JP2019532644A - Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣａｓＸタンパク質、本ＣａｓＸタンパク質をコードする核酸、及び本ＣａｓＸタンパク質及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸタンパク質は、提供される様々な用途において有用である。本開示は、本ＣａｓＸタンパク質に結合し、それに配列特異性を提供するＣａｓＸガイドＲＮＡ、本ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびに本ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸガイドＲＮＡは、提供される様々な用途において有用である。本開示は、古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド及びそれをコードする核酸、ならびにそれらの関連古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ及びそれをコードする核酸を提供する。

Description

ＤＮＡシーケンシング時代の前に科学的に不明であった経路の例である、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は現在、細菌及び古細菌にファージ及びウイルスに対する後天的免疫を付与することが理解されている。過去数十年にわたる集中的研究は、この系の生化学を明らかにした。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの取得、標的化、及び切断に関与するＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質をそれらの標的に誘導する短いスペーサー配列に隣接する直接反復を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなる。クラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、ＲＮＡに結合した単一のＣａｓタンパク質が、標的配列への結合及びその切断に関与する最新版である。これらの最小系のプログラム可能な性質は、ゲノム操作の分野に革命を起こしている汎用技術としてのそれらの使用を促進した。
現在のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術は、培養された細菌からの系に基づいており、単離されていない生物の大多数が未開発のままである。現在まで、ほんのわずかのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が発見されただけである。当該技術分野において、追加のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃａｓタンパク質＋ガイドＲＮＡの組み合わせ）に対する必要性が存在する。
本開示は、本明細書において「ＣａｓＸ」ポリペプチドと称される（「ＣａｓＸタンパク質」とも称される）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼポリペプチド、Ｃａｓｘポリペプチドをコードする核酸、ならびにＣａｓＸポリペプチド及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸポリペプチドは、提供される様々な用途において有用である。
本開示は、ＣａｓＸタンパク質に結合し、それに配列特異性を提供するガイドＲＮＡ（本明細書では「ＣａｓＸガイドＲＮＡ」と称される）、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸガイドＲＮＡは、提供される様々な用途において有用である。
本開示は、古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド及びそれをコードする核酸、ならびにそれらの関連ガイドＲＮＡ（古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）及びそれをコードする核酸を提供する。
２つの天然に存在するＣａｓＸタンパク質配列を示す。 ２つの天然に存在するＣａｓＸタンパク質配列を示す。 ２つの同定された天然に存在するＣａｓＸタンパク質配列のアラインメントを示す。 Ａは、ＣａｓＸについての概略的ドメイン表現を示す。また、ＣａｓＸのホモログの同定を試みた様々な調査からの結果を示す。また、２つの異なる種から同定されたＣａｓＸを含有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分を示す。 Ｂは、ＣａｓＸについての概略的ドメイン表現を示す。また、ＣａｓＸのホモログの同定を試みた様々な調査からの結果を示す。また、２つの異なる種から同定されたＣａｓＸを含有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分を示す。 Ａ及びＢは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現されたＣａｓＸによるプラスミド干渉を実証するために行われた実験を示す。 Ｃは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現されたＣａｓＸによるプラスミド干渉を実証するために行われた実験を示す。 Ａは、ＣａｓＸのＰＡＭ配列を決定するために行われた実験（ＣａｓＸによるＰＡＭ依存性プラスミド干渉）を示す。 Ｂ及びＣは、ＣａｓＸのＰＡＭ配列を決定するために行われた実験（ＣａｓＸによるＰＡＭ依存性プラスミド干渉）を示す。 Ａ及びＢは、ＣａｓＸが、二重誘導型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクター複合体であることを決定するために行われた実験を示す。 Ｃは、ＣａｓＸが、二重誘導型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクター複合体であることを決定するために行われた実験を示す。 ＣａｓＸ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ干渉の概略図を提示する。 ＣａｓＸを使用したヒト細胞中の編集を実証するための一実施形態についての実験設計の概略図を提示する。 ＣａｓＸの組み換え発現及び精製を示すデータを提示する。 切断活性について様々な異なるｔｒａｃｒＲＮＡ配列（異なる配列長）を使用したデータを提示する。 室温対３７℃でのＣａｓＸ機能に関するデータを提示する。 Ａ及びＢは、古細菌Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系（ＡＲＭＡＮ−１ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系）に関する情報を提示する。 Ｃは、古細菌Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系（ＡＲＭＡＮ−１ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系）に関する情報を提示する。 Ｄ及びＥは、古細菌Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系（ＡＲＭＡＮ−１ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系）に関する情報を提示する。 古細菌Ｃａｓ９タンパク質（それぞれＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４、配列番号７１及び７２）の例を提示する。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ）のＤ１０及びＨ８４０に対応する触媒残基は、太字にされ、下線が引かれている。 古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９）と共に使用され得る二重ガイド（上パネル）（上はＲＮＡ配列番号７３、下はＲＮＡ配列番号７７）及び単一ガイド（下パネル）（配列番号７９）フォーマットの例を提示する。 古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９）と共に使用され得る二重ガイド（上パネル）（上はＲＮＡ配列番号７３、下はＲＮＡ配列番号７７）及び単一ガイド（下パネル）（配列番号７９）フォーマットの例を提示する。 古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９）と共に使用され得る二重ガイド（上パネル）（上はＲＮＡ配列番号７４、下はＲＮＡ配列番号７８）及び単一ガイド（下パネル）（配列番号８０）フォーマットの例を提示する。 ２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質を提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 （ｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質を有する２つの新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のアラインメント、（ｉｉ）ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９タンパク質、ならびに構造が解明されている、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ Ｃａｓ９に対する未培養細菌からの２つの密接に関係するＣａｓ９タンパク質のアラインメントを提示する。 Ａ及びＢは、未培養生物からの新規同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提示する。Ａは、Ｈｕｇら３２のデータに基づく、すべての細菌及び古細菌中の代表的なものが単離された、また単離されていない主要な系統の比を示す。これらの結果は、これらのドメインにおいて大規模であるが、未だほとんど調査されていない生物学を強調する。古細菌Ｃａｓ９及び新規ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹは、代表的なものが単離されていない系統において排他的に見出された。Ｂは、新たに発見されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子座組織を示す。 Ａ及びＢは、ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの多様性及びＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列の同定を提示する。Ａは、異なる１５ＡＭＤ試料から再構成されたＣＲＩＳＰＲアレイを示す。白色の四角は、反復を示し、色付きの菱形は、スペーサーを示す（同一のスペーサーは、同様に着色され、固有のスペーサーは黒色である）。アレイの保存領域が強調されている（右側）。最近取得されたスペーサーの多様性（左側）は、系が活性であることを示す。リードデータからのＣＲＩＳＰＲ断片も含む分析は、図２５に提示される。Ｂでは、ＡＭＤメタゲノムデータから再構成された単一の推定ウイルスコンティグは、ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイからの５６プロトスペーサー（赤色の垂直棒）を含有する。 Ｃでは、配列分析は、非標的鎖上のプロトスペーサーの下流にある保存された「ＮＧＧ」ＰＡＭモチーフを明らかにした。 Ａ及びＢは、ＣａｓＸが、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプログラム可能なＤＮＡ干渉を媒介することを示すデータを提示する。Ａでは、ＣａｓＸプラスミド干渉アッセイの図最小ＣａｓＸ遺伝子座を発現するＥ．ｃｏｌｉは、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の配列に一致するスペーサーを含有するプラスミド（標的）または非一致スペーサーを含有するプラスミド（非標的）で形質転換される。形質転換された後、培養物を播種し、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を定量化する。Ｂは、プランクトミセスＣａｓＸ遺伝子座標的化スペーサー１（ｓＸ．１）を発現し、特定された標的で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの段階希釈（ｓＸ１、ＣａｓＸスペーサー１；ｓＸ２、ＣａｓＸスペーサー２；ＮＴ、非標的）を示す。 Ｃ及びＤは、ＣａｓＸが、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプログラム可能なＤＮＡ干渉を媒介することを示すデータを提示する。Ｃは、デルタプロテオバクテリアＣａｓＸによるプラスミド干渉を示す。実験は、三連で行った。平均±標準偏差を示す。Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたプランクトミセスＣａｓＸ遺伝子座についてのＰＡＭ枯渇アッセイを示す。対照ライブラリと比較して３０倍より多く枯渇したＰＡＭ配列を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏを生成した。 Ａ〜Ｃは、ＣａｓＸが二重誘導型ＣＲＩＳＰＲ複合体であることを示すデータを提示する。Ａは、下に図示されるＣａｓＸ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対する環境ＲＮＡ配列（メタトランスクリプトームデータ）のマッピング（赤色の矢印、推定ｔｒａｃｒＲＮＡ；白色の四角、反復配列；緑色の菱形、スペーサー配列）を示す。挿入図は、第１の反復及びスペーサーの詳細図を示す。Ｂは、ＣａｓＸ二本鎖ＤＮＡ干渉の図を示す。ＲＮＡ処理の部位は、黒色の矢印で示される。Ｃは、ＣａｓＸ遺伝子座からノックアウトされた推定ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡ単独、短縮したｓｇＲＮＡ、または全長ｓｇＲＮＡと同時発現したＣａｓＸを用いたプラスミド干渉アッセイの結果（Ｔ、標的；ＮＴ、非標的）を示す。実験は、三連で行った。平均±標準偏差を示す。 Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣａｓＹ遺伝子座の発現が、ＤＮＡ干渉に十分であることを示すデータを提示し、ＣａｓＹ遺伝子座及び隣接タンパク質の図を示す。 Ｂ及びＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣａｓＹ遺伝子座の発現が、ＤＮＡ干渉に十分であることを示すデータを提示し、Ｂは、対照ライブラリに対してＣａｓＹが３倍より多く枯渇した５′ＰＡＭ配列のＷｅｂＬｏｇｏ。ｃ、ＣａｓＹ．１を発現し、示されたＰＡＭを含有する標的で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉによるプラスミド干渉を示す。実験は、三連で行った。平均±標準偏差を示す。 Ａ及びＢは、既知の系の文脈における新たに同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを提示する。Ａは、ユニバーサルＣａｓ１タンパク質の簡易な系統樹を示す。ＣＲＩＳＰＲ型の既知の系は、くさびと枝の上に記され、新たに記載された系は太線である。詳細なＣａｓ１系統発生は、捕捉データ２に提示される。Ｂは、ＩＩ−Ｂ型遺伝子座とＩＩ−Ｃ型遺伝子座との間の組み換えの結果として古細菌ＩＩ型系を生じた提案された進化的シナリオを示す。 ＡＲＭＡＮ−４からの古細菌Ｃａｓ９が、退化ＣＲＩＳＰＲアレイを有する多くのコンティグ上で見出されることを提示する。ＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９は、１６の異なるコンティグ上で濃赤色で強調される。推定ドメインまたは機能を有するタンパク質は標識されているが、仮想タンパク質は標識されていない。１５のコンティグは、２つの退化直接反復（１つのｂｐミスマッチ）及び単一の保存されたスペーサーを含有する。残りのコンティグは、１つのみの直接反復を含有する。ＡＲＭＡＮ−１とは異なり、ＡＲＭＡＮ−４中のＣａｓ９に隣接した追加のＣａｓタンパク質は見出されない。 ＡＲＭＡＮ−４からの古細菌Ｃａｓ９が、退化ＣＲＩＳＰＲアレイを有する多くのコンティグ上で見出されることを提示する。ＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９は、１６の異なるコンティグ上で濃赤色で強調される。推定ドメインまたは機能を有するタンパク質は標識されているが、仮想タンパク質は標識されていない。１５のコンティグは、２つの退化直接反復（１つのｂｐミスマッチ）及び単一の保存されたスペーサーを含有する。残りのコンティグは、１つのみの直接反復を含有する。ＡＲＭＡＮ−１とは異なり、ＡＲＭＡＮ−４中のＣａｓ９に隣接した追加のＣａｓタンパク質は見出されない。 ＡＲＭＡＮ−４からの古細菌Ｃａｓ９が、退化ＣＲＩＳＰＲアレイを有する多くのコンティグ上で見出されることを提示する。ＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９は、１６の異なるコンティグ上で濃赤色で強調される。推定ドメインまたは機能を有するタンパク質は標識されているが、仮想タンパク質は標識されていない。１５のコンティグは、２つの退化直接反復（１つのｂｐミスマッチ）及び単一の保存されたスペーサーを含有する。残りのコンティグは、１つのみの直接反復を含有する。ＡＲＭＡＮ−１とは異なり、ＡＲＭＡＮ−４中のＣａｓ９に隣接した追加のＣａｓタンパク質は見出されない。 ＡＲＭＡＮ−４からの古細菌Ｃａｓ９が、退化ＣＲＩＳＰＲアレイを有する多くのコンティグ上で見出されることを提示する。ＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９は、１６の異なるコンティグ上で濃赤色で強調される。推定ドメインまたは機能を有するタンパク質は標識されているが、仮想タンパク質は標識されていない。１５のコンティグは、２つの退化直接反復（１つのｂｐミスマッチ）及び単一の保存されたスペーサーを含有する。残りのコンティグは、１つのみの直接反復を含有する。ＡＲＭＡＮ−１とは異なり、ＡＲＭＡＮ−４中のＣａｓ９に隣接した追加のＣａｓタンパク質は見出されない。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイの完全再構成を提示する。組み立てられた参照配列、ならびに短ＤＮＡリードから再構成されたアレイセグメントを含む、ＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有のスペーサーは、黒色で着色されている）。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、左側の多様なスペーサーは、最近の取得によるものである。 Ａ及びＢは、ＡＲＭＡＮ−１スペーサーが、古細菌コミュニティメンバーのゲノムにマップすることを示す。Ａでは、ＡＲＭＡＮ−１からのプロトスペーサー（赤色の矢印）は、同じ環境からのナノ古細菌であるＡＲＭＡＮ−２のゲノムにマップする。６つのプロトスペーサーは、両側に２つの長い末端反復（ＬＴＲ）を有するゲノムの部分に固有にマップし、２つの追加のプロトスペーサーは、ＬＴＲ内に完全に一致する（青色及び緑色）。この領域は、トランスポゾンである可能性があり、ＡＲＭＡＮ−１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、この要素の可動化を抑制することにおいて役割を果たすことを示唆する。Ｂでは、プロトスペーサーはまた、ＡＲＭＡＮ生物と同じ試料中で見出されるＲｉｃｈｍｏｎｄ Ｍｉｎｅ生態系の別のメンバーである、サーモプラズマ目古細菌（Ｉ−プラズマ）にマップする。プロトスペーサーは、短い仮想タンパク質をコードするゲノムの領域内でクラスタ化し、これもまた可動要素を表し得ることを示唆する。 Ａは、ＡＲＭＡＮ−１ ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの予測された二次構造を提示する。Ａでは、ＣＲＩＳＰＲ反復及びｔｒａｃｒＲＮＡ抗反復は、黒色で示されるが、スペーサー由来の配列は、一連の緑色のＮとして示される。遺伝子座から明らかな終結シグナルを予測することはできないため、３つの異なるｔｒａｃｒＲＮＡの長さを、それらの二次構造６９、１０４、及び１７９（それぞれ赤色、青色、及びピンク色）に基づいて試験した。 Ｂは、ＡＲＭＡＮ−１ ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの予測された二次構造を提示する。Ｂは、Ａにおける二重ガイドに対応する操作された単一ガイドＲＮＡを示す。 Ｃ〜Ｅは、ＡＲＭＡＮ−１ ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの予測された二次構造を提示する。Ｃは、ｃ、ｔｒａｃｒＲＮＡの３′端部に２つの異なるヘアピン（７５及び１２２）を有するＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９の二重ガイドを示す。Ｄは、Ｃにおける二重ガイドに対応する操作された単一ガイドＲＮＡを示す。Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉインビボ標的アッセイにおいて試験された条件を示す。 Ａ及びＢは、インビトロ生化学研究のための精製概要を提示する。Ａでは、ＡＲＭＡＮ−１（ＡＲ１）及びＡＲＭＡＮ−４（ＡＲ４）Ｃａｓ９は、補足資料において概説される様々な条件下で発現され、精製された。青色の四角で囲まれたタンパク質は、インビトロで切断活性について試験した。Ｂでは、ＡＲ１−Ｃａｓ９及びＡＲ４−Ｃａｓ９精製の分画を、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。 既知のタンパク質と比較して新たに同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提示する。以下の検索に基づく既知のタンパク質に対するＣａｓＸ及びＣａｓＹの類似性を示す。（１）ＮＣＢＩの非冗長（ＮＲ）タンパク質データベースに対するＢｌａｓｔ検索、（２）すべての既知のタンパク質のＨＭＭデータベースに対する隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）検索、及び（３）ＨＨｐｒｅｄ３０を使用する遠隔ホモロジー検索である。 Ａ及びＢは、ＣａｓＸによるプログラムされたＤＮＡ干渉に関するデータを提示する。Ａは、図２０のＣから続く、ＣａｓＸ２（プランクトミセス）及びＣａｓＸ１（デルタプロテオバクテリア）についてのプラスミド干渉アッセイ（ｓＸ１、ＣａｓＸスペーサー１；ｓＸ２、ＣａｓＸスペーサー２；ＮＴ、非標的）を示す。実験は、三連で行った。平均±標準偏差を示す。Ｂは、図２０のＢから続く、ＣａｓＸ遺伝子座を発現し、特定された標的で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの段階希釈を示す。 Ｃは、ＣａｓＸによるプログラムされたＤＮＡ干渉に関するデータを提示する。Ｃは、デルタプロテオバクテリアＣａｓＸについてのＰＡＭ枯渇アッセイを示す。対照ライブラリと比較して示されたＰＡＭ枯渇値閾値（ＰＤＶＴ）よりも多く枯渇したＰＡＭ配列を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏを生成した。 Ｄは、ＣａｓＸによるプログラムされたＤＮＡ干渉に関するデータを提示する。Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたプランクトミセスＣａｓＸについてのＰＡＭ枯渇アッセイを示す。対照ライブラリと比較して示されたＰＡＭ枯渇値閾値（ＰＤＶＴ）よりも多く枯渇したＰＡＭ配列を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏを生成した。 Ｅ及びＦは、ＣａｓＸによるプログラムされたＤＮＡ干渉に関するデータを提示する。Ｅは、ＣａｓＸ．１についてのノーザンブロットプローブの位置を示す図であり、Ｆは、ＣａｓＸ．１遺伝子座を発現するＥ．ｃｏｌｉから抽出された総ＲＮＡ中のＣａｓＸ．１ ｔｒａｃｒＲＮＡについてのノーザンブロットを示す。 Ｃａｓ９ホモログの進化樹を提示する。Ｃａｓ９タンパク質の最大尤度系統樹。それらの型に基づいて着色された以前に記載された系を示す（ＩＩ−Ａは青色、ＩＩ−Ｂは緑色、及びＩＩ−Ｃは紫色）。未培養細菌からの２つの新たに記載された細菌Ｃａｓ９と共に、ＩＩ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有するクラスタである、古細菌Ｃａｓ９。 ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４からのＣａｓ９についてアッセイされた切断条件の表を提示する。
本明細書において使用される場合、「異種」とは、それぞれ天然の核酸またはタンパク質中に見出されないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。例えば、ＣａｓＸポリペプチドに対して、異種ポリペプチドは、ＣａｓＸポリペプチド以外のタンパク質からのアミノ酸配列を含む。ある場合には、１つの種からのＣａｓＸタンパク質の部分が、異なる種からのＣａｓＸタンパク質の部分に融合される。各種からのＣａｓＸ配列は、したがって、互いに対して異種であるとみなされ得る。別の例として、ＣａｓＸタンパク質（例えば、ｄＣａｓＸタンパク質）は、非ＣａｓＸタンパク質（例えば、ヒストンデアセチラーゼ）からの活性ドメインに融合され得、活性ドメインの配列は、異種ポリペプチドであるとみなされ得る（それはＣａｓＸタンパク質に対して異種である）。
本明細書で同義に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。このため、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能である場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で同義に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは遺伝的にコードされた、また非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有しない異種及び同種リーダー配列との融合；免疫学的にタグ付けされたタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「天然に存在する」という用語は、核酸、タンパク質、細胞、または生物に適用される場合、天然に見出される核酸、細胞、タンパク質、または生物を指す。
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境内にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明することを意味する。単離された遺伝的に修飾された宿主細胞は、遺伝的に修飾された宿主細胞の混合集団中に存在し得る。
本明細書において使用される場合、「外因性核酸」という用語は、自然界の所与の細菌、生物、もしくは細胞において通常もしくは天然に見出されない、及び／またはそれによって産生されない核酸を指す。本明細書において使用される場合、「内因性核酸」という用語は、自然界の所与の細菌、生物、または細胞において通常見出されない、及び／またはそれによって産生される核酸を指す。「内因性核酸」はまた、「天然核酸」または所与の細菌、生物、または細胞に「天然」である核酸とも称される。
本明細書において使用される場合、「組み換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然分類系において見出される内因性核酸から区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物もたらすクローニング、制限、及び／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物である。一般に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てて、細胞または無細胞転写及び翻訳系に含まれる組み換え転写単位から発現可能な合成核酸を提供することができる。そのような配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する、内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組み換え遺伝子または転写単位の形成において使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、そのような配列が、コード領域の操作または発現に干渉しないオープンリーディングフレームから５′または３′に存在し得、実際に様々な機序による所望の産物の生産を変調するように作用し得る（下記の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。
このため、例えば、「組み換え」ポリヌクレオチドまたは「組み換え」核酸という用語は、天然に存在しない、例えば、ヒト介入を通して、配列の２つの他の方法で分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、核酸の単離されたセグメントの化学合成手段または人工的な操作のいずれかによって、例えば、遺伝子工学的技法によって達成される。これは通常、典型的に配列認識部位を導入または除去する一方で、コドンを、それをコードする冗長コドンまたは保存アミノ酸と置き換えるために行われる。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に接合して、所望の機能の組み合わせを生成するために行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、核酸の単離されたセグメントの化学合成手段または人工的な操作のいずれかによって、例えば、遺伝子工学的技法によって達成される。
同様に、「組み換え」ポリペプチドという用語は、天然に存在しない、例えば、ヒト介入を通して、アミノ配列の２つの他の方法で分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチドを指す。このため、例えば、異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは、組み換えである。
「構築物」または「ベクター」とは、特異的ヌクレオチド配列（複数可）の発現及び／もしくは伝播を目的として生成された、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築において使用される組み換え核酸、一般に組み換えＤＮＡを意味する。
本明細書で同義に使用される「ＤＮＡ調節配列」「制御要素」、及び「調節要素」は、宿主細胞中のコード配列の発現及び／またはコードされたポリペプチドの産生を提供する及び／または調節する、転写及び翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等を指す。
「形質転換」という用語は、本明細書では「遺伝的修飾」と同義に使用され、細胞中に新たな核酸（細胞に外因性のＤＮＡ）を導入した後に細胞中で誘導された永久または一過性の遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「修飾」）は、宿主細胞のゲノム中への新たな核酸の組み込み、またはエピソーム要素としての新たな核酸の一過性もしくは安定した維持のいずれかによって達成され得る。細胞が真核細胞である場合、永久的遺伝的変化は、一般に細胞のゲノム中への新たなＤＮＡの導入によって達成される。原核細胞において、永久変更は、染色体中に、またはプラスミド及び発現ベクターなどの染色体外要素を介して導入され得、これらは組み換え宿主細胞中のそれらの維持を助けるために１つ以上の選択可能なマーカーを含有し得る。遺伝的修飾の好適な方法としては、ウイルス感染、形質移入、共役、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション等が挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類、及び形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法に関する一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５に見出され得る。
「動作可能に連結した」は、並立を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターは、当該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結される。本明細書において使用される場合、「異種プロモーター」及び「異種制御領域」という用語は、自然界の特定の核酸に通常は関連しないプロモーター及び他の制御領域を指す。例えば、コード領域に対して異種の「転写制御領域」は、自然界のコード領域に通常は関連しない転写制御領域である。
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞、または単細胞実態として培養された多細胞生物からの細胞（例えば、細胞株）を示し、真核または原核細胞は、核酸のレシピエント（例えば、発現ベクター）であり得るか、または核酸のレシピエントとして使用されており、核酸によって遺伝的に修飾された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、不慮の、または意図的な突然変異に起因して、形態において、またはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において元の親と必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。「組み換え宿主細胞」（「遺伝的に修飾された宿主細胞」とも称される）は、異種核酸、例えば、発現ベクターが中に導入された宿主細胞である。例えば、対象の原核宿主細胞は、異種核酸、例えば、その原核宿主細胞に対して外来である（原核宿主細胞中で通常は天然に見出されない）外因性核酸、または原核宿主細胞中で通常は見出されない組み換え核酸の好適な原核宿主細胞への導入によって遺伝的に修飾された原核宿主細胞（例えば、細菌）であり、対象の真核宿主細胞は、異種核酸、例えば、その真核宿主細胞に対して外来である外因性核酸、または真核宿主細胞中で通常は見出されない組み換え核酸の好適な真核宿主細胞への導入によって遺伝的に修飾された真核宿主細胞である。
「保存アミノ酸置換」という用語は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質中の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」のパーセントを有し、整列したときに、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが、それら２つの配列を比較したときに同一であり、同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性を複数の異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを用いて、配列を整列させることができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０を参照されたい。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．に記載されている。配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを許容する一種のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント方法を使用するＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患もしくは症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、かつ／または疾患及び／もしくはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書において使用される場合、「治療」は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
本明細書において同義に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、個々の生物、例えば、マウス、サル、ヒト、哺乳類家畜動物、哺乳類スポーツ動物、及び哺乳類ペットを含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、これから説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物が引用されるものに関して方法及び／または物質を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書と添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上、明らかに別段に解される場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の言及物が含まれることに留意しなければならない。このため、例えば、「ＣａｓＸポリペプチド」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「ガイドＲＮＡ」への言及は、１つ以上のガイドＲＮＡ及び当業者に既知のそれらの同等物への言及を含む等である。特許請求の範囲が、いかなる任意の要素も除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。
明確にするために別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせで提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別個に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個々にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
本開示は、本明細書において「ＣａｓＸ」ポリペプチドと称される（「ＣａｓＸタンパク質」とも称される）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼポリペプチド、Ｃａｓｘポリペプチドをコードする核酸、ならびにＣａｓＸポリペプチド及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸポリペプチドは、提供される様々な用途において有用である。
本開示は、ＣａｓＸタンパク質に結合し、それに配列特異性を提供するガイドＲＮＡ（本明細書では「ＣａｓＸガイドＲＮＡ」と称される）、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸を含む修飾された宿主細胞を提供する。ＣａｓＸガイドＲＮＡは、提供される様々な用途において有用である。
本開示は、古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド及びそれをコードする核酸、ならびにそれらの関連ガイドＲＮＡ（古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）及びそれをコードする核酸を提供する。
組成物
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳＸタンパク質及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣａｓＸタンパク質）は、対応するガイドＲＮＡ（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ）と相互作用して（に結合して）、標的核酸分子内のガイドＲＮＡと標的配列との間の塩基対合を介して標的核酸中の特定の部位に標的される、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。このため、ＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸガイドＲＮＡとの複合体を形成し、ガイドＲＮＡは、ガイド配列を介してＲＮＰ複合体に配列特異性を提供する。複合体のＣａｓＸタンパク質は、部位特異的活性を提供する。換言すれば、ＣａｓＸタンパク質は、ガイドＲＮＡとのその会合により、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。
本開示は、ＣａｓＸポリペプチド（及び／またはＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸）を含む組成物を提供する（例えば、ＣａｓＸポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質等であり得る）。本開示は、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む組成物を提供する（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡは、二重または単一ガイドフォーマットであり得る）。本開示は、（ａ）ＣａｓＸポリペプチド（及び／またはＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸）（例えば、ＣａｓＸポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質等であり得る）及び（ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ（及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸）（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡは、二重または単一ガイドフォーマットであり得る）を含む組成物を提供する。本開示は、以下を含む核酸／タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を提供する。（ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド（例えば、ＣａｓＸポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ニッカーゼＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質等であり得る）及び（ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡは、二重または単一ガイドフォーマットであり得る）。
ＣａｓＸタンパク質
ＣａｓＸポリペプチド（この用語は、「ＣａｓＸタンパク質」という用語と同義に使用される）は、標的核酸及び／または標的核酸に関連したポリペプチドに結合及び／または修飾し得る（例えば、切断、ニック、メチラート、デメチラート等）（例えば、ヒストンテールのメチル化またはアセチル化）（例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、活性を有する融合パートナーを含み、またある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を提供する）。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、天然に存在するタンパク質である（例えば、原核細胞中で天然に存在する）。他の場合には、ＣａｓＸタンパク質は、天然に存在するポリペプチドではない（例えば、ＣａｓＸタンパク質は、変異形ＣａｓＸタンパク質、キメラタンパク質等である）。
所与のタンパク質がＣａｓＸガイドＲＮＡと相互作用するかどうかを決定するアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合について試験する任意の簡便な結合アッセイであり得る。好適な結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）は、当業者に既知となる（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及びタンパク質を標的核酸に付加することを含むアッセイ）。タンパク質が活性を有するかどうかを決定する（例えば、タンパク質が、標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性及び／またはいくらかの異種活性を有するかどうかを決定する）アッセイは、任意の簡便なアッセイ（例えば、核酸切断について試験する任意の簡便な核酸切断アッセイ）であり得る。好適なアッセイ（例えば、切断アッセイ）は、当業者に既知となる。
天然に存在するＣａｓＸタンパク質は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の特定の配列において二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする、関連ガイドＲＮＡによって提供される。天然に存在するガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされたｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、対象の方法及び／または組成物のＣａｓＸタンパク質は、天然に存在する（野生型）タンパク質である（またはそれに由来する）。天然に存在するＣａｓＸタンパク質の例は、図１に示され、配列番号１〜２として記載されている。天然に存在するＣａｓＸタンパク質の例は、図１に示され、配列番号１〜３として記載されている。２つの天然に存在するＣａｓＸタンパク質のアラインメントは、図２に提示される（「ｇｗａ２」は、ＣａｓＸ１であり、「ｇｗｃ２」は、ＣａｓＸ２である）。シーケンシングデータから（デルタプロテオバクテリア（ｇｗａ２足場）から及びプランクトミセス（ｇｗｃ２足場）から）組み立てられたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分的ＤＮＡ足場は、それぞれ配列番号５１及び５２として記載されている。この新たに発見されたタンパク質（ＣａｓＸ）は、以前に同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して短く、またこのため、代替としてのこのタンパク質の使用が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が比較的短いという利点を提供することに留意することが重要である。これは、例えば、ＣａｓＸタンパク質をコードする核酸が望ましい場合、例えば、研究及び／または臨床用途のために真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞、インビトロ、エクスビボ、インビボ）などの細胞に送達するために、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を用いる状況において有用である。また本明細書において、ＣａｓＸ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を内包する細菌が、低温（例えば、１０〜１７℃）で収集された環境試料中に存在したことも留意される。このため、ＣａｓＸは、低温（例えば、１０〜１４℃、１０〜１７℃、１０〜２０℃）で良好に（例えば、現在までに発見された他のＣａｓエンドヌクレアーゼよりも良好に）機能することができると予想される。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、配列が（例えば、以下に記載されるアミノ酸位置において）タンパク質の天然に存在する触媒能を低減するアミノ酸置換（例えば、１、２、または３アミノ酸置換）を含むことを例外として、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、配列が（例えば、以下に記載されるアミノ酸位置において）タンパク質の天然に存在する触媒能を低減するアミノ酸置換（例えば、１、２、または３アミノ酸置換）を含むことを例外として、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、配列が（例えば、以下に記載されるアミノ酸位置において）タンパク質の天然に存在する触媒能を低減するアミノ酸置換（例えば、１、２、または３アミノ酸置換）を含むことを例外として、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２のうちの１つに記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、配列が（例えば、以下に記載されるアミノ酸位置において）タンパク質の天然に存在する触媒能を低減するアミノ酸置換（例えば、１、２、または３アミノ酸置換）を含むことを例外として、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２のうちのいずれか１つに記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つと９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３のうちの１つに記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、配列が（例えば、以下に記載されるアミノ酸位置において）タンパク質の天然に存在する触媒能を低減するアミノ酸置換（例えば、１、２、または３アミノ酸置換）を含むことを例外として、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３のうちのいずれか１つに記載されるＣａｓＸタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。
ＣａｓＸタンパク質ドメイン
ＣａｓＸタンパク質のドメインを図３に示す。図３の概略図に見られるように（アミノ酸は、ＣａｓＸ１タンパク質（配列番号１）に基づいて付番される）、ＣａｓＸタンパク質は、およそ６５０アミノ酸長（例えば、ＣａｓＸ１については６６３、ＣａｓＸ２については６５０）のＮ末端ドメインと、ＣａｓＸタンパク質の一次アミノ酸配列に関して連続しないが、一旦タンパク質が産生され、折り畳まれるとＲｕｖＣドメインを形成する３つの部分的ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではサブドメインとも称される、ＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含むＣ末端ドメインとを含む。このため、ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）Ｎ末端ドメインを有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、スプリットＲｕｖＣドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）に対するＮ末端である、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）アミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応する配列番号２のアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応する配列番号３のアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６５０）と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６５０）と、スプリットＲｕｖ Ｃドメイン（例えば、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）を含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含む。
いくつかの実施形態では、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質のスプリットＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインよりも大きいＲｕｖＣ−ＩＩとＲｕｖＣ−ＩＩＩとの間の領域を含む。例えば、ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比は、１．１以上（例えば、１．２）である。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比は、１超である。）。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比は、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）である。
いくつかの実施形態では（対象の組成物及び／または方法のＣａｓＸタンパク質について）、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比は、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、または１．４以下）である。例えば、ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比は、１．５以下（例えば、１．４以下）である。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比は、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、または１．２〜１．４）の範囲である。
ある場合には（対象の組成物及び／または方法のＣａｓＸタンパク質について）、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比は、１超である。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比は、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）である。
ある場合には（対象の組成物及び／または方法のＣａｓＸタンパク質について）、ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域は、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、または８７アミノ酸長）である。例えば、ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域は、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、または８７アミノ酸長）である。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域は、少なくとも８５アミノ酸長である。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域は、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、または８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。ある場合には、ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域は、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、または８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＮ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸１〜６６３として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６６３に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸１〜６５０）と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを含む、第２のアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有するＮ末端ドメインを有する（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）第１のアミノ酸配列と、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを有するスプリットＲｕｖＣドメインを有する第２のアミノ酸配列（第１に対するＣ末端）とを含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメイン長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、３つの部分的ＲｕｖＣドメインＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩを有するスプリットＲｕｖＣドメインに対するＮ末端である、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）第１のアミノ酸配列を含み、（ｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１．１以上（例えば、１．２）であるか、（ｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、２以下（例えば、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、もしくは１．４以下）であるか、（ｖ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１．５以下（例えば、１．４以下）であるか、（ｖｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインの長さの比が、１〜２（例えば、１．１〜２、１．２〜２、１〜１．８、１．１〜１．８、１．２〜１．８、１〜１．６、１．１〜１．６、１．２〜１．６、１〜１４、１．１〜１．４、もしくは１．２〜１．４）の範囲であるか、（ｖｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超であるか、（ｖｉｉｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインの長さに対するＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域の長さの比が、１超及び１〜１．３（例えば、１〜１．２）であるか、（ｉｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７３アミノ酸長（例えば、少なくとも７５、７７、８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも７８アミノ酸長（例えば、少なくとも８０、８５、もしくは８７アミノ酸長）であるか、（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、少なくとも８５アミノ酸長であるか、（ｘ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、７５〜１００アミノ酸の範囲（例えば、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８３〜１００、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜１００、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有するか、または（ｘｉ）ＲｕｖＣ−ＩＩサブドメインとＲｕｖＣ−ＩＩＩサブドメインとの間の領域が、８０〜９５アミノ酸の範囲（例えば、８０〜９０、８０〜８８、８３〜９５、８３〜９０、８３〜８８、８５〜９５、８５〜９０、もしくは８５〜８８アミノ酸の範囲）の長さを有する。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６を有するアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応する配列番号２のアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応する配列番号３のアミノ酸配列を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）とを含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１及び２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列（配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおいてＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応するアミノ酸配（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を含む。
