JP2023551047A - ウイルス様粒子及びそれらの製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、任意の選択した機能性分子による交換可能な装飾を可能にする高親和性タンパク質付着系を有するウイルス様粒子(VLP)に関する。本発明は、迅速な単一細胞法を含む、VLPを産生するための方法、並びに研究、診断における、及び疾患の予防/治療に使用するためのワクチンとしてのVLPの使用に更に関する。

Description

本発明は、任意の選択された機能性分子による交換可能な装飾を可能にする高親和性タンパク質付着系を有するウイルス様粒子(VLP)に関する。本発明は、迅速な単一細胞法を含む、VLPを産生するための方法、並びに研究、診断における、及び疾患の予防/治療に使用するためのワクチンとしてVLPの使用に更に関する。
緒言
ウイルス様粒子(VLP)はウイルスによく似た分子であるが、ウイルス遺伝物質を含んでいない。ウイルス様粒子は、個々に発現されると粒子へと自己アセンブリするウイルスカプシドタンパク質等のウイルス構造タンパク質から形成される。ほとんどのウイルス様粒子は、中空の「ナノ-サッカーボール」のような外観であり、サッカーボールの表面全体が、単一自己アセンブリタンパク質の多数のコピーで構成されている。産生目的の場合、これは、大型ナノ-サッカーボール型VLP構造の生成には、1つの単一タンパク質の産生で十分であることを意味する。
ウイルス様粒子は医療に活用されている。VLPの最も一般的な使用はワクチンである。この背後にある基本的な機序は、哺乳動物が、ウイルスカプシドに見られる高度反復性パターンを侵入物として認識する免疫感知機序を進化させてきたということである。こうしたパターンは、ウイルス表面タンパク質の反復性高密度提示を含むVLPに依然として存在するが、有害なウイルスゲノムは除去されている。これは、子宮頸がんの原因であるヒトパピローマウイルス(HPV)に対するワクチンとして使用されるVLPの形態である。現在、このタイプの市販HPVワクチンの選択には、Merck & Co.社製のGardasil及びGardasil-9と共に、GlaxoSmithKline社のCervarix等がある。
ワクチンとして使用するためのVLPの更なる開発は、他の作用剤をVLP殻に係留することを含む。この場合、VLP殻は、追加の作用剤を「エピトープ」として免疫系に提示する役目を果たす。一部の場合では、VLP殻を形成するウイルスカプシドタンパク質を修飾して、遺伝子融合により、提示させるエピトープを直接的に組み込むことができる。しかしながら、この手法は、一般的にVLPアセンブリ障害に結び付き、大型タンパク質はVLP不安定性を引き起こすことが多い。更に、この手法は、作用剤がタンパク質ベースでない場合には使用することができない。開発中の現行COVID19ワクチンには、この形態のVLPが使用されており、コロナウイルスに由来するスパイクタンパク質が、無関連ウイルスに由来するVLP殻を形成するウイルスカプシドタンパク質に直接的に融合されている。
更なる代替法は、VLPをアセンブリし、次いで付着手段を使用して作用剤をVLP殻に固定することである。追加の付着手段を有するこのようなVLPは、「複合VLP」と称される場合がある。複合VLPは、殻を形成するウイルスカプシドタンパク質に所望の作用剤を共有結合で付着させるために、化学架橋、反応性非天然アミノ酸等の方法により、又はSpyTag/SpyCatcher系等の結合タンパク質の使用により、製造することができる。
後者の方法では、他の非タンパク質エピトープをVLPに付着させることが可能であるが、複雑な生産プロセスが必要であり、どの作用剤にもまだ使用することができていない。一部の所望のタンパク質は、現行の付着手段を使用してVLP殻に付着させるには単に大き過ぎ、一部の複雑なエピトープとしては、別々に連結させて一緒にしなければならず、連結は追加の化学架橋により達成しなければならない数多くの成分を有する多量体が挙げられる。
SpyTag/SpyCatcher系等、付着手段として使用されている現行の結合タンパク質は、タンパク質間の結合は強力であるものの即座には起こらず、反応物の融合には時間が必要であり、どの作用剤をシェルに付着させるかに応じてVLP殻凝集をもたらす可能性があるという更なる問題を有する。
臨床ヒト又は獣医学応用に使用されるVLPの場合、規制当局は、VLPを「生物学的」活性薬物中間体(ADI)であると分類している。「生物学的」薬物は、規制当局の承認プロセスに従って、生細胞内で産生され、精製される。産生に使用される各細胞株(細菌/植物/酵母/昆虫/哺乳動物に関わりなく)は、ADIの長期安定性を保証するために詳細に特徴付けされ、いわゆる「マスターセルバンク」(MCB)として厳格に指定された条件下で保管される。VLPのアセンブリに2つ(又はそれよりも多く)のタンパク質が必要である場合、例えば、エピトープをVLP殻に付着させるためにタンパク質が使用される場合、現在は、薬物の各タンパク質成分毎に1つのMCBが必要であり、両方とも別々の精製プロセスを必要とし、両方とも「重要薬物中間体」であると分類されるため、各々には別々の特徴付け手順が必要である。また、最終ADIだけでなく各重要薬物中間体にも別々の品質管理出荷管理が必要であり、製造コストが倍増する。
こうした複雑性に加えて、エピトープの産生は、各エピトープ毎にゼロから確立しなければならない。経済的に最も効率的なタイプの産生細胞は、細菌(具体的には大腸菌(E.coli))である。しかしながら、多くのタンパク質は、大腸菌で産生させると天然形状をとらず、精製プロセスの一部として、変性状態から正しい形態へと再フォールディングさせなければならず、全体的収量の大幅な低下及びプロセス複雑性の著しい増加がもたらされる。
こうした全ての特徴の結果として、エピトープ等の作用剤をウイルスカプシドタンパク質に付着させることを試みる複合VLP型薬物の産生プロセスは複雑であり、高価である。そのため、VLP応用の広範な活用は、安価な大量生産により競争力を高めることができる分野に限定されてきた。
非タンパク質、大腸菌内でのフォールディングが困難であるタンパク質、及び多量体等の複雑で大型のタンパク質を含む、ほぼあらゆる所望の作用剤を提示するためのモジュール能力を有する複合VLPを提供することが望ましいだろう。1つの細胞株の使用しか必要とせず、VLP殻及び提示させようとする作用剤が細胞株内で自発的にアセンブリすることができる、より大幅に単純な方法によりそのような複合VLPを産生することが更に望ましいだろう。
本発明の1つ又は複数の態様は、上述の問題の1つ又は複数を解決することを目的とする。
米国特許第4,683,195号明細書
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発明の宣言
本発明の第1の態様によると、
- 1つ又は複数のB型肝炎カプシドタンパク質
- 結合タンパク質の1つ又は複数の対であり、結合タンパク質の各対は、第1の結合タンパク質及び第2の結合タンパク質を含み、結合タンパク質の対は、細菌毒素及びその阻害剤を含む、結合タンパク質の1つ又は複数の対、
- 1つ又は複数の機能性分子
を含むウイルス様粒子(VLP)であって、
各B型肝炎カプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質に付着しており、各機能性分子は、第2の結合タンパク質に付着しており、第1の結合タンパク質及び第2の結合タンパク質は互いに結合している、VLPを提供する。
一実施形態では、1つ又は複数の第1の結合タンパク質は、化学修飾を含んでいてもよい。
一実施形態では、化学修飾は、第2の機能性分子に付着していてもよい。
一実施形態では、第1の機能性分子及び第2の機能性分子は異なっていてもよい。一実施形態では、第1の機能性分子は、抗原、又は抗体等の抗原結合タンパク質から選択することができる。一実施形態では、第2の機能性分子は、蛍光標識であってもよい。
一実施形態では、機能性分子の1つが抗原結合タンパク質である場合、VLPは、第3の結合タンパク質を更に含んでいてもよく、抗原結合タンパク質は、第3の結合タンパク質に付着しており、第3の結合タンパク質は、ひいては第2の結合タンパク質に付着している。一実施形態では、第3の結合タンパク質はプロテインGである。したがって、好適には、機能性分子は、第2の結合タンパク質に直接的又は間接的に付着することができる。好適には、機能性分子は、第3の結合タンパク質を介して第2の結合タンパク質に間接的に付着していてもよい。
本発明の第2の態様によると、
- 1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質、
- 化学修飾を含む1つ又は複数の結合タンパク質であり、各結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、1つ又は複数の結合タンパク質、
- 1つ又は複数の機能性分子
を含むウイルス様粒子(VLP)であって、
各ウイルスカプシドタンパク質は結合タンパク質に付着しており、各化学修飾は機能性分子に付着している、VLPが提供される。
一実施形態では、機能性分子は、非タンパク質分子、好適には非タンパク質抗原又は蛍光(flourescent)分子である。
一実施形態では、VLPは、第2の結合タンパク質を更に含んでいてもよく、第2の結合タンパク質は、第1の結合タンパク質に結合している。一実施形態では、第2の結合タンパク質は、第2の機能性分子に付着していてもよい。
一実施形態では、第2の結合タンパク質は、細菌毒素であってもよい。好適には、細菌毒素は、細菌毒素阻害剤に結合する。
一実施形態では、第1の機能性分子及び第2の機能性分子は異なっていてもよい。一実施形態では、第1の機能性分子は蛍光標識であってもよい。一実施形態では、第2の機能性分子は、抗原、又は抗体等の抗原結合タンパク質から選択することができる。
一実施形態では、機能性分子の1つが抗原結合タンパク質である場合、VLPは、第3の結合タンパク質を更に含み、抗原結合タンパク質は、第3の結合タンパク質に付着しており、第3の結合タンパク質は、ひいては第2の結合タンパク質に結合している。一実施形態では、第3の結合タンパク質はプロテインGである。したがって、好適には、第2の機能性分子は、第2の結合タンパク質に直接的に又は間接的に付着していてもよい。好適には、第2の機能性分子は、第3の結合タンパク質を介して第2の結合タンパク質に間接的に付着していてもよい。
本発明の第3の態様によると、結合タンパク質に融合されたウイルスカプシドタンパク質を含むカプシド融合タンパク質であって、結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、カプシド融合タンパク質が提供される。
一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎ウイルスカプシドタンパク質である。
一実施形態では、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、14、又は15を含む。
一実施形態では、結合タンパク質は化学修飾を含む。
本発明の第4の態様によると、結合タンパク質に融合された機能性分子を含む機能性融合タンパク質であって、結合タンパク質は細菌毒素である、機能性融合タンパク質が提供される。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号16、17、18、19、21、又は46を含む。
本発明の代替的な第4の態様によると、更なる結合タンパク質に融合された第1の結合タンパク質を含む機能性融合タンパク質であって、第1の結合タンパク質は細菌毒素であり、更なる結合タンパク質は、抗原結合タンパク質である機能性分子を捕捉することができる、機能性融合タンパク質が提供される。
一実施形態では、更なる結合タンパク質は、機能性分子に結合することが可能である。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、抗体等の抗原結合タンパク質である。好適には、更なる結合タンパク質は、本明細書の他所に記載のような第3の結合タンパク質である。一実施形態では、更なる結合タンパク質は、プロテインGである。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号20を含む。
本発明の第5の態様によると、第3の態様のカプシド融合タンパク質又は第4の態様の機能性融合タンパク質をコードする1つ又は複数の核酸が提供される。
一実施形態では、核酸は、カプシド融合タンパク質をコードし、配列番号22、23、24、又は25から選択される配列を含む。
一実施形態では、核酸は、機能性融合タンパク質をコードし、配列番号26、27、28、29、30、32、41、又は45から選択される配列を含む。
本発明の第6の態様によると、第5の態様の1つ又は複数の核酸を含む1つ又は複数のベクターが提供される。
一実施形態では、ベクターは、配列番号1～11、47、又は48から選択される配列を含んでいてもよい。
本発明の第7の態様によると、第5の態様の1つ又は複数の核酸、又は第6の態様のベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第8の態様によると、1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞であって、1つ又は複数のベクターは、第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸を含み、第1の結合タンパク質及び第2の結合タンパク質は、互いに結合すること可能である、宿主細胞が提供される。
本発明の第9の態様によると、1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞であって、1つ又は複数のベクターは、第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び機能性分子をコードする第2の核酸を含み、機能性分子は、第1の結合タンパク質の化学修飾を介して第1の結合タンパク質に結合することが可能である、宿主細胞が提供される。
本発明の第10の態様によると、単一宿主細胞内でウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、並びに
(ii)(a)第2の結合タンパク質に任意選択で付着した機能性分子をコードする第2の核酸、及び/又は
(b)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸
を含む、工程、
(b)それぞれ第1の核酸、第2の核酸、及び/又は第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(c)タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
を含む方法が提供される。
一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎カプシドタンパク質である。一実施形態では、第1の結合タンパク質は、細菌毒素阻害剤である。一実施形態では、第2の結合タンパク質は、細菌毒素である。
一実施形態では、工程(B)は、タンパク質が互いに結合するような条件下で培養を行うことを更に含む。
一部の実施形態では、培養工程中に、第1の結合タンパク質を化学的に修飾してもよい。したがって、好適には、条件は、第1の結合タンパク質が化学的に修飾されるような条件である。
他の実施形態では、この方法は、タンパク質を回収し、続いて第1の結合タンパク質を化学的に修飾する工程を更に含む。好適には、こうした工程は、工程(b)の後だが工程(c)の前に行われる。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第2の機能性分子をコードする更なる核酸を更に含んでいてもよい。一部の実施形態では、これは、第2の核酸が、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする場合に生じてもよい。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾される。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(II)(a)第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸を含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されてもよく又はされなくてもよい。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(II)(b)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、第3の結合タンパク質に付着させるための機能性分子を、好適には工程(d)の後で、形成されたVLPに添加してもよい。その代わりに、第3の結合タンパク質に付着させるための機能性分子は、選択肢(II)(a)の第2の核酸にコードされていてもよく、好適には、第2の核酸は、機能性分子のみをコードしていてもよい。
したがって、一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(II)(a)機能性分子をコードする第2の核酸及び選択肢(II)(b)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする核酸を両方とも含んでいてもよい。
好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、核酸の各々からタンパク質が発現される条件下で培養される。
一実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾される。好適には、そのような実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(II)(a)を含んでいてもよく、第2の核酸は、機能性分子のみをコードしていてもよい。
一実施形態では、工程(c)は、各第1の結合タンパク質が、各第2の結合タンパク質に結合することを含む。代替的な実施形態では、工程(c)は、各第1の結合タンパク質が、好適には化学修飾を介して機能性分子に結合することを含む。一実施形態では、工程(c)は、これらの工程の両方を含む。
好適には、この方法は、好適には、存在する場合は第3の結合タンパク質との付着により、機能性分子をウイルス様粒子に付加する工程(d)を更に含んでいてもよい。
本発明の第11の態様によると、ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
(b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第2の結合タンパク質に任意選択で付着した機能性分子をコードする第2の核酸であり、第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第2の核酸、及び/又は
(ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸であり、第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第3の核酸
を含む、工程、
(c)それぞれ第1の核酸、第2の核酸、及び/又は第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(d)タンパク質を回収する工程、
(e)タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、培養ステップ中、第1の結合タンパク質を化学的に修飾することができる。したがって、好適には、第1の宿主細胞を培養するための条件は、第1の結合タンパク質が化学的に修飾されるような条件である。
他の実施形態では、この方法は、第1の結合タンパク質を化学的に修飾する工程を更に含んでいてもよい。好適には、この工程は、工程(d)の後だが工程(e)の前に行われる。
一実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾される。好適には、そのような実施形態では、第2の核酸は、機能性分子のみをコードしていてもよい。
一実施形態では、第2の核酸は、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されてもよく又はされなくてもよい。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第2の機能性分子をコードする核酸を更に含んでいてもよい。一部の実施形態では、これは、第2の核酸が、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする場合に生じてもよい。適切には、更なる核酸は、第1の宿主細胞又は更なる宿主細胞中のベクターに含まれてもよい。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾される。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(b)(i)第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸を含んでもよく、第2の結合タンパク質は細菌毒素である。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されてもよく又はされなくてもよい。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、選択肢(b)(ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸を含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、第3の結合タンパク質に付着させるための機能性分子を、好適には工程(e)の後で、形成されたVLPに添加してもよい。その代わりに、第3の結合タンパク質に付着させるための機能性分子は、第2の核酸にコードされていてもよい。好適には、そのような実施形態では、第2の核酸は、機能性分子のみをコードしていてもよい。
したがって、一部の実施形態では、任意の宿主細胞における1つ又は複数のベクターは、(b)(i)機能性分子をコードする第2の核酸及び(b)(ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸を両方とも含んでいてもよい。
好適には、第2の宿主細胞は、(b)(i)単独、又は(b)(i)及び(b)(ii)の核酸をコードする1つ又は複数のベクターを含んでいてもよい。
好適には、第3の宿主細胞は、(b)(ii)の核酸をコードする1つ又は複数のベクターを含んでいてもよい。
好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、核酸の各々からタンパク質が発現される条件下で培養される。
一実施形態では、工程(e)は、各第1の結合タンパク質が各第2の結合タンパク質に結合することを含む。代替的な実施形態では、工程(e)は、各第1の結合タンパク質が、好適には化学修飾を介して各機能性分子に結合することを含む。一実施形態では、工程(e)は、これらの工程の両方を含む。
一実施形態では、工程(e)は、タンパク質が互いに結合するような条件下で混合することを更に含む。
好適には、この方法は、好適には、存在する場合は第3の結合タンパク質との付着により、機能性分子をウイルス様粒子に付加する工程(f)を含んでいてもよい。
本発明の第12の態様によると、第1の態様又は第2の態様のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物が提供される。
本発明の第13の態様によると、医薬として使用するための、第1の態様若しくは第2の態様のウイルス様粒子(VLP)又は第11の態様の免疫原性組成物が提供される。
本発明の第14の態様によると、感染性疾患、心血管疾患、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、代謝性疾患、リウマチ性変性疾患、又は中毒の予防及び/又は治療に使用するための、第1の態様若しくは第2の態様のウイルス様粒子(VLP)又は第11の態様の免疫原性組成物が提供される。
本発明の第15の態様によると、研究又は疾患の診断における、第1の態様又は第2の態様のウイルス様粒子(VLP)の使用が提供される。
本発明の第16の態様によると、対象における疾患を診断するための方法であって、
(a)第1の態様又は第2の態様によるウイルス様粒子を準備する工程であり、機能性分子は、疾患原因物質に由来する抗原に対する抗体である、工程、
(b)ウイルス様粒子を、対象に由来する好適な試料と混合する工程、
(c)ウイルス様粒子が沈殿するか否かを検出する工程、
(d)VLPが沈殿した場合、疾患の存在を診断する工程
を含む方法が提供される。
有利なことには、本発明は、機能性分子をVLP殻に付着させるために、細菌毒素及び阻害剤タンパク質結合対の望ましい特徴を利用する新規なVLP構造を提供する。VLP設定におけるこのタイプのタンパク質結合対の使用は、本発明以前には試験されたことが全くなかった。本発明者らは、B型肝炎カプシドタンパク質と組み合わせて、細菌毒素及び阻害剤タンパク質結合対を使用すると、ほぼ全ての機能性分子を付着させることができる非常に安定なVLPがもたらされることを見出した。高親和性結合は、所与の分子がVLP殻に接続されるための条件を決定することなく、あらゆる機能性分子に適用することができる。更に、この系では、VLP殻タンパク質への直接融合としては行うことができなかった大型タンパク質全体であってもVLP殻に「貼り付ける」ことが可能になる。本発明者らは、VLPが形成された際に結合タンパク質が互いに背を向けて互いに干渉せず、したがってカプシド不安定性が回避されるように特定の方向に配置されるB型肝炎カプシドタンパク質及び毒素/阻害剤組合せを設計した。更に、B型肝炎ウイルスカプシドは、そのような融合に耐容性であり、構造を喪失しないことも見出された。また更に、B型肝炎カプシドタンパク質コアユニットは二量体であり、それにより、2つのB型肝炎カプシド単量体が各々、二量体機能性分子の単量体に付着することが可能になる。アセンブリ中に2つのB型肝炎カプシド単量体が一緒になると、VLPは、ある特定の重要なサイトカイン等の二量体機能性分子をそれらの天然形態で提示することができる。本発明者らは、VLP構造に遺伝的に融合させることがこれまで困難であったIL17等の二量体機能性分子をうまく提示させることに成功した。
本発明は、1つの宿主細胞内で生じる、VLPを産生するための新規方法を更に提供する。この方法は、現行のVLP産生方法よりも複雑性が著しく低減され、したがってコストが削減される。この方法により、薬物治療コストが大幅に削減され、VLPによる治療に対する患者アクセスが増加する可能性がある。本発明者らは、驚くべきことに、上記に記載の新規VLP構造が、そのような単一細胞法を可能にする生産上の利点も提供することを見出した。本発明者らは、VLPカプシドタンパク質を毒素タンパク質に融合させることにより、及び機能性分子をパートナー阻害剤タンパク質に融合させることにより、両融合タンパク質が細胞内で産生された際に、細菌毒素及び阻害剤対の結合が高親和性であるためVLPが単一細胞内で自発的にアセンブリされることになることを見出した。
更に、細菌毒素及び阻害剤対を使用すると、差次的電荷分布により、VLP殻上に均質な負表面電荷が作出されるという利点も得られる。これにより、産生中のVLP間の望ましくない凝集体や凝塊の形成が防止される。また更に、正荷電結合タンパク質(一般には毒素)と機能性分子との融合は、産生中に機能性分子の「シャペロン」としての役目も同時に果たす。これは、それ自体で産生された場合には、不溶性であるか又は更には宿主細胞に対して毒性であるかのいずれかであると考えられるある特定のタンパク質等の機能性分子は、多くの場合、細菌毒素との融合により毒性を喪失し及び/又は可溶性になることを意味する。これにより、多くの産生困難タンパク質の産生が容易になるため、この系の一般有用性が更に増加する。
驚くべきことに、加えて、本発明者らは、DEAE又はオクチルアミン等の化学物質を使用して、毒素阻害剤の化学修飾を生じさせることができ、それにより、毒素パートナーに対する毒素阻害剤結合に加えて及びそれとは独立して、更なる機能性分子をタンパク質結合対に付着させることが可能になることを発見した。この化学反応は、例えば、毒素融合タンパク質による装飾と並行して又はその代わりに、オクチルアミンに連結された蛍光色素等の小型化学物質を用いて、VLPを装飾するための第2の方法を可能にする。これは、ひいては、異なる機能を有していてもよい1つのタンパク質結合対に対して複数の機能性分子を付着させるという選択肢により、VLP構造に多大な柔軟性及び多用途性をもたらすことができる。
まとめると、本発明者らは、生物医学的応用のための単回放出薬物として任意のタイプの機能性分子を提示する複合VLPの迅速な製造を可能にし、「シャペロン」の非存在下では細菌等の細胞では産生できないと考えられる機能性分子のVLP連結の生成を可能にし、追加の化学架橋を使用することなく、及びVLP安定性を損なうことなく、二量体等の複雑な機能性分子の提示を可能にし、機能的に柔軟な安定VLPを可能にする新規VLP系及びそれを産生するための方法を作出した。
上記態様の特徴及び実施形態は、下記の見出しセクションで更に説明されている。任意の特徴又は実施形態を、任意の実行可能な組合せで任意の態様と組み合わせることができる。
本発明の種々の実施形態の製作及び使用については下記で詳細に説明されているが、本発明は、多種多様な特定の状況で実現することができる多数の応用可能な発明概念を提供することが理解されるべきである。本明細書で考察されている特定の実施形態は、本発明を製作及び使用するための特定の方法の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の理解を容易にするために、少なからぬ用語が下記で定義されている。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。「a」、「an」、及び「the」等の用語は、単一の実体のみを指すことを意図したものではなく、説明のためにその特定の例が使用される一般的なクラスを含む。本明細書における用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き、本発明を限定するものではない。
