CN110312790A - 用于肿瘤浸润淋巴细胞扩增的工程化人工抗原呈递细胞 - Google Patents
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Abstract
在一些实施方案中，公开了涉及分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)的组合物和方法，包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，例如MOLM‑14或EM‑3骨髓细胞，其中，骨髓细胞内源性表达HLA‑A/B/C、ICOS‑L和CD58，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4‑1BBL和/或OX40L的核酸，并转导骨髓细胞以表达CD86和4‑1BBL和/或OX40L蛋白。在一些实施方案中，还公开了用aAPC扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法和用aAPC扩增后使用TIL治疗癌症的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月5日提交的美国临时申请No.62/481,831、2017年3月22日提交的美国临时申请No.62/475,053、2016年12月23日提交的美国临时申请No.62/438,600和2016年10月31日提交的美国临时申请No.62/415,274的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
公开了用于扩增肿瘤浸润淋巴细胞的工程化人工抗原呈递细胞(aAPC)。
背景技术
使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。参见Gattinoni等，Nat.Rev.Immunol.2006，6，383-393。成功的免疫疗法需要大量的TIL，商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩展的技术、物流和监管问题，这是一项挑战。基于IL-2的TIL扩增(随后是“快速扩增方法”(REP))，由于其速度和效率，已成为TIL扩增的优选方法。参见Dudley等，Science 2002，298，850-54；Dudley等，J.Clin.Oncol.2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.2008，26，5233-39；Riddell等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.Immunother.2003，26，332-42。然而，虽然REP可以在14天内导致TIL扩增1000倍，但它需要通常来自多个供体(如饲养细胞)的大量过量(例如，200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)，以及抗CD3抗体(OKT-3)和高剂量的IL-2。参见Dudley等，J.Immunother.2003，26，332-42。尽管PBMC具有高性能，但PBMC具有多种缺点，包括需要大量同种异体PBMC、需要从多个健康供体通过白细胞分离术获得PBMC、由此产生的低温储藏后PBMC生存力的供体间差异和易变的TIL扩增结果、未检测到的病毒病原体导致下游患者感染的风险，以及对每个供体细胞产品进行大量且昂贵的实验室测试以确保无菌和质量(包括病毒污染物测试)和测试扩增特性。
不幸的是，与PBMC相比，开发的用于扩增TIL的aAPC具有较差的性能，包括输入的TIL的表型特性的改变，以及差的扩增性能和/或扩增结果的高度可变性。由于可能适于用作aAPC的大量潜在细胞以及识别合适候选物的不可预测性，用于多克隆TIL的aAPC的开发重点迄今为止仅在于成熟的K562细胞系。参见Butler和Hirano，Immunol.Rev.2014，257，191-209。例如，在REP前的培养物中(而不在REP培养物中)测试经修饰以表达4-1BBL(CD137L)的K562细胞，以确定肿瘤消化物中TIL扩增的增强，但是仍然需要将PBMC与K562细胞一起使用以获得TIL扩增。参见Friedman等，J.Immunother.2011，34，651-661。其他经修饰以表达CD64、CD86和4-1BBL的工程化K562细胞进行了测试并实现了TIL扩增，最佳可与PBMC相媲美，并且很可能低于PBMC，并且还遭受了多克隆TIL表型偏向不太有利的CD8+/CD4+T细胞比率。参见Ye等，J.Translat.Med.2011，9，131。最近，经修饰以表达CD86、4-1BBL(CD137L)、高亲和力Fc受体(CD64)和膜结合的IL-15的K562细胞也显示出以与PBMC饲养细胞相比相当的数量繁殖TIL(REP后)，但具有膜结合的IL-15的额外复杂性。参见Forget等，J.Immunother.2014，37，448-60。开发的其他系统缺乏关键的共刺激分子，导致不利的T细胞表型倾斜，或者需要额外的白细胞介素(例如IL-21)。参见Butler和Hirano，Immunol.Rev.2014，257，191-209。总体而言，尚未显示K562修饰的aAPC可提供具有可接受的可变性的TIL的一致扩增，同时在包括总体扩增细胞计数的其他测量中也比PBMC表现更好。除了K562细胞之外的替代性aAPC已经在其他细胞扩增方法中成功，但是没有获得与具有构成TIL的独特多克隆细胞亚群的PBMC相同的性能。参见Maus等，Nat.Biotechnol.2002，20，143-148；Suhoski等，Mol.Ther.2007，15，981-988。
MOLM-14人白血病细胞系由患有复发性急性单核细胞白血病的患者的外周血建立，并且最初的表型表征表明存在至少以下标志物：CD4、CD9、CD11a、CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD64、CD65、CD87、CD92、CD93、CD116、CD118和CD155。参见Matsuo等，Leukemia1997，11，1469-77。MOLM-14的其他表型表征发现更高水平的HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L、CD58和更低水平的CD86。先前未报道MOLM-14细胞和密切相关的MOLM-13细胞作为用于肿瘤免疫治疗应用的细胞扩增的有用的aAPC。
从患有费城染色体阳性CML的患者的骨髓建立EM-3人细胞系。参见Konopka等，Proc.Nat’l Acad.Sci.，美国，1985，82，1810-4。先前尚未报道EM-3细胞和密切相关的EM-2细胞系作为用于肿瘤免疫治疗应用的细胞扩增的有用的aAPC。EM-3细胞的表型表征表明存在至少以下标志物：CD13、CD15和CD33。
本发明提供了出人意料的发现，用另外的共刺激分子(包括CD86(B7-2)、4-1BBL(CD137L)和OX40L(CD134L))转导工程化骨髓谱系细胞(包括MOLM-13、MOLM-14、EM-3和EM-2细胞)提供了优质和高效的TIL大量扩展，并具有最低限度的可变性，降低了成本，并且不依赖人类血液样本作为PBMC的来源，具有使用可从主细胞库有效生产的aAPC的优点。CD86和4-1BBL是共刺激分子，其为T细胞活化提供共刺激信号。用另外的共刺激分子转导的MOLM-14、MOLM-13、EM-3和/或EM-2细胞可用于例如扩增用于癌症免疫疗法和其他疗法的TIL。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含用一种以上载体转导的骨髓细胞，其中，一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白中的每一种都是人蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，aAPC可以刺激和扩增与aAPC接触的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
显而易见的是，在本发明的某些实施方案中，编码CD86的核酸分子可以与编码4-1BBL的核酸分子包含在不同或相同的病毒载体中。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，在包含浓度为约3000IU/mL的IL-2和浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体的细胞培养基中，aAPC在7天的时间内将TIL群扩增至少50倍。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述aAPC可以刺激和扩增与aAPC接触的T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞基本上不含膜结合的IL-15。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞是MOLM-14细胞。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞是MOLM-13细胞。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述骨髓细胞是EM-2细胞。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述CD86蛋白包含：SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代(conservative amino acidsubstitutions)的氨基酸序列，并且所述4-1BBL蛋白包含：SEQ ID NO：9或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述编码CD86的核酸分子包含SEQID NO：16所示的核酸序列，所述编码4-1BBL的核酸分子包含SEQ ID NO：19所示的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：使TIL群与aAPC接触的步骤，所述aAPC包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，所述TIL群被扩增。在一个实施方案中，该方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，在细胞培养基中，APC群在7天的时间内将TIL群扩增至少50倍。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述骨髓细胞内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述骨髓细胞是MOLM-14细胞。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述骨髓细胞是MOLM-13细胞。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述骨髓细胞是EM-2细胞。
在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述CD86蛋白包含：SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述4-1BBL蛋白包含：SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，所述编码CD86的核酸包含SEQ IDNO：16所示的核酸序列，并且所述编码4-1BBL的核酸包含SEQ ID NO：19所示的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，使用透气性容器进行扩增。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸分子和编码4-1BBL的核酸分子，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，其中，TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：使包含TIL群的TIL群与骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中，所述骨髓aAPC包含至少两个与TIL上的至少两个共刺激分子特异性结合的共刺激配体，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL，并且其中，所述至少两个共刺激配体包含CD86和4-1BBL。在一个实施方案中，前述方法是体外或离体方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，并且其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，TIL是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，并且其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，并且其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍，其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；并且其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，使用透气性容器进行扩增。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；并且其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，使用透气性容器进行扩增。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，第二TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；以及
并且其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，第二TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。在某些实施方案中，第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，并且其中，第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，所述骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，TIL群是第二TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；以及
其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58，其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群。
其中，所述骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，所述骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3。
在一个实施方案中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在一个实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-13细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中MOLM-13细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在某些实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中所述EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在某些实施方案中，骨髓细胞包含用一种以上病毒载体转导的EM-2细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中所述EM-2细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天；
(e)将治疗有效份的第三TIL群施用于患有癌症的患者；和
(f)用高剂量IL-2方案治疗患者，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受；
其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天；
(e)将治疗有效份的第三TIL群施用于患有癌症的患者；和
(f)用高剂量IL-2方案治疗患者，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受；
其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；和
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
进一步地，其中，TIL群用于与非清髓性淋巴细胞清除方案组合施用于患者，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括：环磷酰胺以60mg/m2/天的剂量施用2天，然后氟达拉滨以25mg/m2/天的剂量施用5天，并且其中，TIL群与高剂量IL-2方案组合施用，其中，高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素15分钟，直至耐受。在某些实施方案中，TIL群用于在高剂量IL-2方案之前和非清髓性淋巴细胞清除方案之后施用。
在某些实施方案中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-13细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中MOLM-13细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在某些实施方案中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中所述EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
在一个实施方案中，TIL群用于治疗癌症，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；和
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，在所述第二细胞培养基中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在，OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；和
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；其中，在所述第二细胞培养基中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在，OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；和
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；和
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；和
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，初始扩增使用透气性容器进行。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；和
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，快速扩增使用透气性容器进行。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；其中，初始扩增和/或快速扩增使用透气性容器进行。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率在1∶80和1∶400之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中，TIL群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；其中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率在1∶80和1∶400之间。
在一个实施方案中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群，
其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其用于特异性诱导表达已知共刺激分子的肿瘤浸润淋巴细胞的增殖，所述试剂盒包含有效量的aAPC，其中，所述aAPC包含使用慢病毒载体(LV)转导的MOLM-14细胞或EM-3细胞，其中，LV包含编码至少一种共刺激配体的核酸，所述共刺激配体特异性结合所述已知共刺激分子，其中，已知共刺激分子与所述共刺激配体的结合刺激并扩增所述T细胞，所述试剂盒还包括用于使用所述试剂盒的加样器和说明材料。
在一个实施方案中，本发明提供一种评价肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)效力的方法，包括以下步骤：
(a)提供多个表达内源性CD16Fc受体的小鼠肥大细胞瘤P815细胞，其中，用基于增强型荧光绿色蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导P815细胞；
(b)在有和没有OKT-3的情况下共培养多个P815细胞TIL，分别评价T细胞受体(TCR)活化(特异性杀伤)或淋巴因子激活杀伤(LAK，非特异性杀伤)；
(c)孵育4小时；
(d)加入荧光素并孵育5分钟；
(e)使用光度计读取生物发光强度；和
(f)计算细胞毒性百分比和存活率。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的以下详细描述。
图1显示了使用经辐照的同种异体PBMC饲养细胞的TIL快速扩增的结果。将每个TIL系(M1015T和M1016T)(1.3×105个细胞)与46种不同的经辐照的饲养细胞(1.3×107个细胞)、IL-2(3000IU/mL)和OKT-3(30ng/mL)在T25烧瓶中共培养7天。在第7天计算TIL的倍数扩增值。该图显示了在单独的刺激实验中，两个TIL系的扩增倍数，测试了46个不同的饲养批次，并且突出了使用PBMC饲养细胞的扩增结果的可变性。
图2显示了pLV430G人4-1BBL载体的载体图。
图3显示了pLV430G人4-1BBL载体的4-1BBL PCRP(聚合酶链式反应产物)部分的图。
图4显示了pLV430G人CD86载体的载体图。
图5显示了pLV430G人CD86载体的CD86PCRP部分的图。
图6显示了pDONR221人CD86供体载体的载体图。
图7显示了pDONR221人4-1BBL供体载体的载体图。
图8显示了pLV430G空载体的载体图。
图9显示了pDONR221空载体的载体图。
图10显示了用于慢病毒生产的psPAX2辅助质粒的载体图。
图11显示了用于慢病毒生产的pCIGO-VSV.G辅助质粒的载体图。
图12显示了在慢病毒转染前(“未转染的”)和转染后(“转染的”)对MOLM-14细胞的流式细胞术实验的结果，证实了在工程化的MOLM-14细胞上CD137和CD86的表达。
图13显示了使用经辐照的亲本未修饰的MOLM-14细胞(“亲本MOLM14”)、工程化的MOLM-14细胞(CD86/4-1BBL，“工程化MOLM14”)或用于TIL批次M1032-T2的PBMC饲养细胞(“饲养细胞”)快速扩增TIL的的结果。将TIL与PBMC饲养细胞或亲本或工程化的MOLM14细胞以1∶100的比率与OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。在第6天和第11天对细胞进行计数和分离。各个点分别代表在第0、6、11和14天测定的细胞数。使用对数标度。
图14显示了如图13所示的结果，使用线性标度描绘。
图15显示了具有如图13中给出的其他参数的TIL批次M1033-T6的结果，使用对数标度。
图16显示了如图14所示的结果，使用线性标度描绘。
图17显示了使用表达CD86和4-1BBL的工程化MOLM-14细胞(“TIL+工程化MOLM14(CD86/41BB)+OKT3”)或经辐照的PBMC饲养细胞(“TIL+饲养细胞+OKT3”)快速扩增TIL的结果。将TIL与PBMC饲养细胞或工程化的MOLM-14细胞(aMOLM14)以1∶100的比率与OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。在第6天和第11天对细胞进行计数和分离。各点代表在第14天确定的细胞数。
图18显示了实验结果，其中TIL(2×104)用不同比率(1∶10、1∶30和1∶100，分别表示为“10”、“30”和“100”)的亲本MOLM-14(“MOLM14”)细胞、转导以表达CD86和4-1BBL的MOLM-14细胞(“aMOLM14”)、或PBMC饲养细胞(“PBMC+”)(各自在24孔G-Rex孔板的孔中具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL))培养。使用仅OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)的进行对照(“PBMC-”)。每种条件一式三份培养。在第4天和第7天，用新鲜培养基和IL-2饲养培养物。在第7天计数活细胞。此处表示的条形图显示了在第11天计数的活细胞数的平均值加标准偏差(SD)。p-值由学生′t′测试计算。
图19显示了用不同比率(分别为1∶30、1∶100和1∶300，分别表示为“30”、“100”和“300”)的PBMC饲养细胞(“PBMC”)、亲本MOLM-14细胞(“MOLM14”)或转导以表达CD86和4-1BBL的MOLM-14细胞(“aMOLM14”)(各自在单个24孔G-Rex培养板中具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL))培养TIL的结果。在第11天计数活细胞并绘图。其他条件如图18所示。
图20显示了用不同比率(1∶50、1∶100和1∶200，分别表示为“50”、“100”和“200”)的PBMC饲养细胞(“PBMC”)、亲本MOLM-14细胞(“MOLM14”)或转导以表达CD86和4-1BBL的MOLM-14细胞(“aMOLM14”)(各自在单个24孔G-Rex培养板中具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL))培养TIL的结果。在第14天计数细胞。其他条件如图18所示。
图21显示了用不同比率(1∶100、1∶200、1∶400和1∶800，分别表示为“100”、“200”、“400”和“800”)的PBMC饲养细胞(“PBMC”)、亲本MOLM-14细胞(“MOLM14”)或转导以表达CD86和4-1BBL的MOLM-14细胞(“aMOLM14”)(各自在单个24孔G-Rex培养板中具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL))培养TIL的结果。在第14天计数细胞。其他条件如图18所示。
图22示出了旭日状可视图，显示了用PBMC饲养细胞扩增的活细胞、T细胞受体(TCR)α/β、CD4、CD8、CD27、CD28和CD57 TIL的精细分布。
图23示出了旭日状可视图，显示了用aMOLM14 aAPC扩增的活细胞、TCRα/β、CD4、CD8、CD27、CD28和CD57 TIL的精细分布。
图24描绘了流式细胞术等高线图，显示在活细胞(Live)、TCRα/β+、CD4+或CD8+TIL上门控的记忆子集(CD45RA+/-，CCR7+/-)。
图25示出了使用SPADE树在CD3+细胞上门控的T细胞亚群、CD4+和CD8+REP后TIL(用MOOL14 aAPC扩增)的表型表征。颜色梯度与LAG3、TIM3、PD1和CD137的平均荧光强度(MFI)成比率。
图26示出了使用SPADE树在CD3+细胞上门控的T细胞亚群、CD4+和CD8+REP后TIL(用MOOL14 aAPC扩增)的表型表征。颜色梯度与MFI CD69、CD 154、KLRG1和TIGIT成比率
图27示出了在线粒体应力测试期间测量的用饲养细胞或aMOLM14扩增后TIL的氧消耗速率(OCR)。每个数据点代表三次测量的平均值±平均标准误差(SEM)。
图28示出了在线粒体应力测试期间测量的用饲养细胞或aMOLM14扩增后TIL的细胞外酸化速率(ECAR)。每个数据点代表三次测量的平均值±SEM。
图29示出了目的载体pLV4301G的载体图。
图30示出了供体载体1(pMK 7c12抗mFC scFv CoOp ECORV Sacll L1R5)的载体图。
图31示出了供体载体2(pMK hCD8a scaffold TN L5 L2)的载体图。
图32示出了用于慢病毒生产的最终载体(pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8flag)的载体图。
图33示出了目的载体pLV4301G的载体图。
图34示出了供体载体1(pMK 8B3抗mFC scFv CoOp ECORV Sacll L1R5)的载体图。
图35示出了供体载体2(pMK hCD8a scaffold TN L5 L2)的载体图。
图36示出了用于慢病毒生产的最终载体(pLV4301G 8B3 scFv mlgG hCD8flag)的载体图。
图37示出了在慢病毒转染前(“未转染的”)和转染后(“转染的”)对EM-3细胞的流式细胞术实验的结果，证实了在工程化的EM-3细胞上CD137和CD86的表达。
图38示出了实验结果，其中TIL与aEM3(7C12或8B3)以1∶100的比率共培养，培养时加OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)。在第11天和第14天计数细胞。
图39示出了实验结果，其中TIL与aEM3(7C12或8B3)以1∶100的比率共培养，培养时加OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)。在第11天和第14天计数细胞。
图40示出了实验结果，其中TIL与aEM3或PBMC饲养细胞以1∶100的比率共培养，培养时加IL-2(3000IU/mL)，加或不加OKT-3(30ng/mL)。条形图显示在第11天测定的细胞数量。
图41示出了在不同TIL∶aAPC比率下用EM-3 aAPC对TIL进行扩增的结果。
图42示出了用EM-3 aAPC对TIL进行扩增的结果。将TIL(2×104)与5种不同的PBMC饲养批次或aEM3(一式三份)以1∶100的比率在G-Rex 24孔板中用IL-2(3000IU/mL)共培养。在第14天计数活细胞。该图显示了在第14天计数的活细胞数(平均值)的95％置信区间。
图43示出了用EM-3 aAPC和MOLM-14 aAPC对TIL进行扩增的结果。将TIL(2×104)与5种不同的PBMC饲养批次或aMOLMl4(一式三份)或aEM3(也是式三份)以1∶100的比率在G-Rex 24孔板中用IL-2(3000IU/mL)共培养。该图显示了在第14天计数的活细胞数(平均值)的95％置信区间。
