JP2021531038A - ストレス顆粒集合を調節するためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

Ｇ３ＢＰタンパク質のＮＴＦ２様ドメインと結合し得る１個又は複数個のタンパク質と融合している細胞膜透過性タンパク質を有するタンパク質構築物を利用する、ストレス顆粒集合を調節するためのシステム及び方法。ＮＴＦ２様ドメインとの適切な数のタンパク質を有するタンパク質構築物を構成することにより、ストレス顆粒集合は、患者を処置するために必要に応じて上方制御され得るか、又は下方制御され得る。

Description

関連分野

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１８年７月１３日に出願された米国仮出願第６２／６９７，６９１号明細書及び２０１８年８月２０日に出願された米国仮出願第６２／７１９，７５１号明細書に対する優先権を主張し、これらは両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
[0002]本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に出願されている。この配列表は、２０１９年７月１１日に作成された、ＰＲＩＮ−６３８７６＿ＳＴ２５．ＴＸＴという表題のファイルとして提供され、サイズが約２８，２８７バイトである。この配列表の電子フォーマット中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
[0003]本発明は、個体を処置して個体におけるストレス顆粒の集合を調節するためのシステム及び方法に関し、具体的には、ストレス顆粒集合の上方制御及び下方制御を可能にするように、Ｇ３ＢＰ１／２及び他の主要なストレス顆粒タンパク質と関連する二量体化及び他の相互作用を調節する特定のタンパク質を提供するためのシステム及び方法に関する。

[0004]Ｇ３ＢＰは、Ｇ３ＢＰ１及びＧ３ＢＰ２と呼ばれる２種の類似のヒトタンパク質を指す。Ｇ３ＢＰは、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、内部障害領域、及び二量体化／オリゴマー化ドメインを含む。Ｇ３ＢＰでは、二量体化／オリゴマー化ドメインは、Ｇ３ＢＰ１のアミノ酸１〜１４２又はＧ３ＢＰ２のアミノ酸１〜１３３からなる（これ以降、「ＮＴＦ２様」ドメインと称される）。データは、ウイルスがＧ３ＢＰ１／２のオリゴマー化を妨害してストレス顆粒の形成を防ぐことを示唆し、この形成は、典型的には、継続的なウイルス複製を防ぐために保護細胞死開始シグナルを中継するためのプラットフォームとして機能する。

[0005]ストレス顆粒とは、例えばストレスの多い環境摂動時に形成するＲＮＡ及びタンパク質で構成されているミクロンサイズの膜を持たない凝縮物のことである。持続的なストレス顆粒の集合又は動態の乱れは、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭変性症（ＦＴＤ）、封入体ミオパチー（ＩＢＭ）、及び潜在的なアルツハイマー病（ＡＤ））で観察されている特徴的なタンパク質病理の開始で重要な役割を果たす可能性が高い。驚くことではないが、様々ながんが、直感に反して、Ｇ３ＢＰ上方制御を介して重要なＲＮＡを安定化させることにより、腫瘍生存率を促進するのに関連した戦略を進化させている。そのため、ストレス顆粒の集合及び動態を妨害する、合理的に設計された治療アプローチを開発することが、公衆衛生上緊急に必要とされている。

[0006]現在、ヒトの神経変性疾患との関連では、予防するか、治癒するか、又は延命する処置は存在しない。ＲＮＡホメオスタシスの撹乱と関連する脳疾患は、特に恐るべき課題であり、なぜならば、多くは、必須の生理的タンパク質（例えばＴＤＰ４３）の、最終的にはタンパク質の機能喪失又はほとんど理解されていない機能獲得を介して脳細胞（即ち神経細胞）を死滅させる自己複製型の形成への変換により引き起こされるからである。そのような「タンパク質の誤った折り畳み」と関連する多くの神経変性疾患に対して提案されている単純な戦略は、遺伝子戦略を使用して毒性タンパク質を除去することである。これは、機能に関する冗長性を特徴とするか又は成人の神経系にとって重要ではないタンパク質により引き起こされる疾患に対する実行可能なアプローチである。しかし、残念ながら、ＲＮＡホメオスタシスの疾患（例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＩＢＭ）で蓄積するほとんどのタンパク質は、多様な細胞機能を有する必須のＲＮＡ結合分子である。ストレス顆粒の形成での近位タンパク質（例えばＧ３ＢＰ）も同様に、問題のある標的である。そのため、レベルの低下を目的とする治療薬（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、患者で使用された場合には、重大な望ましくない結果を引き起こす可能性が高い。