本明細書における本発明の背景に関する考察は、本発明の状況を説明するために含まれている。こうした考察は、参照されている資料のいずれかが、請求項のいずれかの優先日の時点で、いずれかの国において発表されていたか、公知であったか、又は一般常識の一部であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本発明は、別様の指示がない限り、当技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来技法を使用することになる。そのような技法は文献に詳しく説明されている。例えば、以下を参照されたい:Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel、2000年、Wiley and son Inc社、Library of Congress、USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrookら、2001年、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press社); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984年);米国特許第4,683,195号明細書; Nucleic Acid Hybridization (Harries及びHiggins編1984年); Transcription and Translation (Hames及びHiggins編1984年); Culture of Animal Cells (Freshney、Alan R. Liss, Inc.社、1987年); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press社、1986年); Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984年); the series, Methods in Enzymology (Abelson及びSimon編集長、Academic Press, Inc.社、New York)、特に154及び155巻(Wuら編)及び185巻、「Gene Expression Technology」(Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller及びCalos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer及びWalker編、Academic Press社、London、1987年); Handbook of Experimental Immunology、I～IV巻(Weir及びBlackwell編、1986年);並びにManipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986年)。
「同一性」及び「同一」等の用語は、2つのポリマー分子間、例えば2つのDNA分子間等の2つの核酸分子間、又は2つのタンパク質分子間の配列類似性を指す。配列アラインメント及び配列同一性の決定は、例えば、Tatusova及びMadden 1999年(FEMS Microbiol Lett 174巻: 247～250頁)に記載の「Blast 2 sequences」アルゴリズム等、Altschulら、1990年(J Mol Biol 215巻: 403～10頁)が初めて記載したBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を使用して行うことができる。
比較のために配列をアラインする方法は当技術分野で周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、以下の文献に記載されている:例えば、Smith及びWaterman (1981年) Adv. Appl. Math. 2巻:482頁; Needleman及びWunsch (1970年) J. Mol. Biol. 48巻:443頁; Pearson及びLipman (1988年) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85巻:2444頁; Higgins及びSharp (1988年) Gene 73巻:237～44頁; Higgins及びSharp (1989年) CABIOS 5巻:151～3頁; Corpetら(1988年) Nucleic Acids Res. 16巻:10881～90頁; Huangら(1992年) Comp. Appl. Biosci. 8巻:155～65頁; Pearsonら(1994年) Methods Mol. Biol. 24巻:307～31頁; Tatianaら(1999年) FEMS Microbiol. Lett. 174巻:247～50頁。配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考慮は、例えば、Altschulら(1990年) J. Mol. Biol. 215巻:403～10頁に見出すことができる。
国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST(商標);Altschulら(1990年))は、幾つかの配列分析プログラムと併せて使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター(ベセスダ、メリーランド州)を含む幾つかの供給源から及びインターネットで入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のBLAST(商標)の「ヘルプ」セクションで入手可能である。核酸配列の比較には、BLAST(商標)(Blastn)プログラムの「BLAST 2 sequences」機能を初期設定のパラメーターを用いて使用することができる。参照配列との類似性が更により高い核酸配列は、この方法で評価すると同一性パーセンテージの増加を示すことになる。典型的には、配列同一性パーセンテージは、配列の長さ全体にわたって計算される。
例えば、以下のスコア付けパラメーター:一致スコア:+2、不一致スコア:-3、ギャップペナルティ:ギャップオープン5、ギャップエクステンション2を用いて、Needleman-Wunschアルゴリズムにより、グローバル最適アライメントを好適に見出すことができる。得られた最適グローバルアラインメントの同一性パーセンテージは、アラインメントの完全長に対するアラインメントされた塩基の数の比に100を乗じることにより好適に計算され、アラインメント長は一致及び不一致の両方を含む。
「ベクター」という用語は当技術分野で周知であり、本明細書で使用される場合、本発明による核酸配列がそれに挿入されていてもよい核酸分子、例えば、二本鎖DNAを指す。ベクターは、挿入核酸分子を好適な宿主細胞へと輸送するために好適に使用される。ベクターは、典型的には、挿入核酸分子の転写、及び好ましくは転写物のポリペプチドへの翻訳を可能にする必要なエレメントを全て含む。ベクターは、典型的には、必要なエレメントを全て含んでおり、ベクターが宿主細胞に入ると、宿主染色体DNAとは独立して、又は宿主染色体DNAと同時に自己複製することができ、ベクター及びその挿入核酸分子の幾つかのコピーを生成することができる。
「作動可能に連結した」、「作動可能に接続された」という用語、又は同等の表現は、本明細書で使用される場合、エレメントが機能的に接続され、意図された様式で互いに相互作用できるような、種々の核酸エレメントの互いに対する配置を指す。
「療法」、「療法上の」、「治療」、又は「治療すること」は、疾患又は状態の1つ又は複数の兆候、症状、又は影響を低減、改善、又は排除することを指す。したがって、本明細書で使用される「治療」又は「療法」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、(a)疾患の素因があるか又は疾患を罹患するリスクがあるが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、(b)疾患を阻害すること、つまり疾患の発症を阻止すること、及び(c)疾患を軽減すること、つまり疾患の退行を引き起こすことを含む。
対象への作用剤の「投与」は、その意図された機能を発揮させるために作用剤を対象に導入又は送達するための任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、眼内、眼科的、非経口(血管内、筋肉内、腹腔内、又は皮下)、又は局所を含む、任意の好適な経路により実施することができる。投与は、自己による投与及び他者による投与を含む。
「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、同義的に使用され、療法を必要とする、好適には本発明による治療による療法を必要とする疾患又は状態を有する任意の個々の対象を指す。本開示の目的では、対象は、ヒト又は動物、例えば、霊長類、好ましくはヒト、又はイヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヤギ、若しくはウシ等の別の哺乳動物であってもよい。
本発明は、以下の図を参照して説明することができる。
(A)富化された純粋なVLPによるクロマトグラフィー画分を示す図である。(B)HBc VLP殻を、Im7ドメインと融合させることができ、次いで精製することができ、それが予想されるサイズの安定したVLPであることを示すVLPの電子顕微鏡画像を示す図である。 (A)原核細胞の例示的なプラスミドダイヤグラムを示す図である。(B)真核細胞の例示的なプラスミドダイヤグラムを示す図である。(C)それぞれT7プロモーター及びtetRプロモーターによる、VLP骨格対機能性分子(IL-33サイトカイン)の独立した誘導のための例示的なプラスミドダイヤグラムを示す図である。 3つの異なるクローンから大腸菌で発現させた候補HBc-Im7及びcolE7-IL13タンパク質のSDS-PAGEを示す図である。この図は、著しい量の両タンパク質が可溶性であり、天然タンパク質フォールディングを取っていることを示している。 (A)親HBc VLPのDEAE陰イオン交換クロマトグラフィー、(B)HBc-Im7融合VLPのDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーから単離及び精製されたタンパク質のSDS-PAGEを示す図である。HBc-Im7の溶出プロファイルが著しく変化し、親和性クロマトグラフィーにおいて典型的に遭遇するものと類似することを示している。 Hbc-Im7融合VLPのマルチモーダル疎水性/弱陰イオン交換クロマトグラフィーから単離及び精製されたタンパク質のSDS-PAGEを示す図である。この図は、HBc-Im7が固定相に不可逆的に結合することを示している。 混合モードサイズ排除クロマトグラフィー(カットオフ700kD)に供したDEAE部分精製HBc-Im7 VLPのフロースルー画分のSDS-PAGEを示す図である。この図は、タンパク質がインタクトVLPの形態で溶出することを示唆し、2段階精製により、高純度VLP画分が得られることを示している。 HBc-Im7 VLPと比較した親HBcカプシドVLPの透過型電子顕微鏡画像(スケールバー:30nM)を示す図である。この図は、親カプシドと比較してHBc-Im7粒子の高電子密度縁部のサイズの著しい増加を示している。 HBc-Im7 VLPと比較した親HBcカプシドVLPの縁部幅及び直径の定量的比較を示す図である。この図は、HBc-Im7 VLPは、全体的直径のわずかな増加を示すが、縁部のサイズは著しく増加したことを示している。これは、HBcカプシドタンパク質上にIm7タンパク質の層が付加されたことと一致する。 HBc VLP及びHBC-Im7 VLPのサイズ分布のヒストグラムをそれぞれ示す図である。この図は、HBc VLPは予想サイズで均一なサイズ分布を示し、HBcIm7 VLPはわずかではあるが統計的に有意に増加したサイズを示している(28.3±3.3対27.3±2.5nm、p=0.009)。 HBc-Im7 VLPによるワクチン接種後の様々な時点での、老齢マウス(研究開始時に15月齢)における血清抗Hbc-Im7抗体の存在に関するELISA分析を示す図である。 大腸菌で発現させたHBc-Im7 VLP殻のサイトゾル画分(レーン1)及びColE7-IL33融合物(レーン2);両タンパク質融合物を含むサイトゾル画分(レーン3)、CaptoCore700レジンでの混合モードサイズ排除クロマトグラフィー後のフロースルーとして精製されたVLP画分(レーン5～7)のSDS-PAGEを示す図である。 HEK293T細胞にて分泌タンパク質として発現させたColE7-RBD-GFP融合物の細胞上清(レーン1)、及び大腸菌にて発現させ部分的に精製されたHBc-Im7 VLP殻の細胞上清(レーン2);画分を混合することによりVLPをColE7-RBD-GFPにカップリングし、続いて混合モードサイズ排除クロマトグラフィー(CaptoCore700)で非VLPタンパク質を除去したもの(レーン3)のSDS-PAGEを示す図である。 オクチルアミン誘導体化ローダミンとのインキュベーション前(左側)及びインキュベーション後(右側)の、親HBc VLP(明陰影)と比較したHBc-Im7 VLP(暗陰影)の蛍光を示す図である。 本発明のVLPの一部の実施形態の模式的ダイヤグラムを示す図である。(A)機能性分子が抗原である、第1の態様のVLP。(B)機能性分子が抗体である、第3の結合タンパク質を含む第1の態様の実施形態のVLP。(C)機能性分子が非タンパク質抗原である、第2の態様のVLP。実施形態(C)は、ここには示されていないが他所に記載されている実施形態(A)又は(B)と組み合わせることもできることに留意されたい。 HBc主要イムノドミナント領域に組み込まれたIm7を有するVLPの生物物理学的沈降特性を、野生型VLPと比較して示す、スクロース密度勾配超遠心分離後のSDS-PAGE分析を示す図である。 スクロース密度勾配超遠心分離後の非還元アガロースゲル電気泳動(NAGE)を示す図である。この図は、T3構成VLP及びT4構成VLPの分布が同様であること並びにHBc-Im7 VLP及び野生型HBc VLPにおけるRNA含有量が同様であることを示している。 主要イムノドミナント領域(MIR)へのIm7の組込みにより、野生型B型肝炎ウイルスコア抗原に対する交差反応性が消失したことが確認される免疫ドットブロットを示す図である。 VLPの形状及びサイズを決定するための、野生型及びHBc-Im7 VLP(スクロース勾配遠心分離により精製)のTEM分析及びDLS分析を示す図である。 VLPの縁部厚を決定するための、野生型及びHBc-Im7 VLP(スクロース勾配遠心分離により精製)のTEM分析を示す図である。 ColE7-IL33で装飾されたHBc-Im7からなるVLPのスクロース密度勾配超遠心分離後のSDS-PAGE分析を示す図である。 IL-33装飾HBc-Im7 VLP及び野生型HBc VLPのスクロース密度勾配超遠心分離画分の非還元アガロースゲル電気泳動(NAGE)を示す図である。 パネルAは、Im7インサートを有するVLPの縁部が肥厚したことを示すHBc、HBc-Im7、及びHBc-Im7-IL33 VLPのTEM画像を示す図である。パネルBは、TEMにより決定されたHBc-Im7-IL33 VLPの直径の棒グラフ、及びIL-33装飾VLPのサイズ増加を示すDLSグラフを示す図である。 IL33の立体構造エピトープに対して生じた抗体を検出することにより、HBC-lm7 VLPの表面に付着したIL33の天然タンパク質フォールディング(並びにHBc野生型VLPに対する交差反応性の欠如)を確認する免疫ドットブロットを示す図である。 グラフA~Cは、CuMV由来VLP(灰色)と比較した、IL33装飾HBc-Im7でワクチン接種したマウスにおけるIL33装飾HBC-Im7 VLP(黒色)の免疫原性を示す。 Im7は、lm7装飾VLPの単一段階親和性精製を可能にする新規化学を有することを示す図である。パネルAの上段及び下段は、DEAE CimMultusモノリスカラムによる溶出画分のSDS PAGE分析を示し、パネルBは、Qa CimMultusモノリスカラムによる溶出画分のSDS PAGE分析を示し、パネルCは、HBc-Im7のDEAEカラム精製による1M NaCl画分のTEM画像、及びDEAE結合又はQ結合の機序の模式図を示す。 ColE7-Im7相互作用が装飾VLPの解離-再アセンブリ精製を可能にすることを示すSDS-PAGE分析ゲルを示す図である。(A)尿素媒介性VLPカプシド解体後の、又は事前にカプシド解体しない場合の(「con」と印を付けた)、IMACによる親和性精製後のSDS PAGE。尿素による処理は、HBc-Im7(灰色矢印)及びColE7-IL33(白色矢印)の結合を保存するが、非解体VLPは、HBc-Im7のC末端のヒスチジンタグが接近可能でないため、Niレジンに結合することができないことを示す。(B)CaptoCore700(Cc700)レジンによる修飾サイズ排除クロマトグラフィー後のSDS PAGEは、解体されたVLPが大きな粒子へと再アセンブリし、Cc700マトリックスを妨げられずに流れることを示す。HBc-Im7及びColE7-IL33の量は化学量論的に等しく、それにより、サイトカインによるVLP装飾は完全であることが示される。 コリシンE7を使用してタンパク質をVLPの表面に融合させると、同時にシャペロン機能がもたらされ、それ自体では大腸菌中で可溶性ではないタンパク質の天然タンパク質フォールディングが可能になることを示す図である。パネルAは、不溶性ペレットと比べた、大腸菌ライセート(左側)及びサイトゾル内の画分のSDS-PAGEを示す。このパネルは、ColE7に融合された状態で発現されると、サイトゾル内に著しい量のIL17が存在することを示す。パネルBは、ColE7-IL17及びColE7-IL33の両方のIm7-アガロースとの相互作用による精製、それに続くTEVプロテアーゼによる融合コリシンE7の切断を示し、その下の模式図は、融合タンパク質の配置を示す。パネル(C)は、IL-17又はIL-33のいずれかに対するヒトIL17RAタンパク質を使用した受容体結合ELISAの結果を示し、その受容体と高親和性で選択的に結合するIL17は天然フォールディングを取っているが、IL33はそうでないことが確認される。 単一細胞内でのVLP骨格及びエピトープタンパク質の独立した連続的誘導により、まずVLPの形成、続いてエピトープのアセンブリが可能になることを示す図である。パネルAは、誘導系を説明する模式的ダイヤグラムであり、プラスミドは、AmpR遺伝子の下流のリボソーム結合部位により駆動され構成的に発現されるtetRタンパク質を有する。これにより、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)の添加によるエピトープタンパク質の選択的誘導が可能になるが(ここではC7-IL17について示されている)、VLP骨格(HBc-Im7)は、IPTGにより別々に誘導することができる。パネルB及びパネルCは、各サイトカイン(IL33及びIL17)の3つの独立したクローンのSDS-PAGEゲルを示し、いかなるリークもなく非常に厳密に調節されていることがわかる。パネルDは、IPTGで既に誘発された大腸菌におけるIL17のaTc誘導の時間経過のSDS-PAGEゲルを示す。 バルスターをHBcに組み込んでVLPを形成することができることを示す図である。パネルAは、HBc-バルスターVLPのスクロース密度勾配遠心分離後のSDS-PAGEゲルを示す。パネルBは、粒子が34nmサイズのピークを示すことを強調するDLS分析を示す。パネルCは、TEMで分析した場合、粒子は縁部の肥厚を呈することを示す。 バルナーゼ-バルスター相互作用が装飾VLPの解離-再アセンブリ精製を可能にすることを示すSDS-PAGEゲルを示す図である。IMACによる親和性精製後のSDS PAGE、及びCaptoCore700(Cc700)レジンによる修飾サイズ排除クロマトグラフィー後のSDS PAGEが同じゲルに示されている。
結合タンパク質の対
本発明は、VLP殻を形成するウイルスカプシドタンパク質に、目的の作用剤、典型的には抗原を付着させることができる架橋を形成するために結合タンパク質の対を利用するVLPに関する。
結合タンパク質の対は、共有結合で結合されていてもよく又は非共有結合で結合されていてもよい。
好適には、結合タンパク質の対は、非共有結合で結合されている。好適には、結合タンパク質の対は、準共有結合で結合されている。好適には、結合タンパク質の対は、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用等の任意の非共有結合型の結合により結合されている。しかしながら、一部の実施形態では、結合タンパク質の対は、疎水性結合では結合されていない。
その代わりに、結合タンパク質の対は、共有結合で結合されていてもよい。好適には、結合タンパク質の対は、任意の共有結合型の結合により結合されていてもよい。
好適には、結合タンパク質の対は、1つの正味正荷電タンパク質及び1つの正味負荷電タンパク質を含む。好適には、第1の結合タンパク質は、正味負電荷を含む。好適には、第2の結合タンパク質は、正味正電荷を含む。
有利には、正味負電荷を有する第1の結合タンパク質は、VLPの安定性を増加させ、凝集又は凝塊を低減させる。
したがって、一実施形態では、結合タンパク質の対は、静電相互作用により非共有結合で結合されている。
好適には、いずれの場合でも、結合タンパク質の対は、高親和性で結合している。好適には、結合タンパク質の対は、フェムトモルからピコモルの範囲のKdで、好適には、10fM～10pM、10fM～1pM、10fM～0.1pM、10fM～0.01pM、1fM～1pM、1fM～0.1pM、1fM～0.01pMのKdで結合している。
有利には、タンパク質間の高親和性結合は、VLPがより安定であることを意味する。
好適には、結合タンパク質の対は、VLPで治療することができる対象のタンパク質に対して低相同性を有する。好適には、結合タンパク質の対は、ヒトタンパク質に対して低相同性を有する。好適には、結合タンパク質の対は、任意のヒトタンパク質の三次構造と低相同性を有する。
有利には、ヒトタンパク質との相同性が低いことは、結合タンパク質自体がオフターゲット免疫反応を刺激する可能性が低いことを意味する。
好適には、結合タンパク質の対は、いかなるジスルフィド結合も含んでいない。
好適には、結合タンパク質の対は、グリコシル化されていない。
好適には、結合タンパク質の対のタンパク質の各々は、サイズが比較的小さい。好適には、結合タンパク質の対のタンパク質の各々は、比較的短い配列長を含む。好適には、結合タンパク質の対のタンパク質の各々は、84～134個アミノ酸の長さを含む。好適には、結合タンパク質の対のタンパク質の各々は、135個アミノ酸未満の長さを含む。
有利には、ジスルフィド結合の欠如、グリコシル化の欠如、及びサイズが小さいことは、結合タンパク質を、大腸菌等の細菌細胞で産生させ易いことを意味する。
好適には、結合タンパク質の対は、細菌毒素及びその対応する阻害剤又は抗毒素を含む。好適には、VLPの第1の結合タンパク質は、細菌毒素阻害剤である。好適には、VLPの第2の結合タンパク質(存在する場合)は、細菌毒素である。
好適な細菌毒素及び阻害剤対は、コリシン及びコリシン免疫タンパク質である。好適には、ColE7及びIm7、ColE8及びIm8、ColE9及びIm9、ColE2及びIm2、又はバルナーゼ及びバルスターである。好適には、細菌毒素及び阻害剤対は、細菌ヌクレアーゼ及びその阻害剤を含む。好適には、第1の結合タンパク質は阻害剤であり、第2の結合タンパク質は細菌ヌクレアーゼである。好適な細菌ヌクレアーゼ及び阻害剤対は、ColE7/Im7及びバルナーゼ/バルスターである。
一実施形態では、結合タンパク質の対は、ColE7及びIm7であり、第1の結合タンパク質はIm7であり、第2の結合タンパク質はColE7である。
一実施形態では、結合タンパク質の対はバルナーゼ及びバルスターであり、第1の結合タンパク質はバルスターであり、第2の結合タンパク質はバルナーゼである。
好適には、第1の結合タンパク質又は第2の結合タンパク質は、野生型タンパク質であってもよく、又は修飾されていてもよい。好適には、第1の結合タンパク質又は第2の結合タンパク質は、本発明のVLPの状況では、結合タンパク質としての機能を向上させるために修飾されていてもよい。好適な修飾としては、タンパク質をコードするアミノ酸配列における挿入、欠失、置換、短縮、反転、又は反復等を挙げることができる。
好適には、VLP投与が意図されている宿主細胞及び/又はレシピエント生物のいずれかに対して有害な毒素(第2の結合タンパク質)の任意の特性は、標的化修飾により中和されている。
好適には、第1の結合タンパク質又は第2の結合タンパク質は、1つ又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。好適には、アミノ酸置換は、第1の結合タンパク質と第2の結合タンパク質との間の結合親和性を増加させることができる。好適には、アミノ酸置換は、第1の結合タンパク質及び/又は第2の結合タンパク質から望ましくないジスルフィド結合を除去することができる。
好適には、第1の結合タンパク質は、1つ又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。
第1の結合タンパク質がバルスターである一実施形態では、好適には、バルスターのアミノ酸配列は、以下の置換:C40A、C82A、及びI87Eのうちの1つ又は複数を含む。好適には、バルスターのアミノ酸配列は、以下の置換:C40A、C82A、及びI87Eの全てを含んでいてもよい。好適には、バルスターのアミノ酸配列は、KKAVINGEQIRSISDLHQTLKKELALPEYYGENLDALWDALTGWVEYPLVLEWRQFEQSKQLTENGAESVLQVFREAKAEGADITIELS(配列番号36)を含む。
第1の結合タンパク質がIm7である一実施形態では、好適には、Im7のアミノ酸配列は、以下の置換:F41Lを含む。好適には、Im7のアミノ酸配列は、ELKNSISDYTEAEFVQLLKEIEKENVAATDDVLDVLLEHFVKITEHPDGTDLIYYPSDNRDDSPEGIVKEIKEWRAANGKPGFKQ(配列番号37)を含む。
好適には、第2の結合タンパク質は、1つ又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。好適には、第2の結合タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、第2の結合タンパク質の負電荷を増加させることができる。
第2の結合タンパク質がバルナーゼである一実施形態では、好適には、バルナーゼのアミノ酸配列は以下の置換:E73Wを含む。好適には、バルナーゼのアミノ酸配列は、AQVINTFDGVADYLQTYHKLPDNYITKSEAQALGWVASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKSGRTWRWADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIR(配列番号38)を含む。
第2の結合タンパク質がColE7である実施形態では、好適には、ColE7のアミノ酸配列は、以下の置換:Arg538Ala、Glu542Ala、及びHis569Alaのうちの1つ又は複数を含む。好適には、ColE7のアミノ酸配列は、以下の置換:Arg538Ala、Glu542Ala、及びHis569Alaの全てを含んでいてもよい。好適には、ColE7のアミノ酸配列は、ESKRNKPGKATGKGKPVNNKWLNNAGKDLGSPVPDRIANKLRDKEFKSFDDFRKKFWEEVSKDPELSKQFSRNNNDRMKVGKAPKTRTQDVSGKATSFALHHEKPISQNGGVYDMDNISVVTPKRAIDIHRGKS(配列番号39)を含む。
好適には、第1の結合タンパク質又は第2の結合タンパク質は、短縮されていてもよい。
好適には、第2の結合タンパク質は、短縮されていてもよい。
第2の結合タンパク質がColE7である実施形態では、好適には、ColE7タンパク質の全体又は一部を第2の結合タンパク質として使用することができる。好適には、ColE7タンパク質の一部のみが第2の結合タンパク質として使用される。好適には、ColE7タンパク質は、好適には、ColE7の触媒ドメインのみを含むように短縮されている。好適には、第2の結合タンパク質は、ColE7の触媒ドメインを含む。
第2の結合タンパク質がバルナーゼである一実施形態では、好適には、バルナーゼタンパク質の全体又は一部を第2の結合タンパク質として使用することができる。好適には、バルナーゼタンパク質の一部のみが第2の結合タンパク質として使用される。好適には、バルナーゼタンパク質は、バルナーゼの触媒ドメインのみを含むように、短縮されている。好適には、第2の結合タンパク質は、バルナーゼの触媒ドメインを含む。
本発明の第3の態様によると、結合タンパク質に融合されたウイルスカプシドタンパク質を含むカプシド融合タンパク質であって、結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、カプシド融合タンパク質が提供される。
好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎ウイルスカプシドタンパク質(HBc)であってもよい。
好適には、結合タンパク質は、HBcについて本明細書の他所で説明されているように、ウイルスカプシドタンパク質のイムノドミナント領域に融合されている。
好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、14、又は15による配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、14、又は15と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、14、又は15による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、カプシド融合タンパク質は、結合タンパク質Im7に融合されたB型肝炎ウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような実施形態では、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、又は14による配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、又は14と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号12、13、又は14による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、カプシド融合タンパク質は、結合タンパク質バルスターに融合されたB型肝炎ウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような実施形態では、カプシド融合タンパク質は、配列番号15による配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号15と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、カプシド融合タンパク質は、配列番号15による配列からなっていてもよい。
