JP2023538897A

JP2023538897A - Ｆａｂ領域中に非標準的なジスルフィドを有する抗原結合タンパク質

Info

Publication number: JP2023538897A
Application number: JP2023511804A
Authority: JP
Inventors: ガルセス，フェルナンド; ワン，ジュウルン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-09-12
Also published as: US20230322955A1; CA3191710A1; EP4200338A1; AU2021329374A1; WO2022040466A1; MX2023002125A

Abstract

複数の標的を同時に認識し得る単一の抗体ベースのコンストラクトを生成する能力は、多くの治療薬候補を臨床へと進めるのに最も重要である。これはしばしば、広範なタンパク質デザインを行い、その成功の度合いは様々である。多重特異性抗体の場合、Ｆａｂ領域中でのＨＣ／ＬＣ対形成の駆動は、多重特異性設計の分野ではまだ最も困難な課題の一つである。本願で説明されているのは、非標準的なジスルフィド結合の新規の配置の発見であり、従って、同一分子中に存在している２つのＦａｂの間の非対称的なシステイン界面の生成により、多重特異性の発生がさらに可能になる。

Description

本発明は、バイオ医薬品の分野に関する。具体的には、本発明は、非標準的なジスルフィド結合を有するＦａｂ領域を含む抗原結合タンパク質に関する。この抗原結合タンパク質は、単一特異性であり得るか、又は多重特異性であり得る。

本願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。この配列表は、２０２１年８月１８日に作成された、サイズが９．４８ＫＢであるＡ－２６６９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿０８１８２０２１＿ＳＴ２５という名称のファイルとして提供されている。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

多重特異性抗体及び抗体様コンストラクトは、治療用分子の開発者にとって魅力的ないくつかの特徴を持っている。二重特異性抗体及び三重特異性抗体のような同時に複数の標的を標的とする多重特異性抗体の臨床潜在性は、複合疾患を標的とするのに大いに有望である。しかしながら、この分子の生成は、大きな課題を示しており、なぜならば、特に抗体の重鎖及び軽鎖のペアリングの際に、単一細胞へのトランスフェクション時での複数のポリペプチド鎖で構成されている新規の四次構造のペアリング／フォールディングが困難だからである。抗体Ｆａｂ領域では、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）との間に下記の２箇所で相互作用が存在している：ＨＣ（ＶＨ）中の可変領域とＬＣ（ＶＬ）中の可変領域との間、及びＦａｂＨＣ（ＣＨ１）の定常領域とＬＣ（ＣＬ）の定常領域との間。

複数のＨＣ及びＬＣが単一細胞に同時にトランスフェクトされて多重特異性分子（即ち、ヘテロＩｇＧ）が作製される場合に、ＨＣ／ＬＣ間の同族ペアリングを駆動するために、二量体界面を操作するための電荷ペアリング変異（ｃｈａｒｇｅ－ｐａｉｒｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＣＰＭ）、又は大きな嵩高い残基（即ち、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の挿入、二量体形成を物理的に有利にするか不利にするためのノブインホール（ＫｉＨ）の様なツールが配置されることが多い。しかしながら、そのような設計の成功は、所望の分子の回収率が低いことから最適ではないことが多い。考えられる原因は、誤ったＨＣ／ＬＣペアをロックし、ＣＰＭ及びＫｉＨの操作効果をキャンセルする、ＣＨ１／ＣＬ間の界面の早過ぎる共有結合形成である可能性がある。しかしながら、分子の安定性に重要な、Ｆａｂ領域（図１）のＣ末端で形成される共有結合は、不可逆的であり、電荷対変異（水素結合及びファンデルワースル）で挿入されたもの等の他の化学的相互作用に勝ることが多い。従って、定常領域中の他の箇所への天然のジスルフィド結合の再配置により、非標準的なＨＣ／ＬＣ鎖間の共有結合形成が停止するだろう。

本明細書で説明されているのは、非標準的なジスルフィド結合の新規の配置の発見であり、従って、多重特異性の作製をさらに可能にする、同一分子中に存在している２つのＦａｂ間の非対称的なシステイン界面の生成の発見である。

一態様では、本発明は、少なくとも１つのＦａｂ領域を含む抗原結合タンパク質であって、このＦａｂ領域は、１２６位でシステインを含み且つ２２０位でシステインを欠いているＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び１２３位でシステインを含み且つ２１４位でシステインを欠いているＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み；アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、抗原結合タンパク質を対象とする。

一実施形態では、ｉ）ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｆ１２６Ｃ変異、Ｃ２２０Ａ変異を含み；ｉｉ）ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｅ１２３Ｃ変異、Ｃ２１４Ａ変異を含む。

一実施形態では、ｉ）ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；ｉｉ）ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、ｉ）ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；ｉｉ）ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、ｉ）ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；ｉｉ）ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、ｉ）ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；ｉｉ）ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及びＶＬ－ＣＬポリペプチドは、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている。

別の態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質であって、この抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＦａｂ領域：
第１のエピトープに特異的に結合する第１のＦａｂ領域、及び第２のエピトープに特異的に結合する第２のＦａｂ領域を含み；
第１のＦａｂ領域は、１２６位でシステインを含み且つ２２０位でシステインを欠いている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び１２３位でシステインを含み且つ２１４位でシステインを欠いている第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
第２のＦａｂ領域は、２２０位でシステインを含み且つ１２６位でシステインを欠いている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び２１４位でシステインを含み且つ１２３位でシステインを欠いている第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、多重特異性抗原結合タンパク質を対象とする。

一実施形態では、ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｆ１２６Ｃ変異、Ｃ２２０Ａ変異を含み；ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｅ１２３Ｃ変異、Ｃ２１４Ａ変異を含む。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、多重特異性抗体又は多重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体断片である。

一実施形態では、
１）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
２）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
３）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域のＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
４）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
５）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
６）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
７）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
又は
８）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されている。

一部の実施形態では、第１のＦａｂ領域及び第２のＦａｂ領域は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、第１の重鎖は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含み；及び第２の重鎖は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含む。

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
１）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含むか；
又は
２）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む。

一実施形態では、第１の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、第２の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、第１の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、第２の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、第２の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、第１の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、第２の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、第１の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

別の態様では、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法であって、この抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＦａｂ領域：第１のエピトープに特異的に結合する第１のＦａｂ領域、及び第２のエピトープに特異的に結合する第２のＦａｂ領域を含み；
第１のＦａｂ領域は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及び第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
第２のＦａｂ領域は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及び第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み；
この方法は、
ａ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１２６位でシステインを導入し、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの２２０位でのシステイン残基を置換するか、修飾するか、又は欠失させること；
ｂ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１２３位でシステインを導入し、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの２１４位でのシステイン残基を置換するか、修飾するか、欠失させること；
ｃ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１２６位でのシステインと、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１２３位でのシステインとの間に、ジスルフィド結合を形成すること；
及び
ｄ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの２２０位でのシステインと、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの２１４位でのシステインとの間に、ジスルフィド結合を形成すること；
を含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、方法を対象とする。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＦ１２６Ｃ変異を導入し、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＣ２２０Ａ変異を導入し；及び
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＥ１２３Ｃ変異を導入し、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＣ２１４Ａ変異を導入する。

一実施形態では、この方法は、
ｅ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でリシンを導入すること；
ｆ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でグルタミン酸を導入すること；
ｇ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でグルタミン酸を導入すること；
及び
ｈ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でリシンを導入すること
をさらに含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｋ変異を導入し；
ｉｉ）第１のＬＶ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｅ変異を導入し；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｅ変異を導入し；
及び
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｋ変異を導入する。

一実施形態では、この方法は、
ｅ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でグルタミン酸を導入すること；
ｆ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でリシンを導入すること；
ｇ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でリシンを導入すること；
及び
ｈ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でグルタミン酸を導入すること、をさらに含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｅ変異を導入し；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｋ変異を導入し；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｋ変異を導入し；
及び
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｅ変異を導入する。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、多重特異性抗体又は多重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体断片である。

一実施形態では、第１のＦａｂ領域及び第２のＦａｂ領域は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
１）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含むか；
又は
２）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む。

