JP3365859B2 - プレｂ細胞増殖支持能を有するポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子、及び該遺伝子
によってコードされる接着因子に関し、更に詳しくは、
プレＢ細胞増殖支持能を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターに
よる形質転換体、及び該遺伝子を用いたプレＢ細胞増殖
支持能を有する接着因子の製造方法に関する。

【０００２】本発明の遺伝子は、慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）患者や多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の骨髄細胞や滑膜
細胞上のプレＢ細胞増殖支持能を亢進する新規接着因子
をコードする。本発明の遺伝子を適当なベクターに挿入
した後、常用の宿主細胞を形質転換することにより、大
量に均一なプレＢ細胞増殖支持能を有する接着因子を製
造することが可能となる。このことから、本発明によ
り、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）の同定及びこれらの臨床上の診断用試薬の作成が可
能となる。

【０００３】

【従来の技術】従来、骨髄細胞の異常が、Ｂ細胞悪性腫
瘍や自己免疫疾患の発生に関与していることが報告され
ている〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２
４３（１９９１）〕。

【０００４】すなわち、多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄
の微小環境に依存して進行する患癌であり骨髄中で限定
された増殖を示す単一形質球癌であるが、骨髄ストロー
マ細胞に依存的なＢ細胞の分化増殖過程の初期段階（プ
レＢ細胞）で多発性骨髄腫（ＭＭ）のガン遺伝子の転換
が起こることが知られている〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
１５０：７９２（１９７９）、及びＣａｎｃｅｒ Ｇｅ
ｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，１７：１３（１９８
５）〕。

【０００５】また、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の末梢血
中を循環する多発性骨髄腫（ＭＭ）の前駆細胞の増殖を
骨髄ストローマ細胞が促進するという事実が報告されて
いる〔Ｂｌｏｏｄ，７７：２６８８（１９９１）〕。

【０００６】これらのことから、骨髄ストローマ細胞が
多発性骨髄腫（ＭＭ）の増殖を促進するシグナルを提供
している可能性がある。

【０００７】一方、ＩＬ−６の異常生産が、慢性関節リ
ウマチ（ＲＡ）の発生に関与していることが知られてい
る〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１７９７
（１９８８）、及びＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，６２：Ｓ６０（１９９２）〕。
更に、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：７２３
（１９９０）、及びＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２
１：６３（１９９１）に報告された自己免疫疾患のマウ
スモデルの結果から、慢性リウマチ（ＲＡ）の骨髄は何
らかの異常が存在することが示唆される。すなわち、慢
性関節リウマチ（ＲＡ）においても、ポリクローナルな
Ｂ細胞活性化が羅患関節に隣接する骨髄に起因している
可能性が示唆されている。

【０００８】本発明者は、これらＢ細胞の機能異常をき
たす疾患における骨髄微小環境の病的意義を明らかにす
ることを目的として、研究を進めており、ＲＡ及びＭＭ
患者では、正常人と比較して、骨髄由来ストローマ細胞
のプレＢ細胞増殖支持能が亢進していること、及びこの
支持能には、プレＢ細胞とストローマ細胞との直接接触
が必須であることを報告すると共に、ＲＡ及びＭＭ患者
の骨髄ストローマ細胞上にプレＢ細胞の増殖を促進する
因子があるはずであるとの洞察に基づいて、各々の患者
のストローマ細胞をセルライン化し、プレＢ細胞の増殖
を促進する因子を有するストローマ細胞株（ＲＡＳＶ５
−５，ＭＭＳＶ３−３）を樹立した。これらストローマ
細胞株によるプレＢ細胞の増殖支持には、既知のＳｔｅ
ｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、ＩＣＡＭ−
１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１α，ＬＦＡ−
１β、ＮＣＡＭ、ＥＬＡＭ−１とは別の未知の接着因子
が関与していることが示唆された〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１４９：４０８８（１９９２）〕。

【０００９】そこで、本発明者は、プレＢ細胞増殖支持
能の高いＲＡ患者の骨髄由来ストローマ細胞株ＲＡＳＶ
５−５を感作抗原としてモノクローナル抗体を作製した
ところ、前記ＲＡ患者の骨髄由来ストローマ細胞株、及
びＭＭ患者の骨髄由来ストローマ細胞株に反応し、プレ
Ｂ細胞増殖支持能を持たないヒト骨髄由来ストローマ細
胞株ＮＦＳＶ１−１には反応しないモノクローナル抗体
ＲＦ３を得た。

【００１０】更にはＲＡ患者の滑膜細胞をセルライン化
した滑膜細胞株ＳｙｎＳＶ６−１４を免疫して得たハイ
ブリドーマＳＧ２が産生するモノクローナル抗体が、Ｒ
Ａ患者の骨髄由来ストローマ細胞株ＲＡＳＶ５−５と反
応し、プレＢ細胞増殖支持能を持たないヒト骨髄由来ス
トローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１には反応しないことも見
い出した。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】これらのハイブリドー
マが認識するプレＢ細胞増殖支持能を有する新規な接着
因子の発現は、ＲＡやＭＭ患者の病態の程度と相関して
いる可能性が考えられることから、この膜タンパクのよ
り正確な性状の解明と共に診断治療やその研究に利用可
能な量の確保が重要な課題となっている。従って、この
接着因子の遺伝子の構造の解明及び組換えＤＮＡ技術を
用いた接着因子の大量生産技術の確立が望まれていた。

【００１２】すなわち、本発明は、プレＢ細胞増殖支持
能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子
を含有するベクター、該ベクターによる形質転換体、及
び該遺伝子を用いたプレＢ細胞増殖支持能を有する接着
因子の製造方法を提供することを目的とするものであ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】かかる状況下において、
本発明者等は、接着因子が発現している細胞より調製し
たｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成した後、こ
れらｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクタ
ーにより形質転換された形質転換体を得た。次いで、前
記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体と強く
反応する形質転換体を選別し、その作成に用いたｃＤＮ
Ａを更に区分けして再び発現ベクターに挿入し、前記抗
体と強く反応する形質転換体を選択し、その作成に用い
たｃＤＮＡを更に区分けして行く工程をくり返すことに
よって、プレＢ細胞増殖支持能を有する新規接着因子の
遺伝子をクローニングすることに成功した。また、この
遺伝子を適当なベクターに挿入して形質転換体を得、そ
れを培養することにより、この新規接着因子を大量に製
造することができることも明らかにした。

【００１４】従って、本発明は、ヒトプレＢ細胞増殖支
持能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供す
る。

【００１５】本発明は、更に、ヒトプレＢ細胞増殖支持
能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換
えベクターを提供する。

【００１６】本発明は、また、ヒトプレＢ細胞増殖支持
能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換
えベクターによって形質転換された原核もしくは真核宿
主細胞を提供する。

【００１７】本発明は、更に、ヒトプレＢ細胞増殖支持
能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換
えベクターによって形質転換された形質転換体を培養
し、産生したポリペプチドを分離することを特徴とする
ヒトプレＢ細胞増殖支持能を有するポリペプチドの製造
方法及びヒトプレＢ細胞増殖支持能を有するポリペプチ
ドを提供する。

