WO2018043716A1 - ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法、真核細胞、真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法、およびキット - Google Patents

ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法、真核細胞、真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法、およびキット Download PDF

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gas vesicle
gene
gvpa
protein complex
gvpc
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良太 水島
朋信 渡邉
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex, a eukaryotic cell, a method for producing a gas vesicle protein complex using a eukaryotic cell, and a kit.
  • Non-patent Document 1 It is known that microorganisms that mainly inhabit lakes and marshes such as cyanobacteria and archaea have organelles called gas vesicles (GV), in order to obtain buoyancy (Non-patent Document 1). ).
  • the gas vesicle is a nano-sized protein supramolecular complex, in which water molecules are excluded and only gas is selectively permeated and stored.
  • gas vesicles gas vesicle protein complexes
  • MRI nuclear magnetic resonance imaging
  • UI ultrasound imaging
  • Patent Documents 1 to 3 and non-patent documents Patent Documents 2 to 3
  • gas vesicles are also used as a carrier protein for presenting a peptide antigen and applied as a vaccine (Patent Document 4 and Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 reports that a gas vesicle gene group composed of 15 genes was cloned from Bacillus megaterium, this gene group was heterologously expressed in E. coli, and gas vesicles were observed in protoplasts of E. coli. is doing.
  • Non-Patent Document 6 reports that gas vesicle genes derived from Planktothrix rubescens were cloned and these genes were heterologously expressed in E. coli, and that gas vesicles were confirmed in the protoplasts of E. coli.
  • gas vesicles are organelles possessed by prokaryotes such as cyanobacteria and archaea.
  • prokaryotes such as cyanobacteria and archaea.
  • heterologous expression of a gas vesicle protein complex has been reported in E. coli, the same prokaryote.
  • eukaryotic organisms differ greatly from prokaryotic organisms in the intracellular environment, such as the complexity and diversity of intracellular structures. In such eukaryotes, there has never been reported that a gas vesicle protein complex, which is a prokaryotic organelle, has been expressed.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to realize a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex.
  • a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex introduces a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC into a eukaryotic cell so as to allow expression.
  • the gas vesicle gene gvpC is a method derived from cyanobacteria.
  • the eukaryotic cell according to the present invention is a eukaryotic cell into which the gas vesicle gene gvpA and the cyanobacterial gas vesicle gene gvpC have been introduced so that they can be expressed.
  • eukaryotic cells capable of expressing a gas vesicle protein complex.
  • a gas vesicle protein complex can be produced using eukaryotic cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a Tol2 transposon vector (gvpA-T2A-mKate2) in which an artificially synthesized gvpA gene is cloned.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of FACS analysis of transformed cells obtained in Example 1. It is a figure which shows the result of having observed the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line acquired in Example 1 under the confocal microscope.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of RT-qPCR performed on the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line obtained in Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the result of having performed the Western blotting about KPL4_gvpA_gvpC20 cell line acquired in Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the observation result by the transmission electron microscope of the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line acquired in Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the purification procedure of a gas vesicle protein complex. It is a figure which shows the observation result by the transmission electron microscope of the gas vesicle protein complex in the gas vesicle protein complex rough refinement
  • FIG. It is a figure which shows the result of the FACS analysis of the transformed cell acquired in Example 2 and 3.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of DLS measurement of gas vesicle protein complexes in the crude gas vesicle protein complex solution obtained in Examples 1 to 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the observation results of a gas vesicle protein complex in the crude purified solution of the gas vesicle protein complex obtained in Examples 2 to 4 using a transmission electron microscope. It is a figure which shows the result of having observed the KPL4_gvpA_gvpC28 cell line acquired in Example 3 under the confocal microscope.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of an ultrasonic echo signal measurement system used in Examples 1 to 4. It is a figure which shows the measurement result of the ultrasonic echo signal of the cell acquired in Examples 1-4. It is a figure which shows the measurement result of the ultrasonic echo signal of the cell acquired in Examples 1-4.
  • a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex is a method for expressing a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC in a eukaryotic cell. Introducing an introduction step, the gas vesicle gene gvpC is derived from cyanobacteria.
  • the above-mentioned “eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex” is capable of expressing not only a eukaryotic cell already expressing a gas vesicle protein complex but also a gas vesicle protein complex. Also included are eukaryotic cells that have not yet expressed the gas vesicle protein complex because the expression of the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC is reversibly or irreversibly suppressed.
  • a “polynucleotide” encoding a protein “Polynucleotide” can also be referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”.
  • base sequence can also be referred to as “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”.
  • base sequence intends a deoxyribonucleotide sequence or a ribonucleotide sequence.
  • the polynucleotide may be a single strand or a double strand structure. In the case of a single strand, the polynucleotide may be a sense strand or an antisense strand.
  • polypeptide can also be referred to as “protein”.
  • the “polypeptide” includes a structure in which amino acids are peptide-bonded, and may further include a structure such as a sugar chain or an isoprenoid group.
  • the introducing step is a step of introducing the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC into a eukaryotic cell so that they can be expressed.
  • “to introduce a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC into a eukaryotic cell so that they can be expressed” means that the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC can be co-expressed in a eukaryotic cell by a genetic engineering technique. Furthermore, it is intended to introduce these genes into eukaryotic cells.
  • co-expressible is intended that both gas vesicle gene gvpA and gas vesicle gene gvpC can be expressed in the same cell. Therefore, as long as the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC can be expressed in the same cell, the order and method of introducing these genes into the cell are not particularly limited.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC introduced into the cells are not limited to one type, and a plurality of genes may be used in combination. When combining a plurality of genes, a plurality of genes having different origins may be combined, or genes having the same origin may be combined.
  • the origin of the gas vesicle gene gvpA is not particularly limited. Examples thereof include cyanobacteria, archaea, and gram positive bacteria.
  • Examples of cyanobacteria include the genus Planktothrix, the genus Anabaena, and the genus Calothrix.
  • Examples of archaea include Halobacterium bacteria.
  • Examples of gram positive bacteria include Bacillus bacteria.
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Planktothrix include Planktothrixkrubescens, Planktothrix agardhii, Planktothrix prolifica, and the like.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Anabaena include Anabaena flos-aquae CCAP 1403 / 13F, Anabaena lemmermannii strain BC Ana0035, and the like.
  • Examples of Calothrix genus bacteria include Calothrix® PCC7601.
  • Examples of the genus Halobacterium include Halobacterium NRC-1, Halobacterium salinarum PHH1, and the like.
  • Examples of Bacillus bacteria include Bacillus cil megaterium.
  • the base sequence of the gas vesicle gene gvpA can be easily obtained from a public database such as GenBank.
  • Examples of the “gas vesicle gene gvpA” include gvpA gene derived from Planktothrix rubescens strain BC-pla9303 (GenBank Accession Number: AJ132357.1, SEQ ID NO: 6), gvpA gene derived from Anabaena flos-aquae CCAP 1403 / 13F (GenBank Accession Number) : U17109.1), gvpA gene derived from Calothrix PCC7601 (GenBank Accession Number: X06085.1), gvpA gene derived from Anabaena lemmermannii strain BC Ana0035 (GenBank Accession Number: DQ120596.1), and the like.
  • the gvpA gene derived from Halobacterium salinarum NRC-1 (GenBank Accession Number: AF016485.1)
  • the gvpA gene derived from Halobacterium salinarum PHH1 (GenBank Accession Number: X94688.1)
  • Bacillus A gvpA gene derived from megaterium (GenBank Accession Number: AF053765.1) and the like can be mentioned.
  • Gas vesicle gene gvpA is a gene encoding gas vesicle protein gvpA.
  • the gas vesicle protein gvpA is a hydrophobic protein that forms a rib, which is the main structure of the gas vesicle protein complex (reference: Anthony E. Walsby, Gas Vesicles. Microbiological reviews, Mar. 1994, p. 94-144 (Non-Patent Document 1)).
  • the mutated gas vesicle protein gvpA is a hydrophobic substance in which a specific amino acid in the amino acid sequence of the wild-type gas vesicle protein gvpA is mutated and has a function of forming a rib of the gas vesicle protein complex. It refers to protein.
  • amino acid “mutation” refers to substitution, deletion, insertion and / or addition.
  • An amino acid “mutation” is preferably a substitution or deletion, more preferably a substitution.
  • the mutant gas vesicle protein gvpA is 75% or more (more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more) of the amino acid sequence of the wild-type gas vesicle protein gvpA.
  • the hydrophobicity has an amino acid sequence having a sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) and has a function of forming a rib of a gas vesicle protein complex It is preferably a protein.
  • sequence identity intends the ratio of the same number of amino acid residues when referring to an amino acid sequence.
  • sequence identity of amino acid sequences can be calculated by a known method. For example, it can be calculated by a web-based amino acid sequence comparison program “Clustal” Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
  • mutant gas vesicle protein gvpA is a “hydrophobic protein” is determined in the web-based program ProtScale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)
  • ProtScale http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1
  • the mutant gas vesicle protein gvpA “has a function of forming a rib of the gas vesicle protein complex” is determined by determining whether the gene encoding the mutant gas vesicle protein gvpA is the gas vesicle gene gvpC (preferably It can be determined by introducing into a eukaryotic cell (host cell) together with the wild-type gas vesicle gene gvpC) and confirming whether a gas vesicle protein complex can be formed in the eukaryotic cell (host cell). it can.
  • a gas vesicle protein complex can be formed in a eukaryotic cell (host cell), as shown in Examples described later, the inside of the cell is observed with a transmission electron microscope.
  • a method for confirming whether or not a biconical structure peculiar to the gas vesicle protein complex is observed inside the cell can be mentioned.
  • the “gas vesicle gene gvpA” includes not only the gene encoding the wild-type gas vesicle protein gvpA but also the gene encoding the mutant gas vesicle protein gvpA as described above.
  • the gas vesicle gene gvpA is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of a polypeptide encoded by the gvpA gene derived from Planktothrixthrrubescens strain BC-pla9303 (GenBank Accession Number: AJ132357.1, SEQ ID NO: 6), and more than 75% (from Preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more).
  • a polynucleotide encoding a hydrophobic polypeptide having an amino acid sequence having the function of forming a rib of a gas vesicle protein complex is preferable.
  • gas vesicle gene gvpA examples include gas vesicle gene gvpA derived from cyanobacteria, and more specifically, for example, gvpA (GenBankGenAccession Number: U17109. Derived from Anabaenaflos-aquae CCAP 1403 / 13F described above). 1), gvpA derived from Calothrix PCC7601 (GenBank Accession Number: X06085.1), gvpA derived from Anabaena lemmermannii strain SBC BC Anana (GenBank Accession Number: DQ120596.1), and the like.
  • gvpA GenBankGenAccession Number: U17109. Derived from Anabaenaflos-aquae CCAP 1403 / 13F described above.
  • gvpA GenBankGenAccession Number: U17109. Derived from Anabaenaflos-aquae CCAP 1403 / 13F described above.
  • gas vesicle genes gvpA have 75% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by gvpA derived from PlanktothrixArubescens strain BC-pla9303 (SEQ ID NO: 8). It corresponds to a polynucleotide encoding the polypeptide. It encodes a hydrophobic polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of 75% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having a function of forming a rib of a gas vesicle protein complex.
  • the polynucleotide includes not only the wild type gas vesicle gene gvpA but also the mutant type gas vesicle gene gvpA.
  • the gas vesicle gene gvpC gene is not particularly limited as long as it is derived from cyanobacteria.
  • cyanobacteria include Planktothrix bacteria and Arthrospira bacteria.
  • the genus Planktothrix is as described above.
  • Arthrospira genus bacteria include Arthrospira sp. Moz. 2.1.
  • the base sequence of the gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria can be easily obtained from a public database such as GenBank.
  • Examples of “gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria” include gas vesicle gene gvpC derived from Planktothrix bacteria, gas vesicle gene gvpC derived from Arthrospira bacteria, and the like.
  • GvpC16, gvpC20, and gvpC28 are gvpC shown in GenBank Accession Number: AJ132354.1 (SEQ ID NO: 13, derived from Planktothrix rubescens stain BC-pla9401, referred to as “gvpC16”), GenBank Accession Number: AJ132361.
  • GvpC (SEQ ID NO: 7, derived from Planktothrix rubescens strain BC-pla9401, called “gvpC20”), GenBank Accession Number: gvpC shown in AJ253131.1 (SEQ ID NO: 14, Planktothrix agardhii strain NIVA- Derived from CYA29 and referred to as “gvpC28”), NCBI reference sequence: gvpC (derived from Planktothrix prolifica) shown in WP — 026798481.1.
  • the gas vesicle gene gvpC derived from the genus Arthrospira is gvpC (derived from Arthrospira sp. Moz. 2.1, referred to as “gvpC1 or gvpC2”) or GenBank Accession Number: HQ641413. GvpC (derived from Arthrospira sp. Moz. 2.1 and called “gvpC3”) etc. (reference: Miklaszewska, M. et al. Elucidation of the gas vesicle gene clusters in) cyanobacteria of the genus Arthrospira (Oscillatoriales, Cyanophyta) and correlation with its phylogeny. Eur. J. Phycol. 47 (3), 233-244 (2012)).
  • Gas vesicle gene gvpC is a gene encoding gas vesicle protein gvpC.
  • the gas vesicle protein gvpC is a hydrophilic protein having a function of stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex (reference: Anthony E. Walsby, Gas Vesicles. Microbiological reviews, Mar. 1994, p. 94-144 (Non-Patent Document 1)).
  • the mutated gas vesicle protein gvpC refers to a hydrophilic protein in which a specific amino acid in the amino acid sequence of the wild-type gas vesicle protein gvpC is mutated and stabilizes the rib structure of the gas vesicle protein complex.
  • the mutant gas vesicle protein gvpC is 75% or more (more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more) of the amino acid sequence of the wild-type gas vesicle protein gvpC.
  • hydrophilic protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) and stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex. Is preferred.
  • mutant gas vesicle protein gvpC is a “hydrophilic protein” is determined in the web-based program ProtScale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)
  • ProtScale http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1
  • the remaining hydrophobicity index value is less than 0 out of all residues except N-terminal 5 residues and C-terminal 5 residues It can be confirmed whether the group is 70% or more.
  • the mutant gas vesicle protein gvpC “has a function of stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex” is determined by determining whether or not the gene encoding the mutant gas vesicle protein gvpC is the gas vesicle gene gvpA ( Preferably, it is introduced into a eukaryotic cell (host cell) together with the wild-type gas vesicle gene gvpA), and it is determined by confirming whether or not a gas vesicle protein complex can be formed in the eukaryotic cell (host cell). be able to.
  • a gas vesicle protein complex can be formed in a eukaryotic cell (host cell), as shown in Examples described later, the inside of the cell is observed with a transmission electron microscope.
  • a method for confirming whether or not a biconical structure peculiar to the gas vesicle protein complex is observed inside the cell can be mentioned.
  • the “gas vesicle gene gvpC” includes not only the gene encoding the wild-type gas vesicle protein gvpgvpC but also the gene encoding the mutant gas vesicle protein gvpC as described above.
  • the gas vesicle gene gvpC may comprise a polynucleotide described in any of the following (a) to (c): (A) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (B) having an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having a function of stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex A polynucleotide encoding a hydrophilic polypeptide; (C) a gas vesicle protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; A polynucleotide encoding a hydrophilic polypeptide having a function of stabilizing the rib structure of the complex.
  • the gene (a) is a gene containing a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of gvpC16 protein derived from Planktothrix rubescens stain BC-pla9401
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of gvpC20 protein derived from Planktothrix rubescens strain BC-pla9401
  • SEQ ID NO: 3 shows Planktothrix agardhii strain
  • the amino acid sequence of gvpC28 protein derived from NIVA-CYA29 is shown.
  • the gene of (b) above is a variant, derivative, variant or homolog that is functionally equivalent (identical and / or similar) with respect to the polypeptide having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the specific sequence thereof is particularly It is not limited.
