KR100260873B1 - 프리 b세포증식 지지능을 보유하는 막 단백폴리펩티드 및 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 프리B세포증식지지능을 보유하는 신규 막 단백 폴리펩티드를 코드화하는 유전자 및 180개의 아미노산배열 또는, 그 일부를 보유하는 프리B세포증식지지능을 보유하는 신규 막 단백 폴리펩티드, 그 유전자를 함유하는 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환해서 형질전환체를 제작하고, 그 형질전환체를 배양함으로써 형성되는 그 신규 막 단백 폴리펩티드의 제조방법에 및 그 신규 막 단백 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
상기 유전자는 프리 B세포증식 지지능을 보유하는 막 단백을 코드화한다. 균일한 신규 막 단백 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수가 있고, 나아가서는 그 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체를 제조할 수가 있으며, 만성 류마티스 관절염(RA)의 동정 및 이것들의 임상상의 진단용 시약의 제작이 가능하다.
Description
[발명의 명칭]
프리 B세포증식 지지능을 보유하는 막 단백폴리펩티드 및 유전자
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은, 유전자 및 유전자에 의해서 코드화되는 신규 막 단백에 관한 것이며 더 상세하게는 프리 B세포증식 지지능을 보유하는 신규 막 단백 폴리펩티드를 코드화하는 유전자, 그 유전자를 함유하는 벡터, 그 벡터에 의한 형질전환체, 및 그 유전자를 사용한 신규 막 단백 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막세포상의 프리 B 세포증식 지지능을 항진하는 신규 막 단백을 코드화한다.
본 발명의 유전자를 적당한 벡터에 삽입한 다음, 상용의 숙주 세포를 형질전환함으로써 대량으로 균일한 프리 B세포 증식 지지능을 보유하는 신규 막 단백 폴리펩티드를 제조할 수가 있게 된다. 이러한 점에서 본 발명에 의해 만성 류마티스 관절염(RA)의 동정(同定)과, 이것들의 임상상의 진단용 시약의 제작이 가능하게 된다.
[배경기술]
만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막이나, 활막액속의 염증세포는 말초혈 유래이며, 이것들의 세포의 활막등으로의 이행에 대해서는 완전히 해명되고 있지 않지만, 세포에 주어지는 화학 시그날과, 세포막 위의 단백(접착분자)의 복잡한 상호작용이 관여하고 있다고 생각되고 있다.
관절염에 있어서의 이들 막 단백의 중요성에 대해서는 여러 가지로 연구되고 있다.
예를 들자면, 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막내층위나, 활막 혈관위에는 T세포표면분자 LFA-1의 리간드(ligand)이며, 혈관벽에서의 세포의 접착이나, 유출(遊出)의 양쪽에 관여하고 있는 세포간접분자-1(이하ICAM-1)이 발현하고 있다는 것이 알려지고 있다 [Hale등 : Arthritis Rheum, 32 : 22(1989), 및 Haynes 등: Springer Semin, Immunopathol., 11 : 163(1989)].
동일하게 T임프구(특히 기억세포)나, 단구위에 발현하고 있는 인테그린 VLA-4의 리간드인 혈관세포 접착분자-1(이하 VCAM-1)이 만성 류마티스 관절염(RA)이나, 변형성 관절연등의 활막이나, 선유아 세포모양 활막세포 위에 발현되고 있다는 것[Mora les-Ducret 등: J, Immuno1, 149 : 1424(1992)], 또, VAP-1라고 부르고 있는 막 단백이 활막의 고내피성 소정맥에 발현하고 있고, 이 단백은 백혈구의 특이적 인식구조로서 활동하고 있는 가능성이 시사되고 있다 [(Salmi 등: Scince 257, 1407(1992)].
본 발명자는, B 세포의 기능이상을 초래하는 질환에 있어서의 골수미소환경의 병적 의의를 밝히는 것을 목적으로 연구를 추진하여 만성 류마티스 관절염(RA) 환자와 다발성 골수종(MM)환자에 있어서는, 정상인과 비교해서 골수유래 스트로마 세포의 프리B세포와 스트로마 세포와의 직접 접촉이 필수적이라는 등의 식견을 얻었으므로 각 환자의 스트로마 세포를 셀라인화하고, 프리 B세포의 증식을 촉진하는 인자를 보유하는 스트로마 세포주(RASV5-5, MMSV3-3)를 수립한 바, 이들 스트로마 세포주에 의한 프리 B세포의 증식지지에는 기지의 Stem Cell factor(SCF), ICAM-1, CD44, VCAM-1, LFA-1α, LFA-1B, ELAM-1과는 별도의 미지의 접착인자가 관여하고 있는 것을 발견하였다[ J. Immuno1,, 149 : 4088(1992)].
또, 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막세포를 셀라인 화학 활막 세포주 Syn SV6-14도, 만성 류마티스 관절염(RA)환자의 골수유래 스트로마 세포주 RASV5-5와 동일하게 프리 B세포 증식 지지능을 보유하고 있다는 것이 시사되었으므로 이들의 세포주에 반응해서 프리 B세포증식 지지능을 갖고 있지 않는 사람 골수유래 스트로마 세포주 NFνI-1에는 반응하지 않는 신규 모노클로날 항체를 얻는 동시에 그 항체막 단백(Bst-1)을 코드화하고 유전자의 클로닝에도 성공했다(특원평 5-141178호).
[발명의 개시]
본 발명자는 만성 류마티스 관절염(RA)환자 유래 활막세포에 발현하고 있지만 정상 유래세포에는 발현하고 있지 않는 막 단백을 인식하는 각종 마우스 모노클로날 항체의 제작 과정에서 Syn SV6-14와 반응하지만, 정상골수 간질세포주 NFSV1-1과는 반응하지 않는 성질을 보유하며, 상기 Bst-1과는 다른 막 단백질을 인식하는 신규 마우스 모노클로날 항체 RS38을 얻었다.
계속해서, 다시, 이 RS38항체를 사용해서 만성 류마티스 관절염(RA) 환자 활막세포주로부터 제작된 cDNA라이브러리를 스크린해서 그 RS38과 반응하는 신규 막단백을 코드화하는 클론을 단리하는 데에 성공하고 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은, 프리 B세포증식 지지능을 보유하는 신규막 단백 폴리펩티드와, 그 폴리펩티드를 코드화하는 유전자, 그리고, 그 유전자를 함유하는 벡터와, 그 벡터에 의한 혈질전환체 및, 그 유전자를 사용한 신규막 단백의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
또, 본 발명은, 프리 B세포 증식 지지능을 보유하는 신규막 단백을 인식하는 모노클로날 항체의 제공도 목적의 한가지로 하는 것이다.
이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 이하의 (1) 내지 (7)로 구성된다.
(1) SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 단리된(isolated) 폴리펩티드.
(2) SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 DNA.
(3) SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 배열에 하이브리드하고 프리 B세포증식 지지능을 보유한 폴리펩티드를 코드화하는 상기 (2)에 기재된 단리된 DNA.