【００１８】続いて、本発明について詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、例えば、ヒトプレＢ細胞増殖支持能
を示す接着因子を発現する細胞等からｍＲＮＡを調製し
た後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換すること
により得られる。このｍＲＮＡの供給源となる細胞とし
ては、ハイブリドーマＲＦ３やＳＧ２の免疫源として用
いたＲＡＳＶ５−５やＳｙｎＳＶ６−１４の細胞株があ
げられるが、これら細胞株に限らず、ヒトプレＢ細胞増
殖支持能を示す接着因子を発現している細胞であればよ
い。一例としては、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：４
０８８（１９９２）に開示された各種ストローマ細胞株
をあげることができる。尚、本発明では、ＳｙｎＳＶ１
−４を用いた。

【００１９】ｍＲＮＡを得るための全ＲＮＡの調製は、
グアニジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾
配遠心を行ない〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４（１９７
９）〕全ＲＮＡを得る方法や、バナジウム複合体のリボ
ヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フ
ェノール処理を行う〔Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｂｉｒｋｅｎ
ｍｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５１４
３（１９７９）〕方法の他、公知の手段を用いることが
できる。

【００２０】全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、オリゴ
（ｄＴ）を結合した担体、例えば、セファロースやセル
ロース等を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーかバッチ法により全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡを回収することでできる。また、ショ糖密度勾配遠
心法等によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを更に精製するこ
ともできる。その他、いったんＲＮＡを調製せずに、直
接ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを得る方法や市販のキットを
用いた簡便な方法もある。

【００２１】上記の如くして得たｍＲＮＡから二本鎖ｃ
ＤＮＡを得るには、例えば、ｍＲＮＡを鋳型にして、
３′末端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）を
プライマーとして逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補
的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。

【００２２】ｍＲＮＡをアルカリ処理により分解、除去
した後、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ
断片等）処理後、Ｓ１ヌクレアーゼなどで処理するか、
直接ＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼ等で処理する
ことによっても二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる〔Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）、及びＧｕｂ
ｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｇｅｎｅ，２５：２６
３（１９８３）〕。最近、簡便なキットも市販されてお
り、これらを用いて二本鎖ｃＤＮＡを得ることもでき
る。

【００２３】このようにして得られたｃＤＮＡを適当な
ベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１等のＥ
Ｋ型プラスミドベクターやλｇｔ１０等のファージベク
ター等に組み込んだ後、大腸菌（Ｘ１７７６，ＨＢ１０
１，ＤＨ１，ＤＨ５など）等を形質転換してｃＤＮＡラ
イブラリーを得ることができる（例えば、前出“Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”を参照）。

【００２４】一方、前述の方法で得た二本鎖ｃＤＮＡを
適当な発現ベクターに挿入することにより、他の原核生
物又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることができ
る。

【００２５】二本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるに
は適当な化学合成ＤＮＡアダプターを付加し、予じめ制
限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡとＡＴＰ存在
下にＴ４ファージＤＮＡリガーゼで処理することにより
行うことができる。

【００２６】本発明の発現ベクターは、複製起源、選択
マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナル等を含んでいる。

【００２７】哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモ
ーターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、シミアンウイルス（ＳＶ）４０等
のウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェー
ン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）等の細胞由来のプロモーターを用いればよい。例え
ば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎ等の方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１０８
（１９７９）〕に従えば、容易に実施することができ
る。

【００２８】複製起源としては、ＳＶ４０ポリオーマウ
イルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰ
Ｖ）等の由来のものを用いることができ、選択マーカー
としては、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）Ｉ
ＩあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を用いることがで
きる。

【００２９】宿主細胞として原核細胞を用いて目的の遺
伝子を形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来の
レプリコン、すなわち複製起源及び調節配列を含んでい
るプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよ
い。また、ベクターは、形質転換細胞に表現形質（表現
型）の選択性を付与することができるマーカー遺伝子を
持つものが望ましい。例えば、大腸菌の場合には、それ
を宿主とするベクターであるｐＢＲ３２２を用いて形質
転換することができる〔Ｂｏｌｉｖｅｒ等，Ｇｅｎｅ，
２：９５（１９７５）〕。ｐＢＲ３２２は、アンピシリ
ン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、ど
ちらかの耐性を利用することによって形質転換細胞を同
定することができる。原核宿主細胞の遺伝子発現に必要
なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ遺伝子のプ
ロモーター〔Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６
１５（１９７８）〕や、ラクトースプロモーター〔Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ等，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７
９）〕、及びトリプトファンプロモーター〔Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，８：４
０５７（１９８０）〕、ｔａｃプロモーター等があげら
れる。

【００３０】本発明の発現系に用いる宿主のうち原核宿
主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、バシラス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等があげられる。

【００３１】また、真核宿主細胞としては、例えば、サ
ッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核微生物があげら
れるほか、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細
胞、ＢＨＫ細胞、ナマルバ細胞、ヒト胎児腎細胞（２９
３細胞）等のホ乳動物由来の細胞も用いることができ
る。尚、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適し
た培養条件を適宜選択して行えばよい。

【００３２】プレＢ細胞増殖支持能を有する接着因子を
コードするｃＤＮＡを単離するには、例えば、プレＢ細
胞増殖支持能を指標とするか、抗体を用いた直接発現ク
ローニング等の方法を用いて行うことができる。プレＢ
細胞増殖支持能の測定は、マウスプレＢ細胞株ＤＷ３４
〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：１７６７（１
９８８）〕を用いて実施することができる。

【００３３】すなわち、２４穴プレートにプレＢ細胞増
殖支持能を有する接着因子を発現している細胞をサブコ
ンフルエント（概ね５０％密度が望ましい）になるまで
培養し、適量の放射線を照射した後、１穴あたり１〜２
×１０³ 個のＤＷ３４を添加し、１０％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で５％ＣＯ₂ の条件下、３７℃
で４〜６日間程度培養する。各穴のＤＷ３４の生存細胞
数をトリパンブルー染色で調べることによって増殖支持
能の亢進の程度がわかる。

【００３４】本発明では、プレＢ細胞増殖支持能を有す
る接着因子を認識するモノクローナル抗体ＲＦ３、ＳＧ
２を用いたＦＡＣＳｃａｎによるフローサイトメトリー
（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により、接着因子を
発現している形質転換体を選別し、その形質転換体の作
成に用いたプラスミドＤＮＡを細分化して再度形質転換
体を作成し、その形質転換体をフローサイトメトリーに
よりスクリーニングすることをくり返すことによって、
目的の遺伝子をクローニングすることができた。

【００３５】すなわち、形質導入された形質転換体（２
９３Ｔ細胞）を培養した後、０．０２％のＥＤＴＡを含
むＰＢＳでプレートより剥がし、２％ＦＣＳ、０．０２
％ＮａＮ₃ を含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ緩衝液で細胞
を洗浄した後、一次抗体としてＲＦ３及びＳＧ２と反応
させる。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して未反応の一
次抗体を除去し、二次抗体のＦＩＴＣ標識抗体（ＦＩＴ
Ｃ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体）と更に反応させた後、ヨ
ウ化プロピジウムによる染色で死亡細胞を識別し、生存
細胞をＦＡＣＳｃａｎで解析することによって、ＲＦ３
及びＳＧ２と強く反応する形質転換体を選別した。