Ｆａｂ界面を表す。Ｆａｂ二量体化に寄与する１００個超の残基を、Ｐｉｓａで算出して棒で示した。ＦａｂＣ末端での標準的なジスルフィド結合を、黄色の円形で強調している。Ｆａｂの定常領域中における非標準的なジスルフィド結合の設計を示す。最初のカラム精製後の発現レベルを示す。Ｖ２２３２及びＶ２２３３と、コントロール（ｍＡｂ、及びＶ５０３、及びＶ６０３）との比較。ＳＥＣ％ＭＰによるコンストラクトの純度を示す。ＭＣＥによるコンストラクトの純度を示す。純度目標が９０％であるコンストラクトの総収量を示す。精製工程中での回収率を示す。

一態様では、本発明は、少なくとも１つのＦａｂ領域を含む抗原結合タンパク質であって、このＦａｂ領域は、１２６位でシステインを含み且つ２２０位でシステインを欠いているＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び１２３位でシステインを含み且つ２１４位でシステインを欠いているＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、抗原結合タンパク質を対象とする。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＦ１２６Ｃ変異を導入し、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＣ２２０Ａ変異を導入し；
及び
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＥ１２３Ｃ変異を導入し、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＣ２１４Ａ変異を導入する。

一実施形態では、
ｉ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｋ変異を導入し；
ｉｉ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｅ変異を導入し；
ｉｉｉ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｅ変異を導入し；
及び
ｉｖ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｋ変異を導入する。

一実施形態では、この方法は、
ｅ）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でグルタミン酸を導入すること；
ｆ）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でリシンを導入すること；
ｇ）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でリシンを導入すること；及び
ｈ）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でグルタミン酸を導入することをさらに含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

一実施形態では、
１）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
２）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
３）第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域のＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
４）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
５）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
６）第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
７）第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；又は
８）第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されている。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、第１の重鎖は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含み；第２の重鎖は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含む。

一実施形態では、抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
１）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含むか；又は
２）修飾された重鎖は、Ｃ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、修飾された重鎖は、Ｎ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、第１の軽鎖は、第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、第２の軽鎖は、第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む。

一実施形態では、一方の重鎖は、Ｆ４０５Ｌ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ、又はＦ４０５Ｙの変異を含み、他方の重鎖は、Ｋ４０９Ｒ変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。一実施形態では、一方の重鎖は、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。一実施形態では、一方の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅの各変異を含み、他方の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

特定の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、３９２位及び４０９位で負荷電アミノ酸を含む（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄの置換）第１の重鎖と、３５６位及び３９９位で正荷電アミノ酸を含む（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋの置換）第２の重鎖とを含む。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、３９２位、４０９位、及び３７０位で負荷電アミノ酸を含む（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＫ３７０Ｄの置換）第１の重鎖と、３５６位、３９９位、及び３５７位で正荷電アミノ酸を含む（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、及びＥ３５７Ｋの置換）第２の重鎖とを含む。

一実施形態では、一方の重鎖は、Ｙ３４９Ｃ変異を含み、他方の重鎖は、Ｅ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃの変異のいずれかを含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。一実施形態では、一方の重鎖は、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの各変異を含み、他方の重鎖は、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。一実施形態では、一方の重鎖は、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの各変異を含み、他方の重鎖は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」という用語は、１種又は複数種の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質には、抗体及びその機能的断片を含め得る。「機能的抗体断片」とは、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合し得る、抗体の一部のことである。機能的抗体断片として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、機能的抗体断片は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物等の任意の哺乳動物源に由来し得る。機能的抗体断片は、標的抗原の結合について、インタクトな抗体と競合し得、この断片は、インタクトな抗体の修飾（例えば、酵素的若しくは化学的な開裂）により作製され得るか、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を使用して新規に合成され得る。

抗原結合タンパク質にはまた、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ又は複数の機能的抗体断片を含むタンパク質も含め得る。例えば、抗原結合タンパク質として下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４－６４４８，１９９３を参照されたい）；細胞内抗体；ドメイン抗体（単一のＶＬ若しくはＶＨドメイン、又はペプチドリンカーにより連結された２つ以上のＶＨドメイン；Ｗａｒｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４－５４６，１９８９を参照されたい）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５－１０６，２００４、及びＰｏｗｅｒｓｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３－１３５，２００１を参照されたい）；三重特異性抗体；四重特異性抗体；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ；Ｏｌａｆｓｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５－２３，２００４を参照されたい）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に結合した１つ又は複数のペプチド、国際公開第００／２４７８２号パンフレットを参照されたい）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７－１０６２，１９９５を参照されたい）；小モジュラー免疫薬（米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号明細書を参照されたい）；並びに免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）。

「多重特異性」は、抗原結合タンパク質が、２種以上の異なる抗原に特異的に結合し得ることを意味する。「二重特異性」は、抗原結合タンパク質が、２種の異なる抗原に特異的に結合し得ることを意味する。本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下で、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して、標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有しており、その結果、この抗原を識別し得る場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）≦１×１０^－６Ｍを有し得る。抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが≦１×１０^－８Ｍである場合に、「高親和性」を伴って抗原に特異的に結合する。

親和性は、様々な技術を使用して決定され、その一例は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。様々な実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によるアッセイ）により決定される。この方法論を用いて、会合速度定数（ｋ_ａ、単位：Ｍ^－１ｓ^－１）及び解離速度定数（ｋ_ｄ、単位：ｓ^－１）を測定し得る。次いで、これらの運動速度定数の比（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）から、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、単位：Ｍ）を算出し得る。一部の実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉｅｔａｌ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８で説明されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）等の速度論的方法により決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、単位：Ｍ）及び会合速度定数（ｋ_ａ、単位：Ｍ^－１ｓ^－１）を測定し得る。これらの値から、解離速度定数（ｋ_ｄ、単位：ｓ^－１）を算出し得る（Ｋ_Ｄ×ｋ_ａ）。他の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法により決定される。ある特定の実施形態では、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイにより決定される。

一部の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質は、ｋ_ｄ（解離速度定数）により測定される結合親和力が、約１０^－２、１０^－３、１０^－４、１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０ｓ^－１以下（値が低いほど結合親和力が高いことを示す）である、及び／又はＫ_Ｄ（平衡解離定数）により測定される結合親和性が、約１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３、１０^－１４、１０^－１５、１０^－１６Ｍ以下（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）である等の望ましい特性を示す。

本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」と互換的に使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し且つこの抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含む、抗原結合タンパク質の領域を指す。

本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）、並びに３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲ領域」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（即ち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２本の鎖の各々におけるＣＤＲは、通常、フレームワーク領域により整列させられ、標的タンパク質の特異的なエピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端へと、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は両方とも、通常、下記のこれらの要素の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と一致する。これらのドメインの各々において位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための付番方式が考案されている。この付番方式は、ＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ａｎｄ１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３で定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を、この方式を使用して同定し得る。

本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はナノボディを含む。一実施形態では、両方の結合ドメインは、Ｆａｂ断片である。別の実施形態では、一方の結合ドメインは、Ｆａｂ断片であり、他方の結合ドメインは、ｓｃＦｖである。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片（各々が単一の抗原結合部位を有する）と、残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン定常領域を含む）とが作製される。Ｆａｂ断片は、全ての可変ドメインと、軽鎖の定常ドメイン、及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。そのため、「Ｆａｂ断片」は、１本の免疫グロブリン軽鎖（軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））と、１本の免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）とから構成されている。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成し得ない。Ｆｃ断片は、炭水化物を示し、抗体の１つのクラスを別のクラスから識別する多くの抗体エフェクター機能（例えば、結合補体及び細胞受容体）に関与する。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分を表す。

「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端で、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、ヒンジ領域で重鎖間のジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。

「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全抗原認識及び結合部位を含む最小の断片である。この断片は、緊密な非共有会合での、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位が規定される。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、抗原を認識して結合する能力を有するが、ＶＨ及びＶＬの両方を含む結合部位全体と比べて親和性が低い。

「一本鎖可変抗体断片」又は「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在しており、任意選択的に、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするペプチドリンカーを、ＶＨ領域とＶＬ領域の間に含む（例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３－４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。

特に、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の実施形態では、結合ドメインは、所望の抗原に特異的に結合する抗体又は抗体断片の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