ある場合には、（対象の組成物及び／または方法の）ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）とを含む。例えば、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１〜３として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のうちのいずれか１つのＣ末端ドメイン（例えば、図３、パネルＡにおけるＣａｓＸ１のアミノ酸６６４〜９８６として示されるドメイン）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０、６００〜７５０、６４０〜７５０、６５０〜７５０、５００〜７００、５５０〜７００、６００〜７００、６４０〜７００、６５０〜７００、５００〜６８０、５５０〜６８０、６００〜６８０、６４０〜６８０、６５０〜６８０、５００〜６７０、５５０〜６７０、６００〜６７０、６４０〜６７０、または６５０〜６７０アミノ酸）の範囲の長さを有する第１のアミノ酸配列（Ｎ末端ドメイン）（例えば、ＮＬＳ及び／または触媒能のあるドメインなどのいかなる融合異種配列も含まない）と、配列番号１として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６６４〜９８６に対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号２として記載されるＣａｓＸタンパク質配列のアミノ酸６５１〜９７８）を有する、第１のアミノ酸配列に対してＣ末端に位置付けられた第２のアミノ酸配列とを含む。
ＣａｓＸ変異形
変異形ＣａｓＸタンパク質は、対応する野生型ＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列と比較したときに、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。二本鎖標的核酸の一方の鎖を切断するが、もう一方は切断しないＣａｓＸタンパク質は、本明細書では「ニッカーゼ」（例えば、「ニッカーゼＣａｓＸ」）と称される。実質的にヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓＸタンパク質は、本明細書では不活性型ＣａｓＸタンパク質（「ｄＣａｓＸ」）と称される（但し、ヌクレアーゼ活性は、キメラＣａｓＸタンパク質の場合、以下でさらに詳述される異種ポリペプチド−融合パートナーによって提供され得る）。本明細書に記載されるＣａｓＸ変異形タンパク質（例えば、ニッカーゼＣａｓＸ、ｄＣａｓＸ、キメラＣａｓＸ）のうちのいずれかについて、ＣａｓＸ変異形は、上記と同じパラメータ（例えば、存在するドメイン、同一性のパーセント等）を有するＣａｓＸタンパク質配列を含み得る。
変異形−触媒能
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、例えば、天然に存在する触媒能のある配列に対して突然変異された変異形ＣａｓＸタンパク質であり、対応する天然に存在する配列と比較したときに、低減された切断活性を呈する（例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、または３０％以下の切断活性を呈する）。ある場合には、そのような変異形ＣａｓＸタンパク質は、触媒的に「不活性型」タンパク質であり（実質的に切断活性を有しない）、「ｄＣａｓＸ」と称され得る。ある場合には、変異形ＣａｓＸタンパク質は、ニッカーゼである（二本鎖標的核酸、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの一本鎖のみを切断する）。本明細書で詳細に記載されるように、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（ある場合には、野生型切断活性を有するＣａｓＸタンパク質、またある場合には、低減した切断活性を有する変異形ＣａｓＸ、例えば、ｄＣａｓＸまたはニッカーゼＣａｓＸ）は、融合タンパク質（キメラＣａｓＸタンパク質）を形成するために関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒能）を有する異種ポリペプチドに融合（共役）される。
ＣａｓＸの保存触媒残基は、ＣａｓＸ１（配列番号１）に従って番号を付けたとき、Ｄ６７２、Ｅ７６９、Ｄ９３５を含み、ＣａｓＸ２（配列番号２）に従って番号を付けたとき、６５９Ｄ、７５６Ｅ、及び９２２Ｄを含む（これらの残基は、図１において下線が引かれている）。（図２のアラインメントにおいて、番号付けは、いずれかのＣａｓＸを追跡しないが、代わりにアラインメント自体を追跡することに留意されたい。このパラグラフにおいて上記の保存残基は、図にマークされ、ＣａｓＸ２は、上の配列（「ｇｗｃ２」）であり、ＣａｓＸ１は、下の配列（「ｇｗａ２」）である）。
このため、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、低減された活性を有し、上記のアミノ酸のうちの１つ以上（または任意のＣａｓＸタンパク質の１つ以上の対応するアミノ酸）は、突然変異される（例えば、アラニンで置換される）。ある場合には、変異形ＣａｓＸタンパク質は、触媒「不活性型」タンパク質であり（触媒能がなく）、「ｄＣａｓＸ」と称される。ｄＣａｓＸタンパク質は、活性を提供する融合パートナーに融合され得、ある場合には、ｄＣａｓＸ（例えば、触媒能を提供するが、真核細胞中で発現されるとき、ＮＬＳを有し得る融合パートナーがないもの）は、標的ＤＮＡに結合することができ、ＲＮＡポリメラーゼを標的ＤＮＡから翻訳するのを遮断することができる。ある場合には、変異形ＣａｓＸタンパク質は、ニッカーゼである（二本鎖標的核酸、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断する）。
変異形−キメラＣａｓＸ（すなわち、融合タンパク質）
上記のように、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（ある場合には、野生型切断活性を有するＣａｓＸタンパク質、またある場合には、低減した切断活性を有する変異形ＣａｓＸ、例えば、ｄＣａｓＸまたはニッカーゼＣａｓＸ）は、融合タンパク質（キメラＣａｓＸタンパク質）を形成するために関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒能）を有する異種ポリペプチドに融合（共役）される。ＣａｓＸタンパク質が融合され得る異種ポリペプチドは、本明細書では「融合パートナー」と称される。
ある場合には、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を変調する（例えば、転写を阻害する、転写を増加する）ことができる。例えば、ある場合には、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（またはタンパク質からのドメイン）（例えば、転写抑制因子、転写阻害剤タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡに関連したヒストンの変調、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾するものなどのヒストン修飾因子の動員等を介して機能するタンパク質）である。ある場合には、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（またはタンパク質からのドメイン）（例えば、転写活性化因子、転写活性化因子タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡに関連したヒストンの変調、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を修飾するものなどのヒストン修飾因子の動員等を介して機能するタンパク質）である。
ある場合には、キメラＣａｓＸタンパク質は、標的核酸を修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
ある場合には、キメラＣａｓＸタンパク質は、標的核酸に関連したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
転写の増加に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢから）などの転写活性化因子、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメイン及び／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のため）；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１〜５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１等）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３等）；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫ等）；ならびにＤＮＡデメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１等が挙げられるが、これらに限定されない。
転写の減少に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写抑制因子；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のため）等；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、ＲＩＺ１等）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ等）；ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１等）；ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）等）；及び末梢動員要素（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂ等）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある場合には、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）等）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジムスターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性突然変異体などのＧｉｎインベルターゼ、ＧｉｎＨ１０６Ｙ）によってもたらされるものなどのインテグラーゼ活性；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼ等）、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある場合には、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）に関連したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る（標的核酸に関連したタンパク質を修飾する）酵素活性の例としては、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、斑入り３〜９ホモログ１の抑圧因子（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１等、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１〜５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢＯ１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫ等の触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１等によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な融合パートナーの追加の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能なキメラＣａｓＸタンパク質を生成するため）、及び葉緑体移行ペプチドである。好適な葉緑体移行ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号８３）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号８４）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号８５）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８６）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８７）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号８８）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号８９）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号９０）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号９１）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号９２）、及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号９３）。
ある場合には、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド及びｂ）葉緑体移行ペプチドを含む。このため、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ複合体は、葉緑体に対して標的され得る。ある場合には、この標的化は、葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド移行ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長の存在によって達成され得る。細菌源からの染色体導入遺伝子は、発現されたポリペプチドが、植物プラスチド（例えば、葉緑体）内で区画化される場合、発現されたポリペプチドをコードする配列に融合されたＣＴＰ配列をコードする配列を有していなければならない。したがって、葉緑体に対する外因性ポリペプチドの局在は、多くの場合、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、その外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５′領域に動作可能に連結することによって１達成される。ＣＴＰは、プラスチドへの転位中の処理ステップにおいて除去される。しかしながら、処理効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのＮＨ２末端における付近の配列によって影響され得る。記載された葉緑体に対して標的化するための他のオプションは、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（米国特許第７，０２２，８９６号、ＷＯ９７／４１２２８）、エンドウグルタチオン還元酵素シグナル配列（ＷＯ９７／４１２２８）、及びＵＳ２００９０２９８６１に記載されるＣＴＰである。
ある場合には、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、及びｂ）エンドソーム脱出ペプチドを含み得る。ある場合には、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号９４）を含み、各Ｘは、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。ある場合には、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号９５）を含む。
Ｃａｓ９、亜鉛フィンガー、及び／またはＴＡＬＥタンパク質との融合の文脈において（部位特異的標的核酸修飾、転写の変調、及び／または標的タンパク質修飾、例えば、ヒストン修飾のために）使用される上記融合パートナー（及びその他）のうちのいくつかの例については、例えば、Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００７ Ｊｕｌ １８；１２９（２８）：８６７６−７、Ｒｉｖｅｎｂａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１２ Ａｐｒ；７（４）：３５０−６０；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊｕｌ ８；４４（１２）：５６１５−２８、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｊｕｌ １８；１５４（２）：４４２−５１、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５ Ｍａｙ；１２（５）：４０１−３、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；３１（１２）：１１３３−６、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｍａｙ；３３（５）：５１０−７、Ｇｏｒｄｌｅｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９ Ｍａｒ ３１；１０６（１３）：５０５３−８、Ａｋｏｐｉａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｌ ２２；１００（１５）：８６８８−９１、Ｔａｎ ｅｔ．，ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；８０（４）：１９３９−４８、Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｏｃｔ １４；１００（２１）：１１９９７−２００２、Ｐａｐｗｏｒｔｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｆｅｂ １８；１００（４）：１６２１−６、Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｊａｎ ５；７（１）：１７１−９２、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８ Ｄｅｃ ８；９５（２５）：１４６２８−３３、Ｓｎｏｗｄｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ ２３；１２（２４）：２１５９−６６、Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｘｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６ Ｍａｙ ３；２：１６００９、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ａｐｒ ２０；５３３（７６０３）：４２０−４、Ｃｈａｉｋｉｎｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ａｕｇ １１、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ａｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｊｕｎ ２３、Ｄｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６ Ｊａｎ ４、Ｐｈａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１３５８：４３−５７、Ｂａｌｂｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５ Ｓｅｐ ８；５（３）：４４８−５９、Ｈａｒａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｎ ９；５：１１２２１、Ｐｉａｔｅｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪ．２０１５ Ｍａｙ；１３（４）：５７８−８９、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ；４２（７）：４３７５−９０、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、及びＭａｅｄｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９７７−９を参照されたい。
追加の好適な異種ポリペプチドとしては、標的核酸の転写及び／または翻訳の増加を直接的及び／または間接的に提供するポリペプチド（例えば、転写活性化因子もしくはその断片、転写活性化因子を動員するタンパク質もしくはその断片、小分子／薬物応答性転写及び／または翻訳調節因子、翻訳調節タンパク質等）が挙げられるが、これらに限定されない。転写の増加または減少を達成する異種ポリペプチドの非限定例としては、転写活性化因子及び転写抑制因子ドメインが挙げられる。そのようなある場合には、キメラＣａｓＸポリペプチドは、ガイド核酸（ガイドＲＮＡ）によって標的核酸中の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、プロモーター（転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）へのＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断する、及び／または局所クロマチン状態を修飾する（標的核酸を修飾する、もしくは標的核酸に関連したポリペプチドを修飾する融合配列が使用される場合）などの遺伝子座特異的調節をもたらす。ある場合には、変化は、一過性である（例えば、転写抑制または活性化）。ある場合には、変化は、遺伝性である（例えば、標的核酸に対して、または標的核酸に関連したタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対して後成的修飾が行われる場合）。
ｓｓＲＮＡ標的核酸を標的化するときに使用するための異種ポリペプチドの非限定例としては、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、延長、及び／または放出因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、Ａ〜Ｉ及び／またはＣ〜Ｕ編集酵素を含む）；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質等が挙げられる（但しこれらに限定されない）。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、またはある場合には、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得る。
対象のキメラＣａｓＸポリペプチドの異種ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡと相互作用可能な任意のドメイン（この開示の目的のために、分子内及び／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループ等の二本鎖ＲＮＡ二体鎖）であり得、一過性または不可逆的、直接的または間接的にかかわらず、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、及びＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン；ＲＮＡ切断を刺激するために関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ−１またはエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ Ｓ１、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、及びＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の変調に関与する（例えば、可能な）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子等の翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ−２、及びＳｔａｒ−ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジン化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＩ Ｄ１及び末端ウリジレートトランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ−Ｄ由来）；ＲＮＡの核保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外搬出に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、及びｈｎＲＮＰ Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低減に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ）；ならびに転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７及びＨＩＶ Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を変調することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子等の翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡのポリウリジン化が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核保持が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外搬出活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングが可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングの刺激が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率の低減が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ならびに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメインを含む群から選択されてもよい。別の好適な異種ポリペプチドは、ＷＯ２０１２０６８６２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されているＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインである。
キメラＣａｓＸポリペプチドの異種ポリペプチドとして（全体でまたはその断片として）使用され得るいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインと共に、モジュール構造化を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びＣ末端ＲＳドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含む。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａｌは、そのＲＲＭドメインを通してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを通してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの代替部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（ｓｓ）の代替使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰ Ａｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠隔部位の使用に変更することができる。そのような因子の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の代替スプライシングを変調するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ−ｘ ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、２つの代替５′スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生して、反対の機能のタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームＢｃｌ−ｘＬは、長寿命の分裂終了細胞中で発現された強力なアポトーシス阻害剤であり、多くのがん細胞中で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームＢｃｌ−ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高いターンオーバー率で細胞中で高レベルで発現される（例えば、リンパ球を発達させる）。２つのＢｃｌ−ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか（例えば、２つの代替５′スプライス部位の間）に位置する複数のｃω要素によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１００７５３０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
さらに好適な融合パートナーとしては、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（またはその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂ等）、タンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１等）が挙げられるが、これらに限定されない。
対象のキメラＣａｓＸポリペプチドに対する様々な追加の好適な異種ポリペプチド（またはその断片）の例としては、以下の出願に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されず（それらの公報は、Ｃａｓ９などの他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに関するが、記載される融合パートナーを代わりにＣａｓＸと共に使用することもできる）、ＰＣＴ特許出願：ＷＯ２０１００７５３０３、ＷＯ２０１２０６８６２７、及びＷＯ２０１３１５５５５５、また例えば、米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（すべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。
ある場合には、異種ポリペプチド（融合パートナー）は、亜細胞性局在を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、亜細胞性局在配列を含む（例えば、核に対して標的するための核局在シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持する配列、例えば、核外搬出配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質中に保持したままにする配列、ミトコンドリアに対して標的するためのミトコンドリア局在シグナル、葉緑体に対して標的するための葉緑体局在シグナル、ＥＲ保持シグナル等）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ融合ポリペプチドは、ＮＬＳを含まないため、タンパク質は、核に対して標的されない（これは、例えば、標的核酸がサイトゾル中に存在するＲＮＡであるときに有利であり得る）。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、追跡及び／または精製を容易にするためのタグを提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能なラベルである）（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＸタンパク質、変異形ＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質（ＣａｓＸ部分は、低減されたヌクレアーゼ活性を有する）、例えば、融合パートナーに融合されたｄＣａｓＸタンパク質等）は、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む（に融合される）（例えば、ある場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）。このため、ある場合には、ＣａｓＸポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。ある場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及び／またはＣ末端またはその付近（例えばその５０アミノ酸内）に位置付けられる。ある場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端またはその付近（例えばその５０アミノ酸内）に位置付けられる。ある場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端またはその付近（例えばその５０アミノ酸内）に位置付けられる。ある場合には、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方またはその付近（例えばそれらの５０アミノ酸内）に位置付けられる。ある場合には、ＮＬＳは、Ｎ末端に位置付けられ、ＮＬＳは、Ｃ末端に位置付けられる。
ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＸタンパク質、変異形ＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、ＣａｓＸ部分が低減したヌクレアーゼ活性を有するキメラＣａｓＸタンパク質、例えば融合パートナーに融合されたｄＣａｓＸタンパク質等）は、１〜１０ＮＬＳ（例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５ＮＬＳ）を含む（に融合される）。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＸタンパク質、変異形ＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、ＣａｓＸ部分が低減したヌクレアーゼ活性を有するキメラＣａｓＸタンパク質、例えば融合パートナーに融合されたｄＣａｓＸタンパク質等）は、２〜５ＮＬＳ（例えば、２〜４または２〜３ＮＬＳ）を含む（に融合される）。
ＮＬＳの非限定例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９６）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号９７）を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号９８）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号９９）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１００）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン−α由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１０１）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１０２）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１０３）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０４）；マウスｃ−ａｂ１ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０５）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１０６）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１０７）；肝炎ウイルスΔ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１０８）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１０９）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１１０）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）糖コルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１１１）に由来するＮＬＳ配列を含む。一般に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核中で検出可能な量のＣａｓＸの蓄積を駆動するのに十分な強度である。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって行われてもよい。例えば、検出可能なマーカーは、ＣａｓＸタンパク質に融合されてもよく、それにより細胞内の位置が可視化され得る。細胞核はまた、細胞から単離されてもよく、次いで、その内容物を、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば免疫組織化学、ウェスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析することができる。核中の蓄積はまた、間接的に決定することができる。
ある場合には、ＣａｓＸ融合ポリペプチドは、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含み、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に付着したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ酸末端に共有結合されている（例えば、野生型ＣａｓＸに連結して融合タンパク質を生成するか、または変異形ＣａｓＸタンパク質、例えば、ｄＣａｓＸ、ニッカーゼＣａｓＸ、またはキメラＣａｓＸタンパク質に連結して融合タンパク質を生成する）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合されている（例えば、野生型ＣａｓＸに連結して融合タンパク質を生成するか、または変異形ＣａｓＸタンパク質、例えば、ｄＣａｓＸ、ニッカーゼＣａｓＸ、またはキメラＣａｓＸタンパク質に連結して融合タンパク質を生成する）。ある場合には、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓＸ融合ポリペプチドに内的に挿入される（すなわち、ＣａｓＸ融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてではない）。ある場合には、対象のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（に共役される、に融合される）。ある場合には、ＰＴＤは、核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば、ある場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。このため、ある場合には、ＣａｓＸ融合ポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ＣａｓＸガイド核酸、ＣａｓＸガイド核酸をコードするポリヌクレオチド、ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド等）に共有結合されている。ＰＴＤの例としては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１２）を含むＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分な多くのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２−１７３７）；欠損ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号１１３）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１１４）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号１１５）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１６）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１８）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、以下のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１９）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１２０）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１２１）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２２）、及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２３）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これが正味電荷をほぼ０に低減し、それにより細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断する。
リンカー（例えば、融合パートナーの場合）
いくつかの実施形態では、対象のＣａｓＸタンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して融合パートナーに融合され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、一般に可撓性のスペーサーペプチドによって接合され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーとしては、４アミノ酸〜４０アミノ酸長、または４アミノ酸〜２５アミノ酸長のポリペプチドが挙げられる。これらのリンカーは、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質を連結することによって産生され得るか、または融合タンパク質をコードする核酸配列によってコードされ得る。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが、一般に可撓性のペプチドをもたらす配列を有することに留意して、連結ペプチドは、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを創出する際に有用である。そのような配列の創出は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーは、商業的に入手可能であり、使用に適していると考えられる。
リンカーポリペプチドの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号１２４）、ＧＧＳＧＧＳｎ（配列番号１２５）、及びＧＧＧＳｎ（配列番号１２６）を含む、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーが挙げられる。例示的なリンカーは、ＧＧＳＧ（配列番号１２７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１２８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号１２９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１３０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１３１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号１３２）等が挙げられるが、これらに限定されないアミノ酸配列を含み得る。熟練者であれば、任意の所望の要素に複合されたペプチドの設計が、すべてまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得、それによりリンカーが、可撓性リンカーならびに可撓性の低い構造を与える１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。
検出可能な標識
ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチドは、検出可能な標識を含む。検出可能なシグナルを提供し得る好適な検出可能な標識及び／または部分としては、酵素、放射性同位体、特異的結合対のメンバー、蛍光体、蛍光タンパク質、量子ドット等を挙げることができるが、これらに限定されない。
好適な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異形、ＧＦＰの青色蛍光変異形（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異形（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異形（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、二量体２、ｔ−二量体２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、レニラＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質及びＢ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５−９０９）等が挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載される、花虫類種由来の様々な蛍光及び染色タンパク質のうちのいずれかが使用に適している。
好適な酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、転化酵素、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
ＣａｓＸタンパク質は、ＤＮＡ標的ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補性の領域によって定義される標的配列において、標的ＤＮＡに結合する。多くのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（及び／または切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される］の両方によって決定される位置において起こる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の５′の直近である（相補鎖は、ガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズするが、非相補鎖は、ガイドＲＮＡと直接ハイブリダイズせず、非相補鎖の逆相補体である）。いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載されるＣａｓＸ１が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５′−ＴＣＮ−３′（及びある場合には、ＴＴＣＮ）であり、Ｎは、任意のＤＮＡヌクレオチドである。例として、図６、パネルＣ及び図７を参照されたい。ここでＰＡＭ（ＴＣＮ）（非相補鎖上）は、ＴＣＡであり（及び図において示されるＰＡＭはＴＴＣＡである）、ＰＡＭは、標的配列の５′である。
ある場合には、異なるＣａｓＸタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓＸタンパク質）は、異なるＣａｓＸタンパク質の様々な酵素的特徴を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列優先性のため、増加または減少した酵素活性のため、増加または減少したレベルの細胞毒性のため、ＮＨＥＪ、ホモロジー配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断等の間の均衡を変更するため、短い全配列を利用するため等）、様々な提供される方法における使用に有利であり得る。異なる種に由来するＣａｓＸタンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。このため、一般に好まれる特定のＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭ配列要件は、上記の５′−ＴＣＮ−３′配列とは異なり得る。適切なＰＡＭ配列の同定のための様々な方法（インシリコ及び／またはウェットラボ法を含む）は、当該技術分野において既知であり、ルーチンであり、任意の簡便な方法が使用され得る。本明細書に記載されるＴＣＮ ＰＡＭ配列は、ＰＡＭ枯渇アッセイを使用して同定された（例えば、下記実施例の図５を参照）。
ＣａｓＸガイドＲＮＡ
ＣａｓＸタンパク質に結合する、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する、及びその複合体を標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）内の特定の位置に標的する核酸分子は、本明細書において「ＣａｓＸガイドＲＮＡ」または単に「ガイドＲＮＡ」と称される。ある場合には、ＣａｓＸガイドＲＮＡが、ＲＮＡ塩基に加えて、ＤＮＡ塩基を含むようにハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡが作製され得るが、「ＣａｓＸガイドＲＮＡ」という用語は、依然として本明細書ではそのような分子を包含するように使用されることを理解されたい。
ＣａｓＸガイドＲＮＡは、標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含むと言うことができる。ＣａｓＸガイドＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖等）内の特定の配列（標的部位）に相補的な（したがってそれとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、ＣａｓＸポリペプチドと相互作用する（に結合する）。対象のＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補性ストレッチを含む。標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／または切断は、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（ＣａｓＸガイドＲＮＡのガイド配列）と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位置（例えば、標的遺伝子座の標的配列）において起こり得る。
ＣａｓＸガイドＲＮＡ及びＣａｓＸタンパク質、例えば、融合ＣａｓＸポリペプチドは、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。ＣａｓＸガイドＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列）を含む、標的化セグメントを含めることによって複合体に標的特異性を提供する。複合体のＣａｓＸタンパク質は、部位特異的活性（例えば、ＣａｓＸタンパク質によって提供される切断活性及び／またはキメラＣａｓＸタンパク質の場合に融合パートナーによって提供される活性）を提供する。換言すれば、ＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸガイドＲＮＡとのその会合によって、標的核酸配列（例えば、標的配列）に誘導される。
ＣａｓＸガイドＲＮＡの「標的化配列」とも称される「ガイド配列」は、（例えば、本明細書に記載されるように）ＰＡＭ配列が考慮され得ることを例外として、ＣａｓＸガイドＲＮＡが、ＣａｓＸタンパク質（例えば、天然に存在するＣａｓＸタンパク質、融合ＣａｓＸポリペプチド（キメラＣａｓＸ）等）を任意の所望の標的核酸の任意の所望の配列に標的し得るように修飾され得る。このため、例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡは、真核細胞中の核酸、例えば、ウイルス核酸、真核細胞核酸（例えば、真核細胞染色体、染色体配列、真核細胞ＲＮＡ等）における配列に対する相補性を有するガイド配列を有し得る（例えば、ハイブリダイズし得る）。
対象のＣａｓＸガイドＲＮＡはまた、「活性化因子」及び「標的化因子」（例えば、それぞれ「活性化因子−ＲＮＡ」及び「標的化因子−ＲＮＡ」を含むと言うこともできる。「活性化因子」及び「標的化因子」が２つの別個の分子である場合、ガイドＲＮＡは、本明細書では「二重ガイドＲＮＡ」、「ｄｇＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、または「二分子ガイドＲＮＡ」（例えば、「ＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡ」）と称される。いくつかの実施形態では、活性化因子及び標的化因子は、互いに共有結合され（例えば、介在ヌクレオチドを介して）、ガイドＲＮＡは、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、または「一分子ガイドＲＮＡ」（例えば、「ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ」）と称される。このため、対象のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡは、互いに連結され（例えば、介在ヌクレオチドによって）、互いにハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成し、したがってステムループ構造をもたらす、標的化因子（例えば、標的化因子−ＲＮＡ）及び活性化因子（例えば、活性化因子−ＲＮＡ）を含む（図６、パネルＣ）。このため、標的化因子及び活性化因子は各々、二重鎖形成セグメントを有し、標的化因子の二重鎖形成セグメント及び活性化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡのリンカーは、ヌクレオチドのストレッチである（図６、パネルＣにおいてＧＡＡＡとして示される）。ある場合には、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡの標的化因子及び活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結され、リンカーは、３〜２０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２０、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、４〜６、または４〜５ｎｔ）の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡのリンカーは、３〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、３〜８０、３〜５０、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１００、４〜８０、４〜５０、４〜３０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、４〜６、または４〜５ｎｔ）の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡのリンカーは、３〜１０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、または４〜５ｎｔ）の長さを有し得る。
ＣａｓＸガイドＲＮＡのガイド配列
対象のＣａｓＸガイドＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸中の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列である、ガイド配列（すなわち、標的化配列）を含む。換言すれば、ＣａｓＸガイドＲＮＡの標的化セグメントは、ハイブリダイゼーションによる配列特異的方法（すなわち、塩基対合）で標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））と相互作用し得る。ＣａｓＸガイドＲＮＡのガイド配列は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの真核細胞標的核酸）内で任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように（例えば、遺伝子組み換えによって）修飾／設計され得る（例えば、ＰＡＭを考慮に入れて、例えば、ｄｓＤＮＡ標的を標的化するとき）。
いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１００％である。
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、７つの連続する３′最端ヌクレオチドにわたって１００％である。
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
ある場合には、ガイド配列は、１９〜３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１９〜２５、１９〜２２、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１９〜２２、１９〜２０、２０〜２５、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９以上のｎｔ（例えば、２０以上、２１以上、または２２以上のｎｔ；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。
ＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント
対象のＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、ＣａｓＸタンパク質と相互作用する。ＣａｓＸガイドＲＮＡは、結合したＣａｓＸタンパク質を、上述のガイド配列を介して標的核酸内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。ＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つのストレッチ（活性化因子の二重鎖形成セグメント及び標的化因子の二重鎖形成セグメント）を含む。このため、タンパク質結合セグメントは、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖領域（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、８〜２５塩基対（ｂｐ）の範囲（例えば、８〜２２、８〜１８、８〜１５、８〜１２、１２〜２５、１２〜２２、１２〜１８、１２〜１５、１３〜２５、１３〜２２、１３〜１８、１３〜１５、１４〜２５、１４〜２２、１４〜１８、１４〜１５、１５〜２５、１５〜２２、１５〜１８、１７〜２５、１７〜２２、または１７〜１８ｂｐ、例えば、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ等）を含む。ある場合には、二重鎖領域は（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、８以上のｂｐ（例えば、１０以上、１２以上、１５以上、または１７以上のｂｐ）を含む。ある場合には、二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが対合されるとは限らないため、二重鎖形成領域は、バルジを含み得る（例えば、図６、パネルＣ及び図７を参照）。本明細書における「バルジ」という用語は、二本鎖二重鎖に寄与しないが、寄与するヌクレオチドによって５′及び３′が囲まれているヌクレオチド（１つのヌクレオチドであり得る）のストレッチを意味するように使用され、そのようなものとしてバルジは、二重鎖領域の一部とみなされる。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、１つ以上のバルジ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、２つ以上のバルジ（例えば、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、１〜５のバルジ（例えば、１〜４、１〜３、２〜５、２〜４、または２〜３のバルジ）を含む。
このため、ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有する。
換言すれば、いくつかの実施形態では、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。ある場合には、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。ある場合には、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。
対象のＣａｓＸガイドＲＮＡの二重鎖領域は（二重ガイドまたは単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、天然に存在する二重鎖領域に対して１つ以上（１、２、３、４、５等）の突然変異を含み得る。例えば、ある場合には、塩基対は維持され得るが、各セグメント（標的化因子及び活性化因子）からの塩基対に寄与するヌクレオチドは異なり得る。ある場合には、対象のＣａｓＸガイドＲＮＡの二重鎖領域は、（天然に存在するＣａｓＸガイドＲＮＡの）天然に存在する二重鎖領域と比較して、より多くの対合塩基、より少ない対合塩基、より小さいバルジ、より大きいバルジ、より少ないバルジ、より多いバルジ、またはそれらの任意の簡便な組み合わせを含む。
ある場合には、対象のＣａｓＸガイドＲＮＡの活性化因子（例えば、活性化因子−ＲＮＡ）は（二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、少なくとも２つの内部ＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡに加えて２つの内部ヘアピン）を含む。活性化因子の内部ＲＮＡ二重鎖（ヘアピン）は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられ得る（例えば、図６、パネルＣ及び図７を参照。両方が活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた２つの内部ヘアピンを有する活性化因子を含む。）ある場合には、活性化因子は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた１つのヘアピンを含む。ある場合には、活性化因子は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた２つのヘアピンを含む。ある場合には、活性化因子は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた３つのヘアピンを含む。ある場合には、活性化因子は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた２つ以上のヘアピン（例えば、３つ以上または４つ以上のヘアピン）を含む。ある場合には、活性化因子は、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖の５′に位置付けられた２〜５つのヘアピン（例えば、２〜４または２〜３つのヘアピン）を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、例えば、図６及び図７のｔｒａｃｒＲＮＡに示されるように、５′最端ヘアピンステムの５′に少なくとも２つのヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、少なくとも３つまたは少なくとも４つのｎｔ）を含む。ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、例えば、図６及び図７のｔｒａｃｒＲＮＡに示されるように、５′最端ヘアピンステムの５′に少なくとも４つのｎｔを含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドフォーマットで）、６５ヌクレオチド（ｎｔ）以上（例えば、６６以上、６７以上、６８以上、６９以上、７０以上、または７５以上のｎｔ）の長さを有する。ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドフォーマットで）、６６ｎｔ以上（例えば、６７以上、６８以上、６９以上、７０以上、または７５以上のｎｔ）の長さを有する。ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドフォーマットで）、６７ｎｔ以上（例えば、６８以上、６９以上、７０以上、または７５以上のｎｔ）の長さを有する。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドフォーマットで）、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）の５′に４５以上のヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、または５５以上のｎｔ）を含む。ある場合には、活性化因子は、天然に存在するＣａｓＸ活性化因子に対して５′末端で短縮されている。ある場合には、活性化因子は、天然に存在するＣａｓＸ活性化因子に対して５′末端で伸長されている。
様々なＣａｓ９ガイドＲＮＡの例は、当該技術分野において見出すことができ、ある場合には、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに導入されたものと同様の異形もまた、本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡに導入され得る。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０−９、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；５６（２）：３３３−９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号を参照されたい。これらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
「活性化因子」または「活性化因子ＲＮＡ」という用語は、本明細書では、ＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡ（及びしたがって、「活性化因子」及び「標的化因子」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結される場合はＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ）のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ：「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を意味するように使用される。このため、例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、活性化因子配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。ｔｒａｃｒ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズしてＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡを形成する、天然に存在する分子である。「活性化因子」という用語は、本明細書では、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡを包含するだけでなく、修飾（例えば、短縮、伸長、配列変異、塩基修飾、骨格修飾、連結修飾等）を有するｔｒａｃｒＲＮＡを包含するように使用され、活性化因子は、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つの機能を保持する（例えば、ＣａｓＸタンパク質が結合するｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する）。ある場合には、活性化因子は、ＣａｓＸタンパク質と相互作用し得る１つ以上のステムループを提供する。活性化因子は、ｔｒａｃｒ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有すると称することができ、ある場合には、ｔｒａｃｒＲＮＡであるが、「活性化因子」という用語は、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡに限定されない。
ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、対応する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡに対して短縮されている（より短い）。ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、対応する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡに対して短縮されていない（より短くない）。ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、５０ｎｔ超（例えば、５５ｎｔ超、６０ｎｔ超、６５ｎｔ超、７０ｎｔ超、７５ｎｔ超、８０ｎｔ超）の長さを有する。ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、８０ｎｔ超の長さを有する。ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、５１〜９０ｎｔ（例えば、５１〜８５、５１〜８４、５５〜９０、５５〜８５、５５〜８４、６０〜９０、６０〜８５、６０〜８４、６５〜９０、６５〜８５、６５〜８４、７０〜９０、７０〜８５、７０〜８４、７５〜９０、７５〜８５、７５〜８４、８０〜９０、８０〜８５、または８０〜８４ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には（例えば、ガイドＲＮＡが単一ガイドフォーマットである場合には）、活性化因子−ＲＮＡは、８０〜９０ｎｔの範囲の長さを有する。
「標的化因子」または「標的化因子ＲＮＡ」という用語は、本明細書では、ＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡの（及びしたがって、「活性化因子」及び「標的化因子」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結される場合は、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）と称される。このため、例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列及び二重鎖形成セグメント（例えば、ｃｒＲＮＡ反復とも称され得る、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント）を含む。標的化因子の標的化セグメント（標的核酸の標的配列とハイブリダイズするセグメント）の配列は、所望の標的核酸とハイブリダイズするために使用者によって修飾されるため、標的化因子の配列は、多くの場合、天然に存在しない配列である。しかしながら、活性化因子の二重鎖形成セグメントとハイブリダイズする（本明細書においてさらに詳細に説明される）標的化因子の二重鎖形成セグメントは、天然に存在する配列を含み得る（例えば、ｃｒＲＮＡ反復とも称され得る、天然に存在するｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントの配列を含み得る）。このため、標的化因子という用語は、本明細書では、標的化因子の一部（例えば、二重鎖形成セグメント）が多くの場合、ｃｒＲＮＡ由来の天然に存在する配列を含むという事実にもかかわらず、天然に存在するｃｒＲＮＡと区別するために使用される。しかしながら、「標的化因子」という用語は、天然に存在するｃｒＲＮＡを包含する。
上記のように、標的化因子は、ＣａｓＸガイドＲＮＡのガイド配列、及びＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子）は、ＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（二重鎖形成セグメント）を含む。換言すれば、標的化因子のヌクレオチドのストレッチは、活性化因子のヌクレオチドのストレッチに相補的であり、それとハイブリダイズしてＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。そのようなものとして、各標的化因子は、対応する活性化因子（標的化因子とハイブリダイズする領域を有する）を有すると言うことができる。標的化因子分子は、追加としてガイド配列を提供する。このため、標的化因子及び（対応する対としての）活性化因子がハイブリダイズして、ＣａｓＸガイドＲＮＡを形成する。所与の天然に存在するｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の特定の配列は、ＲＮＡ分子が見出される種に特徴的であり得る。好適な活性化因子及び標的化因子の例は、本明細書において提供される。
例示的なガイドＲＮＡ配列
図６（二重ガイドフォーマット）及び図７（二重ガイドフォーマット）に示されるガイドＲＮＡは、ＣａｓＸ１の天然遺伝子座に由来する。下記のパラグラフで考察される配列について、及び下記の実施例に記載され、試験された配列について、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ配列は、ＣａｓＸ１遺伝子座に由来していた。考えられる標的化因子−ＲＮＡ及び活性化因子−ＲＮＡの同じパラメータ及び組が予想され、ＣａｓＸ１遺伝子座の配列をＣａｓＸ２遺伝子座のものと比較することに由来し得る。例えば、ＣａｓＸ１ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２５）及びＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）
を、ＣａｓＸ２ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列：
ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２６）及びＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２７）と比較することができる。
ＣａｓＸ３遺伝子座について、ｔｒａｃｒは、これらの２３０ｎｔ内にある可能性がある（相補性領域には下線が引かれている）。
同様に、ＣａｓＸ１ ｃｒＲＮＡ配列
ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１１、Ｎを有する配列番号６１）は、ＣａｓＸ２ ｃｒＲＮＡ配列ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１３、Ｎを有する配列番号６９）と比較することができる。
ＣａｓＸ３遺伝子座からのｃｒＲＮＡ反復は、ＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＴ（配列番号５４）、ＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＡＧＧＴ（配列番号５５）、ＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＧＡＴ（配列番号５６）、及びＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号５７）である。したがって、ｃｒＲＮＡ配列（例えば、ＣａｓＸ３遺伝子座からの）は、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１４、Ｎを有する配列番号３１）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１５、Ｎを有する配列番号３２）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１６、Ｎを有する配列番号３３）、及び／またはＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ｎを有しない配列番号１７、Ｎを有する配列番号３４）を含み得る。
例示的な標的化因子−ＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）配列
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１１）を含む（例えば、図６、パネルＣのｓｇＲＮＡを参照）。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１１）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＡＵＵＵＧＡＡＧＧＵＡＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１２）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列ＡＵＵＵＧＡＡＧＧＵＡＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１２）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１３）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１３）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号１４）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号１４）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１５）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１５）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１６）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１６）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１７）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１７）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、（例えば、ガイド配列に加えて）配列番号１１及び１３のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号１１及び１３のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、ガイド配列に加えて）、配列番号１１〜１３のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号１１〜１３のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて）配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて）配列番号１１〜１７のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号１１〜１７のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
例示的な活性化因子−ＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２１）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２１）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２２）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２２）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）を含む（例えば、図６のｓｇＲＮＡを参照）。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＡＧＵＡＧＵＡＡＡＵＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２４）を含む（例えば、図６のｓｇＲＮＡを参照）。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＡＧＵＡＧＵＡＡＡＵＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２４）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２５）を含む（例えば、図６のｓｇＲＮＡを参照）。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２５）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２６）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２６）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２７）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２７）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、以下の配列内からのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、以下の配列内からのｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号２１〜２７のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号２１〜２７のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号２１〜２７のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号２１〜２８のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡは、配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧｇａａａＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４１）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧｇａａａＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４１）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡは、配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡｇａａａＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４２）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡｇａａａＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４２）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡは、配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧｇａａａＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４３）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧｇａａａＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４３）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡは、配列番号４１〜４３のうちのいずれか１つに記載される配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号４１〜４３のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ＣＡＳＸ系
本開示は、ＣａｓＸ系を提供する。本開示のＣａｓＸ系は、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｂ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｃ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｄ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｅ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｆ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｇ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｈ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｉ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｊ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｋ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｌ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｍ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｎ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｏ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｐ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｑ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；もしくはｒ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；または（ａ）〜（ｒ）のうちの１つのいくつかの異形を含み得る。
核酸
本開示は、ドナーポリヌクレオチド配列、ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、野生型ＣａｓＸタンパク質、ニッカーゼＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質等）、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（二重ガイドＲＮＡフォーマットの場合に２つの別個のヌクレオチド配列を含み得るか、または単一ガイドＲＮＡフォーマットの場合に単一ヌクレオチド配列を含み得る）のうちの１つ以上を含む、１つ以上の核酸を提供する。本開示は、ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。本開示は、ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、ａ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、ａ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを提供する。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、一般に好まれる細胞型（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞等）において動作可能なプロモーターに動作可能に連結される。
ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。この種類の最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図した宿主生物または細胞のコドン優先性を模倣するように、ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列の突然変異を伴い得る。このため、コドンは変更され得るが、コードされたタンパク質は、変更されないままである。例えば、意図した標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドンで最適化されたＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を使用することができた。別の非限定例として、意図した宿主細胞がマウス細胞であった場合、次いでマウスコドンで最適化されたＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を生成することができた。別の非限定例として、意図した宿主細胞が植物細胞であった場合、次いで植物コドンで最適化されたＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を生成することができた。別の非限定例として、意図した宿主細胞が昆虫細胞であった場合、次いで昆虫コドンで最適化されたＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を生成することができた。
本開示は、（ある場合には、異なる組み換え発現ベクター中、またある場合には、同じ組み換え発現ベクター中に）以下を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。（ｉ）ドナーテンプレート核酸のヌクレオチド配列（ドナーテンプレートは、標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的配列に対する相同性を有するヌクレオチド配列を含む）、（ｉｉ）標的ゲノム（例えば、単一または二重ガイドＲＮＡ）の標的遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される）、及び（ｉｉｉ）ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される）。本開示は、（ある場合には、異なる組み換え発現ベクター中、またある場合には、同じ組み換え発現ベクター中に）以下を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。（ｉ）ドナーテンプレート核酸のヌクレオチド配列（ドナーテンプレートは、標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的配列に対する相同性を有するヌクレオチド配列を含む））、及び（ｉｉ）標的ゲノム（例えば、単一または二重ガイドＲＮＡ）の標的遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される）。本開示は、（ある場合には、異なる組み換え発現ベクター中、またある場合には、同じ組み換え発現ベクター中に）以下を含む１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。（ｉ）標的ゲノム（例えば、単一または二重ガイドＲＮＡ）の標的遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される）、及び（ｉｉ）ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、真核細胞などの標的細胞中で動作可能なプロモーターに動作可能に連結される）。
好適な発現ベクターとしては、ウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）；ＳＶ４０；ヘルペス単純ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びレトロウイルスに由来するベクター、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び哺乳動物腫瘍ウイルス）等が挙げられる。ある場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ある場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレンチウイルスベクターである。ある場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレトロウイルスベクターである。
利用される宿主／ベクター系に応じて、複数の好適な転写及び翻訳制御要素（構成的及び誘導的プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む）のうちのいずれかが、発現ベクター内で使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質またはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写抑制要素に動作可能に連結される。
転写制御要素は、プロモーターであり得る。ある場合には、プロモーターは、構成的活性型のプロモーターである。ある場合には、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。ある場合には、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ある場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。ある場合には、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。ある場合には、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的細胞型または標的細胞集団において機能的である。例えば、ある場合には、転写制御要素は、真核細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、動員された末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４（＋）細胞、骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４（＋）細胞等）において機能的であり得る。
真核細胞プロモーター（真核細胞中で機能的なプロモーター）の非限定例としては、ＥＦ１α、最初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、早期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有することができる。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。発現ベクターはまた、ＣａｓＸタンパク質に融合され得、したがってキメラＣａｓＸポリペプチドをもたらす、タンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに動作可能に連結される。
プロモーターは、構成的活性型プロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得、誘導性プロモーターであってもよく（すなわち、活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」状態が外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、転写制御要素、エンハンサー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であってよく、また時間的制約のあるプロモーターであってもよい（すなわち、プロモーターは、胚発達の特定段階中、または生物学的過程の特定段階、例えば、マウスにおける毛包サイクル中に「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態である）。
好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは原核生物もしくは真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７−５００（２００２）、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７）、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ある場合には、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中で動作可能なプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター、強化Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等）に動作可能に連結される（その制御下にある）。当業者によって理解されるように、Ｕ６プロモーター（例えば、真核細胞中）、または別のＰｏｌＩＩＩプロモーターを使用して核酸（例えば、発現ベクター）からＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）を発現するとき、いくつかのＴが並んでいる場合にＲＮＡは、突然変異される必要があり得る（ＲＮＡ中のＵをコードする）。これは、ＤＮＡ中のＴの連続（例えば、５つのＴ）は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のターミネーターとして作用し得る。このため、真核細胞中のガイドＲＮＡ（例えば、二重ガイドまたは単一ガイドフォーマットの活性化因子部分及び／または標的化因子部分）の転写を保証するために、時としてガイドＲＮＡをコードする配列を修飾してＴの連続を除去する必要性があり得る。ある場合には、ＣａｓＸタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＸタンパク質、ニッカーゼＣａｓＸタンパク質、ｄＣａｓＸタンパク質、キメラＣａｓＸタンパク質等）をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中で動作可能なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）に動作可能に連結される。
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節型プロモーター、ラクトース誘導型プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン；エストロゲン及び／またはエストロゲン類似体；ＩＰＴＧ等が挙げられるが、これらに限定されない分子によって調節され得る。
使用に適した誘導性プロモーターとしては、本明細書に記載されるか、または当業者に既知の任意の誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、無制限に、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーターなどの化学的／生化学的調節型及び物理的調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター及び他のテトラサイクリン応答性プロモーター系（テトラサイクリン抑制因子タンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、及びヒトからのメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、ならびに光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられる。
ある場合には、プロモーターは、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）であり、それにより多細胞生物において、プロモーターは、特異的細胞のサブセットにおいて活性（すなわち、「ＯＮ」）である。空間的制約のあるプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御要素、制御配列等と称され得る。任意の簡便な空間的制約のあるプロモーターは、そのプロモーターが、標的宿主細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）中で機能的である限り使用することができる。
ある場合には、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野において既知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば真核生物及び原核生物から単離され、由来し得る。第２の生物において使用するための第１の生物（第１は原核生物及び第２は真核生物、第１は真核生物及び第２は原核生物）に由来する可逆的プロモーターの修飾は、当該技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーター、及びそのような可逆的プロモーターに基づくだけでなく、追加の制御タンパク質を含む系としては、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーター等）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系等）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーター等）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、ダイズヒートショックプロモーター等）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、ＣａｓＸタンパク質及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸等）を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達等が挙げられる。
組み換え発現ベクターを細胞に導入することは、任意の培養培地中、細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボまたはエクスビボで実行され得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビトロで実行され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、ＲＮＡとして提供され得る。ＲＮＡは、直接化学合成によって提供され得るか、または（例えば、ＣａｓＸタンパク質をコードする）ＤＮＡからインビトロで転写され得る。一旦合成されると、ＲＮＡは、核酸を細胞に導入するための周知の技法（例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、形質移入等）のうちのいずれかによって細胞に導入され得る。
核酸は、十分に開発された形質移入技法（例えばＡｎｇｅｌ ａｎｄ Ｙａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ１１７５６を参照）、及びＱｉａｇｅｎから商業的に入手可能なＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ形質移入キット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ形質移入キットを使用して細胞に提供され得る。また、Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５（５０）：１９８２１−１９８２６を参照されたい。
ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。換言すれば、細胞は、対象の核酸を含むベクター（例えば、ドナーテンプレート配列を有し、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする組み換え発現ベクター、ＣａｓＸタンパク質をコードする組み換え発現ベクター等）と接触され、それによりベクターが細胞によって取り込まれる。細胞を、プラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法としては、当該技術分野において周知の電気穿孔、塩化カルシウム形質移入、マイクロインジェクション、及びリポフェクションが挙げられる。ウイルスベクター送達の場合、細胞は、対象のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子と接触され得る。
レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示の方法における使用に適している。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥があり」、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することが不可能である。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。関心対象の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（エコトロピック、アンホトロピック、またはゼノトロピック）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットに対してエコトロピック、ヒト、イヌ、及びマウスを含む大部分の哺乳動物細胞型に対してアンホトロピック、ならびにマウス細胞を除く大部分の哺乳動物細胞に対してゼノトロピック）。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージされたウイルス粒子によって標的されることを保証することができる。対象のベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法及びパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野において周知である。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ＲＮＡのインジェクション）によって導入され得る。
ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸を標的宿主細胞に提供するために使用されるベクターは、関心対象の核酸の発現、つまり転写活性化を駆動するための好適なプロモーターを含み得る。換言すれば、ある場合には、関心対象の核酸は、プロモーターに動作可能に連結される。これは、偏在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、または誘導性プロモーター、特定の細胞集団において活性であるか、もしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターを含み得る。転写活性化によって、標的細胞中の基底レベルよりも１０倍、１００倍、より通常は１０００倍転写が増加されることが意図される。加えて、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸタンパク質を取り込んだ細胞を同定するように、標的細胞中の選択可能なマーカーについてコードする核酸配列を含み得る。
ＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ある場合には、ＲＮＡである。このため、ＣａｓＸ融合タンパク質は、ＲＮＡとして細胞に導入され得る。ＲＮＡを細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、直接注入、形質移入、またはＤＮＡの導入のために使用される任意の他の方法を含み得る。代わりに、ＣａｓＸタンパク質は、ポリペプチドとして細胞に提供されてもよい。そのようなポリペプチドは、任意に、産生物の溶解性を増加させるポリペプチドドメインに融合され得る。このドメインは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される定義されたプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶ配列を通してポリペプチドに連結され得る。リンカーはまた、１つ以上の可撓性配列、例えば、１〜１０個のグリシン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断は、産生物の溶解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５〜２Ｍ尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下等で行われる。関心対象のドメインとしては、エンドソーム不安定化ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン、及び産生を助ける他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメイン等が挙げられる。ポリペプチドは、改善された安定性のために配合され得る。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよく、ポリエチレンオキシ基は、血流中の向上した寿命を提供する。
追加としてまたは代替として、本開示のＣａｓＸポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインに融合されて、細胞による取り込みを促進することができる。複数の浸透性ドメインが、当該技術分野において既知であり、ペプチド、ペプチド模倣体、及び非ペプチド担体を含む、本開示の非統合ポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３３）を含む、ペネトラチンと称される、キイロショウジョウバエ転写因子アンテナペディアの第３のαらせんに由来し得る。別の例として、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ−１ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る。他の浸透性ドメインとしては、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニン等のアミノ酸３４〜５６の領域を含む。（例えば、転位ペプチド及びペプトイドの教示について参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ； ４（２）：８７−９ ａｎｄ ４４６、及びＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２０００ Ｎｏｖ．２１； ９７（２４）：１３００３−８、公開済み米国特許出願第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、及び同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けられたより効率的なＰＴＤのうちの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２）。融合が行われる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌、または結合特徴を最適化するために選択され得る。最適な部位は、慣例実験によって決定される。
本開示のＣａｓＸポリペプチドは、インビトロで、または真核細胞によって、または原核細胞によって産生することができ、それは、アンフォールディング、例えば、熱変性、ジチオスレイトール還元等によってさらに処理することができ、当該技術分野において既知の方法を使用して、さらにリフォールディングすることができる。
一次配列を改変しない関心対象の修飾としては、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等が挙げられる。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成及び処理中またはさらなる処理ステップ中にポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えばポリペプチドを、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素に曝露することによって行われるものが含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列が包含される。
また、核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする、ＣａｓＸ融合タンパク質をコードする等）、ならびにタンパク質分解に対するそれらの耐性を改善するか、標的配列の特異性を変えるか、溶解特性を最適化するか、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性等）を改変するか、またはそれらをより好適にするように、通常の分子生物学的技法及び合成化学を使用して修飾されたタンパク質（例えば、野生型タンパク質または変異形タンパク質に由来するＣａｓＸ融合タンパク質をコードする）が、本開示の実施形態に包含するのに適している。そのようなポリペプチドの類似体としては、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基を含有するもの、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸が挙げられる。Ｄ−アミノ酸は、アミノ酸残基の一部またはすべてについて置換され得る。
本開示のＣａｓＸポリペプチドは、当該技術分野において既知の簡便な方法を使用して、インビトロ合成によって調製され得る。様々な商業的合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成装置が入手可能である。合成装置を使用することによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸で置換されてもよい。特定の配列及び調製方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度等によって決定される。
所望される場合、合成中または発現中に、様々な基がペプチドに導入され得、これが他の分子または表面への連結を可能にする。このため、システインを使用して、チオエーテル、金属イオン複合体に連結するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基等を作製することができる。
本開示のＣａｓＸポリペプチドはまた、組み換え合成の従来方法に従って単離及び精製されてもよい。発現宿主の溶解物が調製され、溶解物は、液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、排除クロマトグラフィ、ゲル電気穿孔、親和性クロマトグラフィ、または他の精製技法を使用して精製され得る。主に、使用される組成物は、産生物の調製及びその精製の方法に関連した汚染物質に関して、所望の産生物の２０重量％以上、より通常は７５重量％以上、好ましくは９５重量％以上、治療目的の場合は通常９９．５重量％を占める。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。このため、ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドは、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である（例えば、汚染物質、非ＣａｓＸタンパク質、または他の高分子等を含まない）。
切断もしくは任意の所望の修飾を標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に誘導するため、または任意の所望の修飾を標的核酸に関連したポリペプチドに誘導するために、本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／もしくはＣａｓＸポリペプチドならびに／またはドナーテンプレート配列は、それらが核酸として導入されるかまたはポリペプチドとして導入されるかにかかわらず、約３０分〜約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分〜約２４時間の任意の他の期間にわたって細胞に提供され、これはほぼ毎日〜約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、またはほぼ毎日〜約４日毎の任意の他の頻度で繰り返されてもよい。薬剤（複数可）は、対象の細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または４回以上提供されてもよく、細胞は、各接触事象に続くいくらかの期間、例えば、１６〜２４時間にわたって薬剤（複数可）でインキュベートされ、この後に培地を新鮮な培地で置き換え、細胞をさらに培養する。
２つ以上の異なる標的化複合体（例えば、同じまたは異なる標的核酸内の異なる配列に相補的である２つの異なるＣａｓＸガイドＲＮＡ）が細胞に提供される場合において、複合体は、同時に提供され得るか（例えば、２つのポリペプチド及び／もしくは核酸として）、または同時に送達され得る。代替として、それらは、連続して提供されてもよく、例えば、標的化複合体が最初に提供され、続いて第２の標的化複合体が提供される等、またはその逆も同様である。
