KR20190071725A - Rna-가이드된 핵산 변형 효소 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Rna-가이드된 핵산 변형 효소 및 이의 사용 방법 Download PDF

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제니퍼 에이. 도우드나
질리안 에프. 반필드
데이비드 버스테인
루카스 벤자민 해링턴
스티븐 씨. 스트루트
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 개시내용은 CasX 단백질, CasX 단백질을 암호화하는 핵산, 및 CasX 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 제공된 CasX 단백질은 다양한 적용분야에서 유용하다. 본 개시내용은 CasX 단백질에 결합하고 이에 대한 서열 특이성을 제공하는 CasX 가이드 RNA; CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 CasX 가이드 RNA 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 제공된 CasX 가이드 RNA는 다양한 적용분야에서 유용하다. 본 개시내용은 고세균 Cas9 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 이와 회합된 고세균 Cas9 가이드 RNA 및 이를 암호화하는 핵산을 제공한다.

Description

RNA-유도된 핵산 개질 효소 및 그 사용방법
상호 참조
본 출원은 2016년 9월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/402,846호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
텍스트 파일로서 제공된 서열목록의 참고에 의한 편입
서열목록은 2017년 9월 28일자에 생성되고, 용량이 135 KB인 텍스트 파일 "BERK-342WO_SeqList_ST25.txt"로서 본 명세서에 제공된다. 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 편입된다.
DNA 서열분석 시대 전의 과학에 알려지지 않은 경로의 예인 CRISPR-Cas 시스템은 이제 파지 및 바이러스에 대해 획득된 면역을 박테리아 및 고세균에 부여하는 것으로 이해된다. 과거 십년에 걸쳐 광대한 연구는 이 생화학 시스템을 발견하지 못하였다. CRISPR-Cas 시스템은 외래 DNA 또는 RNA의 획득, 표적화 및 절단에 연루된 Cas 단백질, 및 Cas 단백질을 그들의 표적에 가이드하는 짧은 스페이서 서열에 측접하는 직접 반복부를 포함하는 CRISPR 어레이로 이루어진다. RNA에 결합된 단일 Cas 단백질이 표적화된 서열에 대한 결합 및 절단을 초래하는 클래스 2 CRISPR-Cas는 최신식의 형태이다. 이들 최소 시스템의 프로그램 가능한 특성은 그들의 용도를 게놈 조작 분야의 혁명을 일으키는 다재다능한 기술로서 용이하게 하였다.
현재의 CRISPR-Cas 기술은 아직 손대지 않은 단리되지 않은 방대한 유기체를 떠나서 배양 박테리아로부터의 시스템에 기반한다. 지금까지, 소수의 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템만이 발견되었다. 추가적인 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, Cas 단백질 + 가이드 RNA 조합)에 대한 당업계의 필요가 있다.
본 발명의 개시내용은 본 명세서에서 "CasX" 폴리펩타이드로서 지칭되는(또한 "CasX 단백질"로서 지칭됨) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 폴리펩타이드; CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및 CasX 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 숙주 세포 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 제공한다. 제공되는 CasX 폴리펩타이드는 다양한 적용분야에서 유용하다.
본 개시내용은 CasX 단백질에 결합하고 이에 대한 서열 특이성을 제공하는 가이드 RNA(본 명세서에서 "CasX 가이드 RNA"로서 지칭됨); CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 CasX 가이드 RNA 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 제공되는 CasX 가이드 RNA는 다양한 적용분야에서 유용하다.
본 개시내용은 고세균 Cas9 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 이와 회합된 가이드 RNA(고세균 Cas9 가이드 RNA) 및 이를 암호화하는 핵산을 제공한다.
도 1은 2개의 천연 유래 CasX 단백질 서열을 도시한 도면.
도 2는 2개의 동정된 천연 유래 CasX 단백질 서열의 정렬을 도시한 도면.
도 3(패널 a 내지 b)은 CasX에 대한 개략적 도메인 제시를 도시한 도면. 또한 CasX의 상동체를 동정하기 위한 다양한 검색 시도로부터의 결과를 나타낸다. 또한 두 상이한 종으로부터 동정된 CasX-함유 CRISPR 좌위의 부분이 도시된다.
도 4(패널 a 내지 c)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현된 CasX에 의한 플라스미드 간섭을 입증하기 위해 수행한 실험을 도시한 도면.
도 5(패널 a 내지 b)는 CasX에 대한 PAM 서열을 결정하기 위해 수행된 실험(CasX에 의한 PAM 의존적 플라스미드 간섭)을 도시한 도면.
도 6(패널 a 내지 c)은 CasX가 이중-가이드된 CRISPR-Cas 효과기 복합체라는 것을 결정하기 위해 수행한 실험을 도시한 도면.
도 7은 CasX RNA 가이드된 DNA 간섭의 개략도를 도시한 도면.
도 8은 CasX를 이용하여 인간 세포에서 편집을 입증하는 일 실시형태에 대한 실험 설계의 개략도를 제시한 도면.
도 9는 CasX의 재조합 발현 및 정제를 나타내는 데이터를 제시한 도면.
도 10은 절단 활성에 대해 다양한 상이한 tracrRNA 서열(상이한 서열 길이)을 이용하는 데이터를 제시한 도면.
도 11은 실온 대 37℃에서 작용하는 CasX에 관한 데이터를 제시한 도면.
도 12(패널 a 내지 e)는 고세균 Cas9 CRISPR 시스템(ARMAN-1 II형 CRISPR-cas 시스템)에 관한 정보를 제시한 도면.
도 13은 고세균 Cas9 단백질(ARMAN-1 및 ARMAN-4, 각각 서열번호 71 및 72)을 제시한 도면. 스트렙토코코스 피오게네스(S. pyogenes)의 D10 및 H840에 대응하는 촉매적 잔기는 볼드체이고 밑줄 표시되어 있다.
도 14는 고세균 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-1 Cas9)과 함께 사용될 수 있는 예시적 이중 가이드(상부 패널)(상부 RNA-서열번호 73, 하부 RNA-서열번호 77) 및 단일 가이드(하부 패널)(서열번호 79) 형식을 제시한 도면.
도 15는 고세균 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-4 Cas9)과 함께 사용될 수 있는 예시적 이중 가이드(상부 패널)(상부 RNA-서열번호 74, 하부 RNA-서열번호 78) 및 단일 가이드(하부 패널)(서열번호 80) 형식을 제시한 도면.
도 16은 2개의 새로 동정된 비-고세균 Cas9 단백질을 도시한 도면.
도 17은 (i) 2개의 새로 동정된 비-고세균 Cas9 단백질과 ARMAN-1 및 ARMAN-4 Cas9 단백질의 정렬; 및 (ii) ARMAN-1 및 ARMAN-4로부터의 Cas9 단백질뿐만 아니라 구조가 밝혀진 악티노마이세스 나이슬런디(Actinomyces naeslundii) Cas9에 대해 비배양 박테리아로부터의 2가지의 밀접하게 관련된 Cas9 단백질의 정렬을 도시한 도면.
도 18(패널 a 내지 b)은 비배양 유기체로부터의 신규한 동정된 CRISPR-Cas 시스템을 제시한 도면. a, Hug et al.32의 데이터에 기반하여 모든 박테리아 및 고세균에서 단리된 대표자가 있는 그리고 대표자가 없는 주된 계통의 비. 결과는 이들 도메인에서 대규모의 아직 거의 연구되지 않은 생물학을 강조한다. 고세균 Cas9 및 신규한 CRISPR-CasY는 단리된 대표자가 없는 계통에서 배타적으로 발견되었다. b, 새로 발견된 CRISPR-Cas 시스템의 국소 조직화.
도 19(패널 a 내지 b)는 ARMAN-1 Cas9 PAM 서열의 ARMAN-1 CRISPR 어레이 다양성 및 동정을 제시한 도면. a, 15개의 상이한 AMD 샘플로부터 재구성한 CRISPR 어레이. 백색 박스는 반복부를 나타내고, 색이 있는 다이아몬드는 스페이서를 나타낸다(동일한 스페이서는 동일하게 색칠하고; 독특한 스페이서는 검정색이다). 어레이의 보존된 영역을 강조한다(우측 상에서). 최근에 획득된 스페이서의 다양성은(좌측 상에서) 시스템이 활성이라는 것을 나타낸다. 또한 판독 데이터로부터의 CRISPR 단편을 포함하는 분석을 도 25에 제시한다. b, AMD 메가게놈 데이터로부터 재구성된 단일 추정 바이러스 콘틱은 ARMAN-1 CRISPR 어레이로부터의 56개 프로토스페이서(적색 수직 막대)를 함유한다. c, 서열분석은 비표적 가닥 상에서 프로토스페이서 하류의 보존된 'NGG' PAM 모티프를 나타내었다.
도 20(패널 a 내지 d)는 이콜라이에서 프로그램 가능한 DNA 간섭을 매개한다는 것을 나타내는 데이터를 제시한 도면. a, CasX 플라스미드 간섭 분석의 다이어그램. 최소 CasX 좌위를 발현시키는 이콜라이는 CRISPR 어레이(표적)에서 서열을 매칭시키는 스페이서를 함유하는 플라스미드 또는 비-매칭 스페이서(비표적)를 함유하는 플라스미드로 형질전환된다. 형질전환된 후에, 배양물을 플레이팅하고, 콜로니 형성 단위(colony forming unit: cfu)를 정량화하였다. b, 부유균문 CasX 좌위 표적화 스페이서 1(sX.1)을 발현시키고 구체화된 표적(sX1, CasX 스페이서 1; sX2, CasX 스페이서 2; NT, 비-표적)으로 형질전환된 이콜라이의 연속 희석. c, 델타프로테오박테리아 CasX에 의한 플라스미드 간섭. 실험을 3회 중복하여 수행하고 평균 ± s.d.를 나타낸다.　d, 이콜라이에서 발현시킨 부유균문 CasX 좌위에 대한 PAM 고갈 분석. 대조군 라이브러리에 비해 30배 초과로 고갈된 PAM 서열을 사용하여 웹로고(WebLogo)를 생성하였다.
도 21(패널 a 내지 c)은 CasX를 나타내는 데이터가 이중-가이드 CRISPR 복합체라는 것을 제시한 도면. a, 아래쪽 다이어그램의 CasX CRISPR 좌위에 대한 환경 RNA 서열(메타전사체 데이터)의 맵핑(적색 화살표, 추정적 tracrRNA; 백색 박스, 반복부 서열; 녹색 다이아몬드, 스페이서 서열). 삽도는 제1 반복부 및 스페이서의 상세한 관점을 나타낸다. b, CasX 이중-가닥 DNA 간섭의 다이어그램. RNA 가공 부위는 검정색 화살표로 나타낸다. c, CasX 좌위의 추정적 tracrRNA 넉아웃 및 crRNA 단독과 함께 공동발현된 CasX, 절단된 sgRNA 또는 전장sgRNA에 의한 플라스미드 간섭 분석 결과(T, 표적; NT, 비-표적). 실험을 3회 중복하여 수행하고 평균 ± s.d.를 나타낸다.　
도 22(패널 a 내지 c)는 이콜라이에서 CasY 좌위의 발현이 DNA 간섭에 충분하다는 것을 나타내는 데이터를 제시한 도면. a, CasY 좌위 및 이웃하는 단백질의 다이어그램. b, 대조군 라이브러리에 비해 CasY에 의해 3배 초과로 고갈된 5' PAM 서열의 웹로고. c, 이콜라이 발현 CasY.1에 의한 그리고 표시된 PAM을 함유하는 표적으로 형질전화된 플라스미드 간섭. 실험을 3회 중복하여 수행하고 평균 ± s.d.를 나타낸다.　
도 23(패널 a 내지 b)은 공지된 시스템과 관련하여 새로 동정된 CRISPR-Cas를 제시한 도면. a, 보편적 Cas1 단백질의 단순화된 계통수. 공지된 시스템의 CRISPR 유형은 쐐기와 분지로 나타내고; 새로 기재한 시스템은 볼드체이다. 상술한 Cas1 계통발생을 보조 데이터 2에 제시한다. b, II-B형과 II-C형 좌위 사이의 재조합 결과로서 고세균 II형 시스템에 생기는 제안된 진화 시나리오.
도 24는 ARMAN-4로부터의 고세균 Cas9가 축퇴 CRISPR 어레이에 의해 수많은 콘틱 상에서 발견된다는 것을 나타내는 도면. 　ARMAN-4로부터의 Cas9는 16개의 상이한 콘틱 상에서 진한 적색으로 강조한다. 추정적 도메인 또는 기능을 갖는 단백질을 표지한 반면, 가설 단백질을 표지하지 않는다. 15개의 콘틱은 2개의 축퇴 직접 반복부(1개는 bp 미스매치) 및 단일, 보존된 스페이서를 함유한다. 남아있는 콘틱은 단지 하나의 직접 반복부를 함유한다. ARMAN-1과 달리, 추가적인 Cas 단백질은 ARMAN-4에서 Cas9에 인접하여 발견되지 않는다.
도 25는 ARMAN-1 CRISPR 어레이의 완전한 재구성을 제시한 도면. 기준 조립 서열뿐만 아니라 짧은 DNA 판독으로부터 재구성된 어레이 세그먼트를 포함하는 CRISPR 어레이의 재구성. 녹색 화살표는 반복부를 나타내고, 색이 있는 화살표는 CRISPR 스페이서를 나타낸다(동일한 스페이서는 동일하게 색칠한 반면, 독특한 스페이서는 검정색으로 색칠한다). CRISPR 시스템에서, 스페이서는 전형적으로 일방향성으로 첨가되고, 따라서 좌측 상에서 매우 다양한 스페이서는 최근의 획득에 기인한다.　
도 26(패널 a 내지 b)은 ARMAN-1 스페이서가 고세균 군집 구성원의 게놈에 맵핑된다는 것을 도시한 도면. a, 동일한 환경으로부터의 나노고세균인 ARMAN-2의 게놈에 대한 ARMAN-1 맵으로부터의 프로토스페이서(적색 화살표). 6개의 프로토스페이서는 2개의 긴-말단 반복부(long-terminal repeat: LTR)에 의해 측접된 게놈의 부분에 독특하게 맵핑되고, 2개의 추가적인 프로토스페이서는 LTR(청색 및 녹색) 내에서 완전하게 매칭된다. 이 영역은 트랜스포존일 가능성이 있는데, ARMAN-1의 CRISPR-Cas 시스템은 이 요소의 이동을 억제하는 역할을 한다는 것을 시사한다. b, 프로토스페이서는 또한 ARMAN 유기체와 동일한 샘플에서 발견된 리치몬드 마인 에코시스템(Richmond Mine ecosystem)의 다른 구성원인 써모플라즈마탈레스(Thermoplasmatales) 고세균(I-플라즈마)에 대해 맵핑한다. 프로토스페이서는 짧은, 가설 단백질을 암호화하는 게놈 영역 내에서 클러스터링하는데, 이것이 또한 이동 요소를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
도 27(패널 a 내지 e)은 ARMAN-1 crRNA 및 tracrRNA의 예측된 2차 구조를 제시한 도면. a, CRISPR 반복부 및 tracrRNA 항-반복부를 검정색으로 도시한 반면, 스페이서-유래 서열을 일련의 녹색 N으로 나타낸다. 좌위로부터 분명한 종결 신호를 예측할 수 없고, 따라서 3개의 상이한 tracrRNA 길이는 그들의 2차 구조(각각 적색, 청색 및 핑크색인 69, 104 및 179)에 기반하여 시험하였다. b, a. c에서 이중-가이드에 대응하는 조작된 단일-가이드 RNA, tracrRNA의 3' 말단 상에서 2개의 상이한 헤어핀(75 및 122)을 갖는 ARMAN-4 Cas9에 대한 이중-가이드. d, c에서의 이중-가이드에 대응하는 조작된 단일-가이드 RNA. e, 이콜라이 생체내 표적화 분석에서 시험한 조건.
도 28(패널 a 내지 b)은 시험관내 생화학 연구를 위한 정제 계획을 제시한 도면. a, ARMAN-1(AR1) 및 ARMAN-4(AR4) Cas9를 발현시키고 나서, 보충 물질에서 약술할 바와 같이 다양한 조건 하에 정제하였다. 청색 박스로 윤곽을 나타낸 단백질을 시험관내 절단 활성에 대해 시험하였다. b, AR1-Cas9 및 AR4-Cas9 정제 분획을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다.
도 29는 공지된 단백질에 비교하여 새로 동정된 CRISPR-Cas 시스템을 제시한 도면. 다음의 검색에 기반하여 알려진 단백질에 대한 CasX 및 CasY의 유사성: (1) NCBI의 흔하지 않은(non-redundant: NR) 단백질 데이터베이스에 대한 Blast 검색, (2) 모든 공지된 단백질의 HMM 데이터베이스에 대한 히든 마르코브 모델(Hidden markov model: HMM) 검색 및 (3) HHpred30을 이용하는 원위 상동성 검색.
도 30(패널 a 내지 f)는 CasX에 의한 프로그래밍된 DNA 간섭과 관련된 데이터를 제시한 도면. a, 도 20, 패널 c로부터 계속된 CasX2 (부유균문) 및 CasX1(델타프로테오박테리아)에 대한 플라스미드 간섭 분석(sX1, CasX 스페이서 1; sX2, CasX 스페이서 2; NT, 비-표적). 실험을 3회 중복하여 수행하고 평균 ± s.d.를 나타낸다. b, 도 20, 패널 b로부터 계속된, CasX 좌위를 발현시키고 구체화된 표적으로 형질감염된 이콜라이의 연속 희석. c, 델타프로테오박테리아 CasX에 대한 PAM 고갈 분석 및 d, 이콜라이에서 발현된 부유균문 CasX. 대조군 라이브러리에 비교하여 나타낸 PAM 고갈 값 역치(PDVT) 초과로 고갈된 PAM 서열을 사용하여 웹로고를 생성하였다. e, CasX.1에 대한 노던 블롯 프로브의 위치를 도시하는 다이어그램. f, CasX.1 좌위를 발현시키는 이콜라이로부터 추출된 총 RNA에서 CasX.1 tracrRNA에 대한 노던 블롯.
도 31은 Cas9 상동체의 진화계통수를 제시한 도면. 유형에 기반하여 색칠한 앞서 기재한 시스템을 나타내는 Cas9 단백질의 최대-가능성 계통수: II-A(청색), II-B(녹색) 및 II-C(보라색). 비배양 박테리아로부터의 2개의 새로 기재된 박테리아 Cas9와 함께 II-C형 CRISPR-Cas 시스템에 의한 클러스터인 고세균 Cas9.
도 32은 ARMAN-1 및 ARMAN-4로부터의 Cas9에 대해 분석한 절단 조건 표를 제시한 도면.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이종성"은 각각 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, CasX 폴리펩타이드에 대해, 이종성 폴리펩타이드는 CasX 폴리펩타이드 이외의 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 하나의 종으로부터의 CasX 단백질 부분은 상이한 종으로부터의 CasX 단백질 부분에 융합된다. 따라서 각각의 종으로부터의 CasX 서열은 서로에 대해 이종성인 것으로 고려될 수 있었다. 다른 예로서, CasX 단백질(예를 들어, dCasX 단백질)은 비-CasX 단백질(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제)로부터의 활성 도메인에 융합될 수 있고, 활성 도메인의 서열은 이종성 폴리펩타이드로 고려될 수 있었다(이는 CasX 단백질에 대해 이종성이다).
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 중 하나의 임의의 길이 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 기재 중인 실시형태에 적용 가능한, 단일-가닥(예컨대 센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 유전적으로 암호화된 그리고 비유전적으로 암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어는 N-말단의 메티오닌 잔기가 있거나 또는 없는, 이종성 아미노산 서열과의 융합 단백질, 이종성 및 상동성 리더 서열과의 융합; 면역학적으로 태그된 단백질 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 융합 단백질을 포함한다.
핵산, 단백질, 세포 또는 유기체에 적용되는 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 유래"는 천연에서 발견되는 핵산, 세포, 단백질 또는 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된"은 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 세포가 자연적으로 생기는 환경과 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 세포를 설명하는 것을 의미한다. 단리된 유전자 변형된 숙주 세포는 유전자 변형된 숙주 세포의 혼합 집단으로 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "외인성 핵산"은 천연에서 주어진 박테리아, 유기체 또는 세포에서 정상적으로 또는 자연적으로 발견되지 않고/않거나 생성되지 않는 핵산을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "내인성 핵산"은 천연에서 주어진 박테리아, 유기체 또는 세포에서 정상적으로 또는 자연적으로 발견되고/되거나 생성된 핵산을 지칭한다. "내인성 핵산"은 또한 "천연 핵산" 또는 주어진 박테리아, 유기체 또는 세포에 대해 "천연"인 핵산으로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 "재조합체"는 특정 핵산(DNA 또는 RNA)이 천연 시스템에서 발견되는 내인성 핵산과 구별 가능한 구조적 암호 또는 비-암호 서열을 갖는 작제물을 초래하는 클로닝, 제한 및/또는 결찰 단계의 다양한 조합의 생성물이라는 것을 의미한다. 일반적으로, 구조적 암호 서열을 암호화하는 DNA 서열은 세포에 또는 무세포 전사 및 번역 시스템에 함유된 재조합 전사 단위로부터 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하기 위해 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오타이드 링커로부터, 또는 일련의 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있다. 이러한 서열은 전형적으로 진핵 유전자에 존재하는 내부 비-번역 서열 또는 인트론에 의해 중단되지 않는 오픈 리딩 프레임 형태로 제공될 수 있다. 적절한 서열을 포함하는 게놈 DNA는 또한 재조합 유전자 또는 전사 단위의 형태로 사용될 수 있다. 비번역 DNA의 서열은 오픈 리딩 프레임으로부터의 5' 또는 3'에 존재할 수 있으며, 여기서 이러한 서열은 암호 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않고, 정말로 다양한 메커니즘에 의해 목적으로 하는 생성물의 생성물을 조작하도록 작용할 수 있다("DNA 조절 서열" 참조, 이하).
따라서, 예를 들어, 용어 "재조합" 폴리뉴클레오타이드 또는 "재조합" 핵산은 천연 유래가 아닌 것, 예를 들어, 인간 개입을 통해 서열의 2개의 다르게 분리된 세그먼트의 인공 조합에 의해 만들어진 것을 지칭한다. 이 인공 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 핵산의 단리된 세그먼트의 인공 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기법에 의해 수행된다. 이는 보통 코돈을 동일한 또는 보존적 아미노산을 암호화하는 풍부한 코돈으로 대체하는 한편, 전형적으로 서열 인식 부위를 도입하거나 또는 제거하기 위해 행한다. 대안적으로, 목적으로 하는 기능의 조합을 생성하기 위해 목적으로 하는 기능의 핵산 세그먼트를 함께 결합하도록 수행된다. 이 인공 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 핵산의 단리된 세그먼트의 인공 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기법에 의해 수행된다.
유사하게, 용어 "재조합" 폴리펩타이드는 천연 유래가 아니며, 예를 들어, 인간 개입을 통해 아미노 서열의 2개의 다르게 분리된 세그먼트의 인공 조합물에 의해 제조된 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 이종성 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 재조합이다.
"작제물" 또는 "벡터"는 특정 뉴클레오타이드 서열(들)의 발현 및/또는 증식의 목적을 위해 생성된, 또는 다른 재조합 뉴클레오타이드 서열의 작제물에서 사용될 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미한다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"는 암호 서열의 발현 및/또는 숙주 세포에서 암호화된 폴리펩타이드의 생성을 제공하고/하거나 조절하는 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호 등을 지칭한다.
용어 "형질전환"은 본 명세서에서 "유전자 변형"과 상호 호환적으로 사용되고, 세포 내로 새로운 핵산(예를 들어, 세포에 외인성인 DNA)의 도입 후 세포에 유도된 영구한 또는 일시적 유전자 변화를 지칭한다. 유전자 변화("변형")는 숙주 세포의 게놈 내로 새로운 핵산의 혼입에 의해, 또는 에피솜 요소로서 새로운 핵산의 일시적 또는 안정한 유지에 의해 달성될 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우에, 영구한 유전자 변화는 일반적으로 세포 게놈 내로 새로운 DNA의 도입에 의해 달성된다. 원핵세포에서, 염색체 내로 또는 염색체외 요소, 예컨대 플라스미드 및 발현 벡터를 통해 영구적 변화가 도입될 수 있는데, 이는 재조합 숙주 세포에서 그들의 유지에 도움을 주는 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 유전자 변형의 적합한 방법은 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공법, 입자총 기법, 인산칼슘 침전, 직접 마이크로주사 등을 포함한다. 방법의 선택은 일반적으로 형질감염 중인 세포의 유형 및 형질감염이 일어나는 환경(즉, 시험관내, 생체외 또는 생체내)에 의존한다. 이들 방법의 일반적 논의는 문헌[Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]에서 찾을 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계인 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 그의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 프로모터는 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성 프로모터" 및 "이종성 제어 영역"은 천연에서 특정 핵산과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터 및 다른 제어 영역을 지칭한다. 예를 들어, "암호 영역에 대해 이종성인 전사 제어 영역"은 천연에서 암호 영역과 정상적으로 결합되지 않은 전사 제어 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"는 진핵 또는 원핵 세포가 핵산에 대한 수용자(예를 들어, 발현 벡터)로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고, 핵산에 의해 유전자 변형된 본래의 세포의 자손을 포함하는, 생체내 또는 시험관내 진핵 세포, 원핵 세포 또는 단세포 독립체로서 배양시킨 다세포 유기체로부터의 세포(예를 들어, 세포주)를 나타낸다. 단일 세포의 자손은 단일 세포의 자손은 천연, 우연한 또는 의도적인 돌연변이에 기인하여, 본래의 모체와 형태가 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체와 완전히 동일할 필요는 없다는 것이 이해된다. "재조합 숙주 세포"(또한 "유전자 변형된 숙주 세포"로서 지칭됨)는 이종성 핵산, 예를 들어, 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 예를 들어, 대상 원핵 숙주 세포는 이종성 핵산, 예를 들어, 원핵 숙주 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 원핵 숙주 세포 또는 재조합 핵산에 대해 외래인(그리고 천연에서 정상적으로 발견되지 않는) 외인성 핵산의 적합한 원핵 숙주 세포 내로의 도입에 의한 유전자 변형된 원핵 숙주 세포(예를 들어, 박테리아)이고; 그리고 대상 진핵 숙주 세포는 이종성 핵산, 예를 들어, 진핵 숙주 세포에 정상적으로 발견되지 않는 진핵 숙주 세포, 또는 재조합 핵산에 대해 외래인 외인성 핵산의 적합한 진핵 숙주 세포 내로 도입에 의한 유전자 변형된 진핵 숙주 세포이다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 단백질에서의 상호 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신으로 이루어지며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌으로 이루어지고; 아마이드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어지고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 알기닌 및 히스티딘으로 이루어지며; 그리고 황-함유 측쇄를 갖는 아미노기의 그룹은 시스테인 및 메티오닌으로 이루어진다. 예시적인 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-알기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 특정 "서열 동일성" 백분율을 갖는데, 이는 정렬될 때, 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일하고, 두 서열을 비교할 때 동일한 상대적 위치에 있다는 것을 의미한다. 서열 유사성은 다수의 상이한 방식으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 월드 와이드 웹에 대해 이용 가능한 BLAST를 포함하는 방법 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 정렬될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1990), J. Mol . Biol . 215:403-10] 참조. 다른 정렬 알고리즘은 옥스퍼드 몰레큘러 그룹, 인코포레이티드(Oxford Molecular Group, Inc.)의 전액 출자된 자회사인 미국 위스콘신주 메디슨에 소재한 제네틱스 컴퓨팅 그룹(Genetics Computing Group: GCG) 패키지에서 이용 가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기법은 문헌[Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA]에 기재되어 있다. 특정 관심 대상 중에서 서열 내 갭을 허용하는 정렬 프로그램이다. 스미스-워터만(Smith-Waterman)은 서열 정렬에서 갭을 허용하는 알고리즘 중 하나의 유형이다. 문헌[Meth . Mol . Biol . 70: 173-187 (1997)] 참조. 또한, 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 정렬 방법을 이용하는 GAP 프로그램은 서열을 정렬하기 위해 이용될 수 있다. 문헌[J. Mol . Biol. 48: 443-453 (1970)] 참조.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 등은 목적으로 하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 것에 관해 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해한 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 관해 치유적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류에서, 예를 들어, 인간에서의 질환의 임의의 치료를 아우르며, (a) 질환의 성향이 있을 수 있지만, 그것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 뮤린, 유인원, 인간, 포유류 농장 동물, 포유류 스포츠 동물 및 포유류 반려동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 개개 유기체, 예를 들어, 포유류를 지칭한다.
본 발명을 추가로 기재하기 전에, 본 발명은 기재한 특정 실시형태로 제한되지 않으며, 그렇게 해서 물론 다를 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는데, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
수치의 범위가 제공되는 경우에, 문맥에서 달리 분명하게 나타내지 않는 한, 해당 범위 및 해당 언급된 범위에서의 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값의 상한과 하한 사이에서 하한 단위의 1/10까지의 각각의 사이의 값은 본 발명 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 본 발명 내에 포함되며, 언급됨 범위 내에서 임의의 구체적으로 제외된 제한이 적용된다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 간행물과 함께 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 명세서에 사용되고 첨부하는 청구범위에 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 분명하게 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것임을 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "CasX 폴리펩타이드"에 대한 언급은 복수의 이러한 폴리펩타이드를 포함하고, "가이드 RNA"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 가이드 RNA 및 이의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것을 추가로 주목한다. 이렇게 해서, 이러한 언급은 청구범위 요소의 열거와 관련하여 "유일하게", "단지" 등의 사용 또는 "음성" 제한의 사용을 위한 선행 기준으로서 작용하는 것으로 의도된다.
명확함을 위해 별개의 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시형태에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인식된다. 대조적으로, 간결함을 위해 단일 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고, 각각의 그리고 모든 조합이 개별적으로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다. 추가로, 다양한 실시형태의 모든 하위 조합 및 이의 요소는 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고, 각각의 그리고 모든 이러한 하위 조합이 개별적으로 그리고 명확하게 본 명세서에 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에서 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명 때문에 이러한 간행물보다 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 간행물의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 간행물과 상이할 수 있다.
상세한 설명
본 발명의 개시내용은 본 명세서에서 "CasX" 폴리펩타이드로서 지칭되는(또한 "CasX 단백질"로서 지칭됨) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 폴리펩타이드; CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및 CasX 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 숙주 세포 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 제공한다. 제공되는 CasX 폴리펩타이드는 다양한 적용분야에서 유용하다.
본 개시내용은 CasX 단백질에 결합하고 이에 대한 서열 특이성을 제공하는 가이드 RNA(본 명세서에서 "CasX 가이드 RNA"로서 지칭됨); CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산; 및 CasX 가이드 RNA 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 제공되는 CasX 가이드 RNA는 다양한 적용분야에서 유용하다.
본 개시내용은 고세균 Cas9 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 이와 회합된 가이드 RNA(고세균 Cas9 가이드 RNA) 및 이를 암호화하는 핵산을 제공한다.
조성물
CRISPR / CasX 단백질 및 가이드 RNA
CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, CasX 단백질)는 대응하는 가이드 RNA(예를 들어, CasX 가이드 RNA)와 상호작용(결합)하여 표적 핵산 분자 내에서 가이드 RNA와 표적 서열 사이의 염기쌍을 통해 표적 핵산 내 특정 부위로 표적화된 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다. 가이드 RNA는 표적 핵산의 서열(표적 부위)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열(가이드 서열)을 포함한다. 따라서, CasX 단백질은 CasX 가이드 RNA와 복합체를 형성하고, 가이드 RNA는 가이드 서열을 통해 RNP 복합체에 서열 특이성을 제공한다. 복합체의 CasX 단백질은 부위-특이적 활성을 제공한다. 다시 말해서, CasX 단백질은 가이드 RNA와 그의 결합 덕분에 표적 핵산 서열(예를 들어, 염색체 서열 또는 염색체외 서열, 예를 들어, 에피솜 서열, 소형 고리형 서열, 미토콘드리아 서열, 엽록체 서열 등) 내에서 표적 부위(예를 들어, 표적 부위에서 안정화됨)로 가이드된다.
본 개시내용은 CasX 폴리펩타이드(및/또는 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)(예를 들어, CasX 폴리펩타이드가 자연적으로 존재하는 단백질일 수 있는 경우에, 틈내기효소 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질 등)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 CasX 가이드 RNA(및/또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)(예를 들어, CasX 가이드 RNA가 이중 또는 단일 가이드 형식일 수 있는 경우)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 (a) CasX 폴리펩타이드(및/또는 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)(예를 들어, CasX 폴리펩타이드가 자연적으로 존재하는 단백질일 수 있는 경우에, 틈내기효소 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질 등) 및 (b) CasX 가이드 RNA(및/또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산)(예를 들어, CasX 가이드 RNA가 이중 또는 단일 가이드 형식일 수 있는 경우)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은: (a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드(예를 들어, CasX 폴리펩타이드가 자연적으로 존재하는 단백질, 틈내기효소 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질 등일 수 있는 경우); 및 (b) CasX 가이드 RNA(예를 들어, CasX 가이드 RNA가 이중 또는 단일 가이드 형식일 수 있는 경우)를 포함하는 핵산/단백질 복합체(RNP 복헵체)를 제공한다.
CasX 단백질
CasX 폴리펩타이드(이 용어는 용어 "CasX 단백질"과 상호 호환적으로 사용됨)는 표적 핵산과 결합된 표적 핵산 및/또는 폴리펩타이드에 결합하고/하거나 변형할 수 있다(예를 들어, 절단, 틈내기, 메틸화, 데메틸화 등)(예를 들어, 히스톤 꼬리의 메틸화 또는 아세틸화)(예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 활성을 갖는 융합 상대를 포함하고, 일부 경우에 CasX 단백질은 뉴클레아제 활성을 제공한다). 일부 경우에, CasX 단백질은 천연 유래 단백질이다(예를 들어, 원핵 세포에서 자연적으로 생긴다). 다른 경우에, CasX 단백질은 천연 유래 폴리펩타이드가 아니다(예를 들어, CasX 단백질은 변이체 CasX 단백질, 키메라 단백질 등이다).
주어진 단백질이 CasX 가이드 RNA와 상호작용하는지의 여부를 결정하는 분석은 단백질과 핵산 사이의 결합에 대해 시험하는 임의의 편리한 결합 분석일 수 있다. 적합한 결합 분석(예를 들어, 겔 이동 분석)은 당업자에게 공지될 것이다(예를 들어, CasX 가이드 RNA 및 표적 핵산에 대한 단백질의 첨가를 포함하는 분석). 단백질이 활성을 갖는지의 여부를 결정하는(예를 들어, 단백질이 표적 핵산을 절단하는 뉴클레아제 활성 및/또는 일부 이종성 활성을 갖는지의 여뷰를 결정하는) 분석은 임의의 편리한 분석(예를 들어, 핵산 절단에 대해 시험하는 임의의 편리한 핵산 절단 분석)일 수 있다. 적합한 분석(예를 들어, 절단 분석)은 당업자에게 공지될 것이다.
천연 유래 CasX 단백질은 표적화된 이중 가닥 DNA(dsDNA) 내 특정 서열에서 이중 가닥 파손을 촉매하는 엔도뉴클레아제로서 작용한다. 서열 특이성은 표적 DNA 내에서 표적 서열에 혼성화하는 회합된 가이드 RNA에 의해 제공된다. 천연 유래 가이드 RNA는 crRNA에 혼성화된 tracrRNA를 포함하며, 여기서 crRNA는 표적 DNA에서 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열 포함하는 단백질 결합 세그먼트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상 방법 및/또는 조성물의 CasX 단백질은 천연 유래(야생형) 단백질이다(또는 이로부터 유래된다). 천연 유래 CasX 단백질의 예는 도 1에 도시하고 서열번호 1 내지 2에 제시한다. 천연 유래 CasX 단백질의 예는 도 1에 도시하고 서열번호 1 내지 3에 제시한다. 2개의 천연 유래 CasX 단백질의 정렬은 도 2에 제시된다('gwa2'는 CasX1이고, 'gwc2'는 CasX2임). 서열분석 데이터로부터(델타프로테오박테리아(Deltaproteobacter)(gwa2 스캐폴드)로부터 그리고 부유균문(gwc2 스캐폴드)으로부터) 조립된 CRISPR 좌위의 부분적 DNA 스캐폴드는 각각 서열번호 51 및 52로서 제시된다. 이 새로 발견된 단백질(CasX)은 이전에 동정된 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제에 비해 짧고, 따라서 대안으로서 이 단백질의 사용은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드가 상대적으로 짧다는 이점을 제공한다는 것을 주목하는 것은 중요하다. 이는, 예를 들어, 연구 및/또는 임상 적용을 위한 세포, 예컨대 진핵 세포(예를 들어, 시험관내, 생체외, 생체내 포유류 세포, 인간 세포, 마우스 세포)에 대한 전달을 위해 CasX 단백질을 암호화하는 핵산이 바람직한 경우에, 예를 들어, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 사용하는 경우에 유용하다. 또한 CasX CRISPR 좌위를 보유하는 박테리아는 저온(예를 들어, 10 내지 17℃)에서 수집된 환경 샘플에 존재한다는 것이 본 명세서에서 주목된다. 따라서, CasX는 저온(예를 들어, 10 내지 14℃, 10 내지 17℃, 10 내지 20℃)에서 제대로 작용할 수 있는 것으로 예상된다(예를 들어, 지금까지 발견된 다른 Cas 엔도뉴클레아제보다 더 양호함).
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 단백질의 천연 유래 촉매 활성을 감소시키는 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)(예를 들어, 이하에 기재하는 아미노산 위치)을 포함한다는 것을 제외하고, 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 단백질의 천연 유래 촉매 활성을 감소시키는 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)(예를 들어, 이하에 기재하는 아미노산 위치)을 포함한다는 것을 제외하고, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 단백질의 천연 유래 촉매 활성을 감소시키는 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)(예를 들어, 이하에 기재하는 아미노산 위치)을 포함한다는 것을 제외하고, 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2 중 임의의 하나에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 단백질의 천연 유래 촉매 활성을 감소시키는 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)(예를 들어, 이하에 기재하는 아미노산 위치)을 포함한다는 것을 제외하고, 서열번호 1 및 2 중 임의의 하나에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나와 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3 중 임의의 하나에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 단백질의 천연 유래 촉매 활성을 감소시키는 아미노산 치환(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환)(예를 들어, 이하에 기재하는 아미노산 위치)을 포함한다는 것을 제외하고, 서열번호 1 내지 3 중 임의의 하나에 제시된 CasX 단백질 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CasX 단백질 도메인
CasX 단백질의 도메인을 도 3에 도시한다. 도 3의 개략적 표현에 알 수 있는 바와 같이(아미노산은 CasX1 단백질에 기반하여 넘버링됨(서열번호 1)), CasX 단백질은 길이가 거의 650개의 아미노산인 N-말단의 도메인(예를 들어, CasX1에 대해 약 663 및 CasX2에 대해 약 650), 및 CasX 단백질의 주요 아미노산 서열에 대해 인접하지 않지만, 일단 단백질이 생성되고 폴딩된다면 RuvC 도메인을 형성하는 3개의 부분적 RuvC 도메인(RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III, 또한 본 명세서에서 서브도메인으로서 지칭됨)을 포함하는 C-말단의 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 N-말단 도메인(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)에 대해 N-말단인 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670, 또는 650-670개의 아미노산) 범위인(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음) 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1로서 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 650); 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1로서 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 650); 및 분할 Ruv C 도메인(예를 들어, 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III)을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질의 분할 RuvC 도메인은 RuvC-III 서브도메인보다 더 큰 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이다. 일부 경우에, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이다. 일부 경우에, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이다.
(대상 조성물 및/또는 방법의 CasX 단백질에 대해) 일부 실시형태에서, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이다. 예를 들어, 일부 경우에, RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이다. 일부 실시형태에서, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인의 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4)의 범위이다.
(대상 조성물 및/또는 방법의 CasX 단백질에 대해)일부 경우에, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이다. 일부 경우에, RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이다.
(대상 조성물 및/또는 방법의 CasX 단백질에 대해) 일부 경우에, RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87 개의 아미노산)이다. 예를 들어, 일부 경우에, RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이다. 일부 경우에, RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이다. 일부 경우에, RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산의 범위)이다. 일부 경우에, RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산의 범위)이다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하고 - 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 N-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대해 아미노산 1 내지 663으로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 제1 아미노산 서열; 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하며 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1로서 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 663에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 1 내지 650); 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III을 포함하는 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단인 제2 아미노산 서열을 포함하고- 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 N-말단인 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670, 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 길이를 갖는 N-말단 도메인을 갖는 제1 아미노산 서열(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 갖는 분할 Ruv C 도메인을 갖는 제2 아미노산 서열(제1에 대해 C-말단)을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 3개의 부분적 RuvC 도메인 - RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III을 갖는 분할 Ruv C 도메인에 대해 N-말단인 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670, 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 길이를 갖는 제1 아미노산 서열(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음)을 포함하며, 여기서: (i) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 대 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역 길이비는 1.1 이상(예를 들어, 1.2)이고; (ii) RuvC-III 서브도메인의 길이에 대해 RuvC-II 내지 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이고; (iii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2)이며; (iv) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 2 이하(예를 들어, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하 또는 1.4 이하)이고; (v) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1.5 이하(예를 들어, 1.4 이하)이며; (vi) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II 서브도메인 길이비는 1 내지 2(예를 들어, 1.1 내지 2, 1.2 내지 2, 1 내지 1.8, 1.1 내지 1.8, 1.2 내지 1.8, 1 내지 1.6, 1.1 내지 1.6, 1.2 내지 1.6, 1 내지 14, 1.1 내지 1.4, 또는 1.2 내지 1.4) 범위이고; (vii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과이며; (viii) RuvC-III 서브도메인 길이에 대해 RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역의 길이비는 1 초과 및 1 내지 1.3(예를 들어, 1 내지 1.2) 이고; (ix) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 73개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 75, 77, 80, 85 또는 87개의 아미노산)이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 78개의 아미노산(예를 들어, 길이가 적어도 80, 85 또는 87개의 아미노산)이며; (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 85개의 아미노산이고; (x) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 적어도 길이가 75 내지 100개의 아미노산 범위(예를 들어, 75-95, 75-90, 75-88, 78-100, 78-95, 78-90, 78-88, 80-100, 80-95, 80-90, 80-88, 83-100, 83-95, 83-90, 83-88, 85-100, 85-95, 85-90 또는 85-88개의 아미노산 범위)이거나; 또는 (xi) RuvC-II와 RuvC-III 서브도메인 사이의 영역은 길이가 80 내지 95개의 아미노산 범위(예를 들어, 80-90, 80-88, 83-95, 83-90, 83-88, 85-95, 85-90 또는 85-88개 아미노산 범위)의 길이를 가진다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 3에 제시된 CasX 단백질 서열의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)(예를 들어, 서열번호 2로서 제시된 CasX 단백질에 대해 아미노산 651 내지 978)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 및 2에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1로서 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 651 내지 978)을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 2로서 제시된 CasX 단백질 서열(예를 들어, 서열번호 2로서 제시된 CasX 단백질에 대한 아미노산 651 내지 978) 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 2로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 2로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 2로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질의 아미노산 651 내지 978)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대해 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)(예를 들어, 서열번호 2로서 제시된 CasX 단백질에 대해 아미노산 651 내지 978)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인, 패널 a)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3의 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986으로서 도시된 도메인, 패널 a)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 서열번호 1로서 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 651 내지 978)을 포함한다.