本明細書において「可変ドメイン」と互換的に使用される「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗体の抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同じ一般構造を有しており、各領域は、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、これらの配列は、広範に保存されており、３つのＣＤＲにより連結されている。フレームワーク領域は、β－シート構造を採用しており、ＣＤＲは、β－シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によりこれらの三次元構造に保持され、他方の鎖由来のＣＤＲと共に、抗原結合部位を形成する。

標的抗原に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）この抗原に対する既知の抗体に由来し得るか、又はｂ）抗原タンパク質若しくはその断片を使用する新規の免疫化法により、ファージディスプレイにより、又は他の常法により得られる新規の抗体又は抗体断片に由来し得る。多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であり得る。ある特定の実施形態では、結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体である。これらの又は他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものであり得る。

「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能性のある天然の変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、通常、様々なエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個別の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体を、当技術分野で既知の任意の技術を使用して作製し得、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することにより作製し得る。脾臓細胞を、当技術分野で既知の任意の技術を使用して不死化し得、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することにより不死化し得る。ハイブリドーマを作製する融合手順において使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生性であり、融合効率が高く、且つ酵素が欠損しており、そのため、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持するある特定の選択培地の中では増殖が不可能である。マウス融合における使用に好適な細胞株の例として、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ１．７、及びＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例として、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９－６である。

一部の例では、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を標的抗原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それにより、ハイブリドーマ細胞を生成し、このハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することにより、ハイブリドーマ細胞株を作製する。

ハイブリドーマ細胞株により分泌されたモノクローナル抗体を、当技術分野において既知の任意の技術を使用して精製し得、例えば、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し得る。ハイブリドーマ又はｍＡｂｓを、さらにスクリーニングして、例えば、標的抗原を発現している細胞に結合する能力、標的抗原リガンドのそれぞれの受容体への結合をブロックするか若しくは妨害する能力、又は受容体のいずれも機能的にブロックする能力等の特定の性質を有するｍＡｂｓを、例えば、ｃＡＭＰアッセイを使用して同定し得る。

一部の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインは、ヒト化抗体に由来してもよい。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）が、ヒト免疫グロブリン由来の対応する領域を含むように修飾されている抗体を指す。一般に、ヒト化抗体を、最初に非ヒト動物で作られたモノクローナル抗体から作製し得る。典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体のある特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように修飾されている。ヒト化を、例えば、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより、種々の方法を使用して実施し得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照されたい）。別の種において生成された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲを、コンセンサスヒトＦＲに移植し得る。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、いくつかのヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。

本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源となり得る標的抗原に対して生成される新規の抗体は、完全ヒト抗体であり得る。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか又はそれを示す可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の作製を実施するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性のＩｇ遺伝子が不活性化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することは、任意の所望の抗原で免疫化し得る動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する一手段である。完全ヒト抗体の使用により、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することにより生じることがあり得る免疫原性及びアレルギー性の応答を最小化し得る。

完全ヒト抗体を、内因性の免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することにより作製し得る。この目的のための抗原は、通常、６つ以上の連続アミノ酸を有しており、任意選択的に担体にコンジュゲートされる（ハプテン等）。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５－２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９３，ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物を、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性のマウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、ヒト重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノムに挿入することにより作製する。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体より少ない補体を有する部分的に修飾された動物を交雑して、所望の免疫系修飾の全てを有する動物を得る。免疫原が投与されると、これらのトランスジェニック動物は、この免疫原に免疫特異性があるが、可変領域を含めてマウスのアミノ酸配列ではなくヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び同第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、同第９０／０４０３６号パンフレット、同第９４／０２６０２号パンフレット、同第９６／３０４９８号パンフレット、同第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書で説明されている。

本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれる上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー鎖遺伝子座及びカッパ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）並びにカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６－８５９）。従って、このマウスは、マウスＩｇＭ又はカッパの発現の低下を示し、且つ免疫化に応答し、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，前掲；ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；ＨａｒｄｉｎｇａｎｄＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．ＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９３，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９４，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：５７９－５９１；ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；ＨａｒｄｉｎｇａｎｄＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．ＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，１９９６，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５－８５１に詳細に説明されており、これらの文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、及び同第５，７７０，４２９号明細書、並びに同第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、同第９２／２２６４６号パンフレット、及び同第９２／０３９１８号パンフレット（これらの全ての開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。この遺伝子導入マウスにおけるヒト抗体の産生を利用する技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、及びＭｅｎｄｅｚｅｔａｌ．，１９９７，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６－１５６でも開示されており、これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

ヒト由来抗体をまた、ファージディスプレイ技術を使用しても生成し得る。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒｅｔａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎａｎｄＫｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）で説明されており、これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ファージ技術により作製される抗体は、通常、細菌において抗原結合断片（例えばＦｖ又はＦａｂ断片）として産生され、そのためエフェクター機能を欠いている。エフェクター機能を、下記の２つの戦略のうち１つにより導入し得る：この断片を操作して、必要に応じて、哺乳動物細胞内で発現する完全な抗体にすることも、エフェクター機能をトリガーし得る別の結合部位を有する多重特異性抗体断片にすることも可能である。通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）を、ＰＣＲにより別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいてランダムに組換え、次いで、特定の抗原に結合するために選択し得る。抗体断片を、ファージ表面上で発現させ、Ｆｖ又はＦａｂ（従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の抗原結合による選択を、パニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行なうことにより実現させる。抗原に特異的な抗体断片を濃縮し、最終的には単離する。ファージディスプレイ技術をまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチでも使用し得る（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２，８９９－９０３（１９９４）を参照されたい）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示し得、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリを、抗原を用いて選択し得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖を、ヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わせる。得られたライブラリの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、抗体である。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、２本の軽鎖のポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２本の重鎖のポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端へと、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）であり得る。「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端へと、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択的な免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）として分類されており、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体は、それぞれ、サブクラス、即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けられる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有しており、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有している。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（即ち、軽鎖と重鎖との間）、及び抗体重鎖のヒンジ領域間で、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結されている。

特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体の抗体（本明細書では「ヘテロ免疫グロブリン」又は「ヘテロＩｇ」と互換的に使用される）であり、これは、２本の異なる軽鎖及び２本の異なる重鎖を含む抗体を指す。

ヘテロ二量体の抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含み得る。「定常領域」という用語は、本明細書で使用する場合、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接には関与しないが、種々のエフェクター機能を発揮する。上記のように、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）並びにサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てで見出されるカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域（例えば、ヒトのカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域）であり得る。

ヘテロ二量体の抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域であり得、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域であり得る。一部の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。

一実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、Ｄｕｏｂｏｄｙ（商標）である。Ｄｕｏｂｏｄｙを、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）テクノロジープラットフォーム（ＧｅｎｍａｂＡ／Ｓ）により作製し得、例えば、国際公開第２００８／１１９３５３号パンフレット、同第２０１１／１３１７４６号パンフレット、同第２０１１／１４７９８６号パンフレット、及び同第２０１３／０６０８６７号パンフレット、ＬａｂｒｉｊｎＡＦｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０（１３）：５１４５－５１５０（２０１３）、Ｇｒａｍｅｒｅｔａｌ．，ｍＡｂｓ，５（６）：９６２－９７３（２０１３）、並びにＬａｂｒｉｊｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，９（１０）：２４５０－２４６３（２０１４）で説明されているように作製し得る。この技術を使用して、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む第１の単一特異性抗体の半分と、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む第２の単一特異性抗体の半分とを組み合わせ得る。得られたヘテロ二量体は、第１の抗体に由来する１本の重鎖及び１本の軽鎖と、第２の抗体に由来する１本の重鎖及び１本の軽鎖とを対にして含む。両方の単一特異性抗体が異なる抗原の異なるエピトープを認識する場合には、得られたヘテロ二量体は、多重特異性抗体である。

ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）プラットフォームについては、単一特異性抗体の各々は、重鎖中に単一の点変異を有する重鎖定常領域を含む。これらの点変異により、得られた多重特異性抗体の重鎖間では、変異のない単一特異性抗体の内のいずれかの重鎖間と比べて強い相互作用が可能になる。各単一特異性抗体の単一の点変異は、重鎖定常領域の重鎖中の残基３６６位、３６８位、３７０位、３９９位、４０５位、４０７位、又は４０９位（ＥＵ付番）であり得る（国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレットを参照されたい）。さらに、単一の点変異は、一方の単一特異性抗体の中において、他方の単一特異性抗体に対して異なる残基に位置する。例えば、一方の単一特異性抗体は、変異Ｆ４０５Ｌ（ＥＵ付番；残基４０５でのフェニルアラニンからロイシンへの変異）、又はＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ、及びＦ４０５Ｙの各変異のうち１つを含み得、他方の単一特異性抗体は、変異Ｋ４０９Ｒ（ＥＵ付番；残基４０９でのリシンからアルギニンへの変異）を含み得る。単一特異性抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）であり得、ＤｕｏＢｏｄｙ（商標）技術により作製された多重特異性抗体を修飾して、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を改変し得（例えば低減させ得）、及び／又は半減期を改善し得る。Ｄｕｏｂｏｄｙ（商標）を生成する一方法は、下記を含む：（ｉ）重鎖中に単一の対となる点変異（即ち、Ｋ４０９Ｒ並びにＦ４０５Ｌ（又はＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ、及びＦ４０５Ｙの各変異のうち１つ）（ＥＵ付番））を含む２つの親ＩｇＧ１を別々に発現させること；（ｉｉ）インビトロにて許容酸化還元条件下で親ＩｇＧ１を混合して、半分子の組換えを可能にすること；（ｉｉｉ）還元剤を除去して、鎖間ジスルフィド結合を再酸化させること；並びに（ｉｖ）クロマトグラフィーによる又は質量分析（ＭＳ）による方法を使用して、交換効率及び最終産物を分析すること（Ｌａｂｒｉｊｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，９（１０）：２４５０－２４６３（２０１４）を参照されたい）。

多重特異性抗体を生成する別の例示的な方法は、ノブイントゥーホール技術（Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，９：６１７－６２１（１９９６）；国際公開第２００６／０２８９３６号パンフレット）によるものである。多重特異性抗体を作製するための主要な欠点であるＩｇ重鎖の誤対形成の問題は、この技術において、ＩｇＧ中で重鎖の界面を形成する選択されたアミノ酸を変異させることにより低減される。２本の重鎖が直接的に相互作用する重鎖内の位置で、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が一方の重鎖の配列の中に導入され、大きい側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が他方の重鎖の、相手として相互作用する残基位置に導入されている。一部の例では、本開示の抗体は、多重特異性抗体を優先的に形成するために２つのポリペプチド間の界面で相互作用する選択されたアミノ酸を変異させることにより重鎖が修飾されている免疫グロブリン鎖を有する。多重特異性抗体は、同じサブクラス又は異なるサブクラスの免疫グロブリン鎖から構成され得る。一例では、ｇｐ１２０及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）変異を「ノブ鎖」で含み、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ＥＵ付番）の各変異を「ホール鎖」で含む。ある特定の実施形態では、例えば、Ｙ３４９Ｃ変異を「ノブ鎖」に導入し、Ｅ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異を「ホール鎖」に導入することにより、追加の鎖間ジスルフィド架橋が重鎖間に導入されている。ある特定の実施形態では、Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅの各変異が「ノブ鎖」に導入され、Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋの各変異が「ホール鎖」に導入されている。他の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの各変異が鎖のうちの一方に導入され、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異が相手側の鎖に導入されている。一部の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの各変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異が相手側の鎖に導入されている一部の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの各変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異が相手側の鎖に導入されている。さらに他の実施形態では、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの各変異が一方の鎖に導入され、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの各変異が相手側の鎖に導入されている（全てＥＵ付番）。

多重特異性抗体を生成するさらに別の方法は、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術である。ＣｒｏｓｓＭａｂは、２種の完全長抗体の各半分で構成されるキメラ抗体である。この技術は、鎖を正確に対形成するために、下記の２つの技術を組み合わせている：（ｉ）２本の重鎖間の正確な対形成に有利なノブイントゥーホー；及び（ｉｉ）軽鎖の誤対形成を回避する非対称を導入するための、２つのＦａｂのうち１つの重鎖と軽鎖との間での交換。Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，９：６１７－６２１（１９９６）；Ｓｃｈａｅｆｅｒｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０８：１１１８７－１１１９２（２０１１）を参照されたい。ＣｒｏｓｓＭａｂは、２種以上の標的を標的化するために、又は１種の標的に対して２：１形式等の二価性を導入するために、２種以上の抗原－結合ドメインを組み合わせ得る。

特定の重鎖とその同族の軽鎖との会合を促進するために、重鎖及び軽鎖の両方は、相補的アミノ酸置換を含み得る。本明細書で使用する場合、「相補的アミノ酸置換」は、一方の鎖における正荷電アミノ酸への置換と、他方の鎖における負荷電アミノ酸置換とを対にすることを指す。例えば、一部の実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するために少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸の反対の電荷を有する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の正荷電残基（例えば、リシン、ヒスチジン、又はアルギニン）を、第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入し得、１つ又は複数の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、ＬＣ１／ＨＣ１の結合界面で、対になる重鎖（ＨＣ１）に導入し得、一方、１つ又は複数の負荷電残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を、第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入し得、１つ又は複数の正荷電残基（例えば、リシン、ヒスチジン、又はアルギニン）を、ＬＣ２／ＨＣ２の結合界面で、対になる重鎖（ＨＣ２）に導入し得る。静電相互作用は、界面で反対に荷電した残基（極性）が引き合うために、ＬＣ１をＨＣ１と対形成させ、且つＬＣ２をＨＣ２と対形成させるように誘導することになる。界面で同じ荷電残基（極性）を有する重鎖／軽鎖の対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は、反発することになり、結果として不所望のＨＣ／ＬＣの対形成が抑制される。

これらの及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そのため、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正荷電アミノ酸は、１つ又は複数の負荷電アミノ酸に置き換えられている。或いは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そのため、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負荷電アミノ酸は、１つ又は複数の正荷電アミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５、及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置でのヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸に置き換えられている。ある特定の実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸での置換に好ましい残基は、Ｓ１８３（ＥＵ付番方式）である。一部の実施形態では、Ｓ１８３は正荷電アミノ酸で置換されている。代替的な実施形態では、Ｓ１８３は負荷電アミノ酸で置換されている。例えば、一実施形態では、Ｓ１８３は、第１の重鎖において負荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｅ）で置換されており、Ｓ１８３は、第２の重鎖において正荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１８３Ｋ）で置換されている。

軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４、及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵ及びＫａｂａｔ付番）での、ヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸に置き換えられている。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６、及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＫａｂａｔ付番）での、ヘテロ二量体の抗体中の第１の及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、負荷電又は正荷電のアミノ酸での置換に好ましい残基は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ及びＫａｂａｔ付番方式）である。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正荷電アミノ酸に置き換えられている。代替的な実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負荷電アミノ酸に置き換えられている。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖において正荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｋ）で置換されており、Ｓ１７６は、第２の軽鎖において負荷電アミノ酸（例えば、Ｓ１７６Ｅ）で置換されている。

ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける相補的アミノ酸置換に加えて、又はその代替として、ヘテロ二量体の抗体中の軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために１つ又は複数の相補的アミノ酸置換を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体の重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そのため、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正荷電アミノ酸は、１つ又は複数の負荷電アミノ酸に置き換えられている。或いは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そのため、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負荷電アミノ酸は、１つ又は複数の正荷電アミノ酸に置き換えられている。

ＶＨ領域内のＶ領域界面残基（即ち、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアセンブリーを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの１位、３位、３５位、３７位、３９位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、５０位、５９位、８９位、９１位及び９３位が含まれる。ＶＨ領域中のこれらの界面残基のうち１つ又は複数を、荷電（正荷電又は負荷電）アミノ酸で置換し得る。ある特定の実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、リシン）に置換されている。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置換されている。一部の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えばＧ３９Ｅ）に置換されており、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ３９位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、Ｇ３９Ｋ）に置換されている。一部の実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、リシン）に置換されている。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置換されている。ある特定の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、Ｇ４４Ｅ）に置換されており、第２の重鎖のＶＨ領域中のＫａｂａｔ４４位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、Ｇ４４Ｋ）に置換されている。

