JP6503370B2 - シクロプロペンアミノ酸及び方法 - Google Patents
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Description
(i)前記ポリペプチドをコードし、シクロプロペン基を有するアミノ酸をコードする直交性コドンを含む核酸を用意すること、
(ii)前記直交性コドンを認識し、シクロプロペン基を有する前記アミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むことが可能な直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対の存在下で前記核酸を翻訳すること
を含む。
シクロプロペンは、公知のタンパク質標識基より少ない炭素リッチな基である。
アミド結合したシクロプロペンを含む非天然アミノ酸は、先行技術(Yu et al 2012)において記載されている。このアミノ酸は、3,3二置換である。このアミノ酸は、以下のとおりである。
適切には、本発明のシクロプロペンアミノ酸は、野生型tRNAシンセターゼを用いて、ポリペプチドに取り込まれる。
本発明による方法において、前記遺伝子取り込みは、直交又は拡張された遺伝子コードを好ましくは用い、ここで、1又は2以上の特異的直交性コドンは、直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対を用いることにより遺伝学的に取り込まれ得るように、シクロプロペン基を有する特異的なアミノ酸残基をコードするよう割り当てられている。直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対は、原則として、tRNAを、シクロプロペン基を含むアミノ酸で荷電する能力があり、直交性コドンに応答してポリペプチド鎖にシクロプロペン基を含むそのアミノ酸を取り込む能力がある、いかなるかかる対であってもよい。直交性コドンは、直交性コドンアンバー、オーカー、オパール、又は4塩基コドンであり得る。コドンは、シクロプロペン基を含むアミノ酸を運ぶために用いられる、直交性tRNAにただ対応していなければならない。好ましくは、直交性コドンはアンバーである。
によりコードされる)として用いて、なされる。
本発明のtRNAシンセターゼは、変動され得る。特定のtRNAシンセターゼ配列は、実施例において用いられ得るが、本発明は、その実施例のみに制限されることを意図しない。
>メタノサルシナ・バーケリ(M.barker)iMS/1〜419/
メタノサルシナ・バーケリMS
バージョンQ6WRH6.1 GI:74501411
>メタノサルシナ・バーケリF/1〜419/
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メタノサルシナ・ブルトニーDSM6242、バージョンYP_566710.1 GI:91774018
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デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスDCB−2
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>デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス_Y51/1〜312
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスY51
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デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス
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>デスルホトマキュラム・アセトキシダンス(D.acetoxidans)/1〜277
デスルホトマキュラム・アセトキシダンスDSM771
バージョンYP_003189614.1 GI:258513392
によりコードされる)として用いて、なされる。
親タンパク質/骨格:メタノサルシナ・バーケリPylS
変異:L266V、L270I、Y271F、L274A、C317F
親タンパク質/骨格:メタノサルシナ・バーケリPylS
変異:M241F、A267S、Y271C、L274M
変異L301V、L305I、Y306F、L309A、C348Fをメタノサルシナ・マゼイPylSに導入するMm AcKRS、
及び
変異M276F、A302S、Y306C、L309Mをメタノサルシナ・マゼイPylSに導入するMm PCKRS。
i)特定のコドンを、タンパク質をコードするヌクレオチド配列中の所望の部位においてアンバーコドンのような直交性コドンで導入するか、又は置き換えるステップ、
ii)ピロリジル−tRNAシンセターゼ/tRNA対のような、細胞における直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対の発現系を導入するステップ、
iii)本発明による、アミノ酸を含有するシクロプロペンを含む培地中で細胞を増殖させるステップ
を含む。
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、本発明のタンパク質が発現され得る。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養され得る。本発明のタンパク質の発現は、それらが継続して生産されるように恒常的であるか、又は誘導可能な、発現を開始するための刺激を要求するものであり得る。誘導可能な発現の場合、タンパク質生産は、例えば、インデューサー物質、例えば、デキサメタゾン又はIPTGの培養培地への添加により要求されるとき、開始され得る。
