TW442493B - A membrane protein polypeptide having pre-B cell growth-supporting ability and a gene thereof - Google Patents

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442493 五、發明説明（1 ) 本發明係有關一種基因，及以該基因可編碼之新穎蛋 白質，更詳而言有關可絹碼具有前B細胞增殖支持活性之 新頴膜蛋白質多肽的基因，含該基因之載體，藉該載體轉 形之轉形體，使用該基因製造具有前B細胞增殖支持活性 的新穎膜蛋白質多肽的方法者。 本發明更爲有關可識別具有前B細胞增殖支持活性之 新穎膜蛋白質多肽的單榇抗體。 本發明之基因係可以編碼對於慢性關節風濕病（RA )病人滑膜辎胞上前B細胞具有亢進增殖支持活性之新穎 膜蛋白質者。將本發明之基因插入適當之載韹後，轉形常 同之宿主細胞，藉此即可製造大量且具有均一之前B細胞 增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽。由此，藉由本發明可 以作成Μ定慢倥關節風濕病（R A )及此等在臨床上診斷 此等病用試藥。 經濟部中央標準局貝工消费合作·杜印製 慢性關節風濕（RA)病人之滑膜或滑膜液中之發炎 細胞係來自未梢血者，此等細胞轉移至滑膜等之機構並未 完全被解明，惟仍可以推測，賦予細胞之化學訊息與細晦 膜上蛋白質（粘著分子）間有複雜之互相作用相關連。 曾有許多有關此等膜蛋白質對關節炎之重要性的硏究 。例如已獏知慢性關節風濕（R A )病人之滑膜內層上， 或滑膜血管上有T細胞表面分子LFA_ 1之配位體，與 血管壁上之細胞粘著或游出雙方相關之細胞間粘著分子-1 (以下稱 I C A Μ - 1 )表現〔H a 1 e 等；A r t h r U 1 s、 R h e u m .， 3 2 : 2 2 ( 1 9 8 9 )、及 H a y n e s 等； 83. 3. !0,〇〇〇 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度通用中国國家梂準（CNS ) A4規冰（210X297公釐） 442493 A7 B7 五、發明説明（2 )

Springer Semin. 1 m m u η o p a t h 〇1 工 j ^ g ^ ( 19 8 9))° 同樣還顯示表現於IT淋巴球（尤其記憶細胞）或單核 球上之integrin V L A - 4之配位體的血管細胞神著分 子一1 (以下稱V C A Μ _ 1 )係表現於慢性關節風濕.（ R A )或變型性關節炎等之滑膜或擬織維母細胞滑膜細胞 上〔morales-Ducret等；J. Immunol., 1 4 9 : 1 4 2 4 (19 9 2)〕，另外顯示被稱爲VAP — 1之膜蛋白質 會表現於滑膜之高內皮性小靜脈，此蛋白有可能做爲白血 球之特異性識別構造而作用〔Salm丨等；Science,2 5 7 >1407 (1992)]° 經濟部中央榇準局β：工消费合作枉印製 本發明人係爲探究使此等B細胞功能異常的疾病中骨 髓微小頊境之病涅上意義爲目的進行硏究，發現慢性關節 風濕（R A )及多發性骨髓瘤（Μ Μ )病人係較正常人之 來自骨Μ基質細胞的前Β細胞增殖支持活性更爲亢進，以 及此支持活性係必須前Β細胞起基質細胞直接接觸等，基 於此Β細胞系化各病人之基質細胞，構築爲具有促進前Β 細胞增殖之因子的基質細胞株（R A S V 5 — 5 ， MMSV 3 — 3 )。發現此等基質細胞株的前細胞增殖支 持—係有已往之 Stem ce!丨 iactor(SCF),丨 CAM-1 CD44, VCAM -lt LFA-Ια, LFA-1々，NCAM, ELAM-1以外之'未知 粘著因子相關連〔J. Irarauno1., 1 4 9 ： 4 0 8 8 { 1 9 9 2 )〕° 另外，細胞系化慢性閼節風濕（R A )病人滑膜細胞 83.3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逆用中國國家標芈（CNS }Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消费合作· 社印製 442493 A7 B7 五、發明説明（3 ) 之滑膜細胞株S y n S V 6 — 1 4亦與來自慢性關節風濕 (RA)病人之骨髓的基質細胞株RASV5-5—樣具 有前Β細胞增殖支持活性，遂而得到與此等細胞株可反應 ，而與不具有前Β細胞增殖支持活性之來自人骨髓基質細 胞株MFSV1-1不反應之新穎單株抗體，同時亦成功 於選殖可編碼其抗原膜蛋白質（B s t - 1 )之基因（特 願平 5-141178 號）。 另一方面，本發明人等係在製作可識別表現於慢性關 節風濕（R A )病人由來之滑膜細胞，但對於來自正常細 胞不表現之膜蛋白質的各種鼠單株抗體之過程中，獲得具 有可以與Syn SV6 — 1 4反應，但與正常骨髓間質 細胞株N F S V 1 - I不反應之性質，可標識與上述 B s t — 1不同之膜蛋白的新穎鼠單株抗體RS 3 8。繼 而篩選使用此R S 3 8抗證自慢性關節風濕（R A )病人 滑膜細胞株所製作之c D NT A庫，成功於單離可以編碼與 該R S 3 8反應之新穎膜蛋白質的純種系，遂而完成本發 明。 即，本發明係以提供具有前B細胞增殖支持活性之新 穎膜蛋白質多肽，可編碼該多肽之基因，含有該基因之載 體，藉該載體轉彤之轉形體，及使用該基因之新穎膜蛋白 質的製造方法爲目的。 另外，本發明還以提供可識別具有前B細胞增殖支持 活性之新穎膜蛋白質的單株抗體爲其另一目的。 爲達成上述目的，本發明係由以下（1 )〜（7 )所 本紙汝尺及適用中國國家標準（CNS ) 規洛（210Χ297公釐） 83.3.10,000 (請先閲靖背面之注意事項再填寫本頁)