(4) 상기 (2) 또는 (3)에 기재된 DNA를 함유하는 재결합벡터.
(5) 상기 (4)에 기재된 재결합벡터에 의해 형질전환된 원핵 또는 진핵주세포.
(6) 상기 (5)에 기재된 숙주세포를 배양액에서 배양하여 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 하는 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 폴리펩티드의 제조방법.
(7) SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체.
계속해서 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 모노클로날 항체를 기본적으로는 다음과 같이 해서 제작할 수가 있다.
즉, 본 발명의 항체는, 프리 B세포 증식 지지능을 보유하는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래 활막세포를 감작항원으로서 사용해서 통상적인 면역법에 따라 면역하고, 통상적인 세포 융합법에 준하여 세포융합 시켜서 통상적인 클론화함으로써 제작할 수가 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 제작방법은, 더 구체적으로는, 예를 들면, 상기 감작항원으로서, 그리고, 배양세포로서 수립되어 있는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막유래 세포주 Syn SV6-14를 사용해서, 그 감작항원으로 면역한 포유동물의 형질세포(면역세포)를 마우스 등의 포유동물의 골수종세포와 융합시켜서 얻어진 융합세포(하이브리도마)를 클론화하여 그속에서 Syn SV6-14를 인식하는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 선별하고, 이것을 배양해서 목적으로 하는 항체를 회수하는 방법이 바람직하게 예시되어 있다.
상기 모노클로날 항체의 제작방법에 있어서 감작항원에서 면역되는 포유동물로는, 특히 한정되는 것은 아니지만 세포융합으로 사용하는 골수종세포 와의 적합성등을 고려해서 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 마우스, 래트, 햄스터등이 사용된다.
면역은, 일반적 방법에 의해 예를 들자면, 상기 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막 유래세포 Syn SV6-14의 배양세포를 포유동물에 복공내 주사 등에 의해 투여함으로써 실시된다. 보다 구체적으로는, PBS나 생리식염수 등으로 적당한 양으로 희석, 헌탁 한 것을 소망에 따라, 통상적인 애주번트를 병용해서 동물에 4 내지 21일 마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또, 상기의 투여에 있어서는, 통상적인 담체(슐레퍼)를 채용할 수도 있다. 면역세포로는, 상기 세포주의 최종투여후에 적출한 비세포를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 면역세포와, 융합되는 다른쪽의 친세포로서의 포유동물의 골수종 세포로는 이미 공지의 각종세포주 예를 들면 P3 (P3X63Ag8. 653) [J. Immuno1., 123 : 1548(1978)], p3-U1 [ Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81 : 1-7(1978)], NS-1 [Eur. J. Immuno1., 6: 511-519(1976)], MPC-11[Cell, 8 : 405-414(1976)], SP2/0 [Nature, 276 : 269-270(1987)], FO [J. Immuno1. Meth., 35 : 1-21(1980)], S194 [J. Exp. Med., 148 : 313-323(1978)], T120 [Nature, 277 : 131-133(1979)]등이 호적하게 사용된다.
상기 면역세포와, 골수종세포와의 세포융합은, 기본적으로 공지의 방법, 예를 들자면, 밀슈타인 등(Milstein eta 1,)의 방법 [Methods Enzymo1, 73 : 3-4 56(1981)]등에 준해서 실시할 수가 있다.
보다 구체적으로는, 상기 세포융합은, 예를 들면, 융합촉진제의 존재하에 통상적인 영양 배지 속에서 실시된다. 융합촉진제로는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리코올(PEG), 센다이 우이루수(HVJ)등이 사용되며, 다시, 소망에 따라 융합효율을 높이기 위하여 디 메틸 술폭시드 등의 보조제를 첨가사용할 수도 있다. 면역세포와, 골수종 세포와의 사용 비율은, 예를 들면, 골수종 세포에 대하여 면역세포를 1 내지 10배 정도로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배지로는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPM1-1640 배지, MEM 배지, 그타, 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 또, 우태아혈청(FCS)등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.
세포융합은, 상기 면역세포와, 골수종세포와의 소정량을 상기 배지 내에서 잘 혼합해서 미리 37℃정도로 가온한 PEG용액, 예를 들자면, 평균분자량 1,000 내지 6,000정도의 PCG를 통상적인 배지에 약 30 내지 60%(W/V)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 실시된다.
계속해서 적당한 배지를 순차적으로 첨가하고 원심에서 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 목적으로 하는 하이브리도마가 형성된다.
그 하이브리도마는, 통상적인 선택배지, 예를 들면, HAT 배지[히폭산틴, 아미노프테린과, 티미진을 포함한 배지)에서 배양함으로써 선택된다. 그 HAT배지에 의한 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(미융합세포)가 사멸하는 데에 충분한 시간, 통상적으로 수일 내지 수주간 계속한다. 이어서, 통상적인 한계 희석법에 따라서 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크린 및 단일 클론화가 실시된다.
이와 같이 하여 제작되는 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 통상적인 배지에서 계대배양 할 수가 있고, 또, 액체 질소 속에서 장기보존 할 수가 있다.
그 하이브리도마에서 본 발명의 모노클로날 항체를 채취하자면, 그 하이브리도마를 상법에 따라서 배양하고, 그 배양상청으로서 얻는 방법, 혹은, 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여해서 증식시키고 그 복수로서 얻는 방법등이 채용된다. 전자의 방법은, 고 순도의 항체를 얻는 데에 적합한 방법이고, 한편, 후자의 방법은, 항체의 대량생산에 적합한 방법이다.
또, 상기의 방법에 의해 얻어지는 항체는 염석법, 겔 여과법, 아피니티 크로마토그리피 등의 통상적인 정제수단을 이용해서 고순도로 정제할 수가 있다.
이와 같이 해서 제작되는 본 발명의 모노클로날 항체는 방사면역측정법(RIA), 효소면역측정법(EIA), 형광항체법(Immunofluoresecnce Analysis)등의 통상적인 면역학적 수단에 의해서 항원의 신규막 단백을 발현하고 있는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막세포를 고감도와, 또한 고정도로서 실별하여 동정하는 것을 가능하게 하는 것이다.
본 발명의 유전자는 사람 프리 B세포증식 지지능을 표시하는 막 단백을 발현하는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막 세포등에서 mRNA를 조제한 다음, 공지의 방법에 따라 2개 쇄 cDNA로 변환함으로써 얻을 수 있다. 이 mRNA의 공급원이 되는 세포로는, 하이브리도마 RS38의 면역원으로서 사용한 Syn SV6-14의 세포주등을 들 수 있지만 이것들의 세포주에 한정되지 않고, 프리 B세포 증식 지지능을 보유하는 막 단백을 발현하고 있는 세포이라면 어떠한 것이라도 된다. 또, 본 발명에 있어서는, Syn SV6-8을 사용했다.
mRNA를 얻기 위한 전기 RNA의 조제는 구아니딘 티오시안 염산 처리후에 염화세시움 밀도 구배원심을 실시하고, [chirgwinet al., Biochemistry, 18 : 5294(1979)], 전 RNA를 얻는 방법이나, 바나듐복합체의 리보누클레아아제 인히비토 존재하에 계면활성제 처리와, 페놀처리를 하는 [Berger & Birkenmeier, Biochemistry, 18 : 5143(1979)]방법 외에 공지의 수단을 사용할 수가 있다.
