagggattat ggaaaacaga tggcaggtga tgattgtgtg 7140 gcaagtagac aggatgagga ttaacacatg gaattctgca acaactgctg tttatccatt 7200 tcagaattgg gtgtcgacat agcagaatag gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg 7260 gagccagtag atcctagact agagccctgg aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct 7320 tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgttt catgacaaaa 7380 gccttaggca tctcctatgg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac 7440 agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata 7500 atagtagcaa tagtagcatt agtagtagca ataataatag caatagttgt gtggtccata 7560 gtaatcatag aatataggaa aatggccgct gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 7620 ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 7680 agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 7740 agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cctcaatgac 7800 gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 7860 gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 7920 ccaagcaaga atcctagctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tagggatttg 7980 gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 8040 taaatctctg gaacagatct ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 8100 caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 8160 tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 8220 aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 8280 aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 8340 gtttcagacc cacctcccaa tcccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 8400 aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatcct tggcacttat 8460 ctgggacgat ctgcggagcc tgtgcctctt cagctaccac cgcttgagag acttactctt 8520 gattgtaacg aggattgtgg aacttctggg acgcaggggg tgggaagccc tcaaatattg 8580 gtggaatctc ctacaatatt ggagtcagga gctaaagaat agtgctgtta gcttgctcaa 8640 tgccacagcc atagcagtag ctgaggggac agatagggtt atagaagtag tacaaggagc 8700 ttgtagagct attcgccaca tacctagaag aataagacag ggcttggaaa ggattttgct 8760 ataagctcga aacaaccggt acctctagaa ctatagctag cagatctttt tccctctgcc 8820 aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa 8880 tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat 8940 gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat 9000 gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca 9060 gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt 9120 tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt 9180 actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 9240 atgaagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 9300 tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 9360 aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 9420 ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt cagcaaccat 9480 agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 9540 gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 9600 gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctaac 9660 ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 9720 aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 9780 catgtctgga tccgctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 9840 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 9900 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 9960 caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 10020 tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 10080 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 10140 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 10200 cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 10260 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 10320 tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 10380 cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 10440 agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 10500 agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 10560 gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 10620 aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 10680 ggattttggt catgagatta tca 10703 <210> 26 <211> 7298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCIGO-VSV.G plasmid <400> 26 gtcgacggat cgggagatca attccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac 60 agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt 120 gaaggctctc aagggcatcg gtcgatgcag gaaaaggaca agcagcgaaa attcacgccc 180 ccttgggagg tggcggcata tgcaaaggat agcactccca ctctactact gggtatcata 240 tgctgactgt atatgcatga ggatagcata tgctacccgg atacagatta ggatagcata 300 tactacccag atatagatta ggatagcata tgctacccag atatagatta ggatagccta 360 tgctacccag atataaatta ggatagcata tactacccag atatagatta ggatagcata 420 tgctacccag atatagatta ggatagccta tgctacccag atatagatta ggatagcata 480 tgctacccag atatagatta ggatagcata tgctatccag atatttgggt agtatatgct 540 acccagatat aaattaggat agcatatact accctaatct ctattaggat agcatatgct 600 acccggatac agattaggat agcatatact acccagatat agattaggat agcatatgct 660 acccagatat agattaggat agcctatgct acccagatat aaattaggat agcatatact 720 acccagatat agattaggat agcatatgct acccagatat agattaggat agcctatgct 780 acccagatat agattaggat agcatatgct atccagatat ttgggtagta tatgctaccc 840 atggcaacat tagcccaccg tgctctcagc gacctcgtga atatgaggac caacaaccct 900 gtgcttggcg ctcaggcgca agtgtgtgta atttgtcctc cagatcgcag caatcgcgcc 960 cctatcttgg cccgcccacc tacttatgca ggtattcccc ggggtgccat tagtggtttt 1020 gtgggcaagt ggtttgaccg cagtggttag cggggttaca atcagccaag ttattacacc 1080 cttattttac agtccaaaac cgcagggcgg cgtgtggggg ctgacgcgtg cccccactcc 1140 acaatttcaa aaaaaagagt ggccacttgt ctttgtttat gggccccatt ggcgtggagc 1200 cccgtttaat tttcgggggt gttagagaca accagtggag tccgctgctg tcggcgtcca 1260 ctctctttcc ccttgttaca aatagagtgt aacaacatgg ttcacctgtc ttggtccctg 1320 cctgggacac atcttaataa ccccagtatc atattgcact aggattatgt gttgcccata 1380 gccataaatt cgtgtgagat ggacatccag tctttacggc ttgtccccac cccatggatt 1440 tctattgtta aagatattca gaatgtttca ttcctacact agtatttatt gcccaagggg 1500 tttgtgaggg ttatattggt gtcatagcac aatgccacca ctgaaccccc cgtccaaatt 1560 ttattctggg ggcgtcacct gaaaccttgt tttcgagcac ctcacataca ccttactgtt 1620 cacaactcag cagttattct attagctaaa cgaaggagaa tgaagaagca ggcgaagatt 1680 caggagagtt cactgcccgc tccttgatct tcagccactg cccttgtgac taaaatggtt 1740 cactaccctc gtggaatcct gaccccatgt aaataaaacc gtgacagctc atggggtggg 1800 agatatcgct gttccttagg acccttttac taaccctaat tcgatagcat atgcttcccg 1860 ttgggtaaca tatgctattg aattagggtt agtctggata gtatatacta ctacccggga 1920 agcatatgct acccgtttag ggttaacaag ggggccttat aaacactatt gctaatgccc 1980 tcttgagggt ccgcttatcg gtagctacac aggcccctct gattgacgtt ggtgtagcct 2040 cccgtagtct tcctgggccc ctgggaggta catgtccccc agcattggtg taagagcttc 2100 agccaagagt tacacataaa ggcaatgttg tgttgcagtc cacagactgc aaagtctgct 2160 ccaggatgaa agccactcaa gggatcttca atattggcca ttagccatat tattcattgg 2220 ttatatagca taaatcaata ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa 2280 tatgtacatt tatattggct catgtccaat atgaccgcca tgttggcatt gattattgac 2340 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 2400 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 2460 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 2520 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 2580 aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 2640 catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 2700 catggtgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 2760 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 2820 ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 2880 acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca ctagaagctt 2940 tattgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc agtgcttctg acacaacagt 3000 ctcgaactta agctgcagaa gttggtcgtg aggcactggg caggtaagta tcaaggttac 3060 aagacaggtt taaggagacc aatagaaact gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg 3120 tttctgatag gcacctattg gtcttactga catccacttt gcctttctct ccacaggtgt 3180 ccactcccag ttcaattaca gctcttaagg ctagagtact taatacgact cactataggc 3240 tagcggtacc gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcaacagag 3300 atcgatctgt ttccttgaca ctatgaagtg ccttttgtac ttagcctttt tattcattgg 3360 ggtgaattgc aagttcacca tagtttttcc acacaaccaa aaaggaaact ggaaaaatgt 3420 tccttctaat taccattatt gcccgtcaag ctcagattta aattggcata atgacttaat 3480 aggcacagcc atacaagtca aaatgcccaa gagtcacaag gctattcaag cagacggttg 3540 gatgtgtcat gcttccaaat gggtcactac ttgtgatttc cgctggtatg gaccgaagta 3600 tataacacag tccatccgat ccttcactcc atctgtagaa caatgcaagg aaagcattga 3660 acaaacgaaa caaggaactt ggctgaatcc aggcttccct cctcaaagtt gtggatatgc 3720 aactgtgacg gatgccgaag cagtgattgt ccaggtgact cctcaccatg tgctggttga 3780 tgaatacaca ggagaatggg ttgattcaca gttcatcaac ggaaaatgca gcaattacat 3840 atgccccact gtccataact ctacaacctg gcattctgac tataaggtca aagggctatg 3900 tgattctaac ctcatttcca tggacatcac cttcttctca gaggacggag agctatcatc 3960 cctgggaaag gagggcacag ggttcagaag taactacttt gcttatgaaa ctggaggcaa 4020 ggcctgcaaa atgcaatact gcaagcattg gggagtcaga ctcccatcag gtgtctggtt 4080 cgagatggct gataaggatc tctttgctgc agccagattc cctgaatgcc cagaagggtc 4140 aagtatctct gctccatctc agacctcagt ggatgtaagt ctaattcagg acgttgagag 4200 gatcttggat tattccctct gccaagaaac ctggagcaaa atcagagcgg gtcttccaat 4260 ctctccagtg gatctcagct atcttgctcc taaaaaccca ggaaccggtc ctgctttcac 4320 cataatcaat ggtaccctaa aatactttga gaccagatac atcagagtcg atattgctgc 4380 tccaatcctc tcaagaatgg tcggaatgat cagtggaact accacagaaa gggaactgtg 4440 ggatgactgg gcaccatatg aagacgtgga aattggaccc aatggagttc tgaggaccag 4500 ttcaggatat aagtttcctt tatacatgat tggacatggt atgttggact ccgatcttca 4560 tcttagctca aaggctcagg tgttcgaaca tcctcacatt caagacgctg cttcgcaact 4620 tcctgatgat gagagtttat tttttggtga tactgggcta tccaaaaatc caatcgagct 4680 tgtagaaggt tggttcagta gttggaaaag ctctattgcc tcttttttct ttatcatagg 4740 gttaatcatt ggactattct tggttctccg agttggtatc catctttgca ttaaattaaa 4800 gcacaccaag aaaagacaga tttatacaga catagagatg aaccgacttg gaaagtaact 4860 caaatcctgc acaacagatt cttcatgttt ggaccaaatc aacttgtgat accatgctca 4920 aagaggcctc aattatattt gagtttttaa tttttatgga attctgcaga tatccatcac 4980 actggcggcc gctcgagcat gcatctagag ggccctattc tatagtgtca cctaaatgct 5040 agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 5100 tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 5160 gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 5220 caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 5280 tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 5340 gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 5400 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 5460 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 5520 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 5580 aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 5640 ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 5700 tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc 5760 tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 5820 ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 5880 tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 5940 ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 6000 tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 6060 aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 6120 aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 6180 aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 6240 ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 6300 acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 6360 ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 6420 gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 6480 taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 6540 tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 6600 gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 6660 cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 6720 aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 6780 cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 6840 tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 6900 gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 6960 tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 7020 gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 7080 ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 7140 cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 7200 agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 7260 gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgac 7298 <210> 27 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mFC-7C12 scFv <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Gln 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asp Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Thr Ser Val Gly Arg Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asp Ile Gln Met 115 120 125 Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ile 130 135 140 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Tyr Leu