，1T 令 442 4 9 3 A7 B7 五、發明説明（ 成0 ("一種具有序列表之第1號序列所示胺基酸或其 —部份之可表現於風濕病人滑膜上旳新穎蛋白質多肽。 -種可編碼具有序列表m】號序列所示胺基酸 (2 ) 或其一部份之多狀的D N A。 (3 )如上述（2 )之D N A， 其爲具有序列表第 號序列所示之驗序歹丨」’或可Ιέ合於其—部份被取代，欠缺 或附加之鹸序列的鹼序列者。 經濟部中央揉孪局貝工消费合作社印製 (4)一種含有如上述（2). 的重組載體。 (5 ) —種藉由上述（4 )之重組載體被轉形之原核 或眞核宿主細胞。 (6 ) —植具句第1號序列所示胺基酸或其—部分之 多肽的製造方法’其特徵爲培養上述（5 )之宿主細胞所 成。 (7 ) —種單株抗_，其爲可識別具有序列表之第1 號序列所示胺基酸序列或其一部份之多肽者。 繼而詳細說明本發明。 基本上，本發明之單株抗體可以如下製作。 即，本發明之抗體係使闬具有前Β細胞增殖支持活性 的來自慢性關節風濕（R A )病人之滑膜細胞做爲致敏抗 原，依一般之免疫法予以免疫，依一般之細胞融合法融合 細胞，依一般之選殖法予以選殖即可製作。 本發明之單株抗體的製作方法可以更具體言，以例如

(3 )之任一 D N A (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁)

-1T 東 本纸乐尺度適用中國S家揉準（CNS ) A4^ ( 210Χ297公釐） 83. 3* 10,000 442493 a7 B7 五、發明説明（5 ) (請先閲谛背面之注意事項再填寫本頁) 使用做爲培養鉑胞已被確立之來自慢性關節風濕（R A ) 病人滑膜之細胞株S y π SV 6- 1 4做爲上述致敏抗 原，使該致敏抗原免疫之哺乳動物的形質細胞（免疫細胞 )融合於鼠等哺乳動物之基質钿胞，使所得Si合細胞純種 系化，自其中篩選可以標識本發明抗體之純種系、培養其 以回收目的之抗體的方法爲較涅想。 製作上述單株抗體的方法中，以致敏抗原被免疫之晡 乳動物並不特別被限制，但考慮其對細胞融合時使用之基 質細胞間之適合性等仍以選擇爲宜，通常可用老鼠、小鼠 、倉鼠等。 免疫係可藉由一般之方法，例如藉ώ腹腔內注射等投 予上述來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜的細胞株 s y n s V 6 - 1 4的培養鈿胞於晡乳細跑即可以施行 。更具體而言可以對動韧每4〜2天投予數次P B S或以 生涅食鹽水等稀釋爲適當量，並予懸濁，視其需要併用一 般之佐劑者爲宜。又，上述投予時還可以採用—般之載劑 。免疫細胞則使用最後一次投予上述細胞株後摘出之脾細 經濟部中央梂绛局只工消f合作社印製 質 基 物 2 動< TX 乳 3 哺 P·) Sn 丨 ¢. ο 胞例Un 細，ΠΙΙη 母株丨 1 胞 J· 另細 ί 之種 > 合各 3 融之 5 所知 6 胞公 . 細爲 8 疫已g 免周 A 述使 3 α 上 以 6 宜與可X 爲胞 3 胞細 Ρ 3 4 8 9 7 8 U I 3 Ρ η ΤΧ 8 7 8 7 9 S Ν 本紙伕尺度適用中國囷家標準（CNS) A4規格（21〇>：297公釐） 83.3. 10,000 A7 442493 B7 五、發明説明（6 ) 6:511-519(1976)〕、M PC — 11 〔 Ceil, 8:405-415 (1976) ]'SP2/0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C Nature, 276 ： 269-270 (1978)〕、 FO 〔J. Immunol. Meth., 3 5 : 1-2 1 ( 1 9 8 0 ))'S194 (J. Exp. Med., 148 ^ 313— 3 2 3 ( 1 9 7 8 ) ] ' R 2 1 0 [ N a t u r e , 2 7 7： 131-133 (1979)〕等。 上述免疫細胞與基質細胞之細胞融合係可用基本上爲 公知之方法，例如可依 Μ丨！ s t e i η等之方法〔M e t h 〇 d s

Enzymol.， 7 3 : 3—4 6 ( 1 9 8 1 )〕等0 經濟部中央標準局貝工消费合作‘社5-裝 更具韹而言，上述細胞融合係可以在例如融合促進劑 存在下，在一般之營養培養基中實施。融合促進劑可例如 使用聚乙二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ )等，更視 其需要爲提高融合效率亦可添加二甲亞碩等補助劑。免疫 細胞與基質細胞之使罔比率係對基質細跑而言，使用1〜 1 0倍左右之免疫钿胞爲宜，上述融合钿胞時使周之培養 基則例如可用對上述基質細胞株增殖時極適宜之R Ρ Μ I 一 1 6 4 0培養基，Μ Ε Μ培養基，其他還有對此種細胞 培養所用之一般培養基，更可以併用牛胎兒血清（F C S )等血清補液。 細胞融合係在上述培養基內充分地混合所定量之上述 免疫細胞與基質細胞，添加對培養基爲約3 〇〜6 ϋ % ( W / V )濃度之預先加溫爲3 7 °C左右之P E G溶液，例 如平均分子量1 〇 0 0〜6 0 〇 〇左右之PEG，並予以 83. 3. 10,000 本紙乐尺及適用中囷國家標準（CNS ) A4現格（2丨0X297公度） 442493 A7 B7 五、發明说明（7 ) 混合即可達成°繼而逐次添加適當之培養基’重s以_心 除去上澄液之操作，藉此即可形成目的之®合細跑^ 該融合細胞可以甩一般之選擇培養基，例如在HAT 培養基（令次黃嘌呤，胺基蝶呤及胸腺核苷之培養基）中 培餐即可以被選擇。