전 RNA로부터의 nRNA의 조제는, 올리고(dT)를 결합한 담체, 예를 들면, 세파로오스나, 세롤로오스 등을 사용한 아피니티 컬럼 크로마토그래피법, 혹은, 배치법에 의해 전 RNA에서 poly(A)+RNA를 회수할 수가 있다. 또, 자당밀도 구배 원심법 등에 의해서 poly(A)+RNA를 다시 정제할 수도 있다. 그 이외에, 일단 RNA를 조제하지 않고, 직접 poly(A)+RNA를 얻는 방법이나, 시판하고 있는 키트를 사용한 간편한 방법도 사용할 수도 있다.
상기한 바와 같이 해서 얻은 mRNA에서 2개체인 cDNA를 얻는 데에는, 예를 들면, mRNA를 주형으로 해서 3′말단에 있는 폴리 A-쇄에 상보적인 올리고(dT)를 프라이머로하여 역 전사효소로 처리해서 mRNA에 상보적인 DNA(cDNA)를 합성한다.
mRNA를 알칼리 처리에 의해 분해, 제거한 다음, 얻어진 1개쇄 cDNA를 주형으로 해서 역전사효소 혹은, DNA폴리 메라아제(예를 들면 Klenow 단편등)처리를 한 다음 SI누쿠레아아제 등으로 처리하거나, 직접, RNase DNA폴리 메라아제 등으로 처리하는 방법으로도 2개체인 cDNA를 얻을 수가 있다 [Maniatis et al., Molecular cloning, cold Spring Harbor Laboratory (1982), 및 ubler & Hoffman Gene, 25 : 263(1983)].
최근 간편한 키트도 시판되고 있어서 이것들을 사용해서 2개체인 cDNA를 얻을 수도 있다.
이와 같이 해서 얻어진 cDNA를 적당한 벡터, 예를 들면 PBR322, PSC101등의 EK형 플라스미드 벡터나 λgt10등의 파아지 벡터등에 짜넣은 다음, 대장균(X1776, HB101, DH1, DH5등)등을 형질변환해서 cDNA라이브러리를 얻을 수가 있다. (예를 들면, 전기한 “Molecular cloning”을 참조).
또, 상기의 방법으로 얻은 2개체인 cDNA를 적당한 발현벡터에 삽입함으로써 다른 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주세포를 형질전환 시킬 수가 있다.
2개체인 cDNA를 벡터와 연결시키려면 적당한 화학합성 DNA어댑터를 부가하고, 미리 제한 효소를 사용해서 개열시킨 벡터 DNA와 ATP존재하에 T4파아지 DNA리가아제로 처리함으로써 실시할 수가 있다.
본 발명의 발현 벡터는 복제기원, 선택마아커, 발현시키려고 하는 유전자의 앞에 위치하는 프로모터, RNA스프라이스부위, 폴리아데닐화 시그널등을 포함하고 있다.
포유동물 세포에 있어서의 유전자 발현의 프로모터로는, 레트로비루스, 폴리오마비루스, 아데노 비루스, 시미안 비루스(SV)40등의 비루스 프로모터나, 사람·폴리펩티드·체인·에론게이션·팩터1α)등의 세포유래의 프로모터를 사용하면 된다.
예를 들면 SV40의 프로모터를 사용할 경우에는 Mulligan등의 방법[Nature, 277(1979)]에 따르면 용이하게 실시할 수가 있다.
복제기원으로는 SV40폴리오마 비루스, 아데노 비루스, 우파피로마 비루스 (BPV)등의 유래의 것을 사용할 수가 있고, 선택 마카로는 포스포트랜스 페타아제 APH(3′) 11혹은 1(neo)유전자, 티미진 키나제(TK)유전자, 대장균 크산텐-구아닌 포스포 리보실 트랜스 페라제 (Ecogpt)유전자, 디히드로 엽산환원효소 (DHFR)유전자 등을 사용할 수가 있다.
숙주세포로서 원핵세포를 사용해서 목적을 하는 유전자를 형질발현 시키는 데에는, 숙주와 적합할 수 있는 종류유래의 레플리콘, 즉, 복제기원 및 조절배열을 포함하고 있는 플라스미드벡터로 숙주세포를 형질전환시키면 된다. 또, 벡터는, 형질전환 세포에 표현형질(표현형)의 선택성을 부여할 수가 있는 마아커 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대장균의 경우에는 그것을 숙주로 하는 벡터인 pBR322를 사용해서 형질전환할 수가 있다 [ Boliver 등 : Gene, 2 : 95(1975)].
그 pBR322는, 암피실린 및 테트라 사이클린 내성의 유전자를 포함하고 있으므로 어느 한 쪽의 내성을 이용함으로써 형질전환 세포를 동정할 수가 있다.
원핵숙주세포의 유전자 발현에 필요한 프로모터로는, β-락타마아제 유전자의 프로모터 [chang 등 : Nature 275 : 615(1978)]이나, 락토오스 프로모터 [Goeddel 등 : Nature, 281 : 544(1979)], 및 트리프토판프로모터[Goeddel 등 : Nucleic Acid Res.. 8 : 4057(1980)], tac프로모터 등을 적당한 것으로서 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 발형계로 사용되는 숙주중에서 원핵숙주세포로는, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli), 고사균(Bacillus Subtilis), 바실루스·더모피일루스(Bacillus thermo philus)등이 적당한 것으로서 들 수 있는데 이것에 한정되는 것은 아니다.
또, 진핵숙주 세포로는 예를 들면, 삭카로미세스·세레비세에(Sac charonyces cere Visiae)등의 진핵 미생물이 적당한 것으로서 들 수 있을 뿐아니라, COS세포, 차이니이즈 함터 난소(CHO)세포, C127세포, 3T3세포, Hela세포, BHK세포, 나마루바세포, 사람 태아 신장세포(293세포)등의 포유동물유래의 세포도 호적하게 사용될 수가 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 형질전환체의 배양은, 숙주세포에 접합한 배양조건을 적당히 선택해서 실시하면 된다.
