MXPA04003057A - Proteina 4 de enlace ul16. - Google Patents

Abstract

El ULBP4, un miembro novedoso de la familia ULBP se ha aislado y caracterizado. El ULBP4 es activador util de las celulas efectoras inmunes, particularmente de celulas NK.

Description

PROTEÍNA 4 DE ENLACE UL16 Campo de la Invención La invención se refiere en general, a un nuevo miembro de la familia (ULBP) de la proteína que enlaza UL16, ULBP4. Más específicamente, la invención se refiere a polipéptidos ULBP4 aislados y purificados, a moléculas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos, y procesos para la producción y uso de los polipéptidos ULBP.

Antecedentes de la Invención Los ULPB (proteínas que enlazan UL16) son una nueva familia de proteínas de superficie celular relacionadas con el grupo I MHC de humano. El ULBP1 se identificó como un polipéptido que enlaza a la glicoproteína (HCMV) citomegalovirus de humano, UL16 (Cosraan et al., 2001, Immunity 14:123-133). El ULBP2 y ULBP3 se descubrieron posteriormente y tienen alguna homología con el ULBPI (Id. ) . Los polipéptidos ULBP comparten algunas, pero no todas las características de las proteínas del grupo I MHC. Los ULBP tienen dominios alfa-1 y alfa-2 característicos de las proteínas del grupo I MHC, pero carecen de un dominio alfa-3 y no están asociados con la beta-2 microglobulin . Id. Algunos miembros de otra familia de proteínas del grupo I MHC no clásicas de humano; las MIC, también enlazan UL16. REF: 154633 Groh et al. (1996) PNAS USA 93: 12445. Los polipéptidos MICA y MICB comparten algunas propiedades similares con las ULBP, como se discute abajo. Los ULBP y MIC son activadores importantes de las células exterminadoras naturales (NK) , que son un componente clave del sistema inmune innato. Las células NK activadas reconocen y lisan a las células dirigidas, tales como células neoplásicas e infectadas con virus. Las células NK reconocen señales a partir de objetivos celulares vía los receptores que son específicos para las moléculas del grupo I, MHC en la célula objetivo. Estos receptores de células NK incluyen al receptor (KIR) como Ig de la célula exterminadora, Ly49 y familias del receptor NKG2. Dependiendo de la estructura del receptor, el acoplamiento con un ligando específico enviará ya sea señales de inhibición o de activación a la célula NK. Lanier (1998) , Ann Rev Immunol 16:359. Hasta últimamente, se pensó que las señales generadas por los receptores de las células NK inhibidoras (KIR) eran dominantes sobre aquellas generadas mediante cualquier receptor de activación, de modo que las células del grupo I, MHC con niveles subrregulados se exterminarían de acuerdo a la hipótesis de "auto desaparición". Ljunggren et al. (1990), Immunology Today 11:237. Sin embargo, la expresión de los ligandos de activación, ULBP o MIC en células resistentes NK, en células objetivo que expresan MHC del grupo I hace que las células sean susceptibles de eliminar células NK. Cosman et al., supra; Bauer et al (1999), Science 285:727-29. Además, se ha encontrado que cuando se administran formas recombinantes solubles de ULBP a células NK de humano, para enlazar a las células NK estimulan la citotoxicidad de las NK contra los objetivos del tumor. Kubin et al. (2001), Eur. J. Immunol . 31: 1428-37. Los ULBP y MIC transducen una señal de activación a las células NK que pueden anular una señal negativa generada por el acoplamiento de los receptores de inhibición de los antígenos del grupo I MHC. Se ha encontrado que los ULBP inducen la producción de células NK de las citocinas IFN-gamma, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta y las quimiocinas MlPI-alfa, ????-beta y 1-309. La co-estimulación de células NK con IL-12 tiene un efecto superaditivo en la producción de estos factores. Cosman et al., supra; Kubin et al., supra. La expresión MICA está sobrerregulada en ciertos tumores epiteliales, en células infectadas con HCMV y en la respuesta al estrés. Groh et al. (1996), PNAS USA 93: 12445-50; Groh et al. (1999). PNAS USA 96:6879-84. En contraste a las MIC, los mensajes de las ULBP se expresan mediante un amplio rango de células, tejidos y tumores y en varias líneas celulares (Cosman et al., supra) . Así, varios tipos de células pueden suministrar potencialmente señales mediadas por los ULBP a las células NK y ser objetivos de una eliminación mediada por el ULBP. A pesar de que las secuencias de aminoácidos de los ULBP y las MIC están relacionadas distantemente, ambas familias de proteínas suministran una señal de activación a las células NK enlazando a los heterocomplejos NKG2D/DAP10. El NKG2D es un homodimérico, una lectina tipo C que se expresa no sólo en las células NK de humano, sino también en las células T aß y células T ?d CD8+ de humano. La expresión NKG2D ha sido reportada también en células NK de murino (ratón) y en células T aß CD8+ de murino y macrófagos. Baucr, supra; Diefenbach et al. (2000), Nature Immunol . 1: 119-126). En las células T, el NKG2D actúa como un receptor coestimulador en una forma similar al CD28. Groh et al. (2001), Nature Immunol. 2:255. El dominio citoplásmico del NKG2D es corto, y la señalización está mediada a través de su asociación con la proteína adaptadora de membrana DAP10. Wu et al. (1999), Science 285:730-32. El DAP10 puede enlazar la subunidad p85 de la PI 3-cinasa y la proteína Grb2 adaptadora. Wu et al., supra; Chang et al. (1999), J. Immunol. 163:4651-54. Los polipéptidos ULBP1, 2 y 3 se enlazan a los heterodímeros NKG2D/DAP10 expresados recombinantemente . Los anticuerpos Anti-NKG2D bloquean el enlace de ULBP 1, 2 y 3 a las células NK. Cosman et al., supra Sutherland et al. (2002), J. Immunol. 168 (2) : 671-79. Esta evidencia soporta la conclusión en la que el NKG2D es el receptor expresado en las células NK de humano primarias que reconocen el ULBP. Los agentes que son efectivos para activar a las células NK, células T o a la actividad de macrófagos, para inducir la producción celular de quimiocinas y citocinas y para inducir la citotoxicidad de las célula objetivo son útiles para la lisis de la célula objetivo, particularmente para la lisis de células infectadas por patógenos y células del tumor. Los nuevos ligandos que tienen la capacidad de activar a las células NK, macrófagos, particularmente vía el complejo receptor NKG2D/DAP10 son útiles como agentes para activar las respuestas terapéuticas a partir de las células efectoras inmune, por ejemplo mediante la generación de células NK y/o eliminando células T y otras terapias dependientes de las células NK y/o células T. Los receptores NKG2D/DAP10 se expresan en células T ?d, células T CD8+ y macrófagos. Bauer et al (1999), Science 285:727-29; Diefenbach et al. (2000), Nature Immunology 1(2): 119-26. El acoplamiento de estos receptores puede estimular la proliferación de células T, citotoxicidad y producción de citocina. Groh et al. (2001), Nature Immunol . 2:255; Das et al. (2001), Immunity 15:83-93.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona ULBP4, un nuevo miembro de la familia ULBP de las proteínas. Los polipéptidos ULBP4 de la invención incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N0:2, así como los polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos sustancial a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y fragmentos útiles de los mismos. Los fragmentos útiles incluyen aquellos que pueden enlazar al N G2D. Tales polipéptidos ULBP4 pueden tener la capacidad de activar células efectoras inmunes, que incluyen células NK y células T, que expresan NKG2D. La invención proporciona también, una molécula de polinucleótidos que codifican a los polipéptidos ULBP . Las moléculas del polinucleótido de la invención incluye las siguientes: aquellas moléculas que tienen una secuencia de ácido nucleico como el que se muestra en la SEC ID NO:l; aquella que produce híbridos para la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N0:1 bajo condiciones de hibridación de alta severidad (por ejemplo, 42°C, 6X SSC, formamida al 50%); aquellas que codifican a una proteína ULBP4 que tiene una identidad de secuencia sustancial a la SEC ID NO: 2; y aquellas que tienen una identidad de secuencia de ácido nucleico sustancial con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N0:1. La invención incluye variantes y derivados del polipéptido ULBP4, que incluye formas solubles y proteínas de fusión. Las formas solubles de las proteínas ULBP son solubles en soluciones acuosas y pueden, por ejemplo, incluir un dominio extracelular y carecer de una región transmembranosa o un GPI de ancla. Las proteínas de fusión de la invención incluyen un polipéptido ULBP4 fusionado a una proteína heteróloga o péptido que confiere una función deseada. La proteína heteróloga o péptido puede facilitar por ejemplo, la purificación, oligomerización, estabilidad, secreción, o dirección del polipéptido ULBP4. Las proteínas de fusión de la invención pueden producirse por ejemplo, a partir de un constructo de expresión que contiene una molécula del polinucleótido que codifica al polipéptido ULBP4 en la estructura con una molécula del polinucleótido que codifica a la proteína heteróloga. La invención proporciona también, vectores, plásmidos, sistemas de expresión, células hospedadoras , y similares, que contienen a la molécula del polinucleótido ULBP4 de la invención. Los métodos generados mediante ingeniería genética para la producción de los polipéptidos ULBP4 de la invención incluyen la expresión de las moléculas del polinucléotido en los sistemas de expresión libre de células, en hospedadores celulares, en tejidos y en modelos animales de acuerdo a los métodos conocidos. La invención incluye además, composiciones f rmacéuticas que contienen un polipéptido ULBP sustancialmente purificado de la invención y un portador f rmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas se administran a células, tejidos o pacientes, por ejemplo, para inducir la actividad de células que expresan NKG2D/DAP10 que incluyen células NK, células T y macrófagos activados; para inducir la producción de citocinas y quimiocinas; para inducir la lisis de las células del tumor y células infectadas tales como las células infectadas viralmente aumentando la citotoxicidad de las células que expresan NKG2D/DAP10 ; y para el tratamiento terapéutico, por ejemplo, de cáncer, infecciones virales e infecciones bacterianas. También se proporcionan anticuerpos anti-ULBP4. Pueden usarse por ejemplo, los anticuerpos anti-ULBP que incluyen aquellos que enlazan a los ULBPI , ULBP2 , ULBP3 y/o ULBP4 , para dirigir agentes terapéuticos objetivo a las células que expresan ULBP, para inducir la citotoxicidad mediada por las células dependientes del anticuerpo contra las células que expresan ULBP, para submodular una respuesta inmune, y/o para purificar, identificar o asegurar la calidad de una proteína ULBP. Tales anticuerpos pueden tener una variedad de propiedades: estas pueden enlazar a los polipéptidos ULBP; ellos pueden ser de humano o humanizados; pueden ser antagónicos, es decir; pueden prevenir o inhibir la activación de las células que expresan NKG2D mediante la interacción de una proteína ULBP y NKG2D; pueden o no inhibir el enlace de la proteína ULBP al NKG2D; y/o pueden fusionarse a un agente radioactivo o citotóxico.

La invención proporciona también reactivos, composiciones y métodos que son útiles para el análisis de la actividad celular que expresa NKG2D; para el análisis del acoplamiento y activación del receptor NKG2D y para el análisis de los efectos inhibidores/estimuladores de las moléculas de señal involucradas en la respuesta del sistema inmune innato a la infección y a las células neoplásicas. Los métodos terapéuticos de la invención incluyen el uso de los polipéptidos ULBP y/o anticuerpos anti-ULBP en numerosas aplicaciones que incluyen: el tratamiento de tumores, en el que las células del tumor pueden o no expresar a las proteínas ULBP; el tratamiento de infecciones que incluyen infecciones bacterianas y/o virales; la submodulación de una respuesta inmune en pacientes que experimentan por ejemplo, un padecimiento autoinmune, un transplante o un padecimiento del intestino inflamatorio entre muchas de las posibles aplicaciones. La invención proporciona además, un método para vacunar a un paciente contra el acrecentamiento del tumor que incluye: eliminar quirúrgicamente un tumor; cultivar células del tumor a partir del tumor eliminado; transfectar las células del tumor cultivado con un ácido nucleico que codifica a la proteína ULBP4 de la reivindicación 1; irradiar las células del tumor cultivado; y reintroducir las células del tumor transfectado irradiado en el paciente.

Estas y otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la lectura de la descripción detallada y la revisión de las reivindicaciones anexadas.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra el porcentaje de citoxicidad de las células NK de murino (células efector) cuando se combinan con células objetivo, ya sea células EL4 no transfectadas etiquetadas con Cr51 o células EL4 etiquetadas con Crsl que han sido transfectadas con ácidos nucleicos que codifican a la proteína ULBP indicada, como una función de la proporción de la célula efector : célula objetivo. La figura 2 muestra el porcentaje de citoxicidad de las células NK de humano (células efector) cuando se combinan con células objetivo, ya sea células EL4 no transfectadas etiquetadas con Cr51 o células EL4 etiquetadas con Cr51 que han sido transfectadas con ácidos nucleicos que codifican a la proteína ULBP indicada, como una función de la proporción de la célula efector : célula objetivo. La figura 3 muestra el tamaño del tumor medio como una función de los días posteriores a la inyección de células EL4 transfectadas con ácidos nucleicos que codifican a las proteínas indicadas en ratones tipo salvaje. La figura 4 muestra el tamaño del tumor como una función de como una función de los días post inyección tanto de células EL4 transfectadas como de células EL4 no transfectadas con ácidos nucleicos que codifican a las proteínas indicadas en ratones scid.

Breve Descripción de las Secuencias La SEC ID NO : 1 es una secuencia del ácido nucleico que codifica al ULBP4. La SEC ID NO : 2 es una secuencia del aminoácido codificada por la SEC ID N0:1. La SEC ID NO : 3 es una secuencia del aminoácido del ULBP1. La SEC ID N0-.4 es una secuencia del aminoácido del ULBP2. La SEC ID NO : 5 es una secuencia del aminoácido del ULBP3. La SEC ID NO: 6 es una secuencia del aminoácido para un cADN descrito en la WO 9931236. La SEC ID NO : 7 es un cebador del ácido nucleico La SEC ID NO: 8 es un cebador del ácido nucleico. La SEC ID NO: 9 es un segmento 3' de la SEC ID N0:1.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones : Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de ciertos términos usados frecuentemente aquí y no significan limitar el alcance de la presente descripción. "Activar" una célula efectora inmune tal como una célula T o célula NK, significa estimular a la célula para acoplarse en una respuesta inflamatoria que puede incluir, por ejemplo, lisis de células objetivo (o enriquecimiento de la citotoxicidad de la célula efector inmune) y/o secreción de citocinas y/o quimiocinas inflamatorias. Las células efectoras inmunes pueden ser activadas "in vitro" (es decir, aún en el cultivo celular) , "in vivo" (es decir, aún las células forman parte de un mamífero viviente) , y/o "ex vivo" (es decir, activadas aún en el cultivo pero devueltas después a un mamífero viviente) . "akt" se refiere a una proteína serina/treonina cinasa involucrada en la señalización anti-apoptótica dentro de las células. Blume-Jensen et al. (2001), Nature 411 (6835) : 355-365. Las técnicas ilustrativas para determinar la actividad de la proteína serina/treonina cinasa se muestran en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . (Wiley & Sons, New Cork, (1998) actualizada trimestralmente) . La activación del Akt puede ensayarse mediante el inmunomanchado mediante la forma fosforilada activada de la proteína. Un anticuerpo para la Akt (Ser473) se encuentra disponible a partir de la Tecnología de Señalización Celular (Beverly, MA) . Además, un kit para evaluar la activación de la Akt está disponible a partir de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . "Aminoácido" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos que se presentan naturalmente, así como a cualquiera de las secuencias de aminoácidos modificados. Las modificaciones pueden incluir procesos naturales tales como el procesamiento post-traduccional , o pueden incluir modificaciones químicas que son conocidas en la técnica. Las modificaciones incluyen pero no se limitan a: fosforilación, ubiquitinación, acetilación, amidación, glicosilación, unión covalente de flavina, ADP-ribosilación, reticulación, yodación, mutilación y similares. "Anticuerpo" se usa aquí en su sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos biespecífieos humanizados, quiméricos, humanizados, de cadena doble o simple, policlonales y monoclonales generados por ingeniería genética y nativos, y fragmentos de estos que retienen la actividad que enlaza antígenos. Los fragmentos incluyen Fab, Fe y Fv. "Antisentido" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son complementarias para dirigir la secuencia de polinucleótidos "sentido" . "Porción de direccionamiento celular" se refiere a cualquier señal en un polipéptido, ya sea que se presente naturalmente o generado por ingeniería genética, usados para dirigir el polipéptido a una célula. Los radicales de dirección incluyen ligandos que enlazan a un antígeno celular o receptor, tales como anticuerpos y ligandos del receptor. Ejemplos específicos de pares de ligandos/receptores incluyen el factor de crecimiento epidermal (EGF) y el receptor EGF, el anticuerpo anti-PSI y el antígeno PS1 presente en las células del cáncer de próstata y similares. Muchos de tales pares de ligandos/receptores de células específicas son conocidos y son útiles en la presente invención, por ejemplo, en las proteínas de fusión para suministrar polipéptidos ULBP a una célula objetivo. "Complementarias" o "complementariedad" se refiere a la capacidad de un polinucleótido en una molécula de polinucleotidos para formar un par base con otro polinucleótido en una segunda molécula de polinucleotidos. Por ejemplo, la secuencia A-G-T es complementaria a la secuencia T-C-A. La complementariedad puede ser parcial, en la que algunos de los polinucleotidos se emparejan de acuerdo con el apareamiento base, o completa, cuando todos los polinucleótidos se emparejan de acuerdo al apareamiento base.