일부 경우에, (대상 조성물 및/또는 방법의) CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 3으로서 제시된 CasX 단백질 서열(예를 들어, 서열번호 2로서 제시된 CasX 단백질에 대한 아미노산 651 내지 978) 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 20% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 3으로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 3으로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1 내지 3으로서 제시된 CasX 단백질 서열 중 임의의 하나의 C-말단 도메인(예를 들어, 도 3, 패널 a에서 CasX1에 대한 아미노산 664 내지 986로서 도시된 도메인)과 90% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, CasX 단백질은 길이가 500 내지 750개의 아미노산(예를 들어, 550-750, 600-750, 640-750, 650-750, 500-700, 550-700, 600-700, 640-700, 650-700, 500-680, 550-680, 600-680, 640-680, 650-680, 500-670, 550-670, 600-670, 640-670 또는 650-670개의 아미노산) 범위인 제1 아미노산 서열(N-말단 도메인)(예를 들어, 임의의 융합된 이종성 서열, 예컨대 NLS 및/또는 촉매 활성을 갖는 도메인을 포함하지 않음); 및 서열번호 1에 제시된 CasX 단백질 서열의 아미노산 664 내지 986에 대응하는 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2에 제시된 CasX 단백질의 아미노산 651 내지 978)을 갖는, 제1 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치된 제2 아미노산 서열을 포함한다.
CasX 변이체
변이체 CasX 단백질은 대응하는 야생형 CasX 단백질의 아미노산 서열에 비교할 때 적어도 하나의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열을 가진다(예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 융합을 가진다). 이중 가닥 표적 핵산 중 한 가닥을 절단하지만, 다른 한 가닥은 절단하지 않는 CasX 단백질은 본 명세서에서 "틈내기효소"(예를 들어, "틈내기효소 CasX"로서 지칭된다. 뉴클레아제 활성이 실질적으로 없는 CasX 단백질은 본 명세서에서 사멸 CasX 단백질("dCasX")로서 지칭된다(뉴클레아제 활성이 이하에 상세하게 기재되는 키메라 CasX 단백질의 경우에 이종성 폴리펩타이드(융합 상대)에 의해 제공될 수 있다는 경고가 있음). 본 명세서에 기재된 임의의 CasX 변이체 단백질(예를 들어, 틈내기효소 CasX, dCasX, 키메라 CasX)에 대해, CasX 변이체는 상기 기재된 것과 동일한 매개변수(예를 들어, 존재하는 도메인, 동일성 백분율 등)를 갖는 CasX 단백질 서열을 포함할 수 있다.
변이체 - 촉매 활성
일부 경우에, CasX 단백질은, 예를 들어, 천연 유래 촉매적으로 활성인 서열에 대해 돌연변이된 변이체 CasX 단백질이고, 대응하는 천연 유래 서열에 비교할 때 감소된 절단 활성을 나타낸다(예를 들어, 90%, 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하 또는 30% 이하의 절단 활성을 나타낸다). 일부 경우에, 이러한 변이체 CasX 단백질은 촉매적으로 '사멸' 단백질이고(절단 활성이 실질적으로 없음) 'dCasX'로서 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 변이체 CasX 단백질은 틈내기효소이다(이중 가닥 표적 핵산, 예를 들어, 이중 가닥 표적 DNA의 단지 하나의 가닥을 절단함). 본 명세서에서 더 상세하게 기재되는 바와 같이, 일부 경우에, CasX 단백질(일부 경우에, 야생형 절단 활성을 갖는 CasX 단백질 및 일부 경우에 감소된 절단 활성을 갖는 변이체 CasX, 예를 들어, dCasX 또는 틈내기효소 CasX)은 융합 단백질(키메라 CasX 단백질)을 형성하기 위해 관심 대상의 활성(예를 들어, 관심 대상의 촉매 활성)을 갖는 이종성 폴리펩타이드에 융합된다(접합된다).
CasX의 보존된 촉매적 잔기는 CasX1(서열번호 1)에 따라 넘버링될 때 D672, E769, D935 및 CasX2(서열번호 2)에 따라 넘버링될 때 659D, 756E, 및 922D를 포함한다(이들 잔기를 도 1에 밑줄 표시함). (도 2의 배열에서, 넘버링은 CasX 단백질로 추적하지 않지만, 대신에 그 자체의 정렬로 추적한다는 것을 주목한다. 이 단락에서 상기 언급한 보존된 잔기는 도면에 표시하며, CasX2는 상부 서열('gwc2')이고, CasX1은 하부 서열('gwa2')임).
따라서, 일부 경우에, CasX 단백질은 감소된 활성을 가지고, 상기 기재된 아미노산 중 하나 이상(또는 임의의 CasX 단백질의 하나 이상의 대응하는 아미노산)이 돌연변이된다(예를 들어, 알라닌으로 치환된다). 일부 경우에, 변이체 CasX 단백질은 촉매적으로 '사멸' 단백질이고(촉매적으로 비활성임), 'dCasX'로서 지칭된다. dCasX 단백질은 활성을 제공하는 융합 상대에 융합될 수 있고, 그리고 일부 경우에, dCasX(예를 들어, 촉매 활성을 제공하지만, 진핵 세포에서 발현될 때 NLS를 가질 수 있는 융합 상대가 없는 하나)는 표적 DNA에 결합할 수 있고, 표적 DNA로부터의 번역으로부터 RNA 중합효소를 차단할 수 있다. 일부 경우에, 변이체 CasX 단백질은 틈내기효소이다(이중 가닥 표적 핵산, 예를 들어, 이중 가닥 표적 DNA의 단지 하나의 가닥을 절단함).
변이체 - 키메라 CasX (즉, 융합 단백질)
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, CasX 단백질(일부 경우에, 야생형 절단 활성을 갖는 CasX 단백질 및 일부 경우에 감소된 절단 활성을 갖는 변이체 CasX, 예를 들어, dCasX 또는 틈내기효소 CasX)은 융합 단백질(키메라 CasX 단백질)을 형성하기 위해 관심 대상의 활성(예를 들어, 관심 대상의 촉매 활성)을 갖는 이종성 폴리펩타이드에 융합된다(접합된다). CasX 단백질이 융합될 수 있는 이종성 폴리펩타이드는 본 명세서에서 '융합 상대'로서 지칭된다.
일부 경우에, 융합 상대는 표적 DNA의 전사를 조절할 수 있다(예를 들어, 전사를 저해, 전사를 증가시킬 수 있다). 예를 들어, 일부 경우에 융합 상대는 전사를 저해하는 단백질(또는 단백질로부터의 도메인)(예를 들어, 전사 리프레서, 전사 저해제 단백질의 보충을 통해 작용하는 단백질, 표적 DNA의 변형, 예컨대 메틸화, DNA 변형제의 보충, 표적 DNA와 회합된 히스톤의 조절, 히스톤 변형제, 예컨대 히스톤의 아세틸화 및/또는 메틸화를 변형시키는 것의 보충 등)이다. 일부 경우에 융합 상대는 전사를 증가시키는 단백질(또는 단백질로부터의 도메인)(예를 들어, 전사 활성체, 전사 활성체 단백질의 보충을 통해 작용하는 단백질, 표적 DNA의 변형, 예컨대 탈메틸화의 변형, DNA 변형제의 보충, 표적 DNA와 회합된 히스톤의 조절, 히스톤 변형제, 예컨대 히스톤의 아세틸화 및/또는 메틸화를 변형시키는 것의 보충 등)이다.
일부 경우에, 키메라 CasX 단백질은 표적 핵산을 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 또는 글리코실라제 활성)을 갖는 이종성 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 경우에, 키메라 CasX 단백질은 표적 핵산과 회합된 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤)를 변형하는 효소 활성(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화(SUMOylating) 활성, 탈수모일화(deSUMOylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성)을 갖는 이종성 폴리펩타이드를 포함한다.
전사 증가에서 사용될 수 있는 단백질(또는 이의 단편)의 예는 전사 활성체, 예컨대 VP16, VP64, VP48, VP160, p65 서브도메인(예를 들어, NFkB로부터 유래), 및 EDLL의 활성화 도메인 및/또는 TAL 활성화 도메인(예를 들어, 식물의 활성에 대해); 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 SET1A, SET1B, MLL1 내지 5, ASH1, SYMD2, NSD1 등; 히스톤 라이신 데메틸라제, 예컨대 JHDM2a/b, UTX, JMJD3 등; 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 예컨대 GCN5, PCAF, CBP, p300, TAF1, TIP60/PLIP, MOZ/MYST3, MORF/MYST4, SRC1, ACTR, P160, CLOCK 등; 및 DNA 데메틸라제, 예컨대 염색체 10번과 11번 사이의 전좌(Ten-Eleven Translocation: TET) 다이옥시게나제 1(TET1CD), TET1, DME, DML1, DML2, ROS1 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
전사 감소에서 사용될 수 있는 단백질(또는 이의 단편)의 예는 전사 리프레서, 예컨대 쿠루펠(
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) 관련 박스(KRAB 또는 SKD); KOX1 억제 도메인; Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID); ERF 리프레서 도메인(ERD), SRDX 억제 도메인(예를 들어, 식물에서의 억제를 위해) 등; 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 Pr-SET7/8, SUV4-20H1, RIZ1 등; 히스톤 라이신 데메틸라제, 예컨대 JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, JARID1A/RBP2, JARID1B/PLU-1, JARID1C/SMCX, JARID1D/SMCY 등; 히스톤 라이신 데아세틸라제, 예컨대 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, SIRT1, SIRT2, HDAC11 등; DNA 메틸라제, 예컨대 HhaI DNA m5c-메틸트랜스퍼라제(M.HhaI), DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1), DNA 메틸트랜스퍼라제 3a(DNMT3a), DNA 메틸트랜스퍼라제 3b(DNMT3b), METI, DRM3(식물), ZMET2, CMT1, CMT2(식물) 등; 및 주변 보충 요소, 예컨대 라민(Lamin) A, 라민 B 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 융합 상대는 표적 핵산(예를 들어, ssRNA, dsRNA, ssDNA, dsDNA)을 변형시키는 효소 활성을 가진다. 융합 상대에 의해 제공될 수 있는 효소 활성의 예는 뉴클레아제 활성, 예컨대 제한 효소(예를 들어, FokI 뉴클레아제)에 의해 제공되는 것, 메틸트랜스퍼라제 활성, 예컨대 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, HhaI DNA m5c-메틸트랜스퍼라제(M.HhaI), DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1), DNA 메틸트랜스퍼라제 3a (DNMT3a), DNA 메틸트랜스퍼라제 3b(DNMT3b), METI, DRM3(식물), ZMET2, CMT1, CMT2(식물) 등)에 의해 제공되는 것; 데메틸라제 활성, 예컨대 데메틸라제(예를 들어, 염색체 10번과 11번 사이의 전좌(TET) 다이옥시게나제 1(TET1CD), TET1, DME, DML1, DML2, ROS1 등)에 의해 제공되는 것, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 예컨대 데아미나제(예를 들어, 사이토신 데아미나제 효소, 예컨대 래트 APOBEC1)에 의해 제공되는 것, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 예컨대 인테그라제 및/또는 레솔바제(예를 들어, Gin 인버타제, 예컨대 Gin 인버타제의 과활성 돌연변이체, GinH106Y; 인간 면역결핍 바이러스 1형 인테그라제(IN); Tn3 레솔바제; 등)에 의해 제공되는 것, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 예컨대 재조합효소(예를 들어, Gin　재조합효소의 촉매 도메인)에 의해 제공되는 것, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성, 및 글리코실라제 활성)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 융합 상대는 표적 핵산(예를 들어, ssRNA, dsRNA, ssDNA, dsDNA)과 회합되는 단백질(예를 들어, 히스톤, RNA 결합 단백질, DNA 결합 단백질 등)을 변형시키는 효소 활성을 가진다. 융합 상대에 의해 제공될 수 있는 (표적 핵산과 회합된 단백질을 변형시키는) 효소 활성의 예는 메틸트랜스퍼라제 활성, 예컨대 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT)에 의해 제공되는 것(예를 들어, 얼룩 3-9 상동체 1의 억제자(SUV39H1, 또한 KMT1A로서 알려짐), 진정염색성 히스톤 라이신 메틸트랜스퍼라제 2(G9A, 또한 KMT1C 및 EHMT2로서 알려짐), SUV39H2, ESET/SETDB1 등, SET1A, SET1B, MLL1 내지 5, ASH1, SYMD2, NSD1, DOT1L, Pr-SET7/8, SUV4-20H1, EZH2, RIZ1), 데메틸라제 활성, 예컨대 히스톤 데메틸라제(예를 들어, 라이신 데메틸라제 1A(또한 LSD1로서 알려진 KDM1A), JHDM2a/b, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, JARID1A/RBP2, JARID1B/PLU-1, JARID1C/SMCX, JARID1D/SMCY, UTX, JMJD3 등)에 의해 제공되는 것, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 예컨대 히스톤 아세틸라제 트랜스퍼라제에 의해 제공되는 것(예를 들어, 촉매 코어/인간 아세틸트랜스퍼라제 p300, GCN5, PCAF, CBP, TAF1, TIP60/PLIP, MOZ/MYST3, MORF/MYST4, HBO1/MYST2, HMOF/MYST1, SRC1, ACTR, P160, CLOCK 등의 단편), 데아세틸라제 활성, 예컨대 히스톤 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, SIRT1, SIRT2, HDAC11 등)에 의해 제공되는 것, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화 활성, 리보실화 활성, 데리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 및 데미리스토일화 활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 융합 상대의 추가적인 예는 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 탈안정화 도메인(예를 들어, 화학적으로 제어 가능한 키메라 키메라 CasX 단백질을 생성), 및 엽록체 수송 펩타이드이다. 적합한 엽록체 수송 펩타이드는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
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일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드; 및 b) 엽록체 수송 펩타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, CRISPR-CasX 복합체는 엽록체에 표적화될 수 있다. 일부 경우에, 이 표적화는 엽록체 수송 펩타이드(CTP) 또는 색소체 수송 펩타이드로 불리는 N-말단 연장의 존재에 의해 달성될 수 있다. 발현된 폴리펩타이드가 식물 색소체(예를 들어, 엽록체)에서 구획화된다면, 박테리아 공급원으로부터의 염색체 이식유전자는 발현된 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 융합된 CTP 서열을 암호화하는 서열을 가져야 한다. 따라서, 엽록체에 대한 외인성 폴리펩타이드의 국소화는 종종 외인성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 영역에 CTP 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 작동 가능하게 연결함으로써 1 달성된다. CTP는 색소체 내로 전좌 동안 가공 단계에서 제거된다. 그러나, 가공 효율은 펩타이드의 CTP의 서열 그리고 NH 2 말단에서 근처의 서열에 의해 영향받을 수 있다. 기재된 엽록체에 대한 표적화를 위한 다른 선택은 마이스 cab-m7 신호 서열(미국 특허 제7,022,896호, WO 97/41228) 완두콩 글루타티온 환원효소 신호 서열(WO 97/41228) 및 미국 특허 제2009029861호에 기재된 CTP이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드; 및 b) 엔도솜 탈출 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 엔도솜 탈출 폴리펩타이드는 아미노산 서열 GLFXALLXLLXSLWXLLLXA(서열번호 94)을 포함하되, 각각의 X는 라이신, 히스티딘 및 알기닌으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 경우에, 엔도솜 탈출 폴리펩타이드는 아미노산 서열 GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(서열번호 95)을 포함한다.
(부위 특이적 표적 변형, 전사의 조절 및/또는 표적 단백질 변형, 예를 들어, 히스톤 변형에 대해) Cas9, 아연 핑거 및/또는 TALE 단백질과의 융합과 관련하여 사용되는 상기 융합 상대의 일부(그리고 더 많은) 예는, 예를 들어, 문헌[Nomura et al,, J Am Chem Soc. 2007 Jul 18;129(28):8676-7; Rivenbark et al., Epigenetics.　2012 Apr;7(4):350-60; Nucleic Acids Res.　2016 Jul 8;44(12):5615-28; Gilbert et. al., Cell.　2013 Jul 18;154(2):442-51; Kearns et al., Nat Methods.　2015 May;12(5):401-3; Mendenhall et. al., Nat Biotechnol. 2013 Dec;31(12):1133-6; Hilton et. al., Nat Biotechnol. 2015 May;33(5):510-7; Gordley et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 31;106(13):5053-8; Akopian et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 22;100(15):8688-91; Tan et., al., J Virol. 2006 Feb;80(4):1939-48; Tan et. al., Proc Natl Acad Sci U S A.　2003 Oct 14;100(21):11997-2002; Papworth et. al., Proc Natl Acad Sci U S A.　2003 Feb 18;100(4):1621-6; Sanjana et. al., Nat Protoc.　2012　Jan 5;7(1):171-92; Beerli et. al., Proc Natl Acad Sci U S A.　1998 Dec 8;95(25):14628-33; Snowden et. al., Curr Biol.　2002 Dec 23;12(24):2159-66; Xu et.al., Xu et. al., Cell Discov. 2016 May 3;2:16009; Komor et al., Nature.　2016 Apr 20;533(7603):420-4; Chaikind et. al., Nucleic Acids Res. 2016 Aug 11; Choudhury at. al., Oncotarget.　2016 Jun 23; Du et. al., Cold Spring Harb Protoc. 2016 Jan 4; Pham et. al., Methods Mol Biol.　2016;1358:43-57; Balboa et al., Stem Cell Reports.　2015 Sep 8;5(3):448-59; Hara et. al., Sci Rep. 2015 Jun 9;5:11221; Piatek et. al., Plant Biotechnol J.　2015 May;13(4):578-89; Hu et al., Nucleic Acids Res.　2014 Apr;42(7):4375-90; Cheng et. al., Cell Res.　2013 Oct;23(10):1163-71; cheng et. al., Cell Res.　2013 Oct;23(10):1163-71; 및 Maeder et. al., Nat Methods.　2013 Oct;10(10):977-9] 참조.
추가적인 적합한 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산의 증가된 전사 및/또는 번역을 직접적으로 그리고/또는 간접적으로 제공하는 폴리펩타이드(예를 들어, 전사 활성체 또는 이의 단편, 전사 활성체를 보충하는 단백질 또는 이의 단편, 소분자/약물-반응성 전사 및/또는 번역 조절제, 번역-조절 단백질 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 증가된 또는 감소된 전사를 달성하기 위한 이종성 폴리펩타이드의 비제한적 예는 전사 활성체 및 전사 리프레서 도메인을 포함한다. 일부 이러한 경우에, 키메라 CasX 폴리펩타이드는 표적 핵산에서 특정 위치(즉, 서열)에 대해 가이드 핵산(가이드 RNA)에 의해 표적화되고, (예를 들어, 표적 핵산을 변형시키거나 또는 표적 핵산과 회합된 폴리펩타이드를 변형시키는 융합 서열이 사용될 때) 프로모터(전사 활성체 기능을 선택적으로 저해)에 대한 RNA 중합효소 결합을 차단하고/하거나 국소 염색질 상태를 변형시키는 것과 같은 좌위-특이적 조절을 발휘한다. 일부 경우에, 변화는 일시적이다(예를 들어, 전사 억제 또는 활성화). 일부 경우에, 변화는 유전성이다(예를 들어, 표적 핵산에 대해 또는 표적 핵산과 회합된 단백질, 예를 들어, 뉴클레오솜 히스톤에 대해 후성적 변형이 만들어질 때).
ssRNA 표적 핵산을 표적화할 때 사용하기 위한 이종성 폴리펩타이드의 비제한적 예는 스플라이싱 인자(예를 들어, RS 도메인); 단백질 번역 성분(예를 들어, 번역 개시, 신장 및/또는 방출 인자; 예를 들어, eIF4G); RNA 메틸라제; RNA 편집 효소(예를 들어, RNA 탈아미나제, 예를 들어, RNA 상에서 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAR)(A 내지 I 및/또는 C 내지 U 편집 효소를 포함)); 헬리카제; RNA-결합 단백질 등을 포함한다(그러나 이들로 제한되지 않음). 이종성 폴리펩타이드는 전체 단백질을 포함할 수 있거나 또는 일부 경우에 단백질(예를 들어, 기능성 도메인)의 단편을 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
대상 키메라 CasX 폴리펩타이드의 이종성 폴리펩타이드는 일시적이든 또는 비가역적이든, 직접적이든 또는 간접적이든; 엔도뉴클레아제(예를 들어, SMG5 및 SMG6과 같은 단백질로부터의 RNase III, CRR22 DYW 도메인, Dicer, 및 PIN(PilT N-말단) 도메인); RNA 절단의 자극을 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, CPSF, CstF, CFIm 및 CFIIm); 엑소뉴클레아제(예를 들어, XRN-1 또는 엑소뉴클레아제 T); 데아데닐라제(예를 들어, HNT3); 넌센스 매개된 RNA 붕괴를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, UPF1, UPF2, UPF3, UPF3b, RNP S1, Y14, DEK, REF2, 및 SRm160); RNA 안정화를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, PABP); 번역 억제를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, Ago2 및 Ago4); 번역 자극을 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, Staufen); 번역 조절을 초래하는(예를 들어, 초래할 수 있는) 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, 번역 인자, 예컨대 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자 등, 예를 들어, eIF4G); RNA의 폴리아데닐화를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, PAP1, GLD-2, 및 Star- PAP); RNA의 폴리유리딘일화를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, CI D1 및 말단의 유리딜레이트 트랜스퍼라제); RNA 국소화를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, IMP1, ZBP1, She2p, She3p 및 Bicaudal-D로부터의); RNA의 핵 보유를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, Rrp6); RNA의 핵 수송을 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, TAP, NXF1, THO, TREX, REF 및 Aly); RNA 스플라이싱의 억제를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, PTB, Sam68 및 hnRNP A1); RNA 스플라이싱의 자극을 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, 세린/알기닌-풍부(SR) 도메인); 전사 효율 감소를 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, FUS (TLS)); 및 전사 자극을 초래하는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, CDK7 및 HIV Tat)을 포함하는 군으로부터 선택된 효과기 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, ssRNA와 상호작용할 수 있는 임의의 도메인(본 개시내용의 목적을 위해, 분자내 및/또는 분자간 2차 구조, 예를 들어, 이중-가닥 RNA 듀플렉스, 예컨대 헤어핀, 줄기-루프 등을 포함함)일 수 있다. 대안적으로, 효과기 도메인은 엔도뉴클레아제; RNA 절단을 자극할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 엑소뉴클레아제; 데아데닐라제; 넌센스 매개된 RNA 붕괴 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA를 안정화시킬 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 억제할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 자극할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 번역을 조절할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인(예를 들어, 번역 인자, 예컨대 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자 등, 예를 들어, eIF4G); RNA의 폴리아데닐화를 가능하게 하는 단백질 및 단백질 도메인; RNA의 폴리유리딘일화를 가능하게 하는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 국소화 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA의 핵 보유를 가능하게 하는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 핵 수송 활성을 갖는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 스플라이싱의 억제를 가능하게 하는 단백질 및 단백질 도메인; RNA 스플라이싱의 자극을 가능하게 하는 단백질 및 단백질 도메인; 전사 효율을 감소시킬 수 있는 단백질 및 단백질 도메인; 및 전사를 자극할 수 있는 단백질 및 단백질 도메인을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 적합한 이종성 폴리펩타이드는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 WO2012068627에서 더 상세하게 기재되는 PUF RNA-결합 도메인이다.
키메라 CasX 폴리펩타이드에 대한 이종성 폴리펩타이드로서 사용될 수 있는(전체로 또는 이의 단편으로서) 일부 RNA 스플라이싱 인자는 별개의 서열-특이적 RNA 결합 분자 및 스플라이싱 효과기 도메인과 함께 모듈 조직화를 가진다. 예를 들어, 세린/알기닌-풍부(SR) 단백질 패밀리의 구성원은 엑손 혼입을 촉진하는 프레-mRNA 및 C-말단의 RS 도메인에서 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)에 결합하는 N-말단의 RNA 인식 모티프(RRM)를 함유한다. 다른 예로서, hnRNP 단백질 hnRNP Al는 그의 RRM 도메인을 통해 엑손 스플라이싱 사일런서(ESS)에 결합하고 C-말단의 글리신-풍부 도메인을 통해 엑손 포함을 저해한다. 일부 스플라이싱 인자는 두 대안의 부위 사이의 조절 서열에 대한 결합에 의해 스플라이스 부위(ss)의 대안의 사용을 조절할 수 있다. 예를 들어, ASF/SF2는 ESE를 인식하고 인트론 근위 부위의 사용을 촉진시킬 수 있는 반면, hnRNP ESS에 결합하고 Al은 인트론 원위 부위의 사용에 대해 스플라이싱을 이동시킬 수 있다. 이러한 인자의 한 가지 적용은 내인성 유전자, 특히 질환 관련 유전자의 대안의 스플라이싱을 조절하는 ESF를 생성하는 것이다. 예를 들어, Bcl-x 프레-mRNA는 반대 기능의 단백질을 암호화하기 위해 2개의 대안의 5' 스플라이스 부위를 갖는 2개의 스플라이싱 아이소폼을 생성한다. 긴 스플라이싱 아이소폼 Bcl-xL은 장기간 생존된 유사분열후(postmitotic) 세포에서 발현된 강력한 세포자멸사 저해제이고, 다수의 암세포, 세포자멸사 신호에 대한 보호 세포에서 상향조절된다. 짧은 아이소폼 Bcl-xS는 세포자멸사전 아이소폼이고, 높음 전환율을 갖는 세포(예를 들어, 발생 중인 림프구)에서 고수준으로 발현된다. 2개의 Bcl-x 스플라이싱 아이소폼의 비는 코어 엑손 영역 또는 엑손 연장 영역 중 하나에(즉, 두 대안의 5' 스플라이스 부위 사이에) 위치된 다중
Figure pct00003
-요소에 의해 조절된다. 더 많은 예에 대해, 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 WO2010075303 참조.
추가적인 적합한 융합 상대는 경계 요소인 단백질(또는 이의 단편)(예를 들어, CTCF), 주변 보충을 제공하는 단백질 및 이의 단편(예를 들어, 라민 A, 라민 B 등), 단백질 도킹 요소(예를 들어, FKBP/FRB, Pil1/Aby1 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
대상 키메라 CasX 폴리펩타이드에 대한 다양한 추가적인 적합한 이종성 폴리펩타이드(또는 이의 단편)의 예는 다음의 요소에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(이들 간행물은 다른 CRISPR 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9와 관련되지만, 기재된 융합 상대는 또한 CasX 대신 사용될 수 있다): PCT 특허 출원: WO2010075303, WO2012068627, 및 WO2013155555, 그리고, 예를 들어 미국 특허 및 특허 출원에서 찾을 수 있다: 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 8,697,359; 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 및 20140377868; 이들 모두는 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
일부 경우에, 이종성 폴리펩타이드(융합 상대)는 세포하 국소화를 제공하고, 즉, 이종성 폴리펩타이드는 핵에 대한 표적화를 위한 세포하 국소화 서열(예를 들어, 핵에 대한 국소화를 위한 핵 국소화 신호(NLS), 핵 밖에서 융합 단백질을 유지하기 위한 서열, 예를 들어, 핵 수송 서열(NES), 세포질에 보유된 융합 단백질을 유지하기 위한 서열, 미노콘드리아에 대한 표적화를 위한 미토콘드리아 국소화 신호, 엽록체, ER 체류 신호 등에 대한 표적화를 위한 엽록체 국소화 신호)을 함유한다. 일부 실시형태에서, CasX 융합 폴리펩타이드는 NLS를 포함하지 않으며, 따라서 단백질은 핵에 대해 표적화되지 않는다(이는, 예를 들어, 표적 핵산이 사이토졸에 존재하는 RNA일 때 유리할 수 있다). 일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드는 수송 및/또는 정제의 용이함을 위한 태그(즉, 이종성 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지임)(예를 들어, 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato 등; 히스티딘 태그, 예를 들어, 6XHis 태그; 혈구응집소(HA) 태그; FLAG 태그; Myc 태그; 등)을 제공할 수 있다.
일부 경우에 CasX 단백질(예를 들어, 야생형 CasX 단백질, 변이체 CasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, 여기서 CasX 부분은 감소된 뉴클레아제 활성을 가짐 - 예컨대 융합상대에 융합된 dCasX 단백질 등)은 핵 국소화 신호(NLS)(예를 들어, 일부 경우에 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)를 포함한다(이에 융합된다). 따라서, 일부 경우에, CasX 폴리펩타이드는 1개 이상의 NLS(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)를 포함한다. 일부 경우에, 1개 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)는 N-말단 및/또는 C-말단에 또는 근처에(예를 들어, 이의 50개 아미노산 내에) 위치된다. 일부 경우에, 1개 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)는 N-말단에 또는 근처에(예를 들어, 이의 50개 아미노산 내에) 위치된다. 일부 경우에, 1개 이상의 NLS(2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)는 C-말단에 또는 근처에(예를 들어, 이의 50개 아미노산 내에) 위치된다. 일부 경우에, 1개 이상의 NLS(3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)는 N-말단과 C-말단 둘 다에 또는 근처에(예를 들어, 이의 50개 아미노산 내에) 위치된다. 일부 경우에, NLS는 N-말단에 위치되고, NLS는 C-말단에 위치된다.
일부 경우에 CasX 단백질(예를 들어, 야생형 CasX 단백질, 변이체 CasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, 여기서 CasX 부분은 감소된 뉴클레아제 활성 - 예컨대 융합 상대에 융합된 dCasX 단백질 등을 가짐)은 1 내지 10개의 NLS(예를 들어, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6 또는 2-5개의 NLS)를 포함한다(이에 융합된다). 일부 경우에 CasX 단백질(예를 들어, 야생형 CasX 단백질, 변이체 CasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질, 여기서 CasX 부분은 감소된 뉴클레아제 활성 - 예컨대 융합 상대에 융합된 dCasX 단백질 등을 가짐)은 2 내지 5개의 NLS(예를 들어, 2 내지 4 또는 2 내지 3개의 NLS)를 포함한다(이에 융합된다).
NLS의 비제한적 예는 아미노산 서열 PKKKRKV(서열번호 96)를 갖는 SV40 바이러스 거대 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 97)을 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS)로부터 유래된 NLS 서열; 아미노산 서열 PAAKRVKLD(서열번호 98) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 99)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(서열번호 100)을 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(서열번호 101); 근종 T 단백질의 서열 VSRKRPRP(서열번호 102) 및 PPKKARED(서열번호 103); 인간 p53의 서열 PQPKKKPL(서열번호 104); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(서열번호 105); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(서열번호 106) 및 PKQKKRK(서열번호 107); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(서열번호 108); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(서열번호 109); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(서열번호 110); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(서열번호 111)을 포함한다. 일반적으로, NLS(또는 다중 NLS)는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 CasX 단백질의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 가진다. 핵에서 축적의 검출은 임의의 적합한 기법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 세포 내의 위치가 시각화될 수 있도록 CasX 단백질에 융합될 수 있다. 세포 핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있고, 이어서, 이의 내용은 단백질을 검출하기 위한 임의의 적합한 방법, 예컨대 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 분석에 의해 분석될 수 있다. 핵에서의 축적은 또한 간접적으로 결정될 수 있다.
일부 경우에, CasX 융합 폴리펩타이드는 "단백질 형질도입 도메인" 또는 PTD(또한 CPP - 세포 침투성 펩타이드로서 알려짐)를 포함하는데, 이는 지질 이중층, 마이셀, 세포막, 세포소기관 막 또는 소수포 막을 가로지르는 것을 용이하게 하는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물 또는 유기 또는 무기 화합물을 지칭한다. 거대 분자 및/또는 나노분자의 범위일 수 있는 다른 분자에 부착된 PTD는 분자가 막을 가로지르는 것, 예를 들어, 세포외 공간으로부터 세포내 공간 또는 사이토졸을 세포소기관 내로 이동하는 것을 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, PTD는 아미노 말단 폴리펩타이드에 공유적으로 연결된다(예를 들어, 융합 단백질을 생성하기 위해 야생형 CasX에 연결되거나, 또는 융합 단백질을 생성하기 위해 변이체 CasX 단백질, 예컨대 dCasX, 틈내기효소 CasX, 또는 키메라 CasX 단백질에 연결됨). 일부 실시형태에서, PTD는 폴리펩타이드의 카복실 말단 공유적으로 연결된다(예를 들어, 융합 단백질을 생성하기 위해 야생형 CasX에 연결되거나, 또는 융합 단백질을 생성하기 위해 변이체 CasX 단백질, 예컨대 dCasX, 틈내기효소 CasX, 또는 키메라 CasX 단백질에 연결됨). 일부 경우에, PTD는 적합한 삽입 부위에서 CasX 융합 폴리펩타이드에서 내부로 삽입된다(즉, CasX 융합 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에서가 아님). 일부 경우에, 대상 CasX 융합 폴리펩타이드는 1개 이상의 PTD(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상의 PTD)를 포함한다(이에 접합되고, 융합된다). 일부 경우에, PTD는 핵 국소화 신호(NLS)(예를 들어, 일부 경우에 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)를 포함한다. 따라서, 일부 경우에, CasX 융합 폴리펩타이드는 1개 이상의 NLS(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 NLS)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PTD는 핵산(예를 들어, CasX 가이드 핵산, CasX 가이드 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 공여자 폴리뉴클레오타이드 등)에 공유적으로 연결된다. PTD의 예는 최소 운데카펩타이드 단백질 형질도입 도메인(YGRKKRRQRRR; 서열번호 112를 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47 내지 57에 대응); 세포 내로 유입을 지시하기에 충분한 다수의 알기닌을 포함하는 폴리알기닌 서열(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 내지 50개의 알기닌); VP22 도메인(Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 초파리 안테나페디아(Antennapedia) 단백질 형질도입 도메인(Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절단된 인간 칼시토닌 펩타이드(Trehin et al. (2004) Pharm . Research 21:1248-1256); 폴리라이신(Wender et al. (2000) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR(서열번호 113); 트랜스포탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(서열번호 114); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(서열번호 115); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 116)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 PTD는 YGRKKRRQRRR(서열번호 117), RKKRRQRRR(서열번호 118); 3개의 알기닌 잔기 내지 50개의 알기닌 잔기의 알기닌 동종중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않고; 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열은 다음 중 어떤 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: YGRKKRRQRRR(서열번호 119); RKKRRQRR(서열번호 120); YARAAARQARA(서열번호 121); THRLPRRRRRR(서열번호 122); 및 GGRRARRRRRR(서열번호 123). 일부 실시형태에서, PTD는 활성화 가능한 CPP(ACPP)이다(Aguilera et al. (2009) Integr Biol ( Camb ) June; 1(5-6): 371-381). ACPP는 매칭 절단 가능한 링커를 통해 다음이온(예를 들어, Glu9 또는 "E9")에 연결된 다양이온 CPP(예를 들어, Arg9 또는 "R9")를 포함하는데, 이는 순전하를 거의 0으로 감소시키고, 이에 의해 세포에 대한 접착 및 흡수를 저해한다. 링커의 절단 시, 다음이온이 방출되며, 다알기닌 및 그의 고유한 부착성을 국소로 가리며, 따라서 막을 가로지르도록 ACPP를 "활성화시킨다".
링커(예를 들어, 융합 상대에 대해)
일부 실시형태에서, 대상 CasX 단백질은 링커 폴리펩타이드(예를 들어, 하나 이상의 링커 폴리펩타이드)를 통해 융합 상대에 융합될 수 있다. 링커 폴리펩타이드는 임의의 다양한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 화학적 결합이 제외되지는 않지만, 단백질은 일반적으로 가요성 특성의 스페이서 펩타이드에 의해 결합될 수 있다. 적합한 링커는 길이가 4개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 또는 길이가 4개의 아미노산 내지 25개의 아미노산인 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 링커는 단백질을 결합하기 위해 합성, 링커-암호화 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로써 생성될 수 있거나, 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일정 정도의 가요성이 있는 펩타이드 링커가 사용될 수 있다. 연결 펩타이드는 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 바람직한 링커는 일반적으로 가요성 펩타이드를 초래하는 서열을 가질 것임을 유념한다. 작은 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌의 사용은 가요성 펩타이드를 생성하는 용도를 가진다. 이러한 서열의 생성은 당업자에게 일상적이다. 다양한 상이한 링커가 상업적으로 입수 가능하고, 사용에 적합한 것으로 고려된다.
링커 폴리펩타이드의 예는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, GSGGSn(서열번호 124), GGSGGSn(서열번호 125) 및 GGGSn(서열번호 126)을 포함, 여기서 n은 적어도 하나의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체를 포함한다. 예시적인 링커는 GGSG(서열번호 127), GGSGG(서열번호 128), GSGSG(서열번호 129), GSGGG(서열번호 130), GGGSG(서열번호 131), GSSSG(서열번호 132) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록 임의의 목적으로 하는 요소에 접합된 펩타이드의 설계가 모두 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
검출 가능한 표지
일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함한다. 적합한 검출 가능한 표지 및/또는 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 모이어티는 효소, 방사성 동위 원소, 특정 결합쌍의 구성원; 형광단; 형광 단백질; 양자점 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 이의 변이체, GFP의 청색 형광 변이체(BFP), GFP의 사이안 형광 변이체(CFP), GFP의 황색 형광 변이체(YFP), 증강된 GFP(EGFP), 증강된 CFP(ECFP), 증강된 YFP(EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 토파즈(TYFP), 비너스, 시트린, 엠시트린(mCitrine), GFPuv, 불안정 EGFP (dEGFP), 불안정 ECFP (dECFP), 불안정 EYFP (dEYFP), mCFPm, 세룰리언, T-사파이어, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-단량체, J-Red, 이량체2, t-이량체2(12), mRFP1, 포실로포린, 레닐라 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, Kaede 단백질 및 킨들링 단백질, 피코빌리단백질 및 피코빌리단백질 접합체(B-피코에리트린, R-피코에리트린 및 알로피코사이아닌을 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광 단백질의 다른 예는 mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape1, mRaspberry, mGrape2, mPlum(Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909) 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Matz et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:969-973]에 기재된 바와 같은 화충류(Anthozoan) 종으로부터의 임의의 다양한 형광 및 착색 단백질이 사용에 적합하다.
적합한 효소는 겨자무과산화효소(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), 베타-갈락토시다제(GAL), 글루코스-6-인산 탈수소효소, 베타-N-아세틸글루코사미니다제, β-글루쿠로니다제, 인버타제, 잔틴 옥시다제, 반딧불이 루시퍼라제, 글루코스 옥시다제(GO) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
프로토스페이서 인접 모티프(PAM)
CasX 단백질은 DNA-표적화 RNA와 표적 DNA 사이의 상보성 영역에 의해 정해지는 표적 서열에서 표적 DNA에 결합한다. 다수의 CRISPR 엔도뉴클레아제에 대한 경우에서와 같이, 이중 가닥 표적 DNA의 부위-특이적 결합(및/또는 절단)은 (i) 가이드 RNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 상보성; 그리고 (ii) 표적 DNA 내 짧은 모티프[프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로서 지칭됨]에 의해 결정된 위치에서 생긴다.
일부 실시형태에서, CasX 단백질에 대한 PAM은 표적 DNA의 비상보성 가닥의 표적 서열의 5' 바로 옆이다(상보성 가닥은 가이드 RNA의 가이드 서열에 혼성화되는 한편, 비-상보성 가닥은 가이드 RNA에 직접 혼성화하지 않으며, 비-상보성 가닥의 역상보체이다). 일부 실시형태에서(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CasX1이 사용될 때), 비-상보성 가닥의 PAM 서열은 5'-TCN-3'이며(그리고 일부 경우에 TTCN), 여기서 N은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이다. 예로서, 도 6, 패널 c, 및 도 7을 참조하며, 이때 PAM(TCN)(비상보적 가닥 상에서)은 TCA이고(도면에서 나타낸 PAM은 TTCA임), PAM은 표적 서열의 5'이다.
일부 경우에, 상이한 CasX 단백질(즉, 다양한 종으로부터의 CasX 단백질)은 상이한 CasX 단백질의 다양한 효소 특징을 활용하기 위해(예를 들어, 상이한 PAM 서열 선호도에 대해; 증가된 또는 감소된 효소 활성에 대해; 세포 독성의 증가된 또는 감소된 수준에 대해; NHEJ, 상동성-직접 수선, 단일 가닥 파손, 이중 가닥 파손 등 사이의 균형 변화를 위해; 짧은 총 서열의 이점을 취하기 위해; 등) 다양한 제공된 방법으로 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상이한 종으로부터의 CasX 단백질은 표적 DNA에서 상이한 PAM 서열을 필요로 할 수 있다. 따라서, 특정 선택 CasX 단백질에 대해, PAM 서열 필요는 상기 기재한 5'-TCN-3' 서열과 상이할 수 있다. 적절한 PAM 서열의 동정을 위한 다양한 방법(인실리코 및/또는 습식 실험실 방법을 포함)은 당업계에 공지되어 있고, 일상적이며, 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 TCN PAM 서열은 PAM 고갈 분석(예를 들어, 이하의 작업 실시예의 도 5 참조)을 이용하여 동정되었다.
CasX 가이드 RNA
리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하고, 표적 핵산(예를 들어, 표적 DNA) 내의 특정 위치에 대해 복합체를 표적화하는 CasX 단백질에 결합하는 핵산은 본 명세서에서 "CasX 가이드 RNA"로서 또는 단순히 "가이드 RNA"로서 지칭된다. 일부 경우에, CasX 가이드 RNA가 RNA 염기에 추가로 DNA 염기를 포함하도록 혼성 DNA/RNA가 만들어질 수 있지만, 용어 "CasX 가이드 RNA"는 여전히 본 명세서의 이러한 분자를 포함하기 위해 사용된다는 것이 이해되어야 한다.
CasX 가이드 RNA는 2개의 세그먼트, 표적화 세그먼트 및 단백질-결합 세그먼트를 포함하는 것으로 언급될 수 있다. CasX 가이드 RNA의 표적화 세그먼트는 표적 핵산(예를 들어, 표적 ssRNA, 표적 ssDNA, 이중 가닥 표적 DNA의 상보성 가닥 등) 내의 특정 서열(표적 부위)에 상보성인(그리고 따라서 이에 혼성화하는) 뉴클레오타이드 서열(가이드 서열)을 포함한다. 단백질-결합 세그먼트(또는 "단백질-결합 서열")는 CasX 폴리펩타이드에 상호작용한다(이에 결합한다). 대상 CasX 가이드 RNA의 단백질의 단백질-결합 세그먼트는 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)을 형성하기 위해 서로 혼성화하는 뉴클레오타이드의 2개의 상보적 신장을 포함한다. 표적 핵산(예를 들어, 게놈 DNA)의 부위-특이적 결합 및/또는 절단은 CasX 가이드 RNA(CasX 가이드 RNA의 가이드 서열 )와 표적 핵산 사이의 염기쌍 상보성에 의해 결정되는 위치(예를 들어, 표적 좌위의 표적 서열)에서 일어날 수 있다.
CasX 가이드 RNA 및 CasX 단백질, 예를 들어, 융합 CasX 폴리펩타이드는 복합체를 형성한다(예를 들어, 비공유 상호작용을 통해 결합한다). CasX 가이드 RNA는 가이드 서열(표적 핵산의 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 표적화 세그먼트를 포함함으로써 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 복합체의 CasX 단백질은 부위-특이적 활성(예를 들어, CasX 단백질에 의해 제공된 절단 활성 및/또는 키메라 CasX 단백질의 경우에 융합 상대에 의해 제공된 활성)을 제공한다. 다시 말해서, CasX 단백질은 CasX 가이드 RNA와 그의 회합 때문에 표적 핵산 서열(예를 들어, 표적 서열)로 가이드된다.
CasX 가이드 RNA의 "표적화 서열"로서도 지칭되는 "가이드 서열"은 PAM 서열을 고려할 수 있다는 것을 제외하고(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이), CasX 가이드 RNA가 임의의 목적으로 하는 표적 핵산의 임의의 목적으로 하는 서열에 대해 CasX 단백질(예를 들어, 천연 유래 CasX 단백질, 융합 CasX 폴리펩타이드(키메라 CasX) 등)을 표적화할 수 있도록 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CasX 가이드 RNA는 진핵 세포 내 핵산, 예를 들어, 바이러스 핵산, 진핵 핵산(예를 들어, 진핵 염색체, 염색체 서열, 진핵 RNA 등) 등에서의 서열에 대해 상보성인(예를 들어, 혼성화할 수 있는) 가이드 서열을 가질 수 있다.