Yu et alは、テトラゾールをポリペプチド中のシクロプロペンアミノ酸に結合させる。Yu et alは、それらのコンジュゲーション基を光活性化するために、紫外線照射の使用を要求する。それらの最適な反応速度は、302ナノメーターのUV照射で達成された。しかしながら、この種のUV照射は、高いイオン化能を有する。これは、照射が向けられる、分子及び/又は細胞が、このUVエネルギーにより損傷される可能性が高いことを意味する。対照的に、本発明のコンジュゲーションは、光活性化のためいかなるUVステップも要求しない。Yu et alが、UV照射のより少ない損傷供給源(例えば、365ナノメーターのUV照射)を用いるときでさえ、観察される反応速度は、本発明により提供されるものより、かなり遅い。したがって、たとえUV照射が、UV処理に関連する欠点のいくつかを回避するか、又は低減しようとする試みにおいて、Yu et alにおいて調節されたとしても、同一の面倒な照射ステップは、依然行われなければならず、より遅い反応速度が達成される。UV照射が省かれ得ること、及び光活性化なしでも、優れた反応速度が得られることは、本発明の利点である。
実施形態の説明
本発明の例示的な実施形態が、添付の図面を参照して、本明細書において詳細に開示されているが、本発明が正確な実施形態に制限されないこと、並びに種々の変更及び修飾が、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物により定義される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によりここでもたらされ得ることが理解される。
全ての化学物質及び溶媒を、Sigma-Alrich社、Alfa Aesar社、又はFisher Scientific社から購入し、別段述べられない限り、さらに精製することなく用いた。薄層クロマトグラフィー(TLC)による定性分析を、シリカでコーティングされたアルミニウムシート(Merck TLC 60F−254)上で行った。スポットを、短い波長の紫外線ランプ(254nm)下で可視化するか、又は塩基性、水性過マンガン酸カリウム、エタノール性ニンヒドリン、若しくはバニリンで染色した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、シリカゲル60(メッシュ230〜400)上で特定の溶媒系で行った。LC−MS分析を、Agilent 1200機械上で行った。用いた溶媒は、水中0.2%ギ酸(緩衝液A)、及びアセトニトリル中0.2%ギ酸(緩衝液B)からなった。LCを、Phenomenex Jupiter C18カラム(150×2mm、5μm)を用いて行い、可変波長を用いてモニターした。保持時間(Rt)を、最短0.1分まで、及びm/z比を最少0.01質量単位まで記録した。小分子LC勾配のための次のプログラム:0〜1分(A:B 10:90〜10:90、0.3mL/分)、1〜8分(A:B 10:90〜90:10、0.3mL/分)、8〜10分(A:B 90:10〜90:10、0.3mL/分)、10〜12(A:B 90:10〜10:90、0.3mL/分)を用いた。
大腸菌エレクトロコンピテント大腸菌DH10B細胞由来のsfGFP−3の発現及び精製を、pBK−MbPylRS及びpsfGFP150TAG PylTで同時形質転換した(Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nat Chem, 2012, 4, 298、Yu, Z.; Pan, Y.; Wang, Z.; Wang, J.; Lin, Q. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 10600)。形質転換した細胞を、S.O.B.(1mL、0.2%グルコースを添加)中、1時間、37℃において回収し、50μg/mLカナマイシン及び25μg/mLテトラサイクリンを含有するLB(LB−KT)に播種するために用いた。細胞を、一晩、37℃、250r.p.mで振盪しながらインキュベートした。一晩培養物1mLを用いて、LB−KT1/2 100mLに播種し、次に、一日培養物をインキュベートした(37℃、250r.p.m)。O.D.600約0.3において、培養物を等しく分け、3(1mM)又はH2O(500μL)いずれかを添加し、さらにインキュベートした(37℃、250r.p.m)。O.D.600約0.6において、アラビノース(0.2%)の添加により、タンパク質発現を誘導し、4時間後、細胞を遠心分離(4000r.p.m、20分)により採取し、さらに使用するまで、ペレットを凍結した。
Agilent 1200LC−MSシステムを用いて、ESI−MSを、6130 Quadrupole分光計でさらに行った。溶媒系は、緩衝液AとしてのH2O中0.1%ギ酸、及び緩衝液Bとしてのアセトニトリル中0.1%ギ酸(MeCN)からなった。タンパク質UV吸光度を、214及び280nmにおいてモニターした。陽イオンモードでタンパク質MS取得を行い、MS Chemstationソフトウェア(Agilent Technologies社)内での逆重畳積分により、総タンパク質質量を計算した。
sfGFP150−1又はsfGFP150−3タンパク質(約30μM、溶出緩衝液中)を精製するために、4a(10モル当量、DMSO中2mMストック溶液由来)を添加した。数回吸引することにより、反応物を混合し、次に、混合物を室温で2時間インキュベートし、試料をESI−MSにより分析した。インキュベーション後、タンパク質を4〜12%SDS−PAGEにより分離させ、Typhoon Trio phosphoimager(GE Life Sciences社)を用いることにより分析した。
テトラジン色素複合体4a(DMSO中2mM溶液10μl)20nmolを添加することにより、sfGFP−3(10.6μM)2nmolを室温で標識し、数回吸引することにより、試料を混合した。異なる時点において、アリコート8μLを溶液から採取し、700倍過剰のビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメタノール(BCN)でクエンチし、液体窒素に投入した。試料を、5%β−メルカプトエタノールを添加したNuPAGE LDS試料緩衝液と混合し、10分間90℃まで加熱し、4〜12%SDS pageにより分析した。標識したタンパク質の量を、蛍光バンドをTyphoon Trio phosphoimager(GE Life Sciences社)でスキャンすることにより、定量した。バンドを、ラバーバンドバックグラウンド減算を用いたImageQuant(商標)TLソフトウェア(GE Life Sciences社)で定量した。速度定数を、データを単一指数方程式に適合させることにより決定した。計算した観察した速度k’を、4aの濃度で割り、反応についての速度定数kを得た。測定を三連で行った。全てのデータ処理を、Kaleidagraphソフトウェア(Synergy Software社、Reading、UK)を用いて行った。Ne−5−ノルボルネン−2−イルオキシカルボニル−L−リジン(NorK)を有するsfGFP標識の速度の比較のため、PylRSの公知の基質を、150位においてNorKを有する、11.25μM sfGFP(−NorK)、及び4a 20当量を用いた同様の方法で決定した。