ＶＬ領域内のＶ領域界面残基（即ち、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアセンブリーを媒介するアミノ酸残基）には、Ｋａｂａｔの３２位、３４位、３５位、３６位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４８位、４９位、５０位、５１位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、８５位、８７位、８９位、９０位、９１位及び１００位が含まれる。ＶＬ領域中の１つ又は複数の界面残基を、荷電アミノ酸で置換し得、好ましくは、同族の重鎖のＶＨ領域に導入されたものと反対の電荷を有するアミノ酸で置換し得る。一部の実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、リシン）に置換されている。代替的な実施形態では、第１の及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸）に置換されている。ある特定の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、正荷電アミノ酸（例えば、Ｇ１００Ｋ）に置換されており、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＫａｂａｔ１００位のアミノ酸は、負荷電アミノ酸（例えば、Ｇ１００Ｅ）に置換されている。

ある特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体の抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖、並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、３９２位（ＥＵ）、及び４０９位（ＥＵ）で含み、第２の重鎖は、アミノ酸置換を４４位（Ｋａｂａｔ）、１８３位（ＥＵ）、３５６位（ＥＵ）、及び３９９位（ＥＵ）で含み、第１の及び第２の軽鎖は、アミノ酸置換を１００位（Ｋａｂａｔ）及び１７６位（ＥＵ）で含み、これらのアミノ酸置換により、前記の各位置に荷電アミノ酸が導入されている。関連する実施形態では、第１の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸に置き換えられており、第２の重鎖の４４位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリシンに置き換えられており、第１の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがリシンに置き換えられており、第２の軽鎖の１００位（Ｋａｂａｔ）のグリシンがグルタミン酸に置き換えられており、第１の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがリシンに置き換えられており、第２の軽鎖の１７６位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸に置き換えられており、第１の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがグルタミン酸に置き換えられており、第１の重鎖の３９２位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸に置き換えられており、第１の重鎖の４０９位（ＥＵ）のリシンがアスパラギン酸に置き換えられており、第２の重鎖の１８３位（ＥＵ）のセリンがリシンに置き換えられており、第２の重鎖の３５６位（ＥＵ）のグルタミン酸がリシンに置き換えられており、及び／又は第２の重鎖の３９９位（ＥＵ）のアスパラギン酸がリシンに置き換えられている。

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体のパパイン消化により生成し得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含み、任意選択的にＣＨ４ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び貪食等のエフェクター機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、エフェクター機能を低減するか又は排除するように修飾され得る。

本発明の抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（即ち、カルボキシル末端の結合ドメイン）は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーにより連結された重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。可変領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの向きで、ｓｃＦｖ内に配置され得る。例えば、一実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ領域、ペプチドリンカー、及びＶＬ領域を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＬ領域、ペプチドリンカー、及びＶＨ領域を含む。ｓｃＦｖのＶＨ領域及びＶＬ領域は、１つ又は複数のシステイン置換を含み、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にジスルフィド結合形成を可能にし得る。そのようなシステインのクランプは、抗原－結合性配置における２つの可変ドメインを安定化させる。一実施形態では、ＶＨ領域中の４４位（Ｋａｂａｔ付番）及びＶＬ領域中の１００位（Ｋａｂａｔ付番）は、それぞれシステイン残基で置換されている。

ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、そのアミノ末端で、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されているか、又は別の方法で連結されている。そのため、一実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＨ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＬ領域を含むように、ｓｃＦｖはＦｃ領域に融合されている。別の実施形態では、得られる融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第１のペプチドリンカー、ＶＬ領域、第２のペプチドリンカー、及びＶＨ領域を含むように、ｓｃＦｖはＦｃ領域に融合されている。「融合タンパク質」は、複数種の親タンパク質又はポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むタンパク質である。通常、融合タンパク質は、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と一緒にインフレームに付加され、任意選択的にリンカーによって、その配列から分離される、融合遺伝子から発現される。次いで、この融合遺伝子は、組換え宿主細胞により発現されて単一の融合タンパク質を産生し得る。

「ペプチドリンカー」とは、１つのポリペプチドを別のポリペプチドに共有結合させる約２～約５０個のアミノ酸のオリゴペプチドを指す。ペプチドリンカーを使用して、ｓｃＦｖ中でＶＨドメインとＶＬドメインとを連結し得る。ペプチドリンカーを使用して、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、又は他の機能的抗体断片をＦｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結して、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質も作り出し得る。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約５個のアミノ酸長～約４０個のアミノ酸長である。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約８個のアミノ酸長～約３０個のアミノ酸長である。さらに他の実施形態では、ペプチドリンカーは、約１０個のアミノ酸長～約２０個のアミノ酸長である。好ましくは、必ずしもというわけではないが、ペプチドリンカーは、２０種の標準的なアミノ酸の中のアミノ酸、特に、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及び／又はセリンを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、及びアラニン等の立体障害のない大多数のアミノ酸で構成されている。そのため、一部の実施形態において好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、及びポリアラニン、又はこれらのうちいずれかの組合せが含まれる。一部の例示的なペプチドリンカーとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ポリ（Ｇｌｙ）_２～８、（配列番号２２～２６、３０、及び５１）、特に（Ｇｌｙ）_３（配列番号２２）、（Ｇｌｙ）_４（配列番号２３）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号２４）、（Ｇｌｙ）_６（配列番号２５）、並びに（Ｇｌｙ）_７（配列番号２６）、並びにポリ（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ（配列番号４８）、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）_２～４（配列番号３３～３５）、及びポリ（Ａｌａ）_２～８（配列番号３６～４２）。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_ｘＳｅｒ）_ｎであり、ここで、ｘ＝３又は４であり、ｎ＝２、３、４、５又は６である（配列番号２９、３１、３２、及び４３～５０）。そのようなペプチドリンカーとして、下記が挙げられる：「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ又は「Ｇ_４Ｓ」；配列番号２７）、「Ｌ９」（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「Ｇ_３ＳＧ_４Ｓ」；配列番号２８）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_２」；配列番号２９）、「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_３」；配列番号３１）、及び「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；又は「（Ｇ_４Ｓ）_５」；配列番号３２）。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ中でＶＨ領域とＶＬ領域とを連結しているペプチドリンカーは、Ｌ１５又は（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号３１）である。これらの及び他の実施形態では、カルボキシル末端の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）をＦｃ領域のＣ末端に連結しているペプチドリンカーは、Ｌ９若しくはＧ_３ＳＧ_４Ｓリンカー（配列番号２８）又はＬ１０（Ｇ_４Ｓ）_２リンカー（配列番号２９）である。

本発明の多重特異性抗原結合タンパク質に使用し得るペプチドリンカーの他の特定の例として、下記が挙げられる：（Ｇｌｙ）_５Ｌｙｓ（配列番号１）；（Ｇｌｙ）_５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号２）；（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号３）；（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号４）；（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号５）；ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号６）；ＧＧＥＧＧＧ（配列番号７）；ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号８）；ＧＥＥＥＧ（配列番号９）；ＧＥＥＥ（配列番号１０）；ＧＧＤＧＧＧ（配列番号１１）；ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号１２）；ＧＤＤＤＧ（配列番号１３）；ＧＤＤＤ（配列番号１４）；ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号１５）；ＷＥＷＥＷ（配列番号１６）；ＦＥＦＥＦ（配列番号１７）；ＥＥＥＷＷＷ（配列番号１８）；ＥＥＥＦＦＦ（配列番号１９）；ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号２０）；及びＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号２１）。

本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響を及ぼす１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合する際に免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質（例えばＣ１ｑ）と、Ｆｃとの結合を介して媒介される。一部の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性を含むエフェクター機能、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強するために、定常領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を増強し得る例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のいずれかの組合せ。

他の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を低減するために、定常領域に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を低減し得る例示的なアミノ酸置換（ＥＵ付番）として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のいずれかの組合せ。

グリコシル化は、抗体（特にＩｇＧ１抗体）のエフェクター機能の要因となり得る。そのため、一部の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、この結合タンパク質のグリコシル化のレベル又はタイプに影響を及ぼす１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。そのため、ポリペプチド中でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用し得るが、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリン又はスレオニン）への糖類Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの結合を指す。

ある特定の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加を、上記のトリペプチド配列のうち１つ又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に実現し得る（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変をまた、１つ又は複数のセリン残基若しくはスレオニン残基の開始配列への付加又は開始配列による置換によっても行ない得る（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化により改変し得、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより改変し得る。