대상 CasX 가이드 RNA는 또한 "활성체(activator)" 및 "표적자(targeter)"(예를 들어, 각각 "활성체-RNA" 및 "표적자-RNA")를 포함하는 것으로 언급될 수 있다. "활성체" 및 "표적자"가 2개의 별개의 분자일 때, 가이드 RNA는 본 명세서에서 "이중 가이드 RNA", "dgRNA", "이중-분자 가이드 RNA" 또는 "2-분자 가이드 RNA", 예를 들어, "CasX 이중 가이드 RNA"로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 활성체 및 표적자는 서로에 대해(예를 들어, 개재 뉴클레오타이드를 통해) 공유결합되고, 가이드 RNA는 본 명세서에서 "단일 가이드 RNA", "sgRNA", "단일-분자 가이드 RNA" 또는 "1-분자 가이드 RNA"(예를 들어, "CasX 단일 가이드 RNA")로서 지칭된다. 따라서, 대상 CasX 단일 가이드 RNA는 서로에 대해(예를 들어, 개재 뉴클레오타이드에 의해) 연결된 표적자(예를 즐어, 표적자-RNA) 및 활성체(예를 들어, 활성체-RNA)를 포함하고, 서로 혼성화되어 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트의 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)를 형성하고, 따라서, 줄기-루프 구조를 초래한다(도 6, 패널 c). 따라서, 표적자 및 활성체는 각각 듀플렉스-형성 세그먼트를 가지며, 여기서, 표적자의 듀플렉스 형성 세그먼트 및 활성체의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 상보성을 가지며, 서로에 대해 혼성화된다.
일부 실시형태에서, CasX 단일 가이드 RNA의 링커는 뉴클레오타이드의 스트레치이다(도 6, 패널 c에서 GAAA로서 도시됨). 일부 경우에, CasX 단일 가이드 RNA의 표적자 및 활성체는 개재 뉴클레오타이드에 의해 서로에 대해 연결되고, 링커는 3 내지 20개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 20, 4 내지 15, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 nt)의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CasX 단일 가이드 RNA의 링커는 3 내지 100개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 3 내지 80, 3 내지 50, 3 내지 30, 3 내지 25, 3 내지 20, 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 100, 4 내지 80, 4 내지 50, 4 내지 30, 4 내지 25, 4 내지 20, 4 내지 15, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 nt)의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CasX 단일 가이드 RNA의 링커는 3 내지 10개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 nt)의 길이를 가질 수 있다.
CasX 가이드 RNA의 가이드 서열
대상 CasX 가이드 RNA의 표적화 세그먼트는 표적 핵산 내 서열(표적 부위)에 대해 상보성은 뉴클레오타이드 서열인 가이드 서열(즉, 표적화 서열)을 포함한다. 다시 말해서, CasX 가이드 RNA의 표적화 세그먼트는 혼성화(즉, 염기쌍)를 통해 서열 특이적 방식으로 표적 핵산(예를 들어, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA) 또는 이중 가닥 RNA(dsRNA))과 상호작용할 수 있다. CasX 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 핵산(예를 들어, 진핵 표적 핵산, 예컨대 게놈 DNA) 내에서 임의의 목적으로 하는 표적 서열(예를 들어, PAM을 고려하는 동안, 예를 들어, dsDNA 표적을 표적화할 때)에 혼성화하도록 변형(예를 들어, 유전자 조작에 의해)/설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 60% 이상(예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 90% 이상(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 100% 이상이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 표적 핵산의 7개의 인접한 가장 3'의 뉴클레오타이드에 대해 100%이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19개 이상의(예를 들어, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 60% 이상(예를 들어, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19개 이상의(예를 들어, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19개 이상의(예를 들어, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 90% 이상(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19개 이상의(예를 들어, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상)의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 100%이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 60% 이상(예를 들어, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 90% 이상(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 19 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 100% 이상이다.
일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 19 내지 30개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 19-25, 19-22, 19-20, 20-30, 20-25 또는 20-22 nt) 범위이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 19-22, 19-20, 20-25, 20-25 또는 20-22 nt) 범위이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 19개 이상의 nt(예를 들어, 20개 이상, 21개 이상 또는 22개 이상의 nt; 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt 등)를 가진다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 19 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 20 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 21 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 22 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 23 nt이다.
CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트
대상 CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트는 CasX 단백질과 상호작용한다. CasX 가이드 RNA는 결합된 CasX 단백질을 상기 언급한 가이드 서열을 통해 표적 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 가이드한다. CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트는 서로에 대해 상보성이고 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)을 형성하도록 혼성화되는 뉴클레오타이드의 2개의 신장(활성체의 듀플렉스-형성 세그먼트 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트)을 포함한다. 따라서, 단백질-결합 세그먼트는 dsRNA 듀플렉스를 포함한다.
일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 듀플렉스 영역(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식에서)은 8 내지 25개의 염기쌍(bp)의 범위(예를 들어, 8-22, 8-18, 8-15, 8-12, 12-25, 12-22, 12-18, 12-15, 13-25, 13-22, 13-18, 13-15, 14-25, 14-22, 14-18, 14-15, 15-25, 15-22, 15-18, 17-25, 17-22 또는 17-18 bp, 예를 들어, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp 등)를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 영역(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)은 8개 이상의 bp(예를 들어, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상 또는 17개 이상의 bp)를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 영역의 모든 뉴클레오타이드가 짝지어지지는 않으며, 따라서 듀플렉스 형성 영역은 벌지(bulge)를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 6, 패널 c 및 도 7 참조). 본 명세서의 용어 "벌지"는 이중 가닥 듀플렉스에 기여하지 않지만, 기여하는 뉴클레오타이드에 의해 5' 및 3'을 둘러싸는 뉴클레오타이드의 신장(하나의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 의미하기 위해 사용되며, 이러한 벌지는 듀플렉스 영역의 부분으로 고려된다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 1개 이상의 벌지(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상의 벌지)를 포함한다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 2개 이상의 벌지(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상의 벌지)를 포함한다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 1 내지 5개의 벌지(예를 들어, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4, 또는 2-3개의 벌지)를 포함한다.
따라서, 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 85% 내지 100% 상보성(예를 들어, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 95% 상보성(예를 들어, 75%-95%, 80%-95%, 85%-95%, 90%-95% 상보성)을 가진다.
다시 말해서, 일부 실시형태에서, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 듀플렉스(즉, 활성체/표적자 dsRNA 이중가닥)는dsRNA 듀플렉스는 서로 70%-100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다. 일부 경우에, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스는 서로 85%-100% 상보성(예를 들어, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다. 일부 경우에, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스는 서로 70%-95% 상보성(예를 들어, 75%-95%, 80%-95%, 85%-95%, 90%-95% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다.
대상 CasX 가이드 RNA의 듀플렉스 영역은 (이중 가이드 또는 단일 가이드 RNA 형식에서) 천연 유래 듀플렉스 영역에 비해 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 등)의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 염기쌍은 유지될 수 있는 한편 각각의 세그먼트(표적자 및 활성체)로부터의 염기쌍에 기여하는 뉴클레오타이드는 상이할 수 있다. 일부 경우에, 대상 CasX 가이드 RNA의 이중가닥 영역은 (천연 유래 CasX 가이드 RNA의) 천연 유래 이중가닥 영역에 비교할 때 더 짝지어진 염기, 덜 짝지어진 염기, 더 작은 벌지, 더 큰 벌지, 소수의 벌지, 더 많은 벌지, 또는 이들의 임의의 편리한 조합을 포함한다.
일부 경우에, 대상 CasX 가이드 RNA의 활성체(예를 들어, 활성체-RNA)는 (이중 또는 단일 가이드 RNA 형식에서) 적어도 2개의 내부 RNA 듀플렉스(즉, 활성체/표적자 dsRNA에 추가로 2개의 내부 헤어핀)를 포함한다. 활성체의 내부 RNA 듀플렉스(헤어핀)는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 5'에 위치될 수 있다(예를 들어, 도 6, 패널 c, 및 도 7 참조, 이들 둘 다 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 2개의 내부 헤어핀이 위치된 5'을 갖는 활성체를 포함함). 일부 경우에, 활성체는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 1개의 헤어핀이 위치된 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 2개의 헤어핀이 위치된 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 3개의 헤어핀이 위치된 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 2개 이상의 헤어핀(예를 들어, 3개 이상 또는 4개 이상의 헤어핀)이 위치된 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체는 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스의 2 내지 5개의 헤어핀(예를 들어, 2 내지 4개 또는 2 내지 3개의 헤어핀)이 위치된 5'을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로), 예를 들어, 도 6 및 도 7의 tracrRNA에 도시한 바와 같이, 가장 5'의 헤어핀 줄기의 적어도 2개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 적어도 3 또는 적어도 4 nt) 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체-RNA는(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로), 예를 들어, 도 6 및 도 7의 tracrRNA에 도시한 바와 같이, 가장 5'의 헤어핀 줄기의 적어도 4개의 nt 5'를 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 형식으로) 65개 이상의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 66개 이상, 67개 이상, 68개 이상, 69개 이상, 70개 이상 또는 75개 이상의 nt)의 길이를 가진다. 일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 형식으로) 66개 이상의 nt(예를 들어, 67개 이상, 68개 이상, 69개 이상, 70개 이상 또는 75개 이상의 nt)의 길이를 가진다. 일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 형식으로) 67개 이상의 nt(예를 들어, 68개 이상, 69개 이상, 70개 이상 또는 75개 이상의 nt)의 길이를 가진다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 형식으로) 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 듀플렉스(활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)의 45개 이상의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 46개 이상, 47개 이상, 48개 이상, 49개 이상, 50개 이상, 51개 이상, 52개 이상, 53개 이상, 54개 이상 또는 55개 이상의 nt) 5'을 포함한다. 일부 경우에, 활성체는 천연 유래 CasX 활성체에 대해 5' 단부에서 절단된다. 일부 경우에, 활성체는 천연 유래 CasX 활성체에 대해 5' 단부에서 연장된다.
다양한 Cas9 가이드 RNA의 예는 당업계에서 찾을 수 있고, 그리고 일부 경우에 Cas9 가이드 RNA 내로 도입된 것과 유사한 변형이 또한 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May; 10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43; Qi et al, Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 2013 Oct 31; Chen et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. 2013 Nov;195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013;3:2510; Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187; Hu et al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188; Larson et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis.　2013　Dec;51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda).　2013 Dec 9;3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 2013 Oct 9; Yang et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9; Briner et al., Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-9]; 및 미국 특허 및 특허 출원: 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 8,697,359; 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 및 20140377868을 참조하며; 이들 모두는 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
용어 "활성체" 또는 "활성체 RNA"는 본 명세서에서 CasX 이중 가이드 RNA의 (그리고 따라서 "활성체" 및 "표적자"가, 예를 들어, 개재 뉴클레오타이드에 의해 함께 연결될 때, CasX 단일 가이드 RNA의) tracrRNA-유사 분자(tracrRNA: "전사 촉진성 CRISPR RNA"를 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 예를 들어, CasX 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)는 활성체 서열(예를 들어, tracrRNA 서열)을 포함한다. tracr 분자(tracrRNA)는 CRISPR RNA 분자(crRNA)와 혼성화하여 CasX 이중 가이드 RNA를 형성하는 천연 유래 분자이다. 용어 "활성체"는 본 명세서에서 천연 유래 tracrRNA를 포함할 뿐만 아니라, 변형(예를 들어, 절단, 연장, 서열 변화, 염기 변형, 골격 변형, 결합 변형 등)을 갖는 tracrRNA를 포함하기 위해 사용되며, 여기서, 활성체는 tracrRNA의 적어도 하나의 기능을 보유한다(예를 들어, CasX 단백질이 결합하는 dsRNA 듀플렉스에 기여한다). 일부 경우에, 활성체는 CasX 단백질과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 줄기 루프를 제공한다. 활성체는 tracr 서열(tracrRNA 서열)을 갖는 것으로 언급될 수 있고, 일부 경우에, tracrRNA이지만, 용어 "활성체"는 천연 유래 tracrRNA로 제한되지 않는다.
일부 경우에(예를 들어, 일부 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우), 활성체-RNA는 대응하는 야생형 tracrRNA에 대해 절단된다(더 짧아진다). 일부 경우에(예를 들어, 일부 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우), 활성체-RNA는 대응하는 야생형 tracrRNA에 대해 절단되지(더 짧아지지) 않는다. 일부 경우에(예를 들어, 일붑 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우에) 활성체-RNA는 50 초과의 nt (예를 들어, 55 초과의 nt, 60 초과의 nt, 65 초과의 nt, 70 초과의 nt, 75 초과의 nt, 80 초과의 nt)인 길이를 가진다. 일부 경우에(예를 들어, 일부 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우) 활성체-RNA는 80 초과의 nt인 길이를 가진다. 일부 경우에(예를 들어, 일부 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우) 활성체-RNA는 51 내지 90 nt(예를 들어, 51-85, 51-84, 55-90, 55-85, 55-84, 60-90, 60-85, 60-84, 65-90, 65-85, 65-84, 70-90, 70-85, 70-84, 75-90, 75-85, 75-84, 80-90, 80-85 또는 80-84 nt) 범위의 길이를 가진다. 일부 경우에(예를 들어, 일부 경우에 가이드 RNA가 단일 가이드 형식인 경우) 활성체-RNA는 80 내지 90nt 범위의 길이를 가진다.
용어 "표적자" 또는 "표적자 RNA"는 본 명세서에서 CasX 이중 가이드 RNA의(따라서 "활성체" 및 "표적자"가, 예를 들어, 개재 뉴클레오타이드에 의해 함께 연결될 때, CasX 단일 가이드 RNA의) crRNA-유사 분자(crRNA: "CRISPR RNA")를 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 예를 들어, CasX 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)는 가이드 서열 및 듀플렉스-형성 세그먼트(예를 들어, crRNA 반복부로서도 지칭될 수 있는 crRNA의 듀플렉스 형성 세그먼트)를 포함한다. 표적자의 표적화 세그먼트(표적 핵산의 표적 서열과 혼성화하는 세그먼트)의 서열은 요망되는 표적 핵산과 혼성화하기 위해 사용자에 의해 변형되기 때문에, 표적자의 서열은 종종 비천연 유래 서열일 것이다. 그러나, 활성체의 듀플렉스-형성 세그먼트와 혼성화하는 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트(본 명세서에서 더 상세하게 기재함)는 천연 유래 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, crRNA 반복부로서도 지칭될 수 있는 천연 유래 crRNA의 듀플렉스-형성 세그먼트 서열을 포함할 수 있다). 따라서, 용어 표적자는 본 명세서에서 crRNA로부터의 천연 유래 서열을 포함한다는 사실에도 불구하고, 천연 유래 crRNA를 구별하기 위해 사용된다. 그러나, 용어 "표적자"는 천연 유래 crRNA를 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 표적자는 CasX 가이드 RNA의 가이드 서열과 CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스의 1/2을 형성하는 뉴클레오타이드의 신장부("듀플렉스-형성 세그먼트")를 둘 다 포함한다. 대응하는 tracrRNA-유사 분자(활성체)는 CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스의 다른 1/2을 형성하는 뉴클레오타이드의 신장부(듀플렉스-형성 세그먼트)를 포함한다. 다시 말해서, 표적자의 뉴클레오타이드의 신장부는 CasX 가이드 RNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 활성체의 뉴클레오타이드의 신장부에 대해 상보성이며 이에 혼성화한다. 이렇게 해서, 각각의 표적자는 대응하는 활성체(표적자와 혼성화하는 영역을 가짐)를 갖도록 언급될 수 있다. 표적자 분자는 가이드 서열을 추가적으로 제공한다. 따라서, 표적자 및 활성체(대응하는 쌍으로서)는 CasX 가이드 RNA를 형성하기 위해 혼성화된다. 주어진 천연 유래 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 특정 서열은 RNA 분자가 발견된 종의 특징일 수 있다. 적합한 활성체 및 표적자의 예가 본 명세서에 제공된다.
가이드 RNA 서열의 예
도 6 (이중 가이드 형식) 및 도 7 (이중 가이드 형식) 에 도시된 가이드 RNA는 CasX1에 대한 천연 좌위로부터 유래된다. 이하의 단란에서 논의되는 서열 및 이하의 작업 실시예에 기재하고 시험하는 서열에 대해, tracrRNA 및 crRNA 서열은 CasX1 좌위로부터 유래되었다. 가능한 표적자-RNA 및 활성체-RNA의 동일한 매개변수 및 세트가 예상되며, CasX1 좌위에 대한 서열을 CasX2 좌위의 서열과 비교하는 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, CasX1 tracrRNA 서열:
Figure pct00004
CasX3 좌위에 대해, tracr는 이들 230개의 nt 내일 가능성이 있다(상보성 영역을 밑줄 표시함):
Figure pct00005
마찬가지로, CasX1 crRNA
CCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(Ns가 없는 서열번호 11, Ns가 있는 서열번호 61)은 CasX2 crRNA 서열 UCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(Ns가 없는 서열번호 13, Ns가 있는 서열번호 69)과 비교될 수 있다.
CasX3 좌위로부터의 crRNA 반복부는 GTTTACACACTCCCTCTCATAGGGT(서열번호 54), GTTTACACACTCCCTCTCATGAGGT(서열번호 55), TTTTACATACCCCCTCTCATGGGAT(서열번호 56) 및 GTTTACACACTCCCTCTCATGGGGG(서열번호 57)이다. 따라서 crRNA 서열(예를 들어, CasX3 좌위)은
GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (Ns가 없는 서열번호 14, Ns가 있는 서열번호 31), GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (Ns가 없는 서열번호 15, Ns가 있는 서열번호 32), UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (Ns가 없는 서열번호 16, Ns가 있는 서열번호 33) 및/또는 GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (Ns가 없는 서열번호 17, Ns가 있는 서열번호 34)를 포함할 수 있다.
예시적 표적자 -RNA(예를 들어, crRNA ) 서열
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 CCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 11)(예를 들어, 도 6, 패널 c의 sgRNA 참조)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 CCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 11)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 AUUUGAAGGUAUCUCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 12)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 AUUUGAAGGUAUCUCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 12)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 UCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(서열번호 13)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 UCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(서열번호 13)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU(서열번호 14)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU(서열번호 14)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU(서열번호 15)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU(서열번호 15)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU(서열번호 16)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU(서열번호 16)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG(서열번호 17)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG(서열번호 17)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)(예를 들어, 가이드 서열에 추가로) 서열번호 11 및 13 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 11 및 13 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 가이드 서열에 추가로) 서열번호 11 내지 13 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 11 내지 13 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열 crRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 가이드 서열에 추가로) 서열번호 14 내지 17 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 14 내지 17 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열 crRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 가이드 서열에 추가로) 서열번호 11 내지 17 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 11 내지 17 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열 crRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
예시적인 활성체-RNA(예를 들어, tracrRNA ) 서열
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 21)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 21)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 22)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 22)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 23)을 포함한다(예를 들어, 도 6의 sgRNA를 참조). 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 23)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 AAGUAGUAAAUUACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 24)을 포함한다(예를 들어, 도 6의 sgRNA를 참조). 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 AAGUAGUAAAUUACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 24)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 25)을 포함한다(예를 들어, 도 6의 sgRNA를 참조). 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 25)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 26)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(서열번호 26)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 27)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG(서열번호 27)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식에서) 다음의 서열 내로부터 tracrRNA 서열을 포함한다: UAAAUUUUUUGAGCCCUAUCUCCGCGAGGAAGACAGGGCUCUUUUCAUGAGAGGAAGCUUUUAUACCCGACCGGUAAUCCGGUCGGGGGAUUGGCCGUUGAAACGAUUUUAAAGCGGCCAAUGGGCCCCUCUAUAUGGAUACUACUUAUAUAAGGAGCUUGGGGAAGAAGAUAGCUUAAUCCCGCUAUCUUGUCAAGGGGUUGGGGGAGUAUCAGUAUCCGGCAGGCGCC(서열번호 28). 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 UAAAUUUUUUGAGCCCUAUCUCCGCGAGGAAGACAGGGCUCUUUUCAUGAGAGGAAGCUUUUAUACCCGACCGGUAAUCCGGUCGGGGGAUUGGCCGUUGAAACGAUUUUAAAGCGGCCAAUGGGCCCCUCUAUAUGGAUACUACUUAUAUAAGGAGCUUGGGGAAGAAGAUAGCUUAAUCCCGCUAUCUUGUCAAGGGGUUGGGGGAGUAUCAGUAUCCGGCAGGCGCC(서열번호 28)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 21 내지 27 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 21 및 27 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 21 내지 27 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 21 및 28 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단일 가이드 RNA는 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGgaaaCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 41)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 tracrRNA 서열 UUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGgaaaCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 41)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단일 가이드 RNA는 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAgaaaCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 42)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 tracrRNA 서열 ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAgaaaCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(서열번호 42)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단일 가이드 RNA는 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGgaaaUCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(서열번호 43)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 tracrRNA 서열 UUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGgaaaUCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(서열번호 43)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, CasX 단일 가이드 RNA는 서열번호 41 내지 43 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 41 내지 43 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
CasX 시스템
본 개시내용은 CasX 시스템을 개시한다. 본 개시내용의 CasX 시스템은 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; b) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; c) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; d) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; e) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; f) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; g) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; h) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; i) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; j) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; k) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; l) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; m) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; n) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; o) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; p) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; q) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 r) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 (a) 내지 (r) 중 하나의 일부 변형을 포함할 수 있다.
핵산
본 개시내용은 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열, CasX 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 CasX 단백질, 틈내기효소 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질 등)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이는 이중 가이드 RNA 형식의 경우에 2개의 별개의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 단일 가이드 RNA 형식의 경우에 단일 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있음) 중 하나 이상의 포함하는 하나 이상의 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 a) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 b) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 a) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 b) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다. 일부 경우에, CasX 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 선택 세포 유형(예를 들어, 원핵 세포, 진핵 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 설치류 세포, 인간 세포 등)에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 이런 최적화 유형은 의도된 숙주 유기체 또는 세포의 코돈 선호도를 모방하는 한편, 동일한 단백질을 암호화하는 CasX-암호화 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이를 수반한다. 따라서, 코돈은 변할 수 있지만, 암호화된 단백질은 변하지 않고 남아있다. 예를 들어, 의도된 표적 세포가 인간 세포라면, 인간 코돈 최적화된 CasX-암호화 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있었다. 다른 비제한적 예로서, 의도된 숙주 세포가 마우스 세포였다면, 마우스 코돈-최적화된 CasX-암호화 뉴클레오타이드 서열이 생성될 수 있었다. 다른 비제한적 예로서, 의도된 숙주 세포가 식물 세포였다면, 식물 코돈-최적화된 CasX-암호화 뉴클레오타이드 서열이 생성될 수 있었다. 다른 비제한적 예로서, 의도된 숙주 세포가 곤충 세포였다면, 곤충 코돈-최적화된 CasX-암호화 뉴클레오타이드 서열이 생성될 수 있었다.
본 개시내용은 (일부 경우에 상이한 재조합 발현 벡터에서, 그리고 일부 경우에 동일한 재조합 발현 벡터에서): (i) 공여자 주형 핵산의 뉴클레오타이드 서열(공여자 주형이 표적 핵산(예를 들어, 표적 게놈)의 표적 서열에 대해 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우); (ii) 표적화된 게놈의 표적 좌위의 표적 서열에 혼성화되는 CasX 가이드 RNA(예를 들어, 단일 또는 이중 가이드 RNA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 세포, 예컨대 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결됨); 및 (iii) CasX 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 세포, 예컨대 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 (일부 경우에 상이한 재조합 발현 벡터에서, 그리고 일부 경우에 동일한 재조합 발현 벡터에서): (i) 공여자 주형 핵산의 뉴클레오타이드 서열(공여자 주형이 표적 핵산(예를 들어, 표적 게놈)의 표적 서열에 대해 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우); 및 (ii) 표적화된 게놈의 표적 좌위의 표적 서열에 혼성화되는 CasX 가이드 RNA(예를 들어, 단일 또는 이중 가이드 RNA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 세포, 예컨대 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 (일부 경우에 상이한 재조합 발현 벡터에서, 그리고 일부 경우에 동일한 재조합 발현 벡터에서): (i) 표적화된 게놈의 표적 좌위의 표적 서열에 혼성화되는 CasX 가이드 RNA(예를 들어, 단일 또는 이중 가이드 RNA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 세포, 예컨대 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결됨); 및 (ii) CasX 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 세포, 예컨대 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결됨)을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 제공한다.
적합한 발현 벡터는 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스; 폴리오 바이러스; 아데노바이러스에 기반한 바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655); 아데노-연관 바이러스(AAV)(예를 들어, 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617] 참조); SV40; 단순포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999]); 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방암 바이러스로부터 유래된 벡터); 등을 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 재조합 렌티바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 재조합 레트로바이러스 벡터이다.
이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라서, 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소(구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함)가 발현 벡터에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 전사 제어 요소, 예컨대 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, CasX 단백질 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 전사 제어 요소, 예컨대 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
전사 제어 요소는 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조절 가능한 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 세포 유형-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 전사 제어 요소(예를 들어, 프로모터)는 표적화된 세포 유형 또는 표적화된 세포 집단에서 기능성이다. 예를 들어, 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포, 예를 들어, 조혈모세포(예를 들어, 이동 말초 혈액(mobilized peripheral blood: mPB) CD34(+) 세포, 골수(BM) CD34(+) 세포 등)에서 기능성일 수 있다.
진핵 프로모터(진핵 세포에서 프로모터 기능성)인 비제한적 예는 EF1α, 거대세포바이러스(CMV) 급초기, 단순포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(LTR) 및 마우스 메탈로티오네인-I로부터의 프로모터를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자 수준 내에서 매우 용이하다. 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 종결자에 대한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 CasX 단백질에 융합되어, 키메라 CasX 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 단백질 태그(예를 들어, 6xHis 태그, 혈구응집소 태그, 형광 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 CasX 융합 폴리펩타이드는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 CasX 융합 단백질은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터(즉, 구성적으로 활성인/"온(ON)" 상태인 프로모터)일 수 있고, 유도성 프로모터(즉, 상태가 활성/"온" 또는 비활성/"오프"인 프로모터, 외부 자극, 예를 들어, 특정 온도, 화합물 또는 단백질의 존재에 의해 제어됨)일 수 있으며, 공간적으로 제한된 프로모터(즉, 전사 제어 요소, 인핸서 등)(예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)일 수 있고, 그리고 일시적으로 제한된 프로모터일 수 있다(즉, 프로모터는 배아 발생의 특정 단계 동안에 또는 생물학적 과정(예를 들어, 마우스에서의 모낭 주기)의 특정 단계 동안에 "온" 상태 또는 "오프" 상태이다.
적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로서 지칭될 수 있거나, 또는 그들은 원핵 또는 진핵 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의해 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순포진 바이러스(HSV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 급초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소핵 프로모터(U6)(Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), 증강된 U6 프로모터(예를 들어, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), 인간 H1 프로모터(H1) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터(예를 들어, U6 프로모터, 증강된 U6 프로모터, H1 프로모터 등)(의 제어 하에서) 작동 가능하게 연결된다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, U6 프로모터(예를 들어, 진핵 세포에서), 또는 다른 PolIII 프로모터를 이용하여 핵산(예를 들어, 발현 벡터)로부터 RNA(예를 들어, 가이드 RNA)를 발현시킬 때, 행에 몇 개의 T이 있다면(RNA에서 U에 대한 암호) RNA는 돌연변이될 필요가 있을 수 있다. 이는 DNA 내 T(예를 들어, 5개의 T)의 문자열이 중합효소 III(PolIII)에 대한 종결자로서 작용할 수 있기 때문이다. 따라서, 진핵 세포 내 가이드 RNA(예를 들어, 이중 가이드 또는 단일 가이드 형식에서 활성체 부분 및/또는 표적자 부분)의 전사를 보장하기 위해, 때때로 T의 실행을 제거하는 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 변형할 필요가 있을 수 있다. 일부 경우에, CasX 단백질(예를 들어, 야생형 CasX 단백질, 틈내기효소 CasX 단백질, dCasX 단백질, 키메라 CasX 단백질 등)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 진핵 세포에서 작동 가능한 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, EF1α 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절 프로모터 등)에 작동 가능하게 연결된다.
유도성 프로모터의 예는 T7 RNA 중합효소 프로모터, T3 RNA 중합효소 프로모터, 아이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)-조절된 프로모터, 락토스 유도된 프로모터, 열 충격 프로모터, 테트라사이클린-조절 프로모터, 스테로이드-조절 프로모터, 금속-조절 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절 프로모터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서 유도성 프로모터는 독시사이클린; 에스트로겐 및/또는 에스트로겐 유사체; IPTG 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 분자에 의해 조절될 수 있다.
사용에 적합한 유도성 프로모터는 본 명세서에 기재되거나 또는 당업자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 화학적으로/생화학적으로-조절된 그리고 물리적으로 조절된 프로모터, 예컨대 알코올-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터 (예를 들어, 테트라사이클린 리프레서 단백질(tetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO) 및 테트라사이클린 트랜스작용인자 융합 단백질(tTA)을 포함하는, 안하이드로테트라사이클린 (aTc)-반응성 프로모터 및 다른 테트라사이클린-반응성 프로모터 시스템), 스테로이드-조절된 프로모터(예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체에 기반한 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑디손 수용체, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 슈퍼패밀리로부터의 프로모터), 금속-조절된 프로모터(예를 들어, 효모, 마우스 및 인간으로부터의 메탈로티오네인으로부터 유래된 프로모터(금속 이온에 결합하고 격리시키는 단백질) 유전자), 발병-조절된 프로모터(예를 들어, 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아다이아졸(BTH)에 의해 유도), 온도/열-유도성 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터), 및 광-조절된 프로모터(예를 들어, 식물 세포로부터의 광 반응성 프로모터)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 다세포 유기체에서, 프로모터가 특정 세포의 서브세트에서 활성(즉, "온")이 되도록 프로모터는 공간적으로 제한된 프로모터(즉, 세포 유형 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터 등)이다. 공간적으로 제한된 프로모터는 또한 인핸서, 전사 제어 요소, 제어 서열 등으로서 지칭될 수 있다. 프로모터가 표적화된 숙주 세포(예를 들어, 진핵 세포; 원핵 세포)에서 기능성이라면, 임의의 편리한 공간적으로 제한된 프로모터가 사용될 수 있다.
일부 경우에, 프로모터는 가역적 프로모터이다. 가역적 유도성 프로모터를 포함하는 적합한 가역적 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터는 다수의 유기체, 예컨대 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리 및 유래될 수 있다. 제2 유기체, 예를 들어, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역적 프로모터의 변형은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터, 및 이러한 가역적 프로모터에 기반할 뿐만 아니라 추가적인 제어 단백질을 포함하는 시스템은 알코올 조절된 프로모터(예를 들어, 알코올 탈수소효소 I(alcA) 유전자 프로모터, 알코올 트랜스작용인자 단백질(AlcR)에 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린 조절된 프로모터, (예를 들어, 테트라사이클린활성체(TetActivator), 테트라사이클린온(TetON), 테트라사이클린오프(TetOFF) 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터(예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병-관련 조절 프로모터(예를 들어, 살리실산 조절 프로모터, 에틸렌 조절 프로모터, 벤조티아다이아졸 조절 프로모터 등), 온도 조절 프로모터(예를 들어, 열 충격 유도성 프로모터(예를 들어, HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광 조절 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
핵산(예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, CasX 단백질 및/또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 등)을 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 핵산(예를 들어, 발현 작제물)을 세포 내로 도입하기 위해 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 리포펙션, 전기천공법, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 입자총 기법, 인산칼슘 침전, 직접 미량주사법, 나노입자-매개 핵산 전달 등을 포함한다.
재조합 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 것은 임의의 배양 배지에서 그리고 세포 생존을 촉진시키는 임의의 배양 조건 하에 생길 수 있다. 표적 세포 내로 재조합 발현 벡터를 도입하는 것은 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 표적 세포 내로 재조합 발현 벡터를 도입하는 것은 시험관외에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, CasX 단백질은 RNA로서 제공될 수 있다. RNA는 직접 화학 합성에 의해 제공될 수 있거나 또는 DNA(예를 들어, CasX 단백질을 암호화)로부터 시험관외에서 전사될 수 있다. 일단 합성되면, RNA는 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 임의의 잘 공지된 기법(예를 들어, 미량주사법, 전기천공법, 형질감염 등)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
핵산은 잘 개발된 형질감염 기법(예를 들어, 문헌[Angel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756] 참조), 및 퀴아젠사(Qiagen)로부터의 상업적으로 입수 가능한 TransMessenger(등록상표) 시약, 스템젠트사(Stemgent)로부터의 Stemfect(상표명) RNA 형질감염 키트, 및 미루스 바이오 엘엘씨(Mirus Bio LLC)로부터의 TransIT(등록상표)-mRNA 형질감염 키트를 이용하여 세포에 제공될 수 있다. 또한 문헌[Beumer et al. (2008) PNAS 105(50):19821-19826] 참조.
벡터는 표적 숙주 세포에 직접 제공될 수 있다. 다시 말해서, 벡터가 세포에 의해 취해지도록, 세포는 대상 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 공여자 주형 서열을 갖고 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터; CasX 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터 등)와 접촉된다. 세포를 플라스미드인 핵산 벡터와 접촉시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있는 전기천공법, 염화칼슘 형질감염, 미량주사법, 및 리포펙션을 포함한다. 바이러스 벡터 전달을 위해, 세포는 대상 바이러스 발현 벡터를 포함하는 바이러스 입자와 접촉될 수 있다.
레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스는 본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합하다. 통상적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "결함성"이며, 즉, 증식성 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생성할 수 없다. 오히려, 벡터의 복제는 패키징 세포주에서의 성장을 필요로 한다. 관심 대상을 포함하는 바이러스 입자를 생성하기 위해, 핵산을 포함하는 레트로바이러스 핵산은 패키징 세포주에 의해 바이러스 캡시드 내로 패키징된다. 상이한 패키징 세포주는캡시드 내로 혼입될 상이한 외피 단백질(동종숙주성(ecotropic), 양쪽성 또는 이종향성(xenotropic))을 제공하는데, 이 외피 단백질은 세포에 대한 바이러스 입자의 특이성(뮤린 및 래트에 대한 동종숙주; 인간, 개 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유류 세포 유형에 대해 양쪽성; 및 뮤린 세포를 제외한 대부분의 포유류 세포에 대해 이종향성)을 결정한다. 적절한 패키징 세포주를 사용하여 세포가 패키징된 바이러스 입자에 의해 표적화되는 것을 보장할 수 있다. 대상 벡터 발현 벡터를 패키징 세포주에 도입하고 패키징 세포주에 의해 생성된 바이러스 입자를 수집하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 핵산은 또한 직접 미량주사법(예를 들어, RNA의 주사)에 의해 도입될 수 있다.
CasX 가이드 RNA 및/또는 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 표적 숙주 세포에 제공하기 위해 사용되는 벡터는 발현을 유도하기 위한, 즉, 관심 대상의 핵산의 전사 활성화를 위한 적합한 프로모터를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 일부 경우에, 관심 대상의 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 것이다. 이는 편재하는 작용 프로모터, 예를 들어, CMV-β-액틴 프로모터, 또는 유도성 프로모터, 예컨대 특정 세포 집단에서 활성이거나 또는 테트라사이클린과 같은 약물의 존재에 반응하는 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 활성화에 의해, 전사는 10배, 100배만큼, 더 보통으로는 1000배만큼 표적 세포에서 기준 수준 초과로 증가될 것이 의도된다. 추가로, CasX 가이드 RNA 및/또는 CasX 단백질을 암호화하는 핵산을 세포에 제공하기 위해 사용되는 벡터는 CasX 가이드 RNA 및/또는 CasX 단백질을 취한 세포를 동정하기 위해 표적 세포에서 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 일부 경우에 RNA이다. 따라서, CasX 융합 단백질은 RNA로서 세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 RNA를 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 직접 미량주사법, 형질감염, 또는 DNA의 도입을 위해 사용되는 임의의 다른 방법을 포함할 수 있다. CasX 단백질은 대신에 폴리펩타이드로서 세포에 제공될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 생성물의 용해도를 증가시키는 폴리펩타이드에 선택적으로 융합될 수 있다. 도메인은 정해진 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, TEV 프로테아제에 의해 절단되는 TEV 서열을 통해 폴리펩타이드에 연결될 수 있다. 링커는 또한 하나 이상의 가요성 서열, 예를 들어, 1 내지 10개의 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질의 절단은 생성물의 용해도를 유지하는 완충제에서, 예를 들어, 0.5 내지 2 M 유레아의 존재 하에, 용해도 등을 증가시키는 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 수행된다. 관심 대상의 도메인은 엔도솜 용해성 도메인, 예를 들어, 인플루엔자 HA 도메인; 및 생성에 도움을 주는 다른 폴리펩타이드, 예를 들어, IF2 도메인, GST 도메인, GRPE 도메인 등을 포함한다. 폴리펩타이드는 개선된 안정성을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 페길화될 수 있으며(PEGylated), 여기서 폴리에틸렌옥시기는 혈류에서 증강된 수명을 제공한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 세포에 의한 흡수를 촉진하기 위해 폴리펩타이드 침투 도메인에 융합될 수 있다. 다수의 침투 도메인이 당업계에 공지되어 있고, 펩타이드, 펩타이드 모방체 및 비-펩타이드 담체를 포함하는 본 개시내용의 비통합 폴리펩타이드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 침투 펩타이드는 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 133)를 포함하는, 페너트라틴(penetratin)으로서 지칭되는 노랑초파리 전사 인자 안테나피디어(Antennapaedia)의 세 번째 알파 나선으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로서, 침투 펩타이드는, 예를 들어, 천연 유래 tat 단백질의 아미노산 49 내지 57을 포함할 수 있는 HIV-1 tat 염기성 영역 아미노산 서열을 포함한다. 다른 침투 도메인은 폴리-알기닌 모티프, 예를 들어, HIV-1 rev 단백질, 노나-알기닌, 옥타-알기닌 등의 아미노산 34 내지 56의 영역을 포함한다. (예를 들어, 전좌 펩타이드 및 펩토이드의 교시에 대해 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입된 문헌[Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-9 및 446; 및 Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8]; 공개된 미국 특허 출원 제20030220334호; 제20030083256호; 제20030032593호; 및 제20030022831호를 참조). 노나-알기닌(R9) 서열은 특성규명된 더 효율적인 PTD 중 하나이다(Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002). 융합이 이루어지는 부위는 폴리펩타이드의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. 최적의 부위는 일상적인 실험에 의해 결정될 것이다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 시험관내에서 또는 진핵세포에 의해 또는 원핵 세포에 의해 생성될 수 있고, 비폴딩, 예를 들어, 열 변성, 다이티오트레이톨 환원 등에 의해 추가로 가공될 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 추가로 재폴딩될 수 있다.
1차 서열을 변경시키지 않는 관심 대상의 변형은 폴리펩타이드의 화학적 유도체화, 예를 들어, 아실화, 아세틸화, 카복실화, 아마이드화 등을 포함한다. 또한 글리코실화의 변형, 예를 들어, 합성 및 가공 동안 또는 추가 가공 단계에서 폴리펩타이드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써; 예를 들어, 글리코실화, 예컨대 포유류 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 영향을 미치는 효소에 폴리펩타이드를 노출시킴으로써 만들어지는 것이 포함된다. 또한 포스포릴화된 아미노산 잔기, 예를 들어, 포스포타이로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 갖는 서열이 포함된다.
또한 단백질 분해에 대한 그들의 내성을 개선시키기 위해, 표적 서열 특이성을 변화시키기 위해, 용해도 특성을 최적화하기 위해, 단백질 활성(예를 들어, 전사 조절 활성, 효소 활성 등)을 변경하기 위해 또는 그들을 더 적합하게 제공하기 위해 보통의 분자 생물학 기법 및 합성 화학을 이용하여 변형된 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA를 암호화, CasX 융합 단백질을 암호화 등) 및 단백질(예를 들어, 야생형 단백질 또는 변이체 단백질로부터 유래된 CasX 융합 단백질)이 본 개시내용의 실시형태에 포함하기에 적합하다. 이러한 폴리펩타이드의 유사체는 천연 유래 L-아미노산, 예를 들어, D-아미노산 또는 비천연 유래 합성 아미노산 이외의 잔기를 함유하는 것을 포함한다. D-아미노산은 일부 또는 모든 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.), 베크만(Beckman) 등에 의한 자동화된 합성기를 이용 가능하다. 합성기를 이용함으로써, 천연 유래 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편리함, 경제성, 필요한 순도 등에 의해 결정될 것이다.
원한다면, 합성 동안 또는 발현 동안에 다양한 기가 펩타이드 내로 도입되는데, 이는 다른 분자에 또는 표면에 대한 연결을 허용한다. 따라서 티오에터, 금속 이온 복합체에 대한 연결을 위한 히스티딘, 아마이드 또는 에스터를 형성하기 위한 카복실기 또는 아마이드를 형성하기 위한 아미노기 등을 만들기 위해 시스테인이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 또한 단리될 수 있고, 재조합 합성의 통상적인 방법에 따라 정제될 수 있다. 발현 숙주의 용해물이 제조될 수 있고, 용해물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피 또는 다른 정제 기법을 이용하여 정제된다. 대부분에 대해, 사용되는 조성물은 생성물의 제조 및 그의 정제 방법과 관련된 오염물질에 대해 20중량% 이상의 목적으로 하는 생성물, 더 보통으로는 75중량% 이상, 바람직하게는 95중량% 이상, 그리고 치료적 목적을 위해, 보통 99.5중량% 이상을 포함할 것이다. 보통, 백분율은 총 단백질을 기준으로 할 것이다. 따라서, 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드는 적어도 80% 순수, 적어도 85% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 순수(예를 들어, 오염물질, 비-CasX 단백질 또는 다른 거대분자 등이 없음)이다.
표적 핵산(예를 들어, 게놈 DNA)에 대한 절단 또는 임의의 목적으로 하는 변형, 또는 표적 핵산, 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA 및/또는 CasX 폴리펩타이드 및/또는 공여자 주형 서열과 관련된 폴리펩타이드에 대한 임의의 목적으로 하는 변형을 유도하기 위해, 그들이 핵산으로서 도입되든 또는 폴리펩타이드로서 도입되든, 약 30분 내지 약 24시간, 예를 들어, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 또는 약 30분 내지 약 24시간의 임의의 다른 기간 동안 세포에 제공되는데, 이는 대략 매일 내지 약 4일마다, 예를 들어, 1.5일마다, 2일마다, 3일마다의 빈도로, 또는 대략 매일 내지 약 4일마다의 임의의 다른 빈도로 반복될 수 있다. 제제(들)는 대상 세포에 1회 이상, 예를 들어, 1회, 2회, 3회, 3회 초과로 제공될 수 있고, 세포는 각각의 접촉 사건 후 일정한 시간 동안, 예를 들어, 16 내지 24시간 동안 제제(들)와 함께 인큐베이션되도록 허용되며, 이 시간 후에 배지는 신선한 배지로 대체되고, 세포는 추가로 배양된다.
2 이상의 상이한 표적화 복합체가 세포(예를 들어, 동일 또는 상이한 표적 핵산 내에서 상이한 서열에 상보성인 2개의 상이한 CasX 가이드 RNA)에 제공되는 경우에, 복합체는 동시에(예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 및/또는 핵산으로서) 제공될 수 있거나, 또는 동시에 전달될 수 있다. 대안적으로, 그들은 연속적으로, 예를 들어, 제1의 제공된 표적화 복합체, 다음에 제2 표적화 복합체 등 또는 그 반대로 제공될 수 있다.