본 발명의 프리 B세포 증식지지능을 보유하는 막 단백을 코드화하는 cDNA를 단리하기 위해서는 예를 들면, 프리 B세포증식 지지능을 지포로 하거나, 혹은 항체를 사용한 직접발현 클로닝등의 방법을 사용해서 실시할 수가 있다. 프리B세포증식지지능의 측정은, 마우스프레B세포주 DW343(Eur, J. 1mmuno1,, 18 : 1767(1988))을 사용해서 실시할 수가 있다. 즉, 24구멍 프레B세포증식지지능을 보유하는 막 단백을 발현하고 있는 세포를 서브콘페루엔트(대략 50%밀도가 바람직하다)가 될 때까지 배양하고, 적당량의 방사선을 조사한 후, 1구멍당 1 내지 2×103개의 DW34를 첨가하고, 10% FCS를 포함하는 RPM1-1640배지 속에서 5% CO2의 조건하에서 37℃로 4내지 6일간정도 배양한다. 각 구멍의 DW34의 생존세포수를 트리판부루염색으로 조사함으로써 증식지지능의 항진의 정도를 알 수 있다.
본 발명에서는, 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막세포상의 신규 막 단백을 인식하는 모노클로날 항체 RS38을 사용한 FACScan에 의한 플로우시트메토리(FlowCytometry)에 의해 막 단백을 발현하고 있는 형질전환체를 선별해서 그 형질전환체의 제작에 사용한 플라스미드 DNA를 세분화하여 재차 형질전환체를 제작하고, 그 형질전환체를 플로우사이트메토리에 의해 스크리닝하는 것을 반복함으로써 목적으로 하는 유전자를 스크로닝할 수가 있었다.
구체적으로는, 형질도입된 형질전환체(293T세포)를 배양한 후, 0.02%의 EDTA를 포함하는 PBS로 플레이트로부터 벗기고, 2% FCS, 0.02% NaN3를 포함하는 PBS로 된 FACS완충액으로 세포를 세정한 다음, 1차 향체로서 RS38과 반응시킨다. 계속해서 FACS완충액으로 세정해서 미반응의 1차 항체를 제거하고, 2차 항체의 F1TC표식항체(F1TC표식 염소항 마우스1g항체)와, 다시 반응시킨 다음, 요오드화 프로피듐에 의한 염색으로 사망세포를 식별하고, 생존세포를 FACScan으로 해석함으로써 RS38과 강하게 반응하는 형질전환체를 선별했다.
또, 항체와 반응한 형질전환체의 제작에 사용한 cDNA를 포함하는 대장균(DH5)을 알칼리처리해서 목적유전자를 포함하는 플라스미드군을 선별하고, 이들 플라스미드군을 다시 몇 개의 플라스미드군으로 소분해서 재차 293T세포에 형질도입시킨 다음, 상기 모노클로날 항체 RS38을 사용한 FACScan해석에 의한 형질전환체의 선택을 되풀이함으로써 배열표의 배열번호2에 표시된 신균의 프리B세포증식지지능을 보유하는 막 단백 폴리펩티드를 코드화하는 완전길이의 cDNA(pRS38-BoS)를 얻을 수가 있었다.
또, 이 cDNA를 puc19벡터의 Xba1 절단부의 사이에 삽입한 pRS38-puc19를 함유하는 대장균(E, coli) DH5α주는 특허수속상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 의거한 국제기탁당국인 공업기술원 생명공학공업기술연구소(수신자명: 일본국이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1쪼오메 1번 3호(우편번호305))에 평성5년(1993년) 10월 5일부로 Escherichis Coli DH5 α(pRS38-puc19), 수탁번호 FERM BP-4434로서 기탁되어 있다.
일반적으로 진행생물의 유전자는 사람인터페론유전자 등으로 알려져 있듯이 다형현상을 표시한다고 생각되며(예를 들자면, Nishi 등 J, Biochem,, 97: 153(1985)), 이 다형현상에 의해서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환되고 있는 경우도 있고, 염기배열의 변화는 있어도 아미노산은 전혀 변하지 않는 경우도 있다. 또, 배열표의 배열번호1의 아미노산배열중의 1개 또는 그 이상의 아미노산을 결여하거나, 또는 부가한 폴리펩티드 혹은, 아미노산이 1개 혹은 그 이상의 아미노산으로 치환된 폴리펩티드일지라도 본 발명의 신규 막 단백과 동일한 기능(프리B세포증식지지능)을 보유하는 적이 있다. 예를 들면 사람인터로이킨-2(1L-2)유전자의 시스테인에 상당하는 염기배열을 세린에 상당하는 배열로 변환해서 얻어진 폴리펩티드가 1L-2황성을 유지한다는 것도 이미 공지의 사실로 되어 있다(Wang 등, Science, 224:1431(1984)).
또, 기지의 단백의 유전자와 배열표의 배열번호2의 유전자를 적당한 제한 효소 또는 아다브타 등을 사용해서 연결시키고, 기지의 단백과 결합한 폴리펩티드로서 생산시킬 수도 있다. 기지의 단백 유전자로는, 예를 들면, 면역글로부린을 들 수 있고, 그 가변영역부분대신에 배열표의 배열번호2에 표시된 유전자를 사용해서 Fc부분과 결합시키면 된다((Zettlmeiss1 등, DNA AND CELL B1OLOGy, 9: 347-353(1990)).
또, 진핵세포로 발현시켰을 경우, 그 대부분은 당쇄가 부가되지만, 아미노산을 1 내지 그 이상 변환시킴으로써 당쇄부가를 조절할 수가 있는데, 이 경우에도 본 발명의 신규 막 단백 폴리펩티드와 동일한 기능을 보유하는 적이 있다. 따라서 상기한 바와 같은 여러 가지방법에 의해 본 발명에 있어서의 막 단백 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 인공적으로 개변한 것이라도 얻어진 폴리펩티드가 본 발명의 막 단백 폴리펩티드와 동일한 기능을 보유하는 한, 그들 유전자 및 폴리펩티드는 모두 본 발명에 포함되는 것을 말할 필요도 없다.
또, 배열표의 배열번호2에 표시된 유전자와, 하이브리드하는 유전자도, 그 유전자에서 발현되는 폴리펩티드가 본 발명의 막 단백 폴리펩티드와, 같은 기능(프리B세포증식지지능)을 보유하는 한에 있어서는, 이들 유전자 및 폴리펩티드는 모두 본 발명에 포함된다는 것을 말할것도 없다. 이 경우, 하이브리디제이션은, 통상적인 하이브리디제이션의 조건(예를 들자면 상기 “Molecular Cloning”을 참조)를 사용해서 실시할 수가 있다.
목적으로 하는 프리B세포증식지지능을 보유하는 막 단백 폴리펩티드를 제조하는 데에는, 그 폴리펩티드를 코드화하는 유전자로 형질전환한 형질전환체를 배양하고 생산한 폴리펩티드를 적당한 가용화제로 가용화한 다음, 분리, 정제함으로써 균일한 가용성인 막 단백 폴리펩티드를 얻을 수가 있다. 또, 가용제로는, 예를 들어 Nonidet P-4(NP-4-), Sodiu Dodecyl Sulphate(SDS), Triton X-100, Tween 20 등을 호적한 것으로서 들 수 있다.