图44示出了旭日状可视图，显示了用aEM3 aAPC或PBMC饲养细胞(TIL批次M1054)扩增的活细胞、TCR α/β、CD4+和CD8+TIL的精细分布。
图45示出了旭日状可视图，显示了用aEM3 aAPC或PBMC饲养细胞(TIL批次M1055)扩增的活细胞、TCR α/β、CD4+和CD8+TIL的精细分布。
图46示出了使用CD3+细胞用aEM3 aAPC或PBMC饲养细胞扩增的TIL的CD4+和CD8+SPADE树。颜色梯度与LAG-3、TIM-3、PD-1和CD137的MFI成比率。
图47示出了使用CD3+细胞用aEM3 aAPC或PBMC饲养细胞扩增的TIL的CD4+和CD8+SPADE树。颜色梯度与CD69、CD 154、KLRG1和TIGIT的MFI成比率。
图48示出了通过Seahorse XF Mito应力测试测量的备用呼吸能力(sparerespiratory capacity)的总结。
图49示出了通过Seahorse XF Mito应力测试测量的糖酵解储备的总结。
图50示出了使用MitoTracker染料针对PBMC或aEM3扩增的活TIL的线粒体染色，其染色活细胞中的线粒体并且其累积取决于膜电位。针对PBMC或aEM3扩增的TIL染色L/DAqua，然后染色MitoTracker红染料。显示的数据是对活细胞群门控的MitoTracker阳性(MFI)细胞。
图51示出了P815 BRLA的细胞毒性效力和功能活性的结果，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aMOLM14 aAPC扩增的TIL进行比较。
图52示出了P815 BRLA的细胞毒性效力和功能活性的结果，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aEM3 aAPC扩增的TIL进行比较。
图53示出了与未刺激(“US”)的TIL相比，用抗CD3/CD28/4-1BB包被的微珠过夜刺激(“S”)后两批TIL的IFN-γ释放，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aMOLM14 aAPC扩增的TIL进行比较。＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，＊＊＊p＜0.001，ns＝不显著。
图54示出了与未刺激(“US”)的TIL相比，用抗CD3/CD28/4-1BB包被的微珠过夜刺激(“S”)后三批TIL的IFN-γ释放，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aEM3 aAPC扩增的TIL进行比较。＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，＊＊＊p＜0.001，ns＝不显著。
图55示出了与未刺激(“US”)的TIL相比，用抗CD3/CD28/4-1BB包被的微珠过夜刺激(“S”)后两批TIL的颗粒酶B释放，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aMOLM14 aAPC扩增的TIL进行比较。＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，＊＊＊p＜0.001，ns＝不显著。
图56示出了与未刺激(“US”)的TIL相比，用抗CD3/CD28/4-1BB包被的微珠过夜刺激(“S”)后三批TIL的颗粒酶B释放，将用PBMC饲养细胞扩增的TIL与使用aEM3 aAPC扩增的TIL进行比较。＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，＊＊＊p＜0.001，ns＝不显著。
图57示出了TIL扩增和处理过程。本发明的aAPC可以用于REP前阶段(图的上半部分)或REP阶段(图的下半部分)，且可在将IL-2添加到每个细胞培养物中时添加。步骤1涉及将4个肿瘤片段添加到10个G-Rex 10烧瓶中。在步骤2中，获得大约40×106个TIL或更多。在步骤3，在36个G-Rex 100烧瓶中发生分裂用于REP。在步骤4通过离心收获TIL。在大约43天的总处理时间之后，在步骤5获得新鲜TIL产物，此时可以将TIL输注到患者体内。
图58示出了与用aAPC扩增的TIL一起使用的治疗方案。手术(和肿瘤切除)在开始时发生，并且淋巴清除化疗是指如本文其他地方所述的化疗的非清髓性淋巴细胞清除。
图59示出了生物发光重定向裂解测定(Bioluminescent Redirected LysisAssay)(BRLA)结果，其显示TIL批次M1033T-1与P815克隆G6(有和没有抗CD3)在各个效应细胞：靶细胞的比率下共培养时的细胞毒性百分比。
图60示出了酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，其显示针对不同比率的效应细胞对靶细胞释放的IFN-γ的量。
图61示出了当TIL批次M1033T-1与P815克隆G6在抗CD3存在下以1∶1效应细胞对靶细胞的比率共培养4小时和24小时共培养时表达的LAMP1(％)。
图62示出了TIL批次M1030的BRLA结果。通过BRLA的细胞毒性(以LU50/1×106 TIL测量)为26±16。
图63示出了TIL批次M1030的标准铬释放测定。通过铬释放测定的细胞毒性(以LU50/1×106TIL测量)为22。
图64示出了TIL批次M1053的BRLA结果，显示通过BRLA的TIL的裂解单位为70±17。
图65示出了TIL批次M1053的标准铬释放测定结果，通过铬测定显示TIL的裂解单位为14±5。将该结果与图64进行比较，显示BRLA与铬释放测定的性能相当。
图66示出了TIL的lFN-γ释放与细胞毒性潜力之间的线性关系。
图67示出了IFN-γ的ELISpot结果。
图68示出了TIL批次M1053的酶促lFN-γ释放。
图69示出了TIL批次M1030的酶促IFN-γ释放。
图70示出了显示通过M1053T和M1030T的颗粒酶B释放的ELISpot数据。该数据证实了BRLA显示的TIL的效力。
图71示出了TIL批次M1053的酶促颗粒酶B释放。
图72示出了TIL批次M1030的酶促颗粒酶B释放。
图73示出了显示通过M1053T和M1030T的TNF-α释放的ELISpot数据。该数据证实了BRLA显示的TIL的效力。
图74示出了TIL批次M1053的酶促TNF-α释放。
图75示出了TIL批次M1030的酶促TNF-α释放。
图76示出了当将aEM3细胞(C712(A)和8B5(B))的细胞群从FBS移至hAB血清培养基时，这些细胞群的变化。
图77示出了在使用aEM3细胞群(其悬浮在各种冷冻培养基(freezing media)中)的冷冻-融化-恢复循环期间细胞群的变化。
图78示出了在8天时间过程中aEM3细胞在透气性细胞培养瓶中的生长。
图79示出了用于测定aEM3细胞纯度的流式面板分析。
图80示出了用于测定aEM3细胞纯度的流式面板分析的结果。
图81示出了OKT3刺激的aEM3饲养细胞和PBMC饲养细胞之间细胞因子表达的差异。
图82示出了与CM1相比，TIL可以有利地用无血清培养基(即CTS Optmizer)扩增(REP前)以提供增加的细胞数量。
图83和图84示出了：在第11天(REP前)(图83)和第22天(REP前和REP后)(图84)，与CM1相比，TIL可以有利地用无血清培养基(即CTS Optmizer)扩增以提供增加的细胞数量。
图85示出了可以使用无血清培养基生长aAPC细胞(即aEM3细胞)。具体而言，与cDMEM(10％hSerum)相比，发现CTS OpTimizer和Prime-TCDM在生长aEM3方面是有效的。显示的数据是五个独立实验的平均值±SD。p值通过学生t检验计算。＊P＜0.05。
图86和图87示出了两个实验的结果，证明了在冷冻保存后第3天从TIL-R3细胞系中快速恢复aEM3细胞。图86显示了实验一的总细胞计数。图87显示了实验二的总细胞计数。
图88示出了冷冻保存后来自TIL-R3细胞系的aEM3细胞的生长，其中将细胞铺板并生长9天。解冻后每三天测量细胞计数。
图89示出了冷冻保存后来自TIL-R3细胞系的aEM3细胞的生长，其中将细胞接种在GREX 10烧瓶中并生长8天。解冻后每4天测量细胞计数。
图90示出了pLenti-C-Myc-DDK人OX40L载体的载体图。
图91示出了用aEM3细胞系和PBMC饲养细胞在REP中扩增的TIL的流式细胞术分析结果，表明用aEM3培养的TIL促进CD8+TIL偏斜(skewness)。
图92示出了从实验获得的活细胞数，该实验中TIL在REP中用aEM3细胞系和PBMC饲养细胞扩增。
图93示出了从实验中获得的CD3+细胞的数量，该实验中TIL在REP中用aEM3细胞系和PBMC饲养细胞扩增。
图94示出了从实验中获得的CD3-细胞的数量，该实验中TIL在REP中用aEM3细胞系和PBMC饲养细胞扩增。
图95示出了使用qPCR方法的端粒长度分析的结果。
图96示出了本发明的aAPC的实施方案的示意图。
图97示出了本发明的aAPC的实施方案的示意图。
图98示出了本发明的aAPC的实施方案的示意图。
序列表简述
SEQ ID NO：1是鼠源单克隆抗体(muromonab)重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是鼠源单克隆抗体(muromonab)轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是重组人IL-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是重组人IL-7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是重组人IL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是重组IL-21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是人CD86的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是人4-1BBL(CD137L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是人OX40L(CD134L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是人CD28的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是人CTLA-4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是人4-1BB(CD137)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是人OX40(CD134)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是pLV430G 4-1BBL空载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是pLV430G人4-1BBL载体的4-1BBL CoOP部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是4-1BBL PCRP的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是pLV430G hCD86空载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是pLV430G人hCD86载体的hCD86 CoOP部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是pLV430G人hCD86载体的hCD86 CoOP B1 B2 PCRP部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是pDONR221 hCD86载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是pDONR221 4-1BBL载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是pLV430G载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是pDONR221载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：25是用于慢病毒生产的psPAX2辅助质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是用于慢病毒生产的pCIGO-VSV.G辅助质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27是mFc-7C12 scFv克隆的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28是mFc-8B3 scFv克隆的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是mFC-7C12 scFv的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是mFC-8B3 scFv的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是目的载体pLV4301G的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是供体载体1(pMK 7c12抗mFC scFv CoOp ECORV Sacll L1R5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是供体载体2(pMK hCD8a scaffold TN L5 L2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是用于慢病毒生产的最终载体(pLV4301G 7C12 scFv mlgG hCD8flag)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：35是目的载体pLV4301G的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36是供体载体1(pMK 8B3抗mFC scFv CoOp ECORV Sacll L1R5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37是供体载体2(pMK hCD8a scaffold TN L5 L2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38是用于慢病毒生产的最终载体(pLV4301G 8B3 scFv mlgG hCD8flag)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：39是用于慢病毒生产的pLenti-C-Myc-DDK OX40L载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40是用于端粒长度的定量聚合酶链反应测量的Tel-1b引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是用于端粒长度的定量聚合酶链反应测量的Tel-2b引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42是用于端粒长度的定量聚合酶链反应测量的Tel-1b引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是用于端粒长度的定量聚合酶链反应测量的Tel-1b引物的核苷酸序列。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利和出版物均以引用的方式整体并入本文。
定义
如本文所用，术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administering)”、“与...组合施用(administered in combination with)”、“与...组合施用(administering in combination with)”、“同时”和“共同”包括向人类受试者施用两种以上活性药物成分，使得活性药物成分和/或其代谢物同时存在于人类受试者中。共同施用包括以不同的组合物同时施用、以不同的组合物在不同时间施用，或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物施用。以不同的组合物同时施用和以其中存在两种药剂的组合物施用也包括在本发明的方法中。
术语“体内”是指发生在受试者体内的事件。
术语“体外”是指在受试者体外发生的事件。体外测定包括其中使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，并且还可以包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
术语“离体”是指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。适当地，该细胞、组织和/或器官可以通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
术语“抗原”是指诱导免疫应答的物质。在一些实施方案中，抗原是如果由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递，能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还包括T细胞表位。另外，抗原能够被免疫系统识别。在一些实施方案中，抗原能够诱导体液免疫应答或细胞免疫应答，导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的活化。在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或与Th细胞表位连接。抗原还可以具有一个以上表位(例如B-表位和T-表位)。在一些实施方案中，抗原优选通常以高度特异性和选择性的方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所述的化合物或化合物组合的量足以实现目标应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可以根据目标应用(体外或体内)、或所治疗的人类受试者和疾病状况(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语还适用于在靶细胞中诱导特定应答(例如，血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将根据所选择的具体化合物、要遵循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间、施用它的组织，以及携带化合物的物理递送系统而变化。
本文使用的术语“治疗效果”包括人类受试者的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或它们的任何组合。
“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。这种药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂在活性药物成分中的应用是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分，例如其他药物，也可以并入所描述的组合物和方法中。
术语“快速扩增”指在一周的时间内抗原特异性TIL的数量增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者最优选在一周的时间内增加至少约100倍。本文描述了许多快速扩增方案。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为白细胞获得的细胞群，其已经离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初级TIL和次级TIL。“初级TIL”是如本文概述的从患者组织样品获得的那些(有时在本文中称为“新鲜收获的”或“第一TIL群”)，并且“次级TIL”是如本文所讨论的已扩增或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于本体TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(在合适的场合称为“REP TIL”或“REP后TIL”，或“第二TIL群”或“第三TIL群”)。
TIL通常可以通过生物化学使用细胞表面标志物来定义，或通过其渗透肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可以通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外，或者，TIL可以通过它们在重新引入患者时渗入实体瘤的能力来在功能上定义。
本文的“冷冻保存的TIL”是指TIL在约-150℃至-60℃的范围内处理和储存。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方描述，包括在实施例中。为清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初级TIL来源的冷冻组织样品区分开。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”是指先前已冷冻保存然后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或TIL可施用于患者的温度)的TIL群。
本文的“细胞群”(包括TIL)是指许多具有共同特征的细胞。
术语“中枢记忆T细胞”是指人细胞中CD45R0+并且组成型表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)的T细胞亚群。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(1L-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。在TCR触发后，中枢记忆T细胞主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞在血液中的CD4区室中占优势，并且在人体中按比率富集在淋巴结和扁桃体。
术语“效应记忆T细胞”是指人或哺乳动物T细胞的亚群，其与中枢记忆T细胞一样是CD45R0+，但已丧失CCR7的组成型表达(CCR7lo)，并且对于CD62L表达是异质的或低的(CD62Llo)。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后迅速分泌高水平的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞在血液中的CD8区室中占优势，并且在人类中在肺、肝和肠中按比率富集。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
在关于两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”、“百分比同一性”和“序列百分比同一性”是指当进行比较和比对(如果需要的话，引入间隔)以获得最大对应性时，两个以上序列或子序列相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查，来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的合适程序包括例如可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站获得的BLAST程序组。可以使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech，南旧金山，加州)或MegAlign(可从DNASTAR获得)是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件确定用于最大比对的合适参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。
术语“保守性氨基酸取代”是指不破坏抗体与抗原的结合或蛋白质与其配体的结合的氨基酸序列修饰。保守性氨基酸取代包括用同一类氨基酸取代一类氨基酸，其中一类由常见的物理化学氨基酸侧链性质和在自然界中发现的同源蛋白质中的高取代频率定义，如通过例如标准的Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵所测定的。已经对六类一般氨基酸侧链进行了分类，包括：I类(Cys)；II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV类(His，Arg，Lys)；V类(Ile，Leu，Val，Met)；和VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如，将Asp替换为另一种III类残基(例如Asn、Gln或Glu)是保守取代。因此，4-1BBL或CD86蛋白中预测的非必需氨基酸残基优选被来自相同类的另一氨基酸残基替换。识别不破坏抗原或配体结合的氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见例如Brummell等，Biochemistry 1993，32，1180-1187；Kobayashi等，Protein Eng.1999，12，879-884(1999)；以及Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1997，94，412-417)。
术语“逆转录病毒”是指在其复制周期中利用逆转录酶的RNA病毒，其中逆转录病毒基因组RNA通过逆转录酶转化为双链DNA。双链DNA形式整合到感染细胞的染色体中(“原病毒”)。原病毒作为RNA聚合酶II的模板，并指导RNA分子的表达，所述RNA分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。在原病毒的每一端都是称为“长末端重复”或“LTR”的结构。LTR含有大量调节信号，包括转录控制元件、多腺苷酸化信号和病毒基因组复制和整合所需的序列。在逆转录病毒科(Retroviridae)中包括的几个属，包括Cisternavirus A、Oncovirus A、Oncovirus B、Oncovirus C、Oncovirus D、Lentivirus、Gammaretrovirus和Spumavirus。一些逆转录病毒是致癌的(即致瘤的)，而其他的则不是。致癌病毒在易感物种中诱导肉瘤、白血病、淋巴瘤和乳腺癌。逆转录病毒感染多种物种，可以水平和垂直传播。由于它们整合到宿主DNA中，它们能够从细胞到细胞传递宿主DNA序列。γ逆转录病毒载体的例子包括衍生自双嗜性莫洛尼鼠白血病病毒(MLV-A)的那些，其利用细胞表面磷酸转运蛋白受体进入，然后永久整合到增殖细胞染色体中。双嗜性MLV载体系统已被很好地建立并且是基因递送的受欢迎工具(参见例如Gordon和Anderson，Curr.Op.Biotechnol.，1994，5，611-616，以及Miller等，Meth.Enzymol.，1993，217，581-599，其公开内容通过引用并入本文)。
术语“慢病毒”是指包括以下的类：HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)、梅迪-维斯纳(visna-maedi)(其在绵羊中引起脑炎(visna)或肺炎(maedi))、山羊关节炎-脑炎病毒(其导致山羊的免疫缺陷、关节炎和脑病)；马传染性贫血病毒(其引起马的自身免疫性溶血性贫血和脑病)；猫免疫缺陷病毒(FIV)(其导致猫的免疫缺陷)；牛免疫缺陷病毒(BIV)(其导致牛的淋巴结病、淋巴细胞增多症和可能的中枢神经系统感染)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)(其在亚人类灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病)。由这些病毒引起的疾病的特征在于长的潜伏期和延长的病程。通常，病毒潜在地感染单核细胞和巨噬细胞，从这些细胞传播到其他细胞。HIV、FIV和SIV也易于感染T淋巴细胞(即T细胞)。
术语“抗CD3抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，其针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为鼠源单克隆抗体。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如otelixizumab、teplizumab和visilizumab。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)是指单克隆抗体或其变体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，其针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体，并且包括商业上可获得的形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotec GmbH，贝尔吉施格拉德巴赫(Bergisch Gladbach)，德国)和鼠源单克隆抗体或其变体、保守性氨基酸取代、糖型(glycoforms)或生物仿制药(biosimilars)。鼠源单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，并分配了ATCC登录号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection ofAuthenticated Cell Cultures)(ECACC)，并且分配了目录号86022706。
表1.鼠源单克隆抗体的氨基酸序列。