該HAT培養基中之培養係被持續至 目的之融合細胞以外細胞（未融合細胞）死滅爲止所需足 夠之時間，通常爲數日〜數週。繼而依超稀釋法，進行篩 選可以產生目的抗體之融合細胞及並予以單一株化° 如上述所製作可產生本發明單株抗體之融合細胞係可 在一般之培養基中繼代培養，亦可在液體氮中長期保存。 自該融合細胞採取本發明之單株抗體時，可以採用依 常法培養該融合細胞，以得其培養上澄液之方法，或將藍 合钿胞投予適合之唁乳動物使其增殖，铵爲其腹水獲得之 方法等。前者方法係極適於獏得高純度抗體之方法，而後 者係適於大量生產抗體之方法。 另外，依上述方法所得之抗體可以利用鹽析法，凝膠 過濾法，親和色譜法等一般之精製手段精製爲高純度者。 經濟部t央橾牟局貝工消f合作社印裝 如上述所製作之本發明單株抗體可以藉由放射免疫測 定法（RIA)，酶免疫測定法（EIA)，螢光抗體法 (1 m m u π 〇 f 丨 u 〇 r e s c e n c e A n a ! y s i s )等一般之免疫學上手 段，可以高感度且高精度識別抗原之表現新穎膜蛋白質的 慢性關節風濕（RA )病人滑膜細胞，並予以鑑定。 本發明之基因係自可表現具有人前B細胞增殖支持活 性之膜蛋白質的慢性關節風濕（RA)病入滑膜細胞調製 8；. 3.1J〇,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本纸伕尺度適用中圉國家橾準（CNS )六衫見格（hOxM7公瘦） -10 - 442493 A7 B7 五、發明説明（S ) mRNA後，藉由已知方法轉變爲雙股c DNA即可得。 做爲此mRN A供給源之鈾胞可爲做爲融合細胞rs 3 8 之免疫源使用之Sy n SV 6 — 1 4細胞株，惟並不限 於此等細胞株’只要可表現具有人前B細胞增殖支持活性 之膜蛋白質的細胞即可。乂，本發明中係使S y n S V 6 - 8 c 爲獲得m R N A而調製全r n A時可採用徑脈基硫瓿 酸酯處理後，進行氯化鉋密度梯度離心〔C h i r g ΐ i n e t al.t Biochemistry, 18:5294 (1979)]]¾ 得全R N A之方法，或採用在釩複合體之核糖核酸酶抑剖 劑存在下以界面活性劑處理，進行酚處理〔B e r g e r & Birkenmier, Biochemistry > l 8 ： 5 1 4 3 ( 1 9 7 9 )〕之方法》除此外還可用公知之方法。 .自全R N A調製m R N A時係可以採用使結合有低（ d T )之載劑，例如使用瓊脂糖或織槎素等之親和柱色譜 法或分批法，自全R Μ A回收p 〇 1 y ( a ) + R N A。 還可以藉由蔗糖密度梯度齬心法再精製 經濟部中央標準局負工消費合作社印袈 po1y (A)+RNA。其他還可以不調製RNA，即 直接製得P〇1y (A)與RNA之方法，或使用市販之 組劑之簡便方法。 自如上述所得m R N A獲得雙股c D N A之方法可以 例如使mRNA爲模板，以逆轉錄酶處理做爲引物之3 一 末端上具有的相辅於po ] y (A) -鏈之低聚（dT) ，合成相輔於mRNA之DNA(cDNA)。 83.3.10,000 · (#先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸法尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（21〇Χ；297公釐） 442493 A7 五、發明説明（9 ) 以鹼處理in R N A，轾分解，除去後，以所得單股 c D N A爲模板，以逆轉錄酶或D N A聚合酶（例如 KUn〇W片段等）處理後，以s i梭酸酶等處理，或直接以 RN a s e Η及DNA聚合酶等處理亦可得雙股c DNA [maniatls et al . , .Molecular Ci〇ningj Co]d Spring Harbor Laboratory ( 1 9 8 2 )，及 Gubler & Hot f man, Gene ’ 25 : 2 6 3 ( i 9 83)〕。最近還 有方便之？itS劑販售於市ο，亦可以使用其獲得雙股 c D N A ° (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) 經濟部中央標丰局爲工消費合作41印袋 將 P B R 1 0等 Η Β 1 (例如 另 表現載 主細胞 欲 合成D 與A Τ 行。 如上述所得之c DN A整合於適當之載體，例如 3 2 2 ，PSC1 0 1等EK型質體載體或Agt >1菌體載韹等後轉形大腸菌（X 1 7 7 6 ， 01 ，DH1 ，DH5等）等，亦可得CDNA庫 參照上述之 Mclecu丨sr cloning ')。 一方面，將上述方法所得雙股c D ΝΑ插入適當之 S ’藉此可以轉髟爲其他原核生物或眞核生物之宿 0 連結雙股c D Ν Α於載體時，可以附加適當之化學 Μ A連接子，在預先使用限制酶裂解之載體D n A p存在下，以τ 4噬菌體D ΝΑ連接酶處理即可進 本發明之表現載體係包含複製起源，選擇性標記，位 表現基因之前的啓動子，RN Α接合部位，聚腺苜酸 化訊號等。 A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 -12 A7 442493 B7 五、發明説明（]〇) (請先閱讀"'面之注意事項再填寫本頁) 晡乳動物細胞中之基因表現啓動子可以使用逆轉錄酶 病毒、多瘤病毒、腺病连、fe病毒（SV) 4 Q等病班啓 動子或人·多肽·鏈.