Ala Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 165 170 175 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ile Gly 195 200 205 Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Tyr Ile Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gly 210 215 220 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 <210> 28 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mFC-8B3 scFv <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Val 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Gly Thr Trp Tyr Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Glu Ala Ser Thr Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Lys Tyr Asn Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 29 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mFC-7C12 scFv <400> 29 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caatttcaat gaccagtaca tgagttggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcattc attagtggta gtggtggtac cacatactac 180 acagactctg tgaagggccg gttcaccatc tccagggaca acaccaagga ctcattgtat 240 ttgcaaatga acagcctgac agtcgaggac acggccgtgt actactgtgc gagaggaggg 300 aattattata cttcggtggg ccggggcacc ctggtcaccg tctcggccgg tggcggcgga 360 tctggcgcgc cagacatcca gatgacccag tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg 420 gaaagagcca tcctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcggctacct agcctggtat 480 caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 540 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 600 agcctgcggc ctgaagatat tggaacatat tactgtaaac agtacattaa tgccccattc 660 actttcggcg gcgggaccaa ggtggagatc aaa 693 <210> 30 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mFC-8B3 scFv <400> 30 caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagccctt acaatggtaa cacagattat 180 gcacagaagg tccagggcag agtcaccttg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atccgacgac acggccgtgt attactgtgc gacaggtggc 300 gggacctggt actccgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcaccgtctc ggccggtggc 360 ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgccaga aattgtgctg 420 actcagtctc cctccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcagcat cacttgccgg 480 gccagtcaga gtattggtgg gtcgttggcc tggtatcaac aaaagccagg gaaagcccct 540 aagctcctga tctctgaggc gtctacttta gagaggggcg tcccatcaag attcagcggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcagcctga agatgttgca 660 acttattact gtcaaaaata taacagtgtc ccgctcactt tcggccctgg gaccaaggtg 720 gagatcaaa 729 <210> 31 <211> 9862 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> destination vector pLV4301G <400> 31 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 cacaagtttg tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt 2760 aaattagatt ttgcataaaa aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc 2820 actatggcgg ccgcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 2880 gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag 2940 aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt 3000 gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg 3060 gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt 3120 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg 3180 gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt 3240 tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa 3300 gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg 3360 tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat 3420 atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 3480 gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 3540 agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaaatggat 3600 ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa 3660 gaatatatac tgatatgtat acccgaagta tgtcaaaaag aggtatgcta tgaagcagcg 3720 tattacagtg acagttgaca gcgacagcta tcagttgctc aaggcatata tgatgtcaat 3780 atctccggtc tggtaagcac aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc 3840 tggaaagcgg aaaatcagga agggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc 3900 tcttttgctg acgagaacag gggctggtga aatgcagttt aaggtttaca cctataaaag 3960 agagagccgt tatcgtctgt ttgtggatgt acagagtgat attattgaca cgcccgggcg 4020 acggatggtg atccccctgg ccagtgcacg tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact 4080 ttacccggtg gtgcatatcg gggatgaaag ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag 4140 tgtgccggtc tccgttatcg gggaagaagt ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat 4200 caaaaacgcc attaacctga tgttctgggg aatataaatg tcaggctccc ttatacacag 4260 ccagtctgca ggtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct 4320 gttttttatg caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt 4380 cagctttctt gtacaaagtg gtgattcgag ttaattaagt taacgaattc cccccctctc 4440 cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg 4500 tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg 4560 gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag 4620 gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt 4680 ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc 4740 aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga 4800 gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga 4860 aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct 4920 ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt 4980 tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggaggcgga agcggcggag 5040 gctcccctcg aggcaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 5100 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 5160 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 5220 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 5280 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 5340 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 5400 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 5460 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 5520 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 5580 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 5640 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 5700 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 5760 acgagctgta caagtaacgc gtcccgggtc tagagctagc ggtaccatgc attacgtagt 5820 cgacgactta attaagctag cctagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 5880 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 5940 ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 6000 ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 6060 atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 6120 ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 6180 ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 6240 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 6300 acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 6360 ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 6420 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 6480 acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 6540 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 6600 cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 6660 gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 6720 cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 6780 cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 6840 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 6900 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 6960 ctgcgcacca gcaccatggc gcaatcacta gagcggggta cctttaagac caatgactta 7020 caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 7080 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 7140 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 7200 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 7260 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 7320 tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 7380 tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7440 atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7500 ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 7560 gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgga 7620 tcccttgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc aacacaacat 7680 tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga catgtacctc 7740 ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg gcctgtgtag 7800 ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg cccccttgtt 7860 aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 7920 ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 7980 tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 8040 atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 8100 attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 8160 gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 8220 agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 8280 aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 8340 cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 8400 cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 8460 actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 8520 cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 8580 ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 8640 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 8700 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 8760 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 8820 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 8880 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 8940 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 9000 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 9060 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 9120 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 9180 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 9420 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 9480 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 9540 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 9600 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 9660 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 9720 ctggcctttt gctggccttt ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac 9780 agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840 aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862 <210> 32 <211> 3334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 1, pMK 7c12 anti mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5 <400> 32 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420 atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga tatcgccacc 480 atgggcagca cagccattct ggccctgctg ctggcagtgc tgcagggcgt gtcagctcag 540 gtgcagctgg tgcagtctgg cggcggactc gtgaaacctg gcggcagcct gagactgagc 600 tgtgccgcca gcggcttcaa cttcaacgac cagtacatga gctggatccg gcaggcccct 660 ggcaagggac tggaatgggt gtccttcatc agcggcagcg gcggcaccac ctactacacc 720 gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca ccaaggacag cctgtacctg 780 cagatgaaca gcctgaccgt ggaagatacc gccgtgtact actgcgccag aggcggcaat 840 tactacacca gcgtgggcag aggcaccctc gtgacagtgt ctgctggcgg aggcggatca 900 ggcggcggag gatcaggggg aggcggaagc ggagcacccg atatccagat gacacagagc 960 cccggcaccc tgtctctgag ccctggcgaa agagccatcc tgagctgcag agccagccag 1020 agcgtgtccg gatacctggc ttggtatcag cagaagcccg gccaggcccc cagactgctg 1080 atctatggcg ccagcagcag agccacaggc atccccgata gattcagcgg ctctggcagc 1140 ggcaccgact tcaccctgac aatcagctcc ctgcggcccg aggacatcgg cacctactat 1200 tgcaagcagt acatcaacgc ccccttcacc ttcggcggag gcaccaaggt ggaaatcaag 1260 ccgcgggcca actttgtata caaaagtgga acgagaaacg taaaatgata taaatatcaa 1320 tatattaaat tagattttgc ataaaaaaca gactacataa tactgtaaaa cacaacatat 1380 ccagtcacta tgaatcaact acttagatgg tattagtgac ctgtactggg cctcatgggc 1440 cttcctttca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg 1500 tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 1560 ctcggtcgtt cgggtaaagc ctggggtgcc taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg 1620 aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 1680 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1740 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 1800 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 1860 tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 1920 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 1980 gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 2040 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 2100 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 2160 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 2220 agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 2280 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 2340 atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 2400 tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc 2460 ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc 2520 gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg 2580 caatcaataa agccgctaaa acggccattt tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca 2640 ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc 2700 tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca tccagatcat cctgatccac caggcccgct 2760 tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc 2820 gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc 2880 ggcgccagat ggctagacag cagatcctga cccggcactt cgcccagcag cagccaatca 2940 cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc 3000 cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc 3060 acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca 3120 atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc 3180 gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 3240 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 3300 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 3334 <210> 33 <211> 2779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 2, pMK hCD8a scaffold TN L5 L2 <400> 33 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420 atgagcaatg cttttttata atgcccaact ttgtatacaa aagtggcccg cggacaacaa 480 cccctgcccc cagacctcct accccagccc ctacaattgc cagccagcct ctgagcctga 540 ggcccgaggc ttgtagacct gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg 600 cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc 660 tcgtgatcac cctgtactgc ggctccacca gcggctccgg caagcccggc tctggcgagg 720 gctccaccag cggcgactac aaggacgacg atgacaagta ataggatatc ggttcagctt 780 tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg 840 tcactatcag tcaaaataaa atcattattt ctgggcctca tgggccttcc tttcactgcc 900 cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960 tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020 aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860 aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920 tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980 gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040 ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100 agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160 ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220 gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280 tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340 gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400 accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460 gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520 cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580 caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640 tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760 tttccccgaa aagtgccac 2779 <210> 34 <211> 9338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Final vector used for lentiviral production, pLV4301G 7C12 scFV mIgG hCD8 flag <400> 34 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caccaacttt gtacaaaaaa gctgaacgat atcgccacca tgggcagcac agccattctg 2760 gccctgctgc tggcagtgct gcagggcgtg tcagctcagg tgcagctggt gcagtctggc 2820 ggcggactcg tgaaacctgg cggcagcctg agactgagct gtgccgccag cggcttcaac 2880 ttcaacgacc agtacatgag ctggatccgg caggcccctg gcaagggact ggaatgggtg 2940 tccttcatca gcggcagcgg cggcaccacc tactacaccg atagcgtgaa gggccggttc 3000 accatcagcc gggacaacac caaggacagc ctgtacctgc agatgaacag cctgaccgtg 3060 gaagataccg ccgtgtacta ctgcgccaga ggcggcaatt actacaccag cgtgggcaga 3120 ggcaccctcg tgacagtgtc tgctggcgga ggcggatcag gcggcggagg atcaggggga 3180 ggcggaagcg gagcacccga tatccagatg acacagagcc ccggcaccct gtctctgagc 3240 cctggcgaaa gagccatcct gagctgcaga gccagccaga gcgtgtccgg atacctggct 3300 tggtatcagc agaagcccgg ccaggccccc agactgctga tctatggcgc cagcagcaga 3360 gccacaggca tccccgatag attcagcggc tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 3420 atcagctccc tgcggcccga ggacatcggc acctactatt gcaagcagta catcaacgcc 3480 cccttcacct tcggcggagg caccaaggtg gaaatcaagc cgcgggccaa ctttgtatac 3540 aaaagtggcc cgcggacaac aacccctgcc cccagacctc ctaccccagc ccctacaatt 3600 gccagccagc ctctgagcct gaggcccgag gcttgtagac ctgctgctgg cggagccgtg 3660 cacaccagag gactggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcaca 3720 tgtggcgtgc tgctgctgag cctcgtgatc accctgtact gcggctccac cagcggctcc 3780 ggcaagcccg gctctggcga gggctccacc agcggcgact acaaggacga cgatgacaag 3840 taataggata tcggttcagc tttcttgtac aaagttggga ttcgagttaa ttaagttaac 3900 gaattccccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 3960 ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 4020 agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 4080 gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 4140 tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 4200 aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 4260 cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 4320 ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 4380 cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaacgtcta ggccccccga 4440 accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatggga 4500 ggcggaagcg gcggaggctc ccctcgaggc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc 4560 accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 4620 gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 4680 accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 4740 cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 4800 cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 4860 cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 4920 gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 4980 aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 5040 cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 5100 ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 5160 aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 5220 atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taacgcgtcc cgggtctaga gctagcggta 5280 ccatgcatta cgtagtcgac gacttaatta agctagccta gtgccatttg ttcagtggtt 5340 cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc 5400 aagtctgtac agcatcttga gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg 5460 ggtatacatt taaaccctaa caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt 5520 tatgtcattg gatgttatgg gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa 5580 tgttttagaa aacttcctat taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg 5640 ggtcttttgg gttttgctgc cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg 5700 tatgcatgta ttcaatctaa gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg 5760 tgtaaacaat acctgaacct ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg 5820 tttgctgacg caacccccac tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga 5880 accttttcgg ctcctctgcc gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc 5940 agcaggtctg gagcaaacat tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat 6000 acatcgtttc catggctgct aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt 6060 gtttacgtcc cgtcggcgct gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc 6120 tctcgtcccc ttctccgtct gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg 6180 gactccccgt ctgtgccttc tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac 6240 gtcgcatgga gaccaccgtg aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga 6300 ctcttggact ctcagcaatg tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt 6360 ttaaagactg ggaggagttg ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct 6420 gtaggcataa attggtctgc gcaccagcac catggcgcaa tcactagagc ggggtacctt 6480 taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 6540 gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt 6600 ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 6660 ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 6720 actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta 6780 gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga 6840 gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 6900 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6960 atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca tcccgcccct 7020 aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 7080 agaggccgag gccggatccc ttgagtggct ttcatcctgg agcagacttt gcagtctgtg 7140 gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta actcttggct gaagctctta caccaatgct 7200 gggggacatg tacctcccag gggcccagga agactacggg aggctacacc aacgtcaatc 7260 agaggggcct gtgtagctac cgataagcgg accctcaaga gggcattagc aatagtgttt 7320 ataaggcccc cttgttaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 7380 ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 7440 gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 7500 acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 7560 tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 7620 agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 7680 cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 7740 aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg 7800 gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 7860 agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 7920 aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 7980 gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 8040 ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc 8100 aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 8160 aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 8220 tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 8280 agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 8340 ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 8400 ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 8460 ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 8520 acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 8580 agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 8640 ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 8700 cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 8760 gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 8820 cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 8880 gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 8940 caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 9000 aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 9060 tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 9120 gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 9180 ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gcctttttga agctgtccct gatggtcgtc 9240 atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag 9300 aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcg 9338 <210> 35 <211> 9862 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> destination vector, pLV4301G <400> 35 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 cacaagtttg tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt 2760 aaattagatt ttgcataaaa aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc 2820 actatggcgg ccgcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 2880 gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag 2940 aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt 3000 gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg 3060 gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt 3120 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg 3180 gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt 3240 tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa 3300 gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg 3360 tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat 3420 atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 3480 gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 3540 agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaaatggat 3600 ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa 3660 gaatatatac tgatatgtat acccgaagta tgtcaaaaag aggtatgcta tgaagcagcg 3720 tattacagtg acagttgaca gcgacagcta tcagttgctc aaggcatata tgatgtcaat 3780 atctccggtc tggtaagcac aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc 3840 tggaaagcgg aaaatcagga agggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc 3900 tcttttgctg acgagaacag gggctggtga aatgcagttt aaggtttaca cctataaaag 3960 agagagccgt tatcgtctgt ttgtggatgt acagagtgat attattgaca cgcccgggcg 4020 acggatggtg atccccctgg ccagtgcacg tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact 4080 ttacccggtg gtgcatatcg gggatgaaag ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag 4140 tgtgccggtc tccgttatcg gggaagaagt ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat 4200 caaaaacgcc attaacctga tgttctgggg aatataaatg tcaggctccc ttatacacag 4260 ccagtctgca ggtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct 4320 gttttttatg caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt 4380 cagctttctt gtacaaagtg gtgattcgag ttaattaagt taacgaattc cccccctctc 4440 cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg 4500 tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg 4560 gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag 4620 gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt 4680 ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc 4740 aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga 4800 gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga 4860 aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct 4920 ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt 4980 tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggaggcgga agcggcggag 5040 gctcccctcg aggcaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 5100 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 5160 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 5220 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 5280 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 5340 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 5400 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 5460 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 5520 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 5580 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 5640 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 5700 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 5760 acgagctgta caagtaacgc gtcccgggtc tagagctagc ggtaccatgc attacgtagt 5820 cgacgactta attaagctag cctagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 5880 actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 5940 ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 6000 ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 6060 atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 6120 ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 6180 ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 6240 ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 6300 acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 6360 ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 6420 tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 6480 acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 6540 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 6600 cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 6660 gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 6720 cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 6780 cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 6840 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 6900 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 6960 ctgcgcacca gcaccatggc gcaatcacta gagcggggta cctttaagac caatgactta 7020 caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 7080 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 7140 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 7200 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 7260 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 7320 tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 7380 tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7440 atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7500 ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 7560 gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgga 7620 tcccttgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc aacacaacat 7680 tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga catgtacctc 7740 ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg gcctgtgtag 7800 ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg cccccttgtt 7860 aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 7920 ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 7980 tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 8040 atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 8100 attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 8160 gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 8220 agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 8280 aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 8340 cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 8400 cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 8460 actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 8520 cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 8580 ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 8640 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 8700 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 8760 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 8820 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 8880 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 8940 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 9000 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 9060 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 9120 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 9180 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 9420 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 9480 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 9540 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 9600 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 9660 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 9720 ctggcctttt gctggccttt ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac 9780 agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840 aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862 <210> 36 <211> 3340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 1, pMK 8B3 anti mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5 <400> 36 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420 atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga tatcgccacc 480 atgggcagca cagccattct ggccctgctg ctggcagtgc tgcagggcgt gtcagctcag 540 gtgcagctgc agcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gcagcagcgt gaaggtgtcc 600 tgcaaggcta gcggcggcac cttcagcagc tacgccattt cttgggtgcg ccaggcccct 660 ggacagggcc tggaatggat gggctggatc agcccctaca acggcaacac cgactacgcc 720 cagaaagtgc agggcagagt gaccctgacc accgacacca gcacctccac cgcctacatg 780 gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgtgccac aggcggcgga 840 acctggtaca gcgatctgtg gggcagaggc accctcgtga cagtgtctgc tggcggcgga 900 ggatctggcg gaggcggaag tggcggggga ggaagcggag cacctgagat cgtgctgacc 960 cagagcccta gcacactgag cgccagcgtg ggcgacagag tgtccatcac ctgtagagcc 1020 agccagagca tcggaggcag cctggcctgg tatcagcaga agcctggcaa ggcccccaag 1080 ctgctgatct ctgaggccag caccctggaa agaggcgtgc ccagcagatt ttccggcagc 1140 ggctctggca ccgacttcac cctgacaatc agcagcctgc agcccgagga cgtggccacc 1200 tactactgcc agaagtacaa cagcgtgccc ctgaccttcg gccctggcac caaggtggaa 1260 atcaagccgc gggccaactt tgtatacaaa agtggaacga gaaacgtaaa atgatataaa 1320 tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca 1380 acatatccag tcactatgaa tcaactactt agatggtatt agtgacctgt actgggcctc 1440 atgggccttc ctttcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 1500 acatggtcat agctgtttcc ttgcgtattg ggcgctctcc gcttcctcgc tcactgactc 1560 gctgcgctcg gtcgttcggg taaagcctgg ggtgcctaat gagcaaaagg ccagcaaaag 1620 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1680 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1740 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1800 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1860 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1920 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1980 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2040 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 2100 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2160 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2220 acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2280 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 2340 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 2400 acttggtctg acagttatta gaaaaattca tccagcagac gataaaacgc aatacgctgg 2460 ctatccggtg ccgcaatgcc atacagcacc agaaaacgat ccgcccattc gccgcccagt 2520 tcttccgcaa tatcacgggt ggccagcgca atatcctgat aacgatccgc cacgcccaga 2580 cggccgcaat caataaagcc gctaaaacgg ccattttcca ccataatgtt cggcaggcac 2640 gcatcaccat gggtcaccac cagatcttcg ccatccggca tgctcgcttt cagacgcgca 2700 aacagctctg ccggtgccag gccctgatgt tcttcatcca gatcatcctg atccaccagg 2760 cccgcttcca tacgggtacg cgcacgttca atacgatgtt tcgcctgatg atcaaacgga 2820 caggtcgccg ggtccagggt atgcagacga cgcatggcat ccgccataat gctcactttt 2880 tctgccggcg ccagatggct agacagcaga tcctgacccg gcacttcgcc cagcagcagc 2940 caatcacggc ccgcttcggt caccacatcc agcaccgccg cacacggaac accggtggtg 3000 gccagccagc tcagacgcgc cgcttcatcc tgcagctcgt tcagcgcacc gctcagatcg 3060 gttttcacaa acagcaccgg acgaccctgc gcgctcagac gaaacaccgc cgcatcagag 3120 cagccaatgg tctgctgcgc ccaatcatag ccaaacagac gttccaccca cgctgccggg 3180 ctacccgcat gcaggccatc ctgttcaatc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 3240 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 3300 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 3340 <210> 37 <211> 2779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 2, pMK hCD8a scaffold TN L5 L2 <400> 37 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420 atgagcaatg cttttttata atgcccaact ttgtatacaa aagtggcccg cggacaacaa 480 cccctgcccc cagacctcct accccagccc ctacaattgc cagccagcct ctgagcctga 540 ggcccgaggc ttgtagacct gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg 600 cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc 660 tcgtgatcac cctgtactgc ggctccacca gcggctccgg caagcccggc tctggcgagg 720 gctccaccag cggcgactac aaggacgacg atgacaagta ataggatatc ggttcagctt 780 tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg 840 tcactatcag tcaaaataaa atcattattt ctgggcctca tgggccttcc tttcactgcc 900 cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960 tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020 aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860 aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920 tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980 gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040 ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100 agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160 ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220 gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280 tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340 gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400 accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460 gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520 cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580 caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640 tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760 tttccccgaa aagtgccac 2779 <210> 38 <211> 9344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Final vector used for lentiviral production, pLV4301G 8B3 scFV mIgG hCD8 flag <400> 38 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caccaacttt gtacaaaaaa gctgaacgat atcgccacca tgggcagcac agccattctg 2760 gccctgctgc tggcagtgct gcagggcgtg tcagctcagg tgcagctgca gcagtctggc 2820 gccgaagtga agaaacccgg cagcagcgtg aaggtgtcct gcaaggctag cggcggcacc 2880 ttcagcagct acgccatttc ttgggtgcgc caggcccctg gacagggcct ggaatggatg 2940 ggctggatca gcccctacaa cggcaacacc gactacgccc agaaagtgca gggcagagtg 3000 accctgacca ccgacaccag cacctccacc gcctacatgg aactgcggag cctgagaagc 3060 gacgacaccg ccgtgtacta ctgtgccaca ggcggcggaa cctggtacag cgatctgtgg 3120 ggcagaggca ccctcgtgac agtgtctgct ggcggcggag gatctggcgg aggcggaagt 3180 ggcgggggag gaagcggagc acctgagatc gtgctgaccc agagccctag cacactgagc 3240 gccagcgtgg gcgacagagt gtccatcacc tgtagagcca gccagagcat cggaggcagc 3300 ctggcctggt atcagcagaa gcctggcaag gcccccaagc tgctgatctc tgaggccagc 3360 accctggaaa gaggcgtgcc cagcagattt tccggcagcg gctctggcac cgacttcacc 3420 ctgacaatca gcagcctgca gcccgaggac gtggccacct actactgcca gaagtacaac 3480 agcgtgcccc tgaccttcgg ccctggcacc aaggtggaaa tcaagccgcg ggccaacttt 3540 gtatacaaaa gtggcccgcg gacaacaacc cctgccccca gacctcctac cccagcccct 3600 acaattgcca gccagcctct gagcctgagg cccgaggctt gtagacctgc tgctggcgga 3660 gccgtgcaca ccagaggact ggatttcgcc tgcgacatct acatctgggc ccctctggcc 3720 ggcacatgtg gcgtgctgct gctgagcctc gtgatcaccc tgtactgcgg ctccaccagc 3780 ggctccggca agcccggctc tggcgagggc tccaccagcg gcgactacaa ggacgacgat 3840 gacaagtaat aggatatcgg ttcagctttc ttgtacaaag ttgggattcg agttaattaa 3900 gttaacgaat tccccccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg 3960 gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 4020 aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 4080 cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 4140 gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 4200 ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 4260 caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 4320 agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 4380 ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc 4440 ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 4500 atgggaggcg gaagcggcgg aggctcccct cgaggcacca tggtgagcaa gggcgaggag 4560 ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 4620 ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 