好適には、結合タンパク質は、化学修飾を含んでいてもよい。
本発明の第4の態様によると、結合タンパク質に融合された機能性分子を含む機能性融合タンパク質であって、結合タンパク質は細菌毒素である、機能性融合タンパク質が提供される。
好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号16、17、18、19、21、又は46による配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号16、17、18、19、21、又は46と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号16、17、18、19、21、又は46による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、結合タンパク質ColE7に融合されたIL13を含んでいてもよい。そのような実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号16又は17による配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号16又は17と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号16又は17による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、結合タンパク質ColE7に融合されたIL33を含んでいてもよい。そのような実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号18又は19による配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号18又は19と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号18又は19による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、結合タンパク質バルナーゼに融合されたIL13を含んでいてもよい。そのような実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号21による配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号21と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号21による配列からなっていてもよい。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、結合タンパク質ColE7に融合されたIL17を含んでいてもよい。そのような実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号46による配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号46と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号46による配列からなっていてもよい。
その代わりに、更なる結合タンパク質に融合された第1の結合タンパク質を含む機能性融合タンパク質であって、第1の結合タンパク質は細菌毒素であり、更なる結合タンパク質は、抗原結合タンパク質である機能性分子を捕捉することができる、機能性融合タンパク質が提供される。
好適には、更なる結合タンパク質は、機能性分子に結合することが可能である。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、抗体等の抗原結合タンパク質である。好適には、更なる結合タンパク質は、本明細書の他所に記載のような第3の結合タンパク質である。好適には、更なる結合タンパク質は、プロテインGである。
一実施形態では、機能性融合タンパク質は、配列番号20による配列を含む。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号20と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性融合タンパク質は、配列番号20による配列からなっていてもよい。
好適には、融合タンパク質の各々は、1つ又は複数のリンカーを含む。好適には、リンカーは、タンパク質コード配列間に位置する。好適には、リンカーは、ウイルスカプシドタンパク質との好適な連結のために、結合タンパク質のN末端及びC末端に位置する。好適には、リンカーは、機能性分子と結合タンパク質との間に位置する。好適には、リンカーは、結合タンパク質と更なる結合タンパク質との間に位置する。好適には、各リンカーは、5～50アミノ酸長である。好適には、各リンカーは、5、10、15、20、21、25、30、35、40アミノ酸長である。好適には、各リンカーは、9、10、又は11アミノ酸長である。好適には、各リンカーは、配列:GGGGSGGGGS(配列番号33)又はGGGGGSGGGGS(配列番号34)又はSGGGSSGSG(配列番号35)を含む。
好適には、第1の結合タンパク質は、追加の修飾を含んでいてもよい。好適には、第1の結合タンパク質は、化学修飾を含んでいてもよい。好適には、Im7は、化学修飾を含んでいてもよい。
好適には、化学修飾は、機能性分子に結合することが可能である。好適には、化学修飾は、機能性分子に共有結合で結合することが可能である。一例では、化学修飾に結合される機能性分子は、蛍光分子であってもよい。他の好適な機能性分子は、本明細書の他所に記載されている。
好適には、化学物質は、非共有結合により第1の結合タンパク質に付着する。好適には、化学物質は、静電結合及び/又は疎水性結合により第1の結合タンパク質に付着する。
好適な化学修飾としては、アミン基を有するアルカンが挙げられる。好適には、アルカンは、任意の鎖長を有してもよい。好適には、アルカンは、低級アルカンである。好適には、アルカンは、1～10個の炭素の鎖長を有してもよい。好適には、アルカンは、4～8個の炭素の鎖長を有してもよい。好適には、アルカンは、分岐していてもよい。
好適には、炭素鎖の長さ及びアミン基にある分岐置換の長さは、所望の応用に応じて、タンパク質への不可逆的付着又は可逆的付着のいずれかを可能にするように選択される。一実施形態では、化学物質は、第1の結合タンパク質に不可逆的に付着する。好適には、不可逆的付着を付与するそのような実施形態では、アルカンは、8個の炭素原子及び末端窒素を有する(オクチルアミン)。別の実施形態では、化学物質は、第1の結合タンパク質に可逆的に付着する。好適には、可逆的付着を可能にするそのような実施形態では、アルカンは、分岐構造中に4個の炭素原子を有する(ジエチルエタノールアミン)。
好適には、第1の結合タンパク質は、1つ又は複数の部位、好適には1つ又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されていてもよい。好適には、第1の結合タンパク質は、1つのアミノ酸が化学的に修飾されている。
一実施形態では、第1の結合タンパク質は、DEAEで化学的に修飾されている。
一実施形態では、第1の結合タンパク質は、オクチルアミンで化学的に修飾されている。
好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、Im7であってもよい。
好適には、DEAEによる修飾は、第1の結合タンパク質の精製、好適にはクロマトグラフィーによる精製を可能にする。
好適には、オクチルアミンによる修飾は、第1の結合タンパク質と機能性分子との直接結合を可能にする。
一実施形態では、結合タンパク質の化学修飾は、宿主細胞内で、好適には翻訳後修飾により生じる。別の実施形態では、結合タンパク質の化学修飾は、宿主細胞の外部で、好適には、化学反応により、好適には、非酵素的に触媒される非共有結合的付着により生じる。
ウイルスカプシドタンパク質
本発明は、1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質を含むVLPであって、ウイルスカプシドタンパク質はVLP殻へと自己アセンブリし、次いでVLP殻には、上記で考察されているタンパク質結合対及び/又は化学的修飾を使用して機能性分子を付着させることができる、VLPに関する。
第1の態様によると、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎ウイルスカプシドタンパク質(HBc)である。
第2の態様によると、ウイルスカプシドタンパク質は、任意の好適なウイルスカプシドタンパク質、例えば、B型肝炎ウイルスカプシドタンパク質、C型肝炎カプシドタンパク質、HPVカプシドタンパク質、AAVカプシドタンパク質、HIVカプシドタンパク質、インフルエンザカプシドタンパク質、ニューカッスル病ウイルスカプシドタンパク質、ニパウイルスカプシドタンパク質から選択することができる。
上記態様のいずれかの一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、二量体ウイルスカプシドタンパク質である。
上記態様のいずれかの一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎ウイルスカプシドタンパク質である。
好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質に付着されている。したがって、好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質を提示する。
好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質を提示するように修飾されている。好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質に融合されている。好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質をウイルスカプシドタンパク質に融合させることにより、第1の結合タンパク質を提示するように修飾されている。好適には、各ウイルスカプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質をウイルスカプシドタンパク質に挿入することにより、第1の結合タンパク質を提示するように修飾されている。好適には、第1の結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域に挿入されている。好適には、第1の結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域に融合されている。好適には、第1の結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域のアミノ酸残基76～80に挿入されている。好適には、第1の結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域のアミノ酸残基77～79に挿入されている。好適には、第1の結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域のアミノ酸残基77～78に挿入されている。
好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、更なる修飾を含んでいてもよい。好適な修飾としては、タンパク質をコードするアミノ酸配列における挿入、欠失、置換、短縮、反転、又は反復等を挙げることができる。好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、主要イムノドミナント領域に更なる修飾を含んでいてもよい。好適には、そのような修飾は、ウイルスカプシドタンパク質への第1の結合タンパク質の挿入を支援する。好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、アミノ酸欠失を含んでいてもよい。好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、主要イムノドミナント領域にアミノ酸欠失を含んでいてもよい。好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、主要イムノドミナント領域に、負荷電アミノ酸を除去するアミノ酸欠失を含んでいてもよい。
一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎カプシドタンパク質であり、以下のアミノ酸欠失:E77及びD78を含む。好適には、HBcのアミノ酸配列は、MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNL[X]PASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV(配列番号40)を含み、配列中、[X]は、好適には第1の結合タンパク質をコードするアミノ酸配列の挿入、好適にはアミノ酸挿入の位置を示す。
一実施形態では、ウイルスカプシドタンパク質は、その主要イムノドミナント領域内の残基76～80の間に挿入された第1の結合タンパク質を含み、更に以下のアミノ酸欠失:E77及びD78を含む、B型肝炎カプシドタンパク質である。
機能性分子
本発明は、タンパク質結合対のおかげで又は第1の結合タンパク質に対する化学修飾のおかげで、それらの表面上に種々の機能性分子を提示することができるVLPに関する。
好適には、結合タンパク質の各対は、少なくとも1つの機能性分子に付着している。好適には、結合タンパク質の各対は、1つよりも多くの機能性分子に付着していてもよい。好適には、機能性分子は、同じタイプであってもよく又は異なるタイプであってもよい。例えば、結合タンパク質の各対は、1つ又は複数の抗原、抗原結合タンパク質、又は蛍光分子の任意の組合せに付着していてもよい。
好適には、結合タンパク質の各対は、1つの機能性分子に付着している。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、第1の態様による第2の結合タンパク質に付着していてもよく、又は存在する場合には第3の結合タンパク質に付着していてもよい。
好適には、各化学修飾は、1つの機能性分子に付着している。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、第2の態様による化学修飾を介して第1の結合タンパク質に付着している。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、非タンパク質抗原若しくはそのエピトープ又は蛍光分子である。
好適には、一部の実施形態では、結合タンパク質の対1つ当たり1つよりも多くの機能性分子が存在してもよい。好適には、第1の機能性分子は、化学修飾を介して第1の結合タンパク質に付着していてもよく、好適には、第2の機能分子は、第2の結合タンパク質、又は存在する場合には第3の結合タンパク質に付着していてもよい。
その代わりに、第1の機能性分子及び第2の機能性分子は、第2の結合タンパク質に付着していてもよい。任意選択で、加えて、第3の機能性分子は、化学修飾を介して第1の結合タンパク質に付着していてもよい。
好適な機能性分子としては、
タンパク質又は非タンパク質抗原、
抗体又はその結合性断片、抗体模倣物、及びアプタマー等の抗原結合タンパク質、
蛍光分子
を挙げることができる。
好適な抗原としては、抗原の全体又は一部を挙げることができる。好適には、抗原は、抗原のサブユニット又は単量体であってもよい。好適には、機能性分子は、抗原のエピトープであってもよい。好適には、抗原を機能性分子として使用すると、抗原に対する免疫応答を刺激することが可能なVLPが産生される。好適には、これは、ワクチンとして有用である。
好適には、抗原は、タンパク質抗原であってもよく又は非タンパク質抗原であってもよい。好適な非タンパク質抗原としては、糖、脂質、若しくは炭水化物、或いはそれらに対する免疫応答が所望であるか、又はニコチン、コカイン、若しくは他の外因性毒素等の検出が必要である小分子化学物質を挙げることができる。
好適には、抗原は、VLPで治療することが意図されている対象に対して自己抗原又は非自己抗原であってもよい。好適には、抗原は、ヒト抗原であってもよく又は非ヒト抗原であってもよい。
好適には、抗原は、疾患又は障害の原因物質に由来してもよい。好適には、原因物質は、自己性であってもよく又は非自己性であってもよい。
好適には、非自己性原因物質は、感染性因子であってもよい。したがって、好適には、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、古細菌等の感染性因子に由来してもよい。
好適には、抗原は、以下のものから選択されるウイルスに由来してもよい:アデノ随伴ウイルス、チクングニヤウイルス、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ハンタンウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトRSウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトトロウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、インフルエンザC型ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、おたふくかぜウイルス、ニパウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスA、サッポロウイルス、シンドビスウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス。
好適には、抗原は、以下のものから選択される細菌に由来してもよい:アクチノミセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バルトネラ・ヘンセラ(Bartonella henselae)、バルトネラ・キンタナ(Bartonella quintana)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・パータシス(Bordetella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボレリア・ガリニ(Borrelia garinii)、ボレリア・アフゼリ(Borrelia afzelii)、回帰熱ボレリア(Borrelia recurrentis)、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマーティス(Chlamydia trachomatis)、クラミドフィラ・シタッシ(Chlamydophila psittaci)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、大腸菌(Escherichia coli)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、レプトスピラ・サンタロサイ(Leptospira santarosai)、レプトスピラ・ウェイリイ(Leptospira weilii)、レプトスピラ・ノグチイ(Leptospira noguchii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプレ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、リケッチア・リケッチア(Rickettsia rickettsia)、サルモネラ・エンテリカ(Rickettsia rickettsia)亜種エンテリカ(enterica)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、シゲラ・ディゼンテリエ(Shigella dysenteriae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミデス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ヴィリダンス型連鎖球菌(Streptococcus viridans)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)。
一実施形態では、抗原は、コロナウイルスに、好適にはSARS-CoV-2に由来する。好適には、抗原は、SARS-CoV-2由来のスパイクタンパク質の全体若しくは一部、又はSARS-CoV-2由来のヌクレオカプシドタンパク質の全体若しくは一部である。
したがって、一実施形態では、機能性分子は、SARS-CoV-2に由来するスパイクタンパク質の一部、好適には受容体結合ドメインである。
したがって、別の実施形態では、機能性分子は、SARS-CoV-2に由来するヌクレオカプシドタンパク質の一部、好適にはC末端である。
好適には、自己性原因物質は、非感染性因子であってもよい。したがって、好適には、抗原は、炎症性分子、神経(ベータアミロイド等)、軟骨、若しくは骨組織に変性変化を引き起こす分子、又は新生物性疾患の悪化を引き起こす分子等の非感染性因子に由来してもよい。
好適には、抗原は、疾患若しくは障害の原因物質である、炎症性分子、変性変化を引き起こす分子、又は新生物性疾患を助長する分子であってもよい。好適には、分子は、ヒト又は非ヒト哺乳動物において作用することができる。好適には、分子は、特定の種において疾患又は障害を引き起こす可能性がある。
好適な炎症性分子としては、ケモカイン若しくはサイトカイン又はプロテアーゼを挙げることができる。好適なケモカイン又はサイトカインとしては、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、及びコロニー刺激因子を挙げることができる。好適なケモカイン又はサイトカインとしては、IL1、IL2、Il3、Il4、IL5、Il6、Il7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL33、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、及びTGFβを挙げることができる。好適なプロテアーゼとしては、ADAMTS4、ADAMTS5を挙げることができる。好適には、抗原は、インターロイキン又はプロテアーゼである。好適には、抗原は、IL13、IL17、若しくはIL33、又はそれらの断片である。
したがって、一実施形態では、機能性分子は、IL13、IL17、又はIL33である。
神経組織における変性変化又は新生物性疾患の悪化を引き起こす好適な分子としては、ADAMTS4/5、血管新生因子、又はガレクチンタンパク質等、腫瘍の回避を可能にする因子を挙げることができる。
本明細書における任意の抗原への参照は、その抗原のエピトープを等しく指す場合がある。
機能性分子として使用するための抗体等の好適な抗原結合タンパク質は、目的の抗原に結合することが可能である。好適には、抗体等の抗原結合タンパク質を機能性分子として使用すると、抗原に結合することが可能なVLPが産生される。好適には、これは、抗原を検出するために、又はVLPを抗原へと標的化するために有用である。
目的の抗原は、上記に列挙したもののいずれかであってもよい。例えば、目的の抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、又は古細菌等の疾患原因物質に由来するものであってもよい。その代わりに、目的の抗原は、非感染性因子、例えば、細胞表面受容体に由来するものであってもよい。
好適には、抗体は、上記に列挙したウイルス、細菌、真菌、原生動物、古細菌に由来する抗原に結合することが可能であってもよい。好適には、ウイルスは、以下のものから選択することができる:アデノ随伴ウイルス、チクングニヤウイルス、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ハンタンウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトRSウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトトロウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、インフルエンザC型ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、おたふくかぜウイルス、ニパウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスA、サッポロウイルス、シンドビスウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス。
一実施形態では、機能性分子は、コロナウイルスに由来する抗原に結合することが可能な抗体である。一実施形態では、抗体は、SARS-CoV-2に由来する抗原に結合することが可能である。
好適な細菌は、以下のものから選択することができる:アクチノミセス・イスラエリイ、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バルトネラ・ヘンセラ、バルトネラ・キンタナ、バクテロイデス・フラジリス、ボルデテラ・パータシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・アフゼリ、回帰熱ボレリア、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマーティス、クラミドフィラ・シタッシ、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフテリエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・サンタロサイ、レプトスピラ・ウェイリイ、レプトスピラ・ノグチイ、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・レプレ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、ノカルジア・アステロイデス、シュードモナス・エルギノーサ、リケッチア・リケッチア、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ、サルモネラ・チフィ、シゲラ・ソネイ、シゲラ・ディゼンテリエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ヴィリダンス型連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、ビブリオ・コレラエ、エルシニア・ペスチス、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・シュードツベルクロシス。
好適には、そのような実施形態では、VLPは、特定のウイルスに対して標的化することができ、好適には、特定のウイルスに結合するように標的化することができる。したがって、好適には、VLPは、ウイルスの存在を検出のために使用することができる。この使用に関する更なる詳細は、他所に提供されている。
好適には、抗体等の抗原結合タンパク質は、細胞表面受容体に由来する抗原に結合することが可能であってもよい。好適には、細胞表面受容体は、イオンチャネル連結型受容体、Gタンパク質共役受容体、又は酵素連結型受容体であってもよい。好適には、細胞表面受容体は、以下のものから選択される:5-HT受容体、nAch受容体、亜鉛活性化イオンチャネル、GABAA受容体、Wntファミリーメンバー受容体、脂質ラフトに含まれる共受容体、T細胞及びT細胞共受容体、B細胞受容体及びB細胞共刺激分子、グリシン受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体、NMDA受容体、グルタミン酸受容体、ATP依存性チャネル、PIP2依存性チャネル、Erb受容体、GDNF受容体、NP受容体、trk受容体、トール様受容体、GABAB受容体、GBPCRクラスA、B、C、D、E、又はF。
好適には、そのような実施形態では、VLPは、特定の細胞に対して標的化することができ、好適には、特定の細胞に結合するように標的化することができる。好適には、VLPは、細胞に積荷を送達するために使用することができる。この使用に関する更なる詳細は、他所に提供されている。
好適な抗体としては、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD抗体を挙げることができる。好適には、抗体はIgG抗体である。好適には、IgGサブクラスとしては、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4が挙げられる。
好適な更なる抗原結合タンパク質としては、抗体と同じ機能を発揮する抗体結合性断片又は抗体模倣物を挙げることができる。好適には、それらも、目的の抗原に結合することが可能である。好適には、機能性分子等の抗原結合性断片又は模倣物を使用した場合も、抗原に結合することが可能なVLPが産生される。好適には、これは、抗原を検出するために、又はVLPを上記に記載のような抗原に対して標的化するために有用である。
好適な抗体結合性断片としては、Fab、単一特異性又は二重特異性F(ab)2、F(ab')2、単一特異性又は二重特異性ダイアボディ、ナノボディ、ScFV、ScFV-Fc、F(ab)3を挙げることができる。
好適な抗体模倣物としては、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、fynomer、Kunitzドメインペプチド、モノボディ、nanCLAMPを挙げることができる。