[0007]そのため、ストレス顆粒集合を調節するためのシステム及び方法が望ましい。
概要
[0008]本開示の第１の態様は、ストレス顆粒集合を調節するために使用され得るタンパク質構築物である。このタンパク質構築物は、細胞を透過してＧ３ＢＰ１（又はＧ３ＢＰ２）ＮＴＦ２様ドメインと結合するように構成されている。そうするために、このタンパク質構築物は、ＮＴＦ２ドメインと二量体化するか又は二量体化ＮＴＦ２様ドメインと相互作用する１〜１０個の追加のタンパク質と融合している細胞膜透過性タンパク質を含み、この追加のタンパク質は、Ｇ３ＢＰ１の最初のｍ個のアミノ酸（ｍは８〜３３４であり、好ましくは８〜１４２である）、Ｇ３ＢＰ２の最初のｎ個のアミノ酸（ｎは８〜３３０であり、好ましくは８〜１３３である）、又は式：（１）Ｘ_ｙ−ＦＧＤＦ−Ｘ_ｙ；（２）Ｘ_ｙ−ＦＧＥＦ−Ｘ_ｙ；若しくは（３）Ｘ_ｙ−ＦＧＳＦ−Ｘ_ｙのいずれかを有するペプチドバリアント（Ｘ_ｙは、１〜ｙ個の追加のアミノ酸である）のうちの１つ又は複数であり得る。いくつかの実施形態では、ｙ≦１５００、ｙ≦１０００、ｙ≦５００、ｙ≦１００、ｙ≦５０である。好ましい実施形態では、ｙ≦２５である。より好ましい実施形態では、ｙ≦１０である。任意選択的に、この細胞膜透過性タンパク質はまた、タンパク質タグ（例えば蛍光タンパク質）にも融合し得る。このタンパク質構築物を発現するプラスミドが構築され得る。

[0009]本開示の第２の態様は、疾患又は感染を有する患者を処置する方法である。この方法は、細胞を透過してＮＴＦ２様ドメイン又はＮＴＦ２様二量体と結合するように構成されているタンパク質構築物（例えば、既に説明しているタンパク質構築物）を提供することを含む。次いで、例えば、このタンパク質構築物を含む溶液又は他の液体を、タンパク質断片が病理学的ストレス粒子集合を調節することを可能にする位置で注射することにより、このタンパク質構築物を患者に適切に導入し、このタンパク質構築物は、溶液又は他の液体中に存在し得る。次いで、このタンパク質構築物に、細胞を透過させ、この細胞内の少なくとも１個のＮＴＦ２様単量体又は二量体と相互作用することを可能にする。このタンパク質構築物が、単一のＮＴＦ２様ドメインのみと結合するように構成されている場合には、そのような二量体化は、ストレス顆粒の形成を減少させる。このタンパク質構築物が、２個以上のＮＴＦ２様ドメインと同時に相互作用するように構成されている場合には、そのような相互作用は、相分離及びストレス顆粒凝縮に必要な相互作用の接続されたネットワークの形成を促進することにより、ストレス顆粒の形成を上方制御する。任意選択的に、患者は、神経変性疾患又は細胞増殖の障害（例えば様々ながん）を有する。任意選択的に、このタンパク質構築物を、脳脊髄液に注射し得る。任意選択的に、このタンパク質構築物は、即時型細胞毒性を引き起こすことなく、必須のストレス顆粒核形成因子と、このタンパク質構築物又は関連する結合パートナーとの間での生体内の少なくとも１種のホモタイプの又はヘテロタイプの相互作用を妨げ得る。任意選択的に、このタンパク質構築物を、予防的処置として導入し得る。任意選択的に、このタンパク質構築物を、ウイルス感染の積極的処置として導入し得る。