4680 atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 4740 ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 4800 gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 4860 aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 4920 ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 4980 agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 5040 atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 5100 cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 5160 ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 5220 gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaac gcgtcccggg tctagagcta 5280 gcggtaccat gcattacgta gtcgacgact taattaagct agcctagtgc catttgttca 5340 gtggttcgta gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg 5400 ggggccaagt ctgtacagca tcttgagtcc ctttttaccg ctgttaccaa ttttcttttg 5460 tctttgggta tacatttaaa ccctaacaaa acaaagagat ggggttactc tctaaatttt 5520 atgggttatg tcattggatg ttatgggtcc ttgccacaag aacacatcat acaaaaaatc 5580 aaagaatgtt ttagaaaact tcctattaac aggcctattg attggaaagt atgtcaacga 5640 attgtgggtc ttttgggttt tgctgcccct tttacacaat gtggttatcc tgcgttgatg 5700 cctttgtatg catgtattca atctaagcag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc 5760 tttctgtgta aacaatacct gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc aggtctgtgc 5820 caagtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcttgg tcatgggcca tcagcgcatg 5880 cgtggaacct tttcggctcc tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt 5940 gctcgcagca ggtctggagc aaacattatc gggactgata actctgttgt cctatcccgc 6000 aaatatacat cgtttccatg gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg 6060 tcctttgttt acgtcccgtc ggcgctgaat cctgcggacg acccttctcg gggtcgcttg 6120 ggactctctc gtccccttct ccgtctgccg ttccgaccga ccacggggcg cacctctctt 6180 tacgcggact ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct 6240 ctgcacgtcg catggagacc accgtgaacg cccaccaaat attgcccaag gtcttacata 6300 agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac ttcaaagact 6360 gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag 6420 gaggctgtag gcataaattg gtctgcgcac cagcaccatg gcgcaatcac tagagcgggg 6480 tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 6540 aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatctgctt tttgcttgta 6600 ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc 6660 cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt 6720 tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta 6780 gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag aaatgaatat 6840 cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 6900 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 6960 tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg cccctaactc cgcccatccc 7020 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 7080 ttatgcagag gccgaggccg gatcccttga gtggctttca tcctggagca gactttgcag 7140 tctgtggact gcaacacaac attgccttta tgtgtaactc ttggctgaag ctcttacacc 7200 aatgctgggg gacatgtacc tcccaggggc ccaggaagac tacgggaggc tacaccaacg 7260 tcaatcagag gggcctgtgt agctaccgat aagcggaccc tcaagagggc attagcaata 7320 gtgtttataa ggcccccttg ttaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 7380 tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 7440 aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 7500 catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 7560 tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 7620 tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 7680 ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 7740 ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 7800 cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 7860 ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 7920 tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 7980 gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 8040 ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc 8100 aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 8160 acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 8220 tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 8280 cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 8340 gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 8400 taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 8460 tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 8520 cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 8580 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 8640 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 8700 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 8760 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 8820 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 8880 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 8940 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 9000 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 9060 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 9120 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 9180 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct ttttgaagct gtccctgatg 9240 gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 9300 agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcg 9344 <210> 39 <211> 6924 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLenti-C-Myc-DDK OX40L <400> 39 gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240 ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420 ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600 catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660 tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720 ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780 cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020 cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080 gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140 tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200 gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260 attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320 gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380 aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440 aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500 aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560 atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620 ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680 ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740 atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800 ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860 cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920 atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980 agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040 attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100 aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160 ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220 ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280 ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340 gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400 cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460 gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520 taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580 cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagaca tgtccaatat gaccgccatg 2640 ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2700 cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2760 caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2820 gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2880 tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2940 ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 3000 attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 3060 gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 3120 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca 3180 aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 3240 tcagaatttt gtaatacgac tcactatagg gcggccggga attcgtcgac tggatccggt 3300 accgaggaga tctgccgccg cgatcgccat ggaaagggtc caacccctgg aagagaatgt 3360 gggaaatgca gccaggccaa gattcgagag gaacaagcta ttgctggtgg cctctgtaat 3420 tcagggactg gggctgctcc tgtgcttcac ctacatctgc ctgcacttct ctgctcttca 3480 ggtatcacat cggtatcctc gaattcaaag tatcaaagta caatttaccg aatataagaa 3540 ggagaaaggt ttcatcctca cttcccaaaa ggaggatgaa atcatgaagg tgcagaacaa 3600 ctcagtcatc atcaactgtg atgggtttta tctcatctcc ctgaagggct acttctccca 3660 ggaagtcaac attagccttc attaccagaa ggatgaggag cccctcttcc aactgaagaa 3720 ggtcaggtct gtcaactcct tgatggtggc ctctctgact tacaaagaca aagtctactt 3780 gaatgtgacc actgacaata cctccctgga tgacttccat gtgaatggcg gagaactgat 3840 tcttatccat caaaatcctg gtgaattctg tgtccttacg cgtacgcggc cgctcgagca 3900 gaaactcatc tcagaagagg atctggcagc aaatgatatc ctggattaca aggatgacga 3960 cgataaggtt taaacggccg gccgcggtct gtacaagtag gattcgtcga gggacctaat 4020 aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atacatgttt aagggttccg gttccactag 4080 gtacaattcg atatcaagct tatcgataat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 4140 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 4200 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 4260 tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 4320 actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 4380 tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 4440 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4500 aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4560 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4620 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4680 tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgatcga gacctagaaa aacatggagc 4740 aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgattgt gcctggctag aagcacaaga 4800 ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 4860 ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 4920 ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 4980 tgattggcag aactacacac cagggccagg gatcagatat ccactgacct ttggatggtg 5040 ctacaagcta gtaccagttg agcaagagaa ggtagaagaa gccaatgaag gagagaacac 5100 ccgcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag aagtattaga 5160 gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacatggcc cgagagctgc atccggactg 5220 tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 5280 cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 5340 gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 5400 tagcagcatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5460 ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5520 gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5580 cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5640 gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5700 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5760 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5820 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5880 gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5940 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 6000 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6060 tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6120 tttggtcatg attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc 6180 attctgccga catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc 6240 agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg 6300 tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg 6360 aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc 6420 acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc 6480 gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat 6540 atcaccagct caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg 6600 gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa 6660 aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat 6720 gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt 6780 tttttctcca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 6840 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt cccgcgcaca 6900 tttccccgaa aagtgccacc tgac 6924 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel-1b primer <400> 40 cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel-2b primer <400> 41 ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hgb1 primer <400> 42 gcttctgaca caactgtgtt cactagc 27 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hgb2 primer <400> 43 caccaacttc atccacgttc acc 23

Claims (12)

  1. CD58을 내인적으로 발현하는 단리된 K562 골수성 세포이며, 여기서 상기 K562 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 안정하게 형질도입되고, 여기서 1종 이상의 바이러스 벡터는 (i) CD86을 코딩하는 핵산; (ii) OX40L 및 4-1BBL로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 공동자극 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산; 및 (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하고; 여기서 K562 골수성 세포는 (i), (ii), 및 (iii)의 각각의 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 것인 K562 골수성 세포.