好適には、機能性分子として蛍光分子を使用すると、可視性のVLPが産生される。好適には、これは、特に、抗原に結合することができる第2の機能性分子、例えば、抗体若しくはその結合性断片、抗体模倣物、又はアプタマーと組み合わせると、標識化に有用である。
好適な蛍光分子としては、以下のものを挙げることができる:GFP、EBFP、EBFP2、アジュライト、GFPuv、T-saphhire、Cerulean、CFP、mCFP、mTurquoise2、CyPet、mKeima-red、tagCFP、AmCyan1、mTFP1、midoriishi cyan、turboGFP、tagGFP、エメラルド、アザミグリーン、ZsGreen1、YFP、tagYFP、EYFP、トパーズ、venus、mCtrine、YPet、turboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、アロフィコシアニン、mkO、RFP、turboRFP、tdTomato、tagRFP、dsRed、mStrawberry、turboFP602、asRed2、J-red、R-フィコエリトリン、B-フィコエリトリン、mCherry、HcRed、Katusha、P3、ペリジニンクロロフィル、mKate、turboFP635、mPlum、mRaspberry。
好適には、蛍光分子はGFP又はGFPの任意の修飾形態である。
第1の態様の一実施形態では、機能性分子又は各機能性分子は、IL13、IL17、IL33、SARS Cov-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン、又はSARS Cov-2ヌクレオカプシドタンパク質のC末端である。
第1の態様の別の実施形態では、機能性分子又は各機能性分子は、IgG抗体又はその結合性断片である。一実施形態では、抗体又はその結合性断片は、SARS-CoV-2に対する抗体又はその結合性断片である。
第2の態様の一実施形態では、機能分子又は各機能分子はGFPである。
更なる実施形態では、VLPが、化学修飾を介して第1の結合タンパク質に付着した第1の機能性分子、及び第2の結合タンパク質に付着した第2の機能性分子を含む場合、好適には、第1の機能性分子はGFPであり、第2の機能性分子は、IgG抗体又はその結合性断片である。
有利には、そのような実施形態では、VLPを使用して、抗原を検出するか、又はVLPを抗原に対して標的化し、同時に抗原を視覚的に標識することができる。
第1の態様の更なる実施形態では、各第2の結合タンパク質は、2つの機能性分子に付着していてもよく、第1の機能性分子は抗原であり、第2の機能性分子は異なる抗原又は蛍光分子である。第1の態様の一実施形態では、各第2の結合タンパク質は、SARS Cov-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン及びSARS Cov-2ヌクレオカプシドタンパク質のC末端に付着している。第1の態様の一実施形態では、各第2の結合タンパク質は、SARS Cov-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン及びGFPに付着している。
ウイルス様粒子(VLP)
本発明は、VLP、それらの使用、及びそれらの製造方法に関する。
好適には、VLPは、好適にはVLP殻を形成する1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質を含む。好適には、1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質は、VLP殻に自己アセンブリする。
好適には、VLPは、ウイルスカプシドタンパク質に付着している1つ又は複数の結合タンパク質を含む。
好適には、VLP殻は、結合タンパク質に好適に付着している1つ又は複数の機能性分子、及び/又は結合タンパク質に存在する化学修飾を含む。
好適には、そのような方法では、本発明のVLPは、その表面上に機能性分子を安定的に提示する。
好適には、VLPは、複数のサブユニットを含んでいてもよい。好適には、各サブユニットは、完全なウイルスカプシドタンパク質、1つ又は複数の結合タンパク質、及び1つ又は複数の機能性分子を含む。好適には、サブユニットは、VLPへと自己アセンブリする。したがって、好適には、VLPは、複数のウイルスカプシドタンパク質、複数の結合タンパク質、及び複数の機能性分子を含む。したがって、好適には、第1の態様の場合では、VLPは、複数のB型肝炎カプシドタンパク質、複数の結合タンパク質の対、及び複数の機能性分子を含む。
好適には、各VLPサブユニットは、ウイルスカプシドタンパク質二量体、少なくとも2つの結合タンパク質、及び少なくとも2つの機能性分子を含む。好適には、各ウイルスカプシド単量体は、少なくとも1つの結合タンパク質、及び少なくとも1つの機能性分子に付着している。
任意選択で、各VLPサブユニットは、1つよりも多くの機能性分子を含んでいてもよい。好適には、各ウイルスカプシド単量体は、1つよりも多くの機能性分子、好適には2つの機能分子に付着してもよい。好適には、機能性分子又は各機能性分子は、同じであってもよく又は異なっていてもよい。例えば、1つのVLPサブユニットは、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子を含んでいてもよく、更にその化学修飾を介して第1の結合タンパク質に付着した機能性分子を含んでいてもよい。
第1の態様の一実施形態では、好適には、各VLPサブユニットは、B型肝炎カプシドタンパク質二量体、2対の結合タンパク質、及び2つの機能性分子を含む。好適には、結合タンパク質の各対は、B型肝炎カプシドタンパク質単量体に付着した第1の結合タンパク質、及び機能性分子に付着した第2の結合タンパク質を含む。
好適には、そのような実施形態では、2つの機能性分子は各々、二量体タンパク質の単量体を含んでいてもよい。したがって、好適には、B型肝炎カプシドタンパク質二量体が形成される場合、2つの機能性分子も一緒になって二量体を形成することができる。そのような場合が該当する機能性分子の一例はIL17である。好適には、VLPがIL17を提示することが意図されている場合、各機能性分子は、IL17の単量体を含む。
第2の態様の一実施形態では、好適には、各VLPサブユニットは、B型肝炎カプシドタンパク質二量体、2つの結合タンパク質、及び2つの機能性分子を含む。好適には、各結合タンパク質は、B型肝炎カプシドタンパク質単量体及び機能性分子に付着している。好適には、結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質に及び機能性分子に直接的又は間接的に付着している。好適には、結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質に直接的に付着しており、一部の場合では、機能性分子に直接的に付着している。
好適には、第1の態様では、第1の結合タンパク質は、B型肝炎カプシドタンパク質に融合されている。好適には、第2の態様では、結合タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質に融合されている。
好適には、第1の態様では、第2の結合タンパク質は、機能性分子に融合されていてもよい。その代わりに、第2の結合タンパク質は、機能性分子に間接的に付着していてもよい。
一部の実施形態では、第2の結合タンパク質は、第3の結合タンパク質を介して機能性分子に間接的に付着していてもよい。好適には、これは、機能性分子が、抗体等の抗原結合性分子である実施形態で使用される。好適には、第3の結合タンパク質は、一般的な抗体結合タンパク質である。好適には、抗体結合タンパク質は、プロテインG、プロテインA、プロテインAG、及びストレプトアビジンから選択される。好適には、第2の結合タンパク質は、機能性分子に付着していてもよい第3の結合タンパク質に融合されていてもよい。一実施形態では、第2の結合タンパク質は、機能性分子に結合することが可能な第3の結合タンパク質に融合されていてもよい。
好適には、第2の態様では、結合タンパク質は、機能性分子に間接的に、好適には化学修飾を介して付着している。
好適には、VLPは、負の表面電荷、好適には均質な負の表面電荷を含む。
核酸及びベクター
本発明は、VLPを形成する構成タンパク質部分をコードする核酸、及びVLPを産生するために宿主細胞において使用することができる上記核酸を含むベクターに関する。
好適には、本発明は、第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸に関し、それを利用する。好適には、第1の核酸は、第1の結合タンパク質に融合されたウイルスカプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードすることができる。好適には、ウイルスカプシドタンパク質は、B型肝炎カプシドタンパク質であってもよい。好適には、これは、「カプシド融合タンパク質」として知られている場合がある。
好適には、第1の核酸は、配列番号22、23、24、又は25による配列を含んでいてもよい。好適には、第1の核酸は、配列番号22、23、24、又は25と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、第1の核酸は、配列番号22、23、24、又は25による配列からなっていてもよい。
好適には、本発明は、第2の結合タンパク質に任意選択で付着した機能性分子をコードする第2の核酸に関し、それを利用する。好適には、第2の核酸は、第2の結合タンパク質に任意選択で融合された機能性分子を含む融合タンパク質をコードしていてもよい。好適には、これは、「機能性融合タンパク質」として知られている場合もある。
一実施形態では、第2の核酸は、機能性分子のみをコードする。
一実施形態では、第2の核酸は、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする。一実施形態では、第2の核酸は、第2の結合タンパク質に融合された機能性分子をコードする。
好適には、第2の核酸は、配列番号26、27、28、29、41、32、又は45による配列を含んでいてもよい。好適には、第2の核酸は、配列番号26、27、28、29、41、32、又は45と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、第2の核酸は、配列番号26、27、28、29、41、32、又は45による配列からなっていてもよい。
好適には、機能性分子はエピトープである。好適には、エピトープは、IL-13、IL-33、IL-17、又はSARS-Cov2スパイクタンパク質受容体結合ドメインから選択される。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合されたIL-13エピトープをコードする実施形態では、好適には、第2の核酸は、配列番号26若しくは27による配列、又は配列番号26若しくは27と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合されたIL-33エピトープをコードする実施形態では、好適には、第2の核酸は、配列番号28若しくは29による配列、又は配列番号28若しくは29と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合されたSARS-CoV2スパイクタンパク質エピトープをコードする実施形態では、好適には、第2の核酸は、配列番号41による配列、又は配列番号41と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合されたIL-17エピトープをコードする実施形態では、好適には、第2の核酸は、配列番号45による配列、又は配列番号45と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合された2つの機能性分子をコードする実施形態では、好適には、第2の核酸は、配列番号42若しくは43による配列、又は配列番号42若しくは43と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、機能性分子は、1つ若しくは複数のエピトープ及び/又は蛍光分子を含んでいてもよい。好適には、機能性分子は、2つのエピトープを含んでいてもよい。好適には、機能性分子は、エピトープ及び蛍光分子を含んでいてもよい。
第2の核酸が2つのエピトープをコードする実施形態では、それらは、第2の結合タンパク質に融合された任意の2つのエピトープであってもよい。一実施形態では、第2の核酸は、SARS-Cov2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン及びヌクレオカプシドタンパク質のC末端断片をコードする。好適には、第2の核酸は、配列番号42による配列、又は配列番号42と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
第2の核酸が、第2の結合タンパク質に融合されたエピトープ及び蛍光分子をコードする実施形態では、それらは、任意のエピトープ及び任意の蛍光分子であってもよい。一実施形態では、第2の核酸は、SARS-Cov2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン及びeGFPをコードする。好適には、第2の核酸は、配列番号43による配列、又は配列番号43と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、第2の機能性分子をコードする更なる核酸に関し、それを利用する。好適には、この更なる核酸は、第4の核酸として知られている場合もある。一部の実施形態では、これは、第2の核酸が、第2の結合タンパク質に付着した第1の機能性分子を既にコードしている場合に生じ得る。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本発明は、第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする更なる核酸に関し、それを利用する。好適には、この更なる核酸は、第3の核酸として知られている場合もある。好適には、第3の結合タンパク質は、抗体等の抗原結合タンパク質に結合することが可能なタンパク質である。好適には、第3の結合タンパク質は、例えばプロテインGであってもよい。
好適には、第3の核酸は、配列番号30による配列を含んでいてもよい。好適には、第3の核酸は、配列番号30と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性を有する配列を含んでいてもよい。好適には、第3の核酸は、配列番号30による配列からなっていてもよい。
好適には、第1の結合タンパク質、第2の結合タンパク質、及び第3の結合タンパク質は、本明細書の他所で定義されている。しかしながら、好適には、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤であってもよく、第2の結合タンパク質は細菌毒素であってもよい。好適には、第3の結合タンパク質は、抗体結合タンパク質であってもよい。
一部の実施形態では、本発明は、第1の核酸及び第2の核酸を利用することができる。
一部の実施形態では、本発明は、第1の核酸、第2の核酸、及び第3の核酸を利用することができる。
一部の実施形態では、本発明は、第1の核酸、第2の核酸、及び第4の核酸を利用することができる。
一部の実施形態では、本発明は、第1の核酸及び第3の核酸を利用することができる。
一部の実施形態では、本発明は、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸を利用することができる。
好適には、本明細書に記載の第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸は、1つの連続した核酸配列として準備してもよく、又は複数の別々の核酸配列として準備してもよい。第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸への参照は、複数の核酸配列を使用して、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸と同じタンパク質コードすることができる実施形態を含む。
好適には、核酸は、それにコードされているタンパク質の発現を支援するための1つ又は複数の発現エレメントを含んでいてもよい。
好適な発現エレメントとしては、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、活性化因子、リプレッサー、5'UTR、3'UTR、イントロン、IRES等が挙げられる。
好適には、核酸の各々は、それにコードされているタンパク質の等しい発現を保証する1つ又は複数の発現エレメントを含む。好適には、核酸の各々は、それにコードされているタンパク質の等しい発現を保証するプロモーターを含む。好適には、プロモーターは、それからの発現レベルを調整する1つ又は複数の修飾を含んでいてもよい。好適には、プロモーターは、1つ又は複数の突然変異を含んでいてもよい。好適には、本明細書に記載の核酸又は各核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。
好適なプロモーターは、CMV-IE、EF1a、SV40、PGK1、CAG、ヒトβアクチン、T7、TetR/TetA、T7lac、SP6、LP1、TTR、CK8、シナプシン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、CaMKII、TBG、及びアルブミンプロモーターから選択される。
好適には、各核酸は、同じプロモーターに連結していてもよく又は異なるプロモーターに連結していてもよい。
好適には、各核酸は、同じプロモーターに連結していてもよい。したがって、好適には、各核酸は、同時に発現されてもよい。好適には、各核酸は、任意選択で、核酸によりコードされているタンパク質の等しい発現レベルを保証するための1つ又は複数の修飾を有するT7プロモーターに連結していてもよい。
好適には、各核酸は、異なるプロモーターに連結していてもよい。したがって、好適には、各核酸は、異なる時点で発現させることができる。好適には、核酸又は各核酸は、独立して発現させることができる。好適には、各核酸の発現を、異なる時点で誘導することができる。したがって、好適には、プロモーター又は各プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、好適には、プロモーターを、それからの発現を誘導するのに有効な濃度の好適な誘導剤と接触させることにより誘導することができる。一実施形態では、第1の核酸配列は、第1のプロモーターに連結していてもよく、第2の核酸は、第2のプロモーターに連結していてもよい。好適には、第1のプロモーターは、T7プロモーターを本明細書に記載のように修飾したT7プロモーターであってもよい。好適には、第2のプロモーターは、TetR/TetAプロモーターであってもよい。
一実施形態では、第2の核酸に作動可能に連結したT7プロモーターは修飾されている。好適には、第2の核酸に作動可能に連結したT7プロモーターは、それにコードされている第2の結合タンパク質に付着した機能性分子の発現レベルを低減させるように修飾されている。好適には、T7プロモーターは、点突然変異により修飾されている。好適には、T7プロモーターは、Konczalら、PLoS One 2019年による命名法の以下の修飾:1C、1T、2T、5A、8G、4C、又はそれらの任意の組合せのいずれかを含んでもよく、この場合、親配列は:agcataat(配列番号44)である。好適には、修飾T7プロモーターは、配列番号31による配列を含む。そのような実施形態では、好適には、第1の核酸に作動可能に連結したT7プロモーターは修飾されていない。
したがって、好適には、第1の核酸は、第2の核酸が、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子を発現するのと同じレベルで、又は第3の核酸と同じレベルで、第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質を発現する。
したがって、好適には、カプシド融合タンパク質は、機能性融合タンパク質又は機能性分子と比較して1:1レベルで発現される。
好適には、核酸は、1つ又は複数のベクターに含まれていてもよい。好適には、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び/又は第4の核酸は、1つのベクターに含まれていてもよい。その代わりに、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び/又は第4の核酸は、複数のベクターに含まれていてもよい。一実施形態では、第1の核酸は1つのベクターに含まれていてもよく、第2の核酸は別のベクターに含まれていてもよい。
一実施形態では、第1の核酸は、第1のベクター、好適には配列番号1又は2のベクターに含まれている。
一実施形態では、第2の核酸は、第2のベクター、好適には配列番号3、4、9、10又は11のベクターに含まれている。
その代わりに、一実施形態では、第1の核酸及び第2の核酸は、同じベクター、好適には配列番号5、6、7、47、又は48のベクターに含まれていてもよい。
一実施形態では、第1の核酸及び第3の核酸は、同じベクター、好適には配列番号8のベクターに含まれている。
好適には、1つ又は複数のベクターは、1つ又は複数の宿主細胞に含まれていてもよい。好適には、1つ又は複数のベクターは、好適には、例えば第10の態様では、単一の宿主細胞に含まれていてもよい。その代わりに、1つ又は複数のベクターは、好適には、例えば第11の態様では、任意の組合せで複数の宿主細胞に含まれていてもよい。
好適には、第10の態様の方法では、第1の核酸、第2の核酸、及び/又は第3の核酸は、1つのベクターに、又は第1のベクター及び第2のベクターに、又はそれぞれ第1のベクター、第2のベクター、及び第3のベクターに含まれていてもよい。第10の態様の方法の一実施形態では、第1の核酸及び第2の核酸は、1つのベクターに含まれている。好適には、ベクター又は各ベクターは、単一の宿主細胞に存在する。第10の態様の方法の一実施形態では、第1の核酸及び第2の核酸は、配列番号5、6、7、47、又は48の単一ベクターに含まれている。第10の態様の方法の一実施形態では、第1の核酸及び第3の核酸は、配列番号8の単一ベクターに含まれている。好適には、単一の宿主細胞は、配列番号5、6、7、8、47、又は48の単一ベクターを含む。第10の態様の方法の一実施形態では、第1の核酸、第2の核酸、及び/又は第3の核酸は、2つの異なるベクターに含まれている。好適には、第1の核酸は、配列番号1又は2から選択される第1のベクターに含まれていてもよい。好適には、第2の核酸は、配列番号3、4、9、10、又は11から選択される第2のベクターに含まれていてもよい。好適には、第1のベクター及び第2のベクターの任意の実行可能な組合せを、単一の宿主細胞にて使用することができる。例えば、第1のベクターは、配列番号1を含んでいてもよく、配列番号3、4、9、10、又は11の第2のベクターのいずれかと組み合わせることができる。例えば、第1のベクターは、配列番号2を含んでいてもよく、配列番号3、4、9、10、又は11の第2のベクターのいずれかと組み合わせることができる。
好適には、第11の態様の方法では、第1の核酸及び第2の核酸は、それぞれ第1のベクター及び第2のベクターに含まれている。好適には、第3の核酸は、第2の核酸と一緒に又は単独で、第2のベクターに含まれていてもよい。その代わりに、第3の核酸は、第3のベクターに含まれていてもよい。好適には、第1のベクターは第1の宿主細胞に存在し、第2のベクター及び/又は第3のベクターは第2の宿主細胞に存在する。その代わりに、第3のベクターは、第3の宿主細胞に存在してもよい。第11の態様の方法の一実施形態では、好適には、第1のベクターは配列番号1又は2のものであり、第2のベクターは配列番号3、4、9、10、又は11のものである。好適には、第1のベクター及び第2のベクターの任意の実行可能な組合せを、宿主細胞にて使用することができる。例えば、第1の宿主細胞は、配列番号1の第1のベクターを含んでいてもよく、配列番号3、4、9、10、又は11のいずれかの第2のベクターを含む第2の宿主細胞と組み合わせることができる。例えば、第1の宿主細胞は、配列番号2の第1のベクターを含んでいてもよく、配列番号3、4、9、10、又は11のいずれかの第2のベクターを含む第2の宿主細胞と組み合わせることができる。
好適には、1つ又は複数のベクターは、第3の核酸及び/又は第4の核酸を更に含んでいてもよい。一実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸、及び第2の機能性分子をコードする第4の核酸の両方を更に含んでいてもよい。
好適には、更なる第3の核酸及び/又は第4の核酸は、第1の宿主細胞又は第2の宿主細胞内のベクターに含まれていてもよい。好適には、更なる第3の核酸及び/又は第4の核酸は、第1の核酸及び/又は第2の核酸と同じベクターに含まれていてもよく、又は異なるベクターに含まれていてもよい。好適には、第3の核酸及び/又は第4の核酸は両方とも第3のベクターに含まれていてもよい。その代わりに、第3の核酸及び/又は第4の核酸は、それぞれ第3のベクター及び第4のベクターに含まれていてもよい。好適には、第3のベクター及び/又は第4のベクターは、第1の宿主細胞又は第2の宿主細胞に存在してもよい。その代わりに、第3のベクター及び/又は第4のベクターは、第3の宿主細胞に存在してもよい。その代わりに、第3のベクターは第3の宿主細胞に存在してもよく、第4のベクターは第4の宿主細胞に存在してもよい。
任意の好適なベクターを、選択された宿主細胞に使用することができる。好適な宿主細胞は、下記で考察されている。好適には、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体から選択される。好適には、ベクター又は各ベクターはプラスミドである。
宿主大腸菌細胞に好適なプラスミドベクターとしては、例えば、以下のものが挙げられる:pALTER-Ex1、pALTER-Ex2、pBAD/His、pBAD/Myc-His、pBAD/gIII、pCal-n、pCal-n-EK、Cal-c、pCal-Kc、pcDNA 2.1、pDUAL、pET-3a-c、pET-9a-d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21a-d(+)、pET-22b(+)、pET-23a-d(+)、pET-24a-d(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a-c(+)、pET-29a-c(+)、pET-30a-c(+)、pET-31b(+)、pET-32a-c(+)、pET-33b(+)、pET-34b(+)、pET-35b(+)、pET-36b(+)、pET-37b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a-c(+)、pET-42a-c(+)、pET-43a-c(+)、pETBlue-1、pETBlue-2、pETBlue-3、pGEMEX-1、pGEMEX-2、pGEX-1lT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P、pHAT10/11/12、pHAT20、pHAT-GFPuv、pKK223-3、pLEX、pMAL-c2X、pMAL-c2E、pMAL-c2G、pMAL-p2X、pMAL-p2E、pMAL-p2G、pProEX HT、pPROLar.A、pPROTet.E、pQE-9、pQE-16、pQE-30/31/32、pQE-40、pQE-60、pQE-70、pQE-80/81/82L、pQE-100、pRSET、pSE280、pSE380、pSE420、pThioHis、pTrc99A、pTrcHis、pTrcHis2、pTriEx-1、pTriEx-2、pTrxFus。
一実施形態では、使用されるベクターは、pET-Duetである。
宿主哺乳動物細胞に好適なプラスミドベクターとしては、pSVシリーズ及びpCMVシリーズのベクターを挙げることができる。
一実施形態では、使用されるベクターは、pcDNA5Dである。一実施形態では、宿主哺乳動物細胞は、HEK293細胞又はCHO細胞又はそれらの派生物である。
好適には、1つよりも多くのベクターが使用される場合、それらは同じベクターである。
好適には、ベクターは、1つ又は複数の選択可能なマーカー、1つ又は複数の複製起点、及び多重クローニング部位等の、様々な他の機能性核酸配列を含んでいてもよい。
VLPを産生するための方法
本発明は、VLPを産生するための方法に更に関する。本明細書では2つの異なる方法が記載されており、一方は、単一細胞法であり、他方は、少なくとも2つの細胞で行われ、VLPを形成するために成分部分の混合を必要とする方法である。
本発明の第10の態様によると、VLPを産生するための単一細胞法が提供される。
本発明の第11の態様によると、VLPを産生するための複数細胞法が提供される。
好適には、こうした方法は、好適には、宿主細胞又は各宿主細胞を培養する前に、核酸を含む1つ又は複数のベクターを宿主細胞又は各宿主細胞にトランスフェクトすることを更に含んでいてもよい。好適には、トランスフェクションは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子送達、化学媒介性エンドサイトーシス、リン酸カルシウム共沈殿、又はリポソーム媒介性送達等、任意の好適な方法により行うことができる。
好適には、タンパク質が発現される条件下での宿主細胞の培養は、最適増殖条件下で宿主細胞を培養することを含む。好適には、最適増殖条件は、使用される宿主細胞に応じて様々であろう。