[0010]細胞膜透過性タンパク質が２個の結合タンパク質及び任意選択のタグ付けタンパク質に融合しているタンパク質構築物の実施形態の概略図である。 [0011]１個のＧ３ＢＰ１タンパク質と相互作用する単一の結合タンパク質を有するタンパク質構築物の概略図である。 [0012]２個のＧ３ＢＰ１タンパク質と相互作用する２個の結合タンパク質を有するタンパク質構築物の概略図である。 [0013]ストレス顆粒の形成に対する結合タンパク質の影響を示すグラフであり、（ｉ）Ｇ３ＢＰｄｉを発現しない細胞（４００）、（ｉｉ）Ｇ３ＢＰｄｉを発現する全ての細胞（４１０）、及び（ｉｉｉ）比較的高濃度のＧ３ＢＰｄｉを発現する細胞のみ（４２０）に関して、ストレス顆粒を有する細胞の割合を比較する。 [0014]結合タンパク質を発現するが細胞膜透過性タンパク質は発現しない発現プラスミドの遺伝子マップである。 [0015]患者を処置する方法の実施形態のフローチャートである。 [0016]図７Ａは、亜ヒ酸塩処理後に高ｍＧＦＰ−ＵＢＡＰ２Ｌ ４６７−５４０を発現するＧ３ＢＰ１／２二重ノックアウトＵ２ＯＳ細胞の画像であり、ストレス顆粒の欠如を示す。[0017]図７Ｂは、亜ヒ酸塩処理後に低ｍＧＦＰ−ＵＢＡＰ２Ｌ ４６７−５４０を発現するＧ３ＢＰ１／２二重ノックアウトＵ２ＯＳ細胞の画像であり、ストレス顆粒（７００）の形成を示す。[0018]図７Ｃは、ＣＡＰＲＩＮｌ−ｉＲＦＰと共発現されたＧ３ＢＰ ΔＲＢＤ構造体を含むシステムの画像であり、この構造体のクラスターの形成を示す。[0019]図７Ｄは、ＵＳＰｌ０−ｉＲＦＰと共発現されたＧ３ＢＰ ΔＲＢＤ構造体を含むシステムの画像であり、クラスター化された構造体の欠如を示す。 [0020]図８Ａ及び図８Ｂは、亜ヒ酸塩処理前にＧＦＰを活性化した場合での（８Ａ）及びｍＣｈｅｒｒｙを活性化した場合での（８Ｂ）、ｍＧＦＰ−ＵＳＰｌ０ ＦＧＤＦｘ２及びＹＢＸｌ−ｍＣｈｅｒｒｙが共導入された野生型Ｕ２ＯＳ細胞中におけるストレス顆粒（８００）の存在を示す画像である。[0021]図８Ｃ及び図８Ｄは、亜ヒ酸塩処理後にＧＦＰを活性化した場合での（８Ａ）及びｍＣｈｅｒｒｙを活性化した場合での（８Ｂ）、ｍＧＦＰ−ＵＳＰｌ０ ＦＧＤＦｘ２及びＹＢＸｌ−ｍＣｈｅｒｒｙが共導入された野生型Ｕ２ＯＳ細胞中におけるより大きなストレス顆粒（８１０）の存在を示す画像である。

[0022]本明細書で使用される場合、特許請求の範囲で使用される際の「ａ」及び「ａｎ」等の冠詞は、特許請求されているか又は説明されているものの１つ又は複数を意味すると理解される。

[0023]本明細書で使用される場合、「約［数字］」は、適切な有効数字まで四捨五入される値を含むことが意図されている。そのため、「約１」は、０．５〜１．５の値を含むことが意図され、一方「約１．０」は、０．９５〜１．０５の値を含むことが意図されるだろう。

[0024]本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１」は、１又は複数を意味し、そのため、個々の成分及び混合物／組み合わせを含む。
[0025]本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定しないことを意味する。

[0026]本明細書で使用される場合、用語「細胞膜透過性タンパク質」は、細胞膜透過性タンパク質及び細胞膜透過性ペプチドの両方を含むことを意味する。
[0027]Ｇ３ＢＰは、二量体であって、この二量体のＮＴＦ２様二量体化ドメインを介して多数の追加のＲＮＡ結合タンパク質と相互作用して、大規模な相分離した又は凝集した生体分子凝集体／集合体を形成する二量体として存在し得る。ストレスを受けた細胞では、ＮＴＦ２様ドメインとの相互作用を介してＧ３ＢＰ二量体を中心として組織化されているそのような集合体は、リボソームサブユニット及びＲＮＡ等の他の成分を動員し、この他の成分は、ストレス依存性のリボソーム分解後に系に入る。このプロセスの最終結果は、顕微鏡で観察され得るミクロンサイズのＲＮＡ−タンパク質集合体（「ストレス顆粒」）の形成である。ストレス顆粒の継続的な存在により、生理機能が損なわれる可能性があり、且つＡＬＳ等の神経変性疾患で観察される特徴的なタンパク質病理が引き起こされる可能性がある。あるいは、がんと関連する細胞の迅速な増殖で細胞生存が促進される場合がある。ストレス顆粒は主にＲＮＡで構成されているが、特徴的なＲＮＡ−結合タンパク質及びオリゴマー化されたＧ３ＢＰも含む。

[0028]本開示のシステム及び方法は、疾患発症の原因となる責任タンパク質の遺伝子破壊と関連する望ましくない副作用又は毒性を最小限に抑えつつ、ストレス顆粒集合の第１段階（Ｇ３ＢＰの二量体化、又はＮＴＦ２様ドメイン結合界面を介した他のＲＮＡ結合タンパク質との複合体の形成）を防ぐことにより、多様なヒト疾患を処置することを目的とする。

[0029]Ｇ３ＢＰは、ストレス顆粒集合に必須の核形成因子である。ＲＢＤ及びＮＴＦ２様ドメインは両方とも、ストレス顆粒の集合でのＧ３ＢＰの機能に重要である。本開示は、ＮＴＦ２様ドメインと結合するために使用される特異的に構成されたタンパク質構築物を導入することによりストレス顆粒の集合を調節し得るという本発見の利点を利用する。