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白细胞介素2的T细胞生长因子，并包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型、生物仿制药及其变体。IL-2描述于例如Nelson，J.Immunol.2004，172，3983-88以及Malek，Annu.Rev.Immunol.2008，26，453-79，其公开内容通过引用结合到本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2包括人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商处购买，每个单独使用的小瓶2200万IU)，以及由CellGenix，Inc.，Portsmouth，新罕布什尔州，美国(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克(East Brunswick)，新泽西州，美国(Cat.No.CYT-209-b)市售提供的重组IL-2的形式，以及其他供应商提供的其他商业等同物。阿地白介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量约为15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可从NektarTherapeutics，南旧金山，加利福尼亚州，美国获得。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容通过引用结合到本文中。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4902,502中，其公开内容通过引用结合到本文中。用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容通过引用结合到本文中。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化的来源于组织的细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突细胞中获得。参见Fry和Mackall，Blood 2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的生长。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IL-7受体α和常见γ链受体(common gamma chain receptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对胸腺内的T细胞发育和外周存活具有重要作用。适用于本发明的重组人IL-7可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西州，美国(Cat.No.CYT-254)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州，美国(人IL-7重组蛋白，Cat.No.Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型、生物仿制药及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri，Blood 2001，97，14-32中，其公开内容通过引用结合到本文中。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人IL-15是非糖基化多肽单链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西州，美国(Cat.No.CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州MA，美国(人IL-15重组蛋白，Cat.No.34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型、生物仿制药及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，Nat.Rev.Drug.Disc.2014，13，379-95，其公开内容通过引用结合到本文中。IL-21主要由天然杀伤T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是非糖基化多肽单链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西州，美国(Cat.No.CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州，美国(人IL-21重组蛋白，Cat.No.14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：7)。
表2.白细胞介素的氨基酸序列。
本文所用的术语“骨髓细胞”是指骨髓谱系的细胞或由其衍生的细胞。骨髓谱系包括许多形态学、表型和功能不同的细胞类型，包括粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、巨核细胞和肥大细胞的不同亚群。在某些实施方案中，骨髓细胞是源自骨髓谱系细胞系的细胞。
“MOLM-14”是指由患有复发性急性单核细胞白血病的患者的外周血建立的人白血病细胞系，并且初始表型特征表明存在至少以下标志物：CD4、CD9、CD11a、CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD64、CD65、CD87、CD92、CD93、CD116、CD118和CD155。参见Matsuo等，Leukemia1997，11，1469-77。MOLM-14的其他表型特征发现更高水平的HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L、CD58和更低水平的CD86。MOLM-14细胞系以登录号ACC777保藏于DSMZ。密切相关的MOLM-13细胞系以登录号ACC554保藏于DSMZ。如本文所用，术语“MOLM-14细胞”是指MOLM-14细胞和/或源自保藏的MOLM-14亲本细胞系的细胞。如本文所用，术语“MOLM-13细胞”是指MOLM-13细胞和/或源自保藏的MOLM-13亲本细胞系的细胞。
“EM-3”是指由患有费城染色体阳性CML的患者的骨髓建立的人细胞系。参见Konopka等，Proc.Nat’l Acad.Sci.，美国，1985，82，1810-4。EM-3细胞的表型表征表明存在至少以下标志物：CD13、CD15和CD33。EM-3细胞系以登录号ACC134保藏在DSMZ，而密切相关的EM-2细胞系以登录号ACC135保藏在DSMZ。如本文所用，术语“EM-3细胞”是指EM-3细胞和/或源自保藏的EM-3亲本细胞系的细胞。
如本文所用，术语“CD86蛋白”可以指包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，术语“4-1BBL”或“CD137L”可以指包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，术语“OX40L”或“CD137L”可以指包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列的蛋白质。
术语“生物仿制药”是指生物制品，包括单克隆抗体或融合蛋白，其与美国许可的参考生物产品高度相似，尽管临床上非活性成分存在微小差异，并且就产品的安全性、纯度和效力而言，该生物制品和参考产品之间临床上没有有意义的差异。此外，类似的生物的或“生物仿制”药是一种生物制药，其类似于已经被欧洲药品管理局授权使用的另一种生物制药。术语“生物仿制药”也被其他国家和地区监管机构同义使用。生物制品或生物制药是由生物来源(例如细菌或酵母)制造或衍生的药物。它们可以由相对小的分子组成，例如人胰岛素或促红细胞生成素，或复合分子例如单克隆抗体。例如，如果参考IL-2蛋白是阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物管理机构批准的关于阿地白介素的蛋白质是与阿地白介素“生物类似的”或者是阿地白介素的“生物仿制药”。在欧洲，类似的生物或“生物仿制”药是一种生物制药，其类似于已经被欧洲药品管理局(EMA)授权使用的另一种生物制药。欧洲用于类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)No 726/2004第6条和指令2001/83/EC第10(4)条，经修订，因此在欧洲，根据法规(EC)No 726/2004第6条和指令2001/83/EC第10(4)条的规定，生物仿制药可以被授权或允许进行授权或作为用于授权的申请主题。已经授权的原始生物医药产品在欧洲可称为“参考药品”。相似生物医药产品CHMP指南中概述了将产品视为生物仿制药的一些要求。此外，产品具体指南(包括与单克隆抗体生物仿制药有关的指南)由EMA以产品为基础提供并在其网站上公布。在质量特征、生物活性、作用机制、安全性和/或功效方面，本文所述的生物仿制药可以与参考药品类似。另外，生物仿制药可以用于或旨在用于治疗与参考药品相同的病症。因此，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品类似或高度相似的质量特征。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品类似或高度相似的生物活性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品类似或高度相似的安全性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品类似或高度相似的功效。如本文所述，将欧洲的生物仿制药与已经由EMA授权的参考药品进行比较。然而，在某些情况下，在某些研究中可以将生物仿制药与已经在欧洲经济区之外授权的生物医药产品(非欧洲经济区授权的“比较物”)进行比较。这些研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物仿制药”还涉及已经或可以与非EEA授权的比较物比较的生物医药产品。某些生物仿制药是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物仿制药可具有在氨基酸结构中具有有不显著影响多肽的功能的微小修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列。生物仿制药可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％以上序列同一性的氨基酸序列，例如97％、98％、99％或100％。生物仿制药可包含一种以上与参考药品的翻译后修饰不同的翻译后修饰，例如但不限于，糖基化、氧化、脱酰胺和/或截短，条件是该不同不会导致药品的安全性和/或功效发生变化。生物仿制药可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特别地，尽管不是唯一的，如果差异涉及或旨在解决与参考药品相关的安全问题，则生物仿制药可具有不同的糖基化模式。另外，生物仿制药可以在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈递方面偏离参考药品，条件是不损害药品的安全性和功效。与参考药品相比，生物仿制药可包括例如药代动力学(PK)和/或药效学(PD)概况的差异，但仍被认为与参考药品足够相似，以获得授权或认为适合授权。在某些情况下，与参考药品相比，生物仿制药表现出不同的结合特性，其中不同的结合特性被管理机构如EMA认为不是作为类似生物产品授权的障碍。术语“生物仿制药”也被其他国家和地区监管机构同义使用。
如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的蛋白质、抗体或融合蛋白：其通过在参考蛋白质或抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含与参考蛋白质或抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。与参考蛋白质或抗体的氨基酸序列相比，变体可在其氨基酸序列中包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如相似带电荷或不带电荷氨基酸的取代。该变体保留了与参考蛋白质或抗体的抗原特异性结合的能力。术语“变体”还包括聚乙二醇化的抗体或蛋白质。
“聚乙二醇化”是指在一个以上PEG基团与抗体、抗体片段或蛋白质连接的条件下，通常与聚乙二醇(PEG)反应的(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)修饰的抗体或其片段或蛋白质。聚乙二醇化可以例如增加抗体或蛋白质的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体或蛋白质可以是非糖基化抗体。聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本文所述的抗体和蛋白质，如例如欧洲专利No.EP 0154316和EP 0401384所描述的。
术语“约”和“大约”表示在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”表示大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性不是、也不必是精确的，但可以根据需要是近似的和/或更大或更小的，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。无论是否明确说明如此，通常，大小、尺寸、配方、参数、形状或其他性质或特性是“约”或“近似”的。应注意，具有非常不同的尺寸、形状和大小的实施方案可采用所描述的布置。
当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，过渡术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”，定义了关于被排除在权利要求的范围之外的未列举的附加的权利要求要素或步骤(如果有的话)的权利要求范围。术语“包含”旨在是包含性的或开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或材料。术语“由......组成”不包括除权利要求中所述那些之外的任何元素、步骤或材料，并且在材料的情况下，术语“由...组成”不包括与指定材料相关的普通杂质。术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的元素、步骤或材料以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。在替代实施方案中，体现本发明的本文所述的所有组合物、方法和试剂盒可以更具体地由任何过渡术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”定义。
人工抗原呈递细胞
在一个实施方案中，本发明包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58的细胞，并被修饰以表达一种以上共刺激分子。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含MOLM-14细胞，其经修饰以表达一种以上共刺激分子。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含MOLM-13细胞，其经修饰以表达一种以上共刺激分子。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含内源性表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58的MOLM-14细胞，其中，所述细胞经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86和4-1BBL。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-13细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-13细胞表达CD86和4-1BBL。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQID NO：9所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQID NO：9所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码OX40L的核酸，并且其中，所述MOLM-14细胞表达CD86和OX40L。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-13细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码OX40L的核酸，并且其中，所述MOLM-13细胞表达CD86和OX40L。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述OX40L蛋白包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-13细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述OX40L蛋白包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-13细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQID NO：10所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的MOLM-14细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在MOLM-14细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
应理解，在任何前述实施方案中，包含MOLM-14或MOLM-13细胞的aAPC可被修饰以表达OX40L和4-1BBL。
表3中给出了人CD86、人4-1BBL(CD137L)和人OX40L(CD134L)的序列。
表3.人CD86、人4-1BBL和人OX40L的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三种蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-14细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的MOLM-13细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
表4中给出了人CD86结合的配体(CD28和CTLA-4)、人4-1BBL结合的配体(4-1BB)和人OX40L结合的配体(OX40)的序列。
表4.人CD28、人CTLA-4、人4-1BB和人OX40的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58的细胞，并被修饰以表达一种以上共刺激分子，其中aAPC衍生自EM-3亲本细胞系。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达一种以上共刺激分子的EM-3细胞。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达一种以上共刺激分子的EM-2细胞。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58的EM-3细胞，其中，所述细胞被修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，所述CD86蛋白包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，并且所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述EM-3细胞表达CD86和4-1BBL。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ IDNO：9所示氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQID NO：9所示氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含EM-3细胞的aAPC，该EM-3细胞经修饰以表达单链可变片段(scFv)结合域，例如本文所述的克隆7C12和883(用以结合单克隆抗体的Fc结构域，例如OKT-3，提供额外的增殖信号)。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ IDNO：9所示氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQID NO：9所示氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三种蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含EM-2细胞的aAPC，该EM-2细胞经修饰以表达单链可变片段(scFv)结合域，例如本文所述的克隆7C12和8B3(用以结合单克隆抗体的Fc结构域，例如OKT-3，提供额外的增殖信号)。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图96所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图97所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图98所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含表达ULA-A/B/C、ICOS-L和CD58的EM-3细胞，其中，所述细胞经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述OX40L蛋白包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，并且其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码OX40L的核酸，并且其中，所述EM-3细胞表达CD86和OX40L。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述OX40L蛋白包含SEQID NO：10所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-3细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-3细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三种蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-3细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含EM-3细胞的aAPC，该EM-3细胞经修饰以表达单链可变片段(scFv)结合域，例如本文所述的克隆7C12和8B3(用以结合单克隆抗体的Fc结构域，例如OKT-3，提供额外的增殖信号)。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述OX40L蛋白包含SEQID NO：10所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和OX40L蛋白的EM-2细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述OX40L蛋白包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和OX40L蛋白在EM-2细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的EM-2细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含EM-2细胞的aAPC，该EM-2细胞经修饰以表达单链可变片段(scFv)结合域，例如本文所述的克隆7C12和8B3(用以结合单克隆抗体的Fc结构域，例如OKT-3，提供额外的增殖信号)。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图96所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图97所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含如图98所示经修饰的EM-3或EM-2细胞。
应理解，在任何前述实施方案中，包含EM-3或EM-2细胞的aAPC可被修饰以表达OX40L和4-1BBL。
在一个实施方案中，本发明包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含表达CD58的细胞，并被修饰以表达一种以上共刺激分子，其中aAPC衍生自K562谱系亲本细胞系。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达一种以上共刺激分子的K562谱系细胞。在一个实施方案中，K562谱系亲本细胞系以登录号ATCC CCL-243保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACCECACC 89121407)。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含表达CD58的K562谱系细胞，其中所述细胞被修饰以表达包含CD86蛋白和4-1BBL蛋白，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，并且其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的K562谱系细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，K562谱系细胞表达CD86和4-1BBL。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQID NO：9所示氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白的K562谱系细胞，所述CD86蛋白包含与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述4-1BBL蛋白包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，其中，CD86蛋白和4-1BBL蛋白在K562谱系细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代，所述第三种蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于99％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于98％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于97％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于96％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于95％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括aAPC，其包含经修饰以表达第一蛋白质和第三蛋白质的K562谱系细胞，所述第一蛋白质与第二蛋白质结合，所述第二蛋白质包含与SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列，所述第三蛋白质与第四蛋白质结合，所述第四蛋白质包含与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有大于90％同一性的序列。在一个实施方案中，本发明包括制备aAPC的任何前述实施方案的方法。
在一个实施方案中，本发明包括包含K562谱系细胞的aAPC，该K562谱系细胞经修饰以表达单链可变片段(scFv)结合域，例如本文所述的克隆7C12和8B3(用以结合单克隆抗体的Fc结构域，例如OKT-3，提供额外的增殖信号)。
制备人工抗原呈递细胞的方法
在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括稳定掺入基因以产生CD86和4-1BBL的步骤。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导体系是本领域已知的并被描述于例如Levine等，Proc.Nat’l Acad.Sci.2006，103，17372-77；Zufferey等，Nat.Biotechnol.1997，15，871-75；Dull等，J.Virology 1998，72，8463-71，以及美国专利号6,627,442，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导体系是本领域已知的并且被描述于例如Cepko和Pear，Cur.Prot.Mol.Biol.1996，9.9.1-9.9.16，其公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移体系是本领域已知的，并且包括如下的体系：其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不在转基因细胞中发生，例如，转座酶作为mRNA提供(例如，包含帽子和poly-A尾的mRNA)。合适的转座子介导的基因转移体系，包括鲑科鱼型类Tel(salmonid-type Tel-like)转座酶(SB或Sleeping Beauty转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x，以及具有增加的酶活性的工程化酶，描述于例如Hackett等，Mol.Therapy 2010，18，674-83和美国专利号6,489,458，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括稳定掺入基因以瞬时产生CD86和4-1BBL的步骤。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法是本领域已知的，并且描述于例如Tsong，Biophys.J.4-1BBL，60，297-306和美国专利申请公开号2014/0227237 A1，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀，细胞表面包被和胞吞作用)是本领域已知的，并且描述于Graham和van der Eb，Virology 1973，52，456-467；Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.1979，76，1373-1376；以及Chen和Okayarea，Mol.Cell.Bio/.1987，7，2745-2752；和美国专利号5,593,875，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中使用阳离子脂质N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1脂质体制剂的方法是本领域已知的，并描述于Rose等，Biotechniques 1991，70，520-525和Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1987，84，7413-7417和美国专利号5,279,833、5,908,635、6,056,938、6,110,490、6,534,484和7,687,070，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，制备aAPC的方法包括使用在以下文献中描述的方法进行转染的步骤：美国专利号5,766,902、6,025,337、6,410,517、6,475,994和7,189,705，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，通过首先使用Gateway克隆方法(可从ThermoFisher，Inc.商购)转导aAPC以制备用于慢病毒转导的载体，然后使用载体和一种以上相关的辅助质粒进行慢病毒转导，如本文其他地方所述。在Gateway克隆方法中，选择基因(例如CD86)，然后提供引物并在attB标记的引物对的帮助下使用PCR技术扩增。然后利用BP反应，将PCR片段与包含attP位点的供体载体(pDONR，例如pDONR221)组合以提供入门克隆。attB和attP位点之间的整合反应将PCR片段与供体载体组合。得到的入门克隆含有侧翼为attL位点的目的基因。然后利用LR反应将入门克隆与目的载体组合以产生表达载体。在LR反应中，利用重组反应，使用attL和attR位点和克隆酶将入门克隆与目的载体(例如pLV430G)连接。attL位点已在入门克隆中找到，而目的载体包含attR位点。进行LR反应以将目标序列转移到同时反应中的一个或多个目的载体中。