  2. 제1항의 K562 골수성 세포를 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 집단이며, 여기서 aAPC의 집단은 aAPC의 집단과 접촉된 종양 침윤 림프구(TIL)를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC의 집단.
  3. 제1항의 K562 골수성 세포를 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 집단이며, 여기서 aAPC의 집단은 TIL의 집단을 약 3000 IU/mL의 농도의 IL-2(인터루킨-2) 및 약 30 ng/mL 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시킬 수 있는 것인 aAPC의 집단.
  4. 제1항에 있어서, K562 골수성 세포가 K562 골수성 세포와 접촉된 T 세포를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 K562 골수성 세포.
  5. 제1항에 있어서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  6. 제1항에 있어서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19를 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  7. 제1항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 4-1BBL 단백질을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  8. 제7항에 있어서, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  9. 제7항에 있어서, 4-1BBL 단백질을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 서열식별번호: 16을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  10. 제1항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 OX40L 단백질을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  11. 제10항에 있어서, OX40L 단백질이 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 K562 골수성 세포.
  12. CD58을 내인적으로 발현하는 단리된 K562 골수성 세포이며, 여기서 상기 K562 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 안정하게 형질도입되고, 여기서 1종 이상의 바이러스 벡터는 (i) CD86 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 코딩하는 핵산; (ii) 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 13, 및 서열식별번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 1종 이상의 핵산; 및 (iii) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하고; 여기서 K562 골수성 세포는 (i), (ii), 및 (iii)의 각각의 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 것인 K562 골수성 세포.
KR1020247002478A 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 KR20240013295A (ko)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662415274P 2016-10-31 2016-10-31
US62/415,274 2016-10-31
US201662438600P 2016-12-23 2016-12-23
US62/438,600 2016-12-23
US201762475053P 2017-03-22 2017-03-22
US62/475,053 2017-03-22
US201762481831P 2017-04-05 2017-04-05
US62/481,831 2017-04-05
PCT/US2017/059271 WO2018081789A1 (en) 2016-10-31 2017-10-31 Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
KR1020197015545A KR20190071802A (ko) 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197015545A Division KR20190071802A (ko) 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240013295A true KR20240013295A (ko) 2024-01-30

Family

ID=60702946

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197015545A KR20190071802A (ko) 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포
KR1020247002478A KR20240013295A (ko) 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197015545A KR20190071802A (ko) 2016-10-31 2017-10-31 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포

Country Status (14)

Country Link
US (4) US10415015B2 (ko)
EP (1) EP3532608A1 (ko)
JP (2) JP2019531744A (ko)
KR (2) KR20190071802A (ko)
CN (2) CN116478930A (ko)
AU (1) AU2017347942A1 (ko)
BR (1) BR112019008560A2 (ko)
CA (1) CA3041673A1 (ko)
IL (1) IL266221A (ko)
MA (1) MA46668A (ko)
MX (2) MX2019004708A (ko)
SG (1) SG11201903825SA (ko)
TW (1) TWI788307B (ko)
WO (1) WO2018081789A1 (ko)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
EP3532607B1 (en) 2016-10-26 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
US20200377855A1 (en) * 2017-05-05 2020-12-03 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Rapid method for the culture of tumor infiltrating lymphocytes
TW201919662A (zh) 2017-06-05 2019-06-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
BR112020018658A2 (pt) 2018-03-15 2020-12-29 KSQ Therapeutics, Inc. Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada
CN112368003A (zh) 2018-04-27 2021-02-12 艾欧凡斯生物治疗公司 肿瘤浸润淋巴细胞的基因编辑及其在免疫治疗中的用途
TW202031273A (zh) * 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
WO2020081450A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading btk via ubiquitin proteosome pathway
TW202039830A (zh) * 2018-11-05 2020-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途
CN109439632A (zh) * 2018-11-16 2019-03-08 中国科学院合肥肿瘤医院 一种提高car-t细胞转染效率的方法
WO2020131547A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
GB201900858D0 (en) * 2019-01-22 2019-03-13 Price Nicola Kaye Receptors providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
US20220249559A1 (en) * 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
EP4069237A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading btk via ubiquitin proteosome pathway
MX2022007598A (es) 2019-12-20 2022-09-23 Instil Bio Uk Ltd Dispositivos y métodos para el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores y usos de los mismos.
US20230174653A1 (en) * 2020-04-06 2023-06-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. B7-h3 chimeric antigen receptors
US20230226110A1 (en) 2020-04-28 2023-07-20 Achilles Therapeutics Uk Limited T cell therapy
WO2021226061A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4247939A2 (en) 2020-11-23 2023-09-27 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing immune cells
AU2022226660A1 (en) 2021-02-25 2023-07-27 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
TW202305360A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於ｔ細胞共培養效力測定及配合細胞療法產品使用的方法及組合物
WO2022214835A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Achilles Therapeutics Uk Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
EP4359511A1 (en) 2021-06-22 2024-05-01 Achilles Therapeutics UK Limited A method for producing antigen-specific t cells
EP4370139A2 (en) * 2021-07-14 2024-05-22 Synthekine, Inc. Methods and compositions for use in cell therapy of neoplastic disease
CN113528436B (zh) * 2021-08-04 2023-01-17 苏州大学 基于淋巴细胞的同源靶向性人工抗原呈递细胞及其构建和应用
CA3234821A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Suman Kumar VODNALA Methods for culturing immune cells
CN114214286A (zh) * 2021-12-17 2022-03-22 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种用于高效扩增nk细胞的k562-ox40l细胞系的制备方法
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment

Family Cites Families (223)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2492258A1 (fr) 1980-10-17 1982-04-23 Pharmindustrie Nouveau medicament a base d'amino-2 trifluoromethoxy-6 benzothiazole
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8504025D0 (en) 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
WO1988000970A2 (en) 1986-08-08 1988-02-11 Regents Of The University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
DE68929551T2 (de) 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
US5177017A (en) 1990-03-22 1993-01-05 Trigen, Inc. Molecular cloning of the genes responsible for collagenase production from Clostridium histolyticum
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5279823A (en) 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE
CA2146559A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 Melanie K. Spriggs Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US5593877A (en) 1993-03-11 1997-01-14 The Rockefeller University Nucleic acid and recombinant production of vespid venom hyaluronidase
US5422261A (en) 1993-04-16 1995-06-06 Baxter International Inc. Composition containing collagenase and chymopapain for hydrolyzing connective tissue to isolate cells
WO1994024267A1 (en) 1993-04-20 1994-10-27 Robinson, William, S. Methods and materials for treatment of individuals infected with intracellular infectious agents
US5674704A (en) * 1993-05-07 1997-10-07 Immunex Corporation Cytokine designated 4-IBB ligand
GB9317380D0 (en) 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US5691188A (en) 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
DE4447484C2 (de) 1994-04-08 1997-07-17 Deutsches Krebsforsch Mittel zur Hemmung von Apoptose
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
WO1996000295A1 (en) 1994-06-27 1996-01-04 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
DK0766745T3 (da) 1995-04-08 2002-11-25 Lg Chemical Ltd Monoklonalt antistof, som er specifikt for humant 4-1BB samt cellelinje, som producerer dette
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5989888A (en) 1996-01-24 1999-11-23 Roche Diagnostics Corporation Purified mixture of collagenase I, collagenase II and two other proteases
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
ES2300113T3 (es) 1996-08-02 2008-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en terapia y diagnostico in vivo.
