WO2007132555A1 - 細胞膜透過性ペプチドと細胞内におけるその使用 - Google Patents

細胞膜透過性ペプチドと細胞内におけるその使用 Download PDF

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WO2007132555A1
WO2007132555A1 PCT/JP2007/000499 JP2007000499W WO2007132555A1 WO 2007132555 A1 WO2007132555 A1 WO 2007132555A1 JP 2007000499 W JP2007000499 W JP 2007000499W WO 2007132555 A1 WO2007132555 A1 WO 2007132555A1
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biomolecule
protein
peptide
cell
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PCT/JP2007/000499
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French (fr)
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Teruyuki Nagamune
Shinya Tsukiji
Original Assignee
The University Of Tokyo
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the use of a cell membrane permeable peptide. More specifically, the present invention relates to a method for functionalizing biomolecules present in cells by using a cell membrane permeable peptide.
  • Biomolecules such as proteins, nucleic acids, and lipids play an important role in the maintenance and control of cell functions. If normal functions and controls of these biomolecules are impaired, cell dysfunction, The tissue and organ dysfunction is caused, resulting in the onset of the disease. Therefore, knowing what kind of activity a biomolecule plays in a cell and what role it plays plays a role in elucidating various phenomena of life activity not only at the cellular level but also at the individual level. As a result, it will also lead to the acquisition of important knowledge for the development of new technologies related to disease treatment, diagnosis and drug discovery.
  • analyzing the intracellular localization and behavior of biomolecules is an effective methodology for clarifying the functions and controls of these biomolecules, not only elucidating the mechanism of action of biomolecules, Useful information for efficiently controlling the activity of biomolecules can be obtained.
  • the target protein can be expressed and purified in vitro, in order to localize the target protein in a desired region in the cell, another protein that controls localization is further bound. In some cases, inconveniences such as an increase in protein size due to binding may affect the activity of the target protein. In addition, it is necessary to select and prepare a molecule that binds to the target protein every time the region desired to be localized is different. This presents a difficult problem in comprehensively verifying the intracellular activity of the target protein. is doing.
  • the cell membrane permeable peptide examples include HIV-1 TAT (SEQ ID NO: 1), HIV-1 gp41 (SEQ ID NO: 2), HIV_1 ReV (SEQ ID NO: 3), pAntp (SEQ ID NO: 4), VP 22 peptide (SEQ ID NO: 5), SV40N LS (SEQ ID NO: 6), Pep-1 (SEQ ID NO: 7), Integrin) S 3 (SEQ ID NO: 8), Influenza HA-2 (SEQ ID NO: 9), WZR (SEQ ID NO: 10), T ransportan (SEQ ID NO: 1 1), BMV-gag (SEQ ID NO: 1 2), HT LV— II Re x (SEQ ID NO: 1) 3), H uma nc FOS (SEQ ID NO: 14), H um
  • Patent Documents 1 to 9 describe methods for introducing various molecules using the cell membrane-permeable peptide. These documents disclose that a desired molecule can be bound to a cell membrane permeable peptide and the molecule can be introduced into the cell. The cell membrane permeable peptide introduces the desired molecule into the cell. It is a very useful tool for doing this.
  • Non-Patent Document 1 TorchiIin et al., Proc. Natl. Acad. Sc in USA 2003; 1 00: 1 972-1 977
  • Non-Patent Document 2 Morri s et al., Natre Biot c h n o l o g y
  • Non-special S No. 3 P h e l a n, N a t u r e B i o t e c h n o l o g y
  • Non-Patent Document 4 Wender et al., Proc. Nat to Acad. Sc to USA 2000; 97: 13003-13008
  • Non-Patent Document 5 C hen et al., P r o c. Nat to A c ad. S c to USA
  • Non-Patent Document 6 Suzuuki et al., J. Biol. Ch em. 2002: 277: 2437-2443
  • Non-special S-century document / ' G a r i e p y, T r e n d s i n B i o t e c h n o lo o y 200 1; 1 9: 2 1 -28
  • Patent Document 1 US 5, 804, 604
  • Patent Document 2 U S 5, 747, 64 1
  • Patent Document 3 U S 5, 674, 980
  • Patent Document 4 U S 5, 670, 6 1 7
  • Patent Document 5 US 5, 652, 122
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 5 _ 5 2 0 8 3
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 5—
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 1 _ 1 9 9 9 9 7
  • the present invention relates to the use of a cell membrane-permeable peptide, and a method for forming a semi-artificial protein in a cell by chemically modifying a small molecule, a polymer, a peptide, or a protein that is chemically synthesized to a target protein. It is another object of the present invention to provide a method for linking intracellular localization signal peptides and the like to a target protein at a desired timing by using a cell membrane permeable peptide. .
  • the present invention introduces various synthetic compounds that are difficult to permeate the cell membrane into the cell through the use of a cell membrane permeable peptide, and further acts by linking the intracellular localized signal peptide.
  • the purpose is to provide a method for localizing in a desired region.
  • the present inventors provide a desired molecule (for example, a synthetic small molecule, a peptide, a protein, etc.) to a biomolecule (for example, a low molecular compound, a peptide, a protein, a lipid, etc.) in a cell at a desired timing.
  • a desired molecule for example, a synthetic small molecule, a peptide, a protein, etc.
  • a biomolecule for example, a low molecular compound, a peptide, a protein, a lipid, etc.
  • the present invention relates to the following (1) to (17).
  • the first aspect of the present invention is the following ( a ) and (b);
  • a second aspect of the present invention is “the method according to (1) above, wherein the functionalization is labeling”.
  • a third aspect of the present invention is “the method according to (1) above, wherein the functionalization is to change the intracellular localization of the biomolecule”.
  • a fourth aspect of the present invention is “the method according to (1) above, wherein the functionalization promotes or inhibits the activity of the biomolecule”.
  • a fifth aspect of the present invention is “the method according to any one of (1) to (4) above, wherein the biomolecule and the effector molecule are not unified.”
  • a sixth aspect of the present invention is “the method according to any one of (1) to (4) above, wherein the biomolecule and the effector molecule are combined.”
  • the seventh aspect of the present invention is as described in the above (6), wherein the receptor molecule bound to the biomolecule binds to the mediator molecule, and the integration is achieved. The method.
  • the mediator molecule is any one of a low molecular compound, a peptide, a protein, a lipid, a nucleic acid, and a sugar
  • the effector molecule is a low molecular compound, a synthetic polymer.
  • a ninth aspect of the present invention is “the method according to (8) above, wherein the mediator molecule is any one of a substrate analog, a metal complex, and a coenzyme”.
  • any one of the above (1) to (9), wherein the effector molecule is a intracellular localization signal peptide is a intracellular localization signal peptide.
  • the first aspect of the present invention is as described in (10) above, wherein the intracellular localization signal is a nuclear localization signal or a cell membrane localization signal. Method ".
  • a first or second aspect of the present invention is “the method according to any one of (1) to (1 1) above, wherein the biomolecule is an exogenous molecule”.
  • a thirteenth aspect of the present invention is “the method according to any one of (1) to (12) above, wherein the biomolecule is a protein”.
  • the 14th aspect of the present invention is as described in (13) above, wherein the protein is expressed from a nucleic acid incorporated into an expression vector introduced into a cell. Method ".
  • the receptor molecule that specifically binds to the mediator molecule is a peptide or a protein, and the receptor molecule directly or directly binds to the protein.
  • the method according to (14) above, wherein an expression vector in which a nucleic acid encoding the receptor molecule is incorporated adjacent to the nucleic acid encoding the protein so as to be linked via a peptide is used. No.
  • a sixteenth aspect of the present invention is “the method according to any one of (13) to (15) above, wherein the protein is a fluorescent protein”.
  • the 17th aspect of the present invention is “a cell membrane-permeable peptide to which a mediator molecule and an effector molecule are bound”.
  • a protein linked with a desired molecule (semi-artificial protein and (Also referred to as a membrane protein) can be effectively modified even for proteins that have been conventionally difficult to modify in a test tube.
  • the localization of the protein can be easily and easily controlled by freely selecting a peptide sequence that links the localization of the target protein in the cell to the protein. .
  • the localization of the protein of interest in the cell or the localization of the protein that is endogenously expressed in the cell without being introduced from the outside of the cell, and the protein
  • a mediator molecule that specifically binds it can be easily and easily observed in an almost physiological state.
  • FIG. 1 shows an example of functionalizing a biomolecule by integrating the effector molecule with the biomolecule.
  • FIG.2 An example of the functionalization of a biomolecule without integrating it with a biomolecule is shown.
  • FIG. 3 shows the structure of a membrane-permeable peptide derivative (Example 1).
  • FIG. 4 shows a conceptual diagram of Example 1.
  • a cell membrane permeable peptide (R9) was conjugated with a single molecule (N LS and Al x a Fl lu 647) and a mediator molecule (TMP).