"Expresión" se refiere a la transcripción y, opcionalmente, a la traducción que se presenta dentro de una célula hospedadora. El nivel de expresión de una molécula del polinucleótido en una célula hospedadora puede estar determinada en base a la cantidad del mA N correspondiente que está presente dentro de la célula ó a la cantidad de la proteína codificada por la molécula de ADN producida por la célula hospedadora (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88) . "Fe" o "Polipéptido Fe" se refiere a ambas formas mutantes y nativas de la región Fe de un anticuerpo que contiene uno o más de los dominios CH de la región Fe, incluyendo las formas truncadas de polipéptidos Fe que contienen la región de articulación que promueve la dimerización. Por ejemplo, los polipéptidos Fe derivados de anticuerpos IgG, que incluyen pero no se limitan a los anticuerpos IgGl, IgG2 e IgG3 pueden usarse en las proteínas de fusión de la invención. Un polipéptido Fe adecuado descrito en la solicitud WO 93/10151 de PCT (incorporada aquí por referencia) , es un polipéptido de cadena simple que se extiende a partir de la región de articulación N-terminal al término C nativo de la región Fe de un anticuerpo IgGl de humano. Otro polipéptido Fe útil es la muteína Fe descrita en la patente norteamericana 5,457,035 y en Baum et al., ((1994), EMBO J. 13:39992-4001). La secuencia de aminoácidos de este muteína es idéntica a la secuencia Fe nativa presentada en la WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. El muteína muestra una afinidad reducida para los receptores Fe.

"Proteína de fusión" se refiere a una primera proteína enlazada a una segunda proteína heteróloga. Preferiblemente, la proteína heteróloga se fusiona vía técnicas de ingeniería genética, tal que la primera y segunda proteínas se expresen en la estructura. La proteína heteróloga puede otorgar una característica deseada a la proteína de fusión, por ejemplo, una señal de detección, estabilización o estabilidad aumentada de la proteína en una célula, facilitar la oligomerización, facilitar la purificación de la proteína de fusión, dirigir un tejido o célula deseados, o una actividad biológica adicional tal como por ejemplo, la activación de las células efectoras inmunes. Ejemplos de proteínas heterólogas útiles en las proteínas de fusión de la invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones de las mismas, etiquetas de péptido tales como etiquetas de histidina (6-His) , cremallera de leucina, citocinas, factores de crecimiento, radicales que dirigen a las células, péptidos de señal, agentes terapéuticos y similares. "Generados por ingeniería genética" se refiere a cualquier método recombinante de ADN o ARN usado para crear una célula hospedadora eucariótica que expresa una proteína objetivo con niveles elevados, con niveles reducidos o en forma mutada. En otras palabras, una molécula de polinucleótidos recombinantes se ha introducido dentro de la célula hospedadora, alterando así las células para alterar la expresión de la proteína de fusión. Los métodos y vectores para generar células hospedadoras por ingeniería genética son bien conocidos en la técnica; por ejemplo, se ilustran varias técnicas en la técnica; por ejemplo, se ilustran varias técnicas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1998, actualizada trimestralmente) . Las técnicas de generación por ingeniería genética incluyen pero no se limitan a los vectores de expresión, recombinación homologa dirigida y activación del gen (ver por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,272,071 por Chappel) y trans activación mediante los factores de trascripción generados por ingeniería genética (ver por ejemplo, Segal et al., Proc Nati Acad Sci USA 96 (6) : 2758-63) . "Homología" se refiere a un grado de complementariedad entre los polinucleotidos que tienen un efecto significativo en la eficiencia y resistencia de hibridación entre las moléculas del polinucleótido . "Célula hospedadora" o "células hospedadoras" se refiere a células que expresan una molécula de polinucleótido heteróloga. Las células hospedadoras de la presente invención expresan polinucleotidos que codifican ULBP4 o expresan un receptor que activa a las células para responder al ULBP4. Ejemplos de células hospedadoras adecuadas útiles en la presente invención incluyen pero no se limitan a células de insectos y de mamíferos. Ejemplos específicos de tales células incluyen células de insecto SF9 (Summers and Smith, 1987, Texas Agricultura Experiment Station Bulletin, 1555) , células de riñon embriónicas de humano (293 células) , células de ovarios de hámster chino (CHO) (Puck et al., 1958, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 60:1275-1281), células de carcinoma cervical de humano (HELA) (ATCC CCL 2) , células de hígado de humano (Hep G2) (ATCC HB8065) , células de cáncer de mama humanas (MCF-7) (ATCC HTB22) , células de carcinoma de colon humano (DLD-1) (ATCC CCL221), células Daudi (ATCC CRL-213), células CV-1 y similares. "Hibridación" se refiere al apareamiento de polinucleótidos complementarios durante un periodo de alineamiento. La resistencia de la hibridación entre las dos moléculas de polinucleótidos está impactada por la homología entre las dos moléculas, severidad de las condiciones involucradas, la temperatura de fusión del híbrido formado y la relación G:C dentro de los polinucleótidos. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones y dirección de la hibridación para idear las condiciones adecuadas se establecen en Sambrook, J., E.F. Frisch, and T. Maniatis ( (1989) , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Capítulos 9 y 11) y en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds . , John iley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4). Estos parámetros y condiciones adecuadas pueden determinarse fácilmente por aquellos expertos en la técnica en base a por ejemplo, la longitud y/o composición base del polinucleótido . Las condiciones para la hibridación pueden ser moderadas o de alta severidad. Por ejemplo, las condiciones de severidad altas pueden incluir una solución de prelavado que contiene 5 x SSC, SDS al 0.5%, EDTA al 1.0 mM (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55 °C para la hibridación del ARN-ARN (o aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42°C para una hibridación de ADN-ADN) y condiciones de lavado de aproximadamente 60°C en 0.5 x SSC, SDS al 0.1%. Generalmente, las condiciones de severidad altas se definen como las condiciones de hibridación de arriba, pero con lavados de aproximadamente 68 °C, 0.2 x SSC, SDS al 0.1%. SSPE (1 x SSPE es NaCl 0.15 M, Na¾P04 10 mM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) pueden sustituirse por SSC (1 x SSC es NaCl 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en la hibridación y amortiguación por lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de completar la hibridación. Se entenderá que la temperatura de lavado y la concentración de la sal del lavado puede ajustarse como sea necesario para lograr un grado deseado de reacciones y estabilidad doble, conocida por aquellos en la técnica y descrita adicionalmente abajo.

Cuando se hace híbrido un ácido nucleico para un polinucleótido objetivo de la secuencia no conocida. Cuando se hacen híbridos los ácidos nucleicos de la secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los ácidos nucleicos e identificar la región o regiones de la complementariedad de la secuencia óptima. La temperatura de hibridación para híbridos anticipados para ser menor de 50 pares base en longitud, deberá ser de 5 a 12 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo a las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores a 18 pares base en longitud, Tm (°C)= 2 ($ de A + bases T) + 4 ($ de G + bases C) . Para híbridos arriba de 18 pares base en longitud, Tm (°C) = 81.5 + 16.6 (log10 [Na+] + 0.41 (% de G + C)-(600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ([Na +] para 1 x SSC = 0.165 M) . "Identidad" se refiere a una comparación entre los pares de ácido nucleico o moléculas de aminoácido. Se muestran los métodos para determinar la secuencia de identidad. Un programa de computadora preferido ejemplar es el programa de aplicación Wisconsin versión 10.0 (GCG; Madison, I) del Grupo de Computadoras Genéticas, 'GAP' (Devereux et al., 1984, Nucí. Acids Res. 12:387; Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482-489): Los parámetros predeterminados preferidos para el programa 'GAP' incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para los nucleótidos y la matriz de comparación del aminoácido pesado de Gribskov and Burgess, Nucí . Acids Res. 14:6745, 1986, descrito por Schwartz and Dayhoff. eds . , Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, Fundación para la Investigación Biomédica Nacional, pp. 353-358, 1979; u otras matrices de comparación semejantes; (2) una penalidad de 30 para cada intervalo y una penalidad adicional de 1 para cada símbolo en cada intervalo para las secuencias de aminoácido, o penalidad de 50 por cada intervalo y una penalidad adicional de 3 para cada símbolo en cada intervalo para las secuencias de nucleótido; (3) una no penalidad para los intervalos finales; y (4) una no penalidad máxima para intervalos prolongados. "Aislados" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que se ha separado de al menos un contaminante (polinucleótido o polipéptido) con el que se asocia normalmente. Por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislado se encuentra en un contexto o en una forma distinta a la que se encuentra en la naturaleza. "JAK2" se refiere a un miembro de la familia Janus de la tirosina cinasa conocida, entre otras cosas, para formar complejos con subunidades del receptor de citocina, modular los transductores de señal y activadores de la trayectoria de la señalización de transcripción (STAT) , y que esta involucrada en los eventos metabólicos de regulación dentro de las células objetivo (Carter-Su et al., 1998, .Recent Prog. Horm. Res. 53:61-83). Las técnicas ilustrativas para determinar la actividad de la tirosina cinasa se encuentran en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . , eds. ( iley & Sons, New York, 1998, actualización trimestral) . "Secuencia del ácido nucleico" se refiere a la orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico . La orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de una cadena de polipéptidos . La secuencia de desoxirribonucleótidos codifica así a la secuencia de aminoácidos . "Polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, ó una mezcla de los mismos. Ejemplos de polinucleótidos en el contexto de la presente invención incluyen ADN de hebras simples y dobles, ARN de hebras simples y dobles, y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN de hebras simples y dobles. Los polinucleótidos de la presente invención pueden contener uno o mas nucleótidos modificados.

"Proteína" , "péptido" y "polipéptido" se usan intercambiablemente para denotar un polímero de aminoácido o un conjunto de dos o mas polímeros de aminoácido unidos o entrelazados . "Pureza" o "purificados" se refiere a una proteína objetivo que está libre de al menos 5 a 10% de proteínas contaminantes. La purificación de una proteína a partir de proteínas contaminadas pueden realizarse usando técnicas conocidas que incluyen, la precipitación por sulfato de amonio o etanol, cromatografía de intercambio de cationes o aniones, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Varias técnicas de purificación de proteínas se ilustran en Cúrrente Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . ( iley & Sons, new Cork, 1998 actualizaciones trimestrales) .

"Marcador seleccionable" se refiere a un marcador que identifica a una célula que está sometida a un evento de ARN o AD recombinante . Los marcadores seleccionables incluyen por ejemplo, genes que codifican antimetabolitos resistentes tales como la proteína DHFR que confiere resistencia al metotrexato ( igler et al. (1980), Proc Nati Acad Sci USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981), Proc Nati Acad Sci USA, 78:1527-1531), la proteína GPT que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg (1981) , Proc Nati Acad Sci USA, 78:2072-2076), el marcador de resistencia a la neomicina que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Calberre Garapin et al. (1981), J. Mol Biol 150: 1-14), la proteína Hygro que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al. (1984), Gene 30: 147-156) y el marcador de resistencia Zeocin™ (Invitrogen) . Además, pueden emplearse la timidina cinasa del virus del herpes simplex, fosforibosiltransferasa hipoxantina-guanina, los genes de la fosforibosiltransferasa de adenina en las células tkf, hgprt" y aprt" respectivamente. "STAT5" se refiere a un miembro de los activadores y transductores de señal de la familia de transcripción (STAT) de factores de trascripción conocidos por activarse mediante las JAK cinasa, translocalizado en el núcleo y participar en la regulación transcripcional enlazando sitios de ADN específicos. Las técnicas ilustrativas para determinar la actividad STAT5 puede realizarse a través de cualquier número de técnicas bien conocidas que incluyen ensayos que enlazan ADN, ensayos reporteros dependientes de STAT5, 32P-etiquetado de STAT5 y similares, como se ilustra en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . (Wiley & Sons, New York, 1998 actualizaciones trimestrales) . "Severidad" se refiere a las condiciones (temperatura, resistencia iónica, solventes, etc.) bajo las cuales se presenta la hibridación entre los polinucleótidos . Una reacción de hibridación conducida bajo condiciones de severidad alta es una que solo se presentará entre las moléculas del polinucleótido que tienen un grado alto de apareo base complementario (85% a 100% de identidad) . Una reacción de hibridación conducida bajo condiciones de severidad moderadas es una que se presentará entre las moléculas del polinucleótido que tienen un grado intermediario de apareo base complementario (50% a 84% de identidad) (Sambrook, J. , E. F. Fritsch, and T. Maniatis 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , capítulos 9 y 11; y Current Protocols ín Molecular Biology, F. . Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3 a 6.4). "ULBP" se refiere a una familia de moléculas relacionadas con el grupo I MHC que tienen un organización característica que incluye una secuencia de señal N-terminal localizada centralmente en los dominios alfa-1 y alfa-2 y un dominio de asociación de la membrana celular C-terminal (Tabla 3) . Los miembros de la familia ULBP son ligandos para el receptor celular efector NKG2D/DAP10 y son conocidos por células NK activadas. Como se usa aquí, "polipéptido ULBP" incluye variantes activas y fragmentos que tienen actividad para activar células NK. Los miembros de la familia ULBP se aparean para producir al menos algunos de sus efectos en las células NK activando las JAK2 , STAT5 , ERK MAP cinasa y Akt/PKB (Sutherland et al., Junio 2001, Immunol . Rev. 181 : 185-192) . "Variante" como se usa aquí, significa una molécula de polipéptido o polinucleótido que difiere de una molécula de referencia. Las variantes pueden incluir cambios de nucleótidos que resultan en sustituciones, eliminaciones, fusiones, o truncamiento en el aminoácido, en el polipéptido de variante que resulta cuando se compara al polipéptido de referencia. Como se usa aquí, "variante unida o empalmada" se refiere a un polinucleótido producido a través de un empalme alternativo de un polinucleótido precursor para producir un transcriptor que tiene porciones discretas de la secuencia del polinucleótido precursor eliminado. "Vector", "vector extra-cromosomal" o "vector de expresión" se refiere a una primer molécula del polinucleótido usualmente de hebra doble, que puede insertarse en una molécula del polinucleótido secundaria, por ejemplo, un polinucleótido heterologo o extranjero. La molécula del polinucleótido heterologo puede o no encontrarse naturalmente en la célula hospedadora y puede ser por ejemplo, uno o mas copias adicionales del polinucleótido heterologo que se presenta naturalmente en el genoma hospedero. El vector se adapta para transportar la molécula del polinucleótido extranjero en una célula hospedadora. Una vez en la célula hospedadora, el vector puede ser capaz de integrarse dentro de los cromosomas de la célula hospedadora. El vector puede contener opcionalmente elementos adicionales para seleccionar células que contienen la molécula del polinucleótido integrada así como elementos para promover la transcripción del mARN del ADN transfectado y la traducción de una proteína del mARN. Ejemplos de vectores útiles en los métodos de la presente invención incluyen pero no se limitan a, plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, retrovirus y cromosomas artificiales.