  • sequence identity of the amino acid sequence is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, It is particularly preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the gene of (c) above is a variant, derivative, variant or homolog that is functionally equivalent (identical and / or similar) with respect to the polypeptide having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the specific sequence thereof is particularly It is not limited.
  • the number of amino acid residues which may be substituted, deleted, inserted and / or added is not limited as long as the above function is not lost.
  • the number of amino acid residues that may be substituted, deleted, inserted and / or added is the number that can be substituted, deleted, inserted or added by a known introduction method such as site-directed mutagenesis.
  • the number is usually 30 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, more preferably 7 or less, more preferably 5 or less (for example, 5, 4, 3, 2 Or 1).
  • the amino acid residue after substitution preferably has the same amino acid side chain property as the amino acid residue before substitution.
  • Whether the gene encoded by the gene (b) and the gene (c) is a “hydrophilic polypeptide” or not is determined based on the web-based program ProtScale (http://web.expasy.org/ In cgi-bin / protscale / protscale.pl? 1), when calculating the hydrophobicity index of each amino acid residue using Kyte & Doolittle Scale, all except N-terminal 5 residues and C-terminal 5 residues This can be confirmed by determining whether residues having a hydrophobicity index value less than 0 among residues are 70% or more.
  • the gene encoded by (b) and the polypeptide encoded by (c) above has a function of stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex"
  • the gene of (c) above is introduced into a eukaryotic cell (host cell) together with the gas vesicle gene gvpA (preferably the wild-type gas vesicle gene gvpA), and the gas vesicle protein is introduced into the eukaryotic cell (host cell). This can be determined by checking whether or not a complex can be formed.
  • a gas vesicle protein complex can be formed in a eukaryotic cell (host cell), as shown in Examples described later, the inside of the cell is observed with a transmission electron microscope.
  • a method for confirming whether or not a biconical structure peculiar to the gas vesicle protein complex is observed inside the cell can be mentioned.
  • Examples of the gene (b) include the gas vesicle gene gvpC derived from the cyanobacterium Planktothrix agardhii. It should be noted that the hydrophilic polymer having an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 and having a function of stabilizing the rib structure of the gas vesicle protein complex
  • the polynucleotide encoding the peptide includes not only the wild type gas vesicle gene gvpC but also the mutant type gas vesicle gene gvpC.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC preferably have codons optimized for expression in mammalian cells.
  • Codon optimization is a mutation that optimizes the codons of a gene for expression in a particular species (preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell, more preferably a species from which the host cell into which the gene is introduced) is derived.
  • the mutation of the gene does not change the encoded amino acid sequence.
  • “optimized for expression in mammalian cells” intends to change a codon of a gene to a codon having a high codon appearance frequency in a mammal.
  • the translation efficiency of the gas vesicle gene gvpA and gas vesicle gene gvpC in eukaryotic cells (especially mammalian cells) is improved, resulting in increased expression levels of gvpA and gvpC proteins.
  • Codon optimization can be performed by optimizing all codons that are not frequently used in mammalian cells in the entire nucleotide sequence of the gas vesicle gene gvpA and gas vesicle gene gvpC.
  • the gvpA protein and the gvpC protein may be modified by peptide addition, chemical modification, or the like. It is known that specific functions of gas vesicles can be regulated by modifying the gvpA protein and the gvpC protein. For example, it has been reported that phagocytosis of gas vesicles can be controlled by fusing a peptide to the C-terminus of gas vesicle gene gvpC (reference: Lakshmanan et al., Molecular engineering of acoustic protein nanostructures. , ACS ACS Nano 2016 2016 10 (8): 7314-7322).
  • the gas vesicle gene gvpA is preferably a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the gas vesicle gene gvpC is preferably a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the gas vesicle gene gvpA is a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the gas vesicle gene gvpC is shown in SEQ ID NO: 11 with a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a combination with a polynucleotide comprising a base sequence is preferred.
  • the gas vesicle gene gvpA is preferably a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the gas vesicle gene gvpC is preferably a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of a polynucleotide obtained by optimizing the codon of gvpA gene (SEQ ID NO: 6) derived from Planktothrix rubescens strain BC-pla9303 for expression in mammalian cells.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of a polynucleotide in which the codon of gvpC20 gene (SEQ ID NO: 7) derived from Planktothrixtorubescens strain BC-pla9401 is optimized for expression in mammalian cells.
  • SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of a polynucleotide in which the codon of gvpC16 gene (SEQ ID NO: 13) derived from Planktothrix rubescens strain BC-pla9401 is optimized for expression in mammalian cells.
  • SEQ ID NO: 12 shows the nucleotide sequence of a polynucleotide in which the codon of gvpC28 gene (SEQ ID NO: 14) derived from Planktothrixtoagardhii strain NIVA-CYA29 is optimized for expression in mammalian cells.
  • the gas vesicle gene gvpA is a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the gas vesicle gene gvpC is shown in SEQ ID NO: 12 with a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a polynucleotide comprising a base sequence is preferred.
  • the gas vesicle gene gvpA is a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the gas vesicle gene gvpC is shown in SEQ ID NO: 11 together with the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • UI ultrasound imaging
  • the eukaryotic cell into which the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are introduced is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples of eukaryotic cells include yeast, insect cells, and mammalian cells.
  • KPL-4 cells which are human breast cancer-derived cell lines used in Examples described later, non-primary cells obtained from eukaryotic tissues. There may be.
  • established cells include KPL-4 cells, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), PC12 cells and the like.
  • primary cells include mouse-derived primary hippocampal neurons.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to the present invention can also be called an expression method for a gas vesicle protein complex in a mammalian cell in vitro or in vivo.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to the present invention can also be used as a method for producing a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex.
  • Examples of a method for introducing the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC into a eukaryotic cell so as to allow expression include a method of introducing an expression vector into which the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are inserted into the cell.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are controllably linked to an expression control region that can function in a host eukaryotic cell (host cell).
  • the “expression control region” refers to a “polynucleotide” that controls the expression of a gene. Examples of the “expression control region” include a promoter region and an enhancer region.
  • the “expression control region” can be appropriately selected from known promoter sequences that can control expression in eukaryotic cells.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC may be inserted into a single expression vector and introduced into a host cell.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC may be inserted into separate expression vectors to produce a plurality of expression vectors, and these expression vectors may be introduced into host cells. Good.
  • the order in which each expression vector is introduced is not particularly limited.
  • a known expression vector that can be expressed in a eukaryotic cell can be used.
  • expression vectors such as transposon vectors, lentivirus vectors, adeno-associated virus vectors can be used.
  • a transposon vector is a vector having a transposon sequence.
  • a transposon vector By using a transposon vector, a polynucleotide inserted between transposon sequences can be integrated into the host cell chromosome.
  • a transposon vector in addition to the Tol2 transposon vector used in the examples described later, PiggyBac (reference: Woodard LE LE et al., Piggybac-ing models and therapeutic strategies, Trends. Biotechnol. 525-33. (2015)), Sleeping Beauty (reference: Zsuzsanna Izsvak et al. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: Victories and challenges. Bioessays, Vol. 32 (9) pp. 756-767 (2010) Can be mentioned.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC may be inserted into a transposon vector.
  • the expression “the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are inserted into the transposon vector” means that the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are inserted between the transposon sequences.
  • the expression vector used for the introduction of the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC may include at least the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC as target genes, but may include other genes depending on the purpose. Good.
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker gene.
  • selectable marker genes include antibiotic resistance genes. Specific examples include a known puromycin resistance gene, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, blasticidin S resistance gene, and the like.
  • the above selection marker gene is used, whether or not the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are introduced into the host cell, and whether or not the gas vesicle gene gvpC is reliably expressed in the host cell, is indirectly determined using the expression of the selection marker gene as an index. Can be confirmed. Thereby, a cell into which an expression vector has been introduced can be selectively obtained.
  • the expression vector may contain a gene encoding a known fluorescent protein (fluorescent protein gene).
  • the fluorescent protein may be expressed as a fusion protein with a gas vesicle protein.
  • a gas vesicle protein and a fluorescent protein can be linked via a known specific proteolytic signal sequence (such as a T2A sequence) or the like and expressed as a fusion protein.
  • a fusion protein linked by a specific proteolytic signal sequence, such as a T2A sequence can be separated into two proteins after being expressed and have a function as an individual protein.
  • the expression level of the gas vesicle protein can be indirectly confirmed using the expression level of the fluorescent protein (ie, fluorescence intensity) as an index. Thereby, cells that highly express the gas vesicle protein can be selectively obtained.
  • the fluorescent proteins linked to the gas vesicle protein gvpA and the gas vesicle protein gvpC are preferably different from each other. Thereby, the expression level of the gas vesicle protein gvpA and the expression level of the gas vesicle protein gvpC can be respectively confirmed using the expression level of the fluorescent protein linked thereto as an index. Examples of the fluorescent protein include known green fluorescent protein (GFP), mKate2, mKO2, and mVenus.
  • a gene expression induction system may be incorporated in the expression vector.
  • the “gene expression induction system” uses a repressor protein and an operator sequence having a protein binding domain to which the repressor protein can bind, and controls the binding of the repressor protein to the operator sequence.
  • the promoter linked downstream of the operator sequence is controlled.
  • the “gene expression induction system” includes a known Tet expression induction system. Examples of the Tet expression induction system include known Tet-On (registered trademark) system (Clontech) and Tet-Off (registered trademark) system (Clontech).
  • the method of introducing the expression vector into the host cell is not particularly limited, and a conventionally known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method can be suitably used.
  • the expression of the gas vesicle protein complex in the host cell is confirmed by observing the inside of the host cell with a transmission electron microscope, and confirming that the cell has a biconical structure peculiar to the gas vesicle protein complex. It can be confirmed by confirming whether or not.
  • the size of the gas vesicle protein complex is not particularly limited, and may be a suitable size according to the cell type to be expressed, the detection method of the gas vesicle protein complex, and other uses of cells. As described later, the use of cells is assumed to be used for transplanting cells themselves into mammals, for injecting gas vesicles purified from mammalian cells into living bodies, and the like.
  • the size of the expressed gas vesicle protein complex varies depending on the types of gas vesicle genes gvpA and gvpC and combinations thereof. In the examples described later, it was shown that the size of the expressed gas vesicle protein complex varies depending on the type of gas vesicle gene gvpC and the combination thereof.
  • the contrast effect varies depending on the size of the expressed gas vesicle protein complex.
  • the difference in size of the gas vesicle protein complex is considered to affect the toxicity to the living body and the expression level in the cell. For example, if the size of the gas vesicle protein complex is small, it is estimated that the toxicity is low. Furthermore, since a sufficiently small gas vesicle protein complex can penetrate tumor blood vessels, it can be used for imaging of tumor cell bodies.
  • the size of the gas vesicle protein complex and the properties such as the contrast effect vary depending on the types and combinations of the gas vesicle genes gvpA and gvpC to be expressed, in other words, the gvpA protein and the gvpC protein contained in the gas vesicle protein complex. .
  • the combination of gvpA protein and gvpC protein contained in the gas vesicle protein complex is not particularly limited. Further, the gvpC protein contained in the gas vesicle protein complex is not limited to one type, and may be a plurality of types. Preferably, there are multiple types of gvpC proteins contained in the gas vesicle protein complex.
  • the combination of the gvpA protein and the gvpC protein can be, for example, the combinations shown below.
  • the gvpA protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and the gvpC protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (combination of polypeptides encoded by the gas vesicle genes gvpA and gvpC20)
  • a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 A combination of the gas vesicle gene gvpA and polypeptides encoded by gvpC16 and gvpC20
  • the gvpA protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:
  • the combination of the gvpA protein and the gvpC protein comprises (1) a polypeptide in which the gvpA protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the gvpC protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A combination with a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or (2) the gvpA protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and the gvpC protein is set forth in SEQ ID NO: 2 A combination of a polypeptide having an amino acid sequence and a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. If the combination of the gvpA protein and the gvpC protein is any of the above, the gas vesicle protein complex exhibits a high contrast effect in the UI, as shown in Examples described later.
  • the combination of the gvpA protein and the gvpC protein comprises a polypeptide in which the gvpA protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and the gvpC protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2.
  • polypeptide constituting each combination described above is 75% or more (more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more) with the amino acid sequence of each SEQ ID NO. It may be a polypeptide having an amino acid sequence having a sequence identity of preferably 95% or more, particularly preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the combination of the gvpA protein and the gvpC protein is not limited to this, but for example, the combination of the gvpA protein and the gvpC protein possessed by a certain microorganism expressing the gas vesicle can also be determined by reference.
  • another step may be included before and after the introduction step described above.
  • a culture step for culturing eukaryotic cells after the introduction step may be included.
  • the expression vector introduced in the introduction step contains a selection marker gene or a fluorescent protein gene
  • the culture step includes a selection step of selecting eukaryotic cells (transformed cells) after the introduction step. May be.
  • the confirmation process which detects formation of the gas vesicle protein complex in the eukaryotic cell after an introduction
  • the culture process is a process of culturing eukaryotic cells after the introduction process.
  • the culture conditions for eukaryotic cells after the introduction step can be appropriately selected according to the type of eukaryotic cell selected as the host cell. Thereby, the eukaryotic cell after an introduction
  • the culture step may include a selection step for selecting eukaryotic cells (transformed cells) after the introduction step. Good.
  • the selection step when the expression vector introduced in the introduction step contains an antibiotic resistance gene as a selection marker, eukaryotic cells (transformed cells) after the introduction step are placed in a medium containing the antibiotic. It can be a step of culturing in the above. The concentration of the antibiotic added to the medium can be set as appropriate depending on the type of antibiotic to be added.
  • the selection step is a step of selecting eukaryotic cells (transformed cells) after the introduction step based on the expression level of the fluorescence protein when the expression vector introduced in the introduction step contains a fluorescent protein gene. It can be. These selection steps may be included alone or in combination with a plurality of steps. By including a plurality of selection steps in combination, it is possible to select a transformed cell that expresses gas vesicle protein gvpA and gas vesicle protein gvpC at a higher level.
  • the confirmation process confirms whether the eukaryotic cells after the introduction process can express the gas vesicle protein complex by confirming whether or not the gas vesicle protein complex is formed in the eukaryotic cells after the introduction process. It is a process to do.
  • the confirmation step when it is confirmed that the gas vesicle protein complex is formed in the eukaryotic cell after the introduction step, the eukaryotic cell after the introduction step is capable of expressing the gas vesicle protein complex. It is judged that.
  • the eukaryotic cell after the introduction step is not a eukaryotic cell capable of expressing the gas vesicle protein complex. Judge that there is no.
  • the method for confirming whether or not the gas vesicle protein complex is formed in the eukaryotic cell after the introduction step is as described above.
  • the present inventors have introduced a gas vesicle protein complex which is a prokaryotic cell organelle by introducing a gas vesicle gene gvpC derived from a bacterium belonging to the genus Planktothrix, which is a cyanobacterium, into a eukaryotic cell in combination with the gas vesicle gene gvpA.
  • a gas vesicle gene gvpC derived from a bacterium belonging to the genus Planktothrix, which is a cyanobacterium
  • production method comprises a culture step of culturing eukaryotic cells obtained by the above-described obtaining method of the present invention. It is an included configuration.
  • the culturing step is a step of culturing eukaryotic cells (that is, transformed eukaryotic cells expressing a gas vesicle protein complex) obtained by the obtaining method of the present invention.
  • the culture conditions for the transformed eukaryotic cells can be appropriately selected according to the type of eukaryotic cell selected as the host cell for transformation. Thereby, the transformed eukaryotic cell can be grown.
  • the production method may further include a purification step of removing the gas vesicle protein complex from the eukaryotic cell after the culturing step.
  • the purification step includes a first contact step in which a eukaryotic cell is contacted with a hypotonic solution containing a protease inhibitor (for example, pure water or a buffer solution having a low salt concentration (about 1.3 M)); You may include the 2nd contact process which contacts a cell with surfactant, the 3rd contact process which contacts a eukaryotic cell with a hypertonic solution, and the centrifugation process which centrifuges this eukaryotic cell.