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
BR9712278A (pt) 1996-10-11 1999-08-31 Bristol Myers Squibb Co Processos e composições para imunomodulação
US6123938A (en) 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
US7118742B2 (en) 1997-07-07 2006-10-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US6475994B2 (en) 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
JP4741074B2 (ja) 1998-02-24 2011-08-03 シスターズ オブ プロビデンス イン オレゴン Ｏｘ−４０レセプター結合因子又はそれをコードする核酸を含む組成物並びに抗原特異的免疫応答を増強するための方法
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
CA2374674A1 (en) * 1999-05-20 2000-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptor 5
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
AUPQ755300A0 (en) * 2000-05-17 2000-06-08 Monash University Immune potentiating compositions
US6627442B1 (en) 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
ATE537845T1 (de) 2000-10-31 2012-01-15 Pr Pharmaceuticals Inc Verfahren zur herstellung von formulierungen zur verbesserten abgabe von bioaktiven molekülen
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
WO2003057171A2 (en) * 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
CA2489004C (en) 2002-06-13 2013-01-08 Crucell Holland B.V. Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor
JP2006506987A (ja) 2002-06-28 2006-03-02 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 自己免疫および臓器または造血幹細胞移植に関連する免疫学的欠損を有する患者における免疫レパートリー回復のための組成物および方法
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
AU2003259294A1 (en) 2002-07-30 2004-02-16 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
US7425619B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
DK1545204T3 (en) 2002-09-06 2016-11-14 The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro selected antigen-specific lymphocytes following non-myeloablative lymphodepletive chemotherapy
EP1553975B8 (en) 2002-09-27 2023-04-12 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
WO2004033685A1 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Avidex Ltd Single chain recombinant t cell receptors
EP1562972B1 (en) 2002-10-15 2010-09-08 Facet Biotech Corporation ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
DE602004024041D1 (de) 2003-03-05 2009-12-24 Halozyme Inc Lösliches hyaluronidase-glycoprotein (shasegp), verfahren zu seiner herstellung, verwendungen und dieses enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
CN103173354B (zh) 2003-10-08 2017-07-14 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
US20080089892A1 (en) 2004-01-12 2008-04-17 Eli Lilly And Co. Fc Region Variants
US20050177518A1 (en) 2004-02-10 2005-08-11 Brown Collie D. Electronic funds transfer and electronic bill receipt and payment system
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
DE102004014983A1 (de) 2004-03-26 2005-10-20 Univ Stuttgart Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1765860B1 (en) 2004-05-19 2008-12-10 MediGene Ltd. High affinity ny-eso t cell receptor
EP1765988B1 (en) 2004-05-27 2017-09-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
WO2006050172A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 University Of Southern California Combination cancer immunotherapy with co-stimulatory molecules
WO2006105021A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
DK1877090T3 (da) 2005-05-06 2014-04-14 Providence Health System Trimert ox40-immunoglobulin-fusionsprotein og fremgangsmåder til anvendelse heraf
SI2161336T1 (sl) 2005-05-09 2013-11-29 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Humana monoklonska protitelesa za programirano smrt 1 (PD-1) in postopki za zdravljenje raka ob uporabi anti-PD-1 protiteles samih ali v kombinaciji z drugimi imunoterapevtiki
BRPI0613361A2 (pt) 2005-07-01 2011-01-04 Medarex Inc anticorpo monoclonal humano isolado, composição, imunoconjugado, molécula biespecìfica, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, camundongo transgênico, método para modular uma resposta imune num indivìduo, método para inibir crescimento de células tumorais num indivìduo, método para tratar uma doença infecciosa num indivìduo, método para aumentar uma resposta imune a um antìgeno num indivìduo, método para tratar ou prevenir uma doença inflamatória num indivìduo e método para preparar o anticorpo anti-pd-l1
WO2007071409A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Method for treating colon cancer
EP1966369B1 (en) 2005-12-21 2010-10-06 Sentoclone AB Method for expansion of tumour-reactive t-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer
WO2007071389A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Method for treating disseminated cancer
AU2006328945B2 (en) 2005-12-21 2011-06-30 Sentoclone International Ab Method for treating malignant melanoma
TWI466269B (zh) 2006-07-14 2014-12-21 Semiconductor Energy Lab 非揮發性記憶體
EP1894940A1 (en) 2006-08-28 2008-03-05 Apogenix GmbH TNF superfamily fusion proteins
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
AU2008219666A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Genentech, Inc. Antagonist OX40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
EP2535354B1 (en) 2007-06-18 2017-01-11 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US7951365B2 (en) 2007-06-27 2011-05-31 Deifiera Falun Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types
EP2484691B1 (en) 2007-07-10 2016-01-13 Apogenix GmbH TNF superfamily collectin fusion proteins
WO2009014708A2 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
EP3239178A1 (en) 2007-12-14 2017-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human ox40 receptor
US8629098B2 (en) * 2008-01-15 2014-01-14 Yale University Compositions and methods for adoptive and active immunotherapy
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
EP2310409A2 (en) 2008-06-17 2011-04-20 Apogenix GmbH Multimeric tnf receptors
EP3103875A1 (en) 2008-07-21 2016-12-14 Apogenix AG Tnfsf single chain molecules
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
WO2014085437A2 (en) 2012-11-27 2014-06-05 The Johns Hopkins University Use of post-transplant cyclophosphamide treated allogeneic marrow infiltrating lymphocytes to augment anti-tumor immunity
US20150320798A1 (en) 2012-11-27 2015-11-12 The Johns Hopkins University Use of Post-Transplant Cyclophosphamide Treated Allogeneic Marrow Infiltrating Lymphocytes to Augment Anti-Tumor Immunity
KR20210060670A (ko) 2008-12-09 2021-05-26 제넨테크, 인크. 항-ｐｄ-ｌ１ 항체 및 ｔ 세포 기능을 향상시키기 위한 그의 용도
ES2593049T3 (es) 2009-01-09 2016-12-05 Apogenix Ag Proteínas de fusión que forman trímeros
US8785601B2 (en) * 2009-01-28 2014-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors and related materials and methods of use
CA2760446C (en) 2009-04-30 2018-01-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inducible interleukin-12
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
PL3023438T3 (pl) 2009-09-03 2020-07-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Przeciwciała anty-gitr
BR122021025338B1 (pt) 2009-11-24 2023-03-14 Medimmune Limited Anticorpo isolado ou fragmento de ligação do mesmo contra b7-h1, composição farmacêutica e seus usos
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
CN102762719A (zh) 2009-12-08 2012-10-31 威尔森沃尔夫制造公司 用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
CA2796571C (en) 2010-04-13 2019-10-29 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
US9783578B2 (en) 2010-06-25 2017-10-10 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
CA2804550C (en) 2010-07-09 2021-01-05 Bionovion Holding B.V. Agonistic antibody to cd27
CN103221427B (zh) 2010-08-23 2016-08-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
RU2551963C2 (ru) 2010-09-09 2015-06-10 Пфайзер Инк. Молекулы, связывающиеся с 4-1вв
ES2385239B1 (es) 2010-09-30 2013-06-19 Proteos Biotech S.L.U. Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
KR102472497B1 (ko) 2010-11-12 2022-11-29 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
EP3305798A1 (en) 2010-12-09 2018-04-11 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012129201A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
KR102028340B1 (ko) 2011-04-13 2019-10-04 이뮤니쿰 에이비 항원-특이적 t 세포의 증식 방법
CN103732238A (zh) 2011-06-08 2014-04-16 奥瑞基尼探索技术有限公司 用于免疫调节的治疗性化合物
US20140234320A1 (en) 2011-06-20 2014-08-21 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
BR112013032552A2 (pt) 2011-07-24 2017-12-12 Curetech Ltd variantes de anticorpos monoclonais humanizados imunomoduladores
KR101685262B1 (ko) 2011-08-23 2016-12-21 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ｏｘ４０ 항체 및 이의 사용 방법
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
EP2768939B1 (en) 2011-10-21 2016-08-17 Cell Medica Limited Device for the aseptic expansion of cells
HUE051954T2 (hu) 2011-11-28 2021-03-29 Merck Patent Gmbh ANTI-PD-L1 ellenanyagok és alkalmazásaik
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
CN104159911A (zh) 2012-03-07 2014-11-19 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的模拟肽化合物
RU2014143443A (ru) 2012-03-29 2016-05-20 Ориджин Дискавери Текнолоджиз Лимитед Иммуномодулирующие циклические соединения
AU2013262485B2 (en) 2012-05-18 2017-12-14 Wilson Wolf Manufacturing, LLC Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
CN110241086A (zh) 2012-06-11 2019-09-17 威尔逊沃夫制造公司 用于过继细胞疗法的改进的细胞培养方法
US9844569B2 (en) 2013-03-01 2017-12-19 The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor reactive T cells from peripheral blood
CN105163744A (zh) 2013-03-01 2015-12-16 美国卫生和人力服务部 从肿瘤中产生肿瘤反应性t细胞的富集群的方法
MX2015012920A (es) 2013-03-14 2016-06-02 Univ Johns Hopkins Celulas presentadoras de antígeno artificial de nanoescala.