好適には、宿主細胞は、任意の細菌、酵母、昆虫細胞、又はヒト細胞から選択することができる。好適には、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。好適には、宿主細胞は、以下のものから選択される:大腸菌、B.ズブチリス(B.subtilis)、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rodhobacter sphaeroides)、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス(Pseudoalteromonas haloplanktis)、シュワネラ属種Ac10株、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、ハロモナス・エロンガタ(Halomonas elongate)、クロモハロバクター・サレキシゲンス(Chromohalobacter salexigens)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ノカルジア・ラクタムズランス(Nocardia lactamdurans)、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム(Brevibacterium lactofermentum)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacien)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルスロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri)。
一実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。好適には、大腸菌菌株は、BL21、lemo21、NiCo21、NEB Express、SHuffle、T7 Express、BLR、HMS174、Tuner、Origami2、Rosetta2、m15から選択される。
一実施形態では、大腸菌菌株は、ジスルフィド形成を調節する追加の遺伝子、dsbC及びerv1Pがゲノムに組み込まれているBL21(DE3)である。好適には、ゲノム組込みは、recAX遺伝子座内である。
代替的な実施形態では、宿主細胞は、HEK293T細胞等のヒト細胞である。
好適な最適増殖条件は、15～25℃の温度で培養することを含む。好適な最適増殖条件は、既知組成培地等、ヒトでの使用が意図されている医療品のためのバイオプロセス応用に適合性である培地中で培養することを含む。好適な最適増殖条件は、通気培養培地中で培養することを含む。
好適には、宿主細胞は、高密度に、好適には、密度OD600が4～20になるまで培養される。
また、好適には、タンパク質が発現される条件下での宿主細胞の培養は、タンパク質が発現されるように宿主細胞を誘導することを含んでいてもよい。好適には、宿主細胞の誘導は、誘導剤を培養培地に添加すること、又は酸/アルカリpH、熱ショック、若しくは低酸素等のある特定の誘導条件を培養培地内に作出することを含んでいてもよい。好適には、誘導剤又は誘導条件は、核酸の転写を刺激する。好適には、誘導剤又は誘導条件は、核酸内の誘導性発現制御配列を刺激することにより、核酸の転写を刺激する。好適には、誘導性発現制御配列は、誘導性プロモーターであってもよい。好適な誘導剤としては、ラクトース駆動性プロモーターの場合はイソプロピル-β-d-チオガラクトシド(IPTG)、又はテトラサイクリン調節性プロモーターの場合はテトラサイクリンが挙げられる。
好適には、培養物が上記に記載の最適密度に到達したら、宿主細胞を誘導してタンパク質を発現させる。好適には、宿主細胞は、対数増殖中に誘導してタンパク質を発現させる。
好適には、タンパク質の濃度は、誘導剤の濃度を調整することにより、又は宿主細胞が曝露される誘導条件を変更することにより変えることができる。
好適には、培養工程には、4～24時間かかる。
好適には、宿主細胞は、2～6時間の培養後に、又は6～8のODが達成された際に、タンパク質の発現が誘導される。
本発明の更なる態様では、第7の態様、第8の態様、又は第9の態様の1つ又は複数の宿主細胞、好適には、複数の上記細胞、及び培地を含む細胞培養物が提供される。
その代わりに、この方法は、1つ又は複数の細胞内で実施しなくともよく、無細胞系で実施してもよい。好適には、第11の態様の方法では、工程(a)は、VLP殻の正しい産生を保証するように宿主細胞内で実施される。しかしながら、好適には、工程(b)は、宿主細胞の外部で、無細胞系にて生じてもよい。
好適には、この方法は、好適にはVLPが形成された後で、VLPを回収する工程、好適にはVLPを宿主細胞から回収する工程を更に含んでいてもよい。
好適には、VLPの回収は、宿主細胞を破壊することを含んでいてもよい。その代わりに、VLPを宿主細胞から培養溶液中へと分泌させてもよい。好適には、宿主細胞の破壊は、ホモジナイズ、超音波処理、又は凍結融解等、任意の好適な方法により実施することができる。
VLPの回収は、濾過、プルダウン、遠心分離、又はクロマトグラフィー等、任意の好適な方法により行うことができる。
好適には、結合タンパク質が化学修飾を含む実施形態では、好適には、VLPの回収及び精製は、好適には、混合モード(疎水性相互作用及びサイズ排除)クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び限外濾過を含む一連の工程を含むクロマトグラフィーにより、好適には陰イオン交換クロマトグラフィーにより行われる。好適には、VLPを回収するために陰イオン交換クロマトグラフィーが使用される場合、VLPは化学修飾を含んでいてもよく、好適には、そのような実施形態では、VLPの第1の結合タンパク質はDEAEで修飾されている。好適には、DEAE分子は、クロマトグラフィーカラムに結合することができる。
好適には、第11の態様の方法では、工程(d)は、タンパク質を回収すること、好適にはタンパク質を宿主細胞から回収することを含む。好適には、タンパク質の回収は、類似の技法により実施することができる。好適には、タンパク質の回収は、宿主細胞を上記のように破壊することを含んでいてもよい。その代わりに、タンパク質を宿主細胞から培養溶液中へと分泌させてもよい。
好適には、VLPは、自己アセンブリにより、好適には自発的自己アセンブリにより形成される。好適には、構成タンパク質を、第10の態様に従って単一宿主細胞内で、又は第11の態様に従って細胞の外部で混合すると、アセンブリしてVLPが形成されることになる。
第10の態様の単一細胞法に関して、好適には、宿主細胞を培養する工程は、第1の核酸及び第2の核酸から又は任意の更なる核酸から発現されるタンパク質が互いに結合するような条件下で培養することを更に含む。
一部の実施形態では、培養工程の後、第1の結合タンパク質を化学的に修飾してもよい。したがって、好適には、この方法は、タンパク質を回収し、続いて第1の結合タンパク質を化学的に修飾する工程を含んでいてもよい。好適には、こうした工程は、工程(b)の後だが工程(c)の前に行われる。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第2の機能性分子をコードする更なる(第4の)核酸を更に含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されている。好適には、第2の機能性分子は、化学修飾に結合する。好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸、第2の核酸、及び第4の核酸からタンパク質が発現される条件下で培養される。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸を更に含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で培養される。好適には、そのような実施形態では、第2の核酸が存在してもよく、機能性分子のみをコードしていてもよい。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、抗原結合タンパク質である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸からタンパク質が発現されるような条件下で培養してもよい。
一実施形態では、第2の核酸は、機能性分子のみをコードする。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は化学的に修飾されているか、又は第3の核酸が存在する。
一実施形態では、第2の核酸は、第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されていてもよく又はされていなくてもよい。
一実施形態では、第10の態様の工程(c)は、各第1の結合タンパク質が各第2の結合タンパク質に結合することを含む。代替的な実施形態では、工程(c)は、各第1の結合タンパク質が、好適には化学修飾を介して機能性分子に結合することを含む。一実施形態では、ステップ(c)は、これらの工程の両方を含む。
第11の態様の複数細胞法に関して、好適には、培養工程中に、第1の結合タンパク質を化学的に修飾してもよい。したがって、好適には、第1の宿主細胞を培養するための条件は、第1の結合タンパク質が化学的に修飾されるような条件である。好適には、第1の結合タンパク質のそのような化学修飾は、翻訳後に生じてもよい。その代わりに、この方法は、第1の結合タンパク質を化学的に修飾する工程を含んでいてもよい。好適には、この工程は、工程(d)の後だが工程(e)の前に行われる。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第2の機能性分子をコードする更なる(第4の)核酸を更に含んでいてもよい。好適には、第4の核酸は、第1の宿主細胞若しくは第2の宿主細胞内のベクターに含まれていてもよく、又は第3の宿主細胞内のベクターに含まれていてもよい。好適には、そのような実施形態では、第1の結合タンパク質は、化学的に修飾されている。好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸、第2の核酸、及び第4の核酸からタンパク質が発現される条件下で培養される。
一部の実施形態では、1つ又は複数のベクターは、第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸を含んでいてもよい。好適には、そのような実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で培養される。
好適には、そのような実施形態では、第2の核酸は、存在する場合、機能性分子のみをコードする。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、抗原結合タンパク質である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、第1の核酸、第2の核酸、第3の核酸、及び第4の核酸からタンパク質が発現されるような条件下で培養してもよい。
一実施形態では、工程(e)は、各第1の結合タンパク質が各第2の結合タンパク質に結合することを含む。代替的な実施形態では、工程(e)は、各第1の結合タンパク質が、好適には化学修飾を介して各機能性分子に結合することを含む。一実施形態では、工程(e)は、これらの工程の両方を含む。
一実施形態では、工程(e)は、タンパク質が互いに結合するような条件下で混合することを更に含む。好適には、工程(e)は、宿主細胞上清又は宿主細胞ライセートを混合すること、好適には、第1の宿主細胞上清又はライセートを更なる宿主細胞上清又はライセートと混合することを含む。好適には、混合は、結合タンパク質の比が均一な化学量論的濃度をもたらすようになされる。好適には、混合は、第1の宿主細胞上清又はライセートの、更なる宿主細胞上清又はライセートに対する比が約1:1となるようになされる。好適には、混合工程は、室温、好適には約18～22℃で行われる。好適には、混合は、15分～2時間、好適には20分～1時間、好適には25分～45分、好適には約30分間行われる。
本発明の第10の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を単一宿主細胞内で産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び
(ii)機能性分子をコードする第2の核酸
を含む、工程、
(b)それぞれ第1の核酸及び第2の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(c)タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
を含み、
好適には、第1の結合タンパク質は化学的に修飾されており、機能性分子は化学物質に付着することが可能である、方法が提供される。
本発明の第10の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を単一宿主細胞内で産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び
(ii)第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸
を含む、工程、
(b)それぞれ第1の核酸及び第2の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(c)タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
を含む方法が提供される。
本発明の第10の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を単一宿主細胞内で産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び
(ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸
を含む、工程、
(b)それぞれ第1の核酸及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(c)タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
を含む方法が提供される。
好適には、機能性分子を、形成されたVLPと混合してもよく、好適には、機能性分子は、第3の結合タンパク質に結合することが可能である。
本発明の第10の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を単一宿主細胞内で産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、並びに
(ii)(a)機能性分子をコードする第2の核酸、及び
(b)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸
を含む、工程、
(b)それぞれ第1の核酸、第2の核酸、及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(c)タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
を含み、
好適には、機能性分子は、第3の結合タンパク質に結合することが可能である、方法が提供される。
本発明の第11の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
(b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(iii)機能性分子をコードする第2の核酸を含む、工程、
(c)それぞれ第1の核酸及び第2の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(d)タンパク質を回収する工程、
(e)タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
を含み、
好適には、第1の結合タンパク質は化学的に修飾されており、機能性分子は化学物質に結合することが可能である、方法が提供される。
好適には、工程(b)は、第2の宿主細胞を準備することを含む。
本発明の第11の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
(b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸であり、第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第2の核酸を含む、工程、
(c)それぞれ第1の核酸及び第2の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(d)タンパク質を回収する工程、
(e)タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
を含む方法が提供される。
好適には、工程(b)は、第2の宿主細胞を準備することを含む。
本発明の第11の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
(b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸であり、第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第3の核酸を含む、工程
(c)それぞれ第1の核酸及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(d)タンパク質を回収する工程、
(e)タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
を含む工程が提供される。
好適には、機能性分子を、形成されたVLPと混合してもよく、好適には、機能性分子は、第3の結合タンパク質に結合することが可能である。
好適には、工程(b)は、第2の宿主細胞を準備することを含む。
本発明の第11の態様の一実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
(a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
(b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、1つ又は複数のベクターは、
(i)機能性分子をコードする第2の核酸、及び
(ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸であり、第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第3の核酸
を含む、工程、
(c)それぞれ第1の核酸、第2の核酸、及び第3の核酸からタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程、
(d)タンパク質を回収する工程、
(e)タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
を含み、
好適には、機能性分子は、第3の結合タンパク質に結合することが可能である、方法が提供される。
好適には、工程(b)は、(i)及び(ii)を含む第2の宿主細胞を準備することを含んでいてもよい。その代わりに、工程(b)は、(i)を含む第2の宿主細胞を準備すること、及び(ii)を含む第3の宿主細胞を準備することを含んでいてもよい。
免疫原性組成物
本発明は、本発明のVLPを含む免疫原性組成物に更に関する。
好適には、免疫原性組成物はワクチンであってもよい。
好適には、免疫原性組成物は、1つ又は複数のアジュバントを更に含んでいてもよい。好適なアジュバントとしては、無機塩、エマルジョン、微生物由来アジュバント、炭水化物、サイトカイン、粒子状物質、又はテンソアクティブ化合物(tensoactive compound)が挙げられる。
好適な無機塩としては、アジュマー(adjumer)、アルハイドロゲル、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム(AAHSA)、アルミニウム塩一般、リン酸カルシウム、レヒドラゲル(Rehydragel)HPA、又はレヒドラゲルLVが挙げられる。
好適なエマルションとしては、完全フロイント、不完全フロイント、モンタニド(montanide)ISA720、モンタニドISA51、不完全モンタニド、Ribi、TiterMax、AF03、AS03、MF59、スペコール(specol)、SPT、又はスクアレンが挙げられる。
好適な微生物由来物としては、コレラ毒素若しくはその突然変異体、コレラ毒素サブユニットB、CpG DNA、LTR 192G、MPL、百日咳菌(Bordella pertussis)成分、大腸菌易熱性毒素、CTA1-DD遺伝子融合タンパク質、Etx Bサブユニット、リポ多糖、フラジェリン、コリネバクテリウム由来P40、LTK72、MPL-SE、又はTy粒子が挙げられる。
好適には、免疫原性組成物は、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を更に含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤としては、安定剤、増量剤、保存剤、希釈剤、栄養素、酸化防止剤、抗菌剤、緩衝剤、溶媒、不活化剤、精製剤、乳化剤、及び界面活性剤等を挙げることができる。
例えば、好適な賦形剤は、以下のものから選択することができる:グルタミン酸一ナトリウム、スクロース、D-マンノース、D-フルクトース、デキストロース、ヒト血清アルブミン、リン酸カリウム、プラスドンC、無水ラクトース、微結晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、ステアリン酸マグネシウム、酢酸フタル酸セルロース、アルコール、アセトン、ヒマシ油、塩化ナトリウム、塩化ベンゼトニウム、ホルムアルデヒド、アスコルビン酸、加水分解カゼイン、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、2-フェノキシエタノール、ポリソルベート80(Tween 80)、ネオマイシン、硫酸ポリミキシンB、ウシ血清アルブミン、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンB、酵母タンパク質、硫酸ストレプトマイシン、チオシアン酸アンモニウム、米タンパク質、ラクトース、ホルマリン、アミノ酸栄養補助剤、リン酸緩衝生理食塩溶液、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、酵母DNA、デオキシコラート、ホスホロチオエート連結オリゴデオキシヌクレオチド、二塩基性十二水和物、一塩基性無水物、L-ヒスチジン、ホウ酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、オバルブミン、トリオレイン酸ソルビタン、クエン酸ナトリウム無水物、クエン酸一水和物、カナマイシン、バリウム、ヒドロコルチゾン、卵タンパク質、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、オクトキシノール-10(TRITON X-100)、コハク酸水素α-トコフェリル、硫酸ゲンタマイシン、リン酸一ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、臭化セチルトリメトリアンモニウム(cetyltrimethlyammonium)、及びβ-プロピオラクトン、チメロサール、コハク酸水素α-トコフェリル、加水分解ブタゼラチン、アルギニン、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸プロタミン、メタ重亜硫酸ナトリウム、ベロ細胞タンパク質、CRM197タンパク質、ビタミン、ウシ仔ウシ血清、尿素、コハク酸塩緩衝液、等張性生理食塩溶液、フェノール、M-199培地、ニワトリタンパク質、ポリゲリン、クロルテトラサイクリン、デキストラン、ダルベッコ変法イーグル培地、硫酸マグネシウム、硝酸鉄(III)、L-シスチン、L-チロシン、ソルビトール、キサンタン、水、EDTA、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、3-O-デサクル4'モノホスホリルリピドA(MPL)、QS-21、及びコレステロール。
一実施形態では、賦形剤は、アルギニン、グルタミン、及びトレハロースであってもよい。
好適には、免疫原性組成物は、流体として、好適には液体として製剤化される。好適には、賦形剤及び添加剤は、製剤が液体、好適には注射可能な液体となるように選択される。
免疫原性
「免疫原性」という用語は、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物が、対象において免疫応答を、好適には、対象において強力で好ましくは防御性の免疫応答を誘発することが可能であることを意味する。したがって、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、対象において抗体応答を、及び/又は対象において非抗体に基づく免疫応答を生じさせることが可能であってもよい。好適には、これは、その免疫原性活性と呼ばれる場合がある。
実施例に示されているように、本発明者らは、本発明のVLPを含む免疫原性組成物が、対照ワクチンと比較して、向上されないとしても同等の免疫原性活性を呈することを実証した。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、本発明のVLPを含むワクチンが、対照ワクチンと比較して、より迅速であり、より持続的で一貫した免疫原性応答を誘発したことを見出した。したがって、本発明のVLPは、医薬としての療法的使用に十分に適した免疫原性活性を示す。
好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の免疫原性活性は、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の投与後の対象に存在する抗体の量、つまり抗体産生、好適には、VLPの抗原に結合する抗体の量により決定することができる。好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の投与後に対象に存在する抗体の量、つまり抗体産生は、一定期間にわたって持続し、一貫している。好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の免疫原性活性は、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の投与後に、所与の期間にわたって対象に存在する抗体の量により、つまり所与の期間にわたる抗体産生により決定してもよい。好適な期間は、下記に概説されている。抗体の量とは、その力価又は濃度、好適には、血清中の抗体の濃度を意味する。
好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも5日間、少なくとも10日間、少なくとも15日間、少なくとも20日間、少なくとも25日間、少なくとも30日間、少なくとも35日間、少なくとも40日間、少なくとも45日間、少なくとも50日間、少なくとも55日間、少なくとも60日間、少なくとも65日間、少なくとも70日間、少なくとも75日間、少なくとも80日間、少なくとも85日間、少なくとも90日間、少なくとも95日間、又は少なくとも100日間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原性活性を持続させることができる。好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも110日間、少なくとも120日間、少なくとも130日間、少なくとも140日間、少なくとも150日間、少なくとも160日間、少なくとも170日間、少なくとも180日間、少なくとも190日間、少なくとも200日間、少なくとも210日間、少なくとも220日間、少なくとも230日間、少なくとも240日間、少なくとも250日間、少なくとも260日間、少なくとも270日間、少なくとも280日間、少なくとも290日間、少なくとも300日間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原活性を持続させることができる。
好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも14週間、少なくとも16週間、少なくとも18週間、少なくとも20週間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原性活性を持続させることができる。好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも30週間、少なくとも40週間、少なくとも50週間、少なくとも60週間、少なくとも70週間、少なくとも80週間、少なくとも90週間、少なくとも100週間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原性活性を持続させることができる。
好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも1年間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、少なくとも4年間、少なくとも5年間、少なくとも6年間、少なくとも7年間、少なくとも8年間、少なくとも9年間、又は少なくとも10年間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原活性を持続させることができる。好適には、本発明のVLP又はVLPを含む免疫原性組成物は、少なくとも10年間、少なくとも15年間、少なくとも20年間、少なくとも25年間、少なくとも30年間、少なくとも35年間、少なくとも40年間、少なくとも45年間、少なくとも50年間、又はそれよりも長期間、対象において免疫原性活性を持続させることができる。
好適には、免疫原性活性は、免疫原性抗体産生、好適には、免疫原性である濃度の抗体産生、好適には、免疫原性である血清濃度の、好適には、例えば、1～20μg/ml、1～18μg/ml、1～16μg/ml、1～14μg/ml、1～12μg/ml、2～18μg/ml、2～16μg/ml、2～14μg/ml、2～12μg/ml、又は2～10μg/mlの血清濃度の抗体産生を指すことができる。
当業者であれば、実施例に示されている情報を考慮して、本発明のVLP又は免疫原性組成物が、本明細書に記載の様式での療法使用に十分に適した免疫原性活性を呈することを認識するだろう。
医療使用
本発明は、疾患の療法又は予防及び/若しくは治療に使用するためのVLP又はVLPを含む免疫原性組成物の使用に更に関する。