  • the centrifugal acceleration condition may be set to a centrifugal acceleration of 70 ⁇ g to 200 ⁇ g, for example, from the viewpoint of operation without destroying the gas vesicle.
  • the present inventors have introduced a gas vesicle protein complex which is a prokaryotic cell organelle by introducing a gas vesicle gene gvpC derived from a bacterium belonging to the genus Planktothrix, which is a cyanobacterium, into a eukaryotic cell in combination with the gas vesicle gene gvpA.
  • a gas vesicle protein complex can be produced using eukaryotic cells (for example, yeast, insect cells, mammalian cells, etc.).
  • the kit according to the present invention is a kit for use in a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing the gas vesicle protein complex of the present invention, and a method for producing a gas vesicle protein complex using the eukaryotic cell of the present invention.
  • the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria are provided.
  • the kit according to an embodiment of the present invention may include a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria in a form inserted into an expression vector.
  • the “expression vector” is also as described in the section “1. Method for obtaining eukaryotic cell capable of expressing gas vesicle protein complex”.
  • the kit according to an embodiment of the present invention may include other reagents and instruments.
  • it may contain a reagent, a buffer or the like for stably retaining the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria, and a restriction enzyme for introducing the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC into an expression vector,
  • It may contain a reagent such as ligase.
  • reagents such as calcium phosphate and liposome for introducing the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC into eukaryotic cells may be included.
  • the kit according to the present invention can be suitably used in a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing the gas vesicle protein complex of the present invention.
  • the eukaryotic cell according to the present invention is a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex, and has a configuration in which a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria are introduced so as to be expressed. That is, the eukaryotic cell according to the present invention refers to a transformed cell that expresses a gas vesicle protein complex by introducing a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria. .
  • the “transformed cell” means not only a eukaryotic cell taken out of a living body but also a cell existing in a living body of a eukaryotic organism.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex is as described in the section “1. Method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex”.
  • the expression of the gas vesicle gene gvpA and the cyanobacterial-derived gas vesicle gene gvpC in the eukaryotic cell according to the present invention is such that the gas vesicle gene gvpA and the cyanobacterial-derived gas vesicle gene gvpC are expressed.
  • RT-PCT method reverse transcription polymerase chain reaction method
  • the eukaryotic cell according to the present invention expresses the gas vesicle protein complex by determining whether or not the gas vesicle protein complex is formed in the eukaryotic cell. it can.
  • the method for confirming whether or not a gas vesicle protein complex is formed in a eukaryotic cell is as described in the section “1. Method for obtaining eukaryotic cell capable of expressing gas vesicle protein complex” above. It is.
  • the eukaryotic cell according to the present invention can be used in the above-described method for producing a gas vesicle protein complex.
  • heterologous expression of gas vesicle protein complexes has been reported only in E. coli, and no one has succeeded in expressing heterologous expression of gas vesicle protein complexes in eukaryotic cells worldwide.
  • the present inventors have succeeded for the first time in heterologous expression of a gas vesicle protein complex in eukaryotic cells.
  • a mammalian cell capable of expressing a gas vesicle protein complex for example, a cancer cell, a neural stem cell, etc.
  • a mammal such as a mouse
  • the position of the transplanted cell in vivo is determined by MRI (including HyperCESTCMRI, etc.) or It is expected that it will be possible to observe in the same individual over a long period of time using UI.
  • gas vesicles purified from mammalian cells are injected into a living body and used as an MRI or UI contrast agent. Since MRI or UI is used for observation, an excellent effect that cells in a deep part in a living body can be observed is exhibited.
  • the expression of the gas vesicle protein complex in the transplanted cells can be reversibly controlled by, for example, ingesting doxycycline into a mouse.
  • doxycycline doxycycline
  • transgenic animal that expresses a gas vesicle by a method such as introducing the gas vesicle genes gvpA and gvpC into a fertilized egg using a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex. It is.
  • the produced transgenic animals are expected to be used for various basic research including otogenetic research. For example, by introducing the gas vesicle genes gvpA and gvpC downstream of a promoter that provides cell type-specific expression, a transgenic animal expressing the gas vesicle in a specific cell type can be produced. It is conceivable to noninvasively observe a specific cell type using MRI or UI using the transgenic animal thus prepared.
  • Example 1 Construction of expression vector DNA sequences of gas vesicle genes of various Planktothrix genera published on the Internet database (GenBank) were searched, and the following gas vesicle genes derived from the Planktothrix genera were used in the experiments. : gvpA: Planktothrix rubescens strain BC-pla9303 (Genbank ID: AJ132357.1, SEQ ID NO: 6) gvpC20: Planktothrix rubescens strain BC-pla9401 (Genbank ID: AJ132361.1, SEQ ID NO: 7).
  • DNA whose codons were optimized for expression in mammalian cells was artificially synthesized (synthesized by Genscript).
  • the base sequence of the artificially synthesized gvpA gene is shown in SEQ ID NO: 4
  • the base sequence of the artificially synthesized gvpC20 gene is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Each of the synthesized DNAs was cloned into a Tol2 transposon vector (provided by Dr. Takai, RIKEN Life System Research Center). Furthermore, the gene of fluorescent protein (mKate2 (manufactured by Evrogen) or mKO2 (manufactured by Amalgaam)) was also cloned through the T2A sequence so that the expression level of the gas vesicle gene could be confirmed by fluorescence.
  • mKate2 manufactured by Evrogen
  • mKO2 manufactured by Amalgaam
  • gvpA-T2A-mKate2 vector a Tol2 transposon vector in which the artificially synthesized gvpA gene was cloned
  • gvpC20-T2A-mKO2 vector a Tol2 transposon vector in which the artificially synthesized gvpC20 gene was cloned
  • FIG. 1 is a view showing the structure of a Tol2 transposon vector (gvpA-T2A-mKate2 vector; SEQ ID NO: 9) in which an artificially synthesized gvpA gene is cloned.
  • gvpC20-T2A-mKO2 vector SEQ ID NO: 10
  • mKate2 is inserted into the artificially synthesized gvpC20 gene of the gvpA-T2A-mKate2 vector shown in FIG. 1 where the artificially synthesized gvpA gene is inserted.
  • This is a configuration in which the part is replaced with mKO2.
  • Tol2 transposon vectors incorporate a Tet-On (registered trademark) system
  • expression of the introduced gene can be induced by doxycycline.
  • a puromycin resistance gene is incorporated in the Tol2 transposon vector
  • cells into which the Tol2 transposon vector has been introduced can be selectively obtained by drug selection with puromycin.
  • References Teakai A, et al. (2015) Expanded palette of Nano-lanterns for real-time multicolor luminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Apr 7; 112 (14) : 4352-6. Doi: 10.1073 / pnas.1418468112. Epub 2015 Mar 23.)
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of FACS analysis.
  • A) and (b) of FIG. 2 show the results of FACS analysis of the expression of fluorescent proteins mKate2 and mKO2 in the control cells, respectively.
  • C) and (d) are the fluorescent proteins in the transformed cells, respectively. The result of having analyzed the expression of mKate2 and mKO2 by FACS is shown. Since the fluorescent proteins mKate2 and mKO2 were expressed in the transformed cells, it was confirmed that the cells expressed both the gvpA gene and the gvpC20 gene.
  • KPL4_gvpA_gvpC20 cell line A cell line of one colony (referred to as “KPL4_gvpA_gvpC20 cell line”) was obtained from cells that highly express both the gvpA gene and the gvpC20 gene.
  • the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line was observed using a confocal microscope (manufactured by Olympus, model number FV3000).
  • As control cells KPL-4 cells into which only a fluorescent protein was introduced with a Tol2 vector were used.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of observing the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line under a confocal microscope.
  • 3 (a) to 3 (b) show the fluorescence of the fluorescent protein mKate2 and the fluorescence of mKO2 in the control cell, respectively, and (c) shows the bright field image of the control cell.
  • 3D to 3E show the fluorescence of the fluorescent protein mKate2 and the fluorescence of mKO2 in the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line, respectively, and
  • FIG. 3F shows the bright field image of the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line.
  • FIG. 3 (g) and (h) show enlarged views of the regions surrounded by the squares (d) and (e) in FIG. 3, respectively, and (i) shows FIG. (G) and (h) of FIG. 3 are superimposed, and (j) is a bright field image of the region of (g) and (h) of FIG. 3 (enclosed by the square of (f) of FIG. 3). The figure which expanded and displayed the area).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of RT-qPCR. As shown in FIG. 4, it was confirmed that mRNA of gvpA and gvpC20 was transcribed in the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Western blotting.
  • FIG. 5 (a) shows the result of GvpA protein detection using an anti-mKate2 antibody as a primary antibody, and (b) shows the result of GvpC20 protein detection using an anti-mKO2 antibody as a primary antibody. .
  • the expression of GvpA protein and GvpC20 protein in the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line is indirectly measured using the expression of fluorescent proteins (mKate2 and mKO2) linked to GvpA protein and GvpC20 protein, respectively, as an index.
  • fluorescent proteins mKate2 and mKO2
  • FIG. 6 is a diagram showing an observation result by a transmission electron microscope.
  • A) of FIG. 6 shows the results of the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line
  • (b) shows the results of the control cells
  • (c) shows an enlarged view of the area surrounded by the square of (a).
  • the protein is shown in black.
  • FIG. 7 is a diagram showing a purification procedure of a gas vesicle protein complex.
  • the cell line KPL4_gvpA_gvpC20
  • a predetermined amount of protease inhibitor cocktail (Roche, model number 05892791001) was dissolved, and gently mixed by inversion at 4 ° C. for 1 hour.
  • the obtained cell lysate was centrifuged at 100 ⁇ g for 4 hours. Fluorescence aggregation was observed on the surface of the solution in the sample tube after centrifugation. This suggests that the gas vesicle protein complex to which the fluorescent protein is bound accumulates on the surface of the solution due to its lighter specific gravity, and the gas vesicle protein complex formed in the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line It has a closed structure, suggesting that it eliminates water molecules and retains the property of selectively permeating gases.
  • the immersed sample was cured in an oven (45 ° C., 24 hours, 60 ° C. for 3 days).
  • the obtained block was trimmed, and the section cut into a thickness of 80 nm with a microtome was subjected to double staining with a mixed solution of uranium acetate aqueous solution and lead citrate, lead nitrate, lead acetate and sodium citrate.
  • observation with a transmission electron microscope using Hitachi H-7500 (magnification ⁇ 5000) and H-9500 (magnification ⁇ 20000) was performed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the observation result of the gas vesicle protein complex in the crude purified solution of the gas vesicle protein complex using a transmission electron microscope. Observation with a transmission electron microscope was performed at a magnification of 5000 or 20000, a sample thickness of 80 nm, and 25 ° C.
  • a of FIG. 8 is a figure which shows the result observed at 5000 times magnification
  • (b) is a figure which shows the result observed at 20000 times magnification.
  • the gas vesicle protein complex was present in an aggregated state in the crude gas vesicle protein complex purification solution.
  • the size and distribution of the size of the gas vesicle protein complex in the gas vesicle protein complex crude purification solution were measured by dynamic light scattering measurement (hereinafter also referred to as DLS measurement). Specifically, in the particle size measurement mode of Malvern's Zetasizer (Nano-ZS), the particle size of the protein in the purified gas vesicle solution at 25 ° C and the particle size distribution by dynamic light scattering (DLS) was calculated. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10 (a), the size peak of the gas vesicle protein complex was one. From this result, it was found that the gas vesicle protein complex having the same size was expressed in the KPL4_gvpA_gvpC20 cell line.
  • Example 2 In Example 2, a combination of gvpC16 and gvpC20 was used as the gas vesicle gene gvpC.
  • the artificially synthesized gvpC16 gene was cloned into the Tol2 transposon vector in the same manner as in Example 1. Furthermore, the gene of a fluorescent protein (GFP (manufactured by Clontech)) was also cloned through the T2A sequence so that the expression level of the gas vesicle gene could be confirmed by fluorescence. As a result, a Tol2 transposon vector (referred to as “gvpC16-T2A-GFP vector”) obtained by cloning the artificially synthesized gvpC16 gene was obtained.
  • GFP fluorescent protein
  • the gvpC16-T2A-GFP vector is a gvpC16 gene obtained by artificially synthesizing the gvpA gene inserted in the gvpA-T2A-mKate2 vector shown in FIG. 1, and the portion in which mKate2 is inserted into GFP. This is a replacement configuration.
  • KPL-4 cells were obtained in the same manner as in Example 1, using the gvpC16-T2A-GFP vector together with the gvpA-T2A-mKate2 vector and gvpC20-T2A-mKO2 vector used in Example 1. After co-transfection into the genome and integration into the genome, the transformed cells were cultured using a selective medium and drug selection was performed. Then, cells that highly expressed the gas vesicle gene were selected by FACS analysis. As control cells, KPL-4 cells into which Tol2 vector was not introduced were used.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of FACS analysis.
  • (A) to (c) of FIG. 9 show the results of FACS analysis of the expression of fluorescent proteins GFP, mKate2 and mKO2 in the control cells, respectively, (d) to (f) in the transformed cells, respectively.
  • the result of having analyzed the expression of fluorescent protein GFP, mKate2, and mKO2 by FACS is shown. Since all the fluorescent proteins GFP, mKate2 and mKO2 were expressed in the transformed cells, it was confirmed that the cells expressed all the gvpA gene, gvpC16 gene and gvpC20 gene.
  • KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line A cell line of one colony (referred to as “KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line”) was obtained from cells that highly expressed all of the gvpA gene, the gvpC16 gene, and the gvpC20 gene.
  • the gas vesicle protein complex was purified in the same manner as in the purification method examined in Example 1, except that the KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line was used as the cell line.
  • the size of the gas vesicle protein complex in the crude purification solution of the gas vesicle protein complex was measured by DLS measurement in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10 (c), the size peak of the gas vesicle protein complex was one. From this result, it was found that the gas vesicle protein complex having the same size was expressed in the KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line.
  • FIG.11 (b) is a figure which shows the observation result. As shown in FIG. 11 (b), a biconic structure peculiar to the gas vesicle protein complex was confirmed in the gas vesicle protein complex crude purified solution.
  • Example 3 In Example 3, gvpC28 was used as the gas vesicle gene gvpC.
  • the artificially synthesized gvpC28 gene was cloned into the Tol2 transposon vector in the same manner as in Example 1. Furthermore, the gene of a fluorescent protein (GFP (manufactured by Clontech)) was also cloned through the T2A sequence so that the expression level of the gas vesicle gene could be confirmed by fluorescence. As a result, a Tol2 transposon vector (referred to as “gvpC28-T2A-GFP vector”) obtained by cloning the artificially synthesized gvpC28 gene was obtained.
  • GFP fluorescent protein
  • the gvpC28-T2A-GFP vector is the gvpC28 gene obtained by artificially synthesizing the gvpA gene inserted in the gvpA-T2A-mKate2 vector shown in FIG. 1, and the mKate2 inserted in mKO2. This is a replacement configuration.
  • the gvpC28-T2A-GFP vector was cotransfected into KPL-4 cells in the same manner as in Example 1 together with the gvpA-T2A-mKate2 vector used in Example 1, and the genome was obtained. Then, after transformant cells were cultured using a selective medium and drug selection was performed, cells that highly expressed the gas vesicle gene were selected by FACS analysis. As control cells, KPL-4 cells into which Tol2 vector was not introduced were used.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of FACS analysis.
  • (A) to (c) of FIG. 9 show the results of FACS analysis of the expression of fluorescent proteins GFP, mKate2 and mKO2 in the control cells, respectively, (g) and (h) in the transformed cells, respectively.
  • the result of having analyzed the expression of fluorescent protein GFP and mKate2 by FACS is shown.
  • both the fluorescent proteins GFP and mKate2 were expressed. Therefore, it was confirmed that the cells expressed both the gvpA gene and the gvpC28 gene.