pBAD_T4L83TAG_MbPylTCUAを、Ncol及びKpnl制限酵素で消化した。同じ制限酵素を、(D67)pBAD_wtT4L由来の野生型T4リゾチームを消化するためにも用いた。挿入物及び骨格を、3:1の比でT4 DNAリガーゼ(室温、2時間)を用いてライゲーションし、化学的コンピテントDH10B細胞に形質転換し、テトラサイクリン寒天プレート上で増殖させた(37℃、18時間)。単一のコロニーを採集し、正しい配列を、DNA配列決定(GATC Gmbh.社)により確認し、このステップにより、pBAD_wtT4L_MbPylTCUAを創出した。全ての最終構築物をDNA配列決定により確認した。
エレクトロコンピテント大腸菌DH10B細胞(50μL)を、pBAD_wtT4L_MbPylTXXXプラスミド(2μL、PyltRNAXXXの発現に必須であり、アラビノース制御下でT4リゾチームを発現する)及びpBKwtPylSプラスミド(2μL、PylRSの発現に必須)で2重に形質転換、又はpBAD_wtT4L_MbPylTXXX単独で1重に形質転換した。形質転換した細胞をS.O.B.(0.2%グルコースを添加した)1mL中、1時間、37℃において回収した。回収物100μLを用いて、LB−KT(50μg/mLカナマイシン及び25μg/mLテトラサイクリン)5mL、又はLB−T(25μg/mLテトラサイクリン)に播種した。培養物を一晩インキュベート(37℃、250r.p.m.)した。各一晩培養物1mLを用いて、1/2強度の抗生物質を含有する培地LB−T又はLB−KT15mLに播種した。O.D.600約0.3に到達するまで、培養物を37℃でインキュベートし、この時点で、各培養物をアリコート5mLに分け、3(終濃度0.1mM)又はH2O(50μL)のいずれかを添加した。次に、培養物をインキュベート(37℃、250r.p.m.)した。O.D.600 0.6において、アラビノース(終濃度0.2%)の添加により、T4リゾチーム発現を開始させ、培養物をさらに4時間インキュベートした。細胞を遠心分離(4000rpm、4℃、20分)により採取し、次に、氷冷PBS 1mLにおいて3回再懸濁し、遠心分離(4000rpm、4℃、20分)により回収した。最終の細菌ペレットを保存のため直ちに凍結した。
凍結した細菌ペレットを、PBS 500μLに再懸濁し、バス超音波処理機(エネルギー出力7.0、総超音波処理時間90秒、粉砕10秒及び休憩20秒、Misonix Sonicator 3000)を用いて溶解した。溶解物を遠心分離(4℃、14000r.p.m.、30分)により清澄化し、上清を新しいチューブに吸引した。清澄化した細胞溶解物50μLに、4a(2mM、DMSO中ストック、終濃度20μM)を添加した。数回吸引することにより、反応物を混合し、次に、試料を暗所でインキュベート(室温、1時間)した。この時間の後、(6mM BCN及び5%BME)を添加した4×LDS試料緩衝液17μLを添加し、優しくボルテックスすることにより、混合した。試料を10分間インキュベートし、その後、90℃において10分間沸騰させた。試料を4〜12%SDS−PAGEにより分析し、Typhoon Trio phosphoimager(GE Life Sciences社)を用いて、蛍光画像を取得した。
HEK細胞における3の部位特異的取り込み
HEK293細胞(ATCC CRL−1573)を24ウェルプレートに蒔き、ほぼ集密状態まで増殖させた。Lipofectamine 2000(Invitrogen社)を用いて、pMmPylS−mCherry−TAG−EGFP−HA構築物及びp4CMVE−U6−PylT構築物で、細胞をトランスフェクトした(Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Accounts of Chemical Research 2011, 44, 816)。1mM 3あり、若しくはなしで、又は1mM 1ありでの16時間増殖後、RIPA緩衝液(Sigma社)を用いて氷上で、細胞を溶解した。溶解物を遠心沈殿させ、上清を4×LDS試料緩衝液(Life technologies社)に添加した。SDS−PAGEにより、試料を流し出し、ニトロセルロース膜に移し、1次ラット抗HA抗体(クローン3F10、Roche社、番号1 867 423)、及びマウス抗FLAG抗体(クローンG191、Abnova社、カタログ番号MAB8183)を用いてブロットし、2次抗体は、抗ラット抗体(Invitrogen社、A11077)、及び抗マウス抗体(Cell Signaling Technologies社、番号7076S)であった。
接着HEK293T細胞(ATCC CRL−11268、1回の免疫沈降当たり4×106)を、製造元のプロトコールに従い、TransIT−293トランスフェクション試薬を用いて、p4CMVE−U6−PylT7.5μg、及びpPylRS−mCherry−TAG−EFGP−HA7.5μg(Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Accounts of Chemical Research 2011, 44, 816)でトランスフェクトし、示した場合、0.5mM 1又は2mM 3を添加した、DMEM/10%FBSにおいて48時間培養した。細胞を、PBSで2回洗浄し、氷上において、30分間、溶解緩衝液(150mM NaCl、1%Triton X−100、50mM Tris HC1(pH8.0))1mL中で溶解した。遠心分離(16000gにおいて10分間)により溶解物を清澄化させた後、HAタグ付けされたタンパク質を、1回のトランフェクション当たりμMACS HA−tag MicroBeads(Milttenyl Biotec社)50μLを用いて捕獲し、RIPA(150mM NaCl、1%Igepal CA−630、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50mM Tris HC1(pH8.0))0.5mL、及びPBS(pH7.4)0.5mLで洗浄した。MicroBeadsの懸濁液を、PBS(pH7.4)50μL、20μM 4aと1時間インキュベートし、続いて、RIPA 0.5mLで洗浄して、過剰な色素を除去した。HAタグ付けされたタンパク質を、SDS試料緩衝液を用いて、ビーズから溶出させ、4〜12%Bis−Tris PAGEゲル(Invitrogen社)で分離させ、Typhoon imager(GE Healthcare社)を用いて画像化し、続いて、DirectBlueで染色するか、又は抗HAタグpAb−HRP−DirecT(MBL)でのウエスタンブロッティングのために移した。