La Familia ULBP La familia de ULBP de ligandos es un grupo de receptores de superficie celular expresados en un amplio rango de células, tejidos y tumores, que incluyen tejido del tumor y tejido inmune (Cosman et al., 2001, supra) . Los ULBP1 , ULBP2 y ULBP3 comparten del 55% al 60% de la identidad de secuencia de los aminoácidos, así como otras proteínas de superficie celular relacionadas con el grupo I MHC que poseen dominios estructurales alfa-1 y alfa-2. A diferencia de las proteínas de superficie celular relacionadas del grupo I MHC tradicionales, los ULBP carecen del dominio alfa-3 y por lo tanto, no se asocian con la beta-2-microglobulina . Cada uno de los ULBP1, ULBP2 y ULBP3 es glicosilfosfatidilinositol (GPI) -enlazado a la membrana celular, como el comparado a las proteínas del grupo I MHC, enlazadas a la transmembrana. Los ULBP son una familia de ligandos relacionados con el grupo I MHC, involucrados en la modificación de la actividad de la célula efector inmune, particularmente la actividad de las células T y NK. Las proteínas de ULBP se expresan en muchas, pero no todas las células y líneas celulares de una variedad de tejidos. Cos an et al., supra. Las infecciones pueden sobreregular la expresión de los ligandos NKG2D. Por ejemplo, la infección bacteriana puede sobreregular la expresión de MICA, un ligando NKG2D. Das et al. (2001), Inmunidad 15: 83-93; Tiene et al. (2002), Proc . Nati. Acad. Sci. 99(5) :2977-82. Aunque los ULBP son similares a los antígenos del grupo I MHC, estos pueden tener una función en la supervisión inmune que es similar a la de los antígenos relacionados del grupo I MHC no tradicionales, MICA y MICB. El tratamiento de las células NK con formas triméricas solubles de ULBP1, ULBP2 o ULBP3 estimulan la producción de células NK del IFN-gama, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, y quimiocinas ????-alfa, ????-beta y 1-309 (Cosman (2001), Inmunidad 14:123-133, kubin et al., supra) . Además, la combinación de IL-12 con un miembro de la familia ULBP tiene un efecto superaditito en la producción de GM-CSF y TNF-beta, y un efecto sinérgico fuerte en la producción de 1-309. Los miembros de la familia ULBP transducen una señal estimuladora dominante a las células NK, superando las señales inhibidoras generadas por el acoplamiento del grupo I MHC a las KIR expresadas. Los miembros de la familia ULBP son actores centrales en la activación de las células NK y están involucradas en otras células inmunes que tienen el complejo receptor NKG2D/DAP10, por ejemplo, las células T y los macrófagos activados. Últimamente, las proteínas ULBP son útiles en las terapias y los tratamientos dirigidos para estimular a las células efector inmune, por ejemplo, en las células NK, para eliminar bacterias, células infectadas viralmente y células de tumores, así como para estimular a las células NK para producir citocinas y quimiocinas que activan a otras células efector del sistema inmune. La inhibición de la expresión ULBP o acoplamiento de los receptores NKG2D por ejemplo, mediante un anticuerpo anti-ULBP, fragmento ULBP no activo, oligómero ULBP o inhibidor análogo de ULBP puede inhibir la activación de las células NK. La inhibición de la activación de las células NK es terapéuticamente útil, por ejemplo, para reducir la respuesta inmune al transplantar el órgano y en el tratamiento de los padecimientos autoinmunes.

ULBP4 Como se describe de manera más completa en los ejemplos de abajo, ha sido ahora aislado y purificado, un miembro de la familia de los ULBP, ULBP4. La secuencia de aminoácido predicha del ULBP4 (SEC ID NO : 2 ) tiene una organización que es característica de la familia ULBP de las proteínas. Tal como los ULBP1, ULBP2 y ULBP3 , el polipeptido ULBP4 posee una secuencia de señal, dominios alfa-1 y alfa-2 localizados centralmente y una porción de asociación con la membrana C-terminal . El ULBP4 nativo contiene una transmembrana que enlaza al dominio, en lugar del dominio GPI encontrado en los ULBP1, ULBP2 y ULBP3. Tal como los ULBP1, ULBP2 y ULBP3 , el polipeptido ULBP4 carece del dominio alfa- 3 encontrado en las moléculas del grupo I MHC tradicionales. El ULBP4 como se muestra abajo, también liga a los ligandos ULBP conocidos (ver el Ejemplo 3). Estas características funcionales y estructurales identifican a un miembro de la familia ULBP de las proteínas . Los polipéptidos ULBP se expresan en numerosas células objetivo, enlazan y activan el complejo del receptor NKG2D/DAP10 localizado en las células N así como a las células efector del sistema inmune tales como las células T aß y las células T ?d CD8+. El enlace de ULBP al complejo NKG2D/DAP10 activa a las JAK2 , STAT5, ERK MAP cinasa y las trayectorias de transducción de la señal Akt (Sutherland et al. (2001), supra) . La activación de estas trayectorias resulta en la activación de las células NK. Últimamente, la activación de ULBP de las células NK estimulan la citotoxicidad de las células NK hacia las células que expresan ULBP. Además, la activación de ULBP de la producción de células NK de citocinas y quimiocinas apoya la respuesta inmune a las infecciones virales y la supervisión del tumor (Cosman et al., 2001 supra) . Tal como otros miembros de la familia ULBP, el nuevo ULBP4 de la presente invención enlaza al complejo receptor estimulador de las células NK, NKG2D/DAP10. El ULBP4 vía el enlace de los receptores NKG2D en las células efector inmune que incluyen células NK, células T y macrófagos, proporcionan una señal estimuladora a las células efector para inducir la producción de citocinas y quimiocinas, y para inducir la eliminación de las células objetivo, particularmente de las células del tumor y las células infectadas.

Polipéptidos ULBP4 Los polipéptidos ULBP4 de la invención incluyen polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra abajo en el Ejemplo 1 [SEC ID N0:2], así como variantes y derivados que incluyen fragmentos, que tienen una identidad sustancial a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y que retienen cualquiera de las actividades funcionales de las proteínas ULBP tales como enlazar a UL16 y/o a los receptores NKG2D. La actividad del polipéptido ULBP puede determinarse fácilmente por ejemplo, sometiendo a la variante, derivado o fragmento del ULBP a un ensayo de enlace como se describe abajo en el Ejemplo 3. Como se muestra abajo en el ejemplo 2, tabla 3, el polipéptido ULBP4 aislado incluye una región hidrofóbica N-terminal que funciona como un péptido de señal, que tiene una secuencia de aminoácidos que se predice para iniciar con el Metí, y terminar en un aminoácido en el rango de Ala23 a Ser32, opcionalmente a Gly30. El sobrante de la proteína contiene un dominio alfa-1 que tiene una secuencia de aminoácidos que inicia aproximadamente en His31 de la SEC ID NO: 2 o en otros aminoácidos a partir de la Leu24 a la Ser 32 de la SEC ID NO: 2 y que se extiende aproximadamente a la ASP116; seguido por un dominio alfa-2 que inicia aproximadamente en el aminoácido Proll7 y se extiende aproximadamente la Thr207; y después un dominio de transmembrana, que inicia aproximadamente en el aminoácido Trp227 y que se extiende aproximadamente en el aminoácido Trp248 seguido por la cola C-terminal. Los ULBP de 1 a 3 no tiene el dominio de transmembrana predicho, pero en su lugar, tiene una porción de señal de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) que enlaza estas moléculas a la membrana celular vía un enlace GPI . Los derivados de ULBP4 incluyen por ejemplo, polipéptidos ULBP4 modificados por una conjunción agregativa o covalente con otros radicales químicos tales como los grupos glicosilo, grupos polietilen glicol (PEG) , lípidos, fosfatos, grupos acetilo y similares y polipéptidos ULBP4 que tienen eliminaciones terminales. La secuencia de aminoácido de los polipéptidos ULBP4 de la invención es opcionalmente al menos aproximadamente 92% idéntica, al menos aproximadamente 93% idéntica, al menos aproximadamente 94% idéntica, al menos aproximadamente 95% idéntica, al menos aproximadamente 96% idéntica, al menos aproximadamente 97% idéntica, al menos aproximadamente 98% idéntica o al menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácido ULBP4 mostrada arriba en la Tabla 1 y la SEC ID N0:2. El porcentaje de identidad, así como la homología de terminación (ver la definición de arriba) puede determinarse fácilmente mediante por ejemplo, comparando las dos secuencias del polipéptido usando cualquiera de los programas de computadora empleados comúnmente para este propósito tal como el programa GAP (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 de UNIX, Grupo de Computadoras Genéticas (GCG) , University Research Park, Madison, Wisconsin) , que usa el algoritmo de Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482-489. Los parámetros predeterminados preferidos para el programa 'GAP' para comparar proteínas incluye: (1) la matriz de comparación del aminoácido pesado de Gribskov and Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, descrito por Schwartz and Dayhoff, eds . , Atlas of Polipeptide Sequence and Structure, Fundación para la Investigación Biomédica Nacional, pp. 353-358, 1979 u otras matrices de comparación similares; (2) una penalidad de 30 por cada intervalo y una penalidad adicional de 1 por cada símbolo en cada intervalo para las secuencias de aminoácido; (3) ninguna penalidad de 30 para los intervalos de extremo; y (4) ninguna penalidad máxima para los intervalos prolongados. Pueden usarse también, otros programas usados por aquellos expertos en la técnica de comparación de secuencias. Los polipéptidos ULBP de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada y preferiblemente están purificados sustancialmente . Los polipéptidos pueden recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante métodos conocidos que incluyen por ejemplo, sulfato de amonio o precipitación de etanol, cromatografía intercambio de catión o anión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina y/o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .

Variantes Las variantes del polipéptido dentro del alcance de la invención pueden contener conservadoramente aminoácidos sustituidos, esto significa que uno o mas aminoácidos pueden reemplazarse mediante un aminoácido que no altera la estructura secundaria y/o terciaria del polipéptido. Tales sustituciones pueden incluir el reemplazamiento de un aminoácido, mediante un residuo que tiene propiedades fisicoquímicas similares, tales como sustituir un residuo alifático (le, Val, Leu o Ala) por otro, o sustituciones entre los residuos Lys y Arg, residuos ácidos Glu y Asp, residuos de amida Gln y ASn, residuos de hidroxilo Ser y Tyr o residuos aromáticos Phe y Tyr. Los intercambios de aminoácidos fenotípicamente silentes se describen de manera más completa en Bowie et al. ((1990), Science 247: 1306-1310) . Además, las variantes de polipéptido ULBP4 funcional incluyen aquellos que tienen sustituciones de aminoácido, eliminaciones o adiciones a la secuencia de aminoácido fuera de las regiones funcionales de la proteína, por ejemplo, fuera de los dominios alfa-1 y alfa-2. Los ULBP1, ULBP2, ULBP3 y ULBP4 pueden alinearse para revelar aminoácidos comunes a todas las cuatro proteínas. Ver la tabla 3 de abajo. Un experto en la técnica comprenderá que los aminoácidos conservados entre las proteínas con una función biológica similar y una estructura total similar son probablemente más importantes para la función biológica en la que los aminoácidos no son conservadores . Ejemplos de tales aminoácidos conservados incluyen por ejemplo, posiciones 44, 49, 50, 61, 62, 64, 77, 84, 87 y 94 de la secuencia ULBP4. Ver la tabla 3 de abajo. La alteración de los residuos no conservados, especialmente la alteración conservativa, es por lo tanto, más probable que produzca variantes biológicamente funcionales que una alteración de los residuos conservados. Además, las alteraciones predichas perturban sustancialmente la estructura tridimensional del ULBP4 también sería probable para perturbar la función biológica. Por lo tanto, las alteraciones en los aminoácidos no conservados que no perturban sustancialmente la estructura tridimensional predicha del ULBP4 tienen mayor probabilidad para producir variantes biológicamente funcionales. La estructura dimensional puede ser evaluada analizando una secuencia de aminoácidos con un programa que enhebra a la proteína, que recubre una secuencia de aminoácido de interrogación sobre la representación estructural del Banco de Datos de la Proteína. Jaroszewski et al. (1998), Pro. Sci. 7: 1431-40- Tal programa que enhebra a la proteína es el GeneFold (Tripos, Inc., St. Louis, Missouri; Berman et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28:235-42). La modificación de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos ULBP4 puede realizarse mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse en lugares particulares mediante la mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos (Walter et al., (1986), Gene 42: 133-139; Bauer et al. (1985), Gene 37: 73-81; Smith et al., Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, (1981); y la patente norteamericana No. 4,518,584; y la patente norteamericana No. 4,737,462). Los polipéptidos ULBP4 que incluyen variantes y fragmentos, pueden ser al menos 20 aminoácidos largos, opcionalmente al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 160, 180, 200 o 220 aminoácidos largos. Es posible que algunas formas de proteínas ULBP que incluyen ULBP1, ULBP2 , ULBP3 y/o fragmentos ULBP4, variantes, y/o proteínas de fusión puedan ser antagonistas ULBP. Tal antagonista ULBP puede bloquear o inhibir los efectos de una proteína ULBP de activación normal. Por ejemplo, una forma antagonista de una proteína ULBP puede bloquear o inhibir la activación de células efector inmune mediante proteínas ULBP capaces de activar células NK. Tal antagonista puede funcionar enlazando NKG2D de tal forma que la señal inflamatoria que resulta normalmente de tal enlace no se presente. En tal enlace, la proteína ULBP antagonista puede bloquear el acceso de otra, activar los ligandos al NKG2D, resultando así en la inhibición de los efectos de estos ligandos. Alternativamente, una forma antagonista de una proteína ULBP puede bloquear o inhibir la célula efector inmune mediante las proteínas ULBP enlazando al NKG2D y provocando de este modo que el NKG2D se vuelva internalizada sin activar la célula efector inmune.

Proteínas de Fusión Las variantes y derivados del polipéptido ULBP4 incluyen, por ejemplo, polipeptidos ULBP4 solubles, así como proteínas de fusión formadas de un polipéptido ULBP4 (que incluyen fragmentos ULBP4 y variantes) y un polipéptido heterologo. Los polipéptidos heterólogos incluyen aquellos que facilitan la purificación, oligomerización, estabilidad o secreción de los polipéptidos ULBP . Otros polipéptidos heterólogos incluyen radicales objetivo que facilitan la liberación o suministro de ULBP4 a un tejido o célula y radicales de polipéptidos que facilitan una respuesta celular efector inmune mediante por ejemplo, atraer o activar la célula efector inmune. Las proteínas de fusión de la invención contienen un polipéptido ULBP enlazado a un polipéptido heterologo. El polipéptido heterologo puede conferir una característica a la proteína de fusión tal como la estabilidad, detección, dirección y similares. Los polipéptidos ULBP4 pueden fusionarse a los polipéptidos heterólogos para facilitar la purificación. Muchos péptidos heterólogos disponibles (etiquetas de péptido) permiten el enlace selectivo de la proteína de fusión a una pareja de enlace. Los ejemplos no limitantes de las etiquetas de péptido incluyen 6-His, tioredoxina, hemaglutinina, GST, y la etiqueta de al secuencia de señal Omp A. Una pareja de enlace que reconoce y enlaza al péptido heterólogo puede ser cualquier molécula o compuesto que incluye iones metálicos (por ejemplo, columnas de afinidad metálicas) , anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o cualquier proteína o péptido que enlaza preferiblemente al péptido heterólogo, para permitir la purificación de la proteína de fusión. Lo polipéptidos ULBP4 pueden modificarse para facilitar la formación de oligómeros ULBP4. Por ejemplo, los polipéptidos ULBP4 pueden fusionarse a los radicales de péptido que promueven la oligomerización, tales como por ejemplo, las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos del fragmento del anticuerpo, por ejemplo, los polipéptidos Fe. Si un radical de péptido promueve la oligomerización cuando se fusiona a otra proteína provoca la formación de dímeros, trímeros, y/o oligómeros de orden elevado. Las técnicas para preparar estas proteínas de fusión son conocidas y se describen por ejemplo en la WO 99/31241 y en Cosman et al. ((2001). Inmunidad 14: 123-133). La fusión de un polipéptido Fe ofrece la ventaja adicional de facilitar la purificación mediante cromatografía de afinidad sobre las columnas de la proteína A o la proteína G. La fusión a una cremallera de leucina (LZ) por ejemplo, una repetición heptada repetitiva frecuentemente de cuatro a cinco residuos de leucina entremezclados con otros aminoácidos, se describe en Landschultz et al. ((1998), Science, 240:1759)). Los polipéptidos ULBP, que incluyen ULBPl, ULBP2 , ULBP3 y/o ULBP4 pueden modificarse para suministrar células dirigidas. Por ejemplo, los polipéptidos ULBP pueden fusionarse a un ligando que enlaza un antígeno de la célula del tumor específico tal como Her2, CEA, MUC-1, y similares o un antígeno de la célula infectada viralmente específico tales como el CD. El ligando puede ser por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza específicamente al antígeno celular, por ejemplo, el anticuerpo anti-Her2 y similares. Una molécula que comprende un polipéptido ULBP tal como un ULBPl, ULBP2, ULBP3 o ULBP4 , y un ligando que enlaza un antígeno de células de tumor específico que puede comprender además, una citocina que puede actuar como un quimioatrayente y/o un activador de una célula que expresa NKG2D. Tal molécula puede atraer células que expresan NKG2D a las células del tumor e incrementar la actividad citolítica de las células que expresan NKG2D. Por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un polipéptido ULBP, un anticuerpo que enlaza un antígeno específico celular del tumor y el IL-15 puede estimular a las células NK para matar a las células del tumor vía ambos, el polipéptido ULBP y el IL-15. Las proteínas de fusión de la invención incluyen también aquellos que contienen anticuerpos anti-ULBP (como se definió aquí) enlazados a un agente terapéutico. En esta modalidad, el anticuerpo anti-ULBP sirve como un radical dirigido celular para suministrar el agente terapéutico unido a una célula que expresa ULBP. Tales proteínas de fusión son útiles, por ejemplo, para suministrar citotoxinas y similares a las células de tumor y células infectadas con virus.