【００３６】更に、抗体と反応した形質転換体の作成に
用いたｃＤＮＡを含む大腸菌（ＤＨ５）をアルカリ処理
して目的遺伝子を含むプラスミド群を選別し、これらの
プラスミド群を更に幾つかのプラスミド群に小分けし
て、再度、２９３Ｔ細胞に形質導入させた後、前述のモ
ノクローナル抗体ＲＦ３及びＳＧ２を用いたＦＡＣＳｃ
ａｎ解析による形質転換体の選択をくり返すことによ
り、配列表の配列番号２に示される新規なプレＢ細胞増
殖支持能を有する膜タンパクポリペプチドをコードする
完全長ｃＤＮＡ（６３−ＢＯＳ）を得ることができた。

【００３７】尚、このｃＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターの
ＸｂａＩ切断部位間に挿入したｐＢｓｔ−１を含有する
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株は、平成５年（１９
９３年）５月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研
究所に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ＤＨ５α
（ｐＢｓｔ−１），受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３０５
としてブタベスト条約に従って国際寄託されている。

【００３８】一般に、真核生物の遺伝子は、ヒトインタ
ーフェロン遺伝子等で知られているように、多形現象を
示すと考えられ〔例えば、Ｎｉｓｈｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，９７：１５３（１９８５）〕、この多形現象
によって１個又はそれ以上のアミノ酸が置換されている
場合もあれば、塩基配列の変化はあってもアミノ酸は全
く変わらない場合もある。

【００３９】また、配列表の配列番号１のアミノ酸配列
の中の１個又はそれ以上のアミノ酸を欠くか又は付加し
たポリペプチドあるいはアミノ酸が１個もしくはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもプレＢ細胞
増殖支持能を有することがある。例えば、ヒトインター
ロイキン（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当する塩
基配列をセリンに相当する配列に変換して得られたポリ
ペプチドがＩＬ−２活性を保持することも既に公知とな
っている〔Ｗａｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１４
３１（１９８４）〕。

【００４０】更には、既知タンパクの遺伝子と配列表の
配列番号２の遺伝子を適当な制限酵素又はアダプター等
を用いて連結させて、既知タンパクと結合したポリペプ
チドとして産生させることもできる。既知タンパクの遺
伝子としては、例えば、免疫グロブリンがあげられ、そ
の可変領域部分の代わりに配列表の配列番号２に示され
る遺伝子を用いて、Ｆｃ部分と結合させればよい〔（Ｚ
ｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ等，ＤＮＡ ＡＮＤ ＣＥＬＬ
ＢＩＯＬＯＧＹ，９：３４７−３５３（１９９０）〕。

【００４１】また、真核細胞で発現させた場合、その多
くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１ないしそれ以上
変換することにより糖鎖付加を調節することができる
が、この場合もプレＢ細胞増殖支持能を有することがあ
る。従って、本発明におけるプレＢ細胞増殖支持能を有
するポリペプチドをコードする遺伝子を人工的に改変し
たものでも、得られたポリペプチドがプレＢ細胞増殖支
持能を有する限り、それらの遺伝子は全て本発明に含ま
れる。

【００４２】更に、配列表の配列番号２に示される遺伝
子とハイブリダイズする遺伝子も、その遺伝子から発現
されるポリペプチドがプレＢ細胞増殖支持能を有する限
り、本発明に含まれる。ハイブリダイゼーションは、通
常のハイブリダイゼーションの条件（例えば、前述の
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”を参照）を用
いて行うことができる。

【００４３】目的とするプレＢ細胞増殖支持能を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換した形質転
換体を培養し、産生したポリペプチドを適当な可溶化剤
で可溶化した後、分離、精製することによって、均一な
可溶性の接着因子を得ることができる。尚、可溶化剤と
しては、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０），Ｓ
ｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｐｈａｔｅ（ＳＤ
Ｓ），ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，Ｔｗｅｅｎ ２０等が
あげられる。

【００４４】また、可溶性の接着因子は遺伝子工学的に
作成することもできる。すなわち、配列表の配列番号１
に於ける２７２番目のＧｌｎから２９０番目のＬｅｕま
での部分は疎水性が高い領域であることから、２７２番
目より前の位置に終止コドンを有する遺伝子をＰＣＲ−
変異誘発法〔Ｍ．Ｋａｍｍａｎ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１５：５４０４（１９８９）〕を用いて
作成すればよい。

【００４５】具体的には、寄託したｐＢｓｔ−１に２つ
のプライマーＡＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡ
ＡＡ（配列表の配列番号１の１８５番目〜１９０番目
に相当）及びＡＣＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＡＧ
ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＡＧＡＣ ＴＴＧ ＧＧＧ Ｃ
ＴＴ（配列表の配列番号１の２６４番目〜２６９番目＋
終止コドン＋ＨｉｎｄＩＩＩ 及びＸｂａＩ制限部位に
相当）を用いて、ＰＣＲ−変異誘発法で増幅する。低融
点アガロースなどを用いて目的の遺伝子を精製し、Ｂｇ
ｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで断片化する。同じ制限酵素
で処理したｐＢｓｔ−１に得られたＢｇｌＩＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を挿入した後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉで処理し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で平滑末端とする。Ｂｓ
ｔＸＩでｐＥＦ−ＢＯＳを処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ断
片で処理したものにこのＤＮＡ断片を連結させ、適当な
宿主細胞を形質転換させて可溶性の接着因子を得ること
ができる。

【００４６】分離、精製の手段としては、通常の蛋白質
で用いられる方法を適用すればよく、例えば、前述のモ
ノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィー等の各種クロマトグラフィー、限外ろ過、塩析、
透析等も適宜選択、組合わせれば、本発明のポリペプチ
ドを分離、精製することができる。

【００４７】本発明のプレＢ細胞増殖支持能を有する接
着因子をコードする遺伝子を得る方法、該遺伝子を有す
る組換えベクター、及びこれを含有する形質転換体、並
びにこの形質転換体を培養し取得した目的の蛋白質、並
びに夫々の製造法について、以下の参考例及び実施例に
よって詳細に説明するが、この実施例によって本発明が
限定されるものではない。

【００４８】参考例１ プレＢ細胞増殖支持能を有する慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）患者由来及び健常人由来ストローマ細胞株の樹立 慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者、健常人の骨髄（ＢＭ）
の単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ）分画を、Ｆｉｃ
ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離で得た後、こ
れを、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、５０μＭ２−メル
カプトエタノール、抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０
培養液中で３７℃で数週間培養した。洗浄をくり返し、
非付着性細胞を除去し、残った付着細胞に、ＳＶ４０の
ｌａｒｇｅ Ｔ抗原ｃＤＮＡとニワトリβ−アクチンプ
ロモーターを含むｐＡｃｔ−ＳＶＴプラスミド〔ＢＢＲ
Ｃ，１８６：１２９−１３４（１９９２）〕を、Ｇｅｎ
ｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＬａｄ社製）でエレクトロポレ
ーションした。