DNA 벡터의 표적 세포의 전달을 개선시키기 위해, DNA는 손상으로부터 보호될 수 있고, 세포 내로 그의 유입은, 예를 들어, 리포플렉스(lipoplex) 및 폴리플렉스(polyplex)를 이용함으로써 용이하게 된다. 따라서, 일부 경우에, 본 개시내용의 핵산(예를 들어, 본 개시내용의 재조합 발현 벡세포 유형-특이적는 마이셀 또는 리포좀과 같이 조직화된 구조에서 지질로 뒤덮일 수 있다. 조직화된 구조가 DNA와 함께 복합체화될 때, 이는 리포플렉스로 불린다. 3가지 유형의 지질, 음이온(음으로 하전됨), 중성 또는 양이온성(양으로 하전됨)이 있다. 양이온성 지질을 이용하는 리포플렉스는 유전자 전달을 위한 증명된 효용을 가진다. 양전하 지질은 그들의 양전하에 기인하여 음으로 하전된 DNA와 자연적으로 복합체화된다. 또한 그들의 하전의 결과로서, 그들은 세포막과 상호작용한다. 이어서, 리포플렉스의 내포작용이 일어나고, DNA는 세포질 내로 방출된다. 양이온성 지질은 또한 세포에 의해 DNA의 분해에 대해 보호한다.
DNA와 중합체의 복합체는 폴리플렉스로 불린다. 대부분의 폴리플렉스는 양이온성 중합체로 이루어지고, 그들의 생성은 이온 상호작용에 의해 조절된다. 폴리플렉스와 리포플렉스의 작용 방법 간의 한 가지 큰 차이는 폴리플렉스는 세포질 내로 그들의 DNA 부하를 방출할 수 없고, 이를 위하여, 엔도솜-용해제(내포작용 동안 만들어진 엔도솜을 용해시키기 위함), 예컨대 비활성화 아데노바이러스와의 공동형질감염이 일어나야 한다는 것이다. 그러나, 이는 항상 그런 것은 아니며; 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민은 키토산 및 트라이메틸키토산과 같이 엔도솜 붕괴의 그 자체의 방법을 가진다.
구체 형태를 갖는 상당히 분지형인 거대분자인 덴드리머는 또한 줄기 세포를 유전적으로 변형하기 위해 사용될 수 있다. 덴드리머 입자의 표면은 그의 특성을 변경시키도록 작용화될 수 있다. 특히, 양이온성 덴드리머(즉, 양성 표면 전하를 갖는 것)를 작제하는 것이 가능하다. 유전자 물질, 예컨대 DNA 플라스미드의 존재 하에 있을 때, 전하 상보성은 양이온성 덴드리머와 핵산의 일시적 회합을 야기한다. 그의 목적에 도달되었을 때, 덴드리머-핵산 복합체는 내포작용에 의해 세포 내로 흡수될 수 있다.
일부 경우에, 개시내용의 핵산(예를 들어, 발현 벡터)은 관심 대상의 가이드 서열에 대한 삽입 부위를 포함한다. 예를 들어, 핵산은 관심 대상의 가이드 서열에 대한 삽입 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 삽입 부위는 가이드 서열이 목적으로 하는 표적 서열(예를 들어, 가이드 RNA의 CasX 결합 양상에 기여하는 서열, 예를 들어, CasX 가이드 RNA의 dsRNA 듀플렉스(들)에 기여하는 서열 - 가이드 RNA의 이 부분은 또한 가이드 RNA의 '스캐폴드' 또는 '불변 영역'으로서 지칭될 수 있음)에 혼성화하도록 변할 때 변하지 않는 CasX 가이드 RNA의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 바로 인접한다. 따라서, 일부 경우에, 가이드 RNA의 가이드 서열을 암호화하는 부분이 삽입 서열(삽입 부위)라는 것을 제외하고, 대상 핵산(예를 들어, 발현 벡터)는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 삽입 부위는 목적으로 하는 서열의 삽입을 위해 사용되는 임의의 뉴클레오타이드 서열이다. 다양한 기법과 함께 사용하기 위한 "삽입 부위"는 당업자에게 공지되어 있고, 임의의 편리한 삽입 부위가 사용될 수 있다. 삽입 부위는 핵산 서열을 조작하기 위한 임의의 방법에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 삽입 부위는 다중 클로닝 부위(MCS)(예를 들어, 하나 이상의 제한 효소 인식 서열을 포함하는 부위), 결찰 독립적 클로닝을 위한 부위, 재조합 기반 클로닝을 위한 부위(예를 들어, att 부위에 기반한 재조합), CRISPR/Cas(예를 들어, Cas9) 기반 기법에 의해 인식되는 뉴클레오타이드 서열 등이다.
삽입 부위는 임의의 바람직한 길이일 수 있고, 삽입 부위 유형에 의존할 수 있다(예를 들어, 부위가 하나 이상의 제한 효소 인식 서열을 포함하는지의 여부(및 얼마나 많이 포함하는지), 부위가 CRISPR/Cas 단백질에 대한 표적 부위를 포함하는지의 여부 등에 의존할 수 있다). 일부 경우에, 대상 핵산의 삽입 부위는 길이가 3개 이상의 뉴클레오타이드(nt)이다(예를 들어, 길이가 5개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상 또는 30개 이상의 nt). 일부 경우에, 대상 핵산의 삽입 부위 길이는 길이가 2 내지 50개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 2 내지 40 nt, 2 내지 30개의 nt, 2 내지 25개의 nt, 2 내지 20개의 nt, 5 내지 50개의 nt, 5 내지 40개의 nt, 5 내지 30개의 nt, 5 내지 25개의 nt, 5 내지 20개의 nt, 10 내지 50개의 nt, 10 내지 40개의 nt, 10 내지 30개의 nt, 10 내지 25개의 nt, 10 내지 20개의 nt, 17 내지 50개의 nt, 17 내지 40개의 nt, 17 내지 30개의 nt, 17 내지 25 nt) 범위이다. 일부 경우에, 대상 핵산의 삽입 부위 길이는 길이가 5 내지 40 nt이다.
핵산 변형
일부 실시형태에서, 새로운 또는 증강된 특징(예를 들어, 개선된 안정성)을 갖는 핵산을 제공하기 위해 대상 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA)는 하나 이상의 변형, 예를 들어, 염기 변형, 골격 변형 등을 가진다. 뉴클레오사이드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오사이드의 염기 부분은 정상적으로 복소환식 염기이다. 이러한 복소환식 염기의 2가지 가장 통상적인 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산염기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드이다. 펜토퓨라노실 당을 포함하는 해당 뉴클레오사이드에 대해, 인산염기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 형성함에 있어서, 인산염기는 서로 인접한 뉴클레오사이드에 공유적으로 연결되어 선형 중합체 화합물을 형성한다. 결국, 이 선형 중합체 화합물의 각각의 단부는 추가로 결합되어 원형 화합물을 형성할 수 있지만, 그러나, 선형 화합물이 적합하다. 추가로, 선형 화합물은 내부 뉴클레오타이드 염기 상보성을 가질 수 있으며, 따라서 완전히 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 생성하기 위한 방식으로 폴딩될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 내에서, 인산염기는 통상적으로 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 골격을 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 정상 결합 또는 골격은 3' 내지 5' 포스포다이에스터 결합이다.
적합한 핵산 변형은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 2'O메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA) 변형된 뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 변형된 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 뉴클레오타이드 및 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)). 추가적인 상세한 설명 및 추가적인 변형을 이하에 기재한다.
2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드(또한 2'-O-메틸 RNA로서 지칭됨)는 tRNA에서 발견되는 RNA 및 전사후 변형으로서 생기는 다른 작은 RNA의 천연 유래 변형이다. 2'-O-메틸 RNA를 함유하는 올리고뉴클레오타이드가 직접적으로 합성될 수 있다. 이 변형은 RNA:RNA 듀플렉스의 Tm을 증가시키지만 RNA:DNA 안정성의 작은 변화만을 초래한다. 이는 단일-가닥 리보뉴클레아제에 의한 공격에 대해 안정하며 전형적으로 DNA보다 DNase에 대해 5 내지 10배 덜 민감하다. 이는 표적 전령에 대한 안정성 및 결합 친화도를 증가시키기 위한 수단으로서 안티센스 올리고에서 통상적으로 사용된다.
2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 2' 플루오로 염기)는 결합 친화도(Tm)를 증가시키는 플루오린 변형된 리보스를 가지며, 또한 천연 RNA에 비해 일부 상대적 뉴클레아제 내성을 부여한다. 이들 변형은 혈청 또는 다른 생물학적 유체에서의 안정성을 개선시키기 위해 리보자임 및 siRNA에서 통상적으로 사용된다.
LNA 염기는 RNA A-형 나선 듀플렉스 기하학을 선호하는 C3'-엔도 위치에서 염기를 잠그는 리보스 골격에 대한 변형을 가진다. 이 변형은 Tm을 상당히 증가시키며, 또한 매우 뉴클레아제 내성이다. 다중 LNA 삽입은 3'-단부를 제외한 임의의 위치에서 올리고에 위치될 수 있다. 적용은 혼성화 프로프에 대한 안티센스 올리고로부터 SNP 검출 및 대립유전자 특이적 PCR까지의 범위로 기재되었다. LNA에 의해 부여되는 Tm의 큰 증가에 기인하여, 그들은 또한 프라이머 이량체 형성뿐만 아니라 자기-헤어핀 형성의 증가를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 단일 올리고 내로 혼입된 LNA의 수는 10개 이하의 염기이다.
포스포로티오에이트(PS) 결합(즉, 포스포로티오에이트 결합)은 핵산(예를 들어, 올리고)의 인산염 골격에서 황 원자를 비-브리징 산소로 치환한다. 이 변형은 뉴클레아제 분해에 내성이 있는 뉴클레오타이드간 결합을 제공한다. 포스포로티오에이트 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 저해하기 위해 올리고의 5'- 또는 3'-단부에서 마지막 3 내지 5개 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다. 올리고 내에서(예를 들어, 전체 올리고를 전체적으로) 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것은 마찬가지로 엔도뉴클레아제에 의한 공격을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상 핵산은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드인 하나 이상의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 하나 이상의 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드를 가진다. 일부 실시형태에서, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 하나 이상의 LNA 염기를 가진다. 일부 실시형태에서, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 가진다(즉, 대상 핵산은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 가진다). 일부 실시형태에서, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G))을 가진다. 일부 실시형태에서, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 변형된 뉴클레오타이드의 조합을 가진다. 예를 들어, 대상 핵산(예를 들어, dsRNA, siNA 등)은 다른 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드(예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드 및/또는 2' 플루오로 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 LNA 염기 및/또는 포스포로티오에이트 결합)를 갖는 것에 추가로 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G))을 가질 수 있다.
변형된 골격 및 변형된 뉴클레오사이드간 결합
변형을 함유하는 적합한 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA)의 예는 변형된 골격 또는 비천연 뉴클레오사이드간 결합을 함유하는 핵산을 포함한다. 변형된 골격을 갖는 핵산은 골격에 인 원자를 보유하는 것 및 골격에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다.
인 원자를 함유하는 적합한 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 카이랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 카이랄 포스포네이트를 포함), 포스피네이트, 포스포르아미데이트(3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 포스포로다이아미데이트, 티오노포스포르아미데이트를 포함), 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터, 셀레노포스페이트 및 정상 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5'연결된 유사체, 및 반전된 극성을 갖는 것을 포함하되, 하나 이상의 뉴클레오타이드간 결합은 3' 내지 3', 5' 내지 5' 또는 2' 내지 2' 결합이다. 반전된 극성을 갖는 적합한 올리고뉴클레오타이드는 가장 3'의 뉴클레오타이드간 결합에서 단일 3' 내지 3' 결합, 즉, 염기성일 수 있는 단일 반전 뉴클레오사이드 잔기를 포함한다(뉴클레오염기는 그 대신에 상실되거나 하이드록실기를 가짐). 다양한 염(예컨대, 칼륨 또는 나트륨), 혼합된 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다.
일부 실시형태에서, 대상 핵산은 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오사이드간 결합, 특히 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로서 알려짐), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-를 포함한다(천연 포스포다이에스터 뉴클레오타이드간 결합은 -O-P(=O)(OH)-O-CH2-로서 나타냄). MMI 유형 뉴클레오사이드간 결합은 상기 언급된 미국 특허 제5,489,677호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입된다. 적합한 아마이드 뉴클레오사이드간 결합은 미국 특허 제5,602,240호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
또한, 예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호에 기재된 바와 같은 몰폴리노 골격 구조를 갖는 핵산이 적합하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상 핵산은 리보스 고리 대신에 6-원 몰폴리노 고리를 포함한다. 일부 이들 실시형태에서, 포스포로다이아미데이트 또는 다른 비-포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 결합은 포스포다이에스터 결합을 대체한다.
인 원자를 포함하지 않는 적합한 변형된 폴리뉴클레오타이드 골격은 짧은 쇄알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합 또는 하나 이상의 짧은 쇄 헤테로원자 또는 복소환식 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성된 골격을 가진다. 이들은 몰폴리노 결합을 갖는 것(뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 티오폼아세틸 골격; 리보아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것을 포함한다.
모방체
대상 핵산은 핵산 모방체일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 용어 "모방체"는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 의도되되, 푸라노스 고리만 또는 푸라노스 고리와 뉴클레오타이드가나 결합 둘 다는 비-푸라노스 기로 대체되며, 푸라노스 고리만의 대체는 또한 본 명세서에서 당 대용물로서 지칭된다. 복소환식 염기 모이어티 또는 변형된 복소환식 염기 모이어티는 적절한 표적 핵산과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 갖는 것을 나타난 하나의 이러한 핵산, 폴리뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA에서, 폴리뉴클레오타이드의 당-골격은 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격을 함유하는 아마이드로 대체된다. 뉴클레오타이드가 보유되며, 골격의 아마이드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 보고된 하나의 폴리뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산(PNA)이다. PNA 화합물의 골격은 PNA에 아마이드 함유 골격을 제공하는 2 이상의 연결된 아미노에틸 글리신 단위이다. 복소환식 염기 모이어티는 골격의 아마이드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다.
연구된 다른 부류의 폴리뉴클레오타이드 모방체는 몰폴리노 고리에 부착된 복소환식 염기를 갖는 연결된 몰폴리노 단위(몰폴리노 핵산)에 기반한다. 몰폴리노 핵산에서 몰폴리노 단량체 단위를 연결하는 다수의 연결기가 보고되었다. 비이온성 올리고머 화합물을 제공하기 위한 연결기의 한 가지 부류가 선택되었다. 비-이온성 몰폴리노계 올리고머 화합물은 세포 단백질과의 원치않는 상호작용을 가질 가능성이 더 적다. 몰폴리노계 폴리뉴클레오타이드는 세포 단백질과의 원치않는 상호작용을 형성할 가능성이 더 적은 올리고뉴클레오타이드의 비이온성 모방체이다(Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). 몰폴리노계 폴리뉴클레오타이드는 미국 특허 제5,034,506호에 개시되어 있고, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입된다. 단량체 서브유닛을 결합하는 다양한 상이한 연결기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 몰폴리노 부류 내의 다양한 화합물이 제조되었다.
추가적인 부류의 폴리뉴클레오타이드 모방체는 사이클로헥센일 핵산(CeNA)으로서 지칭된다. DNA/RNA 분자에 정상적으로 존재하는 푸라노스 고리는 사이클로헥센일 고리로 대체된다. CeNA DMT 보호된 포스포르아미다이트 단량체가 제조되었고, 고전적 포스포르아미다이트 화학 다음의 올리고머 화합물 합성을 위해 사용되었다. CeNA로 변형된 특정 위치를 갖는 완전히 변형된 CeNA 올리고머 화합물 및 올리고뉴클레오타이드가 제조되고, 연구되었다(문헌[Wang et al., J. Am. Chem . Soc., 2000, 122, 8595-8602]을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨). 일반적으로 DNA 쇄에 대한 CeNA 단량체의 편입은 DNA/RNA 혼성체의 그의 안정성을 증가시킨다. CeNA 올리고아데닐레이트는 천연 복합체와 유사한 안정성을 갖는 RNA 및 DNA 상보체와의 복합체를 형성하였다. 천연 핵산 구조에 CeNA 구조를 혼입하는 연구는 용이한 입체배좌 적용에 의해 진행되는 NMR 및 원이색법에 의해 나타낸다.
추가적인 변형은 잠금 핵산(LNA)을 포함하며, 이때 2'-하이드록실기는 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결됨으로써, 2'-C,4'-C-옥시메틸렌 결합을 형성하고, 이에 의해 이환식 당 모이어티를 형성한다. 결합은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 브리징하는 기인 메틸렌(-CH2-)일 수 있되, n은 1 또는 2이다(문헌[Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456], 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨). LNA 및 LNA 유사체는 상보성 DNA 및 RNA에 의한 매우 높은 듀플렉스 열 안정성(Tm=+3 내지 +10℃), 3'-핵산외부 분해 및 양호한 용해도 특성에 대한 안정성을 나타낸다. LNA를 함유하는 강력한 그리고 비독성의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 기재되었다(예를 들어, 문헌[Wahlestedt et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638] 참조, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨).
LNA 단량체 아데닌, 사이토신, 구아닌, 5-메틸-사이토신, 티민 및 유라실의 합성 및 제조는, 그들의 올리고머, 및 핵산 인식 특성과 함께 기재되었다(예를 들어, 문헌[Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630] 참조, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨). LNA 및 이의 제조는 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226뿐만 아니라 미국 특허 출원 제20120165514호, 제20100216983호, 제20090041809호, 제20060117410호, 제20040014959호, 제20020094555호 및 제20020086998호에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
변형된 당 모이어티
대상 핵산은 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오타이드는 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; O-, S- 또는 N-알킨일; 또는 O-알킬-O-알킬로부터 선택된 당 치환체기를 포함하되, 알킬, 알켄일 및 알킨일은 치환된 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알켄일 및 알킨일일 수 있다. O((CH2)nO) mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON((CH2)nCH3)2가 특히 적합하며, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 적합한 폴리뉴클레오타이드는 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알켄일, 알킨일, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 삽입제(intercalator), 올리고뉴클레오타이드의 약물동력학 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오타이드의 약물동력학 특성을 개선시키기 위한 기 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체로부터 선택된 당 치환체기를 포함한다. 적합한 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2 CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 알려짐)(Martin et al., Helv . Chim . Acta, 1995, 78, 486-504, 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨) 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가적인 적합한 변형은 본 명세서의 이하의 실시예에 기재된 바와 같은 2'-DMAOE로서도 알려진 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시(또한 당업계에서 2'-O-다이메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로서 알려짐), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2를 포함한다.
다른 적합한 당 치환체기는 메톡시 (-O-CH3), 아미노프로폭시(--O CH2 CH2 CH2NH2), 알릴(-CH2-CH=CH2), -O-알릴(--O-- CH2―CH=CH2) 및 플루오로(F)를 포함한다. 2'-당 치환체기는 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치일 수 있다. 적합한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형은 또한 올리고머 화합물 상의 다른 위치에서, 특히 3' 말단의 뉴클레오사이드 상의 당의 3' 위치에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 만들어질 수 있다. 올리고머 화합물은 또한 펜토퓨라노실 당 대신 당 모방체, 예컨대 사이클로뷰틸 모이어티를 가질 수 있다.
염기 변형 및 치환
대상 핵산은 또한 핵염기(종종 본 명세서에서 단순히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "비변형" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 유라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로유라실 및 사이토신, 5-프로핀일 (-C=C-CH3) 유라실 및 피리미딘 염기의 사이토신 및 다른 알킨일 유도체, 6-아조 유라실, 사이토신 및 티민, 5-유라실 (슈도유라실), 4-티오유라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 유라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가로 변형된 핵염기는 삼환식 피리미딘, 예컨대 페녹사진 사이티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 사이티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘(2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘(H-피리도(3',2':4,5)피롤로(2,3-d)피리미딘-2-온)을 포함한다.
복소환식 염기 모이어티는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체되는 것을 포함할 수 있다. 추가로 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie , International Edition, 1991, 30, 613]에 의해 개시된 것, 및 문헌[Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 의해 개시된 것을 포함하며; 이의 개시내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다. 특정 이들 핵염기는 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일유라실 및 5-프로핀일사이토신을 포함)을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 0.6 내지 1.2℃만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고(Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278; 이의 개시내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입됨), 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때, 적합한 염기 치환이다.
접합체
대상 핵산의 다른 가능한 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 폴리뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 것을 수반한다. 이들 모이어티 또는 접합체는 작용기, 예컨대 1차 또는 2차 하이드록실기에 공유 결합된 접합체기를 포함할 수 있다. 접합체기는 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아마이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에터, 올리고머의 약력학적 특성을 향상시키는 기, 및 올리고머의 약물동력학적 특성을 향상시키는 기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 접합기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약력학적 특성을 향상시키는 기는 흡수를 개선시키고/시키거나, 분해에 대한 내성을 향상시키고/시키거나 표적 핵산과의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기를 포함한다. 약물동태학적 특성을 향상시키는 기는 대상 핵산의 흡수, 분포, 대사 또는 배설을 개선시키는 기를 포함한다.
접합 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Bioorg . Med . Chem . Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에터, 예를 들어, 헥실-S-트라이틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y . Acad . Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med . Chem . Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl . Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸다이올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트라이에틸암모늄 1,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl . Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol . Exp . Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
접합체는 "단백질 형질도입 도메인" 또는 PTD(또한 CPP - 세포 침투성 펩타이드로서 알려짐)를 포함하는데, 이는 지질 이중층, 마이셀, 세포막, 세포소기관 막 또는 소수포 막을 가로지르는 것을 용이하게 하는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물 또는 유기 또는 무기 화합물을 지칭할 수 있다. 거대 분자 및/또는 나노분자의 범위일 수 있는 다른 분자에 부착된 PTD는 분자가 막을 가로지르는 것, 예를 들어, 세포외 공간으로부터 세포내 공간 또는 사이토졸을 세포소기관(예를 들어, 핵) 내로 이동하는 것을 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, PTD는 외인성 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, PTD는 외인성 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 공유적으로 연결된다. 예시적인 PTD는 최소 운데카펩타이드 단백질 형질도입 도메인(YGRKKRRQRRR; 서열번호 112를 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47 내지 57에 대응); 세포 내로 유입을 지시하기에 충분한 다수의 알기닌을 포함하는 폴리알기닌 서열(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10-50 알기닌); VP22 도메인(Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); 초파리 안테나페디아(Antennapedia) 단백질 형질도입 도메인(Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절단된 인간 칼시토닌 펩타이드(Trehin et al. (2004) Pharm . Research 21:1248-1256); 폴리라이신(Wender et al. (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR 서열번호 113); 트랜스포탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 서열번호 114); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA 서열번호 115); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK 서열번호 116)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 PTD는 YGRKKRRQRRR 서열번호 117), RKKRRQRRR 서열번호 118); 3개의 알기닌 잔기 내지 50개의 알기닌 잔기의 알기닌 동종중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않고; 예시적인 PTD 도메인 아미노산 서열은 다음 중 어떤 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: YGRKKRRQRRR 서열번호 119); RKKRRQRR 서열번호 120); YARAAARQARA 서열번호 121); THRLPRRRRRR 서열번호 122); 및 GGRRARRRRRR 서열번호 123). 일부 실시형태에서, PTD는 활성화 가능한 CPP(ACPP)이다(Aguilera et al. (2009) Integr Biol ( Camb ) June; 1(5-6): 371-381). ACPP는 매칭 절단 가능한 링커를 통해 다음이온(예를 들어, Glu9 또는 "E9")에 연결된 다양이온 CPP(예를 들어, Arg9 또는 "R9")를 포함하는데, 이는 순전하를 거의 0으로 감소시키고, 이에 의해 세포에 대한 접착 및 흡수를 저해한다. 링커의 절단 시, 다음이온이 방출되며, 다알기닌 및 그의 고유한 부착성을 국소로 가리며, 따라서 막을 가로지르도록 ACPP를 "활성화시킨다".
표적 세포 내로의 성분의 도입
본 개시내용의 CasX 가이드 RNA(또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산) 및/또는 CasX 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산) 및/또는 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드(또는 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산) 및/또는 공여자 폴리뉴클레오타이드(공여자 주형)는 임의의 다양한 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하기 위해 임의의 다양한 화합물 및 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어, CasX 시스템은 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; b) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; c) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; d) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; e) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; f) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; g) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; h) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; i) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; j) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; k) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; l) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; m) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; n) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; o) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; p) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; q) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 r) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 (a) 내지 (r) 중 하나의 일부 변형을 포함한다. 비제한적 예로서, 본 개시내용의 CasX 시스템은 지질과 조합될 수 있다. 다른 비제한적 예로서, 본 개시내용의 CasX 시스템은 입자와 조합될 수 있거나 또는 입자 내로 제형화될 수 있다.
숙주 세포 내로 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 임의의 편리한 방법은 대상 핵산(예를 들어, 발현 작제물/벡터)을 표적 세포(예를 들어, 원핵 세포, 진핵 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 등) 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 접합, 프로토플라스트 융합, 리포펙션, 전기천공법, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 입자총 기법, 인산칼슘 침전, 직접 미량주사법, 나노입자-매개 핵산 전달(예를 들어, 문헌[Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023] 참조)등을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA, DNA, 플라스미드, 발현 벡터, 바이러스 벡터 등)으로서 제공된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 단백질로서(예를 들어, 관련된 가이드 RNA 없이 또는 회합 가이드 RNA와 함께, 즉, 리보핵단백질로서) 직접 제공된다. 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 임의의 편리한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며(세포에 제공되며); 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예시적 예로서, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 (예를 들어, CasX 가이드 RNA 또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산과 함께 또는 이들 없이, 그리고 공여자 폴리뉴클레오타이드와 함께 또는 이것 없이) 세포 내로 직접 주사될 수 있다. 다른 예로서, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA(RNP)의 수행된 복합체는 (예를 들어, 주사를 통해, 뉴클레오펙션을 통해; 하나 이상의 성분에 접합된, 예를 들어, CasX 단백질에 접합된, 가이드 RNA 등에 접합된, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 가이드 RNA에 접합된 단백질 형질도입 도메인(PTD)을 통해) 세포(예를 들어, 진핵 세포) 내로 도입될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 상대에 융합된 dCasX, 융합 상대에 융합된 틈내기효소 CasX 등)는 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA, DNA, 플라스미드, 발현 벡터, 바이러스 벡터 등)으로서 제공된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 단백질로서(예를 들어, 관련된 가이드 RNA 없이 또는 회합 가이드 RNA와 함께, 즉, 리보핵단백질로서) 직접 제공된다. 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 임의의 편리한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며(세포에 제공되며); 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예시적 예로서, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 (예를 들어, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산과 함께 또는 이들 없이, 그리고 공여자 폴리뉴클레오타이드와 함께 또는 이것 없이) 세포 내로 직접 주사될 수 있다. 다른 예로서, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA(RNP)의 수행된 복합체는 (예를 들어, 주사를 통해, 뉴클레오펙션을 통해; 하나 이상의 성분에 접합된, 예를 들어, CasX 융합 단백질에 접합된, 가이드 RNA 등에 접합된, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 가이드 RNA에 접합된 단백질 형질도입 도메인(PTD)을 통해) 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 경우에, 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA; 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 등)은 입자 내 또는 입자와 회합된 세포(예를 들어, 표적 숙주 세포) 및/또는 폴리펩타이드(예를 들어, CasX 폴리펩타이드; CasX 융합 폴리펩타이드)에 전달된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 시스템은 입자 내 세포에 전달되거나 또는 입자와 회합된다. 용어 "입자" 및 나노입자"는 적절하다면, 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 CasX 가이드 RNA, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA, 및 가이드 RNA를 포함하는 재조합 발현 벡터는 입자 또는 지질 외피를 이용하여 동시에 전달될 수 있고; 예를 들어, CasX 폴리펩타이드 및 예를 들어, 복합체(예를 들어, 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체)로서 CasX 가이드 RNA가 입자, 예를 들어, 지질 또는 리피도이드 및 친수성 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질 및 친수성 중합체를 포함하는 전달 입자를 통해 전달될 수 있되, 예를 들어, 양이온성 지질은 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP) 또는 1,2-다이테트라데칸오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)을 포함하고/하거나 친수성 중합체는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하고; 그리고/또는 입자는 추가로 콜레스테롤을 포함한다(예를 들어, 제형 1로부터의 입자=DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 제형 번호 2=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 제형 번호 3=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5). 예를 들어, 입자는 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드RNA가, 예를 들어, 1:1 몰비에서, 예를 들어, 실온에서, 예를 들어, 30분 동안, 예를 들어, 멸균, 무 뉴클레아제 1 x 인산염-완충 식염수(PBS) 중에서 함께 혼합되고; 그리고 별개로, 제형에 대해 적용 가능하다면 DOTAP, DMPC, PEG 및 콜레스테롤은 알코올, 예를 들어, 100% 에탄올 중에서 용해되고; 그리고, 두 용액은 함께 혼합되어 복합체를 함유하는 입자를 형성하는 다단계 공정을 이용하여 형성될 수 있다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드(또는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA; 또는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터) 및/또는 CasX 가이드 RNA(또는 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터와 같은 핵산)는 입자 또는 지질 외피를 이용하여 동시에 전달될 수 있다. 예를 들어, 인지질 이중층 껍질로 뒤덮인 폴리(β-아미노 에스터)(PBAE) 코어를 갖는 생분해성 코어 껍질 구조의 나노입자를 사용할 수 있다. 일부 경우에, 자가 조립 생접착성 중합체에 기반한 입자/나노입자가 사용되고; 이러한 입자/나노입자는, 예를 들어, 뇌에 대해, 펩타이드의 경구 전달, 펩타이드의 정맥내 전달 및 펩타이드의 비강 전달에 적용될 수 있다. 다른 실시형태, 예컨대 경구 흡수 및 소수성 약물의 눈 전달이 또한 상정된다. 보호되고 질환 부위로 전달되는 조작된 중합체를 수반하는 분자 외피 기법이 사용될 수 있다. 약 5㎎/㎏의 용량은 다양한 인자, 예를 들어, 표적 조직에 따라서 단일 또는 다회 용량으로 사용될 수 있다.
리피도이드 화합물(예를 들어, 미국 특허 출원 제20110293703호에 기재된 바와 같음)은 또한 폴리뉴클레오타이드의 투여에 유용하고, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 전달하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, CasX 시스템은 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; b) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; c) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; d) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; e) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; f) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; g) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; h) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; i) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; j) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; k) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; l) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; m) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; n) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; o) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; p) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; q) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 r) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 (a) 내지 (r) 중 하나의 일부 변형을 포함한다. 일 양상에서, 아미노알코올 리피도이드 화합물은 세포 또는 대상에 전달될 제제와 조합되어 마이크로입자, 나노입자, 리포좀 또는 마이셀을 형성한다. 아미노알코올 리피도이드 화합물은 다른 아미노알코올 리피도이드 화합물, 중합체(합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 지질 등과 조합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서, 이들 입자는 선택적으로 약제학적 부형제와 조합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
폴리(베타-아미노 알코올)(PBAA)은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 미국 특허 공개 제20130302401호는 조합적 중합을 이용하여 제조된 폴리(베타-아미노 알코올)(PBAA) 부류에 관한 것이다.
당-기반 입자는, 예를 들어, 참고로 WO2014118272(본 명세서에 참고로 편입됨) 및 문헌[Nair, J K et al., 2014, Journal of the American Chemical Society 136 (49), 16958-16961]에 기재된 바와 같은 GalNAc이 사용될 수 있고, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 지질 나노입자(LNP)는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 음으로 하전된 중합체, 예컨대 RNA는 낮은 pH 값(예를 들어, pH 4)에서 LNP에 부하될 수 있고, 여기서 이온화 가능한 지질은 양전하를 나타낸다. 그러나, 생리적 pH 값에서, LNP는 더 긴 순환 시간에 적합한 낮은 표면 전하를 나타낸다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 4가지 종, 즉, 1,2-다이리놀레일-3-다이메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레일옥시-케토-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLinKDMA), 및 1,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란(DLinKC2-DMA)에 중점을 두었다. LNP의 제조는, 예를 들어, 문헌[Rosin et al. (2011) Molecular Therapy 19:1286-2200)]에 기재되어 있다. 양이온성 지질 1,2-다이리놀레일-3-다이메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레일옥시케토-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란 (DLinKC2-DMA), (3-o-[2''-(메톡시폴리에틸렌글리콜 2000) 숙신오일]-1,2-다이미리스토일-sn-글리콜 (PEG-S-DMG), 및 R-3-[(.오메가.-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카바모일]-1,2-다이미리스틸옥실프로필-3-아민(PEG-C-DOMG)이 사용될 수 있다. 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA; 본 개시내용의 핵산 등)은 DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA 및 DLinKC2-DMA(40:10:40:10 몰비로 양이온성 지질:DSPC:CHOL: PEGS-DMG 또는 PEG-C-DOMG)를 함유하는 LNP에서 캡슐화될 수 있다. 일부 경우에, 0.2% SP-DiOC18이 혼입된다.
구체 핵산(SNA(상표명)) 작제물 및 다른 나노입자(특히 금 나노입자)는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19): 7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) 및 Mirkin, et al., Small, 10:186-192] 참조.
RNA를 갖는 자기-조립 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 원위 단부에 부착된 Arg-Gly-Asp (RGD)펩타이드 리간드로 페길화된 폴리에틸렌이민(PEI)에 의해 작제될 수 있다.
일반적으로, "나노입자"는 직경이 1000㎚ 미만인 임의의 입자를 지칭한다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자는 직경이 500㎚ 이하, 예를 들어, 25㎚ 내지 35㎚, 35㎚ 내지 50㎚, 50㎚ 내지 75㎚, 75㎚ 내지 100㎚, 100㎚ 내지 150㎚, 150㎚ 내지 200㎚, 200㎚ 내지 300㎚, 300㎚ 내지 400㎚, 또는 400㎚ 내지 500㎚이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자는 직경이 25㎚ 내지 200㎚이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자는 직경이 100㎚ 이하이고, 일부 경우에, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자는 직경이 35㎚ 내지 60㎚이다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합한 나노입자는 상이한 형태, 예를 들어, 고체 나노입자(예를 들어, 금속, 예컨대 은, 금, 철, 티타늄), 비-금속, 지질계 고체, 중합체), 나노입자의 현탁액 또는 이들의 조합물로 제공될 수 있다. 금속, 유전체 및 반도체 나노입자뿐만 아니라 혼성 구조(예를 들어, 코어-껍질 나노입자)가 제조될 수 있다. 반도체 물질로 만들어진 나노입자는 또한, 그들이 전자 에너지 준위의 양자화가 일어나기에 충분히 작다면(전형적으로 10㎚ 미만), 표지된 양자점일 수 있다. 이러한 나노규모 입자는 약물 담체 또는 영상화제로서의 생의학적 적용분야에서 사용되고, 본 개시내용에서 유사한 목적을 위해 채택될 수 있다.
반고체 및 연질 나노입자는 또한 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용하기에 적합하다. 반고체 특성의 원형 나노입자는 리포좀이다.
일부 경우에, 엑소좀은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 엑소좀은 RNA 및 단백질을 수송하고, RNA를 뇌 및 다른 표적 기관에 전달할 수 있는 내인성 나노소포체이다.
일부 경우에, 리포좀은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단층 또는 다층 지질 이중층 및 상대적으로 불침투성의 외부 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소수포 구조이다. 리포좀은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 이루어질 수 있지만, 그러나 인지질은 리포좀을 생성하는 데 가장 통상적으로 사용된다. 지질막이 수성 용액과 혼합될 때 리포좀 제형은 자발적이지만, 이는 또한 균질기, 초음파분해기 또는 압출 장치를 이용함으로써 진탕 형태로 힘을 적용함으로써 촉진될 수 있다. 이 구조 및 특성을 변형시키기 위래 몇몇 다른 첨가제가 리포좀에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 구조를 안정화시키기 위해 그리고 리포좀 내부 내용물의 누출을 방지하기 위해 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린 중 하나가 리포좀 혼합물에 첨가될 수 있다. 리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-다이스테아릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고마이엘린, 난황 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오사이드를 포함할 수 있다.
안정한 핵산-지질 입자(SNALP)는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. SNALP 제형은 2:40:10:48 몰 백분율 비로 지질 3-N-[(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 2000) 카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 콜레스테롤을 함유할 수 있다. SNALP 리포좀은 콜레스테롤/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA의 25:1 지질/siRNA 비 및 48/40/10/2 몰비를 이용하여 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 siRNA와 함께 D-Lin-DMA 및 PEG-C-DMA를 제형화함으로써 제조될 수 있다. 얻어진 SNALP 리포좀은 크기가 약 80 내지 100㎚일 수 있다. SNALP는 합성 콜레스테롤(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스에 소재), 다이팔미토일포스파티딜콜린(아반티 폴라 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids), 미국 앨리버마주 알라바스터에 소재), 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시프로필아민 및 양이온성 1,2-다이리놀레일옥시-3-N,N-다이메틸아미노프로판을 포함할 수 있다. SNALP는 합성 콜레스테롤(시그마-알드리치), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC; 아반티 폴라 리피트 인코포레이티드), PEG-cDMA, 및 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N;N-다이메틸)아미노프로판(DLinDMA)을 포함할 수 있다.
다른 양이온성 지질, 예컨대 아미노 지질 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노에틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-KC2-DMA)은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다음의 지질 조성으로 수행된 소수포가 상정될 수 있다: 각각 몰비 40/10/40/10로 아미노 지질, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 (R)-2,3-비스(옥타데실옥시) 프로필-1-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카바메이트(PEG-지질), 및 대략 0.05(w/w)의 FVII siRNA/총 지질비. 70 내지 90㎚ 범위의 좁은 입자 크기 분포 및 0.11.+-.0.04(n=56)의 낮은 다분산지수를 보장하기 위해, 입자는 가이드 RNA를 첨가하기 전에 80㎚ 막을 통해 3회까지 압출될 수 있다. 상당히 강한 아미노 지질 16을 함유하는 입자가 사용될 수 있으며, 이때 4가지 지질 성분 16, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질(50/10/38.5/1.5)의 몰비는 생체내 활성을 향상시키도록 추가로 최적화될 수 있다.
지질은 본 개시내용의 CasX 시스템 또는 이의 성분(들) 또는 이를 암호화하는 핵산으로 제형화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성할 수 있다. 적합한 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 코지질(colipid) 다이스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 자발적 소수포 제형화 절차를 이용하여 본 개시내용의 CasX 시스템, 또는 이의 성분으로 제형화될 수 있다. 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/다이스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다.
미국 특허 공개 제20130252281호 및 제20130245107호 및 제20130244279호에서 추가로 기재된 것과 같이 PLGA 마이크로스피어에서 캡슐화된 본 개시내용의 CasX 시스템, 또는 이의 성분이 전달될 수 있다.
과급된 단백질이 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 과급된 단백질은 흔치 않게 높은 양성 또는 음성 이론적 순전하를 갖는 조작된 또는 천연 유래 단백질의 부류이다. 초음성과 초양성으로 하전된 단백질은 둘 다 열적으로 또는 화학적으로 유도된 응집을 견뎌내는 능력을 나타낸다. 초양성으로 하전된 단백질은 또한 포유류 세포를 침투할 수 있다. 이들 단백질, 예컨대 플라스미드 DNA, RNA 또는 다른 단백질과 화물의 회합은 시험관내 그리고 생체내 둘 다에서 포유류 세포 내로 이들 거대분자의 기능적 전달을 용이하게 할 수 있다.
세포 침투성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide: CPP)가 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. CPP는 전형적으로 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 라이신 또는 알기닌의 낮은 상대적 존재비를 함유하거나 또는 극성/하전된 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산의 교번의 패턴을 함유하는 서열을 갖는 아미노산 조성물을 가진다.
이식 가능한 장치는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산(예를 들어, CasX 가이드 RNA, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산, CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 공여자 주형 등), 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포(예를 들어, 생체내 표적 세포, 여기서 표적 세포는 순환에서의 표적 세포, 조직 내 표적 세포, 기관 내 표적 세포임)에 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, 본 개시내용의 RNP, 본 개시내용의 핵산, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템을 표적 세포(예를 들어, 생체내 표적 세포, 여기서 표적 세포는 순환에서의 표적 세포, 조직 내 표적 세포, 기관 내 표적 세포 등임)에 전달하는 데 사용하기에 적합한 이식 가능한 장치는 CasX 폴리펩타이드, CasX 융합 폴리펩타이드, RNP, 또는 CasX 시스템(또는 이의 성분, 예를 들어, 본 개시내용의 핵산)을 포함하는 용기(예를 들어, 저장소, 매트릭스 등)를 포함할 수 있다.
적합한 이식 가능한 장치는 중합체 기질, 예컨대 매트릭스(예를 들어, 장치 본체로서 사용됨), 및 일부 경우에 추가적인 스캐폴드 물질, 예컨대 금속 또는 추가적인 중합체, 및 가시성 및 이미징을 향상시키기 위한 물질을 포함할 수 있다. 이식 가능한 전달 장치는 국소로 그리고 장기간에 걸쳐 방출을 제공하는 데 유리할 수 있고, 여기서 전달될 폴리펩타이드 및/또는 핵산은 표적 부위, 예를 들어, 세포외 기질(ECM), 종양을 둘러싸는 혈관, 질병 조직 등으로 직접 방출된다. 적합한 이식 가능한 전달 장치는 복강과 같은 내강에 대한 전달 및/또는 임의의 다른 유형의 투여에서 사용하기에 적합한 장치를 포함하며, 이때 생체 안정성 및/또는 분해성 및/또는 생체 흡수성 중합체 기질(예를 들어, 선택적으로 매트릭스일 수 있음)을 포함하는 약물 전달 시스템은 고정 또는 부착되지 않는다. 일부 경우에, 적합한 이식 가능한 약물 전달 장치는 분해성 중합체를 포함하되, 주요 방출 메커니즘은 벌크 침식(bulk erosion)이다. 일부 경우에, 적합한 이식 가능한 약물 전달 장치는 비분해성 또는 느리게 분해되는 중합체를 포함하되, 주요 방출 메커니즘은 벌크 침식보다는 확산성이며, 따라서 외부 부분은 막으로서 작용하고, 그의 내부 부분은 약물 저장소로서 작용하는데, 이는 사실상 장기간 동안(예를 들어, 약 1주 내지 약 몇 개월) 주변에 의해 영향받지 않는다. 상이한 중합체와 상이한 방출 메커니즘의 조합이 또한 선택적으로 사용될 수 있다. 농도 구배는 총 방출 기간의 상당한 기간 동안 효과적으로 유지될 수 있고, 따라서 확산 속도는 효과적으로 일정하다("제로 방식(zero mode)" 확산으로 칭해짐). 용어 "일정한"은 치료적 유효성의 하부 역치 초과로 유지되지만, 여전히 선택적으로 초기 버스트 확산 속도를 특징으로 할 수 있고/있거나, 예를 들어, 특정 정도로 증가 및 감소하면서 변동할 수 있는 확산 속도를 의미한다. 확산 속도는 장기간 동안 그렇게 유지될 수 있고, 이는 치료적으로 유효한 기간, 예를 들어, 유효한 침묵 기간을 최적화하기 위해 특정 수준에 대해 일정하게 고려될 수 있다.
일부 경우에, 이식 가능한 전달 시스템은, 천연에서 화학물질이든 또는 대상체의 신체에서 효소 및 다른 인자로부터의 공격에 기인하든 뉴클레오타이드계 치료제가 분해되는 것을 막도록 설계된다.
장치의 이식을 위한 부위 또는 표적 부위는 최대 치료 효능을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 전달 장치는 종양 환경, 또는 종양과 관련된 혈액 공급 내에서 또는 이의 근위에 이식될 수 있다. 표적 위치는, 예를 들어 하기일 수 있다: 1) 기저핵, 백질 및 회백질에서 파킨슨 또는 알츠하이머병에서와 같이 퇴행성 부위에서의 뇌; 2) 근위축성측색경화증(ALS)의 경우에 척추; 3) 자궁경부; 4) 활성 및 만성 염증성 관절염; 5) 건선의 경우에 피부; 7) 알레르기 효과에 대한 교감신경성 및 감각 신경 부위; 7) 뼈; 8) 급성 또는 만성 감염 부위; 9) 질내; 10) 내이--청각계, 내이의 미로, 전정계; 11) 기관내; 12) 심장내; 관상동맥, 심외막; 13) 비뇨기관 또는 방광; 14) 담도계; 15) 신장, 표, 비장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실질세포; 16) 림프절; 17) 침샘; 18) 덴탈검(dental gum); 19) 관절강내(관절내); 20) 안구내; 21) 뇌조직; 22) 뇌실; 23) 복강을 포함하는 강(예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 난소암에 대해); 24) 식도내; 및 25) 직장내; 및 26) 혈관구조내.