在一些实施方案中，本文描述的aAPC可以在基于血清的培养基和/或无血清培养基下生长和维持。根据示例性方法，aAPC可以在24孔板中以每孔约1×106个细胞的细胞密度培养3至5天。然后可以通过离心来分离和/或洗涤细胞并重悬于培养基中或冷冻保存在合适的冷冻保存培养基中(例如，CryoStor 10(BioLife溶液))并储存在-80℃冰箱中。
在一些实施方案中，本文描述的aAPC可以在基于血清的培养基存在下生长。在一些实施方案中，本文所述的aAPC可以在基于血清的培养基存在下生长，所述基于血清的培养基包括含有人血清(hSerum)的培养基(例如，具有10％hSerum的cDMEM)。在一些实施方案中，在基于血清的培养基存在下生长的aAPC可选自aMOLM-13细胞、aMOLM-14细胞和aEM3细胞。
在一些实施方案中，本文描述的aAPC可以在无血清培养基存在下生长。在一些实施方案中，无血清培养基可选自CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime TCell CDM(Irvine)、XFSM(MesenCult)等。在一些实施方案中，在无血清培养基存在下生长的aAPC可选自aMOLM-13细胞、aMOLM-14细胞和aEM3细胞。
扩增肿瘤浸润淋巴细胞和T细胞的方法
在一个实施方案中，本发明包括扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，该方法包括：使包含至少一种TIL的TIL群与本文所述的aAPC接触，其中所述aAPC包含至少一种共刺激配体，所述共刺激配体与在TIL的细胞表面上表达的共刺激分子特异性结合，其中所述共刺激分子与所述共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL。
在一个实施方案中，本发明提供了使用本公开的任何aAPC扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，该方法包括在Jin等，J.Immunotherapy 2012，35，283-292(其公开内容通过引用结合到本文中)中描述的步骤。例如，可将肿瘤置于酶培养基中并机械解离约1分钟。然后可将混合物在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中孵育30分钟后，可以第三次机械破坏肿瘤约1分钟。如果在第三次机械破碎后存在大块组织，可以对样品施加1或2次额外的机械解离，进行或不进行在37℃、5％CO2的另外30分钟的孵育。在最终孵育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，可以使用Ficoll进行密度梯度分离以除去这些细胞。TIL培养物在24孔板(Costar 24孔细胞培养簇，平底；Corning Incorporated，Corning，纽约)中开始，每个孔可以接种在2mL含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，埃默里维尔，加利福尼亚州)的完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化细胞或者一个大小约为1～8mm3的肿瘤片段。CM由含有GlutaMAX的RPMl 1640组成，补充有10％人AB血清，25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素。培养物可以在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气烧瓶(G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿)中开始，每个烧瓶可以装载在10～40mL含有IL-2的CM中的10～40×106个活肿瘤消化细胞或5～30个肿瘤片段。G-Rex 10和24孔板可以在37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养，培养开始后5天，可以取出一半的培养基并用新鲜的CM和IL-2代替，并在第5天后，可每2～3天更换一半的培养基。TIL的快速扩增方案(REP)可以使用T-175烧瓶和透气袋或透气性G-Rex烧瓶、使用本公开的aAPC进行，如本文其他地方所述。对于T-175烧瓶中的REP，可以将1×106个TIL悬浮在每个烧瓶中的150mL培养基中。TIL可以以本文所述的比率与本公开的aAPC一起在CM和AIM-V培养基的1∶1混合物(50/50培养基)中培养，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天可以用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，可将来自2个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，并将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V加入到300mL TIL悬浮液中。可以每天或每两天计数每个袋中的细胞数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5～2.0×106细胞/mL之间。对于具有100cm2透气性硅底部的500mL容量烧瓶(例如，G-Rex 100，WilsonWolf Manufacturing，如本文其他地方所述)中的REP，5×106或10×106的TIL可以与aAPC以本文所述的比率(例如，1∶100)在400mL的50/50培养基中培养，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(OKT-3)。G-Rex100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。获得的TIL球粒可以用150mL含有3000IU/mLIL-2的新鲜50/50培养基重悬浮，并加回到G-Rex 100烧瓶中。当TIL在G-Rex 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，将每个G-Rex 100中的TIL悬浮在每个烧瓶中存在的300mL培养基中，并将细胞悬浮液分成三个100mL等分试样，可用于接种3个G-Rex100烧瓶。然后可以向每个烧瓶中加入约150mL具有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。然后可以将G-Rex 100烧瓶在37℃下在5％CO2中孵育，并且在4天后，可以向每个G-Rex100烧瓶中加入150mL具有3000IU/mL IL-2的AIM-V。此后，可以在培养的第14天收获细胞，完成REP。
如本文所述，TIL可以在无血清培养基存在下有利地扩增。在一些实施方案中，本文所述的TIL扩增方法可包括使用无血清培养基而不是基于血清的培养基(例如，完全培养基或CM1)。在一些实施方案中，本文所述的TIL扩增方法可以使用无血清培养基而不是基于血清的培养基。在一些实施方案中，无血清培养基可选自CTS Optmizer(ThermoFisher)、Xvivo-20(Lonza)、Prime T Cell CDM(Irvine)等。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，在细胞培养基中，APC群在7天的时间内将TIL群扩增至少50倍。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，所述骨髓细胞内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，所述骨髓细胞是MOLM-14细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，所述骨髓细胞是MOLM-13细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，CD86蛋白包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代，4-1BBL蛋白包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，编码CD86的核酸包含SEQ ID NO：19所示的核酸序列，编码4-1BBL的核酸包含SEQID NO：16所示的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，使用透气性容器进行扩增。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞(aAPC)群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触，
其中，TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
在一个实施方案中，本发明提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：使包含TIL群的TIL群与骨髓人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中，所述骨髓aAPC包含至少两个与TIL上的至少两个共刺激分子特异性结合的共刺激配体，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL，并且其中，所述至少两个共刺激配体包含CD86和4-1BBL。
在任何前述实施方案中，除了4-1BBL之外，aAPC还可以包含OX40L，或者aAPC可以包含OX40L而不包含4-1BBL。
在一个实施方案中，扩增或治疗癌症的方法包括从患者肿瘤样品获得TIL的步骤。可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品。例如，TIL可以从酶促肿瘤消化物和来自锐剥离的肿瘤片段(大小约1mm3至约8mm3)中培养。这种肿瘤消化物可以通过在酶培养基(例如，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液，2mM谷氨酸，10mcg/mL庆大霉素，30单位/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育，然后机械解离(例如，使用组织分离器)来产生。肿瘤消化物可以按如下产生：将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下重复循环机械解离和孵育直到仅存在小的组织碎片。在该过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其公开内容通过引用结合到本文中。任何前述方法都可以用于本文所述的扩增TIL的方法或治疗癌症的方法的任何实施方案中。
在一个实施方案中，REP可以使用本公开的aAPC通过任何合适的方法在透气性容器中进行。例如，可以在白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素15(IL-15)存在下，使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如，约30ng/mL的抗CD3抗体，例如，OKT-3，单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，拉里坦(Raritan)，新泽西州，美国或Miltenyi Biotech，奥本市(Auburn)，加利福尼亚州，美国商购)，或UHCT-1(可从BioLegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国商购)。可选地在T细胞生长因子如300IU/mL IL-2或IL-15存在下，可以通过在体外用一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)进一步刺激TIL来快速扩增TIL，所述抗原可任选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，如0.3μM MART-1：26-35(27L)或gpl00：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分。TIL也可以通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞上脉冲的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法可包括使用约5000mL至约25000mL的细胞培养基，约5000mL至约10000mL的细胞培养基，或约5800mL至约8700mL的细胞培养基。在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法可包括使用约1000mL至约2000mL的细胞培养基，约2000mL至约3000mL的细胞培养基，约3000mL至约4000mL的细胞培养基，约4000mL至约5000mL的细胞培养基，约5000mL至约6000mL的细胞培养基，约6000mL至约7000mL的细胞培养基，约7000mL至约8000mL的细胞培养基，约8000mL至约9000mL的细胞培养基，约9000mL至约10000mL的细胞培养基，约10000mL至约15000mL的细胞培养基，约15000mL至约20000mL的细胞培养基，或约20000mL至约25000mL的细胞培养基。在一个实施方案中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增TIL的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺，50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州，美国)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增TIL数量所需的培养基含量和培养基的种类数量。在一个实施方案中，扩增TIL的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率喂食细胞。扩增透气容器中的细胞数量通过降低扩增细胞所需的喂食频率而简化了扩增细胞数量所需的程序。
在一个实施方案中，使用透气性容器进行快速扩增。此类实施方案允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增至在10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一个实施方案中，这种扩增在不进料的条件下发生。在一个实施方案中，只要培养基在透气烧瓶中位于约10cm的高度，这种扩增就不进行进料。在一个实施方案中，没有进料但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可以作为丸剂添加而无需将细胞因子与培养基混合。这种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增TIL，并且包括在美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际专利申请公开WO2014/210036A1、美国专利申请公开号US 2013/0115617A1、国际公开WO2013/188427A1、美国专利申请公开号US2011/0136228A1、美国专利号8,809,050、国际专利申请公开WO2011/072088A2、美国专利申请公开号US2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133A1、国际专利申请公开WO2012/129201A1、美国专利申请公开号US2013/0102075A1，美国专利号8,956,860，国际专利申请公开WO2013/173835A1和美国专利申请公开号US2015/0175966 A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于Jin等，J.Immunotherapy 2012，35，283-292，其公开内容通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 10烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括10cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括40mL的细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在2次培养基交换后提供1亿至3亿个TIL。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 100烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括450mL的细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在2次培养基交换后提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 100M烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括1000mL细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在无需更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 100L烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括2000mL细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在无需更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 24孔板(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括具有孔的板，其中每个孔包括2cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括具有孔的板，其中每个孔包括8mL细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在2次培养基更换后提供每孔2千万至6千万个细胞。
在一个实施方案中，透气性容器是G-Rex 6孔板(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方案中，透气性容器包括具有孔的板，其中每个孔包括10cm2的透气性培养表面。在一个实施方案中，透气性容器包括具有孔的板，其中每个孔包括40mL细胞培养基容量。在一个实施方案中，透气性容器在2次培养基更换后提供每孔1亿至3亿个细胞。
在一个实施方案中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基没有β-巯基乙醇(BME)。
在一个实施方案中，该方法的持续时间包括从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得TIL；在含有细胞培养基的第二透气容器中，使用aAPC扩增TIL的数量持续约14天至约42天(例如约28天)。
在一个实施方案中，快速扩增使用约1x109至约1x1011个aAPC。在一个实施方案中，快速扩增使用约1x109个aAPC。在一个实施方案中，快速扩增使用约1x1010个aAPC。在一个实施方案中，快速扩增使用约1x1011个aAPC。
在一个实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)选自1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100、1∶105、1∶110、1∶115、1∶120、1∶125、1∶130、1∶135、1∶140、1∶145、1∶150、1∶155、1∶160、1∶165、1∶170、1∶175、1∶180、1∶185、1∶190、1∶195、1∶200、1∶225、1∶250、1∶275、1∶300、1∶350、1∶400、1∶450和1∶500。在优选的实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)为约1∶90。在优选的实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)为约1∶95。在优选的实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)为约1∶100。在优选的实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)为约1∶105。在优选的实施方案中，TIL与aAPC的比率(TIL∶aAPC)为约1∶110。
在一个实施方案中，快速扩增中TIL与aAPC的比率为约1∶25、约1∶50、约1∶100、约1∶125、约1∶150、约1∶175、约1∶200、约1∶225、约1∶250、约1∶275、约1∶300、约1∶325、约1∶350、约1∶375、约1∶400或约1∶500。在一个实施方案中，快速扩增中TIL与aAPC的比率在1∶50至1∶300之间。在一个实施方案中，快速扩增中TIL与aAPC的比率在1∶100至1∶200之间。
在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在优选的实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含1000～2000IU/mL、2000～3000IU/mL、3000～4000IU/mL、4000～5000IU/mL、5000～6000IU/mL、6000～7000IU/mL、7000～8000IU/mL或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在优选的实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中、细胞培养基包含0.1ng/mL～1ng/mL、1ng/mL～5ng/mL、5ng/mL～10ng/mL、10ng/mL～20ng/mL、20ng/mL～30ng/mL、30ng/mL～40ng/mL、40ng/mL～50ng/mL、50ng/mL～100ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，TIL的快速扩增过程可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.Immunother.2008，31，742-51；Dudley等，J.Immunother.2003，26，332-42)或透气性培养器皿(G-Rex烧瓶，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation，新布赖顿，明尼苏达州，美国商购)进行。对于T-175烧瓶中的TIL快速扩增，可以将悬浮在150mL培养基中的1×106个TIL加入到各个T-175烧瓶中。TIL可以用aAPC以1个TIL：100个aAPC的比率培养，并且细胞在CM与AFM-V培养基的1∶1混合物中培养，该混合物补充有30001U(国际单位)/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(例如，OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中温育。可以在第5天使用具有30001U/mL的IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3升袋中，并将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V加入到300ml的TIL悬浮液中。每天或每两天计数每个袋中的细胞数，并加入新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5×106～2.0×106个细胞/mL之间。
在一个实施方案中，对于在具有100cm透气性硅底的500mL容量透气性烧瓶中的TIL快速扩增(G-Rex 100，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation，混合物商购)，5×106或10×106个TIL可用aAPC以1∶100的比率在400mL的50/50培养基中培养，该培养基补充有5％人AB血清、3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3(OKT-3)。G-Rex 100烧瓶可以在37℃、5％CO2中温育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(每分钟转数；491×g)离心10分钟。TIL颗粒可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基重新悬浮，并加回到原G-Rex 100烧瓶中。当TIL在G-Rex 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，各个G-Rex 100中的TIL可以悬浮在各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可以将细胞悬浮液分成3个100mL等分试样，用于接种3个G-Rex 100烧瓶。然后可以向每个烧瓶中加入150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-Rex 100烧瓶可以在37℃下在5％CO2中温育，4天后，可以向每个G-Rex 100烧瓶中加入150mL具有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可以在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方案中，TIL可以按如下制备。在包含补充有2mM谷氨酰胺(Mediatech，Inc.，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))、100U/mL青霉素(Invitrogen LifeTechnologies)、100μg/mL链霉素(Invitrogen Life Technologies)、5％热灭活的人AB血清(Valley Biomedical，Inc.，温彻斯特(Winchester)，弗吉尼亚州)和600IU/mL rhIL-2(Chiron，埃默里维尔(Emeryville)，加利福尼亚州)的AIM-V培养基(Invitrogen LifeTechnologies，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)的完全培养基(CM)中培养2mm3肿瘤片段。对于实体肿瘤的酶消化，将肿瘤标本切成RPMI-1640，洗涤并在15-22℃下以800rpm离心5分钟，并重悬于酶消化缓冲液(RPMI-1640中0.2mg/mL胶原酶和30单位/ml DNase)中，然后在室温下旋转过夜。由片段建立的TIL可以在CM中生长3-4周，并在含有10％二甲基亚砜(DMSO)的热灭活的HAB血清中新鲜扩增或冷冻保存，并在-180℃下储存直至研究时间。将从腹水收集物获得的肿瘤相关淋巴细胞(TAL)以3×106个细胞/孔接种于CM中的24孔板中。使用低功率倒置显微镜每隔一天检查TIL生长。
在一个实施方案中，在透气容器中扩增TIL。使用本领域已知的方法、组成和装置，包括在美国专利申请公开号US2005/0106717A1中描述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用PBMC来扩增TIL。在一个实施方案中，TIL在透气袋中扩增。在一个实施方案中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如Xuri细胞扩增系统W25(Xuri Cell Expansion System W25)(GE Healthcare)。在一个实施方案中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约11L、约12L、约13L、约14L、约15L、约16L、约17L、约18L、约19L、约20L、约25L、和约30L。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自50～150mL、150～250mL、250～350mL、350～450mL、450～550mL、550～650mL、650～750mL、750～850mL、850～950mL，以及950～1050mL。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自1L～2L、2L～3L、3L～4L、4L～5L、5L～6L、6L～7L、7L～8L、8L～9L、9L～10L、10L～11L、11L～12L、12L～13L、13L～14L、14L～15L、15L～16L、16L～17L、17L～18L、18L～19L，以及19L～20L。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自0.5L～5L、5L～10L、10L～15L、15L～20L、20L～25L，以及25L～30L。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆时间(rocketing time)为约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天和约28天。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆时间为30分钟～1小时、1小时～12小时、12小时～1天、1天～7天、7天～14天、14天～21天，以及21天～28天。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆速率(rocketing rate)为约2次摇摆(rocks)/分钟、约5次摇摆/分钟、约10次摇摆/分钟、约20次摇摆/分钟、约30次摇摆/分钟和约40次摇摆/分钟。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆速率为2次摇摆/分钟至5次摇摆/分钟、5次摇摆/分钟至10次摇摆/分钟、10次摇摆/分钟至20次摇摆/分钟、20次摇摆/分钟至30次摇摆/分钟、30次摇摆/分钟至40次摇摆/分钟。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆角度为约2°、约3°、约4°、约5°、约6°、约7°、约8°、约9°、约10°、约11°和约12°。在一个实施方案中，细胞扩增系统使用的摇摆角度为2°～3°、3°～4°、4°～5°、5°～6°、6°～7°、7°～8°、8°～9°、9°～10°、10°～11°、11°～12°。
在一个实施方案中，使用aAPC扩增TIL的方法还包括选择TIL以获得优异的肿瘤反应性的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058 A1中描述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择TIL以获得优异的肿瘤反应性。