標的細胞へのＤＮＡベクターの送達を改善するために、ＤＮＡは、例えば、リポプレックス及びポリプレックスを使用することによって促進される損傷及びその細胞への侵入から保護され得る。このため、ある場合には、本開示の核酸（例えば、本開示の組み換え発現ベクター）は、ミセルまたはリポソームのような組織的構造において脂質で被覆され得る。組織的構造がＤＮＡと複合される場合、それはリポプレックスと呼ばれる。３種類の脂質、アニオン性（負電荷）、中性、またはカチオン性（正電荷）が存在する。カチオン性脂質を用いるリポプレックスは、遺伝子移行に対する有用性が証明された。カチオン性脂質は、それらの正電荷に起因して、負電荷ＤＮＡと天然に複合する。また、それらは、電荷の結果として、細胞膜と相互作用する。次いで、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、ＤＮＡが細胞質中に放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの変性に対して保護する。
ポリマーとＤＮＡとの複合体は、ポリプレックスと呼ばれる。ほとんどのポリプレックスは、カチオン性ポリマーからなり、それらの産生は、イオン相互作用によって調節される。ポリプレックスとリポプレックスの作用方法の１つの大きな差異は、ポリプレックスが、それらのＤＮＡ負荷を細胞質中に放出できないことであり、このために、不活性化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤との同時形質移入（エンドサイトーシス中に作製されるエンドソームを溶解する）が起こるに違いない。しかしながら、これは常にそうであるとは限らない。ポリエチレンイミンなどのポリマーは、キトサン及びトリメチルキトサンと同様に、それら独自のエンドソーム崩壊方法を有する。
球形状を有する高度に分岐した高分子であるデンドリマーを使用して、幹細胞を遺伝的に修飾することもできる。デンドリマー粒子の表面を感応化して、その特性を改変することができる。具体的に、カチオン性デンドリマー（すなわち、正の表面電荷を有するもの）を構築することが可能である。ＤＮＡプラスミドなどの遺伝子材料の存在下にある場合、電荷相補性は、核酸とカチオン性デンドリマーとの一時的会合につながる。その目的地に到達したとき、デンドリマー核酸複合体は、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ得る。
ある場合には、開示の核酸（例えば、発現ベクター）は、関心対象のガイド配列に対する挿入部位を含む。例えば、核酸は、関心対象のガイド配列に対する挿入部位を含み得、挿入部位は、ガイド配列が変化して所望の標的配列にハイブリダイズしても変化しないＣａｓＸガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列のすぐ隣にある（例えば、ガイドＲＮＡのＣａｓＸ結合態様に寄与する配列、例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖（複数可）に寄与する配列。ガイドＲＮＡのこの部分はまた、ガイドＲＮＡの「足場」または「定常領域」とも称され得る）。このため、ある場合には、対象の核酸（例えば、発現ベクター）は、ガイドＲＮＡのガイド配列部分をコードする部分が挿入配列（挿入部位）であることを除いて、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。挿入部位は、所望の配列の挿入のために使用される任意のヌクレオチド配列である。様々な技法で使用するための「挿入部位」は、当業者に既知であり、任意の簡便な挿入部位が使用され得る。挿入部位は、核酸配列を挿入するための任意の方法に対するものであり得る。例えば、ある場合には、挿入部位は、複数クローニング部位（ＭＣＳ）（例えば、１つ以上の制限酵素認識配列を含む部位）、ライゲーション非依存性クローニングのための部位、組み換えに基づくクローニングのための部位（例えば、ａｔｔ部位に基づく組み換え）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）に基づく技術によって認識されるヌクレオチド配列等である。
挿入部位は、任意の所望の長さであり得、挿入部位の種類に依存し得る（例えば、その部位が１つ以上の制限酵素認識配列を含むかどうか（またその数）、その部位がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対する標的部位を含むかどうか等に依存し得る）。ある場合には、対象核酸の挿入部位は、３以上のヌクレオチド（ｎｔ）長（例えば、５以上、８以上、１０以上、１５以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、または２５以上、または３０以上のｎｔ長）である。ある場合には、対象核酸の挿入部位の長さは、２〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、２〜４０ｎｔ、２〜３０ｎｔ、２〜２５ｎｔ、２〜２０ｎｔ、５〜５０ｎｔ、５〜４０ｎｔ、５〜３０ｎｔ、５〜２５ｎｔ、５〜２０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２５ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、１７〜５０ｎｔ、１７〜４０ｎｔ、１７〜３０ｎｔ、１７〜２５ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、対象核酸の挿入部位の長さは、５〜４０ｎｔの範囲の長さを有する。
核酸の修飾
いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ）は、核酸に新たなまたは強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供するために、１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾等を有する。ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合は、リン酸基を糖の２′、３′、または５′ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを共有結合で互いに連結して、線状ポリマー化合物を形成する。順に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、さらに接合して環状化合物を形成することができるが、線状化合物が好適である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得るため、完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を産生するような方法で折り畳むことができる。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成しているとみなされている。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結または骨格は、３′〜５′ホスホジエステル連結である。
好適な核酸修飾としては、２′Ｏメチル修飾ヌクレオチド、２′フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート連結を有するヌクレオチド、及び５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））が挙げられるが、これらに限定されない。追加の詳細及び追加の修飾は、以下に記載される。
２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド（２′−Ｏ−メチルＲＮＡとも称される）は、ｔＲＮＡ中に見出されるＲＮＡ及び転写後修飾として生じる他の小ＲＮＡの天然に存在する修飾である。２′−Ｏ−メチルＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチドは、直接合成され得る。この修飾は、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＴｍを増加させるが、ＲＮＡ：ＤＮＡ安定性においてはわずかな変化をもたらすにすぎない。一本鎖リボヌクレアーゼによる攻撃に関して安定しており、典型的にＤＮＡよりもＤＮａｓｅの影響を５〜１０倍受けにくい。一般に、標的メッセージに対する安定性及び結合親和性を増加させる手段として、アンチセンスオリゴにおいて使用される。
２′フルオロ修飾ヌクレオチド（例えば、２′フルオロ塩基）は、結合親和性（Ｔｍ）を増加させ、また天然のＲＮＡと比較したときに、いくらかの相対的ヌクレアーゼ耐性を与える、フルオリン修飾リボースを有する。これらの修飾は、一般に、血清または他の生物流体中の安定性を改善するために、リボザイム及びｓｉＲＮＡにおいて用いられる。
ＬＮＡ塩基は、ＲＮＡ Ａ型らせん二重鎖幾何形状を好む、Ｃ３′末端位置にある塩基をロックするリボース骨格に対する修飾を有する。この修飾は、Ｔｍを著しく増加させ、また非常にヌクレアーゼ耐性がある。複数のＬＮＡ挿入は、３′末端を除く任意の位置にあるオリゴに配置され得る。アンチセンスオリゴからＳＮＰ検出及び対立遺伝子特異的ＰＣＲに対するハイブリダイゼーションプローブに及ぶ用途が記載されている。ＬＮＡによって与えられるＴｍの大幅な増加に起因して、それらはまた、プライマー二量体形成ならびに自己ヘアピン形成の増加を引き起こし得る。ある場合には、単一のオリゴに組み込まれるＬＮＡの数は、１０塩基以下である。
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（すなわち、ホスホロチオエート連結）は、核酸（例えば、オリゴ）のリン酸骨格中の非架橋酸素の代わりに硫黄原子を用いる。この修飾は、ヌクレオチド間連結をヌクレアーゼ変性に耐えるようにする。ホスホロチオエート結合は、エクソヌクレアーゼ変性を阻害するために、オリゴの５′または３′末端における最後の３〜５ヌクレオチド間に導入され得る。ホスホロチオエート結合をオリゴ内（例えば、オリゴ全体を通して）に含めることは、エンドヌクレアーゼによる攻撃の低減も同様に助けることができる。
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである１つ以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、１つ以上の２′フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、１つ以上のＬＮＡ塩基を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、ホスホロチオエート結合によって連結された１つ以上のヌクレオチドを有する（すなわち、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート連結を有する）。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ）を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、修飾ヌクレオチドの組み合わせを有する。例えば、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、他の修飾（例えば、２′−Ｏ−メチルヌクレオチド及び／または２′フルオロ修飾ヌクレオチド及び／またはＬＮＡ塩基及び／またはホスホロチオエート連結）を有する１つ以上のヌクレオチドを有することに加えて、５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））を有し得る。
修飾骨格及び修飾ヌクレオシド間連結
修飾を含む好適な核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ）の例としては、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含む核酸が挙げられる。修飾骨格を有する核酸は、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有しないものを含む。
リン酸原子を中に含む好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３′−アルキレンホスホネート、５′−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネート）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３′−アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常３′−５′連結を有するボラノホスフェート、それらの２′−５′連結類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が、３′−３′、５′−５′、または２′−２′連結である、反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、単一の３′−３′連結を３′最端ヌクレオチド間連結において、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を含む（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に−ＣＨ2 −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｏ−ＣＨ2 −（メチレン（メチルイミノまたはＭＭＩ骨格として知られる）またはＭＭＩ骨格）、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −ＣＨ2 −を含む（天然のホスホジエステルヌクレオチド間連結は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ2 −として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結は、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好適なアミドヌクレオシド間連結は、米国特許第５，６０２，２４０号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるように、モルホリノ骨格構造を有する核酸もまた好適である。例えば、いくつかの実施形態では、対象の核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に代わる。
リン原子を中に含まない好適な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を有する他のものを有するものを含む。
模倣体
対象の核酸は、核酸模倣体であり得る。「模倣体」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみまたはフラノース環及びヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において代理糖であると称される。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのような核酸、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドで置き換えられる。ヌクレオチドは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告された１つのポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える２つ以上の結合されたアミノエチルグリシン単位である。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製について記載する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない（その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
研究されたポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に付着した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を連結する、複数の連結基が報告されている。連結基の１つのクラスを選択して、非イオン性オリゴマー化合物を得た。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物が、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有する可能性は低い。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。モノマーサブユニットを接合する様々な異なる連結基を有する、モルホリノクラスのポリヌクレオチド内の様々な化合物が調製された。
ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環と置き換えられる。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護ホスホルアミダイトモノマーが調製され、オリゴマー化合物合成に続いて古典的ホスホルアミダイト化学のために使用された。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物及びＣｅＮＡで修飾された特定の位置を有するオリゴヌクレオチドが調製され、研究された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照されたい。その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に対する同様の安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ相補体との複合体を形成した。ＣｅＮＡ構造を天然の核酸構造に組み込むことの研究は、ＮＭＲ及び円二色性によって示され、容易な立体構造適応を進めた。
さらなる修飾は、２′−ヒドロキシル基は、糖環の４′炭素原子に結合され、それによって２′−Ｃ、４′−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それによって二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２′酸素原子及び４′炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ2 −）基であり得、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３′−エクソヌクレアーゼ分解に対する安定性、ならびに良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
オリゴマー化及び核酸認識特性と共に、ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製が記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びその調製物はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６、ならびに米国出願第２０１２０１６５５１４号、同第２０１００２１６９８３号、同第２００９００４１８０９号、同第２００６０１１７４１０号、同第２００４００１４９５９号、同第２００２００９４５５５号、及び同第２００２００８６９９８号に記載されており、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
修飾された糖部分
対象の核酸はまた、１つ以上の置換された糖部分を含有し得る。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ．ｓｕｂ．１〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ（（ＣＨ2 ）n Ｏ）m ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＮＨ2 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＮＨ2 、及びＯ（ＣＨ2 ）n ＯＮ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 ）2 が特に好適であり、ｎ及びｍは、１〜約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ1 〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3 、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3 、ＯＣＦ3 、ＳＯＣＨ3 、ＳＯ2 ＣＨ3 、ＯＮＯ2 、ＮＯ2 、Ｎ3 、ＮＨ2 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＣＨ3 、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２′−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、下記の実施例において記載される、Ｏ（ＣＨ2 ）2 ＯＮ（ＣＨ3 ）2 基（２′−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、２′−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２′−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２′−Ｏ−ＣＨ2 −Ｏ−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）2 を含む。
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ3 ）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 ）、アリル（−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、及びフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２′−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。好適な２′−アラビノ修飾は、２′−Ｆである。同様の修飾が、オリゴマー化合物上の他の位置で、特に３′末端ヌクレオシド上のまたは２′−５′結合オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、及び５′末端ヌクレオチドの５′位で行われてもよい。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
塩基修飾及び置換
対象の核酸はまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用される場合、「非修飾」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ3 ）ウラシル及びピリミジン塩基のシトシン及び他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３′，２′：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）が挙げられる。
複素環式塩基部分には、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンで置換されるものも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる（その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えば、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、好適な塩基置換である。
共役体
対象の核酸の別の可能な修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上させる１つ以上の部分または共役体を、ポリヌクレオチドに化学的に結合させることを伴う。このような部分または共役体は、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合した共役体基を含むことができる。共役体基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。好適な共役体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を向上させる基としては、取り込みを改善する、分解に対する耐性を向上させる、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を向上させる基としては、対象の核酸の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。
共役体部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
共役体は、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含んでよく、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指し得る。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子に付着したＰＴＤは、例えば、細胞外空間からサイトゾルに、またはサイトゾルから細胞小器官（例えば、核）内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの３′末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの５′末端に共有結合される。例示的なＰＴＤとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１２）を含むＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分な複数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２−１７３７）；欠損ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号１１３）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１１４）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号１１５）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１６）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１７）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１８）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、以下のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１９）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１２０）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１２１）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２２）、及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２３）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これが正味電荷をほぼ０に低減し、それにより細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断する。
標的細胞中に構成要素を導入
本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡ（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはＣａｓＸポリペプチド（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／または本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド（もしくは本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはドナーポリヌクレオチド（ドナーテンプレート）は、様々な周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。
様々な化合物及び方法のうちのいずれかを使用して、本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる（例えば、ＣａｓＸ系は、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｂ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｃ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｄ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｅ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｆ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｇ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｈ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｉ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｊ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｋ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｌ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｍ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｎ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｏ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｐ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｑ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；もしくはｒ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；または（ａ）〜（ｒ）のうちの１つのいくつかの異形を含む。非限定例として、本開示のＣａｓＸ系は、脂質と組み合わせることができる。別の非限定例として、本開示のＣａｓＸ系は、粒子と組み合わされ得るか、または粒子中に配合され得る。
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、対象の核酸（例えば、発現構築物／ベクター）を標的細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞等）に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、共役、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３）等が挙げられる。
ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチドは、ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター等）として提供される。ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチドは、タンパク質として直接提供される（例えば、関連ガイドＲＮＡ無しに、または関連ガイドＲＮＡと共に、すなわち、リボヌクレオタンパク質複合体として）。本開示のＣａｓＸポリペプチドは、任意の簡便な方法によって細胞に導入（細胞に提供）することができ、そのような方法は、当業者に知られている。例示的な例として、本開示のＣａｓＸポリペプチドは、細胞に直接注入され得る（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡまたはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸と共にまたは無しに、及びドナーポリヌクレオチドと共にまたは無しに）。別の例として、本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）の予備形成された複合体は、細胞（例えば、真核細胞）に導入され得る（例えば、注入を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の成分に共役された、例えば、ＣａｓＸタンパク質に共役された、ガイドＲＮＡに共役された、本開示のＣａｓＸポリペプチド及びガイドＲＮＡに共役されたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して等）。
ある場合には、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド（例えば、融合パートナーに融合されたｄＣａｓＸ、融合パートナーに融合されたニッカーゼＣａｓＸ等）は、ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター等）として提供される。ある場合には、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、タンパク質として直接提供される（例えば、関連ガイドＲＮＡ無しに、または関連ガイドＲＮＡと共に、すなわち、リボヌクレオタンパク質複合体として）。本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、任意の簡便な方法によって細胞に導入（細胞に提供）することができ、そのような方法は、当業者に知られている。例示的な例として、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、細胞に直接注入され得る（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸と共にまたは無しに、及びドナーポリヌクレオチドと共にまたは無しに）。別の例として、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）の予備形成された複合体は、細胞に導入され得る（例えば、注入を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の成分に共役された、例えば、ＣａｓＸタンパク質に共役された、ガイドＲＮＡに共役された、本開示のＣａｓＸポリペプチド及びガイドＲＮＡに共役されたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して等）。
ある場合には、核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）は、粒子中の細胞（例えば、標的宿主細胞）及び／またはポリペプチド（例えば、ＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸ融合ポリペプチド）に送達されるか、または粒子と会合される。ある場合には、本開示のＣａｓＸ系は、粒子中の細胞に送達されるか、または粒子と会合される。「粒子」及び「ナノ粒子」という用語は、必要に応じて同義に使用され得る。本開示のＣａｓＸポリペプチド及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、ＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡは、例えば、複合体として（例えば、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として）は、粒子、例えば、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含む送達粒子を介して送達され得、例えば、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含み、及び／または親水性ポリマーは、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、及び／または粒子は、コレステロールをさらに含む（例えば、配合物１からの粒子＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール０；配合物番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール０；配合物番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール５）。例えば、粒子は、多段階プロセスを使用して形成することができ、ここでＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡは、例えば、１：１モル比で、例えば、室温で、例えば、３０分間にわたって、例えば、無菌のヌクレアーゼを含まない１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で一緒に混合され、別個に、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及び配合物に必要な場合はコレステロールを、アルコール、例えば、１００％エタノールに溶解し、これら２つの溶液を一緒に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。
本開示のＣａｓＸポリペプチド（もしくは本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、または本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター）及び／またはＣａｓＸガイドＲＮＡ（もしくはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現ベクターなどの核酸）は、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、リン脂質二層シェルによって封入されたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子を使用することができる。ある場合には、自己集合生体付着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が使用され、そのような粒子／ナノ粒子は、例えば、脳へのペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用され得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達などの他の実施形態もまた企図される。保護され、疾患の部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを必要とする分子エンベロープ技術を使用することができる。約５ｍｇ／ｋｇの用量は、様々な因子、例えば、標的組織に応じて、単回または多回用量で使用され得る。
リピドイド化合物（例えば、米国特許出願第２０１１０２９３７０３号に記載される）はまた、ポリヌクレオチドの投与において有用であり、それを使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を送達することができる（例えば、ＣａｓＸ系は、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｂ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｃ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｄ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｅ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｆ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｇ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｈ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｉ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｊ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｋ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｌ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｍ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｎ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｏ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｐ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｑ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；もしくはｒ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；または（ａ）〜（ｒ）のうちの１つのいくつかの異形を含む。一態様では、アミノアルコールリピドイド化合物は、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、脂質等と組み合わされて、粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子は、任意に、薬学的賦形剤と組み合わされて、薬学的組成物を形成することができる。
ポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。米国特許公開第２０１３０３０２４０１号は、コンビナトリアル重合を使用して調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。
糖系粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃは、ＷＯ２０１４１１８２７２（参照により本明細書に組み込まれる）及びＮａｉｒ，Ｊ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３６（４９），１６９５８−１６９６１）を参照して記載されるように使用することができ、それを使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。
ある場合には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーを、ＬＮＰ中に低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）で負荷され得、イオン化脂質は、正電荷を示す。しなしながら、生理学的ｐＨ値において、ＬＮＰは、より長い循環時間に対応した低表面電荷を呈する。４種のイオン化カチオン脂質、すなわち１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に焦点が当てられている。ＬＮＰの調製は、例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：１２８６−２２００）に記載されている。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２″−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクリノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（．ｏｍｅｇａ．−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を使用することができる。核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、本開示の核酸等）は、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有するＬＮＰにカプセル化され得る（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを４０：１０：４０：１０モル比で）。ある場合には、０．２％のＳＰ−ＤｉＯＣ１８が組み込まれる。
球形核酸（ＳＮＡ（商標）構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２７：６３５−６３８、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．″Ｍｅｄ．″５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２を参照されたい。
ＲＮＡを有する自己集合ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠隔端に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）でＰＥＧ化されるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で構築され得る。
一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、５００ｎｍ以下、例えば、２５ｎｍ〜３５ｎｍ、３５ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜７５ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、２００ｎｍ〜３００ｎｍ、３００ｎｍ〜４００ｎｍ、または４００ｎｍ〜５００ｎｍの直系を有する。ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの直径を有する。ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、１００ｎｍ以下の直径を有する。ある場合には、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの直径を有する。
本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、異なる形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質系固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組み合わせとして提供され得る。金属、絶縁体、及び半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）が調製され得る。半導体材料で作製されたナノ粒子はまた、それらが電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい場合（典型的に、１０ｎｍ以下）、標識化量子ドットであり得る。そのようなナノスケール粒子は、生物医学的適用において、薬物担体または造影剤として使用され、本開示において同様の目的で適応され得る。
半固体かつ軟質のナノ粒子はまた、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する際に使用するのに好適である。半固体性質のプロトタイプナノ粒子は、リポソームである。
ある場合には、エキソソームを使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる、内因性ナノベシクル粒子である。
ある場合には、リポソームを使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達する。リポソームは内部水性区画を取り囲む単層または多層脂質二層、及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二層で構成される球形ベシクル構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から作製され得るが、リポソームを生成するために、リン脂質が最も一般に使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されたときに自然に起こるが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出装置を使用することによる振盪の形態で力を印加することによって促進され得る。それらの構造及び特性を修飾するために、いくつかの他の添加剤がリポソームに添加されてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソーム内部カーゴの漏出を防止するために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかがリポソーム混合物に添加されてもよい。リポソーム配合物は、主に、天然のリン脂質、ならびに１，２−ジステアロリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドなどの脂質で構成され得る。
安定な核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。ＳＮＡＬＰ配合物は、脂質３−Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを、２：４０：１０：４８モル％比で含有し得る。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと配合することによって、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを使用して調製され得る。結果として得られるＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍのサイズであり得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る。
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。以下の脂質組成物、アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）をそれぞれ４０／１０／４０／１０モル比、及びおよそ０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比で有する予備形成されたベシクルが企図され得る。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数を保証するために、粒子は、ガイドＲＮＡを付加する前に８０ｎｍ膜を通して最大３回押し出され得る。非常に強力なアミノ脂質１６を含有する粒子が使用されてもよく、ここで４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比が、さらに最適化され、インビボ活性を向上させることができる。
脂質は、本開示のＣａｓＸ系またはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸と配合され、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。好適な脂質としては、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが挙げられるが、これらに限定されず、ＰＥＧ−ＤＭＧは、自発的なベシクル形成手順を使用して、本開示のＣａｓＸ系またはその成分と配合され得る。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。
本開示のＣａｓＸ系またはその成分は、米国公開済み出願第２０１３０２５２２８１号及び同第２０１３０２４５１０７号及び同第２０１３０２４４２７９号にさらに記載されるように、ＰＬＧＡ微小球にカプセル化されて送達され得る。
超電荷タンパク質を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。超電荷タンパク質は、異常に高い正または負の正味理論的電荷を有する操作されたまたは天然に存在するタンパク質のクラスである。超負及電荷及び超正電荷のタンパク質の両方は、熱的または化学的に誘導された凝集に耐える能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳動物細胞を透過することができる。カーゴをこれらのタンパク質、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることは、インビトロ及びインビボの両方で、哺乳動物細胞へのこれらの高分子の機能的送達を促進し得る。
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる。ＣＰＰは、典型的に、リジンもしくはアルギニンなどの高い相対的存在量の正電荷アミノ酸を含有するか、または極性／電荷アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成物を有する。
埋め込み可能なデバイスを使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸、ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸、ドナーテンプレート等）、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞に送達することができる（例えば、インビボでの標的細胞、この標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官中の標的細胞等である）。本開示のＣａｓＸポリペプチド、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＸ系を標的細胞（例えば、インビボでの標的細胞、この標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官中の標的細胞等である）に送達する際に使用するのに適した埋め込み可能なデバイスは、ＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＲＮＰ、またはＣａｓＸ系（もしくはその成分、例えば、本開示の核酸）を含む容器（例えば、貯留器、マトリックス等）を含み得る。
好適な埋め込み可能なデバイスは、例えば、デバイス本体として使用されるマトリックスなどのポリマー基質、またある場合には、金属などの追加の足場材料、追加のポリマー、ならびに可視性及び撮像を向上させる材料を含み得る。埋め込み可能な送達デバイスは、局所的かつ長期間にわたる放出を提供することにおいて有利であり得、送達されるポリペプチド及び／または核酸は、標的部位（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、腫瘍を取り囲む血管系、罹患組織等）に直接放出される。好適な埋め込み型デバイスとしては、腹腔などの空洞への送達及び／または薬物送達系が係留もしくは付着されていない任意の他の種類の投与において使用するのに適したデバイスが挙げられ、生安定性及び／または生分解性及び／または生体吸収性ポリマー基質（例えば、任意にマトリックスであり得る）を含む。ある場合には、好適な埋め込み型薬物送達デバイスは、分解性ポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食である。ある場合には、好適な埋め込み可能な薬物送達デバイスは、非分解性または分解の遅いポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食ではなく拡散であり、それにより外側部分は膜として機能し、その内側部分は、薬物貯留器として機能し、これは実際には長期間（例えば、約１週間〜約数ヶ月間）にわたって周囲に影響されない。異なる放出機序を有する異なるポリマーの組み合わせが、任意に使用されてもよい。濃度勾配は、総放出期間の実質的な期間中、効果的に一定に維持され得るため、拡散速度は効果的に一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。「一定」という用語は、治療効果の低い閾値より上で維持されるが、依然として任意に初期バーストを特徴とし得る、及び／または変動し得る（例えば、ある特定の程度に増加及び減少する）拡散速度を意味する。拡散速度は、長期間にわたってそのように維持され得、治療有効期間（例えば、有効サイレンシング期間）を最適化するために、ある特定のレベルで一定であるとみなされ得る。
ある場合には、埋め込み型送達系は、化学的性質であるか否か、または対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃に起因して、ヌクレオチド系治療剤を分解から遮断するように設計される。
デバイスの埋め込みのための部位、または標的部位が、最大治療効果のために選択され得る。例えば、送達デバイスは、腫瘍環境または腫瘍に関連した血液供給内またはその近位に埋め込まれ得る。標的位置は、例えば、１）基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病またはアルツハイマー病のような変性部位での脳、２）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎、３）子宮頸部、４）活性及び慢性炎症性関節、５）乾癬の場合のような真皮、７）鎮痛効果のための交換及び感覚神経部位、７）骨、８）急性または慢性感染の部位、９）膣内、１０）内耳−聴覚系、内耳の迷路、前庭系、１１）気管内、１２）心臓内、環状部、心外膜、１３）尿路または膀胱、１４）胆道系、１５）腎臓、肝臓、脾臓を含むが、これらに限定されない実質組織、１６）リンパ節、１７）唾液腺、１８）歯肉、１９）関節内（関節中）、２０）眼内、２１）脳組織、２２）脳室、２３）腹腔を含む空洞（例えば、限定されないが、卵巣癌の場合）、２４）食道内、２５）直腸内、ならびに２６）血管系中であり得る。
埋め込みなどの挿入の方法は、任意に、他の種類の組織埋め込みのため、及び／または挿入のため、及び／または組織採取のため、任意に修飾無しに、あるいは任意にそのような方法において主要でない修飾のみと共に使用されてもよい。そのような方法として、任意に、近接照射療法、生検、超音波を伴う及び／または伴わない内視鏡検査、例えば、脳組織への定位放射線法、関節、腹部器官、膀胱壁、及び体腔中への腹腔鏡の埋め込みを含む腹腔鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
修飾された宿主細胞
本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチド、及び／または本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、修飾された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドを含む修飾された細胞を提供し、修飾された細胞は、通常は本開示のＣａｓＸポリペプチドを含まない細胞である。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、修飾された細胞（例えば、遺伝子修飾された細胞）を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｂ）本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｃ）ドナーテンプレートをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。