또, 가용성의 막 단백은, 유전자공학적으로 제조할 수도 있다. 즉, 제3도에 표시된 바와 같이 RS38은, N말단측으로 세포막관통도메인 및, 세포내 도메인을 갖는 세포막관통형 단백질이라고 예상되므로 배열표의 배열번호1의 49번째의 Asn을 N말단으로하는 가용성RS38을 PCR-변이 유발법(M, Kamman 등, Nucl, Acids Res,, 15: 5404(1989))를 사용해서 제조할 수가 있다. 그 경우, 시그날배열로는, 공지의 것을 사용하면 되고 예를 들면 Bst-1(특원평 5-141178호) 및 G-CSF(특공평2-5395호)의 시그날배열 등을 들 수 있다.
그 막 단백 폴리펩티드의 분리, 정제의 수단으로는, 통상적인 단백질로 사용되는 방법을 적용시키면 되고, 예를 들자면 상기 모노클로날 항체를 사용한 아피니티크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당히 선택, 조합해서 통상적인 방법에 준하여 분리, 정제하면, 본 발명의 막 단백의 폴리펩티드를 분리, 정제할 수가 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 실시예에서 얻어진 유전자의 Northern Blotting and lysis에 의한 해석결과(아가로스겔전기영동시진도)를 표시한다.
제2도는 본 발명의 실시예에서 얻어진 막 단백의 마우스 프리 B세포주 DW34의 증식지지능을 가리킨다.
제3도는 본 발명의 실시예에서 얻어진 유전자의 소수성영역과 친수성영역을 DNA 해석 소프트Gene Works를 사용해서 해석한 결과를 가리킨다.
이하 참고예와 실시예에 의하여 본 발명을 설명하는데, 이 실시예에 의하여 본 발명은 하등의 한정이 되는 것은 아니다.
[참고예 1]
건강한 통상인 유래의 스트로마세포주의 수립, 건강한 통상인의 스트로마세포에 SV4의 Large T항원 cDNA와 닭악틴프로모터를 포함하는 pAct-SVT 플라스미드(BBRC 186:134(1992)를 Gene pulser(BioLad제)를 사용해서 전기영동했다. 즉, PBS중의 건강한 통상인의 스트로마세포 1×107세포/㎖의 0.8㎖분취량과 10μg의 플라스미드를 혼합하고, 10분간 얼음속에서 배양한 후, 250V, 250μF 정전용량의 조건으로 전기유동을 하고, 다시 10분간 얼음속에서 배양한 후, 10% Fcs(Bioproducts제)를 포함하는 RPM1-1640배지(G1BCO제)에 헌탁해서 10cm배양접시로 배양했다. 배양액의 교환은 3일걸러 실시하고, 약 2주간후에 생육이 좋은, 부착세포의 콜로니를 트립신을 배어들게한 소편의 약포지로 집어내고, 건강한 통상인의 골수유래 스트로마 세포주(NFSV1-1)을 얻었다(J, lmmuno1..149: 4088(1992)).
[참고예 2]
만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래의 활막세포주의 수립, 만성 류마티스 관절염(RA)유래의 활막세포에 SV40의 Large T항원 CDNA와, 닭 β-악틴프로모터를 포함한 PAct-SVT플라스미드(BBRC, 186: 129-134(1992))를 Gene pulser(Bio Lad제)를 사용해서 전기영동했다. 즉, PBS속의 RS환자 유래의 활막세포 1×107세포/㎖의 0.8㎖의 일정량의 액과, 10㎍의 플라스미드를 혼합해서 10분간 얼음속에서 배양한 다음, 250V, 250μF 정전용량의 조건으로 전기영동을 하고, 다시 10분간 얼음속에서 배양한 다음, 10% FCS(Bioproducts제)를 포함하는 RPM1-1640배지(GIBCO제)에 헌탁해서 10cm 배양접시로 배양했다. 배양액의 교환은 3일걸러 실시하고, 약 2주간 후에 생육이 좋은 부착세포의 콜로니를 트립신을 배어들게한 소편의 약포지로 집어내에서 만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래의 활막세포주(Syn SV-6-8 및 Syn Sv6-14)를 얻었다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
이하에 본 발명의 실시예에 대하여 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
[모노클로날 항체의 제작]
1) 감작항원과 면역법
감작항원으로서 상기 참고예2에서 얻은 프리B세포증식지지능을 보유하는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래의 활막세포주Syn SV6-14를 사용해서 항원감작을 하였다. 세포주는, 10% 우태아혈청(FCS, Bio products제) 및, 50㎛ 2-메르카프트 에탄올함유 RPM1-1640(GIBCO제)을 배지로서 사용하고, 50% CO2배양속에서 37℃의 온도조건하에서 계대배양을 했다.
세포는, 0.02% EDTA, PBS처리후, 가벼운 피펫테잉에 의해서 배양의 배양플라스크에서 회수했다. 이 세포를 약 1×107개/㎖의 세포수로 RPM1-1640배지에 헌탁하고, 부유시켜서 BALB/c계 마우스(4주령, 우, 일본에스에루시사제)에 면역했다. 초회의 면역에는 약 1×107개/㎖의 세포를 마우스 복질내로 주사하고, 2 내지 3주일후에 1×107/㎖ 세포를 추가면역했다. 또, 2내지 3주일 간격으로 1×107개/㎖의 세포를 2내지 3회 추가면역하고, 최종면역하에 3일후에 마우스를 도살해서 비장을 추출하였다.
2) 세포융합
1마리의 마우스에서 추출한 비장을 잘게절단한 후에, 유리한 비장세포를 원침한 후에 RPM1-16402배지(GIBCO제)속에 헌탁하고 유리시켜서 충분히 세정을 실시하였다. 한편, 마우스·골수종세포주 P3X63 Ag 8.653(J, lmmunol.. 123: 1548(1979))를 10% 우태아혈청 PCS, FILTRON제)을 함유하는 DMEM(GIBCO제)배지에서 배양하여 얻은 세포를 역시 상기 DMEM배지에서 세정후, 그 1×107개와 상기 비장세포1×108개를 원심관에 넣어서 혼합해서 상법(clin Exp, lmmunol.. 42: 458-462(1980))에 따라서 세포융합시켰다. 얻어진 융합세포를 10% FCS를 포함한 DMEM배지에서 96개의 웰플레이트에 분주하고, 5% CO2배양속에서 37℃로 배양했다. 다음날로부터 HAT선택배지(1.0×10-4M히폭산티, 4.0×10-7M아미노프테린, 1.6×10-5M티미딘을 함유한 완전 RPM1-1640배지에서 10% FCS 및 50㎛ 2-메프카프트에타노올을 첨가한 배지)에 서서히 치환시켜서 배양을 계속했다. 배양개시후에, 상청의 절반을 주2회의 빈도로 각각 새로운 HAT배지로 바꾸어서 배양을 계속해서 증식유지시켰다.
이와 같이해서 얻어진 융합세포를 한계희석법을 이용하여 클로닝했다.