在一个实施方案中，本发明的aAPC可用于扩增T细胞。用于TIL扩增的本发明的任何前述实施方案也可以应用于T细胞的扩增。在一个实施方案中，本发明的aAPC可用于扩增CD8+T细胞。在一个实施方案中，本发明的aAPC可用于扩增CD4+T细胞。在一个实施方案中，本发明的aAPC可用于扩增用嵌合抗原受体转导的T细胞(CAR-T)。在一个实施方案中，本发明的aAPC可用于扩增包含修饰的T细胞受体的T细胞(TCR)。CAR-T细胞可以靶向任何合适的抗原，包括CD19，如本领域所述，例如，美国专利号7,070,995、7,446,190、8,399,645、8,916,381和9,328,156，其公开内容通过引用并入本文。修饰的TCR细胞可以靶向任何合适的抗原，包括NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或它们的抗原性部分，如本领域所述，例如，美国专利号8,367,804和7,569,664，其公开内容通过引用并入本文。
治疗癌症和其他疾病的方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方案中，它们用于治疗过度增殖性疾病。它们还可以用于治疗本文和以下段落中描述的其他病症。本文描述的TIL、TIL群和其组合物可用于治疗疾病。在一个实施方案中，本文所述的TIL、TIL群和组合物用于治疗过度增殖性疾病。
在一些实施方案中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，过度增殖性疾病是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌、肾脏上皮肾细胞癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，过度增殖性疾病是恶性血液肿瘤。在一些实施方案中，恶性血液肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，本发明包括用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；(b)在细胞培养基中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群。在一个实施方案中，aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在一个实施方案中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明包括用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；(b)在第一细胞培养基中使用第一人工抗原呈递细胞(aAPC)群，对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高10倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；(c)在第二细胞培养基中，使用第二aAPC群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，第三TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群。在一个实施方案中，aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在一个实施方案中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。在一个实施方案中，使用透气性容器进行初始扩增。
在一个实施方案中，本发明包括用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，包括以下步骤：(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；(b)在第一细胞培养基中初始扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高10倍，并且其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；(c)在第二细胞培养基中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，第三TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群。在一个实施方案中，aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。在一个实施方案中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
在一个实施方案中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗法预治疗患者。在一个实施方案中，非清髓性化疗法施用环磷酰胺60mg/kg/天，持续2天(TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天，持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开内容的非清髓性化疗法和TIL输注(在第0天)后，患者每8小时静脉输注720,000IU/kg的IL-2至达到生理耐受。
本文所述化合物和化合物组合在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症中的功效可使用本领域已知的各种模型进行测试，为人类疾病的治疗提供指导。例如，用于确定卵巢癌治疗功效的模型描述于例如Mullany等，Endocrinology 2012，153，1585-92；以及Fong等，J.Ovarian Res.2009，2，12。用于确定胰腺癌治疗功效的模型描述于Herreros-Villanueva等，World J.Gastroenterol.2012，78，1286-1294。用于确定乳腺癌治疗功效的模型描述于例如Fantozzi，Breast Cancer Res.2006，8，212。用于确定黑素瘤治疗功效的模型描述于例如Damsky等，Pigment Cell&Melanoma Res.2010，23，853-859。用于确定肺癌治疗功效的模型描述于例如Meuwissen等，Genes&Development，2005，19，643-664。用于确定肺癌治疗功效的模型描述于例如Kim，Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009，2，55-60；以及Sano，Head Neck Oncol.2009，1，32。
非清髓性淋巴细胞清除与化疗
在一个实施方案中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗法预治疗患者。在一个实施方案中，本发明提供了可通过本文所述的方法获得的用于治疗癌症的TIL群，其中，所述TIL群用于治疗用非清髓性化疗法预治疗的患者。在一个实施方案中，非清髓性化疗法施用环磷酰胺60mg/kg/天，持续2天(TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天，持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开内容的非清髓性化疗法和TIL输注(在第0天)后，患者每8小时静脉输注720,000IU/kg的IL-2(阿地白介素，可作为PROLEUKIN商购)至达到生理耐受。
实验结果表明，过继转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞清除通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争元素(“细胞因子沉降”)而在增强治疗功效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的aAPC扩增的TIL之前对患者使用淋巴细胞清除步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
通常，通过施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺(mafosfamide))及其组合来实现淋巴细胞清除。这些方法描述于Gassner等，CancerImmunol.Immunother.2011，60，75-85，Muranski等，Nat.Clin.Pract.Oncol.，2006，3，668-681，Dudley等，J.Clin.Oncol.2008，26，5233-5239，以及Dudley等，J.Clin.Oncol.2005，23，2346-2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，氟达拉滨以0.5μg/mL～10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方案中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2～7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4～5天。
在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺以0.5μg/ml～10μg/ml的浓度获得马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺以1μg/mL的浓度获得马磷酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方案中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方案中，静脉(i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2～7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉施用4～5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉施用4天。
在一些实施方案中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用于患者来进行淋巴细胞清除。在一些实施方案中，氟达拉滨以25mg/m2/天静脉施用且环磷酰胺以250mg/m2/天静脉施用4天。
在一个实施方案中，通过以60mg/m2/天的剂量持续两天施用环磷酰胺进行淋巴细胞清除，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。
药物组合物、剂量和给药方案
在一个实施方案中，使用本公开的APC扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。本公开的使用aAPC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。优选地，TIL作为单次输注施用，例如动脉内或静脉内输注，输注优选持续约30～60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。优选地，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是当癌是黑素瘤时。在一个实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一个实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012以及5×1012至1×1013。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
本发明实施方案的药物组合物中提供的TIL在宽剂量范围内有效。确切的剂量取决于给药途径、给药化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的TIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量，将取决于所治疗的人或哺乳动物、疾病或病症的严重程度、给药速度、活性药物成分的处置和处方医师的自由裁量权。
在一些实施方案中，TIL可以单剂量施用。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方案中，TIL可以是多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或大于六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或每隔一天一次。只要有必要，TIL的施用可以继续。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg，或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量范围为约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg，或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg，或约198mg至约207mg。
有效量的TIL可以通过任何可接受的具有类似用途的药剂的给药方式以单剂量或多剂量施用，包括鼻内和透皮途径、动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部、通过移植或吸入。
实施例
现在参考以下实施例描述本文包括的实施方案。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1-使用PBMC饲养细胞扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的可变性
通过比较从患者获得的相同TIL系上的多个TIL扩增的结果，可以展示通过使用PBMC饲养细胞获得的TIL扩增的可变性。图1显示了使用经辐照的同种异体PBMC饲养细胞(PBMC饲养细胞)快速扩增TIL的典型结果。将标记为M1015T和M1016T(1.3×105个细胞)的两个TIL系与46种不同的经辐照的饲养细胞批次(1.3×107)、IL-2(3000IU/mL)，重组人IL-2(例如，阿地白介素或等同物)(CellGenix，Inc.，朴次茅斯，新罕布什尔州，美国)和OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotec GmbH，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)在T25烧瓶中共培养7天。在第7天计算TIL的倍数扩增值。该图显示了在单独的刺激实验中，两个TIL系的倍数扩增值。对于每个TIL系，测试了46个不同的PBMC饲养批次。每个TIL系的结果超过100倍，并突出显示使用PBMC饲养细胞的扩增结果的可变性。与PBMC饲养细胞相比，本发明的aAPC提供了降低的扩增性能的可变性，以及其它优点，如以下实施例所示。
实施例2-选择用于aAPC发育的骨髓细胞
对各种骨髓谱系细胞系进行表型表征，以识别进一步修饰用于TIL扩增的aAPC的潜在候选物。结果总结在表5中。MOLM-14细胞系表现出CD64的内源性表达，并被选择用于进一步发育。基于观察到的ICOS-L的内源性表达(尽管取自同一患者，但在EM-2细胞系中未观察到)，选择EM-3细胞系。
表5.在aAPC的候选细胞系上内源性表达的共刺激分子的总结。CML是指慢性髓性白血病，AML是指急性髓性白血病。“群”是指观察到表达标志物的细胞群(1/2群＝50％)。
实施例3-制备MOLM-14人工抗原呈递细胞(aMOLM14
aAPC)
MOLM-14细胞获自Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH。为了发展基于MOLM-14的aAPC，用共刺激分子CD86和4-1BBL(CD137L)工程化MOLM-14细胞。将人CD86(hCD86)和人4-1BBL(h4-1BBL)基因克隆到市售PLV430G中，并使用慢病毒转导方法用PDONR221载体(Invitrogen/ThermoFisher Scientific，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚洲，美国)共转染。使用Gateway克隆方法(如Katzen，Expert Opin.Drug Disc.2007，4，571-589所描述的)，将hCD86和hCD137L基因克隆到PLV430G和PDONR221载体上。将293T细胞系(用大T抗原转化的人胚肾细胞)用于慢病毒生产、转导至MOLM-14细胞。使用APC缀合的CD86和PE缀合的CD137L分选转染的细胞(S3e Cell Sorter，Bio-Rad，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福利亚州，美国)以分离和富集细胞。通过流式细胞术检查富集的细胞的纯度。
用于克隆的载体及其部分描述于图2至图11，并且表6中给出了每种载体的核苷酸序列。pLV430G人4-1BBL载体如图2所示，聚合酶链反应产物(PCRP)部分如图3所示。pLV430G人CD86载体如图4所示，PCRP部分如图5所示。pDONR221人CD86供体和人4-1BBL供体载体分别显示于图6和图7中。用于Gateway克隆方法的空pLV430G目的载体和空pDONR221供体载体的图分别显示在图8和图9中。图10和图11显示了用于慢病毒生产的psPAX2和pCIGO-VSV.G辅助质粒的载体图。
表6.用于制备用于转导aAPC的慢病毒的核苷酸序列。
使用流式细胞术(Canto II流式细胞仪，Becton，Dickinson，and Co.，富兰克林湖，新泽西州，美国)确认CD86和4-1BBL在工程化MOLM-14aAPC(在本文中也称为aMOLM14aAPC)上的表达，结果如图12所示。aMOLM-14 aAPC在100Gy下γ-照射并冷冻。
实施例4-使用MOLM-14人工抗原呈递细胞扩增肿瘤浸润性淋巴细胞
在与TIL共培养之前，将工程化的MOLM-14细胞以100Gy进行γ-照射。通过在含有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)的CM2培养基中以1∶100的比率用经辐照的工程化MOLM-14细胞培养TIL 14天，来开始REP。在REP收获时，测量TIL扩增速率、活化和分化阶段标志物的表型、代谢速率，细胞毒性和再快速扩增方案(re-REP)实验。
结果如图13、图14、图15和图16所示，其中比较了两组患者TIL的两次扩增。CD86/4-1BBL修饰的MOLM-14细胞(标记为“TIL+工程化MOLM14+OKT3”)的结果与PBMC饲养细胞(标记为“TIL+饲养细胞+OKT3”)相当。
在图17中比较了第14天的结果，其中显示了来自另外两个患者TIL的结果。结果表明，与同种异体饲养细胞相比，用CD86和4-1BBL工程化的MOLM-14细胞在快速扩增方案中显示出相似的TIL扩增。然而，与亲本MOLM-14一起培养的TIL没有扩增。
此外，针对MOLM-14扩增的TIL维持TIL表型并且显示出使用BRLA测量的杀死P815细胞的效力，其在实施例9中详细描述。简言之，将荧光素转导的P815靶细胞和目的TIL在含抗CD3和不含抗CD3的条件下共培养，以确定TIL的肿瘤反应性是通过TCR活化(特异性杀伤)还是非特异性杀伤。孵育4小时后，将荧光素加入孔中并孵育5分钟。孵育后，使用光度计读取生物发光强度。使用以下公式计算细胞毒性百分比和存活百分比：存活％＝(实验存活-最小值)/(最大信号-最小信号)×100或细胞毒性％＝100-(存活％)。
在图18中，与用PBMC饲养细胞的扩增结果相比，显示了用低比率的TIL对MOLM-14aAPC进行扩增的结果。以不同的TIL∶aAPC或TIL：PBMC比率(1∶10、1∶30和1∶100，分别表示为“10”、“30”和“100”)培养TIL(2×104)与亲本MOLM-14(“MOLM14”)细胞、转导以表达CD86和4-1BBL的MOLM-14细胞(“aMOLM14”)、或PBMC饲养细胞(“PBMC+”)，各自在24孔G-Rex板中具有OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)。仅使用OKT-3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)(“PBMC-”)进行对照实验。每种条件一式三份培养。在第4天和第7天，用新鲜培养基和IL-2饲养培养物。在第7天计数活细胞。图18显示了在第11天计数的活细胞数的平均值加标准偏差(SD)，其中p值由学生t检验计算。使用单独的TIL、单独的PBMC和单独的aMOLM-14细胞进行另外的对照实验，所有这些都得到检测不到的细胞数(数据未显示)。结果显示，与具有OKT-3和IL-2的PBMC饲养细胞相比，1∶100(TIL：aMOLM14)的比率与OKT-3和IL-2产生类似的扩增(p＝0.0598)。
在图19中，显示了与用PBMC饲养细胞的扩增结果相比，用较高比率的TIL：MOLM-14aAPC进行扩增的结果(其他如图18所描述地那样进行)。以1∶300的比率，具有OKT-3和IL-2的CD86/4-1BBL修饰的MOLM-14 aAPC显著优于具有OKT-3和IL-2的PBMC饲养细胞。在图20和图21中所示的重复实验中使用不同的TIL批次验证了这些结果。特别地，如图21所示，在相同条件下，与PBMC饲养细胞相比，1∶200的TIL：aMOLM14比率显示增强的TIL扩增。这些结果证实，aMOLM14 aAPC在扩增TIL的数量方面出乎意料地优于PBMC，特别是当使用的TIL：aMOLM14比率为1∶200至1∶300时。
在图22和图23中，通过流式细胞术分析比较用MOLM14或PBMC扩增的TIL，以确认TIL表现出相似的表型，并且预期在再输注到患者体内时表现相似。简而言之，首先用L/DAqua染色TIL以确定生存力。接下来，用TCR α/β PE-Cy7、CD4FITC、CD8PB、CD56APC、CD28PE、CD27APC-C7和CD57-PerCP-Cy5.5对细胞进行表面染色。通过使用Canto II流式细胞仪(Becton，Dickinson，and Co.，富兰克林湖，新泽西州，美国)根据正向光散射法(FSC)/侧向光散射法(SSC)门控10,000至100,000个细胞来进行表型分析。通过Cytobank软件分析数据以创建旭日图和SPADE(密度标准化事件的生成树进展(Spanning Tree Progression ofDensity Normalized Event))分析。基于荧光减一(FMO)对照来设定门。与PBMC饲养细胞相比，针对aMOLM14扩增的TIL增加了CD8+TIL。不受理论束缚，这种增加的CD8+TIL百分比可能是由于存在工程化至MOLM14的4-1BBL。CD28、CD57和CD27分化标志物的表达没有差异。另外的流式细胞术数据显示在图24，描绘了流式细胞术等高线图，其显示了在活的(Live)、TCRα/β+、CD4+或CD8+TIL上门控的记忆子集(CD45RA+/-，CCR7+/-)，表明用PBMC饲养细胞获得的记忆子集由aMOLMl4aAPC复制。
使用CD3+细胞用aMOLM14 aAPC或PBMC饲养细胞扩增的TIL的CD4和CD8 SPADE树显示于图25和图26中。颜色梯度与LAG3、TIL3、PD1和CD137或CD69、CD154、KLRG1和TIGIT的平均荧光强度(MFI)成比例。不受理论束缚，结果显示针对aMOLM14扩增的两批TIL经历了活化，但aMOLM14 aAPC和PBMC饲养细胞之间的MFI没有差异，表明aMOLM14 aAPC有效地复制用PBMC饲养细胞获得的TIL表型结果。
也分析了针对aMOLM14或PBMC扩增的TIL的代谢图。使用双线粒体-糖酵解应激试验测量用辐照的PBMC饲养细胞或aMOLM14 aAPC扩增后TIL的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。简而言之，在测定培养基(XF测定培养基，Agilent Technologies，圣克拉拉(SantaClara)，加利福尼亚州，美国)中洗涤细胞，该培养基补充有10mM葡萄糖、1mM丙酮酸钠和2mML-谷氨酰胺，pH为7.4，然后将1×105个活细胞接种到涂有粘合剂的(CelI-TakTM，Corning)XFp细胞培养微孔板上。将板旋转以使细胞粘附到板上，然后在分析细胞代谢之前在潮湿的非CO2培养箱中在37℃下平衡。使用Seahorse XFp分析仪(Agilent Technologies，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)进行线粒体和糖酵解应激测试实验，以指定的间隔依序注射下列化合物，用于同时分析细胞的线粒体和糖酵解呼吸：1μM寡霉素；0.5μM FCCP；50mM 2-脱氧葡萄糖；和鱼藤酮和抗霉素A各0.5μM。使用WAVE v2.3.0软件(Agilent Technologies，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国Santa Clara，CA，USA)和GraphPad Prism v6.07绘图软件分析结果，并显示在图27和图28中，其中点代表一式三份测量的平均值±SEM。用aMOLM14 aAPC和PBMC饲养细胞生长的两种TIL显示出类似的氧化磷酸化(oxphos)和糖酵解行为。该数据表明，与PBMC饲养细胞相比，aMOLM14不会改变TIL的代谢程序化。
实施例5-制备EM-3人工抗原呈递细胞(aEM3
aAPC)
EM-3细胞获自Creative Bioarray，Inc.(Shirley，纽约，美国)。为了发展基于EM-3的人工APC，用CD86、4-1BBL和针对IgG Fc区的抗体(克隆7C12或克隆8B3)工程化EM-3细胞系。将人CD86和人4-1BBL/CD137基因克隆到市售PLV430G中，并使用慢病毒转导方法用PDONR221载体(Invitrogen)共转染。使用Gateway克隆方法(如Katzen，Expert Opin.DrugDisc.2007，4，571-589中描述的)，将hCD86和hCD137L基因克隆到PLV430G和PDONR221载体上。293T细胞系用于慢病毒生产，并转导至EM-3细胞系。使用APC缀合的CD86和PE缀合的CD137L分选转染的细胞(S3e Cell Sorter，BioRad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)以分离和富集细胞。通过流式细胞术检查富集的细胞的纯度。命名为7C12和8B3的单链Fv(scFv)抗体克隆针对小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b的Fc(Viva Biotech Ltd.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)产生。这些scFv克隆的氨基酸序列在表7中给出(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28)。筛选所产生的scFv克隆用于针对OKT-3的Fc结合效率，工程化至含有eGFP作为共报道基因的pLV4301G以产生慢病毒。293T细胞系用于包装和慢病毒生产。使用慢病毒系统转导工程化的EM-3(CD86/CD137L)细胞，并使用eGFP分选。通过流式细胞术定期评估EM37C12CD86CD137L和EM38B3CD86CD137L的各转导分子的一致表达。
表7.scFv克隆7C12和8B3的氨基酸序列。
用于制备aEM3 aAPC的非限制性方案，其也可以适用于aMOM14 aAPC，在以下段落中描述。
感兴趣的质粒的分子克隆可以按如下进行。为了产生DONR载体，可以使用以下混合物：B位点侧翼PCR产物或目的载体(例如，适合Gateway的慢病毒载体)50～100μg；DONR载体(例如，pDONR222)50～100μg；BR Clonase II(Life Technologies)1μL；和TE缓冲液((1mM Tris，0.1mM EDTA，pH 8.0，适量，使体积达到5μL)。在室温下孵育至少1小时。孵育后，通过热激法或电穿孔进行细菌转化。为了产生目的载体，可以使用以下混合物：重组的pDONR载体(例如，pDON222-geneX)50～100μg，目的载体(例如，适合Gateway的慢病毒载体)50～100μg，LR CIonase II(Life Technologies)1μL和TE缓冲液((1mM Tris，0.1mM EDTA，pH8.0，适量，使体积达到5μL)。在室温下孵育至少1小时。孵育后，通过化学性感受态菌转化法或热激法进行细菌转化。
克隆质粒的转化和选择(selection)可以按如下进行。化学性感受态菌转化法可以按如下进行。用抗生素制备营养琼脂平板(LB-Lennox或YT)用于选择。确保在室温下随时可以获得恢复培养基(Recovery Medium)(由Lucigen，米德尔顿(Middleton)，威斯康星洲，美国提供)。任选地，无菌培养管可以在冰上冷冻(例如，17mm×100mm管(14mL管))，每个转化反应一个管。从-80℃冰箱中取出E.cloni细胞(Lucigen)并在湿冰上完全解冻(5～15分钟)。任选地，将40μL的E.cloni细胞加入冷冻的培养管中。将1-4μL DNA样品加入40μL细胞中。用手指轻弹(不要上下移液混合，这会引入气泡并使细胞变暖)。将细胞/DNA混合物在冰上孵育30分钟。通过将培养管置于42℃水浴中45秒来热休克细胞。将1.7mL管或培养管放回冰中2分钟。向细胞中加入350μL室温回收培养基或向培养管中的细胞中加入960μL室温回收培养基。将管置于振荡培养箱中，在37℃下以250rpm旋转1小时。将高达100％的转化混合物接种在含有适当抗生素的LB-Lennox或YT琼脂平板上。可能需要根据DNA优化接种量。将板在37℃孵育过夜。转化的克隆可以在任何富集培养基(例如LB或TB)中进一步生长。
小规模制备(Miniprep)(Qiagen，Inc.，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州，美国)的菌落可以按如下生长。在通过接种回收的DNA操作转化反应(例如，LR反应)形成菌落后，将1mL所需的TB/抗生素加入到所需数量的具有穿刺帽的2mL Eppendorf微管中。使用ART LTS 20μL软移液管尖端(VWR 89031-352)或10μl Denville尖端选择所需数目的菌落。将尖端置于具有穿刺帽的2mL Eppendorf微管中。切割尖端使其适合管，封盖，并将管放在振动器上(紫色15mL管架，带VWR品牌15mL管)。在225rpm/37℃下摇动过夜(不超过16小时)。孵育过夜后，将每个尖端置于来自Denville的ClavePak 96板中的1mL管中，其中含有无菌水(以在筛选和选择质粒后保存用于制备细菌原种的尖端)。根据Qiagen Mini prep试剂盒方案(Qiagen，Inc.，瓦伦西亚，加利福尼亚州，美国)进行Miniprep。一旦质粒被洗脱，进行限制性消化以选择正确的克隆。选择质粒后，使用从相同质粒克隆中保存的尖端，用质粒培养大肠杆菌(E.coli)，制成细菌的原种(bacterial stock)。