[0030]本開示の第１の態様は、ストレス顆粒集合を調節するために使用され得るタンパク質構築物である。図１を参照すると、タンパク質構築物（１００）は、全体的に、少なくとも２個のセグメントを有するように構成されており、第１のセグメント（１１０）は、第２のセグメント（１２０）と融合している。第１のセグメント（１１０）は、この構築物が細胞を透過することを可能にする配列を含む。第２のセグメント（１２０）は、Ｇ３ＢＰ１タンパク質中の又はＧ３ＢＰ２タンパク質中のＮＴＦ２様ドメインと結合し得る１個又は複数個の配列又は断片（１２１、１２２）を含む。タンパク質タグを含む第３の任意選択のセグメント（１３０）も、第１の群（１１０）と融合している場合がある。

[0031]第１のセグメント（１１０）は、細胞膜透過性タンパク質（ＣＰＰ）を含むべきである。当業者に既知の任意の適切なＣＰＰが想定される。一例として、ＣＰＰは、正に荷電したペプチドであり得、且つ（１）転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）（配列番号１）、（ｂ）ペネトラチン（配列番号２）、（ｃ）ポリアルギニン、（ｄ）ポリリシン、又は（ｅ）ヒスチジン、リシン、及び／若しくはアルギニンの少なくとも約７０％を含むオリゴペプチドからなる群から選択され得る。加えて、ＣＰＰは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含み得、且つ細胞膜透過性タンパク質でもあり得る。

[0032]第２のセグメント（１２０）は、Ｇ３ＢＰ１タンパク質中の又はＧ３ＢＰ２タンパク質中のＮＴＦ２様ドメインと結合し得る１〜１０個の追加のタンパク質（「結合タンパク質」）（１２１、１２２）（本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、完全長タンパク質及びタンパク質断片の両方を含む）を含むべきである。いくつかの好ましい実施形態では、追加の結合タンパク質の数は、１又は２である。この追加の結合タンパク質は同一であってもよいが、それぞれ異なる完全長タンパク質又はタンパク質断片であってもよい。

[0033]第２のセグメント（１２０）は、好ましくはＲＮＡ結合タンパク質の豊富さを破壊することなく、ストレス顆粒の形成（即ち、Ｇ３ＢＰの二量体化、又はこのＧ３ＢＰと関連タンパク質とのオリゴマー化）を特異的に調節する。

[0034]図２を参照すると、第２のセグメント中の単一の結合タンパク質（１２１）と融合している細胞膜透過性タンパク質を有する第１のセグメント（１１０）を含む構築物を含むシステム（２００）が示されている。第２のセグメント中の単一の結合タンパク質（１２１）は、Ｇ３ＢＰ１タンパク質（２１０）のＮＴＦ２様ドメイン（２２０）に結合する（２２５）。示されるように、このタンパク質構築物は、Ｇ３ＢＰ１タンパク質のＲＮＡ結合ドメイン（２３０）を妨げない。第２のセグメントが、ＮＴＦ２様ドメインと結合し得る単一の結合タンパク質からなるこの構成では、ストレス顆粒集合は下方制御される。換言すると、この構成のタンパク質構築物は、単一の結合タンパク質が「キャップ」として機能してＧ３ＢＰタンパク質が第２のＧ３ＢＰタンパク質に結合するのを妨げることを可能にし、そのため、周囲にストレス顆粒が核形成する可能性があるコアの形成を妨げる。

[0035]図３を参照すると、第２のセグメントに融合している第１のセグメント（１１０）を含む構築物を含むシステム（３００）が示されており、第２のセグメントは、ＮＴＦ２様ドメインへの結合のために第１の結合タンパク質（１２１）及び第２の結合タンパク質（１２２）を含む。第１の結合タンパク質（１２１）は、あるＧ３ＢＰ１タンパク質（２１０）のＮＴＦ２様ドメイン（２２０）に結合し、第２の結合タンパク質（１２２）は、別のＧ３ＢＰ１タンパク質（３１０）のＮＴＦ２様ドメイン（３２０）に結合する。示されるように、このタンパク質構築物は、これらのＧ３ＢＰ１タンパク質のいずれのＲＮＡ結合ドメイン（２３０、３３０）も妨げない。第２の群が、ＮＴＦ２様ドメインと結合し得る複数の結合タンパク質からなるこの構成では、ストレス顆粒集合は上方制御される。換言すると、この構成の構築物は、ストレス顆粒生合成の最も基部のステップを標的とし、免疫系を回避して複製するためにウイルスタンパク質により使用される同様の自己保護又は自己複製のアプローチを模倣する。