Fragmentos Los fragmentos útiles de ULBP, que incluyen ULBP4, son aquellos polipéptidos que tienen una actividad ULBP suficiente tales como la capacidad para enlazar receptores NKG2D y/o para activar células NK. Por ejemplo, un fragmento que carece del dominio de transmembrana que suministra el polipéptido ULBP soluble y mantiene su actividad. Un polipéptido ULBP4 soluble puede producirse, por ejemplo, eliminando toda o una porción del dominio de transmembrana, la secuencia de aminoácido Trp227 a Trp248 mostrado en la Tabla 2 y en la SEC ID NO:2. Tal fragmento puede iniciar en una posición a partir del aminoácido 1 al aminoácido 35 de la SEC ID NO: 2 y el extremo entre el aminoácido 207 y el aminoácido 224 de la SEC ID NO: 2. Opcionalmente , tales extremos del fragmento entre el aminoácido 207 y 218, opcionalmente el aminoácido 217. Un fragmento puede iniciar en aproximadamente, el aminoácido 31 o 32 de la SEC ID NO: 2 y el extremo de aproximadamente el aminoácido 217 de la SEC ID NO: 2. Para la producción recombinante de tales fragmentos, pude usarse la secuencia de la señal ULBP4 o una secuencia de señal heteróloga para facilitar la secreción. Los fragmentos del polipéptido ULBP4 pueden usarse por ejemplo, para generar anticuerpos anti-ULBP4 específicos. Usando las técnicas de selección conocidas, los epítopos específicos pueden seleccionarse y usarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales . Tales anticuerpos tienen utilidad en el ensayo de la actividad ULBP4 así como en bloquear o inhibir la activación de ULBP4 de los receptores NKG2D y la actividad de la célula efector inmune de las células que expresan NKG2D. Tales anticuerpos anti-ULBP pueden usarse para agentes terapéuticos objetivos o radioisótopos para células que expresan ULBP4 tales como las células de tumores.

Anticuerpos Los polipéptidos de la presente invención en su totalidad o en parte, pueden usarse para aumentar los anticuerpos monoclonales y policlonales que son útiles en ensayos diagnósticos para detectar la expresión del polipéptido ULBP4 , como un herramienta de reacción para caracterizar las acciones moleculares del polipéptido ULBP4 en un ensayo de control de calidad para un proceso comercial, para la producción de una proteína ULBP4, y/o un agente terapéutico. Los anticuerpos anti-ULBP4 pueden enlazar específicamente proteínas ULBP4. La especificación para enlazar puede probarse en un número de formas que incluyen el desplazamiento competitivo. Por ejemplo, una proteína ULBP4 no radioactiva, pero no una proteína no radioactiva que no se enlaza específicamente a un anticuerpo ULBP4 que enlaza específicamente a un ULBP4 , puede desplazar el enlace del ULBP4 radioactivo al anticuerpo anti-ULBP4 específicamente enlazado. En contraste, una proteína no relacionada combinada con la proteína ULBP4 radioactiva puede tener poco efecto en la cantidad del enlace ULBP4 radioactivo mediante un anticuerpo anti-ULBP4 que se enlaza específicamente. Los anticuerpos de los polipéptidos ULBP, que incluyen ULBP , pueden ser útiles como agentes terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de padecimientos autoinmunes, tumores, infecciones y padecimientos caracterizados por una inflamación inapropiada, tal como la enfermedad del intestino inflamatoria. Todos o parte de los polipéptidos ULBP pueden usarse para generar anticuerpos. En particular, un polipéptido que contiene un epítopo único del polipéptido ULBP tales como por ejemplo, los 15 aminoácidos del término C del ULBP4, pueden usarse en la preparación de anticuerpos usando técnicas convencionales. Son conocidos los métodos para la selección de epítopos de péptido y la producción de anticuerpos. Ver por ejemplo. , Anticuerpos: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds . ) , 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y.; Monoclonal Antibodies, Hybridomas : A New Dimensión in Biological Analices, Kennet et al . , (eds) , 1980, Plenum Press, New York. En una modalidad, los anticuerpos anti-ULBP pueden fusionarse a los agentes terapéuticos (tales como por ejemplo, toxinas y/o compuesto radioactivos) para facilitar el suministro de los agentes a las células que expresan ULBP. Algunos de los anticuerpos anti-ULBP4 pueden interferir con ó antagonizar la interacción entre el ULBP4 y el NKG2D. Tales anticuerpos pueden, por ejemplo, inhibir la mejora de las células NK, células T y/o macrófagos mediados por la toxicidad mediante células que expresan ULBP4 o mediante un polipéptido ULBP soluble. Tal anticuerpo se refiere aquí como un anticuerpo antagonista. Tales anticuerpos pueden ser particularmente apropiados como agentes terapéuticos para tratar padecimientos autoinmunes. Otros anticuerpos anti-ULBP4 pueden enlazar ULBP4 sin interferir con la interacción entre el ULBP4 y el NKG2D. Ambos anticuerpos monoclonales y policlonales pueden producirse mediante epítopos de los polipéptidos de la invención, si los epítopos se han aislado o permanece una parte de los polipéptidos, y pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Ver por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analices, Kennet et al. (eds.) (1980) Plenum Press, New Cork; Antibodíes: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), (1980) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Kholer and Milstein, Patente norteamericana No. 4,736,110; "The Human B-Cell Hybridoma Technique," (Kozbor et al. (1984), J. Immunol . 133:3001-05); Colé et al. (1983), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-30; y "The EBV-hybridoma Technique," (Colé et al., in Monoclonal Antibodíes And Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96 (1985)). se contemplan también aquí, las líneas celulares del hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipeptidos de la invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Takeda et al. (1985), Nature 314:452-454; Morrison et al. (1984), Proc Nati Acad Sci USA 81:6851-6855; Boulianne et al. (1984), Nature 312:643-646; Neuberger et al. (1985), Nature 314: 268-70) pueden usarse mediante el empalme de los genes a partir de un antígeno específico apropiado de la molécula del anticuerpo del ratón junto con los genes de una molécula del anticuerpo de humano, de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que, diferentes porciones se derivan de las distintas especies animales tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb de porcino y una región constante de inmunoglobulina de humano. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención también incluyen versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de murino. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas que frecen la ventaja de reducir la inmunogeneicidad cuando los anticuerpos se administran a los humanos. Los procedimientos para la producción de quiméricos y anticuerpos monoclonales generados por ingeniería genética incluyen aquellos descritos en Riechman et al., ((1998), Nature 332:323), Liu et al. ((1987), PNAS 84:3439), Larrick et al. ((1989), BioTechnology 7:934), y Winter and Harris ((1983), TIPS 14:139). Las técnica útiles para anticuerpos humanizados son discutidos también en la patente norteamericana No. 6,054,297. Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicos particularmente, anticuerpos de humano generados en un animal o no animal transgénico pueden encontrase en GB 2,272,440, las patentes norteamericanas Nos. 5,569,825 y 5,545,806 y patentes relacionadas. Preferiblemente, para usarse en humanos, los anticuerpos son humanos o humanizados; técnicas para crear tales anticuerpos de humanos o humanizados son también conocidos y se encuentran comercialmente disponibles mediante por ejemplo, Medarex Inc. (Princeton, NJ) y Abgenix Inc. (Fremont, CA) . En otra modalidad preferida, los anticuerpos totalmente humanos, para usarse en humanos, se producen mediante la separación por exclusión de una colección que exhibe fagos de dominios variables del anticuerpo de humano. Vaughan et al. (1998), Nat Biotechnol . 16(6): 535-539; y la patente norteamericana No. 5,969,108. Los fragmentos del anticuerpo enlazados al antígeno que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpos que incluyen pero no se limitan a los fragmentos F(ab' ) 2 que pueden producirse mediante la digestión de pepsina de la molécula del anticuerpo y los fragmentos del anticuerpo que pueden generarse reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, las bibliotecas de expresión Fab pueden ser construidas (Huse et al. (1989), Science 246:1275-1281) para permitir una identificación fácil, útil y rápida de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. El término "anticuerpo" se usa aquí en su mas amplio sentido e incluye específicamente ambas formas nativa y mutante, anticuerpos monoclonales y simples, composiciones del anticuerpo con especificidad poliepitópica, así como fragmentos del anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab' )2/ EV, Fe) que exhiben las actividades biológicas deseadas. Las formas de la región Fe de un anticuerpo que contiene uno o mas de los dominios CH de la región Fe, que incluye formas truncas de polipéptidos FC que contienen la región hinge que promueve la dimerización (Fe ó polipéptido Fe) , y particularmente los polipéptidos Fe derivados del anticuerpo IgGI de humano, son útiles en las proteínas de fusión ULBP de la invención. Las técnicas descritas para la producción de los anticuerpos de cadena simple (Patente norteamericana No. 4,946,778; Bird (1998), Science 242: 423-426; Huston et al. (1998), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 ; y Ward et al. (1989), Nature 334:544-546) pueden adaptarse también para producir anticuerpos de cadena simple contra las proteínas de genes ULBP. Los anticuerpos de cadena simple se forman enlazando los fragmentos de cadena ligera y pesada de la región Fv vía un puente de aminoácido, que resulta en un polipéptido de cadena simple. Tales anticuerpos de cadena simple pueden también ser útiles intracelularmente (es decir, como intracuerpos) , por ejemplo, descrito por Marasco et al. ((1999), J. Immunol. Methods 231:223-238,) para terapias genéticas en la infección del VIH. Además, los anticuerpos del polipéptido ULBP pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que "mimetizan" al polipéptido ULBP y que pueden enlazar a las parejas que enlazan al polipéptido ULBP usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. (Ver por ejemplo, Greenspan & Bona (1993), FASEB J 7 (5) :437-444 ; and Nissinoff (1991), J. Immunol . 147(8): 2429-2438). Tales anticuerpos también pueden usarse en métodos para detectar y cuantificar los anticuerpos anti-ULBP4. Además, tales anticuerpos anti-isotipo pueden por ejemplo, enlazar a NKG2D y pueden o no activar células efector inmunes que expresan NKG2D. Así, tales anticuerpos pueden activar células efector inmunes que expresan NKG2D, que incluyen células N , células T y/o macrófagos o pueden bloquear o inhibir la activación de tales células vía el NKG2D. Los anticuerpos que se enlazan específicamente con los polipéptidos de la invención incluyen anticuerpos biespecífieos (es decir, anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos de la invención vía un dominio que enlaza a un primer antígeno, y también inmunoreactivos con un polipéptido diferente vía un segundo dominio que enlaza al antígeno) . Se han preparado una variedad de anticuerpos biespecífieos , y se han encontrado útiles ambos in vi tro e ín vivo (ver, por ejemplo, la patente norteamericana 5,807,706; y Cao and Suresh (1998), Bioconjugate Chem 9: 635-644). Además, las moléculas biespecíficas tetravalentes pueden prepararse mediante la fusión del ADN que codifica a la cadena pesada de un fragmento F(ab')2 de un anticuerpo con ya sea un ADN que codifica a la cadena pesada de una segunda molécula F(ab' ) 2 (en la que el dominio CH1 se reemplaza por un dominio CH3) o con un ADN que codifica un fragmento FV de la cadena simple de un anticuerpo, como se describe en la patente norteamericana No. 5,959,083. Los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse también como se describe en al patente norteamericana No. 5,807,706. Mas aún, se han preparado fragmentos (sFvs) variables de cadena simple mediante la unión covalente de dos dominios variables los fragmentos resultantes pueden formar dímeros o trímeros, dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables. Kortt et al. (1997). Protein Engineering 10:423-433. Un pepticuerpo tal como un pepticuerpo que enlaza a una proteína del ULBP, que incluye ULBP1, ULBP2 , ULBP3 y ULBP4 puede usarse en lugar de un anticuerpo en cualquiera de los usos terapéuticos para los anticuerpos discutidos aquí. Los penticuerpos se describen en la WO 01/83525 y WO 00/24782.

Secuencias del Polinucleotido La invención proporciona también, moléculas del polinucleotido que codifican a los polipéptidos discutidos arriba. Las moléculas de los polinucleótidos ULBP de la invención incluyen las siguientes moléculas : moléculas del polinucleótido que tienen la secuencia del ácido nucleico mostradas en la Tabla 1 y la SEC ID NO: 1; moléculas del polinucleótido que forman híbridos bajo condiciones moderadas o altamente severas a la secuencia del ácido nucleico de la Tabla 1 y la SEC ID N0:1; y las moléculas del polinucleotido que tienen una identidad de la secuencia del ácido nucleico sustancial con la secuencia de ácido nucleico de la Tabla 1 y la SEC ID NO: 1, particularmente con aquellos ácidos nucleicos que codifican a los dominios alfa-1 y alfa-2 del polipéptido ULBP , que tiene una secuencia de aminoácido que inicia con ya sea, el Leu24, His31, Ser32 o un aminoácido entre Leu24 y Ser32 que se extiende aproximadamente a Thr207, His217 o a un aminoácido de Thr207 a His217. Tales polinucleótidos incluyen una región que inicia a partir del residuo 70 al residuo 94 de la SEC ID NO: 1 y que termina en el residuo 621 al residuo 651 de la SEC ID NO:l. Las moléculas del polinucleotido ULBP4 de la invención son preferiblemente, moléculas aisladas que codifican al polipéptido ULBP4 , que tienen una secuencia de aminoácido como se muestra en la Tabla 1 y la SEC ID N0:2, así como derivados, variantes y fragmentos útiles del polinucleotido ULBP . La secuencia del polinucleotido ULBP4 puede incluir eliminaciones, sustituciones o adiciones a la secuencia del ácido nucleico de la Tabla 1 y la SEC ID NO:l. La molécula del polinucleotido ULBP4 de la invención puede ser cADN, ADN químicamente sintetizado, ADN amplificado por PCR, ARN o combinaciones de los mismos. Debido a la degeneración del código genético, dos secuencias de ADN pueden diferir e incluso, codificar secuencias de aminoácidos idénticos. La presente invención proporciona así, una molécula de polinucleótidos aislados que tienen una secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido ULBP4, en donde la secuencia del ácido nucleico codifica un polipéptido ULBP4 que tiene una secuencia de aminoácido completa como se muestra en la Tabla 1 y la SEC ID N0:2, o variantes, derivados y fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos ULBP4 de la invención tienen una secuencia de ácido nucleico que es al menos 92% idéntico a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la tabla 1 y la SEC ID N0:1. Opcionalmente, la secuencia de ácido nucleico es al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% ó al menos 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico mostrado en la Tabla 1 y la SEC ID N0:1. El porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse mediante la inspección visual y cálculo matemático, ó más preferiblemente, la comparación se hace comparando la información de la secuencia usando un programa de computadora. Un programa de computadora preferido ejemplar es el programa de aplicación Wisconsin versión 10.0 (GCG; adison, WI) del Grupo de Computadoras Genéticas, 'GAP' (Devereux et al., 1984, Nucí. Acids Res. 12:387). Los parámetros predeterminados preferidos del programa 'GAP' incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación uñaría (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos u otras matrices de comparación semejantes; (2) una penalidad de 50 para cada intervalo y una penalidad adicional de 3 para cada símbolo en cada intervalo para las secuencias de nucleótido; (3) una no penalidad para los intervalos finales; y (4) una no penalidad máxima para intervalos prolongados . Pueden usarse otros programas usados mediante aquellos expertos en la técnica de comparación de la secuencia tales como por ejemplo, el programa BLASTIN versión 2.0.9 o el algoritmo UW-BLAST. Alternativamente, la identidad de la secuencia del ácido nucleico se determina mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante la alineación de dos secuencias en un programa de tal como el programa MACAW creado por Grez Schuler (Schuler et al., 1991 Proteins 9: 130-190) . Las moléculas del polinucleótido ULBP4 de la invención incluyen también moléculas del polinucleótido aisladas que tienen una secuencia del ácido nucleico que forma híbridos bajo condiciones de severidad altas (como se definió arriba) a la secuencia de ácido nucleico mostrado en la Tabla 1 y la SEC ID NO:l. La hibridación de los polinucleótidos es de al menos 15 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 20 nucleótidos contiguos, mas preferiblemente al menos 30 nucleótidos contiguos y aún mas preferiblemente, al menos 100 nucleótidos contiguos de la secuencia del ácido nucleico mostrado en la Tabla 1 y la SEC ID N0:1. Los fragmentos útiles para las moléculas de polinucleótidos que codifican ULBP4 descritas en la presente incluyen cebadores y sondas . Tales sondas y cebadores pueden usarse, por ejemplo, en métodos PCR para amplificar y detectar la presencia de polinucleótidos ULBP4 in vitro, así como en manchados Southern y Northern para análisis de ULBP4. Las células que expresan la moléculas de polinucleótido ULBP4 de la invención también pueden identificarse por el uso se tales sondas. Los métodos para la producción y de uso de tales cebadores y sondas se conocen. Para PCR, los cebadores 5' y 3' correspondientes a una región en la terminación de la molécula de polinucleótido ULBP4 pueden ampliarse para aislar y amplificar en polinucleótido ULBP4 usando técnicas convencionales. Una sonda o cebador de hibridación ejemplar comprende nueve o mas ácidos nucleótidos continuos tomados de la única región de transmembrana 3 ' de ULBP4 : GAG TGG CAG GCT GGT CTC TGG CCC TTG AGG ACG TCT TAG [SEQ ID NO: 9] Otros fragmentos útiles para los polinucleótidos ULBP4 incluyen los oligonucleótidos antisentido o sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla capaz de enlazarse al ARNm ULBP4 objetivo (usando una hebra sencilla) o secuencia de ADN (usando una hebra antisentido) .