延伸.因子la (HEF-lff) 等來自細胞的啓動子。例如使用S V 4 0啓動子時，依 mulligan等方 S 〔Nature’ 2 7 7 . 1 0 8 ( 1 9 7 9 ) 〕，即可以極容易實施。 複製起源可以使用來自s V 4 0多瘤病毒，腺病毒， 牛乳頭狀瘤病毒（B P V )等者，選擇性標記可以使用磷 酸轉移酶ΑΡΗ ( 3 > ) Π及I (neo )基因 '胸腺核苷 激酶（TK)基因 '大腸菌黃嘌呤素一鳥嘌呤轉磷酸核糖 基酶（Eccigpt)基因，二氫葉酸還原酶（DHF R )基因 等。 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 使甩原核細胞傲爲宿主細胞以形質表現目的之基因時 可以用適合於宿主之種由來的複製子’即以包含複製起源 及調節序列之質粒載體轉髟宿主細胞即可。又，載體係以 具有對轉形細胞可賦予表現彤質（表現型）選擇性之標識 基因者爲宜。例如大腸菌時，可以使用以其爲宿主之載體 p BR 3 2 2 予以轉形〔B〇 liver 等 ’Gene，2 : 9 5 ( 1 9 7 5 )〕。該pBR3 2 2係包含胺爷青徽素及四環 素耐性之基因，可利甩其任一之耐性即可以鑑定轉形細胞 0 原核宿主細胞之基因表現所需啓動子有Θ 一內醯胺酶 基因之啓動子〔Chang 等 ’Nature， 2 7 5 : 6 1 5 ( 1 9 7 8 )〕，或乳糖啓動子〔G〇eddel 等，Nature’ 83. 3. l〇f〇〇〇 本紙法尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規洛{ 21〇Χ：297公4 ) -13 - 442493 A7 _________ B7_五、發明説明（11) 281:544 (1979)〕，及色胺酸啓動子〔Goeddel 等 ’Nucleic Acid Res.,8 : 4 0 5 7 ( 經濟部中央標準局男工消t合作社印袋 大 等 還 C 乳 主 質爲 株 細 適 4 如 } , ， 晴 宿 白性 .胞 Β 射 3 。 例 S 外胞，自 於 蛋活 細 前 照W 等有US1U此細胞來 適 膜持 00丨現 止D 此胞iilhl除} 細等 擇 之支 前 7 表 爲個 於細ciop» OK) 選 性殖 鼠 6 可丨態 3 定主BarIP丨物 HH 胞 地 活增 用 7 養集狀 ο 限宿 ihe菌生 C B 細 當 持胞。採 1 培密 }1 不核菌 t 母微丨，3 適 支細法以：中稍宜 X 並原桿US酵核巢胞 9 以 殖 B 方可 8 盤至爲 2 惟中草 N 酒眞卵細 2U 可 增前等時 1 養胞度？ ， 主枯CI如等鼠la{ 等， 胞以殖性 ，培細密 1 等宿，Ba例丨倉He胞此養 細用選活1洞的0//0入 子之 }丨 有ae國，細於培 B 採現持ΠΟ8 質 ο 加 動用—菌 係 S 中胞腎定之 前以表支mu2 白 5 中 啓使01:)桿。胞\,1，細兒限體。有可接殖]01在蛋約洞 C中 a 性等細re胞 3 胎不髟行具如直增.，膜大一 ta系hi熱此主ce細丁 人並轉進碼例體胞 J 即之ί 毎 ’ 現1C嗜於宿 SS3 ，惟明件編則抗細 r 。 性}， }表”，定核〇60，胞，發條可時用03』一活〇1後 >明0}限眞 WC 胞細胞本養離 A 使前ί丨持ue線 ο 發Eslis不，ro用細ba細，培單 N 或定 48 支 Π 射 8 本 ί]]並又ha使 7ru之又之欲 D ，測 38 殖on放 9 菌bt惟CC以 2ma物 胞 C 標W9 增be之 1 腸su，sa可lNa動 細 的指 D1 胞SU量 (請先Μιΐ介面之注意事項再填寫本頁) 本紙沬尺度適用t國囷家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 442493 A7 B7 五、發明説明（12) ’在含有1 〇%FCS之RPMI - 1 6 4 0培養基中， 於5%C〇2條件下在3 7°C培養4〜6天S右。各洞孔 之D W 3 4生存細胞數係以錐蟲藍染色予以調査，即可知 增殖支持活性之抗進程度。 本發明中係使用可識別慢性關節風濕（R A )病人滑 膜細胞上新穎蛋白質的單株抗體R S 3 8的F A C S c a η 之流動細胞計測法（Π ο ΐ c y t ο m e t r y )，選別表現膜蛋白 質之轉形體，細分化作成該轉形體時使周之質體DN A， 再度作成轉形體，藉由流動細胞計測法重覆選別該轉形键 ，即可以選殖目的之基因。 具體言，培養被導入彤質之轉形體（‘ 2 9 3 T蹈胞） 後，以含有0. 02%EDTA之PBS自培養盤中剝去 ，以含有 2 % F C S，0 . 0 2 % N a N 3 之 P B S 所较 F A C S緩衝液洗滌铝胞後，做爲一次抗體與R S 3 8反 應。繼而以F A C S緩衝液浣滌除去未反應之一次抗體， 再與二次抗體之F I TC標識抗體（F I TC標識羊抗鼠 1 g抗體）反應後，以镔化丙錠染色識別死亡細胞，以 經濟部宁央揉牟局負工消资合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁」 F A C S c a η分析生存細胞，藉此選別可以與R S 3 8强 烈反應之轉形體。 再以鹼處理包含與抗體反應使用於製作轉形體之 cDNA的大提菌（DH5)，選別含目的基因之質粒群 ，再將此等質粒群再細分爲幾個質粒群’再度形質導入於 2 9 3Τ細胞後，藉由使闬上述單株抗體RS 3 8的 F AC Scan解析，重覆選擇轉形體，即可得到序列表之 本紙张尺度適用中囷國家標準（CNS )六4说格（2I〇X 297公釐） S3. 3.10,000 44249,3.....