[0036]追加の結合タンパク質として、（ｉ）Ｇ３ＢＰ１（配列番号１）の最初のｍ個のアミノ酸［ｍは、８〜３３４であり（この最初の３３４個のアミノ酸からなる配列は、Ｇ３ＢＰ１ ΔＲＢＤと称され得る）、好ましくは８〜１４２である］；又は（ｉｉ）Ｇ３ＢＰ２（配列番号２）の最初のｎ個のアミノ酸［ｍは、８〜３３０であり（この最初の３３０個のアミノ酸からなる配列は、Ｇ３ＢＰ２ ΔＲＢＤと称され得る）、好ましくは８〜１３３である］が挙げられ得るが、これらに限定されない。Ｇ３ＢＰ１の最初の１４２個のアミノ酸からなる配列は、これ以降、「Ｇ３ＢＰｄｉ」（Ｇ３ＢＰ二量体阻害剤）と称される。

[0037]作用では、これらの結合タンパク質を使用して、ストレス顆粒の形成を調節し得る。一例では、ストレス顆粒の蛍光マーカー（ＰＡＢＰＣ１−ＥＹＦＰ）を発現するヒトＨＥＫ２９３細胞を、２時間にわたり１ｍＭの亜ヒ酸ナトリウムで処理した。陰性コントロール（蛍光融合タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙ−ｓｓｐＢ）を発現する細胞を使用し、Ｇ３ＢＰｄｉの末端に配置された陰性コントロール（Ｇ３ＢＰｄｉ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｓｓｐＢ）を発現する細胞と比較した。亜ヒ酸ナトリウム処理後、ストレス顆粒を有する細胞の割合を定量した。

[0038]図４を参照すると、ＰＡＢＰＣ１陽性ストレス顆粒を特徴とする細胞の割合を、亜ヒ酸ナトリウム処理（ＳＡ）後に撮影した共焦点顕微鏡画像に基づいて手動で計数した。ＳＡの非存在下では、ストレス顆粒を特徴とする細胞はなかった（データは示されない）。コントロール細胞（ｍＣｈ−ＳＳＰＢ）（４００）では、細胞の８５％（Ｎ＝４０）でストレス顆粒を観察した。実験的な１４２個のアミノ酸のペプチド（Ｇ３ＢＰｄｉ−ｍＣｈ−ＳＳＰＢ）を発現する細胞（４１０）は、そのような顆粒を特徴とする可能性が有意に低かった（細胞の４６％、Ｎ＝３９）。比較的高濃度のＧ３ＢＰｄｉを発現する細胞のみを考慮する場合には（４２０）、ストレス顆粒を特徴とする細胞はさらに少ない（細胞の約１３％、Ｎ＝８）。このデータは、調査中の断片の用量依存的な効果を示唆する。アスタリスクは、統計的有意性を示す（^＊ｐ値０．０００３、^＊＊ｐ値＜０．０００１）。これらの結果は、Ｇ３ＢＰｄｉがストレス顆粒の形成を有意に阻害することを証明する。

[0039]しかしながら、高発現レベルでは、細胞増殖の欠損及び時々の細胞死を観察したことから、好ましいＧ３ＢＰ断片は、１４２個未満のアミノ酸を有する。Ｇ３ＢＰ−基質結合の構造的知識に基づいて、他の適切なタンパク質を同定し得る。例えば、ストレス顆粒の動態を調整する２種の因子（ＵＳＰ１０及びＣＡＰＲＩＮ１）は、Ｇ３ＢＰの最初の１２４個のアミノ酸での特定の界面において結合を競合する。さらに、ＦＧＤＦペプチドを特徴とするウイルスタンパク質、及びおそらく同様に関連するＦＧＥＦ及びＦＧＳＦは、同様の位置でＧ３ＢＰのオリゴマー化を乱すと考えられる。

[0040]この理解により、追加の結合タンパク質は、Ｇ３ＢＰ１、Ｇ３ＢＰ２、ＵＳＰ１０、及び／又はＦＧＤＦモチーフを有するウイルスタンパク質からの特定のアミノ酸残基を選択的に利用し得、これら特定のアミノ酸残基は、オリゴマー化及び／又は高次複合体集合を媒介する他のタンパク質との相互作用に重要であり得る。

[0041]Ｇ３ＢＰ１／２からのこれら特定のアミノ酸残基は、Ｋ５、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｆ１５、Ｒ３２、Ｆ３３、Ｋ１２３、及びＦ１２４を含み得ると考えられる。従って、これら残基を特異的に標的とするペプチドバリアントも利用し得る。いくつかの実施形態では、８個全ての残基が優先的に結合している。いくつかの実施形態では、８個の残基のうちの７個が結合している。いくつかの実施形態では、８個の残基のうちの６個が結合している。いくつかの実施形態では、８個の残基のうちの５個が結合している。いくつかの実施形態では、８個の残基のうちの４個が結合している。