  • KPL4_gvpA_gvpC28 cell line A cell line of one colony (referred to as “KPL4_gvpA_gvpC28 cell line”) was obtained from cells that highly expressed both the gvpA gene and the gvpC28 gene.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results. Note that (a) to (d) in FIG. 12 are all images showing the same area.
  • FIGS. 12A and 12B show the fluorescence of the fluorescent protein GFP and the fluorescence of mKate2 in KPL4_gvpA_gvpC28 cells, respectively.
  • FIG.12 (c) has shown the bright field image of the area
  • FIG. 12D is a drawing obtained by superimposing the drawings of FIGS. 12A and 12B.
  • the gas vesicle protein complex was purified in the same manner as the purification method examined in Example 1, except that the KPL4_gvpA_gvpC28 cell line was used as the cell line.
  • the size of the gas vesicle protein complex in the crude purification solution of the gas vesicle protein complex was measured by DLS measurement in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • gas vesicle protein complex in the gas vesicle protein complex roughly purified solution was treated as follows to prepare a sample, and the sample was observed with a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • the purified gas vesicle solution was mixed 1: 1 with a 2% glutaraldehyde solution. 3 ⁇ l of this mixed solution was placed on a membrane-clad grid that had been hydrophilized by an ion sputtering apparatus, and was allowed to stand for 60 seconds to be adsorbed on the membrane-clad grid. The solution contained in the membrane-clad grid was sucked with a filter paper, and the membrane-clad grid was brought into contact with water droplets of pure water. The solution containing the membrane-clad grid was again blotted with the filter paper.
  • FIG. 11A shows the observation result.
  • the gas vesicle protein complex was present in an aggregated state in the crude purification solution of the gas vesicle protein complex.
  • Example 4 In Example 4, a combination of gvpC20 and gvpC28 was used as the gas vesicle gene gvpC.
  • Expression vectors used The gvpA-T2A-mKate2 vector, gvpC20-T2A-mKO2 vector, and gvpC28-T2A-GFP vector constructed in Example 1 and Example 2 were used as expression vectors.
  • the gvpC28-T2A-GFP vector was cotransfected into KPL-4 cells in the same manner as in Example 1 together with the gvpA-T2A-mKate2 vector and the gvpC20-T2A-mKO2 vector. After integration into the genome, the transformed cells were cultured using a selective medium and drug selection was performed to obtain cells expressing the gas vesicle gene.
  • KPL4_gvpA_gvpC20_gvpC28 cell line A cell line of one colony (referred to as “KPL4_gvpA_gvpC20_gvpC28 cell line”) was obtained from cells expressing all of the gvpA gene, the gvpC20 gene, and the gvpC28 gene.
  • the gas vesicle protein complex was purified in the same manner as in the purification method examined in Example 1, except that the KPL4_gvpA_gvpC20_gvpC28 cell line was used as the cell line.
  • the size of the gas vesicle protein complex in the crude purification solution of the gas vesicle protein complex was measured by DLS measurement in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10 (d), the size peak of the gas vesicle protein complex was one. From this result, it was found that the gas vesicle protein complex having the same size was expressed in the KPL4_gvpA_gvpC20_gvpC28 cell line.
  • FIG. 11C shows the observation result.
  • TEM transmission electron microscope
  • Example 5 Cell lines expressing the gas vesicle protein complex obtained in Examples 1 to 4 (KPL4_gvpA_gvpC20 cell line, KPL4_gvpA_gvpC28 cell line, KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line, and KPL4_gvpA_gvpC28 cell ultrasonogram) Signal measurements were made.
  • Pulsar receiver (Olympus, part number MODEL 5077PR) and oscilloscope (Agilent, DSO5014A LX1), 5MHz and 10MHz transducers (Olympus, V309-SU-F1 (5MHz), M312-SU-F1 (10MHz) )
  • a BNC coaxial cable With this configuration, 1) Set the parameters of the ultrasonic wave irradiated by the pulsar receiver, 2) The sample cell is irradiated with ultrasonic waves having a transmission frequency of 5 MHz and 10 MHz from the transducer, and 3) The ultrasonic wave scattered from the sample cell was received by the transducer, and the time waveform was observed with an oscilloscope.
  • the software Intuilink data capture (manufactured by KEYSIGHT ⁇ ⁇ technologies) and Excel (Microsoft) for transferring oscilloscope data to the PC provided by the manufacturer together with the oscilloscope were installed on a notebook PC (manufactured by Fujitsu, FMVS765ATK).
  • a notebook PC manufactured by Fujitsu, FMVS765ATK.
  • the sample well was washed twice with PBS and filled with about 5.0 ⁇ 10 6 sample cells suspended in PBS and control KPL-4 cells, and used as a measurement sample.
  • FIG. 13 (b) shows signals observed when the KPL4_gvpA_gvpC16_gvpC20 cell line was used as a sample cell and a transmission frequency of 5 MHz was used.
  • the pulsar receiver settings were as follows. Acoustic power: 40dB Pulse Repetition Frequency (PRF): 200Hz Pulse Voltage: 300V Transducer Frequency: 5MHz / 10MHz For the 25 points measured, the time waveform of the echo signal from the cell was examined, and the average value of the difference between the maximum value and the minimum value of the amplitude of the time waveform was calculated.
  • PRF Pulse Repetition Frequency
  • FIG. 14 shows a typical time waveform of echo signals from cells measured at 25 points.
  • FIG. 15 shows an average value of the difference between the maximum value and the minimum value of the amplitude of the time waveform.
  • the error bar means standard error.
  • GV_A_C20, GV_A_C28, GV_A_C16_C20, GV_A_C20_C28 are used as KPL4_gvpA_gvC20 cell line, KPL4_gvpA_gvC20 cell line, KPL4_gvpC_cell cell line, and KPL4_gvP20 cell line.
  • 14A and 14B and 15B show the results using transmission frequencies of 5 MHz and 10 MHz, respectively. Moreover, in FIG. 15, the symbol was used with the following meaning.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex includes an introducing step of introducing a gas vesicle gene gvpA and a gas vesicle gene gvpC into a eukaryotic cell so as to allow expression.
  • the gas vesicle gene gvpC is a method derived from cyanobacteria.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to aspect 2 of the present invention is the above described aspect 1, wherein the gas vesicle gene gvpC is any one of the following (a) to (c): (A) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (b) any of SEQ ID NOs: 1 to 3 A polypeptide encoding a hydrophilic polypeptide having an amino acid sequence having 75% or more of sequence identity with the amino acid sequence described in 1.
  • nucleotides in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOS: 1-3, one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / Or have additional amino acid sequence, and a polynucleotide encoding a hydrophilic polypeptide rib structure of the gas vesicle protein complex has a function of stabilizing.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to aspect 3 of the present invention is the method of obtaining an eukaryotic cell according to aspect 1 or 2, wherein the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are It may be an optimized method.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to aspect 4 of the present invention is the method according to any one of aspects 1 to 3, wherein the gas vesicle gene gvpA is derived from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the gas vesicle gene gvpC is a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. It is good also as a method of being 1 or more types selected from the group which consists of.
  • the method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing a gas vesicle protein complex according to aspect 5 of the present invention is the transposon vector according to any one of the above aspects 1 to 4, wherein the gas vesicle gene gvpA and the gas vesicle gene gvpC are It is good also as the method inserted in.
  • the eukaryotic cell according to aspect 6 of the present invention has a configuration in which the gas vesicle gene gvpA and the cyanobacterial-derived gas vesicle gene gvpC are introduced so that they can be expressed.
  • the method for producing a gas vesicle protein complex using a eukaryotic cell according to aspect 7 of the present invention is a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing the gas vesicle protein complex according to any one of aspects 1 to 5 of the present invention. It is the method including the culture
  • a kit according to aspect 8 of the present invention is a kit for use in a method for obtaining a eukaryotic cell capable of expressing the gas vesicle protein complex according to any one of aspects 1 to 5 of the present invention, and comprises a gas vesicle gene gvpA and And a gas vesicle gene gvpC derived from cyanobacteria.
  • the present invention can be used in various fields such as biolife science and medicine.

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Abstract

ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する導入工程を包含し、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、シアノバクテリアに由来する。

Description

ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法、真核細胞、真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法、およびキット
　本発明は、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法、真核細胞、真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法、およびキットに関する。
　シアノバクテリア、古細菌等の主に湖沼に生息する微生物は、浮力を得るために、ガスベシクル（Ｇａｓ　Ｖｅｓｉｃｌｅ，ＧＶ）と呼ばれる細胞小器官を有していることが知られている（非特許文献１）。ガスベシクルは、ナノサイズのタンパク質超分子複合体であり、その内部には、水分子が排除されて、気体のみが選択的に透過されて溜められている。
　これらの微生物に由来するガスベシクル（ガスベシクルタンパク質複合体）は、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および超音波イメージング（ＵＩ）における造影剤として利用できることが報告されている（特許文献１～３および非特許文献２～３）。また、ガスベシクルは、造影剤としての用途以外に、ペプチド抗原を提示するキャリアタンパク質として用いて、ワクチンとして応用する研究も行われている（特許文献４および非特許文献４）。
　ガスベシクルは、タンパク質のみから構成されているため、遺伝的にコード可能であると考えられる。例えば、非特許文献５は、Bacillus megateriumから１５個の遺伝子で構成されるガスベシクル遺伝子群をクローニングし、この遺伝子群を大腸菌において異種発現させて、大腸菌のプロトプラスト内にガスベシクルが観察されたことを報告している。
　非特許文献６は、Planktothrix rubescens由来のガスベシクル遺伝子をクローニングして、これらの遺伝子を大腸菌において異種発現させたこと、および大腸菌のプロトプラスト内にガスベシクルが確認されたことを報告している。
米国特許出願公開第２０１４／０２８８４１１号明細書（２０１４年　９月２５日公開） 米国特許出願公開第２０１４／０２８８４２１号明細書（２０１４年　９月２５日公開） 米国特許出願公開第２００６／０２１６８１０号明細書（２００６年　９月２８日公開） 国際公開第９７／２０８５４号パンフレット（１９９７年　６月１２日公開）
Anthony E. Walsby, Gas Vesicles. Microbiological reviews, Mar. 1994, p.94-144 Shapiro, M. G. et al., Biogenic Gas Nanostructures as Ultrasonic Molecular Reporters. Nat Nanotechnol. 2014 Apr;9(4):311-6 Shapiro, M. G. et al., Genetically encoded reporters for hyperpolarized xenon magnetic resonance imaging. Nature Chemistry 2014 Jul;6(7):629-34 DasSarma, S. & DasSarma, P., Gas Vesicle Nanoparticles for Antigen Display. Vaccines. 2015 Sep 7;3(3):686-702 Li N & Cannon MC, Gas vesicle genes identified in Bacillus megaterium and functional expression in Escherichia coli. JOURNAL OF BACTERIOLOGY1998 May;180(9):2450-8. ｉＧＥＭ２０１２ホームページ［平成２８年　７月１４日検索］、インターネット＜URL：http://2012.igem.org/Team:OUC-China/Project/GVP/GasandBackground＞
　しかしながら、上述したとおり、ガスベシクルは、シアノバクテリア、古細菌等の原核生物が有している細胞小器官である。このため、ガスベシクルタンパク質複合体の異種発現の成功が報告された例は、同じ原核生物である大腸菌においてのみである。一方、真核生物は、細胞内の構造の複雑さ、多様性等、細胞内の環境が原核生物とは大きく異なる。このような真核生物において、原核生物由来の細胞小器官であるガスベシクルタンパク質複合体を発現させたという報告はこれまでにない。
　本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法を実現することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明に係る、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する導入工程を包含し、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、シアノバクテリアに由来する方法である。
　また、本発明に係る真核細胞は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとが発現可能に導入されている真核細胞である。
　本発明によれば、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞を取得することができるという効果を奏する。また、本発明によれば、真核細胞を用いてガスベシクルタンパク質複合体を生産することができる。
人工合成したｇｖｐＡ遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２）の構成を示す図である。 実施例１で取得した形質転換細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 実施例１で取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株を共焦点顕微鏡下で観察した結果を示す図である。 実施例１で取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株についてＲＴ－ｑＰＣＲを行った結果を示す図である。 実施例１で取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株についてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 実施例１で取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株の透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。 ガスベシクルタンパク質複合体の精製手順を示す図である。 実施例１で取得したガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。 実施例２および３で取得した形質転換細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 実施例１～４で取得したガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体のＤＬＳ測定の結果を示す図である。 実施例２～４で取得したガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。 実施例３で取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株を共焦点顕微鏡下で観察した結果を示す図である。 実施例１～４で用いた超音波エコー信号計測系の構成を示す図である。 実施例１～４で取得した細胞の超音波エコー信号の測定結果を示す図である。 実施例１～４で取得した細胞の超音波エコー信号の測定結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
　〔１．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法〕