本発明はまた、炭水化物構造が改変されて、エフェクター活性が改変されている多重特異性抗原結合タンパク質分子（例えば、フコシル化がないか又は減少してＡＤＣＣ活性の向上を示す抗原結合タンパク質）の作製も包含する。フコシル化を減少させるか又は排除する様々な方法が、当技術分野において既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合により媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生により、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体が得られる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照されたい）。同様の効果を、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするような細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤を用いる培養によって、達成し得る（Ｒｏｔｈｍａｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照されたい）。いくつかの宿主細胞株（例えば、Ｌｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株）は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照されたい）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された炭水化物レベルの増加もＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照されたい）。

他の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除去することによって、低減しているか、又は排除されている。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除するか又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を低減し得るか、又は排除し得る。ある特定の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７Ｇ等のＮ２９７位（ＥＵ付番）での変異を含む。特定の一実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、分子のＦｃ領域をさらに操作してもよい。例えば、一部の実施形態では、Ｆｃ領域における１つ又は複数のアミノ酸は、二量体状態でジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換されている。そのため、ＩｇＧ１Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ付番）に対応する残基は、システインで置換され得る。好ましくは、残基の特定の対が、互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換されており、そのため、ジスルフィド結合のスクランブルが制限されるか、又は防止される。好ましい対として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ。特定の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃで変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。そのような実施形態では、Ｆｃ領域はまた、Ｎ２９７Ｇ変異も含み得る。

例えば、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合エピトープの組み込み又は付加による（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで、例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合させることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい）、或いはＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマー等の分子の付加による、血清半減期を延長するための本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の修飾もまた望ましい場合がある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ又は複数のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質中の類似の位置に移入される領域を構成する。より一層好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が移入されている。さらにより好ましくは、エピトープがＦｃ領域（例えば、ＩｇＧＦｃ領域）のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は複数のそのような領域に移入されている。或いは、エピトープがＦｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移入されている。Ｆｃ変異体及びそのサルベージ受容体との相互作用の説明については、国際出願である、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び同第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。

本発明は、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質及びその成分をコードする１つ又は複数の単独で存在する核酸を含む。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組合せが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子、並びにこれらの断片の組合せが含まれる。本発明の核酸は、優先的にはヒト供給源に由来するが、本発明には、非ヒト種に由来するものも含まれる。

免疫グロブリン若しくはその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域等）又は目的のポリペプチドに由来の関連するアミノ酸配列を、直接タンパク質配列解析法により決定し得、好適なコードヌクレオチド配列を、普遍コドン表に従ってデザインし得る。或いは、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源となり得る、モノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、そのような抗体を産生する細胞から単離して配列決定し得る。

本明細書において「単独で存在するポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単独で存在する核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合には、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離されている核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチド等の鋳型から酵素的に合成されたか又は化学的に合成された核酸の場合には、そのようなプロセスから得られる核酸は、単独で存在する核酸であると理解される。単独で存在する核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸コンストラクトの成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、不純にする内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で概説されているもの）によるその成分ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されている。そのような配列は、好ましくは、通常、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供されており、及び／又は構築されている。非翻訳のＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在し得、この場合には、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書で論じられている任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書で説明されているポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメータ、及び好適な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ９ａｎｄ１１；及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ２．１０ａｎｄ６．３－６．４）によって示されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者が容易に決定し得る。中程度にストリンジェントな条件を達成する一方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約４２℃のハイブリダイゼーション温度による、約５０％ホルムアミドを含有するもの）、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、およそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること以外は上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（ｌ×ＳＳＰＥは、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、及び１．２５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中のＳＳＣ（ｌ×ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置換し得、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間洗浄を行う。当業者に知られており、且つ下記でさらに説明されるように、ハイブリダイゼーション反応及び二本鎖の安定性を決定する基本原理を適用することにより、所望の程度のストリンジェンシーを達成するために必要に応じて、洗浄温度及び洗浄塩濃度を調節し得ることと理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９を参照されたい）。核酸を未知の配列の標的核酸にハイブリダイズさせる場合には、ハイブリッド長はハイブリダイズする核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合には、ハイブリッド長を、両核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性の領域又は領域群を同定することにより決定し得る。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、下記の式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合には、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長を超えるハイブリッドの場合には、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）、（式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である）（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、そのようなハイブリダイズする核酸の各々は、少なくとも１５個のヌクレオチド（又はより好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチド、若しくは少なくとも２０個のヌクレオチド、若しくは少なくとも２５個のヌクレオチド、若しくは少なくとも３０個のヌクレオチド、若しくは少なくとも４０個のヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド）の長さ、或いはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有しており、且つそれがハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、及び最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有しており、ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されているように、ハイブリダイズする核酸の配列を、重複及び同一性が最大となり、配列ギャップが最小になるように整列させた場合に当該核酸の配列を比較することにより決定される。

本明細書で説明されている抗原結合タンパク質の変異体を、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当技術分野において周知の他の技術を使用する、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発により、この変異体をコードするＤＮＡを作製し、その後、本明細書で概説されているように、細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることにより調製し得る。しかし、約１００～１５０個までの残基を有する変異体ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質を、確立された技術を使用するインビトロ合成により調製し得る。変異体は、典型的には、天然の類似体と同じ定性的生物学的活性を示し、例えば抗原への結合を示す。そのような変異体は、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行って、最終コンストラクトに至るが、但し、この最終コンストラクトは、所望の特性を保持するものとする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスも改変し得る。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質変異体は、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾する目的で調製される。他の実施形態では、本明細書で論じられている目的のために、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の修飾が望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかにおける変異誘発が企図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な修飾をデザインするために、当業者は共分散分析技術を使用し得る。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａｅｔａｌ．、米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒｅｔａｌ．、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈｅｔａｌ．、国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓｅｔａｌ．、国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共分散分析によって決定されるそのような改変により、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態学的、薬力学的、及び／又は製造可能性の特性を改善し得る。

本発明はまた、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ又は複数の核酸を含むベクターも含む。「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を指す。ベクターの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター。「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞において作動可能に連結されているコード配列の発現に必要な、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合には、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列として、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び場合により他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択的に発現ベクターによってコードされ、目的のコード配列に作動可能に連結されることが可能であり、これにより、所望の場合には、細胞から目的のポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させ得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号１）、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号２）、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号３）、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号４）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号５）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号６）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号７）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号８）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号９）からなる群から選択される。

通常、本発明の多重特異性抗原タンパク質を産生するために宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びにこの多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含む。集合的に「隣接配列」と呼ばれるそのような配列は、ある特定の実施形態では、典型的には、下記のヌクレオチド配列：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントのうち１つ又は複数を含む。これらの配列の各々を、以下で論じる。

任意選択的に、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、ポリペプチドコード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、このオリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は市販の抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、通常、ポリペプチドが発現すると、ポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段としての役目をすることができる。親和性精製を、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーにより実現し得る。任意選択的に、その後、ある特定の開裂用ペプチダーゼを使用する等の様々な手段によって、精製されたポリペプチドからタグを除去し得る。

隣接配列は、同種性（即ち、宿主細胞と同一の種及び／又は株に由来する）、異種性（即ち、宿主細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（即ち、複数種の供給源に由来する隣接配列の組合せ）、合成、又は天然であり得る。従って、隣接配列の供給源は、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎動物若しくは無脊椎動物、又は任意の植物であり得るが、但し、この隣接配列が宿主細胞機構において機能し、且つ宿主細胞機構によって活性化され得るものとする。

本発明のベクターに有用な隣接配列を、当技術分野において周知の複数の方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書において有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって事前に同定されていることになるため、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織源から単離し得る。場合により、隣接配列の全ヌクレオチド配列が既知であり得る。この場合、隣接配列を、核酸合成又はクローン化の常法を使用して合成し得る。

隣接配列の全てが既知であるか、又はその一部のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して、並びに／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくは隣接配列断片等の好適なプローブを用いてゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、隣接配列を得ることができる。隣接配列が不明である場合には、隣接配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列又は１つ若しくは複数の別の遺伝子さえ含み得るＤＮＡの大型断片から単離し得る。単離を、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を作製し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に既知の他の方法を使用して単離することにより実現し得る。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に分かるであろう。

複製起点は、通常、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合には、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、様々なウイルス性の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶ若しくはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるベクターのクローン化に有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含むという理由でのみ、使用されることが多い）。