[0042]ＵＳＰ１０及び／又はＦＧＤＦモチーフを有するウイルスタンパク質からの追加の結合タンパク質として、式：（１）Ｘ_ｙ−ＦＧＤＦ−Ｘ_ｙ；（２）Ｘ_ｙ−ＦＧＥＦ−Ｘ_ｙ；又は（３）Ｘ_ｙ−ＦＧＳＦ−Ｘ_ｙのいずれかを有するペプチドバリアント（Ｘ_ｙは、１〜ｙ個の追加のアミノ酸である）が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｙ≦１５００、ｙ≦１０００、ｙ≦５００、ｙ≦１００、ｙ≦５０である。好ましい実施形態では、ｙ≦２０である。より好ましい実施形態では、ｙ≦１０である。

[0043]図１に戻って参照すると、任意選択の第３のセグメント（１３０）は、タンパク質タグを含む。所与の用途のニーズに応じて、親和性タグ、クロマトグラフィータグ、蛍光タグ等を含む任意の適切なタンパク質タグを利用し得る。多くの場合には、蛍光タグが利用され、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ、又はＥＹＦＰが使用される。図１では、第３の群がタンパク質構築物の右端に示されているが、タンパク質タグが使用される場合には、このタンパク質タグは、この構築物中のどこにでも現れ得、タグは同一である必要はなく、且つこの構築物全体にわたり配置され得る。例えば、構築物は、下記の一般的形態に従う構造を有する可能性がある：ＣＰＰ−ＧＦＰ−結合タンパク質−ＥＹＦＰ−結合タンパク質−ｍＣｈｅｒｒｙ。

[0044]細胞膜透過性タンパク質を除く目的の配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲに使用するオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴにより合成した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して、ＰＣＲ増幅断片を、（Ａ）ＡｓｃＩ（ＮＥＢ制限酵素）−線形化ＦＭ５−ｍＧＦＰ−ＡｓｃＩ部位ベクター；（Ｂ）ＡｓｃＩ（ＮＥＢ制限酵素）−線形化ＦＭ５−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＡｓｃＩ部位ベクター；及び（Ｃ）ＡｓｃＩ（ＮＥＢ制限酵素）−線形化ＦＭ５−ｍｉＲＦＰ６７０−ＡｓｃＩ部位ベクターに挿入した。クローニング産物を、ＧＥＮＥＷＩＺ配列決定により確認し、挿入物の両端から配列決定した。各挿入物の後ろの終止配列に加えて、挿入物は下記を含んだ：（Ａ）Ｇ３ＢＰ１ ＮＴＦ２様ドメイン（Ｇ３ＢＰ１での最初の１４２個のアミノ酸）；（Ｂ）Ｇ３ＢＰ１ ΔＲＢＤ（Ｇ３ＢＰ１での最初の３３４個のアミノ酸）；（Ｃ）ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘｌ［ＰＱＹＩＦＧＤＦＳＰ ＤＥＦＮＱＦＦＶＴＰ ＲＳＳＶＥＬＰ］（配列番号５）；及び（Ｄ）ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２［ＰＱＹＩＦＧＤＦＳＰ ＤＥＦＮＱＦＦＶＴＰ ＲＳＳＶＥＬＰＳＳＧＳＧＳＧＳ ＰＱＹＩＦＧＤＦＳＰ ＤＥＦＮＱＦＦＶＴＰ ＲＳＳＶＥＬＰ］（配列番号６）。既知の標準的な技術を使用して、上記の挿入物に細胞膜透過性タンパク質を組み込み得る。

[0045]ストレス顆粒集合を減少させる能力を示す一例では、Ｇ３ＢＰ１及びＵＢＡＰ２Ｌ（配列番号７）が考えられる。未処理条件での、並びに亜ヒ酸塩により誘発される翻訳停止及びその後のポリソーム分解の後の両方のヒトＵ２ＯＳ細胞。野生型（ＷＴ）細胞では、１〜２時間にわたる４００μＭの亜ヒ酸塩処理により、十分に確立されたストレス顆粒マーカーにより可視化された場合に、ストレス顆粒の形成が引き起こされる。Ｇ３ＢＰ１／２二重ノックアウトＵ２ＯＳ細胞に、ｍＧＦＰ−ＵＢＡＰ２Ｌ ４６７−５４０（ＦＧリッチＧ３ＢＰ相互作用ドメイン）及びＧ３ＢＰｌ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現するように共形質導入した。高ＵＢＡＰ２Ｌ ４６７−５４０を特徴とする細胞では（図７Ａ）、ストレス顆粒は形成されず、Ｇ３ＢＰｌ−ｍＣｈｅｒｒｙは、細胞質全体にわたり拡散したままであった。低ＵＢＡＰ２Ｌ ４６７−６５０を発現する細胞では（図７Ｂ）、ストレス顆粒（７００）が顕在化した。そのため、このデータは、ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘｌと同様に、このＦＧリッチＵＢＡＰ２Ｌペプチドは、Ｇ３ＢＰ ＮＴＦ２様ドメインに結合し得、且つ他のＲＮＡ結合タンパク質との高次の相互作用を阻害し得ることを示唆する。これらの実験では、１秒当たり０．５フレームの走査速度、１０２４×１０２４ピクセルフレーム、及びｌ．７５×Ｎｙｑｕｉｓｔズーム（６３×油浸レンズ）を使用して、画像を収集した。レーザー出力（１％４８８及び１００％５４６）、強度、並びにゲインを一定に保持した。