慢病毒生产可以按如下进行。制备以下培养基组合物：500mL DMEM/F12(Sigma)；25mL FBS热灭活(HI)(Hyclone)；10mM HEPES(Life Technologies)；1X Primocin(Invivogen)；1X Plasmocin(Invivogen)；和1X 2-巯基乙醇(2-mermactoethanol)(LifeTechnologies)。收获含有90％汇合的293T细胞的T75烧瓶(Thermo Fisher Scientific)。抽取培养基。加入10ml PBS，轻轻冲洗并吸出。加入2mLTrypLE Express(LifeTechnologies)并使其均匀分布在细胞层上，在37℃下静置3～5分钟(细胞培养箱)。加入10mL培养基，通过上下移液分散细胞。如果有多个烧瓶，将其合并。计数细胞。如果使用血细胞计数器来确定浓度，则细胞/mL＝(#计数的细胞×稀释因子×104)。要拆分回T75烧瓶，确定细胞完全汇合并相应稀释所需的时间。(细胞每16～18小时加倍，因此3天＝1/27稀释)。通常，在汇合为2×105个细胞/cm2的情况下，可以使用每天2.5的倍增因子。容量最多为25mL的培养基。为了接种用于原种的滴定，测定的每个孔需要在0.4mL培养基中的5×104个细胞。在培养基中将293T细胞调节至2×104/mL。在24孔板中每孔接种1mL。例如，周一接种的细胞可能在周二被感染，并在周五在流式细胞仪上运行，周四接种的细胞周五被感染，周一在流式细胞仪上运行。为了接种用于包装转染，在转染前一天将6.8×106个细胞接种在T75烧瓶或在转染的早晨接种1.7×106个细胞。(转染当天接种可以减少转染效率的变化)。用培养基将烧瓶中的体积增加至25mL。例如，周一设置的烧瓶周二被转染，病毒在周四和周五被收集。在一些情况下(例如，高滴定构建体)，可以省略第二次收集。为了包装慢病毒载体，每个T75烧瓶转染需要2μg的Baculo p35质粒(可选的；仅在包装死亡基因时是必需的)、2μgVSV.G env质粒(例如pMD2.G或PCIGO VSV-G)；4.7μg Gag/聚合酶质粒(例如，psPAX2或pCMV-deltaR8.91)和2.3μg上述慢病毒载体。确定所有样品所需的VSV和R8.2/9.1(+/-Baculo)质粒的量(如果制备许多样品，则制备这些DNA的混合物)。每次T75转染需要在2mLOpti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中的90μL的LipofectAmine 2000(ThermoFisher Scientific)。为所有样品制作含有足够Opti-Mem和LipofectAmine 2000的混合物。轻轻混合，在室温下静置5分钟，并标记为管A。对于每次转染，将包装DNA和特定慢病毒载体DNA加入500μL室温Opti-MEM培养基中至微管并混合，并标记为管B。将来自管B的500μLDNA加入到管A中的2mL LipofectAmine 2000混合物中并轻轻混合，并在室温下孵育20～30分钟。从包装瓶中吸出培养基。将2.5mL DNA/Lipofectamine复合物加入到5mLOpti-MEM培养基中并加入细胞(不要直接在细胞上吸取，因为293T细胞只是半粘附的)。按小组处理平板以避免干燥。孵育过夜并在第二天早晨更换培养基。更换培养基24小时后收集上清液。上清液可以在转染后48小时以单次收集收获，或者在转染后48和72小时以2次收集收获(在这种情况下，合并收获物)。如果需要两次收集，在第一天用移液管收集上清液，并用20mL新鲜培养基替换。为避免烧瓶干燥，一次只能使用5个烧瓶。将收集的上清液保持在4℃，直到第二天合并。第二天再次冷却上清液并适当地合并。将上清液以2000rpm旋转5分钟以沉淀任何污染的293T细胞。通过含有预过滤盘的0.45μm或0.8μm过滤器过滤收获的上清液。使用足够大的过滤单元，使过滤速度相对较快。储存在4℃直至准备好可以浓缩。
可以使用PEG-it方法(System Biosciences，Inc.，帕拉阿图市(Palo Alto)，加利福尼亚州，94303)浓缩病毒，以在-80℃下长期储存。收集转染平板的上清液。旋转使上清液中的细胞碎片沉降。也可以过滤上清液以完全除去任何包装细胞。向上清液中加入一定量的PEG-it溶液，其量等于上清液体积的四分之一。将悬浮液在4℃孵育过夜。在4℃下以3500rpm(1500g)离心30分钟。除去上清液，在4℃下以3500rpm离心5分钟。去除剩余的上清液。将病毒重悬于所需量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并在-80℃下冷冻等分试样。
使用慢病毒转导细胞系可以按如下进行。将待转导的细胞调节至：24孔板中每孔1×106个悬浮细胞(每个转导1个孔)或24孔板中贴壁细胞(每个转导1个孔)50％汇合。对于悬浮细胞，将细胞浓度调节至1×107/mL，并在24孔板中每孔接种100μL(每个转导1个孔)。对于贴壁细胞，接种以在转导当天达到基于细胞/cm2的50％汇合(例如，对于293T细胞，汇合＝2×105/cm2)。使用3～10μg/mL的聚凝胺(Hexadimethrine bromide，Sigma-AldrichCo.，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州，美国)，每孔的转导总体积应为约500μL。加入的浓缩病毒量取决于所需的MOI(感染复数)。典型的MOI为10∶1，但这可能因细胞类型而变化。转染孔应含有100μL的含有1×106个悬浮细胞或50％汇合细胞的标准培养基。对于10∶1的MOI(例如，病毒活性为1×108IU/mL且目标是感染1×106个细胞，则需要1×107个病毒粒子或100μL病毒)。将标准培养基添加至500μL。将聚凝胺加入3μg/mL(原代细胞)至10μg/mL(肿瘤细胞系)。将平板在30℃下以1800rpm旋转1.5～2小时。使用组织培养箱在37℃/5％CO2下孵育平板5小时至过夜。更换培养基。转导72小时后，如果有足够的细胞，则进行流式细胞分析以测试转导效率。
aAPC的分选可以按如下执行。在上述培养基中培养细胞直至细胞计数达到最低10～20百万。每种条件取1×106个细胞，并用转导的蛋白质的抗体染色。洗涤细胞并通过流式细胞术分析以测试转导的稳定性。一旦分析并确认了目的蛋白质的表达，准备剩余的细胞进行分选。通过门控感兴趣的标志物在S3分选机中对细胞进行分选。使用上述培养基培养分选的细胞。在冷冻小瓶之前，测试感兴趣的蛋白质表达的稳定性。使用恢复细胞培养物冷冻培养基(Recovery cell culture Freezing media)(Invitrogen)，制备相同细胞的细胞库。在每次转导和分选程序后，可以将细胞分库。
表8中给出了7C12和8B3 scFv克隆(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30)及它们的慢病毒载体的核苷酸序列信息。用于产生pLV4301G 7C12 scFv mlgG hCD8 flag载体的序列提供为SED lQ NO：31至SEQ ID NO：34，并示于图29至图32。用于产生pLV4301G 8B3 scFvmlgG hCD8 flag载体的序列提供为SEQ ID NO：35至SEQ ID NO：38，并示于图33至图36。
表8.用于制备用于转导aAPC的慢病毒的核苷酸序列。
在用于本文所述实验的工程化EM-3 aAPC(本文中也称为aEM3 aAPC)的制备中，使用流式细胞术(Canto ll流式细胞仪，Becton，Dickinson，and Co.，富兰克林胡，新泽西州，美国)确认CD86和4-1BBL的表达，结果如图37所示。aEM3 aAPC在100Gy下γ-照射并冷冻。
使用类似的慢病毒转导方法，将如上所述的预先转导以表达CD86、针对IgG Fc区的抗体和4-1BBL(或可选地不包括4-1BBL)的aEM-3细胞用共刺激性人OX-40L进行基因工程改造。为了产生含有人OX-40L的慢病毒，使用PolyJet(Signagen Laboratories，Rockville，马里兰州，美国)将pLenti-C-Myc-DDK OX40L(PS100064，Origene，SEQ ID NO：39，图90)载体与VSV-G包膜质粒(pCIGO-VSV.G)一起共转染到Phoenix-GP(ATCC CRL-3215)细胞系中。60小时后收获上清液，并使用具有Ultracel-100膜的Amicon Ultra-15离心过滤装置浓缩。然后用浓缩的慢病毒感染aEM-3细胞并进一步扩增5天。细胞用PE缀合的抗人OX40L、亮紫421(Brilliant Violet 421)缀合的抗人CD137L(如果4-1BBL包含在先前的aEM-3细胞中)和PE/Cy7缀合的抗人CD86染色，并使用S3e细胞分选仪(Bio-Rad，Inc.，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)，基于GFP、OX40L、CD137L(当包括时)和CD86的表达对细胞进行分选。使用流式细胞术进一步验证分选的细胞的纯度。通过流式细胞术检查富集的细胞的纯度。
实施例6-使用EM-3人工抗原呈递细胞扩增肿瘤浸润性淋巴细胞
进行实验以测试EM-3 aAPC(aEM3)扩增TIL的能力。将TIL与aEM3(7C12或8B3)以1∶100的比率加上OKT-3(30mg/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。在第11天和第14天计数细胞。如图38和图39所示，对两批TIL的结果进行绘图。此外，TIL与aEM3或PBMC饲养细胞以1∶100的比率共培养，其中有IL-2(3000IU/mL)且有或没有OKT-3(30mg/mL)。结果绘制在图40中，其中条形图显示在第11天测定的细胞数量。
图41显示了以不同的TIL∶aAPC比率用EM-3 aAPC(aEM3)进行TIL扩增的结果。结果显示，aEM3 aAPC的表现与PBMC相当并且在某些情况下优于PBMC，特别是在较长培养时间(14天)以1∶200的比率下。
图42显示与PBMC饲养细胞相比，使用EM-3 aAPC(aEM3)的TIL扩增的细胞计数的低变化性。将TIL(2×104)与5种不同的PBMC饲养批次或aEM3(一式三份)以1∶100的比率与IL-2(3000IU/mL)在G-Rex24孔板中共培养。该图显示了在第14天计数的活细胞数(平均值)，置信区间为95％。图43比较了EM-3aAPC与MOLM-14aAPC的TIL扩增结果，以说明与将TIL(2×104)与5种不同的PBMC饲养批次或aMOLM14(一式三份)或aEM3(也一式三份)以1∶100的比率与IL-2(3000IU/mL)在G-Rex 24孔板中的共培养相比，aEM3和aMOLM14的细胞计数变化性。在第14天计数活细胞，并且该图显示活细胞数(平均值)，置信区间为95％。aEM3和aMOLM14结果表明，与现有技术中优选的PBMC饲养细胞方法相比，使用两种aAPC可以获得更高的一致性。
使用4种不同的组(分化组1和2，T细胞活化组1和2)，将针对aEM3或PBMC饲养细胞扩增的TIL用于流式细胞术分析。简而言之，首先用L/D Aqua染色TIL以确定生存力。接下来，对于分化组1，用TCR α/β PE-Cy7、CD4FITC、CD8PB、CD56APC、CD28PE、CD27APC-Cy7和CD57-PerCP-Cy5.5对细胞进行表面染色；对于分化组2，用CD45RA PE-Cy7、CD8a PerCP/Cy5、CCR7 PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、CD38 APC和HLA-DR PB对细胞进行表面染色；对于T细胞活化组1，用CD137 PE-Cy7、CD8a PerCP-Cy5.5、Lag3 PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、PD1APC和Tim-3 BV421对细胞进行表面染色；或对于T细胞活化组2，用CD69 PE-Cy7、CD8aPerCP/Cy5.5、TIGIT PE、CD4 FITC、CD3 APC-Cy7、KLRG1 ALEXA 647和CD154 BV421对细胞进行表面染色。通过使用Canto II流式细胞仪根据FSC/SSC门控10,000至100,000个细胞进行表型分析。使用Cytobank软件(Cytobank，Inc.，Santa Clara，加利福尼亚州，美国)分析数据以产生旭日图和SPADE(密度标准化事件的生成树进展分析)图。基于荧光减一(FMO)对照来设定门。用细胞组产生SPADE图，基于表面标志物的表达水平以相关节点的形式表征。基于CD3+门控确定CD4+和CD8+TIL子集，并生成树。旭日可视化图如图44和图45所示。图44显示，与针对PBMC饲养细胞扩增的相同TIL相比，针对aEM3 aAPC扩增的TIL维持了CD8+表型。图45显示来自不同患者的针对aEM3 aAPC扩增的第二批TIL的结果，其中与使用PBMC饲养细胞的扩增结果(25％)相比，观察到CD8+细胞的明显增加(65.6％)。
使用CD3+细胞的aEM3 aAPC或PBMC饲养细胞扩增的TIL的CD4和CD8SPADE树显示于图46和图47。颜色梯度与LAG3、TIL3、PD1和CD137或CD69，CD154、KLRG1和TIGIT的平均荧光强度(MFI)成比例。不受理论束缚，结果显示用aEM3 aAPC扩增的TIL经历了活化，但aEM3aAPC和PBMC饲养细胞之间的MFI没有差异，表明aEM3 aAPC有效地复制了用PBMC饲养细胞获得的表型结果。
还评估了与PBMC饲养细胞相比，用aEM3 aAPC扩增的TIL的备用呼吸能力(SRC)和糖酵解储备，结果显示在图48和图49中。Seahorse XF细胞Mito应力测试(Seahorse XFCell Mito Stress Test)通过使用呼吸作用调节剂直接测量细胞的耗氧率(OCR)来测量线粒体功能，所述呼吸作用调节剂针对线粒体中电子传递链的组分。连续注射测试化合物(寡霉素、FCCP、以及鱼藤酮和抗霉素A的混合物，如下所述)以分别测量ATP产生、最大呼吸和非线粒体呼吸。然后使用这些参数和基础呼吸计算质子泄漏和备用呼吸能力。每个调节剂靶向电子传递链的一种特定组分。寡霉素抑制ATP合酶(复合物V)，并且注射寡霉素后OCR的减少与细胞ATP产生相关的线粒体呼吸相关。羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)是一种解偶联剂，可破坏质子梯度并破坏线粒体膜电位。结果是，通过电子传递链的电子流不受抑制，并且复合物IV最大程度地消耗氧。然后，FCCP刺激的OCR可用于计算备用呼吸能力，该备用呼吸能力被定义为最大呼吸和基础呼吸之间的差异。备用呼吸能力(SRC)是细胞响应增加的能量需求的能力的量度。第三次注射是鱼藤酮(一种复合物l抑制剂)和抗霉素A(一种复合物III抑制剂)的混合物。这种组合可以关闭线粒体呼吸，并能够计算由线粒体以外的过程驱动的非线粒体呼吸。
图50显示了针对PBMC饲养细胞或aEM3aAPC扩增的活TIL的线粒体染色。MitoTracker染料染色活细胞中的线粒体，其积累依赖于膜电位。针对PBMC饲养细胞或aEM3扩增的TIL染色L/D Aqua，然后是MitoTracker红染料。数据显示MitoTracker阳性(MFI)细胞在活细胞群上门控。
实施例7-工程化MOLM-14(aMOLM14)和EM-3(aEM3)aAPC的比较
如前面实施例中所述，使用用于细胞毒性效力的BRLA，评估用PBMC饲养细胞和aMOLM14和aEM3 aAPC扩增的TIL的功能活性。实施例9中详细描述了P815BRLA。结果如图51和图52所示，显示用aAPC扩增的TIL与用PBMC饲养细胞扩增的TIL具有相似的功能特性(和预期的临床疗效)。
在用抗-CD3/CD28/4-1BB包被的微珠刺激过夜后，还评估了如上所述用PBMC饲养细胞和aMOLM14和aEM3 aAPC扩增的TIL的IFN-γ释放和颗粒酶B释放。IFN-γ释放结果显示在图53和图54中，并且颗粒酶B释放结果显示在图55和图56中。相对于用PBMC饲养细胞扩增的TIL，观察到用aEM3 aAPC扩增的TIL的IFN-γ释放和颗粒酶B释放的显著和惊人的增加，但是对于由MOLM14 aAPC扩增的TIL没有观察到。不受理论束缚，这表明用aEM3 aAPC培养的TIL在体内作为癌症疗法可能更具活性。观察到的大多数其他差异无统计学意义。
表9总结了用aEM3和aMOLM14 aAPC进行TIL扩增的结果。
表9.用aAPC的TIL扩增结果的总结。
实施例8-制备aEM3和aMOLM14
aAPC的主细胞库
aEM3和aMOLM14 aAPC可以在以下培养基组合物中生长以产生主细胞库，其可以在该培养基中进一步生长以供应aAPC：500mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′sModified Eagle Medium)DMEM/F12(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)、50mL胎牛血清(FBS)热灭活(HI)(Hyclone)；10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙硫磺酸(HEPES缓冲液)(Life Technologies)；1X Primocin(Invivogen)；1XPlasmocin(Invivogen)和1X2-巯基乙醇(Life Technologies)。
本文所述的aAPC，包括aEM3和aMOLM14 aAPC，也可以使用本领域已知的用于细胞生长的任何合适方法从主细胞库生长。在一个实施方案中，将aAPC解冻，然后通过每2～3天将饱和培养物1∶2至1∶3分裂，在24孔板中以约0.5～1×106个细胞/mL接种，并保持在约0.5～1.5×106个细胞/mL，在37℃和5％CO2下孵育，将aAPC在80～90％RPMI 1640+10-20％h.iFBS(胎牛血清)的培养基中扩增。
可用于将本发明某些实施方案的aAPC用于人类治疗的生产的其他步骤是本领域已知的并且包括细胞系表征(HLA高分辨率分型)；细胞因子释放试验；检测人血清代替FBS来生长aAPC；测试冷冻培养基以冻结aAPC；主细胞库(包括原料测试和稳定性测试)；辐照标准化(包括辐射剂量(1000、3000、5000、10000、15000rad)，新鲜的与冷冻的aAPC，在有/无TIL的情况下)；aAPC的稳定性；发展评估aAPC污染的小组；发展分子生物学分析(qPCR，DNA测序)；检测不同肿瘤类型的TIL扩增，肿瘤类型包括黑色素瘤、宫颈癌和头颈癌(使用G-Rex5M)；效力、纯度和一致性(identity)测试；支原体和无菌试验；微生物检测(USP/EP无菌、生物负载和内毒素检测)；和外来病毒性试剂测试。
实施例9-扩增TIL和用扩增的TIL治疗癌症的方法
可以使用本文所述的任何扩增方法，使用本发明某些实施方案的aAPC，例如aEM3和aMOLM14 aAPC，扩增TIL。例如，图57中示出了一种扩增TIL的方法。使用aAPC的TIL的扩增可以进一步与本文描述的在患者中治疗癌症的任何方法组合。图58示出了扩增TIL和用扩增的TIL治疗患者的方法，其中扩增使用aAPC(包括aEM3和aMOLM14 aAPC)。
实施例10-P815生物发光重定向裂解测定(Bioluminescent Redirected Lysis
Assay)
在本实施例中，描述了发展替代靶细胞系以评估TIL在生物发光重定向裂解测定(BRLA)中的裂解潜力。BRLA能够在不存在自体肿瘤细胞的情况下评估T细胞介导的杀伤。可以通过在1到4小时内使T细胞受体参与和不参与，评估使T细胞受体参与的T细胞杀伤并且没有所谓的淋巴因子激活的杀伤活性(LAK)，来评估细胞裂解活性(cytolytic activity)。
表达内源性CD16Fc受体的小鼠肥大细胞瘤P815细胞可以结合抗CD3ε(OKT-3)，提供有效的TCR激活信号作为靶细胞系。P815克隆G6用基于eGFP和萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导，使用BD FACSAria II分选和克隆。基于使用Intellicyt iQue筛选器分析的eGFP强度选择克隆G6。将感兴趣的靶细胞和TIL共培养+/-OKT-3以分别评估TCR活化(特异性杀伤)或非特异性(淋巴因子激活杀伤，LAK)。温育4小时后，加入萤火虫荧光素酶((4S)-2-(6-羟基-1，3-苯并噻唑-2-基)-4，5-二氢噻唑-4-羧酸，可从多种来源商购)到孔中并孵育5分钟。使用光度计读取生物发光强度。使用以下公式计算细胞毒性百分比和存活百分比：存活％＝(实验存活-最小值)/(最大信号-最小信号)×100或细胞毒性％＝100-(存活％)。通过ELISA分析共培养的TIL的培养基上清液中的干扰素γ释放，并且在流式细胞仪上分析TIL上的LAMP1(CD107a，克隆eBioH4A3)表达以评估TIL的细胞毒性效力。
结果显示在图59至图75中。图59显示了通过BRLA以各个效应细胞：靶细胞的比率与P815克隆G6(有和没有抗CD3)共培养的TIL批次M1033T-1的毒性百分比。图60显示了酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，其显示针对不同的效应细胞：靶细胞比率释放的IFN-γ的量。图61显示了当TIL批次M1033T-1在抗CD3存在下与P815克隆G6以1∶1的效应细胞：靶细胞的比率共培养4小时和24小时时表达的LAMP1(％)。
使用第二TIL批次确认结果，如图62所示，显示了TIL批次M1030的BRLA。通过BRLA的细胞毒性(测量为LU50/1×106TIL)为26±16。图63显示了TIL批次M1030的标准铬释放测定的结果。通过铬释放测定的细胞毒性(测量为LU50/1×106TIL)为22。
使用第三TIL批次进一步确认结果。图64显示了TIL批次M1053的BRLA结果，显示通过BRLA的TIL的裂解单位为70±17。图65显示了TIL批次M1053的标准铬释放测定的结果，显示通过铬测定的TIL的裂解单位为14±5。两个测定结果的比较表明了BRLA结果与铬释放测定结果的可比性能。
图66示出了TIL的IFN-γ释放与细胞毒性潜力之间的线性关系。图67示出了IFN-γ的ELISpot结果。图68示出了TIL批次M1053的酶促lFN-γ释放。图69示出了TIL批次M1030的酶促IFN-γ释放。图70示出了显示M1053T和M1030T的颗粒酶B释放的ELISpot数据。图71示出了TIL批次M1053的酶促颗粒酶B释放。图72示出了TIL批次M1030的酶促颗粒酶B释放。图73示出了显示M1053T和M1030T的TNF-a释放的ELISpot数据。图74示出了TIL批次M1053的酶促TNF-α释放。图75示出了TIL批次M1030的酶促TNF-α释放。图66至图76中的数据证实了这些批次的TIL的效力，也如通过BRLA显示的。
总之，BRLA不需要放射性核素，并且与传统的细胞毒性测定一样有效和敏感。在各个时间点对TIL上的Lamp 1表达的流式细胞术评估显示，与通过BRLA显示的效力相关的细胞毒性T细胞的脱粒。BRLA表现出类似于比标准铬释放测定更好的效力。BRLA还能够评估TIL裂解活性的效力。BRLA与铬释放试验的比较显示了BRLA的效率和可靠性。BRLA与TIL的IFNγ释放具有线性关系。通过ELISpot对IFN-γ、TNFα和颗粒酶B的释放测定与BRLA评估的TIL的细胞毒性效率一致。
实施例11-将EM3细胞从FBS脱离(Weaning)至hAB血清的方法
为了避免反应性，可能需要将一些细胞系从一种培养基脱离至另一种培养基。在这里，EM3细胞从FBS脱离至hAB血清以避免反应性。如图76所示，aEM3细胞成功脱离FBS至hAB血清。
实施例12-冷冻培养基配方优化
对于如本文所述培养的低温库EM3细胞，优化冷冻培养基配方的方法。如图77所示，使用三种冷冻培养基并计算它们对细胞数量的影响。使用的细胞培养基包括CryStor10(Biolife Solutions(CS10))(A)、hAB[90％]和DMSO[10％](B)，以及hAB[20％]含DMSO[10％]和cDMEM2[70％](C)。图77表明人AB血清(90％)和DMSO(10％)的配方在3天的恢复后提供了意外增加的EM3细胞数。
实施例13-在GREX烧瓶中生长aEM3细胞
将aEM3细胞在透气性细胞培养瓶(即，GREX烧瓶(Wilson Wolf Manufacturing))中培养，并在8天的时间过程中观察对细胞倍增时间的影响。如图78所示，GREX烧瓶提供aEM3细胞的快速生长。
实施例14-确定aEM3细胞纯度的流式面板分析
为了确定根据本文所述方法培养的细胞的纯度，使用流式面板分析来确定aEM3aAPC的纯度。这种分析的结果描述于图79和图80中。如图80所示，在分选aEM3细胞群之前，对于aEM3 7C12和aEM3 8B5细胞，分别为53.5％和43.2％eGFP+。分选后，对于aEM3 7C12和aEM3 8B5细胞，将细胞群分别提高至96.8％和96.3％eGFP+(图80)。
实施例15-aEM3饲养细胞作为PBMC饲养细胞的替代
如本文所述，aEM3细胞可用作PBMC饲养细胞的替代，导致TIL扩增过程和所获的TIL的预料之外不同的性质。为了比较细胞因子表达的差异，通过用OKT-3处理刺激PBMC和aEM3细胞。如图81所示，与PBMC相比，aEM3细胞显示出相对不同的细胞因子表达谱。令人惊讶的是，本发明的aEM3细胞提供了有效的TIL(如本文所示)，而没有再现与用常规PBMC扩增的TIL相同的细胞因子分泌特性。
实施例16-完全培养基和无血清培养基的TIL扩增之间的比较
为了优化TIL扩增方案，如本文所述进行了若干TIL扩增实验，但是使用无血清培养基而不是完全培养基(CM1)。
在一个实验中，在单孔中用含300IU/mL IL-2的CM1或各种无血清培养基培养组织片段。然后在开始REP之前，在第11天对细胞进行计数。使用的各种无血清培养基包括PrimeCDM(Irvine)、CTS Optimizer(ThermoFisher)和Xvivo-20(Lonza)。如图82所示，与CM1相比，使用CTS的TIL扩增(REP前(PreREP))提供了增加的细胞数量。
另外，将组织片段用含6000IU/mL IL-2的CM1或各种无血清培养基培养至第11天。然后在第11天使用PBMC饲养细胞、OKT-3和IL-2开始REP，并在第16天分离培养物。然后在第22天结束时终止培养物。使用的各种无血清培养基包括Prime CDM(Irvine)、CTSOptimizer(ThermoFisher)和Xvivo-20(Lonza)。如图83和图84所示，当分别在第11天和第22天计数细胞时，与CM1相比，用Prime CDM的TIL扩增(REP前)提供了增加的细胞数量。
实施例17-与基于血清的培养基相比，无血清培养基中aAPC的生长
为了在不存在血清的情况下优化aAPC生长和维持的方案，使用各种无血清培养基培养aEM3细胞。
使用如本文所述的常规细胞培养方案，将aEM3细胞在24孔板中以1×106个细胞/孔培养3天，不同之处在于为一组细胞提供基于血清的培养基(cDMEM(10％hSerum)，为其他组细胞提供无血清培养基。用于该研究的无血清培养基包括CTSOpTmizer(ThermoFisher)、Xvivo 20(Lonza)、Prime-TCDM(Irvine)和XFSM(MesenCult)培养基。然后在第3天计数细胞。
如图85所示，CTS OpTmizer和Prime-TCDM无血清培养基提供的细胞生长与基于血清的培养基(即cDMEM(10％hSerum))相当。因此，与基于血清的培养基相比，无血清培养基是生长和维持aAPC的有效替代。
实施例18-aAPC的增殖、维持和冷冻保存
在本实施例中，提供了用于制备和保存aAPC的方法。具体地，将来自称为TIL-Rs3的细胞系的aEM3细胞增殖并冷冻保存。
可以使用以下非限制性方法完成aEM3细胞的解冻和恢复。将冷冻保存的aEM3细胞在预热培养基(37℃)中缓慢加热，所述培养基由CTS OpTmizer基础培养基(Basal Media)(Thermo Fisher)、CTS OpTmizer细胞补充剂(Cell Supplement)(Thermo Fisher)、Gentamicin(Lonza)和Glutamax(Life Technologies)制备。然后将悬浮的细胞在4℃下以1500rpm离心5分钟。弃去所得上清液，将剩余的aEM3细胞重悬于前述培养基中并接种(6孔板的每孔5×106个细胞/10mL)。
可以使用以下非限制性方法完成aEM3细胞的增殖。在透气性细胞培养瓶(即GREX10烧瓶(Wilson Wolf Manufacturing))中制备上述培养基的等分试样。接种的aEM3细胞通过离心(即，在4℃下1500rpm，5分钟)洗涤，重悬于培养基中，并以1～2×106个细胞/mL的细胞密度加入GREX烧瓶中。用30mL培养基稀释aEM3细胞悬浮液，然后将GREX烧瓶在37℃下在CO2下孵育3～4天。3～4天后，将GREX烧瓶从培养箱中取出并置于生物安全柜(BSC)中。通过移液管从GREX烧瓶中小心地吸取培养的aEM3细胞，并将所得的吸取物离心以提供数量增加的aEM3细胞，其可以以每个GREX 10烧瓶中10～20×106个细胞的细胞密度重悬浮。
可以使用以下非限制性方法完成aEM3细胞替代的冷冻保存。将上述含有aEM3细胞的GREX 10烧瓶从培养箱中取出并置于BSC中。通过移液管从GREX烧瓶中小心地吸取培养的aEM3细胞，并将所得的吸取物离心以提供数量增加的aEM3细胞，将其重悬于一定体积的CryStor 10(Biolife Solutions)中以提供冷冻管中10～100×106个细胞/小瓶的浓度。可以将aEM3细胞悬浮液置于冷冻容器中并转移至-80℃冰箱中。
实施例19-冷冻保存后aEM3细胞快速恢复的证明
使用CS-10冷冻保存培养基，根据实施例18中所述的方法冷冻保存来自TIL-R3细胞系(1～2×106个细胞)的aEM3细胞。然后解冻这些细胞的小瓶并计数细胞。在解冻前、解冻后和解冻3天后(即解冻后恢复)进行细胞计数。如图86和图87所示，在两次单独的实验中，解冻后活细胞总数快速恢复。
解冻TIL-R3细胞(1×106个细胞)(解冻后第3天)，并在24孔板的每个孔中以0.5×106/cm2的密度接种。在第0天和第3天，计数并记录活细胞。在第一次传代(第6天)，以2×106个细胞/cm2或0.5×106个细胞/cm2的密度分离细胞。在第一次传代结束时，进行细胞计数。得到的细胞计数如图88所示，其显示了解冻后的恢复期和生长期。
此外，根据实施例18中描述的方法，在GREX 10烧瓶中以2×106/cm2的密度培养TIL-R3细胞(20×106个细胞)。在第4天和第8天，计数并记录活细胞。得到的细胞计数如图89所示，显示了冷冻保存后细胞的生长期，生长期在第4天和第8天之间当细胞达到13.9×106个细胞/cm2的密度时达到稳定期。
实施例20-用aEM3aAPC培养的TIL的CD8偏斜(skewness)、扩增性能和CD3污染
将15种不同的PreREP TIL系(0.4×105个细胞)与aEM3aAPC(如本文所述)或PBMC饲养细胞(10×106)、OKT3(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养，并且在第5天使用6孔Grex平板分离培养物。在第11天对培养物取样并通过流式细胞术分析。通过公式(CD8％aEM3)/(CD8％PBMC)计算CD8+细胞的相对比例。结果如图91所示，表明用aEM3细胞培养的TIL令人惊讶地促进CD8偏斜并改善TIL产物。这些实验的其他结果显示在图92、图93和图94，结果显示，与用PBMC饲养细胞培养的TIL相比，用aEM3 aAPC培养的TIL显示出相当的扩增和更少的非CD3+细胞污染。
实施例21-端粒长度测量
从REP前或REP后(用于CD3+分选的磁珠)TIL分离基因组DNA用于qPCR(定量聚合酶链式反应)测定以测量端粒长度。实时qPCR方法在Cawthon，Nucleic Acids Res.2002，30(10)，e47；以及Yang等，Leukemia，2013，27，897-906中描述。简而言之，使用PCR热循环仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)以96孔格式测定端粒重复拷贝数与单基因拷贝数的比率(T/S)。将10ng基因组DNA用于端粒或血红蛋白(hgb)PCR反应，所用引物如下：
Tel-1b引物(CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT)(SEQ IDNO：40)；
Tel-2b引物(GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT)(SEQ IDNO：41)；
hgb1引物(GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC)(SEQ ID NO：42)；和
hgb2引物(GAG CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC)(SEQ ID NO：43).