【００４９】前記細胞とプラスミドを１５分間水中でイ
ンキュベートした後、２５０Ｖ、２５０μＦ静電容量で
エレクトロポレーションを行い、更に氷上で１０分間イ
ンキュベートした後、１０ｃｍディシュ中で培養した。
付着細胞が多く成育しているコロニーを、小片のろ紙で
取り出し、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者及び健常人の
骨髄由来ストローマ細胞株（ＲＡＳＶ５−５、及びＮＦ
ＳＶ１−１）を得た。〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４
９：４０８８（１９９２）〕。

【００５０】参考例２ プレＢ細胞増殖支持能を有する慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）患者由来滑膜細胞株の樹立 慢性関節リウマチ（ＲＡ）由来の滑膜細胞にＳＶ４０の
Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原ｃＤＮＡとニワトリβ−アクチンプ
ロモーターを含むｐＡｃｔ−ＳＶＴプラスミド〔ＢＢＲ
Ｃ，１８６：１２９−１３４（１９９２）〕を、Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＬａｄ社製）を用いてエレク
トロポレーションした。すなわち、ＰＢＳ中のＲＡ患者
由来の滑膜細胞１×１０⁷ 細胞／ｍｌの０．８ｍｌアリ
コートと１０μｇのプラスミドを混合し、１０分間氷中
でインキュベートした後、２５０Ｖ、２５０μＦ静電容
量の条件でエレクトロポレーションを行い、更に、１０
分間氷中でインキュベートした後、１０％ＦＣＳ（Ｂｉ
ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培
地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し１０ｃｍ培養皿にて培養
した。培養液の交換は３日おきに行い、約２週間後に生
育のよい付着細胞のコロニーをトリプシンを染み込ませ
た小片のろ紙にて取りだし、ＲＡ由来滑膜細胞株（Ｓｙ
ｎＳＶ１−４及びＳｙｎＳＶ６−１４）を得た。

【００５１】参考例３ モノクローナル抗体の作製 １）感作抗原と免疫法 感作抗原として、上記参考例１及び２で得たプレＢ細胞
増殖支持能の高いＲＡ患者由来ストローマ細胞株ＲＡＳ
Ｖ５−５及び滑膜細胞株ＳｙｎＳＶ６−１４を用いて抗
原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ，Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、及び５０μＭ２−
メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢ
ＣＯ社製）を培地として使用し、５％ＣＯ₂ インキュベ
ーター中で３７℃の温度条件下で継代培養を行った。

【００５２】細胞は、０．０２％ＥＤＴＡ、ＰＢＳ処理
後、軽いピペッティングによってインキュベーターの培
養フラスコより回収した。この細胞を約１×１０⁷ 個／
ｍｌの細胞数でＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、浮遊
させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（４週令、♀、日本エスエ
ルシー社製）に免疫した。初回免疫には、約１×１０⁷
個／ｍｌの細胞をマウス腹腔内に注射し、２〜３週後に
１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞を追加免疫した。更に、２〜
３週間隔にて１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞を２〜３回追加
免疫し、最終免疫３日後にマウスを屠殺して脾臓を摘出
した。

【００５３】２）細胞融合 １匹のマウスから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細
胞を遠沈した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ
社製）中に懸濁し、浮遊させ、充分に洗浄を行った。一
方、マウス・ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８（１９７
９）〕を、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ，ＦＩＬＴＲＯＮ
社製）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地にて
培養して得た細胞を、同様に前記ＤＭＥＭ培地で洗浄
後、その１×１０⁷ 個と、前記脾細胞１×１０⁸ 個とを
遠心管に入れ混合し、ポリエチレングリコール１５００
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）によって常法〔Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：４５８−４６２
（１９８０）〕に従い細胞融合させた。

【００５４】得られた融合細胞を、１０％ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培地にて９６個のウェルプレートに分注し、５
％ＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃で培養した。翌日
よりＨＡＴ選択培地（１．０×１０^-4Ｍヒポキサンチ
ン、４．０×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０^-5
Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０
％ＦＣＳ及び５０μＭ２−メルカプトエタノールを加え
た培地）に徐々に置換させて培養を続けた。培養開始
後、上清の半分を週２回の頻度に、それぞれ新しいＨＡ
Ｔ培地に代え、培養を継続し、増殖維持させた。

【００５５】このようにして得られた融合細胞を限界希
釈法を用いてクローニングした。すなわち、前記融合細
胞の培養上清中の抗体を利用して、感作抗原との結合性
を調べ、感作抗原と強い結合性を有するクローンだけを
常法により限界希釈法を用いてクローンを形成させた。

【００５６】クローンの形成は、前記ハイブリドーマ及
びＢＡＬＢ／Ｃ系マウス脾細胞を所定量含むように調整
し、ハイブリドーマ１〜１０個／ウエルとなるように９
６ウエルのプレートに播いて５％ＣＯ₂ インキュベータ
ー中で３７℃にて培養した。増殖してくるハイブリドー
マを同様にクローニングする操作を、通常の限界希釈法
に従って、理論上単一のクローンとなるまで繰り返し
た。目的の抗体を産生するクローンは、前記感作抗原を
用いてスクリーニングを行った。

【００５７】このようにして、ＲＡＳＶ５−５とは反応
するが、プレＢ細胞増殖支持能を持たない正常ヒト骨髄
由来ストローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１とはほとんど反応
しない抗体を産生する２種のハイブリドーマ（ＲＦ３，
ＳＧ２）を分離した。これらのハイブリドーマが産生す
る抗体は、それぞれ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ａであっ
た。

【００５８】尚、上記のモノクローナル抗体ＲＦ３、及
びＳＧ２を産生する当該ハイブリドーマは、ＢＡＬＢ／
Ｃ系マウス脾細胞とマウス・ミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３を親細胞として作製された新規な融合細胞で
あり、平成５年（１９９３年）４月２８日付で公的微生
物寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所
に、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｒ
Ｆ３，受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６５６、及びＭｏｕｓ
ｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＧ２，受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６５７として寄託されている。

【００５９】３）スクリーニング 融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フロ
ーサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を
使った間接蛍光抗体法により行った。目的の抗体を産生
するクローンのスクリーニングは、ターゲット細胞とし
て、ａ）ＲＡＳＶ５−５（感作抗原）、ｂ）正常ヒト骨
髄由来ストローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１、等を用いて行
った。すなわち、プレＢ細胞増殖支持能の高いＲＡ患者
の骨髄由来ストローマ細胞株（ＲＡＳＶ５−５）をＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに免疫することにより、ＲＡＳＶ５−５
と反応するがプレＢ細胞増殖支持能を持たない正常ヒト
骨髄由来ストローマ細胞株（ＮＦＳＶ１−１）とは反応
しない事を指標にモノクローナル抗体のスクリーニング
を行った。最初のスクリーニングは、反応細胞として感
作抗原であるＲＡＳＶ５−５を用いて行った。先ず、Ｒ
ＡＳＶ５−５に反応する融合細胞クローンを選ぶため
に、当該ＲＡＳＶ５−５に反応する培養上清を選別し、
１次スクリーニングを行った。