本開示のＣａｓＸポリペプチドのレシピエントとして役立つ細胞、及び／または本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び／または本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡは、例えば、インビトロ細胞、インビボ細胞、エクスビボ細胞、一次細胞、がん細胞、動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞等を含む様々な細胞のうちのいずれかであり得る。本開示のＣａｓＸポリペプチドのレシピエントとして役立つ細胞、及び／または本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び／または本開示のＣａｓＸガイドＲＮＡは、「宿主細胞」または「標的細胞」と称される。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＸ系のレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＸ ＲＮＰのレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＸ系の単一成分のレシピエントであり得る。
細胞（標的細胞）の非限定例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生生物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類コケ植物、苔類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。ある場合には、細胞は、天然の生物を起源としない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得る。人工細胞とも称される）。
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体からの培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体中の細胞）であり得る。細胞は、単離細胞であり得る。細胞は、生物の体内の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養物（例えば、インビトロ細胞培養物）中の細胞であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、無脊椎動物細胞であり得るか、または無脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞であり得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液肝細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
ある場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。ある場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。ある場合には、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
ある場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞と称される。
成体幹細胞は、分化組織中に常駐するが、自己更新の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例は、当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅官幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。ある場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３−として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統をインビボで再配置させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。そのようなものとして、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
他の実施形態では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することが可能である。神経幹細胞は、多分裂が可能である多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、ニューロン及びグリア細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように傾倒した細胞を産生し得る。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されたＭＳＣは分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
細胞は、ある場合には、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
ある場合には、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（アプランド）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オーツ麦、ピーナッツ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（ダラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例として、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツトップ（ｂｅｅｔ ｔｏｐｓ）、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、エンダイブ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、ｇａｉｌｏｎ、ガランガル（サイアム、タイジンジャー）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（ｑｕｉｌｅｔｅ）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（ｌｏｌｌａ ｒｏｓｓａ）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ｌｏ ｂｏｋ、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（糸瓜）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、豆、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（ｓｅａ ｂｅａｎ）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム（ｎａｍｅｓ）、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
細胞は、ある場合には、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、鋏角類、多足類、六脚類、クモ類、昆虫類、イシノミ目、シミ類、旧翅下綱、カゲロウ目、トンボ目、不均翅亜目、イトトンボ類、新翅類、外翅類、積翅類、シロアリモドキ目、直翅類、絶翅目、ハサミムシ類、網翅類、非翅目、ガロアムシ科、マントファスマ科、ナナフシ、ゴキブリ、等翅類、カマキリ類、副脈翅類、チャタテ虫、アザミウマ目、シラム目、半翅類、内翅類もしくは完全変態類、膜翅目、鞘翅目、ネジレバネ目、ラクダムシ目、広翅類、脈翅類、長翅類、ノミ目、双翅類、毛翅目、または鱗翅目の亜目、科、亜科、群、下位群、または種であり得る。
細胞は、ある場合には、昆虫細胞である。例えば、ある場合には、細胞は、蚊、バッタ、ナンキンムシ、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、ラウス、蛾、またはカブトムシの細胞である。
キット
本開示は、本開示のＣａｓＸ系、または本開示のＣａｓＸ系の成分を含むキットを提供する。
本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｂ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｃ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｄ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｅ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｆ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｇ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡ；ｈ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びドナーテンプレート核酸；ｉ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｊ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｋ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｌ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーテンプレート核酸をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；ｍ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｎ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｏ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター；ｐ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組み換え発現ベクター、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組み換え発現ベクター、及びドナーテンプレート核酸；ｑ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；もしくはｒ）本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び第２のＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター；または（ａ）〜（ｒ）のうちの１つのいくつかの異形を含み得る。
本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓＸ系の上記の成分（または本開示のＣａｓＸ系を含み得る）、ならびにｂ）１種以上の追加の試薬、例えば、ｉ）緩衝液、ｉｉ）プロテアーゼ阻害剤、ｉｉｉ）ヌクレアーゼ阻害剤、ｉｖ）検出可能な標識を現像または可視化するために必要な試薬、ｖ）正及び／または負の対照標的ＤＮＡ、ｖｉ）正及び／または負の対照ＣａｓＸガイドＲＮＡ等を含み得る。本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓＸ系の上記の成分（または本開示のＣａｓＸ系を含み得る）、及びｂ）治療剤を含み得る。
本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓＸガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、及びｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡのＣａｓＸ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含み得る。本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓＸガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡのＣａｓＸ結合部分をコードするヌクレオチド配列、及びｃ）本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含み得る。
実用性
本開示のＣａｓＸポリペプチドまたは本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、様々な方法において用途を見出す（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡと組み合わせて、またある場合には、ドナーテンプレートとさらに組み合わせて）。例えば、本開示のＣａｓＸポリペプチドを使用して、（ｉ）標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖）を修飾する（例えば、切断、例えば、ニック、メチレート等）、（ｉｉ）標的核酸の転写を変調する、（ｉｉｉ）標的核酸を標識する、（ｉｖ）標的核酸に結合する（例えば、単離、標識化、撮像、追跡等の目的）、（ｖ）標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する等が可能である。このため、本開示は、標的核酸を修飾する方法を提供する。ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、及びｂ）１つ以上（例えば、２つ）のＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含む。ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）本開示のＣａｓＸポリペプチド、ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びｃ）ドナー核酸（例えば、ドナーテンプレート）と接触させることを含む。ある場合には、接触ステップは、インビトロで細胞中で実行される。ある場合には、接触ステップは、インビボで細胞中で実行される。ある場合には、接触ステップは、エクスビボで細胞中で実行される。
ＣａｓＸポリペプチドを使用する方法は、ＣａｓＸポリペプチドを標的核酸中の特定領域に（会合したＣａｓＸガイドＲＮＡによってそこで標的されることによって）結合することを含むため、これらの方法は、一般に本明細書では、結合方法（例えば、標的核酸の結合方法）として言及される。しかしながら、ある場合には、結合方法は、標的核酸の結合以外は何ももたらさない場合があるが、他の場合では、この方法は、異なる最終結果を有し得る（例えば、この方法は、標的核酸の修飾、例えば、切断／メチル化等；標的核酸からの転写の変調；標的核酸の翻訳の変調；ゲノム編集；標的核酸に会合したタンパク質の変調；標的核酸の単離等をもたらし得る）ことを理解されたい。
好適な方法の例については、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５；、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０−９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
例えば、本開示は、標的核酸を切断する方法、標的核酸を編集する方法、標的核酸からの転写を変調する方法、標的核酸を単離する方法、標的核酸を結合する方法、標的核酸を撮像する方法、標的核酸を修飾する方法等を提供する（但し、これらに限定されない）。
本明細書において使用される場合、「標的核酸を接触させる」及び例えば、ＣａｓＸポリペプチドと、またはＣａｓＸ融合ポリペプチド等と「標的核酸を接触させる」という用語／語句は、標的核酸を接触させるためのすべての方法を包含する。例えば、ＣａｓＸポリペプチドは、タンパク質、ＲＮＡ（ＣａｓＸポリペプチドをコードする）、またはＤＮＡ（ＣａｓＸポリペプチドをコードする）として細胞に提供され得るが、ＣａｓＸガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る。そのようなものとして、例えば、細胞中（例えば、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側）で方法を行うとき、標的核酸を接触させることを含む方法は、活性／最終状態にある（例えば、ＣａｓＸポリペプチドのタンパク質（複数可）の形態の、ＣａｓＸ融合ポリペプチドのタンパク質の形態の、ある場合にはガイドＲＮＡのＲＮＡの形態の）いずれかまたはすべての成分の、細胞への導入を包含し、また成分のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸（例えば、ＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ドナーテンプレートをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）の、細胞への導入を包含する。これらの方法はまた、細胞の外側でインビトロで行われ得るため、標的核酸を接触させることを含む方法は、（別途特定されない限り）インビトロで細胞の外側、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側等で接触させることを含む。
ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓＸポリペプチドと接触させること、または本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドと接触させることを含む。ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含む。ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓＸポリペプチド１、第１のＣａｓＸガイドＲＮＡ、及び第２のＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含み、ある場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡテンプレートと接触させることを含む。
標的核酸及び関心対象の標的細胞
本開示のＣａｓＸポリペプチド、または本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドは、ＣａｓＸガイドＲＮＡに結合されたとき、標的核酸に結合することができ、ある場合には、標的核酸に結合し、修飾することができる。標的核酸は、任意の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）であり得、二本鎖または一本鎖であり得、任意の種類の核酸（例えば、染色体（ゲノムＤＮＡ）、染色体由来、染色体ＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、細胞外、細胞内、ミトコンドリア、葉緑体、線状、環状等）であり得、また任意の生物に由来し得る（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡが、標的核酸中の標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む限り、標的核酸は標的化され得る）。
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。標的核酸は、二本鎖（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ）または一本鎖（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ）であり得る。ある場合には、標的核酸は、一本鎖である。ある場合には、標的核酸は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。ある場合には、標的ｓｓＲＮＡ（例えば、標的細胞ｓｓＲＮＡ、ウイルスｓｓＲＮＡ等）は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される。ある場合には、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、ウイルスＤＮＡ）である。上記のように、ある場合には、標的核酸は、一本鎖である。
標的核酸は、任意の場所、例えば、インビトロで細胞の外側、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側に位置し得る。好適な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的核酸を含み得る）としては、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ミバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、昆虫の細胞（例えば、蚊、ミツバチ、農業害虫等）、クモ形類動物の細胞（例えば、クモ、ダニ等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯類の細胞（例えば、マウス、ラット）、ウサギ類の細胞（例えば、ウサギ）、有蹄類の細胞（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒツジ、ヤギ等）、海洋哺乳動物の細胞（例えば、クジラ、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。任意の種類の細胞が関心対象であり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、成体細胞、体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞、任意の段階にある胚のインビトロまたはインビボの胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフィッシュ胚等）。
細胞は、確立された細胞株に由来し得るか、またはそれらは一次細胞であってもよく、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書では、対象に由来し、インビトロで培養物の限定数の継代、すなわち分裂にわたって成長させた細胞及び細胞培養物を指すように同義に使用される。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されたが、危機段階を通過するには十分でない培養物である。典型的には、一次細胞株は、インビトロで１０継代未満にわたって維持される。標的細胞は、単細胞生物であり得、及び／または培養物中で成長され得る。細胞が一次細胞である場合、それらは任意の簡便な方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって簡便に採取され得るが、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等由来の細胞は、生検によって簡便に採取され得る。
上記適用のうちのいくつかにおいて、対象の方法を用いて、標的核酸切断、標的核酸修飾を誘導する、及び／または有糸分裂もしくは有糸分裂後の細胞中の標的核酸を（例えば、可視化のために、収集及び／または分析等のために）、インビボで及び／またはエクスビボで及び／またはインビトロで結合する（例えば、標的化ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生を妨害する、標的ＤＮＡを切断するか、または他の方法で修飾する、標的細胞を遺伝子修飾する）ことができる。ガイドＲＮＡは、標的核酸にハイブリダイズすることによって特異性を提供するため、開示される方法における関心対象の有糸分裂及び／または有糸分裂後の細胞としては、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ミバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞等）を挙げることができる。ある場合には、対象のＣａｓＸタンパク質（及び／もしくはＤＮＡ及び／もしくはＲＮＡなどのタンパク質をコードする核酸）ならびに／またはＣａｓＸガイドＲＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）、ならびに／またはドナーテンプレート、及び／またはＲＮＰは、個体（例えば、哺乳動物、ラット、マウス、ブタ、霊長類、非ヒト霊長類、ヒト等）に導入され得る（すなわち、標的細胞がインビボであり得る）。ある場合には、そのような投与は、例えば、標的化細胞のゲノムを編集することによって、疾患を治療する及び／または予防する目的のためであり得る。
植物細胞としては、単子葉植物の細胞及び双子葉植物が挙げられる。細胞は、根細胞、葉細胞、木部の細胞、師部の細胞、形成層の細胞、頂端分裂組織細胞、実質細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞等であり得る。植物細胞としては、農業作物、例えば小麦、トウモロコシ、米、モロコシ、キビ、大豆等の細胞が挙げられる。植物細胞としては、農業果物及びナッツ植物細胞、例えば、アプリコット、オレンジ、レモン、リンゴ、プラム、ナシ、アーモンド等を産生する植物の細胞が挙げられる。
標的細胞の追加の例は、「修飾細胞」という表題のセクションにおいて上に列挙される。細胞（標的細胞）の非限定例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生生物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類コケ植物、苔類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。ある場合には、細胞は、天然の生物を起源としない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得る。人工細胞とも称される）。
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体からの培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体中の細胞）であり得る。細胞は、単離細胞であり得る。細胞は、生物の体内の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養物（例えば、インビトロ細胞培養物）中の細胞であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、無脊椎動物細胞であり得るか、または無脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞であり得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液肝細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
ある場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。ある場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。ある場合には、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
ある場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞と称される。
成体幹細胞は、分化組織中に常駐するが、自己更新の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例は、当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅官幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。ある場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３−として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統をインビボで再配置させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。そのようなものとして、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
他の実施形態では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することが可能である。神経幹細胞は、多分裂が可能である多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、ニューロン及びグリア細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように傾倒した細胞を産生し得る。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されたＭＳＣは分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
細胞は、ある場合には、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
ある場合には、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（アプランド）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オーツ麦、ピーナッツ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（ダラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例として、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツトップ（ｂｅｅｔ ｔｏｐｓ）、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、エンダイブ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、ｇａｉｌｏｎ、ガランガル（サイアム、タイジンジャー）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（ｑｕｉｌｅｔｅ）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（ｌｏｌｌａ ｒｏｓｓａ）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ｌｏ ｂｏｋ、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（糸瓜）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、豆、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（ｓｅａ ｂｅａｎ）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム（ｎａｍｅｓ）、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
細胞は、ある場合には、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、鋏角類、多足類、六脚類、クモ類、昆虫類、イシノミ目、シミ類、旧翅下綱、カゲロウ目、トンボ目、不均翅亜目、イトトンボ類、新翅類、外翅類、積翅類、シロアリモドキ目、直翅類、絶翅目、ハサミムシ類、網翅類、非翅目、ガロアムシ科、マントファスマ科、ナナフシ、ゴキブリ、等翅類、カマキリ類、副脈翅類、チャタテ虫、アザミウマ目、シラム目、半翅類、内翅類もしくは完全変態類、膜翅目、鞘翅目、ネジレバネ目、ラクダムシ目、広翅類、脈翅類、長翅類、ノミ目、双翅類、毛翅目、または鱗翅目の亜目、科、亜科、群、下位群、または種であり得る。
細胞は、ある場合には、昆虫細胞である。例えば、ある場合には、細胞は、蚊、バッタ、ナンキンムシ、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、ラウス、蛾、またはカブトムシの細胞である。
標的細胞中に構成要素を導入
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）、及び／またはＣａｓ９融合ポリペプチド（またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）、及び／またはドナーポリヌクレオチドは、様々な周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。
核酸を細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を標的細胞（例えば、真核細胞、ヒト細胞、幹細胞、前駆細胞等）に導入することができる。好適な方法は、本明細書の別の場所でより詳細に記載されており、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、共役、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）が挙げられる。成分のうちのいずれかまたはすべては、既知の方法、例えば、ヌクレオフェクションなどの既知の方法を使用して、組成物（例えば、ＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド等の任意の簡便な組み合わせを含む）として細胞に導入され得る。
ドナーポリヌクレオチド（ドナーテンプレート）
ＣａｓＸ二重または単一ガイドＲＮＡによって誘導されると、ある場合には、ＣａｓＸタンパク質は、（例えば、ＣａｓＸタンパク質がニッカーゼ変異形であるとき）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内で部位特異的二本鎖破断（ＤＳＢ）または一本鎖破断（ＳＳＢ）を生成し、これらは非相同末端接合（ＮＨＥＪ）または相同性配向型組み換え（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
ある場合には、標的ＤＮＡを（ＣａｓＸタンパク質及びＣａｓＸガイドＲＮＡと）接触させることは、非相同性末端接合または相同性配向型修復を許容する条件下で起こる。このため、ある場合には、対象の方法は、標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと（例えば、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することによって）接触させることを含み、ここでドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの部分が標的ＤＮＡに統合される。ある場合には、方法は、細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように修飾される。
ある場合には、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）及びＣａｓＸタンパク質（またはそれをコードする核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、１つ以上の発現ベクター）が、少なくとも標的ＤＮＡ配列に対して相同性を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と共投与され（例えば、標的核酸と接触される、細胞に投与される等）、対象の方法を使用して、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に付加する、すなわち、挿入または置換すること（例えば、核酸、例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードするものに「ノックイン」すること）、タグを付加すること（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）、調節配列を遺伝子に付加すること（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在シグナル等）、核酸配列を修飾すること（例えば、突然変異を導入する、正しい配列を導入することによって突然変異を引き起こす疾患を除去する）等ができる。そのようなものとして、ＣａｓＸガイドＲＮＡ及びＣａｓＸタンパク質を含む複合体は、任意のインビトロまたはインビボ用途において有用であり、部位特異的、すなわち「標的化」方法、例えば、遺伝子療法において、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス、抗病原性、または抗がん治療として使用される遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等、農業における遺伝子修飾された生物の産生、治療、診断、または研究を目的とした細胞によるタンパク質の大規模産生、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失または置換のための病原体の遺伝子の標的等でＤＮＡを修飾することが望ましい。
ポリヌクレオチド配列を、標的配列が切断されるゲノムに挿入することが望ましい用途において、ドナーポリヌクレオチド（ドナー配列を含む核酸）もまた細胞に提供され得る。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナーテンプレート」とは、ＣａｓＸタンパク質によって切断された部位において（ｄｓＤＮＡ切断後、標的ＤＮＡをニッキングした後、標的ＤＮＡを二重ニッキングした後等に）挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位におけるゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、標的部位に隣接するヌクレオチド配列（例えば、標的部位の約５０以下の塩基内、例えば、約３０塩基内、約１５塩基内、約１０塩基内、約５塩基内、または標的部位に直ぐ隣接する）との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含み、それと相同性を担持するゲノム配列との間の相同性配向型修復を支持することができる。およそ２５、５０、１００、もしくは２００ヌクレオチド、または２００超のヌクレオチドの、ドナーとゲノム配列との間の配列相同性（または１０〜２００ヌクレオチドの任意の整数値、もしくはそれ以上）は、相同性配向型修復を支持することができる。ドナーポリヌクレオチドは、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上等であり得る。
ドナー配列は、典型的に、それが置換されるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性配向型修復を支持するのに（例えば、遺伝子補正のため、例えば、疾患を引き起こす塩基対を、疾患を引き起こさない塩基対に変換するために）十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つ以上の単一塩基変更、挿入、欠失、反転、または再配置を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、相同性の２つの領域に隣接した非相同性配列を含み、それにより標的ＤＮＡ領域と２つの隣接する配列との間の相同性配向型修復は、標的領域における非相同性配列の挿入をもたらす。ドナー配列はまた、関心対象のＤＮＡ領域に対して相同性でなく、関心対象のＤＮＡ領域への挿入が意図されないベクター骨格を含有する配列を含み得る。一般に、ドナー配列の相同性領域（複数可）は、組み換えが所望されるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の配列同一性の任意の値が存在し得る。
ドナー配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列の相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多形、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）を含み得、これらを使用して、切断部位におけるドナー配列の良好な挿入について評価することができるか、またはある場合には、他の目的で使用することができる（例えば、標的化ゲノム遺伝子座における発現を示す）。ある場合には、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違は、アミノ酸配列を変更しないか、またはサイレントアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響しない変化）をもたらす。あるいは、これらの配列の相違は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組み換え配列、例えば、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列等を含み得る。
ある場合には、ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。ある場合には、ドナー配列は、二本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。線状または環状形態で細胞に導入され得る。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、任意の簡便な方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得、そのような方法は、当業者に既知である。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３′末端に付加され得、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一方の末端もしくは両方の末端にライゲーションされ得る。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、及び修飾ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、及びＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、これらに限定されない。線状ドナー配列の末端を保護するための代替として、追加の長さの配列が、組み換えに影響を及ぼすことなく分解され得る相同性の領域の外側に含まれ得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合された核酸として導入され得るか、またはＣａｓＸガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＸ融合ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について本明細書の別の場所に記載されるように、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
遺伝子導入の非ヒト生物
上記のように、ある場合には、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドを産生する遺伝子導入の非ヒト生物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子導入の非ヒト生物を提供する。
遺伝子導入の非ヒト動物
本開示は、遺伝子導入の非ヒト動物を提供し、この動物は、ＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子導入の非ヒト動物のゲノムは、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ある場合には、遺伝子導入の非ヒト動物は、遺伝子修飾のためにホモ接合性である。ある場合には、遺伝子導入の非ヒト動物は、遺伝子修飾のためにヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入の非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、魚（例えば、サケ、トラウト、ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚等）、両生類（カエル、イモリ、サンショウウオ等）、鳥（例えば、ニワトリ、七面鳥等）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ等）、非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄類、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等、ウサギ類（例えば、ウサギ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類等）等である。ある場合には、遺伝子導入の非ヒト動物は、無脊椎動物である。ある場合には、遺伝子導入の非ヒト動物は、昆虫（例えば、蚊、農業害虫等）である。ある場合には、遺伝子導入の非ヒト動物は、クモ形類である。
本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち動作可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに統合されるとき）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、動作可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）等を含み得る。
遺伝子導入植物
上記のように、ある場合には、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、本開示のＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドを産生する遺伝子導入植物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子導入植物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物のゲノムは、対象の核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物は、遺伝子修飾のためにホモ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子導入植物は、遺伝子修飾のためにヘテロ接合性である。
外因性核酸を植物細胞に導入する方法は、当該技術分野において周知である。そのような植物細胞は、上に定義されるように「形質転換された」とみなされる。好適な方法としては、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、形質移入、共役、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバクテリウム媒介型形質転換等が挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類、及び形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。
土壌細菌のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に基づく形質転換方法は、外因性核酸分子を維管束植物に導入するために特に有用である。野生型形態のアグロバクテリウムは、宿主植物上で成長する腫瘍原性クラウウンゴールの産生を配向するＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含有する。Ｔｉプラスミドの腫瘍誘導Ｔ−ＤＮＡ領域の、植物ゲノムへの移行は、Ｔｉプラスミドでコードされた病原性遺伝子ならびにＴ−ＤＮＡ境界を必要とし、これらは移行される領域を描写する直接ＤＮＡ反復の組である。アグロバクテリウム系ベクターは、修飾形態のＴｉプラスミドであり、腫瘍誘導機能は、植物宿主に導入される関心対象の核酸配列によって置き換えられる。
アグロバクテリウム媒介型形質転換は、一般に、融合体ベクターまたはバイナリベクター系を用い、Ｔｉプラスミドの成分は、アグロバクテリウム宿主に永久に常駐し、病原性遺伝子を担持するヘルパーベクターと、Ｔ−ＤＮＡ配列によって限定された関心対象の遺伝子を含むシャトルベクターとに分けられる。様々なバイナリベクターは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。例えば、アグロバクテリウムを培養された植物細胞または葉組織などの傷ついた組織、根片、胚軸、塊茎の幹片と共培養する方法もまた、当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい。
マイクロプロジェクタイル媒介型形質転換を使用して、対象の遺伝子導入植物を産生することもできる。Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３（１９８７）によって最初に記載されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールでの沈降によって所望の核酸分子でコーティングされた金またはタングステンなどのマイクロプロジェクタイルに依存する。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＤ−１０００（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆ．）などのデバイスを使用して、被子植物組織中に高速で進められる。
本開示の核酸（例えば、本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組み換え発現ベクター）は、核酸が、例えば、インビボまたはエクスビボプロトコルを介して植物細胞（複数可）に侵入することができるような方法で植物に導入され得る。「インビボ」とは、核酸が植物の生体に投与されること、例えば、浸潤を意味する。「エクスビボ」とは、細胞または外植片は、植物の外側で修飾され、次いでそのような細胞または器官は、植物に再生されることを意味する。植物細胞の安定した形質転換または遺伝子導入植物の確立に適した複数のベクターが記載されており、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されるものが挙げられる。特定の例には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するもの、ならびにＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９，Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１，Ｋｌｅｅ（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ３：６３７−６４２によって開示されるものが挙げられる。あるいは、非Ｔｉベクターを使用して、遊離ＤＮＡ送達技法を使用することによって、ＤＮＡを植物及び細胞に移行させることができる。これらの方法を使用することによって、小麦、米（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９及び４４６２）ならびにトウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８）などの遺伝子導入植物が産生され得る。未熟な胚もまた、粒子ガンを使用することによる直接ＤＮＡ送達技法のため（Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０２：１０７７−１０８４；Ｖａｓｉｌ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ １０：６６７−６７４、Ｗａｎ ａｎｄ Ｌｅｍｅａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７−４８、及びアグロバクテリウム媒介型ＤＮＡ移行のため（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：７４５−７５０）の単子葉植物の良好な標的組織であり得る。ＤＮＡを葉緑体に導入するための例示的な方法は、微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションである（Ｄａｎｉｅｌｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３４５−３４８，１９９８、Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：３３３−３３８，２０００、Ｏ′Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７２９−７３８，１９９３、Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９０６−９０９、米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号、同第５，５４５，８１８号、及び同第５，５７６，１９８号、国際出願第ＷＯ９５／１６７８３号、及びＢｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５１０−５３６（１９９３）、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７（１９９３）、ならびにＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５（１９９４））。微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションの方法に適した任意のベクターは、葉緑体形質転換のための標的ベクターとして好適である。任意の二本鎖ＤＮＡベクターは、特に導入の方法がアグロバクテリウムを利用しないときに、形質転換ベクターとして使用され得る。
遺伝子修飾され得る植物としては、穀物、飼料作物、果物、野菜、油料種子作物、ヤシ、森林、及びツル植物が挙げられる。修飾され得る植物の特定例としては、以下が挙げられる：トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウマメ、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、小麦、バーレー、オーツ麦、ジャガイモ、大豆、綿、カーネーション、ソルガム、ハウチワマメ、及び米。
本開示は、形質転換された植物細胞、組織、植物、及び形質転換された植物細胞を含有する産生物を提供する。対象の形質転換細胞、及び組織、及びそれを含む産生物の特徴は、ゲノムに統合された対象の核酸の存在、及び植物細胞による本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドの産生である。本発明の組み換え植物細胞は、組み換え細胞の集合として、または組織、種子、全植物、幹、果実、葉、根、花、幹、塊茎、穀物、動物飼料、植物の分野等において有用である。
本開示のＣａｓＸポリペプチドまたはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち動作可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに統合されるとき）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、動作可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり得、構成的に活性なプロモーター、誘導性プロモーター、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーターなどが挙げられる。
古細菌ＣＡＳ９ポリペプチド及びガイドＲＮＡ
発明者らは、古細菌におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座を初めて発見した。古細菌細胞は、ＩＩ型系ではなく、Ｉ型及び／またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系のみを含み、Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の特徴的タンパク質であると以前は考えられていた。換言すれば、本開示の前に、当該技術分野は、古細菌に属する生物がＣａｓ９タンパク質を含まないことを教示した。古細菌Ｃａｓ９タンパク質（もしくはそれをコードする核酸）（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質、その変異形等）、及び／または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（二重もしくは単一ガイドＲＮＡフォーマット）（もしくはそれをコードするＤＮＡ、例えば、１つ以上の発現ベクター）、及び／またはドナーテンプレートを含む、方法及び組成物が提供される。
ＡＲＭＡＮという用語は、「古細菌リッチモンド・マイン好酸球性ナノ生物」と称される。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ Ｍａｙ １１；１０７（１９）：８８０６−８８１１、Ｂａｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ｄｅｃ ２２；３１４（５８０７）：１９３３−５を参照されたい。ＡＲＭＡＮ−１はまた、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−１」とも称され得るが、ＡＲＭＡＮ−４はまた、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−４」とも称され得る。ＡＲＭＡＮ−２及びＡＲＭＡＮ−５もまた同定されており、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−２」と称され得るが、ＡＲＭＡＮ−５は、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−５」と称され得る。このため、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ」という用語は、少なくともＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−１及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−２を包含する汎称であるが、「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ」という用語は、少なくともＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−４及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−５を包含する汎称である。このため、古細菌Ｃａｓ９タンパク質（もしくはそれをコードする核酸）（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質、その変異形等）、及び／または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（二重もしくは単一ガイドＲＮＡフォーマット）（もしくはそれをコードするＤＮＡ、例えば、１つ以上の発現ベクター）、及び／またはドナーテンプレートを含む、方法及び組成物が提供される。