年月EJ 修正 k η 、ίϊ死 ίί 第83109496號專利申請案 中文說明書修正興·民國88年7月修正 _ Β7 五、發明說明（13) 序列號碼2所示新穎之可編碼具有前B細胞增殖支持活性 之膜蛋白多肽的完全長cDNA(pR S 3 8-B0S)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，將此cDNA插入於pUCl 9載體之Xb a I 切斷部位間之含pBst — 1的大腸菌（e. Coli) DH5 α株係依布達佩斯條約於1 9 9 3年1 0月5日以 寄存號碼 F E RM Β Ρ _ 4 4 3 4 將Escherichia Coli DH5a(pRS 3 8 — pUC 1 9)寄存於日本工業技術院 生命工學工業技術研究所•並於1 9 9 4年8月2 3曰以 pRS 3 8 — pUC 1 9(於大腸桿菌DH5 α中）寄存號 碼9 4 0 0 1 5寄存於中華民國食品工業發展研究所。 通常真核生物之基因係由人干擾素基因等爲人所知， 亦有多形現象〔例如Nishi等，J. Biochem.，9 7 153 (1985)〕者，有時會因此多形現象而有一個 或一個以上之胺基酸被取代，有時亦有鹼序列之有所改變 但胺基酸完全不變者* 經濟部智慧財產局員Μ消費合作社印製 又*序列表序列號碼1號之胺基酸序列中缺少或附加 一個或一個以上胺基酸的多肽，或一個或一個以上胺基酸 被胺基酸所取代之多肽有時亦會具有與本發明之新穎蛋白 質一樣之功能（前B細胞增殖支持活性）。例如將相當於 人間白素一2(1 L — 2)基因之半晄胺酸的鹸基序列改換 爲絲胺酸之該序列所得多肽保有I L 一 2活性亦已爲公知 〔Wang等，Science ，2 2 4 __ 1 4 3 1C1 9 8 4)〕。 另外，使用適當之限制_或連結子等連結已知蛋白的 基因與序列表之序列猇碼2的基因•亦可以產生結合於已 本紙張尺度適用中00家標準（CNS)AW見格（；n(M3)7公.¾ ) -16 - 442493 A7 B7 五、發明説明（14 ) 知蛋白的多肽。已知蛋白的基因有例如免疫球蛋白，代替 此可變領域部份使用序列表之序列2號所示基因，與F c 部份結合即可〔（Zottlmeissl 等，DNA and Cell

Biology ，9 :34 7—353(1990)〕。 乂 ’以眞核剧胞表現時，多數會附加糖鍵，籍由改 換1個或1個以上胺基酸而可以調節附加糖鏈。這時亦有 時具有與本發明新穎腠蛋白質多肽一樣之功能。因此藉由 如上述方法以人工改變可編碼本發明中膜蛋白質多肽之基 因者，若所得多肽仍具有與本發明之新穎膜蛋白質多肽一 樣之功能，該等基因及多肽亦全部包含於本發明中。 另外，與序列表中序列2號所示基因雜交之基因，亦 只要自該基因所表現之多肽可以具有與本發明之膜蛋白€ 多肽一樣之功能（前B細胞增殖支持活性），該等基因及 多肽當然亦可被包含於本發明。這時雜交可以使用—般之 雜交條件（例如參照上述’‘ Π! Q 1 e c u 1 a r c丨0 ni π g )進行。 經系，却中央糅準扃貝工消費合作社印¾ 製造目的之具有前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質多 肽時，可以培養以可編碼該多肽之基因予以轉形之轉形體 ，以適當之可溶化劑使產生之多肽爲可溶化後’分離’精 製，即可得具均一可溶性膜蛋白質多肽。又可溶化劑有 Nonidet P — 4 0 (NP~4Q) ’ 硫駿十一醋銷（ SDS )，Triton X — 1 0 0 ’Tween 2 0 等爲較爲適 宜。 又，可溶性膜蛋白質還可以依基因工程學上操作予作 成。即，如圖3所示，根據預測R S 3 8係在N末端側具 83. 3. !〇,〇〇〇 (請先閱讀<ί·面之注意事項再填寫本頁) 本紙伕尺度通用中國國家標率<CNS) Α4現格（2丨0X297公釐） -17 - 442493 經濟部中央標準局月工消費合作社印^ A7 B7五、發明説明（15) 有貫通細胞膜功能部位蛋白質及細胞內功能部位蛋白質之 細胞膜貫通型蛋白質，所以可使拐PC R-變異誘導法〔 M. Kamman 等，Nuc丨.Acids Res，， 1 5 : 5 4 〇 4 ( 1 9 8 9 )〕將序列表序列第1號之第4 9的A s n製作 爲Ν末端之可溶性R S 3 8。道時訊息序列可以闱公知者 ，例如可爲Bs t — I (特願平5 — 1 4 1 1 7 8號）及 G— CSF (特公平2 — 5 3 9 5號）之訊息序列。 該膜蛋白質多肽之分離，精製于段可以應闬~般蛋白 質所用方法，例如使用上述單株抗體之親和色譜法等各種 色譜法，超濾，鹽析，滲析等適當地選擇，組合，依—般 之方法分離，精製即可以分離，精製本發明之膜蛋白質多 肽。 以下藉由參考例及實施例詳細說明本發明，恒本發明 並不受此實施例之任何限制。 參考例1 確立來自健康人之基質細胞株 使罔Gene Pulser(Bi〇Lad公司製）將含有SV4 0 之La r g e T抗原c D N A與雞万一肌動蛋白啓動子之 pAct-SVT質體〔BBRC 186:129- 1 3 4 ( 1 9 9 2 )〕電穿孔（electrop〇rati〇T1 )於健 常人之基質細胞。即，混合1 X 1 〇 7細胞/ m又 PBS中健常人基質細胞之〇. 整份部份與ίο e g質體，在冰中培育1 0分鐘後，再以2 5 0V， 2 5 0 ^ F靜電容量之條件施予電穿孔，再於冰中培育 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)

.-1T Λ 本紙伕尺度逍用中國國家栋準（CNS ) Α4见格（210x297公釐） 83. 3.10,000 -18 - 4424® 多 A7 B7 五、發明説明（16) 1 0分鐘後，懸濁於含1 0 % F C S ( B 1 〇 p r g d u c t s製） 之 RPMI-1 6 4 0 培養基（G1BC0 製），於 1 0 cm 培養皿中培養。每三天交換一次培養液，以含浸有胰蛋白 酶之小片濾紙取出大約二週後生育完成之附著細胞菌落， 得到來自健常人骨髓Z基質細胞株（NFSV 1 — 1 )〔 J, iniinunol.,1 4 9 ： 4 088 (1 992) ] ° 參考例2 確立來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞 株 使用 Gene Pulser (BioLad公司製）施行電穿孔法將 含T抗原cDNA與雞/?-肌動蛋白啓動子之cAc t — SVT 質體〔BBRC，186 : 129 — 134 ( 1 9 9 2 )〕導入於來自慢住關節風濕（R A )之滑膜細 胞。