  • N LS and Al x a Fl lu 647 was conjugated with a single molecule (N LS and Al x a Fl lu 647) and a mediator molecule (TMP).
  • FIG. 5 shows cell fluorescence images before and after introducing a cell membrane permeable peptide (Example 1) into cells.
  • FIG. 6 shows the structure of a membrane-permeable peptide derivative (Example 2).
  • FIG. 7 shows a conceptual diagram of Example 2.
  • a cell membrane permeable peptide (R 9) was conjugated with a single molecule (Myr_GC and AlxaFlour 6 4 7) and a single mediator molecule (TMP).
  • FIG. 8 shows cell fluorescence images before and after introducing a cell membrane permeable peptide (Example 2) into cells.
  • a function that is not conventionally held by intracellular biomolecules can be imparted at a desired timing, or a function that has been conventionally held can be changed.
  • the term “function” as used herein includes a wide range of specific activities or properties. For example, in addition to enzymatic activity, physical activity, fluorescence, and other properties, biomolecules are intracellular. It also includes the property of localizing to a specific part of. “Functionalization” here means to change the function that a biomolecule has previously held, and a new function is expressed by “functionalization”, or a part of the conventional function or All is to disappear.
  • biomolecules include, for example, molecules labeled by the addition of fluorescent dyes, molecules to which signals for migration to specific organelles are added, and biomolecule-specific activities are suppressed. Examples thereof include a molecule whose activity has been reduced by the provision of a factor, or a molecule which has been activated by the provision of a factor that promotes the intrinsic activity of a biomolecule.
  • “Functionalization” here includes not only directly binding a specific molecule or atom (for example, a functional group such as a phosphate group, a methyl group, and a acetyl group, or a fluorescent molecule) to a biomolecule. It also includes cases where a new activity or property is imparted to a biomolecule by integrating it with a single molecule. Furthermore, “functionalization” here includes not only the case of being caused by the direct action of an effector molecule, but also the case of being caused by an indirect action via other factors.
  • an effector molecule for functionalizing the biomolecule and a cell membrane permeable peptide linked with a mediator molecule for mediating the effect of the effector molecule on the biomolecule (mediator) are used.
  • a cell membrane permeable peptide linked with a mediator molecule for mediating the effect of the effector molecule on the biomolecule (mediator)
  • mediator a cell membrane permeable peptide linked with a mediator molecule for mediating the effect of the effector molecule on the biomolecule.
  • it is possible to confer functions to target biomolecules by linking and introducing into the cell a single effector molecule and mediator molecule necessary for imparting a new function to the biomolecule.
  • the timing at which such a cell membrane-permeable peptide is added to the cells the function of the target biomolecule can be imparted at the desired timing.
  • various functions can be provided by using various molecules of various effects as appropriate.
  • One or more effector molecules and mediator molecules can be bound to one cell membrane permeable peptide.
  • the mode of binding between the cell membrane permeable peptide and the effector molecule or mediator molecule may be such that a single effector molecule and Z or mediator molecule may be directly bound to the cell membrane permeable peptide, and the cell membrane via the effector molecule or mediator molecule. It may be combined with a permeable peptide.
  • the "cell membrane permeable peptide” is a peptide having cell membrane permeability characterized by containing many basic amino acids.
  • HI V — 1 TAT SEQ ID NO: 1
  • HI V — 1 gp 41 SEQ ID NO: 2
  • HIV_1 Re V SEQ ID NO: 3
  • pAntp SEQ ID NO: 4
  • VP22 peptide SEQ ID NO: 5
  • SV40N LS SEQ ID NO: 6
  • Pep-1 SEQ ID NO: 5
  • peptide is not limited to these peptides, and any peptide having cell membrane permeability that can be easily selected by those skilled in the art can be used.
  • Effective molecule means a molecule for imparting a new function (referred to as functionalization) to a biomolecule through a mediator molecule.
  • a single effector molecule is, for example, a variety of fluorescent dye molecules when a biomolecule is imparted with a fluorescence coloring function, and when a biomolecule is imparted with a function that localizes to a specific intracellular site.
  • Intracellular localization signal peptides eg, nuclear localization signal peptide, cell membrane localization signal peptide, endoplasmic reticulum localization signal, mitochondria localization signal, etc.
  • a molecule having an activity of activating, suppressing or inhibiting the function of a biomolecule existing in a cell can also be used as a single effector molecule.
  • effector molecules proteins, unnatural amino acids, low molecular weight compounds, synthetic polymers, lipids, nucleic acids, sugars, and the like can be suitably used in addition to peptides such as signal peptides.
  • a "mediator molecule” is necessary to change the function of a biomolecule without integrating or integrating the effector molecule and biomolecule to achieve functionalization of the biomolecule by the effector molecule. It is an intermediary molecule used depending on the situation.
  • a biomolecule and an effector molecule are integrated (for example, when the effector molecule is a fluorescent dye molecule, etc.), for example, the biomolecule or a receptor molecule directly linked to the biomolecule
  • a molecule that binds directly eg, a small molecule ligand for the biomolecule or receptor molecule, an antibody that recognizes the biomolecule or receptor molecule, or a portion thereof, etc.
  • receptor molecule refers to a molecule that binds to or interacts with a mediator molecule.
  • the mediator molecule is any ligand molecule, it corresponds to an enzyme or receptor that can bind to the ligand molecule. To do.
  • “mediator molecule” integrates biomolecule and effector molecule. (E.g., by localizing an effector molecule in the immediate vicinity of the site where the biomolecule is present, the activity of the biomolecule can be changed.
  • a molecule capable of localizing an effector molecule to the site of the biomolecule for example, controlling the activity of a biomolecule that functions at the cell membrane
  • a cell membrane localization signal peptide can be used (see, for example, Fig. 2).
  • mediator molecules peptides, proteins, lipids, nucleic acids, sugars, etc. can be used in addition to low-molecular ligands such as substrate analogs, metal complexes, and coenzymes.
  • biomolecules and effector molecules are integrated. If it is, a molecule having a high binding affinity and specificity with a biomolecule or a receptor molecule is preferable.
  • the cell membrane permeable peptide used in the present invention and the effector molecule and mediator molecule, or the effector molecule and mediator molecule are linked, they can be linked via an appropriate crosslinking agent. Any one of those skilled in the art can use any crosslinking agent that can be easily selected.
  • a divalent crosslinking agent is used.
  • N- (6-maleimidocapryoxy (succinimide ester (EMCS)) can be suitably used.
  • EMCS 6-maleimidocapryoxy
  • disulfide bonds may be used.
  • a chimeric molecule in which the N-terminus or C-terminus of the cell membrane-permeable peptide and one molecule of EF Ita and one of Z or mediator molecules are linked directly or via a linker peptide can also be prepared using an expression vector.
  • the "biomolecule” in the present invention includes all that can be grasped as ordinary knowledge of those skilled in the art, and includes any molecule that constitutes a living organism or controls the function of the living organism. It is.
  • the “biomolecule” of the present invention may be a molecule inherent in the cell or an exogenous molecule, but is preferably an exogenous molecule. Furthermore, if it is a molecule that controls the functions of living things, It may include artificial things that do not exist.
  • Examples of “biomolecules” include proteins, nucleic acids, sugars, etc., but proteins are particularly preferred and foreign proteins are more preferred.
  • a nucleic acid encoding the exogenous protein of interest can be incorporated into an appropriate expression vector and expressed in the target cell.
  • An expression vector incorporating a nucleic acid encoding the target protein can be obtained by linking the nucleic acid encoding the target protein to an appropriate expression vector.
  • a receptor molecule that specifically binds with high affinity to a mediator molecule linked to a cell membrane permeable peptide is a peptide (or protein)
  • the nucleic acid encoding the receptor molecule can be directly or via a linker sequence. It can also be placed on an expression vector for the target protein to express a complex in which the target protein is directly bound to the receptor molecule.
  • a vector that can be replicated in a target cell and has a promoter that can express a target protein, a nucleic acid encoding a receptor molecule, and the like can be used.
  • vectors examples include plasmid DNA and phage DNA.
  • plasmid DNA examples include E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC1 18, pUC1 19, pUC1 8, pUC19, pCBD-C, etc.), derived from Bacillus subtilis Plasmids (eg, p UB 110, pTP 5, p C 1 94, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YE p 1 3, YE p 24, YC p 50, YI p 30, etc.) It can be selected according to the nature of the target cells.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC1 18, pUC1 19, pUC1 8, pUC19, pCBD-C, etc.
  • Bacillus subtilis Plasmids eg, p UB 110, pTP 5, p C 1 94, etc.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is an appropriate promoter corresponding to a cell that expresses the target protein.
  • SRQ? Promoter CMV promoter, SV40 promoter, LTR promoter, HSV-TK promoter, EF-1 promoter and the like can be mentioned.