　本発明に係る、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法（以下、「取得方法」と称する。）は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する導入工程を包含しており、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、シアノバクテリアに由来する構成である。
　ここで、上記「ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞」とは、ガスベシクルタンパク質複合体を既に発現している真核細胞のみならず、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能であるが、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの発現が可逆的または不可逆的に抑制されているためにガスベシクルタンパク質複合体を未だ発現していない真核細胞もその範疇に含む。「ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能であるが、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの発現が可逆的または不可逆的に抑制されているためにガスベシクルタンパク質複合体を未だ発現していない真核細胞」は、タンパク質をコードしている「ポリヌクレオチド」を指す。「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
　また、本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。
　（導入工程）
　導入工程は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する工程である。ここで、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを「発現可能に真核細胞に導入する」とは、遺伝子工学的手法によって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが真核細胞内で共発現可能となるように、これらの遺伝子を真核細胞に導入することを意図している。「共発現可能」とは、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの両方が、同一細胞内で発現し得ることを意図している。よって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが同一細胞内で発現し得る限りは、これらの遺伝子が細胞に導入される順序、方法等は特に限定されない。
　細胞内に導入するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、１種類に限らず、複数の遺伝子を組み合わせて用いてもよい。また、複数の遺伝子を組み合わせる場合は、由来が異なる複数の遺伝子を組み合わせてもよく、由来が同じ遺伝子を組み合わせてもよい。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡの由来は特に限定されない。例えば、シアノバクテリア、古細菌、グラム陽性細菌等を挙げることができる。
　シアノバクテリアとしては、Planktothrix属細菌、Anabaena属細菌、Calothrix属細菌等を挙げることができる。古細菌としては、Halobacterium属細菌を挙げることができる。グラム陽性細菌としては、Bacillus属細菌等を挙げることができる。
　Planktothrix属細菌としては、Planktothrix rubescens、Planktothrix agardhii、Planktothrix prolifica等を挙げることができる。Anabaena属細菌としては、Anabaena flos-aquae CCAP 1403/13F、Anabaena lemmermannii strain BC Ana0035等を挙げることができる。Calothrix属細菌としては、Calothrix PCC7601等を挙げることができる。Halobacterium属細菌としては、Halobacterium NRC-1、Halobacterium salinarum PHH1等を挙げることができる。Bacillus属細菌としては、Bacillus megaterium等を挙げることができる。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡの塩基配列は、例えば、GenBank等の公共のデータベースから容易に取得することができる。「ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ」としては、例えば、Planktothrix rubescens strain BC-pla9303由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：AJ132357.1、配列番号６）、Anabaena flos-aquae CCAP 1403/13F由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：U17109.1）、Calothrix PCC7601由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：X06085.1）、Anabaena lemmermannii strain BC Ana0035由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：DQ120596.1）等を挙げることができる。
　また、シアノバクテリアに由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ以外では、Halobacterium salinarum NRC-1由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：AF016485.1）、Halobacterium salinarum PHH1由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：X94688.1）、Bacillus megaterium由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：AF053765.1）等を挙げることができる。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡをコードする遺伝子である。ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡは、ガスベシクルタンパク質複合体の主要な構造であるリブ（ｒｉｂ）を形成する疎水性タンパク質である（参考文献：Anthony E. Walsby, Gas Vesicles. Microbiological reviews, Mar. 1994, p.94-144（非特許文献１））。よって、ガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している疎水性タンパク質であれば、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡだけでなく、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡも、上記「ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡ」の範囲に含まれる。
　変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡとは、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が変異したものであって、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している疎水性タンパク質をいう。尚、本明細書において、アミノ酸の「変異」とは、置換、欠失、挿入および／または付加を指す。アミノ酸の「変異」は、好ましくは置換または欠失であり、より好ましくは置換である。
　変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡは、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡのアミノ酸配列と７５％以上（より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している疎水性タンパク質であることが好ましい。尚、本明細書において「配列同一性」とは、アミノ酸配列についていう場合、同一のアミノ酸残基数の割合を意図している。アミノ酸配列の配列同一性は、公知の方法によって算出することができる。例えば、ウェブベースのアミノ酸配列比較プログラム Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）によって算出することができる。
　変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡが「疎水性タンパク質」であるか否かは、ウェブベースのプログラム ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1）において、Kyte & DoolittleのScaleを用いて、各アミノ酸残基の疎水性インデックスを計算したとき、Ｎ末端５残基、Ｃ末端５残基を除く全残基のうち、疎水性インデックスの値が０以上の残基が７０％以上であるかで確認することができる。また、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡが「ガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している」か否かは、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡをコードする遺伝子を、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ（好ましくは野生型のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ）と共に真核細胞（宿主細胞）に導入して、真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認することによって判断することができる。真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認する方法としては、後述する実施例に示したように、透過型電子顕微鏡によって細胞内部の様子を観察し、細胞内部にガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐形構造が認められるか否かを確認する方法を挙げることができる。
　従って、本明細書において、上記「ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ」は、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡをコードする遺伝子だけでなく、上述したような変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡをコードする遺伝子もその範囲に含む。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、Planktothrix rubescens strain BC-pla9303由来のｇｖｐＡ遺伝子（GenBank Accession Number：AJ132357.1、配列番号６）がコードしているポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）と、７５％以上（より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している疎水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
　このようなガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡとしては、シアノバクテリアに由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡを挙げることができ、より具体的には、例えば、上述したAnabaenaflos-aquae CCAP 1403/13F由来のｇｖｐＡ（GenBank Accession Number：U17109.1）、Calothrix PCC7601由来のｇｖｐＡ（GenBank Accession Number：X06085.1）、Anabaena lemmermannii strain BC Ana0035由来のｇｖｐＡ（GenBank Accession Number：DQ120596.1）等を挙げることができる。これらのガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、Planktothrix rubescens strain BC-pla9303由来のｇｖｐＡがコードしているポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）に対して、それぞれが、７５％以上のアミノ酸配列の配列同一性を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相当する。尚、配列番号８に示すアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブを形成する機能を有している疎水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、野生型ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡだけでなく、変異型ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡもその範疇に含まれる。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ遺伝子は、シアノバクテリアに由来するものであれば特に限定されない。シアノバクテリアとしては、Planktothrix属細菌、Arthrospira属細菌等を挙げることができる。Planktothrix属細菌については上述したとおりである。Arthrospira属細菌としては、Arthrospira sp. Moz. 2.1等を挙げることができる。
　シアノバクテリアに由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの塩基配列は、例えば、GenBank等の公共のデータベースから容易に取得することができる。「シアノバクテリアに由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ」としては、例えば、Planktothrix属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ、Arthrospira属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ等を挙げることができる。
　Planktothrix属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとして、ｇｖｐＣ１６、ｇｖｐＣ２０およびｇｖｐＣ２８の３種の変異体が存在することが報告されている（参考文献：S.J. Beard et al., Gas vesicle genes in Planktothrix spp. from Nordic lakes: strains with weak gas vesicles possess a longer variant of gvpC., Microbiology 2000 146 (8): 2009-2018）。
　上記ｇｖｐＣ１６、ｇｖｐＣ２０およびｇｖｐＣ２８はそれぞれ、GenBank Accession Number：AJ132354.1に示されるｇｖｐＣ（配列番号１３、Planktothrix rubescens stain BC-pla9401に由来、「ｇｖｐＣ１６」と称される。）、GenBank Accession Number：AJ132361.1に示されるｇｖｐＣ（配列番号７、Planktothrix rubescens strain BC-pla9401に由来、「ｇｖｐＣ２０」と称される。）、GenBank Accession Number：AJ253131.1に示されるｇｖｐＣ（配列番号１４、Planktothrix agardhii strain NIVA-CYA29に由来、「ｇｖｐＣ２８」と称される。）、NCBI reference sequence：WP_026798481.1に示されるｇｖｐＣ（Planktothrix prolificaに由来）である。
　Arthrospira属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとしては、GenBank Accession Number：HQ641417.1に示されるｇｖｐＣ（Arthrospira sp. Moz. 2.1に由来、「gvpC1またはgvpC2」と称される。）またはGenBank Accession Number：HQ641413.1に示されるｇｖｐＣ（Arthrospira sp. Moz. 2.1に由来、「gvpC3」と称される。）等を挙げることができる（参考文献：Miklaszewska, M. et al. Elucidation of the gas vesicle gene clusters in cyanobacteria of the genus Arthrospira (Oscillatoriales, Cyanophyta)and correlation with its phylogeny. Eur. J. Phycol. 47 (3), 233-244 (2012)）。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣをコードする遺伝子である。ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣは、ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性タンパク質である（参考文献：Anthony E. Walsby, Gas Vesicles. Microbiological reviews, Mar. 1994, p.94-144（非特許文献１））。よって、ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる親水性タンパク質であれば、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣだけでなく、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣも、上記「ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣ」の範囲に含まれる。
　変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣとは、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が変異したものであって、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる親水性タンパク質をいう。変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣは、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣのアミノ酸配列と７５％以上（より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる親水性タンパク質であることが好ましい。
　変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣが「親水性タンパク質」であるか否かは、ウェブベースのプログラム ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1）において、Kyte & DoolittleのScaleを用いて、各アミノ酸残基の疎水性インデックスを計算したとき、Ｎ末端５残基、Ｃ末端５残基を除く全残基のうち、疎水性インデックスの値が０未満の残基が７０％以上であるかによって確認することができる。また、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣが「ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している」か否かは、変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣをコードする遺伝子を、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ（好ましくは野生型のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ）と共に真核細胞（宿主細胞）に導入して、真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認することによって判断することができる。真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認する方法としては、後述する実施例に示したように、透過型電子顕微鏡によって細胞内部の様子を観察し、細胞内部にガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐形構造が認められるか否かを確認する方法を挙げることができる。
　従って、本明細書において、上記「ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ」は、野生型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐｇｖｐＣをコードする遺伝子だけでなく、上述したような変異型ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣをコードする遺伝子もその範囲に含む。
　一実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、以下の（ａ）～（ｃ）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含み得る：
　（ａ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　上記（ａ）の遺伝子は、配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子である。配列番号１は、Planktothrix rubescens stain BC-pla9401由来のｇｖｐＣ１６タンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号２は、Planktothrix rubescens strain BC-pla9401由来のｇｖｐＣ２０タンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号３は、Planktothrix agardhii strain NIVA-CYA29由来のｇｖｐＣ２８タンパク質のアミノ酸配列を示している。
　上記（ｂ）の遺伝子は、配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関して、機能的に同等（同一および／または類似）である変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意図し、ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードする限り、その具体的な配列については特に限定されない。ここで、アミノ酸配列の配列同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であることが特に好ましい。
　上記（ｃ）の遺伝子は、配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関して、機能的に同等（同一および／または類似）である変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意図し、ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードする限り、その具体的な配列については特に限定されない。ここで、置換、欠失、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸残基の数は、上記機能を失わせない限り、限定されない。例えば、置換、欠失、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸残基の数は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって置換、欠失、挿入または付加できる程度の数をいい、通常は３０個以内であり、好ましくは２０個以内であり、さらに好ましくは１０個以内であり、より好ましくは７個以内、さらに好ましくは５個以内（例えば、５、４、３、２または１個）である。アミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換される場合、置換後のアミノ酸残基は、置換前のアミノ酸残基とアミノ酸側鎖の性質が同一であることが好ましい。
　上記（ｂ）の遺伝子および上記（ｃ）の遺伝子によってコードされるポリペプチドが「親水性のポリペプチド」であるか否かは、ウェブベースのプログラム ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1）において、Kyte & DoolittleのScaleを用いて、各アミノ酸残基の疎水性インデックスを計算したとき、Ｎ末端５残基、Ｃ末端５残基を除く全残基のうち、疎水性インデックスの値が０未満の残基が７０％以上であるかによって確認することができる。また、上記（ｂ）の遺伝子および上記（ｃ）の遺伝子によってコードされるポリペプチドが「ガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している」か否かは、上記（ｂ）の遺伝子または上記（ｃ）の遺伝子を、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ（好ましくは野生型のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ）と共に真核細胞（宿主細胞）に導入して、真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認することによって判断することができる。真核細胞（宿主細胞）内にガスベシクルタンパク質複合体が形成され得るか否かを確認する方法としては、後述する実施例に示したように、透過型電子顕微鏡によって細胞内部の様子を観察し、細胞内部にガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐形構造が認められるか否かを確認する方法を挙げることができる。
　上記（ｂ）の遺伝子としては、シアノバクテリアであるPlanktothrix agardhiiに由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを挙げることができる。尚、配列番号１～３に示すアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、野生型ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣだけでなく、変異型ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣもその範疇に含まれる。