[0046]ＮＴＦ２関連タンパク質は、ストレス顆粒凝集に必須の高いＲＢＤ価（ＲＢＤ ｖａｌｅｎｃｙ）にまとめて寄与すると考えられる。さらに、ＲＢＤを欠くパートナー（例えば、ＵＳＰ１０、トランケート型Ｇ３ＢＰ等）の過剰な濃度は、ＲＢＤ含有タンパク質（例えば、ＣＡＰＲＩＮ１（配列番号８））の結合を打ち負かすことにより、この相転移を阻害し得る。ＵＳＰ１０は、おそらく、Ｇ３ＢＰノード間のタンパク質−タンパク質架橋を切断するか又はネットワークを「キャップすること」によって、ネットワークのＲＢＤ価の大幅な減少を引き起こすことにより、このシステムの分子遮断弁として作用すると仮定される。そのようなオフスイッチは、オリゴマーＲＢＤノード間のさらなる弱いＲＮＡ架橋とは無関係に生じるだろうということ、及び操作された構造間の強い多価のＮＴＦ２−ＮＴＦ２相互作用は、関連するタンパク質ネットワークの相分離に十分であるだろうということが考えられる。別の実験では、Ｇ３ＢＰ ΔＲＢＤを含む構造を、ＣＡＰＲＩＮ１−ｉＲＦＰ（即ち、ＲＢＤを有するＧ３ＢＰ ＮＴＦ２結合パートナー）又はＵＳＰ１０−ｉＲＦＰ（即ち、ＣＡＰＲＩＮ１及びおそらく複合体にさらなる価数を付与する他のＲＢＰと結合に関して競合する、ＲＢＤを含まないＮＴＦ２関連パートナー）と共発現させた。図７Ｃに示されるように、過剰なＣＡＰＲＩＮｌ−ｉＲＦＰは、この構造と結合するが、Ｇ３ＢＰ ΔＲＢＤを含む構造のクラスタリング／相分離を妨げない。しかしながら、図７Ｄに示されるように、過剰なＵＳＰ１０は、この構造の相分離を完全にブロックする。

[0047]ストレス顆粒集合を増加させる能力を示す一例では、ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２及びＹＢＸ１（配列番号９）が考慮される。ＹＢＸ１は、ストレス顆粒に印を付けるＲＮＡ結合タンパク質であり、侵入するためにＧ３ＢＰ１ ＮＴＦ２様ドメインを必要としない。ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ１はストレス顆粒形成を阻害するが、ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２は、Ｇ３ＢＰ二量体を、ＲＮＡと相互作用する能力を保持する拡張複合体に架橋することにより、ストレス顆粒の生合成を促進する。野生型Ｕ２ＯＳ細胞に、ｍＧＦＰ−ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２及びＹＢＸｌ−ｍＣｈｅｒｒｙで共形質導入した。ストレスの非存在下（即ち非処理）であっても、ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２（図８Ａ）及びＹＢＸ１（図８Ｂ）の両方でストレス顆粒（８００）が観察される。ＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘ２（図８Ｃ）及びＹＢＸ１（図８Ｄ）の両方で、ストレス（亜ヒ酸塩）後に、より大きな顆粒（８１０）が観察される。

[0048]同様に開示されているのは、上記で説明されているタンパク質構築物を発現するように構成されているプラスミドである。一実施形態では、このタンパク質構築物をカスタムレンチウイルスベクターにクローニングし得、分裂するヒト細胞へのＤＮＡの安定した組込みを可能にする。このタンパク質構築物を、非複製コンピテントレンチウイルス感染及びその後のゲノム組込みの標準的なプロトコルを使用して哺乳動物細胞中で発現させた。この結合タンパク質を発現する（しかしながら細胞膜透過性タンパク質を発現しない）プラスミドの遺伝子マップを、図５を参照して確認し得る。そこでは、このプラスミドは、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）プロモーター下で、フルオロフォア配列（ｍＧＦＰ）と、既に説明されているＵＳＰ１０ ＦＧＤＦモチーフｘｌの配列とを組み込む。

[0049]同様に開示されているのは、患者の疾患又は感染を処置する方法である。場合によっては、この患者は、神経変性疾患又は細胞増殖の障害（例えば、様々ながん）を有する。場合によっては、この方法は、疾患又は感染を積極的に処置する（例えば、ウイルス感染を積極的に処置する）方法である。場合によっては、この方法を、予防的処置として使用する。