通过端粒和血红蛋白反应分析所有样品，分析在同一板上一式三份进行。除了测试样品之外，使用从1301人T细胞白血病细胞系(可从Sigma和ATCC获得)分离的基因组DNA，每个96孔板含有0.08ng至250ng的五点标准曲线。通过从中值端粒Ct值中减去中值血红蛋白阈值循环(Ct)值，来计算每个样品的T/S比率(-dCt)。通过从每个未知样品的T/S比率中减去10.0ng标准曲线点的T/S比率，来确定相对T/S比率(-ddCt)。
结果显示在图95中。显示的每个数据点是相对T/S比率的中值测量值。结果表明，用aEM3培养的TIL维持其端粒长度。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司(IOVANCE BIOTHERAPEUTICS, INC.)
<120> 用于肿瘤浸润淋巴细胞扩增的工程化人工抗原呈递细胞
<150> 62/415,274
<151> 2016-10-31
<150> 62/438,600
<151> 2016-12-23
<150> 62/475,053
<151> 2017-03-22
<150> 62/481,831
<151> 2017-04-05
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鼠源单克隆抗体重链（Muromonab heavy chain）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鼠源单克隆抗体轻链（Muromonab light chain）
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-2
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿地白介素
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-7
<400> 5
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-15
<400> 6
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-21
<400> 7
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130
<210> 8
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CD86
<400> 8
Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu
20 25 30
Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val
35 40 45
Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu
50 55 60
Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr
65 70 75 80
Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile
85 90 95
Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr
100 105 110
Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala
115 120 125
Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn
130 135 140
Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro
145 150 155 160
Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr
165 170 175
Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp
180 185 190
Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met
195 200 205
Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile
225 230 235 240
Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val
245 250 255
Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn
260 265 270
Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln
275 280 285
Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala
290 295 300
Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp
305 310 315 320
Thr Cys Phe
<210> 9
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人4-1BBL
<400> 9
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 10
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人OX40L
<400> 10
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 11
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CD28
<400> 11
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CTLA-4
<400> 12
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 13
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人4-1BB
<400> 13
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 14
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人OX40
<400> 14
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 15
<211> 7569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pLV430G人4-1BBL载体
<400> 15
cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60
gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180
taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300
cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360
tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420
accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480
agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540
ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780
gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840
cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900
agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960
tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020
ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080
aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140
taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200
agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260
cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320
aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380
tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440
cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500
tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560
tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620
gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680
ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740
acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800
taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860
aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920
tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980
tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040
ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100
ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280
ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340
caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400
agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460
ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520
agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580
atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640
cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700
caacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttcg ccaccatgga atacgcctct gatgccagcc 2760
tggaccccga agctccttgg cctcctgccc ctagagccag agcctgtaga gtgctgcctt 2820
gggctctggt ggctggcctt ctccttctgc tgctgctggc cgctgcctgc gctgtgtttc 2880
tggcttgtcc ttgggccgtg tcaggcgcca gagcttctcc tggatctgcc gccagcccca 2940
gactgagaga gggacctgag ctgagccccg atgatcctgc cggactgctg gatctgagac 3000
agggcatgtt cgcccagctg gtggcccaga acgtgctgct gatcgatggc cccctgagct 3060
ggtacagcga tcctggactg gctggcgtgt cactgacagg cggcctgagc tacaaagagg 3120
acaccaaaga actggtggtg gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttt cagctggaac 3180
tgcggagagt ggtggccggc gaaggatccg gctctgtgtc tctggcactg catctgcagc 3240
ccctgagatc tgctgcaggc gctgctgcac tggccctgac agtggacctg cctccagcct 3300
ctagcgaggc cagaaactcc gcattcgggt ttcaaggcag actgctgcac ctgtctgccg 3360
gccagagact gggagtgcat ctgcacacag aggccagagc cagacacgcc tggcagctga 3420
cacagggcgc tacagtgctg ggcctgttca gagtgacccc cgaaattcca gccggcctgc 3480
ccagccctag aagcgagtag gacccagctt tcttgtacaa agtggtgatt cgagttaatt 3540
aagctagcct agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt 3600
cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt 3660
taccgctgtt accaattttc ttttgtcttt gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa 3720
gagatggggt tactctctaa attttatggg ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc 3780
acaagaacac atcatacaaa aaatcaaaga atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc 3840
tattgattgg aaagtatgtc aacgaattgt gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac 3900
acaatgtggt tatcctgcgt tgatgccttt gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt 3960
cactttctcg ccaacttaca aggcctttct gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt 4020
tgcccggcaa cggccaggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg 4080
cttggtcatg ggccatcagc gcatgcgtgg aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac 4140
tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac 4200
tgataactct gttgtcctat cccgcaaata tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc 4260
tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc 4320
ggacgaccct tctcggggtc gcttgggact ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg 4380
accgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc 4440
ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac 4500
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cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccggatcc cttgagtggc 5340
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ctcgcgtcg 7569
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BBL CoOP
<400> 16
atggaatacg cctctgatgc cagcctggac cccgaagctc cttggcctcc tgcccctaga 60
gccagagcct gtagagtgct gccttgggct ctggtggctg gccttctcct tctgctgctg 120
ctggccgctg cctgcgctgt gtttctggct tgtccttggg ccgtgtcagg cgccagagct 180
tctcctggat ctgccgccag ccccagactg agagagggac ctgagctgag ccccgatgat 240
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<210> 17
<211> 832
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BBL PRCP
<400> 17
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gcccagccct agaagcgagt aggacccagc tttcttgtac aaagtggtcc cc 832
<210> 18
<211> 7776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pLV430G人CD86载体
<400> 18
cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60
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tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420
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gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840
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taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200
agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260
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aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380
tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440
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tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560
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acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800
taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860
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ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280
ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340
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tgtacaaagt ggtgattcga gttaattaag ctagcctagt gccatttgtt cagtggttcg 3780
tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat tgggggccaa 3840
gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt tgtctttggg 3900
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tgtcattgga tgttatgggt ccttgccaca agaacacatc atacaaaaaa tcaaagaatg 4020
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tgcatgtatt caatctaagc aggctttcac tttctcgcca acttacaagg cctttctgtg 4200
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cttttcggct cctctgccga tccatactgc ggaactccta gccgcttgtt ttgctcgcag 4380
caggtctgga gcaaacatta tcgggactga taactctgtt gtcctatccc gcaaatatac 4440
atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc ctgcgcggga cgtcctttgt 4500
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ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 6900
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gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 7020
atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 7080
tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 7140
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ctacctgcct ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa 7740
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD86 CoOP
<400> 19
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ctgtaccagt gcatcatcca ccacaagaaa cccaccggca tgatcagaat ccaccagatg 360
aacagcgagc tgtccgtgct ggccaacttc agccagcccg agatcgtgcc catcagcaac 420
atcaccgaga acgtgtacat caacctgacc tgcagcagca tccacggcta ccccgagccc 480
aagaaaatga gcgtgctgct gcggaccaag aacagcacca tcgagtacga cggcgtgatg 540
cagaaaagcc aggacaacgt gaccgagctg tacgacgtga gcatcagcct gagcgtgagc 600
ttccccgacg tgaccagcaa catgaccatc ttttgcatcc tggaaaccga caagacccgg 660
ctgctgtcca gccccttcag catcgagctg gaagatcccc agccccctcc cgaccacatc 720
ccctggatca ccgccgtgct gcccaccgtg atcatctgcg tgatggtgtt ctgcctgatc 780
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<220>
<223> CD86 PCRP
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> pDONR221 4-1BBL载体
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ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60
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<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pLV430G载体
<400> 23
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aattttcggg tttattacag ggacagcaga gatccagttt ggaaaggacc agcaaagctc 7020
ctctggaaag gtgaaggggc agtagtaata caagataata gtgacataaa agtagtgcca 7080
agaagaaaag caaagatcat cagggattat ggaaaacaga tggcaggtga tgattgtgtg 7140
gcaagtagac aggatgagga ttaacacatg gaattctgca acaactgctg tttatccatt 7200
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actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt 9240
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tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 9360
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catgtctgga tccgctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 9840
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tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 10080
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 10140
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 10200
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<220>
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tgctgactgt atatgcatga ggatagcata tgctacccgg atacagatta ggatagcata 300
tactacccag atatagatta ggatagcata tgctacccag atatagatta ggatagccta 360
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Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Thr Ser Val Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asp Ile Gln Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Tyr Leu Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
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195 200 205
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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gcacagaagg tccagggcag agtcaccttg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atccgacgac acggccgtgt attactgtgc gacaggtggc 300
gggacctggt actccgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcaccgtctc ggccggtggc 360
ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgccaga aattgtgctg 420
actcagtctc cctccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcagcat cacttgccgg 480
gccagtcaga gtattggtgg gtcgttggcc tggtatcaac aaaagccagg gaaagcccct 540
aagctcctga tctctgaggc gtctacttta gagaggggcg tcccatcaag attcagcggc 600
agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tgcagcctga agatgttgca 660
acttattact gtcaaaaata taacagtgtc ccgctcactt tcggccctgg gaccaaggtg 720
gagatcaaa 729
<210> 31
<211> 9862
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 目的载体pLV4301G
<400> 31
cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60
gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180
taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300
cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360
tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420
accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480
agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540
ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720
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taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200
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cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320
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acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800
taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860
aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920
tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980
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ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100
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cacaagtttg tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt 2760
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ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa 3660
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gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt 4680
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ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt 4980
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ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 5280
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 5340
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 5400
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 5460
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 5520
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 5580
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 5640
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 5700
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acgagctgta caagtaacgc gtcccgggtc tagagctagc ggtaccatgc attacgtagt 5820
cgacgactta attaagctag cctagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 5880
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ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 6000
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 6060
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ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 6420
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 6480
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 6540
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 6600
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 6660
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 6720
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 6780
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gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 6960
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caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 7080
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 7140
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cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 7260
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 7320
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 7380
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7440
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7500
ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 7560
gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgga 7620
tcccttgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc aacacaacat 7680
tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga catgtacctc 7740
ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg gcctgtgtag 7800
ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg cccccttgtt 7860
aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 7920
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 7980
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 8040
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attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 8160
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 8220
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 8280
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 8340
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 8400
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 8460
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 8520
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ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 8640
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gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 8760
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gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240
aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360
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agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840
aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862
<210> 32
<211> 3334
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 供体载体 1, pMK 7c12抗mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5
<400> 32
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
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acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360
aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420
atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga tatcgccacc 480
atgggcagca cagccattct ggccctgctg ctggcagtgc tgcagggcgt gtcagctcag 540
gtgcagctgg tgcagtctgg cggcggactc gtgaaacctg gcggcagcct gagactgagc 600
tgtgccgcca gcggcttcaa cttcaacgac cagtacatga gctggatccg gcaggcccct 660
ggcaagggac tggaatgggt gtccttcatc agcggcagcg gcggcaccac ctactacacc 720
gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca ccaaggacag cctgtacctg 780
cagatgaaca gcctgaccgt ggaagatacc gccgtgtact actgcgccag aggcggcaat 840
tactacacca gcgtgggcag aggcaccctc gtgacagtgt ctgctggcgg aggcggatca 900
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cccggcaccc tgtctctgag ccctggcgaa agagccatcc tgagctgcag agccagccag 1020
agcgtgtccg gatacctggc ttggtatcag cagaagcccg gccaggcccc cagactgctg 1080
atctatggcg ccagcagcag agccacaggc atccccgata gattcagcgg ctctggcagc 1140
ggcaccgact tcaccctgac aatcagctcc ctgcggcccg aggacatcgg cacctactat 1200
tgcaagcagt acatcaacgc ccccttcacc ttcggcggag gcaccaaggt ggaaatcaag 1260
ccgcgggcca actttgtata caaaagtgga acgagaaacg taaaatgata taaatatcaa 1320
tatattaaat tagattttgc ataaaaaaca gactacataa tactgtaaaa cacaacatat 1380
ccagtcacta tgaatcaact acttagatgg tattagtgac ctgtactggg cctcatgggc 1440
cttcctttca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg 1500
tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 1560
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tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 1860
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 1920
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 1980
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 2040
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ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 2160
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 2220
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aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 2340
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 2400
tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc 2460
ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc 2520
gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg 2580
caatcaataa agccgctaaa acggccattt tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca 2640
ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc 2700
tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca tccagatcat cctgatccac caggcccgct 2760
tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc 2820
gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc 2880
ggcgccagat ggctagacag cagatcctga cccggcactt cgcccagcag cagccaatca 2940
cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc 3000
cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc 3060
acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca 3120
atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc 3180
gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 3240
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 3300
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 3334
<210> 33
<211> 2779
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 供体载体 2, pMK hCD8a scaffold TN L5 L2
<400> 33
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360
aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420
atgagcaatg cttttttata atgcccaact ttgtatacaa aagtggcccg cggacaacaa 480
cccctgcccc cagacctcct accccagccc ctacaattgc cagccagcct ctgagcctga 540
ggcccgaggc ttgtagacct gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg 600
cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc 660
tcgtgatcac cctgtactgc ggctccacca gcggctccgg caagcccggc tctggcgagg 720
gctccaccag cggcgactac aaggacgacg atgacaagta ataggatatc ggttcagctt 780
tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg 840
tcactatcag tcaaaataaa atcattattt ctgggcctca tgggccttcc tttcactgcc 900
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960
tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020
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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440
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ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860
aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920
tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980
gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040
ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100
agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160
ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220
gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280
tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340
gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400
accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460
gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520
cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580
caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640
tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760
tttccccgaa aagtgccac 2779
<210> 34
<211> 9338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于慢病毒生产的最终载体, pLV4301G 7C12 scFV mIgG hCD8 flag
<400> 34
cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60
gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180
taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300
cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360
tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420
accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480
agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540
ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780
gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840
cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900
agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960
tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020
ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080
aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140
taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200
agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260
cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320
aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380
tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440
cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500
tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560
tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620
gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680
ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740
acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800
taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860
aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920
tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980
tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040
ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100
ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280
ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340
caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400
agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460
ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520
agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580
atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640
cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700
caccaacttt gtacaaaaaa gctgaacgat atcgccacca tgggcagcac agccattctg 2760
gccctgctgc tggcagtgct gcagggcgtg tcagctcagg tgcagctggt gcagtctggc 2820
ggcggactcg tgaaacctgg cggcagcctg agactgagct gtgccgccag cggcttcaac 2880
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accatcagcc gggacaacac caaggacagc ctgtacctgc agatgaacag cctgaccgtg 3060
gaagataccg ccgtgtacta ctgcgccaga ggcggcaatt actacaccag cgtgggcaga 3120
ggcaccctcg tgacagtgtc tgctggcgga ggcggatcag gcggcggagg atcaggggga 3180
ggcggaagcg gagcacccga tatccagatg acacagagcc ccggcaccct gtctctgagc 3240
cctggcgaaa gagccatcct gagctgcaga gccagccaga gcgtgtccgg atacctggct 3300
tggtatcagc agaagcccgg ccaggccccc agactgctga tctatggcgc cagcagcaga 3360
gccacaggca tccccgatag attcagcggc tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 3420
atcagctccc tgcggcccga ggacatcggc acctactatt gcaagcagta catcaacgcc 3480
cccttcacct tcggcggagg caccaaggtg gaaatcaagc cgcgggccaa ctttgtatac 3540
aaaagtggcc cgcggacaac aacccctgcc cccagacctc ctaccccagc ccctacaatt 3600
gccagccagc ctctgagcct gaggcccgag gcttgtagac ctgctgctgg cggagccgtg 3660
cacaccagag gactggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcaca 3720
tgtggcgtgc tgctgctgag cctcgtgatc accctgtact gcggctccac cagcggctcc 3780
ggcaagcccg gctctggcga gggctccacc agcggcgact acaaggacga cgatgacaag 3840
taataggata tcggttcagc tttcttgtac aaagttggga ttcgagttaa ttaagttaac 3900
gaattccccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 3960
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 4020
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 4080
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 4140
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aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 4260
cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 4320
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 4380
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaacgtcta ggccccccga 4440
accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac aaccatggga 4500
ggcggaagcg gcggaggctc ccctcgaggc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc 4560
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 4620
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 4680
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 4740
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 4800
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cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 4920
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 4980
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 5040
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 5100
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aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 5220
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taacgcgtcc cgggtctaga gctagcggta 5280
ccatgcatta cgtagtcgac gacttaatta agctagccta gtgccatttg ttcagtggtt 5340
cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc 5400
aagtctgtac agcatcttga gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg 5460
ggtatacatt taaaccctaa caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt 5520
tatgtcattg gatgttatgg gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa 5580
tgttttagaa aacttcctat taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg 5640
ggtcttttgg gttttgctgc cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg 5700
tatgcatgta ttcaatctaa gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg 5760
tgtaaacaat acctgaacct ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg 5820
tttgctgacg caacccccac tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga 5880
accttttcgg ctcctctgcc gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc 5940
agcaggtctg gagcaaacat tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat 6000
acatcgtttc catggctgct aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt 6060