삽입, 예컨대 이식 방법은 선택적으로 변형 없이 또는 대안적으로 선택적으로 이러한 방법에서 중요하지 않은 변형만으로 다른 유형의 조직 이식을 위해 그리고/또는 삽입을 위해 그리고/또는 조직 샘플링을 위해 선택적으로 이미 사용될 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 브라키테라피 방법, 생검, 초음파와 함께 그리고/또는 초음파 없이 내시경검사, 예컨대 뇌 조직 내로 주촉성 방법, 관절, 복부 기관, 방광벽 및 체강 내로 복강경의 이식을 포함하는 복강경검사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
변형된 숙주 세포
본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 세포 및/또는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 포함하는 변형된 세포를 제공하며, 여기서 변형된 세포는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 정상적으로 포함하지 않는 세포이다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 변형된 세포(예를 들어, 유전자 변형된 세포)를 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 mRNA로 유전자 변형된 유전자 변형 세포를 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 유전자 변형된 유전자 변형 세포를 제공한다. 본 개시내용은: a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 b) 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 유전자 변형된 유전자 변형 세포를 제공한다. 본 개시내용은: a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; b) 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 c) 공여자 주형을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 유전자 변형된 유전자 변형 세포를 제공한다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및/또는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및/또는 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA에 대한 수용자로서 작용하는 세포는, 예를 들어, 시험관내 세포; 생체내 세포; 생체외 세포; 1차 세포; 암 세포; 동물 세포; 식물 세포; 조류 세포; 진균 세포 등을 포함하는 임의의 다양한 세포일 수 있다. 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및/또는 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및/또는 본 개시내용의 CasX 가이드 RNA에 대한 수용자로서 작용하는 세포는 "숙주 세포" 또는 "표적 세포"로서 지칭된다. 숙주 세포 또는 표적 세포는 본 개시내용의 CasX 시스템의 수용자일 수 있다. 숙주 세포 또는 표적 세포는 본 개시내용의 CasX RNP의 수용자일 수 있다. 숙주 세포 또는 표적 세포는 본 개시내용의 CasX 시스템의 단일 성분의 수용자일 수 있다.
세포(표적 세포)의 비제한적 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 마이스, 밀, 종자, 토마토, 벼, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 목화, 대마초, 담배, 하훼, 구과 식물, 겉씨식물, 속씨식물, 양치식물, 석송, 뿔이끼류, 우산이끼류, 선태식물, 쌍떡잎식물, 외떡잎식물 등), 조류 세포, (예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 칼라마이도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 모자반속(Sargassum patens, C. agardh) 등), 해초(예를 들어, 켈프) 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포, 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추동물(예를 들어, 과실파리, 강장동물, 극피동물, 선충 등)으로부터의 세포, 척추동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류)로부터의 세포, 포유류 (예를 들어, 유제류(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양)로부터의 세포; 설치류(예를 들어, 래트, 마우스); 비-인간 영장류; 인간; 고양이과(예를 들어, 고양이); 갯과(예를 들어, 개); 등) 등을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 천연 유기체로부터 유래되지 않은 세포이다(예를 들어, 세포는 합성으로 만들어진 세포일 수 있고; 또한 인공 세포로서 지칭된다).
세포는 시험관내 세포일 수 있다(예를 들어, 확립된 배양 세포주). 세포는 생체외 세포일 수 있다(개체로부터의 배양 세포). 세포는 생체내 세포(예를 들어, 개체 내 세포)일 수 있다. 세포는 단리된 세포일 수 있다. 세포는 유기체 내부의 세포일 수 있다. 세포는 유기체일 수 있다. 세포는 세포 배양물 내 세포일 수 있다(예를 들어, 시험관내 세포 배양물). 세포는 세포 수집물 중 하나일 수 있다. 세포는 원핵 세포이거나 또는 원핵 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 박테리아 세포일 수 있거나 또는 박테리아 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 고세균 세포일 수 있거나 또는 고세균 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 진핵 세포일 수 있거나 또는 진핵 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 식물 세포일 수 있거나 또는 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 동물 세포일 수 있거나 또는 동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 무척추동물 세포일 수 있거나 또는 무척추동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 척추동물 세포일 수 있거나 또는 척추동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있거나 또는 포유류 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 설치류 세포일 수 있거나 또는 설치류 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있거나 또는 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 미생물 세포일 수 있거나 또는 미생물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 진균 세포일 수 있거나 또는 진균 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 곤충 세포일 수 있다. 세포는 절지동물 세포일 수 있다. 세포는 원생동물 세포일 수 있다. 세포는 유충 세포일 수 있다.
적합한 세포는 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포; 생식세포(예를 들어, 난모세포, 정자, 난원세포, 정원세포 등); 체세포, 예를 들어, 섬유아세포, 희소돌기신경교, 교세포, 조혈모세포, 뉴런, 근육 세포, 골세포, 간세포, 췌장 세포 등을 포함한다.
적합한 세포는 인간 배아 줄기 세포, 태아 심장 근육 세포, 근육섬유아세포, 간충직 줄기 세포, 자가이식 확장된 심장 근육 세포, 지방세포, 전분화 세포, 만능 세포, 혈액 줄기 세포, 근아세포, 성체 줄기 세포, 골수 세포, 간충직 세포, 배아 줄기 세포, 실질 세포, 상피세포, 내피세포, 중피세포, 섬유아세포, 조골세포, 연골세포, 외인성 세포, 내인성 세포, 줄기 세포, 조혈모세포, 골수 유래 전구체 세포, 심근세포, 골격 세포, 태아 세포, 미분화 세포, 다능 전구체 세포, 단분화능 전구체 세포, 단핵구, 심장 근아세포, 골격 근아세포, 대식세포, 모세혈관 내피세포, 이종 세포, 동종 세포 및 출산후 줄기 세포를 포함한다.
일부 경우에, 세포는 면역세포, 뉴런, 상피세포 및 내피세포 또는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 자연살해 세포, 수지상 세포 또는 대식세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 헬퍼 T 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 조절 T 세포(Treg)이다.
일부 경우에, 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포를 포함한다. 성체 줄기 세포는 또한 체세포 줄기 세포로서 지칭된다.
성체 줄기 세포는 분화된 조직 내에 존재하지만, 자기 재생 특성 및 다중 세포 유형, 보통 줄기 세포가 발견된 전형적인 조직의 세포 유형이 생기게 하는 능력을 보유한다. 체세포 줄기 세포의 수많은 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 근육 줄기 세포; 조혈모세포; 상피 줄기 세포; 신경 줄기 세포; 간충직 줄기 세포; 유방 줄기 세포; 장 줄기 세포; 중배엽 줄기 세포; 내피 줄기 세포; 후각 줄기 세포; 신경 능선 줄기 세포 등을 포함한다.
관심 대상의 줄기 세포는 포유류 줄기 세포를 포함하며, 용어 "포유류"는 인간; 비-인간 영장류; 가축 및 농장 동물; 및 동물원, 실험실, 운동 또는 반려 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 마우스, 래트, 토끼 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 경우에, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 설치류(예를 들어, 마우스; 래트) 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 비-인간 영장류 줄기 세포이다.
줄기 세포는 하나 이상의 줄기 세포 마커, 예를 들어, SOX9, KRT19, KRT7, LGR5, CA9, FXYD2, CDH6, CLDN18, TSPAN8, BPIFB1, OLFM4, CDH17 및 PPARGC1A를 발현시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기 세포는 조혈모세포(HSC)이다. HSC는 골수, 혈액, 제대혈, 태아간 및 난황낭으로부터 단리될 수 있는 중배엽-유래 세포이다. HSC는 CD34+ 및 CD3-으로서 특성규명된다. HSC는 생체내 적혈구, 호중성-대식세포, 거핵구 및 림프계 조혈세포 계통을 재생시킬 수 있다. 시험관내에서, HSC는 적어도 일부의 자기-재생 세포 분열을 겪도록 유도될 수 있고, 생체내에서 알 수 있는 바와 같이 동일한 계통으로 분화되도록 유도될 수 있다. 이렇게 해서, HSC는 적혈구 세포, 거핵구, 호중구, 대식세포 및 림프구 세포 중 하나 이상으로 분화되도록 유도될 수 있다.
다른 실시형태에서, 줄기 세포는 신경 줄기 세포(NSC)이다. 신경 줄기 세포(NSC)는 뉴런, 및 교세포(희소돌기신경교 및 성상교세포를 포함)로 분화할 수 있다. 신경 줄기 세포는 다회 분열할 수 있는 다능성 줄기 세포이고, 특정 조건 하에서 신경아세포 또는 아교모세포, 예를 들어, 각각 뉴런 및 교세포 중 하나 이상의 유형이 되도록 기여하는 세포일 수 있는 신경 줄기 세포 또는 신경 전구체 세포인 딸 세포를 생성할 수 있다. NSC를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
다른 실시형태에서, 줄기 세포는 간충직 줄기 세포(MSC)이다. MSC는 본래 배아 중배엽으로부터 유래되고, 성체 골수로부터 단리되며, 근육, 뼈, 연골, 지방, 골수 기질 및 힘줄을 형성하도록 분화될 수 있다. MSC를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; MSC를 얻기 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 MSC의 단리를 기재하는 미국 특허 제5,736,396호 참조.
세포는 일부 경우에 식물 세포이다. 식물 세포는 외떡잎식물의 세포일 수 있다. 세포는 쌍떡잎식물의 세포일 수 있다.
일부 경우에, 세포는 식물 세포이다. 예를 들어, 세포는 주요 농작물, 예를 들어, 보리, 콩류(건조 식용), 카놀라, 옥수수, 목화(피마), 목화(업랜드), 아마씨, 건초(알팔파), 건초(비-알팔파), 귀리, 땅콩, 벼, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기(오일), 해바라기(비-오일), 고구마, 담배(벌리), 담배(연관처리(Flue-cured)), 토마토, 밀(듀럼), 밀(봄), 밀(겨울) 등의 세포일 수 있다. 다른 예로서, 세포는, 예를 들어, 알팔파, 알로에 잎, 애로루트, 벗풀, 아티초크, 아스파라거스, 죽순, 바나나꽃, 콩나물, 콩류, 비이트톱, 근대, 비타멜론, 청경채, 브로콜리, 브로콜리 라베(엽경채), 방울다다기 양배추, 양배추, 방울 양배추, 가재발 선인장(노팔), 호리병박 열매, 카르둔, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 차요테, 중국 아티초크(두루미냉이), 중국 양배추, 중국 셀러리, 중국 차이브, 채심, 국화잎(퉁호), 콜라드 그린, 옥수수대, 단옥수수, 오이, 대컨, 단데리온 그린, 타로토란, 다우 무에(dau mue)(피 팁(pea tip)), 동과(겨울멜론), 가지, 엔다이브, 에스카롤, 선수 장식 양치식물, 갓류 식물, 치커리, 갓 (중국 겨자), 가일론(gailon), 갈랑가(시암, 태국 생강), 마늘, 생강 뿌리, 우엉, 나물, 하노버 샐러드 나물, 후아우존틀, 예루살렘 아티초크, 히카마, 케일 나물, 콜라비, 명아주(?리떼), 상추(비브), 상추(보스턴), 상추 (보스턴 레드), 상추(녹색잎), 상추(아이스버그), 상추(롤라로사), 상추(오크리프 - 녹색), 상추 (오크리프 - 적색), 상추(가공처리), 상추(적색잎), 상추(로메인), 상추(루비 로메인), 상추(러시안 레드 겨자), 린쿡, 로 복, 긴콩류, 연근, 마하, 용설란 (아가베) 잎, 말랑가, 메스꿀랭 믹스, 겨자과, 모압(수세미오이), 무(moo), 모쿠아(moqua)(동과), 버섯, 겨자, 참마, 오크라, 옹초이, 그린 어니언, 오포(opo)(롱 스쿼시), 장식용 옥수수, 관상용 호박, 파슬리, 파스닙, 완두콩, 후추(벨형), 후추, 호박, 라디키오, 무순, 무, 레이프 그린(rape greens),레이프 그린, 대황, 로메인(베이비 레드), 루타베가, 함초(씨빈), 신쿠아(앵글드/줄기가 선 수세미), 시금치, 스쿼시, 짚 더미, 사탕수수, 고구마, 근대, 타마린드, 타로, 타로잎, 타로 슈트, 탓소이, 테페구아헤(tepeguaje)(구아헤), 빔바, 토마틸로, 토마토, 토마토 (체리), 토마토(포도형), 토마토 (자두형), 강황, 순무 어린잎 나물, 순무, 마름, 얌피, 얌스(네임스), 유초이, 유카(카사바) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 채소 작물의 세포이다.
세포는 일부 경우에 절지동물 세포이다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, 협각류, 다지류, 헥시포디아(Hexipodia), 거미강, 곤충강, 돌좀목, 좀류, 구시아강, 하루살이목, 잠자리목, 잠자리하목, 실잠자리아목, 신시류, 외시류, 강도래목, 흰개미붙이목, 메뚜기, 민벌레목, 집게벌레목, 바퀴목, 귀뚜라미붙이목, 갈르와벌레과, 만토파스마토데과, 대벌레목, 바퀴목, 흰개미목, 사마귀목, 책좀, 다듬이벌레목, 총채벌레목, 이목, 반시목, 내시류 또는 완전변태류, 막시류, 초시류, 부채벌레목, 약대벌레목, 뱀잠자리목, 풀잠자리목, 밑드리목, 버룩목, 파리목, 날도래류 또는 인시목의 아목, 과, 아과, 군, 하위군, 또는 종의 세포일 수 있다.
세포는 일부 경우에 곤충 세포이다. 예를 들어, 일부 경우에, 세포는 모기, 메뚜기, 노린재류, 파리, 벼룩, 벌, 말벌, 개미, 이, 나방 또는 딱정벌레의 세포이다.
키트
본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 시스템 또는 본 개시내용의 CasX 시스템의 성분을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용의 키트는 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; b) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; c) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA; d) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; e) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; f) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; g) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 및 CasX 가이드 RNA; h) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, CasX 가이드 RNA, 및 공여자 주형 핵산; i) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; j) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; k) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; l) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 공여자 주형 핵산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; m) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; n) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; o) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; p) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터, 및 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 공여자 주형 핵산; q) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 r) 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 제1 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 또는 (a) 내지 (r) 중 하나의 일부 변형을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트는 a) 본 개시내용의 CasX 시스템, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템의 상기 기재한 바와 같은 성분; 및 b) 1종 이상의 추가적인 시약, 예를 들어, i) 완충제; ii) 프로테아제 저해제; iii) 뉴클레아제 저해제; iv) 검출 가능한 표지를 개발하거나 또는 시각화하는 데 필요한 시약; v) 양성 및/또는 음성 대조군 표적 DNA; vi) 양성 및/또는 음성 대조군 CasX 가이드 RNA 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키트는 a) 상기 기재한 바와 같은 본 개시내용의 CasX 시스템의 성분, 또는 본 개시내용의 CasX 시스템; 및 b) 치료제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트는 a) 표적 핵산에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 CasX 가이드 RNA의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 삽입하기 위한 삽입 부위; 및 b) CasX 가이드 RNA의 CasX-결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키트는 a) 표적 핵산에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 CasX 가이드 RNA의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 삽입하기 위한 삽입 부위; b) CasX 가이드 RNA의 CasX-결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 c) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있다.
효용
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 다양한 방법에서의(예를 들어, CasX 가이드 RNA와 조합하여 그리고 일부 경우에 추가로 공여자 주형과 조합하여) 용도를 발견한다. 예를 들어, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드는 (i) 표적 핵산(DNA 또는 RNA; 단일 가닥 또는 이중 가닥)을 변형(예를 들어, 절단, 예를 들어, 틈내기; 메틸화 등); (ii) 표적 핵산의 전사를 조절; (iii) 표적 핵산을 표지; (iv)(예를 들어, 단리, 표지, 영상화, 추적 등의 목적을 위해) 표적 핵산에 결합; (v) 표적 핵산과 회합된 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤)를 변형 등을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을: a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드; 및 b) 하나 이상의(예를 들어, 2개의) CasX 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을 a) 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드; b) CasX 가이드 RNA; 및 c) 공여자 핵산(예를 들어, 공여자 주형)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 시험관내 세포에서 수행된다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 생체내 세포에서 수행된다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 생체외 세포에서 수행된다.
CasX 폴리펩타이드를 사용하는 방법은 (회합된 CasX 가이드 RNA에 의해 거기서 표적화한 덕분에) 표적 핵산 내 특정 영역에 대한 CasX 폴리펩타이드의 결합을 포함하기 때문에, 상기 방법은 일반적으로 본 명세서에서 결합 방법(예를 들어, 표적 핵산의 결합 방법)으로서 지칭된다. 그러나, 일부 경우에, 결합 방법이 표적 핵산의 결합에 불과할 수 있지만, 다른 경우에, 상기 방법은 상이한 최종 결과를 가질 수 있다는 것이 이해되어야 한다(예를 들어, 상기 방법은 표적 핵산의 변형, 예를 들어, 절단/메틸화/등, 표적 핵산으로부터의 전사의 조절; 표적 핵산의 번역의 조절; 게놈 편집; 표적 핵산과 회합된 단백질의 조절; 표적 핵산의 단리 등을 초래할 수 있다).
적합한 방법의 예에 대해, 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May;10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43; Qi et al, Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 2013 Oct 31; Chen et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. 2013 Nov;195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013;3:2510; Fujii et al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187; Hu et al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188; Larson et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis.　2013　Dec;51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda).　2013 Dec 9;3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 2013 Oct 9; Yang et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9]; 및 미국 특허 및 특허 출원 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 8,697,359; 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 및 20140377868를 참조하며; 이들 각각은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.
예를 들어, 본 개시내용은 표적 핵산의 절단 방법; 표적 핵산의 편집 방법; 표적 핵산으로부터 전사를 조절하는 방법; 표적 핵산을 단리시키는 방법, 표적 핵산을 결합시키는 방법, 표적 핵산의 영상화 방법, 표적 핵산을 변형시키는 방법 등을 제공한다(그러나 이들로 제한되지 않는다).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 예를 들어, CasX 폴리펩타이드와 또는 CasX 융합 폴리펩타이드 등과 "표적 핵산을 접촉시키다" 및 "표적 핵산을 접촉시키는"이라는 용어/어구는 표적 핵산을 접촉시키기 위한 모든 방법을 포함한다. 예를 들어, CasX 폴리펩타이드는 단백질, RNA(CasX 폴리펩타이드를 암호화) 또는 DNA(CasX 폴리펩타이드를 암호화)로서 세포에 제공될 수 있는 반면; CasX 가이드 RNA는 가이드 RNA로서 또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산으로서 제공될 수 있다. 이렇게 해서, 예를 들어, 세포에서(예를 들어, 시험관내 세포 내에서, 생체내 세포 내에서, 생체외 세포 내에서) 방법을 수행할 때, 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법은 그들의 활성/최종 상태에서(예를 들어, CasX 폴리펩타이드에 대한 단백질(들)의 형태로; CasX 융합 폴리펩타이드에 대한 단백질의 형태로; 일부 경우에 가이드 RNA에 대한 RNA의 형태로) 임의의 또는 모든 성분의 세포 내로의 도입을 포함하고, 그리고 또한 하나 이상의 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산(들), 가이드 RNA(들)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 핵산(들), 공여자 주형을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 등)의 세포 내로의 도입을 포함한다. 상기 방법은 또한 세포밖 시험관내에서 수행될 수 있기 때문에, 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법은, (달리 구체화되지 않는 한) 시험관내 세포 밖에서, 시험관내 세포 내에서, 생체내 세포 내에서, 생체외 세포 내 등에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드와, 또는 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을 CasX 폴리펩타이드, 제1 CasX 가이드 RNA, 및 제2 CasX 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 개시내용의 방법은 표적 핵산을 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA 및 공여자 DNA 주형과 접촉시키는 단계를 포함한다.
관심 대상의 표적 핵산 및 표적 세포
CasX 가이드 RNA에 결합될 때, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드는 표적 핵산에 결합할 수 있고, 일부 경우에, 표적 핵산에 결합하고 이를 변형시킬 수 있다. 표적 핵산은 임의의 핵산(예를 들어, DNA, RNA)일 수 있고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 임의의 유형의 핵산(예를 들어, 염색체(게놈 DNA), 염색체로부터 유래, 염색체 DNA, 플라스미드, 바이러스, 세포외, 세포내, 미토콘드리아, 엽록체, 선형, 원형 등)일 수 있고, (예를 들어, 표적 핵산이 표적화될 수 있도록 CasX 가이드 RNA가 표적 핵산 내 표적 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 한) 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 표적 핵산은 이중 가닥(예를 들어, dsDNA, dsRNA) 또는 단일 가닥(예를 들어, ssRNA, ssDNA)일 수 있다. 일부 경우에, 표적 핵산은 단일 가닥이다. 일부 경우에, 표적 핵산은 단일 가닥 RNA(ssRNA)이다. 일부 경우에, 표적 ssRNA(예를 들어, 표적 세포 ssRNA, 바이러스 ssRNA 등)는 mRNA, rRNA, tRNA, 비-암호 RNA(ncRNA), 긴 비-암호 RNA(lncRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)로부터 선택된다. 일부 경우에, 표적 핵산은 단일 가닥 DNA(ssDNA)(예를 들어, 바이러스 DNA)이다. 상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 표적 핵산은 단일 가닥이다.
표적 핵산은 어디에서나, 예를 들어, 시험관내 세포 밖에서, 시험관내 세포 내에서, 생체내 세포 내에서, 생체외 세포 내 등에 위치될 수 있다. 적합한 표적 세포(표적 핵산, 예컨대 게놈 DNA를 포함할 수 있음)는 박테리아 세포; 고세균 세포; 단세포 진핵 유기체의 세포; 식물 세포; 조류 세포, 예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니, 칼라마이도모나스 레인하르티, 난노클로롭시스 가디타나, 클로렐라 피레노이도사, 모자반속 등; 진균 세포(예를 들어, 효모 세포); 동물 세포; 무척추동물(예를 들어, 과실파리, 강장동물, 극피동물, 선충 등)로부터의 세포; 곤충(예를 들어, 모기; 벌; 해충 등)의 세포; 거미류(예를 들어, 거미; 진드기 등)의 세포; 척추동물 (예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류)로부터의 세포; 포유류(예를 들어, 설치류로부터의 세포; 인간으로부터의 세포; 비-인간 포유류의 세포; 설치류(예를 들어, 마우스, 래트)의 세포; 토끼목(예를 들어, 토끼)의 세포; 유제류(예를 들어, 소, 말, 낙타, 라마, 비쿠냐, 양, 염소 등)의 세포; 해양 포유류(예를 들어, 고래, 바다표범, 바다 코끼리, 돌고래, 바다사자 등) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 임의의 유형의 세포에 관심이 있을 수 있다(예를 들어, 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포, 생식세포(예를 들어, 난모세포, 정자, 난원세포, 정원세포 등), 성체 줄기 세포, 체세포, 예를 들어, 섬유아세포, 조혈모세포, 뉴런, 근육 세포, 골세포, 간세포, 췌장 세포; 임의의 단계에서 배아의 시험관내 또는 생체내 배아 세포, 예를 들어, 1-세포, 2-세포, 4-세포, 8-세포 등 단계 제브라피쉬 배아 등).
세포는 확립된 세포주로부터 유래될 수 있거나 또는 그들은 1차 세포일 수 있고, 여기서 "1차 세포", "1차 세포주" 및 "1차 배양물"은 대상으로부터 유래되고 배양물의 제한된 수의 계대, 즉, 분할 동안 시험관내에서 성장이 허용되는 세포 및 세포 배양물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 예를 들어, 1차 배양물은 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회 또는 15회(그러나, 위기의 단계를 통과하기에 충분한 시간은 아님) 계대될 수 있는 배양물이다. 전형적으로, 1차 세포주는 시험관내에서 10회보다 더 적은 계대 동안 유지된다. 표적 세포는 단세포 유기체일 수 있고/있거나 배양물에서 성장될 수 있다. 세포가 1차 세포라면, 그들은 임의의 편리한 방법에 의해 개체로부터 채취될 수 있다. 예를 들어, 백혈구는 분리반출법, 백혈구분리반출법, 밀도 구배 분리 등에 의해 편리하게 채취될 수 있는 한편, 조직, 예컨대 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 폐, 장, 위 등으로부터의 세포는 생검에 의해 편리하게 채취될 수 있다.
일부 상기 적용에서, 대상 방법은 (예를 들어, 표적화된 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 생성을 파괴하기 위해, 표적 DNA를 절단하거나 또는 달리 변형시키기 위해, 표적 세포 등을 유전적으로 변형시키기 위해) 생체내 및/또는 생체외 및/또는 시험관내 유사분열 또는 유사분열후 세포에서 표적 핵산 절단, 표적 핵산 변형을 유도하기 위해, 그리고/또는 표적 핵산에 결합하기 위해(예를 들어, 수집 및/또는 분석 등을 위한 시각화를 위해) 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 표적 핵산에 혼성화함으로써 특이성을 제공하기 때문에, 개시된 방법에서 관심 대상의 유사분열 및/또는 유사분열후 세포는 임의의 유기체로부터의 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일 세포 진핵 유기체의 세포, 식물 세포, 조류 세포, 예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니, 칼라마이도모나스 레인하르티, 난노클로롭시스 가디타나, 클로렐라 피레노이도사, 모자반속 등, 진균 세포(예를 들어, 효모 세포), 동물 세포, 무척추동물(예를 들어, 과실파리, 강장동물, 극피동물, 선충 등)으로부터의 세포, 척추동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류)로부터의 세포, 포유류로부터의 세포, 설치류로부터의 세포, 인간으로부터의 세포 등)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 CasX 단백질(및/또는 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 DNA 및/또는 RNA), 및/또는 CasX 가이드 RNA(및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA), 및/또는 공여자 주형, 및/또는 RNP는 개체에게 도입될 수 있다(즉, 표적 세포는 생체내일 수 있다)(예를 들어, 포유류, 래트, 마우스, 돼지, 영장류, 비-인간 영장류, 인간 등). 일부 경우에, 이러한 투여는, 예를 들어, 표적화된 세포의 게놈을 편집함으로써 질환을 치료하고/하거나 예방하는 목적을 위한 것일 수 있다.
식물 세포는 외떡잎식물의 세포, 및 쌍떡잎식물의 세포를 포함한다. 세포는 뿌리 세포, 잎 세포, 물관부의 세포, 체관부의 세포, 형성층의 세포, 정단분열조직 세포, 격벽 유세포, 후각조직, 후막조직 세포 등일 수 있다. 식물 세포는 농작물, 예컨대 밀, 옥수수, 벼, 수수, 조, 대두 등의 세포를 포함한다. 식물 세포는 농업 과일 및 견과 식물, 예를 들어, 살구, 오렌지, 레놈, 사과, 자두, 배, 아몬드 등을 생산하는 식물을 포함한다.
표적 세포의 추가적인 예는 상기 표제 "변형 세포" 부문에서 열거된다. 세포(표적 세포)의 비제한적 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 마이스, 밀, 종자, 토마토, 벼, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 목화, 대마초, 담배, 하훼, 구과 식물, 겉씨식물, 속씨식물, 양치식물, 석송, 뿔이끼류, 우산이끼류, 선태식물, 쌍떡잎식물, 외떡잎식물 등), 조류 세포, (예를 들어, 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 칼라마이도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 모자반속(Sargassum patens, C. agardh) 등), 해초(예를 들어, 켈프) 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포, 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추동물(예를 들어, 과실파리, 강장동물, 극피동물, 선충 등)으로부터의 세포, 척추동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류)로부터의 세포, 포유류 (예를 들어, 유제류(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양)로부터의 세포; 설치류(예를 들어, 래트, 마우스); 비-인간 영장류; 인간; 고양이과(예를 들어, 고양이); 갯과(예를 들어, 개); 등) 등을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 천연 유기체로부터 유래되지 않은 세포이다(예를 들어, 세포는 합성으로 만들어진 세포일 수 있고; 또한 인공 세포로서 지칭된다).
세포는 시험관내 세포일 수 있다(예를 들어, 확립된 배양 세포주). 세포는 생체외 세포일 수 있다(개체로부터의 배양 세포). 세포는 생체내 세포(예를 들어, 개체 내 세포)일 수 있다. 세포는 단리된 세포일 수 있다. 세포는 유기체 내부의 세포일 수 있다. 세포는 유기체일 수 있다. 세포는 세포 배양물 내 세포일 수 있다(예를 들어, 시험관내 세포 배양물). 세포는 세포 수집물 중 하나일 수 있다. 세포는 원핵 세포이거나 또는 원핵 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 박테리아 세포일 수 있거나 또는 박테리아 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 고세균 세포일 수 있거나 또는 고세균 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 진핵 세포일 수 있거나 또는 진핵 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 식물 세포일 수 있거나 또는 식물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 동물 세포일 수 있거나 또는 동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 무척추동물 세포일 수 있거나 또는 무척추동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 척추동물 세포일 수 있거나 또는 척추동물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있거나 또는 포유류 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 설치류 세포일 수 있거나 또는 설치류 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있거나 또는 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 미생물 세포일 수 있거나 또는 미생물 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 진균 세포일 수 있거나 또는 진균 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 곤충 세포일 수 있다. 세포는 절지동물 세포일 수 있다. 세포는 원생동물 세포일 수 있다. 세포는 유충 세포일 수 있다.
적합한 세포는 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포; 생식세포(예를 들어, 난모세포, 정자, 난원세포, 정원세포 등); 체세포, 예를 들어, 섬유아세포, 희소돌기신경교, 교세포, 조혈모세포, 뉴런, 근육 세포, 골세포, 간세포, 췌장 세포 등을 포함한다.
적합한 세포는 인간 배아 줄기 세포, 태아 심장 근육 세포, 근육섬유아세포, 간충직 줄기 세포, 자가이식 확장된 심장 근육 세포, 지방세포, 전분화 세포, 만능 세포, 혈액 줄기 세포, 근아세포, 성체 줄기 세포, 골수 세포, 간충직 세포, 배아 줄기 세포, 실질 세포, 상피세포, 내피세포, 중피세포, 섬유아세포, 조골세포, 연골세포, 외인성 세포, 내인성 세포, 줄기 세포, 조혈모세포, 골수 유래 전구체 세포, 심근세포, 골격 세포, 태아 세포, 미분화 세포, 다능 전구체 세포, 단분화능 전구체 세포, 단핵구, 심장 근아세포, 골격 근아세포, 대식세포, 모세혈관 내피세포, 이종 세포, 동종 세포 및 출산후 줄기 세포를 포함한다.
일부 경우에, 세포는 면역세포, 뉴런, 상피세포 및 내피세포 또는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 자연살해 세포, 수지상 세포 또는 대식세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 헬퍼 T 세포이다. 일부 경우에, 면역세포는 조절 T 세포(Treg)이다.
일부 경우에, 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포를 포함한다. 성체 줄기 세포는 또한 체세포 줄기 세포로서 지칭된다.
성체 줄기 세포는 분화된 조직 내에 존재하지만, 자기 재생 특성 및 다중 세포 유형, 보통 줄기 세포가 발견된 전형적인 조직의 세포 유형이 생기게 하는 능력을 보유한다. 체세포 줄기 세포의 수많은 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 근육 줄기 세포; 조혈모세포; 상피 줄기 세포; 신경 줄기 세포; 간충직 줄기 세포; 유방 줄기 세포; 장 줄기 세포; 중배엽 줄기 세포; 내피 줄기 세포; 후각 줄기 세포; 신경 능선 줄기 세포 등을 포함한다.
관심 대상의 줄기 세포는 포유류 줄기 세포를 포함하며, 용어 "포유류"는 인간; 비-인간 영장류; 가축 및 농장 동물; 및 동물원, 실험실, 운동 또는 반려 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 마우스, 래트, 토끼 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 경우에, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 설치류(예를 들어, 마우스; 래트) 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 비-인간 영장류 줄기 세포이다.
줄기 세포는 하나 이상의 줄기 세포 마커, 예를 들어, SOX9, KRT19, KRT7, LGR5, CA9, FXYD2, CDH6, CLDN18, TSPAN8, BPIFB1, OLFM4, CDH17 및 PPARGC1A를 발현시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기 세포는 조혈모세포(HSC)이다. HSC는 골수, 혈액, 제대혈, 태아간 및 난황낭으로부터 단리될 수 있는 중배엽-유래 세포이다. HSC는 CD34+ 및 CD3-로서 특성규명된다. HSC는 생체내 적혈구, 호중성-대식세포, 거핵구 및 림프계 조혈세포 계통을 재생시킬 수 있다. 시험관내에서, HSC는 적어도 일부의 자기-재생 세포 분열을 겪도록 유도될 수 있고, 생체내에서 알 수 있는 바와 같이 동일한 계통으로 분화되도록 유도될 수 있다. 이렇게 해서, HSC는 적혈구 세포, 거핵구, 호중구, 대식세포 및 림프구 세포 중 하나 이상으로 분화되도록 유도될 수 있다.
다른 실시형태에서, 줄기 세포는 신경 줄기 세포(NSC)이다. 신경 줄기 세포(NSC)는 뉴런, 및 교세포(희소돌기신경교 및 성상교세포를 포함)로 분화할 수 있다. 신경 줄기 세포는 다회 분열할 수 있는 다능성 줄기 세포이고, 특정 조건 하에서 신경아세포 또는 아교모세포, 예를 들어, 각각 뉴런 및 교세포 중 하나 이상의 유형이 되도록 기여하는 세포일 수 있는 신경 줄기 세포 또는 신경 전구체 세포인 딸 세포를 생성할 수 있다. NSC를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
다른 실시형태에서, 줄기 세포는 간충직 줄기 세포(MSC)이다. MSC는 본래 배아 중배엽으로부터 유래되고, 성체 골수로부터 단리되며, 근육, 뼈, 연골, 지방, 골수 기질 및 힘줄을 형성하도록 분화될 수 있다. MSC를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; MSC를 얻기 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 MSC의 단리를 기재하는 미국 특허 제5,736,396호 참조.
세포는 일부 경우에 식물 세포이다. 식물 세포는 외떡잎식물의 세포일 수 있다. 세포는 쌍떡잎식물의 세포일 수 있다.
일부 경우에, 세포는 식물 세포이다. 예를 들어, 세포는 주요 농작물, 예를 들어, 보리, 콩류(건조 식용), 카놀라, 옥수수, 목화(피마), 목화(업랜드), 아마씨, 건초(알팔파), 건초(비-알팔파), 귀리, 땅콩, 벼, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기(오일), 해바라기(비-오일), 고구마, 담배(벌리), 담배(연관처리(Flue-cured)), 토마토, 밀(듀럼), 밀(봄), 밀(겨울) 등의 세포일 수 있다. 다른 예로서, 세포는, 예를 들어, 알팔파, 알로에 잎, 애로루트, 벗풀, 아티초크, 아스파라거스, 죽순, 바나나꽃, 콩나물, 콩류, 비이트톱, 근대, 비타멜론, 청경채, 브로콜리, 브로콜리 라베(엽경채), 방울다다기 양배추, 양배추, 방울 양배추, 가재발 선인장(노팔), 호리병박 열매, 카르둔, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 차요테, 중국 아티초크(두루미냉이), 중국 양배추, 중국 셀러리, 중국 차이브, 채심, 국화잎(퉁호), 콜라드 그린, 옥수수대, 단옥수수, 오이, 대컨, 단데리온 그린, 타로토란, 다우 무에(피 팁), 동과(겨울멜론), 가지, 엔다이브, 에스카롤, 선수 장식 양치식물, 갓류 식물, 치커리, 갓 (중국 겨자), 가일론, 갈랑가(시암, 태국 생강), 마늘, 생강 뿌리, 우엉, 나물, 하노버 샐러드 나물, 후아우존틀, 예루살렘 아티초크, 히카마, 케일 나물, 콜라비, 명아주(?리떼), 상추(비브), 상추(보스턴), 상추(보스턴 레드), 상추(녹색잎), 상추(아이스버그), 상추(롤라로사), 상추(오크리프 - 녹색), 상추(오크리프 - 적색), 상추(가공처리), 상추(적색잎), 상추(로메인), 상추(루비 로메인), 상추(러시안 레드 겨자), 린쿡, 로 복, 긴콩류, 연근, 마하, 용설란(아가베) 잎, 말랑가, 메스꿀랭 믹스, 겨자과, 모압(수세미오이), 무, 모쿠아(동과), 버섯, 겨자, 참마, 오크라, 옹초이, 그린 어니언, 오포(롱 스쿼시), 장식용 옥수수, 관상용 호박, 파슬리, 파스닙, 완두콩, 후추(벨형), 후추, 호박, 라디키오, 무순, 무, 레이프 그린, 레이프 그린, 대황, 로메인(베이비 레드), 루타베가, 함초(씨빈), 신쿠아(앵글드/줄기가 선 수세미), 시금치, 스쿼시, 짚 더미, 사탕수수, 고구마, 근대, 타마린드, 타로, 타로잎, 타로 슈트, 탓소이, 테페구아헤(구아헤), 빔바, 토마틸로, 토마토, 토마토(체리), 토마토(포도형), 토마토(자두형), 강황, 순무 어린잎 나물, 순무, 마름, 얌피, 얌스(네임스), 유초이, 유카(카사바) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 채소 작물의 세포이다.
세포는 일부 경우에 절지동물 세포이다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, 협각류, 다지류, 헥시포디아), 거미강, 곤충강, 돌좀목, 좀류, 구시아강, 하루살이목, 잠자리목, 잠자리하목, 실잠자리아목, 신시류, 외시류, 강도래목, 흰개미붙이목, 메뚜기, 민벌레목, 집게벌레목, 바퀴목, 귀뚜라미붙이목, 갈르와벌레과, 만토파스마토데과, 대벌레목, 바퀴목, 흰개미목, 사마귀목, 책좀, 다듬이벌레목, 총채벌레목, 이목, 반시목, 내시류 또는 완전변태류, 막시류, 초시류, 부채벌레목, 약대벌레목, 뱀잠자리목, 풀잠자리목, 밑드리목, 버룩목, 파리목, 날도래류 또는 인시목의 아목, 과, 아과, 군, 하위군, 또는 종의 세포일 수 있다.
세포는 일부 경우에 곤충 세포이다. 예를 들어, 일부 경우에, 세포는 모기, 메뚜기, 노린재류, 파리, 벼룩, 벌, 말벌, 개미, 이, 나방 또는 딱정벌레의 세포이다.
표적 세포 내로의 성분의 도입
Cas9 가이드 RNA(또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산), 및/또는 Cas9 융합 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산) 및/또는 공여자 폴리뉴클레오타이드는 임의의 다양한 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
핵산을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 임의의 편리한 방법을 사용하여 핵산(예를 들어, 발현 작제물)을 표적 세포(예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 줄기 세포, 전구체 세포 등) 내로 도입할 수 있다. 적합한 방법은 본 명세서의 다른 곳에 더 상세하게 기재되어 있으며, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 프로토플라스트 융합, 리포펙션, 전기천공법, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 입자총 기법, 인산칼슘 침전, 직접 미량주사법, 나노입자-매개 핵산 전달(예를 들어, 문헌[Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023] 참조)등을 포함한다. 임의의 또는 모든 성분이 공지된 방법, 예를 들어, 뉴클레오펙션을 이용하여 조성물(예를 들어, CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 공여자 폴리뉴클레오타이드 등의 임의의 편리한 조합을 포함)로서 세포 내로 도입될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오타이드 (공여자 주형)
CasX 이중 또는 단일 가이드 RNA에 의해 가이드된, CasX 단백질은 일부 경우에 비-상동성 말단 접합(NHEJ) 또는 상동성-관련 재조합(HDR) 중 하나에 의해 수선된 이중-가닥 DNA(dsDNA) 표적 핵산 내에서 부위-특이적 이중 가닥 파손(double strand break: DSB) 또는 단일 가닥 파손(SSB)(예를 들어, CasX 단백질이 틈내기효소 변이체일 때)을 생성한다.
일부 경우에, 표적 DNA를 (CasX 단백질 및 CasX 가이드 RNA와) 접촉시키는 것은 비상동성 말단 결합 또는 상동 직접 수선을 허용하는 조건 하에서 일어난다. 따라서, 일부 경우에, 대상 방법은 표적 DNA를 공여자 폴리뉴클레오타이드와 (예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입함으로써) 접촉시키는 단계를 포함하되, 공여자 폴리뉴클레오타이드, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 일부, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 복제물, 또는 공여자 폴리뉴클레오타이드 복제물의 일부가 표적 DNA 내로 통합된다. 일부 경우에, 상기 방법은 세포를 공여자 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하지 않으며, 표적 DNA 내의 뉴클레오타이드가 결실되도록 표적 DNA는 변형된다.
일부 경우에, CasX 가이드 RNA(또는 이를 암호화하는 DNA) 및 CasX 단백질(또는 이를 암호화하는 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA, 예를 들어, 하나 이상의 발현 벡터)는 적어도 표적 DNA 서열에 상동성인 세그먼트를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 공동투여되며(예를 들어, 표적 핵산과 접촉되고, 세포에 투여됨 등), 대상 방법은 핵산 물질을 표적 DNA 서열에 첨가하기 위해, 즉, 삽입 또는 대체하기 위해(예를 들어, 핵산, 예를 들어, 단백질을 암호화하는 것, siRNA, miRNA 등을 "넉인"하기 위해), 태그(예를 들어, 6xHis, 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질; 황색형광 단백질 등), 혈구응집소(HA), FLAG 등)를 첨가하기 위해, 조절 서열을 유전자(예를 들어, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 유입 서열(IRES), 2A 펩타이드, 개시 코돈, 정지 코돈, 스플라이스 신호, 국소화 신호 등)를 첨가하기 위해, 핵산 서열(예를 들어, 돌연변이를 도입하기 위해, 정확한 서열을 도입함으로써 돌연변이를 야기하는 질환을 제거하기 위해) 등을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 해서, CasX 가이드 RNA 및 CasX 단백질을 포함하는 복합체는 부위-특이적, 즉, "표적화된" 방법으로 DNA를 변형시키는 것이 바람직한 임의의 시험관내 또는 생체내 적용, 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 바와 같은, 예를 들어, 유전자 넉인, 유전자 편집, 유전자 태깅 등에서, 예를 들어, 질환을 치료하거나 또는 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료제로서, 농업에서 유전자 변형된 유기체의 생산, 치료적, 진단적 또는 연구적 목적을 위한 세포에 의한 단백질의 생성, iPS 세포의 유도, 생물학적 연구, 검출 또는 대체 등을 위한 병원균 유전자의 표적화에서 유용하다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 표적 서열이 절단되는 게놈 내로 삽입하는 것이 바람직한 적용에서, 공여자 폴리뉴클레오타이드(공여자 서열을 포함하는 핵산)는 또한 세포에 제공될 수 있다. "공여자 서열" 또는 "공여자 폴리뉴클레오타이드" 또는 "공여자 주형"은 (예를 들어, dsDNA 절단 후에, 표적 DNA의 틈내기 후에, 표적 DNA의 이중 틈내기 후에 등) CasX 단백질에 의해 절단된 부위에 삽입될 핵산 서열을 의미한다. 공여자 폴리뉴클레오타이드는 그것과 상동성을 보유하는 게놈 서열 사이의 상동 직접 수선을 뒷받침하기 위해, 예를 들어, 표적 부위의 약 50개 이하의 염기 이내, 예를 들어, 약 30개의 염기 이내, 약 15개의 염기 이내, 약 10개의 염기 이내, 약 5개의 염기 이내, 또는 표적 부위에 바로 측접하여 표적 부위에서 게놈 서열에 대한 충분한 상동성, 예를 들어, 표적 부위에 측접하는 뉴클레오타이드 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 상동성을 함유할 수 있다. 공여자와 게놈 서열 사이의 서열 상동성의 대략 25, 50, 100 또는 200개 이상의 뉴클레오타이드, 또는 200개 초과의 뉴클레오타이드(또는 10 내지 200개 이상의 뉴클레오타이드의 임의의 정수값)는 상동 직접 수선을 뒷받침할 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오타이드는 임의의 길이, 예를 들어, 10개 이상의 뉴클레오타이드, 50개 이상의 뉴클레오타이드, 100개 이상의 뉴클레오타이드,250개 이상의 뉴클레오타이드, 500개 이상의 뉴클레오타이드, 1000개 이상의 뉴클레오타이드, 5000개 이상의 뉴클레오타이드 등을 가질 수 있다.