즉, 상기 융합세포의 배양상청중의 항체를 이용해서 감작항원과의 결합성을 조사해서 감작항원과 강한 결합성을 보유하는 클로닝만을 상법에 의해 한계희석법을 사용해서 클로닝을 형성시켰다.
클로닝의 형성은, 상기 하이브리도마 및 BALB/C계 마우스의 비장세포를 소정의 양을 함유하도록 조정 조정해서 하이브리도마를 1개 내지 10개/웰가 되도록 96웰의 플레이트에 뿌려서 5% CO2배양속에서 37℃로 배양했다. 증식해오는 하이브리도마를 동일하게 클로닝하는 조작을 통상적인 한계희석법에 따라서 이론상 단일 클로닝이 될 때까지 되풀이하였다. 목적으로하는 항체를 상생하는 클로닝은, 상기 감작항원을 사용해서 스크리닝을 하였다.
3)스트리닝
융합세포(하이브리도마)의 스크리닝은, 플로우사이토미터(Flow Cytometer)를 사용한 간접형광항체법에 의해 실시했다.
목적으로하는 항체를 생산하는 클로닝의 스크리닝은 타겟세포로서, a) Syn SV6-14(감작항원), b) 정상적인 사람골수유래 스트로마세포주 NFS V1-1, 등을 사용해서 실시하였다. 즉, 프리B세포증식지지능을 보유하는 만성 류마티스 관절염(RA) 환장의 활막유래세포주(Syn SV6-14)를 BALB/c계 마우스에 면역함으로써 Syn SV6-14와는 반응하지만, 프리B 세포증식지지능을 보유하지 않는 정상적인 사람골수유래스트로마세포주(NFS V1-1)와는 반응하지 않는다는 것을 지표로하여 모노클로날 항체의 스크리닝을 하였다.
최초의 스크리닝은, 반응세포로서 감작항원인 Syn SV6-14를 사용해서 실시했다. 먼저 Syn SV6-14에 반응하는 융합세포 클로닝을 선별하기 위하여 그 Syn SV6-14에 반응하는 배양상청을 선별해서 1차 스크리닝을 실시했다.
즉, 세포를 반응완충제(2% FCS, 0.02% NaN3를 함유하는 PBS)에 헌탁하고, 하이브리도마 배양상청 20㎕속에 부유시켜서(약 5×105개/20㎕), 4℃로 20분간 반응시켰다.
상기 완충제(buffer)에 의해 2회 세정한 다음, FITC표식 염소항마우스 1g 항체(cappel제)를 첨가해서 20분간 인규베이셔했다. 3회 세정한 다음에 세포계산기(Flow Cytometer)(FACScan, Becton Dickin Son제)로 해석했다.
그다음에, 반응세포로서 정상적인 사람골수유래스트로마세포주 NFS V1-1을 사용해서 상기한 바와 같이 세포계산기(Flow Cytometer)에 의해서 해석했다. 이것에 의하여 Syn SV6-14에 의해 강하게 반응하는 항체를 생산하고 있는 하이브리도마를 얻었다.
이와 같이해서 Syn SV6-14와는 반응하지만 정상적인 사람골수유래 스트로마세포주 NFS V1-1과는 반응을 하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마(RS38)를 분리했다. 이 하이브리도마가 생산하는 항체는, 1gM, K형이 였다.
또, 상기 모노클로날 항체 RS 38을 생산하는 그 하이브리도마는 BALB/c계 마우스의 비장세포와, 마우스·골수증 P3X 63Ag 8.653을 어미세포로해서 제작된 신규의 융합세포로서 특히 수속상의 미생물의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 의거한 국제기탁당국인 공업기술원 생명공학기술연구소(수신자명: 일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1쪼오메 1반 3고오(우편번호 305))에 평성5년(1993)10월 5일부로 Mouse-Mouse hybridoma RS38, 기탁번호FERMBP-4433으로서 기탁되어 있다.
4) 항체의 정제
상기의 2)에서 제작한 융합세포를 상법에 따라서 배양하고, 배양상청속에 생산되는 항체를 통상법에 의해 분리해서 정제했다.
즉, 각 비루스중에서 상기 감작항원에 대한 항체가 가장높았던 웰에서 하이브리도마를 채취하고, 세포의 증식이 확인된 웰중에서 1개를 따서 얻어진 배양세포를 5% CO2조직배양 프라스코에 펴서 37℃로 계대배양을 해서 증식시켰다. 얻어진 세포를 프리스탄 투요를 실시한 BALB/c계 마우스(6주일생, 우, 일본에스에루시사제)에 복길내 주입했다. 10일내지 14일 후에 생산된 복수를 채취해서 50%황산암모늄으로 염석하고, PBS로 투석후에 QAE컬럼으로 정제를 했다. 항체는, 다시 염석해서 충분히 투석을 하여 약 6mg/㎖의 정제품을 얻었다.
[실시예 2]
모노클로날 항체의 성질
1)세포주의 분포
각종세포주(표 1에 표시하는 각종셀라인)에 있어서의 RS38항원의 분포를 FACScan을 사용해서 해석했다. 즉, 각종 세포주를 1차 항체로하여 실시예1에서 얻어진 마우스모노클로날 항체RS38, 10㎍/㎖존제하에서 2% FCS, 0.02% NaN3을 포함한 PBS로된 FACS완충액에 헌탁해서 20분간 얼음속에서 배양했다. FACS완충액으로 2회 세정한 다음, 2차 항체로서 F1TC표지 염소항마우스 1g항체(Cappel제)를 사용해서 다시 15분간 얼음속에서 배양했다. 요오드화 프로피듐(propidiumlodide, P1)을 최종농도 1㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 다시 5분간 얼음속에서 배양했다. FACS완충액으로 3회 세정한 다음, 전방산란광으로 세포의 생사를 식별하고, 살아있는 세포만을 FACScan(Becton Dickin Son제)로 해석했다. 또, 대상으로서 마우스모노클로날 항체SG2 및 RF3(특원평 5-141178호)을 사용했다. 그 결과를 표 1에 표시한다. 표 1에서 명확하듯이 RS38항원의 분포는 SG2 및 RF3과 다른것이라는 것을 알 수 있었다.
[표 1]
[실시예 3]
1. cDNA라이브러리의 제작
1) poly(A)+RNA의 조제
만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래의 활막세포주 Syn SV6-8세포로부터의 Poly(A)+RNA의 조제는 Fast TrackTMmRNA ISOLATION KIT Version2(Invitrogen제)를 사용해서 실시했다.
즉, 10cm 배양접시 20매분의 Syn SV6-8세포를 호모지나이저하고, 키토첨부의 처방에 따라서 전 RNA를 조제했다.
또, 키토가 부속된 올리고d(T) 셀룰로오스를 사용해서 키토첨부의 처방에 따라서 poly(A)+RNA를 정제했다.