PEIを用いて、DNA 15μgで、10cmの組織培養皿において、HEK293Tをトランスフェクトし、3(0.5μM)と共に72時間インキュベートした。細胞を、PBSで2回洗浄し、RIPA緩衝液1mLにおいて溶解した。清澄化した溶解物を、GFP−Trap(登録商標)M(ChromoTek社)50μLに添加し、4時間インキュベートした。RIPA 1mL、PBS 1mL、PBS 1mL+500mM NaCL、ddH2O 1mLで、ビーズを洗浄し、1%酢酸/ddH2Oにおいて溶出した。精製したタンパク質を、2μM 4aで4時間標識し、4〜12%Bis−Tris PAGEゲル上に添加した。4aで標識されたsfGFPの蛍光を、Typhoon imagerで検出し、ゲルを、DirectBlueで続いて染色した。
この研究における全てのハエ実験は無作為化も盲検も使用しなかった。
QuikChange mutagenesisキット、及びpSG108(pJet 1.2−U6−PylT、S. Greissより贈呈)を鋳型として用いて、PyltRNACUAアンチコドンを変異させた。これは、ショウジョウバエU6−bプロモーターに融合させた、3’末端のCCAを欠くPylT遺伝子を含有する。プライマーFMT19及びFMT20を用いて、PyltRNATGCを生成して、アラニンコドンをデコードし(pFT18を創出する)、プライマーFMT23及びFMT24を用いて、PyltRNAGCTを生成して、セリンコドンをデコードし(pFT20を創出する)、プライマーFMT27及びFMT28を用いて、PyltRNACAGを生成して、ロイシンコドンをデコードし(pFT22を創出する)、プライマーFMT29及びFMT30を用いて、PyltRNACATを生成して、メチオニンコドンをデコードした(pFT23を創出する)。変異させたtRNA発現カセットを、EcoRI及びHinDIIIを用いて、pFT18、pFT20、pFT22、及びPFT23からpUC18にサブクローニングし、次に、AsiSI、BamHI、及びBglIIを用いてマルチマー化して、2つのコピー、次に、4つのコピーのtRNAを創出した。4つのコピーのバージョンのtRNAカセットを、AsiSI及びMluIを用いてpSG118にサブクローニングし、pFT58(Ala)、pFT60(Ser)、pFT62(Leu)、及びpFT63(Met)を創出した。pSG118は、メタノサルシナ・マゼイPylRS遺伝子を含有する(Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518)。
ショウジョウバエ胚インジェクションサービス(BestGene Inc.社)を用いて、Pエレメント挿入により、遺伝子導入系統を創出した。次のプラスミド:pFT58(Ala)、pFT60(Ser)、pFT62(Leu)、及びpFT63(Met)を用いて、系統を生成した。nos−Gal4−VP16(Bloomington 4937)、及びMS1096−Gal4(Bloomington 8860)を、GAl4ドライバーとして用いた。全てのハエを、25℃において、標準的イベリアン培地にて成長させた(grown)。乾燥酵母を、dH2Oにおいて希釈した、適切な濃度のアミノ酸(通常、10mM)と混合して、ペーストを製造することにより、非天然アミノ酸をハエに与えた。アミノ酸を含む、又は含まない酵母ペーストを添加したイベリアハエ食餌において、最短48時間成長させたメスから、卵巣を調製した。プロテオーム標識実験のため、構築物FT58、FT60、FT62、及びFT63の遺伝子導入オスのハエを、nos−vp16−GAL4処女バエと交配させて、それぞれ、FT58/nos−vp16−GAL4、FT60/nos−vp16−GAL4、FT62/nos−vp16−GAL4、及びFT63/nos−vp16−GAL4を生成した。
ルシフェラーゼアッセイ
3、1を与えた、又はアミノ酸を与えていない、nos−Gal4−VP16で組み換えられた、10匹のメスの3重Rep−Lハエ由来の卵巣を、1×受動的溶解緩衝液100μL中で解体し、従前に記載されたとおり、ルシフェラーゼアッセイのため処理した(Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518)。
100匹(対照及び3について)、又は500匹(1について)のメス由来の卵巣を、PBS中で解体し、次に、1×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)を含有するRIPA緩衝液300又は1500μlにおいて溶解した。試料を、総溶解対照として4×LDS緩衝液に入れ、次に、残りを、製造元の指示に従い、GFP−TRAPアガロースビーズ(Chromotek社)での免疫沈降のため用いた。IPの総体積は、3mlであった。一晩インキュベーション後、ビーズを、RIPA緩衝液で2回、次に、PBSで2回洗浄した。テトラジン標識のため、ビーズを、PBS 200μl+4μM 4gにおいて再懸濁し、2時間、ローラー上、室温でインキュベートした。ビーズを、洗浄緩衝液500μLで3回洗浄し、次に、4×LDS試料緩衝液において再懸濁した。
タンパク質標識において有用な種類の反応は、歪んだアルケン(又はアルキン)とテトラジンの間の非常に迅速で特異的な逆電子要求型ディールス−アルダー反応である(Lang, K.; Davis, L.; Wallace, S.; Mahesh, M.; Cox, D. J.; Blackman, M. L.; Fox, J. M.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2012, 134, 10317、Borrmann, A.; Milles, S.; Plass, T.; Dommerholt, J.; Verkade, J. M. M.; Wiesler, M.; Schultz, C.; van Hest, J. C. M.; van Delft, F. L.; Lemke, E. A. ChemBioChem 2012, 13, 2094、Schoch, J.; Staudt, M.; Samanta, A.; Wiessler, M.; Jaschke, A. Bioconjug Chem 2012, 23, 1382、Karver, M. R.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Angew Chem Int Ed Engl 2012, 51, 920、Bianco, A.; Elliott, T. S.; Townsley, F. M.; Pisa, R.; Davis, L.; Elsasser, S. J.; Ernst, R. J.; Lang, K.; Sachdeva, A.; Chin, J. W. Under Review)。