Todavía otros ácidos nucleótidos útiles incluyen los AR s de interferencia (que pueden ser ARNs de hebra doble que incluye la secuencia de un ARNm ULBP) , o secuencias que codifican los AR que interfieren (que incluyen ADNs que codifican las haripinas de ARN que comprenden secuencias de un ARNm ULBP) , que pueden inhibir la expresión de proteínas ULBP. Ver, por ejemplo, Bosher and Labouesse (2000), Nature Cell Biol . 2:E31-E36; Fjose et al. (2001), Biotechnol . Ann. Rev, 7:31-57.

Vectores y Células Hospedadoras La presente invención también proporciona vectores que contiene las moléculas de polinucleótido de la invención así como células hospedadoras transformadas con tales vectores. Cualesquiera de las moléculas de polinucleótidos de la invención que incluyen uno o mas de ULBP1, ULBP2 , ULBP3 y ULBP4 pueden estar contenidas en un vector, que generalmente incluye un marcador seleccionable y un origen de replicación, para propagación en un hospedador. Los vectores incluyen además secuencias reguladoras transcripcionales o de traducción apropiadas, tales como aquellas derivadas de genes de mamífero, microbios, virales o insectos, enlazados de manera operativa a la molécula de polinucleótido o ULBP. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o aumentadores , sitios de enlace de ARNm ribosomal, y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos se enlazan operablemente cuando las secuencias reguladoras se relacionan funcionalmente al ADN que codifica la proteína objetivo. De esta manera una secuencia de nucleótidos promotora se enlaza operablemente a una secuencia de ADN ULBP si la secuencia de nucleótido del promotor dirige la transcripción de la secuencia ULBP. La selección de vectores apropiada para la clonación de moléculas de polinucleótido ULBP4 que codifican los polipéptidos ULBP4 objetivo de esta invención dependerá de la célula hospedadora en la cual el vector se transformará y en donde sea aplicable, la célula hospedadora de la cual el polipéptido objetivo se expresará. Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de polipéptidos ULBP4 incluyen procariotas, levaduras, y células eucorióticas superiores, cada una de la cuales se discute a continuación. Los polipéptidos ULBP a expresarse en tales células hospedadoras también pueden ser proteínas de fusión que incluyen regiones de proteínas heterólogas . Como se discute arriba, tales regiones pueden incluirse para permitir, por ejemplo, la secreción, estabilidad mejorada, facilitar la purificación, dirección, u oligomerización del polipéptido ULBP. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal apropiada puede incorporarse en un vector de expresión. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal (líder secretoria) puede fusionarse en estructura a una secuencia ULBP de manera que ULBP se traduce como una proteína de fusión que comprende en péptido de señal. El péptido de señal que es funcional en la célula hospedadora pretendida, promueve la secreción extracelular del polipéptido ULBP. Un péptido de señal heterólogo puede remplazar la secuencia de señal nativa. Los ejemplos de péptidos de señal que son funcionales en células hospedadoras de mamífero incluyen la secuencia de señal para interleucina 7 (IL-7) descrita en la patente de E.U.A No. 4,965,195, la secuencia de señal para el receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et al. ((1984), Nature 312: 758) ; el péptido de señal del receptor de interleucina 4 descrito en la patente EP No. 0 367 566; el péptido de señal del receptor de interleucina 1 del tipo I descrito en la patente de E.U.A No. 4,968, 607; el péptido de señal interleucina 1 del tipo II descrito en la patente EP No . 0 460 846; la secuencia de señal de IgK humano (que es METDTLLLWVLLLWVPGSTG) ; y la secuencia de señal de la hormona de crecimiento humano (que es MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA) . Preferiblemente, la secuencia de señal se desdobla para del polipéptido ULBP durante la secreción de ULBP de la célula. Otras secuencias de señal que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen el factor a de levadura y el líder de melatina de miel de abeja en células de insecto Sf9. Brake (1989), Biotechnology 13: 269-280; Homa et al. (1995), Protein Ex . Purif. 6141-148; Reavy et al. (2000), Protein Exp. Purifi, 6: 221-228. Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de los polipéptidos objetivo de la invención incluyen células procariotas, de levadura, y eucariotas superiores. Las hospedadoras procariotas apropiadas para usarse en la expresión de estos polipéptidos incluyen bacterias del género Escherichia, Bacillus, y Salmonella, así como miembros del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus . Para la expresión en células procariotas, por ejemplo, en E. coli, la molécula de polinucleotidos que codifica el polipéptido ULBP incluye preferiblemente un residuo de metionina terminal N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante . El Met de terminal N puede opcionalmente desdoblarse del polipéptido expresado. Los vectores de expresión para su uso en hospedadores celulares, comprenden generalmente uno o mas genes marcadores de selección fenotípicos. Tales genes codifican, por ejemplo, una proteína que otorga resistencia a los antibióticos o que suministra un requerimiento auxotrófico. Una amplia variedad de tales vectores están fácilmente disponibles de fuentes comerciales. Los ejemplo incluyen los vectores pGEM (Promega) , vectores pSPORT y vectores pPROEX (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) , vectores Bluescript (Stratagene) , y los vectores pQE (Qiagen) . El ULBP también se puede expresar en células hospedadoras de levadura de los géneros que incluyen Saccharo yces, Pichia, y Kluveromyces . Los hospedadores de levadura preferidos son S. cerevísiae y P. pastoris. Los vectores de levadura contendrán a menudo un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2µ, una secuencia autónomamente replicada (ARS) , una región del promotor, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador de selección. Los vectores replicables tanto en la levadura como en E. coli (denominados vectores de transferencia) también se pueden usar. Además de la características antes mencionadas de los vectores de levadura, un vector de transferencia también incluirá secuencias para la replicación y selección en E.coli. La secreción directa de los polipéptidos objetivo expresados en los hospedadores de levadura se puede lograr por la inclusión de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder del factor a de levadura en la terminación 5' de la secuencia de nucleótido que codifica ULBP. Brake (1989) Biotechnology 13: 269-280. También se puede usar los sistemas de cultivo de células hospedadoras de insectos para la expresión de los polipéptidos ULBP. Los polipéptidos objetivo de la invención, se expresan preferiblemente usando un sistema de expresión de baculovirus, como se describe, por ejemplo, en la revisión por Lucko y Summers ((1988), BioTechnology 6:47). Se pueden expresar los polipéptidos ULBP de la invención en células hospedadoras mamíferas. Los ejemplos no limitativos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos apropiadas incluyen la línea COS-7 de células de riñon de mono (Gluzman et al. (1981), Cell 23: 175-182), células de ovario de hámster chino (CHO) (Punck et al. (1985), PNAS USA 60: 1275-1281), CV-1 (Fischer et al. (1970), Int. J. Cáncer 5: 21-27) y células de carcinoma cervical humano (HELA) (ATCC CCL 2) . La elección de un vector de expresión adecuado para la expresión de los polipéptidos ULBP de la invención dependerá de la célula hospedadora de mamífero específica a ser usada. Los ejemplos de los vectores de expresión adecuados incluyen pcADN3. l/Hygro+ ( Invitrogen) , Pdc409 (McMahan et al. (1991), EMBO J. 10:2821-2832), y pSVL (Pharmacia Biotech) . Los vectores de expresión para su uso en células hospedadores de mamíferos pueden incluir secuencias de control de transcripción y de traducción derivadas de genomas virales. Las secuencias del promotor comúnmente usadas y las secuencias intensificadoras que se pueden usar para expresar ULBP4, incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas del citomegalovirus humano (CMV) , adenovirus 2, virus del polioma, y virus de simio 40 (SV40) . Se describen los métodos para la construcción de vectores de expresión mamíferos, por ejemplo, en Okayama and Berg ((1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170), Cosman et al. ((1986) Mol. Inmmunol . 23:935-941), Cosman et al. ((1984) Nature 312:768-771), EP-A-0367566 , y WO 91/18982. La modificación de la molécula de polinucleótido ULBP para facilitar la inserción de un vector en particular (por ejemplo, al modificar los sitios de restricción) , la facilidad de un sistema u hospedador de expresión en particular (por ejemplo, usando los codones hospedadores preferidos) , y similares, se conocen y se contemplan para su uso en la invención. Los métodos de ingeniería genética para la producción de los polipéptidos ULBP incluyen la expresión de las moléculas de polinucleótidos en sistemas de expresión de células libres, en hospedadores celulares, en tejidos y modelos animales, de conformidad con los métodos conocidos.

Composiciones Farmacéuticas La invención proporciona composiciones farmacéuticas que contiene un polipéptido ULBP substancialmente purificado de la invención, incluyendo fragmentos, variantes y/o proteínas de fusión, o un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a tales polipéptidos ULBP, y un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas se administran a células, tejidos, o pacientes, para una diversidad de propósitos que incluyen: inducir la actividad de las células que expresan NKG2/DAP10, incluyendo células NK, células T (que incluyen células aß? y células ?d?) , y macrófagos activados; para inducir la producción de citocinas y quimiocimas ; para inducir la citotoxicidad de las células efectoras imnunes contra las células de tumor y células infectadas, tales como células infectadas viralmente o bacterialmente; y para el tratamiento terapéutico, por ejemplo, del cáncer, infección viral e infección bacteriana. Un polipéptido ULBP puede ser una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada o una porción de direccionamiento . La invención también proporciona reactivos, composiciones, y métodos que son útiles para el análisis de la actividad de las células NK y/o T, para el análisis del acoplamiento del receptor NKG2D y la activación y para el análisis de los efectos inhibidores/estimuladores de moléculas de señal involucradas en la respuesta del sistema inmune innata a la infección y a las células neoplásicas. Los polinucleótidos y polipéptidos ULBP, que incluyen vectores que expresan ULBP de la invención, se pueden formular como composiciones farmacéuticas y administrarse a un hospedador, preferiblemente un hospedador mamífero, incluyendo un paciente humano, en una diversidad de formas adaptadas a la vía de administración elegida. Los compuestos se administran preferiblemente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, y se pueden combinar con o conjugar a agentes de administración específicos, incluyendo anticuerpos y/o citocinas de direccionamiento . El ULBP se puede administrar por técnicas conocidas, tales como oralmente, parenteralmente (incluyendo inyección subcutánea, técnicas intravenosas, intramusculares, intraesternales o de infusión) por un rocío de inhalación, localmente por absorción a través de la membrana mucosa, o rectalmente, en formulaciones de dosis unitaria que contienen portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de suspensiones o tabletas adecuadas para administración oral, rocíos nasales, cremas, preparaciones estériles inyectables, tales como suspensiones o supositorios oleaginosos o acuosos inyectables estériles. Para la administración oral como una suspensión, se pueden preparar las composiciones de acuerdo con técnicas que son bien conocidas en el arte de la formulación farmacéutica. Las composiciones pueden contener celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido algénico o alginato de sodio como un agente de suspensión, metilcelulosa como un mej orador de la viscosidad y edulcorantes o agentes saborizantes . Como tabletas de liberación inmediata, las composiciones pueden contener celulosa microcristalina, almidón, estearato y magnesio y lactosa u otros excipientes, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, agentes de dilución y lubricantes conocidos en el arte. Para la administración por inhalación o aerosol, las composiciones se pueden preparar de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte de la formulación farmacéutica. Se pueden preparar las composiciones como soluciones en solución salina, usando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos u otros agentes de dispersión o solubilizantes conocidos en el arte. Para la administración como soluciones o suspensiones inyectables, se pueden formular las composiciones de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte, usando agentes adecuados de dispersión o humectantes o de dispersión, tales como aceites estériles incluyendo mono o diglicéridos sintéticos o ácidos grasos, incluyendo ácido oleico. Para la administración rectal como supositorios, se pueden preparar las composiciones al mezclar un excipiente adecuado no irritante tal como manteca de cacao, esteres de glicéridos sintéticos o polietilen glicoles, que son sólidos a temperaturas ambientes, pero que se licúan o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco. Las vías de administración preferidas incluyen vías orales, parenterales , así como intravenosas, intramusculares o subcutáneas. Más preferiblemente, los compuestos de la presente invención se administran parenteralmente , esto es, se inyectan por vía intravenosa, intraarterial , intramuscular, intralesiones, subcutánea, o intraperitonealmente por infusión o inyección. La administración localizada, esto es, en el sitio de la enfermedad, se contempla, como son la administración transdermal y la liberación sostenida de implantes o parches para la piel. En una modalidad de la invención, se pueden administrar los compuestos directamente a un tumor por inyección, o por la administración sistémica por inyección intravenosa. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos, preparaciones orales tales como pildoras o grageas, jarabes y goma de mascar, y preparaciones locales tales como lociones, geles, rocíos, y ungüentos. En la mayoría de los casos, las moléculas terapéuticas que son polipéptidos se pueden administrar localmente o por inyección o inhalación. Las soluciones o suspensiones de los compuestos, se pueden preparar en agua, solución salina isotónica (PBS) y opcionalmente mezclarse con un tensoactivo no tóxico. También se pueden preparar las dispersiones en glicerol, polietileno líquido, glicoles, ADN, aceites vegetales, triacetina y mezclas de los mismos. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para evitar el crecimiento de los microorganismos . La forma de dosis farmacéutica adecuada para uso de inyección o infusión, pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles, o polvos estériles que comprenden un ingrediente activo que se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles, inyectables o de infusión. La forma final de dosis debe ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o dispersión líquida en un medio que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol tal como glicerol, propilen glicol, o polietilen glicoles líquidos, y similares, aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por la formación de liposomas, por el mantenimiento de partícula requerido en el caso de dispersión, o por el uso de tensoactivos no tóxicos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr por diversos agentes antibacterianos y antifungales . Por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, soluciones amortiguadoras o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede generar para la inclusión en las composiciones de agentes que retrazan la absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoesterato de aluminio y gelatina. Las soluciones estériles inyectables se preparan al incorporar los compuestos en la cantidad requerida en el solvente adecuado con diversos otros ingredientes como se enumeran arriba, y como se requiere, seguido por esterilización del filtro. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío, y técnicas de secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones previamente filtradas estériles .

Dosis El régimen y dosificación terapéuticos más adecuados para el tratamiento del paciente, variarán con la enfermedad o condición a tratarse, y de acuerdo con el peso del paciente y otros parámetros. Una dosis útil de un polipéptido ULBP o un anticuerpo contra un polipéptido ULBP, pueden ser alrededor de 0.01-100 mg ULBP/kg/dí (o menos, ver a continuación) administrado sistémicamente . Se espera que dosis mucho más pequeñas, como por ejemplo, en el rango de 0.001-1 mg ULBP/kg/d£a con una duración mayor de tratamiento, también producirán resultados terapéuticamente útiles. Se pueden administrar las dosis en cualquier frecuencia adecuada y para cualquier duración adecuada. Por ejemplo, se pueden administrar dosis diariamente cada tercer día, una vez cada tercer día, 2 veces por semana, una vez por semana, una vez cada 10 días, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez por mes o una vez cada 2 meses, entre muchos posibles regímenes de dosificación. La frecuencia o cantidad de cada dosis no necesita permanecer constante a través de la duración del tratamiento. El tratamiento puede continuar para cualquier para cualquier duración adecuada desde 1 a más días o años . Una dosis efectiva y protocolo de tratamiento se pueden determinar por medios convencionales, partiendo de una dosis baja en animales de laboratorio y luego incrementando la dosis mientras se observan los efectos, y se varía sistemáticamente también el régimen de dosis. Se pueden tomar en consideración diversos factores por un médico cuando se determina una dosis óptima para un sujeto dado. Los factores incluyen el tamaño del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad en particular a tratarse, la severidad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente y similares. Las dosis de ensayos se escogerían después de la consideración de los resultados de estudios animales y la literatura clínica.