  • the host is E. coli, tac promoter, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, PL promoter, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ p promoter, etc.
  • the host is Bacillus subtilis, SP01 promoter, SPO 2 promoter, pen P promoter and the like.
  • examples include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the target protein expression vector includes selection marker, terminator, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, ribosome binding sequence (SD sequence), SV40 replication origin (SV40 ori) etc. can be linked.
  • Selection markers include, but are not limited to, hygromycin resistance marker (Hyg, dihydrofolate reductase gene (dhfr), ampicillin resistance gene (Amp), kanamycin resistance gene (Kanri, neomycin resistance gene (Neo G41 8) ) Etc. are available.
  • Introducing a nucleic acid encoding a target protein and a receptor molecule into the above-described vector means that a cloned DNA is added as it is or after digestion with a restriction enzyme if necessary, and a linker is added to the vector DN. It can be carried out by inserting the restriction enzyme site of A or a multicloning site.
  • the DNA to be ligated may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the DNA to be ligated must be integrated into a vector so that the target protein and receptor molecule encoded in the DNA are expressed in the host cell.
  • Example 1 Induction of nuclear translocation of EGFP
  • a nuclear localization signal sequence SEQ ID NO: 19: three nuclear localization sequences derived from SV40 large T antigen
  • a fluorescent dye A lexa Fluor 647
  • TMP 2,4-diamino-5_ (3,4,5-trimethylbenzyl) pyrimidine
  • TMP 2,4-diamino-5_ (3,4,5-trimethylbenzyl) pyrimidine
  • TMP 2,4-diamino-5_ (3,4,5-trimethylbenzyl) pyrimidine
  • R 9 SEQ ID NO: 18
  • Tri me thoprim (S i gma) 25. O g (, 8 ⁇ . 1 mm o I) is dissolved in 300 mL of 48% HBr (Aldrich) and stirred for 20 minutes in an oil bath at 100 ° C. did. The reaction vessel was lifted from the oil bath, and 60 mL of a 500/0 aqueous sodium hydroxide solution was slowly added thereto. After standing to cool to room temperature, it was allowed to stand at 4 ° C. The precipitated solid crystals were collected by filtration, washed with 100 mL of cold water, and redissolved in 200 mL of boiling water. The pH was adjusted to around 7 using 28% aqueous ammonia and allowed to cool to room temperature. Further, the white solid ( ⁇ ) obtained by standing at 4 ° C for 4 hours was collected by filtration and dried under reduced pressure in the presence of diphosphorus pentoxide in a desiccator. The product was identified by 1 H-NMR.
  • the peptides shown in Fig. 3 were synthesized by solid phase synthesis by the Fmoc method.
  • Fmo c— NH— SAL— Re sin (Watanabe Chemical) as the resin
  • Fmo c— Cys (T rt) — OH
  • Fmo c— A rg (P bf) — OH
  • Fmoc—Lys Boc) —OH
  • Fmoc—Ac p—OH (Watanabe Chemical) were used as Fmoc—amino acids.
  • De-Fmoc was performed using 20% piperidine ZDM F, and DI CZHOB t system was used as a condensing agent for coupling.
  • the peptide was lyophilized, then modified in DM SO with A lexa Fluor 647—C 2 ⁇ Ma I eimide (Invitrogen) to the C-terminal cysteine group, and again with reverse-phase HP LC (C 1 8 Column).
  • DM SO liquid phase liquid phase liquid phase liquid phase liquid phase
  • the gene for E. coli-derived dihydrofolate reductase was amplified from the E. coli genome by PCR. At that time, 5′—A AAACTGCAGAC CATGGCT ATCAGTCTG AT TGCGGCGT T AGCG—3 ′ (SEQ ID NO: 20) and 5′—CGCGG ATCCG AAGCGGCCGC CCGCCGCTCCAG AAT—3 ′ (SEQ ID NO: 21) were used as primers.
  • the PCR product was inserted into the pEGFP-N1 vector (CIonetech) using PstI and BamHI sites to prepare an eDHFR-EGFP fusion protein expression plasmid. The nucleotide sequence of the PCR fragment was confirmed by DNA sequencing.
  • HeLa cells were used for the experiment.
  • DMEM containing 10% FBS (Sigma) was used as a medium, and subculture was performed at intervals of 2 to 3 days. The culture was performed in a 37 ° C incubator under a 5% CO 2 atmosphere.
  • HeLa cells were seeded in a 35 mm glass pot dish so as to have 2 ⁇ 10 6 cells, and cultured for 24 hours. Thereafter, eDHFR-EGFP expression plasmids were transfected using Lipofectamine and PIus test (Invitrogen). Incubate for another 24 hours to confirm gene expression Then, the following intracellular peptide introduction experiment was conducted.
  • the cell culture medium was removed, and a medium containing 10 M of peptide was added thereto. After leaving still in the incubator for 4 hours and washing 3 times with PBS (-), the medium was added again, and the fluorescence was observed with a confocal laser microscope.
  • Fig. 4 shows a conceptual diagram of this experiment
  • Fig. 5 shows cell fluorescence images before and after introducing the peptide into the cell.
  • the biomolecule is EG FP
  • the effector molecule is NLS and Alexa Fluor 647.
  • the mediator molecule is TMP derivative
  • the acceptor molecule is eDHFR
  • the cell membrane permeability peptide is R9 (SEQ ID NO: It corresponds to 1 8).
  • the green fluorescence derived from eDHFR—EG FP Prior to introduction of the peptide into the cell, the green fluorescence derived from eDHFR—EG FP is uniformly distributed in the cytoplasm and nucleus, and most of the fluorescence is emitted from the nucleolus in the nucleus. Not observed. However, when TMP-linked nuclear localization sequence 1 R 9 peptide (TMP—N LS—R9) was introduced into the cell, strong green fluorescence was observed, particularly from the nucleolus in the nucleus. It was shown that e DH FR—EG FP expressed in cells by 1 ⁇ 1 ⁇ -1 ⁇ 11_5-9 could be localized in the nucleus.
  • Example 2 Induction of cell membrane translocation of EG FP
  • a cell membrane localization signal sequence part of a cell membrane localization motif derived from a Lyn protein belonging to the S rc family, SEQ ID NO: 1 8) and fluorescent dye (A lexa Fluor 647), 2,4-Damino_5_ (3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidine (TMP: ⁇ lime prim) derivative as a mediator molecule ()
  • TMP 2,4-Damino_5_ (3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidine
  • the peptide shown in Fig. 6 was synthesized by solid phase synthesis by Fmoc method.
  • Fmo c— NH— SAL— Re sin (Watanabe Chemical) is used as the resin, Fmo c— GI y— OH, Fmo c— Cys (T rt) — OH, Fmo c— A rg (P bf) — OH, Fmo c—L ys (M tt) —OH and Fmo c—L ys (B oc) —OH (Watanabe Chemical) were used as Fmo c—amino acids.
  • De-Fmoc was performed using 20% piperidine ZDMF, and DI CZHOB t system was used as a condensing agent for coupling.
  • DI CZHOB t system was used as a condensing agent for coupling.
  • Myristic Acid Tokyo Kasei
  • the target peptide was purified by reversed-phase HP LC (C18 column) and identified by MALD I—TO F—MS. After lyophilization of the peptide, in the pH 8.0.3, 0.1 M sodium bicarbonate buffer, A lexa Fluor 647—C arboxyl ⁇ c A c ⁇ d- S uccinimidyl ts ter (Invitrogen) is near the C-terminus The lysine residue was modified and purified again by reverse phase HPLC (C 1 8 column). Peptide creates an aqueous stock and its concentration is calculated using absorbance from Alexa Fluor 647.
  • e DH FR—EG FP expression plasmid (see Example 1) was introduced into Lipofectamine and PI uss formula drug (Invitrogen) 3 ⁇ 4: Serum and HeLa cells. After further incubation for 24 hours, gene expression was confirmed. Then G 41 8 performs antibiotic selection by to give e DH FR-EG FP constitutively expressing cell lines.
  • HeLaZe DH FR—EG FP constitutively expressing cells were seeded on a 35 mm glass bottom dish so as to have 2 ⁇ 10 5 cells, cultured for 48 hours, and then subjected to the following intracellular peptide introduction experiment.
  • the cell culture medium was removed, and a medium containing peptide 6 M shown in FIG. 6 was added thereto. Allow to stand in incubator for 1 hour, wash 3 times with PBS (+), add medium again, and observe fluorescence with confocal laser microscope
  • FIG. 7 A conceptual diagram of this experiment is shown in Fig. 7, and cell fluorescence images before and after introducing the peptide into the cell are shown in Fig. 8.
  • the biomolecule is EG FP
  • the effector molecule is M yr _GC and A lexa Fluor 647.
  • the mediator molecule is TMP derivative
  • the acceptor molecule is e DH FR
  • the cell membrane permeable peptide is R 9 ( It corresponds to SEQ ID NO: 1 8).