即，混合P B S中之來自R A病入的滑膜細胞1 X 1 07細胞/ mi?之0. 整分部份，與I Oyg質 體，於冰中培育1 0分鐘後，以2 5 0 V，2 5 0 v F靜 電容量條件進行電穿孔。再於;水中培育1 0分鐘後，懸濁 經濟部中央標準局負工消费合作社印策 於含 1 0%FCS (Bioproducts 公司製）RPWTI— 1640培養基（GIBCO公司製），於10cm培養 皿中培養。每三天交換一次培養液，以染浸胰蛋白薛之小 片濾紙取出約二週後生育良好之附著細胞的菌落，得到來 自RA滑膜細胞株（Syn SV6-8及Syn S V 6 - 1 4 )。 , 83. y 10,000 (請先聞婧背面之注意事項再填寫本頁) 本紙法尺度適用中國囷家標準{ CNS ) A4^格（2丨0X29?公釐） 442493 A? B7 五、發明説明（17) 寅施例1 製作單株抗體 (1)致敏抗原與免疫法 做爲致敏抗原使用上述參考例2所得具有前B細胞增 殖支持活性之來自慢性關節風浚（RA)病人滑膜細胞株 Syr) S V 6 - I 4進行敏化抗原。細胞株係使用含有 1 0 %牛胎兒血清（F C S ’ Bioproduct公司製）及5 0 "M2 -氫硫基乙醇之RPMI — 1 δ 4 〇 (G1BC0公司 製）做爲培養基，於5%C〇2 ，3 7°C溘度條件，在培 養器中繼代培養。 細胞係經0 . 0 2 % E D T A，P B S處理後，經由 經濟部中央樣準局負工消f合作枉印袈 輕輊吸移自培養器之培養燒瓿回收。以約1 X 1 0 7個/ m 細胞數將此細胞懸濁於R Ρ Μ I _ i 6 4 0培養基， 使之浮遊，免疫於BALB/C系鼠（4週齡，雌，日本 S L C公司製）。初次免疫係將約1 X 1 0 7個/ m $細 胞注射於鼠腹腔內，2〜3週後再以1 X 1 0 7個/m j 細胞追加免疫。再每間隔2〜3週以1 X 1 0 7個/ m jj 細胞追加免疫2〜3次◊最後免疫後之第3天屠殺老鼠取 出脖臟。 (2 )細胞融合 細切自一隻老鼠取出之脾臟，離心沈溧遊離之脾細胞 後，懸濁於RPMI — 1 6 4 0培養基（G1BC0公司製） 中，使其浮游，充分洗滌。另一方面，於含有1 0%牛胎 兒血清（FCS, FILTR0N公司製）之 DMEM (GIBC0公司製） 83. 3. L0.000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) " 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八衫見格（210X297公釐） 20 -

44249J A7 B7 五、發明説明（is) 培養基培養鼠骨髓細胞瘤細胞株P 3 X 6 3 Ag 8 . 653 ( J. Immunol. >123： 1548( 1979))，與上述一樣以上述DMEM培養基洗滌所 得細胞後，將1 X 1 0 7個該細胞與1 X 1 [) 8個上述脾 細胞放入離心管中混合，依常法〔C丨1 η . £ X p . i m m u I) ο 1 ., 4 2 :458-462 (1 980)〕藉由聚乙二醇 1 5 0 0 ( B o e h r i n g e r公司製）進行細胞融合。 將所得融合細胞分別注入含1 0 % F C S之D Μ Ε Μ 培養基的9 6個洞孔培養盤，於5 %C〇2恆溫器中，在 3 7 °C培養。自第二天開始慢慢地以HAT選擇培養基（ 含1. 0X1 0_4 Μ次黃嘌呤4. 0X10—7Μ胺基蝶呤 ，‘ 1 . 6 X 1 0-5Μ胸腺核苷之完全RPMI — 1 6 4 0 培養基中，加入1 〇%FCS及S 0"Μ2—氫硫基乙醇 之培養基）予以替換繼續培養。開始培養後以每週二次分 別以新之H A Τ培養基取代上澄液之一半，繼續培養，維 持其增殖。 使用極限稀釋法選殖上述所得融合細胞。 經濟部中央樣準局男工消費合作杜印製 即，利用上述融合細胞之培養上澄液中的抗體，調查 其與致敏性抗原之結合性，依常法使用極限稀釋法僅將其 中與致敏性抗原具有强烈結合性之純種系形成爲純種系。 純種系之形成係調整使其含所定量之上述融合瘤及 BALB/C系鼠脾細胞，使每1洞孔可爲1〜1 〇個融 合瘤，將其播種於9 6孔洞之培養盤，於5%C〇z恆溫 器中在3 7 °C培養。依一般之極限稀釋法，對增殖之融合

83. 3. LO.OOO (请先閱讀竹面之注意事項再填寫本頁) -1 βϋ速用中國國家標準（CN’S ) A4现格（2丨0X297公釐） -21 * μ r '442 4 9 «3 _______B7 五、發明説明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 瘤施予同樣選殖之操作，操作至理論上可成爲單一之純種 系爲止。可產生目的之抗體的純種系係使用上述致敏性抗 原進行篩選。 (3 )篩選 融合細胞（融合瘤）之篩選係使甩流動細胞計測儀（ F I 〇 w c y u m e t e r )依間接螢光抗體法施行。 可產生目的抗體的純種系之篩選係做爲靶細胞使用（ a ) S y n S V 6 - 1 4 (致敏性抗原）（b)來自正 常人骨髓基質細胞株NFSV 1 — 1等。即，使具有前B 細胞增殖支持活性的來自R A病人滑膜之細胞株（S y η SV 6 — 1 4 )免疫於BALB/C系鼠，藉此以可以與 Syn SV6—14反應，與不具前B細胞增殖支持活 性之正常人骨髓由來之基質細胞株（NFSV1—1)不 反應做爲指標進行篩選單株抗體。最初之篩選係使用致敏 性抗原之S n y S V 6 — 1 4做爲反應細胞進行。首先 經濟部中央標準局貝工消贫合作社印裝 爲選出與Sny ‘SV6 — 14反應之融合細胞純種系， 選別與該S y n S V 6 _ 1 4反應之培養上澄液，進行 一次篩選。 即，將細胞懸濁於反應緩衝液〔含2 % F C S， 0.002%NaN32PBS〕，使其浮遊於20"交 之融合瘤培養上澄液中（約5X1 05個/2 0" j?)， 於4 °C反應2 0分鐘。 藉該緩衝液洗滌二次後，加入F I TC識別羊抗鼠 83. 3.10,000 本纸伕尺j!逍用中國國家標準（CNS ) 格（210X297公釐） _ 22 - ΠΓΤΠΓ A7 B? 五、發明說明（2〇 ) I g抗體（Cappel公司製）培養2 0分鐘。洗滌三次後· 以流動細胞計測儀（FACScan, Becton Dickinson公司製 )予以分析。