JP6304683B2 - 標的タンパク質の細胞内導入剤及び標的タンパク質の細胞内導入方法 - Google Patents
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[i]以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
(a)下記式(1):
Xn−Y−Z …(1)
(式中、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数である。)のアミノ酸配列、
(b)前記(a)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式(2):
[(X’n−Y’−Z’)3]2 …(2)
(式中、X’、Y’、Z’は、それぞれ、前記式(1)のX、Y、Zで示されるアミノ酸配列において、0個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。)で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
(c)下記式(3):
[(Xn−Y−Z)3]2 …(3)
(式中、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数である。)で示されるポリペプチド複合体、
(d)前記(c)のポリペプチド複合体において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、かつ細胞内移行活性を有するポリペプチド複合体。
(e)下記式(1):
Xn−Y−Z …(1)
(式中、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数である。)のアミノ酸配列、
(f)前記(e)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式(2):
[(X’n−Y’−Z’)3]2 …(2)
(式中、X’、Y’、Z’は、それぞれ、前記式(1)のX、Y、Zで示されるアミノ酸配列において、0個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。)で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
(g)下記式(4):
WA−Xn−Y−Z−VB …(4)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数であり、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)のアミノ酸配列、
(h)前記(g)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式(5):
[(WA−X’n−Y’−Z’−VB)3]2 …(5)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、X’、Y’、Z’は、それぞれ、前記式(4)のX、Y、Zで示されるアミノ酸配列において、0個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
(i)下記式(6):
[(WA−Xn−Y−Z−VB)3]2 …(6)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数であり、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)で示される融合タンパク質複合体、
(j)前記式(6)のXn−Y−Zで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。
バクテリオファージは、細菌や動物細胞に、核酸とともに必要なタンパク質を注入する。本発明の標的タンパク質の細胞内導入剤は、バクテリオファージが核酸やタンパク質を細胞に導入する機構を応用したものである。
Xn−Y−Z …(1)
式(1)中、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2〜5のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6〜9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数である。
式(1)のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その構造特性に基づいて、自発的に3量体化する。さらにこの3量体2分子がN末端側で会合して6量体を形成する。ここで、式(1)のアミノ酸配列からなるポリペプチドが形成した3量体を、式(7):
(Xn−Y−Z)3 …(7)
のように示し、この3量体2分子がN末端側で会合して形成した6量体を式(3):
[(Xn−Y−Z)3]2 …(3)
のように示す。上述したように、式(1)のアミノ酸配列からなるポリペプチドは変異を有していてもよい。また、上記の6量体はホモ6量体であってもヘテロ6量体であってもよい。以下の実施例で示すように、式(1)のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現させると、このポリペプチドは自然に自己会合して上記式(3)で示される6量体を形成する。この6量体のポリペプチド複合体は、細胞内移行活性、すなわち、細胞膜を通過して細胞内に移行する活性を有する。このため、このポリペプチド複合体に標的タンパク質を結合させることにより、標的タンパク質を対象細胞の細胞内に導入することが可能となる。
1実施形態において、細胞内導入剤への標的タンパク質の結合は、遺伝子組み換えにより、上述した式(1)のアミノ酸配列からなるポリペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を作製して発現させることによって行うことができる。ここで、核酸としては、上記の融合タンパク質を発現させることができる限り、使用する発現系に応じてDNAであってもRNAであってもよい。
WA−Xn−Y−Z−VB …(4)
[(WA−Xn−Y−Z−VB)3]2 …(6)
1実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入方法は、標的タンパク質が結合した細胞内導入剤である、上記式(6)で示される融合タンパク質の複合体を、対象細胞に接触させる工程を含む。
後述するように、本実施形態の方法により細胞内に導入された標的タンパク質は、細胞内で、容易に細胞内導入剤から開裂させ、放出することができる。例えば、上記式(4)のWで示される標的タンパク質のアミノ酸配列中に、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列を導入してもよい。このようなアミノ酸配列として、具体的には、SSVPP、DVED等のアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列「SSVPP」は、キモトリプシンで切断することができる。また、アミノ酸配列「DVED」は、カスパーゼ3で切断することができる。細胞内導入剤から切断され、放出された標的タンパク質は、細胞内で標的タンパク質本来の機能を発揮することができる。
<「GFP−gp5−foldon」発現用プラスミドの作製>
「GFP−gp5−foldon」(以下、「GFP−gp5f」という場合がある。)発現用プラスミドを作製した。ここで、「GFP−gp5f」とは、下記式(4)
WA−Xn−Y−Z−VB …(4)