  • the intracellular biomolecule can be easily functionalized by using the method of the present invention, for example, means for promoting or suppressing the function of a specific biomolecule, or a specific pharmacology Localize effective biomolecules in desired areas in cells It can be used as a means to Therefore, it will make a great contribution in the fields of medicine, pharmaceutical development, and research and development of new species of animals and plants.

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Abstract

　本発明は、細胞膜透過性ペプチド誘導体を用いた細胞内生体分子の機能を変更する方法の提供を目的とする。 　細胞内生体分子（例えば、タンパク質など）の機能に影響を与えるエフェクター分子、及びエフェクター分子の作用を生体分子に媒介するためのメディエーター分子を連結した細胞膜透過性ペプチドを細胞内に導入し、細胞内生体分子の機能又は性質、例えば、酵素的な活性、物理的な活性、細胞内局在性などに変更を与えるための有効な方法を提供する。

Description

明 細 書
細胞膜透過性べプチドと細胞内におけるその使用
技術分野
[0001 ] 本発明は、 細胞膜透過性ペプチドの使用に関する。 より詳細には、 細胞膜 透過性べプチドの使用により、 細胞内に存在する生体分子を機能化する方法 に関する。
背景技術
[0002] タンパク質、 核酸、 脂質などの生体分子は、 細胞機能の維持や制御におい て重要な役割を担っており、 これら生体分子の正常な機能及び制御が損なわ れると、 細胞の機能不全、 さらには、 組織、 器官の機能不全が引き起こされ 、 その結果、 疾患への発症へとつながっていく。 従って、 生体分子が細胞内 において如何なる活性を発揮して、 どのような役割を演じているかを知るこ とは、 細胞レベルのみならず個体レベルにおける生命活動の諸現象を解明す ることにつながリ、 延いては疾患の治療や診断及び創薬に関する新しい技術 開発のための重要な知見の獲得にもつながる。
特に生体分子の細胞内局在や挙動を解析することはこうした生体分子の機 能及び制御を明らかにする上で有効な方法論であり、 生体分子の作用機序を 解明するのみならず、 目的の生体分子の活性などを効率的に制御するための 有益な情報を得ることができる。
[0003] 特定の生体分子、 特に、 タンパク質の細胞内挙動やその機能を調べる手法 として、 対象のタンパク質に蛍光色素などをラベル化したり、 細胞内の特定 の小器官へ局在化するためのシグナル配列べプチドなどを付加して、 その挙 動や細胞内活性を調べる方法などが用いられている。 そのためには、 対象タ ンパク質を i n V i t r oにおいて発現及び精製したのち、 適当な標識化 を行う必要がある。 しかしながら、 タンパク質を i n V i t r oで発現さ せる場合には、 かならずしも所望の発現を実現できるとはかぎらず、 また、 発現できた場合でも発現タンパク質を精製するにあたり、 活性を保持しなが ら精製を行うなど、 多くの点に留意しながら行う必要がある。 標識化に関し ても現状としてはその制御が難しく、 望ましい部位への修飾にはかなりの難 度が伴う。
[0004] また、 対象タンパク質を i n V i t r oにおいて発現及び精製できたと しても、 対象タンパク質を細胞内の所望の領域に局在化させるために、 局在 を制御する別のタンパク質をさらに結合させる場合などには、 結合によるタ ンパク質の巨大化により対象タンパク質の活性に影響が出るなどの不都合も 生じる可能性がある。 さらに、 局在化を望む領域が異なる毎に対象タンパク 質と結合させる分子を選択して調製し直す必要があリ、 対象タンパク質の細 胞内活性を網羅的に検証する点において難しい問題が存在している。
その他、 i n V i t r oにおいて修飾した生体分子を細胞内に導入し、 その動態から該生体分子の作用機序などを検討する場合には、 修飾した生体 分子の量的調整などが困難であるため、 例えば、 元来生体内に存しているタ ンパク質などであっても、 修飾したタンパク質を過剰に導入することは、 細 胞内を非正常な状況に導く可能性が高く、 得られた結果の信憑性が問われる ケースも少なからず生じていた。
以上のような問題を改善することは、 精度の高い実験データを得る上でも 重要なことであるが、 現在のところ従来法に代わる新たな手法は見出されて いない。
[0005] 一方、 細胞内に外来性分子を導入する手法は、 細胞膜透過性べプチドの発 見以来、 目的分子を迅速に細胞内へ導入する技術が開発され、 順調な発展を 示している。 細胞膜透過性ペプチドとしては、 例えば、 H I V_ 1 TAT (配列番号 1) 、 H I V_ 1 g p 41 (配列番号 2 ) 、 H I V _ 1 Re V (配列番号 3) 、 p An t p (配列番号 4) 、 VP 22ペプチド （配列番 号 5) 、 SV40N LS (配列番号 6) 、 P e p - 1 (配列番号 7) 、 I n t e g r i n )S 3 (配列番号 8) 、 I n f l u e n z a HA-2 (配列番号 9) 、 WZR (配列番号 1 0) 、 T r a n s p o r t a n (配列番号： 1 1 ) 、 BMV- g a g (配列番号 1 2) 、 HT LV— I I Re x (配列番号 1 3) 、 H uma n c FOS (配列番号 1 4) 、 H uma n c J U N (配 列番号 1 5) 、 F H V c o a t (配列番号 1 6) 、 Y e a t GCN 4 (配 列番号 1 7) などがこれまでに報告されている （非特許文献 1〜7などを参 照のこと） 。
[0006] また、 上記細胞膜透過性ペプチドを用いた種々の分子の導入法に関しては 、 特許文献 1〜9に記載されている。 これらの文献には、 細胞膜透過性ぺプ チドに所望の分子を結合して、 該分子を細胞内に導入できることなどが開示 されており、 細胞膜透過性ペプチドは、 細胞内に所望の分子を導入するため の非常に有用なツールであるといえる。
[0007] 非特許文献 1 ： T o r c h i I i nら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA 2003 ; 1 00 : 1 972- 1 977
非特許文献 2： Mo r r i sら， N a t u r e B i o t e c h n o l o g y
200 1 ; 1 9 : 1 1 73- 1 1 76
非特 S午文献 3： P h e l a nり， N a t u r e B i o t e c h n o l o g y
1 998 ; 1 6 : 440-443
非特許文献 4： We n d e rら， P r o c. N a t に A c a d. S c に U S A 2000 ; 97 ： 1 3003- 1 3008
非特許文献 5： C h e nら， P r o c. N a t に A c a d. S c に USA
1 999 ; 96 : 4325-4329
非特許文献 6： S u z u k i ら， J. B i o l . C h em. 2002 : 277 ： 2437 -2443
非特 S午文献/'： G a r i e p yり， T r e n d s i n B i o t e c h n o l o y 200 1 ; 1 9 ： 2 1 -28
特許文献 1 ： U S 5， 804， 604号
特許文献 2 ： U S 5， 747, 64 1号
特許文献 3 ： U S 5， 674, 980号
特許文献 4 ： U S 5， 670, 6 1 7号
特許文献 5 ： U S 5， 652, 1 22号 特許文献 7：特開 2 0 0 5 _ 5 2 0 8 3
特許文献 8：特開 2 0 0 5— 2 5 3 4 0 8
特許文献 9：特開 2 0 0 1 _ 1 9 9 9 9 7
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、 細胞膜透過性ペプチドの使用に関するもので、 化学合成した小 分子、 高分子、 ペプチド、 又はタンパク質などを対象のタンパク質に連結修 飾した半人工タンパク質を細胞内において形成する方法の提供を目的とする また、 本発明は、 細胞膜透過性ペプチドの使用により、 細胞内局在化シグ ナルぺプチドなどを対象タンパク質に対して所望のタイミングで連結する方 法の提供を目的とする。
さらに、 本発明は、 細胞膜を透過しにくい種々の合成化合物を細胞膜透過 性べプチドの使用により細胞内に導入し、 更に連結した細胞内局在化シグナ ルぺプチドなどの働きによって、 細胞内の所望の領域に局在化させる方法の 提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、 生体分子 （例えば、 低分子化合物、 ペプチド、 タンパク質 、 脂質など） に所望の分子 （例えば、 合成小分子、 ペプチド、 タンパク質な ど） を、 所望のタイミングで細胞内において連結、 修飾させる方法に関し、 鋭意研究を重ねた結果、 細胞膜透過性べプチドの使用により本課題の解決が 可能であることを見出し、 本発明を完成した。