転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’末端側に位置しており、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリから容易にクローン化されるか、又はベクターの一部として、市販品を購入する場合さえあるが、既知の核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。

選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させる宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物の宿主細胞に、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、又はカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質；又は（ｃ）複合培地若しくは限定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことには、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物の宿主細胞及び真核生物の宿主細胞の両方における選択に使用し得る。

他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それにより、選択遺伝子と、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分等の別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）を特徴とする。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側、及び発現されることになるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写産物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。

真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される等の場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を改変し得るか、又はプロ配列を付加し得、これもグリコシル化に影響を及ぼし得る。最終タンパク質産物は、－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）で、発現に付随する１つ又は複数の追加のアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ開裂部位に見出される１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。代わりに、幾つかの酵素開裂部位を使用することにより、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合に、所望のポリペプチドがわずかにトランケートされた形態が生じ得る。

本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、且つポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令し得る核酸分子が作製されるように２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列にライゲートされる。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組合せを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激するか又は調節する場合に、このコード配列に作動可能に連結されている。

プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（即ち５’側；一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）に位置し、この構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。通常、プロモーターは、下記の２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化等の培養条件の何らかの変化に応じ、その制御下で、ＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に転写し、即ち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが、周知である。好適なプロモーターは、供給源ＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の、例えば、重鎖、軽鎖、修飾された重鎖、又は他の成分をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。

酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモーターも、当技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に使用されるのが有利である。哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモーターは周知であり、下記が挙げられるが、これらに限定されない：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られたもの。他の好適な哺乳動物プロモーターとして、異種哺乳動物プロモーターが挙げられ、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。

対象となり得るさらなるプロモーターとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｎｏｉｓｔａｎｄＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎｅｔａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒｅｔａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９－４２）；並びにベータ－ラクタマーゼプロモーター等の原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）。組織特異性を示し且つトランスジェニック動物で利用されている下記の動物転写制御領域も対象とする：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔｅｔａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚｅｔａｌ．，１９８６，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５－５１５）；膵β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５－１２２）；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌｅｔａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、乳房、リンパ球、及び肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔｅｔａｌ．，１９８７，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）、肝臓において活性であるアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆｅｔａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙｅｔａｌ．，１９８７，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるベータ－グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３－２８６）；並びに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎｅｔａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２－１３７８）。

エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物によって、多重特異性抗原結合タンパク質の成分（例えば、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの転写を増加させ得る。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の双方の位置にて見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な複数のエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェト－タンパク質、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当技術分野において既知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいてコード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモーターから５’側の部位に位置する。適切な天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、細胞外への抗体の分泌を促進し得る。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生されることになる宿主細胞の型に依存し、異種性のシグナル配列が天然のシグナル配列に取って代わることができる。シグナルペプチドの例は、上で説明されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとして、下記が挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号明細書で説明されているインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８で説明されているインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号明細書で説明されているインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書で説明されているＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号明細書で説明されているＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド。

提供される発現ベクターを、市販のベクター等の出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書で説明されている隣接配列のうちの１つ又は複数がベクターに最初から存在していない場合、それらを個々に取得してベクターにライゲートしてもよい。隣接配列の各々を取得するために使用される方法は、当業者に周知である。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書で説明されている核酸によってコードされる融合タンパク質を含むタンパク質を産生し得る。

ある特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の異なる成分をコードする核酸を、同じ発現ベクターに挿入してもよい。そのような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、単一のプロモーターの制御下で、２つの核酸が分離されてもよい。或いは、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下にあってもよい。

同様に、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ多重特異性抗原結合タンパク質については、軽鎖をコードする核酸は、修飾された重鎖（重鎖及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質）をコードする核酸と同じ発現ベクターにクローン化されてもよく、その場合、２つの核酸は単一のプロモーターの制御下にあってＩＲＥＳによって分離されるか、又は２つの核酸は２つの別個のプロモーターの制御下にある。ＩｇＧ－Ｆａｂ多重特異性抗原結合タンパク質については、３つの成分の各々をコードする核酸は、同じ発現ベクターにクローン化されてもよい。一部の実施形態では、ＩｇＧ－Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸、及び第２のポリペプチド（Ｃ末端のＦａｂドメインのもう半分を含む）をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化され、一方、修飾された重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸は、第２の発現ベクターにクローン化される。ある特定の実施形態では、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分は、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１つ又は複数の成分が別個の発現ベクターにクローン化される場合でも、宿主細胞に両方の発現ベクターを同時トランスフェクトして、１つの細胞が多重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分を産生するようにする。

ベクターを構築され、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１種又は複数種の核酸分子を、１種又は複数種のベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入し得る。そのため、本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１種又は複数種の発現ベクターを含む、単独で存在する宿主細胞を包含する。「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸で形質転換されているか、又は形質転換されることが可能であり、それにより、目的の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫の形態又は遺伝的構造が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された、本発明の単独で存在する核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。

抗原結合タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換を、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含む周知の方法によって実現し得る。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞の型に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，２００１に示されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると抗原結合タンパク質を合成し、その後、この抗原結合タンパク質を、（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合は）培養培地から採取し得るか、又は（それが分泌されない場合は）それを産生する宿主細胞から直接的に採取し得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化等）に望ましいか又は必要であるポリペプチドの修飾、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ等の様々な要因に依存することになる。

例示的な宿主細胞として、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞として、下記が挙げられる：グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物等の真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）。真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等の複数の他の属、種、及び株が、本明細書において一般に利用可能であり、且つ有用である。

グリコシル化された抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルスの株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）等の宿主由来の、対応する昆虫の許容宿主細胞が同定されている。そのような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公に入手可能である。

脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、そのような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は常法となっている。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、下記が挙げられるが、これらに限定されない：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、又は懸濁培養での増殖用にサブクローン化された２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．ＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株。別の実施形態では、それ自体の抗体は作製しないが、異種性抗体を作製して分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択し得る。一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞が、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質を発現するのに好ましい宿主細胞である。

多重特異性抗原結合タンパク質の産生のために、宿主細胞を上記の核酸又はベクターで形質転換するか又はトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養する。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規のベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。そのため、本発明はまた、本明細書で説明されている多重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法であって、本明細書で説明されている１種又は複数種の発現ベクターを含む宿主細胞を、この１種又は複数種の発現ベクターによってコードされる多重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下にて培養培地中で培養することと、この培養培地から多重特異性抗原結合タンパク質を回収することとを含む方法も提供する。

本発明の抗原結合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞を、様々な培地中で培養し得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，９２７，７６２号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；若しくは同第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；同第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書で説明されている培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用し得る。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商標）薬剤）、微量元素（通常はマイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充し得る。任意の他の必要な栄養補助物質もまた、当業者に既知であるだろう適切な濃度で含まれ得る。温度及びｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

宿主細胞を培養すると、多重特異性抗原結合タンパク質は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生されること、又は培地中に直接分泌されることが可能である。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒状の破片である宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。多重特異性抗原結合タンパク質を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又は好ましくは、親和性リガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し得る。プロテインＡを、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用し得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて実現し得るよりも、流速を速く且つ処理時間を短くすることが可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合には、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されるべき特定の多重特異性抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製のための他の技術もまた可能である。

抗体の天然の発現レベル、精製プロファイル、及び全体的な安定性を模倣するために、ＣＨ１／ＣＬ界面の広範なスクリーニングを実施した。側鎖の回転異性体構造が最適であり且つ各Ｃα－Ｃα間の距離が約４．５Åである２つの２残基を求めた。結果から、ＨＣ中のＦ１２６Ｃ及びＬＣ中のＥ１２３Ｃが、標準的なジスルフィド結合を成功裏に置き換え得、ＣＰＭｖ１と共に効率的に配置され得る（ＨＣ－Ｓ１８３Ｋ及びＬＣ－Ｓ１７６Ｅ）ことが分かる（図２）。

６種の二重特異性を選択し、４種の異なる二重特異性形式に変換した。新規の非標準的なジスルフィド結合が配置に適していることを検証するために、この分子のセットに含まれているのは、カッパ／カッパ、ラムダ／ラムダ、及びカッパ／ラムダ二重ＬＣ構成であった。「交換あり」及び「交換なし」は、Ｆａｂ領域中でのＣＰＭの配置を指す（下記の表１及び表２を参照されたい）。