本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて（例えば、すべての記載される組成物及び方法、例えば、核酸、結合方法、撮像方法、修飾方法、ゲノム編集等を含む）、ＣａｓＸタンパク質の代わりに、古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質等）を使用することができる。換言すれば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質等）は、ＣａｓＸタンパク質の代わりになり得る。そのような場合において、必要に応じて、対応するガイドＲＮＡ（古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、例えば、二重または単一ガイドフォーマットのいずれか）が、ＣａｓＸガイドＲＮＡの代わりに使用されるべきである。古細菌Ｃａｓ９タンパク質及び古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの例は、図１３（ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質）、図１４（ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）、及び図１５（ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）において例示されている。ガイドＲＮＡの残りに対する（例えば、標的化因子の二重鎖形成セグメントに対する）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのガイド配列の配向は、ＣａｓＸガイドＲＮＡの反対であるが（例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡの場合、ガイド配列が３′末端にある図６及び図７のＮを、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合、ガイド配列が５′末端にある図１４及び図１５のＮと比較する）、標的ｄｓＤＮＡ上のＰＡＭの位置もまた、ＣａｓＸタンパク質と比較して古細菌Ｃａｓ９タンパク質の反対であることに留意されたい（さらなる詳細については以下を参照）。
古細菌Ｃａｓ９タンパク質
非古細菌Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、古細菌由来ではなく、細菌由来のＣａｓ９タンパク質）は、当該技術分野において既知であり、対象の古細菌Ｃａｓ９タンパク質は、同様のドメイン構造を有する。しかしながら、古細菌Ｃａｓ９タンパク質の全体配列は、非常に多様であり、極わずかな全体配列相同性を共有する。
天然に存在する古細菌Ｃａｓ９タンパク質は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の特定の配列において二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする、関連ガイドＲＮＡによって提供される。天然に存在するガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされたｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。
いくつかの実施形態では、対象の方法及び／または組成物の古細菌Ｃａｓ９タンパク質は、天然に存在する（野生型）タンパク質である（またはそれに由来する）。天然に存在する古細菌Ｃａｓ９タンパク質の例は、図１３に示され、配列番号７１及び７２として記載されている。この新たに発見された古細菌Ｃａｓ９タンパク質（例えば、図１３を参照）は、以前に同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して短く（例えば、それらは最小として知られるＣａｓ９タンパク質である）、またこのため、代替としての古細菌Ｃａｓ９タンパク質の使用が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が比較的短いという利点を提供することに留意することが重要である。これは、例えば、ＣａｓＸタンパク質をコードする核酸が望ましい場合、例えば、研究及び／または臨床用途のために真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞、インビトロ、エクスビボ、インビボ）などの細胞に送達するために、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を用いる状況において有用である。
非古細菌Ｃａｓ９タンパク質であるが、系統樹上で古細菌Ｃａｓ９とクラスタ化し、したがって古細菌Ｃａｓ９に対する配列において関連する２つの追加のＣａｓ９タンパク質（図１６を参照）が、発明者らによって同定された（例えば、図１６のデルタプロテオバクテリアＣａｓ９は、図１２、パネルＤの系統樹においてＲＢＧ＿Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ｜ＲＢＧ＿１６＿Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ＿４２＿７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜９９１ａａとして現れるが、図１６のＬｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ Ｃａｓ９は、図１２、パネルＤの系統樹においてＲＩＦ２＿ＣＰＲ｜ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２＿１２＿ＦＵＬＬ＿Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ＿６２＿２７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜ＲＩＦ２｜１０４４ａａとして現れる）。ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９に対する図１６の配列のアラインメントは、図１７に提供される。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１（ＡＲＭＡＮ−１）として記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１（ＡＲＭＡＮ−１）として記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１（ＡＲＭＡＮ−１）として記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１（ＡＲＭＡＮ−１）として記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１として記載されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質である。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質である。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７２（ＡＲＭＡＮ−４）として記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７２（ＡＲＭＡＮ−４）として記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７２（ＡＲＭＡＮ−４）として記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７２（ＡＲＭＡＮ−４）として記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７２として記載されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質である。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質である。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１及び７２（それぞれＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４）のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１及び７２（それぞれＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４）のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１及び７２（それぞれＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４）のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１及び７２（それぞれＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４）のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、配列番号７１及び７２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質）またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質）である。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５として記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５として記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５として記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５として記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５として記載されるアミノ酸配列を含む。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３６として記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３６として記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３６として記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３６として記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３６として記載されるアミノ酸配列を含む。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１３５及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１、７２、１３５、及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１、７２、１３５、及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１、７２、１３５、及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１、７２、１３５、及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、対象のＣａｓ９タンパク質は、配列番号７１、７２、１３５、及び１３６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
変異形（ニッカーゼ、ｄＣａｓ９、及びキメラＣａｓ９タンパク質）
使用され得る変異形の学名及び使用等（例えば、ＣａｓＸタンパク質の古細菌Ｃａｓ９タンパク質におけるスワップ、ＣａｓＸタンパク質の新たに同定された２つの非古細菌Ｃａｓ９タンパク質のうちのいずれかにおけるスワップ等）については、ＣａｓＸタンパク質の変異形に関するセクションを参照されたい。例えば、上記の同一性％パラメータ、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質を含む、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）についての上記パラメータのうちのいずれかは、スワップされ得る。
Ｃａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）の触媒残基は、非古細菌Ｃａｓ９タンパク質との極めて低い全体配列同一性にもかかわらず、容易に同定可能である。例えば、配列番号７１（ＡＲＭＡＮ−１）として記載される古細菌Ｃａｓ９のＤ３０（ＲｕｖＣドメイン）及びＨ５０６（ＨＮＨドメイン）は、それぞれ化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のＤ１０及びＨ８４０に対応するが、配列番号７２（ＡＲＭＡＮ−４）として記載される古細菌Ｃａｓ９のＤ５８（ＲｕｖＣドメイン）及びＨ５１４（ＨＮＨドメイン）は、それぞれ化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のＤ１０及びＨ８４０に対応する。これらの残基は、図１３において太字にされ、下線が引かれている。
Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、古細菌Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、ＲｕｖＣドメイン（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９のＤ３０、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質のＤ５８を突然変異させることによって）またはＨＮＨドメイン（例えば、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９のＨ５０６、ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質のＨ５１４を突然変異させることによって）のいずれかの触媒能を除去することによって（例えば、触媒残基を突然変異させることによって）生成され得る（例えば、各ドメインは、標的二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断する）。不活性バージョンのＣａｓ９タンパク質（例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質）（例えば、ｄＣａｓ９、古細菌ｄＣａｓ９）は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメイン両方の触媒能を除去することによって（例えば、触媒残基を突然変異させることによって）生成され得る。
古細菌Ｃａｓ９（または新たに同定された非古細菌Ｃａｓ９のうちの１つ）がＣａｓＸの場合にスワップされ得ることを除いて、同じ融合タンパク質のすべてを使用することができる。非限定例としては、ＮＬＳ（複数可）を有する古細菌Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９、触媒能及び／または転写抑制もしくは活性化能を有する古細菌Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９（例えば、標的ＤＮＡを修飾するため、標的ＤＮＡに会合したヒストンなどのタンパク質を修飾するため、標的ＤＮＡからの転写を変調するため等）、検出可能な標識を有する古細菌Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９等が挙げられる。古細菌Ｃａｓ９に対して使用され得る融合パートナーの一覧は、ＣａｓＸタンパク質に対して使用され得る一覧と同じである（本明細書においてさらに詳述される）。
古細菌Ｃａｓ９タンパク質のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
古細菌Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の３′の直近である（相補鎖は、ガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズするが、非相補鎖は、ガイドＲＮＡと直接ハイブリダイズせず、非相補鎖の逆相補体である）。このため、古細菌Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭは、ＣａｓＸタンパク質のＰＡＭと比較して標的配列の反対側にある（例えば、ＣａｓＸタンパク質のＰＡＭの５′配向を示す、図６のパネルＣ、及び図７を参照）。いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載される古細菌Ｃａｓ９タンパク質が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５′−ＮＧＧ−３′であり、Ｎは、任意のＤＮＡヌクレオチドである。
ある場合には、異なる古細菌Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、様々な種に由来する古細菌Ｃａｓ９タンパク質）は、異なる古細菌Ｃａｓ９タンパク質の様々な酵素的特徴を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列優先性のため、増加または減少した酵素活性のため、増加または減少したレベルの細胞毒性のため、ＮＨＥＪ、ホモロジー配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断等の間の均衡を変化させるため、短い全配列を利用するため等）、様々な提供される方法における使用に有利であり得る。異なる種に由来する古細菌Ｃａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を好み得る。このため、一般に好まれる特定の古細菌Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭ配列優先性は、上記の５′−ＮＧＧ−３′配列とは異なり得る。適切なＰＡＭ配列の同定のための様々な方法（インシリコ及び／またはウェットラボ法を含む）は、当該技術分野において既知であり、ルーチンであり、任意の簡便な方法が使用され得る。本明細書に記載されるＮＧＧ ＰＡＭ配列は、インシリコ配列分析技法を使用して同定された（例えば、下記実施例の図１２、パネルＢを参照）。
古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ
非古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（すなわち、古細菌由来ではなく、細菌由来のＣａｓ９ガイドＲＮＡ）は、当該技術分野において既知であり、対象の古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、非古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと同様のドメイン構造を有する。古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合、ガイド配列は、標的化因子ＲＮＡの二重鎖形成セグメントの５′に位置するが、ＣａｓＸガイドＲＮＡでは二重鎖形成セグメントの３′に位置することに留意されたい（例えば、例示的な古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを示す図１４及び図１５を、例示的なＣａｓＸガイドＲＮＡを示す図６のパネルＣ及び図７と比較する）。
ある場合には、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒａｃｒ配列）は、（ｉ）タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する二重鎖形成セグメント、及び（ｉｉ）二重鎖形成セグメントのヌクレオチド３′のストレッチ（例えば、本明細書では３′テールと称される）を含む。ある場合には、二重鎖形成セグメントの追加のヌクレオチド３′は、１つ以上のステムループ（例えば、２つ以上、３つ以上、１、２、または３）を形成する。ある場合には、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒａｃｒ配列）は、（ｉ）タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する二重鎖形成セグメント、及び（ｉｉ）二重鎖形成セグメントのヌクレオチドの５つ以上のヌクレオチド（例えば、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、７０以上、または７５以上のヌクレオチド）３′を含む。ある場合には、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）の活性化因子（例えば、活性化因子ＲＮＡ）は、（ｉ）タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する二重鎖形成セグメント、及び（ｉｉ）二重鎖形成セグメントのヌクレオチドの５つ以上のヌクレオチド（例えば、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、７０以上、または７５以上のヌクレオチド）３′を含む。
ある場合には、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒａｃｒ配列）は、（ｉ）タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖に寄与する二重鎖形成セグメント、及び（ｉｉ）二重鎖形成セグメントのヌクレオチド３′のストレッチ（例えば、本明細書では３′テールと称される）を含む。ある場合には、二重鎖形成セグメントのヌクレオチド３′のストレッチは、５〜２００ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、５〜１５０ｎｔ、５〜１３０ｎｔ、５〜１２０ｎｔ、５〜１００ｎｔ、５〜８０ｎｔ、１０〜２００ｎｔ、１０〜１５０ｎｔ、１０〜１３０ｎｔ、１０〜１２０ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１２〜２００ｎｔ、１２〜１５０ｎｔ、１２〜１３０ｎｔ、１２〜１２０ｎｔ、１２〜１００ｎｔ、１２〜８０ｎｔ、１５〜２００ｎｔ、１５〜１５０ｎｔ、１５〜１３０ｎｔ、１５〜１２０ｎｔ、１５〜１００ｎｔ、１５〜８０ｎｔ、２０〜２００ｎｔ、２０〜１５０ｎｔ、２０〜１３０ｎｔ、２０〜１２０ｎｔ、２０〜１００ｎｔ、２０〜８０ｎｔ、３０〜２００ｎｔ、３０〜１５０ｎｔ、３０〜１３０ｎｔ、３０〜１２０ｎｔ、３０〜１００ｎｔ、または３０〜８０ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、活性化因子ＲＮＡの３′テールのヌクレオチドは、野生型配列である。
複数の異なる代替配列が使用され得るが、例示的な古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ配列は、配列番号７５〜７６（例示的なｃｒＲＮＡ配列−ガイド配列）、７７〜７８（例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列）、及び８１〜８２（例示的な単一ガイドＲＮＡ配列−ガイド配列）を含み得る。
ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖領域（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、８〜２５塩基対（ｂｐ）の範囲（例えば、８〜２２、８〜１８、８〜１５、８〜１２、１２〜２５、１２〜２２、１２〜１８、１２〜１５、１３〜２５、１３〜２２、１３〜１８、１３〜１５、１４〜２５、１４〜２２、１４〜１８、１４〜１５、１５〜２５、１５〜２２、１５〜１８、１７〜２５、１７〜２２、または１７〜１８ｂｐ、例えば、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ等）を含む。ある場合には、二重鎖領域は（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、８以上のｂｐ（例えば、１０以上、１２以上、１５以上、または１７以上のｂｐ）を含む。ある場合には、二重鎖領域のすべてのヌクレオチドが対合されるとは限らないため、二重鎖形成領域は、バルジを含み得る（例えば、図６、パネルＣ及び図７を参照）。本明細書における「バルジ」という用語は、二本鎖二重鎖に寄与しないが、寄与するヌクレオチドによって５′及び３′が囲まれているヌクレオチド（１つのヌクレオチドであり得る）のストレッチを意味するように使用され、そのようなものとしてバルジは、二重鎖領域の一部とみなされる。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、１つ以上のバルジ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、２つ以上のバルジ（例えば、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。ある場合には、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、１〜５のバルジ（例えば、１〜４、１〜３、２〜５、２〜４、または２〜３のバルジ）を含む。
このため、ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。ある場合には、活性化因子及び標的化因子の二重鎖形成セグメントは、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有する。
換言すれば、いくつかの実施形態では、活性化因子と標的化因子との間に形成されたｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖）は、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。ある場合には、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。ある場合には、活性化因子／標的化因子ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。
対象の古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの二重鎖領域は（二重ガイドまたは単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、天然に存在する二重鎖領域に対して１つ以上（１、２、３、４、５等）の突然変異を含み得る。例えば、ある場合には、塩基対は維持され得るが、各セグメント（標的化因子及び活性化因子）からの塩基対に寄与するヌクレオチドは異なり得る。ある場合には、対象の古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの二重鎖領域は、（天然に存在する古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの）天然に存在する二重鎖領域比較して、より多くの対合塩基、より少ない対合塩基、より小さいバルジ、より大きいバルジ、より少ないバルジ、より多いバルジ、またはそれらの任意の簡便な組み合わせを含む。
古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの例示的な配列
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＣＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＧＣＡＵＧＵＧＵＡＡＧ（配列番号７５）を含む（例えば、図６、パネルＣのｓｇＲＮＡを参照）。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＣＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＧＣＡＵＧＵＧＵＡＡＧ（配列番号７５）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＣＵＵＡＡＡＵＡＡＵＵＵＧＣＡＵＧＵＧＵＡＡＧ（配列番号７５）を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＣＡＡＡＵＡＡＡＵＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＵＧＵＡＡＣ（配列番号７６）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＣＡＡＡＵＡＡＡＵＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＵＧＵＡＡＣ（配列番号７６）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＣＡＡＡＵＡＡＡＵＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＵＧＵＡＡＣ（配列番号７６）を含む。
ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号７５〜７６のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号７５〜７６のうちのいずれか１つに記載されるｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＧＧＣＡＵＧＧＡＣＣＡＵＡＵＣＣＡＧＧＵＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＡＡＡＵＵＡＵＡＵＡＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵＡＵＣＵＵＣＡＣＵＡＵＣＣＡＡＡＧＵＵＡＵＣＵＣＵＧＧＵＵＵＵＧＧＵＵＵＧＧＵＡＡＧＣＵＵＣＡＣＵＵＣＡＣＵＡＵＵＧＵＵＵＵＣＡＣＵＣＣＣＡＡＵＵＵＧＡＧＵＡＵＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＧＵＧＣＵＵＵＵＡ（配列番号７７）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＧＧＣＡＵＧＧＡＣＣＡＵＡＵＣＣＡＧＧＵＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＡＡＡＵＵＡＵＡＵＡＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵＡＵＣＵＵＣＡＣＵＡＵＣＣＡＡＡＧＵＵＡＵＣＵＣＵＧＧＵＵＵＵＧＧＵＵＵＧＧＵＡＡＧＣＵＵＣＡＣＵＵＣＡＣＵＡＵＵＧＵＵＵＵＣＡＣＵＣＣＣＡＡＵＵＵＧＡＧＵＡＵＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＧＵＧＣＵＵＵＵＡ（配列番号７７）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＡＣＵＧＧＣＵＡＵＵＧＣＵＡＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＡＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＡＧＡＣＧＵＵＡＧＧＧＵＵＣＧＣＧＵＧＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＣＣＡＧＣＡＧＧＵＡＣＣＵＣ（配列番号７８）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＡＡＣＵＧＧＣＵＡＵＵＧＣＵＡＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＡＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＡＧＡＣＧＵＵＡＧＧＧＵＵＣＧＣＧＵＧＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＣＣＡＧＣＡＧＧＵＡＣＣＵＣ（配列番号７８）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、活性化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号７７〜７８のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは（例えば、二重または単一ガイドＲＮＡフォーマットで）、配列番号７７〜７８のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡは、配列ＣＵＵＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＣＵＵａａａｃＡＧＧＵＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＡＡＡＵＵＡＵＡＵＡＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵＡＵＣＵＵＣＡＣＵＡＵＣＣＡＡＡＧＵＵＡＵＣＵＣＵＧＧＵＵＵＵＧＧＵＵＵＧＧＵＡＡＧＣＵＵＣＡＣＵＵＣＡＣＵＡＵＵＧＵＵＵＵＣＡＣＵＣＣＣＡＡＵＵＵＧＡＧＵＡＵＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＧＵＧＣＵＵＵＵＡ（配列番号８１）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＣＵＵａａａｃＡＧＧＵＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＡＡＣＡＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＡＡＡＵＵＡＵＡＵＡＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵＡＵＣＵＵＣＡＣＵＡＵＣＣＡＡＡＧＵＵＡＵＣＵＣＵＧＧＵＵＵＵＧＧＵＵＵＧＧＵＡＡＧＣＵＵＣＡＣＵＵＣＡＣＵＡＵＵＧＵＵＵＵＣＡＣＵＣＣＣＡＡＵＵＵＧＡＧＵＡＵＧＧＵＵＧＧＧＧＧＵＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵＵＣＧＧＧＧＡＧＵＧＣＵＵＵＵＡ（配列番号８１）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡは、配列ＣＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＣＡＡＡＵＡＡａａａｃＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＡＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＡＧＡＣＧＵＵＡＧＧＧＵＵＣＧＣＧＵＧＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＣＣＡＧＣＡＧＧＵＡＣＣＵＣ（配列番号８２）を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列ＣＵＵＵＣＡＡＵＡＡＡＣＡＡＡＵＡＡａａａｃＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＡＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＡＧＡＣＧＵＵＡＧＧＧＵＵＣＧＣＧＵＧＣＡＵＧＵＡＧＧＣＵＣＣＡＧＣＡＧＧＵＡＣＣＵＣ（配列番号８２）と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
ある場合には、古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡは、配列番号８１〜８２のうちのいずれか１つに記載される配列を含む。ある場合には、標的化因子−ＲＮＡは、配列番号８１〜８２のうちのいずれか１つに記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのガイド配列
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。ある場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
ある場合には、ガイド配列は、１７〜３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７〜２５、１７〜２２、１７〜２０、１９〜３０、１９〜２５、１９〜２２、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７〜２２、１７〜２０、１９〜２５、１９〜２２、１９〜２０、２０〜２５、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１７以上のｎｔ（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、または２２以上のｎｔ；１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１７ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１８ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。
様々なＣａｓタンパク質及びＣａｓ９ガイドＲＮＡの例は（たとえ非古細菌Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡであっても）、当該技術分野において見出すことができ、ある場合には、非古細菌Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡに導入されたものと同様の異形もまた、例えば、高忠実度バージョンのＣａｓ９を含む本開示のＣａｓ９ガイドＲＮＡに導入され得る。例えば、高忠実度のＣａｓ９を生成するために、以前に知られているＣａｓ９タンパク質に導入され得る突然変異はまた、同じまたは同様の目的のために古細菌Ｃａｓ９タンパク質に導入され得る（例えば、配列及び／または構造アラインメントを行って、対象の古細菌Ｃａｓ９タンパク質、例えば、古細菌Ｃａｓ９タンパク質ではない化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６において突然変異する適切なアミノ酸を決定することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０を参照されたい）。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ ３１、Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３ Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３ Ｄｅｃ ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｏｃｔ ９、Ｙａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３７０−９、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２３；５６（２）：３３３−９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号を参照されたい。これらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の非限定的態様の例
上に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、１〜１３１の番号が付けられた（ＣａｓＸに関連するセットＡ）及び１〜１３３の番号が付けられた（古細菌Ｃａｓ９に関連するセットＢ）本開示のある特定の非限定的な態様が、以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかと共に使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
セットＡ
ＣａｓＸ関連
１．組成物であって、
ａ）ＣａｓＸポリペプチド、または前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子と、
ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と
を含む、組成物。
２．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１に記載の組成物。
３．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、１または２に記載の組成物。
４．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、１または２に記載の組成物。
５．前記組成物が、脂質を含む、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
６．ａ）及びｂ）が、リポソーム内にある、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
７．ａ）及びｂ）が、粒子内にある、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
８．緩衝剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤のうちの１つ以上を含む、１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
９．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．前記ＣａｓＸポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１１．前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１２．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、１０または１１に記載の組成物。
１３．ＤＮＡドナーテンプレートをさらに含む、１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
１４．ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子であって、
ａ）標的核酸にハイブリダイズするガイド配列、及び二重鎖形成セグメントを含む標的化因子配列と、
ｂ）標的化因子配列の二重鎖形成セグメントとハイブリダイズしてＣａｓＸポリペプチドに結合し得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する活性化因子と
を含む、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子。
１５．前記ガイド配列が、１９〜３０ヌクレオチドの長さを有する、１４に記載のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子。
１６．１４または１５に記載のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
１７．前記ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、１６に記載のＤＮＡ分子。
１８．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、１７に記載のＤＮＡ分子。
１９．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、１８に記載のＤＮＡ分子。
２０．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、１７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
２１．前記ＤＮＡ分子が、組み換え発現ベクターである、１６〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
２２．前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、２１に記載のＤＮＡ分子。
２３．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、１７に記載のＤＮＡ分子。
２４．異種ポリペプチドに融合されたＣａｓＸポリペプチドを含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド。
２５．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
２６．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
２７．前記ＣａｓＸポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、２４〜２７のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
２８．前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、２４〜２７のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
２９．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、２７または２８に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３０．前記異種ポリペプチドが、ＣａｓＸポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に融合される、２４〜２９のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３１．ＮＬＳを含む、２４〜３０のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３２．前記異種ポリペプチドが、標的細胞または標的細胞型上の細胞表面部分への結合をもたらす標的ポリペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３３．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３４．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３３に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３６．前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３７．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、３６に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３８．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３６または３７に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
３９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３８に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４０．前記異種ポリペプチドが、エンドソーム脱出ポリペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４１．前記エンドソーム脱出ポリペプチドが、ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号９４）及びＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される、４０に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４２．前記異種ポリペプチドが、葉緑体移行ペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４３．前記葉緑体移行ペプチドが、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号８３）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号８４）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号８５）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８６）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８７）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号８８）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号８９）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号９０）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号９１）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号９２）、及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号９３）から選択されるアミノ酸配列を含む、４２に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４４．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４５．前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、４４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４６．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、４４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４７．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
４８．２４〜４７のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
４９．前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、４８に記載の核酸分子。
５０．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、４９に記載の核酸分子。
５１．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、５０に記載の核酸分子。
５２．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、４９〜５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
５３．前記ＤＮＡ分子が、組み換え発現ベクターである、４８〜５２のいずれか１項に記載の核酸分子。
５４．前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、５３に記載の核酸分子。
５５．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、４９に記載の核酸分子。
５６．前記核酸分子が、ｍＲＮＡである、４８に記載の核酸分子。
５７．１つ以上の核酸分子であって、
（ａ）活性化因子ＲＮＡ及び標的化因子ＲＮＡを含むＣａｓＸガイドＲＮＡと、
（ｂ）ＣａｓＸポリペプチドと
を含む、１つ以上の核酸分子。
５８．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、５７に記載の１つ以上の核酸分子。
５９．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、５７に記載の１つ以上の核酸分子。
６０．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６１．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６２．前記１つ以上の核酸分子が、活性化因子をコードする第１のヌクレオチド配列と、標的化因子をコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１及び第２のヌクレオチド配列が、異なるＤＮＡ分子上に存在する、６１に記載の１つ以上の核酸分子。
６３．前記１つ以上の核酸分子が、プロモーターに動作可能に連結されたＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５７〜６２のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６４．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、６３に記載の１つ以上の核酸分子。
６５．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、６４に記載の１つ以上の核酸分子。
６６．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、６３〜６５のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６７．前記１つ以上の核酸分子が、１つ以上の組み換え発現ベクターである、５７〜６６のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６８．前記１つ以上の組み換え発現ベクターが、１つ以上の組み換えアデノ関連ウイルスベクター、１つ以上の組み換えレトロウイルスベクター、または１つ以上の組み換えレンチウイルスベクターから選択される、６７に記載の１つ以上の核酸分子。
６９．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、６３に記載の１つ以上の核酸分子。
７０．真核細胞であって、
ａ）Ｃａｓｘポリペプチド、またはＣａｓｘポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、またはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含む、真核細胞。
７１．前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、７０に記載の真核細胞。
７２．前記真核細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形網動物細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、７０または７１に記載の真核細胞。
７３．ＣａｓＸ融合ポリペプチド、またはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、細胞。
７４．前記細胞が、原核細胞である、７３に記載の細胞。
７５．前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、７３または７４に記載の細胞。
７６．標的核酸を修飾する方法であって、
標的核酸を、
ａ）ＣａｓＸポリペプチド、及び
ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含み、
前述の接触させることが、ＣａｓＸポリペプチドによる標的核酸の修飾をもたらす、方法。
７７．前記修飾が、標的核酸の切断である、７６に記載の方法。
７８．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、７６または７７に記載の方法。
７９．前述の接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．前述の接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８１．前述の接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８２．前記細胞が、真核細胞である、８０または８１に記載の方法。
８３．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞である、８２に記載の方法。
８４．前記細胞が、原核細胞である、８０または８１に記載の方法。
８５．前述の接触させることが、ゲノム編集をもたらす、７６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
８６．前述の接触させることが、細胞中に、（ａ）ＣａｓＸポリペプチド、またはＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）ＣａｓｘガイドＲＮＡ、またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、７６〜８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．前述の接触させることが、細胞中にＤＮＡドナーテンプレートを導入することをさらに含む、８６に記載の方法。
８８．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
８９．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
９０．標的ＤＮＡからの転写を変調するか、標的核酸を修飾するか、または標的核酸に関連したタンパク質を修飾する方法であって、
標的核酸を、
ａ）異種ポリペプチドに融合されたＣａｓＸポリペプチドを含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
ｂ）標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含む、方法。
９１．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、９０に記載の方法。
９２．前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、９０に記載の方法。
９３．前記修飾が、標的核酸の切断ではない、９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
９４．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
９５．前述の接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９６．前述の接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９７．前述の接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９８．前記細胞が、真核細胞である、９６または９７に記載の方法。
９９．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞である、９８に記載の方法。
１００．前記細胞が、原核細胞である、９６または９７に記載の方法。
１０１．前述の接触させることが、細胞中に、（ａ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、またはＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）ＣａｓｘガイドＲＮＡ、またはＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、９０〜１００のいずれか１項に記載の方法。
１０２．前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、９０〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
１０３．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、９０〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
１０４．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１０５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０４に記載の方法。
１０６．異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０５に記載の方法。
１０７．前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１０８．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、１０７に記載の方法。