【００６０】すなわち、細胞を反応バッファー〔２％Ｆ
ＣＳ，０．０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢＳ〕に懸濁し、ハ
イブリドーマ培養上清２０μｌ中に浮遊させ（約５×１
０⁵個／２０μｌ）、４℃にて２０分間反応させた。前
記バッファーにより２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ
抗マウスＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を加えて２０分
間インキュベーションした。３回洗浄した後、フローサ
イトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＦＡ
ＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）
にて解析した。

【００６１】次に、反応細胞として正常ヒト骨髄由来ス
トローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１を用い、前記の如くフロ
ーサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に
より解析した。これによって、ＲＡＳＶ５−５により強
く反応する抗体を産生しているハイブリドーマとして２
種の細胞を得た。

【００６２】４）抗体の精製 前記２）で作製した融合細胞を常法に従って培養し、培
養上清中に産生される抗体を常法により分離し、精製し
た。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原に対する抗
体価の最も高かったウエルからハイブリドーマを採取
し、細胞の増殖が認められたウエルのうち１つを取り、
得られた培養細胞を５％ＣＯ₂ 組織培養フラスコに広げ
て３７℃にて継代培養を行い、増殖させた。得られた細
胞をプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／Ｃ系マウス
（６週令，♀，日本エスエルシー社製）に腹腔内注入し
た。１０〜１４日後、産生された腹水を採取し、５０％
硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析後、ＱＡＥカラ
ムにて精製を行った。抗体は、更に塩析し、充分に透析
を行い、約６ｍｇ／ｍｌの精製品を得た。

【００６３】参考例４ プレＢ細胞増殖支持能を有するＲＡ患者由来骨髄ストロ
ーマ細胞株を選択的に認識するマウスモノクローナル抗
体ＲＦ３及びＳＧ２は、以下に示す方法により同一の分
子を認識していることが確認された。

【００６４】すなわち、それぞれの抗体をＮ−ｈｙｄｒ
ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ Ｂｉｏｔｉｎを用いて
ビオチン化〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ等，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）〕した後、ＲＡ患者由来骨
髄ストローマ細胞株ＲＡＳＶ５−５を用いた交差阻害実
験を行った。ＲＡＳＶ５−５細胞株をビオチン化ＲＦ３
及びＳＧ２、又はビオチン化ＳＧ２及びＲＦ３の組み合
わせで２％ＦＣＳ及び０．０２％ＮａＮ₃ を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなるＦＡＣＳ緩衝液２０
μｌ中に懸濁し２０分間氷中でインキュベートし、ＦＡ
ＣＳ緩衝液にて２回洗浄後ＦＩＴＣ標識ストレプトアビ
ジンを加え、更に２０分間氷中でインキュベートした。
ＦＡＣＳ緩衝液にて３回洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析し、いず
れの組み合わせでも交差阻害が認められた。このことよ
り、マウスモノクローナル抗体ＲＦ３及びＳＧ２は、同
一の分子の同じエピトープ、もしくは極近傍のエピトー
プを認識しているものと考えられた。

【００６５】

【実施例】

実施例１ １．ｃＤＮＡライブラリーの作製 １）ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製 慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細胞株ＳｙｎＳ
Ｖ１−４細胞からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製は、
Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ^TM ｍＲＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯ
Ｎ ＫＩＴ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社製）を用いて実施した。すなわち、１０ｃｍ培
養皿２０枚分のＳｙｎＳＶ１−４細胞をホモジネート
し、キット添付の処方に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを調
製した。更に、キット付属のオリゴｄ（Ｔ）セルロース
を用いて、キット添付の処方に従ってｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＮＡを精製した。

【００６６】２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 上記ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ５μｇを材料としてｃＤＮ
Ａ合成キットＴｉｍｅＳａｖｅｒ^TM ｃＤＮＡ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用
いてキット添付の処方に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成
し、ＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）をＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社
製）を用いてキット添付の処方に従って連結した。遊離
のＢｓｔＸＩアダプターの除去はキット付属のＳｉｚｅ
Ｓｅｐ ４００ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを用いてキ
ット添付の処方に従って行い、アダプター付加２本鎖ｃ
ＤＮＡ約１００μｌを得た。

【００６７】作製したアダプター付加２本鎖ｃＤＮＡ約
１００μｌのうち１回のＬｉｇａｔｉｏｎ反応には２μ
ｌを使用し、予じめ制限酵素ＢｓｔＸＩ及びアルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造社製）処理したｐＥＦ−ＢＯＳ
ベクター〔Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１８：５３２２
（１９９０）〕とＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ
（宝酒造社製）を用いて連結し、ｃＤＮＡライブラリー
を構築した。構築したｃＤＮＡライブラリーは大腸菌細
胞株ＤＨ５（トーヨーボー社製）に形質導入され、全体
のサイズは約２×１０⁵ の独立したクローンであると推
定された。形質導入した大腸菌２０００〜４０００クロ
ーンからなるプールを５０プール作成し以下の実験に用
いた。

【００６８】２．直接発現法によるクローニング １）２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション 上記のプールした大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢ培地〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕に
て培養することによりｃＤＮＡの増幅を行い、アルカリ
法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕により大腸菌からプ
ラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡ
は、塩化セシウム／臭化エチジウム密度勾配による超遠
心を２回繰り返すことにより精製度を高め、リン酸カル
シウム法により２９３Ｔ細胞〔２９３細胞（Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ
ｋｉｄｎｅｙ，ｈｕｍａｎ ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７
３）にＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原ｃＤＮＡを導入し
た細胞株〕にトランスフェクションした。

【００６９】すなわち、精製したプラスミドＤＮＡ２μ
ｇを１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む１００μｌの緩衝液に溶解し、１４μｌの２Ｍ
ＣａＣｌ₂ を添加した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．１），２８０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ Ｓｏｄ
ｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅからなる緩衝液に徐々に混
合し、室温にて３０分間インキュベートし、２４穴プレ
ート中の２９３Ｔ細胞に添加した。２９３Ｔ細胞は、１
０％牛胎児血清（ＰＣＳ，Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社
製）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地にて、３７
℃、５％ＣＯ₂ の条件下で２日間培養した。

【００７０】２）ＦＡＣＳによる解析 形質導入した２９３Ｔ細胞は、０．０２％のＥＤＴＡを
含むＰＢＳにて２４穴プレートより剥がし、２％ＦＣ
Ｓ、０．０２％Ｎ_a Ｎ₃ を含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ
緩衝液にて２回細胞を洗浄した後、１次抗体として１０
μｇ／ｍｌのＲＦ３及びＳＧ２の混合物存在下で２０μ
ｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し２０分間氷中でインキュベ
ートした。ＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄後、２次抗体と
してＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ
社製）を使用し、更に１５分間氷中でインキュベートし
た。ヨウ化プロピジウムＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉ
ｄｅ（ＰＩ）を最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加
え、更に５分間氷中でインキュベートした後、ＦＡＣＳ
緩衝液にて３回洗浄後、前方散乱光にて細胞の生死を識
別した後、生細胞のみをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析した。