공여자 서열은 전형적으로 그것이 대체하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 오히려, 상동 직접 수선을 뒷받침하기 위해(예를 들어, 유전자 보정을 위해, 예를 들어, 질환 원인 염기쌍을 비질환 원인 염기쌍으로 전환시키기 위해) 충분한 상동성이 존재한다면 공여자 서열은 게놈 서열에 대해 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 DNA 영역과 두 측접 서열 사이의 상동 직접 수선이 표적 영역에서 비상동성 서열의 삽입을 초래하도록 공여자 서열은 상동체의 두 영역에 의해 측접되는 비상동성 서열을 포함한다. 공여자 서열은 또한 관심 대상의 DNA 영역에 상동성이 아니고 관심 대상의 DNA 영역 내로의 삽입에 대해 의도되지 않는 서열을 함유하는 벡터 골격을 포함할 수 있다. 일반적으로, 공여자 서열의 상동성 영역(들)은 재조합이 요망되는 게놈 서열에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 서열 동일성이 존재한다. 공여자 폴리뉴클레오타이드의 길이에 따라서 1% 내지 100%의 서열 동일성의 임의의 값이 존재할 수 있다.
공여자 서열은 게놈 서열, 예를 들어, 제한 부위, 뉴클레오타이드 다형성, 선택 가능한 마커(예를 들어, 약물 내성 유전자, 형광 단백질, 효소 등) 등에 비교하여 특정 서열 차이를 포함할 수 있는데, 이는 절단 부위에서 공여자 서열의 성공적인 삽입에 대한 평가를 위해 사용될 수 있거나 또는 일부 경우에 다른 목적을 위해(예를 들어, 표적화된 게놈 좌위에서 발현을 나타내기 위해) 사용될 수 있다. 일부 경우에, 암호 영역에 위치된다면, 이러한 뉴클레오타이드 서열 차이는 아미노산 서열을 변화시키지 않을 것이고, 또는 침묵 아미노산 변화(즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화)를 만들 것이다. 대안적으로, 이들 서열 차이는 측접하는 재조합 서열, 예컨대 FLP, loxP 서열 등을 포함할 수 있는데, 이는 마커 서열의 제거를 위해 이후의 시간에 활성화될 수 있다.
일부 경우에, 공여자 서열은 단일-가닥 DNA로서 세포에 제공된다. 일부 경우에, 공여자 서열은 이중-가닥 DNA로서 세포에 제공된다. 이는 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입된다면, 공여자 서열의 말단은 임의의 편리한 방법에 의해 (예를 들어, 핵산외부분해로부터) 보호될 수 있고, 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오타이드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보성 올리고뉴클레오타이드가 단부 중 하나 또는 둘 다에 결찰될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889] 참조. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 변형된 뉴클레오타이드간 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선형 공여자 서열 말단 보호에 대한 대안으로서, 서열의 추가적인 길이가 재조합에 영향을 미치는 일 없이 분해될 수 있는 영역 외부에 포함될 수 있다. 공여자 서열은 추가적인 서열, 예를 들어, 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터의 부분으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 게다가, 공여자 서열은 네이키드 핵산으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 CasX 가이드 RNA 및/또는 CasX 융합 폴리펩타이드 및/또는 공여자 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산에 대해 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV)에 의해 전달될 수 있다.
유전자이식, 비인간 유기체
상기 기재한 바와 같이, 일부 경우에, 본 개시내용(예를 들어, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 등)의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 생성하는 유전자이식 비-인간 유기체를 생성하기 위해 이식유전자로서 사용된다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자이식 비인간 유기체를 제공한다.
유전자이식, 비-인간 동물
본 개시내용은 유전자이식 비-인간 동물을 제공하는데, 이 동물은 CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 이식유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자이식 비-인간 동물의 게놈은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 유전자이식 비-인간 동물은 유전자 변형에 대해 동형접합적이다. 일부 경우에, 유전자이식 비-인간 동물은 유전자 변형에 대해 이형접합적이다. 일부 실시형태에서, 유전자이식 비-인간 동물은 척추동물, 예를 들어, 어류(예를 들어, 연어, 송어, 제브라피쉬, 금붕어, 복어, 동굴어 등), 양서류(개구리, 영원, 도롱뇽 등), 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 등), 파충류(예를 들어, 뱀, 도마뱀 등), 비-인간 포유류(예를 들어, 유제류, 예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양 등; 토끼목(예를 들어, 토끼); 설치류(예를 들어, 래트, 마우스); 비-인간 영장류 등) 등이다. 일부 경우에, 유전자이식 비-인간 동물은 무척추동물이다. 일부 경우에, 유전자이식 비-인간 동물은 곤충(예를 들어, 모기; 해충 등)이다. 일부 경우에, 유전자이식 비-인간 동물은 거미류이다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 미공지 프로모터(예를 들어, 핵산이 숙주 세포 게놈 내로 무작위로 통합될 때) 제어 하에 있을 수 있거나(즉, 이에 작동 가능하게 연결됨) 또는 알려진 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다(즉, 이에 작동 가능하게 연결됨). 적합한 알려진 프로모터는 임의의 알려진 프로모터일 수 있고, 구성적으로 활성인 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터), 유도성 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절 프로모터 등), 공간적으로 제한된 그리고/또는 일시적으로 제한된 프로모터(예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등) 등을 포함한다.
유전자이식 식물
상기 기재한 바와 같이, 일부 경우에, 본 개시내용(예를 들어, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 본 개시내용의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 등)의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 생성하는 유전자이식 식물을 생성하기 위해 이식유전자로서 사용된다. 본 개시내용은 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자이식 식물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 유전자이식 식물의 게놈은 대상 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자이식 식물은 유전자 변형에 대해 동형접합적이다. 일부 실시형태에서, 유전자이식 식물은 유전자 변형에 대해 이형접합적이다.
식물 세포 내로 외인성 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 식물 세포는 상기 정의한 바와 같이 "형질전환되는" 것으로 고려된다. 적합한 방법은 바이러스 감염(예컨대 이중 가닥 DNA 바이러스), 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공법, 입자총법, 인산칼슘 침전, 직접 미량주사법, 탄화규소 위스커 기법, 아그로박테륨-매개 형질전환 등을 포함한다. 방법의 선택은 일반적으로 형질감염 중인 세포의 유형 및 형질감염이 일어나는 환경(즉, 시험관내, 생체외 또는 생체내)에 의존한다.
토양 박테리아 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 기반한 형질전환 방법은 외인성 핵산 분자를 관다발 식물 내로 도입하는 데 특히 유용하다. 아그로박테륨의 야생형 형태는 숙주 식물 상에서 종양형성성 뿌리혹병 성장의 생산을 지시하는 Ti(종양-유도성) 플라스미드를 함유한다. 식물 게놈에 대한 Ti 플라스미드의 종양 유도성 T-DNA 영역의 전달은 Ti 플라스미드-암호화된 독력 유전자뿐만 아니라 T-DNA 경계를 필요로 하는데, 이는 전달될 영역을 설명하는 직접 DNA 반복부의 세트이다. 아그로벡테리움계 벡터는 Ti 플라스미드의 변형된 형태인데, 이때 종양 유도성 작용은 식물 숙주 내로 도입될 관심 대상의 핵산 서열에 의해 대체된다.
아그로박테륨-매개 형질전환은 일반적으로 합체 벡터 또는 바이너리 벡터 시스템을 사용하는데, 이때 Ti 플라스미드의 성분은 아그로박테륨 숙주에서 영구적으로 체류하고 독력 유전자를 운반하는 헬퍼 벡터와 T-DNA 서열에 의해 결합되는 관심 대상의 유전자를 함유하는 셔틀 벡터 사이에서 분할된다. 다양한 바이너리 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 클론테크(Clontech)(캘리포니아주 팔로알토에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 배양된 식물 세포 또는 상처 조직, 예컨대 잎 조직, 뿌리 외식편, 배축, 줄기 조각 또는 덩이줄기와 함께 아그로박테륨을 배양시키는 방법은, 예를 들어, 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993)] 참조.
미세투사물-매개 형질전환이 또한 대상 유전자이식 식물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 문헌[Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987))]에 의해 처음 기재된 이 방법은 염화칼슘, 스퍼미딘 또는 폴리에틸렌 글리콜에 의한 침전에 의해 목적으로 하는 핵산 분자로 코팅된 금 또는 텅스텐과 같은 미세투사물에 의존한다. 미세투사물 입자는 BIOLISTIC PD-1000(바이오래드(Biorad); 캘리포니아주 허큘레스에 소재)와 같은 장치를 이용하여 속씨식물 내로 고속으로 가속화된다.
핵산이, 예를 들어 생체내 또는 생체외 프로토콜을 통해 식물 세포(들) 내로 들어갈 수 있는 방식으로 본 개시내용의 핵산(예를 들어, 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터))은 식물 내로 도입될 수 있다. "생체내"는 핵산이 식물의 살아있는 몸체에 투여되는 것, 예를 들어, 침윤을 의미한다. "생체외"는 세포 또는 외식편이 식물 외부에서 변형되고, 이어서, 이러한 세포 또는 기관이 식물에 대해 재생된다는 것을 의미한다. 문헌[Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, 및 Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers]에 기재된 것을 포함하는 식물 세포의 안정한 형질전환 또는 유전자이식 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터가 기재되었다. 구체적 예는 아그로박테륨 투메파시엔스의 Ti 플라스미드로부터 유래된 것뿐만 아니라 문헌[Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642]에 의해 개시된 것을 포함한다. 대안적으로, 비-Ti 벡터는 유리 DNA 전달 기법을 이용함으로써 식물 및 세포에 대한 DNA의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이들 방법을 이용함으로써, 유전자이식 식물, 예컨대, 밀, 벼(Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 및 4462) 및 옥수수(Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618)가 생산될 수 있다. 미성숙 배아는 또한 입자총(문헌[Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48]을 이용함으로써 직접 DNA 전달 기법을 위한 그리고 아그로박테륨-매개 DNA 전달(Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750)을 위한 외떡잎식물에 대한 양호한 표적 조직일 수 있다. 엽록체 내로 DNA의 도입을 위한 예시적인 방법은 유전자충격, 프로토플라스트의 폴리에틸렌 글리콜 형질전환, 및 미량주사법이다(문헌[Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909]; 미국 특허 제5,451,513호, 제5,545,817호, 제5,545,818호 및 제5,576,198호; 국제 특허 출원 WO 95/16783; 및 문헌[Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), 및 McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)]). 유전자충격, 프로토플라스트의 폴리에틸렌 글리콜 형질전환 및 미량주사법의 방법에 적합한 임의의 벡터는 엽록체 형질전환을 위한 표적화 벡터로서 적합할 것이다. 임의의 이중 가닥 DNA 벡터는 형질전환 벡터, 특히 도입 방법이 아그로박테륨을 이용하지 않을 때 사용될 수 있다.
유전자 변형될 수 있는 식물은 곡물, 사료용 작물, 과일, 채소, 오일시드 작물, 야자나무, 삼림 및 덩굴식물을 포함한다. 변형될 수 있는 식물의 구체적 예는 다음에 따를 수 있다: 마이스, 바나나, 땅콩, 경협종완두, 해바라기, 토마토, 카놀라, 담배, 밀, 보리, 귀리, 감자, 대두, 목화, 카네이션, 수수, 루핀 및 벼.
본 개시내용은 형질전환된 식물 세포, 조직, 식물 및 형질전환 식물 세포를 함유하는 생성물을 제공한다. 대상 형질전환 세포, 및 조직 및 이를 포함하는 생성물의 특징은 게놈 내로 통합되는 대상 핵산의 존재, 및 본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드의 식물 세포에 의한 생성이다. 본 발명의 재조합 식물 세포는 재조합 세포의 집단으로서, 또는 조직, 종자, 전체 식물, 줄기, 열매, 잎, 뿌리, 꽃, 줄기, 덩이줄기, 곡물, 동물 사료, 식물의 밭 등으로서 유용하다.
본 개시내용의 CasX 폴리펩타이드, 또는 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 미공지 프로모터(예를 들어, 핵산이 숙주 세포 게놈 내로 무작위로 통합될 때) 제어 하에 있을 수 있거나(즉, 이에 작동 가능하게 연결됨) 또는 알려진 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다(즉, 이에 작동 가능하게 연결됨). 적합한 알려진 프로모터는 임의의 알려진 프로모터일 수 있고 구성적으로 활성인 프로모터, 유도성 프로모터, 공간적으로 제한된 그리고/또는 일시적으로 제한된 프로모터 등을 포함한다.
고세균 Cas9 폴리펩타이드 및 가이드 RNA
본 발명자들은 처음에 고세균 세포 내 II형 CRISPR/Cas 좌위를 발견하였다. 고세균 세포는 I형 및/또는 III형 CRISPR/cas 시스템만을 포함하지만, II형 시스템은 포함하지 않으며, Cas9는 II형 CRISPR 시스템의 서명 단백질인 것이 이전에 생각되었다. 다시 말해서, 본 개시내용 전에 당업계에서 고세균에 속하는 유기체가 Cas9 단백질을 포함하지 않는 것으로 교시되었다. 고세균 Cas9 단백질(또는 이를 암호화하는 핵산)(예를 들어, ARMAN-1 Cas9 단백질, ARMAN-4 Cas9 단백질, 이들의 변이체 등), 및/또는 고세균 Cas9 가이드 RNA(이중 또는 단일 가이드 RNA 형식)(또는 이를 암호화하는 DNA, 예를 들어, 하나 이상의 발현 벡터), 및/또는 공여자 주형을 포함하는 방법 및 조성물이 제공된다.
용어 ARMAN은 "고세균 리치몬드 광산 호산성 나노유기체(archaeal Richmond Mine acidophilic nanoorganism)"를 지칭하며, 예를 들어, 문헌[Baker et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 11; 107(19): 8806-8811; Baker et. al., Science. 2006 Dec 22;314(5807):1933-5]을 참조한다. ARMAN-1은 또한 "칸디다투스 마이크라카에움(Candidatus Micrarchaeum) 호산성 ARMAN-1"로서 지칭될 수 있는 한편; ARMAN-4는 또한 "칸디다투스 파르바카에움(Candidatus　Parvarchaeum) 호산성 ARMAN-4"로서 지칭될 수 있다. ARMAN-2 및 ARMAN-5가 또한 동정되었고, "칸디다투스 마이크라카에움 호산성 ARMAN-2"로서 지칭될 수 있는 한편, ARMAN-5는 "칸디다투스 파바카에움(Candidatus　Parvarchaeum) 호산성 ARMAN-5"로서 지칭될 수 있다 따라서, 용어 "칸디다투스 마이크라카에움 호산성"은 적어도 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 ARMAN-1 및 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 ARMAN-2를 포함하는 일반적 용어인 반면, 용어 "칸디다투스 마이크라카에움 호산성"은 적어도 칸디다투스 파바카에움 호산성 ARMAN-4 및 칸디다투스 파바카에움 호산성 ARMAN-5를 포함하는 일반적 용어이다. 따라서 고세균 Cas9 단백질(또는 이를 암호화하는 핵산)(예를 들어, 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 Cas9 단백질, 칸디다투스 파바카에움 호산성 Cas9 단백질, ARMAN-1 Cas9 단백질, ARMAN-4 Cas9 단백질, 이들의 변이체 등), 및/또는 고세균 Cas9 가이드 RNA(이중 또는 단일 가이드 RNA 형식)(또는 이를 암호화하는 DNA, 예를 들어, 하나 이상의 발현 벡터), 및/또는 공여자 주형을 포함하는 방법 및 조성물이 제공된다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서(예를 들어, 모든 기재된 조성물 및 방법, 예를 들어, 핵산, 결합 방법, 이미징 방법, 변형 방법, 게놈 편집 등을 포함), CasX 단백질 대신에, 고세균 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-1 Cas9 단백질, ARMAN-4 Cas9 단백질 등)이 사용될 수 있다. 다시 말해서, 고세균 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-1 Cas9 단백질, ARMAN-4 Cas9 단백질 등)은 CasX 단백질을 대체할 수 있다. 이러한 경우에, 적절하다면, 대응하는 가이드 RNA는 (고세균 Cas9 가이드 RNA, 예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 형식으로) CasX 가이드 RNA 대신 사용되어야 한다. 고세균 Cas9 단백질 및 고세균 Cas9 가이드 RNA의 예는 도 13(ARMAN-1 및 ARMAN-4 Cas9 단백질), 도 14(ARMAN-1 Cas9 가이드 RNAs), 및 도 15(ARMAN-4 Cas9 가이드 RNA)에 도시되어 있다. 가이드 RNA의 나머지에 대해(예를 들어, 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트에 대해) 고세균 Cas9 가이드 RNA의 가이드 서열의 배향은 CasX 가이드 RNA의 반대인 한편(예를 들어, 가이드 서열이 CasX 가이드 RNA에 대해 3' 단부에 있는 도 6 및 도 7의 Ns를 가이드 서열이 고세균 Cas9 가이드 RNA의 5' 단부에 있는 도 14 및 도 15의 Ns와 비교); 표적 dsDNA 상에서 PAM의 위치는 또한 CasX 단백질에 비교되는 고세균 Cas9 단백질에 대해 반대라는 것을 주목한다(더 상세하게는 이하를 참조).
고세균 Cas9 단백질
비-고세균 Cas9 단백질(즉, 박테리아로부터의 Cas9 단백질이지만, 고세균으로부터는 아님)은 당업계에 공지되어 있으며, 대상 고세균 Cas9 단백질은 유사한 도메인 구조를 가진다. 그러나, 고세균 Cas9 단백질의 전반적인 서열은 고도로 분기성이며, 전반적 서열 상동성을 매우 조금 공유한다.
천연 유래 고세균 Cas9 단백질은 표적화된 이중 가닥 DNA(dsDNA) 내 특정 서열에서 이중 가닥 파손을 촉매하는 엔도뉴클레아제로서 작용한다. 서열 특이성은 표적 DNA 내에서 표적 서열에 혼성화하는 회합된 가이드 RNA에 의해 제공된다. 천연 유래 가이드 RNA는 crRNA에 혼성화된 tracrRNA를 포함하며, 여기서 crRNA는 표적 DNA에서 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열 포함하는 단백질 결합 세그먼트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상 방법 및/또는 조성물의 고세균 Cas9 단백질은 천연 유래(야생형) 단백질이다(또는 이로부터 유래된다). 천연 유래 고세균 Cas9 단백질의 예는 도 13에 도시하고 서열번호 71 및 72에 제시한다. 새로 발견된 고세균 Cas9 단백질(예를 들어, 도 13 참조)은 이전에 동정된 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제에 비해 짧고(예를 들어, 그들은 가장 짧은 것으로 알려진 Cas9 단백질임), 따라서 대안으로서 고세균 Cas9 단백질의 사용은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드가 상대적으로 짧다는 이점을 제공한다는 것을 주목하는 것은 중요하다. 이는, 예를 들어, 연구 및/또는 임상 적용을 위한 세포, 예컨대 진핵 세포(예를 들어, 시험관내, 생체외, 생체내 포유류 세포, 인간 세포, 마우스 세포)에 대한 전달을 위해 CasX 단백질을 암호화하는 핵산이 바람직한 경우에, 예를 들어, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 사용하는 경우에 유용하다.
비-고세균 Cas9 단백질이지만, 계통수 상에서 고세균 Cas9와 군집을 이루고, 따라서 고세균 Cas9에 대한 서열에서 관련된 2개의 추가적인 Cas9 단백질(도 16 참조)이 본 발명자들에 의해 동정되었다(예를 들어, 도 16의 델타프로테오박테리아 Cas9는 도 12, 패널 d의 계통수에 RBG_프로테오박테리아|RBG_16_델타프로테오박테리아_42_7_큐레이트|991aa로서 나타내는 한편; 도 16의 린도우박테리아 Cas9는 도 12, 패널 d의 계통수에 RIF2_CPR|RIFCSPLOWO2_12_FULL_린도우박테리아_62_27_큐레이트|RIF2|1044aa로서 나타낸다). ARMAN-1 Cas9 및 ARMAN-4 Cas9에 대해 도 16의 서열의 정렬을 도 17에 제공한다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71(ARMAN-1)로서 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71(ARMAN-1)로서 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71(ARMAN-1)로서 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71(ARMAN-1)로서 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 Cas9 단백질이다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 ARMAN-1 Cas9 단백질이다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 72(ARMAN-4)로서 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 72(ARMAN-4)로서 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 72(ARMAN-4)로서 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 72(ARMAN-4)로서 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 칸디다투스 파바카에움 호산성 Cas9 단백질이다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 ARMAN-4 Cas9 단백질이다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71 및 72(각각 ARMAN-1 및 ARMAN-4) 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71 및 72(각각 ARMAN-1 및 ARMAN-4) 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71 및 72(각각 ARMAN-1 및 ARMAN-4) 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71 및 72(각각 ARMAN-1 및 ARMAN-4) 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 서열번호 71 및 72 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)은 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-1 Cas9 단백질) 또는 칸디다투스 파바카에움 호산성 Cas9 단백질(예를 들어, ARMAN-4 Cas9 단백질)이다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135로서 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135로서 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135로서 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135로서 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 136으로서 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 136으로서 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 136으로서 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 136으로서 제시된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 136에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135 및 136 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 71, 72, 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 50% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 71, 72, 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 71, 72, 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 71, 72, 135 및 136 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 대상 Cas9 단백질은 서열번호 71, 72, 135 및 136 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
변이체 ( 틈내기효소 , dCas9 및 키메라 Cas9 단백질을 포함)
사용될 수 있는 변이체에 대한 명명법 및 용도에 대해 CasX 단백질의 변이체에 대한 부문을 참조한다(예를 들어, CasX 단백질에 대해 고세균 Cas9 단백질로 교체하고, CasX 단백질 등에 대해 2가지의 새로 동정된 비-고세균 Cas9 단백질 중 하나로 교체함). 대상 Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)에 대해, 예를 들어, 상기 동일성% 매개변수를 포함하는, 임의의 상기 매개변수는 ARMAN-1 Cas9 단백질, ARMAN-4 Cas9 단백질, 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 Cas9 단백질, 칸디다투스 파바카에움 호산성 Cas9 단백질 등으로 교체될 수 있다.
Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)의 촉매 잔기는 비-고세균 Cas9 단백질과의 극도로 낮은 전반적 서열 동일성에도 불구하고 용이하게 동정 가능하다. 예를 들어, 서열번호 71(ARMAN-1)로서 제시된 고세균 Cas9의 D30(RuvC 도메인) 및 H506 (HNH 도메인)은 각각 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9의 D10 및 H840에 대응하는 한편; 서열번호 72(ARMAN-4)에 제시된 고세균 Cas9의 D58(RuvC 도메인) 및 H514(HNH 도메인)는 각각 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 D10 및 H840에 대응한다. 이들 잔기는 도 13에서 볼드체이며 밑줄 표시되어 있다.
Cas9 틈내기효소(예를 들어, 고세균 Cas9 틈내기효소)는 RuvC 도메인(예를 들어, ARMAN-1 Cas9의 D30; ARMAN-4 Cas9 단백질의 D58을 돌연변이시킴으로써) 또는 HNH 도메인(예를 들어, ARMAN-1 Cas9의 H506; ARMAN-4 Cas9 단백질의 H514를 돌연변이시킴으로써) 중 하나의 촉매 활성을 제거함으로써(예를 들어, 촉매적 잔기를 돌연변이시킴으로써) 생성될 수 있다(예를 들어, 각각의 도메인은 표적 이중 가닥 DNA의 하나의 가닥을 절단한다). Cas9 단백질(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질)(예를 들어, dCas9, 고세균 dCas9)의 사멸 형태는 RuvC 도메인과 HNH 도메인 둘 다의 촉매 활성을 제거함으로써(예를 들어, 촉매 잔기를 돌연변이시킴으로써) 생성될 수 있다.
고세균 Cas9(또는 새로 동정된 비-고세균 Cas9의 하나)가 CasX에 대해 교체될 수 있다는 것을 제외하고, 모든 동일한 융합 단백질이 사용될 수 있다. 비제한적 예는 NLS(들)를 갖는 고세균 Cas9 또는 dCas9 또는 틈내기효소 Cas9, (예를 들어, 표적 DNA를 변형시키기 위해, 표적 DNA와 회합된 히스톤과 같은 단백질을 변형시키기 위해, 표적 DNA로부터 전사를 조절하기 위해 등) 촉매적 활성 및/또는 전사 억제 또는 활성화 활성을 갖는 융합 상대 고세균 Cas9 또는 dCas9 또는 틈내기효소 Cas9, 검출 가능한 표지 등을 갖는 고세균 Cas9 또는 dCas9 또는 틈내기효소 Cas9를 포함한다. 고세균 Cas9에 대해 사용될 수 있는 융합 상태의 목록은 CasX 단백질에 대해 사용될 수 있는 목록과 동일하다(본 명세서에서 더 상세하게 논의됨).
고세균 Cas9 단백질에 대한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)
고세균 Cas9 단백질에 대한 PAM은 표적 DNA의 비상보성 가닥의 표적 서열의 3' 바로 옆이다(상보성 가닥은 가이드 RNA의 가이드 서열에 혼성화되는 한편, 비-상보성 가닥은 가이드 RNA에 직접 혼성화하지 않으며, 비-상보성 가닥의 역상보체이다). 따라서, 고세균 Cas9 단백질에 대한 PAM은 CasX 단백질에 대한 PAM에 비교하여 표적 서열의 반대측 상에 있다(예를 들어, CasX 단백질에 대한 PAM의 5' 배향을 나타내는 도 6, 패널 c, 및 도 7 참조). 일부 실시형태에서(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 고세균 Cas9 단백질이 사용될 때), 비-상보성 가닥의 PAM 서열은 5'-NGG-3'이며, 여기서 N은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이다.
일부 경우에, 상이한 고세균 Cas9 단백질(즉, 다양한 고세균 종으로부터의 고세균 Cas9 단백질, 고세균 Cas9 단백질의 변이체, 여기서 PAM 선호도는 변화됨)은 상이한 고세균 Cas9 단백질의 다양한 효소 특징을 활용하기 위해(예를 들어, 상이한 PAM 서열 선호도에 대해; 증가된 또는 감소된 효소 활성에 대해; 세포 독성의 증가된 또는 감소된 수준에 대해; NHEJ, 상동성-직접 수선, 단일 가닥 파손, 이중 가닥 파손 등 사이의 균형 변화를 위해; 짧은 총 서열의 이점을 취하기 위해; 등) 다양한 제공된 방법으로 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상이한 종으로부터의 고세균 Cas9 단백질(또는 이의 변이체)은 표적 DNA에서 상이한 PAM 서열을 선호할 수 있다. 따라서, 선택의 특정 고세균 Cas9 단백질에 대해, PAM 서열 선호도는 상기 기재한 5'-NGG-3' 서열과 상이할 수 있다. 적절한 PAM 서열의 동정을 위한 다양한 방법(인실리코 및/또는 습식 실험실 방법을 포함)은 당업계에 공지되어 있고, 일상적이며, 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 NGG PAM 서열은 인실리코 서열 분석 기법을 이용하여 동정되었다(예를 들어, 이하의 작업 실시예의 도 12, 패널 b 참조).
고세균 Cas9 가이드 RNA
비-고세균 Cas9 가이드 RNA(즉, 박테리아로부터 유래된 Cas9 가이드 RNA, 그러나 고세균으로부터 유래된 것은 아님)는 당업계에 공지되어 있고, 대상 고세균 Cas9 가이드 RNA는 비-고세균 Cas9 가이드 RNA와 유사한 구조를 가진다. 고세균 Cas9 가이드 RNA에 대해, 가이드 서열은 표적자 RNA의 듀플렉스-형성 세그먼트의 5'에 위치되는 반면, CasX 가이드 RNA 내 듀플렉스-형성 세그먼트의 3'에 위치된다는 것을 주목한다(예를 들어, 예시적 고세균 Cas9 가이드 RNA를 도시하는 도 14 및 도 15를 예시적 CasX 가이드 RNA를 도시하는 도 6, 패널 c 및 도 7과 비교함).
일부 경우에, 고세균 Cas9 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)의 활성체(예를 들어, tracr 서열)는 (i) 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스에 기여하는 듀플렉스 형성 세그먼트; 및 (ii) 듀플렉스 형성 세그먼트의 뉴클레오타이드 신장부(예를 들어, 본 명세서에서 3' 꼬리로서 지칭됨) 3'를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 형성 세그먼트의 추가적인 뉴클레오타이드 3'은 하나 이상의 줄기 루프(예를 들어, 2 이상, 3 이상, 1, 2 또는 3)를 형성한다. 일부 경우에, 고세균 Cas9 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)의 활성체(예를 들어, tracr 서열)는 (i) 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스에 기여하는 듀플렉스 형성 세그먼트; 및 (ii) 듀플렉스 형성 세그먼트의 5개 이상의 뉴클레오타이드(예를 들어, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의, 40개 이상의, 45개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 75개 이상의 뉴클레오타이드) 3'을 포함한다. 일부 경우에, 고세균 Cas9 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)의 활성체(활성체 RNA)는 (i) 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스에 기여하는 듀플렉스 형성 세그먼트; 및 (ii) 듀플렉스 형성 세그먼트의 5개 이상의 뉴클레오타이드(예를 들어, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상의, 40개 이상의, 45개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상 또는 75개 이상의 뉴클레오타이드) 3'을 포함한다.
일부 경우에, 고세균 Cas9 가이드 RNA(dgRNA 또는 sgRNA)의 활성체(예를 들어, tracr 서열)는 (i) 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스에 기여하는 듀플렉스 형성 세그먼트; 및 (ii) 듀플렉스 형성 세그먼트의 뉴클레오타이드 신장부(예를 들어, 본 명세서에서 3' 꼬리로서 지칭됨) 3'를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 형성 세그먼트의 뉴클레오타이드 3'의 신장부는 5 내지 200개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 5 내지 150개의 nt, 5 내지 130개의 nt, 5 내지 120개의 nt, 5 내지 100개의 nt, 5 내지 80개의 nt, 10 내지 200개의 nt, 10 내지 150개의 nt, 10 내지 130개의 nt, 10 내지 120개의 nt, 10 내지 100개의 nt, 10 내지 80개의 nt, 12 내지 200개의 nt, 12 내지 150개의 nt, 12 내지 130개의 nt, 12 내지 120개의 nt, 12 내지 100개의 nt, 12 내지 80개의 nt, 15 내지 200개의 nt, 15 내지 150개의 nt, 15 내지 130개의 nt, 15 내지 120개의 nt, 15 내지 100개의 nt, 15 내지 80개의 nt, 20 내지 200개의 nt, 20 내지 150개의 nt, 20 내지 130개의 nt, 20 내지 120개의 nt, 20 내지 100개의 nt, 20 내지 80개의 nt, 30 내지 200개의 nt, 30 내지 150개의 nt, 30 내지 130개의 nt, 30 내지 120개의 nt, 30 내지 100 nt, 또는 30 내지 80 nt) 범위의 길이를 가진다. 일부 경우에, 활성체 RNA의 3' 꼬리의 뉴클레오타이드는 야생형 서열이다.
다수의 상이한 대안의 서열이 사용될 수 있다면, 예시적 고세균 Cas9 가이드 RNA 서열은 서열번호 75 내지 76(예시적 crRNA 서열 - 가이드 서열), 77 내지 78(예시적 tracrRNA 서열) 및 81 내지 82(예시적 단일 가이드 RNA 서열 - 가이드 서열)에 제시된 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 듀플렉스 영역(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식에서)은 8 내지 25개의 염기쌍(bp)의 범위(예를 들어, 8-22, 8-18, 8-15, 8-12, 12-25, 12-22, 12-18, 12-15, 13-25, 13-22, 13-18, 13-15, 14-25, 14-22, 14-18, 14-15, 15-25, 15-22, 15-18, 17-25, 17-22 또는 17-18 bp, 예를 들어, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp 등)를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 영역(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로)은 8개 이상의 bp(예를 들어, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상 또는 17개 이상의 bp)를 포함한다. 일부 경우에, 듀플렉스 영역의 모든 뉴클레오타이드가 짝지어지지는 않으며, 따라서 듀플렉스 형성 영역은 벌지(bulge)를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 6, 패널 c 및 도 7 참조). 본 명세서의 용어 "벌지"는 이중 가닥 듀플렉스에 기여하지 않지만, 기여하는 뉴클레오타이드에 의해 5' 및 3'을 둘러싸는 뉴클레오타이드의 신장(하나의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 의미하기 위해 사용되며, 이러한 벌지는 듀플렉스 영역의 부분으로 고려된다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 1개 이상의 벌지(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상의 벌지)를 포함한다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 2개 이상의 벌지(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상의 벌지)를 포함한다. 일부 경우에, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 이중가닥(즉, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스)는 1 내지 5개의 벌지(예를 들어, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4, 또는 2-3개의 벌지)를 포함한다.
따라서, 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 85% 내지 100% 상보성(예를 들어, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 가진다. 일부 경우에, 활성체 및 표적자의 듀플렉스-형성 세그먼트는 서로 70% 내지 95% 상보성(예를 들어, 75%-95%, 80%-95%, 85%-95%, 90%-95% 상보성)을 가진다.
다시 말해서, 일부 실시형태에서, 활성체와 표적자 사이에 형성된 dsRNA 듀플렉스(즉, 활성체/표적자 dsRNA 이중가닥)는dsRNA 듀플렉스는 서로 70%-100% 상보성(예를 들어, 75%-100%, 80%-10%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다. 일부 경우에, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스는 서로 85%-100% 상보성(예를 들어, 90%-100%, 95%-100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다. 일부 경우에, 활성체/표적자 dsRNA 듀플렉스는 서로 70%-95% 상보성(예를 들어, 75%-95%, 80%-95%, 85%-95%, 90%-95% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드의 2개 신장을 포함한다.
대상 고세균 Cas9 가이드 RNA의 듀플렉스 영역은 (이중 가이드 또는 단일 가이드 RNA 형식에서) 천연 유래 듀플렉스 영역에 비해 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 등)의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 염기쌍은 유지될 수 있는 한편 각각의 세그먼트(표적자 및 활성체)로부터의 염기쌍에 기여하는 뉴클레오타이드는 상이할 수 있다. 일부 경우에, 대상 고세균 Cas9 가이드 RNA의 이중가닥 영역은 (천연 유래 고세균 Cas9 가이드 RNA의) 천연 유래 이중가닥 영역에 비교할 때 더 짝지어진 염기, 덜 짝지어진 염기, 더 작은 벌지, 더 큰 벌지, 소수의 벌지, 더 많은 벌지, 또는 이들의 임의의 편리한 조합을 포함한다.
고세균 Cas9 가이드 RNA에 대한 예시적 서열
일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 CCUUACAAUCGACACUUAAAUAAUUUGCAUGUGUAAG(서열번호 75)(예를 들어, 도 6, 패널 c의 sgRNA 참조)를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 CUUACAAUCGACACUUAAAUAAUUUGCAUGUGUAAG(서열번호 75)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 CCUUACAAUCGACACUUAAAUAAUUUGCAUGUGUAAG(서열번호 75)를 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 crRNA 서열 CUUUCAAUAAACAAAUAAAUCUUAGUAAUAUGUAAC(서열번호 76)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA crRNA 서열 CUUUCAAUAAACAAAUAAAUCUUAGUAAUAUGUAAC(서열번호 76)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) crRNA 서열 CUUUCAAUAAACAAAUAAAUCUUAGUAAUAUGUAAC(서열번호 76)를 포함한다.
일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 75 내지 76 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 75 내지 76 중 임의의 하나에 제시된 crRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 GGCAUGGACCAUAUCCAGGUGUUGAUUGUAAACACCUAGCGGGGAAAUUAUAUAUGUUUGUAAUAUCUUCACUAUCCAAAGUUAUCUCUGGUUUUGGUUUGGUAAGCUUCACUUCACUAUUGUUUUCACUCCCAAUUUGAGUAUGGUUGGGGGUAAGGAUGCUUUCGGGGAGUGCUUUUA(서열번호 77)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 GGCAUGGACCAUAUCCAGGUGUUGAUUGUAAACACCUAGCGGGGAAAUUAUAUAUGUUUGUAAUAUCUUCACUAUCCAAAGUUAUCUCUGGUUUUGGUUUGGUAAGCUUCACUUCACUAUUGUUUUCACUCCCAAUUUGAGUAUGGUUGGGGGUAAGGAUGCUUUCGGGGAGUGCUUUUA(서열번호 77)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 AACUGGCUAUUGCUAAUAUUAUUUGUUUAUUGAAAGAAGCCUAGACGUUAGGGUUCGCGUGCAUGUAGGCUCCAGCAGGUACCUC(서열번호 78)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) tracrRNA 서열 AACUGGCUAUUGCUAAUAUUAUUUGUUUAUUGAAAGAAGCCUAGACGUUAGGGUUCGCGUGCAUGUAGGCUCCAGCAGGUACCUC(서열번호 78)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 활성체-RNA는 (예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 77 내지 78 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA를 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA(예를 들어, 이중 또는 단일 가이드 RNA 형식으로) 서열번호 77 및 78 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA는 서열 CUUACAAUCGACACUUaaacAGGUGUUGAUUGUAAACACCUAGCGGGGAAAUUAUAUAUGUUUGUAAUAUCUUCACUAUCCAAAGUUAUCUCUGGUUUUGGUUUGGUAAGCUUCACUUCACUAUUGUUUUCACUCCCAAUUUGAGUAUGGUUGGGGGUAAGGAUGCUUUCGGGGAGUGCUUUUA(서열번호 81)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 tracrRNA 서열 CUUACAAUCGACACUUaaacAGGUGUUGAUUGUAAACACCUAGCGGGGAAAUUAUAUAUGUUUGUAAUAUCUUCACUAUCCAAAGUUAUCUCUGGUUUUGGUUUGGUAAGCUUCACUUCACUAUUGUUUUCACUCCCAAUUUGAGUAUGGUUGGGGGUAAGGAUGCUUUCGGGGAGUGCUUUUA(서열번호 81)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA는 서열 CUUUCAAUAAACAAAUAAaaacUUAUUUGUUUAUUGAAAGAAGCCUAGACGUUAGGGUUCGCGUGCAUGUAGGCUCCAGCAGGUACCUC(서열번호 82)을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 tracrRNA 서열 CUUUCAAUAAACAAAUAAaaacUUAUUUGUUUAUUGAAAGAAGCCUAGACGUUAGGGUUCGCGUGCAUGUAGGCUCCAGCAGGUACCUC(서열번호 82)과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA는 서열번호 81 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 표적자-RNA는 서열번호 81 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 tracrRNA 서열과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
고세균 Cas9 가이드 RNA의 가이드 서열
일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17개 이상의(예를 들어, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 60% 이상(예를 들어, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17개 이상의(예를 들어, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17개 이상의(예를 들어, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상) 인접한 뉴클레오타이드에 대해 90% 이상(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17개 이상의(예를 들어, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상)의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 100%이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 60% 이상(예를 들어, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 80% 이상(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 90% 이상(예를 들어, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%)이다. 일부 경우에, 표적 핵산의 가이드 서열과 표적 부위 사이의 상보성 백분율은 17 내지 25개의 인접한 뉴클레오타이드에 대해 100% 이상이다.
일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 17 내지 30개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 17-25, 17-22, 17-20, 19-30, 19-25, 19-22, 19-20, 20-30, 20-25 또는 20-22 nt) 범위이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 17 내지 25개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들어, 17-22, 17-20, 19-25, 19-22, 19-20, 20-25, 20-25 또는 20-22 nt) 범위이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 17개 이상의 nt(예를 들어, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상 또는 22개 이상의 nt; 17 nt, 18nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt 등)를 가진다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 17 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 18 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 19 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 20 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 21 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 22 nt이다. 일부 경우에, 가이드 서열은 길이가 23 nt이다.
다양한 Cas 단백질 및 Cas9 가이드 RNA의 예는 (비록 비-고세균 Cas9 단백질 및 가이드 RNA일지라도) 당업계에서 발견할 수 있으며, 일부 경우에, 예를 들어, Cas9의 높은 충실도 형태를 포함하여, 비고세균 Cas9 단백질 및 가이드 RNA 내로 도입된 것과 유사한 변형이 또한 고세균 Cas9 단백질 및 본 개시내용의 가이드 RNA 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 고충실도 Cas9를 생성하기 위해 이전에 공지된 Cas9 단백질 내로 도입될 수 있는 돌연변이는 또한 동일 또는 유사한 목적을 위해 고세균 Cas9 단백질 내로 도입될 수 있다(예를 들어, 대상 고세균 Cas9 단백질에서의 돌연변이를 위한 적절한 아미노산(예를 들어, 고세균 Cas9 단백질이 아닌 스트렙코코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 N497, R661, Q695 및 Q926)을 결정하기 위해 서열 및/또는 구조적 정렬이 수행될 수 있다)(예를 들어, 문헌[Kleinstiver et al. (2016) Nature529:490] 참조). 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May;10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43; Qi et al, Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 2013 Oct 31; Chen et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. 2013 Nov;195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013;3:2510; Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187; Hu et al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188; Larson et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis.　2013　Dec;51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda).　2013 Dec 9;3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 2013 Oct 9; Yang et al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9; Briner et al., Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-9]; 및 미국 특허 및 특허 출원: 8,906,616; 8,895,308; 8,889,418; 8,889,356; 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 8,697,359; 20140068797; 20140170753; 20140179006; 20140179770; 20140186843; 20140186919; 20140186958; 20140189896; 20140227787; 20140234972; 20140242664; 20140242699; 20140242700; 20140242702; 20140248702; 20140256046; 20140273037; 20140273226; 20140273230; 20140273231; 20140273232; 20140273233; 20140273234; 20140273235; 20140287938; 20140295556; 20140295557; 20140298547; 20140304853; 20140309487; 20140310828; 20140310830; 20140315985; 20140335063; 20140335620; 20140342456; 20140342457; 20140342458; 20140349400; 20140349405; 20140356867; 20140356956; 20140356958; 20140356959; 20140357523; 20140357530; 20140364333; 및 20140377868을 참조하며; 이들 모두는 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
개시내용의 비제한적 양상의 예
상기 기재한 본 대상의 실시형태를 포함하는 양상은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양상 또는 실시형태와 조합하여 유리하게 될 수 있다. 앞서 언급한 설명을 제한하는 일 없이, 1 내지 131로 넘버링된 개시내용의 특정 비제한적 양상(세트 A - CasX에 관련됨) 및 1 내지 133으로 넘버링된 양상(세트 B - 고세균 Cas9에 관련됨)을 이하에 제공한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 각각의 개별적으로 넘버링된 양상은 임의의 앞서 선행하는 또는 뒤에 오는 개개로 넘버링된 양상과 함께 사용되거나 또는 조합될 수 있다. 이는 모든 이러한 조합에 대한 근거를 제공하는 것으로 의도되며, 이하에 명확하게 제공되는 양상의 조합으로 제한되지 않는다:
세트 A
CasX와 관련
1. 조성물로서,
a) CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자; 및
b) CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 분자
를 포함하는, 조성물.
2. 1에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
3. 1 또는 2에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 조성물.
4. 1 또는 2에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중-가이드 RNA인, 조성물.
5. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 지질을 포함하는, 조성물.
6. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, a) 및 b)는 리포좀 내에 있는, 조성물.
7. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, a) 및 b)는 입자 내에 있는, 조성물.
8. 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 완충제, 뉴클레아제 저해제, 및 프로테아제 저해제 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
9. 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
10. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, 조성물.
11. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, 조성물.
12. 10 또는 11에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
13. 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, DNA 공여자 주형을 더 포함하는, 조성물.
14. CasX 단일 가이드 RNA 분자로서,
a) 표적 핵산에 혼성화하는 가이드 서열, 및 듀플렉스-형성 세그먼트를 포함하는 표적자 서열; 및
b) 표적자 서열의 듀플렉스-형성 세그먼트와 혼성화하여 CasX 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 활성체 서열
을 포함하는, CasX 단일 가이드 RNA 분자.
15. 14에 있어서, 상기 가이드 서열은 길이가 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, CasX 단일 가이드 RNA 분자.
16. 14 또는 15의 CasX 단일 가이드 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
17. 16에 있어서, 상기 CasX 단일 가이드 RNA를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, DNA 분자.
18. 17에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
19. 18에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, DNA 분자.
20. 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, DNA 분자.
21. 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, DNA 분자.
22. 21에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, DNA 분자.
23. 17에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
24. 이종성 폴리펩타이드에 융합된 CasX 폴리펩타이드를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
25. 24에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
26. 24에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
27. 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, CasX 융합 폴리펩타이드.
28. 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, CasX 융합 폴리펩타이드.
29. 27 또는 28에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
30. 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 상기 CasX 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된, CasX 융합 폴리펩타이드.
31. 24 내지 30 중 어느 하나에 있어서, NLS를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
32. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 세포 또는 표적 세포 유형 상의 세포 표면 모이어티에 대한 결합을 제공하는 표적화 폴리펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
33. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
34. 33에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
35. 34에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
36. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
37. 36에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
38. 36 또는 37에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
39. 38에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
40. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엔도솜 탈출 폴리펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
41. 40에 있어서, 상기 엔도솜 탈출 폴리펩타이드는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드: GLFXALLXLLXSLWXLLLXA(서열번호 94), 및 GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(서열번호 95), 여기서, 각각의 X는 라이신, 히스티딘 및 알기닌으로부터 독립적으로 선택된다.
42. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엽록체 수송 펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
43. 42에 있어서, 상기 엽록체 수송 펩타이드는,
Figure pct00006
으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
44. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, CasX 융합 폴리펩타이드.
45. 44에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
46. 44에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
47. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
48. 제24항 내지 제47항 중 어느 하나의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
49. 48에 있어서, 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
50. 49에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
51. 50에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 핵산.
52. 49 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 핵산 분자.
53. 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, 핵산 분자.
54. 53에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, 핵산 분자.
55. 49에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
56. 48에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA인, 핵산 분자.
57. 하나 이상의 핵산 분자로서,
(a) 활성체 RNA 및 표적자 RNA를 포함하는 CasX 가이드 RNA; 및
(b) CasX 폴리펩타이드
를 암호화하는, 하나 이상의 핵산 분자.
58. 57에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
59. 57에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
60. 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
61. 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중-가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
62. 61에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 상기 활성체를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 표적자를 암호화화는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 상이한 DNA 분자 상에 존재하는, 하나 이상의 핵산 분자.
63. 57 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
64. 63에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
65. 64에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
66. 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 하나 이상의 핵산 분자.
67. 57 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 재조합 발현 벡터인, 하나 이상의 핵산 분자.
68. 67에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 아데노연관 바이러스 벡터, 하나 이상의 재조합 레트로바이러스 벡터, 또는 하나 이상의 재조합 렌티바이러스 벡터로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자.
69. 63에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
70. 진핵 세포로서,
a) CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자,
b) CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및
c) CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자
중 하나 이상을 포함하는, 진핵 세포.
71. 70에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 진핵 세포.
72. 70 또는 71에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 거미류 세포, 진균 세포, 조류 세포, 파충류 세포, 양서류 세포, 무척추동물 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 또는 인간 세포인, 진핵 세포.
73. CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포.
74. 73에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 세포.
75. 73 또는 74에 있어서, 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 세포.
76. 표적 핵산의 변형 방법으로서, 상기 표적 핵산을,
a) CasX 폴리펩타이드; 및
b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 CasX 가이드 RNA
와 접촉시키는 단계를 포함하되,
상기 접촉시키는 단계는 상기 CasX 폴리펩타이드에 의해 상기 표적 핵산의 변형을 초래하는, 표적 핵산의 변형 방법.
77. 76에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단인, 방법.
78. 76 또는 77에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 방법.
79. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
80. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
81. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
82. 80 또는 81에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
83. 82에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 방법.
84. 80 또는 81에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 방법.
85. 76 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 게놈 편집을 초래하는, 방법.
86. 76 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
87. 86에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 DNA 공여자 주형을 상기 세포 내로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
88. 76 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 방법.
89. 76 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 방법.
90. 표적 DNA로부터 전사를 조절하거나, 표적 핵산을 변형시키거나, 또는 표적 핵산과 회합된 단백질을 변형시키는 방법으로서, 상기 표적 핵산을,
a) 이종성 폴리펩타이드에 융합된 CasX 폴리펩타이드를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드; 및
b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 CasX 가이드 RNA
와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
91. 90에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 방법.
92. 90에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 방법.
93. 90 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단이 아닌, 방법.
94. 90 또는 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 방법.
95. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
96. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
97. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
98. 96 또는 97에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
99. 98에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 방법.
100. 96 또는 97에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 방법.
101. 90 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
102. 90 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, 조성물.
103. 90 또는 102에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 방법.
104. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
105. 104에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
106. 105에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
107. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
108. 107에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, 방법.
109. 107 또는 108에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
110. 109에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
111. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, 방법.
112. 111에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, 방법.
113. 111에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, 방법.
114. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, 방법.
115. 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체로서, 게놈이,
a) CasX 폴리펩타이드,
b) CasX 융합 폴리펩타이드, 및
c) CasX 가이드 RNA
중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
116. 제115항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
117. 제115항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
118. 115 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 유기체는 식물, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 무척추동물, 곤충, 절지동물, 거미류, 기생충, 벌레, 강장동물, 척추동물, 어류, 파충류, 양서류, 유제류, 조류, 돼지, 말, 양, 설치류, 마우스, 래트 또는 비 인간 영장류인, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
119. 시스템으로서,
a) CasX 폴리펩타이드 및 CasX 단일 가이드 RNA;
b) CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
c) CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA;
d) CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
e) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 및 CasX 단일 가이드 RNA;
f) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
g) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 및 CasX 가이드 RNA;
h) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
i) i) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
j) i) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
k) i) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터; 및
l) i) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터
를 포함하는, 시스템.
120. 119에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 시스템.
121. 119에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 시스템.
122. 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 8개의 뉴클레오타이드 내지 1000개의 뉴클레오타이드인, CasX 시스템.
123. 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 25개의 뉴클레오타이드 내지 500개의 뉴클레오타이드인, CasX 시스템.
124. 119 내지 123 중 어느 하나의 CasX 시스템을 포함하는 키트.
125. 124에 있어서, 상기 키트의 부품은 동일한 용기에 있는, 키트.
126. 124에 있어서, 상기 키트의 부품은 별개의 용기에 있는, 키트.
127. 119 내지 126 중 어느 하나의 CasX 시스템을 포함하는 멸균 용기.
128. 127에 있어서, 상기 용기는 주사기인, 멸균 용기.
129. 119 내지 126 중 어느 하나의 CasX 시스템을 포함하는 이식 가능한 장치.
130. 129에 있어서, 상기 CasX 시스템은 기질 내인, 이식 가능한 장치.
131. 129에 있어서, 상기 CasX 시스템은 저장소 내인, 이식 가능한 장치.
세트 B
고세균 Cas9와 관련
1. 조성물로서,
a) 고세균 Cas9 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자; 및
b) 고세균 Cas9 가이드 RNA, 또는 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 분자
를 포함하는, 조성물.
2. 1에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
3. 1 또는 2에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 조성물.
4. 1 또는 2에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 조성물.
5. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 지질을 포함하는, 조성물.
6. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, a) 및 b)는 리포좀 내에 있는, 조성물.
7. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, a) 및 b)는 입자 내에 있는, 조성물.
8. 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 완충제, 뉴클레아제 저해제, 및 프로테아제 저해제 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
9. 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
10. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, 조성물.
11. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 고세균 Cas9 폴리펩타이드(사멸 고세균 Cas9)인, 조성물.
12. 10 또는 11에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
13. 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, DNA 공여자 주형을 더 포함하는, 조성물.
14. 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA 분자로서,
a) 표적 핵산에 혼성화하는 가이드 서열, 및 듀플렉스-형성 세그먼트를 포함하는 표적자 서열; 및
b) 표적자 서열의 듀플렉스-형성 세그먼트와 혼성화하여 고세균 Cas9 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 활성체 서열
을 포함하는, 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA 분자.
15. 14에 있어서, 상기 가이드 서열은 길이가 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA 분자.
16. 14 또는 15의 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
17. 16에 있어서, 상기 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, DNA 분자.
18. 17에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
19. 18에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, DNA 분자.
20. 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, DNA 분자.
21. 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, DNA 분자.
22. 21에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, DNA 분자.
23. 17에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
24. 이종성 폴리펩타이드에 융합된 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
25. 24에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
26. 24에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
27. 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
28. 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 고세균 Cas9 폴리펩타이드(사멸 고세균 Cas9)인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
29. 27 또는 28에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
30. 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
31. 24 내지 30 중 어느 하나에 있어서, NLS를 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
32. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 세포 또는 표적 세포 유형 상의 세포 표면 모이어티에 대한 결합을 제공하는 표적화 폴리펩타이드인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
33. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
34. 33에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
35. 34에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
36. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
37. 36에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
38. 36 또는 37에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
39. 38에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
40. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엔도솜 탈출 폴리펩타이드인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
41. 40에 있어서, 상기 엔도솜 탈출 폴리펩타이드는 GLFXALLXLLXSLWXLLLXA(서열번호 94), 및 GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(서열번호 95)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는 라이신, 히스티딘 및 알기닌으로부터 독립적으로 선택되는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
42. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엽록체 수송 펩타이드인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
43. 42에 있어서, 상기 엽록체 수송 펩타이드는,
Figure pct00007
으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
44. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
45. 44에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
46. 44에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
47. 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드.
48. 제24항 내지 제47항 중 어느 하나의 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
49. 48에 있어서, 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
50. 49에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
51. 50에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 핵산.
52. 49 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 핵산 분자.
53. 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, 핵산 분자.
54. 53에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, 핵산 분자.
55. 49에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
56. 48에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA인, 핵산 분자.
57. 하나 이상의 핵산 분자로서,
(a) 활성체 RNA 및 표적자 RNA를 포함하는 고세균 Cas9 가이드 RNA; 및
(b) 고세균 Cas9 폴리펩타이드
를 암호화하는, 하나 이상의 핵산 분자.
58. 57에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
59. 57에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
60. 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
61. 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 이중-가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
62. 61에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 상기 활성체를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 표적자를 암호화화는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 상이한 DNA 분자 상에 존재하는, 하나 이상의 핵산 분자.
63. 57 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
64. 63에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
65. 64에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
66. 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 하나 이상의 핵산 분자.
67. 57 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 재조합 발현 벡터인, 하나 이상의 핵산 분자.
68. 67에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 아데노연관 바이러스 벡터, 하나 이상의 재조합 레트로바이러스 벡터, 또는 하나 이상의 재조합 렌티바이러스 벡터로부터 선택되는, 하나 이상의 핵산 분자.
69. 63에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
70. 진핵 세포로서,
a) 고세균 Cas9 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자,
b) 고세균 융합 Cas9 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및
c) 고세균 Cas9 가이드 RNA 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자
중 하나 이상을 포함하는, 진핵 세포.
71. 70에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 진핵 세포.
72. 70 또는 71에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 거미류 세포, 진균 세포, 조류 세포, 파충류 세포, 양서류 세포, 무척추동물 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 또는 인간 세포인, 진핵 세포.
73. 고세균 융합 Cas9 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포.
74. 73에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 세포.
75. 73 또는 74에 있어서, 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 세포.
76. 표적 핵산의 변형 방법으로서, 상기 표적 핵산을,
a) 고세균 Cas9 폴리펩타이드; 및
b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 고세균 Cas9 가이드 RNA
와 접촉시키는 단계를 포함하되,
상기 접촉시키는 단계는 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드에 의해 상기 표적 핵산의 변형을 초래하는, 방법.
77. 76에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단인, 방법.
78. 76 또는 77에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 방법.
79. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
80. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
81. 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
82. 80 또는 81에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
83. 82에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 방법.
84. 80 또는 81에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 방법.
85. 76 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 게놈 편집을 초래하는, 방법.
86. 76 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA, 또는 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
87. 86에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 DNA 공여자 주형을 상기 세포 내로 도입하는 것을 더 포함하는, 방법.
88. 76 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 방법.
89. 76 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 방법.
90. 표적 DNA로부터 전사를 조절하거나, 표적 핵산을 변형시키거나, 또는 표적 핵산과 회합된 단백질을 변형시키는 방법으로서, 상기 표적 핵산을,
a) 이종성 폴리펩타이드에 융합된 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 포함하는, 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드; 및
b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 고세균 Cas9 가이드 RNA
와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
91. 90에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 방법.
92. 90에 있어서, 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 방법.
93. 90 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단이 아닌, 방법.
94. 90 또는 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 방법.
95. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
96. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
97. 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
98. 96 또는 97에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
99. 98에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 방법.
100. 96 또는 97에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 방법.
101. 90 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA, 또는 상기 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
102. 90 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 고세균 Cas9 폴리펩타이드(사멸 고세균 Cas9)인, 방법.
103. 90 또는 102에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 방법.
104. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
105. 104에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
106. 105에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
107. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
108. 107에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, 방법.
109. 107 또는 108에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
110. 109에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
111. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, 방법.
112. 111에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, 방법.
113. 111에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, 방법.
114. 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, 방법.
115. 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체로서, 게놈이,
a) 고세균 Cas9 폴리펩타이드,
b) 고세균 융합 Cas9 폴리펩타이드; 및
c) 고세균 Cas9 가이드 RNA
중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
116. 제115항에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
117. 제115항에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
118. 115 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 유기체는 식물, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 무척추동물, 곤충, 절지동물, 거미류, 기생충, 벌레, 강장동물, 척추동물, 어류, 파충류, 양서류, 유제류, 조류, 돼지, 말, 양, 설치류, 마우스, 래트 또는 비 인간 영장류인, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
119. 시스템으로서,
a) 고세균 Cas9 폴리펩타이드 및 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA;
b) 고세균 Cas9 폴리펩타이드, 고세균 Cas9 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
c) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드 및 고세균 Cas9 가이드 RNA;
d) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드, 고세균 Cas9 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
e) 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및 고세균 Cas9 단일 가이드 RNA;
f) 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; 고세균 Cas9 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
g) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 및 고세균 Cas9 가이드 RNA;
h) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA, 고세균 Cas9 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
i) i) 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
j) i) 고세균 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
k) i) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터; 및
l) i) 고세균 Cas9 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) 고세균 Cas9 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터
를 포함하는, 시스템.
120. 제119항에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 고세균 Cas9 시스템.
121. 제119항에 있어서, 상기 고세균 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 고세균 Cas9 시스템.
122. 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 8개의 뉴클레오타이드 내지 1000개의 뉴클레오타이드인, 고세균 Cas9 시스템.
123. 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 25개의 뉴클레오타이드 내지 500개의 뉴클레오타이드인, 고세균 Cas9 시스템.
124. 119 내지 123 중 어느 하나의 고세균 Cas9 시스템을 포함하는 키트.
125. 124에 있어서, 상기 키트의 부품은 동일한 용기에 있는, 키트.
126. 124에 있어서, 상기 키트의 부품은 별개의 용기에 있는, 키트.
127. 119 내지 126 중 어느 하나의 고세균 Cas9 시스템을 포함하는 멸균 용기.
128. 127에 있어서, 상기 용기는 주사기인, 멸균 용기.
129. 119 내지 126 중 어느 하나의 고세균 Cas9 시스템을 포함하는 이식 가능한 장치.
130. 129에 있어서, 상기 고세균 Cas9 시스템은 기질 내인, 이식 가능한 장치.
131. 129에 있어서, 상기 고세균 Cas9 시스템은 저장소 내인, 이식 가능한 장치.
132. 1 내지 131(세트 B) 중 어느 하나에 있어서, 고세균 Cas9 단백질이 ARMAN-1 Cas9 단백질 또는 ARMAN-4 Cas9 단백질인 것.
133. 1 내지 131(세트 B) 중 어느 하나에 있어서, 고세균 Cas9 단백질이 칸디다투스 마이크라카에움 호산성 Cas9 단백질 또는 칸디다투스 파바카에움 호산성 Cas9 단백질인 것.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제시하며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지도 또는 이하의 실험이 모든 또는 수행되는 실험만을 나타내는 것으로 의도하지도 않는다. 사용한 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 일부 실험적 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압에서 또는 대기압 근처이다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); 등.
실시예 1
본 명세서에 기재된 작업은 지하수, 퇴적물 및 산성 광산 배수로부터의 미생물 군집의 메타게놈 샘플 분석을 포함한다. 배양 유기체 중에서 나타나지 않은 뉴 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 동정하였다.
도 3. CasX 도메인 및 유사성 검색. (패널 a) HHpred를 이용하여 AcCpf1이 있는 원위 상동체 정렬로부터 추론되는 CasX에 대한 개략적 도메인 표현. 보존된 촉매적 잔기를 단백질 위의 적색 막대로 표시한다. CasX는 C-말단 영역에서 RuvC 분할 도메인(RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III), 및 거대 신규한 N-말단 도메인을 함유한다. 이하의 개략도는 다음의 검색에 기반하여 상부 히트를 나타낸다: (1) NCBI(모델 및 환경 단백질을 포함하는 NR 데이터베이스)에서 모든 단백질에 대한 BLAST 검색. (2) 문헌[Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36, 및 Shmakov et al. Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97)]에서 기재한 모든 Cas 단백질을 이용하여 구성한 모델에 기반한 프로파일 은닉 마르코브 모델(hidden markov model: HMM) 검색. (3) HHpred에 기반한 원위 상동체 검색. 히트는 그들의 유의도에 기반하여 색-암호화하고, 히트 범위 및 E-값을 제공한다. 특히, CasX는 국소 히트만을 가졌다. CasX의 620개의 N-말단 아미노산은 임의의 검색 개략도에서 히트가 없었다. 종합하면, 이들 발견은 CasX가 새로운 Cas 단백질이라는 것을 나타낸다. (패널 b) 두 상이한 CasX-함유 CRISPR 좌위 스캐폴드를 서열 데이터로부터 구성하였고, 상부는 델타프로테오박터(CasX1)로부터 유래되며, 하부는 부유균문(CasX2)이다. 대응하는 DNA 서열은 각각 서열번호 51 및 52에 제시한다.
실시예 2
도 4(패널 a 내지 c). 이콜라이에서 발현된 CasX에 의한 플라스미드 간섭. (패널 a) CasX 플라스미드 간섭의 실험 설계. 최소 간섭 CasX 좌위(제거된 획득 단백질)을 발현시키는 적격 이콜라이 세포를 제조하였다. 이들 세포를 CasX CRISPR 좌위에서 스페이서에 대한 매칭을 함유하는 플라스미드(표적) 또는 그렇지 않은 것(비-표적)으로 형질전환시키고 나서, CRISPR 및 표적 플라스미드에 대한 항생제 선택을 함유하는 배지 상에서 플레이팅하였다. 성공적인 플라스미드 간섭은 표적 플라스미드에 대해 감소된 수의 형질전환 콜로니를 초래한다. (패널 b) CasX1로부터의 스페이서(sX1), CasX2로부터의 스페이서(sX2)를 함유하는 형질전환된 플라스미드 또는 무작위 30nt 서열을 함유하는 비표적 플라스미드의 cfu/㎍. (패널 c) CRISPR과 표적 플라스미드 둘 다에 대해 항생제 선택을 함유하는 배지 상에서 패널 b로부터의 형질전환체의 연속 희석을 수행하였다.
도 5 (패널 a 내지 b) CasX에 의한 PAM 의존적 플라스미드 간섭. (패널 a) CasX를 이용하여 PAM 고갈 분석을 수행하였다. CasX CRISPR 좌위를 함유하는 이콜라이를 표적 서열의 7개 뉴클레오타이드 무작위화된 5' 또는 3'을 갖는 플라스미드 라이브러리로 형질전환시켰다. 표적 플라스미드를 선택하고 형질전환체를 모았다. 무작위화된 영역을 증폭시키고 나서, 심층 서열분석을 위해 제조하였다. 고갈된 서열을 동정하고 나서, PAM 로고를 생성하는 데 사용하였다. (패널 b) 델타프로테오박테리아 CasX에 대해 생성된 PAM 로고는 표적의 5'-TTCN-3' 측접 서열 5'을 함유하는 서열에 대한 강한 선호도를 나타내었다. 3' PAM은 검출되지 않았다. c, 부유균 CasX에 대해 생성된 PAM 로고는 첫 번째 T에서 더 낮은 엄격함을 갖는 표적의 5'-TTCN-3' 측접 서열 5'을 함유하는 서열에 대해 강한 선호도를 나타내었다. 3' PAM은 검출되지 않았다.
도 6(패널 a 내지 c). CasX는 이중 가이드된 CRISPR - Cas 효과기 복합체이다. (패널 a) tracrRNA 넉아웃 실험 및 sgRNA 시험에 대한 CRISPR 좌위. (패널 b) 표적 또는 비표적 서열을 함유하는 형질전환 플라스미드의 ㎍ 당 콜로니 형성 단위(cfu). tracrRNA의 결실은 플라스미드 간섭의 제거를 초래하였다. tracrRNA 및 CRISPR 어레이 대신에 합성 shRNA의 발현은 CasX에 의한 강한 플라스미드 간섭을 초래하였다. (패널 c) sgRNA 설계의 다이어그램(CasX1에 대한 tracrRNA 및 crRNA 서열로부터 유래됨). tracrRNA(녹색)을 테트라루프(GAAA)에 의해 crRNA(반복부, 검정색; 스페이서, 적색)에 결합시켰다.
도 7. CasX RNA 가이드된 DNA 간섭의 개략도. CasX는 tracrRNA(녹색) 및 crRNA(검정색, 반복부; 적색, 스페이서)에 결합한다. 정확한 프로토스페이서 인접 모티프(황색)를 함유하는 표적 서열(청색)에 대한 가이드 RNA의 염기쌍은 표적 DNA의 이중 가닥 절단을 초래한다. 도시한 서열은 CasX1에 대한 tracrRNA 및 crRNA 서열로부터 유래된다.
실시예 3
도 8. CasX를 이용하여 인간 세포를 편집하기 위한 실험 설계. 탈안정화된 GFP를 발현시키는 HEK293 세포를 플라스미드 발현 CasX 및 그의 가이드 RNA의 리포펙션 또는 가이드 RNA와 함께 사전 조립된 CasX의 뉴클레오펙션을 이용하여 CasX로 처리하였다. 성공적인 게놈 절단은 유세포분석 및/또는 서베이어 분석(예를 들어, T7E1 분석)에 의해 검출될 수 있는 형광 신호의 상실을 야기하는 GFP 좌위에서 삽입결실을 초래할 것이다.
실시예 4
도 9. CasX의 재조합 발현 및 정제. CasX를 말토스 결합 단백질에 융합시켰고, 이콜라이에서 발현시켰다. 용해물을 Ni-NTA 수지에 대해 정제하고 나서, TEV로 처리하고, 헤파린 칼럼 및 크기 배제 칼럼에 대해 정제하였다. 크기 배제 칼럼으로부터의 분획을 참조를 위해 분자량 마커로 나타낸다. CasX의 계산된 크기는 대략 110kDa이었다.
실시예 5
도 10. 다양한 tracrRNA 서열의 시험. 시험한 tracrRNA 서열은 다음과 같다(CasX 이중 가이드 RNA의 개략도에 대해 도 7을 참조한다):
Figure pct00008
추가로, 다음의 crRNA 서열을 기능에 대해 시험하였다:
crRNA 1(crRNA의 가공 형태 - sgRNA와 이중 가이드 형식 둘 다에서 활성임):
CCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(서열번호 61)
crRNA 2(이중 가이드 형식에서 활성임):
AUUUGAAGGUAUCUCCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(서열번호 62)
추가로, 다음의 sgRNA 서열을 기능에 대해 시험하였다(CasX 가이드 RNA의 개략적 표현에 대해 도 6 및 도 7을 참조한다):
sgRNA1(은 활성, 센스, 가공됨):
Figure pct00009
sgRNA2(는 비활성, 센스, 사전가공, 밑줄 표시 서열은 sgRNA1에 대해 상이함):
Figure pct00010
sgRNA3(은 비활성, 안티센스, 가공됨):
Figure pct00011
sgRNA4(는 비활성):
Figure pct00012
실시예 6
도 11. CasX 시스템(CasX 단백질 및 가이드 RNA)은 실온 및 37℃에서 박테리아 세포에서의 기능에 대해 시험하였다. 형질전환 플라스미드의 ㎍ 당 콜로니 형성 단위(cfu)를 표적 또는 비표적 서열을 함유하는 플라스미드에 대해 분석하였다. 분석을 실온 또는 37℃에서 수행하였다. 데이터는 CasX 시스템은 실온 또는 37℃에서 유사한 정도로 작용하였다.
실시예 7 - 고세균 Cas9
도 12. ARMAN -1 II형 CRISPR -cas 시스템. (패널 a), ARMAN-1 CRISPR-Cas 좌위 개요. (패널 b) NGG 3' PAM에 대한 강한 선호도는 240개의 프로토스페이서의 분석으로부터 추론하였다. (패널 c) 리치몬드 광산 생태계로부터 샘플링한 ARMAN-1 게놈에서 CRISPR 어레이의 재구성. 녹색 화살표는 반복부를 나타내고, 색이 있는 화살표는 CRISPR 스페이서를 나타낸다(동일한 스페이서는 동일하게 색칠한 반면, 독특한 스페이서는 검정색으로 색칠한다). 콘틱(회색 막대)은 메타게놈 콘틱 상의 스페이서 순서를 기준으로 정렬한다. 회색 배경은 어레이의 보존된 그리고 추정적으로 오래된 영역을 나타낸다. CRISPR 시스템에서, 스페이서는 전형적으로 편방향으로 첨가되고, 따라서 좌위의 좌측에서 매우 다양한 스페이서가 최근의 획득이 일어난 경우라는 것을 나타낸다.　최근에 획득된 스페이서의 다양성의 존재뿐만 아니라 상이한 부위에서 그리고 상이한 시간에 수집한 데이터세트로부터 조립된 게놈 단편에서 반복부 및 스페이서 서열의 보존은 시스템이 활성이라는 것을 나타낸다. (패널 d)　ARMAN-1 Cas9의 계통발생은 그것을 ARMAN-4 Cas9 및 본 명세서에 처음 보고된 2종의 새로운 박테리아 Cas9와 함께 클러스터링하였다(검정색). 이들 Cas9는 좌위가 Cas4를 함유한다고 해도, II-B형 시스템에서 전형적으로 발견되는 II-C형 시스템과 진화적으로 관련되는 것으로 여겨진다. (패널 e) 상이한 세트의 II-B형과 함께 클러스터링된 ARMAN-1 Cas1의 계통발생. 종합하면, 패널 (d) 및 (e)에서 계통수는 ARMAN-1 II형 시스템이 II-B 및 II-C형 CRSIPR-Cas 시스템의 재조합 결과일 수 있다는 것을 시사한다.
도 14. (상부 패널) ARMAN-1 Cas9에 대한 crRNA:tracrRNA 이중-가이드 RNA의 예측된 2차 구조. crRNA(상부 가닥)와 다양한 길이의 예측된 tracrRNA 서열(하부 가닥) 사이의 2차 구조 및 염기쌍을 도시한다. "crRNA"는 ARMAN-1로부터의 직접 반복부 서열을 나타내는 반면, 녹색의 N20은 사용자-정의 서열(가이드 서열)이다. TracrRNA-69를 적색으로 나타낸 한편, tracrRNA-104 및 tracrRNA-179는 각각 청색 및 핑크색 서열에 의해 연장된다. (하부 패널) ARMAN-1 Cas9에 대한 예시적 단일-가이드 RNA의 예측 구조. sgRNA의 2차 구조를 도시한다. "표적자"는 부분 직접 반복부(절단됨) 및 표적자를 활성체에 연결하는(또한 절단됨) 조작된 테트라루프(링커)를 나타낸다. 녹색의 N20은 사용자-정의 서열(가이드 서열)이다. tracrRNA-69, tracrRNA-104 및 tracrRNA-179를 포함하는 SgRNA를 도시한다.
도 15. (상부 패널) ARMAN-4 Cas9에 대한 crRNA:tracrRNA 이중-가이드 RNA의 예측된 2차 구조. crRNA(상부 가닥)와 예측된 tracrRNA 서열(하부 가닥) 사이의 2차 구조 및 염기쌍을 도시한다. "crRNA"는 ARMAN-4로부터의 직접 반복부 서열을 나타내는 반면, 녹색의 N20은 사용자-정의 서열(가이드 서열)이다. (하부 패널) ARMAN-4 Cas9에 대한 예시적 단일-가이드 RNA의 예측 구조. sgRNA의 2차 구조를 도시한다. "표적자"는 부분 직접 반복부(절단됨) 및 표적자를 활성체에 연결하는(또한 절단됨) 조작된 테트라루프(링커)를 나타낸다. 녹색의 N20은 사용자-정의 서열(가이드 서열)이다.
실시예 8: 비배양 미생물로부터의 새로운 CRISPR - Cas 시스템
CRISPR-Cas 적응 면역계는 부위-특이적 DNA 절단을 할 수 있는 프로그램 가능한 효소를 제공함으로써 게놈에 혁신을 일으켰다. 그러나, 현재의 CRISPR-Cas 기술은 아직 손대지 않은 단리되지 않은 유기체로부터의 방대한 효소를 떠나서 배양 박테리아로부터의 시스템에만 기반한다. 본 명세서의 데이터는 배양-독립적 게놈-해결 메타게노믹스를 이용하여, 고세균의 생활 도메인에서 처음 보고된 Cas9를 포함하는 새로운 CRISPR-Cas 시스템의 동정을 나타낸다. 이런 분기하는 Cas9 효소는 활성 CRISPR-Cas 시스템의 부분으로서 거의 연구되지 않은 나노고세균에서 발견되었다. 박테리아에서, 2개의 이전에 알려지지 않은 시스템, 즉, 아직 동정되지 않은 가장 최신의 시스템 중에서 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY가 발견되었다. 특히, 모든 필요한 기능성 성분을 메타게노믹스에 의해 동정하였는데, 이는 이콜라이에서 강한 RNA-가이드 DNA 간섭의 확인을 허용하였다. 본 명세서의 데이터는 살아있는 세포에서의 실험과 조합된 환경적 미생물 군집의 의문이 내용이 미생물계 생물기법의 레퍼토리를 확장하는 게놈의 전례없는 다양성에 대한 접근을 허용한다는 것을 나타낸다.
결과
지하수, 퇴적물, 및 산성 광산 배수 미생물 군집으로부터의 테라베이스-규모의 메타게놈 데이터세트를 분석하였고, 배양 유기체 중에서 나타내지 않은 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 탐색하였다. 도메인 고세균에서 제1 Cas9 단백질을 동정하였고, 비배양 박테리아에서 2개의 새로운 CRISPR-Cas 시스템, 즉, CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY를 발견하였다(도 18). 특히, 고세균 Cas9와 CasY는 둘 다 알려진 단리된 대표물이 없는 계통으로부터의 유기체 게놈에서 배타적으로 암호화되었다.
고세균 Cas9의 제1 동정
CRISPR-Cas9의 특징 중 하나는 박테리아 도메인에서만의 그의 추정적 존재였다. 따라서 산성 광산 배수(AMD) 메타게놈 데이터세트에서 나노고세균 ARMAN-1(칸디다투스 마이크라카에움(Candidatus Micrarchaeum) 호산성 ARMAN-1) 및 ARMAN-4(칸디다투스 파르바카에움(Candidatus Parvarchaeum) 호산성 ARMAN-4) 게놈에서 암호화된 Cas9 단백질을 발견한 것은 놀라웠다. 이들 발견은 Cas9-함유 CRISPR 시스템의 발생을 다른 생활 도메인으로 확장시킨다.
ARMAN-4 cas9 유전자는 동일한 게놈 내용의 16개의 상이한 샘플에서 발견되었지만, 다른 인접한 cas 유전자는 없었고(25 kbp 초과로 몇몇 DNA 서열 콘틱에서 중심에 위치됨에도 불구하고), 하나의 인접한 CRISPR 반복-스페이서 단위만을 가진다(도 24). 보편적인 CRISPR 인테그라제를 암호화하는 전형적인 CRISPR 어레이 및 cas1의 결여는 새로운 스페이서를 획득하는 능력이 없는 시스템을 시사한다. 표적은 스페이서 서열에 대해 동정될 수 없었지만, 몇년에 걸쳐 수집한 샘플 내 좌위의 보존을 제공하였으며, "단일-표적" CRISPR-Cas 시스템에서 그의 기능은 이때에 제외할 수 없다.
대조적으로, 15개의 상이한 샘플로부터 회수한 ARMAN-1에서 CRISPR-Cas 좌위는 cas1, cas2, cas4 및 cas9 유전자에 인접한 거대 CRISPR 어레이를 포함한다. 대체로 보존된 말단(가장 오래된 스페이서를 포함할 가능성이 있음) 및 다수의 별개의 스페이서가 혼입된 가변 영역을 갖는 수많은 대안의 ARMAN-1 CRISPR 어레이를 재구성하였다(도 19a 및 도 25). 스페이서 내용에서 이 초가변성에 기반하여, 이들 데이터는 ARMAN-1 CRISPR-Cas9 시스템이 샘플링한 집단에서 활성이라는 것을 나타낸다.
현저하게는, ARMAN-1 CRISPR-Cas9 시스템의 추정적 스페이서 표적(프로토스페이서) 중 56개를, 그것이 고밀도의 짧은 가설 단백질을 암호화한다는 것을 고려하여 ARMAN-1 바이러스일 가능성이 있는 단일 10 kbp 게놈 단편에 위치시켰다(도 19b). 사실, 극저온 전자 단층 촬영 재구성은 종종 ARMAN 세포에 부착된 바이러스 입자를 동정하였다. ARMAN-1 프로토스페이서는 또한 동일한 생태계로부터의 I-플라즈마를 포함하는, ARMAN-2(다른 나노고세균)의 게놈 내에서 추정적 트랜스포존 및 써모플라스마탈레스(Thermoplasmatales) 고세균의 게놈 내 추정적 이동 요소로부터 유래되었다(도 26). ARMAN과 써모플라스마탈레스 세포 사이에 직접 세포질 "브리지"가 관찰되었는데, 이는 그들 사이의 밀접한 관계를 나타낸다. 따라서 ARMAN-1 CRISPR-Cas9는 진핵 생식 계통에서 piRNA-매개 방어를 연상시키는 역할인 이들 유기체 사이의 트랜스포존 증식에 대해 방어될 수 있다.
활성 DNA-표적화 CRISPR-Cas 시스템은 자기 대 비자기 차별에 대해 표적 서열 다음에 위치된 2 내지 4개의 bp 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)를 사용한다. 게놈 표적 서열에 인접한 서열의 시험은 사실 ARMAN-1에서의 강한 'NGG' PAM 선호도를 나타내었다(도 19c). Cas9는 또한 RNA-가이드 DNA 절단을 위해 2개의 별개의 전사체, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 전사 촉진 CRISPR RNA(tracrRNA)를 사용한다. ARMAN-1과 ARMAN-4 CRISPR-Cas9 시스템 둘 다의 근처에서 추정적 tracrRNA를 동정하였다(도 27). 이전에, 고세균에서는 숙주 인자인 RNase III의 결여에 기인하여 II형 CRISPR 시스템이 없고, 이는 crRNA-tracrRNA 가이드 복합체 성숙을 초래하였다는 것을 시사하였다. 특히, RNase III 상동체는 ARMAN-1 게놈(95% 완전한 것으로 추정됨)에서 동정되지 않았고, 내부 프로모터는 CRISPR 어레이에 대해 예측되지 않았는데, 이는 가이드 RNA 생산의 아직 결정되지 않은 메커니즘을 시사한다. 이콜라이와 효모 둘 다로부터 정제된 ARMAN-1 및 ARMAN-4 Cas9 단백질의 절단 활성을 시험하기 위한 생화학적 실험 및 생체내 이콜라이 표적화 분석은 임의의 검출 가능한 활성을 나타내지 않았다(도 32 및 도 28 참조).
CRISPR - CasX는 새로운 이중-RNA-가이드 CRISPR 시스템이다
Cas9에 추가로, 클래스 2 Cas 효과기 단백질의 3가지 패밀리만을 발견하였고, 실험적으로 확인하였다: Cpf1, C2c1 및 C2c2. 작은 DNA 단편 상에서만 동정된 다른 유전자인 c2c3은 또한 이러한 단백질 패밀리를 암호화하는 것으로 시사되었다. 새로운 유형의 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템은 지하수 및 퇴적물 샘플로부터 반복적으로 회수한 2종의 박테리아의 게놈에서 발견되었다. 상이한 문에 속하는 2종의 유기체, 즉, 델타프로테오박테리아 및 부유균문에서 이 시스템의 높은 보존은 최근의 문 간의 전달을 시사한다. 이 새로 기재된 시스템은 본 명세서에서 CasX로서 지칭되는 Cas1, Cas2, Cas4 및 비특성규명된 대략 980개의 aa 단백질을 포함한다. 각각의 CasX와 회합된 CRISPR 어레이는 37개의 염기쌍의 고도로 유사한 반복부, 33 내지 34개 염기쌍의 스페이서, 및 Cas 오페론과 CRISPR 어레이 사이의 추정적 tracrRNA를 가졌다(도 18b). BLAST 검색은 CasX C-말단의 특정 영역으로 제한된 유사성으로, 트랜스포사제에 대해 약한 유사성만을 나타내었다(e-값 > 1×10-4). 원위 상동성 검출 및 단백질 모델링은 V형 CRISPR-Cas 시스템에서 발견된 조직화를 연상시키는 CasX C-말단 단부 근처의 RuvC 도메인을 동정하였다(도 29). CasX 단백질의 나머지(630 N-말단의 아미노산)은 임의의 공지된 단백질에 대해 검출 가능한 유사성을 나타내지 않았는데, 이는 신규한 클래스 2 효과기라는 것을 시사한다. tracrRNA와 별개의 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질의 조합은 V형 시스템 중에서 독특하다. 추가로, CasX는 임의의 공지된 V 단백질보다 상당히 더 작다: Cpf1, C2c1 및 C2c3에 대해 980 aa은 1,200 aa보다 더 큰 전형적인 크기와 비교됨.
다음에, 그의 작은 크기 및 비정규 좌위 내용에도 불구하고, CasX는 Cas9 및 Cpf1 효소와 유사한 RNA-가이드 DNA 표적화를 할 수 있는지의 여부를 생각하였다. 이 가능성을 시험하기 위해, casX, 짧은 반복부-스페이서 어레이 및 간접 비암호 영역을 포함하는 최소 CRISPR-CasX 좌위를 암호화하는 플라스미드를 합성하였다. 이콜라이에서 발현될 때, 이런 최소 좌위는 메타게놈 분석에 의해 동정된 플라스미드 보유 표적 서열에 의한 형질전환을 차단하였다(도 20a 내지 도 20c, 도 30). 더 나아가, 최소-좌위에서 스페이서 서열이 플라스미드 표적 내 프로토스페이서 서열에 매칭될 때에만 형질전환에 의한 간섭이 일어났다. CasX에 대한 PAM 서열을 동정하기 위해, 표적 부위에 인접한 5' 또는 3' 무작위화 서열 중 하나를 함유하는 플라스미드를 사용하여 형질전환 분석을 이콜라이에서 반복하였다. 이 분석은 프로토스페이서 서열의 5' 바로 옆에 위치된 서열 'TTCN'에 대한 엄격한 선호도를 나타내었다(도 20d). 3' PAM 선호도는 관찰되지 않았다(도 30). 이 발견과 일치되게, 'TTCA'는 환경 샘플에서 동정한 추정적 델타프로테오박테리아 CRISPR-CasX 프로토스페이서 상류에서 발견된 서열이었다. 특히, CRISPR-CasX 좌위는 동일한 PAM 서열을 공유하는데, 이는 그들의 높은 정도의 CasX 단백질 상동성과 연결된다.
단일-RNA와 이중-RNA 가이드 시스템 둘 다의 예는 V형 CRISPR 좌위에 존재한다. 실험적 메타-전사체 데이터를 사용하여 CasX가 DNA 표적화 활성에 대해 tracrRNA를 필요로 하는지의 여부를 결정하였다. 이 분석은 Cas2 오픈 리딩 프레임과 CRISPR 어레이 사이에 암호화된 CRISPR 반복부에 상보성인 서열을 갖는 비-암호 RNA 전사체를 나타내었다(도 21a). CasX 좌위를 발현시키는 이콜라이에서 이 비-암호 RNA의 발현에 대해 확인하기 위해, 방향 둘 다에서 이 전사체에 대해 노덧 블롯을 수행하였다(도 30). 결과는 대략 60 내지 70개의 nt의 더 이종성의 전사체에 의한, casX 유전자와 동일한 가닥 상에서 암호화된 대략 110개의 nt의 전사체의 발현을 나타내었고, 이는 CRISPR 어레이에 대한 리더 서열이 tracrRNA와 어레이 사이에 있다는 것을 시사한다. 전사체 맵핑은 추가로 CRISPR RNA(crRNA)가 CRISPR-Cas9 시스템에서 생긴 crRNA 가공과 유사하게 반복부의 22 nt(또는 약 23 nt) 및 인접한 스페이서의 20nt를 포함하도록 가공된다는 것을 시사한다(도 21a). 더 나아가, 2-nt 3' 돌출부를 동정하였는데, 이는 crRNA-tracrRNA 듀플렉스의 RNase III-매개 가공과 일치된다(도 21b). 추정적 tracrRNA에 대한 CasX 활성의 의존도를 결정하기 위해, 이 영역을 상기 기재한 최소 CRISPR-CasX 좌위로부터 결실시키고, 플라스미드 간섭 분석을 반복하였다. CasX 플라스미드로부터의 추정적 tracrRNA-암호화 서열의 결실은 그의 존재에서 관찰된 강한 형질전환 간섭이 없었다(도 21c). 단일-가이드 RNA(sgRNA)를 형성하기 위해 테트라루프를 이용하여 가공된 crRNA와 이 추정적 tracrRNA를 결합하였다. crRNA 단독의 이종성 프로모터 또는 sgRNA의 단축 형태를 이용하는 발현이 임의의 상당한 플라스미드 간섭을 나타내지 않았다면, 전장 sgRNA의 발현은 플라스미드 형질전환에 대한 내성을 부여하였다(도 21c). 종합하면, 이들 결과는 새로운 기능성 DNA-표적화, 이중-RNA 가이드 CRISPR 효소로서 CasX를 확립한다. 이들 결과는 CasX가 단일-RNA 가이드 CRISPR 효소로서 작용할 수 있다는 것을 추가로 입증한다.