gtttacgtcc cgtcggcgct gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc 6120
tctcgtcccc ttctccgtct gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg 6180
gactccccgt ctgtgccttc tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac 6240
gtcgcatgga gaccaccgtg aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga 6300
ctcttggact ctcagcaatg tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt 6360
ttaaagactg ggaggagttg ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct 6420
gtaggcataa attggtctgc gcaccagcac catggcgcaa tcactagagc ggggtacctt 6480
taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 6540
gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt 6600
ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 6660
ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 6720
actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta 6780
gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga 6840
gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 6900
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6960
atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca tcccgcccct 7020
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gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta actcttggct gaagctctta caccaatgct 7200
gggggacatg tacctcccag gggcccagga agactacggg aggctacacc aacgtcaatc 7260
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ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 7440
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 7500
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 7560
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 7620
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 7680
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 7740
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg 7800
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 7860
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 7920
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 7980
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 8040
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc 8100
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 8160
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tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 8280
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 8340
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 8400
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 8460
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 8520
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 8580
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 8640
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aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcg 9338
<210> 35
<211> 9862
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 目的载体, pLV4301G
<400> 35
cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60
gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120
cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180
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tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420
accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480
agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540
ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780
gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840
cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900
agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960
tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020
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tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980
tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040
ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100
ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280
ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340
caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400
agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460
ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520
agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580
atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640
cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700
cacaagtttg tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt 2760
aaattagatt ttgcataaaa aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc 2820
actatggcgg ccgcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 2880
gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag 2940
aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt 3000
gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg 3060
gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt 3120
cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg 3180
gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt 3240
tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa 3300
gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg 3360
tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat 3420
atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 3480
gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 3540
agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaaatggat 3600
ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt tgcggtataa 3660
gaatatatac tgatatgtat acccgaagta tgtcaaaaag aggtatgcta tgaagcagcg 3720
tattacagtg acagttgaca gcgacagcta tcagttgctc aaggcatata tgatgtcaat 3780
atctccggtc tggtaagcac aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc 3840
tggaaagcgg aaaatcagga agggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc 3900
tcttttgctg acgagaacag gggctggtga aatgcagttt aaggtttaca cctataaaag 3960
agagagccgt tatcgtctgt ttgtggatgt acagagtgat attattgaca cgcccgggcg 4020
acggatggtg atccccctgg ccagtgcacg tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact 4080
ttacccggtg gtgcatatcg gggatgaaag ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag 4140
tgtgccggtc tccgttatcg gggaagaagt ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat 4200
caaaaacgcc attaacctga tgttctgggg aatataaatg tcaggctccc ttatacacag 4260
ccagtctgca ggtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct 4320
gttttttatg caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt 4380
cagctttctt gtacaaagtg gtgattcgag ttaattaagt taacgaattc cccccctctc 4440
cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg 4500
tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg 4560
gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag 4620
gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt 4680
ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc 4740
aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga 4800
gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga 4860
aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct 4920
ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt 4980
tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggaggcgga agcggcggag 5040
gctcccctcg aggcaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 5100
tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 5160
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 5220
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 5280
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 5340
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 5400
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 5460
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 5520
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 5580
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 5640
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 5700
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 5760
acgagctgta caagtaacgc gtcccgggtc tagagctagc ggtaccatgc attacgtagt 5820
cgacgactta attaagctag cctagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 5880
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 5940
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 6000
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 6060
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 6120
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 6180
ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 6240
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 6300
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 6360
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 6420
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 6480
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 6540
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 6600
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 6660
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 6720
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 6780
cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 6840
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 6900
gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 6960
ctgcgcacca gcaccatggc gcaatcacta gagcggggta cctttaagac caatgactta 7020
caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 7080
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 7140
gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 7200
cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 7260
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 7320
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 7380
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7440
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 7500
ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 7560
gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgga 7620
tcccttgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc aacacaacat 7680
tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga catgtacctc 7740
ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg gcctgtgtag 7800
ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg cccccttgtt 7860
aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 7920
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 7980
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 8040
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 8100
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 8160
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 8220
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 8280
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 8340
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 8400
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 8460
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 8520
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 8580
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 8640
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 8700
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 8760
gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 8820
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 8880
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 8940
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 9000
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 9060
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 9120
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 9180
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240
aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 9420
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 9480
ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 9540
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 9600
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 9660
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 9720
ctggcctttt gctggccttt ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac 9780
agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840
aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862
<210> 36
<211> 3340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 供体载体 1, pMK 8B3 抗 mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5
<400> 36
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360
aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420
atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga tatcgccacc 480
atgggcagca cagccattct ggccctgctg ctggcagtgc tgcagggcgt gtcagctcag 540
gtgcagctgc agcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gcagcagcgt gaaggtgtcc 600
tgcaaggcta gcggcggcac cttcagcagc tacgccattt cttgggtgcg ccaggcccct 660
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc agcccctaca acggcaacac cgactacgcc 720
cagaaagtgc agggcagagt gaccctgacc accgacacca gcacctccac cgcctacatg 780
gaactgcgga gcctgagaag cgacgacacc gccgtgtact actgtgccac aggcggcgga 840
acctggtaca gcgatctgtg gggcagaggc accctcgtga cagtgtctgc tggcggcgga 900
ggatctggcg gaggcggaag tggcggggga ggaagcggag cacctgagat cgtgctgacc 960
cagagcccta gcacactgag cgccagcgtg ggcgacagag tgtccatcac ctgtagagcc 1020
agccagagca tcggaggcag cctggcctgg tatcagcaga agcctggcaa ggcccccaag 1080
ctgctgatct ctgaggccag caccctggaa agaggcgtgc ccagcagatt ttccggcagc 1140
ggctctggca ccgacttcac cctgacaatc agcagcctgc agcccgagga cgtggccacc 1200
tactactgcc agaagtacaa cagcgtgccc ctgaccttcg gccctggcac caaggtggaa 1260
atcaagccgc gggccaactt tgtatacaaa agtggaacga gaaacgtaaa atgatataaa 1320
tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca 1380
acatatccag tcactatgaa tcaactactt agatggtatt agtgacctgt actgggcctc 1440
atgggccttc ctttcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 1500
acatggtcat agctgtttcc ttgcgtattg ggcgctctcc gcttcctcgc tcactgactc 1560
gctgcgctcg gtcgttcggg taaagcctgg ggtgcctaat gagcaaaagg ccagcaaaag 1620
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1680
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1740
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1800
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1860
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1920
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1980
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2040
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 2100
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2160
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2220
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2280
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 2340
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 2400
acttggtctg acagttatta gaaaaattca tccagcagac gataaaacgc aatacgctgg 2460
ctatccggtg ccgcaatgcc atacagcacc agaaaacgat ccgcccattc gccgcccagt 2520
tcttccgcaa tatcacgggt ggccagcgca atatcctgat aacgatccgc cacgcccaga 2580
cggccgcaat caataaagcc gctaaaacgg ccattttcca ccataatgtt cggcaggcac 2640
gcatcaccat gggtcaccac cagatcttcg ccatccggca tgctcgcttt cagacgcgca 2700
aacagctctg ccggtgccag gccctgatgt tcttcatcca gatcatcctg atccaccagg 2760
cccgcttcca tacgggtacg cgcacgttca atacgatgtt tcgcctgatg atcaaacgga 2820
caggtcgccg ggtccagggt atgcagacga cgcatggcat ccgccataat gctcactttt 2880
tctgccggcg ccagatggct agacagcaga tcctgacccg gcacttcgcc cagcagcagc 2940
caatcacggc ccgcttcggt caccacatcc agcaccgccg cacacggaac accggtggtg 3000
gccagccagc tcagacgcgc cgcttcatcc tgcagctcgt tcagcgcacc gctcagatcg 3060
gttttcacaa acagcaccgg acgaccctgc gcgctcagac gaaacaccgc cgcatcagag 3120
cagccaatgg tctgctgcgc ccaatcatag ccaaacagac gttccaccca cgctgccggg 3180
ctacccgcat gcaggccatc ctgttcaatc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 3240
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 3300
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 3340
<210> 37
<211> 2779
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 供体载体 2, pMK hCD8a scaffold TN L5 L2
<400> 37
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360
aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420
atgagcaatg cttttttata atgcccaact ttgtatacaa aagtggcccg cggacaacaa 480
cccctgcccc cagacctcct accccagccc ctacaattgc cagccagcct ctgagcctga 540
ggcccgaggc ttgtagacct gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg 600
cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc 660
tcgtgatcac cctgtactgc ggctccacca gcggctccgg caagcccggc tctggcgagg 720
gctccaccag cggcgactac aaggacgacg atgacaagta ataggatatc ggttcagctt 780
tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg 840
tcactatcag tcaaaataaa atcattattt ctgggcctca tgggccttcc tttcactgcc 900
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960
tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020
aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860
aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920
tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980
gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040
ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100
agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160
ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220
gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280
tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340
gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400
accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460
gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520
cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580
caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640
tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于慢病毒生产的最终载体, pLV4301G 8B3 scFV mIgG hCD8 flag
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagggactg gggctgctcc tgtgcttcac ctacatctgc ctgcacttct ctgctcttca 3480
ggtatcacat cggtatcctc gaattcaaag tatcaaagta caatttaccg aatataagaa 3540
ggagaaaggt ttcatcctca cttcccaaaa ggaggatgaa atcatgaagg tgcagaacaa 3600
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tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 4440
gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4500
aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4560
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4620
ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4680
tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgatcga gacctagaaa aacatggagc 4740
aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgattgt gcctggctag aagcacaaga 4800
ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 4860
ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 4920
ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 4980
tgattggcag aactacacac cagggccagg gatcagatat ccactgacct ttggatggtg 5040
ctacaagcta gtaccagttg agcaagagaa ggtagaagaa gccaatgaag gagagaacac 5100
ccgcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag aagtattaga 5160
gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacatggcc cgagagctgc atccggactg 5220
tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 5280
cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 5340
gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 5400
tagcagcatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5460
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5520
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5580
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5640
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5700
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5760
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5820
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5880
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5940
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 6000
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6060
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6120
tttggtcatg attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc 6180
attctgccga catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc 6240
agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg 6300
tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg 6360
aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc 6420
acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc 6480
gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat 6540
atcaccagct caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg 6600
gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa 6660
aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat 6720
gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt 6780
tttttctcca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 6840
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt cccgcgcaca 6900
tttccccgaa aagtgccacc tgac 6924
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tel-1b引物
<400> 40
cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tel-2b引物
<400> 41
ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hgb1引物
<400> 42
gcttctgaca caactgtgtt cactagc 27
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hgb2引物
<400> 43
caccaacttc atccacgttc acc 23
Claims (99)
1.一种人工抗原呈递细胞aAPC，其包含用一种以上病毒载体转导的骨髓细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码共刺激分子的一种以上核酸，以及其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和一种以上共刺激分子。
2.根据权利要求1所述的aAPC，其中，所述aAPC可以刺激和扩增与aAPC接触的肿瘤浸润淋巴细胞TIL。
3.根据权利要求1或2所述的aAPC，其中，在包含浓度为约3000IU/mL的IL-2和浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体的细胞培养基中，所述aAPC在7天的时间内将TIL群扩增至少50倍。
4.根据权利要求1或2所述的aAPC，其中，所述aAPC可以刺激和扩增与aAPC接触的T细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的aAPC，其中，所述骨髓细胞内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的aAPC，其中，所述骨髓细胞是MOLM-14细胞。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的aAPC，其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞。
8.根据权利要求7所述的aAPC，其中，所述EM-3细胞被进一步转导以表达能够结合OKT-3抗体的Fc结构域的、单链可变片段(scFv)结合结构域。
9.根据权利要求8所述的aAPC，其中，所述scFv结合结构域包含克隆7C12(SEQ ID NO：27)或克隆8B3(SEQ ID NO：28)，或它们的包含一个以上保守性氨基酸取代的序列。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的aAPC，其中，所述CD86蛋白包含：SEQ ID NO：8所示的序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的aAPC，其中，编码CD86的核酸包含SEQ ID NO：19。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的aAPC，其中，所述一种以上共刺激分子包含4-1BBL蛋白。
13.根据权利要求12所述的aAPC，其中，所述4-1BBL蛋白包含：SEQ ID NO：9所示的序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
14.根据权利要求12所述的aAPC，其中，编码4-1BBL蛋白的一种以上核酸包含SEQ IDNO：16。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的aAPC，其中，一种以上共刺激分子包含OX40L蛋白。
16.根据权利要求15所述的aAPC，其中，所述OX40L蛋白包含：SEQ ID NO：10所示的序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的aAPC，其中，所述aAPC在无血清培养基中生长。
18.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，所述方法包括使TIL群与权利要求1～17中任一项的aAPC接触的步骤，其中，TIL群被扩增。
19.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用一种以上病毒载体转导骨髓细胞，获得人工抗原呈递细胞aAPC群，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码一种以上共刺激分子的一种以上核酸，以及其中，所述骨髓细胞表达CD86蛋白和一种以上共刺激分子，和
(b)在细胞培养基中使TIL群与aAPC群接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，在细胞培养基中，APC群在7天的时间内将TIL群扩增至少50倍。
22.根据权利要求19～21中任一项所述的方法，其中，所述骨髓细胞内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58。
23.根据权利要求19～22中任一项所述的方法，其中，所述骨髓细胞是MOLM-14细胞。
24.根据权利要求19～23中任一项所述的方法，其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述EM-3细胞被进一步转导以表达能够结合OKT-3抗体的Fc结构域的、单链可变片段(scFv)结合结构域。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述scFv结合结构域包含克隆7C12(SEQ IDNO：27)或克隆8B3(SEQ ID NO：28)，或它们的包含一个以上保守性氨基酸取代的序列。
27.根据权利要求19～26中任一项所述的方法，其中，所述CD86蛋白包含：SEQ ID NO：8或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
28.根据权利要求18～26中任一项所述的方法，其中，编码CD86的核酸包含SEQ ID NO：19。
29.根据权利要求18～28中任一项所述的方法，其中，一种以上共刺激分子包含4-1BBL蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述4-1BBL蛋白包含：SEQ ID NO：9所示的序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，编码4-1BBL蛋白的一种以上核酸包含SEQ IDNO：16。
32.根据权利要求18～31中任一项所述的方法，其中，一种以上共刺激分子包含OX40L蛋白。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述OX40L蛋白包含：SEQ ID NO：10所示的序列或它的含有一个以上保守性氨基酸取代的序列。
34.根据权利要求18～33中任一项所述的方法，其中，使用透气性容器进行扩增。
35.根据权利要求18～34中任一项所述的方法，其中，TIL群与aAPC群的比率在1：200和1：400之间。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
37.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其中，所述方法包括：使包含TIL群的TIL群与骨髓人工抗原呈递细胞aAPC接触，其中，所述骨髓aAPC包含CD86和至少一种共刺激配体，所述共刺激配体与TIL上的至少一种共刺激分子特异性结合，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL，以及其中，所述至少一种共刺激配体包含4-1BBL。
38.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其中，所述方法包括：使包含TIL群的TIL群与骨髓人工抗原呈递细胞aAPC接触，其中，所述骨髓aAPC包含CD86和至少一种共刺激配体，所述共刺激配体与TIL上的至少一种共刺激分子特异性结合，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL，以及其中，所述至少一种共刺激配体包含OX40L。
39.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其中，所述方法包括：使包含TIL群的TIL群与骨髓人工抗原呈递细胞aAPC接触，其中，所述骨髓aAPC包含CD86和至少两种共刺激配体，所述共刺激配体与TIL上的至少两种共刺激分子特异性结合，其中，共刺激分子与共刺激配体的结合诱导TIL的增殖，从而特异性地扩增TIL，以及其中，所述至少两种共刺激配体包含4-1BBL和OX40L。
40.一种用肿瘤浸润淋巴细胞TIL群治疗癌症的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；和
(c)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第二TIL群；
其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58；
以及其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，以及其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，以及其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述EM-3细胞被进一步转导以表达能够结合OKT-3抗体的Fc结构域的、单链可变片段(scFv)结合结构域。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述scFv结合结构域包含克隆7C12(SEQ IDNO：27)或克隆8B3(SEQ ID NO：28)或它们的保守性氨基酸取代。
45.根据权利要求40～44中任一项所述的方法，其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
46.根据权利要求40～45中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
47.根据权利要求40～46中任一项所述的方法，其中，使用透气性容器进行扩增。
48.根据权利要求40～47中任一项所述的方法，其中，第二TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
50.根据权利要求40～49中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤。
51.根据权利要求40～50中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在将第二TIL群施用于患者之前用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者的步骤。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天。
53.根据权利要求40～52中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在向患者施用第二TIL群后第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
55.一种用肿瘤浸润淋巴细胞TIL群治疗癌症的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)从患者切除的肿瘤中获得第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，以及其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；以及其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3；
(d)向患有癌症的患者施用治疗有效份的第三TIL群。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，MOLM-14细胞表达CD86蛋白和4\1BBL蛋白。
57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述骨髓aAPC包含用一种以上病毒载体转导的EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码4-1BBL的核酸，并且其中，EM-3细胞表达CD86蛋白和4-1BBL蛋白。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述EM-3细胞被进一步转导以表达能够结合OKT-3抗体的Fc结构域的、单链可变片段(scFv)结合结构域。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述scFv结合结构域包含克隆7C12(SEQ IDNO：27)或克隆8B3(SEQ lD NO：28)或它们的保守性氨基酸取代。
60.根据权利要求55～59中任一项所述的方法，其中，在所述第二细胞培养基中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在，OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
61.根据权利要求55～60中任一项所述的方法，其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
62.根据权利要求55～61中任一项所述的方法，其中，初始扩增使用透气性容器进行。
63.根据权利要求55～62中任一项所述的方法，其中，快速扩增使用透气性容器进行。
64.根据权利要求55～63中任一项所述的方法，其中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率在1∶80和1∶400之间。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，快速扩增中第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
66.根据权利要求55～65中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤。
67.根据权利要求55～65中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在将第三TIL群施用于患者之前用非清髓性淋巴细胞清除方案治疗患者的步骤。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞清除方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天。
69.根据权利要求55～68中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在向患者施用第三TIL群后第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
71.根据权利要求55～70中任一项所述的方法，其中，第一细胞培养基还包含第二骨髓aAPC群，第二骨髓aAPC群包含用一种以上病毒载体转导的MOLM-14或EM-3细胞，其中，所述一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸和编码共刺激分子的一种以上核酸，所述共刺激分子选自4-1BBL、OX40L或它们的组合，以及其中，骨髓aAPC表达CD86蛋白和共刺激分子。
72.一种试剂盒，其用于特异性诱导表达已知共刺激分子的肿瘤浸润淋巴细胞的增殖，所述试剂盒包含有效量的aAPC，其中，所述aAPC包含使用慢病毒载体LV转导的MOLM-14细胞或EM-3细胞，其中，LV包含编码至少一种共刺激配体的核酸，所述共刺激配体特异性结合所述已知共刺激分子，其中，已知共刺激分子与所述共刺激配体的结合刺激并扩增所述T细胞，所述试剂盒还包括用于使用所述试剂盒的加样器和说明材料。
73.一种评价肿瘤浸润淋巴细胞TIL对癌细胞的效力的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)提供多个表达内源性CD16Fc受体的小鼠肥大细胞瘤P815细胞，其中，用基于增强型绿色荧光蛋白GFP和萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导P815细胞；
(b)用OKT-3共培养多个P815细胞和TIL，评价用于特异性杀伤的T细胞受体TCR活化，以及在没有OKT-3的情况下共培养多个P815细胞和TIL，评价用于非特异性杀伤的淋巴因子激活杀伤LAK；
(c)孵育共培养物4小时；
(d)加入荧光素并孵育5分钟；
(e)使用光度计，读取共培养物的生物发光强度；和
(f)计算细胞毒性百分比和存活率。
74.用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞TIL群，其中，肿瘤浸润淋巴细胞群是第一TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群快速扩增第一TIL群，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是预先从患者切除的肿瘤中获得的，并且其中，在快速扩增开始7天后，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高50倍；
其中，骨髓aAPC内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58；
以及其中，骨髓aAPC被转导以表达CD86蛋白和共刺激分子，所述共刺激分子选自4-1BBL蛋白、OX40L蛋白以及它们的组合。
75.根据权利要求74所述的用于应用的TIL群，其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
76.根据权利要求74或75所述的用于应用的TIL群，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
77.根据权利要求74～76中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，扩增使用透气性容器进行。
78.根据权利要求74～77中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，第二TIL群与aAPC群的比率在1∶200和1∶400之间。
79.根据权利要求78所述的用于应用的TIL群，其中，第二TIL群与aAPC群的比率约为1∶300。
80.用于治疗患者癌症的肿瘤浸润淋巴细胞TIL群，其中，肿瘤浸润淋巴细胞群是第三TIL群并且可以通过包括以下步骤的方法获得：
(a)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群，其中，第一TIL群是从患者切除的肿瘤中获得的，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量至少高5倍，其中，所述第一细胞培养基包含IL-2；
(b)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aAPC)群对第二TIL群进行快速扩增，获得第三TIL群，其中，在快速扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量至少高50倍；并且其中，所述第二细胞培养基包含IL-2和OKT-3。
81.根据权利要求80所述的用于应用的TIL群，其中，快速扩增在不超过14天的时间内进行。
82.根据权利要求80或81所述的用于应用的TIL群，其中，所述细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体。
83.根据权利要求80～82中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，在所述第二细胞培养基中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在，OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
84.根据权利要求80～83中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，初始扩增在不超过14天的时间内进行。
85.根据权利要求80～84中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，使用透气性容器进行初始扩增和/或快速扩增。
86.根据权利要求80～85中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，所述骨髓aAPC包含转导以表达CD86蛋白和共刺激分子的MOLM-14细胞，所述共刺激分子选自4-1BBL蛋白、OX40L蛋白以及它们的组合。
87.根据权利要求80～86中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，所述骨髓aAPC包含转导以表达CD86蛋白和共刺激分子的EM-3细胞，所述共刺激分子选自4-1BBL蛋白、OX40L蛋白以及它们的组合。
88.根据权利要求87所述的用于应用的TIL群，其中，所述EM-3细胞被进一步转导以表达能够结合OKT-3抗体的、Fc结构域的单链可变片段(scFv)结合结构域。
89.根据权利要求87所述的用于应用的TIL群，其中，所述scFv结合结构域包含克隆7C12(SEQ ID NO：27)或克隆8B3(SEQ ID NO：28)或它们的保守性氨基酸取代。
90.根据权利要求80～89中任一项所述的用于应用的TIL群，其中，所述癌症选自黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌NSCLC、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌、肾癌和肾脏上皮肾细胞癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤。
91.根据权利要求80～90中任一项所述的TIL群，其中，所述TIL群用于在患者接受非清髓性淋巴细胞清除方案后对患者给药。
92.根据权利要求91所述的TIL群，其中，所述TIL群用于在以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天之后给药。
93.根据权利要求80～92中任一项所述的TIL群，其中，所述TIL群用于在高剂量IL-2方案前一天给药。
94.根据权利要求93所述的TIL群，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
95.一种(1)权利要求80～94中任一项所述的TIL群、(2)环磷酰胺和(3)氟达拉滨的组合，其中，环磷酰胺以60mg/m2/天的剂量施用2天，然后氟达拉滨以25mg/m2/天的剂量施用5天。
96.权利要求80～92中任一项所述的TIL群和高剂量IL-2方案的组合，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时推注静脉输液600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
97.一种人工抗原呈递细胞aAPC，其中，所述aAPC包含经基因工程改造以表达CD86和一种以上共刺激分子的骨髓细胞，所述一种以上共刺激分子选自4-1BBL蛋白、OX40L蛋白以及它们的组合。
98.根据权利要求97所述的aAPC，其中，所述骨髓细胞是EM-3细胞，所述骨髓细胞被进一步基因工程改造以表达能够结合OKT-3抗体的Fc结构域的、单链可变片段(scFv)结合结构域。
99.根据权利要求98所述的aAPC，其中，EM-3细胞经基因工程改造以表达4-1BBL和OX40L。
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