Ensayos Los agentes que modifican, por ejemplo, incrementan o disminuyen la estimulación ULBP de las células NK u otras células que expresan NKG2D tales como las células CD8+ aß T, células ?d T, o macrófagos, se pueden identificar por ejemplo, por el ensayo del enlace ULBP al receptor NKG2D/DAP10 y/o el análisis de la información del complejo ULBP/NKG2D, de la citotoxicidad mediada por células T o células NK o de la producción de células T o células NK de las quimiocinas y/o citocinas. La incubación de las células NK en presencia de un polipéptido ULBP4 y en presencia o ausencia de un agente de prueba y la correlación de la formación del complejo ULBP/NKG2D de la citotoxicidad mediada por células T o células NK, o de la producción de células T o células NK de las quimiocinas y/o citocinas con la actividad o inhibición de ULBP4, permite la separación por exclusión de tales agentes. En tales ensayos, una disminución o incremento desproporcionado en la actividad de mediada por el receptor NKG2D de las células tratadas con ULBP contra un control sin tratar, se correlaciona con la estimulación o inhibición del agente de prueba de la actividad ULBP4. Las actividades objetivo específicas para el polipéptido ULBP, que incluyen ULBP4 , en NKG2D en las células que expresan (células NK, o células T, o macrófagos), por ejemplo, la activación ULBP de la serina/treonina cinasa anti-apoptótica Akt , PKB, JA 2 tirosina cinasa, así como el factor de transcripción STAT5 , y las cinasas de mapa ERK, también se puede analizar y correlacionar con la actividad contra la inhibición de un agente de prueba. Preferiblemente, se usa una forma soluble de ULBP para estimular la actividad objetivo de ULBP en células que expresan NKG2D. Opcionalmente , las células que expresan NKG2D pueden ser células NK. La actividad estimulada por ULBP4 se determina en presencia y ausencia de un agente de prueba y luego se compara. Una actividad de prueba activada por ULBP4 inferior en presencia del agente de prueba, que en ausencia del agente de prueba, indica que el agente de prueba ha disminuido la actividad del ULBP. Una actividad de prueba activada por ULBP superior en presencia del agente de prueba que en ausencia del agente de prueba indica que el agente de prueba ha incrementado actividad de ULBP. Se pueden usar estimuladores e inhibidores de ULBP para aumentar, inhibir, o modificar la actividad mediada por ULBP, y por lo tanto pueden tener usos terapéuticos potenciales. Por ejemplo, los inhibidores de ULBP pueden ser útiles para reducir la citotoxicidad de las células NK, por ejemplo en enfermedades autoinmunes o en pacientes que se someten a transplantes de órganos.

Aplicaciones Terapéuticas Los polipéptidos ULBP, incluyendo los polipéptidos ULBP4 de la invención, son agentes activadores efectivos de macrófagos y/o células T, células NK. En los métodos de la invención, los efectos activadores de las células del efector inmune de los polipéptidos ULBP se alcanzan al tratar las células efectoras inmunes con cantidades picomolares a milimorales del polipéptido ULBP, y preferiblemente con cantidades nanomolares o micromorales del polipéptido ULBP soluble. Las células activadas en NK han demostrado lisar bacterias, lisar células infectadas por virus y participar en la eliminación de células de tumor. Ver, por ejemplo, Whiteside et al. (1996), Anticancer Res. 16 (4C) :2537-64 ; Yamaue et al. (1989), C ncer Immunol Immunother. 29(2): 79-86. La estimulación de ULBP de las células NK produce citocinas y quimiocinas que activan a otros componentes del sistema inmune y es, por lo tanto, útil como un tratamiento en infecciones virales o infecciones bacterianas, y en ciertos tipos de tratamientos de células de tumor. Las células diferentes a las células de NK que también expresan al receptor ULBP NKG2D, tal como las células CD8+ aß T y las células ?d T, se pueden activar por los ligandos NKG2D. Diefenbach et al. (2000), Nature Immunology 1(2): 119-26; Baucr et al. (1999), Sciences 285: 272-29. (1) Producción de Citocina/Quimiocina Pueden usarse polipéptidos ULBP aislados, y preferiblemente purificados, que incluyen ULBP1, ULBP2 , ULBP3 y/o ULBP4, para estimular la producción de citocinas y quimiocinas de células, tales como células NK, células CDe+aß?, macrófagos, y/o células ?d . Opcionalmente , los polipéptidos ULBP usados en este método se fusionan a una porción LZ o Fe como se discute arriba, creando una proteína de fusión ULBP-LZ, que puede ser un multímero tal como un trímero o un dímero, o una proteína de fusión ULBP- Fe, que puede ser un multímero tal como un dímero. Las células NK primarias se tratan con IL-15 u otro material similar durante un periodo de tiempo, preferiblemente desde 15 hasta 20 horas, para maximizar el enlace de ULBP a las células NK. Las células tratadas se estimulan entonces con un polipéptido ULBP soluble, preferiblemente a una concentración desde alrededor de 0.05 hasta alrededor de 20.0 opcionalmente desde alrededor de 0.5 hasta alrededor de 5.0 µg/ml o desde alrededor de 0.8 hasta alrededor de 3.0 µg/ml. Las células estimuladas se incuban además durante un periodo de tiempo, preferiblemente desde alrededor de 15 hasta 20 horas, y se colecta el sobrenadante. Las citocinas y quimiocinas se aislan y purifican del sobrenadante por métodos convencionales. Las citocinas y quimiocinas producidas por medio de ULBP inducen la activación de células, tales como células NK, que incluyen G -CSF, interferón ?, TNF-alfa, TNF-beta, ????-alfa, ????-beta y quimiocina CC 1-309. Las células NK tratadas con IL-15 se estimulan opcionalmente con una combinación de ULBP4 soluble y IL-12 para realizar un rendimiento aún mayor. (2) Tratamiento de Tumores e Infecciones Los polipéptidos ULBP, que incluyen variantes ULBP4 , fragmentos, y proteínas de fusión, también encuentran utilidad como agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores e infecciones, por ejemplo, infecciones bacteriales o virales. En consecuencia, la presente invención abarca métodos para inhibir o detener el crecimiento del tumor, eliminar células de tumor, o reducir el tamaño y/o número de tumores en un paciente. La invención abarca además métodos para tratar una infección viral bacterial al administrar a un individuo un polipéptido ULBP. El tratamiento de una infección que puede ser una infección viral o bacterial o una infección por un organismo eucariótico, abarca: la reducción de la cantidad articulas infectivas detectables u organismo; la reducción en la cantidad de ácidos nucleicos o proteínas detectables del virus u organismo infectivo y/o la reducción en los síntomas asociados con la infección. El cáncer o infecciones pueden tratarse al administrar un polipéptido ULBP soluble, que puede ser una variante, fragmento, y/o proteína de fusión que puede enlazarse a NKG2D y activar células que expresan NKG2D, preferiblemente células NK, células T, y/o macrófagos. Alternativamente tales condiciones pueden tratarse al administrar un anticuerpo, antidiotípico que puede enlazarse a un anticuerpo ULBP, que es capaz se enlazarse a NKG2D y activar células que expresan NKG2D. En casos en donde el cáncer o una infección expresa la proteína ULBP, el cáncer o infección pueden tratarse usando un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína ULBP. En enlace de un anticuerpo a una célula cancerosa o infectada puede estimular la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo, lo que lleva a la muerte de la célula cancerosa o infectada. Opcionalmente el anticuerpo puede fusionarse a un agente citotóxico o radioactivo para aumentar además lo efectos citotóxicos del anticuerpo enlazado. Algunas, pero no todas, las células de cáncer expresan proteínas ULBP. Ver, por ejemplo, Cosman et al., Supra; Onda et al. (2001), Biochem, Biophys.Res Comm 285: 235-43. Para incrementar el número de proteínas ULBP localizadas cerca de una célula de cáncer, que puede o no expresar la proteína ULBP, la proteína ULBP que incluye ULBPl ULBP2 ULBP3 y ULBP4, puede fusionarse a un anticuerpo u otro polipeptido (tal como uno seleccionado in vitro para enlazarse a un antígeno de tumor) que se enlaza a un antígeno específico de tumor y se usa para tratar el tumor. Además, tal proteína de fusión ULBP puede además incluir una citocina, tal como, por ejemplo, IL-15, IL-2, y/o IL-12, y esta proteína de fusión triple puede usarse para tratar tipos de cáncer o infecciones. Las citocinas fusionadas a los anticuerpos específicos de tumor en los cuales, tanto la citocina como el anticuerpo, mantienen la función biológica, se han encontrado que son agentes anticáncer efectivos en una variedad de establecimientos. Ver, por ejemplo, Gillies et al. (2002) Cáncer Immunol . Immunother, 51:449-60; Ruehlmann et al. (2001), Cáncer Res. 61:8498-503; Holden et al., (2001), Clinical Cáncer Res, 7:2862-69. La adición de la proteína ULBP a una fusión citocina: anticuerpo puede además estimular la respuesta inmune contra la células de tumor. Todavía en otra modalidad, se proporciona un método para prevenir o inhibir el crecimiento de células de tumor que se mantienen en un paciente después de la cirugía para remover un tumor. El ácido nucleico que codifica la proteína ULBP, incluyendo ULBP1 ULBP2 ULBP3 y/o ULBP4 y fragmentos, variantes, y/o fusiones de los mismos, puede introducirse en células de tumor cultivadas derivadas de un tumor que se removió quirúrgicamente de un paciente. Estas células pueden entonces tratarse para prevenir la proliferación adicional, por ejemplo, al irradiarlas. Tales células no divididas tiene una proteína ULBP expresada en su superficie y pueden volverse a introducir en el paciente del cual se removieron. Tales células puede servir como vacunas que pueden erigir una respuesta inmune contra células de tumor del mismo tipo como aquellas removidas quirúrgicamente. Tal tratamiento puede prevenir o inhibir el crecimiento de células de tumor que se mantienen en un paciente después de la cirugía. (3) Anticuerpos Anti-ULBP como Porciones Objetivo Los anticuerpos anti-ULBP, incluyendo anticuerpos anti-ULBP4 , pueden ser terapéuticamente útiles para dirigir las células que expresan ULBP, incluyendo células de tumor o células infectadas, para la destrucción por el sistema inmune a través de la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo, fijación de complemento, u otro mecanismo. Además los anticuerpos anti-ULBP pueden fusionarse a agentes citotóxicos, citoestáticos , o radioactivos, pueden ser terapéuticamente útiles para dirigir estos agentes terapéuticos a las células que expresan ULBP, tales como células de tumor o células infectadas por virus, bacterias, u organismos eucarióticos . Alternativamente, los anticuerpos anti-ULBP4 fusionados a agentes radioactivos o luminiscentes pueden usarse para detectar las células que expresan ULBP4. Numerosos agentes citotóxicos, citoestáticos, luminiscentes, o radioactivos se conocen en la técnica y se han fusionado a otros anticuerpos para detener el crecimiento de células, para eliminar células o para detectar células que expresan antígenos particulares. Los ejemplos de tales agentes incluyen: derivados de maitansina (tal como DM1) , enterotoxinas (tal como una enterotoxina estafilococal) , isótopos de yodo (tal como yodo- 125) , isótopos de tecnecio (tal como Tc-99m) , fluorocromo de cianina (tal como CY5.5.18), o proteínas inactivadas o ribosoma (tal como bouganina, gelonina, o saporina, -S6) . En la administración las proteínas de fusión que contiene un anticuerpo ULBP y un agente citotóxico, citoestático, luminiscente o radioactivo deseado enlazado a la célula que expresa ULBP objetivo, de esta manera se permite su detección o se porta el agente terapéutico a la célula con objeto de eliminar la célula o inhibir su proliferación. Si una célula de tumor expresa ULBP4, por ejemplo, tal porción objetivo puede usarse para eliminar la célula de tumor o prevenir su proliferación. (4) Sinergia con IL-12 Las proteínas ULBP4 y IL-12 tiene una sinergia fuerte para inducir la producción del interferon gamma de células NK previamente tratadas con IL-15. Las proteínas ULBP también sobreregulan los niveles de ARNm para quimiocina. En particular las quimiocinas 1-309 y lifotactina se muestran para estar sobrereguladas por las proteínas ULBP. Adicionalmente , en las células NK, las citocinas que son marcadores conocidos de la activación de la célula NK, incluyendo GM-CSF, lifontoxina-alfa y TNF-alfa se sobreregulan en la administración de ULBP. Como se discute arriba, las células NK son capaces de excretar un efecto citotóxico al lisar una variedad de tipos de célula. De esta manera, un sistema hospedador que es capaz de activar las células NK y dirigir las células NK activadas a una célula infectada o célula de tumor es una característica importante en la lucha contra la infección y los tumores. (5) Enlace a GNKG2D/Dap 10 Como se describe y de muestra a continuación a modo de un ejemplo, los polipéptidos ULBP, incluyendo ULBP4, enlazados a NKG2D/DaplO, un antígeno expresado por célula NK, células T CD8+otp, células T ?d, en algunos macrófagos . La activación de células eliminadoras NK resulta en la producción de citocina y la inducción de células NK eliminadoras. La capacidad de las proteínas ULBP para actuar en sinergia en la producción de citocina esenciales, indica que las proteínas ULBP pueden activar la función citolítica de la célula NK. En consecuencia, las proteínas ULBP encuentran utilidad como terapéuticos antitumor y como terapéuticos para tratar infecciones que incluyen infecciones virales o bacteriales o infecciones por organismos eucorióticos, incluyendo protozoarios .

Adicionalmente, las moléculas bifuncionales o moléculas multifuncionales, que son capaces de enlazarse y activar células NK, macrófagos, células T ?d, o células T 0?8+ ß y también enlazan células de tumor, son útiles de conformidad con la presente invención. Las moléculas bifuncionales o multifuncionales apropiadas pueden ser moléculas que incluyen al menos una proteína ULBP, o un fragmento de enlace al receptor NKG2D de una proteína ULBP, y un polipéptido u otra porción que enlaza un antígeno de célula de tumor, tal como, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla. Puede apreciarse que tal terapéutico es capaz de enlazarse a y activar células NK, macrófagos, células T ?d y/o células T CD8+aP y dirigir las células de tumor para lisis para estas células efectoras. (6) Inmunodepresión Además, los agentes que interfieren con la capacidad de las ULBPs para activar el sistema inmune son útiles en situaciones en donde la submodulacion de una respuesta inmune se desea, tales como en un transplante (Manilay et al., 1998, Curr, Opin, Immmunol . 10:532-538), enfermedad hospedador contra injerto, rechazo al injerto, enfermedad autoinmune, terapia de gen (Hackett et al., 2000, Curr. Opin. Mol. Therap. 2:376-382), enfermedades caracterizadas por la inflamación inapropiada tal como enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de Crohn, y similares. Por ejemplo, un anticuerpo o pepticuerpo antagónico que se enlaza específicamente a una ULBP, incluyendo, pero no limitado a, ULBP1, ULBP4 ULBP2 ULBP3 y ULBP4, puede administrarse antes de, a aproximadamente el mismo tiempo (ya sea cercanamente antes o cercanamente después) , o concurrentemente en la administración de un vector de terapia de gen a un mamífero, transplante, o como sea apropiado de otra manera para la inmunodepresión deseada. También es apropiado para tal tratamiento una forma antagonista de un polipéptido ULBP (incluyendo variantes, fragmentos y proteínas de fusión) o un anticuerpo antiidiotípico que puede bloquear o inhibir la activación por medio de NKG2D. Un anticuerpo ULBP antagonista o una forma antagonista de un polipéptido ULBP o anticuerpo antiidiotípico puede administrarse a un paciente que padece de una enfermedad autoinmune con objeto de reducir el número de autoanticuerpos detectables, para reducir la activación de células efectoras inmunes, y/o para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes incluyen todas las condiciones en las cuales los propios tejidos del paciente se someten a efectos perjudiciales causados por el sistema inmune del paciente. Tales efectos puede mediarse por autoanticuerpos y/o por la activación de células efectoras inmunes, entres otras posibilidades. Los ligandos NKG2D que antagonizan, tales como las proteínas ULBP, pueden ser particularmente útiles donde la activación de células efectoras inmunes juega un papel en la patología de la enfermedad. No obstante que las causas de las enfermedades autoinmunes usualmente no son claras, una correlación entre la existencia de varios tipos de infecciones y varias enfermedades autoinmunes se ha establecido en algunos casos, y es un objeto recurrente de discusión en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Corapcioglu et al. (2002), Thyroid 12:613-17; Sewell et al. (2002), Immunol . Lett 82: 101-10; Rose (1998), Semin. Immunol. 10(1): 5-13; Matsiota-Bernard (1996), Clin. Exp. Immunol. 104:228-35; y McMurray and Elbourne (1997), Semin Arthritris Rheum, 26:690-701. Alguien de experiencia en la técnica apreciará que los síntomas de las enfermedades autoinmunes son extremadamente diversos y pueden depender en que tejidos se dirigen por el sistema inmune de los pacientes. Las enfermedades autoinmunes pueden ser de órgano específico o sistémicas, incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Addison, diabetes mellitus dependiente de la insulina (diabetes mellitus tipo I) , síndrome de endocrinopatia poliglandular, lupus eretimatoso sistémico, hepatitis activa crónica, varias formas de tiroiditis (incluyendo tiroiditis de Hashimoto, síndrome de tiroiditis transitorio, y enfermedad de Grave) , adenohipofisitis linfocítica, insuficiencia ovárica prematura, fioparatiroidismo idiopático, anemia perniciosa, glomerulonefritis , neutropenia autoinmune, síndrome de Goodpasture, esclerosis múltiple, vitiligio, miastenia gravis, artritis reumatoide, escleroderma , síndrome de Sjogren primario, polionisitis, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopenica autoinmune, penfigus vulgaris, fiebre reumática aguda, crioglobulinemia esencial mezclada, y anemia emolítica autoinmune tibia, entre muchas otras. Además un anticuerpo ULBP, antagonista o pepticuerpo o un polipéptido ULBP, o anticuerpo antidiotípico puede administrarse a un paciente que padece enfermedades inflamatorias, tales como enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de Crohn, para reducir o eliminar los síntomas de estas enfermedades. Además, en todas las aplicaciones terapéuticas anteriores para ULBPs, otros ligandos para NKG2D, conocidos o aún por descubrirse, pueden substituirse para ULBPs. Estos ligandos incluyen, pero no se limitan a MICA, MICB, y anticuerpos y pepticuerpos que se enlazan a NKG2D. Dentro de la solicitud, salvo que se establezca de otra manera, las técnicas utilizadas pueden encontrarse en cualesquiera de varias referencias bien conocidas, tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. (1989); "Gene Expressión Technology," Methods in Enzymonology, Vol . 185, editado por D.Goeddel, (1991) Academic Press, San Diego, C,A; "Guide to Protein Purificatión" in Methods in Enzymology, .P. Deutscher, 3d., (1990) Academic Press, Ind; PCR Protocols: A Guide to Methods anda Aplications Innis et al. (1990) Academic Press, San Diego, CA; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd ed. , R.I. Freshney (1987) Liss, Inc., ew York, N.Y; y Gene Transfer and Espression Protocols, pp 109-128, ed E.J. Murray, The Humana Press. Inc., Clifton, N.J. Teniendo generalmente descrita la invención, la misma se entenderá mas fácilmente por referencia de los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretenden como limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Clonado Molecular de ADNc ULPB4 Humano Las secuencias de ADNc descritas en dos patentes relacionadas, WO 99/06554 ('554) y WO 99/31236 ('236), se identifican en la presente como que tienen una homología posible a la familia ULBP de proteínas. La WO'554 describe una secuencia EST de 370 bp, reportada para codificar posiblemente una proteína secretoria, sin embargo la EST no se reconoce como que codifica cualquier proteína específica ni cualquier proteína relaciona a cualquier familia conocida de proteína. La WO'236 recita una secuencia 989 pares base de extensión de ADNc (SEQ ID NO: 320) considerada para codificar una porción de una proteína secretoria humana. La secuencia no se reconoce como que codifica cualquier proteína específica ni cualquier proteína relacionada a cualquier familia conocida de proteínas. Una base de datos genómica pública (NCBI/NIH) se busca para secuencias que tienen homología a la secuencia de ADNc 989 bp de la solicitud WO'236. La búsqueda revela una secuencia homologa, pero no idéntica en un alargado genómico del ADN (GenBank número de acceso AL355312) . Con base en el conocimiento de la estructura intron-exon de los genes ULBPl, 2 y 3, la estructura del gen ULBP4 se predice y se usa para diseñar cebadores PCR que serán específicos para un ADNc ULBP4 predicho. Los dos cebadores, cebador delantero: 5' TAT GCT GAC CTC CAC AGT ATG GGA AGA ATA TCC CTG 3' (SEQ ID NO: 7) y cebador inverso: 5 'ATA GGC GGC CGC AGA CTA AGA CGT CCT CAA 3' (SEQ ID NO: 8) , se usan para amplificar la longitud completa del ADNc ULBP4 de una colección de ADN de Namalwa (linfoma de célula B humanos) (línea de célula CRL-1432 disponible de ATCC, Manassas, VA) por PCR. Se clona un ADNc, secuencia y se encuentra que tiene una estructura de lectura abierta de 789 pares bases. La secuencia del ácido nucleico del clon de ADNc (SEQ ID NO: 1) y su secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 2) se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 ÜLBP4 Met Arg Arg lie Ser Leu Thr Ser Ser Pro Val Arg Leu Leu 14 ATG CGA AGA ATA TCC CTG ACT TCT AGC CCT GTG CGC CTT CTT Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu lie Ala Leu Glu lie Met Val 28 TTG TTT CTG CTG TTG CTA CTA ATA GCC TTG GAG ATC ATG GTT Gly Gly His Ser Leu Cys Phe Asr. Phe Thr lie Lys Ser Leu 42 GGT GGT CAC TCT CTT TGC TTC AAC TTC ACT ATA AAA TCA TTG Ser Arg Pro Gly Gln Pro Trp Cys Glu Ala Gln Val Phe Leu 56 TCC AGA CCT GGA CAG CCC TGG TGT GAA GCG CAG GTC TTC TTG Asn Lys Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Asn Ser Asp Asn Asn Met 70 AAT AAA AAT CTT TTC CTT CAG TAC AAC AGT GAC AAC AAC ATG Val Lys Pro Leu Gly Leu Leu Gly Lys Lys Val Tyr Ala Thr 84 GTC AAA CCT CTG GGC CTC CTG GGG AAG AAG GTA TAT GCC ACC Ser Thr Trp Gly Glu Leu Thr Gln Thr Leu Gly Glu Val Gly 98 AGC ACT TGG GGA GAA TTG ACC CAA ACG CTG GGA GAA GTG GGG Arg Asp Leu Arg Met Leu Leu Cys Asp lie Lys Pro Gln lie 112 CGA GAC CTC AGG ATG CTC CTT TGT GAC ATC AAA CCC CAG ATA Lys Thr Ser Asp Pro Ser Thr Leu Gln Val Glu Met Phe Cys 126 AAG ACC AGT GAT CCT TCC ACT CTG CAA GTC GAG ATG TTT TGT Gln Arg Glu Ala Glu Arg Cys Thr Gly Ala Ser Trp Gln Phe 140 CAA CGC GAA GCA GAA CGG TGC ACT GGT GCA TCC TGG CAG TTC Ala Thr Asn Gly Glu Lys Ser Leu Leu Phe Asp Ala Met Asn 154 GCC ACC AAT GGA GAG AAA TCC CTC CTC TTT GAC GCA ATG AAC Met Thr Trp Thr Val lie Asn His Glu Ala Ser Lys lie Lys 168 ATG ACC TGG ACA GTA ATT AAT CAT GAA GCC AGT AAG ATC AAG Glu Thr Trp Lys Lys Asp Arg Gly Leu Glu Lys Tyr Phe Arg 182 GAG ACA TGG AAG AAA GAC AGA GGG CTG GAA AAG TAT TTC AGG Lys Leu Ser Lys Gly Asp Cys Asp His Trp Leu Arg Glu Phe 196 AAG CTC TCA AAG GGA GAC TGC GAT CAC TGG CTC AGG GAA TTC Leu Gly His Trp Glu Ala Met Pro Glu Pro Thr Val Ser Pro 210 TTA GGG CAC TGG GAG GCA ATG CCA GAA CCG ACA GTG TCA CCA Val Asn Ala Ser Asp lie His Trp Ser Ser Ser Ser Leu Pro 224 GTA AAT GCT TCA GAT ATC CAC TGG TCT TCT TCT AGT CTA CCA Asp Arg Trp lie lie Leu Gly Ala Phe lie Leu Leu Val Leu 238 GAT AGA TGG ATC ATC CTG GGG GCA TTC ATC CTG TTA GTT TTA Met Gly lie Val Leu lie Cys Val Trp Trp Gln Asn Gly Glu 252 ATG GGA ATT GTT CTC ATC TGT GTC TGG TGG CAA AAT GGT GAG Trp Gln Ala Gly Leu Trp Pro Leu Arg Thr Ser [SEQ ID NO: 2] TGG CAG GCT GGT CTC TGG CCC TTG AGG ACG TCT TAG [SEQ ID NO;l] La secuencia de aminoácido predicha por el ADNc se determina para tener homología con los polipéptidos ULBP como se muestra a continuación en el Ejemplo 2, Tabla 3. El polipéptido ULBP novedoso, ULBP4, tiene una secuencia de aminoácido predicha que es distinta de la que se predice de la secuencia de ADNc descrita en WO 99/31236 [SEQ ID NO: 320] , con 26 aminoácidos no idénticos de 264, como se muestra en la Tabla 2. Ocho de los distintos residuos de aminoácidos caen dentro de aproximadamente 183 aminoácidos de los dominios alfa 1 y alfa 2. De estos, dos de los aminoácidos erróneos, aquellos en la posiciones 123 y 166, se representan por los codones de detención potenciales en las posiciones correspondientes en la secuencia de ADNc descrita en WO 99/31236 (SEQ ID NO: 320} .

Tabla 2 WO'23S 1 MRRISLTSSPVRLLLXLLLLLIALEIMVGGHSLCFNFTIKSLSRPGQPWC 50 iiiiiiiiiiiiiii imiimiiimimiimiiMiiiiii ULBP4 1 KHRISLTSSPVRLLLFLLLLLIALEIMVGGHSLCFNFTIKSLSRPGQPWC 50 51 FLNKNLFLQYNSDNMVKPLGLLGKKVYATSTWGBLTQTLGHVGRD 100 51 VFUJKNLFLQYNSD NMVKPLGLLGKKVYATSTWGELTQTLGEVGRD 100 101 LRMLLCDIKPQIKTSDPSTLQV ??FCQREAERCTGASWQFATNGEKSLLF 150 101 LRMLLCDIKPQIKTSDPSTLQVEM FCQREAERCTGASWQFATNGEKSLLF 150 151 DAMNMTKTVINHEAS ttKETWKKDBMLE ÍFRKLSKGDCDHWLREFLGH 200 151 DAMNMTWTVINHEASl] IKETWKKDRHLE ÍFRKIJSKGDCDH LREFLGHW 200 201 EAMP59pjxh/SF^N S^IHWSSS0LP^¾WIILGAFILL¡X|LMGIVLICVWWQN 250 MNlijiLiiiniiiiiijiriiiiiiiiiiniiiiiuiiiui 201 EAMP@P^SE^AS§IH SSS||]LPpgWIILGAFILI^MGIVLICV WQN 250 251 GKXSTXXl* 253 WO '236 [SEQ ID NO: 6] 251 G|EWQAGI,WPLRTS|» 264 ULBP4 [SEQ ID NO: 2] Ejemplo 2: ULBP4 es un Miembro de la Familia ULBP Las alineaciones y comparaciones de secuencia de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos ULBPl, ULBP2 , ULBP3, y ULBP4, se prepararon usando los programas PILEUP y GAP de Genetics Computer Group, Inc (GCG, Inc., Madison, Wisconsin) . Un examen de la alineación de la secuencia de aminoácidos de los miembros de la familia ULBP indica que la secuencia de aminoácido ULBP4 es homologa a la secuencia de aminoácido de los miembros de la familia ULBP conocidos, ULBPl, ULBP2, y ULBP3 , (Ver Tabla 3) . La secuencia de aminoácido predicha para ULBP es aproximadamente 35% idéntica a ULBPl, aproximadamente 28% idéntica a ULBP2 , y aproximadamente 33% idéntica a ULBP3. En particular, ULBP4 tiene regiones que son homologas a los dominios alfa 1 y alfa 2 de ULBPl, ULBP2, y ULBP3. Por ejemplo, el dominio alfa 1 del polipéptido ULBP4 se extiende desde los residuos de aminoácidos Leu 24-His31 hasta Aspll6. Esto conforma cercanamente al dominio alfa 1 de ULBPl, ULBP2, y ULBP3. El dominio alfa 2 del polipéptido ULBP4 se extiende desde los residuos de aminoácidos Proll7 hasta Thr207, que conforma cercanamente al dominio alfa 2 de ULBPl, ULBP2 , y ULBP3. Los residuos de aminoácidos altamente conservados están presentes a través de los dominios alfa 1 y alfa 2, lo que agrega un soporte adicional de que en ULBP4 es un miembro de la familia ULBP. Los datos de alineación soportan la conclusión de que ULBP4 es un miembro de esta familia de proteína. Una molécula de polinucleotido novedosa y el polipéptido deducido correspondiente ULBP4 se identifica en la presente como un miembro nuevo de la familia ULBP de proteína. Varias características interesantes están presentes en la secuencia de aminoácido ULBP4, incluyendo una secuencia de señal, dominios alfa 1 y alfa 2, y un dominio de transmembrana único con una raíz citoplásmica corta. Como se discute arriba, esta estructura es característica de los polipéptidos ULBP conocidos, ULBP1, ULBP2, y ULBP3. El ULPB4 novedoso tipo ULBP1, ULBP2,y ULBP3 , difiere de la moléculas de clase I MHC tradicionales en que carece de un dominio alfa 3 y por lo tanto no es capaz de asociarse con la microglobulina beta 2.

Tabla 3 Secuencia de señal ULBPl MAAAA SPAFLLCLPL L.HLLSG SR AGWV DTHCLC YDFIITPKSR ULB?2 MAAAA ATKILLCLPL L . LLLSGWSR AGRA DPHSLC YDITVIPKFR ULBP3 MAAA». SPAILPRLAI LPYLLFDWSG TGRA DAHSLW YNFTIIHLPR ULBP4 MRRISLTSSP VRLLLFLLLL LIAL EIMV GGHSLC FNFTIKSLSR 1 * *##* ** 44 ninio al ULBPl PEPQWCEVQG LVDERPFLHY DCVNHKAKAF ASLGKKVNVT KTOEEQTETL LXBP2 PGPRWCAVQG QVDEKTFLHY DCGNKTVTPV SPLGKKLNVT TAWKAQNPVL ULHP3 HGQQWCEVQS QVDQ NFLSY DCGSD VLSM GHLEEQLYAT DA GKQLEML ULBP4 PGQPJCEAQV F NKNIjFLQY NSDNTfi/KPL GLLG KV?AT ST GELTQTL 45 94 ULBPl RDWDFLKGQ LLDIQVENLIPIE PLTLQAR MSCEHEAHGH GRGSWQFLFN ULBP2 REWDILTEQ LRDIQLENYTPKE PLTLQAR MSCEQ AEGH SSGSWQFSFD ULBP3 REVGQRLRLE LADTELEDFrPSG PLTLQVR MSCECSADGY IRGSWQFSFD ULBP4 GEVGRDLR L LCDIK.PQI TSD PSTLQVE MFCQREAERC TGASWQFATN 95 113 117 143 Dominio a2 UL3P1 GQKFLLFDSN NRK TALHPG AKK TEKWEK NRDVTMFFQK ISLGDCKMWL UL3P2 GQIFLLFDSE KRMWTTVHPG AR MKEK EK DKWAMSFHY FS GDCIGWL UL3P3 GRKFLLFDSN NRKVÍ WHAG ARR KH WEK DSGLTTFFKM VSMRDCKS L ULBP4 GEKSLLFDAM NMTWTVINHE ASKIKETWKK DRGLEKYFRK LSKGDCDHWL 144 193 Señal de ancla QPI ÜLBP1 EEFLKYWEQM LDPT.. KPPS LAPGTTQPKA MATTLSPWSL LIIFLCFILA ULBP2 EDFtiMGMDST LEPSAG APLA MSSGT QLRA TATTLILCCL LIILPCFILP ULBP3 RDFLMHRKKR LEPT.. APPT MAPGLAQPKA lATTLSPWSF LIIL.CFILP ULBP4 REFLGHWEAM PEPT.. ..VS PVNASDIHWS SSSLPDRWII LGAFILLVLM — Dominio TM - 194 211 139 ULBP1 GR* [SEQ ID NO: 3] ULBP2 GT* [SEO. ID NO: 4] ULBP3 GZ* [SEQ ZD NO: 5] ULBP4 GIVLICVWWQ NGEWQAGLWP LRTS* (SEQ ID NO:2] 240 263 Nota: Las numeraciones de conformidad de la secuencia de aminoácido de ULBP4. * Extremo potencial de la secuencia de señal ULBP4.