１０９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０７または１０８に記載の方法。
１１０．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０９に記載の方法。
１１１．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１１２．前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、１１１に記載の方法。
１１３．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、１１１に記載の方法。
１１４．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１１５．遺伝子導入の多細胞非ヒト生物であって、それらのゲノムが、
ａ）Ｃａｓｘポリペプチド、
ｂ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１６．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１７．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１８．前記生物が、植物、単子葉植物、双子葉植物、無脊椎動物、昆虫、節足動物、クモ形網動物、寄生虫、蠕虫、脊椎動物、魚、爬虫類、両生類、有蹄類、鳥、ブタ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、１１５〜１１７のいずれか１項に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１９．系であって、
ａ）ＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡと、
ｂ）ＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｃ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡと、
ｄ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｅ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡと、
ｆ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｇ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡと、
ｈ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｉ）ｉ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｊ）ｉ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）ＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｋ）ｉ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｌ）ｉ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと
を含む、系。
１２０．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１９に記載のＣａｓＸ系。
１２１．前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１９に記載のＣａｓＸ系。
１２２．前記ドナーテンプレート核酸が、８ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さを有する、１１９〜１２１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系。
１２３．前記ドナーテンプレート核酸が、２５ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さを有する、１１９〜１２１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系。
１２４．１１９〜１２３のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、キット。
１２５．前記キットの構成要素が、同じ容器内にある、１２４に記載のキット。
１２６．前記キットの構成要素が、別個の容器内にある、１２４に記載のキット。
１２７．１１９〜１２６のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、無菌容器。
１２８．前記容器が、シリンジである、１２７に記載の無菌容器。
１２９．１１９〜１２６のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、埋め込み可能なデバイス。
１３０．前記ＣａｓＸ系が、マトリックス内にある、１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
１３１．前記ＣａｓＸ系が、貯蔵器内にある、１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
セットＢ
古細菌Ｃａｓ９関連
１．組成物であって、
ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸分子と、
ｂ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と
を含む、組成物。
２．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１に記載の組成物。
３．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、１または２に記載の組成物。
４．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、１または２に記載の組成物。
５．前記組成物が、脂質を含む、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
６．ａ）及びｂ）が、リポソーム内にある、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
７．ａ）及びｂ）が、粒子内にある、１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
８．緩衝剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤のうちの１つ以上を含む、１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
９．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
１０．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１１．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、触媒能がない古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド（不活性型古細菌Ｃａｓ９）である、１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
１２．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、１０または１１に記載の組成物。
１３．ＤＮＡドナーテンプレートをさらに含む、１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
１４．古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ分子であって、
ａ）標的核酸にハイブリダイズするガイド配列、及び二重鎖形成セグメントを含む標的化因子配列と、
ｂ）標的化因子配列の二重鎖形成セグメントとハイブリダイズして古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドに結合し得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖を形成する活性化因子と
を含む、古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ分子。
１５．前記ガイド配列が、１９〜３０ヌクレオチドの長さを有する、１４に記載の古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ分子。
１６．１４または１５に記載の古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
１７．前記古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、１６に記載のＤＮＡ分子。
１８．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、１７に記載のＤＮＡ分子。
１９．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、１８に記載のＤＮＡ分子。
２０．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、１７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
２１．前記ＤＮＡ分子が、組み換え発現ベクターである、１６〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
２２．前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、２１に記載のＤＮＡ分子。
２３．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、１７に記載のＤＮＡ分子。
２４．異種ポリペプチドに融合された古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドを含む、古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
２５．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２４に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
２６．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、２４に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
２７．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、２４〜２７のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
２８．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、触媒能がない古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド（不活性型古細菌Ｃａｓ９）である、２４〜２７のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
２９．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、２７または２８に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３０．前記異種ポリペプチドが、古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に融合される、２４〜２９のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３１．ＮＬＳを含む、２４〜３０のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３２．前記異種ポリペプチドが、標的細胞または標的細胞型上の細胞表面部分への結合をもたらす標的ポリペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３３．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３４．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３３に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３４に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３６．前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３７．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、３６に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３８．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３６または３７に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
３９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、３８に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４０．前記異種ポリペプチドが、エンドソーム脱出ポリペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４１．前記エンドソーム脱出ポリペプチドが、ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号９４）及びＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される、４０に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４２．前記異種ポリペプチドが、葉緑体移行ペプチドである、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４３．前記葉緑体移行ペプチドが、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号８３）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号８４）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号８５）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８６）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８７）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号８８）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号８９）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号９０）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号９１）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号９２）、及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号９３）から選択されるアミノ酸配列を含む、４２に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４４．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４５．前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、４４に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４６．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、４４に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４７．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、２４〜３１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド。
４８．２４〜４７のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
４９．前記古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、４８に記載の核酸分子。
５０．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、４９に記載の核酸分子。
５１．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、５０に記載の核酸分子。
５２．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、４９〜５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
５３．前記ＤＮＡ分子が、組み換え発現ベクターである、４８〜５２のいずれか１項に記載の核酸分子。
５４．前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、５３に記載の核酸分子。
５５．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、４９に記載の核酸分子。
５６．核酸分子が、ｍＲＮＡである、４８に記載の核酸分子。
５７．１つ以上の核酸分子であって、
（ａ）活性化因子ＲＮＡ及び標的化因子ＲＮＡを含む古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及び
（ｂ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする、１つ以上の核酸分子。
５８．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、５７に記載の１つ以上の核酸分子。
５９．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、５７に記載の１つ以上の核酸分子。
６０．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６１．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６２．前記１つ以上の核酸分子が、活性化因子をコードする第１のヌクレオチド配列と、標的化因子をコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１及び第２のヌクレオチド配列が、異なるＤＮＡ分子上に存在する、６１に記載の１つ以上の核酸分子。
６３．前記１つ以上の核酸分子が、プロモーターに動作可能に連結された古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５７〜６２のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６４．前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、６３に記載の１つ以上の核酸分子。
６５．前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、６４に記載の１つ以上の核酸分子。
６６．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、６３〜６５のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６７．前記１つ以上の核酸分子が、１つ以上の組み換え発現ベクターである、５７〜６６のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
６８．前記１つ以上の組み換え発現ベクターが、１つ以上の組み換えアデノ関連ウイルスベクター、１つ以上の組み換えレトロウイルスベクター、または１つ以上の組み換えレンチウイルスベクターから選択される、６７に記載の１つ以上の核酸分子。
６９．前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、６３に記載の１つ以上の核酸分子。
７０．真核細胞であって、
ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｃ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含む、真核細胞。
７１．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、７０に記載の真核細胞。
７２．前記真核細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形網動物細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、７０または７１に記載の真核細胞。
７３．古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、細胞。
７４．前記細胞が、原核細胞である、７３に記載の細胞。
７５．前記古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、７３または７４に記載の細胞。
７６．標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸を、
ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、及び
ｂ）標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと接触させることを含み、
前述の接触させることが、古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドによる標的核酸の修飾をもたらす、方法。
７７．前記修飾が、標的核酸の切断である、７６に記載の方法。
７８．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、７６または７７に記載の方法。
７９．前述の接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．前述の接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８１．前述の接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
８２．前記細胞が、真核細胞である、８０または８１に記載の方法。
８３．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞である、８２に記載の方法。
８４．前記細胞が、原核細胞である、８０または８１に記載の方法。
８５．前述の接触させることが、ゲノム編集をもたらす、７６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
８６．前述の接触させることが、細胞中に、（ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、７６〜８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．前述の接触させることが、細胞中にＤＮＡドナーテンプレートを導入することをさらに含む、８６に記載の方法。
８８．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
８９．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
９０．標的ＤＮＡからの転写を変調するか、標的核酸を修飾するか、または標的核酸に関連したタンパク質を修飾する方法であって、
標的核酸を、
ａ）異種ポリペプチドに融合された古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドを含む、古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、及び
ｂ）標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと接触させることを含む、方法。
９１．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、９０に記載の方法。
９２．前記古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、９０に記載の方法。
９３．前記修飾が、標的核酸の切断ではない、９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
９４．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
９５．前述の接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９６．前述の接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９７．前述の接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９８．前記細胞が、真核細胞である、９６または９７に記載の方法。
９９．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞である、９８に記載の方法。
１００．前記細胞が、原核細胞である、９６または９７に記載の方法。
１０１．前述の接触させることが、細胞中に、（ａ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、または古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、または古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、９０〜１００のいずれか１項に記載の方法。
１０２．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、触媒能がない古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド（不活性型古細菌Ｃａｓ９）である、９０〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
１０３．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、９０〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
１０４．前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１０５．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０４に記載の方法。
１０６．前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０５に記載の方法。
１０７．前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１０８．前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、１０７に記載の方法。
１０９．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０７または１０８に記載の方法。
１１０．前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、１０９に記載の方法。
１１１．前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１１２．前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、１１１に記載の方法。
１１３．前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、１１１に記載の方法。
１１４．前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
１１５．遺伝子導入の多細胞非ヒト生物であって、それらのゲノムが、
ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、
ｂ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、及び
ｃ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１６．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１７．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１８．前記生物が、植物、単子葉植物、双子葉植物、無脊椎動物、昆虫、節足動物、クモ形網動物、寄生虫、蠕虫、脊椎動物、魚、爬虫類、両生類、有蹄類、鳥、ブタ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、１１５〜１１７のいずれか１項に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
１１９．系であって、
ａ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド及び古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡと、
ｂ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチド、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｃ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド及び古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと、
ｄ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチド、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｅ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及び古細菌Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡと、
ｆ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｇ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及び古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと、
ｈ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
ｉ）ｉ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｊ）ｉ）古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）ＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｋ）ｉ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
ｌ）ｉ）古細菌Ｃａｓ９融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）古細菌Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと
を含む、系。
１２０．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１９に記載の古細菌Ｃａｓ９系。
１２１．前記古細菌Ｃａｓ９ポリペプチドが、配列番号７１または配列番号７２に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、１１９に記載の古細菌Ｃａｓ９系。
１２２．前記ドナーテンプレート核酸が、８ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さを有する、１１９〜１２１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９系。
１２３．前記ドナーテンプレート核酸が、２５ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さを有する、１１９〜１２１のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９系。
１２４．１１９〜１２３のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９系を含む、キット。
１２５．前記キットの構成要素が、同じ容器内にある、１２４に記載のキット。
１２６．前記キットの構成要素が、別個の容器内にある、１２４に記載のキット。
１２７．１１９〜１２６のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９系を含む、無菌容器。
１２８．前記容器が、シリンジである、１２７に記載の無菌容器。
１２９．１１９〜１２６のいずれか１項に記載の古細菌Ｃａｓ９系を含む、埋め込み可能なデバイス。
１３０．前記古細菌Ｃａｓ９系が、マトリックス内にある、１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
１３１．前記古細菌Ｃａｓ９系が、貯蔵器内にある、１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
１３２．前記古細菌Ｃａｓ９タンパク質が、ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９タンパク質またはＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質である、態様１〜１３１（セットＢ）のいずれか１項。
１３３．前記古細菌Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ Ｃａｓ９タンパク質である、態様１〜１３１（セットＢ）のいずれか１項。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラー及び偏差が計上されるはずである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐＬはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃ．は皮下の（に）の標準的な略語を使用してもよい。
実施例１
本明細書に記載される研究は、地下水、沈殿物、及び酸鉱山廃水からの微生物群集のメタゲノム試料の分析を含む。培養生物の中で表されない新たなクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が同定された。
図３．ＣａｓＸドメイン及び類似性研究（パネルＡ）ＨＨｐｒｅｄを使用してＡｃＣｐｆ１との遠隔ホモログアラインメントから推定されたＣａｓＸの概略的ドメイン表現。保存された触媒残基は、タンパク質の上に赤色の棒でマークされる。ＣａｓＸは、Ｃ末端領域（ＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ）ならびに大きな新規Ｎ末端ドメインにＲｕｖＣスプリットドメインを含有する。概略図の下には、以下の検索に基づく上位ヒットが表示される。（１）ＮＣＢＩ中のすべてのタンパク質に対するＢＬＡＳＴ検索（モデル及び環境タンパク質を含む、ＮＲデータベース）。（２）Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２−３６、及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５−９７に記載されるすべてのＣａｓタンパク質を使用して構築されたモデルに基づくプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）検索。（３）ＨＨｐｒｅｄに基づく遠隔ホモログ検索。ヒットは、それらの重要性に基づいてカラーコードされ、ヒット範囲及びＥ値が提供される。明らかに、ＣａｓＸは、局所ヒットのみを有していた。ＣａｓＸの６２０Ｎ末端アミノ酸は、検索スキームのうちのいずれかにおいてヒットを有していなかった。合わせて、これらの発見は、ＣａｓＸが新たなＣａｓタンパク質であることを示す。（パネルＢ）２つの異なるＣａｓＸを含有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座足場は、配列データから構築された。上はデルタプロテオバクター（ＣａｓＸ１）からのものであり、下は、プランクトミセス（ＣａｓＸ２）からのものである。対応するＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５１及び５２として記載される。
実施例２
図４（パネルＡ〜Ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＣａｓＸによるプラスミド干渉。（パネルＡ）ＣａｓＸプラスミド干渉の実験デザイン。最小の干渉ＣａｓＸ遺伝子座を発現する有能なＥ．ｃｏｌｉ細胞（取得タンパク質が除去された）を調製した。これらの細胞を、ＣａｓＸ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中にスペーサーに対する一致を含有する（標的）または含有しない（非標的）プラスミドで形質転換し、ＣＲＩＳＰＲ及び標的プラスミドに対する抗生物質選択を含む培地上に播種した。良好なプラスミド干渉は、標的プラスミドに対する減少数の形質転換コロニーをもたらす。（パネルＢ）ＣａｓＸ１（ｓＸ１）からのスペーサー、ＣａｓＸ２（ｓＸ２）からのスペーサー、またはランダムな３０ｎｔ配列を含有する非標的プラスミドを含有する形質転換したプラスミドのｃｆｕ／μｇ。（パネルＣ）ＣＲＩＳＰＲ及び標的プラスミドの両方について、抗生物質選択を含有する培地上でパネルＢからの形質転換体の段階希釈を行った。
図５（パネルＡ〜Ｂ）ＣａｓＸによるＰＡＭ依存的プラスミド干渉。（パネルＡ）ＰＡＭ枯渇アッセイは、ＣａｓＸを用いて行った。ＣａｓＸ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含有するＥ．ｃｏｌｉを、標的配列の５′または３′でランダム化された７ヌクレオチドを有するプラスミドライブラリで形質転換した。標的プラスミドを選択し、形質転換体をプールした。ランダム化領域を増幅し、ディープシーケンシングのために調製した。枯渇した配列を同定し、それを使用してＰＡＭロゴを生成した。（パネルＢ）デルタプロテオバクテリアＣａｓＸに対して生成されたＰＡＭロゴは、標的の５′−ＴＴＣＮ−３′隣接配列５′を含有する配列に対して強い優先性を示した。３′ＰＡＭは検出されなかった。ｃ、プランクトミセスＣａｓＸに対して生成されたＰＡＭロゴは、最初のＴにおいて低い厳格性を有する標的の５′−ＴＴＣＮ−３′隣接配列５′を含有する配列に対して強い優先性を示した。３′ＰＡＭは検出されなかった。
図６（パネルＡ〜Ｃ）。ＣａｓＸは、二重ガイドＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクター複合体。（パネルＡ）ｔｒａｃｒＲＮＡノックアウト実験及びｓｇＲＮＡ試験のためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座。（パネルＢ）標的または非標的配列を含有する形質転換されたプラスミドの１μｇ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）。ｔｒａｃｒＲＮＡの欠失は、プラスミド干渉の除去をもたらした。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲアレイの代わりの合成ｓｇＲＮＡの発現は、ＣａｓＸによる頑健なプラスミド干渉をもたらした。（パネルＣ）ｓｇＲＮＡデザインの図（ＣａｓＸ１のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ配列に由来する）。ｔｒａｃｒＲＮＡ（緑色）を、テトラループ（ＧＡＡＡ）によってｃｒＲＮＡに接合した（反復、黒色；スペーサー、赤色）。
図７．ＣａｓＸ ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ干渉の概略図。ＣａｓＸは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（緑色）及びｃｒＲＮＡ（黒色、反復；赤色、スペーサー）に結合する。正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（黄色）を含有する標的配列（青色）に対するガイドＲＮＡの塩基対合は、標的ＤＮＡの二本鎖切断をもたらす。示される配列は、ＣａｓＸ１のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ配列に由来する。
実施例３
図８．ＣａｓＸを使用するヒト細胞を編集するための実験デザイン。不安定化ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＣａｓＸ及びそのガイドＲＮＡを発現するプラスミドのリポフェクションまたはそのガイドＲＮＡで事前に組み立てられたＣａｓＸのヌクレオフェクションのいずれかを使用し、ＣａｓＸで処置する。良好なゲノム切断は、フローサイトメトリー及び／または検査官アッセイ（例えば、Ｔ７Ｅ１アッセイ）によって検出され得る、蛍光シグナルの喪失を引き起こす、ＧＦＰ遺伝子座における挿入欠失をもたらす。
実施例４
図９．ＣａｓＸの組み換え発現及び精製。ＣａｓＸをマルトース結合タンパク質に融合し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製し、ＴＥＶで処置し、ヘパリンカラム及びサイズ排除カラム上で精製した。サイズ排除カラムからの分画は、参照のための分子量マーカーと共に示される。ＣａｓＸの算出サイズは、約１１０ｋＤａであった。
実施例５
図１０．様々なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の試験。試験したｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、以下のとおりであった（ＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡの概略については、図７を参照）。
ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ１：
ＡＡＧＵＡＧＵＡＡＡＵＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２４）
ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ２：
ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２１）
ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ３：
ＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号６６）
ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ４：
ＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ
（配列番号６７）
ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ５：
ＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号６８）
加えて、以下のｃｒＲＮＡ配列を機能について試験した。
ｃｒＲＮＡ１（処理されたバージョンのｃｒＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ及び二重ガイドフォーマットの両方で活性であった）。
ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号６１）
ｃｒＲＮＡ２（二重ガイドフォーマットで活性であった）。
ＡＵＵＵＧＡＡＧＧＵＡＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号６２）
加えて、以下のｓｇＲＮＡ配列を機能について試験した（ＣａｓＸガイドＲＮＡの概略表現については、図６及び図７を参照）。
ｓｇＲＮＡ（活性、センス、処理した）：
ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡｇａａａＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号４２）
ｓｇＲＮＡ２（不活性、センス、前処理した。下線が引かれた配列は、ｓｇＲＮＡ１に対して異なる）
ｓｇＲＮＡ３（不活性、センス、処理した）：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＵＵＵＧＡＵＧＣＧＵＵＵＵＡＣＵＵＡＵＣＧＧｇａａａＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＣＧＣＵＵＣＧＵＣＣＡＵＡＣＧＡＣＡＵＡＧＵＣＧＣＵＧＧＧＡＣＵＧＧＣＵＣＣＡＡＡＧＵＡＡＵＧＧＡＡＵＡＡＡＣＧＣＧＣＣＡＧＡＵＧＵ（配列番号６４）
ｓｇＲＮＡ４（不活性）：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＵＵＵＧＡＵＧＣＧＵＵＵＵＡＣＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＵＡＣＣＵＵＣＡＡＡＵｇａａａＧＧＡＧＣＵＡＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＣＧＣＵＵＣＧＵＣＣＡＵＡＣＧＡＣＡＵＡＧＵＣＧＣＵＧＧＧＡＣＵＧＧＣＵＣＣＡＡＡＧＵＡＡＵＧＧＡＡＵＡＡＡＣＧＣＧＣＣＡＧＡＵＧＵＡＡＵＵＵＡＣＵＡＣＵＵ（配列番号６５）
実施例６
図１１．ＣａｓＸ系（ＣａｓＸタンパク質及びガイドＲＮＡ）を、室温及び３７℃で細菌細胞中の機能について試験した。形質転換されたプラスミドの１μｇ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、標的または非標的配列を含有するプラスミドについてアッセイした。このアッセイは、室温または３７℃のいずれかで行った。データは、ＣａｓＸ系が、室温または３７℃のいずれかで同様の程度で機能したことを示す。
実施例７−古細菌Ｃａｓ９
図１２．ＡＲＭＡＮ−１ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（パネルＡ）ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の概要（パネルＢ）ＮＧＧ ３′ＰＡＭに対する強い優先性が、２４０プロトスペーサーの分析から推定された。（パネルＣ）リッチモンド・マイン生態系から採取されたＡＲＭＡＮ−１ゲノム中のＣＲＩＳＰＲアレイの再構成。緑色の矢印は、反復を示し、色付きの矢印は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを示す（同一のスペーサーは、同じ色で着色されているが、固有能力は、黒色で着色されている）。コンティグ（灰色の棒）を、メタゲノムコンティグ上のスペーサーの順序に基づいて整列させる。灰色の背景は、アレイの保存された古いと思われる領域を示す。ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーは、典型的に一方向に付加されるため、遺伝子座の左側の多様なスペーサーは、左側が最近の取得が起こった場所であることを示す。最近取得されたスペーサーの多様性の存在、ならびに異なる部位から異なる時点で収集されたデータセットから組み立てられたゲノム断片中の反復及びスペーサー配列の保存は、その系が活性であることを示した。（パネルＤ）ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９の系統発生は、それをＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９及びここで初めて報告される２つの新たな細菌Ｃａｓ９（黒色）と一緒にクラスタ化した。これらのＣａｓ９は、遺伝子座がＩＩ−Ｂ型系において典型的に見出されるＣａｓ４を含有しているが、進化的にＩＩ−Ｃ型系に関連すると思われる。（パネルＥ）異なるＩＩ−Ｂ型のセットとクラスタ化されたＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ１の系統発生。パネルＤ及びＥにおける系統樹を組み合わせると、ＡＲＭＡＮ−１ ＩＩ型系は、ＩＩ−Ｂ及びＩＩ−Ｃ ＣＲＳＩＰＲ−Ｃａｓ系の組み換えの結果であり得ることが示唆される。
図１４．（上パネル）ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重ガイドＲＮＡの予測二次構造。可変長のｃｒＲＮＡ（上鎖）と予測ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二次構造及び塩基対合が示される。「ｃｒＲＮＡ」は、ＡＲＭＡＮ−１からの直接反復配列を表すが、緑色のＮ２０は、ユーザ定義配列（ガイド配列）である。ｔｒａｃｒＲＮＡ−６９は、赤色で示されるが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−１０４及びｔｒａｃｒＲＮＡ−１７９は、それぞれ青色及びピンク色の配列によって伸長される。（下パネル）ＡＲＭＡＮ−１ Ｃａｓ９の例示的な単一ガイドＲＮＡの予測構造。ｓｇＲＮＡの二次構造が示される。「標的化因子」は、部分的直接反復（短縮された）及び標的化因子を活性化因子（同様に短縮された）に接続する操作されたテトラループ（リンカー）を表す。緑色のＮ２０は、ユーザ定義配列（ガイド配列）である。ｔｒａｃｒＲＮＡ−６９、ｔｒａｃｒＲＮＡ−１０４、及びｔｒａｃｒＲＮＡ−１７９を含むＳｇＲＮＡが示される。
図１５．（上パネル）ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重ガイドＲＮＡの予測二次構造。ｃｒＲＮＡ（上鎖）と予測ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（下鎖）との間の二次構造及び塩基対合が示される。「ｃｒＲＮＡ」は、ＡＲＭＡＮ−４からの直接反復配列を表すが、緑色のＮ20は、ユーザ定義配列（ガイド配列）である。（下パネル）ＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９の例示的な単一ガイドＲＮＡの予測構造。ｓｇＲＮＡの二次構造が示される。「標的化因子」は、部分的直接反復（短縮された）及び標的化因子を活性化因子（同様に短縮された）に接続する操作されたテトラループ（リンカー）を表す。緑色のＮ２０は、ユーザ定義配列（ガイド配列）である。
実施例８：未培養微生物由来の新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ適応免疫系は、部位特異的ＤＮＡ切断が可能なプログラム可能な酵素を提供することによってゲノム操作を改革した。しかしながら、現在のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術は、単に培養された細菌からの系に基づいており、単離されていない生物由来の酵素の大多数が未開発のままである。本明細書において提供されるデータは、培養独立型ゲノム判定済みメタゲノム解析を使用して、古細菌生活ドメイン中に初めて報告されたＣａｓ９を含む、新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の同定を示す。この多様なＣａｓ９酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部として、ほとんど研究されていないナノ古細菌中で見出された。細菌中、最も主流であるが、未だに同定されていない系の中で２つの以前に知られていない系（ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ及びＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ）が発見された。明らかに、メタゲノム解析によってすべての必要な機能性成分が同定され、これがＥ．ｃｏｌｉ中の頑健なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ干渉活性の検証を可能にした。本明細書におけるデータは、生きた細胞における実験と組み合わせた環境微生物群集の照合が、先例がない種々のゲノムへのアクセスを可能にし、その内容が微生物に基づくバイオテクノロジーのレパートリーを拡大することを示す。
結果
地下水、沈殿物、及び酸鉱山廃水微生物群集からのテラベーススケールのメタゲノムデータセットを分析し、培養生物の中で表されないクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を捜した。ドメイン古細菌で最初のＣａｓ９タンパク質が同定され、２つの新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ及びＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ）が、未培養細菌中で発見された（図１８）。明らかに、古細菌Ｃａｓ９及びＣａｓＹの両方は、既知の単離された代表的なものがない系統からの生物のゲノム中で排他的にコードされた。
古細菌Ｃａｓ９の最初の同定
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の特徴のうちの１つは、細菌ドメインにおいてのみ推定されるその存在であった。したがって、驚くべきことに、酸鉱山廃水（ＡＭＤ）メタゲノムデータセットにおいて、ナノ古細菌ＡＲＭＡＮ−１（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−１ ）及びＡＲＭＡＮ−４（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ＡＲＭＡＮ−４）のゲノム中でコードされるＣａｓ９タンパク質を発見した。これらの発見は、Ｃａｓ９含有ＣＲＩＳＰＲ系の発生を別の生活ドメインにまで拡大する。
ＡＲＭＡＮ−４ ｃａｓ９遺伝子は、同じゲノム文脈において、他の隣接したｃａｓ遺伝子を有しない（２５ｋｂｐを超えるいくつかのＤＮＡ配列の中央に位置するにもかかわらず）、１つの隣接したＣＲＩＳＰＲ反復スペーサー単位のみを有する、１６の異なる試料中で見出された（図２４）。ユニバーサルＣＲＩＳＰＲインテグラーゼをコードする典型的なＣＲＩＳＰＲアレイ及びｃａｓ１の欠失は、新たなスペーサーを取得する能力がない系を指し示す。スペーサー配列に対する標的を同定することができなかったが、数年にわたって収集された試料中の遺伝子座の保存を考慮すると、「単一標的」ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系中のその機能は、今回除外することができない。
反対に、１５の異なる試料から回収したＡＲＭＡＮ−１中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ４、及びｃａｓ９遺伝子に隣接した大きなＣＲＩＳＰＲアレイを含む。広範に保存された末端を有する（最も古いスペーサーで構成される可能性がある）多くの代替ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲアレイ、及び多くの別個のスペーサーが組み込まれた可変領域が再構成された（図１９Ａ及び図２５）。スペーサー含有量のこの超可変性に基づいて、これらのデータは、ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、採取された集団中で活性であることを示す。
注目すべきことには、ＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の推定スペーサー標的（プロトスペーサー）のうちの５６は、それが高密度の短い仮想タンパク質をコードすることを考慮して、恐らくＡＲＭＡＮ−１ウイルスである単一の１０ｋｂｐゲノム断片上に位置していた（図１９Ｂ）。実際に、低温電子断層撮影の再構成は、多くの場合、ＡＲＭＡＮ細胞に付着したウイルス粒子を同定した。ＡＲＭＡＮ−１プロトスペーサーはまた、ＡＲＭＡＮ−２（別のナノ古細菌）のゲノム内の推定トランスポゾン、及び同じ生態系からのＩ−プラズマのものを含む、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅ古細菌のゲノム中の推定移動要素に由来する（図２６）。直接細胞質間「橋」は、ＡＲＭＡＮ細胞とＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅ細胞との間で観察され、それらの間の密接な関係を示唆している。したがってＡＲＭＡＮ−１ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、これらの生物間のトランスポゾン伝播から防御することができ、真核生殖系における転位に対するｐｉＲＮＡ媒介型防御を思わせる役割である。
活性ＤＮＡ標的ＣＲＩＳＰ−Ｃａｓ系は、自己対非自己の区別のために標的配列の隣に位置する２〜４ｂｐプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を使用する。ゲノム標的配列に隣接した配列を調べることは、実際に、ＡＲＭＡＮ−１における強い「ＮＧＧ」ＰＡＭ優先性を明らかにした（図１９Ｃ）。Ｃａｓ９はまた、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断に対して２つの別個の転写、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を用いる。推定ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の両方の近位で同定された（図２７）。以前に、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡガイド複合体成熟に関与する宿主因子ＲＮａｓｅ ＩＩＩの欠失に起因して、古細菌中で不在であったことが示唆された。明らかに、ＲＮａｓｅ ＩＩＩホモログは、ＡＲＭＡＮ−１ゲノム中で同定されておらず（９５％完全であると推定される）、内部プロモーターは、ＣＲＩＳＰＲアレイに対して予測されず、ガイドＲＮＡの産生機序が依然として未確定であることを示唆する。Ｅ．ｃｏｌｉ及び酵母の両方ならびにインビボＥ．ｃｏｌｉ標的アッセイから精製されたＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４ Ｃａｓ９タンパク質の切断活性を試験する生化学実験は、いかなる検出可能な活性も明らかにしなかった（図３２及び図２８を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸは、新たな二重ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ系である。