US9308236B2 (en) 2013-03-15 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions
SG10201708048XA (en) 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
CN110564612A (zh) 2013-06-24 2019-12-13 威尔逊沃夫制造公司 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法
GB201311487D0 (en) 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
ES2773548T3 (es) 2013-07-15 2020-07-13 Us Health Métodos de preparación de células T anti-antígeno de virus del papiloma humano
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3385257A1 (en) 2013-09-06 2018-10-10 Aurigene Discovery Technologies Limited 1,3,4-oxadiazole and 1,3,4-thiadiazole derivatives as immunomodulators
CA2922607C (en) 2013-09-06 2022-08-30 Aurigene Discovery Technologies Limited 1,2,4-oxadiazole derivatives as immunomodulators
WO2015036927A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunomodulating peptidomimetic derivatives
CN107011441B (zh) 2013-09-13 2020-12-01 百济神州(广州)生物科技有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
WO2015039100A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cd137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
EP3048999A1 (en) 2013-09-27 2016-08-03 Acclarent, Inc. Enhanced gripping features for nasal and paranasal sinus systems
KR20160068960A (ko) * 2013-10-25 2016-06-15 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 면역요법을 위한 다클론성 감마 델타 t 세포
BR112016013963A2 (pt) 2013-12-17 2017-10-10 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agonistas de ligação de ox40 e antagonistas de ligação do eixo de pd-1
TW201613635A (en) 2014-02-04 2016-04-16 Pfizer Combination of a PD-1 antagonist and a 4-1BB agonist for treating cancer
JP2017511375A (ja) 2014-03-20 2017-04-20 エイチ リー モフィット キャンサー センター アンド リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド 養子細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球
US20170044496A1 (en) 2014-04-10 2017-02-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Adoptive Cell Therapy
US11173146B2 (en) 2014-04-25 2021-11-16 The Regents Of The University Of California Selective activators of the intermediate conductance CA2+activated K+ channel KCa3.1 and their methods of use
JP6840072B2 (ja) * 2014-06-05 2021-03-10 アイム・セラピューティクス・べー・フェー Ｔ細胞認識を決定するための手段及び方法
UA123821C2 (uk) 2014-06-11 2021-06-09 Полібіосепт Гмбх Композиція для експансії лімфоцитів in vitro
AU2015311761B2 (en) 2014-09-04 2020-11-12 The Johns Hopkins University Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions
CN107074932A (zh) 2014-10-02 2017-08-18 美国卫生和人力服务部 分离对癌症特异性突变具有抗原特异性的t细胞受体的方法
EP3034092A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 Université de Lausanne Adoptive immunotherapy for treating cancer
RU2017125957A (ru) 2015-01-04 2019-02-04 Проталикс Лтд. Модифицированная днказа и ее применения
US20180044429A1 (en) 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
CA2984234C (en) 2015-05-01 2023-10-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating t cells and t cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation from peripheral blood
FR3040396A1 (fr) 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
FR3038324B1 (fr) 2015-06-30 2020-10-30 Lab Francais Du Fractionnement Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique
WO2017048614A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating tumor-reactive t cell receptors from tumor or peripheral blood
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
WO2017072251A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Life Technologies As Selective expansion of different subpopulations of t cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio
EP3487990A4 (en) 2016-06-28 2020-07-29 Geneius Biotechnology, Inc. T-CELL COMPOSITIONS FOR IMMUNOTHERAPY
CN106244538A (zh) 2016-08-04 2016-12-21 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种恶性腹水来源的til细胞的分离培养方法
EP3532607B1 (en) 2016-10-26 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
WO2018102761A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 City Of Hope Methods for manufacturing and expanding t cells expressing chimeric antigen receptors and other receptors
CN106591232A (zh) 2017-01-04 2017-04-26 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种高效的pd‑1‑cd8+t细胞的培养方法
CN110913690A (zh) 2017-03-14 2020-03-24 朱诺治疗学股份有限公司 用于低温储存的方法
CN107384867B (zh) 2017-08-04 2020-09-11 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基

Also Published As

Publication number Publication date
CN110312790A (zh) 2019-10-08
AU2017347942A1 (en) 2019-05-30
MX2022012409A (es) 2023-05-03
US20220315892A1 (en) 2022-10-06
EP3532608A1 (en) 2019-09-04
CN116478930A (zh) 2023-07-25
WO2018081789A1 (en) 2018-05-03
JP2023016809A (ja) 2023-02-02
US20180127715A1 (en) 2018-05-10
TWI788307B (zh) 2023-01-01
WO2018081789A8 (en) 2019-05-09
SG11201903825SA (en) 2019-05-30
US20220315893A1 (en) 2022-10-06
MX2019004708A (es) 2019-08-29
US10415015B2 (en) 2019-09-17
BR112019008560A2 (pt) 2019-09-17
CA3041673A1 (en) 2018-05-03
MA46668A (fr) 2019-09-04
US11667890B2 (en) 2023-06-06
KR20190071802A (ko) 2019-06-24
IL266221A (en) 2019-06-30
JP2019531744A (ja) 2019-11-07
US20190345445A1 (en) 2019-11-14
TW201831690A (zh) 2018-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11667890B2 (en) Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
KR102630017B1 (ko) 프로그램화된 사멸 1 리간드 1 (pd-l1) 결합 단백질 및 그의 사용 방법
AU2021204620A1 (en) Central nervous system targeting polynucleotides
AU2016343979A1 (en) Delivery of central nervous system targeting polynucleotides
US11129890B1 (en) Non-integrating HIV-1 comprising mutant RT/IN proteins and the SARS-CoV-2 spike protein
CN111094569A (zh) 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体
KR20170136528A (ko) 세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법
AU2024200154A1 (en) An engineered multi-component system for identification and characterisation of T-cell receptors, T-cell antigens and their functional interaction
CN113692225B (zh) 经基因组编辑的鸟类
JP2023025182A (ja) Ｔ細胞レセプター及びｔ細胞抗原の同定及び特徴決定のための遺伝子操作された多成分システム
KR20220078607A (ko) 융합 단백질들을 이용한 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법들
CN115968300A (zh) 用于体内转导的载体和方法
KR20240037185A (ko) 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도
KR101539796B1 (ko) 암 치료법을 위한 다중 발현 카세트를 포함하는 구조물
CN111315212B (zh) 经过基因组编辑的鸟
KR20210151785A (ko) 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도
KR20240037192A (ko) 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
CN116323942A (zh) 用于基因组编辑的组合物及其使用方法
RU2812852C2 (ru) Невирусные днк-векторы и варианты их применения для экспрессии терапевтического средства на основе фактора viii (fviii)
NZ793899A (en) Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
KR20240029020A (ko) Dna 변형을 위한 crispr-트랜스포손 시스템

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent