CN105101951B - 一种用于基因-药物治疗的新型试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于以遗传物质转染细胞的组合物,其包括能够引导遗传物质远离细胞酸性区室的第一剂和能够稳定微管或其网络的第二剂。本发明还涉及所述组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用,一种用于递送遗传物质到细胞内的方法以及一种试剂盒。
Description
相关申请交叉引用
本申请要求2012年10月29日提交的美国临时申请No.61/719,908的优先权,就所有目的而言,其内容通过引用整体地结合于本文中。
技术领域
本公开内容涉及用于以遗传物质转染细胞的组合物。特别是,本发明涉及使用组合物转染细胞,所述组合物包括能够引导遗传物质远离细胞酸性区室的第一剂和能够稳定微管或其网络的第二剂。
背景技术
pDNA、反义寡核苷酸和shRNA的基因递送为毁灭性疾病的治疗提供了可能,所述毁灭性疾病包括神经退行性疾病和脊髓损伤,对于这些毁灭性疾病,目前处治选择有限。然而,以基于核酸的治疗作为生物学的一个新类别仍然处于发展的初期阶段。基因递送的功效需要将这些分子递送到细胞内,递送策略存在巨大的挑战。考虑到与病毒载体临床应用有关的不足,因现有的非病毒载体转染分化神经元不佳,由于非病毒基因递送降低了免疫原性、可适应大尺寸转基因的能力、改善的安全性和便于制造的原因,其成为有吸引力的替代。
聚乙烯亚胺(LPEI),一种现成的转染剂,已被用于转染各种类型的细胞,包括神经元的体内(in vivo)和体外(in vitro)的转染。人们认为LPEI将DNA 凝聚到纳米粒子中,由于LPEI的阳离子特性,通过结合到位于细胞表面的带负电荷的硫酸类肝素蛋白促进了这些载体进入细胞。人们认为内化后, LPEI/DNA纳米复合物被运输到细胞核周围区域。然后假设LPEI可以通过“质子海绵效应”逃离内体,将DNA从聚合物上释放,随后DNA被摄取进入细胞核。
目前,通过优化使用LPEI的实验方法来提高分化的神经元细胞的转染效率和细胞存活率的努力获得的成效有限。已经尝试在非神经元细胞、原代神经元和神经元细胞系中鉴定限制高转染效率的潜在机制。包括神经元细胞在内的非分裂的、有丝分裂后细胞的不良转染通常被认为是由于pDNA在核内转运中的推测缺陷。另外认为内化和细胞内的障碍限制了分化的神经元细胞的转染。通过提高摄取,发现更多的神经元细胞表达转基因,但是仅少量地 (总细胞数的2%至6%)。迄今为止,在分化的神经元中使用非病毒载体实现高转染效率的目标仍然很难,产生更多具有这种特性的新型聚合物的努力仍继续。
尽管对各种毁灭性疾病(如癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病) 诊断上有了显著改进且处治上有了创新,但这些疾病的有效处治仍存在较多的挑战。目前,低的转染和递送效率限制了药物-基因治疗的应用。正是这种不满足的需求,要求开发方法以提高活体外和活体内的基因递送,随后采用这种技术开发盖伦制剂。
因此,本公开的目的在于改善上述不足,并提供改进的转染效率。
发明内容
第一方面,本发明提供了一种用于以遗传物质转染细胞的组合物,其包括能够引导遗传物质远离细胞酸性区室的第一剂和能够稳定微管或其网络的第二剂。
第二方面,本发明提供了一种将遗传物质递送到细胞内的方法,其包括借助组合物施用遗传物质的步骤。
第三方面,本发明提供一种组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用,所述疾病选自癌症、SMA、骨癌、白血病、血癌、镰状细胞疾病、Wiskott-Aldrich 综合征、HIV、遗传性疾病、糖尿病、心脏疾病和神经退行性疾病。
第四方面,本发明提供一种组合物,其包括如本文所描述的第一剂和如本文所描述的第二剂。
第五方面,本发明提供一种试剂盒,其包括如本文所描述的组合物和使用说明书。
术语定义
如本文所用,术语“核酸”表示包括一个或多个核苷酸、或寡核苷酸、或其片段的分子,包括但不限于,核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、 DNA/RNA杂交体、非天然的或合成的核酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹 RNA(shRNA),脱氧核糖核酸(DNA)、质粒DNA(pDNA)、反义和正义寡核苷酸、核苷酸或其组合。核酸可以是单链、或部分或全部双链(两条)。双链核酸可以是同源双链或异源双链。术语“核糖核酸”(RNA)是指在基因的调控、编码、解码和表达中发挥重要作用的生物分子。每个”核糖核酸“由核苷酸(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘌呤(T))和核糖组成。核糖核酸序列包括这些核酸的链,产生糖-磷酸骨架。目前,术语"脱氧核糖核酸"(DNA)是指生物分子,由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G) 或胸腺嘧啶(T)连接到糖/磷酸以形成完整的核苷酸。
如本文所用,术语“分离的”意思是核苷酸序列(如基因、引物或寡核苷酸或其他序列)实质上或基本上不含其他核酸或其他杂质。
如本文所用,术语“扩增子(amplicon)”、“扩增的产物(amplified product)”或“扩增产物(amplification product)”是指扩增反应的产物。扩增子的实施方案是PCR、实时PCR、逆转录PCR、竞争RT-PCR、连接酶链式反应(LCR)、缺口-LCR、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)等产生的核苷酸序列。
如本文所用术语“引物”是指在如PCR或RCA的技术中能被用作引物的任何单链寡核苷酸序列。因此,根据公开内容,“引物”是指单链寡核苷酸序列,其能够作为引物延伸产物合成的起始点,所述引物延伸产物为与要复制的核酸链基本上相同(用于正向引物)或基本上与要复制的核酸链反向互补(用于反向引物)。引物可以适用于如PCR技术。单链包括,如单链核苷酸序列形成的发夹结构。引物设计,如其长度和特异性序列,依赖于靶核苷酸序列的性质和该引物使用的条件,如温度和离子强度。
所述引物可以由本文所描述的核苷酸序列组成,或者可以是10、15、20、 25、30、35、40、45、50、75、100个或更多核苷酸,这些包括或落入本文所描述的序列中,只要在严格条件下它们适合于特异性结合靶核酸序列。在一个实施方案方案中,引物序列长度小于35个核苷酸,例如引物序列长度小于 34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、 17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。能对引物或探针在长度或序列上进行微小修饰以维持在给定的情况下所需的特异性和灵敏度。在本公开的一个实施方案方案中,如在任一方向,本文中所描述的探针和/或引物的长度可延长为1、2、3、4或5个核苷酸或长度可减少为1,2、3、4或5个核苷酸。引物序列能使用本领域中公知的任何方法合成。
如本文所用,术语“扩增”是指扩增反应,例如用于扩增的特定靶核苷酸序列的酶介导的反应。通过扩增靶核苷酸序列,反应产生更多拷贝的靶核苷酸序列,以产生扩增子、扩增的产物或扩增产物。扩增反应的一个实施方案是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是在热循环仪辅助下,在含有聚合酶、一组引物和四种脱氧核糖核酸(dNTPs)的混合物中进行,其中所述一组引物为如一组正向和反向引物和可能需要的任何额外的引物。
如本文所用,术语“治疗性基因”和基因治疗是指遗传性疾病的治疗,往往类似于其它疾病的治疗。基因治疗可以涉及将正常拷贝的基因插入到人体内具有特定遗传性疾病的细胞中。这种治疗可以涉及替代有缺陷的化合物或阻塞过于活跃的通路。基因治疗也可以涉及关闭基因。遗传修饰,也可以用于活体外基因治疗。例如,人干细胞、免疫细胞或癌细胞可以被遗传修饰以用于各种应用。修饰细胞以诱导分化、转分化和重新编程。此外,也可修饰细胞以用作递送治疗性蛋白质的工具。例如,间充质干细胞可以被修饰以过表达BMP2。
术语“复合物(polyplex)”是指遗传物质和阳离子物质的复合物质。遗传物质和阳离子物质的比例(核酸:聚合物(N/P))可以选自约0至约1000、约0至约900、约0至约800、约0至约700、约0至约600、约0至约500、约0至约400、约0至约300、约0至约200、约0至约100、约0至约75、约0至约50、约0至约25、约0至约20、约0至约15、约0至约10和约0 至约5。
术语“抗癌药物”,也被称为化疗剂,是指用于处治人体癌症的剂。有不同种类的化疗剂,其基于它们的作用方法来分组定义。本领域已知的不同组的化疗剂的实施方案如下:烷基化抗肿瘤剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。该剂可以静脉注射地、口服地或鞘内注射地施用于患者。在某些情况下,肢体隔离灌注也是已知的化疗剂的递送方法。
术语“紫杉烷类(taxanes)”是指一类紫杉属的植物(红豆杉)产生的二萜类。基于紫杉烷的化学治疗的广泛用于癌症患者。紫杉烷类,其包括紫杉醇和多西他赛(docetaxel),促进微管稳定,并扰乱从中期向后期的过渡。阻止细胞分裂的进程和延长有丝分裂检查点的活化诱导细胞凋亡或复归到G 期,最终导致细胞死亡。紫杉烷类可以选自(二十二碳六酸紫杉醇)、Xytotax TM(聚谷氨酸紫杉醇)、紫杉醇、 BMS-184476、DJ-927、BMS-275183、RPR109881A、奥他塞、Genexol(共聚物的组合)、LEP(脂质体封装紫杉醇)和维生素E乳剂中的紫衫酚(taxol)。
如本文所用的术语“埃坡霉素(epothilone)”是一类新兴的用于癌症治疗的药物。埃坡霉素类的作用机制类似于紫杉烷,其抑制有丝分裂并诱导细胞凋亡。然而,埃博霉素类显示比紫杉烷类更有效且副作用更温和。此外,它们更好的水溶性特性使得能够代替克列莫佛(cremophor,紫杉醇的增溶剂),克列莫佛显示影响心脏功能。
术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”(HDACi)是指一类干扰组蛋白脱乙酰酶功能的化合物。HDACi也称为表观遗传修饰剂。例如,通过表观遗传形式的修饰,已经表明SAHA和TSA显示出各种活性,如免疫调节和细胞凋亡。虽然HDACi在临床上被广泛用作抗癌治疗,对HDACi用于神经退行性疾病、抗炎和心肌保护的干扰治疗也进行了研究。最近,已经证明HDACi促进干细胞的自我更新和增强分化,以及增强体细胞的重编程效率。也已知HDACs 通过组蛋白的乙酰化状态的调控参与染色质的维持和功能。有利的是,考虑到这些对组蛋白调节的整体作用,HDACi影响很多生理过程,包括参与增殖、分化、生存和DNA修复的基因的转录。
术语“TrafEnTM”代表转运增强子,并且涉及用于高效转染的引导遗传物质或含有遗传物质的复合物质到的生产性通路的两种剂。特别是,TrafEnTM涉及使用组合物转染细胞,所述组合物包括能够引导遗传物质远离细胞酸性区室的第一剂和能够稳定微管或其网络的第二剂。TrafEnTM的应用可进一步延伸至化学增敏细胞,通过合理地设计组合物以实现特定的治疗作用。第一剂,如上述定义,也可以被称为“chemoRe-router”。
“受试者”或“个体”是活的多细胞的有脊椎的生物体。在本公开的上下文中,受试者可以是实验受试者,诸如非人动物,如小鼠、棉鼠或非人灵长类。可替代地,受试者可以是人类受试者。
如本文所用的术语“生物材料”或“生物样品”是指任何材料或样品,其包括如本文定义的被分析物。此类样品,例如包括来自于或包括粪便、全血、血清、血浆、骨髓、眼泪、唾液、鼻液、痰液、耳液体、生殖器液体、乳液、牛奶、初乳、胎盘液、羊水、汗水、滑膜液,腹水、脑脊液、胆汁、胃液、眼房水、玻璃体液、胃肠液、分泌物、渗出物、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液,从免疫反应部位收集的液体、从汇集部位(pooled collection site)收集的液体、支气管灌洗、尿液、如从所有合适的器官收集的活检材料如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃等,有核细胞样品,与粘膜表面有关的液体、毛发或皮肤。
本文使用的术语“处治(treatment)”、“治疗性干预(therapeuticintervention)”和“治疗(therapy)”可以互换(除非上下文另有说明),这些术语是指治疗性处治和预防性或防范性措施,其中目的是尝试和防止或减缓 (减轻)目标病理状态或疾病。在肿瘤的处治中,处治可直接减少肿瘤细胞的病理学、或者使肿瘤细胞更易于被其他治疗剂处治,如放疗和/或化疗。这种肿瘤处治的目的或结果可以包括,如下列一种或多种:(1)抑制(即减少、减缓或完全停止)肿瘤生长;(2)减少或消除症状或肿瘤细胞;(3)减小肿瘤尺寸;(4)抑制肿瘤细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织;(5)抑制转移; (6)增强抗肿瘤的免疫反应,其可以但是不必,导致肿瘤消退或排斥;(7) 增加存活时间;和(8)处治后,在给定的时间点降低死亡率。处治可能需要用单一剂或组合剂(两个以上)来处治。本文使用的“剂(agent)”广义上是指,如用于处治的药物/化合物或其他手段,如放射处治或手术。处治的实施方案包括手术干预、肝移植、免疫疗法、用给定的药物或药物组合进行的化学疗法、放射治疗、新辅助处治、饮食、维生素治疗、激素治疗、基因治疗、细胞治疗、抗体治疗等。术语“处治“还包括实验性处治如,药物筛选和临床试验。
另外,本文使用的术语和表达用作描述性术语而非限制性术语,并且在使用这些术语和表达时无意排除所显示和描述的任何等同特征或其部分,应认为各种修饰都可能落入本发明要求的范围内。因此,应该理解的是,尽管本发明已通过优选实施方案方案和任选特征特别地被公开,但本文中所公开的其中体现的本发明的修饰和变化实施方案可依赖于本领域的技术人员,并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围之内。
在本文中本发明已被广泛地和一般性地描述。落入一般性公开范围内的每个更窄的种类和亚分组也构成本发明的一部分。这包括带有从属中去除任何主体物质的消极限制或附加条件的本发明的一般性描述,不管本文是否中特别地列举了该离体材料。
其它实施方案方案实施方案在下列权利要求和非限制性实施方案中。此外,本发明的特征或方面以马库什组的方式描述,本领域的技术人员应承认本发明也依据任何单独成员或马库什组的亚组成员来描述。
本发明的详细描述
在描述本发明之前,应该理解本发明不限于所描述的特别的实施方案,因这些是可以改变的。也应该理解本文所用的术语目的仅在于描述特别的实施方案,并非意味着限制,因本发明的范围将仅限制在所附的权利要求中。
当递送遗传物质(如质粒DNA和shRNA)时,获得高转染效率为大量毁灭性疾病的治疗提供了可能,该毁灭性疾病包括但不限于癌症,神经退行性疾病和炎症性疾病,对此,当前处治选择有限。目前,低的转染和递送效率限制了基因-药物治疗的应用。盖伦制剂和使用这种技术来增强基因在活体外和活体内递送的方法的发展表明在这个行业不能满足需求。
有利的是,本公开提供了一种生物相容的试剂(TrafEnTM)的独特组合物,旨在大幅增强基因递送,同时化学增敏多种难以感染细胞。本文描述的药物- 基因组合涉及一种策略,其凭借一类靶向微管的化学增敏剂和chemoRe-router 来增强治疗基因的递送。TrafEnTM和治疗基因的协同作用被认为能产生优异的治疗作用。如在下面的实施方案进一步描述的,化学增敏剂的配方可以含有膜融合分子的优化混合物,其特异地重新引导载体/DNA复合物质远离非生产性酸性区室,然后使他们重新改变路线到被化学增敏剂所稳定的微管网络。
因此,本公开提供了一种用于以遗传物质转染细胞的组合物,其包括能够引导遗传物质远离细胞酸性区室的第一剂和能够稳定微管或其网络的第二剂。
在一个实施方案方案中,第一剂可以是能够引导遗传物质远离细胞的非生产性酸性区室。在另一个实施方案方案中,第一剂可以是,但不限于,脂质、肽融合剂或其组合。
在一个实施方案方案中,所述脂质融合剂可以选自DOPE、CHEMS、DPPC 和DOPC以及其组合。
在一个实施方案中,肽融合剂可以是至少下列中的任一种,但不限于,血血凝素(HA2-肽)、流感来源的融合肽diINF-7、白喉毒素T结构域和聚阳离子肽(如聚赖氨酸和聚精氨酸),或其组合。
在一个实施方案中,前述肽融合剂可以通过附着脂质进行化学修饰。
在一个实施方案中,前述肽可以通过附着生物分子或合成的载体进行化学修饰,所述生物分子如核酸,所述合成载体如阳离子聚合物。
在一个实施方案中,第二剂可以是能够增强微管蛋白乙酰化。在另一个实施方案中,第二剂可以是能够增强细胞对治疗剂的敏感性和/或可以是能够修饰宿主遗传状态。
在一个实施方案中,前述第二剂可以选自组蛋白脱乙酰酶抑制剂 (HDACi)、微管蛋白结合剂(TBA)和siRNA,siRNA能够直接或间接地影响微管网络的稳定性。HDACi可以选自Tubastatin A、belinostat、丁苯羟酸、帕比司他(panobinostat)、PCI-24781、SAHA(伏立诺他)、scriptaid、曲古霉素A、丙戊酸、B2、salermide、sirtinol及其组合。
在一个实施方案中,表明本发明第二剂的TBA可以选自紫杉烷类、埃博霉素类,及其组合。紫杉烷类可以是紫杉醇、多西他赛(docetaxel)或其组合。
在另一个实施例中,紫杉烷类可以选自cremophor(二十二碳六酸紫杉醇)、Xytotax TM(聚谷氨酸紫杉醇)、紫杉醇、 BMS-184476、DJ-927、BMS-275183、RPR109881A、奥他塞、Genexol(共聚物的组合)、LEP(脂质体封装紫杉醇)和维生素E乳剂中的紫杉酚。
在一个实施例中,埃坡霉素类可以是帕妥匹隆(patupilone),伊沙匹隆(ixabepilone),BMS310705,沙戈匹隆(sagopilone),KOS-862,KOS-1584,或其组合。
在一个实施方案中,化学增敏剂可以是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)、微管蛋白结合剂、紫杉烷类和siRNA,能够直接或间接地影响微管网络的稳定性。
有利的是,在本公开中使用的化学增敏剂已知具有体内抗肿瘤、抗炎、抗血管生成或神经治疗作用。
在一个实施方案中,遗传物质可以被耦合到至少一种阳离子物质上。阳离子物质可以选自聚乙烯亚胺、聚阳离子两亲化合物、DEAE-葡聚糖、阳离子聚合物、它们的衍生物和其组合。此外,该阳离子物质可以是阳离子聚合物,如树枝状聚合物、支化聚乙烯亚胺(BPEI)、线性聚乙烯亚胺(PEI)、聚 (酰胺-胺树状分子)(PAMAM)、及其组合。在一个实施方案中,阳离子物质是LPEI。
在一个实施方案中,遗传物质与阳离子物质的核酸:聚合物(N/P)的比例可以是选自约0至约1000、约0至约900、约0至约800、约0至约700、约0至约600、约0至约500、约0至约400、约0至约300、约0至约200、约0至约100、约0至约75、约0至约50、约0至约25、约0至约15、约0 至约10和约0至约5。在一个实施方案中,遗传物质与阳离子物质的核酸:聚合物(N/P)的比例可以是20。
在一个实施方案中,N/P比例是组合物中形成复合物的遗传物质与阳离子物质的比例。
在另一个实施方案中,遗传物质可以是核酸序列。在另一个实施方案中,核酸序列可以选自DNA、RNA、mRNA、核酶、反义寡核苷酸、修饰的聚核苷酸及其组合。
在一个实施方案中,细胞是分化的或未分化的细胞。在一个实施方案中,细胞可以选自神经系统细胞、肝细胞、造血细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、肿瘤细胞、缺血性组织细胞、T细胞、B细胞、皮肤细胞及其组合。
在一个实施方案中,细胞可以分离自生物样品。在一个实施方案中,所述生物材料可以选自新鲜组织、冷冻组织、石蜡保存的组织和/或乙醇保存的组织的样品。在另一个实施方案中,生物材料可以选自全血或其组分、淋巴、胆汁、脑脊髓液、支气管肺泡灌洗液、滑膜液、精液、腹水瘤液、母乳、羊水,口腔粘膜涂片和脓液。
在一个实施方案中,第一剂和第二剂可以是同时、分别或相继地向细胞提供。在一个实施方案中,第一剂和第二剂可以是在遗传物质转染细胞的第一个小时内提供。可选择地,第一剂和第二剂可以是在遗传物质转染细胞的2、 3、4、5、6、7、8、9、10小时内提供。
在一个实施方案中,第二剂可以是在第一剂之后提供。在一个实施方案中,第二药剂可以包括如本文中所描述的两种或多种治疗剂。
在一个实施方案中,本文所描述的组合物可以用于基因治疗。
在一个实施方案中,本文所描述的组合物可以进一步包含治疗剂。所述治疗剂可以是化疗剂。在一个实施方案中,化疗剂可以选自紫杉烷类、紫杉醇、多西紫杉醇和埃博霉素类,及其组合。
在一个实施方案中,提供了一种处治需要基因治疗的患者的方法,其包括施用遗传物质和如本文所描述的组合物。
在另一个实施方案中,提供了本文所描述的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用,所述疾病选自癌症、SMA、骨癌、白血病、血癌、镰状细胞疾病、Wiskott-Aldrich综合征、HIV、遗传性疾病、糖尿病、单基因疾病、传染性神经疾病、眼疾病、炎症疾病、心脏疾病和神经退行性疾病。
在另一个实施方案中,本文所描述的组合物可以用于基因标记。
在一个实施方案中,提供了一种递送遗传物质到细胞内的方法,其包括借助本文所描述的组合物施用遗传物质的步骤。所述方法可以在体外或活体外或原位进行。
在一个实施方案中,提供一种组合物,其包括如本文所定义的第一剂和如本文所定义的第二剂。
在另一个实施方案中,提供一种试剂盒,其包括如本文所定义的第一剂和如本文所定义的第二剂、如本文所定义的治疗剂以及使用说明书。
本公开进一步涵盖治疗基因或遗传物质。如以下实施方案所列举的,这种遗传物质可包括,但不限于,编码任一基因或其部分的核酸序列,当其进入细胞,然后通过与靶基因相互作用可能增强表达或可能减弱表达,来对靶基因发挥治疗作用。应当理解的是,遗传物质(包括治疗性基因)可以不同于本文所示例的和描述的任何确切序列。因此,本发明考虑对所显示的序列缺失、添加和更换,只要该序列的功能与本发明的方法一致。对于本发明的目的,任何定量遗传物质的方法都适合用于本发明的文本,许多是现有技术中已知的。例如,所述遗传物质可以使用本领域已知的技术来分离,如限制性酶消化、聚合酶链式反应(PCR)、琼脂糖凝胶电泳、排阻色谱法等等。此外,分离的遗传物质可以使用本领域中已知的方法来定量,可以是,但不限于,分光光度分析、荧光标记、定量PCR(qPCR,也被称为实时PCR)、以及如DNA微阵列(CHIP)分析,用以确定转染后基因的表达水平。所有公开的方法可以按任何可能的顺序使用。
如本文所描述的组合物可以在许多不同的应用中使用,作为一种独特的途径,所有这些应用都有/关于TrafEnTM的使用,其中具有微管修饰活性和/或表观遗传修饰活性的基因和药物(如HDACi)的同时作用可以对以下所描述的所有领域是有用的。
细胞治疗是指引起细胞恢复正常功能的过程,所述功能由于衰老、疾病、损伤或先天性缺陷而丧失。有许多种形式的基于细胞的治疗,包括干细胞和免疫细胞和癌细胞。此外,已知HDACi影响干细胞分化和体细胞的重新编程进入可诱导多能干细胞(iPSCs)的过程,拓宽了TrafEnTM在基于细胞的治疗中的应用。这些基于细胞的治疗可用于,但不限于,干细胞的应用,如用于修饰群体分离的阴性或阳性选择,和/或干细胞及其后代的生长控制,如将自杀基因插入到干细胞群体,能够使用外部刺激来消除不受控制的细胞增殖。本发明进一步的应用也可以是修饰干细胞来递送基因产品,其取决于应用,可能需要治疗基因的长期或瞬时表达。像伤口愈合、骨再生、血管生成和中枢神经系统的损伤修复,瞬时表达将是优选的实施方案。另一方面,为了纠正遗传疾病,持续性的基因表达是需要的。
本发明的另一种可能的应用是通过本发明介导的基因转移来调制在干细胞中的分化。对干细胞的基因转移的另一个潜在应用是提供遗传信号、改善现有技术中已知的分化实验方法的结果。通过功能的获得-(质粒DNA)或缺失-(shRNA、siRNA、miRNA)引导细胞分化的可能性,产生更纯的分化细胞群体,从而成为本发明一个特别有吸引力的实施方案,在基于细胞的治疗中,分化和重编程细胞的临床适用性已驱动使用不同类型干细胞的进行探索,这可以是,但不限于,诱导多能干细胞、间质干细胞、神经干细胞、iPSCs、 ESCs、人胚胎干细胞(hESCs)、ASCs、造血(HSCs)和间充质干细胞(MSC)、神经干细胞(NSCs)、免疫细胞(促进T细胞的功能)、癌症细胞(用于癌症的疫苗接种)和其遗传修饰的变体、神经元、胶质细胞、星形胶质细胞。
本文所描述的组合物用做处治和治疗的可能应用,如基于细胞的和基因治疗/治疗学的下列疾病中的任一种,但不限于,SMA(通过基于iPS细胞的治疗)、骨癌、白血病、血癌、癌症(抗血管生成、停止细胞生长)、用于镰状细胞疾病和Wiskott-Aldrich综合征的HSC治疗、癌症的基因处治、HIV感染和遗传性疾病、修复损伤组织、糖尿病(T1D和T2D)、心脏疾病,神经退行性疾病,如帕金森氏疾病。
另外,本文所描述的组合物还可以用于重编程细胞和或细胞转分化的方法。已经建立本领域已知的遗传工具以在各种类型的细胞中引发重编程的过程。
此外,有人已经提出HDACi可能在促进转分化中发挥作用。现有技术表明,在通常无SOX9的肝细胞中HDACi诱导SOX9表达。SOX9的异常表达诱导COL2A1和COMP1的表达,其通常发现于软骨形成期间。这些观察结果表明典型的发育过程重新部署为非典型设置可以通过HDACi处治细胞来启动。
附图说明
结合非限制性实施方案和附图,参照详细的说明书可更好地理解本发明,其中:
图1示出TrafEnTM的可能作用的示意图。含有优化的chemoRe-router混合物,其特异地重新引导复合物远离酸性区室(步骤1)并改变路线至通过使用化疗增敏剂稳定化的微管网络上(步骤2),(如组蛋白脱乙酰酶抑制剂 (HDACi),紫杉烷类)。化疗增敏剂协同基因产物以实现有益的治疗作用(步骤3)TrafEnTM也可以用于提高治疗物质的细胞内转运。
图2示出TrafEnTM组合物的示意图,其含有优化的chemoRe-router和微管靶向的化疗增敏剂的混合物。TrafEnTM显示增强了转染效率并与基因产物协同,达到有益的治疗作用。
图3示出微管网络修饰剂的作用。(A)示出微管动力学被微管蛋白乙酰化或微管结合剂(TBA)所抑制。TBA,如化学治疗的紫杉烷类,结合到微管蛋白,而HDAC6和Sirtuin2的抑制阻止微管的去乙酰化,导致微管的稳定。 (B)描述组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)的可能作用。通过包括保护基因的去抑制和促炎基因表达抑制的多种可能的机制,这些似乎减轻了心力衰竭的病理学条件。HDACi其他非转录作用可能包括肌小节蛋白的乙酰化的增强和自噬和细胞凋亡通路的抑制。
图4示出原理图,其描述TrafEnTM协同作用,以及其用做新颖的基因-药物治疗组合治疗剂。如前面图2所示,组成TrafEnTM的组分是微管靶向的化疗增敏剂和chemoRe-router。这两种组分相互作用,以帮助并增强基因转移的过程,这可能导致靶基因的基因表达的上调或下调。这种基因表达的调控,结合化学增敏剂,可获得期望的治疗效果,这可以是,但不限于,细胞重编程、干细胞分化、促进凋亡作用、抗血管生成作用、抗炎作用和/或神经保护作用。
图5示出聚合的复合物高效转染原始的而非分化的神经元细胞的数据。 A.转染前,用50ng/ml的GDNF、10μM的全反式视黄酸(RA)或10μM的毛喉素(FSK)分化细胞48小时。使用温和的离心,用复合物(N/P=20)转染原始的或分化的细胞。转染后48小时,用FACS定量表达绿色荧光蛋白 (EGFP)的细胞百分比。B.代表性荧光图像(下排),获得于转染后48小时。 C.通过计算荧光图像和明场图像来确定用10μM RA处理的EGFP阳性(+) 和阴性(-)的Neuro2A细胞(原始型和分化型)的百分比。轴突是细胞体长度两倍的细胞被认为是分化型。数据显示为平均值±标准误差,n=4。
图6示出显微图片和直方图,其显示分化后不影响复合物的内化。A.使用温和的离心,用罗丹明-pDNA复合物(N/P=20)转染原始的或分化的 Neuro2A和NG-108细胞。孵育4小时后,拍摄用0.4%台盼蓝淬灭前和淬灭后的细胞图像。标尺代表10μm。B.复合物转染后,在多个时间点用pAA/DNAse (脱氧核糖核酸酶)处理细胞以去除细胞外的pDNA。通过qPCR定量内化 DNA前,用胰酶消化并用pAA/尿素裂解缓冲液处理细胞。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图7示出数据,其显示在原始而非分化的神经元细胞中,PKC参与复合物摄取。A.转染前用2.5μg/ml的咖马林、5μg/ml的菲律宾菌素III(Filipin III) 或30μg/ml的Dynasore处理原始的和分化的(10μM RA)Neuro2a 45分钟。用DMSO/0.5%FBS用作对照进行处治。用复合物(N/P=20)转染后,细胞在4℃或37℃孵育4小时。通过pAA/DNAse去除细胞外的pDNA,并用胰酶消化细胞。然后,用pAA/尿素裂解缓冲液处理样品,并用qPCR定量pDNA 的绝对拷贝数。在相似的实验中,转染后,原始的Neuro2A细胞于37℃孵育 24小时。B.代表性荧光图像(下排),获得于转染后48小时。C.计算表达EGFP 细胞的百分比。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。数据显示平均值±标准误差,n=4。*,p<0.05;**,p<0.005.
图8.示出显微图像和柱状图,其显示复合物在原始的和分化的神经元细胞中定位不同。A.在离心转染的步骤,使用LPEI/FITC-pDNA(N/P=20)转染原始的和分化的(10μMRA)Neuro2A细胞。转染4小时后,加入淬灭剂 EtBr(20μg/ml)。拍摄用EtBr淬灭前和淬灭后的细胞图像。标尺代表5μm。 B.以N/P=20,用预先复合的LPEI/FITC-pDNA或罗丹明-pDNA转染细胞。在转染后4或24小时,用EtBr或台盼蓝淬灭细胞外荧光后,获得与标记的DNA 有关的细胞百分比。计算原始的和分化的Neuro2A细胞中FITC/罗丹明 (FITC/Rho)的比例。C.用LPEI/罗丹明-pCDNA(N/P=20)转染原始的和分化的Neuro2A细胞后4小时,去除培养介质并重新添加含有含有50nM Lysotracker green DND-26的1×PBS,在使用共聚焦显微镜观察前孵育5分钟。在100×放大倍数下拍摄单细胞的图像。星号表明复合物与被标记区室共定位。D.分析罗丹明和lysotracker green DND-26的共定位像素。数据显示为平均值±标准误差,n=20。
图9观察数据显示DOPE/CHEMS促进复合物逃离内体,显著提高转染。 A.在离心转染的步骤,使用LPEI/pDNA(N/P=20)转染RA分化的Neuro2A 细胞。转染后,将在HEPEs中预先复合的DOPE/CHEMS(9:2摩尔比)迅速加入到培养基中。24小时后,通过计算荧光和明场图像分析转染效率。轴突两倍于细胞体长度的EGFP阳性细胞的百分比表示为组平均值±标准误差 (n=4)。B.代表图像拍摄于孵育结束时。C.通过LPEI/罗丹明-pDNA(N/P=20) 转染原始的和分化的Neuro2A细胞。然后,转染后4小时,用lysotracker green 标记酸性区室。在100×放大倍数下拍摄单细胞图像。D.分析共定位的像素。数据表示为组平均值±标准误差(n=20)。
图10示出直方图和显微照片,其显示复合物逃离内体后,增强的转运显著地改善了转染。A.在离心转染的步骤,使用LPEI/pDNA(N/P=20)转染原始的和分化的Neuro2A细胞或原代皮层神经元(DIV3)。A.对于分化的 Neuro2A,在存在/不存在DOPE/CHEMS时,转染1小时后加入Tubastatin A (5μM),并进一步孵育24小时。对于原始的Neuro2A(黑色标尺),计算总细胞数。对于分化的Neuro2A(灰色标尺),计算轴突两倍于细胞体长度的细胞。数据表示为组平均值±标准误差(n=4)。转染分化的细胞的代表性图像 (20×放大倍数)(左列)。B.原代皮层神经元最初暴露于复合物,随后是含有多种DOPE/CHEMS和Tubastatin A(16μM)组合的neurobasal介质。24 小时后结束处理,细胞进一步在新鲜的neurobasal介质中孵育48小时。通过 FACS定量转染效率,并表示为平均值±标准差(n=3)。显示代表性的图像(20×放大倍数)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。*,p<0.05; **,p<0.005。
图11示出直方图,其显示增加N/P比例降低细胞存活率。用 pIRES-EGFP-EV71与LPEI复合,以多种N/P比例转染原始的或分化的 A.Neuro2A和B.NG-108细胞。在快速转染中,将细胞暴露于转染混合物4小时。在新鲜的介质中孵育48小时后通过MTS测定细胞存活率。数据点表示为对照(N/P=0)的百分比和组平均值±标准误差。(n=6)。使用双尾学生t检验来计算细胞活力与对照的显著差异。*,p<0.05;**,p<0.005.
图12示出直方图,其描述温和的离心改善了转染效率。在不同的时间,用LPEI/pDNA以A.N/P=20和B.多种N/P比例转染Neuro2A细胞,孵育结束后离心或不离心。转染48小时后,用FACS定量EGFP阳性细胞的百分比。数据显示平均值±标准误差,n=4。
图13示出散点图和显微照片,其显示复合物聚集并沉积于DMEM中。 A.25分钟的利用动态光散射测量的复合物在HEPES或DMEM中尺寸增长的动力学分析。B.制备LPEI/FITC-pDNA(N/P=20),并在HEPES或DMEM中孵育15分钟。在不存在或存在Neuro2A细胞时,离心转染混合物。表示的 DIC和荧光的叠加图像。标尺代表10μm。
图14示出显微照片,其描绘在低毒性条件下,温和的离心和短时间的孵育产生高转染效率的数据。A.用离心转染的步骤,用LPEI/pDNA以多种N/P 比例转染原始的或分化的A.Neuro2A和B.NG-108细胞。转染48小时后,分别用细胞存活率试验和FACS测量细胞活力和转染效率。转染效率和细胞存活率分别显示为平均值±标准误差(n=4)和平均值±标准误差(n=6)。
图15示出柱状图和凝胶电泳图像,其pAA/尿素裂解缓冲液有效地解离复合物。A.用qPCR定量不同溶液(水、pAA、尿素裂解缓冲液和pAA/尿素裂解缓冲液)中的质粒(106拷贝),并用对照(pDNA于水中)标准化。所用裂解溶液不影响qPCR的扩增效率。在95℃用pAA/尿素裂解缓冲液或水处理不同N/P比例的LPEI/pDNA 30分钟。数据显示为平均值±标准误差(n=3)。
图16示出直方图,其显示神经元分化后,复合物的细胞结合不受影响。通过离心转染的步骤,使用LPEI/pDNA(N/P=20)转染A.Neuro2A和 B.NG-108。在不同的时间点收获细胞并用pAA/尿素裂解缓冲液处理细胞。使用实时qPCR定量与细胞有关的pDNA绝对拷贝数。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图17示出明场图像,台盼蓝有效地淬灭标记DNA的表面结合LPEI-Rho 复合物。LPEI/罗丹明-pDNA复合物(N/P=20)首先沉积到Neuro2A细胞上。下一步,转染混合物更换为冰冷的完全介质,且进一步于4℃孵育4小时。然后加入台盼蓝。拍摄用0.4%台盼蓝淬灭前和淬灭后的细胞图像。在4℃,内化被抑制,标记DNA的表面结合荧光被有效地淬灭。标尺代表20μm。
图18示出柱形图和荧光图像,其显示DNAse有效地去除表面结合复合物。A.离心后,在DMEM中预先复合的LPEI/pDNA(N/P=20)沉积到Neuro2A 细胞上。细胞在4℃或37℃孵育4小时,用DMEM中的pAA/DNase去除细胞外pDNA。2小时后,用胰酶消化来收获细胞并用pAA/尿素裂解缓冲液处理细胞,然后通过qPCR定量内化的DNA。数据显示为平均值±标准误差, n=4。B.复合物沉积后,用PBS洗涤培养孔一次,并重新添加DMEM(有或没有pAA/DNAse)。用Sybr Green I(1xPBS中)染色并孵育5分钟来观察表面结合复合物。用1xPBS洗涤后在10×放大倍数下拍摄图像。示出代表性图像。
图19示出荧光图像,其显示PKC抑制剂显著地降低转染。转染前, Neuro2A细胞用(2μM)处理45分钟。转染混合物(N/P=20的 LPEI/pDNA)换成含有0.5%FBS和(2μM)的DMAE。示出代表性的图像(拍摄于转染后24小时)。
图20示出观察数据的直方图和荧光图像,其显示在原始的而非分化的神经元细胞中,PKC参与复合物的摄取。A.转染前用咖马林、菲律宾菌素III 或Dynasore处理原始的和分化的NG-108(10μM FSK)45分钟。用DMSO/0.5% FBS用作对照进行处理。转染后(N/P=20的LPEI/pDNA),细胞在4℃或37℃孵育4小时。通过pAA/DNAse去除细胞外的pDNA,并用胰酶消化细胞。然后,用pAA/尿素裂解缓冲液处理样品,并用qPCR定量pDNA的绝对拷贝数。在相似的实验中,转染后,原始的NG-108细胞在37℃孵育24小时。B.示出代表性图像,C.通过手动细胞计数获得表达EGFP的细胞百分比。数据显示为平均值±标准误差,n=4。
图21示出显微图像,其描绘了分化的而非原始的神经元细胞中 FITC-pDNA的荧光被淬灭。A.用LPEI/FITC-pDNA(N/P=20)转染原始的和分化的(10μM FSK)NG-108细胞。转然4小时后,加入淬灭剂EtBr(20μg/ml)。拍摄用EtBr淬灭前和淬灭后的细胞图像。标尺代表5μm。B.用预先复合的 LPEI/FITC-pDNA或罗丹明-pDNA转染细胞。在转染4或24小时后,用EtBr或台盼蓝淬灭细胞外荧光后,获得与标记pDNA有关的细胞百分比。在原始的和分化的NG-108细胞中计算FITC/Rho的比例。数据显示为平均值±标准误差,n=20。
图22示出数据,其描绘了原代皮层神经元中FITC-pDNA的荧光被淬灭。 A.用LPEI/FITC-pDNA(N/P=20)转染原代皮层神经元。转然4小时后,加入淬灭剂EtBr(20μg/ml)。拍摄用EtBr淬灭前和淬灭后的细胞图像。标尺代表5μm。B.用预先复合的LPEI/FITC-pDNA或罗丹明-pDNA转染细胞。在转染4或24小时后,用EtBr或台盼蓝淬灭细胞外荧光后,获得与标记pDNA 有关的细胞百分比。计算原代皮层神经元中FITC/Rho的比例。数据显示为平均值±标准误差,n=20。
图23示出直方图,其显示复合物在原始的和分化的神经元细胞中定位不同。在离心转染的步骤,使用LPEI/罗丹明-pDNA(N/P=20)转染原始的或分化的(10μM FSK)NG-108细胞。4小时后,去除培养介质并重新添加含有50nM的Lysotracker green DND-26的1×PBS,并在使用共聚焦显微镜观察前孵育5分钟。在100×放大倍数下拍摄单细胞的图像。分析罗丹明和 lysotracker green DND-26的共定位像素点。数据显示为平均值±标准误差,n=20。
图24示出直方图,其观察到神经元分化后酸性区室数量增加。原始的和分化的(10μM RA)Neuro2A在含有Lysotracker Green的PBS中孵育。标记的酸性区室的所有像素通过加和(所有细胞)多层光切(Z-stack)图像获得。使用双尾学生t检验来计算全部像素点/细胞的显著差异。数据显示每种表型的平均值±标准误差,n=20。**,P<0.005。
图25示出显微图像,其描述了加入DOPE/CHEMS后,发生标记的pDNA 的内体释放。用LEPI/罗丹明-pDNA复合物(N/P=20)转染分化的Neuro2A 细胞,并且进一步孵育4小时。然后,加入lysotracker green和DOPE/CHEMS,连续拍摄图像20分钟。实时跟踪显示复合物从酸性区室释放(用星号表示)。测量标尺代表5μm。
图26示出直方图,其描述了DOPE/CHEMS是时间依赖性的作用。使用 LPEI/pDNA(N/P=20)转染分化的(10μM RA)Neuro2A细胞。在转染后不同的时间点加入DOPE/CHEMS。孵育24小时后,通过荧光和明场图像分析计算EGFP+细胞的转染效率。轴突两倍于细胞体长度的EGFP阳性细胞的百分比数据表示为平均值±标准误差(n=4)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。**,p<0.005。
图27示出柱形图,数据表明商业试剂未显示转染的累积提高。使用预先复合的LPEI/pDNA(N/P=20)转染分化的(10μM RA)Neuro2A细胞。转染后,加入氯喹(25μM或100μM)、PLUS试剂(10μL或20μL)或INF7融合肽(10μg或20μg)。孵育48小时后,通过荧光和明场图像分析计算EGFP+ 细胞的转染效率和细胞存活率。轴突两倍于细胞体长度的EGFP阳性细胞的百分比数据表示为平均值±标准误差(n=3)。使用双尾学生t检验来计算与对照(仅复合物)相比细胞活力的显著差异。*,p<0.05,**,p<0.005。
图28示出柱形图,其显示LPEI/融合肽试剂-pDNA复合物不对转染产生显著的改进。与LPEI(N/P=20)形成复合物前,质粒DNA(2μg)与PLUS 试剂(10μL或20μL)或INF7融合肽(10μg or 20μg)孵育15分钟。使用复合物转染分化的(10μM RA)Neuro2A细胞。孵育48小时后,通过荧光和明场图像分析计算EGFP+细胞的转染效率和细胞存活率。轴突两倍于细胞体长度的EGFP+阳性细胞的百分比数据表示为平均值±标准误差(n=3)。使用双尾学生t检验来计算细胞活力与对照的显著差异。**,p<0.005。
图29示出柱状图,用DOPE/CHEMS和Tubastatin A孵育获得高的转染效率的最短时间。使用LPEI/pDNA(N/P=20)转染分化的(用20μM RA刺激)Neuro2A。用DOPE/CHEMS和Tubastatin A(5,10或20μM)处理细胞 6、8或12小时。通过更换完全介质来去除化学物质,细胞进一步孵育养48 小时。通过荧光和明场图像来计算EGFP+细胞的转染效率。数据表示为组平均值±标准误差(n=3)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。 *,p<0.05。
图30示出直方图,其描述了DOPE/CHEMS和Tubastatin A提高转染效率是一些但非所有阳离子载体所介导的。使用LPEI/pDNA(N/P=20)、 PAMAM/pDNA(N/P=10)、XtremeGeneHP/pDNA(3μL:1μg的pDNA)和 Fugene HD(1.5μL:1μg的pDNA)转染未分化的和分化的(10μMRA) Neuro2A。用DOPE/CHEMS、Tubastatin A(10μM)或DOPE/CHEMS和 Tubastatin A(10μM)处理细胞12小时。对照表示细胞仅暴露于DNA复合物。更换为完全介质来去除化学物质,细胞进一步孵育养48小时。通过荧光和明场图像来计算EGFP+细胞的转染效率。数据表示为组平均值±标准差。 (n=3)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。*,p<0.05。
图31.示出图标,其描述了Trichostatin A提高转染的数据。使用 LPEI/pDNA(N/P=20)转染分化的(10μM RA)Neuro2A细胞。在存在 DOPE/CHEMS时,转染1小时后加入Trichostatin A(50和100nM)。24小时后,通过计算荧光和明场图像获得孵育24小时后的EGFP+细胞的转染效率。轴突两倍于细胞体长度的EGFP阳性细胞的百分比数据表示为平均值±标准误差(n=3)。
图32示出直方图,其显示在原代皮层神经元中DOPE/CHEMS和 Tubastatin A产生高的转染效率和低毒性。在离心转染的步骤,使用 LPEI/pDNA(N/P=20)转染原代皮层神经元。细胞在含有DOPE/CHEMS和 Tubastatin A(16μM)neurobasal介质中孵育24小时。用新鲜的Neurobasal 介质更换来去除化学物质,并将细胞进一步孵育24小时。通过计算每个明场图像中所有细胞数来获得细胞存活率,并用对照(没有DOPE/CHEMS和 Tubastatin A)进行标准化。数据表示为组平均值±标准误差(n=4)。B.转染 1、2和3h后,在DOPE/CHEMS存在时,迅速地向原代皮层神经元培养物中加入Tubastatin A(16μM)。48小时后,通过FACS定量转染效率,并表示为平均值±标准差(n=3)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。*, p<0.05;**,p<0.005。
图33示出显微照片,其表明HDAC6抑制和紫杉醇处治导致微管蛋白乙酰化。分化的Neuro2A细胞(用10μM的RA预处理)暴露于HDAC抑制剂 2小时,然后用4%甲醛固定细胞,并共染色乙酰化的α微管蛋白和β微管蛋白。所述HDAC抑制剂如Tubastatin A(10μM)、TSA(50nM)、紫杉醇(25nM), SAHA。(5nM),Entinostat(10μM),或Tacedinaline(50μM)。示出单独和叠加通道的共聚焦图像,标尺代表20μm。进一步地,给出一个表格,其给出试剂和相应的靶标,及其进行实验时的浓度。
图34示出数据,其显示用DOPE/CHEMS和HDAC6靶向抑制剂处理,产生前所未有的转染效率。在离心转染的步骤,使用LPEI/pDNA(N/P=20) 转染分化的神经元细胞。然后,细胞暴露于DOPE/CHEMS和Tubastatin A (10μM),TSA(50nM)、紫杉醇(25nM)、SAHA(5μM)、Entinostat(10μM) 或Tacedinaline(50μM)12小时。细胞暴露于DOPE/CHEMS作为对照。48小时后,通过FACS定量转染效率,并表示为平均值±标准差(n=3)。使用双尾学生t检验来计算转染效率的显著差异。*,p<0.05;**,p<0.005。
图35示出显微照片,其显示Tubastatin A对微管蛋白乙酰化瞬时作用。用Tubastatin A(10μM)处理Neuro2a细胞12小时。然后,通过用完全介质更换来去除化学物质,并将细胞进一步孵育48小时。在不同时间点,用4%的甲醛固定细胞并对乙酰化的α微管蛋白(绿色)和细胞核(赫斯特染色,蓝)进行染色。示出代表性的图像。标尺代表20μm。
图36示出数据,其表明LPEI介导的转染不影响轴突生长。在存在和不存在DOPE/CHEMS和Tubastatin A(10μM)的时,用LPEI-pDNA(N/P=20) 转染Neuro2A细胞。转染12小时后,去除细胞培养介质并更换为含有1%FBS 的DMEM。6小时后,用10μM RA/1%FBS/DMEM刺激神经元分化。孵育 48小时后,用4%的甲醛固定细胞,并对细胞核(赫斯特染色,蓝)和imperial 蛋白染色(imperial protein stain)。A示出代表性图像的显微照片。标尺代表50μm。B.示出显示平均轴突长度的直方图,其用HCA vision测量,并表示为平均像素点±标准误差(n=80-100,重复四次)。
图37示出各种线状图表,其描绘了洗去DOPE/CHEMS和Tubastatin A 后,总体代谢的恢复。存在或不存在DOPE/CHEMS和Tubastatin A(10μM) 时,用LPEI-pDNA(N/P=20)转染Neuro2A细胞。负对照表明没有用实验处理。转染12小时后,通过用新鲜的完全介质更换来去除化学物质。在4、24 和48小时后收集细胞,并用LC/MS分析各种通路,包括A.TCA循环,B.糖酵解,C.糖原代谢,D.核苷酸代谢,E.磷脂合成和F.色氨酸代谢。在每个时间点,将负对照(C)、暴露于复合物的细胞(P)和同时暴露于复合物、 DOPE/CHEMS和Tubastatin A(T)各收集四份。每种代谢物以ATP标准化读数后,获得与阴性对照相比的相对倍数变化,表示为平均值±标准差。(n=4)。使用双尾学生t检验来计算相对倍数变化的显著差异。*,p<0.05。
图38示出直方图,其显示与复合物沉淀有关的数据。LPEI/pDNA(各种 N/P比例)在DMEM中孵育15分钟或4小时。在孵育结束时,离心一些样品和随后用pAA/尿素的裂解缓冲液处理所有样品。用qPCR定量上清液中 pDNA的量(用对照进行标准化,其中N/P=0)。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图39示出实验设计示意图,其表示测试聚集的复合物对转染的贡献。存在或不存在Neuro2A细胞时,离心DMEM中预先复合的LPEI/pDNA(NP=20) (通过或不通过0.22微米过滤)。用完全介质更换为转染混合物,并孵育48 小时。用流式细胞术定量转染效率。
图40示出柱形图,其描述聚集的复合物介导的有效转染。A.利用bolus 或沉积介导的转染步骤,用DMEM中预先复合的LPEI/pDNA(N/P=20)(过滤或不过滤)转染Neuro2A细胞。48小时后,用FACS定量转染效率。数据显示为平均值±标准差,n=3。B.通过沉积介导的转染的步骤,将各种量的 pDNA与LPEI复合,以N/P=0、10、20来转染Neuro2A细胞。孵育48小时后,用FACS定量转染效率。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图41示出用0.22μM过滤器去除聚集的复合物的数据。过滤在HEPEs中预先复合的LPEI/pDNA(N/P=20)。之后,浓缩的DMEM(18×)加入到滤液中至终浓度为1×DMEM,并孵育15分钟。之后将混合物(过滤的和未过滤的)加入到铺有Neuro2A细胞的细胞培养板并离心。不使用过滤液转染细胞(嵌入)。48小时后,用FACS定量转染效率。数据显示为平均值±标准差, n=4。此外,示出进行实验的示意图。
图42以直方图的形式示出数据,其表明LPEI/pDNA在DMEM中广泛地聚集的。LPEI/pDNA(NP=20)在25mM HEPES或DMEM中,孵育15分钟。有或没有过滤(HEPES或DMEM)的、在HEPES中被加入至18×DMEM的、有或没有第二步过滤的(HEPES+18×DMEM)的,用pAA/尿素裂解缓冲液处理后,通过qPCR定量pDNA的绝对拷贝数。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图43示出直方图,数据表明pDNA未有效地从表面结合聚合体释放。在存在或不存在Neuro2A时,离心LPEI/pCDNA(N/P=20)转染混合物,并重新添加完全介质。在多个时间点,胰酶消化收获细胞并收集上清液。然后用 pAA/尿素裂解缓冲液处理样品。用qPCR定量pDNA的绝对拷贝数,并用对照(N/P=0)标准化。数据显示为平均值±标准误差,n=3。
图44示出在增强基于聚合物的转染中TrafEnTM的作用。这在不同的细胞和细胞类型中进行了测试,如人神经胶质瘤/乳腺癌细胞系、人类间质干细胞 (hMSC)、鼠Abelson白血病病毒诱导的肿瘤细胞(RAW264.7)、人类前列腺癌细胞(PC3)、人黑色素瘤细胞(M14)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。用PEIMAX/2μg PMAXGFP(LONZA)转染细胞。转染后,在存在或不存在 TrafEnTM试剂的培养介质中孵育细胞。四十八小时后,用FACS分析或半自动细胞计数的ImageJ分析GFP+细胞。直方图表示GFP+细胞的百分比和,误差标尺表示三次生物重复样本和双次技术重复样本的标准误差(S.E.M)。示出代表性的图像(蓝色:细胞核;绿色:GFP)。
图45示出TrafEnTM在基于聚合物的转染增强中的作用。用与不同的转染试剂转染复合的EV71-pIRES-eGFP表达工具转染MEF和M14细胞。使用 MI和IP两种实验方法进行转染。MI参考制造商的说明书。IP参考内部实验方法,其在说明书中描述为沉积介导的转染,如图39。IP+TrafEnTM参考TrafEn TM试剂在转染后在培养介质中的加入。此直方图表示每种程序中GFP+细胞的百分比(%),每种程序使用不同的转染试剂。
图46示出直方图,其描述有效的PTB1基因抑制。用Scramble 30012(对照)、和PTBshRNA(即TR302218A 8865(1)、TR302218B 8866(2)、 TR302218C 8867(3)或TR302218D8868(4)转染HeLa细胞。在存在或不存在TrafEnTM(DOPE/CHEMS+10μM Tubastatin A)时,用PEIMAX(N/P=10) 递送所述shRNAs。处理后3天收获细胞用于qPCR分析。图表表示,用GAPDH标准化后,PTB1相对于对照的倍数变化。
图47示出显微照片,其描述了有效的PTB基因抑制导致快速的转分化。用Scramble30012(对照)、PMAXGFP(对照)、和TR302218C 8867转染 Hela细胞。在存在或不存在TrafEnTM(DOPE/CHEMS+10μM Tubastatin A)时,用PEIMAX(N/P=10)递送所述shRNAs。转染后,用嘌呤霉素处理细胞,并在N3培养介质中培养(用于神经元细胞的介质)。图像拍摄至8天。然后,用4%的甲醛固定细胞,并用Tuj抗体染色。
图48示出图表,其表示显示低/高表达细胞百分比和全部GFP+细胞的百分比(%)。另外,表示FACS分析和每种条件下转染细胞的代表性图像。误差标尺表示标准误差(S.E.M.),n=3。采用双尾学生t检验得到 DOPE/CHEMS+SAHA和DOPE/CHEMS或SAHA处理的细胞之间转染效率的统计学显着性,*,P<0.01DOPE/CHEMS和SAHA或Tubastatin A在转染增强中的组合作用。在不存在或存在DOPE/CHEMS和/或HDACi(10μM Tubastatin A,5μMSAHA)时,用1.5μg的PMAXGFP复合的PEIMAX以N/P=10 转染U251MG细胞。转染24小时后,培养基更换为有或没有SAHA/Tubastatin A的新鲜培养介质,并进一步培养48小时。下一步,收集细胞并通过FACS 分析对GFP表达进行分析。
图49示出荧光显微照片和直方图,其显示p53和转染增强子间的协同作用。用1.5μg的PMAXGFP或pEGFP-N1-p53(p53)转染细胞。转染后,将转染增强子(DOPE/CHEMS[D]和5μMSAHA)加入到培养介质。转染24小时后,培养介质更换为有或没有SAHA的新鲜培养介质,并进一步培养48 小时。然后用4%的甲醛固定细胞,并用Hoechst 33342染色。拍摄荧光图像,并用Image J计算细胞核数量。活细胞的百分比表示细胞相对于负对照(-ve) 的百分比。下排包含来自每种条件的代表性图像。误差棒表示均值标准误差 (S.E.M.),n=3。进行未配对的学生t-检验来检验用P53、D和SAHA处理的细胞之间的统计显著性。**,p<0.001。
图50示出图表,其描述了活细胞的百分比,以及这些细胞的荧光图像,显示U251MG细胞与SAHA的孵育延长后,其不增加细胞的死亡。用 pEGFP-N1-p53(p53)转染细胞。转染后,将转染增强子(DOPE/CHEMS和 5μM SAHA)加入到培养介质。细胞进一步地用SAHA处理48、72和96小时。下一步,用4%甲醛固定细胞并用Hoechst 3334染色。拍摄荧光图像,并用Image J计算细胞核数量。活细胞的百分比表示细胞相对于用p53转染的细胞的百分比。下排包含来自每种条件的代表性图像。进行未配对的学生t-检验来检验用SAHA处理48、72和96小时的细胞之间的统计显著性。**, p<0.001。
图51示出图表和相应的荧光图像,其显示p53与SAHA,而非与Tubastatin A的协同细胞毒性作用。用PMAXGFP或pEGFP-N1-p53(p53)转染细胞。转染后,将转染增强子(DOPE/CHEMS[D]、10μM Tubastatin A[T]和5μM SAHA)分别地或组合地加入到培养介质中。培养介质更换为有或没有 Tubastatin A或SAHA的新鲜培养介质,并进一步孵育48小时。然后用4%的甲醛固定细胞,并用Hoechst 33342染色。拍摄荧光图像,并用Image J计算细胞核数量。活细胞的百分比表示细胞相对于用PMAXGFP转染的细胞的百分比。下排包含每种条件的代表性图像。误差标尺表示均值标准误差(S.E.M.), n=3。进行未配对的学生t-检验来检验两种处治条件之间的统计显著性。**, p<0.001.
图52示出荧光照片和直方图,其描述了在TMZR-U251MG和GSC中, p53与SAHA诱导显著的细胞死亡的协同作用。在存在和不存在 DOPE/CHEMS[D]和SAHA时,用PMAXGFP和pEGFP-N1-p53(p53)单独地或组合地转染(A)TMZR-U251MG和(B)GSC细胞。转染后22小时,TMZR-U251MG细胞介质更换为有或没有SAHA的DMEM/10%FBS/40μM TMZ,GSC的更换为有或没有SAHA的DMEM/血清。细胞进一步地孵育48 小时。用4%甲醛固定细胞并用Hoechst 3334染色。用Image J分析图像。示出代表性图像。图表表示相对于仅暴露于DOPE/CHEMS的对照细胞(负对照 +D)的细胞百分比的平均。误差标尺表示均值标准误差(S.E.M.),n=3。进行未配对的学生t-检验来检验p53转染的细胞和对照之间的统计显著性。**, p<0.001。
图53示出荧光显微照片和直方图,其显示DOPE/CHEMS和Trichostatin A(TSA)对在转染提高中的作用。在不存在或存在DOPE/CHEMS和/或 HDACi(100nM Trichostatin A)时,用1.5μg的PMAXGFP复合的PEIMAX 以N/P=10转染人胚U251MG细胞。转染24小时后,培养介质更换为有或没有Tubastatin A的新鲜培养介质,并进一步培养48小时。下一步,收集细胞并通过FACS分析对GFP表达进行分析。图表表示GFP+细胞的百分比。误差标尺表示均值标准误差(S.E.M.),n=3。使用双尾学生t检验获得仅暴露于复合物的和其他条件的细胞之间转染效率的统计显著性,*,p<0.01。表示每种条件下转染细胞的代表性图像。
图54示出直方图,其描述了各种处理条件下,BMP2在人MSC中的表达水平。用PMAXGPF(对照)或PMAXGFP-BMP2(BMP2)复合的PMAXGFP 以N/P=10转染人胚MSC细胞,所述BMP2为人BMP2,被克隆到载体上。转染后,用有或没有DOPE/CHEMS、5μM Tubastatin A和150nM TSA单独地或组合地处理细胞。转染后24小时,细胞培养介质置换为含有HDACi的新鲜培养介质。孵育48小时后,胰酶消化细胞,并用RNeasy Mini Kit(Qiagen) 收集全部RNA以避免DNA污染。反转录一微克(μg)全部RNA,并用qPCR 测量BMP2的表达。BMP2的阈值循环(Cts)用管家基因GAPDH标准化。用PEIMAX/PMAXGFP转染细胞作为负对照(对照)。图表表示相对于负对照, BMP2表达的倍数变化。误差标尺表示平均值的均值标准误差(n=3)。进行未配对的学生t-检验来检验两种处理条件之间的统计显著性。*,p<0.01.
图55示出孵育至21天时,人MSC中GFP表达的明场和荧光图像。用 PEIMAX/PMAXGFP复合物以N/P=10转染人胚MSC细胞。转染后,培养介质更换为有或没有DOPE/CHEMS和150nMTSA的新鲜培养介质。转染3天后,培养基更换为新鲜培养基。在转染2、7、14和21天后,拍摄明场和荧光图像。示出代表性的图像。
图56示出转染后3至21天的MSC细胞的明场图像。用PEIMAX介导的PMAXGFP或PMAXGFP-BMP2递送转染MSC细胞。转染后,用 DOPE/CHEMS和150nM TSA单独地或组合地处理细胞。转染72小时后,培养介质更换为(A)expansion media alpha-MEM/10%FBS(B)成骨分化培养介质(α-MEM补充10%FBS、10mMβ-甘油磷酸酯(glycerophosphate)、10nM 地塞米松和0.2mM抗坏血酸。然后进一步细胞孵育,并每3天更换各自的培养介质。
图57示出显微图像(明场或荧光),以及柱形图和FACS分析图表,其显示DOPE/CHEMS和SAHA或Tubastatin A在转染提高中的组合作用。在不存在或存在DOPE/CHEMS[D]和/或HDACi(20μM Tubastatin A[T], 5μMSAHA)时,用1.5μg的PMAXGFP复合的PEIMAX以N/P=20转染PC3 细胞。转染24小时后,培养基更换为有或没有SAHA/Tubastatin A的新鲜培养介质,并进一步孵育48小时。下一步,收集细胞并通过FACS分析对GFP 表达进行分析。柱形图,表示GFP低/高表达的细胞百分比和全部GFP+细胞的百分比(%)。表示FACS分析和每种条件下转染细胞的代表性图像。误差棒表示均值标准误差(S.E.M.),n=3。
图58示出直方图,其描述了各种处理条件下,GM-CSF在PC3中的表达水平。用PMAXGPF(对照)或PMAXGFP-GM-CSF(人GM-CSF克隆至 PMAXGPF载体,GMCSF)复合的PMAXGFP以N/P=20转染人PC3细胞。转染后,用有或没有DOPE/CHEMS[D]和5μM SAHA单独地或组合地[TrafEnTM]处理细胞。转染24小时后,细胞培养介质分别地更换为含有HDACi 的新鲜培养介质。孵育48小时后,胰酶消化细胞,并用RNeasy Mini Kit (Qiagen)分别地收集全部RNA以避免DNA污染。反转录一微克(μg)全部RNA,并用qPCR测量GM-CSF的表达。GM-CSF的阈值循环(Cts)用管家基因GAPDH标准化。未转染的细胞作为对照(Ctrl)。
图59示出直方图,观察到在PC3细胞中,SAHA诱导MICA和NKG2D 上调。用5μM SAHA处理人PC3细胞(前列腺癌)8、20和48小时(hr)。孵育结束时,收集细胞并进行PCR分析。未暴露于SAHA的细胞(阴性8小时)作为对照。直方图表示用GAPDH标准化后,相对于对照的倍数变化。
图60示出用于HaF转染的高的N/P比例。利用沉积介导的转染实验方法,用PEIMAX/2μg PMAXGFP以各种N/P比例转染细胞。四十八小时后,胰酶消化细胞并用流式细胞术分析。示出表达GFP细胞的百分比,误差表示标准差(S.D.),n=3。
图61示出数据,其显示高转染导致HaF有效的重编程。(A)用与PEIMAX (N/P=50)、Lipofectamine或Satisfection复合的2μg PMAXGFP来转染成纤维细胞。四十八小时后,胰酶消化细胞并用流式细胞术分析。图表表示平均的GFP+细胞百分比(n=3)。示出GFP+细胞的荧光图像。(B、C)用与PEIMAX 复合的2μg的PMAXGFP或聚顺反子性的OSKM(Addgene:20328)以N/P=50 来转染成纤维细胞。下一步,转染混合物更换为有或没有TrafEnTM(DOPE/CHEMS+10μM Tubastatin A)的培养介质。两天后,培养介质更换为新鲜的培养介质(10%FBS/DMEM)。孵育24小时后,用Qiagen RNAeasy kit分离全部RNA,并进行qPCR分析。图表表示,用GAPDH标准化后,OSKM 相对于对照(用PMAXGFP转染细胞)的表达。对第二组实验,细胞进一步孵育7天。实验结束时,用4%的甲醛固定细胞,并用Oct4抗体染色。
图62.示出直方图,表明在HaF中,VPA诱导KLF4和c-Myc上调。用 1mM VPA处理成纤维细胞至3天。孵育结束时,收集细胞并进行PCR分析。未暴露于VPA的细胞(3天)作为对照。图表表示,用GAPDH标准化后,相对于对照的倍数变化。
具体实施方式
实施例1:在神经元细胞中温和离心改善转染效率并降低细胞毒性。
为建立用于神经元细胞转染的最佳实验方法,、大量转染的细胞毒性是首先被研究的,其中细胞被暴露于确定的复合物的组合物一段时间。发现即使在血清存在的情况下,增加复合物的N/P比例会降低原始的Neuro2A和 NG-108细胞的细胞存活率(图11)。我们假设在高N/P比例下的细胞毒性是由于延长细胞暴露于毒性游离聚合物,缩短孵育时间应该降低毒性。然而,较短的孵育时间显著地降低转染效率(15min或1h,图12a)。先前报道温和离心提高转染。接着,探索该方法,试图在短的孵育时间改善转染。如假设,更短的温育(15min),结合温和的离心产生堪比大量转染的转染效率(图12b)。如以前报道的,发现LPE/pDNA复合物广泛地聚集并沉积于含盐的生理介质中(图13),其可以解释转染中温和离心的有益作用。
实施例2:复合物形成聚集体并通过温和离心沉淀。
预期地,动态光散射研究表明,当置于DMEM中时,纳米级LPEI/pDNA (~100nm)的尺寸迅速增加(图13a),与在高盐条件下低胶体稳定性和聚集体的形成相一致。(Wightman,L.,et al.J Gene Med,2001.3(4):p.362-72; Mishra,S.,P.Webster,and M.E.Davis.EurJ Cell Biol,2004.83(3):p.97-111)。这些大的聚集体随时间的沉积可能说明当PEI/pDNA复合物在达尔伯克(氏) 必需基本培养基DMEM(而非HEPES)中孵育后,细胞培养板的表面上存在不同的颗粒(图13b)。即使不存在细胞时,在培养孔的表面上观察到这些大的异质性的颗粒(>0.5μm),排除了细胞的人工制品的可能性。为了定量上清液中的pDNA的量,pDNA高效地从复合物上释放并通过qPCR测量。离心后,上清液中的pDNA的量显著减少,表明DMEM中复合物的沉积(图38)。总的来说,这些观察结果都说明聚集的复合物随时间沉积到在基质上,并且这些聚集体的沉积通过温和离心增强。
实施例3:离心提高转染导致基因有效地递送至原始的而非分化的神经元细胞内。
然后该方法应用于转染分化的Neuro2A和NG108细胞。两种细胞系被药物诱导分化,并且转染前显示完好的神经突增生(图5b)。有趣的是,与相同的原始的细胞相比,两种分化的细胞类型的转染都不佳(图5a,b)。事实上,大多数的EGFP阳性细胞呈现未分化的表型,其中发现仅约3%的EGFP阳性细胞具有两倍于细胞体长度的轴突(图5c)。增加N/P比例(从10至50)没有增加转染效率。类似于原始的细胞,观察到分化的细胞转染后的毒性可以忽略不计(图14)。总的来说,这些观察结果表明,相比于相应的原始的细胞,分化的神经元细胞难于用PEI/DNA复合物来转染。
实施例4:神经元分化后,复合物的细胞结合与内化不受到影响。
为了评估神经元分化时DNA摄取是否受到影响,通过定量实时PCR (qPCR)测量分化的和原始的细胞中与细胞有关的DNA的总量。为定量与细胞有关的pDNA的量,pDNA从复合物高效地释放,并通过定量实时PCR (qPCR)来测量(图15b,c)。用于从复合物上释放pDNA的裂解溶液不影响qPCR的反应(图15a)。随着时间DNA的可比较量(~106拷贝/细胞)与原始的和分化的细胞有关(图16),表明不论细胞的分化状态,复合物同样地关联很好。为了检测复合物是否在分化的细胞中内化,细胞用罗丹明-pDNA 转染。细胞外的复合物的荧光使用台盼蓝高效淬灭(图17)。有趣的是,在原始的和分化的细胞中,检测到的细胞内的荧光信号强度都为显著水平(图6a)。此观察通过qPCR进一步证实,显示了转染后4、24和48小时,在原始的和分化的细胞中内化的pDNA的可比较量(图6b)。qPCR测量前,细胞外pDNA 通过pAA/DNAase处治被有效地去除(图18)。这些结果表明,神经分化后聚集的复合物的细胞关联性/摄取没有显著不同。
实施例5:复合物在原始的而非分化的神经元细胞中内化,涉及PKC。
为了检验原始的和分化的细胞中复合物的摄取可能涉及不同的生化机制的假设,我们药理学地检查各种信号通路的贡献。Dynasore,发动蛋白GTPase 活性的抑制剂,显著抑制分化的和原始的Neuro2A细胞中复合物的摄取。非律宾菌素III(Filipin III),胆固醇封存剂,不影响任一表型复合物的摄取。有趣的是,Rottlerin,蛋白激酶C抑制剂,显著减少原始的而非分化的细胞的复合物的摄取(图7a)。这些抑制剂对转基因表达的影响具有类似的相关性(图 7b和c)。PKC对转染的抑制作用使用另一PKC抑制剂进一步被确认(图19)。用NG-108细胞也获得相似的观察结果(图20)。在复合物内化中,PKC的差别参与和神经元分化时细胞运输机制已改变的提示相一致。
实施例6:沉淀的复合物是可生物利用的并介导有效的转染。
粒径被认为影响内体的摄取、细胞内运输和细胞核进入,并且尺寸依赖可以由于不同的细胞类型和应用而不同。为了解决尺寸对转染的贡献,在 DMEM中预先复合的LPEI/pDNA首先通过0.22微米的过滤器。然后用过滤物转染细胞(见图39中实验设计)。有趣的是,去除转染溶液中复合物的聚集体几乎完全消除转染(图40a)。相反,HEPES中预复合的LPEI/pDNA过滤物(复合物的平均尺寸<200nm)在DMEM中孵育后可以有效地转染细胞 (图41)。另外,当HEPEs过滤物在DMEM中孵育时第二次过滤步骤消除转染。这些发现支持复合物仅在高盐培养基中聚集的假设,并且对有效的转染是关键的。平行地,过滤物中pDNA的量显著地降低,表明大的、聚集的复合物(>200nm)已经通过过滤有效地去除(图42)。下一步,测试假设表明聚集的复合物沉积在基质的表面可以有效地转染细胞。通过温和的离心,聚集的复合物首先沉淀到培养孔的表面,去除上清和培养孔用介质清洗。然后Neuro2A直接接种在这些预负载沉淀的复合物聚集体的表面。有趣的是,细胞被有效地转染,表明这些沉淀的复合物是高度可生物利用的(图40a),并且转染的细胞的百分比与复合物中pDNA的量有关(图40b)。以上观察使我们想到的问题是如此大的聚集体是如何被细胞内化。人们提议表面固定的 LPEI/pDNA复合物通过释放大量的纳米级复合物到介质来介导转染,从而允许复合物被细胞内化。为了测试表面沉积的聚集体释放大量的pDNA到介质中的假说,在培养系统中pDNA的分布被测量超过48小时。在存在或不存在细胞时,整个孵育的48h时间段内,释放入介质的pDNA的量小于培养孔中发现的pDNA总量的1%,表明pDNA没有有效地从结合聚集体的表面释放 (图43)。
实施例7:在分化的神经元细胞中,细胞内质粒DNA定位于酸性区室。
LPEI/DNA复合物和腺病毒在原代神经元中的细胞内的行为对比,表明复合物而非腺病毒,被隔离于酸性区室,可能对复合物不良的转染效率做出解释。因为发现在原始的细胞中而非分化的细胞转染是高度有效的(图5a),我们假设复合物的细胞内运输的改变可能是关键的原因。为了检验这一假设,我们利用荧光素的pH敏感特性来测定复合物的细胞内定位。
当用含有FITC-pDNA的复合物转染时,通过溴化乙锭(EtBr)淬灭细胞外荧光后,在大多数原始的细胞中观察到明显的荧光,但是在分化细胞中则显著地降低(图8a)。为确认pDNA被摄取到细胞内,含有罗丹明-pDNA的复合物(pH值不敏感的)被类似地转染到原始的和分化的细胞内。在大多数原始的和分化细胞中观察到罗丹明-pDNA;两种表型有效地内化复合物进一步支持该观察(图6)。在原始细胞中,含有FITC-或罗丹明质-pDNA的细胞百分比是可比较的,而在分化细胞中FITC/Rho比例显著降低,表明细胞内 FITC的淬火(图8b)。总之,这些数据表明复合物在分化的而非原始的细胞的酸性区室隔离。
为了检验这是否是一个普遍的现象,类似实验在分化的NG-108细胞和原代皮层神经元中进行。一致地,观察到FITC的淬火(图21和22);这表明复合物转运到酸性区室可能是分化的神经元不良转染的一个重要因素。
为了验证分化细胞中pDNA被转运到酸性区室,用共聚焦成像观察到 pDNA与lysosensor green标记的酸性区室的共定位。在Neuro2A(图8c,d) 和NG-108细胞(图23)中都观察到转染4小时后罗丹明-pDNA定位到酸性区室并随时间增加(24小时)。值得注意的是,分化细胞中,每个细胞标记的酸性区室的总像素显著提高(图24)。这些结果表明,分化的神经元中,复合物被直接地或间接地细胞内转运到酸性区室,可能部分归因于不良的的转染效率。
实施例8:复合物逃离酸性区室提高分化细胞中的转染。
人们假设,促进逃离酸性区室可以增加转染效率。加入pH敏感的 DOPE/CHEMS导致分化的神经元中的转染效率增大10倍(图9a和b)。为了探究DOPE/CHMES的膜融合作用,用标记的pDNA测定复合物转运到酸性区室。正如所料,用DOPE/CHEMS处治后,定位于酸性区室的DNA的量显著地降低(图9c和d),类似于在原始的细胞中观察到的细胞内定位。实时跟踪复合物从区室的释放(图25)清楚地表明DOPE/CHEM促进复合物逃离酸性区室的能力。此外,发现DOPE/CHEMS的作用是临时的,其中当离心后立即加入化学制品时获得最佳效果(图26)。显然,在分化的神经元中复合物定位到酸性区室导致不良的转染,其能够通过使用的膜融合脂质提高复合物的内体逃离得以改善。
另外值得注意的是氯喹,亲溶酶体的化合物,已知其通过缓冲水泡内部来抑制内体的融合以及降低DNA的酶促降解,并没有显示出转染的累积增强。当转染后PLUSTM试剂和INF7融合肽被加入到培养物中,这些试剂发现类似的观察结果(图27)。此外,分化的神经元细胞中,LPEI介导的与PLUS 和INF7融合肽预复合的pDNA的递送没有改善转染(图28)。
实施例9:增强的微管介导的复合物转运和内体逃离使分化的细胞能够有效的转染。
众所周知,微管介导的运输在聚合物/pDNA转运中发挥作用。具有在从酸性区室释放复合物的能力,我们接下来探所了细胞内转运的化学治疗介导物的影响,其作为一种进一步提高转染效率的策略。特别是,评价了Tubastatin A,组蛋白脱乙酰化酶-6(HDAC6)抑制剂,其可增强微管介导的物质的胞内运输。DOPE/CHEMS和Tubastatin A的共同施用导致EGFP阳性的分化的 Neuro2A(~70%)的数量非常显著的增加(图10a和b)。时间过程研究显示,细胞最低暴露于DOPE/CHEMS和Tubastatin A 12h,对获得高转染效率是必须的(图29)。有趣的是,发现DOPE/CHEMS和Tubastatin A的组合作用是载体依赖的,当使用LPEI、PAMAM和XtremeGENE XP而非Fugene HD 时,产生增强转染(图30)。另外,曲古菌素A,另一种HDAC抑制剂(HDACi),在DOPE/CHEMS的存在时大大提高了转染效率(图31)。接下来,当 DOPE/CHEM和Tubastatin A共同施用时,在原代皮层神经元中评价温和离心来沉淀聚合的复合物的策略。值得注意的是,接近75%的这些有丝分裂后的皮层神经元被转染(图10c和d),且没有显著的细胞毒性(图32a)。应当注意的是,最佳转染仅发生在转染第一个小时内共同施用试剂(图32b)。为了进一步证实稳定微管对有效转染的意义,测定了紫杉醇和各种HDACi对微管蛋白乙酰化和转染的作用。与之前的报道一致,HDAC6以小分子(Tubastatin、 TSA、Varinostat/SAHA)和紫杉醇为靶标,而非Entinostat,Tacedenaline明显地增强微管蛋白乙酰化(图33)。当以DOPE/CHEMS和诱导微管蛋白乙酰化的小分子来处治细胞时,观察到转染的累加效应(图34)。总之,这些数据表明,内体逃离和微管稳定通过协同机制提高转染。
转基因表达的增强是通过TrafEnTM组合作用于内体转运和微管网络的稳定来实现。已经在各种条件中测定了TrafEnTM对转染增强的作用,各种条件包括细胞类型、基因载体、遗传物质和HDACi。
实施例10:TrafEnTM的作用在各种细胞类型中不同。众所周知,各种细胞类型,甚至来自同一组织起源细胞系呈现不同的转染效率。扩展TrafEnTM的原理发现,几个细胞类型也观察到转染的显著增强(图44),进一步给出证据表明,内体的释放和微管网络的稳定间的协调对转染效率作出显著贡献。此外,这种方法可以通过控制转染效率产生具有可比较的转基因表达水平的同一组织起源的细胞系模型。
实施例11:TrafEnTM提高各种商业的基因载体的转染
还发现DOPE/CHEMS和Tubastatin A的组合作用提高了除LPEI之外许多市场可以买到的聚合物的转染效率(图45)。当用制造商的实验方法进行转染实验时,除了XtremeGene HP,所有的商业试剂表现不佳。当用沉积介导的转染工作流程更换制造商的实验方法时,观察到转染提高。TrafEnTM的添加获得进一步的提高。通过促进内体逃离和各种聚合物的微管转运提高转染,表明不同载体的转染机制可能是类似的。
实施例12:TrafEnTM增强shRNA的转染
遗传操作可以通过使用质粒DNA(pDNA)来过表达基因或发夹RNA (shRNA)抑制基因来完成。迄今为止,已经设计了shRNA文库用于抑制哺乳动物细胞中目的基因的表达。例如,已报道用shRNA抑制PTB来引发多个细胞类型的细胞重新编程和转分化到神经元样细胞。为了证明TrafEnTM对基因抑制的作用,案例研究显示当TrafEnTM存在时,RNA结合聚嘧啶结合蛋白 (PTB)呈现有效地抑制。转染后测定了HeLa细胞中PTB1(宫颈癌细胞系) 的mRNA水平。显然,在TrafEnTM的存在下基因抑制的效率更有效(图46, 1-4栏)。有效的基因抑制有助于快速的转分化过程,其中处治8天后,观察神经元样细胞(图47)。
实施例13:基因-药物组合策略
使用DOPE/HEMS与微管网络稳定剂HDAC6抑制剂,通过偶联时间依赖的从非生产性内体通路改变路径的作用,许多细胞类型中已表明转染提高。一些HDAC抑制剂,如曲古抑菌素A(TSA)和Varinostat(SAHA),通过靶向微管并同时影响表观遗传修饰的活动来增强转染。这些物质对组蛋白和非组蛋白乙酰化状态的作用,对各种临床应用具有启示。例如,HDACi已被用作化学增敏剂以增加癌症治疗剂的细胞毒作用(A),以诱导干细胞的分化(B),以提高癌症疫苗的免疫原性(C),和以增强重编程过程(D)。HDACi 的广泛临床应用的实现已导致探索药物-基因组合作用可能性的研究, DOPE/CHEMS和HDAC6抑制剂共同作用以提高转染效率(图1,1和2),且HDACi可以通过表观遗传修饰增大转基因的作用(图1,3)。换句话说,该基因药-物组合策略同时增加转基因表达,且HDACi的协同效应可以进一步增强治疗效果。
实施例14:p53基因过表达和SAHA的协同效应导致高细胞毒性。
众所周知,对患者实体肿瘤,用单一的抗癌剂治疗,如单独的基因治疗和HDACi通常表现出有限的临床益处。例如,单一的治疗剂如p53替代疗法和SAHA的抗癌情况已显示出不良的临床结果,促使开发与其他癌症治疗剂的新组合。已知p53参与多种功能,其包括细胞周期的调节、DNA修复和细胞凋亡的激活。已经在神经胶质瘤中检验p53基因替代疗法的药效,其中发现这些癌症的30-60%呈现p53基因的突变。迄今为止尽管进行了许多临床前和临床研究,还没有通过I期临床试验。另一方面,作为单一疗法,SAHA显示出中等临床益处,但是在联合治疗中已经获得很多令人兴奋事。已经显示在对正常细胞具有最小毒性作用的浓度时,SAHA在各种癌细胞中具有强效的抗肿瘤作用。虽然SAHA潜在的抗癌机制仍不清楚,可能是它运用改变基因的表达表观遗传学修饰而导致生长停滞、迁移抑制和细胞死亡。研究表明, SAHA诱导促凋亡基因(Bax、Bim、BMF、Bik、细胞色素C和Smac)的上调和抗凋亡基因(XIAP和生survivin)的下调。其它研究已经表明,SAHA 诱导的细胞死亡的易感性被p53调控。这些观察结果表明SAHA与p53可能的协同作用,并且因此暗示可能的组合基因-药物作用。为了说明基因-药物组合(TrafEnTM)的协同作用,在U251MG胶质瘤细胞系(U251MG)中,测定了组合p53和HDACi处治的治疗结果。这里提出的策略表明通过 DOPE/CHEMS和SAHA增强的p53转染效率的组合作用,其中后者化合物还可以产生表观遗传作用。首先,DOPE/CHEMS和SAHA对转染增强的作用在 U251MG神经胶质瘤细胞(p53突变体)中得到证实(图48)。转染后,单一或多种试剂的组合(DOPE/CHEMS、Tubastatin A和SAHA)处理细胞导致转染效率的显著提高。有趣的是,在所有情况下,当转染增强剂存在时,高水平表达GFP的细胞(由RFU确定)的百分比(%)显著地增加。DOPE/CHEMS 和Tubastatin的A/SAHA的共同施用比用单一试剂处治呈现优异的效果。下一步,测定p53与转染增强剂的组合作用。相比于阴性对照(-ve),细胞存活率分别受到不同程度的影响(图49)。p53而不是PMAXGFP过表达,观察到细胞数量显著减少,表明细胞死亡是P53依赖的(可能通过其他研究所表明的凋亡通路。发现在DOPE/CHEMS(无毒的膜融合脂质)存在时,用p53,细胞死亡进一步增加,因此,提供了通过改善转染效率来增强杀伤细胞的证据。而用DOPE/CHEMS或SAHA处治的U251MG的转染效率是可比较的(图 48),组合p53和SAHA导致U251MG细胞更多的细胞死亡。这个观察结果与报道的SAHA在抗癌功能中的化学增敏作用相一致。有趣的是,相比于转染增强剂单独地加入的其他条件,在DOPE/CHEMS和SAHA存在时,P53 递送到细胞呈现示出优异的细胞毒性作用(细胞数量减少~95%)。这个数据支持我们的假设,即抗癌药物和转基因产物彼此协同,增强治疗结果。此外,增加与SAHA孵育的持续时间没有进一步减少细胞数目(图50)。下一步,与SAHA比较Tubastatin A(细胞质HDAC6特异性抑制剂)的作用,进一步证实SAHA的表观遗传学调节对p53诱导的细胞死亡的贡献(图51)。与 DOPE/CHEMS相比,不像SAHA,Tubastatin A没有产生细胞数量更多的减少。正如所料,用Tubastatin A和DOPE/CHEMS转染p53不利于药物-基因组合作用,如使用SAHA所观察的。
越来越多的证据表明,神经胶质瘤的异质性可能是治疗失败的关键原因。迄今为止,被称为TMZ抗性细胞和癌症干细胞的两个亚群已经鉴定。这两个亚群都已经发育为呈现侵袭性癌症表型的遗传机制,所述侵袭性癌症表型如迁移和抗TMZ。由于抗性,癌症干细胞假说被认为是对处治一个挑战。这些细胞呈现出干细胞样特征,并且能够产生异质的肿瘤块。最近的研究支持在神经胶质瘤(GSC)中存在少数癌症干细胞。因为这些细对放射疗法和化学疗有抗性,它们足以产生复发肿瘤。下一步,在抗40μM的TMZ的U251MG 细胞(TMZR-U251MG)和GSC中,测定使用p53基因、DOPE/CHEMS和 SAHA的基因-药物组合的协同作用(图52)。显然,策略具有优异的细胞毒性作用,导致在TMZR-U251MG和GCS的细胞数方面分别减少89.1%和 91.7%。有趣的是,p53的单独过表达在TMZR-U251MG中导致显著的细胞死亡,但在GSC中没有作用。这尚未见报道,并且是第一次在亲本、TMZ 抗性细胞和GS中测定p53的过表达的作用。
实施例15:BMP2过表达和TSA协同作用诱导成骨分化。
为了实现干细胞的临床应用,必须建立技术来引导干细胞以调控的方式分化,来规避非自体干细胞来源的细胞的免疫原性,并用作药物递送工具和调节移植后细胞的生长。为应对这些挑战,基因递送是递送生物信号的潜在工具。借助间充质干细胞(MSCs)对TrafEnTM基因-药物组合在干细胞技术中的应用进行阐明。
为测定药物-基因的组合作用,我们首先测定了TSA(HDAC6抑制剂和表观遗传修饰剂)在转染MSC中的作用(图53)。单独地加入DOPE/CHEMS 和TSA导致转染显著的提高,但组合使用时未观察到进一步增强。下一步,在DOPE/CHEMS和/或HDACi(TSA、Tubastatin A)存在或不存在时,使用 qPCR定量MSC中BMP2的表达水平,来测试药物-基因组合作用(图54)。用PMAXGFP-BMP2(BMP2)转染后3天,观察到BMP2表达水平显著提高 (为阴性对照~13,000倍)。DOPE/CHEMS(BMP2+DOPE/CHEMS)或 Tubastatin A(BMP2+5μMTubastatin A)的加入,BMP2的表达增强~20,000 倍。出人意料的是,用TSA处治没有进一步增强BMP2表达(BMP2+150nM TSA)。有趣的是,DOPE/CHEMS和TSA的组合(~200,000倍,相比于对照组)对BMP2表达引起比DOPE/CHEMS和Tubastatin A的组合(~80000 倍)更优异的作用。除仅仅稳定微管蛋白网络外,这些出人预料的结果暗示 TSA在增强BMP2表达中独特的功能,而这可以作为一个机会以通过使用特定的HDACi来鉴定基因-药物组合的新颖作用。值得一提的是,用DOPE/CHEMS和TSA处理细胞,在MSC培养中观察到转基因持续表达至21 天(图55)。这一发现表明治疗产品的持续释放达到潜在有效细胞治疗。同时需要进一步特征描述和功能分析来证实BMP2释放和骨生成,在研究结束时,我们在维持在骨生成特定介质(osteogenesisdefined media)(图56B)而非扩展介质(expansion media)(图56A)的细胞中观察到大量的钙沉积。
实施例16:GM-CSF的过表达和SAHA的协同作用,提高癌细胞的免疫原性。
癌症疫苗能够产生于遗传修饰的肿瘤细胞,或者自体的(在手术过程中从患者上移除)或同种异体(建立的癌细胞系)的。遗传修饰后,细胞被辐射灭活,并注射到患者皮下或皮内以诱导接受体的对肿瘤细胞的免疫应答。利用同种异体细胞,如现有的细胞系,提供了充分表征的细胞的持续和不受限制的来源,其可以被标准化用于大规模生产的。它也可以提供单一批次,用于对临床结果的比较分析的临床分组,并排除了连续收获患者的癌细胞的需要。此外,也不再有量身定制个体癌症疫苗的需求,所述量身定制会增加成本和劳动。迄今为止,基于癌症疫苗的最晚期的细胞系是GVAX,包括 GM-CSF基因修饰的PC3细胞,其用于转移性的前列腺癌的处治。修饰的PC3 细胞能够激活抗原递呈细胞(APC),并诱导免疫应答。另一方面,HDACi 通过增强主要组织相容性复合体(MHC)I类和II蛋白、共刺激/黏附分子的表达,能够增强肿瘤细胞的免疫原性。而且,已发现用HDACi处治(如SAHA 和TSA)与癌症细胞而非正常细胞表面的MICA和MICB的呈现增强有关。 MICA和MICB诱导免疫受体、自然杀伤细胞的蛋白质组2D(NKG2D)的激活,导致癌细胞对自然杀伤细胞(NK细胞;CD4和CD8T细胞)的易感性增加。此处,我们的目标是测定GM-CSF和SAHA的组合对PC3细胞免疫原性的增强。此TrafEnTM基因-药物的策略可以产生PC3癌症疫苗,其能够使APC 和NK细胞都激活。
第一次测定了SAHA(HDAC6抑制剂和表观遗传修饰剂)在转染PC3 中的作用(图57)。单独地加入DOPE/CHEMS、Tubastatin A和TSA导致转染显著增强,但组合使用时没有观察到进一步增强。下一步,存在或不存在 DOPE/CHEMS和/或的SAHA时,使用qPCR来定量PC3中GM-CSF的表达水平,以检验药物-基因的组合作用(图58)。用PMAXGFP-GM-CSF(GM-CSF)转染3天后,观察到GM-CSF的表达水平显著增强,(对照的8000~倍以上, ctrl)。加入DOPE/CHEMS(GM-CSF+DOPE/CHEMS)或SAHA (GM-CSF+5μMSAHA)分别增强GM-CSF表达~9000和~14000倍。有趣的是,DOPE/CHEMS和SAHA的组合对GM-CSF过表达产生非常优异的作用(~30,000倍,与对照相比)。这些意料之外的结果暗示除仅仅稳定微管网络之外,SAHA一种独特的功能,增强GM-CSF表达。除了用TrafEnTM增加 GM-CSF的表达,SAHA的处理诱导MICA和NKG2D的上调长达48小时的处理(图59)。这个观察结果与SAHA对多种细胞系作用的报告一致。MICA 和NKG2D的表达增加是NK细胞的激活的原因。总之,这些数据表明,TrafEn TM基因-药物组合作为一个有前途的策略,以产生癌症疫苗,该癌症疫苗激活 APC(GM-CSF)和NK细胞(MICA)。
实施例17:OSKM过表达和VPA/Tubastatin A的协同作用,增加人成纤维细胞重编程效率。
重新编程描述细胞状态转换的过程,包括分化的细胞到较低分化状态的转换。已经建立基因工具来在各种细胞类型中发起重编程过程。例如, Yamanaka等人。成功地鉴定了四种转染因子,Oct4、Sox2、Klf4和cMYC,足以使成纤维细胞产生iPSC。在重编程的细胞来源的临床使用方面存在一些问题。病毒工具的使用可以引发肿瘤发生和免疫反应的风险。另一个问题是转基因整合诱导肿瘤发生的风险。具体地,c-Myc(众所周知的致癌基因)过表达和它的重激活能够导致肿瘤的形成。从重新编程混合物中去除c-Myc大大降低了重编程效率。有趣的是,cMyc和Klf4两者的功能能够通过HDACi (如丙戊酸(VPA))处治细胞来补偿。
成人成纤维细胞(HAF)的转染需要高PEIMAX的N/P比例(图60)。增加的N/P(从50-70)不导致转染的进一步改善,表明存在细胞内的转染屏障。加入TrafEnTM(PEIMAX-N/P=50,DOPE/CHEMS+10μM Tubastatin A) 导致表达GFP细胞的百分比(~70%)急剧增量。相反,脂质体和Satisfection 介导的转染没有检测到转染结果(图61A)。使用TrafEnTM制剂来递送聚顺反子表达载体(Addgene:20328),相比于对照(PMAXGFP),发现cMYC、 KLF4、SOX2、OCT4的表达水平是~4000、~4500、~4800和~5400倍更高。在不存在TrafEnTM时,相比于对照,OSKM水平是~1000倍(图61B)。高水平表达可能有助于iPSC样集落的迅速形成。转染九天后,用TrafEnTM盖伦制剂转染的细胞培养中观察到集落(图61C)。同时,探索VPA对诱导cMYC 的和KLF4表达的作用(图62)。观察cMYC和KLF4两者表达逐渐增加至 72h。总之,这些数据表明,TrafEnTM基因-药物组合作为一个有前途的策略,其使用基于非病毒方法在人成纤维细胞中诱导有效的重编程过程。
讨论
据我们所知,这是第一次报告表明使用非病毒载体转染分化的神经元细胞系和原代皮质神经元是出人意料地高度有效。合理的策略涉及聚集的复合物的温和离心、促进内体逃离和增强微管转运。匹配的原始的和分化的神经元细胞模型的选择和可靠的定量工具的开发极大地促进了使用非病毒载体转染分化的神经元中迄今未确认的转染障碍的识别和缓解。
分化的神经元对物理应力和细胞环境改变敏感,这使得这些细胞的转染具有显著挑战。通过限制细胞暴露于复合物并温和离心,转染效率和细胞存活率均显著增加。温和离心被认为来沉积聚集的复合物,该聚集的复合物形成于高盐介质中(图13和38-43)。可能是复合物在高盐介质中固有的不稳定性。在基质上沉积的复合物没有以显著水平释放到介质中(图43),观察结果与之前的报道不一致。因此,沉积的复合物可以从细胞表面或细胞培养基质直接摄取,与最近的结果一致,最近的结果显示内吞参与神经元迁移、运动和黏附到基质中关键过程。沉积的聚集的复合物介导有效转染的关键作用在补充部分(图13和38-43)讨论。
为更好地理解非病毒载体的摄取和细胞内转运的机制,已经付出相当大的努力。已经显示LPEI-复合物的摄取涉及多种通路,其包括小窝和网格蛋白介导的内吞作用。目前还不清楚网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用的确切尺寸的限制(120-500nm)。最近的证据表明,通过咖马林敏感的和非选择性宏吞饮通路,甚至更大的LPEI-复合物的摄取导致哺乳动物细胞的成功转染。出乎意料的是,在原始的而非分化的神经元细胞中,DNA的摄取对PKC是敏感的,提示复合物的摄取途径和细胞内运输的改变,这可能有助于对复合物在酸性区室内的差异定位。
相较于以前的报告中,DNA的定量摄取在原始的和分化的神经元细胞之间是可比较的。尽管摄取的水平类似,分化的神经元细胞转染不佳。这一发现与之前的报道相一致,其中试图通过使用RGD、HIV TAT、Tet-1、HGP修饰的聚合物提高摄取,以在分化的神经元中提高转染,仅获得适度的改进。有趣的是,观察到原始的和分化的神经元细胞间复合物的差异定位。与以前的报道一致,在分化的神经元中复合物被聚集到酸性区室。人们认为LPEI发挥“质子海绵效应”,但发现LPEI-复合物被截留在神经元分化的酸性区室内, DOPE/CHEMS的加入使标记的DNA从该区室释放。逃离内体的标记的pDNA 急剧增加和DOPE/CHEMS导致的转染效率是出人意料的,与复合物的内体逃离是至关重要的想法相一致。酸性内体环境中DOPE/CHEMS的pH依赖不稳定被认为导致膜的相变,所述膜的相变造成膜融合,并最终释放内容物到细胞质中。值得要注意的是,包括氯喹的其他商业内体靶向试剂对转染效率没有作用。
已经表明,复合物,类似于一些病毒,利用微管网络从细胞质向细胞核转运。因此,微管的稳定导致动力蛋白和驱动蛋白马达更多的募集,其提高了转染。使用融合脂质促进有效的内体逃离的能力连同微管网的稳定作为一种有吸引力的协同策略用于增强聚合物介导的转染。事实上,当诱导微管稳定时,观察到协同效应。显然,使用这个合理的方法,已经在分化的神经元细胞和初级神经元中实现了高的转染效率。有趣的是,融合脂质和Tubastatin A提高转染的作用是协同的和时间控制的,表明在分化的神经元中,复合物的细胞内转运受到严格的控制。复合物可能需要在细胞内吞作用的早期阶段被释放,且细胞内转运以防止DNA降解或运输复合物到非生产性通路。
通过使用本文所描述的组合试剂和策略合理地减轻障碍的贡献,通过利用胶体稳定的复合物,其它的阳离子聚合物和衍生物可以成功地用于神经元的体外和体内的转染,其可能不令人惊奇,所述胶体稳定的复合物促进细胞膜上自组装超分子体,并引导选择性细胞内转运通路的靶向。与此意见一致,其它阳离子聚合物和众所周知的难以进行基于阳离子聚合物基因递送的非神经元细胞类型已观察到显著的转染提高(例如,树枝状聚合物和BPEI(图30,图44和图45)。值得注意的是,融合试剂的使用和HDAC抑制剂没有对整体的细胞过程产生长期作用。
对转染限制壁垒的阐释导致体外高效地将基因递送至分化的神经元细胞的合理方法。使用pH敏感脂质和增强微管介导的转运,变更内体释放复合物的路径,在分化的神经元细胞和原代皮层神经元中实现了高水平的转染。在聚集的复合物的转运中,这些迄今未确认的变化可能为原始的和分化的神经元中转染效率的差异提供一种可能的解释。因此,本研究对合成的非病毒载体的合理设计和使用阳离子聚合物在体外将基因转染至分化的神经元细胞内的优化盖伦制剂提供了有益的观察。
融合剂,例如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)/胆固醇辛酸酯(CHEMS),改善了基因递送。通过酸性内体环境中DOPE/CHEMS的 pH依赖不稳定,融合剂促进了内体逃离,从而导致膜的相变和膜融合。如其它的例子所示,DOPE/CHEM特异地重新引导载体/DNA复合物远离非生产性酸性区室,从而导致转染效率的提高。具有类似于DOPE特性的融合剂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。已发现一些肽有膜融合特性,如血细胞凝集素(HA2肽)、流感来源的膜融合肽diINF-7、白喉毒素的T结构域和聚阳离子肽,如聚赖氨酸和聚精氨酸。
微管靶向剂和表观遗传修饰剂的用作本领域已知的各种疾病患者的一线和二线处治。本公开内容进一步包括微管靶向剂和表观遗传修饰剂的使用。这里,微管靶向化学增敏剂(MT-C)被分类为微管蛋白结合剂(TBA)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)(图3)。
微管蛋白结合剂的两个主要类别是本领域已知的,紫杉烷类和埃博霉素类。TBA可以抑制微管动力学,导致有丝分裂抑制和凋亡。紫杉烷类可包括紫杉醇(紫杉酚)、多西他赛(泰索帝(Taxotere))或其组合。本领域已知埃博霉素类,像紫杉烷类,通过诱导细胞周期停滞在G2-M期的过渡阶段以阻止细胞分裂,产生细胞毒性,接着细胞死亡。本领域中已知的埃博霉素类似物是帕妥匹隆、伊沙匹隆、BMS310705、沙戈匹隆、KOS-862和KOS-1584。
以下表1显示的HDACi对HDAC/Sirtuin具有的抑制作用。如本领域已知的,HDACi已经显示具有微管靶向和/或表观遗传修饰的活性。HDACi抑制HDAC6和Sirtuin2来促进微管的乙酰化,从而导致微管网络的稳定。已多次表明乙酰化与微稳定性相关管,其中词组“乙酰化的微管”往往与“稳定的微管”同义。与TBA的作用类似,已知HDACi阻止微管动力学并影响抗癌作用。一些HDACi,像伏立诺他,抑制多种HDAC(HDAC1、2、3和6),并表现出各种活性,如免疫调节和细胞凋亡。HDACs通过调控组蛋白乙酰化状态参与染色质的维持和功能。此外,已知的HDACi具有多种功能,因为 HDAC家族影响很多生理过程,包括参与细胞增殖、分化、存活和DNA修复的基因转录。最近的,已经证明HDACi促进造血干细胞的自我更新,增强神经干细胞的分化和提高体细胞的重编程效率。
表1:HDACi对HDAC/Sirtuin具有抑制作用。阐述了对各种疾病的抑制剂的发展状况。格雷码(Grey code)代表抑制剂可能的微管稳定作用及其在TrafEnTM-基因组合策略中的应用。HA:氧肟酸。
已知,HDAC6抑制影响非神经元细胞中和神经元细胞中的轴突生长的微管动力学。因此,Tubastatin A对神经元细胞的细胞过程的长期作用的可能性值得仔细阐明,所述细胞过程包括微管动力学、神经发生和整体细胞代谢。显然,用Tubastatin A处治导致微管蛋白乙酰化的瞬时作用(<24小时)(图 35)。此外,本文所述的转染范例没有对轴突生长造成持续的改变(图36)和神经元细胞的整体代谢(图37)。
MSC是成人基质干细胞的异质性亚类,其可以被分离并活体外扩大,并且可以适当地分化成现有组织的细胞,修复受损组织,及恢复正常的功能。除了它们分化成成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞类型的潜能,研究已经证实 MSC也具有产生神经元、肾和其它细胞类型的能力。已经开发了病毒介导的 BMP2表达载体递送,通过提供基因信号以改善分化实验方法的结果来驱动这些干细胞分化成成骨细胞。除了使用MSC作为细胞来源以产生分化细胞,已检验其作为基因/药物递送的工具。用BMP2对MSCs进行基因修饰以促进组织修复。另一方面,提高MSC的分化的新兴方法是用HDACi直接处治。在许多报告中已经表明,HDACi如TSA、SAHA和丙戊酸能促进MSC的成骨分化。这些HDACi诱导的表观遗传学改变造成的成骨促进因子上调,如 BMP2,RUNX,osterix和骨调素(osteopontin)。迄今为止,BMP2转染和TSA的协同作用尚未被检验。
实验方法
细胞培养
稳定表达GFRα2a的Neuro2A(ATCC:CCL-131TM)和大鼠原代皮层神经元的培养与维持如前所述(Yoong,L.F.,G.Wan,and H.P.Too.Mol Cell Neurosci,2009.41(4):p.464-73;Zhou,L.and H.P.Too.PLoS One,2011.6(6): p.e21680)。非神经元细胞包括在Neurobasal-B27中生长的神经元细胞数量的小于0.5%(Brewer,G.J.,et al.J NeurosciRes,1993.35(5):p.567-76)。DIV 3 (体外3天),转染原代神经元。为了转染分化的神经元细胞,转染前48小时,在补充有1%胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s Modified Eagle介质(DMEM) 中用50ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(GDNFBiosource,Camarillo,CA)、 10μM的全反式维甲酸(RA)或10μM毛喉素(FSK;西格玛,St.Louis,MO) 分化Neuro2A和NG-108细胞。
生产TrafEnTM
首先,脂质组分(如DOPE和CHEMS)溶解于氯仿中。这些组分以一定的比例(DOPE:CHEMS)混合,其取决于形成的融合脂质体的预期应用和所用脂质类型。然后蒸发溶剂,从而促进玻璃管底形成含有DOPE/CHEMS的脂质膜。通过剧烈摇晃脂质膜在25mM HEPES缓冲液中重新形成,之后脂质溶液在水浴型超声仪中超声2min。脂质溶液解释第一剂。之后通过组合本公开内容所定义的第一剂和第二剂来制备TrafEnTM组合物。引用的TrafEnTM组合物也可预想到使用融合肽代替融合脂质。
转染步骤
根据制造商的说明纯化表达EGFP的质粒DNA(Geneaid Biotech,中国 台湾)。在25mM HEPES缓冲液中以不同的N/P比例将LPEI(25-kDa的;Polyscience,美国)加入到pDNA中,并在室温孵育15分钟。之后LPEI/pDNA复合物质加入至完全介质(1:10)以制备转染混合物(pDNA为2μg/ml)。对大量转染 (有或没有离心),转染前24小时接种细胞。转染混合物加入到培养中的细胞中,并以280g离心5min。之后转染混合物更换为完全介质,并进一步孵育细胞。分化细胞的转染,转染混合物更换为含有相应分化试剂的DMEM(1% FBS)。孵育指定的时间段后,通过手动计数或荧光激活细胞分类分析仪 (FACS)定量转染效率(EGFP阳性细胞的百分比)。
对于使用抑制剂的研究,转染前,细胞在DMEM(0.5%FBS)中与Dynasore (30μg/ml)、Filipin III(5μg/ml)或Rottlerin(2.5μg/ml)孵育45min。转染后,细胞进一步在含有相应抑制剂的DMEM中孵育。在所用的浓度,没有发生细胞死亡。
为改善分化神经元的转染,使用了DOPE/CHEMS和Tubastatin A(Bio Vision,洛杉矶,美国)。溶剂(氯仿)蒸发后,含有DOPE/CHEMS(9:2摩尔比)(Polar Avanti Lipid,Alabaster)的脂质膜形成于玻璃管的底部。脂质膜在 25mM HEPES缓冲液重新形成,并在水浴型超声仪(Brandson 2200)中超声 2min。在转染后的不同指定时间脂质溶液被加入到细胞培养物中。转染后一小时,Tubastatin A(5或16μM)被加入到培养介质。24h后,含有抑制剂介质更换为新鲜的介质。
流式细胞术分析
转染后,胰酶消化细胞,离心并在PBS中重悬。细胞块通过40μm的网眼过滤来去除。通过FACS分析(BD FACSCanto,BD Biosciences)来定量表达EGFP的细胞的百分比,并使用WinMDI分析原始数据。每个样品至少分析10,000个细胞。
实时qPCR定量DNA
定量被细胞内化的DNA,去除上清液,用1×PBS洗涤细胞一次,4℃下在含有的pAA/DNAse的DMEM中孵育2小时。接着,胰消化细胞并用pAA/ 尿素裂解缓冲液处理细胞。评价pAA/尿素裂解缓冲液和pAA/DNase释放DNA 的效率(补充附图15&18)。沉积的复合物单独与胰酶孵育后,DNA的定量显示在胰酶组分中检测到显著量的pDNA(数据未显示)。特异于EGFP的引物,使用正向引物(5’–3’,GACCACTACCAGCAGAACACC)和反向引物 (5’–3’,GACCATGTGATCGCGCTT)。如前所述进行pDNA的PCR定量。 Too.Mol Cell Neurosci,2009.41(4):p.464-73)。通过插值利用质粒标准确定 pDNA的绝对量。
图像研究
根据制造商的建议制备FITC-和罗丹明-pDNA(Mirus Bio,美国)。荧光标记的pDNA转染的细胞中观察到EGFP的表达(数据未显示)。FITC-或罗丹明-pDNA用于观察复合物的内化,转染4小时后,标记的pDNA的细胞外荧光分别用EtBr(20μg/ml)或0.4%台盼兰淬灭。用配备有荧光检测(Zeiss cell observer Z1)的倒置Zeiss显微镜拍摄并处理(Axio VisionRel.4.7)淬灭前后的细胞图像。测定台盼兰的淬灭效率(补充附图7)为研究罗丹明的-pDNA和酸性区室的共定位,细胞与lysotracker green DND-26(50nM)孵育5min。用Zeiss共聚焦显微镜(LSM710,Oberkochen,德国)拍摄图像。用Zeiss ZEN 软件分析(v2010)共定位的像素。
细胞存活率试验
为评估LPEI介导转染对原始的和分化的神经元细胞成活率的影响,转染前48h,用GDNF(50ng/ml)或RA(10μM)和FSK(10μM)在96孔板内分化Neuro2A和NG-108。然后将细胞暴露于LPEI/pDNA(以不同的N/P比例)15min或4h。有或没有在280g下离心5min,转染混合物更换为完全培养基,并孵育48h。培养基更换为100μl的DMEM和20微升的CellTiter96 AqueousOne SolutionCell Proliferation Assay(Promega,新加坡)。在37℃孵育1h之后,使用96孔酶标仪(680型,Biorad)记录490nm处的吸收。
DNA释放试验
DNA通过以下步骤收集(1)定量上清液中的DNA,用pAA/尿素裂解缓冲液处理上清液以释放DNA;(2)定量与细胞有关的DNA,用胰酶消化来收获细胞并用pAA/尿素裂解缓冲液处理细胞之前,去除上清液并用1×PBS洗涤细胞一次;(3)为定量被细胞内化的DNA,去除上清液,用1×PBS洗涤细胞一次,并在含有pAA/DNAse的DMEM中于4℃孵育2h。接着,用胰消化细胞并用pAA/尿素的裂解缓冲液-聚丙烯酸(PAA,西格玛,Mw:8000; 10ng pAA/ng pDNA;pAA中32羧基/pDNA中1磷酸基团)、0.5M氯化钠、 10mM磷酸钠和4M尿素在95℃处理细胞30min。pAA用作竞争性试剂用于从LPEI中更换pDNA。使用两种不同的方法-DNA的阻滞分析和定量PCR来观察/定量pDNA解离的效率。在0.8%琼脂糖凝胶中对DNA复合物进行电泳(100V,20min),用溴化乙锭染色并在UV透照器上观察。
表面结合pDNA的去除
转染后,将细胞(在6孔板中)与400μL含有pAA(10ng的pAA/ng pDNA)、 10mM氯化钙、6mM的MgCl2和4单位/ml脱氧核糖核酸酶I(DNAse)的无血清DMEM在4℃孵育2小时。优化这个配方以完全释放和降解表面结合的pDNA。与LPEI复合的质粒DNA被PAA替换,并在CaCl2和MgCl2存在下,用DNAseI降解。在4℃孵育,阻止DNA被细胞内化。RT-qPCR和成像研究证实了使用这种方法有效地去除了表面结合的pDNA(补充附图18)。
动态光散射
在25mM HEPES或DMEM中制备LPEI/pDNA(N/P=20)。通过使用 Zetasizer Nano的的动态光散射(Malvern,Worcestershire,美国)测量粒径。
沉积介导的转染
为了沉积-介导的转染,转染混合物转移到培养板(用完全介质预涂覆 24h),并孵育指定的时间(有或没有离心)。去除转染混合物并接种细胞。转染48小时后,通过人工计数或FACS分析来定量转染效率(EGFP阳性细胞的百分比)。
免疫细胞化学
用含有4%甲醛的1×PBS固定对照和10μM分化的Neuro2A细胞于室温20min,随后在含有0.5%Triton-X100的1XPBS中透化。然后,在37℃用含有正常山羊血清(1:10;Dako,Glostrup,Denmark)的0.1%Triton X-100/1×PBS 封闭固定细胞样品30min。之后在37℃,细胞在含有抗乙酰化α微管蛋白的第一抗体(1:200稀释Sigma Aldrich T7451)或TUJ(R&DSystems MAB1195, 1:50稀释)的0.1%TritonX-100/1%BSA/1XPBS中孵育2小时,并用1XPBS 洗涤三次。随后,细胞与具有1:200稀释的山羊抗小鼠的荧光第二抗体(AlexaFluor488/596;Invitrogen,CA)的0.1%Triton X-100/1%BSA/1×PBS 中于37℃孵育2小时。细胞用1×PBS中洗涤三次并上样。使用具有Axio Observer.Z1的Zeiss LSM710共聚焦显微镜系统拍摄图像。用相同的激光和光学设置拍摄所有图像。
利用LC-MS的代谢物试验
细胞(在6孔板中培养,约1百万个细胞)用从冰冷的HPLC水迅速漂洗。然后,HPLC水注入后,将该培养板在液氮中骤冷以淬灭细胞代谢状态。孵育1分钟后,为了提取目的,250μL冰冷的甲醇:氯仿(9:1比例)加至每个孔中,用细胞刮刀刮细胞(GreenpiaTech.)(Lorenz,M.A.,C.F.Burant,and R.T.Kennedy.Anal Chem,2011.83(9):p.3406-14)。提取物转移到含有0.1mm 玻璃珠的1.5ml离心管(Biospec Product)。为了有效地释放代谢物,该样品经过Mini-Beadbeater(Bio Spec Products Inc.)2分钟。之后,提取物在16000g 离心沉淀3分钟。将上清液转移到自动进样器小瓶中(安捷伦科技)并检验。
使用UPLC(Waters ACQUITY UPLC)–(TOF)MS(Bruker micrOTOF II)平台分析代谢物。为扫描50-800的m/z,在负模式下,以与-500伏端板电压和4500V毛细管电压,使用电喷雾离子化和运行(TOF)质谱。提供1 巴(bar)雾化气体。干燥气体速度及干燥气体温度分别调整在9ml/min和200 ℃。从所获取的数据(50-800M/Z),提取一定范围的m/z(0.06M/Z宽度,所用MS仪器的平均M/Z分布宽度)。随后,确定每个中间物的停留时间和使用制造商提供的软件的对峰面积进行积分。
计算出各代谢物对ATP的相对量。ATP被用作标准,因为它是最丰富的代谢物并且样品间是稳定的,每个时间点的变异系数小于5%。归一化之后,计算代谢物相对于阴性对照的相对倍数变化。
Claims (18)
1.第一剂和第二剂在制备用于增强用遗传物质转染后的细胞中遗传物质细胞内转运的组合物中的应用,
其中当所述组合物用于增强用遗传物质转染后的细胞中遗传物质细胞内转运时,用遗传物质转染细胞后的1、2、3、4或5个小时内,所述第一剂和第二剂同时地、分别地或相继地加入到细胞,
其中所述第一剂引导遗产物质远离细胞中酸性区室,并且其中所述第二剂稳定微管及其网络,
其中所述第一剂是复合的DOPE/CHEMS,并且其中所述第二剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi),其中所述HDACi选自由Tubastatin A、SAHA(伏立诺他)、曲古抑菌素A组成的组。
2.根据权利要求1所述的应用,其中所述第二剂增强微管蛋白乙酰化。
3.根据权利要求1所述的应用,其中所述第二剂增强细胞对治疗剂的敏感性,和/或修饰宿主的遗传状态。
4.根据权利要求1所述的应用,其中所述遗传物质被耦合到至少一种阳离子物质上。
5.根据权利要求4所述的应用,其中所述阳离子物质选自聚乙烯亚胺、聚阳离子两亲化合物、DEAE-葡聚糖、阳离子聚合物及其组合。
7.根据权利要求6所述的应用,其中所述阳离子物质是LPEI。
8.根据权利要求4所述的应用,其中所述遗传物质与阳离子物质的核酸:聚合物(N/P)的比例选自0至1000、0至500、0至100、0至50和0至20。
9.根据权利要求8所述的应用,其中所述N/P比例是组合物中形成复合物的遗传物质与阳离子物质的比例。
10.根据权利要求1所述的应用,其中所述遗传物质选自DNA、RNA、mRNA、核酶、反义寡核苷酸、修饰的聚核苷酸及其组合。
11.根据权利要求1所述的应用,其中所述细胞是分化的或未分化的细胞。
12.根据权利要求1所述的应用,其中所述细胞选自神经系统细胞、肝细胞、造血细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、肿瘤细胞、缺血性组织细胞、皮肤细胞、干细胞、癌细胞系及其组合。
13.根据权利要求12所述的应用,其中所述癌细胞系选自U251MG(CLS ID no.300385)、RAW 264.7(ATCC no.TIB-71)、PC3(ATCC no.CRL-1435)、M14(Pubmed ID:12354931)、MEF(ATCC no.SCRC-1040)、Neuro2A(ATCC no.CCL-131)、NG-108(ATCC no.HB-12317)和HeLa(ATCC no.CCL-2)。
14.根据权利要求1所述的应用,其中所述第二剂是在所述第一剂之后提供。
15.根据权利要求1所述的应用,其用于基因治疗。
16.根据权利要求1所述的应用,进一步包括治疗剂。
17.根据权利要求16所述的应用,其中所述治疗剂是化疗剂。
18.根据权利要求17所述的应用,其中所述化疗剂选自紫杉醇、多西他赛和埃博霉素及其组合。
Applications Claiming Priority (3)
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Citations (3)
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WO2001093836A2 (en) * | 2000-06-09 | 2001-12-13 | Teni Boulikas | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes |
WO2006007712A1 (en) * | 2004-07-19 | 2006-01-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents |
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WO1993003709A1 (en) * | 1991-08-16 | 1993-03-04 | Vical, Inc. | Composition and method for treating cystic fibrosis |
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WO2006007712A1 (en) * | 2004-07-19 | 2006-01-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents |
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