【００７１】３）ｃＤＮＡライブラリーのクローニング ２０００−４０００クローンの大腸菌をひとつのプール
としてアルカリ法にて回収されたプラスミドＤＮＡを前
述の方法に従って２９３Ｔ細胞にトランスフェクション
し、上記ＦＡＣＳ解析によるスクリーニングを行った。
２０番目のプールを発現させた２９３Ｔ細胞に、マウス
モノクローナル抗体ＲＦ３及びＳＧ２により強く染色さ
れるピークを認めた。本プラスミドＤＮＡを再び大腸菌
ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）に形質導入し、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢアガープレート
に接種した。

【００７２】コロニーを形成した２０００個のクローン
をプレート底面に網目状に区分を入れ、接種したクロー
ンの位置がわかるようにしたアガープレートに１００ク
ローン／プレートとなるように一つずつ接種し、同じも
のを２つ作製した。１００個のクローンを一つのプール
として２０プール作製し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢ培地で大腸菌を培養した。アルカリ法にて
プラスミドＤＮＡを回収後、２９３Ｔ細胞にリン酸カル
シウム法によりトランスフェクションして前述と同様に
ＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳ解析の結果、陽性と認
められた一つのプールから大腸菌１００クローンを一つ
ずつ単離してそれぞれのクローンを培養し、アルカリ法
にてプラスミドＤＮＡを回収した。各プラスミドＤＮＡ
を２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウム法によりトランスフ
ェクションして前述と同様にＦＡＣＳ解析を行い、単一
の陽性クローンを得て、６３−ＢＯＳと命名した。

【００７３】本クローンについて、Ａｕｔｏ Ｒｅａｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製）及びＡｕｔｏ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、キット
添付の処方に従いシークエンス反応を行い、Ａ．Ｌ．
Ｅ．^TM ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）にて塩基配列の決定を行った。その結果、最長のＯ
ｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅより３１８アミノ
酸残基をコードすると推定される全長１４１１ｂｐ（配
列表の配列番号２）の新規の遺伝子であった。

【００７４】３．ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞による発現 新規分子をＢＡＬＢ３Ｔ３細胞に導入し動物細胞での発
現を検討した。すなわち、２０μｇの６３−ＢＯＳと２
μｇのネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶ２ｎｅｏ
〔Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｅｔｈｅｍ ａｎｄ Ｐ．Ｂｅｒｇ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１
９８２）〕を１×１０⁷ 細胞／ｍｌの０．８ｍｌのアリ
コートに加え１０分間氷中でインキュベートした後、Ｇ
ｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＬａｄ社製）を用いて、
２５０Ｖ、２５０μＦの静電容量の条件にてトランスフ
ェクションを行い、同時形質導入した。

【００７５】更に１０分間氷中でインキュベートした
後、細胞を２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び１０％ＦＣＳ
（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むＤＭＥＭ培地
（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、２４穴プレートにて培養
した。培養液の交換は３日おきに行い、約２週間後に生
育のよいネオマイシン耐性付着細胞の単一のコロニーを
形成している穴より、前記マウスモノクローナル抗体Ｒ
Ｆ３と反応する形質転換細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ２
を得た。また、対照細胞として、ＲＦ３と反応しないが
ネオマイシン耐性である形質転換細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３
６３Ｓ１を得た。

【００７６】４．新規分子の生物学的性質 新規分子の生物学的性質は、ストローマ細胞依存性に増
殖するマウスプレＢ細胞株ＤＷ３４を用いて、増殖細胞
数を指標として以下に示す方法にて解析した。まず、２
４穴プレートに形質導入細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ２
及び対照細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ１をサブコンフル
エントになるまで培養し、３０Ｇｙの放射線を照射後、
１穴あたり２×１０³ 個のＤＷ３４を添加し、１０％Ｆ
ＣＳ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を含むＲＰＭＩ−
１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）培地中で、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂ の条件で４日間培養した。各穴のＤＷ３４の生細胞
数をトリパンブルー染色にて算定し、増殖支持能を解析
した。その結果、図１に示すごとく、形質導入細胞株Ｂ
ＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ２において、対照細胞株ＢＡＬＢ３
Ｔ３６３Ｓ１と比べて、ＤＷ３４の増殖が促進された。

【００７７】５．新規分子の物理化学的性質 １）グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰ
Ｉ）結合型蛋白の確認 ＲＡ由来骨髄ストローマ細胞株ＲＡＳＶ５−５あるいは
形質転換細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ２を３７℃にて２
Ｕ／ｍｌのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリ
バーゼＣ（ＰＩＰＬＣ，フナコシ社製）存在下あるいは
非存在下、１％ＦＣＳを含むＰＢＳ中にて３７℃１〜２
時間インキュベートした後、前述ＦＡＣＳ緩衝液にて２
回洗浄後、ＲＦ３存在下で２０分間氷中でインキュベー
トした。ＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄後、ＦＩＴＣ標識
ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を含むＦＡ
ＣＳ緩衝液で、更に２０分間氷中でインキュベートし、
ＦＡＣＳ緩衝液にて３回洗浄後ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて解析した。

【００７８】対照実験として、１次抗体は、ＲＡＳＶ５
−５ではＣＤ２９（ＶＬＡβ１，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ
社製）、ＢＡＬＢ３Ｔ３６３Ｓ２ではＲ２５〔Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１４８：９８９−９９５（１９９２）〕
を用い、２次抗体として前述と同じ抗体を使用した。そ
の結果、ＣＤ２９及びＲ２５では蛍光強度の変化が見ら
れなかったが、ＲＦ３抗体を用いたものでは蛍光強度の
低下が認められた。このことより新規分子はＧＰＩを介
して細胞膜に結合しているものと推定される。

【００７９】２）Ｎ末端の解析 ＤＮＡ解析ソフトＧｅｎｅ Ｗｏｒｋｓを用いて得られ
た遺伝子の、疎水性領域と親水性領域の解析を行った
（図２）。その結果、配列表の配列番号２の１〜２８番
目に示される２８個のアミノ酸残基部分に疎水性領域が
認められ、２９番目のアミノ酸グリシンが成熟蛋白質の
Ｎ末端であると推定された。

【００８０】実施例２ １．可溶性接着因子（ｓＢｓｔ−１）の構築 可溶性Ｂｓｔ−１は、２７２番目のアミノ酸の前に終止
コドンを有する遺伝子をＰＣＲ−変異誘発法〔Ｍ．Ｋａ
ｍｍａｎ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：
５４０４（１９８９）〕により構築した。すなわち、プ
ライマーとしてＳ１及びＳ２′（Ｓ１プライマー：ＡＡ
Ｃ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡＡＡ、Ｓ２′プラ
イマー：ＡＣＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＡＧ Ａ
ＴＣＡＡＴ ＡＡＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＣＴ
Ｔ）を、また鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＢｓｔ−１
を用いＰＣＲ−変異誘発法を行った。