2) cDNA라이브러리의 구축
상기 poly(A)+RNA5㎍를 재료로 해서 cDNA합성키토 Time SaverTMcDNA Synthesis Kit(Pharmacia제)를 사용해서 키토첨부의 처방에 따라서 2개체인 cDNA를 합성하고 BstXI어댑터(Invitrogen제)를 DNA ligation Kit(타카라 주조사제)를 사용해서 키토첨부의 처방에 따라서 연결했다.
유리의 BstXI 어댑터의 제거는 키토부속의 Size Sep400 Spin Column을 사용해서 키토첨부의 처방에 따라서 실시하여 어댑터부가 2개체인 cDNA약 100㎕을 얻었다.
이와 같이 해서 제작한 어댑터부가 2개체인 cDNA 약100㎕중에 1회의 Ligation 반응에는 2㎕를 사용하고, 미리 제한효소 BstXI 및 알칼리포스파타아제(타카라슈조오사제)처리한 PEF-BOS벡터 [Nuc, Acid Res., 18:5322(1990)]과, DNA ligation Kit(타카라슈조오사제)를 사용해서 연결하여 cDNA라이브러리를 구축했다. 구축한 cDNA라이브러리는, 대장균세포주 DH5(토오요오보오사제)에 형질도입되고, 전체의 사이즈는 약 2×105의 독립된 클론이라고 추정되었다. 형질도입된 대장균 2,000 내지 4,000클론으로 된 푸울을 50푸울 제작하고 이하의 실험에서 사용했다.
2. 직접 발현법에 의한 클로닝
1) 293T 세포에의 트라스페크션
상기의 푸울한 대장균을 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB배지(Molecular cloing: A Laboratory Manual, Sambrook등, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)]로 배양함으로써 cDNA의 증폭을 하고, 알칼리법[Molecular cloing:A Laboratory Manual, Sambrook등 Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)]에 의해 대장균에서 플라스미드 DNA를 회수했다.
얻어진 플라스미드는DNA는, 염화세슘/취화에티듐 밀도구배에 의한 초원심을 2회 반복함으로써 정제도를 높이고, 인산칼슘법에 의해 293T세포[ 293세로(Trasformed primary embryonal Kidney, human ATCC CRL 1573)에 SV40 LargeT항원 cDNA를 도입한 세포주]에 트라스페크션했다.
즉, 정제한 플라스미드 DNA2㎍을 1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA를 함유한 100㎕의 완충액에 용해해서, 14㎕의 2M CaCl2를 첨가한 다음, 50mM HEPES(ph7.1), 280mM NaCl, 1.5mM Sodium phosphate로 된 완충액에 서서히 혼합하고, 온실에서 30분간 배양하고 24구멍 플레이트속의 293T세포에 첨가했다. 293T 세포는, 10%우태아혈청(PCS: Bioproducts제)을 포함한 DMEM(GIBCO제)배지에서 37℃, 5%CO2의 조건하에서 2일간 배양했다.
2) FACScan에 의한 해석
형질도입한 293T세포는 0.02%의 EDTA를 포함한 PBS로 24구멍 플레이트에서 박리하고, 2%FCS, 0.02%N, N3을 포함하는 PBS로 된 FACS완충액으로 2회, 세포를 세정한 다음, 1차항체로서 10㎍/㎖의 상기 모노클로날 항체 RS38존재하에서 20㎕의 FACS완충액에 헌탁하고, 20분간 얼음속에서 배양했다.
RACS완충액으로 2회세정 후에, 2차항체로서 FITC표지 염소항마우스1g항체(Cappel제)를 사용해서 다시 15분간 얼음속에서 배양했다.
요오드화 프로피듐(propidium Iodide, pI)을 최종농도 1㎍/㎖이 되도록 첨가하고, 다시 5분간 얼음속에서 배양한 다음, FACS완충액으로 3회세정한 다음, 전방산란광으로 세포의 생사를 식별한 후, 살아있는 세포만을 FACS can(Becton Dickin Son제)으로 해석했다.
3) cDNA라이브러리의 클로닝
2,000 내지 4,000클로닝의 대장균을 하나의 푸울로 하여 알칼리법에 의해 회수된 플라스미드 DNA를 상기한 바와 같은 방법에 따라 293T 세포에 트한스페크션하고, 상기 FACS해석에 의한 스크리닝을 실시했다.
25번째 푸울을 발현시킨 293T세포에 마우스 모노클로날 항체 RS38에 의해 강하게 염색되는 피이크를 확인했다.
본 플라스미드 DNA의 푸울을 다시 대장균DH5(GIBCO BRL제)에 형질도입해서, 50㎍/㎖의 암피실린을 포함한 LB아가플레이트에 접종했다.
콜로니를 형성한 약 2,000개의 클론을 플레이트의 저면에 망목현상으로 구분을 해서 접종한 클론의 위치를 알 수 있도록 한 아가플레이트에 100클론/플레이트가 되도록 1개씩 접종해서 같은 것을 2개 제작했다.
100개의 클론을 1개의 푸울로해서 20푸울을 제작하고, 50㎍/㎖의 암피실린을 포함한 LB배지 대장균을 배양했다.
알칼리법으로 플라스미드 DNA회수한 후, 293T세포에 인산칼슘법에 따라 트란스페크션하여 상기한 바와 같이 해서 FACS can해석을 실시했다. FACS can해석의 결과, 양성이라고 인정된 하나의 푸울에서 대장균 100클론을 1개씩 단리해서 각자의 클론을 배양하고, 알칼리법에 의해 플라스미드 DNA를 회수했다.
각, 플라스미드 DNA를 회수했다.
각, 플라스미드 DNA를 293T세포에 인산칼슘법에 따라 트란스페크션해서 상기한 바와 같이 FACS can해석을 하여 단일 양성클론을 얻어서 pRS38-BOS라고 명명했다.
본 클론에 대하여 Auto Read Seguencing Kit(pharmacia제) 및 Auto Cycle Seguen Cing Kit(pharmacia제)를 사용해서 키트첨부의 처방에 따라서 시이퀀스 반응을 하고, A.L.FTMDNA시이퀀스(pharmacia제)로 염기배열의 결정을 했다. 그 결과, 최장의 Open Reading Frame 보다 180아미노산 잔기를 코드화한다고 추정되는 전장 996bp(배열표의 배열번호2)의 유전자이고, 유전자 해석 소프트 Genetex를 사용해서 데이터 베이스 SWISS PLOT 및 NBRL에 의한 동질성 검색을 한 결과, 신규의 유전자였다.
4) Northern Blotting analysis에 의한 발현검토
RA환자유래의 활막세포주 Syn SV6-14, RA환자유래의 활수간질세포주 RASV5-5, 및 정삭적인 사람유래의 골수간질세포주 NF SV1-1에서 Fast TrackTMmRNA ISOLATION KIT version 3.2(Invitrogen제)를 사용해서 poly(A)+RNA를 조제하고, Northern Blotting analysis (Molecular Cloing:A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989)을 실시했다.