[0050]図６を参照すると、この処置方法（６００）は、大まかには３つのステップを含む。
[0051]第１のステップ（６１０）は、細胞を透過してＮＴＦ２様ドメインと結合するように構成されているタンパク質構築物を提供することである。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物は単独で提供される。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物は、注射に適した液体中に存在する。この液体は、水を含み得る。いくつかの実施形態では、提供され得るものは、例えば、３０重量％未満のタンパク質構築物を含む液体が入った無菌パッケージである。

[0052]第２のステップ（６２０）は、患者に、このタンパク質構築物（このタンパク質構築物を含む任意の組成物を含む）を導入することである。このことを、当業者に既知の任意の適切な技術により行ない得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物を、例えば、経口投与してもよいし、経皮投与してもよいし、又は筋肉内注射により、皮下注射により、若しくは皮内注射により投与してもよい。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物を脳脊髄液に注射する。

[0053]第３のステップ（６３０）は、このタンパク質構築物が病理学的ストレス顆粒集合を調節することを可能にすることである。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物が、ＮＴＦ２様ドメインと結合する単一タンパク質からなる場合には、このタンパク質構築物は、ストレス顆粒の形成を下方制御する。いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物が、ＮＴＦ２様ドメインと結合する２個以上のタンパク質からなる場合には、このタンパク質構築物は、ストレス顆粒の形成を上方制御する。

[0054]いくつかの実施形態では、このタンパク質構築物は、好ましくは即時型細胞毒性を引き起こすことなく、必須のストレス顆粒核形成因子と、それ自体又は関連する結合パートナーとの間での生体内の少なくとも１種のホモタイプの又はヘテロタイプの相互作用を妨げる。

[0055]当業者は、本明細書で説明されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる通常の実験を使用して認識するか又は確認し得るだろう。そのような等価物は、下記の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (15)

1. ＮＴＦ２様ドメインに結合し得るｋ個の結合タンパク質と融合している細胞膜透過性タンパク質を含むタンパク質構築物であって、各結合タンパク質は、Ｇ３ＢＰ１の最初のｍ個のアミノ酸、Ｇ３ＢＰ２の最初のｎ個のアミノ酸、及び式：Ｘ_ｙ−ＦＧＤＦ−Ｘ_ｙ；（２）Ｘ_ｙ−ＦＧＥＦ−Ｘ_ｙ；又は（３）Ｘ_ｙ−ＦＧＳＦ−Ｘ_ｙを有するペプチドバリアントからなる群から選択され、
   Ｘ_ｙは、１〜ｙ個の追加のアミノ酸であり、ｙ≦１５００、１≦ｋ≦１０、８≦ｍ≦３３４、及び８≦ｎ≦３３０である、
   タンパク質構築物。
2. 前記細胞膜透過性タンパク質は、タンパク質タグとさらに融合している、請求項１に記載のタンパク質構築物。
3. 前記タンパク質タグは、蛍光タンパク質である、請求項２に記載のタンパク質構築物。
4. 請求項１に記載のタンパク質構築物を発現するように構成されているプラスミド。
5. 患者の疾患又は感染を処置する方法であって、
   細胞を透過してＮＴＦ２様ドメインと結合するように構成されているタンパク質構築物を提供するステップと、
   前記患者に前記タンパク質構築物を導入するステップと、
   前記タンパク質構築物が、前記細胞内の少なくとも１個のＮＴＦ２様ドメインと結合することを可能にするステップと
   を含む方法。
6. 前記タンパク質構築物は、単一のＮＴＦ２様ドメインのみと結合し、ストレス顆粒の形成は下方制御される、請求項５に記載の方法。
7. 前記タンパク質構築物は、２個以上のＮＴＦ２様ドメインと結合し、ストレス顆粒の形成は上方制御される、請求項５に記載の方法。
8. 前記タンパク質構築物を、予防的処置として導入する、請求項５に記載の方法。
9. 前記タンパク質構築物を、ウイルス感染の積極的処置として導入する、請求項８に記載の方法。
10. 患者の疾患又は感染を処置する方法であって、
    請求項１に記載のタンパク質構築物を含む液体を提供するステップと、
    前記液体を、前記タンパク質構築物が病理学的ストレス顆粒集合を調節することを可能にする位置で患者に注射するステップと
    を含む方法。
11. 前記患者は、神経変性疾患又は細胞増殖の障害を有する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記タンパク質構築物を脳脊髄液に注射する、請求項１０に記載の方法。
13. 前記タンパク質構築物は、ストレス顆粒の形成を上方制御する、請求項１０に記載の方法。
14. 前記タンパク質構築物は、ストレス顆粒の形成を下方制御する、請求項１０に記載の方法。
15. 前記タンパク質構築物は、即時型細胞毒性を引き起こすことなく、必須のストレス顆粒核形成因子と、それ自体又は関連する結合パートナーとの間での生体内の少なくとも１種のホモタイプの又はヘテロタイプの相互作用を妨げる、請求項１０に記載の方法。
    

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