【００８１】ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣ１、０．
２５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２．５ユニット
のＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）、それぞれ１００ｐｍ
ｏｌｅのプライマー（Ｓ１及びＳ２′）及び０．１μｇ
のプラスミドＤＮＡを含有する。これを５０μｌの鉱油
で覆った後、９４℃の初期温度にて１．５分間加熱し、
次に９４℃にて１分間、５０℃にて１分間、７２℃にて
１分間の順で加熱するサイクルを２５回反復した後、７
２℃にて１０分間インキュベートした。

【００８２】ＰＣＲ法により増幅した２７４ｂｐのＤＮ
Ａ断片を１．５％の低融点アガロースゲル（ＦＭＣ，Ｂ
ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）にて精製し、制限酵素Ｂｇ
ｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）にて消化し
た。得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素ＢｇｌＩＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）にて消化したｐＢｓｔ
−１にＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社
製）を用いてキット添付の処方に従って挿入し、制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて消化後、１．５％
の低融点アガロースゲル（ＦＭＣ，Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ社製）にて精製し約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片を、Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑末
端とした後、制限酵素ＢｓｔＸＩで消化後、Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片を用いて平滑末端としたｐＥＦ−ＢＯＳにＤＮＡ
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキ
ット添付の処方に従って挿入し、ｐΔ６３−ＢＯＳを構
築した。

【００８３】２．２９３Ｔ細胞による発現 上記のようにして構築した発現用プラスミドｐΔ６３−
ＢＯＳを大腸菌ＤＨ５αに形質導入し、得られた大腸菌
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地〔Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕にて培養することによりプラ
スミドＤＮＡの増幅を行い、アルカリ法〔Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８９）〕により大腸菌からプラスミドＤＮＡを
回収した。得られたプラスミドＤＮＡは、塩化セシウム
／臭化エチジウム密度勾配による超遠心を２回繰り返す
ことにより精製度を高め、リン酸カルシウム法により２
９３Ｔ細胞〔２９３Ｔ細胞（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｋｉｄｎｅｙ，
ｈｕｍａｎＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）〕にＳＶ４０
Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原ｃＤＮＡを導入した細胞株〕にト
ランスフェクションした。

【００８４】すなわち、精製したプラスミドＤＮＡ １
０μｇを１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１００μｌの緩衝液に溶解し、１４μｌの２
ＭＣａＣｌ₂ を添加した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ７．１）、２８０ｍＭＮ_a Ｃｌ、１．５ｍＭ Ｓｏｄ
ｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅからなる緩衝液に徐々に混
合し、室温にて３０分間インキュベートし、１０ｃｍ培
養皿中の２９３Ｔ細胞に添加した。２９３Ｔ細胞は、１
０％牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社
製）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地にて２４時
間培養した後、１％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢ
ＣＯ社製）培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ₂ の条件下
で培養した。

【００８５】形質導入した２９３Ｔ細胞の培養上清は、
４８時間後に回収し、マイクロコンセントレーター（Ｃ
ｅｎｔｏｐｒｅｐ １０，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて
１０倍に濃縮し、以下の実験に使用した。また、ｐＥＦ
−ＢＯＳを同様にして２９３Ｔ細胞にトランスフェクシ
ョンして、その培養上清をコントロールとして用いた。

【００８６】３．ｓＢｓｔ−１によるプレＢ細胞ＤＷ３
４の増殖阻害 ｓＢｓｔ−１の生物学的性質は、ストローマ細胞依存性
に増殖するマウスプレＢ細胞株ＤＷ３４を用いて、増殖
細胞数を指標として以下に示す方法にて解析した。ま
ず、２４穴プレートにプレＢ細胞株の増殖支持能を有す
るＲＡ患者由来骨髄ストローマ細胞株ＲＡＳＶ５−５及
び滑膜細胞株ＳｙｎＳＶ６−１４を１穴あたり１×１０
⁵ 個培養し、２４時間後に３０Ｇｙの放射線を照射し
た。プレＢ細胞株ＤＷ３４を１穴あたり２×１０³ 個添
加し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を
含むＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）の培地中で
３７℃、５％ＣＯ₂ の条件で４日間培養した。ｓＢｓｔ
−１を含む２９３Ｔ細胞の濃縮培養上清は、表１に示す
濃度で添加した。各穴のＤＷ３４の生細胞数は、トリパ
ンブルー染色にて算定し、増殖支持能を解析した。その
結果、表１に示すごとく、ｓＢｓｔ−１を含む２９３Ｔ
細胞の培養上清にて濃度依存的にＤＷ３４の増殖が抑制
された。

【００８７】

【表１】 細胞株 ＲＡＳＶ５−５ ＳｙｎＳＶ６−１４ sBst-1を含む 293T細胞（10倍 濃縮培養上清） sBst-1添加 コントロール sBst-1添加 コントロール ％ V/V 0 10.2±1.4 6.9±0.1 0.2 10.7±1.6 10.4±0.8 6.2±0.2 7.2±0.8 0.4 10.5±1.6 11.1±1.0 6.4±0.9 6.4±0.4 0.8 9.0±2.2 12.1±1.3 3.6±0.2 8.7±0.3 1.6 9.6±0.2 11.6±1.6 3.4±0.7 6.6±1.4 3.2 7.3±0.8 11.2±0.7 1.7±0.3 4.3±0.3 １穴あたりのＤＷ３４細胞数 （ＲＡＳＶ５−５：×１０^-4, ＳｙｎＳＶ６−１４：×
１０^-5）±Ｓ．Ｅ．

【００８８】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、プレＢ
細胞増殖支持能を有するポリペプチドをコードする遺伝
子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターによる形
質転換体、及び該遺伝子を用いたプレＢ細胞増殖支持能
を有する接着因子の製造方法に関するものであり、本発
明の遺伝子は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者や多発性
骨髄腫（ＭＭ）患者の骨髄細胞や滑膜細胞上のプレＢ細
胞増殖支持能を亢進する新規接着因子をコードする。