[0010] すなわち、 本発明は 以下の （1 ) 〜 （1 7 ) に関する。
( 1 ) 本発明の第 1の態様は、 「以下の （a ) 及び （b ) ；
( a ) メディエーター分子及びェフエクタ一分子が結合した細胞膜透過性 ぺプチドを細胞内に導入する工程、
( b ) 該メディエーター分子を介して、 該細胞内に存在する生体分子と該ェ フエクタ一分子を一体化し又は一体化することなく、 該生体分子の機能を変 更する工程、
を含むことを特徴とする生体分子を機能化する方法」 である。
(2) 本発明の第 2の態様は、 「前記機能化が標識化であることを特徴とす る上記 （1 ) に記載の方法」 である。
(3) 本発明の第 3の態様は、 「前記機能化が前記生体分子の細胞内局在を 変動させることである上記 （1 ) に記載の方法」 である。
(4) 本発明の第 4の態様は、 「前記機能化が前記生体分子の活性を促進又 は阻害することである上記 （1 ) に記載の方法」 である。
(5) 本発明の第 5の態様は、 「前記生体分子と前記エフェクター分子を一 体化させないことを特徴とする上記 （1 ) 乃至 （4) のいずれかに記載の方 法」 である。
(6) 本発明の第 6の態様は、 「前記生体分子と前記エフェクター分子を一 体化させることを特徴とする上記 （1 ) 乃至 （4) のいずれかに記載の方法 」 である。
(7) 本発明の第 7の態様は、 「前記生体分子と結合している受容分子と前 記メディエーター分子が結合し、 前記一体化が達成されることを特徴とする 上記 （6) に記載の方法」 である。
(8) 本発明の第 8の態様は、 「前記メディエーター分子が、 低分子化合物 、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 核酸、 糖のいずれかであり、 前記エフェク ター分子が、 低分子化合物、 合成高分子、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 核 酸、 糖のいずれかであることを特徴とする上記 （1 ) 乃至 （7) のいずれか に記載の方法」 である。
(9) 本発明の第 9の態様は、 「前記メディエーター分子が、 基質アナログ 、 金属錯体、 補酵素のいずれかであることを特徴とする上記 （8) に記載の 方法」 である。
(1 0) 本発明の第 1 0の態様は、 「前記エフェクター分子が細胞内局在化 シグナルペプチドであることを特徴とする上記 （1 ) 乃至 （9) のいずれか に記載の方法」 である。
(1 1 ) 本発明の第 1 1の態様は、 「前記細胞内局在化シグナルが、 核局在 化シグナル又は細胞膜局在化シグナルであることを特徴とする上記 （1 0) に記載の方法」 である。
(1 2) 本発明の第 1 2の態様は、 「前記生体分子が外来性の分子であるこ とを特徴とする上記 （1 ) 乃至 （1 1 ) のいずれかに記載の方法」 である。
(1 3) 本発明の第 1 3の態様は、 「前記生体分子がタンパク質であること を特徴とする上記 （1 ) 乃至 （1 2) のいずれかに記載の方法」 である。
(1 4) 本発明の第 1 4の態様は、 「前記タンパク質が細胞内に導入された 発現ベクターに組み込まれた核酸から発現するものであることを特徴とする 上記 （1 3) に記載の方法」 である。
(1 5) 本発明の第 1 5の態様は、 「前記メディエーター分子と特異的に結 合する前記受容分子がぺプチド又はタンパク質であり、 該受容分子が前記タ ンパク質と直接又はリンカ一べプチドを介して連結するように、 該受容分子 をコードする核酸を、 前記タンパク質をコードする核酸に隣接して組み込ん だ発現ベクターを使用することを特徴とする上記 （1 4) に記載の方法」 で める。
(1 6) 本発明の第 1 6の態様は、 「前記タンパク質が蛍光タンパク質であ ることを特徴とする上記 （1 3) 乃至 （1 5) のいずれかに記載の方法」 で める。
(1 7) 本発明の第 1 7の態様は、 「メディエーター分子及びエフェクター 分子が結合した細胞膜透過性ペプチド」 である。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、 生体分子への新たな機能付与を所望のタイミングで、 容 易に行うことができる。
[0012] 本発明によれば、 同一の生体分子に対して、 異なる機能の付与を簡便に行 うことができる。
[0013] 本発明によれば、 所望の分子を連結したタンパク質 （半人工タンパク質と も称する） を細胞内において調製する方法であり、 従来から試験管内におけ る修飾が困難とされているタンパク質 （例えば、 膜タンパク質など） であつ ても、 有効に修飾することができる。
[0014] 本発明によれば、 対象タンパク質の細胞内における局在を該タンパク質に 連結させるぺプチド配列を自在に選択することで、 該タンパク質の局在を簡 便かつ容易に制御することができる。
[0015] 本発明によれば、 対象タンパク質の細胞内における局在を、 又は、 細胞外 部から導入せずに細胞内にて内在的に発現している該タンパク質の局在を、 該タンパク質と特異的に結合するメディエーター分子を選択することにより 、 ほぼ生理的状態において、 簡便かつ容易に観察することが出来る。
[0016] 本発明によれば、 薬理効果を示す合成化合物のうち細胞膜透過性を示さな いものや、 ペプチド性薬剤などであっても、 細胞内の所望の領域に局在化さ せることが可能であるため、 的確な薬理効果を実現することができ、 また、 必要となる薬剤量を低減させることもできる。
[0017] 本発明によれば、 細胞内の特定部位において薬理効果を発揮する化合物の スクリーニングと探索、 及び、 既知の薬効に関する薬効機序解析などを適正 に行うことが可能となる。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]エフェクター分子が生体分子と一体化することにより、 生体分子を機能 化する場合の一例を示す。
[図 2]ェフエクタ一分子が生体分子と一体化せずに、 生体分子を機能化する場 合の一例を示す。
[図 3]膜透過性ペプチド誘導体 （実施例 1 ) の構成を示す。
[図 4]実施例 1の概念図を示す。 細胞膜透過性ペプチド （R9) にェフエクタ 一分子 （N LS及び A l e x a F l u o r 647) 及びメディエーター分子 (TMP) を結合させた。
[図 5]細胞膜透過性ペプチド （実施例 1 ) を細胞内へ導入する前後での細胞蛍 光画像を示す。 [図 6]膜透過性ペプチド誘導体 （実施例 2 ) の構成を示す。
[図 7]実施例 2の概念図を示す。 細胞膜透過性ペプチド （R 9 ) にェフエクタ 一分子 （M y r _ G C及び A l e x a F l u o r 6 4 7 ) 及びメディエータ 一分子 （T M P ) を結合させた。
[図 8]細胞膜透過性ペプチド （実施例 2 ) を細胞内へ導入する前後での細胞蛍 光画像を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、 細胞内の生体分子が従来保持していない機能を、 所望の タイミングにて付与すること、 又は、 従来保持している機能に変更を加える ことができる。 ここでいう 「機能」 とは、 特定の活性又は性質などを広く包 含するものであり、 例えば、 酵素的な活性、 物理的な活性、 蛍光を発する性 質などのほか、 生体分子が細胞内の特定の部位に局在する性質なども含まれ る。 ここでの 「機能化」 とは、 生体分子が従来保持している機能に変更を加 えることを意味し、 「機能化」 により新規な機能が発現するか、 又は従来の 機能の一部又は全部が消失することである。 従って、 「機能化」 の結果、 従 来の機能の全部を保持したまま新たな機能が付加されてもよく、 また、 従来 の機能の全部又は一部が消失してもよく、 さらに、 従来の機能の全部又は一 部が消失した後新たな機能が付加されてもよい。 従って、 「機能化」 された 生体分子としては、 例えば、 蛍光色素の付加により標識化された分子、 特定 の細胞内小器官への移行シグナルを付加された分子、 生体分子固有の活性を 抑制する因子の付与により活性が低下した分子、 あるいは、 生体分子固有の 活性を促進する因子の付与により活性化された分子などを挙げることができ る。 ここでの 「機能化」 には、 特定の分子又は原子 （例えば、 リン酸基、 メ チル基、 ァセチル基などの官能基、 蛍光分子など） を直接生体分子に結合さ せることのほか、 ェフエクタ一分子と一体化することで生体分子に新たな活 性又は性質などを付与する場合も含まれる。 さらに、 ここでの 「機能化」 は 、 エフェクター分子の直接的作用によって生じる場合だけでなく、 他の因子 を介した間接的作用によって生じる場合も含む。 [0020] 生体分子を機能化するツールとして、 生体分子を機能化するエフェクター 分子、 及びエフェクター分子の作用を生体分子に媒介 （メディエー卜） する ためのメディエーター分子を連結した細胞膜透過性べプチドを用いることが できる。 細胞膜透過性ペプチドは、 細胞に接触させると容易に細胞内に侵入 することができる。 そのため、 生体分子に新たな機能を付与するために必要 なェフエクタ一分子及びメディエーター分子を連結して細胞内に導入するこ とにより、 対象の生体分子への機能付与が可能となる。 このような細胞膜透 過性べプチドを細胞に添加するタイミングを選ぶことで、 所望のタイミング で対象の生体分子の機能付与を図ることができる。 また、 様々なェフエクタ 一分子を適宜用いることで、 多様な機能付与を実現することができる。