100mLの2首丸底フラスコにCH2Cl2(2mL)及び酢酸ロジウム(442mg、1mmol、0.05当量)を充填し、ドライアイス冷却器を装着した。プロピン(約10mL)を、酢酸ロジウム懸濁液に凝縮し、フラスコを水浴(20℃)に下ろし、プロピンの一定の環流を達成した。ジアゾ酢酸エチル(2.1mL、20mmol、1当量)を、シリンジポンプを用いて、1時間かけて、撹拌プロピン溶液に滴下添加した。反応物を室温でさらに10分間撹拌し、これにより、TLC分析は、反応がこの時間の後完了したことを示した。次に、シクロプロペン産物を、ペンタン及びジエチルエーテル(90:10)で溶出する、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、所望の生成物S1を無色の揮発性液体として得た(1.9g、収率75%)。1H NMR分析 δΗ(400MHz,CDCl3)6.35(1H,t,J1.4)、4.18〜4.09(2H,m)、2.16(3H,d,J1.3)、2.12(1H,d,J1.6)、1.26(3H,t,J7.1);LRMS m/z(ES+)127.2[M+H]+。
DIBAL−H(CH2Cl2中1Mの溶液22.5mL、22.5mmol、1.5当量)を、−10℃において、CH2Cl2中のシクロプロペンエステルS1(1.9g、15mmol、1当量)の撹拌溶液(15mL)に滴下添加した。反応物を、−10℃において20分間撹拌した後、H2O(1mL)、次に、NaOH(H2O中の1Mの溶液1mL)及びH2O(2.3mL)を注意深く添加して、クエンチした。混合物をさらに2時間室温で撹拌し、その後、乾燥(Na2SO4)させ、濾過した。ヒューニッヒ塩基(3.9mL、22.5mmol、1.5当量)を濾液(粗シクロプロペンアルコールS2を含有する)に添加し、続いて、4−ニトロフェニルクロロホルメート(3.3g、16.5mmol、1.1当量)を添加した。室温で18時間撹拌後、有意な無色の沈殿物が形成され、TLC分析は、粗シクロプロペンアルコールS2の完全な消費を示した。反応物をCH2Cl2で希釈し、次に、シリカゲル上に乾燥添加し、これにより、活性化されたカーボネートS3を、酢酸エチル及びヘキサン(20:80)で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、所望のシクロプロペンカーボネートS3を無色の油状物として得た(2.7g、2つのステップに渡り収率73%)。1H NMR分析 δΗ(400MHz,CDCl3)8.28(2H,d,J9.2)、7.39(2H,d,J9.2)、6.62(1H,s)、4.21(1H,dd,J10.9,5.3)、4.14(1H,dd,J10.9,5.3)、2.18(3H,d,J1.3)、1.78(1H,td,J5.3,1.3)。
Fmoc−Lys−OH・HCl(6.7g、16.5mmol、1.5当量)を、THF(30mL)及びDMF(10mL)に溶解し、この溶液に、ヒューニッヒ塩基(9.0mL、55.0mmol、5当量)、続いて、シクロプロペンカーボネートS3(2.7g、11.0mmol、1当量)を添加し、炭酸塩を添加すると直ぐに黄色の着色を観察した。反応物を室温で6時間撹拌し、TLC分析が示したとおり、この時間後、出発材料の消費が完了したと判断した。粗反応混合物をシリカゲル上に乾燥添加し、酢酸エチル、ヘキサン、及び酢酸(50:49:1、次に99:0:1)で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、主要な生成物を精製した。これにより、所望の生成物S4を無色のゴムとして得た(4.3g、収率82%)。1H NMR分析 δΗ(400MHz,CDCl3)7.77(2H,t,J7.6)、7.65〜7.55(2H,m)、7.39(2H,t,J7.6)、7.31(2H,t,J7.3)、6.54(1H,s)、5.68〜5.57(1H,m)、4.84(1H,br−s)、4.44〜4.32(2H,m)、4.22(1H,t,J7.0)、3.98〜3.87(1H,m)、3.17〜3.09(2H,m)、2.15〜2.06(6H,m)、1.99〜1.86(1H,m)、1.84〜1.70(1H,m)、1.68〜1.59(1H,m)、1.58〜1.34(2H,m);LRMS m/z(ES+)479.3[M+H]+、501.3[M+Na]+、m/z(ES−)477.2[M−H]−。
Nα−(Fmoc)−Nε(((2−メチルシクロプロパ−2−エン−1−イル)メトキシ)カルボニル)−L−リジンS4(3.5g、7.0mmol、1当量)を、THF及びH2O(3:1 40mL)に溶解し、この溶液に、水酸化ナトリウム(0.9g、22.6mmol、3.1当量)を添加した。反応物を室温で8時間撹拌し、その後、LC−MS分析により、反応は完了したと判断した。反応混合物をH2O(100mL)で希釈し、HCl(1M)の添加により、pHを約5に調節した。水溶液をEt2O(5×100mL)で洗浄し、次に、濃縮乾固して、無色の固体を得た。固体を、分取HPLCにより精製し、生成物分画を合わせ、溶媒を凍結乾燥により除去した。これにより、Nε−[({2−メチルシクロプロパ−2−エン−1−イル}メトキシ)カルボニル]−L−リジン3を無色の固体として得た。δΗ(400MHz,D2O)6.45(1H,s)、3.90〜3.61(2H,m)、3.09(1H,t,J6.4)、2.98〜2.86(2H,m)、1.92(3H,s)、1.52〜1,37(2H,m)、1.37〜1.22(2H,m)、1.21〜1.08(2H,m)、0.83(1H,d,J5.2)。LRMS m/z(ES+)257.2[M+H]+、m/z(ES−)255.2[M−H]−。δC(100MHz,D2O)101.1(CH)、72.3(CH2)、55.9(CH)、40.2(CH2)、34.3(CH2)、28.9(CH2)、20.3(CH2)、16.6(CH3)、10.8(CH)HRMS(ES+)実測値:(M+Na)+279.1302。C12H20O4N2Na計算値M+、279.1315。