즉, 10cm 배양접시 10매로 배양한 각자의 세포주를 회수해서 호모지나이저 후, 키트첨부의 처방에 따라서 전RNA를 조제했다. 또, 키트부속의 올리고d(T) 셀룰로오스를 사용해서 키트첨부의 처방에 따라서 poly(A)+RNA를 정제했다.
프로브의 표지는 Multiprime DNA labelling SySytem(Amersham제)를 사용해서 실시했다. pEF-BOS stXI부위에 삽입된 RS38을 코오딩한다고 생각되는 인서트를 제한효소 HindⅢ에 의해 소화시켜서 315bp의 단편(fragment)을 조제하고, 키트첨부의 처방에 따라서 표지프로브를 제작했다. synSV6-14, RASV5-5, 및 NFSV1-1에서 조제한 poly(A)+RNA를 1레인당 3㎍를 사용해서 아가로스겔 전기영동을 한 다음, Hybri dization Transfer Membrane로서 Gene Screen plusTM(DUPONT제)를 사용하고, 캐필레리법에 의해 하이브리디제이션은 0.5M NaPO4, 1mM EDTA, 7%SDS, 1%BSA, ph7.0의 조성으로 된 Gilbert & Church buffer를 사용해서 65℃로 하룻밤 실시했다. 하이브리디제이션 수료후에, 맘브란을 2×SSC호 실온으로 4회 세정하고 다시 0.1×SSC, 0.1%SDS로 55℃로 2회 세정한 다음, X선 필름과 중합해서 하룻밤 오토레디오그래피를 실시했다.
그 결과 제1도에 표시하듯이 Syn SV6-14에 약 1.0Kb의 명료한 밴드가 검출되었다.
3. BALB 3T3세포에 의한 발현
신규분자를 BALB 3T3세포에 도입해서 동물세포에서의 발현을 검토했다.
즉, 20㎍의 pRS38-BOS와, 2㎍의 네오마이신 내성유전자를 포함한 pSV2neo[P. J. Souethem and P.Berg, J. MO1. Appl. Genet., 1:327(1982)]을 1×107세포/㎖의 0.8㎖의 분취량에 첨자하고, 10분간 얼음속에서 배양한 다음, Gene pulser(BioLad 제)를 사용해서 250V??250μF의 정전용량의 조건으로 트란스페크션을 하여 동시형질 전도입했다.
또, 10분간 얼음속에서 배양한 다음, 세포를 2㎎/㎖의 G418 및 10% FCS(Bio products 제)를 포함한 DMEM배지(GIBCO)에 헌탁해서 24구멍플레이트에서 배양했다. 배약액의 교환은 3일 걸러서 실시하고, 약2주간 후에 생육이 좋은 네오마이신 내성부착세포의 단일의 콜로니를 형성하고 있는 구멍으로부터 상기 마우스 모노클노날 항체 RS38과 반응하는 형질전환세포주 BALB 3T3 38-1, 38-3 및 38-9를 얻었다. 또, 대조세포로서 RS38과는 반응하지 않지만 네오마이신 내성인 형질전환 세포주 BALB 3T3 38-4를 얻었다.
4. 신규분자의 생물학적 성질
1) 마우스프리B세포주의 증식지지
신규분자의 생물학적성질은, 스트로마세포의존성에 증식하는 마우스프리B세포주DW34를 사용해서 증식세포수를 지표로하여 이하에 표시하는 방법으로 해석했다.
먼저 24구멍플레이트에 형질도입세포주 BALB3T3 38-1, 38-3 및 38-9와 대조세포주 BALB3T3 및 BALB3T3 38-4를 융합이 될 때까지 배양하고, 30Gy의 방사선을 조사한 후, 1구멍당 2×103개의 DW34를 첨가해서 10%FCS(Bioproducts제)를 포함한 RPMI-1640(GIBCO제) 배지속에서 37℃, 5%CO2의 조건으로 4일간 배양했다. 각 구멍의 DW34의 살아있는 세포수를 트리판블루염색으로 산정해서 증식지지능을 해석했다. 그 결과, 제2도에 표시하듯이 형질도입세포주 BALB3T3 38-1, 38-3 및 38-9에 있어서 대조세포주 BALB3T3 및 BALB3T3 38-4와 비하여 DW34의 증식이 촉진되었다.
5. 신규분자의 물리화학적 성질
1) N말단의 해석
DNA해석 소프트 Gene Works를 사용해서 상기한 바와 같이 해서 얻어진 유전자의 소수성영역과, 친수성영역의 해석을 실시했다.
해석한 결과를 제3도에 표시한다.
그 결과, 배열표의 배열번호1의 21번째에 표시되어 있는 아미노산LyS에서 48번째의 아미노산 Ala에 이르는 28개의 아미노산 잔기로 된 영역이 가장 소수성 높고, 성숙단백질인 N말단측으로 세포막관통구역과, 세포내구역을 갖는 세포막관통형단백질이라고 예상할 수 있었다.
[산업상의 이용가능성]
상기에 상세하게 설명했듯이 본 발명은, 프리B세포증식지지능을 보유하는 신규 막 단백 폴리펩티드를 코드화하는 유전자, 그 유전자를 함유하는 벡터, 그 벡터에 의한 형질전환체 및 그 유전자를 사용한 프리 B 세포증식지지능을 보유하는 신규 막 단백의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 유전자는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자의 활막세포상의 막 단백을 코드화한다.
본 발명의 유전자를 적당한 벡터에 삽입한 다음, 상용의 숙주세포를 형질전환함으로써 대량으로 균일적인 신규 막 단백 폴리펩티드를 제조할 수가 있고, 나아가서는 만성 류마티스 관절염(RA) 환자 유래의 활막세포를 감작항원으로 사용하여 그 막 단백 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체를 제조할 수가 있으며, 이에 따라, 본 발명에 의해 만성 류마티스 관절염(RA)의 동정 및 이것들의 임상상의 진단용 시약의 제작이 가능하다.
[배열표]
배열번호(SEQ ID NO) : 1
배열의 길이 : 180
배열의 형 : 아미노산
토포로지 : Linear
배열의 종류 : 펩티드
배열
배열번호(SEQ ID NO) : 2
배열의 길이 : 996
배열의 형 : 핵산
체인의 수 : 2개체인
토포로지 : Linear
배열의 종류 : cDNA to mRNA
특징을 결정한 방법 : E
배열
Claims (7)
- SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 단리된 폴리펩티드.
- SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 DNA.
- 제2항에 있어서, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 배열에 하이브리드하고 프리 B세포증식 지지능을 보유한 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 DNA.
- 청구항 제2항 또는 제3항에 기재된 DNA를 함유하는 재결합벡터.
- 청구항 제4항에 기재된 재결합벡터에 의해 형질전환된 원핵 또는 진핵주세포.
- 청구항 제5항에 기재된 숙주세포를 배양액에서 배양하여 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 하는 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단면을 보유하는 폴리펩티드의 제조방법.
- SEQ ID NO:1의 아미노산 배열 또는 프리 B세포증식 지지능을 보유한 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열의 단편을 보유하는 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체.
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