　一実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、コドンが哺乳類細胞における発現に最適化されていることが好ましい。コドンの最適化は、遺伝子のコドンを特定の生物種（好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞、さらに好ましくは遺伝子が導入される宿主細胞が由来する生物種）における発現に最適化させる変異であり、かかる遺伝子の変異によって、コードされるアミノ酸配列には変化が生じない。また、「哺乳類細胞における発現に最適化」とは、遺伝子のコドンを、哺乳動物においてコドン出現頻度が高いコドンに変更することを意図する。コドンを哺乳類細胞における発現に最適化することによって、真核細胞（特に、哺乳類細胞）におけるガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの翻訳効率が向上し、その結果、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の発現量を増加させることができる。コドンの最適化は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの全塩基配列中の哺乳類細胞であまり使用されないコドンをすべて最適化することによって行うことができる。
　また、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質は、ペプチド付加および化学修飾等により、修飾されていてもよい。ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質を修飾することで、ガスベシクルの特定の機能を調節することができることが知られている。例えば、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣのＣ末端にペプチドを融合することによって、ガスベシクルの貪食を制御すること等が可能であることが報告されている（参考文献：Lakshmanan et al., Molecular engineering of acoustic protein nanostructures., ACS Nano 2016 10 (8): 7314-7322）。また、ガスベシクルの表面をＰＥＧ化等により修飾することによって、クリアランス、および免疫原性を低下させること等が可能であることが報告されている（参考文献：Shapiro et al., Biogenic Gas Nanostructures as Ultrasonic Molecular Reporters., Nat Nanotechnol. 2014 April ; 9(4): 311-316）。この他、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質にターゲティングシグナルを付与することによって、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の細胞内での輸送、および局在を調節してもよい。
　一実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
　別の実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組み合わせであることが好ましい。
　別の実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。尚、配列番号４は、Planktothrix rubescens strain BC-pla9303由来のｇｖｐＡ遺伝子（配列番号６）のコドンを、哺乳類細胞における発現に最適化したポリヌクレオチドの塩基配列を示している。配列番号５は、Planktothrix rubescens strain BC-pla9401由来のｇｖｐＣ２０遺伝子（配列番号７）のコドンを、哺乳類細胞における発現に最適化したポリヌクレオチドの塩基配列を示している。配列番号１１は、Planktothrix rubescens strain BC-pla9401由来のｇｖｐＣ１６遺伝子（配列番号１３）のコドンを、哺乳類細胞における発現に最適化したポリヌクレオチドの塩基配列を示している。配列番号１２は、Planktothrix agardhii strain NIVA-CYA29由来のｇｖｐＣ２８遺伝子（配列番号１４）のコドンを、哺乳類細胞における発現に最適化したポリヌクレオチドの塩基配列を示している。
　別の実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
　より好ましい実施形態においては、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣがこの組み合わせであれば、後述する実施例において示すように、発現されるガスベシクルタンパク質複合体が、超音波イメージング（ＵＩ）において、特に高い造影効果を示す。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが導入される対象となる真核細胞は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等を挙げることができる。例えば、後述する実施例で使用したヒト乳がん由来細胞株であるＫＰＬ－４細胞のような株化された細胞以外に、真核生物の組織から取得した株化されていないプライマリー（primary）細胞であってもよい。株化された細胞としては、例えば、ＫＰＬ－４細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ＰＣ１２細胞等を挙げることができる。また、プライマリー細胞としては、マウス由来初代海馬ニューロン等を挙げることができる。尚、生体外に取り出された真核細胞のみならず、真核生物（ヒトを除く）の生体内に存在している細胞もガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが導入される対象となる。従って、本発明に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、生体外または生体内の哺乳類細胞におけるガスベシクルタンパク質複合体の発現方法とも換言できる。また、本発明に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の生産方法としても利用することができる。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを発現可能に真核細胞に導入する方法としては、例えば、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを挿入した発現ベクターを細胞に導入する方法を挙げることができる。発現ベクターにおいて、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、宿主となる真核細胞（宿主細胞）内で機能し得る発現制御領域に制御可能に連結されている。上記「発現制御領域」は、遺伝子の発現を制御している「ポリヌクレオチド」を指す。上記「発現制御領域」の一例としては、プロモータ領域、エンハンサ領域等を挙げることができる。上記「発現制御領域」は、真核細胞中で発現を制御し得る公知のプロモータ配列等から適宜選択することができる。
　一実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを、単一の発現ベクターに挿入して、この発現ベクターを宿主細胞に導入してもよい。また、別の実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを、それぞれ別の発現ベクターに挿入して複数個の発現ベクターを作製し、これらの複数個の発現ベクターを宿主細胞に導入してもよい。尚、複数個の発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、各発現ベクターを導入する順序は特に限定されない。
　発現ベクターとしては、真核細胞（宿主細胞）で発現可能な公知の発現ベクターを使用することができる。例えば、トランスポゾンベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等の発現ベクターを使用することができる。トランスポゾンベクターとは、トランスポゾン配列を有しているベクターである。トランスポゾンベクターを用いることによって、トランスポゾン配列の間に挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。トランスポゾンベクターとしては、後述する実施例で使用したＴｏｌ２トランスポゾンベクターの他に、PiggyBac（参考文献：Woodard LE et al., piggybac-ing models and new therapeutic strategies, Trends. Biotechnol. Sep;33(9);525-33.(2015)）、Sleeping Beauty（参考文献：Zsuzsanna Izsvak et al. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: Victories and challenges. Bioessays, Vol. 32 (9) pp. 756-767 (2010)）等を挙げることができる。
　従って、一実施形態において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、トランスポゾンベクターに挿入されていてもよい。ここで、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが「トランスポゾンベクターに挿入されている」とは、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣがトランスポゾン配列の間に挿入されていることを意図している。
　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの導入に使用される発現ベクターは、少なくとも、目的遺伝子としてガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを含んでいればよいが、目的に応じて、他の遺伝子を含んでいてもよい。
　例えば、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含んでいることが好ましい。このような選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。具体的には、公知の、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子等を挙げることができる。
　上記選択マーカー遺伝子を用いれば、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを、選択マーカー遺伝子の発現を指標として間接的に確認することができる。これにより、発現ベクターが導入された細胞を選択的に取得することができる。
　また、例えば、発現ベクターは、公知の蛍光タンパク質をコードする遺伝子（蛍光タンパク質遺伝子）を含んでいてもよい。蛍光タンパク質は、ガスベシクルタンパク質との融合タンパク質として発現させてもよい。例えば、ガスベシクルタンパク質と蛍光タンパク質とを、公知の特異的タンパク質分解シグナル配列（Ｔ２Ａ配列等）等を介して連結して融合タンパク質として発現させることができる。Ｔ２Ａ配列等の特異的タンパク質分解シグナル配列によって連結された融合タンパク質は、発現された後に、２つのタンパク質に分離されて個々のタンパク質としての機能を有し得る。
　蛍光タンパク質との融合タンパク質としてガスベシクルタンパク質を発現させることにより、ガスベシクルタンパク質の発現量を、蛍光タンパク質の発現量（すなわち、蛍光強度）を指標として間接的に確認することができる。これにより、ガスベシクルタンパク質を高発現している細胞を選択的に取得することができる。ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡおよびガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣにそれぞれ連結させる蛍光タンパク質は、互いに異なっていることが好ましい。これにより、ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡの発現量およびガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣの発現量を、それぞれに連結させた蛍光タンパク質の発現量を指標として、それぞれ確認することができる。蛍光タンパク質としては、公知の、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＫａｔｅ２、ｍＫＯ２、ｍＶｅｎｕｓ等を挙げることができる。
　また、例えば、発現ベクターには、遺伝子発現誘導系が組み込まれていてもよい。上記「遺伝子発現誘導系」は、リプレッサータンパク質と、当該リプレッサータンパク質が結合し得るタンパク質結合ドメインを有しているオペレーター配列を利用するものであり、オペレーター配列に対するリプレッサータンパク質の結合性を制御することによって、オペレーター配列の下流に連結したプロモータを制御する。例えば、上記「遺伝子発現誘導系」としては、公知のＴｅｔ発現誘導系を挙げることができる。Ｔｅｔ発現誘導系としては、公知のＴｅｔ－Ｏｎ（登録商標）システム（クロンテック社製）、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ（登録商標）システム（クロンテック社製）を挙げることができる。発現ベクターに遺伝子発現誘導系を組み込むことによって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの発現を可逆的に制御することができる。
　発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法は特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
　ガスベシクルタンパク質複合体が宿主細胞内で発現していることは、透過型電子顕微鏡によって宿主細胞内部の様子を観察し、細胞内部にガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐形構造が認められるか否かを確認することによって確認することができる。
　ガスベシクルタンパク質複合体の大きさは、特に限定されるものではなく、発現させる細胞種、ガスベシクルタンパク質複合体の検出方法、その他細胞の用途等に応じて、好適な大きさにすればよい。細胞の用途としては、後述するように、細胞そのものを哺乳動物に移植する用途、および哺乳類細胞から精製したガスベシクルを生体に注入する用途等が想定される。ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびｇｖｐＣの種類およびその組み合わせによって、発現するガスベシクルタンパク質複合体の大きさが異なる。後述する実施例においては、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの種類およびその組み合わせによって、発現するガスベシクルタンパク質複合体の大きさが異なることを示した。実施例において示したように、発現するガスベシクルタンパク質複合体の大きさによって、造影効果が異なっている。この他、ガスベシクルタンパク質複合体の大きさの違いは、生体に対する毒性、および細胞内での発現量に影響すると考えられる。例えば、ガスベシクルタンパク質複合体の大きさが小さければ、毒性が低いと推定される。さらに、十分小さいガスベシクルタンパク質複合体であれば、腫瘍血管を透過することが可能であるため、腫瘍細胞体の造影に用いることが考えられる。
　ガスベシクルタンパク質複合体の大きさ、および造影効果等の性質は、発現させるガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびｇｖｐＣ、換言すれば、ガスベシクルタンパク質複合体に含まれるｇｖｐＡタンパク質、およびｇｖｐＣタンパク質の種類およびその組み合わせによって異なる。ガスベシクルタンパク質複合体に含まれるｇｖｐＡタンパク質、およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせは、特に限定されない。また、ガスベシクルタンパク質複合体に含まれるｇｖｐＣタンパク質は、１種類に限られず、複数種類であってもよい。好ましくは、ガスベシクルタンパク質複合体に含まれるｇｖｐＣタンパク質は、複数種類である。ガスベシクルタンパク質複合体に複数種類のｇｖｐＣタンパク質が含まれる実施形態において、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせは、例えば以下に示す組み合わせであり得る。
・ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する（ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡとｇｖｐＣ２０とにコードされるポリペプチドの組み合わせ）
・ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの組み合わせである（ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ｇｖｐＣ１６およびｇｖｐＣ２０にコードされるポリペプチドとの組み合わせ）
・ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する（ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡとｇｖｐＣ２８とにコードされるポリペプチドの組み合わせ）
・ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの組み合わせである（ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ｇｖｐＣ２０およびｇｖｐＣ２８にコードされるポリペプチドとの組み合わせ）
　好ましくは、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせは、（１）ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの組み合わせである、または（２）ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの組み合わせである。ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせが上記のどちらかであれば、後述する実施例において示されるように、ガスベシクルタンパク質複合体が、ＵＩにおいて高い造影効果を示す。
　さらに好ましくは、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせは、ｇｖｐＡタンパク質が配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有し、かつｇｖｐＣタンパク質が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの組み合わせである。ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質が上記の組み合わせであれば、後述する実施例において示されるように、ガスベシクルタンパク質複合体がＵＩにおいて特に高い造影効果を示す。
　また、上述したそれぞれの組み合わせを構成するポリペプチドは、上述したそれぞれの配列番号のアミノ酸配列と７５％以上（より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
　この他、ｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせは、これに限定されるものではないが、例えば、ガスベシクルを発現しているある微生物が有するｇｖｐＡタンパク質およびｇｖｐＣタンパク質の組み合わせを参考に決定することもできる。
　本発明の一実施形態に係る取得方法では、上述した導入工程の前後に、さらに別の工程を包含していてもよい。例えば、導入工程の後に、導入工程後の真核細胞を培養する培養工程を含んでいてもよい。また、上記導入工程において導入した発現ベクターが選択マーカー遺伝子や蛍光タンパク質遺伝子を含んでいる場合は、上記培養工程は、導入工程後の真核細胞（形質転換細胞）を選択する選択工程を含んでいてもよい。また、導入工程後の真核細胞におけるガスベシクルタンパク質複合体の形成を検出する確認工程を含んでいてもよい。
　（培養工程）
　培養工程は、導入工程後の真核細胞を培養する工程である。導入工程後の真核細胞の培養条件は、宿主細胞として選択した真核細胞の種類に応じて、適切な培養条件を適宜選択することができる。これにより、導入工程後の真核細胞を増殖させることができる。
　上記導入工程において導入した発現ベクターが選択マーカー遺伝子や蛍光タンパク質遺伝子を含んでいる場合は、上記培養工程は、導入工程後の真核細胞（形質転換細胞）を選択する選択工程を含んでいてもよい。選択工程は、上記導入工程において導入した発現ベクターが選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含んでいる場合は、導入工程後の真核細胞（形質転換細胞）を、抗生物質を含有している培地中で培養する工程であり得る。培地に添加する抗生物質の濃度は、添加する抗生物質の種類によって適宜設定することができる。
　また、選択工程は、上記導入工程において導入した発現ベクターが蛍光タンパク質遺伝子を含んでいる場合は、導入工程後の真核細胞（形質転換細胞）を、蛍光タンパク質の発現量に基づいて選択する工程であり得る。これらの選択工程は、単独で含んでいてもよく、複数の工程を組み合わせて含んでいてもよい。選択工程を複数組み合わせて含むことによって、ガスベシクルタンパク質ｇｖｐＡおよびガスベシクルタンパク質ｇｖｐＣをより高いレベルで発現する形質転換細胞を選択することが可能となる。
　（確認工程）
　確認工程は、導入工程後の真核細胞におけるガスベシクルタンパク質複合体の形成の有無を確認することにより、導入工程後の真核細胞がガスベシクルタンパク質複合体を発現可能であるか否かを確認する工程である。確認工程において、導入工程後の真核細胞においてガスベシクルタンパク質複合体が形成されていることを確認した場合は、導入工程後の真核細胞が、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞であると判断する。一方で、導入工程後の真核細胞においてガスベシクルタンパク質複合体が形成されていないことを確認した場合は、導入工程後の真核細胞が、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞ではないと判断する。導入工程後の真核細胞内にガスベシクルタンパク質複合体が形成されているか否かを確認する方法については、上述したとおりである。
　尚、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが、発現を可逆的または不可逆的に制御可能に導入されている場合は、確認工程の前に、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの発現を誘導する遺伝子発現誘導工程を実施すればよい。
　本発明者らは、シアノバクテリアであるPlanktothrix属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと組み合わせて真核細胞に導入することによって、原核生物由来の細胞小器官であるガスベシクルタンパク質複合体を、真核細胞（特に、哺乳類細胞）において発現させることに初めて成功した。本発明に係る取得方法によれば、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞を取得することができる。
　〔２．真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法〕
　本発明に係る真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法（以下、「生産方法」と称する。）は、上述した本発明の取得方法によって取得した真核細胞を培養する培養工程を包含している構成である。
　（培養工程）
　培養工程は、本発明の取得方法によって取得した真核細胞（すなわち、ガスベシクルタンパク質複合体を発現している形質転換真核細胞）を培養する工程である。上記形質転換真核細胞の培養条件は、形質転換の宿主細胞として選択した真核細胞の種類に応じて、適切な培養条件を適宜選択することができる。これにより、上記形質転換真核細胞を増殖させることができる。
　本発明の一実施形態に係る生産方法では、培養工程後に、ガスベシクルタンパク質複合体を真核細胞から取り出す、精製工程をさらに包含していてもよい。一実施形態において、精製工程は、真核細胞をプロテアーゼインヒビターを含む低張液（例えば、純水や低塩濃度（１．３Ｍ程度）の緩衝液）と接触させる第１接触工程と、真核細胞を界面活性剤と接触させる第２接触工程と、真核細胞を高張液と接触させる第３接触工程と、該真核細胞を遠心分離する遠心分離工程とを包含していてもよい。上記遠心分離工程では、遠心加速度の条件は、例えば、ガスベシクルを破壊させずに操作を行う観点から、７０×ｇ～２００×ｇの遠心加速度に設定すればよい。
　本発明者らは、シアノバクテリアであるPlanktothrix属細菌に由来するガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと組み合わせて真核細胞に導入することによって、原核生物由来の細胞小器官であるガスベシクルタンパク質複合体を、真核細胞（特に、哺乳類細胞）において発現させることに初めて成功した。本発明に係る生産方法によれば、真核細胞（例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等）を用いてガスベシクルタンパク質複合体を生産することができる。
　〔３．キット〕
　本発明に係るキットは、本発明のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法、および本発明の真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法に使用するためのキットであって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣと、を備えている構成である。
　上記「ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡ」および上記「シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ」については、上記「１．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法」の項で説明したとおりであるので、説明を省略する。
　本発明の一実施形態に係るキットは、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびシアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを、発現ベクターに挿入された形態で備えていてもよい。上記「発現ベクター」についても、上記「１．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法」の項で説明したとおりである。
　本発明の一実施形態に係るキットは、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびシアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを安定的に保持するための試薬、バッファー等を含んでもよいし、当該ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを発現ベクターに導入するための制限酵素、リガーゼ等の試薬を含んでいてもよい。また、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣを真核細胞に導入するためのリン酸カルシウム、リポソーム等の試薬を含んでいてもよい。
　本発明に係るキットは、本発明のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法に好適に使用することができる。
　〔４．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞〕
　本発明に係る真核細胞は、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞であって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとが発現可能に導入されている構成である。すなわち、本発明に係る真核細胞は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとが発現可能に導入されることによってガスベシクルタンパク質複合体を発現するようになった形質転換細胞をいう。ここで「形質転換細胞」は、生体外に取り出された真核細胞のみならず、真核生物の生体内に存在している細胞も含むことを意味する。
　ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、上記「１．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法」の項で説明したとおりである。
　本発明に係る真核細胞において、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびシアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣが発現可能に導入されていることは、真核細胞におけるガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびシアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣの発現の有無を確認すればよい。例えば、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡまたはシアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣをそれぞれ増幅可能なプライマーペアを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ－ＰＣＴ法）によって確認することができる。また、本発明に係る真核細胞が、ガスベシクルタンパク質複合体を発現していることは、真核細胞内にガスベシクルタンパク質複合体が形成されているか否かを確認することによって判断することができる。真核細胞内にガスベシクルタンパク質複合体が形成されているか否かを確認する方法については、上記「１．ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法」の項で説明したとおりである。
　本発明に係る真核細胞は、上述したガスベシクルタンパク質複合体の生産方法に用いることができる。
　これまでに、ガスベシクルタンパク質複合体の異種発現は大腸菌でしか報告されておらず、真核細胞でのガスベシクルタンパク質複合体の異種発現は、世界的にも誰も成功していない。本発明者等は、真核細胞でのガスベシクルタンパク質複合体の異種発現に初めて成功した。
　ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な哺乳類細胞（例えば、がん細胞、神経幹細胞等）をマウス等の哺乳動物に移植すると、生体内の移植細胞の位置を、ＭＲＩ（HyperCEST MRI等を含む）またはＵＩを用いて、非侵襲的に、長期間にわたって、同一個体において観察することが可能となることが期待される。さらに、哺乳類細胞から精製したガスベシクルを生体に注入して、ＭＲＩまたはＵＩの造影剤として用いることも想定される。観察にＭＲＩまたはＵＩを用いるため、生体内の深部の細胞を観察できるという優れた効果を奏する。移植細胞におけるガスベシクルタンパク質複合体の発現を、例えば、ドキシサイクリンをマウスに摂取させることで、可逆的に発現を制御することも可能である。また、光学顕微鏡におけるＧＦＰのように、個体中の細胞の特定の遺伝子の発現を、ガスベシクルタンパク質の発現を指標として、ＭＲＩまたはＵＩを用いて１細胞レベルの空間分解能で観察することも想定される。
　従来、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な大腸菌等の原核細胞、および該原核細胞から精製したガスベシクルタンパク質複合体を、造影剤として生体内に投与する場合、大腸菌等の原核生物に由来する有害物質が生体内に混入する虞があった。これに対し、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な哺乳類細胞、または該細胞から精製したガスベシクルを、造影剤として生体内に投与する場合、原核生物に由来する有害物質が生体内に混入する虞を排除することが可能である。
　また、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法を用いて、受精卵にガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびｇｖｐＣを導入する等の方法により、ガスベシクルを発現するトランスジェニック動物を作製することも可能である。作製したトランスジェニック動物を、音遺伝学的研究を含む様々な基礎研究等に活用することが期待される。例えば、細胞種特異的な発現をもたらすプロモータの下流にガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよびｇｖｐＣを導入することにより、特定の細胞種においてガスベシクルを発現しているトランスジェニック動物を作製できる。このようにして作製したトランスジェニック動物を用いて、ＭＲＩまたはＵＩを用いて、特定の細胞種を非侵襲的に観察することが考えられる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　〔実施例１〕
　（１）発現ベクターの構築
　インターネット上のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）で公開されている、種々のＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ属菌株のガスベシクル遺伝子のＤＮＡ配列を検索し、以下のＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ属菌株に由来するガスベシクル遺伝子を実験に用いた：
　　ｇｖｐＡ：Planktothrix rubescens株　BC-pla9303（Genbank ID：AJ132357.1，配列番号６）
　　ｇｖｐＣ２０：Planktothrix rubescens株　BC-pla9401（Genbank ID：AJ132361.1，配列番号７）。
　これらのガスベシクル遺伝子の塩基配列を基に、哺乳類細胞における発現用にコドンを最適化したＤＮＡを人工合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社において合成）。人工合成したｇｖｐＡ遺伝子の塩基配列を配列番号４に、人工合成したｇｖｐＣ２０遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。
　合成した各ＤＮＡを、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（理研生命システム研究センター　高井研博士より提供）に、それぞれクローニングした。さらに、Ｔ２Ａ配列を介して、蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ２（Evrogen社製）またはｍＫＯ２（Amalgaam社製））の遺伝子もクローニングし、ガスベシクル遺伝子の発現量を蛍光で確認できるようにした。これにより、人工合成したｇｖｐＡ遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（「ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクター」と称する。）および人工合成したｇｖｐＣ２０遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（「ｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクター」と称する。）を取得した。
　図１は、人工合成したｇｖｐＡ遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクター；配列番号９）の構成を示す図である。尚、ｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクター（配列番号１０）は、図１に示したｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターの、人工合成したｇｖｐＡ遺伝子が挿入された部分を人工合成したｇｖｐＣ２０遺伝子に、ｍＫａｔｅ２が挿入された部分をｍＫＯ２に置き換えた構成である。これらのＴｏｌ２トランスポゾンベクターにはＴｅｔ－Ｏｎ（登録商標）システムが組み込まれているので、導入した遺伝子を、ドキシサイクリンによって発現誘導することができる。また、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターにはピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｓｉｎ）耐性遺伝子が組み込まれているので、ピューロマイシンによる薬剤選択を行うことによりＴｏｌ２トランスポゾンベクターが導入された細胞を選択的に取得することができる。Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターの構成については、参考文献（Takai A, et al. (2015) Expanded palette of Nano-lanterns for real-time multicolor luminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Apr 7;112(14):4352-6. doi: 10.1073/pnas.1418468112. Epub 2015 Mar 23.）に説明されている。
　（２）形質転換細胞の取得
　人工合成したガスベシクル遺伝子をそれぞれ組み込んだ各Ｔｏｌ２ベクター（ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターおよびｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクター）を、ヒト乳がん由来細胞株であるＫＰＬ－４細胞（NCBI BioSample ： SAMN03471036 ； ＧＮＥ ： GNE Tracking ID:586687）に、公知のリポフェクション法（Hugene HD, Roche製、型番04709705001）によってコトランスフェクションしてゲノムに組み込んだ。
　ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に１０μｇ／μｌのピューロマイシン（Invitrogen製、型番：A1113803）を添加した選択培地を用いて形質転換細胞を培養して薬剤選択を行った後に、ＦＡＣＳ解析によってガスベシクル遺伝子を高発現している細胞の選別を行った。薬剤選択の際には、１μｇ／μｌのドキシサイクリンを添加して、ガスベシクル遺伝子の発現を誘導させた。コントロール細胞として、Ｔｏｌ２ベクターを導入していないＫＰＬ－４細胞を使用した。
　図２は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。図２の（ａ）および（ｂ）はそれぞれ、コンロトール細胞における蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示し、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ、形質転換細胞における蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示している。形質転換細胞では、蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２が発現していたことから、この細胞は、ｇｖｐＡ遺伝子およびｇｖｐＣ２０遺伝子の両方を発現していることが確認できた。
　ｇｖｐＡ遺伝子およびｇｖｐＣ２０遺伝子の両方を高発現する細胞から、１コロニーの細胞株（「ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株」と称する。）を得た。
　（３）ガスベシクルタンパク質の発現の誘導
　１μｇ／μｌのドキシサイクリンをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に添加して、ガスベシクル遺伝子の発現を誘導して、取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株におけるガスベシクルタンパク質複合体の発現の有無を検証した。
　まず、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株を、共焦点顕微鏡（Olympus社製、型番FV3000）を用いて観察した。コントロール細胞として、Ｔｏｌ２ベクターで蛍光蛋白質のみを導入したＫＰＬ－４細胞を使用した。
　図３は、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株を共焦点顕微鏡下で観察した結果を示す図である。図３の（ａ）～（ｂ）は、それぞれ、コンロトール細胞における蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２の蛍光およびｍＫＯ２の蛍光を示し、（ｃ）は、コントロール細胞の明視野像を示している。また、図３の（ｄ）～（ｅ）は、それぞれ、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株における蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２の蛍光およびｍＫＯ２の蛍光を示し、（ｆ）は、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株の明視野像を示している。また、図３の（ｇ）および（ｈ）は、それぞれ、図３の（ｄ）および（ｅ）の四角で囲った領域を拡大して表示した図を示しており、（ｉ）は図３の（ｇ）および（ｈ）の図を重ね合わせた図面であり、（ｊ）は、図３の（ｇ）および（ｈ）の領域の明視野像（図３の（ｆ）の四角で囲った領域を拡大して表示した図）を示している。
　図３の（ｄ）および（ｅ）に示すように、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株において、発現したＧｖｐＡタンパク質とＧｖｐＣ２０タンパク質とが細胞内で凝集していることが観察された。さらに、図３の（ｇ）～（ｉ）に示すように、ＧｖｐＡタンパク質およびＧｖｐＣ２０タンパク質の局在は一致していた。これはガスベシクルタンパク質複合体形成の有力な証拠である。
　次いで、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株について、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現を確認した。図４は、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果を示す図である。図４に示すように、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株においてｇｖｐＡおよびｇｖｐＣ２０のｍＲＮＡが転写されていることを確認した。
　次に、Ｔ２Ａ配列の切断効率が１００％ではないことを利用し、ＧｖｐＡおよびＧｖｐＣ２０にそれぞれ連結した蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２）の抗体（MBL製、型番PM005およびMBL製、型番PM051M）を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。図５は、ウェスタンブロッティングの結果を示す図である。図５の（ａ）は一次抗体として抗ｍＫａｔｅ２抗体を用いてＧｖｐＡタンパク質の検出を行った結果を示し、（ｂ）は一次抗体として抗ｍＫＯ２抗体を用いてＧｖｐＣ２０タンパク質の検出を行った結果を示す。図５の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＧｖｐＡタンパク質およびＧｖｐＣ２０タンパク質にそれぞれ連結した蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２）の発現を指標として、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株におけるＧｖｐＡタンパク質およびＧｖｐＣ２０タンパク質の発現を間接的に検出することができた。
　さらに、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用のサンプルを作製し、観察を行った。コントロール細胞として、Ｔｏｌ２ベクターを導入していないＫＰＬ－４細胞を使用した。透過型電子顕微鏡による観察は、倍率５０００倍、サンプル厚８０ｎｍ、室温（２５℃）で行った。図６は、透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。図６の（ａ）はＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株の結果を示し、（ｂ）はコントロール細胞の結果を示し、（ｃ）は（ａ）の四角で囲った領域を拡大して表示した図を示している。ＴＥＭ像では、タンパク質を黒色で示している。図６の（ａ）および（ｃ）に示すように、サンプル厚８０ｎｍの汎用ＴＥＭでの観察から、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株において、ガスベシクルタンパク質に特有の双円錐形構造の存在を示すデータを得た。
　（４）ガスベシクルタンパク質複合体の精製
　ガスベシクルタンパク質複合体の精製方法を検討した。図７は、ガスベシクルタンパク質複合体の精製手順を示す図である。まず、細胞株（ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０）を、所定量のプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche製、型番05892791001）を溶かした純水で懸濁して、４℃で１時間穏やかに転倒混和した。
　次に、０．４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００を加えて、さらに、４℃で１時間穏やかに転倒混和した。この後、細胞懸濁液と等量の１．３Ｍスクロース溶液を加え、さらに４℃で２時間転倒混和した。こうして、浸透圧ショックと界面活性剤とを用いた穏やかな条件で細胞を破砕した。
　得られた細胞破砕液を、１００×ｇで４時間遠心した。遠心後のサンプル管中の溶液表面に、蛍光の凝集が観察された。これは、蛍光タンパク質の結合したガスベシクルタンパク質複合体が、その水よりも軽い比重のために溶液表面に集積していることを示唆し、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株内で形成されたガスベシクルタンパク質複合体が閉じた構造を有し、水分子を排除して、気体を選択的に透過する性質を保持することを示唆している。
　ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体をアガロースゲルに包埋したサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。
　精製ガスベシクルタンパク質複合体溶液（ＯＤ２８０ｎｍ＝３．４）を、寒天溶液（最終濃度４％）と混合し、氷上で固めた試料から、１ｍｍ角の正方体を切り出した。この試料を２．５％グルタルアルデヒドで前固定、１％四酸化オスミウム溶液で後固定した後、エタノールシリーズ（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１００％）で脱水した。脱水後、ＱＹ－１（中間溶媒）とＱｕｅｔｏｌ８１２（樹脂）の等量混合液中に６時間浸漬し、さらにＱＹ－１：Ｑｕｅｔｏｌ８１２＝１：２に２時間浸漬、その後、１００％Ｑｕｅｔｏｌに６時間浸漬させた試料を、オーブンで硬化した（４５℃、２４時間、６０℃３日間）。得られたブロックをトリミングし、ミクロトームで８０ｎｍの厚さに切り出した切片に対し、酢酸ウラン水溶液とクエン酸鉛、硝酸鉛、酢酸鉛、クエン酸ナトリウムの混合液により２重染色を行った。これを用いて日立Ｈ－７５００（倍率×５０００）とＨ－９５００（倍率×２００００）とによる透過型電子顕微鏡観察を行った。
　図８は、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。透過型電子顕微鏡による観察は、倍率５０００倍または２００００倍、サンプル厚８０ｎｍ、２５℃で行った。図８の（ａ）は、倍率５０００倍で観察した結果を示す図であり、（ｂ）は倍率２００００倍で観察した結果を示す図である。図８に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中でガスベシクルタンパク質複合体は凝集して存在していた。
　以上の結果から、ガスベシクルタンパク質複合体を安定に発現している細胞株を取得することができたと結論付けた。
　また、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の大きさと、大きさの分布を、動的光散乱測定（以下、ＤＬＳ測定とも称する）によって測定した。具体的には、Malvern社のゼータサイザー（Nano-ZS）の粒子径測定モードにおいて、動的光散乱法（DLS）により、25℃の精製ガスベシクル溶液中のタンパク質の粒子径と、粒子径の分布を算出した。結果を、図１０（ａ）に示す。図１０（ａ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体の大きさのピークは一つであった。この結果から、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株において、大きさが揃ったガスベシクルタンパク質複合体が発現されていることがわかった。
　〔実施例２〕
　実施例２では、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとして、ｇｖｐＣ１６およびｇｖｐＣ２０を組み合わせて使用した。
　（１）発現ベクターの構築
　インターネット上のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）で公開されているガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ１６：Planktothrix rubescens株　BC-pla9401（GenBank Accession Number：AJ132354.1，配列番号１３）の塩基配列を基に、哺乳類細胞における発現用にコドンを最適化したＤＮＡを人工合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社において合成）。人工合成したｇｖｐＣ１６遺伝子の塩基配列を配列番号１１に示す。
　人工合成したｇｖｐＣ１６遺伝子を、実施例１と同様にして、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターにクローニングした。さらに、Ｔ２Ａ配列を介して、蛍光タンパク質（ＧＦＰ（Clontech社製））の遺伝子もクローニングし、ガスベシクル遺伝子の発現量を蛍光で確認できるようにした。これにより、人工合成したｇｖｐＣ１６遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（「ｇｖｐＣ１６－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクター」と称する。）を取得した。尚、ｇｖｐＣ１６－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターは、図１に示したｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターの、人工合成したｇｖｐＡ遺伝子が挿入された部分を人工合成したｇｖｐＣ１６遺伝子に、ｍＫａｔｅ２が挿入された部分をＧＦＰに置き換えた構成である。
　（２）形質転換細胞の取得
　ｇｖｐＣ１６－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターを、実施例１で使用した、ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターおよびｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクターと共に、実施例１と同様の方法でＫＰＬ－４細胞にコトランスフェクションしてゲノムに組み込み、その後、選択培地を用いて形質転換細胞を培養して薬剤選択を行った後に、ＦＡＣＳ解析によってガスベシクル遺伝子を高発現している細胞の選別を行った。コントロール細胞として、Ｔｏｌ２ベクターを導入していないＫＰＬ－４細胞を使用した。
　図９は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。図９の（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、コンロトール細胞における蛍光タンパク質ＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示し、（ｄ）～（ｆ）は、それぞれ、形質転換細胞における蛍光タンパク質ＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示している。形質転換細胞では、蛍光タンパク質ＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２が全て発現していたことから、この細胞は、ｇｖｐＡ遺伝子、ｇｖｐＣ１６遺伝子およびｇｖｐＣ２０遺伝子を全て発現していることが確認できた。
　ｇｖｐＡ遺伝子、ｇｖｐＣ１６遺伝子、およびｇｖｐＣ２０遺伝子の全てを高発現する細胞から、１コロニーの細胞株（「ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株」と称する。）を得た。
　（３）ガスベシクルタンパク質の発現の誘導
　１μｇ／μｌのドキシサイクリンをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に添加して、取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株において、ガスベシクル遺伝子の発現を誘導した。
　（４）ガスベシクルタンパク質複合体の精製
　細胞株としてＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株を用いたこと以外は、実施例１において検討した精製方法と同様に、ガスベシクルタンパク質複合体を精製した。
　ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の大きさを、実施例１と同様に、ＤＬＳ測定によって測定した。結果を、図１０（ｃ）に示す。図１０（ｃ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体の大きさのピークは一つであった。この結果から、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株において、大きさが揃ったガスベシクルタンパク質複合体が発現されていることがわかった。
　さらに、実施例１と同様に、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体をアガロースゲルに包埋したサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。図１１（ｂ）は、その観察結果を示す図である。図１１（ｂ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中において、ガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐構造が確認できた。
　以上の結果から、ガスベシクルタンパク質複合体を安定に発現している細胞株を取得することができたと結論付けた。
　〔実施例３〕
　実施例３では、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとして、ｇｖｐＣ２８を使用した。
　（１）発現ベクターの構築
　インターネット上のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）で公開されているガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣ２８：Planktothrix agardhii株　NIVA-CYA29（GenBank Accession Number：AJ253131.1，配列番号１４）の塩基配列を基に、哺乳類細胞における発現用にコドンを最適化したＤＮＡを人工合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社において合成）。人工合成したｇｖｐＣ２８遺伝子の塩基配列を配列番号１２に示す。