本発明者らは、3が、PylRS/tRNACUA対、及び150位においてアンバーコドンを有するsfGFP遺伝子を用いて、アンバーコドンに対応して、組換えタンパク質に効率的及び部位特異的に取り込まれることを示した(補足図2a)。タンパク質の収量は、培養物1リットル当たり8mgであり、それは、PylRS Nε−[(tert−ブトキシ)カルボニル]−L−リジン1の十分に確立された効率的な基質について得られるもの(培養物1リットル当たり4mg)より多い(参考文献33)。150位において3を有するsfGFP(−3)のエレクトロスプレーイオン化質量分析により、非天然アミノ酸の取り込みを確認する(補足図2b)。SfGFP−3を、蛍光テトラジンプローブ4aで特異的に標識し、一方、SfGFP−1は標識しないままであった(補足図2b)。蛍光イメージング及び質量分析両方を用いて判断したとおり、SfGFP−3 2nmolを、4a 10当量で30分で定量的に標識した(補足図2b)。4aでのSfGFP−3の標識についての2次速度定数は、27±1.8M−1s−1であった(補足図2c)(Yu, Z.; Pan, Y.; Wang, Z.; Wang, J.; Lin, Q. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 10600)。
PylRS/tRNACUA対及びmCherry−TAG−EGFP−HA(アンバー終止コドン(TAG)により分離した、mCherry遺伝子とC末端のHAタグ有するEGFP遺伝子の融合物)を有するHEK293細胞において、全長mCherry−3−GFP−HAを発現させた(Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Accounts of Chemical Research 2011, 44, 816)。全長タンパク質を、3の存在下でのみ検出した(図8a、補足図11における全ゲル)。mCherry−3−EGFP−HAを4aで選択的に標識し、一方、mCherry−1−EGFP−HAを標識せず(図8b)(Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Accounts of Chemical Research 2011, 44, 816)、これは、ヒト細胞における3のPylRS/tRNACUA対での部位特異的取り込みを示している。
本発明者らは、3が、キイロショウジョウバエにおいて、タンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることを示した。これを達成するために、本発明者らは、(U6プロモーターから一様に発現されたtRNA、及びnos−vp16−GAL4ドライバーを用いて卵巣に指示されたUAS−PylRS発現を有する)PylRS/tRNACUA対、並びにホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの間にアンバーコドンを有する2重ルシフェラーゼレポーターを含有するハエを用いた(Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518)。本発明者らは、1又は3の添加に依存する強いルシフェラーゼシグナルを観察し、2重ルシフェラーゼシグナルは3との方がより大きい。これらの実験は、3がハエにより取り込まれ、PylRSの公知の優れた基質である1より、アンバーコドンに応答して、インビボでより効率的に取り込まれることを示す(図10a)。10mMのアミノ酸3を添加した餌を与えることにより、3を供給し得る。追加実験において、本発明者らは、ウエスタンブロットにより、卵巣において発現させたGFP−TAG−mCherry−HA構築物(補足図15)への3の効率的な取り込み(Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518)(図10b)、4gでの、取り込まれたアミノ酸の特異的蛍光標識(図10c)を示した。
以前に報告された手順を用いて、Boc−保護テトラジンS6を合成した(Lang, K. et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nat Chem 4, 298-304 (2012))。ジオキサン中の4M HCl(500μL、2.0mmol)を、DCM(500μL)中のテトラジンS5(8mg、0.02mmol)の撹拌溶液に添加した。反応を、2時間、室温で行い、続いて、溶媒を減圧下で除去して、第1級アミン塩酸塩S6をピンク色の固体として得た(6mg、0.02mmol、100%)。さらに精製することなく、化合物を次のステップにおいて直接用いた。
BODIPY FLスクシンイミジルエステル(5mg、0.013mmol、Life technologies社)、及びヒューニッヒ塩基(50μl、2.8mmol)を、乾燥DMF(1mL)中のテトラジン−アミンS2(6mg、0.02mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、室温で16時間撹拌した。反応混合物を、水4mlで希釈し、10%〜90%の勾配の緩衝液A中の緩衝液B(緩衝液A:H2O、緩衝液B:アセトニトリル)を用いた、半分取逆相HPLCにより、生成物を精製した。テトラジンBODIPY FL複合体4dの同一性及び純度を、LC−MSにより確認した。ESI−MS:[M−H]−、計算値581.38、実測値581.2。
本発明者らは、アミノ酸3を含有するシクロプロペンの合成、遺伝学的にコードされる、部位特異的取り込みを特徴付け、大腸菌、哺乳動物細胞、及びキイロショウジョウバエにおいて発現されたタンパク質中の、テトラジンプローブでの3の定量的標識を示し、これにより、本発明の幅広い実用性及び産業上の適用が示されている。
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6.Lang, K. et al. Genetically encoded norbornene directs site−specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nat Chem 4, 298−304 (2012).