更なる態様では、本発明は、疾患を有する対象を治療するための方法であって、第1の態様又は第2の態様によるVLP又は第11の態様による免疫原性組成物を有効量で対象に投与することを含む方法を更に提供する。
更なる態様では、本発明は、疾患を治療するための医薬を製造するための方法であって、医薬は、第1の態様又は第2の態様によるVLP又は第11の態様による免疫原性組成物を有効量で含む、方法を更に提供する。
好適には、疾患は、感染性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、神経疾患、又はリウマチ性変性疾患、又は中毒から選択することができる。
好適な感染性疾患としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、又は原虫感染症が挙げられる。
好適なウイルス感染症としては、以下のものが挙げられる:COVID-19、SARS、MERS、インフルエンザ、風邪、RSウイルス感染症、アデノウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、ノロウイルス感染症、ロタウイルス感染症、アストロウイルス感染症、麻疹、おたふく風邪、風疹、水痘、帯状疱疹、バラ疹、天然痘、第五病、チクングニヤウイルス感染症、HPV感染症、A型、B型、C型、D型、又はE型肝炎、疣贅、ヘルペス、伝染性軟属腫、エボラ出血熱、ラッサ熱、デング熱、黄熱病、マールブルグ出血熱、クリミア-コンゴ出血熱、ポリオ、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性脳炎、狂犬病、ジカウイルス感染症、西ナイルウイルス感染症、HIV/AIDS、ハンタウイルス感染症、HPS。
好適な細菌感染症としては、以下のものが挙げられる:尿路感染症、膀胱炎、膿痂疹、細菌性食中毒、カンピロバクター症、C.ディフィシレ(C.difficile)感染症、細菌性蜂窩織炎、MRSA、CRPA、VRSA、敗血症、丹毒、壊死性筋膜炎、細菌性毛嚢炎、淋病、クラミジア、梅毒、マイコプラズマ・ゲニタリウム(mycoplasma genitalium)、細菌性膣炎、骨盤炎症性疾患、結核、百日咳、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)症、肺炎、細菌性髄膜炎、ライム病、コレラ、ボツリヌス菌中毒、破傷風、炭疽菌、クリプトスポリジウム症、ジフテリア、大腸菌感染症、レジオネラ症、レプトスピラ症、リステリア症、サルモネラ感染症、赤痢菌胃腸炎、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、TSS、腸チフス、エルセニア感染症。
好適ながんとしては以下のものが挙げられる:乳がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、脳がん、前立腺がん、腸がん、直腸がん、骨がん、白血病、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、眼がん、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、胆嚢がん、頭頸部がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、中皮腫、ミエローマ、リンパ腫、卵巣がん、食道がん、口腔がん、上咽頭がん、鼻副鼻腔がん、皮膚がん、肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、陰茎がん、外陰がん。
好適な自己免疫疾患としては、以下のものが挙げられる:喘息、乾癬、MS、関節リウマチ、反応性関節炎、狼瘡、炎症性腸症候群/疾患、1型糖尿病、ギラン・バレー症候群、脱髄性多発ニューロパチー、グレーブス病、ハシモ甲状腺炎(Hashimo's thyroiditis)、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群、川崎病、脱毛症、白斑、強皮症、シェーグレン症候群、クローン病、セリアック病、アジソン病、ナルコレプシー。
好適な心血管疾患としては、狭心症、心臓発作、心不全、冠状動脈性心疾患、脳卒中、一過性虚血発作、末梢動脈疾患、大動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脳血管疾患、腎動脈狭窄症、動脈瘤、心筋症、肺心症、不整脈、律動異常、心内膜炎、心肥大、心筋炎、心臓弁膜症、先天性心疾患、リウマチ性心臓病が挙げられる。
好適な代謝疾患としては、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、高脂血症、高ビリルビン血症、高カルシウム血症が挙げられる。
好適な炎症性疾患としては、上記の感染症又は自己免疫疾患のいずれかを挙げることができる。好適な炎症性疾患としては、関節炎、喘息、結核、歯周炎、慢性潰瘍、副鼻腔炎、肝炎、糸球体腎炎、炎症性腸症候群/疾患、灌流前傷害、移植拒絶反応、鎌状赤血球症、アレルギー、心血管疾患、乾癬、サイトカイン媒介性そう痒症、COPD、糖尿病、気管支炎、クローン病、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、動脈炎、狼瘡を挙げることができる。
好適な神経疾患としては、以下のものが挙げられる:アルツハイマー病、運動失調、ALS、ベル麻痺、脳腫瘍、動脈瘤、てんかん、ギラン・バレー症候群、水頭症、髄膜炎、MS、筋ジストロフィー、神経皮膚症候群、パーキンソン病、片頭痛、脳炎、重症筋無力症、認知症、発作、脊髄性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、脊柱管狭窄症、ニューロパチー、慢性疲労症候群、脳性麻痺(cerebal palsy)。
好適なリウマチ性変性疾患としては、関節リウマチ、関節乾癬、脊椎関節症、変形性関節症、狼瘡、全身性硬化症が挙げられる。
好適な中毒としては、アルコール、ニコチン、カフェイン、アンフェタミン、オピオイド、鎮静剤、催眠薬、抗不安薬、コカイン、カンナビノイド、幻覚剤、フェニシルシジン(phenycylcidine)が挙げられる。
一実施形態では、VLP又は免疫原性組成物は、COVID-19の予防又は治療に使用するためのものである。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、SARS-CoV-2抗原、好適にはSARS-CoV-2スパイクタンパク質であってもよい。その代わりに、そのような実施形態では、機能性分子は、炎症性サイトカイン、好適にはIL-33であってもよい。
一実施形態では、VLP又は免疫原性組成物は、乾癬又は関節炎の予防又は治療に使用するためのものである。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、炎症性サイトカイン、好適にはIL17であってもよい。
一実施形態では、VLP又は免疫原性組成物は、喘息又はアトピー性皮膚炎の予防又は治療に使用するためのものである。好適には、そのような実施形態では、機能性分子は、炎症性サイトカイン、好適にはIL13又はIL33であってもよい。
好適には、対象への投与の有効量は、疾患を予防又は治療するための有効量である。好適な有効量は、熟練の医師であれば容易に決定することができる。
好適には、用量は、有効量を含む。VLPの好適な用量は、10～100マイクログラム、好適には10～80マイクログラム、好適には20～60マイクログラム、好適には20～40マイクログラムを含んでいてもよい。
好適には、VLP又は免疫原性組成物は、任意の経路により投与することができる。好適には、VLP又は免疫原性組成物は、経腸的に又は非経口的に投与してもよい。好適には、VLP又は免疫原性組成物は、経口、直腸的、膣的、舌下、注射、経皮、又は吸入により投与してもよい。
一実施形態では、VLP又は免疫原性組成物は、注射により、好適には皮下注射により投与してもよい。
一実施形態では、VLP又は免疫原性組成物は、吸入により、好適には鼻吸入により投与してもよい。
対象
本発明は、VLP又はその免疫原性組成物を使用することにより、対象における疾患を予防及び/又は治療することに関する。
好適には、対象は、ヒト又は動物であってもよい。したがって、好適には、疾患の予防及び/又は治療は、獣医学分野であってもよい。
好適には、対象は、成体又は子であってもよい。好適には、対象は、雄又は雌であってもよい。一実施形態では、対象は、成体ヒトである。
好適には、対象は、疾患を有すると診断されていてもよい。
その代わりに、対象は、疾患を有することが疑われていてもよい。好適には、対象は、疾患の1つ又は複数の症状を示していてもよい。
その代わりに、対象は、疾患を罹患するリスクがあってもよい。好適には、対象は、疾患に関連付けられる1つ又は複数のリスク因子を有していてもよい。好適なリスク因子としては、例えば、体重、喫煙、アルコール又は薬物中毒、年齢、性別、人種、遺伝を挙げることができる。好適なリスク因子としては、例えば、特定の遺伝子の発現による、又は遺伝子における特定の突然変異の存在による、疾患に対する遺伝的素因を更に挙げることができる。
一実施形態では、疾患を有すると診断されている対象、又は疾患の1つ又は複数の症状を有する対象に、疾患を治療するためにVLP又は免疫原性組成物が提供される。
一実施形態では、疾患を発症するリスクがある対象に、疾患を予防するためにVLP又は免疫原性組成物が提供される。
他の使用
本発明は、疾患の研究及び診断におけるVLPの使用に更に関する。
好適には、第1の態様又は第2の態様のVLPを研究に使用することができる。好適には、VLPは、検出ツールとして使用することができる。好適には、VLPを標識として使用することができる。好適には、そのような実施形態では、VLPは、蛍光分子である機能性分子を含む。
好適には、VLPは、抗体等の抗原結合性分子である第1の機能性分子、及び蛍光分子である第2の機能性分子を含んでいてもよい。好適には、抗原結合性分子は、細胞表面受容体に特異的に結合することができる。好適な細胞表面受容体は、本明細書の他所で考察されているが、好適には、細胞表面受容体は、細胞タイプに特異的である。したがって、好適には、VLPは、特定の細胞タイプに結合し、それを標識することが可能である。
好適には、VLPを担体として使用することができる。好適には、そのような実施形態では、VLPは積荷を含んでいてもよい。好適には、積荷は、VLP内に、好適にはVLP殻内に含まれていてもよい。好適には、積荷は、療法用分子であってもよい。したがって、好適には、VLPは、それ自体は療法薬でなくてもよいが、療法用分子の担体であってもよい。好適な療法用分子としては、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチドを挙げることができる。一実施形態では、療法用分子は、特定の核酸の発現を抑制するように作用することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。別の実施形態では、療法用分子は、細胞死を引き起こすように作用することができる細胞傷害性化学物質を含んでいてもよい。
好適には、そのような実施形態では、VLPは、特定の部位、例えば、療法用分子が必要とされる特定の細胞又は細胞タイプを標的とする。好適には、これは、抗体等の抗原結合性分子である機能性分子を含むVLPにより達成される。好適には、抗原結合性分子は、細胞表面受容体に、好適には、標的細胞に特異的な細胞表面受容体に特異的に結合することができる。好適には、細胞表面受容体との結合は、細胞内へのVLPの取込みを刺激することができる。したがって、好適には、VLPは、特定の細胞タイプに結合し、そこに積荷を送達することが可能である。
本発明の更なる態様では、積荷に加えて、第1の態様又は第2の態様の特徴を含む担体VLPであって、積荷はVLP殻内に含まれている、担体VLPが提供される。好適には、積荷は、療法用分子である。
好適には、第1の態様又は第2の態様のVLPは、診断にも使用することができる。
好適には、VLPは、抗体等の抗原結合性分子である第1の機能性分子を含む。好適には、抗体は、上記で考察されているように、疾患原因物質に由来する、好適には、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、又は古細菌等の感染性因子に由来する抗原に特異的に結合する。
したがって、好適には、VLPは、疾患原因物質に結合し、その検出を可能にすることが可能である。
したがって、好適には、本発明のVLPは、本発明の第16の態様による疾患を診断するための方法に使用することができる。好適には、対象における疾患を診断するための方法であって、
(a)本発明の第1の態様又は第2の態様によるVLPを準備する工程であり、機能性分子は、疾患原因物質に由来する抗原に対する抗原結合性分子である、工程、
(b)VLPを、対象に由来する好適な試料と混合する工程、
(c)VLPが沈殿するか否かを検出する工程、
(d)VLPが沈殿した場合、疾患の存在を診断する工程
を含む方法が提供される。
好適には、機能性分子が抗原結合性分子であることを考慮すると、VLPは、第3の結合タンパク質を更に含む。第3の結合タンパク質は、本明細書の他所に記載されている。好適には、抗原結合タンパク質は、第3の結合タンパク質を介して第2の結合タンパク質に間接的に付着している。
好適には、検出は、疾患原因物質に結合したVLPの沈殿による。好適には、沈殿の検出は、視覚的確認又は分光計による試験を含んでいてもよい。
好適には、沈殿が生じない場合には、疾患は存在しない。
また、好適には、VLPは、蛍光分子である第2の機能性分子を含んでもよい。好適には、そのような第2の機能性分子は、第1の結合タンパク質の化学修飾に付着していてもよい。そのような実施形態では、好適には、検出工程は、試料中の蛍光の存在を検出することを含んでいてもよい。好適には、検出工程は、試料中の蛍光沈殿の存在を検出すること、好適には、蛍光沈殿が生じた場合、疾患の存在を診断することを含んでいてもよい。
有利には、蛍光を使用することにより、試料中の沈殿のより高感度な検出が可能になる。
一実施形態では、この診断方法で使用されるVLPは、
- 1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質、
- 化学修飾を含む1つ又は複数の第1の結合タンパク質、
- 1つ又は複数の第3の結合タンパク質に付着した1つ又は複数の第2の結合タンパク質、
- 1つ又は複数の機能性分子
を含み、
各ウイルスカプシドタンパク質は第1の結合タンパク質に付着しており、各第1の結合タンパク質は第2の結合タンパク質に付着しており、各第3の結合タンパク質は第1の機能性分子に付着しており、各化学修飾は第2の機能性分子に付着しており、
好適には、第3の結合タンパク質に結合した第1の機能性分子は、抗原結合性分子であり、好適には、第1の結合タンパク質の化学薬剤に付着した第2の機能性分子は、蛍光分子である。
対象に由来する好適な試料は、血液試料、唾液試料、血清試料、痰試料、精子試料、粘液試料、CSF試料であってもよい。好適には、試料は流体試料である。
好適には、この診断方法は、試料をVLPと共に、好適には、VLPが試料中の任意の抗原と結合して沈殿するのに十分な時間にわたって、好適には少なくとも1分間、好適には最長30分間、好適には最長25分間、好適には最長20分間、好適には最長15分間、インキュベートする工程を更に含んでいてもよい。
この方法により検出することができる好適な疾患は、本明細書の上記に列挙されているもののいずれであってもよい。
好適には、この診断方法は、疾患が診断された場合、対象を治療する工程を更に含んでいてもよい。好適には、対象の治療は、関連疾患に対する任意の既知の治療剤の有効量を対象に投与することを含んでいてもよい。
本発明のある特定の実施形態を、以下の例を参照してこれから説明するものとする。
物質及び方法
プラスミドは全て、ダンディー大学配列決定及びクローニングサービス(https://www.dnaseq.co.uk)により供給され、同機関はクローニングサービス並びに配列検証も実施した。使用したプラスミド:Pet-28 a(+)、pETDuet 1、pcDNA5D
修飾VLP殻のクローニング
Im7又はバルスターとのHBc融合のためのクローニング戦略:
Im7(GenBank受入Genbank:KJ470776.1)及びバルスター(GenBank ARW38026.1)のORFを、GGGGSGGGGS(配列番号33)からなるリンカーでいずれかの側を伸長させ、それぞれ、B型肝炎コア抗原(GenBank受入Genbank:KJ470776.1)のM1～Leu76をコードする配列でN末端を伸長させ、B型肝炎コア抗原のPro79～V145をコードする配列及びそれに続く停止コドンでC末端を伸長させた。得られた配列(Table 3(表3):ヌクレオチド配列)を、Xba1及びNot1の制限部位を有する商業的遺伝子合成物として購入し、pET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした。
選択したエピトープタンパク質とのColE7融合のためのクローニング戦略:
E444から始まるコリシンE7の触媒ドメインのORF(GenBank受入Genbank:KJ470776.1)を、突然変異:R538A、E542A(Ku、NAR、2002年)、His569A (Ko、Structure、1999年)を有するように修飾し、Im7結合能力を保持させつつ、完全な触媒活性不活化を保証した。N末端メチオニン並びにTEVプロテアーゼ切断部位、それに続いてC末端にグリシン/セリンリンカーを付加した。この配列を、それぞれNdeI制限部位及びBamH1制限部位でフランキングした。この配列を、商業的遺伝子合成物として購入し、Im7に融合されたB型肝炎カプシドをコードするORFを有するpET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした(上記を参照)。
選択したエピトープタンパク質とのバルナーゼ融合のためのクローニング戦略:
残基A40から始まる(シグナルペプチドを省略)バルナーゼの触媒ドメインのORF(GenBank受入Genbank:AAA86441.1、ヌクレオチド403～732)を、N末端メチオニンで伸長させ、触媒活性を排除するためにE73Wに突然変異させ、TEVプロテアーゼ切断部位でC末端を伸長させ、それに続いてC末端をグリシン/セリンリンカーで伸長させた。この配列を、それぞれNdeI制限部位及びBamH1制限部位でフランキングした。この配列を、商業的遺伝子合成物として購入し、バルスターに融合されたB型肝炎カプシドをコードするORFを有するpET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした(上記を参照)。
選択したエピトープ又は提示させる更なる結合タンパク質のクローニング戦略:
提示されるエピトープタンパク質のORF(それぞれ、マウスIL33、ヒトIL13、又は更なる結合タンパク質のC末端断片;プロテインG)を、公的に利用可能なソフトウェアを使用して大腸菌でのコドン使用に最適化し、それぞれBamH1制限部位及びXhoI制限部位で伸長させ、それぞれの配列において詳述されているように、ColE7若しくはバルナーゼのいずれかの下流又はColE7の上流(プロテインGの場合)でのインフレームクローニングを可能にした(Table 2(表2):アミノ酸配列)。ヌクレオチド配列を、商業的遺伝子合成物として購入し、上記のように、それぞれColE7 ORF又はバルナーゼORFを有するように事前にクローニングしたpET-Duet 1ベクター(Novage社)にクローニングした。注:Sars-Cov2エピトープタンパク質は、哺乳動物細胞で発現させたため、こうした配列最適化は必要なかった。
修飾VLP殻及びエピトープ融合タンパク質の発現
トランスフェクション:
コンピテントBL21 DE3及びP812細胞(ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子を有するようにBL21-DE3から誘導した遺伝子操作された細胞株、ジスルフィド結合を有するタンパク質の発現を容易にする。このような株は当技術分野で公知である)を、100ngの対応するプラスミドで形質転換し、氷上で30分間インキュベートしてから、42℃で30秒間ヒートショックを行った。100ulのLB培地を細菌バイアルに添加し、37℃で1時間更にインキュベートし、続いて寒天プレートに広げ、一晩培養した。
誘導:
3×4mlの開始培養物を2×YT培地(Sigma社)で調製し、200rpmで振盪しながら37℃で一晩増殖させた。各開始培養物1mlを、2×YTで最終容積20mlに増量し、OD600が0.6～0.8に達するまで37℃で培養した。未誘導試料を収集し、14,000rpmで1分間遠心分離し、上清を除去し、100ulの2×Laemmli緩衝液(Sigma社)をペレットに添加した。培養物を、0.5mM IPTG及び5mM MgCl2を用いて誘導し、200rpmで振盪しながら18℃で一晩VLPを発現させた。誘導した100ulのライセートを14,000rpmで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100mlの2×Laemmli緩衝液に再懸濁した。
VLP骨格及びエピトープタンパク質を別々に誘導するように設計されたプラスミドでは、40ng/mlのアンヒドロテトラサイクリンを15～20℃で4～16時間添加することにより後者を誘導した。
細胞破壊(分析用):
培養物を、4,000rpmで10分間4℃にて遠心分離することにより回収し、上清を破棄し、ペレットを秤量し、溶解緩衝液(培養物1g当たり溶解緩衝液3ml)中で2分10秒間の休止間隔で30秒間超音波処理した。10%のTriton x100を最終濃度が0.5%になるように添加し、続いて超音波処理した。50ulの溶解物質を14,000rpmで1分間遠心分離し、上清を150ulの2×Laemmli緩衝液に添加し、ペレットを200mlの2×Laemmli緩衝液に再懸濁した。残りの溶解培養物を4,000rpmで10分間遠心分離し、上清を50mlのポリプロピレンチューブに移し、凍結した。12%Bis-Tris Nu-Page SDS-PAGE(Thermofisher社)ゲルを100Vで2.5時間泳動させ、続いてInstant Blueクーマシー染色剤で1時間染色して、VLP発現を分析した。
細胞破壊(分取用):
細胞を上記のようにペレット化し、続いてHepes 50mM、pH7.0、200mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Pierce社)を添加し、続いて一切の界面活性剤の非存在下で高圧ホモジナイズした。得られた溶解物を、4℃、18000gで30分間遠心分離することにより清澄化した。
VLPの精製
イオン交換クロマトグラフィー - ジエチルアミン(DEAE、BIA Separations社/Sartorius社):
DEAEカラム(IBS)を、室温にて、10カラム容量の脱イオン水及び10カラム容量の20mM/50mM 50mM Tris-HCl pH7で平衡化した。濾過した粗抽出物を5mlシリンジで負荷し、フロースルーを収集した。カラム結合物質を洗浄し、NaClの段階勾配(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M、及び2M)で溶出した。1条件毎に3×1ml画分を収集し、氷上で保管した。DEAEカラムを、10カラム容量の2M NaCl、10カラム容量の2M NaCl及び1M NaOHを含む緩衝液、10カラム容量の脱イオン水で洗浄し、続いて、その後使用するまで20%イソプロパノールで4℃にて保管した。得られた試料を、Nanodropでの280nmのタンパク質吸光度及びBCA定量化(Thermofisher社)を使用して定量化した。精製物を、100Vで2.5時間泳動させ、続いてInstant Blue (Abcam社)クーマシー染色剤で1時間染色した12% Bis-Tris NuPage SDS-PAGEゲルを使用して分析した。
イオン交換クロマトグラフィー - 第四級アミン(QA、BIA Separations社/Sartorius社):
QAカラム(IBS)を、室温にて、10カラム容量の脱イオン水及び10カラム容量の20mM/50mM Tris-HCl pH7で平衡化した。濾過した粗抽出物を5mlシリンジで負荷し、フロースルーを収集した。カラム結合物質を洗浄し、NaClの段階勾配(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M、及び2M)で溶出した。1条件毎に3×1ml画分を収集し、氷上で保管した。DEAEカラムを、10カラム容量の2M NaCl、10カラム容量の2M NaCl及び1M NaOHを含む緩衝液、10カラム容量の脱イオン水で洗浄し、続いて、その後使用するまで20%イソプロパノールで4℃にて保管した。得られた試料を、Nanodropでの280nmのタンパク質吸光度及びBCA定量化(Thermofisher社)を使用して定量化した。精製物を、100Vで2.5時間泳動させ、続いてInstant Blue (Abcam社)クーマシー染色剤で1時間染色した12% Bis-Tris NuPage SDS-PAGEゲルを使用して分析した。
イオン交換クロマトグラフィー - 混合モード(PrimaS、BIA Separations社/Sartorius社):
PrimaSカラム(IBS)を、室温にて、10カラム容量の脱イオン水及び10カラム容量の20mM/50mM Tris-HCl pH7で平衡化した。濾過した粗抽出物を5mlシリンジで負荷し、フロースルーを収集した。カラム結合物質を洗浄し、NaClの段階勾配(0.1M、0.3M、0.5M、0.7M、1M、及び2M)で溶出した。1条件毎に3×1ml画分を収集し、氷上で保管した。DEAEカラムを、10カラム容量の2M NaCl、10カラム容量の2M NaCl及び1M NaOHを含む緩衝液、10カラム容量の脱イオン水で洗浄し、続いて、その後使用するまで20%イソプロパノールで4℃にて保管した。得られた試料を、Nanodropでの280nmのタンパク質吸光度及びBCA定量化(Thermofisher社)を使用して定量化した。精製物を、100Vで2.5時間泳動させ、続いてInstant Blue (Abcam社)クーマシー染色剤で1時間染色した12% Bis-Tris NuPage SDS-PAGEゲルを使用して分析した。
混合モードサイズ排除クロマトグラフィー:
自己充填用0.5ml直径10camガラスカラムにCaptoCore 700(GE Healthcare社)を満たし、20% ETOHで充填した。このカラムを、室温にて、10カラム容量の脱イオン水及び10カラム容量の20mM Tris-HCl pH7で平衡化した。イオン交換クロマトグラフィーからの半精製試料を負荷し、1ml画分を収集した。カラムを、10カラム容量の30%イソプロパノール中1MのNaOHで、続いて10カラム容量の2M NaClで洗浄し、20% ETOH保管溶液と交換した。サイズ排除物を、100Vで2.5時間泳動させ、続いてInstant Blue (Abcam社)クーマシー染色剤で1時間染色した12% Bis-Tris NuPage SDS-PAGEゲルを使用して分析した。
(実施例1)
好適なVLP殻の特定及び最適化
インフレーム融合に成功した先例があり、二量体エピトープタンパク質の融合を可能にする二量体VLPタンパク質構造を呈し、臨床使用に適合した先例がある候補VLP殻を探求した。B型肝炎カプシド(HBc)が、VLPの好適な候補として特定された。
次いで、HBcタンパク質のアミノ酸配列を、結合タンパク質の挿入を考慮して以下ように最適化した。負荷電アミノ酸E77及びD78を欠失させて、主要イムノドミナント領域の正味負電荷を低減させ、タンパク質のフォールディングを加速させるために突然変異F97Lを付加し、天然ウイルスのRNAに結合するC末端配列を、残基V145の後で除去し、正の正味電荷配列をC末端に付加し、タンパク質表面に露出していないV145の下流に6個のヒスチジン残基を挿入することによりVLPを安定化した。得られたクローン:DU67866及びDU67867。
(実施例2)
タンパク質結合対の最適化
ColE7/Im7及びバルナーゼ/バルスターを、機能性分子とHBc VLP殻との付着に好適タンパク質結合対として選択した。
両対を、以下のように及び上記で説明したように更に最適化した。
ColE7:
・ 公的リポジトリにあるX線構造を検討することに基づき、Im7との結合に必要な触媒ドメインの必須断片を選択する。E444から始まるコリシンE7の触媒ドメイン(GenBank受入:KJ470776.1)のORFを、突然変異:R538A、E542A(Ku、NAR、2002年)、His569A(Ko、Structur、1999年)を有するように修飾し、Im7結合能力を保持させつつ、完全な触媒活性不活化を保証した。
・ N末端メチオニン並びにTEVプロテアーゼ切断部位、それに続いてC末端にグリシン/セリンリンカーを付加した。この配列を、それぞれNdeI制限部位及びBamH1制限部位でフランキングし、Im7に融合したHepBカプシドのバリアントのORFを有するpET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした(下記を参照)。
・ Im7:Im7(GenBank受入:KJ470776.1)のORFを、リンカー配列GGGSGGGSでいずれかの側を伸長させ、それぞれ、B型肝炎コア抗原(GenBank受入:KJ470776.1)のM1～Leu76をコードする配列でN末端を伸長させ、Pro79～V145をコードする配列及びそれに続く停止コドンでC末端を伸長させた。得られた配列に、Xba1及びNot1の制限部位を付与し、pET-Duet 1にクローニングした。
・ 上記で指定したIm7の一次配列に、タンパク質フォールディング速度の20倍増加を引き起こす突然変異:F41L(Capaldi、Nat Struct Biol 2002年)を挿入する。
・ カプシド形成を増強することが知られている更なる突然変異:F97L(Alexander、PNAS 2013年)を、上記で指定のIm7配列に挿入する。
バルナーゼ:
・ (Want、Biophys J 2004年)のデータに基づき、バルスター結合を保持するが触媒活性を無効にすることになる突然変異を選択する。E73->Qを試験したが、残留毒性を保持していることが見出された。したがって、E73->Wを選択し、この配列に挿入した。