1つの細胞膜透過性べプチドに対して、 エフェクター分子及びメディエー ター分子は 1又は複数結合させることができる。 特に、 エフェクター分子を 複数結合させた場合には、 対象となる生体分子に複数の機能を付与すること が可能となる。 また、 細胞膜透過性ペプチドとエフェクター分子又はメディ エーター分子との結合様式は、 ェフエクタ一分子及び Z又はメディエーター 分子が直接細胞膜透過性べプチドと結合してもよく、 エフェクター分子又は メディエーター分子を介して細胞膜透過性べプチドと結合してもよい。
[0021] 「細胞膜透過性ペプチド」 とは、 塩基性アミノ酸を多く含むことを特徴と する細胞膜透過性を有するペプチドのことで、 例えば、 H I V_ 1 TAT (配列番号 1) 、 H I V_ 1 g p 41 (配列番号 2 ) 、 H I V _ 1 Re V (配列番号 3) 、 p An t p (配列番号 4) 、 VP 22ペプチド （配列番 号 5) 、 SV40N LS (配列番号 6) 、 P e p - 1 (配列番号 7) 、 I n t e g r i n )S 3 (配列番号 8) 、 I n f l u e n z a HA-2 (配列番号 9) 、 WZR (配列番号 1 0) 、 T r a n s p o r t a n (配列番号： 1 1 ) 、 BMV- g a g (配列番号 1 2) 、 HT LV— I I Re x (配列番号 1 3) 、 H uma n c FOS (配列番号 1 4) 、 H uma n c J UN (配 列番号 1 5) 、 F H V c o a t (配列番号 1 6) 、 Y e a t GCN4 (配 列番号 1 7) 、 R9 (配列番号 1 8) などを挙げることができるが、 特に、 これらのぺプチドに限定されるものではなく、 当業者によって容易に選択す ることができる細胞膜透過性を有するぺプチドであれば、 如何なるものでも 使用することができる。
[0022] 「エフェクター分子」 とは、 メディエーター分子を介して生体分子に新た な機能を付与する （機能化と称する） ための分子のことを意味する。 ェフエ クタ一分子は、 例えば、 生体分子に蛍光発色機能を付与する場合には各種の 蛍光色素分子のことであり、 生体分子に特定の細胞内部位に局在化する機能 を付与する場合には、 細胞内局在化シグナルべプチド （例えば、 核移行シグ ナルぺプチド、 細胞膜局在化シグナルべプチド、 小胞体局在化シグナル、 ミ トコンドリア局在化シグナルなど） などのことである。 また、 細胞内に存在 する生体分子の機能を活性化、 抑制又は阻害する活性を有する分子もェフエ クタ一分子として使用することができる。 エフェクター分子としては、 シグ ナルペプチドなどのペプチドの他、 タンパク質、 非天然アミノ酸、 低分子化 合物、 合成高分子、 脂質、 核酸、 糖なども好適に使用可能である。
[0023] 「メディエーター分子」 とは、 エフェクター分子による生体分子の機能化 を達成するために、 エフェクター分子と生体分子を一体化し又は一体化しな いで、 生体分子の機能に変更を加えるために、 必要に応じて使用する媒介分 子のことである。
Γメディエーター分子」 は、 生体分子とエフェクター分子を一体化させる 場合には （例えば、 エフェクター分子が蛍光色素分子などの場合） 、 例えば 、 該生体分子又は該生体分子と直接連結されている受容分子と直接結合する 分子 （例えば、 該生体分子又は受容分子に対する低分子リガンド、 該生体分 子又は受容分子を認識する抗体もしくはその一部など） を使用することがで きる （例えば、 図 1を参照のこと） 。 ここで 「受容分子」 とは、 メディエー ター分子と結合又は相互作用する分子のことで、 例えば、 メディエーター分 子が何らかのリガンド分子であれば、 そのリガンド分子と結合し得る酵素や 受容体などが相当する。
また、 「メディエーター分子」 は、 生体分子とエフェクター分子を一体化 させることなくその活性を調節等する場合には （例えば、 生体分子の存在す る部位の極近傍にエフェクタ一分子を局在化させることで生体分子の活性に 変更を加えることができ、 必ずしも生体分子とェフエクタ一分子を常に接触 させておく必要がない場合） 、 エフェクター分子を該生体分子の存在部位へ 局在化させることができる分子 （例えば、 細胞膜で機能する生体分子の活性 を調節する場合には、 細胞膜局在化シグナルペプチドなど） などが使用可能 である （例えば、 図 2を参照のこと） 。
メディエーター分子としては、 基質アナログ、 金属錯体、 補酵素などの低 分子リガンドの他、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 核酸、 糖などが好適に使 用可能であり、 特に、 生体分子とエフェクター分子を一体化させる場合には 、 生体分子又は受容分子との結合親和性及び特異性の高い分子が好ましい。
[0024] 本発明で使用される細胞膜透過性べプチドとエフェクター分子及びメディ エーター分子、 又は、 エフェクター分子とメディエーター分子を連結する場 合、 適当な架橋剤を介して連結することができる。 架橋剤の選択は、 当業者 であれば容易に選択可能ないかなる物も使用可能であり、 エフェクター分子 及びメディエーター分子がペプチド、 タンパク質、 核酸又は糖などである場 合には、 2価の架橋剤、 例えば、 N— ( 6—マレイミドカプロィルォキシ （ コハク酸イミドエステル （E M C S ) などが好適に使用可能である。 特に、 ェフエクタ一分子及びメディエーター分子がぺプチド又はタンパク質であれ ば、 ジスルフィド結合を介して連結してもよく、 また、 該細胞膜透過性ぺプ チドの N末端又は C末端とェフ Iクタ一分子及び Z又はメディエーター分子 が直接又はリンカ一べプチドなどを介し連結したキメラ分子の発現ベクター を用いて調製することもできる。
[0025] 本発明における 「生体分子」 には、 当業者の通常の知識として把握される ものの全てが含まれ、 生物を構成し、 あるいは、 該生物の機能をつかさどる 分子であれば如何なるものも含まれる。 本発明の 「生体分子」 は、 元々細胞 内に内在する分子であっても、 外来性の分子であってもよいが、 好ましくは 外来性の分子である。 さらには、 生物の機能をつかさどる分子であれば、 天 然に存在しない人工的なものを含んでもよい。 「生体分子」 には、 例えば、 タンパク質、 核酸、 糖、 などを挙げることができるが、 特にタンパク質が好 ましく、 外来性のタンパク質がより好ましい。
[0026] 生体分子が外来性タンパク質である場合、 対象となる該外来性タンパク質 をコードする核酸を適当な発現ベクターに組み込んで、 目的の細胞内で発現 させることができる。
対象タンパク質をコードする核酸を組み込んだ発現ベクターは、 適切な発 現ベクターに対象タンパク質をコードする核酸を連結することにより得るこ とができる。 細胞膜透過性べプチドに連結されたメディエーター分子と高い 親和性で特異的に結合する受容分子がペプチド （又はタンパク質） である場 合、 該受容分子をコードする核酸を直接又はリンカ一配列を介して対象タン パク質の発現ベクター上に配置し、 対象タンパク質と該受容分子が直接結合 した複合体を発現させることもできる。 発現ベクターとしては、 対象とする 細胞内で複製可能なものであって、 対象タンパク質、 受容分子をコードする 核酸を発現させることができるプロモーターなどを有するものが使用可能で める。
[0027] 使用可能なベクターとしては、 例えば、 プラスミド DNA、 ファージ DN A等が挙げられる。 プラスミド DN Aとしては、 大腸菌由来のプラスミド （ 例えば p BR322、 p BR325、 p UC 1 1 8、 p UC 1 1 9、 p U C 1 8、 p UC 1 9、 p CBD— C等） 、 枯草菌由来のプラスミド （例えば p U B 1 1 0、 p T P 5、 p C 1 94等） 、 酵母由来のプラスミド （例えば Y E p 1 3、 Y E p 24、 YC p 50、 Y I p 30等） などが挙げられ、 対象 とする細胞の性質に応じて選択することができる。
[0028] 本発明で用いられるプロモーターとしては、 対象タンパク質の発現を行う 細胞に対応した適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、 動物細胞を宿主として用いる場合は、 S RQ?プロモーター、 CM Vプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 HSV— T Kプロモーター、 E F— 1 ひプロモーター等が挙げられる。 宿主が大腸菌である場合には、 t a cプロモーター、 t r pプロモーター 、 l a cプロモーター、 r e c Aプロモーター、 ； P Lプロモーター、 Ι ρ pプロモーター等が、 宿主が枯草菌である場合には、 SP01プロモーター 、 SPO 2プロモーター、 p e n Pプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモ 一ターなどが好ましい。