　人工合成したｇｖｐＣ２８遺伝子を、実施例１と同様にして、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターにクローニングした。さらに、Ｔ２Ａ配列を介して、蛍光タンパク質（ＧＦＰ（Clontech社製））の遺伝子もクローニングし、ガスベシクル遺伝子の発現量を蛍光で確認できるようにした。これにより、人工合成したｇｖｐＣ２８遺伝子をクローニングしたＴｏｌ２トランスポゾンベクター（「ｇｖｐＣ２８－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクター」と称する。）を取得した。尚、ｇｖｐＣ２８－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターは、図１に示したｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターの、人工合成したｇｖｐＡ遺伝子が挿入された部分を人工合成したｇｖｐＣ２８遺伝子に、ｍＫａｔｅ２が挿入された部分をｍＫＯ２に置き換えた構成である。
　（２）形質転換細胞の取得
　ｇｖｐＣ２８－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターを、実施例１で使用した、ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクターと共に、実施例１と同様の方法でＫＰＬ－４細胞にコトランスフェクションしてゲノムに組み込み、その後、選択培地を用いて形質転換細胞を培養して薬剤選択を行った後に、ＦＡＣＳ解析によってガスベシクル遺伝子を高発現している細胞の選別を行った。コントロール細胞として、Ｔｏｌ２ベクターを導入していないＫＰＬ－４細胞を使用した。
　図９は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。図９の（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、コンロトール細胞における蛍光タンパク質ＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２およびｍＫＯ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示し、（ｇ）および（ｈ）は、それぞれ、形質転換細胞における蛍光タンパク質ＧＦＰおよびｍＫａｔｅ２の発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示している。形質転換細胞では、蛍光タンパク質ＧＦＰおよびｍＫａｔｅ２の両方が発現していたことから、この細胞は、ｇｖｐＡ遺伝子およびｇｖｐＣ２８遺伝子の両方を発現していることが確認できた。
　ｇｖｐＡ遺伝子、およびｇｖｐＣ２８遺伝子の両方を高発現する細胞から、１コロニーの細胞株（「ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株」と称する。）を得た。
　（３）ガスベシクルタンパク質の発現の誘導
　１μｇ／μｌのドキシサイクリンをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に添加して、ガスベシクル遺伝子の発現を誘導して、取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株におけるガスベシクルタンパク質複合体の発現の有無を検証した。
　まず、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株を、共焦点顕微鏡（Olympus社製、型番FV3000）を用いて観察した。図１２は、その結果を示す図である。なお、図１２の（ａ）～（ｄ）は、すべて同一の領域を映した図である。
　図１２の（ａ）～（ｂ）は、それぞれ、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞における蛍光タンパク質ＧＦＰの蛍光およびｍＫａｔｅ２の蛍光を示している。図１２（ｃ）は、図１２の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の領域の明視野像を示している。また、図１２（ｄ）は図１２の（ａ）および（ｂ）の図を重ね合わせた図面である。
　図３の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株において、発現したＧｖｐＡタンパク質とＧｖｐＣ２８タンパク質とが細胞内で凝集していることが観察された。さらに、図３の（ａ），（ｂ），および（ｄ）に示すように、ＧｖｐＡタンパク質およびＧｖｐＣ２８タンパク質の局在は一致していた。これはガスベシクルタンパク質複合体形成の有力な証拠である。
　（４）ガスベシクルタンパク質複合体の精製
　細胞株として、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株を用いたこと以外は、実施例１において検討した精製方法と同様に、ガスベシクルタンパク質複合体を精製した。
　ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の大きさを、実施例１と同様に、ＤＬＳ測定によって測定した。結果を、図１０（ｂ）に示す。
　さらに、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体を以下の通り処理してサンプルを作製し、サンプルを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察した。
　まず精製ガスベシクル溶液を２％グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)溶液と1:1で混合した。この混合液3μlを、イオンスパッタ装置で親水化処理した膜張グリッド上に乗せ、60秒間静置して膜張グリッドに吸着させた。膜張グリッドが含んでいる溶液を濾紙で吸い取り、膜張グリッドを純水の水滴に接触させた。再度、濾紙で膜張グリッドが含んでいる溶液を濾紙で吸い取った。続いて、膜張グリッドを2％酢酸ウラン溶液の水滴に接触させて、溶液を吸い取る操作を３回繰り返すことにより、膜張グリッドの染色を行った。染色後、2％酢酸ウラン溶液を吸い取り、乾燥させてＴＥＭ観察に用いるサンプルとした。
図１１（ａ）は、その観察結果を示す図である。図１１（ａ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中でガスベシクルタンパク質複合体は凝集して存在していた。
　以上の結果から、ガスベシクルタンパク質複合体を安定に発現している細胞株を取得することができたと結論付けた。
　〔実施例４〕
　実施例４では、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとして、ｇｖｐＣ２０およびｇｖｐＣ２８を組み合わせて使用した。
　（１）用いた発現ベクター
　実施例１および実施例２において構築した、ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクター、ｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクター、およびｇｖｐＣ２８－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターを、発現ベクターとして用いた。
　（２）形質転換細胞の取得
　ｇｖｐＣ２８－Ｔ２Ａ－ＧＦＰベクターを、ｇｖｐＡ－Ｔ２Ａ－ｍＫａｔｅ２ベクター、およびｇｖｐＣ２０－Ｔ２Ａ－ｍＫＯ２ベクターと共に、実施例１と同様の方法でＫＰＬ－４細胞にコトランスフェクションしてゲノムに組み込み、その後、選択培地を用いて形質転換細胞を培養して薬剤選択を行い、ガスベシクル遺伝子を発現している細胞を得た。
　ｇｖｐＡ遺伝子、ｇｖｐＣ２０遺伝子、およびのｇｖｐＣ２８遺伝子の全てを発現する細胞から、１コロニーの細胞株（「ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株」と称する。）を得た。
　（３）ガスベシクルタンパク質の発現の誘導
　１μｇ／μｌのドキシサイクリンをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に添加して、取得したＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株において、ガスベシクル遺伝子の発現を誘導した。
　（４）ガスベシクルタンパク質複合体の精製
　細胞株として、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株を用いたこと以外は、実施例１において検討した精製方法と同様に、ガスベシクルタンパク質複合体を精製した。
　ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体の大きさを、実施例１と同様に、ＤＬＳ測定によって測定した。結果を、図１０（ｄ）に示す。図１０（ｄ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体の大きさのピークは一つであった。この結果から、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株において、大きさが揃ったガスベシクルタンパク質複合体が発現されていることがわかった。
　さらに、実施例１と同様に、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中のガスベシクルタンパク質複合体をアガロースゲルに包埋したサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。図１１（ｃ）は、その観察結果を示す図である。図１１（ｃ）に示すように、ガスベシクルタンパク質複合体粗精製溶液中でガスベシクルタンパク質複合体に特有の双円錐構造が確認できた。
　以上の結果から、ガスベシクルタンパク質複合体を安定に発現している細胞株を取得することができたと結論付けた。
　〔実施例５〕
　実施例１～４で取得したガスベシクルタンパク質複合体を発現している細胞株（ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株、およびＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株）をサンプル細胞として用いて、以下の超音波エコー信号測定を行った。
　（１）ガスベシクルタンパク質複合体の超音波エコー信号測定
　（１－１）超音波エコー信号計測系の構成
　サンプル細胞に超音波を照射した時の散乱強度を測定するために、超音波エコー信号計測系を構成した。
　パルサーレシーバー（オリンパス社製, 品番MODEL 5077PR）と、オシロスコープ（Agilent製, DSO5014A LX1）、5MHzおよび10MHzのトランスデューサー（オリンパス社製, V309-SU-F1 (5MHz), M312-SU-F1(10MHz)）をBNC同軸ケーブルで接続した。この構成により、
1) パルサーレシーバーで照射する超音波のパラメーターを設定し、
2) トランスデューサーから5MHzおよび10MHzのトランスミット周波数を持つ超音波をサンプル細胞に照射し、かつ
3) サンプル細胞から散乱された超音波をトランスデューサーで受信し、オシロスコープで時間波形を観測した。
　オシロスコープと共にメーカーから提供されている、オシロスコープデータをPCに転送するためのソフトウェアIntuilink data capture （KEYSIGHT technologies製）、およびExcel (Microsoft)を、ノートPC（Fujitsu製, FMVS765ATK）にインストールした。該ノートPCをオシロスコープに接続することで、測定データをオシロスコープからPCへと転送し、エクセル上で測定データを解析した。
　（１－２）測定サンプルの作成
　市販の透明なプラスチックケースに１％アガロースゲルを流し込み、９６ウェルプレートで型取りして、細胞用のサンプルウェルを作成した。サンプルウェルの形態の概要を、図１３（ａ）に示した。
　このサンプルウェルに、ＰＢＳで２回ウォッシュし、ＰＢＳに懸濁したサンプル細胞、およびコントロールのＫＰＬ－４細胞を、５．０ｘ１０６個程度充填し、測定サンプルとした。
　（１－３）細胞からのエコー信号の計測
　除振台上に固定され、PCで制御された水平方向二次元電動オートステージ上で、上記の測定サンプルを水平に固定した。図１３（ａ）に示すように超音波ビームの焦点が測定サンプルの細胞中に来るように高さを調整し、トランスデューサーを測定サンプル上で固定した。オートステージを２５０μｍ間隔でＸ－Ｙ方向に移動し、図１３（ａ）で示すように、測定サンプル中の１ｍｍ四方にわたって、２５個のスキャンポイントから、データ取得を行った。水中での音速から、観測された信号のトランスデューサーからの距離を計算し、観測された信号から計算される細胞、およびプラスチックケースの底の位置が、測定サンプルの構成と一致していることを確認した。図１３（ｂ）に、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株をサンプル細胞として用い、5MHzのトランスミット周波数を用いた場合に観測された信号を示した。
　パルサーレシーバーの設定は以下の通りとした。
Acoustic power: 40dB
Pulse Repetition Frequency (PRF) : 200Hz
Pulse Voltage: 300V
Transducer Frequency: 5MHz / 10MHz
　測定した２５点について、細胞からのエコー信号の時間波形を調べ、該時間波形の振幅の最大値と最小値との差の平均値とを算出した。
　（１－４）計測結果
　図１４に、２５点で計測した細胞からのエコー信号の時間波形のうち、典型的なものを示した。また、図１５に、時間波形の振幅の最大値と最小値との差の平均値を示した。尚、図１５において、エラーバーは標準誤差を意味する。なお、図１４および図１５において、ＧＶ＿Ａ＿Ｃ２０、ＧＶ＿Ａ＿Ｃ２８、ＧＶ＿Ａ＿Ｃ１６＿Ｃ２０、ＧＶ＿Ａ＿Ｃ２０＿Ｃ２８は、それぞれ、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０細胞株、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２８細胞株、ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ１６＿ｇｖｐＣ２０細胞株、＿ＫＰＬ４＿ｇｖｐＡ＿ｇｖｐＣ２０＿ｇｖｐＣ２８細胞株をサンプル細胞として用いた計測結果を示す。また、図１４および図１５の（ａ）、（ｂ）はそれぞれ、5MHzおよび10MHzのトランスミット周波数を用いた結果を示す。また、図１５において、記号は以下の意味で用いた。
　**, P<0.01; ***, p< 0.001 (welch’s t-test); エラーバーは標準誤差。
　５ＭＨｚのトランスミット周波数においては、すべてのサンプル細胞について、コントロール（通常のＫＰＬ－４細胞）と比較して統計的に有意な散乱強度の増加が観察された（図１５（ａ））。特にＧＶ＿Ａ＿Ｃ２８，ＧＶ＿Ａ＿Ｃ１６＿Ｃ２０，ＧＶ＿Ａ＿Ｃ２０＿Ｃ２８の３つで、コントロールと比較して電圧値で２倍以上の散乱強度を示した。一方、１０ＭＨｚにおいては、ＧＶ＿Ａ＿Ｃ１６＿Ｃ２０およびＧＶ＿Ａ＿Ｃ２０＿Ｃ２８が、コントロールに対して有意な散乱強度の増加を示した。特にＧＶ＿Ａ＿Ｃ１６＿Ｃ２０は２倍以上の散乱強度を示した（図１５（ｂ））。
　以上の結果から、細胞内におけるガスベシクルの発現によって、有意に超音波散乱強度が増加することが示された。これは、この哺乳類細胞で発現したガスベシクルタンパク質複合体が、水を排除し、ガスを選択的に透過する、ガスベシクルとしての性質を保持している有力な証拠である。特にＧＶ＿Ａ＿Ｃ１６＿Ｃ２０が、超音波エコーイメージングにおいて、細胞内で発現して機能する造影剤として、いずれの周波数においても、高い造影効果を持つ事が示唆された。
　〔まとめ〕
　本発明を以下のように表現することもできる。
　本発明の態様１に係る、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する導入工程を包含し、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、シアノバクテリアに由来する方法である。
　本発明の態様２に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、上記の態様１において、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、以下の（ａ）～（ｃ）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含んでいる方法としてもよい：（ａ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　本発明の態様３に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、上記の態様１または２において、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよび上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、コドンが哺乳類細胞における発現に最適化されている方法としてもよい。
　本発明の態様４に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、上記の態様１から３のいずれかにおいて、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる群より選択される１種類以上である方法としてもよい。
　本発明の態様５に係るガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法は、上記の態様１から４のいずれかにおいて、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとは、トランスポゾンベクターに挿入されている方法としてもよい。
　本発明の態様６に係る、真核細胞は、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとが発現可能に導入されている構成である。
　本発明の態様７に係る真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法は、本発明の態様１から５のいずれかのガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法によって取得した真核細胞または本発明の態様６の真核細胞を培養する培養工程を包含している方法である。
　本発明の態様８に係るキットは、本発明の態様１から５のいずれかのガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法に使用するためのキットであって、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣと、を備えている構成である。
　本発明は、バイオライフサイエンス、および医学等の種々の分野において利用することができる。

Claims (8)

  1. 　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとを発現可能に真核細胞に導入する導入工程を包含し、
    　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、シアノバクテリアに由来することを特徴とする、ガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法。
  2. 　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、以下の（ａ）～（ｃ）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする、請求項１に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法：
    　（ａ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号１～３のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つガスベシクルタンパク質複合体のリブ構造を安定化させる機能を有している親水性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  3. 　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡおよび上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、コドンが哺乳類細胞における発現に最適化されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法。
  4. 　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、
    　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる群より選択される１種類以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法。
  5. 　上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、上記ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとは、トランスポゾンベクターに挿入されていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法。
  6. 　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣとが発現可能に導入されていることを特徴とする、真核細胞。
  7. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法によって取得した真核細胞または請求項６に記載の真核細胞を培養する培養工程を包含していることを特徴とする、真核細胞を用いたガスベシクルタンパク質複合体の生産方法。
  8. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のガスベシクルタンパク質複合体を発現可能な真核細胞の取得方法に使用するためのキットであって、
    　ガスベシクル遺伝子ｇｖｐＡと、
    　シアノバクテリア由来のガスベシクル遺伝子ｇｖｐＣと、を備えていることを特徴とする、キット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200237346A1 (en) 2019-01-07 2020-07-30 California Institute Of Technology Burst ultrasound reconstruction with signal templates and related methods and systems
EP3908656A4 (en) * 2019-01-07 2022-10-05 California Institute of Technology GAS VESICLE EXPRESSION SYSTEMS, GAS VESICLE CONSTRUCTS AND ASSOCIATED GENETIC CIRCUITS, VECTORS, MAMMALIAN CELLS, HOSTS, COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
US11504438B2 (en) 2016-06-02 2022-11-22 California Institute Of Technology Gas-filled structures and related compositions, methods and systems to image a target site

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990010071A1 (fr) * 1989-02-27 1990-09-07 Institut Pasteur Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990010071A1 (fr) * 1989-02-27 1990-09-07 Institut Pasteur Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"OptimumGENETM Codon Saitekika", GENSCRIPT, 1 August 2016 (2016-08-01), Retrieved from the Internet <URL:http://www.genscript.jp/codon-opt.htm> [retrieved on 20171110] *
"Transposon ni yori Genome eno Kumikomi", JOKYO GA KANO NA HATSUGEN SYSTEM, 10 August 2016 (2016-08-10), Retrieved from the Internet <URL:http://www.funakoshi.co.jp/contents/5301> [retrieved on 20171110] *
BEARD, S. J. ET AL.: "Gas vesicle genes in Planktothrix rubescens from Nordic lakes: strains with weak gas vesicles possess a longer variant of gvpC", MICROBIOLOGY, vol. 146, no. 18, 2000, pages 2009 - 2018 *
BEARD, S. J. ET AL.: "The diversity of gas vesicle genes in Planktothrix rubescens from Lake Zurich", MICROBIOLOGY, vol. 145, no. 10, 1999, pages 2757 - 2768, XP055470800 *
TIANHE, W. ET AL.: "Floating Escherichia coli by Expressing Cyanobacterial Gas Vesicle Genes", J. OCEAN UNIV. CHINA, vol. 14, no. l, 2015, pages 84 - 88, XP035427750 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11504438B2 (en) 2016-06-02 2022-11-22 California Institute Of Technology Gas-filled structures and related compositions, methods and systems to image a target site
US20200237346A1 (en) 2019-01-07 2020-07-30 California Institute Of Technology Burst ultrasound reconstruction with signal templates and related methods and systems
EP3908656A4 (en) * 2019-01-07 2022-10-05 California Institute of Technology GAS VESICLE EXPRESSION SYSTEMS, GAS VESICLE CONSTRUCTS AND ASSOCIATED GENETIC CIRCUITS, VECTORS, MAMMALIAN CELLS, HOSTS, COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
US11761008B2 (en) 2019-01-07 2023-09-19 California Institute Of Technology Gas vesicle expression systems, gas vesicle constructs and related genetic circuits, vectors, mammalian cells, hosts, compositions, methods and systems
US11786218B2 (en) 2019-01-07 2023-10-17 California Institute Of Technology Burst ultrasound reconstruction with signal templates and related methods and systems

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