・ 残基A40から始まる(シグナルペプチドを省略)バルナーゼの触媒ドメイン(GenBank受入:AAA86441.1、ヌクレオチド403～732)のORFを、N末端メチオニンで伸長させ、E73Wに突然変異させ、TEVプロテアーゼ切断部位でC末端を伸長させ、それに続いてC末端をグリシン/セリンリンカー(GGGGSGGGGS配列番号33)で伸長させた。この配列を、それぞれNdeI制限部位及びBamH1制限部位でフランキングし、バルスターのORFを有するpET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした(下記を参照)。
バルスター:
・設計:システインの除去(C40->A、C82->A)
・設計:二量体化を無効にする突然変異、システインを消失させ、文献特徴付け(Korchuganov、2004年)に基づきタンパク質二量体化を除外するために選択された突然変異:I87->Eを挿入する
・クローニング:バルスター(GenBank:ARW38026.1)のORFを、リンカー配列(GGGGSGGGGS配列番号33)でいずれかの側を伸長させ、それぞれ、B型肝炎コア抗原(GenBank:KJ470776.1)のM1～Leu76をコードする配列でN末端を伸長させ、Pro79～V145をコードする配列及びそれに続く停止コドンでC末端を伸長させた。得られた配列を、Xba1及びNot1の制限部位で伸長させ、pET-Duet 1(Novagen社)にクローニングした。
(実施例3)
関連試験エピトープの選択
好適な試験エピトープを、タンパク質結合対を介してVLP殻に付着させた際に機能性分子として作用するように選択した。
IL-33、IL-13、及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメイン並びにヌクレオカプシドをエピトープとして選択した。IL-33を、関連ワクチン標的として、並びにCOVID及び喘息における過剰免疫応答の標的として選択した。IL-13を、アレルギーの関連ワクチン標的として選択した。IL-17を、乾癬の関連ワクチンとして選択した。この系が哺乳動物細胞におけるエピトープの発現に有効であることを実証するために、及びCovid-19の関連標的として、SARS-CoV-2スパイク受容体結合ドメインを選択した。
マウスIL-33(RefSeq NP_001158196)の場合、細胞外シグナル伝達カスパーゼ切断C末端断片(S109から始まる)を選択し、GGGGSGGGGS(配列番号33)リンカーを、N末端に挿入して、この断片を上流のColE7断片に付着させた。同種ST2受容体との結合を無効にし、それによりあらゆる非ワクチン関連受容体媒介性毒性を排除するために2つの突然変異:それぞれヒトIL33配列の突然変異D149K及びE165Kのマウス相当物を挿入した。この配列を、大腸菌に対してコドン最適化し、これは、公的に利用可能なソフトウェアを使用して行われ、得られた配列をそれぞれBamH1制限部位及びXhoI制限部位で伸長して、pET Duet 1プラスミドへの、ColE7又はバルナーゼのいずれかの下流でのインフレームクローニングを可能にした。得られたクローン:DU70051
ヒトIL-13(RefSeq NM_002188)の場合、SGGGSSGSGリンカー(配列番号35)を挿入してこの配列を上流のColE7断片に付着させ、次いで大腸菌に対してコドン最適化を実施した。得られたクローン:DU70076、DU70080。
ヒトIL-17(RefSeq NM_ NM_002190.3)の場合、SGGGSSGSGリンカー(配列番号35)を挿入して、この配列を上流のColE7断片に付着させ、次いで大腸菌に対してコドン最適化を実施した。得られたクローン:DU70721。
SARS-CoV-2-Spikeタンパク質の場合、構造誘導性受容体結合ドメイン(RBD)断片を選択及び単離した。好適な哺乳動物発現ベクターを選択した(pcDNA5D)。リンカーGGGGSGGGGS(配列番号33)を、この配列とN末端に位置するColE7との間に挿入した。得られたクローンはDU67808だった。より広範な標的ワクチン接種のために、SARS2ヌクレオカプシドタンパク質C末端断片の追加のC末端融合物を含む第2のクローンを作出した。得られたクローンはDU67817だった。次いで、発現のモニタリングを可能にするためにC末端融合eGFPを付加した第3のクローンを作出した。得られたクローンはDU67793だった。
(実施例4)
発現プラスミドの設計
原核生物発現には、プラスミド骨格pETDuetを使用した。プラスミドに付加された更なる特徴としては以下のものが挙げられる:
・ IPTG誘導性T7プロモーターにより駆動される第1の結合タンパク質(例えば、Im7)インフレーム融合物を有するHBcカプシドを含むVLP構築物、
・ IPTG誘導性T7プロモーター、又はVLP及びエピトープタンパク質の等しい発現を可能にするためのより低い活性を有する調整されたT7プロモーターにより駆動される第2の結合タンパク質-エピトープタンパク質融合物(例えば、ColE7-IL13)、
・ その代わりに、独立したtetR/tetAプロモーター系を発現プラスミドに組み込むことによる、アンヒドロテトラサイクリンによるエピトープタンパク質(例えば、ColE7-IL33)の独立した誘導性、
・ VLP構築物ColE7-エピトープタンパク質融合物の誘導性発現を駆動するためのLacI、
・ エピトープのみを単離発現させるために挿入して、ELISAのための抗原としてのエピトープタンパク質の精製を容易にする任意選択のTEVプロテアーゼ部位、
・ バイオプロセス応用向けの、Amp又は非ベータラクタム等のプラスミド耐性遺伝子。
基本的プラスミド設計が、クローン67866、67867、70076、70051、70080、70059、70126、65750、70680、70612に適用される。
真核生物発現には、プラスミド骨格pcDNA5Dを使用した。このプラスミドに追加された更なる特徴としては、以下のものが挙げられる:
・ 哺乳動物細胞における強力な発現のためのCMVプロモーター、
・ 産物を細胞培養培地へと分泌させるための強力なシグナルペプチド、
・ エピトープタンパク質(例えば、SARS-CoV-2-Spike RBD)とN末端融合され、エピトープタンパク質のシャペロンとして機能する結合タンパク質(例えば、ColE7)、
・ 任意選択のtetリプレッサー系、
・ 任意選択の精製用C末端ヘキサ-Hisタグ、
・ バイオプロセス応用向けの、AmpR又はHygR又は非ベータラクタム等のプラスミド耐性遺伝子。
基本的プラスミド設計が、クローンDU67808、DU67793、DU67808に適用される。
(実施例5)
候補タンパク質の発現
プロトコール(より詳細は上記):クローンDU70080を有する大腸菌BL21D3の開始培養物に接種し、次いで25mlの培養物に接種し、OD0.7まで増殖させ、次いで1mMのIPTGで22時間18℃にて誘導する。細胞をペレット化し、20mM Tris/HCl、pH 7.0、100mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤カクテルに再懸濁し、高圧ホモジナイザーで破砕し、アリコートを「ライセート」として採取し、4℃、18,000Gで30分間遠心し、上清を「サイトゾル」として採取し、triton X100及び尿素を含む緩衝液にペレットを「不溶性物」として再懸濁する
候補タンパク質の予想サイズ:HBc-Im7:27.6kDa。Col7-IL13:28.8kDa。
SDS-PAGEは、3つのクローンにわたって両予想サイズのバンドを示す。HBc-Im7融合VLP骨格は、同一のT7プロモーター使用にも関わらず、大腸菌にて高度に可溶性であり、ColE7-IL13融合物は全体的により高い発現を示す。可溶性サイトゾルでは、VLP骨格及びサイトカイン発現がより均一に分布している。
(実施例6)
候補タンパク質の精製
プロトコール(より詳細は上記):VLP含有サイトゾル画分を上記のように調製する。15G遠心分離及び0.2ミクロン濾過により清澄化し、Tris-HCl、pH7.0中で表記のNaCl段階的勾配を用いて流速1ml/分にてCIM-モノリスカラム(Sartorius社)に流す。画分を12%ゲルでのSDS-PAGEにより分析した。
DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー後のSDS-PAGEは、HBc-Im7 VLPが、弱DEAE陰イオン交換体で親和性クロマトグラフィー様の溶出プロファイルを示し、わずか1M NaClで溶出することを示す。
プロトコール(より詳細は上記):得られたDEAE精製HBc-Im7 VLP画分を、流速1ml/分において示されているように段階的NaCl勾配を適用してpH7.0における混合モードクロマトグラフィー(PrimaS 1mlカラム、Sartorius社)に供した。画分を採取し、SDS-PAGEで分析した。
混合モードクロマトグラフィー後のSDS-PAGEは、HBc-Im7融合VLPが、疎水性誘導体化ポリメタクリレートと不可逆的に結合することを示す。
プロトコール(より詳細は上記):得られたDEAE精製HBc-Im7 VLP画分を、代替的には、マルチモードサイズ排除クロマトグラフィー(CaptoCore 700、1mlカラムに負荷、直径0.5cm、流速1.5ml/分、Tris/HCl 20mM pH 7.0、300mM NaCl中)に供した。レジンは、大きな粒子をおよそ700kDのカットオフで排除する。より小さな粒子は、架橋アガロースビーズの内側に含まれているオクチルアミンにより捕捉される。画分を採取し、SDS-PAGEで分析した。
マルチモードサイズ排除クロマトグラフィー後のSDS-PAGEは、HBc-Im7がマルチモードサイズ排除クロマトグラフィーで見かけ上均質に精製されたことを示す。
(実施例7)
VLPの形成
プロトコール:HBc-Im7 VLPを、上記で詳述したように見かけ上均質に精製し、10mM Tris/HCl、pH7.0、200mM NaCl中にてタンパク質含有量1.5mg/mlの濃度にした。VLP試料を、カーボンコーティングメッシュグリッドに堆積させた。その後、試料をグリッドに負荷し、室温で1分間インキュベートした。過剰な試料をグリッドから排出した。試料を2%酢酸ウラニルを用いて室温で1分間ネガティブ染色した。過剰な染色剤を排出し、グリッドを室温で乾燥させた。TEM検査は、JEOL JEM-2200FS電子顕微鏡を使用して実施した。VLP直径の評価のため、各調製物についてn=150個のVLPから測定値を得た。各VLPについて2つの直径及び縁部の測定値を得た。統計的検定では、サイズ測定値の等分散及び正規分布を確認した後、両側独立t検定を実施した。
HBc-Im7融合VLPは、均一なVLPを形成し、親HBc-カプシド由来VLPと比較して直径の増加を示す(38.3±2対29±2nm、p<0.001)。
HBc-Im7融合VLPは、外側高電子密度縁部の厚さの有意な増加を示す。観察可能な縁部厚の増加(10.2±1.5対5.7±1.2nm、p<0.0001)は、HBc主要イムノドミナント領域から突出したIm7ドメインタンパク質の追加層と一致する。
(実施例8)
VLPの免疫原性
プロトコール:高齢雌C56B/6jマウス(研究開始時に15月齢)に、5ugのHBc-Im7 VLPを鼻腔内ワクチン接種し(各群n=5)、また21日目に単回追加免疫ワクチン接種を行い、示されているように血清を採取した。データは、HBc-Im7をコーティング抗原として用いてELISAにより分析した。
データは、HBc-Im7 VLPが、鼻腔内ワクチン接種後に、高齢マウスにおいてでさえ強力な免疫応答を誘発することを示す。
(実施例9)
エピトープとVLPとの連結
プロトコール:大腸菌で発現させたVLP殻(レーン1)及びColE7融合IL33(レーン2)のサイトゾル画分をカップリングし(レーン3)、続いて上記で説明したようにCaptoCore700レジンでの混合モードサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、フロースルー画分(レーン5～7)を収集した。データはSDS-PAGE分析を示す。HBc-Im7 VLP殻とColE7-IL33エピトープ融合物とのカップリングの成功が達成されている。
プロトコール:Col-E7-RBD-GFPを、懸濁培養の293T細胞で分泌タンパク質として発現させた。細胞上清(レーン1)を収集し、DEAE精製HBc-Im7 VLP殻(レーン2)と共にインキュベートした。その後、培地を上記に記載のようにCaptoCore700レジンと共にバッチインキュベーションすることにより精製して、非VLPタンパク質(サイズ排除およそ700kDa)を除去し、枯渇細胞上清を限外濾過スピンカラムを使用して濃縮した(Pierce社、カットオフ100kD、レーン3)。データは、SDS-PAGE分析を示す。HBc-Im7 VLP殻とColE7-RBD-GFPエピトープ融合物とのカップリングの成功が達成されている。
(実施例10)
非共有結合によるVLPの化学修飾
プロトコール:TBTA及びTCEPを還元剤として使用し、90% DMSO及び10% PBSで構成される反応混合物中の最終濃度250uMローダミンを使用した、室温で1時間の銅触媒アジド-アルキン付加環化反応により、ローダミン-アジドをオクチンで誘導体化した。10ulのこの反応ミックスを、50mM Hepes、pH 7.0、200mM NaCl、20%グリセロールに溶解した、HBc-Im7-VLP(オレンジ色)又はHBc-カプシドVLP(青色)のいずれかを含む90ulのVLP-サイトゾル画分と1分間激しくボルテックスすることにより共インキュベートした。その後、100ulのVLP/ローダミンミックスを、50mM Hepes、20%グリセロールで予め平衡化した、100ulの充填Captocore700レジンと共にバッチで室温で回転させながら1時間インキュベートし、続いて遠心分離した(5000gで5分間)。50ulの上清(「C8-FITC後」)及び50ulの元のVLP画分(「C8-FITC前」)の蛍光を、488nmで励起させ520nmで発光させて測定した。
データにより、HBc-Im7融合VLPは、オクチルアミン誘導体化ローダミンとのインキュベーションにより蛍光標識することができるが、親HBc-カプシドVLPは蛍光標識できないことが示される。
(実施例11)
修飾VLPの生物物理学的沈降特性
プロトコール:HBc又はHBcIm7のいずれかを発現する大腸菌から新たに得たサイトゾル画分を、Beckman Coulter(商標)超透明遠心分離管を使用して60～20%(質量/容積)連続スクロース勾配に手作業で重層した。分離は、Sorvall Surespin 630ローターを使用し、4℃にて16時間30,000rpmで実施した。スクロース画分を、50～60%界面の間を21G針で穿刺することにより収集した。個々の画分を、データに示されているように(図13)、還元SDS-PAGEに供した。
VLPは大型構造物であり、スクロースでの密度遠心分離により、より小型のタンパク質から日常的に分離することができる。VLP等の大きな粒子は、単量体タンパク質とは対照的に、より高密度の、典型的には40～50%のスクロースと平衡化することになる。データにより、まさにこれが、Im7タンパク質が組み込まれたHBc由来VLPに見出されることが確認される。
図13は、HBc主要イムノドミナント領域にIm7が組み込まれたVLPの生物物理学的沈降特性を示すSDS-PAGE分析を示す。VLP粒子(黒色矢印)は、40～50%密度画分に存在すると予想される。修飾VLPは、野生型VLPと同様に挙動する。
(実施例12)
大腸菌でのVLPの完全性の確認
プロトコール:1%アガロースゲルを0.5×TBE緩衝液を使用してキャストし、1レーン当たり50μlの試料を60Vで1時間室温にて泳動した。Instant Blueクーマシーで一晩4℃にて染色した。SYBR(商標) safe(ThermoFisher社)を1:10,000希釈で使用し、ChemiDock(商標)ゲル画像化装置(BioRad社)で画像化した。
スクロース密度勾配画分を非還元アガロースゲル電気泳動(NAGE)に供した(図14)。この技法では、単量体VLPタンパク質の局在化を確認するSDS-PAGEとは対照的に、インタクトVLPの遊走が評価される。並行してNAGEゲルを泳動させ、タンパク質内容物のクマシーブルー染色(左側)又は核酸内容物のSYBR safe染色(右側)のいずれかで分析した。HBc VLPの精製試料が対照として含まれていた(一番左側のレーン)。
HBc VLPは、2つの構成で、240個のタンパク質サブユニットで構成されるわずかにより大きないわゆるT4バリアント又は180個のサブユニットで構成されるより小さなT3バリアントのいずれかとして存在することができる。これらは、NAGEゲルでは別個のバンドとして区別することができる。野生型VLP(上段)では、T3バンド及びT4バンドが明確に視認され(矢印で示されている)、より小さなT3粒子は、予想通り、密度のより低い40%画分に非常により豊富に含まれている。
Im7含有修飾VLP(下段)は、HBc野生型対照と比較してゲル内での遊走がシフトしたことを示しており、それらのサイズがより大きいことと一致する。相対的T4/T3密度は、野生型VLPで見られるものと同一であり、50%スクロース画分ではほぼ均等に分布し(灰色矢印)、40%クッションではT3バンドが非常により豊富に存在する(黒色矢印)。
大腸菌内部でのVLPアセンブリ中に、大腸菌由来RNAがVLPに組み込まれる。溶解の際、ベンゾナーゼを添加してDNAを消化する。したがって、スクロース勾配遠心分離後、高密度スクロース画分中にVLPと共局在する核酸は、VLP内にあるRNAである。複製ゲルのSYBR染色は、40%スクロース画分中のT3 VLPバンドと共局在化する高密度バンドを示す(白色矢印で示されている)。これは、VLP内部に局在化されたRNAがベンゾナーゼ消化から保護されていることを示し、それによりVLPの完全性が確認される。
(実施例13)
融合タンパク質の組込みは、B型肝炎コア抗原に対する一切の交差反応性を消失させる。
プロトコール:スクロース密度勾配により精製したVLPをPBSに対して透析した。図に示されている容積をニトロセルロース膜にスポットした。膜をBSA/PBSTでブロッキングし、続いてPBST中で抗HBcAg(Invitrogen社、MA1-7607、濃度0.1μg/ml)と共にインキュベートした。膜を洗浄し、二次抗体(ロバ抗ヤギHRP、1:10,000に希釈;Stratech社、705-035-147-JIR)に曝露し、続いて洗浄し、Amersham ECL(商標)ウエスタンブロッティング検出試薬で顕色させた。
HBc由来VLPは、ワクチンとして臨床的に使用することが意図されている。したがって、患者が生成する抗体は、患者が誤ってB型肝炎陽性であると識別されないように、B型肝炎抗体と交差反応しないことが重要である。B型肝炎による過去の感染を、HBcAg(C型肝炎抗原)に対する血清学的検査により定期的にスクリーニングする。HBcAg認識抗体は、Im7又はバルスターのいずれかの組込み時に破壊される、いわゆる「主要イムノドミナント領域(major immunodominant region)」(MIR)と反応する。データは、300ngの精製HBcAg(「HBc149」と表記)に対して、野生型C型肝炎カプシドに強力に反応する市販の抗体が、試験した全ての量(最大5μg)の精製HBc-Im7 VLPと反応しないことを示す。これにより、融合タンパク質の組込みは、B型肝炎コア抗原に対する一切の交差反応性を消失させることが確認される(図15)。
(実施例14)
HBc-Im7 VLPと野生型HBc VLPとのサイズ比較
プロトコール:TEM:試料を25mM Tris/HCl、pH7.0又は50mM Hepes、pH7.5に溶解し、グロー放電した炭素-ホルムバールコーティング銅グリッドに吸着させ、1%酢酸ウラニル水溶液でネガティブ染色した。グリッドを80kVで検査した。ImageJを使用して、サイズ測定(VLPタイプ1つ当たりn=200個の粒子)を実施した。DLS:スクロースに含まれる試料を、Tris/HCl pH7.0、150mM NaClに対して透析し、Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical社)を用いて1ml容量で分析した。
スクロース勾配遠心分離により精製した野生型及びHBc-Im7 VLPを電子顕微鏡(TEM)及び動的光散乱(DLS)分析に供して、形状及びサイズを決定した。
得られたデータ(図16)は、野生型HBc(上段)のTEM及びDLS測定の両方によりサイズが約30nmであることを示し、これはVLPの優勢なT4集団に関する発表されている結果と良好に一致する。対照的に、Im7が組み込まれたVLP(下段)は、TEM及びDLSの両方により約38nmのサイズ増加を示す。VLP表面上にIm7タンパク質が組み込まれていることを考慮すると、サイズの増加は予想通りである。データは、VLP集団の均一性を示す。
TEMを、VLP縁部の厚さを決定するためにも使用した。データ(図17)に示されているように、Im7を有するVLP(右側)の縁部は、野生型VLP(左側)の縁部よりも著しく厚かった。これは、ImageJに基づく測定により定量化されたものであり、修飾縁部の厚さはおおよそ2倍になった(12.4対6.5nm)。この結果は、HBc表面層の上にIm7タンパク質が均一に配置されていることと一致する。
(実施例15)
IL33装飾VLPは、スクロース密度超遠心分離において予想通りに挙動する。
プロトコール:HBcIm7及びColE7_IL-33サイトゾルの組合せのSDS-PAGEによるスクロース密度勾配分析。HBc-Im7及びColE7-IL33を含むサイトゾル画分を1:1の比で1時間4℃にて混合することにより、IL33をHBc-Im7 VLPにカップリングした。カップリングしたサイトゾルを、連続スクロース密度勾配に重層した。レーン:1)ColE7_IL-33及びHBc-Im7を含むサイトゾル、2)60%スクロース、3)50%スクロース、4)40%スクロース、5)30%スクロース、6)20%スクロース、7)10%スクロース。黒色矢印は、ColE7_IL-33(34.2kDa)を指しており、赤色矢印は、HBc-Im7(27.4kDa)を指している。
スクロース密度勾配遠心分離は、粒子のサイズ及び密度に対して感受性である。HBc及びHBc-Im7 VLPは、40%及び50%スクロース帯に平衡化する。HBc-Im7 VLPを追加のエピトープタンパク質で装飾すると、それらのサイズが増加し、スクロース勾配における平衡がより高い密度へとシフトすることが予想される。データは、ColE7-IL33で装飾されたHBc-Im7で構成されるVLPが、それらのサイズの増加と一致して、50～60%帯に等モルで平衡化することを示す(図18)。(平衡化後にはチューブの底にある60%スクロース画分は、50～60%界面相を有する。)
(実施例16)
IL33装飾VLPは、T3亜集団及びT4亜集団の予想される比を示し、野生型VLPにも見られるRNA含有量を保持する。
プロトコール:1%アガロースゲルを0.5×TBE緩衝液を使用してキャストし、1レーン当たり50μlの試料を60Vで1時間室温にて泳動させた。Instant Blueクーマシーで一晩4℃にて染色した。SYBR(商標)safe(ThermoFisher社)を1:10,000希釈で使用し、ChemiDock(商標)ゲル画像化装置(BioRad社)で画像化した。
スクロース勾配密度遠心分離のTEM及びSDS-PAGE分析(実施例14及び15)により検出されたより大きなサイズのIL33装飾VLPと一致して、非還元アガロースゲル電気泳動(NAGE)によるスクロース密度画分の分析でも、IL33装飾VLPは、より高密度に、大部分は50%スクロース画分に局在化し、40%画分にはわずかな成分のみが存在する(図19の左側に示されているクーマシー染色NAGEゲルの矢印)ことを示した。
加えて、NAGEは、T4 VLP集団及びT3 VLP集団の相対存在量が、HBc-Im7及びHBc野生型VLPでも観察された相対比(T3>>T4)を維持することを示した。
NAGEゲルのSYBR SAFE染色(図19の右側)は、それぞれT3バンド及びT4バンドと共に遊走する別個のRNAバンドを示し、VLPの完全性が確認され、大腸菌由来VLP内局在化RNAがベンゾナーゼ消化から保護されている。
(実施例17)
IL33装飾VLPは、予想されるサイズ及び縁部構造を呈する。
プロトコール:実施例14に記載のTEMプロトコール及びDLSプロトコール。
野生型HBc、HBc-Im7、並びにHBc-Im7-IL33 VLPの透過型電子顕微鏡法(TEM)は、実施例5に詳述されているように、Im7インサートを有するVLPにおける縁部の肥厚を示す。コリシンE7-IL33でHBc-Im7 VLPの外側を装飾すると、特により高倍率では、第3の点状外側タンパク質層が見えるようになる(図20パネルAの右側の拡大画像において黒色矢印で示されている)。これは、追加されたタンパク質層から予想される通りである。
TEM画像(図20パネルBの左側)及び動的光散乱(図20パネルBの右側)を使用したサイズ測定により、IL33装飾VLPのサイズ増加が確認される。TEM(48nm)及びDLS(71nm)で観察された平均粒径間の明らかな不一致は、TEMの試料調製中にカーボングリッドに付着させた際の、柔軟に連結された外側IL33層のタンパク質収縮アーティファクトを示す。
(実施例18)
イムノドットブロットにより、VLPの表面に付着したIL33の天然タンパク質フォールディングが確認される。
プロトコール:スクロース密度勾配で精製したVLPをPBSに対して透析した。図に示されている容積をニトロセルロース膜にスポットした。膜をBSA/PBSTでブロッキングし、続いてPBST中で抗mIL33(Invitrogen社、PA5-4007、濃度0.4μg/ml)と共にインキュベートした。膜を洗浄し、二次抗体(ロバ抗ヤギHRP、1:10,000に希釈;Stratech社、705-035-147-JIR)に曝露し、続いて洗浄し、Amersham ECL(商標)ウエスタンブロッティング検出試薬で顕色させた。
VLPの表面に結合したIL33の天然フォールディングを、立体構造エピトープを認識する抗体の特異的認識により検証した。漸減量のIL33装飾HBc-Im7 VLP又は非装飾HBc-Im7 VLPのいずれかをニトロセルロース膜にスポットした。データ(図21)は、存在するIL33が最も低い量であっても抗体により明らかに検出されるのに対し、IL33の非存在下のVLPでは検出可能なシグナルが存在しないことを示し、シグナルの特異性が確認される。
(実施例19)
IL33装飾HBcIm7 VLPは免疫原性である。
プロトコール:8月齢の雌C57Bl/6jマウスに、IL33コンジュゲートCuMV VLP(A.Zeltins、BMC ラトビア、リガにより提供された)又はIL33装飾HBcIm7 VLP(1群当たりn=5)のいずれかを3μg注射した。ワクチンを滅菌濾過し、使用前にLALアッセイによりエンドトキシンが<50EU/mlであることを確認した。両ワクチンを、アジュバントとして20%ミョウバンを含むPBSで製剤化した。短時間の肩甲骨内麻酔下で皮下注射した。データに表記されている日に末梢尾静脈血液を試料採取した(図22)。
ここで提供されている方法に従って、サイトカインを提示するVLPの免疫原性能力を試験するために、装飾されたIL-33を使用してC57Bl/6jマウスにワクチン接種した。これは、キュウリモザイクウイルス由来VLP(CuMV、Zeltins、npj Vaccines 2巻、30頁(2017年)。https://doi.org/10.1038/s41541-017-0030-8)の表面へのサイトカインの化学架橋に基づく以前に使用された方法に従って製作されたIL33保持VLPとの直接付合せ比較で行った。
いずれのワクチンタイプも原理的には免疫原性であることが予想されたため、実験は制限条件下で実施し、1用量当たり最小量(3μg)のワクチンを使用し、高齢マウス(初回投与時に8月齢)を使用した。
ワクチンの意図されている臨床使用はモノクローナル抗体の代替であるため、ワクチン接種マウスにおける観察されたIL33特異的抗体の蓄積は、伝統的に行われているような、希釈の「力価」としては表さなかった。むしろ、試料血清を、IL33に対する市販の高親和性モノクローナル抗体により較正したELISAで分析した。したがって、IL33に対するポリクローナル抗体を有するワクチン接種血清の反応による任意の所与の測定された光学濃度を、「モノクローナル抗IL33のxμg/mlに相当する」値に割り当てることができる。「力価」を報告することとは対照的に、このタイプの分析の大きな利点は、データがプロトタイプワクチンの潜在的な有効性を直接的に示すことである。例えば、臨床使用における多数のモノクローナル抗体の場合、患者の血清中の濃度はおおよそ2～10μg/ml程度である。これは、ワクチンがポリクローナル抗体を誘発し、この濃度に相当する応答を達成する場合、ワクチンは臨床的に活性である可能性を有するということを意味する。
データ(図22)に示されているように、研究された制限条件下では、本発明を使用して製作したIL33ワクチンは、同様の最大抗体応答を示した(濃度中央値は、HBcIm7ワクチンでは1.90μg/mlであるのに対し、CuMVワクチンでは1.97μg/mlに相当する)。しかしながら、本発明者らは、HBcIm7ワクチンでワクチン接種したマウスがより早期に応答したことを示した(図22Cに示されているように、基線から3週間後及び7週間後を参照)。加えて、力価中央値も、基線から少なくとも23週間後までに臨床有効レベル(1.12μg/ml)である可能性が高いと考えられるレベルで持続した(図22A及び図22Cに示されているように)。
重要なことには、図22に示されているように、HBcIm7ワクチン接種マウスは、CuMVワクチン接種マウスと比較して、個々のマウス間でより持続的で一貫した応答を示した。HBcIm7ワクチン接種マウスでは23週時点でも力価中央値は依然として療法範囲内にあったが、CuMVワクチン接種マウスではそうではなかった。
CuMV VLPプラットフォームは十分に確立されており、幾つかのワクチンモデルで有効であることが示されているため、こうした結果は、新しいHBcIm7プラットフォームが、ワクチンとしての使用に好適な免疫原性を有することを示唆している。
(実施例20)
Im7は、VLPの単一段階親和性精製を可能にする新規化学を有する。
プロトコール:HBc又はHBc-Im7を発現する大腸菌のサイトゾル画分を、段階的NaCl勾配による1mlのQa又はDEAE CimMultusモノリスカラムでの陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。レーン:1 - サイトゾル、2 - フロースルー、3、4 - 0.1M NaCl、5、6 - 0.3M NaCl、7、8 - 0.5M NaCl、9、10 - 0.7M NaCl、11、12 - 1M NaCl、13、14 - 2M NaCl。図23A、図23B、及び図23Dは、溶出画分のSDS PAGE分析を示す。黒色矢印は、VLP単量体タンパク質の予想サイズを示す。図23Cは、HBc-Im7のDEAEカラム精製からの1M NaCl画分の代表的なTEM画像を示す。