Ejemplo 3: Enlace de ULBP4 a los Receptores NK Receptores de superficie de célula NKG2D que median la activación ULBP de células eliminadoras NK (Cosman et al. (2001), Immunity 14: 123-133). El polipéptido ULBP4 de los Ejemplos 1 y 2 se analiza para su capacidad de enlazar células CV-1 que expresan el receptor NKG2D recombinante , siguiendo los métodos generales escritos en Cosman et al . , supra . Los constructos de proteína de fusión FC que expresan NKG2D humano y murino se prepararon, expresados en células CV-1, y las proteínas de fusión se purificaron de los sobrenadantes de cultivo por cromatografía (proteína A-columna Poros, PerSeptive Biosystem) . Las proteínas de fusión Fe contienen el dominio extracelular de la proteína de interés fusionada a la terminación amino de la región de articulación de una región IgGl Fe humana modificada (Baum et al., (1994), EMBO J. 13: 3992-4001) y se subclonan en el vector de expresión mamífero pDC409 (Giri et al. (1994), EMBO J. 13 : 2822-2830) . La proteína de fusión UL16-FC contiene el domino extracelular de UL16 fusionado a la región Fe después del aminoácido 183. La proteína de fusión NKG2D-Fc contiene la región extracelular del NKG2D fusionado a la región Fe en el aminoácido 74. Estas proteínas de fusión solubles se preparan como se describe (Cosman et al. (2001), Immunity 14: 123-133). Las células CV-1 se transfectan con vectores pDC409 que contienen ADNc que expresa los ULBP1, ULBP2, ULBP3 , y ULBP4, de longitud completa, así como vector de control vacíos. Las células transfectadas se incuban entonces con NKG2D-Fc humano o murino o con UL16-Fc en solución salina amortiguada de fosfato que contiene suero de bovino fetal al 3%. Después de la incubación con la proteína de fusión indicada durante una hora en hielo, las células se lavan dos veces y se incuban con el anticuerpo IgG antihumano de cabra (Fe específico) conjugado a ficoeritina (PE) (Sigma, Milwaukee, WI) . Las células se lavan dos veces y se analizan para enlace por citrometría de flujo en un Becton Dickinson FACScan. Las células que tienen fluorescencia entre un log hasta dos logs arriba del respaldo (el respaldo se toma como la cantidad de fluorescencia de la células manchadas con el reactivo de la segunda etapa) se caracterizan como ++. Las células que tienen una fluorescencia mas fuertemente se registran como +++. Las células que tienen una fluorescencia mayor que las del respaldo, pero menos que las de un log arriba del respaldo, se caracterizan como +++ . Como se muestra a continuación en la Tabla 4, ULBP4 se enlaza fuertemente y específicamente al NKG2D-FC humano en un patrón que es similar a la actividad de enlace de ULBP3. Igual que cada uno de ULBP1, ULBP2 , y ULBP3 , la proteína novedosa ULBP4 enlaza al receptor de célula eliminadora NK humana, NKG2D. Esta actividad de enlace, tomada junto con el grado mayor de identidad estructural con ULBP1, ULBP2, y ULBP3 , confirma la colocación de ULBP4 en la familia ULBP de proteínas que estimulan la células efectoras inmunes por medio del acoplado del receptor NKG2D.

TABLA 4 Resultados de NKG2D-FC NKG2D-FC UL16-FC Humano Murino ULBP1 +++ +++ +++ ULBP2 +++ +++ ++ ULBP3 +++ Negativo Negativo ULBP4 +++ + Negativo Vector 409 vacío Negativo Negativo Negativo Ejemplo 4: Aumento de la Citotoxicidad Mediada por la Célula NK por Proteínas ULBP. Este experimento fue un ensayo de liberación de 51Cr diseñado para determinar si la expresión de la proteína ULBP en la superficie de una célula objetivo etiquetada con 51Cr puede aumentar la eliminación de la célula objetivo por una célula efectora NK. Células NK humanas traídas de la línea NKL de células NK humanas descrita en Robertson et al., ((1996), Exp. Hematol . 24: 406-15). Las células NK murinas se obtienen de ratones C57/B6 SCID como sigue. Los ratones se sacrifican y los bazos se remueven y machacan para liberar las células, que consisten primariamente de células de glóbulos rojos, células B, células T y células NK. Las células liberadas se incuban durante 2 minutos a temperatura ambiente en 155 mM NH4C1, 16.5 mM Tris-HCl, pH 7.4 y se lavan rápidamente en un medio con objeto de lisar selectivamente las células de glóbulos rojos, dejando la mayoría de las otras células intactas. Para estimular la expansión de células NK, las células restantes se cultivan durante 3 días a 2 millones de células por mililitro en un medio que contiene 200 nanogramos por mililitro de IL-15 humano recombinante (descrito en la patente de E.U.A. No. 5,574,138, donde IL-15 se llama "factor de célula T derivado del epitelio", y en EP 0 772 624). Al día 3, las células se tiñen con un anticuerpo que se enlaza específicamente al NKG2D murino, que se expresa en células N murinas, para determinar que porcentaje de las células son células NK. Un cultivo en el cual al menos alrededor del 80% de las células teñidas con el anticuerpo para NKG2D murino, es apropiado para usarse en un ensayo de citotoxicidad en el día 4. Las células objetivo fueron células EL4 , una línea de células de linfoma disponible de, por ejemplo, American Type Culture Collection, ya sea transfectadas o no transfectadas con ácidos nucleicos que codifican la longitud completa de las proteínas ULBPl, ULBP2 , ULBP3 ó ULBP4 humanas. Las células EL4 no transfectadas no expresan las proteínas ULBPl, ULBP2, ULBP3 ó ULBP4 humanas. Las células objetivo fueron 51Cr alimentadas en un medio durante alrededor de 1 hora y posteriormente se lavan. Los ensayos se realizan en placas microtituladas de 96 pozos en un volumen total de 200 µ? . Para células efectoras NK humanas, se incuban células objetivo 104 durante 2 hasta 3 horas a 37°C en C02 al 5% con varios números de células NK (esto es, efectores) en las siguientes relaciones efector: célula objetivo: 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 6 0.6:1. Para células efectoras NK murinas, se incuban células objetivo 5 x 103 durante 2 hasta 3 horas a 37°C en C02 al 5% con varios números de células NK (esto es, efectoras) en la siguiente relación efector : célula objetivo: 20:1, 10:1, 5:1, ó 2.5:1.

Como un control negativo, se incuban células objetivo sin células efectoras. Como un control positivo, las células objetivo se lisan con detergente. La radioactividad liberada en el medio se cuenta en un contador gamma. Se calcula el porcentaje de citotoxicidad como la radioactividad liberada de una muestra experimental menos la radioactividad liberada del control negativo dividido por la radioactividad liberada del control positivo menos la radioactividad liberada del control negativo multiplicado por 100. Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 indica que la expresión de la proteína ULBP1, ULBP2 ó ULBP4 en la superficie de las células objetivo puede aumentar la citotoxicidad de células NK murinas . La Figura 2 indica que la expresión de proteína ULBP1, ULBP2 , ULBP3 ó ULBP4 en la superficie de las células objetivo puede aumentar la citotoxicidad de las células NK humanas.

Ejemplo 5: Enlace de Formas Solubles de ULBP4 a Células NK Se da el siguiente experimento para determinar si las formas solubles de proteína ULBP4 podrán enlazarse a células NK humanas. Se crean dos diferentes constructos que codifican las proteínas de fusión ULBP4:Fc. Uno que codifica una proteína ULBP4:Fc iniciando en la posición 1 y terminando en la posición 217 de SEQ ID NO : 2 (ULBP4 : Fc-B) . el otro codifica una proteína ULBP4 iniciando en la posición 1 y terminando en la posición 224 de SEQ ID NO: 2 (ULBP4 : Fe-A) . Ambas de estas proteínas ULBP4 se fusionan en sus terminales carboxi para una región Fe de un anticuerpo IgGl humano. Estas proteínas de fusión ULBP4:Fc más una proteína de fusión ULBPl:Fc usada como control, se purifican por la cromatografía de proteína A de un medio de células de mamífero transíectadas con constructos que codifican las proteínas. Los análisis de las secuencia de terminal amino de estas proteínas ULBP4 indican que His31 de SEQ ID NO : 2 es la terminación amino de la forma madura de estas proteínas . Se aislan células NK humanas de dos diferentes donadores y se estimulan durante la noche con IL-15 humano recombinante como se describe en Kubin et al. ((2001), Eur. J. Immunol . 31: 1428-37) . Alrededor de un millón de células NK se preincuban con 1 µg de proteína (ya sea ULBP4:Fc-A, ULBP4:Fc-B, ó ULBPl:Fc) durante 30 minutos a 0°C. Las células NK se lavan posteriormente, se tiñen con un anticuerpo etiquetado de fluorescencia específico para la región Fe de un anticuerpo IgG humano, y se analizan por citometría de flujo. Como un control negativo, las células NK que no se preincuban con ninguna proteína se lavan, se tiñen y se analizan igual que las muestras experimentales. La intensidad de fluorescencia media de las muestras usando células NK de un donador se muestra en la Tabla 5. Los valores usando células NK de otro donador son similares.

TABLA 5 Estos datos muestran que (JLBP4 : Fc-B puede enlazarse a células NK, mientras que ULBP4 : Fc-A, si es que se enlaza, a una extensión menor.

Ejemplo 6: Rechazo de Tumores Mediado por ULBP en Ratones de Tipo Silvestre In Vivo El siguiente experimento prueba si la expresión de proteína ULBP en la superficie de tumor murino puede jugar un papel en el rechazo de tumor in vivo. Cuando se inyecta en ratones, las células EL4 pueden causar tumores. Las células EL4 expresan los ligandos NKG2D. Diefenbach et al. (2000), Nature Immunology 1(2): 119-26. Las células EL4 se transfectan en un cultivo ya sea con ULBP1, ULBP2, RAE-?ß (un ligando NKG2D murino: Diefenbach et al., supra) , o una forma truncada del receptor IL-4 de murino (IL-4R) . El IL-4R no se espera que medie el rechazo del tumor in vivo y se pretende como un control negativo. El día cero, 3 x 105 células de tumor EL4 que expresan ya sea ULBP1, ULBP2, ULBP3 , RAE-?ß, ó IL-4R, se inyectaron subcutáneamente en ratones C57/B6. El tamaño del tumor se midió durante un periodo de 15 días. La incidencia de tumor el día 15 se muestra en la Tabla 6. El tamaño de tumor medio se hace en una gráfica contra el tiempo en la Figura 3. Tabla 6 Estos datos indican que los tumores en ratones que comprenden células que expresan ULBP o RAE-?ß se rechazan de preferencia in vivo cuando se compara con tumores que no expresan estos ligandos NKG2D.

Ejemplo 7¡ Rechazo de Tumores Mediado por ULBP en Ratones s id In Vivo El siguiente experimento se diseña para determinar si el rechazo de tumor observado en el Ejemplo 6 anterior depende de la acción de la células B y/o T. Alrededor de 3 x 105 células EL4, ya sea no transfectadas o transfectadas con, ya sea ULBP1, ULBP2 , ULBP3 , ó RAE-?ß, se inyectan en ratones C57/B6 que portan una mutación que confiere una deficiencia inmune combinada severa (ratones scid) . Se inyectan diez ratones con cada uno de los tipos de células. Los ratones scid exhiben una falla de recolocación de ADN en el desarrollo de linfocitos y tienen células B y T muy inmaduras. Janeway et al., Immunobiology, 5th edition, Part V, Garland Publishing, New York and London (2001) . El tamaño de tumor se mide en los días 1 hasta 24 y se hacen gráficas contra tiempo en la Figura 4. Estos datos indican que el rechazo al tumor que es dependiente de la transfección con RAE-?ß o un ULBP, se presenta en ratones scid así como ratones de tipo silvestre. De esta manera, tal rechazo al tumor posiblemente no depende de la acción de las células B y T. La invención se ha descrito con referencia a ejemplos específicos. Estos ejemplos no son un medio para limitar la invención de ninguna manera. Se entenderá para propósitos de esta descripción, que pueden hacerse varios cambios y modificaciones a la invención que están dentro del alcance de la invención. Pueden hacerse numerosos otros cambios que se sugieren fácilmente por si mismos para aquellos expertos en la técnica y que se abarcan en el espíritu de la invención descrita en la presente y como se define en las reivindicaciones adjuntas. Esta especificación contiene numerosas citas a patentes, solicitudes de patentes y publicaciones. Cada una se incorpora en la presente para referencia para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una proteína ULBP4 aislada, caracterizada porque comprende un polipeptido que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 92% idéntica a la SEQ ID NO: 2, en donde la proteína ULBP4 es codificada por un polinucleotido, en donde el polinucleotido codifica a una proteína de al menos alrededor de 217 aminoácidos, y en donde el polipéptido puede enlazarse a NKG2D. 2. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos codifica un domino alfa-1 y un dominio alfa-2. 3. La proteína de ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 2. 4. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácido es al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:2. 5. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína ULBP4 es soluble . 6. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende los aminoácidos 32 hasta 207 de SEQ ID NO:2. 7. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende los aminoácidos 31 hasta 217 de SEQ ID NO:2. 8. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende SEQ ID NO: 2. 9. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína ULBP4 comprende además un péptido heterólogo. 10. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido heterólogo es una etiqueta de péptido. 11. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido heterólogo es una porción péptida que promueve la oligomerización. 12. Una proteína ULBP4 aislada, caracterizada porque comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos al menos 98% idéntica a SEQ ID N0:2, en donde el polipéptido puede enlazarse a NKG2D. 13. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos es 100% idéntica a SEQ ID NO:2. 14. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína ULBP es soluble . 15. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos codifica un dominio alfa-1 y un dominio alfa-2. 16. La proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína ULBP4 comprende además un péptido heterólogo. 17. Un polinucleótido ULBP4 aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:l, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que se puede enlazar a NKG2D, y en donde el polipéptido es al menos de 160 aminoácidos de longitud. 18. El polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido comprende un dominio alfa-1 y un dominio alfa-2. 19. El polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido es al menos 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1. 20. El polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende los residuos 94 hasta 621 de la SEQ ID NO:l. 21. El polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido comprende además un péptido heterólogo. 22. El polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido comprende los aminoácidos 31 hasta 217 de SEQ ID NO: 2. 23. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 17. 24. Una célula hospedadora, caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 23. 25. Un método para producir el polipéptido ULBP4, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 24 bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido ULBP4. 26. Una célula hospedadora producida genéticamente, caracterizada porque expresa el polinucleótido ULBP4 de conformidad con la reivindicación 22. 27. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la célula hospedadora es una célula de mamífero. 28. Un método para producir una proteína ULBP , caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 27, bajo condiciones que permiten la expresión del polinucleótido ULBP4. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además aislar la proteína ULBP4 de las células hospedadoras o el medio. 30. Una proteína ULBP4, caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 28. 31. Un polinucleótido ULBP4 aislado que codifica la proteína ULBP4, caracterizado porque comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos al menos 92% idéntica a la SEQ ID NO: 2, en donde la proteína ULBP4 es al menos alrededor de 217 aminoácidos en longitud, y en donde el polipéptido pueden enlazarse a NKG2D. 32. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1. 33. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 5. 34. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 12. 35. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se enlaza específicamente a la proteína que consiste de la SEQ ID NO: 2. 36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo enlaza específicamente a la proteína que consiste de los aminoácidos 32 hasta 207 de SEQ ID N0:2. 37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo es humano o humanizado . 38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo se fusiona a un agente citotóxico o radioactivo. 39. El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, en la manufactura de una composición farmacéutica . 40. El uso de la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, en la manufactura de un medicamento para activar células que expresan NKG2D. 41. El uso de la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, en la manufactura de un medicamento para aumentar la citotoxicidad de las células que expresan NKG2D. 4 . El uso de la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, en la manufactura de un medicamento para estimular la producción de citocinas o quimiocinas por células que expresan NKG2D. 43. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 40 a 42, en donde las células son células N . 44. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 40 a 42, en donde las células son células T. 45. El uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35 en la manufactura de un medicamento para submodular una respuesta inmune . 46. El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, en la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune . 47. Un método para detectar o cuantificar una proteína, caracterizado porque comprende incubar el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, con una proteína ULBP4 y analizar la cantidad de complejo proteína ULBP4-anticuerpo, por lo que se detecta o cuantifica la proteína en la muestra. 48. El uso de la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, en la manufactura de un medicamento para inhibir el crecimiento del tumor. 49. El uso de células de tumor no divididas, cultivadas, derivadas de un tumor removido de un paciente, en la manufactura de un medicamento para inhibir el crecimiento de células de tumor que se mantienen en el paciente después de remover el tumor, en donde la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1 se expresa en la superficie de las células de tumor cultivadas. 50. El uso de conformidad con la reivindicación 49, en donde los ácidos nucleicos que codifican la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1, se han introducido en las células de tumor cultivadas. 51. El uso de conformidad con la reivindicación 49, en donde las células de tumor cultivadas se han irradiado. 52. El uso de la proteína ULBP4 de conformidad con la reivindicación 1 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección. 53. El uso de conformidad con la reivindicación 52, en donde la infección es una infección viral .