合計６０種の分子（コントロールを含む）を、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、続いて２段階タンパク質精製を行ない、９０％超の純度を満たした。新規に設計したシステインの細胞機構への影響を理解するために、ＰｒｏＡによる最初の精製工程後に、ＳＥＣ及びＭＣＥによる広範な分析を行なって、凝集体及び低分子量種を評価した（図３、４、及び５）。図６は、純度目標が９５％を超える全精製物を示す。図７は、ＳＰ精製工程とＰｒｏＡ精製工程との間の回収率％を示す。図３～７は、上記の表１及び表２で示される６種の二重特異性のそれぞれの結果を示す。幅広の棒中の白線は、中央値の結果を示す。

結果は、Ｖ２２３２及びＶ２２３３が、Ｖ５０３及びＶ６０３の各コントロールを使用した場合と同等の多重特異性収量を生成したことを示している。興味深いことに、データから、Ｖ２２３３は、交換された場合には、最良のコントロールと比べて高い回収率（それぞれ、４０％対３５％）を示すことが分かる。さらに、設計されたＦ１２６Ｃ及びＥ１２３Ｃは、これらの多重特異性分子を発現する細胞の能力に悪影響を及ぼさないように見える。これら２つの挿入されたシステイン間での正しいシステイン結合の形成を、ＰｒｏＡ精製工程後の低ｐＨでの溶出により最初に評価し、ＭＳＱＣによりさらに確認した。

Claims

多重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法であって、前記抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＦａｂ領域：第１のエピトープに特異的に結合する第１のＦａｂ領域、及び第２のエピトープに特異的に結合する第２のＦａｂ領域を含み；
前記第１のＦａｂ領域は、第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及び第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
前記第２のＦａｂ領域は、第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及び第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み；
前記方法は、
ａ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１２６位でシステインを導入し、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの２２０位でのシステイン残基を置換するか、修飾するか、又は欠失させること；
ｂ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１２３位でシステインを導入し、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの２１４位でのシステイン残基を置換するか、修飾するか、欠失させること；
ｃ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１２６位でのシステインと、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１２３位でのシステインとの間に、ジスルフィド結合を形成すること；及び
ｄ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの２２０位でのシステインと、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの２１４位でのシステインとの間に、ジスルフィド結合を形成すること；
を含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、方法。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＦ１２６Ｃ変異を導入し、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドにＣ２２０Ａ変異を導入し；及び
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＥ１２３Ｃ変異を導入し、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドにＣ２１４Ａ変異を導入する、
請求項１に記載の方法。
ｅ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でリシンを導入すること；
ｆ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でグルタミン酸を導入すること；
ｇ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でグルタミン酸を導入すること；及び
ｈ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でリシンを導入することをさらに含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項１又は２に記載の方法。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｋ変異を導入し；
ｉｉ）前記第１のＬＶ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｅ変異を導入し；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｅ変異を導入し；及び
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｋ変異を導入する、
請求項３に記載の方法。
ｅ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でグルタミン酸を導入すること；
ｆ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でリシンを導入すること；
ｇ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドの１８３位でリシンを導入すること；及び
ｈ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドの１７６位でグルタミン酸を導入すること
をさらに含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１又は２に記載の方法。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｅ変異を導入し；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｋ変異を導入し；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドに、Ｓ１８３Ｋ変異を導入し；及び
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドに、Ｓ１７６Ｅ変異を導入する、
請求項５に記載の方法。
前記抗原結合タンパク質は、多重特異性抗体又は多重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体断片である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
１）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
２）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
３）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域のＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
４）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
５）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
６）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
７）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；又は
８）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されている、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のＦａｂ領域及び前記第２のＦａｂ領域は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている、請求項８に記載の方法。
前記抗原結合タンパク質は、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
前記第１の重鎖は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含み；及び
前記第２の重鎖は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含む、
請求項７に記載の方法。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
１）前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、
前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含むか；又は
２）前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、
前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項７に記載の方法。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、
前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、
前記軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項７に記載の方法。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、
前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、
前記軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項７に記載の方法。
前記第１の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、前記第２の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１０に記載の方法。
前記第１の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、前記第２の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１４に記載の方法。
前記第２の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、前記第１の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１０に記載の方法。
前記第２の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、前記第１の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１６に記載の方法。
多重特異性抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＦａｂ領域：
第１のエピトープに特異的に結合する第１のＦａｂ領域、及び第２のエピトープに特異的に結合する第２のＦａｂ領域を含み；
前記第１のＦａｂ領域は、
１２６位でシステインを含み且つ２２０位でシステインを欠いている第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び
１２３位でシステインを含み且つ２１４位でシステインを欠いている第１のＶＨ－ＣＬポリペプチド
を含み、
前記第２のＦａｂ領域は、
２２０位でシステインを含み且つ１２６位でシステインを欠いている第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び
２１４位でシステインを含み且つ１２３位でシステインを欠いている第２のＶＨ－ＣＬポリペプチド
を含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、多重特異性抗原結合タンパク質。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｆ１２６Ｃ変異、Ｃ２２０Ａ変異を含み；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｅ１２３Ｃ変異、Ｃ２１４Ａ変異を含む、
請求項１８に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項１８又は１９に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項１８又は１９に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；
ｉｉ）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；
ｉｉｉ）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；
ｉｖ）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質は、多重特異性抗体又は多重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体断片である、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
１）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
２）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
３）前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域のＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
４）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
５）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
６）前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；
７）前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されているか；又は
８）前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＣ末端は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドのＮ末端に、直接的に若しくはペプチドリンカーを介して接続されている、
請求項１８～２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
前記第１のＦａｂ領域及び前記第２のＦａｂ領域は、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質は、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
前記第１の重鎖は、前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含み；及び
前記第２の重鎖は、前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチド領域を含む、
請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む多重特異性抗体であり、
１）前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、
前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含むか；又は
２）前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドをさらに含み、
前記第１の軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含み、
前記第２の軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、
前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、
前記軽鎖は、前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質は、修飾された重鎖、軽鎖、及び前記第１のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含む多重特異性抗体であり、
前記修飾された重鎖は、そのＣ末端でヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端に連結されている前記第２のＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドを含み、前記修飾された重鎖は、そのＮ末端で前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に連結されている前記第１のＶＬ－ＣＬポリペプチドをさらに含み、
前記軽鎖は、前記第２のＶＬ－ＣＬポリペプチドを含む、
請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
前記第１の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、前記第２の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項２７に記載の抗原結合タンパク質。
前記第１の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、前記第２の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項３１に記載の抗原結合タンパク質。
前記第２の重鎖は、４０９位及び３９２位で負荷電アミノ酸を含み、前記第１の重鎖は、３９９位及び３５６位で正荷電アミノ酸を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項２７に記載の抗原結合タンパク質。
前記第２の重鎖は、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの各変異を含み、前記第１の重鎖は、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋの各変異を含み、アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項３３に記載の抗原結合タンパク質。
少なくとも１つのＦａｂ領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記Ｆａｂ領域は、
１２６位でシステインを含み且つ２２０位でシステインを欠いているＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド；及び
１２３位でシステインを含み且つ２１４位でシステインを欠いているＶＨ－ＣＬポリペプチド
を含み、
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、抗原結合タンパク質。
ｉ）前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｆ１２６Ｃ変異、Ｃ２２０Ａ変異を含み；
ｉｉ）前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｅ１２３Ｃ変異、Ｃ２１４Ａ変異を含む、
請求項３５に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でリシンを含み；
ｉｉ）前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でグルタミン酸を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項３５又は３６に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み；
ｉｉ）前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項３７に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、１８３位でグルタミン酸を含み；
ｉｉ）前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、１７６位でリシンを含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項３５又は３６に記載の抗原結合タンパク質。
ｉ）前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み；
ｉｉ）前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、Ｓ１７６Ｋ変異を含み；
アミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、
請求項３９に記載の抗原結合タンパク質。
前記ＶＨ－ＣＨ１ポリペプチド及び前記ＶＬ－ＣＬポリペプチドは、ＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳからなる群から選択されるリンカーを介して接続されている、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。