タンパク質中のプログラム化された部位に2つの異なる分子を結合させる能力は、タンパク質の構造、立体構造、及び動態学を研究するためのFRETを含む、様々な適用(Zhang, J.; Campbell, R. E.; Ting, A. Y.; Tsien, R. Y. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002, 3, 906、Kajihara, D.; Abe, R.; Iijima, I.; Komiyama, C.; Sisido, M.; Hohsaka, T. Nat Methods 2006, 3, 923)を促進する。タンパク質を2重に標識するいくつかのアプローチが報告されている。1つのアプローチは、システインチオール標識との組合せで特異的に標識される、1つの非天然アミノ酸の導入に頼るが、このアプローチは、遊離チオールを含有しないタンパク質に一般的に制限される(Brustad, E. M.; Lemke, E. A.; Schultz, P. G.; Deniz, A. A. J Am Chem Soc 2008, 130, 17664、Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011, 133, 11418)。化学的ライゲーションアプローチは、タンパク質標識のための単一の非天然アミノ酸の遺伝子コード化と組み合わされ得るが(Wissner, R. F.; Batjargal, S.; Fadzen, C. M.; Petersson, E. J. J Am Chem Soc 2013, 135, 6529)、これは、標識され得るサイズ及び/又は部位を制限し得る。恐らく、タンパク質2重標識の最も一般的に適用可能なアプローチは、所望の遺伝子中のユーザーが定義した部位において導入された2つの異なるコドンに応答した、2つの異なるアミノ酸の遺伝子取り込みに基づく。
(1)Zhang, J.; Campbell, R. E.; Ting, A. Y.; Tsien, R. Y. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002, 3, 906.
(2)Kajihara, D.; Abe, R.; Iijima, I.; Komiyama, C; Sisido, M.; Hohsaka, T. Nat Methods 2006, 3, 923.
(3)Brustad, E. M.; Lemke, E. A.; Schultz, P. G.; Deniz. A. A. J Am Chem Soc 2008, 130, 17664.
(4)Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011, 133. 11418.
(5)Wissner, R. F.; Batjargal, S.; Fadzen, C. M.; Petersson, E. J. J Am Chem Soc 2013, 135, 6529.
(6)Neumann, H .: Wang, K.; Davis, L.: Garcia−Alai, M.; Chin, J. W. Nature 2010, 464, 441.
(7)Wan, W.; Huang, Y.; Wang, Z.; Russell, W. K.; Pai, P. J.; Russell, D. H.; Liu, W. R. Angew Chem Int Ed Engl 2010, 49, 3211.
(8)Chatterjee, A.; Sun, S. B.; Furman, J. L.; Xiao, H.; Schultz, P, G. Biochemistry 2013.
(9)Wang, K.; Sachdeva, A.; Cox, D. J.; Wilf, N. W.; Wallace, S.; Mehl, R, A.; Chin, J. W. submitted.
(10)Wu, B.; Wang, Z.; Huang, Y.; Liu W. R. Chembiochem: a European journal of chemical biology 2012, 13, 1405.
(11)Sasmal, P. K.; Carregal−Romero, S.; Han, A. A.; Streu, C. N.; Lin, Z.; Namikawa, K.; Elliott, S. L.; Koster, R. W.; Parak, W. J.; Meggers, E. ChemBioChem 2012, 13, 1116.
(12)Rotenberg, S. A.; Calogeropoulou, T.; Jaworski, J. S.; Weinstein, I. B.; Rideout, D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1991, 88, 2490.
(13)Seitchik, J. L.; Peeler, J. C; Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Rhoads, T. W.; Cooley, R. B.; Refakis, C; Fox, J. M.; Mehl, R. A. J Am Chem Soc 2012, 134, 2898.
(14)Lang, K.; Davis, L.; Torres−Kolbus, J.; Chou, C; Deiters, A.; Chin, J, W. Nat Chem, 2012, 4, 298.
(15)Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 4166.
(16)Kaya, E.: Vrabel, M.; Deiml, C.; Prill, S.; Fluxa, V. S.; Carell, T. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 4466.