Ｃａｓ９に加えて、クラス２Ｃａｓエフェクタータンパク質の３つのファミリーＣｐｆ１、Ｃ２ｃ１、及びＣ２ｃ２のみが発見され、実験的に検証された。小さいＤＮＡ断片上でのみ同定された別の遺伝子ｃ２ｃ３は、そのようなタンパク質ファミリーをコードすることも示唆された。新たな種類のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、地下水及び沈殿物試料から繰り返し回収された２種の細菌のゲノム中で見出された。異なる門に属する２種の生物（デルタプロテオバクテリア及びプランクトミセス）におけるこの系の高い保存は、細菌の交差門移行を示唆する。この新たに記載された系としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、及び本明細書ではＣａｓＸと称される、特徴化されていない約９８０ａａタンパク質が挙げられる。各ＣａｓＸと会合したＣＲＩＳＰＲアレイは、３７塩基対の高度に類似した反復、３３〜３４塩基対のスペーサー、及びＣａｓオペロンとＣＲＩＳＰＲアレイとの間の推定ｔｒａｃｒＲＮＡを有していた（図１８Ｂ）。ＢＬＡＳＴ検索は、トランスポザーゼに対する弱い類似性（ｅ値＞１×１０-4）を明らかにしただけであり、類似性はＣａｓＸ Ｃ末端の特定領域に制限されていた。遠隔ホモロジー検出及びタンパク質モデリングは、ＣａｓＸ Ｃ終端の近くのＲｕｖＣドメインを同定し、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において見出されたものを思わせる組織を有していた（図２９）。ＣａｓＸタンパク質（６３０Ｎ末端アミノ酸）の残部は、任意の既知のタンパク質に対して検出可能な類似性を示さず、これが新規のクラス２エフェクターであることを示唆してする。ｔｒａｃｒＲＮＡ及び別個のＣａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣａｓ４タンパク質の組み合わせは、Ｖ型系の中で固有である。さらに、ＣａｓＸは、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、及びＣ２ｃ３に対する１，２００ａａよりも大きい典型的なサイズと比較して、任意の既知のＶ型タンパク質：９８０ａａよりも大幅に小さい。
次に、その小さいサイズ及び非標準的遺伝子座含有量にもかかわらず、ＣａｓＸがＣａｓ９及びＣｐｆ１酵素に類似するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的を可能にするかどうかが疑問であった。この可能性を試験するために、ｃａｓＸを含む最小ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ遺伝子座をコードするプラスミド、短い反復スペーサーアレイ、及び介入する非コード領域を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるとき、この最小遺伝子座は、メタゲノム分析によって同定された標的配列を担持するプラスミドによって形質転換を遮断した（図２０Ａ〜Ｃ、図３０）。さらに、形質転換を伴う干渉は、最小遺伝子座におけるスペーサー配列が、プラスミド標的中のプロトスペーサー配列に一致した場合にのみ起こった。ＣａｓＸのＰＡＭ配列を同定するために、標的部位に隣接した５′または３′ランダム化配列のいずれかを含有するプラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で形質転換アッセイを繰り返した。この分析は、プロトスペーサー配列の５′の直近に位置する配列「ＴＴＣＮ」に対する厳格な優先性を明らかにした（図２０Ｄ）。３′ＰＡＭ優先性は観察されなかった（図３０）。この発見と一致して、「ＴＴＣＡ」は、環境試料中で同定された推定デルタプロテオバクテリアＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸプロトスペーサーの上流で見出された配列であった。明らかに、両方のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ遺伝子座は、それらの高度のＣａｓＸタンパク質相同性に即して、同じＰＡＭ配列を共有する。
単一ＲＮＡ及び二重誘導型系の両方の例は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の中で存在する。環境メタトランスクリプトームデータを使用して、ＣａｓＸがＤＮＡ標的化活性のためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするかどうかを決定した。この分析は、Ｃａｓ２オープンリーディングフレームとＣＲＩＳＰＲアレイとの間でコードされたＣＲＩＳＰＲ反復に対する配列相補性を有する非コードＲＮＡ転写を明らかにした（図２１Ａ）。ＣａｓＸ遺伝子座を発現するＥ．ｃｏｌｉ中のこの非コードＲＮＡの発現をチェックするために、この転写に対して両方向でノーザンブロットを行った（図３０）。結果は、ｃａｓＸ遺伝子と同じ鎖上にコードされた約１１０ｎｔの転写の発現を示し、約６０〜７０ｎｔはより異種の転写であり、ＣＲＩＳＰＲアレイのリーダー配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡとアレイとの間に存在することを示唆する。トランスクリプトームマッピングは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系中で起こるｃｒＲＮＡ処理と同様に、２２ｎｔ（または約２３ｎｔ）の反復及び２０ｎｔの隣接スペーサーを含むように処理されることをさらに示唆する（図２１Ａ）。さらに、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖のＲＮａｓｅ ＩＩＩ媒介型処理と一致する、２ｎｔの３′オーバーハングが同定された（図２１Ｂ）。推定ｔｒａｃｒＲＮＡ上のＣａｓＸ活性の依存性を決定するために、この領域を上記の最小ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ遺伝子座から欠失させ、プラスミド干渉アッセイを繰り返した。ＣａｓＸプラスミドからの推定ｔｒａｃｒＲＮＡコード配列の欠失は、その存在中で観察される頑健な形質転換干渉を排除した（図２１Ｃ）。この推定ｔｒａｃｒＲＮＡを、テトラループを使用して処理されたｃｒＲＮＡと接合して、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成した。ｃｒＲＮＡの異種プロモーター単独または短縮バージョンのｓｇＲＮＡを使用する発現は、いかなる有意なプラスミド干渉も有していなかったが、全長ｓｇＲＮＡの発現は、プラスミド形質転換に対する耐性を与えた（図２１Ｃ）。一緒に、これらの結果は、ＣａｓＸを新たな機能的ＤＮＡ標的化、二重ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ酵素として確立する。これらの結果は、ＣａｓＸが、単一ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ酵素として機能し得ることをさらに実証する。
ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ、単離体を欠く細菌系統において排他的に見出された系
ある特定の候補門放射線（ＣＰＲ）細菌のゲノム中でコードされた別の新たなクラス２ Ｃａｓタンパク質が同定された。これらの細菌は、典型的に、小さい細胞サイズ（低温ＴＥＭデータ及びろ過による富化に基づく）、非常に小さいゲノム、及び制限された生合成能力を有し、それらが共生生物である可能性が最も高いことを示す。本明細書においてＣａｓＹと称される新たな約１，２００ａａ Ｃａｓタンパク質は、最大でＣａｓ１及びＣＲＩＳＰＲアレイを含む最小ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部であると思われる（図２２Ａ）。ＣＲＩＳＰＲアレイの大部分は、１７〜１９ｎｔの異常に短いスペーサーを有するが、Ｃａｓ１を欠く１つの系（ＣａｓＹ．５）は、より長いスペーサーを有する（２７〜２９ｎｔ）。同定されたＣａｓＹタンパク質の６つの例は、公用データベースにおける任意のタンパク質に対して有意な配列類似性を有していなかった。公開されたＣａｓタンパク質3.4 から構築されたプロファイルモデル（ＨＭＭ）を使用する高感度検索は、６つのＣａｓＹタンパク質のうちの４つが、ＲｕｖＣドメイン及びＮ末端の小領域（約４５ａａ）に重なるＣ末端領域におけるＣ２ｃ３に対する局所類似性（ｅ値４×１０-11 〜３×１０-18 ）を有していたことを示した（図２９を参照）。Ｃ２ｃ３は、分類学的関係がない短いコンティグ上で同定された推定Ｖ型Ｃａｓエフェクターであり、実験的に検証されていない。ＣａｓＹと同様に、Ｃ２ｃ３は、短いスペーサー及びＣａｓ１を有するが、他のＣａｓタンパク質を有しないアレイの次に見出された。明らかに、現行の研究で同定されたＣａｓＹタンパク質のうちの２つは、他のＣａｓＹタンパク質との有意な配列類似性（最良ブラストヒット：ｅ値６×１０-85 、７×１０-75 ）を共有するにもかかわらず、Ｃ２ｃ３に対する有意な類似性を有していなかった。
任意の実験的に検証されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対するＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹの低い相同性を考慮して、次に、この系がＲＮＡ誘導型ＤＮＡ干渉を及ぼすかどうかが疑問に思われたが、短いスペーサー長に起因して、そのような活性に必要とされる可能性のあるＰＡＭモチーフに関する信頼性のある情報が存在しなかった。これに対処するために、全体ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ．１遺伝子座を短縮されたＣＲＩＳＰＲアレイで合成し、プラスミドベクター上のＥ．ｃｏｌｉに導入した。次いで、これらの細胞を、形質転換アッセイにおいて、アレイ中のスペーサー配列と一致し、隣接したランダム化５′または３′領域を含有する配列を有する標的プラスミドを使用して検証し、可能性のあるＰＡＭを同定した。形質転換体の分析は、標的された配列に直接隣接した５′ＴＡを含有する配列の枯渇を明らかにした（図２２Ｂ）。この同定されたＰＡＭ配列を使用して、ＣａｓＹ．１遺伝子座を、単一ＰＡＭを含有するプラスミドに対して試験した。同定された５′ＴＡ ＰＡＭ配列を含有する標的の存在下においてのみ、プラスミド干渉が実証された（図２２Ｃ）。したがって、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹがＤＮＡ干渉活性を有することを示す。
考察
未培養細菌及び古細菌由来のゲノム中の新たなクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ適応免疫系が同定され、特徴付けられた。活性ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対して普遍的なＣａｓ１の進化的分析（図２３Ａ）は、本明細書に記載される古細菌Ｃａｓ９系が、任意の既存のＩＩ型サブタイプに明らかに含まれないことを示唆した。Ｃａｓ１系統発生（ならびにｃａｓ４の存在）は、それをＩＩ−Ｂ型系と一緒にクラスタ化したが、Ｃａｓ９の配列は、ＩＩ−Ｃ型タンパク質により類似していた（図３１）。したがって、古細菌ＩＩ型系は、ＩＩ−Ｃ型及びＩＩ−Ｂ型系の融合として生じ得た（図２３Ｂ）。同様に、Ｃａｓ１系統発生分析は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ系からのＣａｓ１が、任意の他の既知のＶ型系から離れていることを示した。Ｖ型系は、トランスポゾンと、先祖Ｉ型系からの適応モジュール（Ｃａｓ１−Ｃａｓ２）との融合の結果であることが示唆された。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ系が、前述のＶ型系に対して生じたものとは異なる融合事象に続いて出現したと仮定される。驚いたことに、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ及び推定Ｃ２ｃ３系の両方は、ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むために必須であると考えられるタンパク質、Ｃａｓ２を欠くと思われる。すべてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、Ｃａｓ１及びＣａｓ２の両方を含有していた先祖Ｉ型系の子孫であると考えられることを考慮して、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹ及びＣ２ｃ３系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の残部とは異なる先祖を有し得るか、あるいはＣａｓ２が、それらの進化の歴史の間に喪失されたかのいずれかであり得る。
本明細書に記載される古細菌中のＣａｓ９及び細菌中の２つの以前に知られていないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の発見は、複雑な天然微生物群集から得られた包括的なＤＮＡ及びＲＮＡ配列データベースを使用した。ＣａｓＸ及びＣａｓＹの場合において、ゲノム文脈は、組み立てられていない配列情報から証明されていない機能の予測に重要であった。さらに、推定ｔｒａｃｒＲＮＡならびに標的されたウイルス配列の同定は、メタゲノムデータにより誘導される機能試験の分析を通して明らかになった。興味深いことに、これまでに同定された最も小型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座のうちのいくつかは、非常に小さいゲノムを有する生物において発見された。小さいゲノムサイズの結果は、これらの生物が、基本的代謝要件について、他の群集メンバーに依存する可能性があり、したがってそれらが、伝統的な培養に基づく方法の範囲から大幅に外れたままであることである。干渉に必要とされる制限数のタンパク質は、これらの最小系を、新たなゲノム編集ツールの開発に対して特に価値あるものにする。重要なことに、本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関するメタゲノム的発見が、インシリコ観察に制限されないが、それらの機能が試験され得る実験設定に導入され得ることが示される。生命が存在する事実上すべての環境が、ゲノム判定済みメタゲノム法によってここで証明され得ることを考慮して、本明細書に記載される複合計算的・実験的アプローチが、既知のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の多様性を大幅に拡張すると予想され、生物学的研究及び臨床適用のための新たな技術を提供する。
方法
メタゲノム及びメタトランスクリプトーム
３つの異なる部位からのメタゲノム試料を分析した。（１）リッチモンド鉱山（Ｉｒｏｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から２００６年〜２０１０年に収集された酸鉱山廃水（ＡＭＤ）試料、（２）コロラド州Ｒｉｆｌｅ近くのコロラド川に隣接したＲｉｆｌｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＦＲＣ）サイトから２００７年〜２０１３年に収集された地下水及び沈殿物試料。（３）Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｅｙｓｅｒ（ユタ州コロラド高原にある冷たいＣＯ2 駆動型間欠泉）から２００９年〜２０１４年に収集された地下水。
ＡＭＤデータについて、ＤＮＡ抽出方法及び短いリードシーケンシングが、Ｄｅｎｅｆ ａｎｄ Ｂａｎｆｉｅｌｄ（２０１２）及びＭｉｌｌｅｒら（２０１１）によって報告された。Ｒｉｆｌｅデータについて、ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出、ならびにシーケンシング、アセンブリ、及びゲノム再構成は、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎら（２０１６）及びＢｒｏｗｎら（２０１５）によって説明された。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｅｙｓｅｒからの試料について、方法は、Ｐｒｏｂｓｔら（２０１６）及びＥｍｅｒｓｏｎら（２０１５）によって説明されたものに従う。簡潔に言うと、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ単離キット（ＭｏＢｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＤＮＡを試料から抽出した。ＲＮＡを、Ｂｒｏｗｎら（２０１５）によって説明されるように、６つの２０１１年Ｒｉｆｌｅ地下水試料から収集した０．２μｍフィルターから抽出した。ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォーム上でシーケンシングし、メタトランスクリプトームｃＤＮＡを５５００ＸＬ ＳＯＬｉＤプラットフォーム上でシーケンシングした。新たに報告されたＣｒｙｓｔａｌ Ｇｅｙｓｅｒデータ及びＡＭＤデータの再分析のために、ＩＤＢＡ−ＵＤを使用して配列を組み立てた。配列包括度及び遺伝子発現を決定するために使用されるＤＮＡ及びＲＮＡ（ｃＤＮＡ）リードマッピングはそれぞれ、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用して行った。Ｐｒｏｄｉｇａｌを使用し、組み立てられた足場上でオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測した。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｅｙｓｅｒデータセットからの足場を、緊急自己組織化写像（ＥＳＯＭ）を使用し、ＡＢＡＷＡＣＡ、ＡＢＡＷＡＣＡ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＣＫ７）Ｍａｘｂｉｎ２、及びテトラヌクレオチド頻度の組み合わせを使用して、示差的包括度増加傾向に基づいてビニングした。ＧＣ含有率％、分類学的関係、及びゲノム完全性を使用して、ゲノムを手動で精選した。足場エラーは、ｒａ２．ｐｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｔｂｒｏｗｎ）を使用して補正した。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ計算分析
様々な試料から組み立てられたコンティグを、Ｍａｋａｒｏｖａら及びＳｈｍａｋｏｖらからのアラインメントに基づいて、ＨＭＭｅｒスイートを使用して構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して、既知のＣａｓタンパク質について走査した。ローカルバージョンのＣｒｉｓｐｒＦｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して、ＣＲＩＳＰＲアレイを同定した。ｃａｓ１遺伝子に隣接した１０のＯＲＦのうちの１つが、８００ａａより大きい、特徴付けられていないタンパク質をコードしたかどうかについて、Ｃａｓ１及びＣＲＩＳＰＲアレイの両方を含有していた遺伝子座をさらに分析したところ、同じコンティグ上で既知のｃａｓ干渉遺伝子は同定されなかった。潜在的なクラス２ Ｃａｓエフェクターとして、これらの大きなタンパク質をさらに分析した。これらの潜在的なエフェクターを、ＭＣＬを使用して、配列類似性に基づいてタンパク質ファミリーにクラスタ化した。これらのファミリーの各々を代表するＨＭＭを構築すること、及びそれらを使用して同様のＣａｓタンパク質のメタゲノムデータセットを検索することによって、これらのタンパク質ファミリーを拡張した。タンパク質ファミリーが本当に新しいことを保証するために、ＮＣＢｌの非冗長（ｎｒ）及びメタゲノム（ｅｎｖ＿ｎｒ）タンパク質データベースに対してＢＬＡＳＴ、ならびにＵｎｉＰｒｏｔ ＫｎｏｗｌｅｄｇｅＢａｓｅに対してＨＭＭ検索を使用して、既知のホモログを検索した。全長ヒットがない（タンパク質の長さの＞２５％）タンパク質のみを新規のタンパク質とみなした。推定Ｃａｓタンパク質の遠隔相同性検索を、ＨＨ−スイートからのＨＨｐｒｅｄを使用して行った。ハイスコアＨＨｐｒｅｄヒットを使用して、分解された結晶構造及びＪＰｒｅｄ４によって予測された二次構造との比較に基づいて、ドメインアーキテクチャを推測した。新たに発見されたＣａｓタンパク質を含むＨＭＭデータベースは、補足データ１において入手可能である。
スペーサー配列は、ＣｒｉｓｐｒＦｉｎｄｅｒを使用して、組み立てられたデータから決定した。ＣＲＡＳＳを使用して、関連試料の短いＤＮＡリードにおける追加のスペーサーを位置付けた。次いで、スペーサーに対して≦１ミスマッチを有するヒットについて、関連メタゲノムアセンブリに対するＢＬＡＳＴ検索によって（「−ｔａｓｋ ｂｌａｓｔｎ−ｓｈｏｒｔ」を使用して）スペーサー標的（プロトスペーサー）を同定した。関連した反復を含んでいたコンティグに属するヒットをフィルタリングした（ＣＲＩＳＰＲアレイをプロトスペーサーとして同定するのを避けるため）。プロトスペーサーに隣接する領域を整列させることによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を同定し、ＷｅｂＬｏｇｏを使用して可視化した。ｍＦｏｌｄを使用して、ＲＮＡ構造を予測した。組み立てられたデータからのスペーサー、反復、及び隣接する配列を手動で整列させることによって、ＣＲＩＳＰＲアレイの多様性を分析した。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ９．１を用いて、手動アラインメント及びコンティグ可視化を行った。
系統発生分析のために、新たに同定された系のＣａｓ１及びＣａｓ９タンパク質を、Ｍａｋａｒｏｖａら及びＳｈｍａｋｏｖらからのタンパク質と共に使用した。ＣＤ−ＨＩＴを使用して≧９０％同一性を有するタンパク質と一緒にクラスタ化することによって、非冗長セットをコンパイルした。アラインメントをＭＡＦＦＴで産生し、最大尤度系統発生を、置換モデルとしてＰＲＯＴＧＡＭＭＡＬＧを用いるＲＡｘＭＬ及び１００ブートストラップサンプリングを使用して構築した。Ｃａｓ１ツリーは、ｃａｓｐｏｓｏｎにつながる枝を使用して根付かせた。ＦｉｇＴｒｅｅ １．４．１（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）及びｉＴＯＬ ｖ３を使用して、ツリーを可視化した。
異種プラスミドの生成
メタゲノムコンティグを、ＣａｓＸの場合は取得に関連したタンパク質を除去し、ＣａｓＸ及びＣａｓＹ両方の場合はＣＲＩＳＰＲアレイのサイズを低減することによって、最小ＣＲＩＳＰＲ干渉プラスミドにした。最小遺伝子座を、Ｇｂｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として合成し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して組み立てた。
ＰＡＭ枯渇アッセイ
ＰＡＭ枯渇アッセイを、修正を伴って以前に記載されたように行った。プライマーを有する７ｎｔのランダム化ＰＡＭ領域と共に標的を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニールすることによって、ランダム化ＰＡＭ配列を含有するプラスミドライブラリを組み立て、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）を用いて伸長した。二本鎖ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＵＣ１９骨格にライゲーションした。ライゲーションしたライブラリをＤＨ５αに形質転換し、＞１０8 細胞を採取して、プラスミドを抽出し、精製した。２００ｎｇのプールしたライブラリを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を内包するエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉまたは遺伝子座を有しない対照プラスミドに形質転換した。形質転換した細胞を、カルベニシリン（１００ｍｇＬ−１）及びクロラムフェニコール（３０ｍｇＬ−１）を含有する選択培地上に３０時間２５℃で播種した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＡＭ配列をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのアダプターで増幅させた。７ｎｔのＰＡＭ領域を抽出し、各７ｎｔ配列についてＰＡＭ頻度を計算した。特定された閾値を超えて枯渇したＰＡＭ配列を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏを生成した。
プラスミド干渉
メタゲノム配列分析またはＰＡＭ枯渇アッセイから同定された推定標的を、ｐＵＣ１９プラスミドにクローン化した。１０ｎｇの標的プラスミドを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座プラスミドを含有するエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ安定）に形質転換した。細胞を２５℃で２時間回収し、適切な希釈液を選択培地上に播種した。プレートを２５℃でインキュベートし、コロニー形成単位をカウントした。すべてのプラスミド干渉実験を３重に行い、エレクトロコンピテント細胞を各複製について独立して調製した。
ＡＲＭＡＮ−Ｃａｓ９タンパク質の発現及び精製
ＡＲＭＡＮ−１（ＡＲ１）及びＡＲＭＡＮ−４（ＡＲ４）からのＣａｓ９の発現構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉについてコドン最適化したｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から組み立てられた。組み立てられた遺伝子を、Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＭＢＰまたはＨｉｓ６融合タンパク質として、ｐＥＴ系発現ベクターにクローン化した。発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、ＬＢブロス中３７℃で成長させた。タンパク質発現について、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド）でｍｉｄ−ｌｏｇ相中に細胞を誘導し、１６℃で一晩インキュベートした。すべての後次ステップを４℃で行った。細胞ペレットを、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０ｍＭイミダゾール）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁し、音波による溶解前に完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）を補充した。１５０００ｇで４０分間の遠心分離によって溶解物を清澄化し、バッチ中のＳｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。洗浄緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０ｍＭイミダゾール）に続いて、５カラム量の洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０ｍＭイミダゾール）で全体的に樹脂を洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、３００ｍＭイミダゾール）でＮｉ−ＮＴＡからタンパク質を溶出した。洗浄緩衝液Ａに対して一晩の透析中に、Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグをＴＥＶプロテアーゼによって除去した。切断されたＣａｓ９を、第２のＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムを通して親和性タグから除去した。５ｍＬのヘパリンＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）への適用前に、タンパク質を、ＩＥＸ緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール）中に透析した。Ｃａｓ９を、線形ＮａＣｌ（０．３〜１．５Ｍ）勾配にわたって溶出した。分画をプールし、３０ｋＤａスピン濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で濃縮した。該当する場合、Ｃａｓ９を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でサイズ排除クロマトグラフィを介してさらに精製し、後次切断アッセイのためにＩＥＸ緩衝液Ａ中で保存した。酵母発現の場合、ＡＲ１−Ｃａｓ９を、Ｇａｌ１／１０ Ｈｉｓ６−ＭＢＰ ＴＥＶ Ｕｒａ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４８３０５）にクローン化した。ベクターをＢＹ４７４１ ＵＲＡ３株に形質転換し、培養物を培地中３０℃で成長させた。約０．６のＯＤ６００において、タンパク質発現を２％ ｗ／ｖガラクトースで誘導し、１６℃で一晩インキュベートした。タンパク質精製は、上記のように行った。
ＲＮＡインビトロ転写及びオリゴヌクレオチド精製
インビトロ転写反応を、Ｔ７プロモーター配列を含有する合成ＤＮＡテンプレートを使用して、前述のように６５行った。すべてのインビトロ転写ガイドＲＮＡ及び標的ＲＮＡまたはＤＮＡを、変性ＰＡＧＥを介して精製した。二本鎖標的ＲＮＡ及びＤＮＡを、９５℃で１分間のインキュベーションによって２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５及び１００ｍＭ ＮａＣｌ中でハイブリダイズし、続いて室温までゆっくり冷却した。天然のＰＡＧＥによってハイブリッドを精製した。
インビトロ切断アッセイ
３７℃で３０分間、１×ＰＮＫ緩衝液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）及び［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、精製したＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチドを放射線標識した。ＰＮＫを６５℃で２０分間にわたって熱不活性化し、ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、遊離ＡＴＰを標識化反応から除去した。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、１×リフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール）中に等モル量で混合し、７０℃で５分間インキュベートした後、室温までゆっくり冷却した。反応液を１ｍＭ最終金属濃度まで補充し、続いて５０℃で５分間加熱した。室温までゆっくり冷却した後、リフォールドしたガイドを氷上に置いた。緩衝液、塩濃度について記載されない限り、Ｃａｓ９は、３７℃で１０分間、１×切断緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、５ｍＭ二価金属）中で等モル量のガイドを用いて再構成した。切断反応は、３７℃または指示された温度で放射線標識された標的上で１０ｘ過剰のＣａｓ９−ガイド複合体を用いて１×切断緩衝液中で行った。５０ｍＭ ＥＤＴＡを補充した等量のゲル負荷緩衝液中で反応をクエンチした。切断産生物を１０％変性ＰＡＧＥ上で溶解し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇによって可視化した。
インビボＥ．ｃｏｌｉ干渉アッセイ
ＡＲ１−及びＡＲ４−Ｃａｓ９についてのＥ．ｃｏｌｉ形質転換アッセイを、以前に公開されたように行った。簡潔に言うと、ガイドＲＮＡで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、エレクトロコンピテントにした。次いで、細胞を、野生型または触媒能がないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする９ｆｍｏｌのプラスミドで形質転換した。回収された細胞の段階希釈を、選択的抗生物質と共にＬＢプレート上に播種した。３７℃で１６時間後にコロニーをカウントした。
表１．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が同定された生物及びゲノム位置に関する詳細、ならびに再構成されたスペーサーの数及び平均長さ、及び反復長さ（ＮＡ、入手付加）。１６試料からＡＲＭＡＮ−１スペーサーを再構成した。
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物が置き換えられてもよいことを理解されたい。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正が行われてもよい。すべての係る修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内となるように意図されている。
相互参照
本出願は、２０１６年９月３０日出願の米国仮特許出願第６２／４０２，８４６号の利益を主張するものであり、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１７年９月２８日に作成された１３５ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＢＥＲＫ−３４２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供される。このテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (131)

  1. ａ）ＣａｓＸポリペプチド、または前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子と、
    ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と
    を含む、組成物。
  2. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  5. 脂質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. ａ）及びｂ）が、リポソーム内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ａ）及びｂ）が、粒子内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 緩衝剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤のうちの１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
  13. ＤＮＡドナーテンプレートをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. ａ）標的核酸にハイブリダイズするガイド配列、及び二重鎖形成セグメントを含む標的化因子配列と、
    ｂ）前記標的化因子配列の前記二重鎖形成セグメントとハイブリダイズしてＣａｓＸポリペプチドに結合し得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成する活性化因子配列と
    を含む、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子。
  15. 前記ガイド配列が、１９〜３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１４に記載のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子。
  16. 請求項１４または請求項１５に記載のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
  17. 前記ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、請求項１６に記載のＤＮＡ分子。
  18. 前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
  19. 前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、請求項１８に記載のＤＮＡ分子。
  20. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
  21. 組み換え発現ベクターである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
  22. 前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、請求項２１に記載のＤＮＡ分子。
  23. 前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、請求項１７に記載のＤＮＡ分子。
  24. 異種ポリペプチドに融合されたＣａｓＸポリペプチドを含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  25. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  26. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  27. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  28. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  29. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、請求項２７または請求項２８に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  30. 前記異種ポリペプチドが、前記ＣａｓＸポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に融合される、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  31. ＮＬＳを含む、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  32. 前記異種ポリペプチドが、標的細胞または標的細胞型上の細胞表面部分への結合をもたらす標的化ポリペプチドである、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  33. 前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  34. 前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項３３に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  35. 前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項３４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  36. 前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  37. 前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、請求項３６に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  38. 前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項３６または請求項３７に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  39. 前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項３８に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  40. 前記異種ポリペプチドが、エンドソーム脱出ポリペプチドである、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  41. 前記エンドソーム脱出ポリペプチドが、ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号９４）及びＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される、請求項４０に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  42. 前記異種ポリペプチドが、葉緑体移行ペプチドである、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  43. 前記葉緑体移行ペプチドが、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号８３）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号８４）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号８５）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８６）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号８７）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号８８）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号８９）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号９０）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号９１）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号９２）、及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号９３）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  44. 前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  45. 前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、請求項４４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  46. 前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、請求項４４に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  47. 前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
  48. 請求項２４〜４７のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
  49. 前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、請求項４８に記載の核酸分子。
  50. 前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、請求項４９に記載の核酸分子。
  51. 前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、請求項５０に記載の核酸分子。
  52. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
  53. ＤＮＡ分子が、組み換え発現ベクターである、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の核酸分子。
  54. 前記組み換え発現ベクターが、組み換えアデノ関連ウイルスベクター、組み換えレトロウイルスベクター、または組み換えレンチウイルスベクターである、請求項５３に記載の核酸分子。
  55. 前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、請求項４９に記載の核酸分子。
  56. ｍＲＮＡである、請求項４８に記載の核酸分子。
  57. （ａ）活性化因子ＲＮＡ及び標的化因子ＲＮＡを含むＣａｓＸガイドＲＮＡと、
    （ｂ）ＣａｓＸポリペプチドと
    を含む、１つ以上の核酸分子。
  58. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の１つ以上の核酸分子。
  59. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の１つ以上の核酸分子。
  60. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
  61. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
  62. 前記活性化因子をコードする第１のヌクレオチド配列と、前記標的化因子をコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１及び第２のヌクレオチド配列が、異なるＤＮＡ分子上に存在する、請求項６１に記載の１つ以上の核酸分子。
  63. プロモーターに動作可能に連結された前記ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
  64. 前記プロモーターが、真核細胞中で機能的である、請求項６３に記載の１つ以上の核酸分子。
  65. 前記プロモーターが、植物細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、ハエ細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞のうちの１つ以上において機能的である、請求項６４に記載の１つ以上の核酸分子。
  66. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞型特異的プロモーター、及び組織特異的プロモーターのうちの１つ以上である、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
  67. １つ以上の組み換え発現ベクターである、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載の１つ以上の核酸分子。
  68. 前記１つ以上の組み換え発現ベクターが、１つ以上の組み換えアデノ関連ウイルスベクター、１つ以上の組み換えレトロウイルスベクター、または１つ以上の組み換えレンチウイルスベクターから選択される、請求項６７に記載の１つ以上の核酸分子。
  69. 前記プロモーターが、原核細胞中で機能的である、請求項６３に記載の１つ以上の核酸分子。
  70. ａ）Ｃａｓｘポリペプチド、または前記Ｃａｓｘポリペプチドをコードする核酸分子、
    ｂ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
    ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含む、真核細胞。
  71. 前記Ｃａｓｘポリペプチドをコードする前記核酸分子を含み、前記核酸分子が、前記真核細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、請求項７０に記載の真核細胞。
  72. 植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形網動物細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項７０または請求項７１に記載の真核細胞。
  73. ＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む、細胞。
  74. 原核細胞である、請求項７３に記載の細胞。
  75. 前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする前記核酸分子を含み、前記核酸分子が、前記細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、請求項７３または請求項７４に記載の細胞。
  76. 標的核酸を修飾する方法であって、
    前記標的核酸を、
    ａ）ＣａｓＸポリペプチド、及び
    ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含み、
    前記接触させることが、前記ＣａｓＸポリペプチドによる前記標的核酸の修飾をもたらす、方法。
  77. 前記修飾が、前記標的核酸の切断である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、請求項７６または請求項７７に記載の方法。
  79. 前記接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記細胞が、真核細胞である、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
  83. 前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞から選択される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記細胞が、原核細胞である、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
  85. 前記接触させることが、ゲノム編集をもたらす、請求項７６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記接触させることが、細胞中に、（ａ）前記ＣａｓＸポリペプチド、または前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）前記ＣａｓｘガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、請求項７６〜８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記接触させることが、前記細胞中にＤＮＡドナーテンプレートを導入することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、請求項７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、請求項７６〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  90. 標的ＤＮＡからの転写を変調するか、標的核酸を修飾するか、または標的核酸に関連したタンパク質を修飾する方法であって、
    前記標的核酸を、
    ａ）異種ポリペプチドに融合されたＣａｓＸポリペプチドを含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
    ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含む、方法。
  91. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記修飾が、前記標的核酸の切断ではない、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記接触させることが、細胞の外側でインビトロで行われる、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記接触させることが、培養中の細胞の内側で行われる、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記接触させることが、細胞の内側でインビボで行われる、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  98. 前記細胞が、真核細胞である、請求項９６または請求項９７に記載の方法。
  99. 前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞から選択される、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記細胞が、原核細胞である、請求項９６または請求項９７に記載の方法。
  101. 前記接触させることが、細胞中に、（ａ）前記ＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び（ｂ）前記ＣａｓｘガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、請求項９０〜１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、請求項９０〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、請求項９０〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記異種ポリペプチドが、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈する、請求項９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記異種ポリペプチドが、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及びリコンビナーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記異種ポリペプチドが、標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈する、請求項９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  108. 前記異種ポリペプチドが、ヒストン修飾活性を呈する、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項１０７または請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記異種ポリペプチドが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、及びデアセチラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈する、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記異種ポリペプチドが、転写を増加または減少させるタンパク質である、請求項９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記異種ポリペプチドが、転写抑制因子ドメインである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記異種ポリペプチドが、転写活性化ドメインである、請求項１１１に記載の方法。
  114. 前記異種ポリペプチドが、タンパク質結合ドメインである、請求項９０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 遺伝子導入の多細胞非ヒト生物であって、
    それらのゲノムが、
    ａ）ＣａｓＸポリペプチド、
    ｂ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
    ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
  116. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
  117. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１５に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
  118. 植物、単子葉植物、双子葉植物、無脊椎動物、昆虫、節足動物、クモ形網動物、寄生虫、蠕虫、刺胞動物、脊椎動物、魚、爬虫類、両生類、有蹄類、鳥、ブタ、ウマ、ヒツジ、齧歯類、マウス、ラット、または非ヒト霊長類である、請求項１１５〜１１７のいずれか１項に記載の遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。
  119. ａ）ＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡと、
    ｂ）ＣａｓＸポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
    ｃ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド及びＣａｓＸガイドＲＮＡと、
    ｄ）ＣａｓＸ融合ポリペプチド、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
    ｅ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡと、
    ｆ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
    ｇ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＣａｓＸガイドＲＮＡと、
    ｈ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＣａｓＸガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーテンプレートと、
    ｉ）ｉ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
    ｊ）ｉ）ＣａｓＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）ＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
    ｋ）ｉ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと、
    ｌ）ｉ）ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びＤＮＡドナーテンプレートを含む、１つ以上の組み換え発現ベクターと
    を含む、ＣａｓＸ系。
  120. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載のＣａｓＸ系。
  121. 前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載のＣａｓＸ系。
  122. 前記ドナーテンプレート核酸が、８ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１９〜１２１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系。
  123. 前記ドナーテンプレート核酸が、２５ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１１９〜１２１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系。
  124. 請求項１１９〜１２３のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、キット。
  125. 前記キットの構成要素が、同じ容器内にある、請求項１２４に記載のキット。
  126. 前記キットの構成要素が、別個の容器内にある、請求項１２４に記載のキット。
  127. 請求項１１９〜１２６のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、無菌容器。
  128. シリンジである、請求項１２７に記載の無菌容器。
  129. 請求項１１９〜１２６のいずれか１項に記載のＣａｓＸ系を含む、埋め込み可能なデバイス。
  130. 前記ＣａｓＸ系が、マトリックス内にある、請求項１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
  131. 前記ＣａｓＸ系が、貯蔵器内にある、請求項１２９に記載の埋め込み可能なデバイス。
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