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，使用來自正常人骨髓基質細胞株NF SV 1 -1做爲反應細胞，如上述藉由流動細胞計測儀予以分析》 藉此得到產生出對Sy n SV6_ 1 4可更強烈反應之 融合瘤* 如上述分離出可產生與Syn SV6 — 14反應， 但與來自正常人骨髓基質細胞株NF SV 1 — 1不反應之 抗體的融合瘤（RS38) *此融合瘤產生之抗體係 I g Μ，k 型。 又*可產生上述單株抗體R S 3 8之該融合瘤係以 B A L B / C系鼠脾細胞與鼠骨髄瘤P3X 63Ag8.653做爲 母細胞被製作之新穎融合細胞，依據布達佩斯特條約，於 1993 年 10 月 5 日以 Μ o U s e - Μ 〇 u s e h y b r i d 〇 m a R S 3 8， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 寄存號碼FERM BP-4433被國際寄存於日本的公設微生物寄 存機關之工業技術院生命工學工業技術研究所。並於 1 9 94年8月1 5日以鼠-鼠融合瘤細胞RS38寄存 號碼9 6 0 0 0 6寄存於中華民國食品工業發展研究所。 (4 )精製抗體 依常法培養上述（2 )製作之融合細胞，依常法分離 |精製培養上澄液中所產生之抗體· 即，自各洞孔中，從上述致敏性抗原之抗體價最髙的 洞孔採取融合瘤·取其中一個確認有細胞增殖的洞孔，將 本紙張尺度適用中00家柃準（CNS)/\1規格（210x297公坌） -23 - 44249 A7 B7 五、發明説明（21) 所得培養細胞展開於5%C〇2組铵培養燒瓶，於3 7°C 繼代培養，使其增殖。在投予十八碳烷之BA L B/C系 鼠（6週齡，雌，日本SLC公司製）之腹腔注入所得細 胞。1 0〜1 4日後採取所產生之腹水，以5 0 %硫酸鉉 鹽析，以PB S透析後，於QA£柱精製。抗體係再予鹽 析，充分透析，得約6 mg / m又精製品。 實施例2 單株抗體之性質 (1 )細胞株之分佈 使用F A C S c a η分析在各種細胞株（如表1所示各 細胞系）中之R S 3 8抗原分佈。即，在1 Ο μ g / m J? 做爲一次抗體寅施例1中所得鼠單株抗體R S 3 8存在下 ，將各種細胞榇恝濁於含2 % F C S ，0 . 0 2 %

M濟部中央標準局男工消f合作社印5L N a N 3之P B S所成F A C S緩衝液中，於冰中培養 2 0分鐘。以F A C S緩衝液洗滌二次後，使用F I T C 標識羊抗鼠I g抗體（Cappel製）做爲二次抗體，再於冰 中培養1 5分鐘。添加碘化丙錠（propidium丨odide, P1 )使其最後濃度爲1 g/mi?，再於冰中培養5分鐘。 以F A C S緩衝液洗淨3次後，以前方散射光識別細胞之 生死，以 F A C Scan (Becton Dickinson )僅分析活細 产 胞。又，使肸鼠單株抗體S G 2及5 -1 4 1 1 7 8號）做爲對象。結果示於表i。由表1可知 ，RS38抗原之分佈係與SG2及RF3不同。 叮3.10,000 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -24 · 442493 五 '發明説明（π) 表1 以F A C S分析細胞系之結果 經濟部中央標準局只工消費合作社印裳

Or i gen Cell Line SG2/RF3 RS38 T cell line MOLT-4 — + /- JURKAT + — B cell line Ra j i 一 — Paud i — — CL4 — _]_ _L Ramos 一 — Myeloid U937 + K562 — HL60 + /- M07 + Miscellaneous HepG2 — T24 — + /- SKWG-4(P122) — + /- He 1 a — -r / — (讀先閲讀卄面之注意事項再填寫本頁〕 本紙張尺度適用中國S家標準（CNS ) A4規潘（21〇Χ 297公釐） 813. 10,000 44249 3 A7 B7 經濟部中央標準局男工消費合作社印裳 五、發明説明（23 ) 實施例3 1 .製作c D N A庫 (1 )調製多聚腺苷酸（po 1 y (A) ) +RNA 自來自慢性關節風濕（RA.) g人滑膜細胞株S y n S V 6 - 4細胞f自製！> 〇丨y ( A ) + R N A時係便用 Fast Track™ niRNA 1S0L ation kit version 3 . 2 { 丨nvitrogen公司製）予以實施。即，使2 0個1 0 crnl§ 養皿所需量之S y n S V 6 — 8細胞勻質化，依組劑所 附處方調製全R NA。另外，使用組劑所附之低聚 d ( Τ )纖維素，依組劑所附處方，精製 P 〇 ] y ( A ) -r R N A ° (2)構築〇0〜八庫 以5pg上記po1 y (A)+RNA做爲材料使甩 c D N A 合成組劑 T i m e S a v e r T M c D N A S y n t h e s i s K i c ( Pharmacia公司製）依組劑之處方合成爲雙股c Di\T A， 使用DNA ligation Kit (寶酒造公司製）依組劑所附 處方連接B s t X I連接子。使用組劑所附之Size Sep 4 0 0 Spin Co丨umn，依組劑所附處方除去避離之 Bs tX I連接子，得約1 0 0# i?附加連接子之雙股 c D N A 0 在第1次之連接反應反應中使用所製作約1 0 0 v β 附加連接子雙股c DNA中之2 μ i?，使用預先以限制薛 B s t X I及鹸性磷酸酯酶（寶酒造公司製）處理之 本纸伕尺度速用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ2ί>7公釐） 83. 3* 1〇.000 (請先閲靖背面之注意事項再填寫本頁) *-& 味 -26 * 44249 3 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 五 '發明说明（24) pEF-BOS 載體〔Nuc. Acid Res,, I 8 : 5 3 2 2 (1 9 9 〇 )〕與 D ΝΑ ligation Kit (寶酒造公司製 )連接，構築爲cDNA庫。構築cDΝΑ庫係被形質轉 形於大腸菌細胞株DH5 (Toyobo公司製），全體之尺寸 係被推定爲約2 X 1 (3 5之獨立純種系。將導入彤質之大 腸菌2 0 0 〇〜4 0 〇 〇純種系所成庫作成5 0庫，使用 於以下實驗。 2 .