[0029] 対象タンパク質の発現ベクターには対象タンパク質のコード化配列、 プロ モーター配列以外にも、 選択マーカー、 ターミネータ一、 ェンハンサー、 ス プライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 リボソーム結合配列 （SD配 列） 、 SV40複製起点 （SV40 o r i ) などを連結することができる。 選択マーカーとしては、 限定はしないが、 ハイグロマイシン耐性マーカー (H y g 、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （d h f r) 、 アンピシリン耐性 遺伝子 （Amp 、 カナマイシン耐性遺伝子 （Ka nリ 、 ネオマイシン耐 性遺伝子 （N e o G41 8) などが利用可能である。
[0030] 上述のベクターに対して対象タンパク質、 受容分子をコードする核酸を揷 入することは、 クローニングされた DNAをそのまま、 又は所望により制限 酵素で消化して、 リンカ一を付加し、 ベクター DN Aの制限酵素部位又はマ ルチクローニングサイ卜に挿入することにより行うことができる。 連結する DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG A又は TAGを有していて もよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN Aァ ダブターを用いて付加することもできる。 連結する DNAは、 当該 DNA中 にコードされている対象タンパク質、 受容分子が宿主細胞中で発現されるよ うにべクタ一に組み込まれることが必要である。
[0031] 以下に実施例を示すが、 本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 〔実施例 1〕 ： E G F Pの核内移行の誘発 本実施例は、 エフ Iクタ一分子として核局在化シグナル配列 （配列番号 1 9 ： S V40ラージ T抗原由来の核局在化配列を三回繰り返したもの） 及び 蛍光色素 （A l e x a F l u o r 647) 、 メディエーター分子として 2， 4—ジァミノ一 5_ (3， 4， 5—卜リメ トキシベンジル） ピリミジン （T MP ： 卜リメ 卜プリム） の誘導体 （ ） 、 細胞膜透過性ペプチドとして R 9 (配列番号 1 8) を用いて、 細胞内に発現させた EG F Pの細胞内局在の変 更及ぴ EG F Pに更なる蛍光発色性を付与した結果を示したものである。
[化 1]
Figure imgf000015_0001
1. T MP誘導体 （ ） の合成
T N P誘導体の合成スキームを下記に示す。
[化 2]
Figure imgf000016_0001
3
1 - 1. 化合物 （丄） の合成
T r i me t h o p r i m (S i gma) 25. O g (,8 ο. 1 mm o I ) を 48%HB r (A l d r i c h) 300m Lに溶解し、 1 00°Cの油浴中 で 20分間攪拌した。 反応容器を油浴から上げ、 そこへ 500/0水酸化ナ卜リ ゥム水溶液 60mLをゆっくり加えた。 室温まで放冷後、 4°Cでー晚静置し た。 析出した固体結晶をろ取し、 冷水 1 00 m Lで洗浄後、 沸騰水 200m Lに再溶解した。 28%アンモニア水を用いて p Hを 7付近に調整し、 室温 まで放冷した。 更に 4°Cで 4時間静置することで得られた白色固体 （丄） を ろ取し、 デシケーター内で五酸化二リンの存在下、 減圧乾燥した。 生成物の 同定は1 H— NMRにより行った。
収量： 1 7. 6 g (収率： つ 4 %) [化 3]
Figure imgf000017_0001
1 1 -2. 化合物 （ ) の合成
1 5. 0 g (54. 3mmo I ) の化合物 （丄） を乾燥 DM SO 1 80m Lに溶解し、 カリウム t e r t—ブトキシド （東京化成） 6. 70 g (59 . 7mmo I ) を加えた。 室温で 20分間攪拌した後、 臭化吉草酸ェチル （ 東京化成） 9. 53mL (59. 7mmo I ) を加え、 更に 1 8時間攪拌し た。 溶媒を減圧留去し、 得られた油状残渣をカラムクロマトグラフィー （シ リカゲル：クロ口ホルム Zメタノール =2 OZ1 ) により精製した。 目的フ ラクシヨンを回収し、 減圧乾燥後、 白色固体 （ ) を得た。 生成物の同定は1 H— NMRおよび MALD I— T O F— M Sにより行った。
収量： 4. 26 g (収率： 1 9 %)
[化 4]
Figure imgf000018_0001
[0036] 1 -3. 化合物 （ ） の合成
4. 26 g (1 0. 5mmo I ) の化合物 （ ) をメタノール 2 OmLに 溶解し、 5 N水酸化ナトリウム水溶液 6. 3mL (2. 52mmo I ) を加 えた。 1時間攪拌後、 溶媒を減圧留去し、 蒸留水 8 OmLに再溶解した。 若 干の不溶物をろ過によリ除去し、 濃塩酸を用いてろ液の p Hを 5付近に調整 した。 生じた白色固体 （ ) をろ取し、 冷水 5 OmLで洗浄後、 デシケータ 一内で五酸化二リンの存在下、 減圧乾燥した。 生成物の同定は1 H— N MRお よび MA L D I— TO F— MSによリ行った。
収量： 2. 03 g (収率： 51 %)
[0037] 2. ペプチド合成
図 3に示すぺプチドを Fmo c法による固相合成により合成した。 Fmo c— NH— SAL— Re s i n (渡辺化学） を樹脂として用い、 Fmo c— C y s (T r t ) — O H、 Fmo c— G I y— O H、 Fmo c— A r g (P b f ) — OH、 Fmo c— Va l— OH、 Fmo c— L y s (B o c) — O H、 Fmo c— P r o— OH、 Fmo c— Ac p— OH (渡辺化学） を Fm o c—アミノ酸として用いた。 20%ピペリジン ZDM Fを用いて脱 Fmo cを行い、 カップリングの縮合剤には D I CZHOB t系を用いた。 ぺプチ ドの N末端には化合物 （3) を HBTUZHOB tZD I EA系を用いて導 入した。 ペプチドの伸長後、 T FAZEDTZH20 (=92. 5/5/2. 5) を用いて切り出しおよび脱保護を行い、 溶媒を減圧留去後、 ジェチルェ 一テルにより粗ペプチドを沈殿させた。 目的ペプチドは逆相 H P LC (C 1 8カラム） によって精製し、 MALD I— TOF— MSにより同定を行った 。 ぺプチドは凍結乾燥後、 DM SO中で A l e x a F l u o r 647— C 2 ― M a I e i m i d e ( I n v i t r o g e n) を C末端のシスティン歹虔基 に修飾し、 再度、 逆相 H P LC (C 1 8カラム） によって精製を行った。 ぺ プチドは水溶液ストックを作成し、 その濃度は A l e x a F l u o r 647 由来の吸光度を用いて算出した。
[0038] 3. e D H F R— EG F P発現ベクターの構築
大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素 （e DH FR) の遺伝子を大腸菌ゲノ ムから PC Rによって増幅した。 その際、 5' — A AAACTGCAGAC CATGGCT ATCAGTCTG AT TGCGGCGT T AGCG— 3' (配列番号 20) および 5' — CGCGG ATCCG AAGCGGCCGC CCGCCGCTCCAG AAT— 3' (配列番号 21 ) をプライマーとし て用いた。 その PC R産物を p EG F P— N 1ベクター （C I o n e t e c h) に P s t Iおよび B amH Iサイ卜を用いて揷入し、 e D H F R— EG FP融合蛋白質発現プラスミドを作成した。 なお PC R断片の塩基配列は D NAシークェンシングによつて確認した。
[0039] 4. 細胞培養
実験には H e L a細胞を用いた。 DMEM (1 0%F BS含） （S i gm a) を培地として用い、 2〜3日の間隔で継代を行った。 培養は 5%CO 2 雰囲気下、 37°Cのインキュベーター内で行った。
[0040] 5. 細胞実験
H e L a細胞を 2 X 1 06個になるように 35 mmガラスポトムディッシュ に播種し、 24時間培養した。 その後、 e DH FR— EG FP発現プラスミ 卜を L i p o f e c t am i n eおよひ P I u s試 ( I n v i t r o g e n) を用いて遺伝子導入を行った。 更に 24時間培養し、 遺伝子発現を確認 した後、 以下の細胞内ペプチド導入実験を行った。
まず細胞培養液を除去し、 そこへペプチド 1 0 Mを含んだ培地を添加し た。 インキュベーター内で 4時間静置し、 PBS (-) で 3回洗浄した後に 、 改めて培地を加え、 共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
[0041] M:
本実験の概念図を図 4に、 またべプチドを細胞内へ導入する前後での細胞 蛍光画像を図 5に示す。 本実施例においては、 生体分子が EG FP、 ェフエ クタ一分子が N LS及び A l e x a F l u o r 647. メディエーター分子 が T M P誘導体、 受容分子が e D H F R、 細胞膜透過性べプチドが R 9 (配 列番号 1 8) に相当する。