(17)Wang, Q.; Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Finn, M. G. J Am Chem Soc 2003, 125, 3192.
(18)Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Accounts of Chemical Research 2011, 44, 816.
(19)Yang, J.; Seckute, J.; Cole, C M.; Devaraj, N. K. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 7476.
(20)Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518.
(21)Lang, K.; Davis, L.; Wallace, S.; Mahesh, M.; Cox, D. J.; Blackman, M. L.; Fox, J. M.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2012, 134, 10317.
(22)Borrmann, A.; Milles, S.; Plass, T.; Dommerholt, J.; Verkade, J. M. M.; Wiessler, M.; Schultz, C; van Hest, J. C. M.; van Delft, F. L.; Lemke, E. A. ChemBioChem 2012, 13, 2094.
(23)Schoch, J.; Staudt, M.; Samanta, A.; Wiessler, M.; Jaschke, A. Bioconjug Chem 2012, 23, 1382.
(24)Karver, M. R.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Angew Chem Int Ed Engl 2012, 51, 920.
(25)Bianco, A.; Elliott, T. S.; Townsley, F. M.; Pisa, R.; Davis, L.; Elsasser, S. J.; Ernst, R. J.; Lang, K.; Sachdeva, A.; Chin, J. W. Under Review.
(26)Yu, Z.; Pan, Y.; Wang, Z.; Wang, J.; Lin, Q. Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 10600.
(27)Kamber, D. N.; Nazarova, L. A.; Liang, Y; Lopez, S. A.; Patterson, D. M.; Shih, H. W.; Houk, K. N.; Prescher, J. A. J Am Chem Soc 2013, 135, 13680.
(28)Wang, K.; Schmied, W. H.; Chin, J. W. Angew Chem Int Ed Engl 2012, 51, 2288.
(29)Wang, K.; Neumann, H.; Peak−Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nature biotechnology 2007, 25, 770.
(30)Rackham, O.; Chin, J. W. Nature chemical biology 2005, 1, 159.
(31)Deiters, A,; Schultz, P. G. Bioorganic & amp; Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 1521.
Claims (18)
- 1,3−二置換シクロプロペン基を有するアミノ酸を含むポリペプチドであって、前記シクロプロペン基が、カルバメート基を介して前記アミノ酸に結合されている、前記ポリペプチド。
- シクロプロペンが、1,3−ジメチルシクロプロペンである、請求項1に記載のポリペプチド。
- シクロプロペン基が、リジンアミノ酸の残基として存在する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- シクロプロペン基に連結されたテトラジン化合物をさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド。
- 1,3−二置換シクロプロペン基を含むアミノ酸であって、前記シクロプロペン基が、カルバメート基を介して前記アミノ酸部分に結合されている、前記アミノ酸。
- シクロプロペンが、1,3−ジメチルシクロプロペンである、請求項5に記載のアミノ酸。
- リジンアミノ酸である、請求項5又は6に記載のアミノ酸。
- Nε−[((2−メチルシクロプロパ−2−エン−1−イル)メトキシ)カルボニル]−l−リジンを含む、請求項7に記載のアミノ酸。
-
- 1,3−二置換シクロプロペン基を含むポリペプチドを生産する方法であって、
前記シクロプロペン基が、カルバメート基を介してアミノ酸部分に結合されており、
前記方法が、カルバメート基を介して前記アミノ酸部分に結合されている1,3−二置換シクロプロペン基を含むアミノ酸を、ポリペプチドに遺伝学的に取り込むことを含み、
光活性化のためいかなるUVステップも要求しない、前記方法。 - ポリペプチドの生産が、
(i)前記ポリペプチドをコードし、シクロプロペン基を有するアミノ酸をコードする直交性コドンを含む核酸を用意すること、
(ii)前記直交性コドンを認識し、シクロプロペン基を有する前記アミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むことが可能な直交性tRNAシンセターゼ/tRNA対の存在下で前記核酸を翻訳すること
を含む、請求項10に記載の方法。 - 直交性コドンがアンバーコドン(TAG)を含み、tRNAがMbtRNACUAを含み、かつtRNAシンセターゼがMbPylRSを含むか、或いは
直交性コドンがアンバーコドン(TAG)を含み、tRNAがMmtRNACUAを含み、かつtRNAシンセターゼがMmPylRSを含む、請求項10又は11に記載の方法。 - 1,3−二置換シクロプロペン基を含むアミノ酸が、請求項5〜9のいずれかに記載のアミノ酸である、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
- テトラジン基を含むポリペプチドを生産する方法であって、請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチドを用意すること、前記ポリペプチドをテトラジン化合物と接触させること、及びインキュベートして、逆電子要求型ディールス−アルダー環化付加反応によりテトラジンを前記シクロプロペン基に結合させることを含む、前記方法。
- 反応が、10分以下、好ましくは、1分以下、好ましくは、30秒以下、進行してもよい、請求項14に記載の方法。
- それぞれがシクロプロペン基を有する2又は3以上のアミノ酸を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチドであって、それぞれの前記シクロプロペン基が、カルバメート基を介してそれぞれの前記アミノ酸に結合される、前記ポリペプチド。
- それぞれがシクロプロペン基を有する4つのアミノ酸を含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜4、16及び17のいずれかに記載のポリペプチドを含む、抗体薬物複合体(ADC)。
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