VLP精製のスクリーニング試験中、Im7装飾VLPが、弱陰イオン交換体DEAEに極めて強固に結合したことが認められた(図23A、下段ゲル)。これは、同じ陰イオン交換体に弱くしか結合しなかった野生型HBc VLPとは顕著な対照をなしていた(図23A、上段ゲル)。より強力な陰イオン交換体Qに対するHBc-Im7 VLPの結合は弱いことが見出されたため、Im7-HBc VLPの観察された親和性は、化学基としてのDEAEに特異的だった(図23B、上段)。
Im7-HBcとDEAEとの相互作用の親和性は高いため、粗サイトゾル画分からのVLPの単一段階精製が可能だった。精製VLPは、TEM下では、スクロース勾配精製VLPと区別できないと思われた(図23C)。
機序の点では、DEAEは、Qと比較して追加の疎水性基を含み(灰色矢印で示されている、図23C)、それによりこの部分はC4炭素構造になる。以前の報告には、少なからぬ特定の酵素に対するC4部分の高親和性相互作用が記録されている(Hofstee, B. H. J.、Biochem. Biophys. Res. Comm、53巻、1973年、1137～1144頁)。類推するに、観察されたIm7とDEAEとの相互作用には同様の化学的性質が根底にある可能性がある。
この予期せぬ化学的特性は、任意の他のタイプのVLPについてこれまでに報告されていない親和性クロマトグラフィーによるVLP精製の簡易でスケーラブルな手段を提供する。
(実施例21)
ColE7-Im7相互作用は、装飾VLPの解離-再アセンブリ精製を可能にする。
プロトコール:ColE7-Im7相互作用によるVLP表面へのPG装飾:各々のサイトゾル画分を4℃で30分間混合した。
PG装飾VLPカプシドのVLP二量体への解体:サイトゾルを50mM Tris、pH8.0、最終67mM NaCl、30mMイミダゾール、及び3M尿素で1:3に希釈した。
Ni-NTA精製:解体された二量体を、IMAC(Ni-NTA)クロマトグラフィーにより、VLPタンパク質上に今や露出したC末端ヘキサHisタグを使用して精製した。吸着後、カラムを2M尿素及び30mMイミダゾールを含む8カラム容積(CV)の緩衝液で洗浄し、続いて低濃度尿素(0.5M)を含む2CVの緩衝液で洗浄した。
カプシド再アセンブリ:試料を250mM imi、50mM Arg/Glut、10% glyc、20mM Tris pH7.0、及び800mM NaClで溶出し、続いて室温で1時間回転させた。
VLP単離:Ni溶出物を、<700kDのタンパク質を保持するCaptoCore700の1mlカラムに通し、0.5mlのフロースルー画分を収集した。
コリシンE7及びIm7は両方とも、3M尿素の存在下でタンパク質のフォールディングを保存する。この尿素濃度では、HBc VLPはタンパク質二量体へと解離する(Wingfieldら、Biochemistry 1995年、34巻、4919～4932頁)。HBc-Im7 VLPは、C末端配列にヘキサ-ヒスチジンタグを有しており、これは大部分がVLPの内部に収められている。しかしながら、尿素によるカプシド解体によりヘキサ-ヒスチジンタグが露出し、IMACによる親和性精製が可能になる。
図24Aに示されているSDS PAGE分析により、インタクトVLPは、まず尿素を使用してカプシドを解体しない限り、Ni-NTAに結合しないことが確認される(「con」と表記されたレーン)。HBcIm7(灰色矢印)及びColE7-IL33(白色矢印)を含むサイトゾル画分、並びに3M尿素の非存在下又は存在下で表示のように実施したバッチ精製の溶出画分が示されている。ヒスチジンタグ付きでないコリシンE7-IL33は、ニッケルカラムからHBcIm7と共に共溶出する。これは、3M尿素にも関わらずColE7とIm7との結合が維持されることを示す。
ニッケルカラムから溶出させた後(洗浄中に緩衝液から尿素を段階的に除去した後)、二量体タンパク質を、高NaCl濃度でインキュベーションすることにより再付随させてカプシドにすることができる(Ceres及びZlotnick、Biochemistry 2002年、41巻、11525～11531頁)。したがって、ニッケルカラムから溶出させた二量体タンパク質を、800mM NaCl及び追加の安定化因子の存在下でインキュベートした。その後、これらを、700kD未満の全てのタンパク質を保持するCaptoCore700(Cc700)レジンでの修飾サイズ排除クロマトグラフィーに供した。得られたSDS PAGE分析を図24Bに示す。これは、HBc-Im7及びColE7-IL33の両方がCc700カラムのフロースルーに共溶出することを示し、カプシドの再アセンブリが検証される。
(実施例22)
コリシンE7を使用してタンパク質をVLPの表面に融合させると、シャペロン機能が同時に提供され、それ自体では大腸菌中で可溶性ではないタンパク質の天然タンパク質のフォールディングが可能になる。
プロトコール:発現 - コリシンE7のN末端融合物(模式図ではC7と表記されている)を有するヒトIL17を含むプラスミドを、ジスルフィド形成のためのヘルパー酵素(Erv1P、DsbC)を有する大腸菌BL21/DE3細胞にトランスフェクトした。誘導は、アンヒドロテトラサイクリン(IL17の場合)及びIPTG(ヘルパー酵素の場合)で16時間18℃にて誘導した。細胞を溶解した。サイトゾル画分を、超音波処理し、ベンゾナーゼを添加し、続いて0.5% Triton X100と共に4℃で45分間インキュベートし、遠心分離することにより調製した。上清をサイトゾルと称した。封入体を含む不溶性ペレットを7M尿素に再懸濁した。SDS-PAGE分析(図25A)は、3つの独立したクローンを示し、IL17は太字矢印で示されており、ヘルパー酵素は小さな矢印で示されている。
精製 - ヒトIL17又はIL33を(図25A)に示されているように発現させた。サイトゾルを、セファロースに連結された市販のIm7と共にインキュベートした。徹底的に洗浄した後、Im7-セファロースをTEVプロテアーゼと共に4℃で一晩インキュベートし、カラムに充填し、重力流により溶出した。得られたSDS-PAGE分析は図25Bに示されており、TEV消化前後のサイトカインは、それぞれIL17又はIL33として矢印で標記で示されている。
受容体結合ELISA - (図25C)ヒトIL17RAタンパク質(SinoBiological社)を0.25ug/ウェルでELISAプレートにコーティングした。4ulのIm7-セファロース精製IL17及び2.5ulのIL33を、それぞれ1ウェル当たり200ulのPBSTに添加した。第2の抗体は、1:1000の抗IL17/抗IL33だった(両方ともマウスIgG)。抗マウスIgG-APを、1:10,000で30分間添加した。EC50の計算には、グリコシル化を欠くヒトIL17二量体(大腸菌で産生)に相当する30KDのMWを使用した。
コリシンE7は、Im7との結合を介してサイトカインとVLPとの付着を達成させる役目を果たすだけでなく、同時に、産生が難しいタンパク質の発現を可能にするシャペロンとしても機能する。ヒトIL17は、IL17等のジスルフィド結合を含むタンパク質のフォールディングを支援するヘルパー酵素(DsbC、Erv1P)を添加しても、それ自体では大腸菌内で可溶性タンパク質として発現させることができない。
図25は、コリシンE7をN末端融合ユニットとして付加した場合(模式図に示されている)、本発明者らの系を使用するとIL17がロバストに誘導され、誘導されたタンパク質のおよそ50%がサイトゾル内で可溶性であることを示す(図25A)。コリシン-E7部分は、タンパク質を固定化Im7クロマトグラフィーにより単離し、続いてTEVプロテアーゼにより切断することができるため、正しくフォールディングしている(図25B、IL33も示されている)。最後に、精製したIL17は機能性であり、kD計算値5.3nMでその受容体IL17RAに対して特異的結合を示す(図25C)。これは、公開されているデータ(2.3nM、Wright, J Immunol 2015, doi 10.4049/ jimmunol.181.4.2799)と良好に一致する。特異性を確認すると、IL33は、IL17RA受容体には結合しない。
(実施例23)
単一細胞内でのVLP骨格及びエピトープタンパク質の独立した連続的誘導により、まずVLPの形成、続いてエピトープアセンブリが可能になる。
発現系を、VLP骨格及び表面に装飾されることになるエピトープタンパク質の独立した連続的な誘導を達成するように改良した。これにより、もはや全ての組換えタンパク質を同時に産生する必要がなくなった細胞の代謝ストレスが軽減される。この目的のために、tetRタンパク質が、AmpR遺伝子の下流のリボソーム結合部位により構成的に発現、駆動されるプラスミドを構築した(模式図、図26A)。第2に、エピトープタンパク質を、やはり二重tetオペレーターを含むtetR/tetAプロモーターの下流に配置した。結果として、エピトープタンパク質は、tetR/tetAプロモーターからtetRタンパク質の解離が引き起こされることにより、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)を培養培地に添加した場合にのみ誘導される。
この系を、異なるエピトープを使用して試験した。ここに示されているのは、IL33及びIL17のデータである。このプラスミドを、T7プロモーターの制御下で2つの酵素DsbC及びErv1Pを染色体組込みコピーとしても有するように修飾されていたBL21/DE3大腸菌菌株にトランスフェクトした。こうした酵素は、それぞれジスルフィドトランスフェラーゼ酵素及びジスルフィドイソメラーゼ酵素であり、IL17等の、ジスルフィド結合を有する組換えタンパク質のフォールディングを支援する。トランスフェクトされた大腸菌を、IPTGを用いて20時間20℃にて誘導した(「IPTG」と表記)。未誘導ライセート(「U」と表記)と比較すると、HBc-Im7 VLP骨格が強力に誘導され、並びに予想されるDsbC及びErv1Pの誘導が見られる。その後、培地を交換することによりIPTGを除去し、aTcを添加し、27℃で5時間インキュベートした。これは、IL33及びIL17の両方の強力な追加の誘導に結び付いた(「aTc」と表記)。
図26のパネルB及びパネルCのSDS PAGEゲルは、各サイトカインの3つの独立したクローンを示し、リークが一切なく非常に厳密に制御されていることがわかる。これにより、細菌細胞内でのVLPの事前形成及び表面エピトープによるその後の装飾が可能になる。図26のパネルDに示されているゲルは、IPTGで既に誘導された大腸菌におけるaTc誘導の時間経過を示す。IL17の誘導は60分後に顕著になり、3時間以内に完了する。
(実施例24)
バルスターをHBcに組み込んでVLPを形成することができる。
プロトコール:実施例11に記載のようにスクロース勾配を実施した。TEM:試料を50mM Tris/HCl、pH7.0、150mM NaCl緩衝液に溶解し、グロー放電した炭素-ホルムバールコーティング銅グリッドに吸着させ、1%酢酸ウラニル水溶液でネガティブ染色した。グリッドを80kVで検査した。DLS:スクロースに含まれる試料を、Tris/HCl pH7.0、150mM NaClに対して透析し、Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical社)を用いて80ul容量で分析した。
Im7タンパク質と同様に、バルスタータンパク質を、HBcカプシドに組み込んでVLPを得ることができる。大腸菌内でインフレーム融合物として発現させた場合、スクロース密度勾配遠心分離にかけると40%画分に遊走する大きなナノ粒子が形成される(図27のパネル「a」において灰色矢印で示されている)。こうした粒子は、DLS測定で34nmサイズのピークを示し(パネルb)、TEMで分析すると(パネルc)、Im7をHBc VLPに組み込んだ場合に見られるものと同様に、縁部の肥厚を呈する(実施例14を参照)。
(実施例25)
バルナーゼ-バルスター相互作用は、装飾VLPの解離-再アセンブリ精製を可能にする。
コリシンE7及びIm7の場合と全く同様に(実施例21を参照)、バルナーゼ及びバルスターは、3M尿素の存在下でタンパク質フォールディングを保存する。この尿素濃度では、HBc VLPはタンパク質二量体へと解離する(Wingfieldら、Biochemistry 1995年、34巻、4919～4932頁)。HBc-バルスターVLPは、C末端配列にヘキサ-ヒスチジンタグを有しており、これは大部分がVLPの内部に収められている。しかしながら、尿素によるカプシド解体によりヘキサ-ヒスチジンタグが露出し、IMACによる親和性精製が可能になる。
図28に示されているSDS-PAGE分析は、HBc-バルスターをVLP(灰色矢印)として使用し、バルナーゼ-IL13をエピトープ(白色矢印)として使用したことを除いて、実施例21に示されているものと同様である。ゲルは、HBc-バルスター及びバルナーゼ-IL13を両方とも含む混合サイトゾル画分、続いてNi-NTA溶出物を示す。CaptoCore700画分は、Cc700カラムのフロースルーを表し、>700kDのタンパク質のみを含む。この結果は、実施例21で詳述したように、カプシド再アセンブリが成功したことを示している。
配列
配列番号1
>pETDuet-1 HcI DU67866(6107bp)
配列番号2
>pETDuet-1 HcI 6His
配列番号3
>pETDuet-1 C7リンカーTEV IL13 70076 (6167bp)
配列番号4
>pETDuet-1 C7リンカーTEV IL33 70051 (6305bp)
配列番号5
>pETDuet-1 HcI F L 6His-C7リンカーTEV IL13 70080 (6872bp)
配列番号6
>pETDuet-1 HcI F L 6His-C7リンカーTEV IL33 70059 (7010bp)
配列番号7
>pETDuet-1 HcI F L 6His-C7リンカーTEV IL33突然変異T7 70126含有(7010bp)
配列番号8
>65750 pETDuet1 HcI F L 6His+プロテインGリンカーTEV C7 (7139bp)
配列番号9
DU67808_pcDNA3D_FRT_シグナルペプチド_ColE7_スパイク_RBD_ヘキサhis
配列番号10
>DU67793_pcDNA5D FRT TO SP C7 S-RBD His GFP 41574 (7031bp)
配列番号11
>DU67817 pcDNA5D FRT TO SP C7 S-RBD N-ntd His (6752bp)
配列番号47
>DU70680. pETDuet-1 HBc-Im7 F->L 6His-tet-誘導性_ColE7-リンカー-TEV_部位_hIL17A;7634 bp
配列番号48
>DU70612. pETDuet-1 HBc-Im7 F->L 6His-tet-誘導性_ColE7-リンカー-TEV_部位_mIL33;7700bp
リンカー:
バルスター:
Im7:
バルナーゼ:
ColE7:
HBc:
T7プロモーター親配列:
gcataat(配列番号44)

Claims (39)

  1. - 1つ又は複数のB型肝炎カプシドタンパク質、
    - 結合タンパク質の1つ又は複数の対であり、結合タンパク質の各対は、第1の結合タンパク質及び第2の結合タンパク質を含み、前記結合タンパク質の対は、細菌毒素及びその阻害剤を含む、結合タンパク質の1つ又は複数の対、
    - 1つ又は複数の機能性分子
    を含むウイルス様粒子(VLP)であって、
    各B型肝炎カプシドタンパク質は、第1の結合タンパク質に付着しており、各機能性分子は、第2の結合タンパク質に付着しており、前記第1の結合タンパク質及び前記第2の結合タンパク質は互いに結合している、VLP。
  2. 前記第1の結合タンパク質が、細菌毒素阻害剤であり、前記第2の結合タンパク質が、前記細菌毒素である、請求項1に記載のVLP。
  3. 各機能性分子が、第3の結合タンパク質を介して第2の結合タンパク質に間接的に付着しており、好ましくは、前記第3の結合タンパク質が、プロテインGである、請求項1又は2に記載のVLP。
  4. 前記第1の結合タンパク質が、化学修飾を含み、任意選択で、前記化学修飾が、第2の機能性分子に付着している、請求項1、2、又は3に記載のVLP。
  5. 各機能性分子が、同じであってもよく又は異なっていてもよく、好ましくは、前記機能性分子が、タンパク質若しくは非タンパク質抗原又はそのエピトープ、抗原結合タンパク質、或いは蛍光分子から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のVLP。
  6. 各機能性分子が、抗原結合タンパク質であり、好ましくは、前記抗原結合タンパク質が、抗体又はその結合性断片、抗体模倣物、及びアプタマーから選択され、好ましくは、前記抗原結合タンパク質が、抗体、好ましくは目的の抗原に結合することが可能な抗体である、請求項3に記載のVLP。
  7. - 1つ又は複数のウイルスカプシドタンパク質、
    - 化学修飾を含む1つ又は複数の第1の結合タンパク質であり、各第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、1つ又は複数の第1の結合タンパク質、
    - 1つ又は複数の機能性分子
    を含むウイルス様粒子(VLP)であって、
    各ウイルスカプシドタンパク質は第1の結合タンパク質に付着しており、各化学修飾は機能性分子に付着している、VLP。
  8. 前記ウイルスカプシドタンパク質が、B型肝炎カプシドタンパク質である、請求項7に記載のVLP。
  9. 第2の結合タンパク質を更に含み、前記第2の結合タンパク質は前記第1の結合タンパク質に結合しており、任意選択で、前記第2の結合タンパク質は第2の機能性分子に付着している、請求項7又は8に記載のVLP。
  10. 前記第2の結合タンパク質が、細菌毒素、好ましくは前記細菌毒素阻害剤に結合する細菌毒素である、請求項9に記載のVLP。
  11. 各第2の機能性分子が、第3の結合タンパク質を介して第2の結合タンパク質に間接的に付着しており、好ましくは、前記第3の結合タンパク質が、プロテインGである、請求項9又は10に記載のVLP。
  12. 各機能性分子が、同じであってもよく又は異なっていてもよく、好ましくは、前記機能性分子が、タンパク質若しくは非タンパク質抗原又はそのエピトープ、抗原結合タンパク質、或いは蛍光分子から選択される、請求項7から11のいずれか一項に記載のVLP。
  13. 各機能性分子が、抗原結合タンパク質であり、好ましくは、前記抗原結合タンパク質が、抗体又はその結合性断片、抗体模倣物、及びアプタマーから選択され、好ましくは、前記抗原結合タンパク質が、抗体、好ましくは目的の抗原に結合することが可能な抗体である、請求項11に記載のVLP。
  14. 前記細菌毒素阻害剤が、Im7、Im8、Im9、Im2、及びバルスターから選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載のVLP。
  15. 前記細菌毒素が、好ましくは、ColE7、ColE8、ColE9、ColE2、及びバルナーゼから選択される細菌ヌクレアーゼである、請求項1から6又は10から14のいずれかに一項に記載のVLP。
  16. 前記細菌毒素及びその阻害剤が、バルナーゼ及びバルスターであり、好ましくは、バルスターアミノ酸配列が、以下の置換:C40A、C82A、及びI87Eのうちの1つ又は複数を含み、並びに/又はバルナーゼのアミノ酸配列は、以下の置換:E73Wを含む、請求項1から6又は10から15のいずれか一項に記載のVLP。
  17. 前記細菌毒素及びその阻害剤が、ColE7及びIm7であり、好ましくは、Im7のアミノ酸配列が、以下の置換:F41Lを含み、並びに/又はColE7のアミノ酸配列が、以下の置換:Arg538Ala、Glu542Ala、及びHis569Alaのうちの1つ又は複数を含む、請求項1から6又は10から15のいずれか一項に記載のVLP。
  18. 前記第1の結合タンパク質が、B型肝炎カプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域に挿入されており、好ましくは、前記第1の結合タンパク質が、B型肝炎カプシドタンパク質の主要イムノドミナント領域のアミノ酸残基76～80の間に挿入されている、請求項1から6又は8から17のいずれか一項に記載のVLP。
  19. 前記B型肝炎カプシドタンパク質が、以下のアミノ酸欠失:E77及びD78を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から6又は8から18のいずれか一項に記載のVLP。
  20. 前記化学修飾が、アミン基を有するアルカン、好ましくは、アミン基を有する炭素数1～10のアルカンであり、好ましくは、化学修飾が、DEAE又はオクチルアミンから選択される、請求項4から19のいずれか一項に記載のVLP。
  21. 前記非タンパク質抗原が、糖、脂質、炭水化物、又は小分子化学物質から選択される、請求項5又は12に記載のVLP。
  22. 前記タンパク質抗原が、感染性因子に由来し、好ましくは、前記タンパク質抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、古細菌に由来し、好ましくは、前記タンパク質抗原は、ウイルスに由来し、好ましくは、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、チクングニヤウイルス、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ハンタンウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザ、ヒトRSウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトトロウイルス、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、インフルエンザC型ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、おたふくかぜウイルス、ニパウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスA、サッポロウイルス、シンドビスウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルスから選択され、好ましくは、前記タンパク質抗原は、コロナウイルスに、好ましくはSARS-CoV-2に由来し、好ましくは、前記タンパク質抗原が、SARS-CoV-2に由来するスパイクタンパク質の全体若しくは一部、又はSARS-CoV-2に由来するヌクレオカプシドタンパク質の全体若しくは一部である、請求項5又は12に記載のVLP。
  23. 前記タンパク質抗原が、非感染性因子に由来し、好ましくは、前記タンパク質抗原が、炎症性分子、神経、軟骨、若しくは骨組織に変性変化を引き起こす分子、又は新生物性疾患の悪化を引き起こす分子に由来し、好ましくは、前記タンパク質抗原が、ケモカイン、サイトカイン、又はプロテアーゼから選択される炎症性分子であり、好ましくは、前記タンパク質抗原は、IL1、IL2、Il3、Il4、IL5、Il6、Il7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL33、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、及びTGFβから選択され、好ましくは、前記タンパク質抗原が、IL13、IL17、又はIL33の全体又は一部である、請求項5又は12に記載のVLP。
  24. 前記蛍光分子が、GFP、EBFP、EBFP2、アジュライト、GFPuv、T-saphhire、Cerulean、CFP、mCFP、mTurquoise2、CyPet、mKeima-red、tagCFP、AmCyan1、mTFP1、midoriishi cyan、turboGFP、tagGFP、エメラルド、アザミグリーン、ZsGreen1、YFP、tagYFP、EYFP、トパーズ、venus、mCtrine、YPet、turboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、アロフィコシアニン、mkO、RFP、turboRFP、tdTomato、tagRFP、dsRed、mStrawberry、turboFP602、asRed2、J-red、R-フィコエリトリン、B-フィコエリトリン、mCherry、HcRed、Katusha、P3、ペリジニンクロロフィル、mKate、turboFP635、mPlum、mRaspberryから選択され、好ましくは前記蛍光分子が、GFPである、請求項5又は12に記載のVLP。
  25. 結合タンパク質に融合されたウイルスカプシドタンパク質を含むカプシド融合タンパク質であって、前記結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、カプシド融合タンパク質。
  26. 結合タンパク質に融合された機能性分子を含む機能性融合タンパク質であって、前記結合タンパク質は細菌毒素である、機能性融合タンパク質。
  27. 更なる結合タンパク質に融合された第1の結合タンパク質を含む機能性融合タンパク質であって、前記第1の結合タンパク質は細菌毒素であり、前記更なる結合タンパク質は、抗原結合タンパク質である機能性分子に結合することができる、機能性融合タンパク質。
  28. 請求項25に記載のカプシド融合タンパク質又は請求項26若しくは27に記載の機能性融合タンパク質をコードする1つ又は複数の核酸。
  29. 請求項28に記載の1つ又は複数の核酸を含む1つ又は複数のベクター。
  30. 請求項28に記載の1つ若しくは複数の核酸又は請求項29に記載の1つ若しくは複数のベクターを含む宿主細胞。
  31. 1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞であって、前記1つ又は複数のベクターは、第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び第2の結合タンパク質に付着した機能性分子をコードする第2の核酸を含み、前記第1の結合タンパク質及び前記第2の結合タンパク質は、互いに結合することが可能である、宿主細胞。
  32. 1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞であって、前記1つ又は複数のベクターは、第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、及び機能性分子をコードする第2の核酸を含み、前記機能性分子は、前記第1の結合タンパク質の化学修飾を介して前記第1の結合タンパク質に結合することが可能である、宿主細胞。
  33. 単一宿主細胞内でウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
    (a)1つ又は複数のベクターを含む宿主細胞を準備する工程であり、前記1つ又は複数のベクターは、
    (i)第1の結合タンパク質に付着したウイルスカプシドタンパク質をコードする第1の核酸、並びに
    (ii)(a)第2の結合タンパク質に任意選択で付着した機能性分子をコードする第2の核酸、及び/又は
    (b)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸
    を含む、工程、
    (b)それぞれ前記第1の核酸、前記第2の核酸、及び/又は前記第3の核酸から前記タンパク質が発現される条件下で前記宿主細胞を培養する工程、
    (c)前記タンパク質からウイルス様粒子を形成する工程
    を含む方法。
  34. ウイルス様粒子(VLP)を産生するための方法であって、
    (a)1つ又は複数のベクターを含む第1の宿主細胞を準備する工程であり、前記1つ又は複数のベクターは、
    (i)第1の結合タンパク質に付着したB型肝炎カプシドタンパク質をコードする第1の核酸であり、前記第1の結合タンパク質は細菌毒素阻害剤である、第1の核酸を含む、工程、
    (b)1つ又は複数のベクターを含む1つ又は複数の更なる宿主細胞を準備する工程であり、前記1つ又は複数のベクターは、
    (i)第2の結合タンパク質に任意選択で付着した機能性分子をコードする第2の核酸であり、前記第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第2の核酸、及び/又は
    (ii)第3の結合タンパク質に付着した第2の結合タンパク質をコードする第3の核酸であり、前記第2の結合タンパク質は細菌毒素である、第3の核酸
    を含む、工程、
    (c)それぞれ前記第1の核酸、前記第2の核酸、及び/又は前記第3の核酸から前記タンパク質が発現される条件下で前記宿主細胞を培養する工程、
    (d)前記タンパク質を回収する工程、
    (e)前記タンパク質を混合してウイルス様粒子を形成する工程
    を含む方法。
  35. 請求項1から25のいずれか一項に記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
  36. 医薬として使用するための、請求項1から24のいずれか一項に記載のウイルス様粒子(VLP)又は請求項35に記載の免疫原性組成物。
  37. 感染性疾患、心血管疾患、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経疾患、リウマチ性変性疾患、又は中毒の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1から24のいずれか一項に記載のウイルス様粒子(VLP)又は請求項35に記載の免疫原性組成物。
  38. 研究又は疾患の診断における、請求項1から24のいずれか一項に記載のウイルス様粒子(VLP)の使用。
  39. 対象における疾患を診断するための方法であって、
    (a)請求項1から24のいずれか一項に記載のウイルス様粒子を準備する工程であり、前記機能性分子は、疾患原因物質に由来する抗原に対する抗体である、工程、
    (b)前記ウイルス様粒子を、前記対象に由来する好適な試料と混合する工程、
    (c)前記ウイルス様粒子が沈殿するか否かを検出する工程、
    (d)前記VLPが沈殿した場合、疾患の存在を診断する工程
    を含む方法。
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