【００８９】本発明の遺伝子を適当なベクターに挿入し
た後、常用の宿主細胞を形質転換することにより、大量
に均一なプレＢ細胞増殖支持能を有する接着因子を製造
することが可能であり、このことから、本発明により多
発性骨髄腫（ＭＭ）及び慢性関節リウマチ（ＲＡ）の同
定及びこれらの臨床上の診断用試薬の作成が可能であ
る。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ala Gln Gly Cys Ala Ala Ser Arg Leu Leu Gln Leu Leu Leu -25 -20 -15 Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ala -10 -5 1 Arg Trp Arg Ala Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg Asp Ile Phe Leu 5 10 15 20 Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro Glu Gln Arg Asn 25 30 35 Lys Asn Cys Thr Ala Ile Trp Glu Ala Phe Lys Val Ala Leu Asp Lys 40 45 50 Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Ile Asn Leu 55 60 65 Ser Arg His Ser Ile Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe Trp Glu Asn Ser 70 75 80 His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg Arg Phe Met Pro 85 90 95 100 Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe Leu Ser Trp Cys 105 110 115 Arg Gln Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gln Ser Cys Pro Thr Ser 120 125 130 Glu Asp Cys Glu Asn Asn Pro Val Asp Ser Phe Trp Lys Arg Ala Ser 135 140 145 Ile Gln Tyr Ser Lys Asp Ser Ser Gly Val Ile His Val Met Leu Asn 150 155 160 Gly Ser Glu Pro Thr Gly Ala Tyr Pro Ile Lys Gly Phe Phe Ala Asp 165 170 175 180 Tyr Glu Ile Pro Asn Leu Gln Lys Glu Lys Ile Thr Arg Ile Glu Ile 185 190 195 Trp Val Met His Glu Ile Gly Gly Pro Asn Val Glu Ser Cys Gly Glu 200 205 210 Gly Ser Met Lys Val Leu Glu Lys Arg Leu Lys Asp Met Gly Phe Gln 215 220 225 Tyr Ser Cys Ile Asn Asp Tyr Arg Pro Val Lys Leu Leu Gln Cys Val 230 235 240 Asp His Ser Thr His Pro Asp Cys Ala Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala 245 250 255 260 Thr Gln Arg Lys Ala Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Gln Arg Ala Gly Leu 265 270 275 Ile Ile Pro Leu Phe Leu Val Leu Ala Ser Arg Thr Gln Leu 280 285 290 配列番号：２ 配列の長さ：１４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．８４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGGGAAACGG CAAACAGCGA GATATCCGAG CGAGAGTCCC GCCCTGCATC AGTTTGCGGA 60 ACCGCCTTGG TAGAAGGAGA GAAGGGGAGT GGAGGAAGCA CGGGACTGGA GGGACCAAAG 120 TTCCCCG ATG GCG GCC CAG GGG TGC GCG GCA TCG CGG CTG CTC CAG CTG 169 CTG CTG CAG CTT CTG CTT CTA CTG TTG CTG CTG GCG GCG GGC GGG GCG 217 CGC GCG CGG TGG CGC GCG GAG GGC ACC AGC GCA CAC TTG CGG GAC ATC 265 TTC CTG GGC CGC TGC GCC GAG TAC CGC GCA CTG CTG AGT CCC GAG CAG 313 CGG AAC AAG AAC TGC ACA GCC ATC TGG GAA GCC TTT AAA GTG GCG CTG 361 GAC AAG GAT CCC TGC TCC GTG CTG CCC TCA GAC TAT GAC CTT TTT ATT 409 AAC TTG TCC AGG CAC TCT ATT CCC AGA GAT AAG TCC CTG TTC TGG GAA 457 AAT AGC CAC CTC CTT GTT AAC AGC TTT GCA GAC AAC ACC CGT CGT TTT 505 ATG CCC CTG AGC GAT GTT CTG TAT GGC AGG GTT GCA GAT TTC TTG AGC 553 TGG TGT CGA CAG AAA AAT GAC TCT GGA CTC GAT TAC CAA TCC TGC CCT 601 ACA TCA GAA GAC TGT GAA AAT AAT CCT GTG GAT TCC TTT TGG AAA AGG 649 GCA TCC ATC CAG TAT TCC AAG GAT AGT TCT GGG GTG ATC CAC GTC ATG 697 CTG AAT GGT TCA GAG CCA ACA GGA GCC TAT CCC ATC AAA GGT TTT TTT 745 GCA GAT TAT GAA ATT CCA AAC CTC CAG AAG GAA AAA ATT ACA CGA ATC 793 GAG ATC TGG GTT ATG CAT GAA ATT GGG GGA CCC AAT GTG GAA TCC TGC 841 GGG GAA GGC AGC ATG AAA GTC CTG GAA AAG AGG CTG AAG GAC ATG GGG 889 TTC CAG TAC AGC TGT ATT AAT GAT TAC CGA CCA GTG AAG CTC TTA CAG 937 TGC GTG GAC CAC AGC ACC CAT CCT GAC TGT GCC TTA AAG TCG GCA GCA 985 GCC GCT ACT CAA AGA AAA GCC CCA AGT CTT TAT ACA GAA CAA AGG GCG 1033 GGT CTT ATC ATT CCC CTC TTT CTG GTG CTG GCT TCC CGG ACT CAA CTG 1081 TAACTGGAAA CTGTGTTGCT CTAACCCTCC TCCAGCCCTG CAGCCTCCCC TTGCAGTCAT 1141 CATTCGTGTT CTGTGTATAC CAAATGATTC TGTTATCTAA AGAAGCTTTT TGCTGGGAAA 1201 ACGATGTCCT GAAAATGGTA TTTCAATGAG GCATATGTTC AGGATTTCAG AAACAAGAAG 1261 TTAGTTCTAT TTAGCAGGTT AAAAAATGCT GCATTAGAAT TAAAGCAAGT TATTTTCTTA 1321 TTTGTATAAT GACACAAAGC ATTGGGAGTC AGACTGCTTG TATATTATCA AACATTTTAA 1381 GAGAATTCTA ATAAAGCTGT ATTTTACATC 1411

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例で得られた新規接着因子のマウ
スプレＢ細胞株ＤＷ３４の増殖能を示す。

【図２】本発明の実施例で得られた遺伝子の疎水性領域
と親水性領域を解析した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−268971（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1989，Ｖｏｌ．86，ｐ. 302−306 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，1988，Ｖｏ ｌ．48，Ｎｏ．22，ｐ．6436−6443 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/28 C07K 14/435 - 14/79 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｏｂＭｅｄ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   又はそのアミノ酸配列を一部置換、欠除もしくは付加し
   たアミノ酸配列を有し、かつプレＢ細胞増殖支持能を有
   するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが、配列表の配列番号１に
   示すアミノ酸配列の１から２９０番目の配列を有するポ
   リペプチドである、請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ポリペプチドが、配列表の配列番号１に
   示すアミノ酸配列の１から２６９番目の配列を有するポ
   リペプチドである、請求項１記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ポリペプチドが、配列表の配列番号１に
   示すアミノ酸配列の−２８から２６９番目の配列を有す
   るポリペプチドである、請求項１記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 ポリペプチドが、配列表の配列番号１に
   示すアミノ酸配列の−２８から２９０番目の配列を有す
   るポリペプチドである、請求項１記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ポリペプチドが、配列表の配列番号１に
   示すアミノ酸配列の１から２６９番目の配列との融合蛋
   白質である、請求項１記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含有する組換えベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組換えベクターにより
   形質転換された原核又は真核宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の宿主細胞を培養し、産
   生したポリペプチドを分離することを特徴とするプレＢ
   細胞増殖支持能を有するポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法で製造したこと
    を特徴とする、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
    又はそのアミノ酸配列を一部置換、欠除もしくは付加し
    たアミノ酸配列を有し、かつプレＢ細胞増殖支持能を有
    するポリペプチド。