단리물이 없는 박테리아 계통에서 배타적으로 발견된 시스템인 CRISPR - CasY
특정 후보 문 방사선(candidate phyla radiation: CPR) 박테리아의 게놈에서 암호화된 다른 새로운 클래스 2 Cas 단백질을 동정하였다. 이들 박테리아는 전형적으로 작은 세포 크기(크라이오-TEM 데이터 및 여과를 통한 농축에 기반함), 매우 작은 게놈 및 제한된 생합성 능력을 갖는데, 이는 그들이 공생자일 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 CasY로서 지칭되는 새로운 대략 1,200 aa Cas 단백질은 기껏해야, Cas1 및 CRISPR 어레이를 포함하는 최소 CRISPR-Cas 시스템의 부분인 것으로 나타났다(도 22a). 대부분의 CRISPR 어레이는 보통 17 내지 19 nt의 짧은 스페이서를 갖지만, Cas1을 결여하는 하나의 시스템(CasY.5)은 더 긴 스페이서(27 내지 29 nt)를 가진다. 동정된 CasY 단백질의 6가지 예는 공공의 데이터베이스에서 임의의 단백질에 대해 상당한 서열 유사성이 없었다. 공개된 Cas 단백질3,4로부터 구성된 프로파일 모델(HMM)을 이용하는 민감한 검색은 6개의 CasY 단백질 중 4개는 RuvC 도메인과 중복되는 C-말단 영역 및 N-말단의 작은 영역(대략 45aa)에서 C2c3에 대해 국소 유사성(e-값 4×10-11 내지 3×10- 18)을 가진다는 것을 나타내었다(도 29 참조). C2c3은 분류학상의 소속 없이 짧은 콘틱에 대해 동정된 추정적 V형 Cas 효과기이며, 실험적으로 입증되지 않았다. CasY와 같이, C2c3는 짧은 스페이서 및 Cas1를 갖지만, 다른 Cas 단백질이 없는 어레이 옆에서 발견되었다. 특히, 현재의 연구에서 동정된 CasY 단백질 중 둘은 다른 CasY 단백질과 상당한 서열 유사성(최고 Blast 히트: e-값 6×10-85, 7×10-75)을 공유함에도 불구하고, C2c3에 대해 상당한 유사성이 없었다.
임의의 실험적으로 확인된 CRISPR 좌위에 대한 CRISPR-CasY의 낮은 상동성을 고려하여, 다음에 이 시스템이 RNA-가이드 DNA 간섭을 부여하는지의 여부를 생각하였지만, 짧은 스페이서 길이 때문에 이러한 활성에 필요할 수 있는 가능한 PAM 모티프에 관해 신뢰 가능한 정보는 존재하지 않았다. 이것에 착수하기 위해, 단축된 CRISPR 어레이로 전체 CRISPR-CasY.1 좌위를 합성하고 나서, 플라스미드 벡터 상에서 이콜라이에 도입하였다. 이어서, 가능한 PAM을 동정하기 위해 어레이에서 스페이서 서열에 매칭되고 인접한 무작위화 5' 또는 3'영역을 함유하는 서열을 갖는 플라스미드를 이용하여 형질전환 분석에서 이들 세포에 도전하였다. 형질전환체의 분석은 표적화된 서열에 직접적으로 인접한 5' TA를 함유하는 서열의 고갈을 나타내었다(도 22b). 이 동정된 PAM 서열을 이용하여, CasY.1 좌위를 단일 PAM을 함유하는 플라스미드에 대해 시험하였다. 플라스미드 간섭은 동정된 5'TA PAM 서열을 함유하는 표적의 존재에서만 입증되었다(도 22c). 따라서, 이들 데이터는 CRISPR-CasY가 DNA 간섭 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
논의
비배양 박테리아 및 고세균으로부터의 게놈에서 새로운 클래스 2 CRISPR-Cas 적응 면역계를 동정하였고 특성규명하였다. 활성 CRISPR 좌위에 대해 보편적인 Cas1의 진화 분석(도 23a)은 본 명세서에 기재된 고세균 Cas9 시스템이 임의의 존재하는 II형 서브타입에 명확하게 속하지 않았다는 것을 시사하였다. Cas1 계통발생(뿐만 아니라 cas4의 존재)을 야생형 II-B 시스템과 함께 클러스터링시켰고, 아직 Cas9의 서열은 II-C형 단백질과 더 유사하였다(도 31). 따라서, 고세균 II형 시스템은 II-C형 및 II-B형 시스템의 융합으로서 생길 수 있다(도 23b). 마찬가지로, Cas1 계통발생 분석은 CRISPR-CasX 시스템으로부터의 Cas1인 임의의 다른 공지된 V형 시스템으로부터 원위에 있다는 것을 나타내었다. V형 시스템은 조상 I형 시스템으로부터의 적응 모듈(Cas1 내지 Cas2)과 트랜스포존의 융합 결과가 되는 것으로 시사되었다. 따라서 CRISPR-CasX 시스템이 이전에 기재된 V형 시스템에 생기는 것과 상이한 융합 사건 후에 나타났다는 가설을 세운다. 현저하게, CRISPR-CasY와 추정적 C2c3 시스템은 둘 다 CRISPR 좌위 내로 DNA를 통합하는 데 필수적인 것으로 생각되는 단백질인 Cas2를 결여하는 것으로 보인다. 모든 CRISPR-Cas 시스템이 Cas1과 Cas2를 둘 다 함유한 조상 I형 시스템의 후속인 것으로 생각되는 것을 고려하면, CRISPR-CasY 및 C2c3 시스템은 CRISPR-Cas 시스템의 나머지와 상이한 혈통을 가질 수 있거나, 또는 대안적으로, Cas2는 그들의 진화 이력 동안 상실될 수 있었다.
고세균에서 Cas9의 본 명세서에 기재된 발견 및 박테리아에서 2가지의 이전에 미공지 CRISPR-Cas 시스템은 복잡한 천연 미생물 군집으로부터 얻은 광대한 DNA 및 RNA 서열을 사용하였다. CasX 및 CasY의 경우에, 게놈 내용은 결집되지 않은 서열 정보로부터 명백하지 않은 기능의 예측에 대해 중요하였다. 추가로, 추정적 tracrRNA뿐만 아니라 표적화된 바이러스 서열의 동정은 메타게놈 데이터 가이드된 기능성 시험의 분석을 통해 다루지 않았다. 흥미롭게도, 지금까지 동정된 가장 빽빽한 CRISPR-Cas 좌위의 일부는 매우 작은 게놈을 갖는 유기체에서 발견되었다. 작은 게놈 크기의 결과는 기본적 대사 필요를 위해 다른 군집 구성원에 의존할 가능성이 있으며, 따라서 그들은 대체로 전통적 배양-기반 방법의 범주 밖에서 남아있었다. 간섭에 필요한 제한된 수의 단백질은 이들 최소 시스템이 새로운 게놈 편집 도구의 개발에 특히 가치 있게 만든다. 중요하게는, CRISPR-Cas 시스템과 관련된 메타게놈 발견이 인실리코 관찰로 제한되지 않지만, 그들의 기능이 시험될 수 있는 실험 환경에 도입될 수 있다는 것을 본 명세서에 나타낸다. 생명이 존재하는 사실상 모든 환경이 현재 게놈-해결 메타게놈 방법에 의해 프로빙될 수 있다는 것을 고려하면, 본 명세서에 기재된 조합된 컴퓨터-실험 접근은 공지된 CRISPR-Cas 시스템의 다양성을 크게 확장시켜, 생물학적 연구 및 임상 용도를 위한 새로운 기법을 제공한다는 것이 예상된다.
방법
메타게놈 및 메타전사체분석
3개의 상이한 부위로부터의 메타게놈 샘플을 분석하였다: (1) 캘리포니아주 아이언 마운틴에 소재한 리치몬드 광산으로부터 2006년과 2010년 사이에 수집한 산성 광산 배수(AMD) 샘플 (2) 콜로라도주 라이플 근처의 콜로라도강에 인접한 라이플 인터그레이티드 필드 리서치(Rifle Integrated Field Research: IFRC) 현장으로부터의 2007년과 2013년 사이에 수집한 지하수 및 퇴적물 샘플. (3) 유타주 콜로라도 고원에서 크리스탈 가이저(Crystal Geyser)로부터 2009년과 2014년에 수집한 지하수, 차가운, CO2-유도 간헐천.
AMD 데이터에 대해, 문헌[Denef and Banfield (2012) 및 Miller et al. (2011)]에 의해 DNA 추출 방법 및 짧은 판독 서열분석을 보고하였다. 라이플 데이터에 대해, DNA 및 RNA 추출뿐만 아니라 서열분석, 조립체 및 재구성된 게놈을 문헌[Anantharaman et al. (2016) 및 Brown et al. (2015)]에 의해 기재하였다. 크리스탈 가이저로부터의 샘플에 대해, 방법은 문헌[Probst et al (2016) 및 Emerson et al. (2015)]에 의해 기재된 것에 따른다. 간략하게, 파워소일(PowerSoil) DNA 단리 키트(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 모바이오 래버러토리즈 인코포레이티드(MoBio Laboratories Inc.))를 이용하여 DNA를 샘플로부터 추출하였다. 문헌[Brown et al. (2015)]에 의해 기재된 바와 같은 6개의 2011 라이플 지하수로부터 수집된 0.2㎛ 필터로부터 RNA를 추출하였다. DNA를 일루미나(Illumina) HiSeq2000 플랫폼 상에서, 그리고 메타전사체 cDNA를 5500XL SOLiD 플랫폼 상에서 서열분석하였다. 새로 보고된 크리스탈 가이저 데이터 및 AMD 데이터의 재분석을 위해, IDBA-UD를 이용하여 서열을 조립하였다. Bowtie2를 이용하여 서열분석 범위 및 유전자 발현을 각각 결정하기 위해 사용한 DNA 및 RNA(cDNA) 판독-맵핑을 수행하였다. 프로디갈(Prodigal)을 이용하여 조립 스캐폴드에 대해 오픈 리딩 프레임(Open reading frame: ORF)을 예측하였다. 출현 자기-조직화 맵(Emergent Self-Organizing Map: ESOM)을 이용하여 ABAWACA, ABAWACA2(https://github.com/CK7) Maxbin2, 및 테트라뉴클레오타이드 빈도의 조합을 이용하는 차별적 범위 존재비 패턴에 기반하여 크리스탈 가이저 데이터세트로부터의 스캐폴드를 버렸다. GC 함량%, 분류학상의 소속 및 게놈 완전성을 이용하여 게놈을 수동으로 만들었다. ra2.py를 이용하여 스캐폴딩 오차를 수정하였다(https://github.com/christophertbrown).
CRISPR - Cas 계산 분석
문헌[Makarova et al. 및 Shmakov et al.]으로부터의 정렬에 기반하여 허머(HMMer) 스위트를 이용하여 구성한 은닉 마르코프 모델(HMM) 프로파일을 이용하여 공지된 Cas 단백질에 대해 다양한 샘플로부터의 조립 콘틱을 스캐닝하였다. CrisprFinder 소프트웨어의 국소 형태를 이용하여 CRISPR 어레이를 동정하였다. cas1 유전자에 인접한 10개의 ORF 중 하나가 800 aa보다 더 큰 비특성규명 단백질에 대해 암호화되었다면 Cas1과 CRISPR 어레이를 둘 다 함유한 좌위를 추가로 분석하였고, 동일한 콘틱 상에서 cas 간섭 유전자는 동정되지 않았다. 이들 거대 단백질을 잠재적 클래스 2 Cas 효과기로서 추가로 분석하였다. MCL을 이용하여 서열 유사상에 기반하여 단백질 패밀리에 대해 잠재적 효과기를 클러스터링하였다. 각각의 이들 패밀리를 나타내는 HMM을 구성함으로써, 그리고 유사한 Cas 단백질에 대해 메타게놈 데이터세트를 검색하기 위해 그들을 이용함으로써 이들 단백질 패밀리를 확장시켰다. 단백질 패밀리가 정말로 새롭게 되도록 하기 위해, NCBI의 흔치않은(nr) 및 메타게놈(env_nr) 단백질 데이터베이스에 대한 BLAST뿐만 아니라 UniProt KnowledegeBase에 대한 HMM 검색을 이용하여 공지된 상동체를 검색하였다. 전장 히트가(단백질 길이의 25% 초과) 없는 단백질만을 신규한 단백질로 고려하였다. HH-스위트로부터의 HHpred를 이용하여 추정적 Cas 단백질의 원위 상동성 검색을 수행하였다. 해결된 결정 구조, 및 JPred4에 의해 예측된 2차 구조와의 비교에 기반하여 도메인 구조를 추론하기 위해 고스코어링 HHpred 히트를 사용하였다. 새로 발견된 Cas 단백질을 포함하는 HMM 데이터베이스를 보조 데이터 1에서 이용 가능하다.
CrisprFinder를 이용하여 조립 데이터로부터 스페이서 서열을 결정하였다. 적절한 샘플의 짧은 DNA 판독에서 추가적인 스페이서를 위치시키기 위해 CRASS를 사용하였다. 스페이서에 대해 미스매치가 1 이하인 히트에 대한 적절한 메타게놈 조립체에 대해 BLAST 검색에 의해("-task blastn-short"를 이용) 스페이서 표적(프로토스페이서)을 동정하였다. (프로토스페이서로서 CRISPR 어레이 동정을 피하기 위해) 관련된 반복부를 함유한 콘틱에 속하는 히트를 여과시켰다. 프로토스페이서에 측접하는 영역을 정렬함으로써 그리고 웹로고(WebLogo)를 이용하여 시각화함으로써 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 동정하였다. mFold를 이용하여 RNA 구조를 예측하였다. 조립 데이터로부터 스페이서, 반복부 및 측접 서열을 수동으로 정렬함으로써 CRISPR 어레이 다양성을 분석하였다. 제네이오스(Geneious) 9.1을 이용하여 수동 정렬 및 콘틱 시각화를 수행하였다.
새로 동정된 시스템의 Cas1 및 Cas9 단백질의 계통발생학적 분석을 위해 문헌[Makarova et al. 및 Shmakov et al.]으로부터의 단백질과 함께 사용하였다. CD-HIT를 이용하여 90% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 함께 클러스터링함으로써 비중복 세트에 따랐다. MAFFT를 이용하여 정렬을 생성하였고, 그리고 치환 모델로서 PROTGAMMALG를 이용하는 RAxML 및 100 부트스트랩(bootstrap) 샘플링을 이용하여 최대-가능성 계통발생을 작제하였다. 카스포존(casposon)을 야기하는 분지를 이용하여 Cas1 나무의 뿌리를 고정시켰다. FigTree 1.4.1 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) 및 iTOL v3을 이용하여 나무를 시각화하였다.
이종성 플라스미드의 생성
CasX에 대한 획득과 관련된 단백질을 제거함으로써 그리고 CasX와 CasY 둘 다에 대해 CRISPR 어레이 크기를 감소시킴으로써 메타게놈 콘틱을 최소 CRISPR 간섭 플라스미드로 만들었다. 최소 좌위를 Gblocks(인테그레이티드 DNA 테크놀로지)로서 합성하고 나서, 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)를 이용하여 조립하였다.
PAM 고갈 분석
변형에 의해 앞서 기재한 바와 같이 PAM 고갈 분석을 수행하였다. 무작위화된 PAM 서열을 함유하는 플라스미드 라이브러리를 프라이머를 이용하여 7 nt 무작위화된 PAM 영역을 함유하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 어닐링함으로써 조립하고 나서, 클레노브단편(Klenow Fragment: NEB)으로 연장시켰다. EcoRI 및 NcoI로 이중 가닥 DNA를 분해시키고 나서, pUC19 골격에 결찰시켰다. 결찰된 라이브러리를 DH5α로 형질전환시키고, 108개 초과의 세포를 채취하고 나서, 플라스미드를 추출하고, 정제하였다. 200ng의 풀링 라이브러리를 CRISPR 좌위 또는 좌위가 없는 대조군 플라스미드를 보유하는 전기천공적격 이콜라이로 형질전환시켰다. 형질전환 세포를 30시간 동안 25℃에서 카베니실린(100㎎ ℓ-1) 및 클로람페니콜(30㎎ ℓ-1)을 함유하는 선택 배지 상에서 플레이팅하였다. 플라스미드 DNA를 추출하고 나서, 일루미나 서열분석을 위한 어댑터를 이용하여 PAM 서열을 증폭시켰다. 7 nt PAM 영역을 추출하고 나서, 각각의 7nt 서열에 대해 PAM 빈도를 계산하였다. 명시된 역치 초과에서 고갈된 PAM 서열을 사용하여 웹로고(WebLogo)를 생성하였다.
플라스미드 간섭
메타게놈 서열 분석 또는 PAM 고갈 분석으로부터 동정된 추정적 표적을 pUC19 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 10ng의 표적 플라스미드를 CRISPR 좌위 플라스미드를 함유하는 전기천공적격 이콜라이(NEB 안정성)로 형질전환시켰다. 세포를 2시간 동안 25℃에서 회수하고 나서, 선택 배지 상에서 적절한 희석물을 플레이팅하였다. 플레이트를 25℃에서 인큐베이션하고 나서, 콜로니 형성 단위를 계수화하였다. 모든 플라스미드 간섭 실험을 3회 수행하고 나서, 전기천공적격 세포를 각각의 복제물에 대해 독립적으로 제조하였다.
ARMAN - Cas9 단백질 발현 및 정제
ARMAN-1(AR1) 및 ARMAN-4(AR4)로부터의 Cas9에 대한 발현 작제물을 이콜라이에 대해 코돈 최적화된 gBlocks(인터그레이티드 DNA 테크놀로지즈)으로부터 조립하였다. N-말단 His6-MBP 또는 His6 융합 단백질로서 pET-기반 발현 벡터에 조립 유전자를 클로닝하였다. 발현 벡터를 BL21(DE3) 이콜라이 세포로 형질전환시키고 나서, 37℃에서 LB 브로스에서 성장시켰다. 단백질 발현을 위해, 0.4mM IPTG(아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)를 이용하여 중간-대수기 동안 세포를 유도하고 나서, 16℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 모든 후속적 단계를 4℃에서 수행하였다. 세포 펠렛을 용해 완충제(50mM 트리스(Tris)-HCl pH 8, 500mM NaCl, 1mM TCEP, 10mM 이미다졸) 0.5% 트리톤 X-100 중에서 재현탁시키고, 초음파처리에 의한 용해 전에 적격 프로테아제 저해제 혼합물(로슈(Roche))로 보충하였다. 용해물을 15000g에서 40분 동안 원심분리에 의해 정화시키고 나서, 배취에서 슈퍼플로우(Superflow) Ni-NTA 아가로스(퀴아젠(Qiagen))에 적용하였다. 세척 완충제 A(50mM 트리스-HCl pH 8, 500mM NaCl, 1mM TCEP, 10mM 이미다졸)를 이용하여 수지를 광범위하게 세척한 후에, 5개 칼럼 용적의 세척 완충제 B(50mM 트리스-HCl pH 8, 1M NaCl, 1mM TCEP, 10mM 이미다졸)로 세척하였다. 용해 완충제(50mM 트리스-HCl pH 8, 500mM NaCl, 1mM TCEP, 300mM 이미다졸)를 이용하여 Ni-NTA 수지의 단백질을 용리시켰다. 세척 완충제 A에 대해 밤새 투석 동안 TEV 프로테아제에 의해 His6-MBP 태그를 제거하였다. 제2 Ni-NTA 아가로스 칼럼을 통해 친화도 태그로부터 절단된 Cas9를 제거하였다. 5㎖ 헤파린 HiTrap 칼럼(GE 라이프 사이언시즈(GE Life Sciences))에 대한 적용 전에 IEX 완충제 A(50mM 트리스-HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 1mM TCEP, 5% 글리세롤)에 단백질을 투석하였다. 선형 NaCl(0.3 내지 1.5 M) 구배로 Cas9를 용리시켰다. 분획을 풀링하고 나서, 30kDa 스핀 농축기(써모 피셔(Thermo Fisher))를 이용하여 농축시켰다. 적용 가능할 때, 슈퍼덱스(Superdex) 200pg 칼럼(GE 라이프 사이언시즈) 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 통해 Cas9를 추가로 정제하였고, 후속적 절단 분석을 위해 IEX 완충제 A에서 저장하였다. 효모 발현을 위해, AR1-Cas9를 Gal1/10 His6-MBP TEV Ura 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae) 발현 벡터(애드진 플라스미드(Addgene plasmid) # 48305)에 클로닝시켰다. 벡터를 BY4741 URA3 균주에 형질전환시키고 나서, 배양물을 30℃로 배지에서 성장시켰다. 대략 0.6의 OD600에서, 2% w/v 갈락토스를 이용하여 단백질 발현을 유도하고 나서, 16℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 단백질 정제를 수행하였다.
RNA 시험관내 전사 및 올리고뉴클레오타이드 정제
T7 프로모터 서열을 함유하는 합성 DNA 주형을 이용하여 앞서 기재한 바와 같이 시험관내 전사 반응을 수행하였다65. 변성 PAGE를 통해 모든 시험관내 전사된 가이드 RNA 및 표적 RNA 또는 DNA를 정제하였다. 95℃에서 1분 동안 인큐베이션에 의해 20mM 트리스 HCl pH 7.5 및 100mM NaCl 중에서 이중-가닥 표적 RNA 및 DNA를 혼성화시킨 후에, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 천연 PAGE에 의해 혼성체를 정제하였다.
시험관내 절단 분석
1x PNK 완충제 중에서 37℃에서 30분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(NEB) 및 [γ-32P] ATP(퍼킨-엘머)를 이용하여 정제된 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드를 방사성표지하였다. 65℃에서 20분 동안 PNK를 열 불활성화시키고 나서, 일러스트라 마이크로스핀(illustra Microspin) G-25 칼럼(GE 라이프 사이언시즈)를 이용하여 표지 반응으로부터 유리 ATP를 제거하였다). CrRNA와 tracrRNA를 1x 재폴딩 완충제(50mM 트리스 HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 1mM TCEP, 5% 글리세롤) 중에서 등몰량으로 혼합하고 나서, 70℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 반응물을 1mM 최종 금속 농도로 보충하고, 후속적으로 50℃에서 5분 동안 가열하였다. 실온으로 서서히 냉각시킨 후에, 재폴딩된 가이드를 얼음에 위치시켰다. 완충제, 염 농도에 대해 언급되지 않는 한, Cas9를 37℃에서 10분 동안 1x 절단 완충제(50mM 트리스 HCl pH 7.5, 300mM NaCl, 1mM TCEP, 5% 글리세롤, 5mM 2가 금속) 중에서 등몰량의 가이드로 재구성하였다. 37℃또는 표시된 온도에서 방사성표지 표적에 대해 10x 과량의 Cas9-가이드 복합체를 갖는 1x 절단 완충제에서 절단 반응을 수행하였다. 50mM EDTA로 보충한 동일 용적의 겔 부하 완충제에서 반응을 퀀칭시켰다. 10% 변성 PAGE 상에서 절단 생성물을 분해하고 나서, 포스포르이미징에 의해 시각화하였다.
생체내 이콜라이 간섭 분석
AR1- 및 AR4-Cas9에 대한 이콜라이 형질전환 분석을 앞서 공개된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 가이드 RNA에 의해 형질전환된 이콜라이는 전기천공적격으로 만들어졌다. 이어서, 세포를 야생형 또는 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9)를 암호화하는 플라스미드의 9 fmol로 형질전환시켰다. 회수한 세포의 연속 희석물을 선택적 항생제와 함께 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 16시간 후에 콜로니를 계수하였다.
CRISPR-Cas 시스템을 동정한 유기체 및 게놈 위치에 관한 상세한 설명뿐만 아니라 재구성된 스페이서의 수 및 평균 길이 및 반복부 길이에 대한 정보(NA, 이용 가능하지 않음). ARMAN-1 스페이서를 16개의 샘플로부터 재구성하였다.
분류학적 그룹 Cas 효과기 NCBI 접근 좌표 반복부 길이 스페이서 수 스페이서 평균 길이
ARMAN-1 Cas9 MOEG01000017 1827..7130 36 271 34.5
ARMAN-4 Cas9 KY040241 11779..14900 36 1 36
델타프로테오박테리아 CasX MGPG01000094 4319..9866 37 5 33.6
부유균문 CasX MHYZ01000150 1..5586 37 7 32.3
칸디다투스 칸타노박테리아(Candidatus Katanobacteria) CasY.1 MOEH01000029 459..5716 26 14 17.1
칸디다투스 보겔박테리아(Candidatus Vogelbacteria) CasY.2 MOEJ01000028 7322..13087 26 18 17.3
칸디다투스 보겔박테리아(Candidatus Vogelbacteria) CasY.3 MOEK01000006 1..4657 26 12 17.3
칸디다투스 파르쿠박테리아(Candidatus Parcubacteria) CasY.4 KY040242 1..5193 25 13 18.4
칸디다투스 코메일리박테리아(Candidatus Komeilibacteria) CasY.5 MOEI01000022 2802..7242 36 8 26
칸디다투스 케르펠드박테리아(Candidatus Kerfeldbacteria) CasY.6 MHKD01000036 11503..15366 NA NA NA
본 발명을 이의 구체적 실시형태를 참고로 하여 기재하였지만, 본 발명의 진정한 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물이 치환될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 추가로, 본 발명의 객관적 정신 및 범주에 대해 특정 상황, 물질, 대상 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적용하여 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 명세서에 첨부하는 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> RNA-GUIDED NUCLEIC ACID MODIFYING ENZYMES AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO/2018/064371 <140> PCT/US2017/054081 <141> 2017-09-28 <150> US 62/402,846 <151> 2016-09-30 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 986 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> identified from meta-transcriptomics sequence data from unknown deltaproteobacter <400> 1 Met Glu Lys Arg Ile Asn Lys Ile Arg Lys Lys Leu Ser Ala Asp Asn 1 5 10 15 Ala Thr Lys Pro Val Ser Arg Ser Gly Pro Met Lys Thr Leu Leu Val 20 25 30 Arg Val Met Thr Asp Asp Leu Lys Lys Arg Leu Glu Lys Arg Arg Lys 35 40 45 Lys Pro Glu Val Met Pro Gln Val Ile Ser Asn Asn Ala Ala Asn Asn 50 55 60 Leu Arg Met Leu Leu Asp Asp Tyr Thr Lys Met Lys Glu Ala Ile Leu 65 70 75 80 Gln Val Tyr Trp Gln Glu Phe Lys Asp Asp His Val Gly Leu Met Cys 85 90 95 Lys Phe Ala Gln Pro Ala Ser Lys Lys Ile Asp Gln Asn Lys Leu Lys 100 105 110 Pro Glu Met Asp Glu Lys Gly Asn Leu Thr Thr Ala Gly Phe Ala 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gacgataaaa 840 ttacgaatta atcttgcaat tccctgtagc ttgctgcagg gttactttat agttccctcc 900 cccttgatgg gggagggtta gggtgggggt gatagaatgt tgtttccacc ctcccctttg 960 tcccctcccg tcaagagagg ggagatttta ggataccccg cagcttgccg cggggaggtt 1020 cattaactac gaattttaaa aaaaccattc agatgtctta gcaggctgtt gaaaaagtca 1080 tcaacagcct tgattacaca gattataaaa aatgattaca cagatatttc aaggagtttc 1140 aatctgtgta atccaatctt ttctctgtgt aatcagagat tgttgagttt ttcaacaatc 1200 tgttaatttt taattcttac ttcataattg ctttcctatg aacataatcg caaccattaa 1260 aatagccgcc aatgccctgg gcataaataa aatgaggtca ggccttacca tgcttggcat 1320 aataatcggc gtggccgctg ttatagccat gctctctgta ggctcaggcg caaggactca 1380 gatttctaaa gagattgcca gcctcggctc caaccttttg ataattctgc ctggcgcgcc 1440 caccagcggc ggactcagaa tgggttttgg aacagcgccc acgttgacat ccgatgatgc 1500 aaaggcaata cctcaggaaa tatctaatgt tgcatttgca gcgccgattt taggcggcac 1560 agcgcagata gtatacggaa atcaaaactg gagcaccatt gtgacaggca caacaccggg 1620 tttttttgat atacgggaat ggcagcttga ctcaggcgct ctgtttaccc 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agcggactgg 2520 gtttgtctgg ctgggttgcg gcattacaga ggaagtaaat ttgggaaact gttataaaaa 2580 aggttgaaat acatatctgt tctgcttata ataagaatat cagataatca gaaaggagga 2640 atttatatgc ctgttgtcaa aatgagggaa aggggacaac taaccatccc atacgaatac 2700 aggaaagatc tcggcattgg caaggaagat atgctcaatg tcttaaaaat cggcgatgtg 2760 cttatccttg tgccgaaaca gcttgccgga gatatcgtat ccaagaaaat tgaagggacg 2820 atgaagaaaa aagggctgac acttgataac cttctaagca atctcaggga gcagagaaaa 2880 agatattcca aagagacata tgccaaagca aagacctaaa gtttttcttg acacaagcgc 2940 attgattgcc ggcatagcat cttcaagggg cgcagcaagg gctgtgctgc agcttgctga 3000 aatcggtttg atacaggtct ttgtctcaag gcaggtcatt gtggaagcag acaggaatat 3060 tgaagaaaaa ctgccggaga tgctgaatga atacagagaa tttatcaaac tcctatcacc 3120 cgtgttagtt gatgacccaa gccacaagga agttgcaaaa tatttatcag taatcaattc 3180 ggatgacgcg cctatccttg cctctgcaat aacctcacac gctgatttcc ttatcacatg 3240 ggacagaaag catttcatcg gcaaaaatat ccgtatccac ttaaacctga aaatcgttac 3300 tccgggagat tttttgaagt atttcaggaa atatattgag taaaagccca cctctttggc 3360 aaagagggga atggcatttg tttgagggac gaggggactg tcccagacaa aataaattat 3420 ttttaaccgt tttttggatg tgtgttatat tctgtgaata aggagggatt gccatggatg 3480 ataaagacaa ggatttaatg ctggaattta gaaaaaggct ttcatcggat ttagcaaatc 3540 atataacacg tctcatagta ttcgggtcaa gggcgaaagg tgaagtagca gaggattctg 3600 atcttgatgt aattgccata gttgatgaaa aaaactctgc gattgaaaaa agtcttgaag 3660 atatagcgta tcggattatg tgggatcatg acttcaggcc aatcatatca ctcaaagtgc 3720 tctctgaagc ccaattcagt gacgcccttc gtagagggtt ttctttttac aggcatgtgg 3780 aaaaagaggg ggttttggta tgaccgagga agtaaaaaag ctgattgaaa aagctgaaca 3840 cgcccttgag gtagccgaaa agttaatgaa tgacggttat ccatcagatg ccgcaagcaa 3900 aatctattat tcaatgtatt atgcagcaca tgccccttta aaatcagaag gaattgatgt 3960 catcaagcac tcagccgttg aatcagcctt cgggtattac tttgcgaaga ctggaaagat 4020 taatcccaaa caccacagga tgctaataga cgcaagaaag attcgtgaaa tagccgatta 4080 tgatattcag gaagagattg ttgagccaac tgcatcgcta aaaattaaag aggggaagtc 4140 ttttttgtct gcaatcagaa aaattcttgg cagcctgtag caatggactt 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<212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (38)..(70) <223> n is a, c, g, or u <400> 62 auuugaaggu aucuccgaua aguaaaacgc aucaaagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn 70 <210> 63 <211> 174 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (142)..(174) <223> n is a, c, g, or u <400> 63 aaguaguaaa uuacaucugg cgcguuuauu ccauuacuuu ggagccaguc ccagcgacua 60 ugucguaugg acgaagcgcu uauuuaucgg agauagcucc gaaaauuuga agguaucucc 120 gauaaguaaa acgcaucaaa gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 174 <210> 64 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n is a, c, g, or u <400> 64 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cuuugaugcg uuuuacuuau cgggaaaucu ccgauaaaua 60 agcgcuucgu ccauacgaca uagucgcugg gacuggcucc aaaguaaugg aauaaacgcg 120 ccagaugu 128 <210> 65 <211> 171 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> n is a, c, g, or u <400> 65 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cuuugaugcg uuuuacuuau cggagauacc 60 uucaaaugaa aggagcuauc uccgauaaau aagcgcuucg uccauacgac auagucgcug 120 ggacuggcuc caaaguaaug gaauaaacgc gccagaugua auuuacuacu u 171 <210> 66 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 66 uuccauuacu uuggagccag ucccagcgac uaugucguau ggacgaagcg cuuauuuauc 60 ggaga 65 <210> 67 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 67 gucccagcga cuaugucgua uggacgaagc gcuuauuuau cggaga 46 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 68 gaagcgcuua uuuaucggag a 21 <210> 69 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (27)..(46) <223> n is a, c, g, or u <400> 69 ucuccgauaa auaagaagca ucaaagnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 46 <210> 70 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 70 aaaaaaaaaa 10 <210> 71 <211> 949 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic sequence <400> 71 Met Arg Asp Ser Ile Thr Ala Pro Arg Tyr Ser Ser Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ile Lys Glu Phe Asn Ser Ala Phe Lys Leu Gly Ile Asp Leu Gly 20 25 30 Thr Lys Thr Gly Gly Val Ala Leu Val Lys Asp Asn Lys Val Leu Leu 35 40 45 Ala Lys Thr Phe Leu Asp Tyr His Lys Gln Thr Leu Glu Glu Arg Arg 50 55 60 Ile His Arg Arg Asn Arg Arg Ser Arg Leu Ala Arg Arg Lys Arg Ile 65 70 75 80 Ala Arg Leu Arg Ser Trp Ile Leu Arg Gln Lys Ile Tyr Gly Lys Gln 85 90 95 Leu Pro Asp Pro Tyr Lys Ile Lys Lys Met Gln Leu Pro Asn Gly Val 100 105 110 Arg Lys Gly Glu Asn Trp Ile Asp Leu Val Val Ser Gly Arg Asp Leu 115 120 125 Ser Pro Glu Ala Phe Val Arg Ala Ile Thr Leu Ile Phe Gln Lys Arg 130 135 140 Gly Gln Arg Tyr Glu Glu Val Ala Lys Glu Ile Glu Glu Met Ser Tyr 145 150 155 160 Lys Glu Phe Ser Thr His Ile Lys Ala Leu Thr Ser Val Thr Glu Glu 165 170 175 Glu Phe Thr Ala Leu Ala Ala Glu Ile Glu Arg Arg Gln Asp Val 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925 Pro Glu Gly Ile Tyr Arg Val Lys Glu Leu Gly Ser Asn Gly Val Ile 930 935 940 Val Val Gln Glu Asn Ala Val Ser Lys Glu Leu Ala Asn Lys Leu Gly 945 950 955 960 Ile Ser Asp Asp Gln Phe Ser Lys Val Pro Glu Arg Ala Leu Gly Lys 965 970 975 Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Phe Lys Gly Asn Gln Arg Ser Gly 980 985 990

Claims (131)

  1. 조성물로서,
    a) CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자; 및
    b) CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 하나 이상의 DNA 분자
    를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중-가이드 RNA인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 지질을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, a) 및 b)는 리포좀 내에 있는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, a) 및 b)는 입자 내에 있는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제, 뉴클레아제 저해제, 및 프로테아제 저해제 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 공여자 주형을 더 포함하는, 조성물.
  14. CasX 단일 가이드 RNA 분자로서,
    a) 표적 핵산에 혼성화하는 가이드 서열, 및 듀플렉스-형성 세그먼트를 포함하는 표적자 서열; 및
    b) 상기 표적자 서열의 상기 듀플렉스-형성 세그먼트와 혼성화하여 CasX 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 활성체 서열
    을 포함하는, CasX 단일 가이드 RNA 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 가이드 서열은 길이가 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, CasX 단일 가이드 RNA 분자.
  16. 제14항 또는 제15항의 CasX 단일 가이드 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CasX 단일 가이드 RNA를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, DNA 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, DNA 분자.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, DNA 분자.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, DNA 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, DNA 분자.
  23. 제17항에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, DNA 분자.
  24. 이종성 폴리펩타이드에 융합된 CasX 폴리펩타이드를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  26. 제24항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 이중-가닥 표적 핵산 분자의 하나의 가닥만을 절단할 수 있는 틈내기효소인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 상기 CasX 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된, CasX 융합 폴리펩타이드.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, NLS를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 세포 또는 표적 세포 유형 상의 세포 표면 모이어티에 대한 결합을 제공하는 표적화 폴리펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  33. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  36. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화(SUMOylating) 활성, 탈수모일화(deSUMOylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  40. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엔도솜 탈출 폴리펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 엔도솜 탈출 폴리펩타이드는 GLFXALLXLLXSLWXLLLXA(서열번호 94) 및 GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(서열번호 95)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는 라이신, 히스티딘 및 알기닌으로부터 독립적으로 선택된, CasX 융합 폴리펩타이드.
  42. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 엽록체 수송 펩타이드인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  43. 제42항에 있어서, 상기 엽록체 수송 펩타이드는,
    Figure pct00013
    으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드.
  44. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  45. 제44항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  46. 제44항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  47. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, CasX 융합 폴리펩타이드.
  48. 제24항 내지 제47항 중 어느 한 항의 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  49. 제48항에 있어서, 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  50. 제49항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
  51. 제50항에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 핵산.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 핵산 분자.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 분자는 재조합 발현 벡터인, 핵산 분자.
  54. 제53항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 아데노연관 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스 벡터인, 핵산 분자.
  55. 제49항에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 핵산 분자.
  56. 제48항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA인, 핵산 분자.
  57. 하나 이상의 핵산 분자로서,
    (a) 활성체 RNA 및 표적자 RNA를 포함하는 CasX 가이드 RNA; 및
    (b) CasX 폴리펩타이드
    를 암호화하는, 하나 이상의 핵산 분자.
  58. 제57항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
  59. 제57항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
  61. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중-가이드 RNA인, 하나 이상의 핵산 분자.
  62. 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 상기 활성체를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 표적자를 암호화화는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 상이한 DNA 분자 상에 존재하는, 하나 이상의 핵산 분자.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자.
  64. 제63항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
  65. 제64항에 있어서, 상기 프로모터는 식물 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물의 세포, 파리 세포, 척추동물의 세포, 포유류 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 세포 유형-특이적 프로모터, 및 조직-특이적 프로모터 중 하나 이상인, 하나 이상의 핵산 분자.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 재조합 발현 벡터인, 하나 이상의 핵산 분자.
  68. 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 아데노연관 바이러스 벡터, 하나 이상의 재조합 레트로바이러스 벡터, 또는 하나 이상의 재조합 렌티바이러스 벡터로부터 선택된, 하나 이상의 핵산 분자.
  69. 제63항에 있어서, 상기 프로모터는 원핵 세포에서 기능성인, 하나 이상의 핵산 분자.
  70. 진핵 세포로서,
    a) CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자,
    b) CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및
    c) CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자
    중 하나 이상을 포함하는, 진핵 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 진핵 세포.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 거미류 세포, 진균 세포, 조류 세포, 파충류 세포, 양서류 세포, 무척추동물 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 또는 인간 세포인, 진핵 세포.
  73. CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포.
  74. 제73항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 세포.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자는 상기 세포의 상기 게놈 DNA 내로 통합된, 세포.
  76. 표적 핵산의 변형 방법으로서, 상기 표적 핵산을
    a) CasX 폴리펩타이드; 및
    b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 CasX 가이드 RNA
    와 접촉시키는 단계를 포함하되,
    상기 접촉시키는 단계는 상기 CasX 폴리펩타이드에 의해 상기 표적 핵산의 변형을 초래하는, 표적 핵산의 변형 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단인, 표적 핵산의 변형 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 표적 핵산의 변형 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
  80. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 표적 핵산의 변형 방법.
  81. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 표적 핵산의 변형 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 표적 핵산의 변형 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 표적 핵산의 변형 방법.
  84. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 표적 핵산의 변형 방법.
  85. 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 게놈 편집을 초래하는, 표적 핵산의 변형 방법.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 CasX 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 변형 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 DNA 공여자 주형을 상기 세포 내로 도입하는 것을 더 포함하는, 표적 핵산의 변형 방법.
  88. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 표적 핵산의 변형 방법.
  89. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 표적 핵산의 변형 방법.
  90. 표적 DNA로부터 전사를 조절하거나, 표적 핵산을 변형시키거나, 또는 표적 핵산과 회합된 단백질을 변형시키는 방법으로서, 상기 표적 핵산을,
    a) 이종성 폴리펩타이드에 융합된 CasX 폴리펩타이드를 포함하는, CasX 융합 폴리펩타이드; 및
    b) 상기 표적 핵산의 표적 서열에 혼성화하는 가이드 서열을 포함하는 CasX 가이드 RNA
    와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA인, 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 CasX 가이드 RNA는 이중 가이드 RNA인, 방법.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 상기 표적 핵산의 절단이 아닌, 방법.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, RNA, 게놈 DNA, 및 염색체외 DNA로부터 선택된, 방법.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 외부의 시험관내에서 일어나는, 방법.
  96. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 배양물 내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
  97. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내 세포의 내부에서 일어나는, 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포, 진균 세포, 포유류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 기생충 세포, 절지동물 세포, 무척추동물의 세포, 척추동물의 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 영장류 세포, 비-인간 영장류 세포, 및 인간 세포로부터 선택된, 방법.
  100. 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인, 방법.
  101. 제90항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 세포 내로: (a) 상기 CasX 융합 폴리펩타이드, 또는 상기 CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 (b) 상기 CasX 가이드 RNA, 또는 상기 CasX 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  102. 제90항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 촉매적으로 비활성인 CasX 폴리펩타이드(dCasX)인, 조성물.
  103. 제90항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1의 D672, E769 및 D935로부터 선택된 것에 대응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  104. 제90항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 DNA를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스무타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 광분해효소 활성 및 글리코실라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 탈아미노화 활성, 탈퓨린화 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성 및 재조합효소 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
  107. 제90항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 표적 핵산과 회합된 표적 폴리펩타이드를 변형시키는 효소 활성을 나타내는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스톤 변형 활성을 나타내는, 방법.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 데유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모일화 활성, 탈수모일화활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 글리코실화 활성(예를 들어, O-GlcNAc 트랜스퍼라제로부터의 활성) 및 탈글리코실화 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성 및 데아세틸라제 활성으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성을 나타내는, 방법.
  111. 제90항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사를 증가 또는 감소시키는 단백질인, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 리프레서 도메인인, 방법.
  113. 제111항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 전사 활성화 도메인인, 방법.
  114. 제90항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인인, 방법.
  115. 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체로서, 게놈이,
    a) CasX 폴리펩타이드,
    b) CasX 융합 폴리펩타이드, 및
    c) CasX 가이드 RNA
    중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
  116. 제115항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
  117. 제115항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
  118. 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체는 식물, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 무척추동물, 곤충, 절지동물, 거미류, 기생충, 벌레, 강장동물, 척추동물, 어류, 파충류, 양서류, 유제류, 조류, 돼지, 말, 양, 설치류, 마우스, 래트 또는 비 인간 영장류인, 유전자이식, 다세포, 비인간 유기체.
  119. 시스템으로서,
    a) CasX 폴리펩타이드 및 CasX 단일 가이드 RNA;
    b) CasX 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
    c) CasX 융합 폴리펩타이드 및 CasX 가이드 RNA;
    d) CasX 융합 폴리펩타이드, CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
    e) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 및 CasX 단일 가이드 RNA;
    f) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
    g) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 및 CasX 가이드 RNA;
    h) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA; CasX 가이드 RNA, 및 DNA 공여자 주형;
    i) i) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
    j) i) CasX 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 iii) DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터;
    k) i) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터; 및
    l) i) CasX 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; ii) CasX 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 DNA 공여자 주형을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터
    를 포함하는, 시스템.
  120. 제119항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 시스템.
  121. 제119항에 있어서, 상기 CasX 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CasX 시스템.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 8개의 뉴클레오타이드 내지 1000개의 뉴클레오타이드인, CasX 시스템.
  123. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자 주형 핵산은 길이가 25개의 뉴클레오타이드 내지 500개의 뉴클레오타이드인, CasX 시스템.
  124. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항의 CasX 시스템을 포함하는 키트.
  125. 제124항에 있어서, 상기 키트의 부품은 동일한 용기에 있는, 키트.
  126. 제124항에 있어서, 상기 키트의 부품은 별개의 용기에 있는, 키트.
  127. 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항의 CasX 시스템을 포함하는 멸균 용기.
  128. 제127항에 있어서, 상기 용기는 주사기인, 멸균 용기.
  129. 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항의 CasX 시스템을 포함하는 이식 가능한 장치.
  130. 제129항에 있어서, 상기 CasX 시스템은 기질 내인, 이식 가능한 장치.
  131. 제129항에 있어서, 상기 CasX 시스템은 저장소 내인, 이식 가능한 장치.
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