ぺプチドの細胞内導入前には、 e DH FR— EG FP由来の緑色蛍光は細 胞質および核内に均一に分布しており、 また核内の核小体からは蛍光がほと んど観察されなかった。 ところが、 TMPを連結した核局在化配列一 R 9ぺ プチド （TMP— N LS— R9) を細胞内へ導入した際には、 核内の特に核 小体から強い緑色蛍光が観察され、 丁1\1卩ー1\11_5— 9にょって細胞内に 発現させた e DH FR— EG FPを核内へ局在化できることが示された。 ま たぺプチドに修飾した A l e x a F l u o r 647由来の蛍光を観察するこ とで、 実際にペプチドが細胞内に取り込まれていることが確認された。 一方 、 核局在化配列を持たないペプチド （TMP— R9) は、 細胞内に取り込ま れているにも関わらず、 e DH FR— EG FPの局在を変化させないことが 示された。
[0042] 〔実施例 2〕 ： EG FPの細胞膜移行の誘発 本実施例は、 エフェクター分子として細胞膜局在化シグナル配列 （S r c ファミリーに属する L y n蛋白質由来の細胞膜局在化モチーフの一部、 配列 番号 1 8) 及び蛍光色素 （A l e x a F l u o r 647) 、 メディエーター 分子として 2， 4—ジァミノ _5_ (3， 4， 5—卜リメトキシベンジル） ピリミジン （TMP ： 卜リメ卜プリム） の誘導体 （ ） を用いて、 細胞内に 発現させた E G F Pの細胞内局在の変更及び E G F Pに更なる蛍光発色性を 付与した結果を示したものである。
[0043] 1. ペプチド合成
図 6に示すぺプチドを Fmo c法による固相合成により合成した。 Fmo c— NH— SAL— Re s i n (渡辺化学） を樹脂として用い、 Fmo c— G I y— O H、 Fmo c— C y s (T r t ) — O H、 Fmo c— A r g (P b f ) —OH, Fmo c— L y s (M t t) — OH、 Fmo c— L y s (B o c) —OH (渡辺化学） を Fmo c—アミノ酸として用いた。 20%ピぺ リジン Z DM Fを用いて脱 Fmo cを行い、 カップリングの縮合剤には D I CZHOB t系を用いた。 C末端に L y s (M t t) 基を導入後、 DCMZ T FAZT I S (=93/2/5) 処理により脱保護を行い、 化合物 （ ） をHBTUZHOB tZD I E A系を用いて導入した。 その後、 通常通リベ プチド鎖を伸張した。 ペプチドの N末端には My r i s t i c Ac i d ( 東京化成） を D I CZHOB t系を用いて導入した。 その後、 T FAZED TZH20 (=92. 5Z5Z2. 5) を用いて切り出しおよび脱保護を行い 、 溶媒を減圧留去後、 ジェチルエーテルにより粗ペプチドを沈殿させた。 目 的ペプチドは逆相 H P LC (C 1 8カラム） によって精製し、 MALD I— TO F— MSにより同定を行った。 ペプチドは凍結乾燥後、 p H8. 3、 0 . 1 M炭酸水素ナ卜リゥムバッファ一中、 A l e x a F l u o r 647— C a r b o x y l ι c A c ι d― S u c c i n i m i d y l ts t e r ( I n v i t r o g e n) を C末端付近のリジン残基に修飾し、 再度、 逆相 H P L C (C 1 8カラム） によって精製を行った。 ペプチドは水溶液ストックを作 成し、 その濃度は A l e x a F l u o r 647由来の吸光度を用いて算出し
[0044] 2. H e L aZe DH FR—EG F P恒常発現株細胞の作製
e DH FR— EG F P発現プラスミド （実施例 1参照） を L i p o f e c t a m i n eおよび P I u s s式薬 (, I n v i t r o g e n) ¾：用レ、て H e L a細胞に導入した。 更に 24時間培養し、 遺伝子発現を確認した。 その後 G 41 8による抗生物質選択を行い、 e DH FR—EG FP恒常発現細胞株を 得た。
[0045] 3. 細胞実験
H e LaZe DH F R— EG F P恒常発現株細胞を 2 X 1 05個になるよう に 35 mmガラスボトムディッシュに播種し、 48時間培養した後、 以下の 細胞内べプチド導入実験を行った。
まず細胞培養液を除去し、 そこへ図 6に示すぺプチド 6 Mを含んだ培地 を添加した。 インキュベーター内で 1時間静置し、 PBS ( + ) で 3回洗浄 した後に、 改めて培地を加え、 共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行つ
[0046] M:
本実験の概念図を図 7に、 またべプチドを細胞内へ導入する前後での細胞 蛍光画像を図 8に示す。 本実施例においては、 生体分子が EG FP、 ェフエ クタ一分子が M y r _GC及び A l e x a F l u o r 647. メディエータ 一分子が T MP誘導体、 受容分子が e DH FR、 細胞膜透過性ペプチドが R 9 (配列番号 1 8) に相当する。
ぺプチドの細胞内導入前には、 e DH FR— EG FP由来の緑色蛍光は細 胞質に均一に分布していた。 ところが、 TMPを連結した細胞膜局在化配列 —R 9ペプチド （My r— GC— R9— TMP) を細胞内へ導入した際には 、 細胞膜から強い緑色蛍光が観察され、 My r— GC— R9— TMPによつ て細胞内に発現させた e DH FR— EG FPを細胞膜の内膜上へ局在化でき ることが示された。 またべプチドに修飾した A l e x a F l u o r 647由 来の蛍光を観察することで、 実際にべプチドが細胞内に取り込まれているこ とが確認された。
産業上の利用可能性
[0047] 本発明の方法を使用すれば、 細胞内の生体分子を容易に機能化することが できるため、 例えば、 特定の生体分子の機能を促進又は抑制する手段、 ある いは、 特定の薬理効果を有する生体分子を細胞内の所望の領域に局在化させ る手段などに利用可能である。 従って、 医療や医薬開発、 さらには、 新種の 動植物などの研究開発などの分野において多大なる貢献をするものである。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の （a ) 及び （b ) ；
( a ) メディエーター分子及びェフエクタ一分子が結合した細胞膜透過性 ぺプチドを細胞内に導入する工程、
( b ) 該メディエーター分子を介して、 該細胞内に存在する生体分子と該ェ フエクタ一分子を一体化し又は一体化することなく、 該生体分子の機能を変 更する工程、
を含むことを特徴とする生体分子を機能化する方法。
[2] 前記機能化が標識化であることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] 前記機能化が前記生体分子の細胞内局在を変動させることである請求項 1 に記載の方法。
[4] 前記機能化が前記生体分子の活性を促進又は阻害することである請求項 1 に記載の方法。
[5] 前記生体分子と前記エフェクタ一分子を一体化させないことを特徴とする 請求項 1乃至 4のいずれかに記載の方法。
[6] 前記生体分子と前記エフェクタ一分子を一体化させることを特徴とする請 求項 1乃至 4のいずれかに記載の方法。
[7] 前記生体分子と結合している受容分子と前記メディエーター分子が結合し
、 前記一体化が達成されることを特徴とする請求項 6に記載の方法。
[8] 前記メディエーター分子が、 低分子化合物、 ペプチド、 タンパク質、 脂質
、 核酸、 糖のいずれかであり、 前記エフェクター分子が、 低分子化合物、 合 成高分子、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 核酸、 糖のいずれかであることを 特徴とする請求項 1乃至 7のいずれかに記載の方法。
[9] 前記メディエーター分子が、 基質アナログ、 金属錯体、 補酵素のいずれか であることを特徴とする請求項 8に記載の方法。
[10] 前記エフェクター分子が細胞内局在化シグナルべプチドであることを特徴 とする請求項 1乃至 9のいずれかに記載の方法。
[I I] 前記細胞内局在化シグナルが、 核局在化シグナル又は細胞膜局在化シグナ ルであることを特徴とする請求項 1 0に記載の方法。
[12] 前記生体分子が外来性の分子であることを特徴とする請求項 1乃至 1 1の いずれかに記載の方法。
[13] 前記生体分子がタンパク質であることを特徴とする請求項 1乃至 1 2のい ずれかに記載の方法。
[14] 前記タンパク質が細胞内に導入された発現ベクターに組み込まれた核酸か ら発現するものであることを特徴とする請求項 1 3に記載の方法。
[15] 前記メディエーター分子と特異的に結合する前記受容分子がぺプチド又は タンパク質であり、 該受容分子が前記タンパク質と直接又はリンカ一べプチ ドを介して連結するように、 該受容分子をコードする核酸を、 前記タンパク 質をコードする核酸に隣接して組み込んだ発現べクターを使用することを特 徴とする請求項 1 4に記載の方法。
[16] 前記タンパク質が蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項 1 3乃至
1 5のいずれかに記載の方法。
[17] メディエーター分子及びエフェクター分子が結合した細胞膜透過性べプチド
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