において、A及びnが1であり、Bが0であり、Wが標的タンパク質のアミノ酸配列、すなわち、「GFP(緑色蛍光タンパク質)のアミノ酸配列(配列番号10)」であり、Xが配列番号1のアミノ酸配列であり、Yが「gp5のアミノ酸配列(配列番号2)」であり、Zが「foldonのアミノ酸配列(配列番号6)」であるポリペプチドである。なお、配列番号10に示すGFPのアミノ酸配列のC末端側には、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列「SSVPP」が導入されている。配列番号10のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号20に示す。
作製したGFP−gp5fの発現用プラスミドを大腸菌に導入して大量に発現させて精製し、以下の実験に用いた。
上述のようにして調製したGFP−gp5fの超遠心分析を行った。より具体的には、1.2μMのGFP−gp5fを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で透析し、Optimal XL−I analytical ultracentrifuge (Beckman)を用いて500,000rpm、20℃で分析を行った。
<標的タンパク質の細胞への導入及び担体(細胞内導入剤)からの標的タンパク質の放出>
実施例1で調製した[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体を、HeLa細胞の培地に0.8μMの濃度で添加した。融合タンパク質複合体の添加12時間後の細胞中のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。図2に蛍光顕微鏡写真を示す。図2中、「N」はHoechst 33342で染色した核を示し、「G」はGFPの蛍光を示す。以上の結果から、GFPが効率よくHeLa細胞の細胞内に導入されたことが確認された。
<[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体の細胞内での開裂>
実施例1で調製した[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体を、実験例1と同様にしてHeLa細胞の培地に添加し、細胞内に導入した。続いて、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いたゲル濾過解析により、細胞内に導入した[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体の分子量の変化を経時的に解析した。具体的には、HeLa細胞の培地に1.7μMの濃度で[(GFP−gp5f)3]2を添加し、24時間後及び48時間後に細胞を回収した。続いて、10%Triton X−100で細胞膜を破壊し、得られた溶液をHPLCで解析した。カラムにはGF−510 HQ(Asahipak)を使用した。
<動物実験>
実験例1で調製した[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体を、マウス胎児に注入し、GFPの蛍光を観察した。具体的には、E13.5でマウス胎児を子宮内から取り出し、側脳室に10μMの[(GFP−gp5f)3]2を1μL注射し、子宮内へと戻した。続いて24時間後に胎児を取り出し、蛍光顕微鏡による解析を行った。図4に、顕微鏡写真を示す。図4(A)は、マウス胎児の明視野観察の写真であり、(B)は、GFPの蛍光観察(励起波長485nm、蛍光波長510nm)の写真であり、(C)は、核染色試薬であるDAPIで染色したマウス脳の組織切片の蛍光観察(励起波長402nm、蛍光波長450nm)の写真であり、(D)は、マウス脳の組織切片におけるGFPの蛍光観察(励起波長485nm、蛍光波長510nm)の写真である。この結果、マウスの脳内の細胞にGFPが均一に導入されたことが明らかとなった。脳内の細胞にこのように均一にタンパク質を導入することは通常困難である。[(GFP−gp5f)3]2の融合タンパク質複合体の細胞内への導入効率が非常に高いことが確認された。
<長さの異なる細胞内導入剤の作製および確認>
実施例1と同様にして、長さの異なる細胞内導入剤を作製し、原子間力顕微鏡(AFM)で観察した。より具体的には、下記式(1):
Xn−Y−Z …(1)
において、Xが配列番号1のアミノ酸配列であり、Yが「gp5のアミノ酸配列(配列番号2)」であり、Zが「foldonのアミノ酸配列(配列番号6)」であるポリペプチドであって、nが1、5及び8であるポリペプチドの発現用プラスミドをそれぞれ作製し、大腸菌で発現させた。得られた各長さのタンパク質(細胞内導入剤)を2μg/mLの濃度で20mMグリシン緩衝液(pH3.0)に懸濁した。これらの各溶液をマイカ基板に載せ、4時間放置後に溶液中AFMによる観察を行った。結果を図5に示す。(a)はnが1である細胞内導入剤のAFM観察画像であり、(b)はnが5である細胞内導入剤のAFM観察画像であり、(c)はnが8である細胞内導入剤のAFM観察画像である。上記式(1)のXで示されるアミノ酸配列の繰り返し数を増加させることにより、細胞内導入剤の長さの伸長が確認された。
Claims (4)
- 以下の(g)又は(h)のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
(g)下記式(4):
WA−Xn−Y−Z−VB …(4)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2のアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6のアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数であり、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)のアミノ酸配列、
(h)前記(g)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式(5):
[(WA−X’n−Y’−Z’−VB)3]2 …(5)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、X’ n −Y’−Z’は、前記式(4)のX n −Y−Zで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。 - 以下の(i)又は(j)の融合タンパク質複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
(i)下記式(6):
[(WA−Xn−Y−Z−VB)3]2 …(6)
(式中、W及びVは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Xは配列番号1のアミノ酸配列を示し、Yは配列番号2のアミノ酸配列を示し、Zは配列番号6のアミノ酸配列を示し、nは1〜8の整数であり、A及びBは0又は1の整数であり、かつA及びBが同時に0になることはない。)で示される融合タンパク質複合体、
(j)前記式(6)のXn−Y−Zで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。 - 前記標的タンパク質が、分子量30kDa以下のタンパク質である、請求項1又は2に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤を対象細胞に接触させる工程を含む、標的タンパク質の細胞内導入方法。
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