以直接表現法予以選殖 (1)轉移感染於293丁細胞 以含有5 D 〃 g/mp安匹西林之LB培養基〔 Molecular Cloing: A Laboratory Manual, Sambrook^, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 9 8 9 )) 培養上述庫之大腸菌以擴大c DN A，藉由鹼式法〔 Molecular C ] o i n g ： A Laboratory Manual , Sambrook^j , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 9 8 9 )) 自大腸菌回收質體DN A。可藉由氯化铯/溴化乙錠密度 梯度重缓.二次超離心提髙所得質體DN A之精製度，藉由 磷酸鈣法轉移感染於2 9 3 T細胞〔在2 9 3細胞（ Transformed primary embryonal kidney, human A T C C CRL 1 5 7 3 )中導入 SV4 0 Large T 抗原 cDNA 之細胞株〕。 即，將2 〃 g精製之質粒D N A溶解於含1 πί Μ Tris-HC] 〇. 1 m M EDTA 之 1〇〇p5 本紙涑尺度適用中國國家揉準（CNS) A4規格{ 210X297公釐） 81110,000 (請先Μ讀t面之注意事項再填寫本頁) 訂 ^ -27 - '^'4 42^93 A7 B7 五、發明説明（25 ) 緩衝液中，添加1 4 " Θ之2 M C a C丨2後，慢慢混 合於 50mM HEPES (pH7. 1) > 2 8 0 m Μ N a C 1 ，1. 磷酸鈉所成緩衝液，於室溫培育 3 0分鐘，在2 4洞孔培養盤中添加2 9 3 T細胞。 2 9 3 T細胞係在含1 0 %牛胎兒血清（P C S ， Bioproducts公司製）之DMEM (G1BCO公司製）培養 基，於3 7°C，5%C〇2之條件下培養二天。 (2) 藉由FACS分析 以含有0. 0 2%£〇丁六之卩：63自2 4洞孔剝去 形質導入過之2 9 3 T細胞，以含有2 % F C S， 0 . 0 2 % N a N 3之P B S所成F A C S緩衝液浣淨二 次細胞後，在佞爲一次抗體之1 0 μ g/mi?上述單株抗 體R S 3 8存在下，懸濁於2 0 p F A C S緩衝液， 經濟部中央標準局員工消贤合作妇印裝 於水中培育2 Q分鐘。以F A C S緩衝液洗滌二次後，使 用做爲二次抗體的F I TC標記羊抗鼠I g抗體（Cappe丨 公司製.），再於冰中培育1 5分鐘。加入碘化丙錠（P I )使其最終濃度爲1 p g/mj?，再於冰中培育5分鐘後 ，以F A C S緩衝液洗滌三次，以前方散射光識別細胞之 生死，僅以活細胞進行F A C Scan (Becton Dickinson 公司製）之分析。 (3) 選殖〇01^八庫 以2 0 0 0〜4 0 0 0純種系之大腸菌做爲一個庫， 83.3.10,000 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標半（CNS ) ( 210Χ 297公釐） 28 - 442 4 9 3 A7 B7 五、發明説明（26) 依上述方法將鹼方法所回收之質體D λ; A轉移感染於 2 9 3 T細胞，藉由上述fACS分析進行篩選。在表現 第2 5庫之2 9 3 T細胞確認藉由鼠單株抗體r 3 8强烈 地被染色的艏峰。再將該質體D N A彤質導入大腸菌 D U 〇 a (GIBC〇 B K L公司製），接種於含5 0 A g/mf安匹西林之瓊脂培養盤。 經濟部中央樣準局負工消費合作社印製 在培蓑盤底面將形成菌落之2 0 〇 〇個純種系分割爲 網狀’在可以知道接種之純種系位置的瓊脂培養盤上，逐 一接種使其成爲每個培養盤1 0 0純種，作成同樣之二個 。以1 0 0個純種系做爲一庫，製作2 0庫，於含5 0 "g/mj?安匹西林之LB培養基培養大腸菌。以鹼方法 回收質體D N A，藉由磷酸钙法轉移感染於2 9 3 T細胞 ，與上述一樣進行FAC Scan分析。FAC Scan分析 之結杲，自確認爲陽性之一個庫逐一單_ 1 〇 〇純種系大 腸菌，分別培養各純種系，以驗法回收質證D !\τ A。以碟 酸鈣方法轉移感染各貢體D ΝΑ於2 9 3 T細胞，與上述 —樣道行F AC Scan分析，得到單一之陽性純種系，命 名爲 I>RS3 8_B〇S 。 使用 A u t 〇 R e a d s e q u e n c 丨 n g k 丨 t ( P h a r m a c i a 公司製 )及 β Auto Cycle sequencing kit (Pharmacia 公司製 )，依該組劑處方進行該純種系之序列反應，以A . L . F . TM D N A序列儀（Pharmacia公司製）決定驗序列。結果爲 被推定可編自最長之開放密碼（〇 p e n r e a d i n g f r a m )至 第1 8 Q胺基酸殘基之全長9 9 6 bp (序列表之序列號 83.11ί),000 (诗先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家栋準（CNS ) AAg { 210X297公釐） -29 ^ A7 B7 "4442493 五、發明説明（27) 碼2 )的基因’使用基因分析軟體Genetex，藉由檢索軟 體SH SS PLOT及NBU進行同種性檢索，結果獲知爲新 穎基因。 (4 )藉由北方吸溃分祈法（n 〇 Γ t h 〇 r η B 1 t】n g analysis)檢討其表現。 使用 F a s 匕 T r a c k T M m K N A I S 0 L A T 1 0 N K I T v e r s 1 o n 3. 2 Unvit「ogen製）自Ra病人由來之滑膜細胞株 s y n SV6-1 4 ，RA病人由來骨髓間質細胞株 RASV5—5 *及來自正常人骨髓間質細胞NFSV1 —1調製po 1 y (A) 丁 RNA，進行北方吸潰分析（ Molecular Cloing; A Laboratory Manual, Sambrook等 > Cold Spring Harbor Laboratory Press5 1 9 8 9 ) 即’分別回收以1 0個1 0 c m培養皿所培養之細胞株， 經勻質化後，依組劑之處方調製全r N A。再以組劑所附 之低聚d ( T )纖維素，依組劑所附處方精製 poly ( A ) + R N A ° 探針之標識係使用M u 1 t i p r丨m e D N A丨a b e 1 1 i π g sysytem (Amersham製）進行。即，藉由限制酶H i n d ΠΙ消化被插入於p E F — B 0 S之B s ί X I部位被推 測可以編碼RS 3 8之插入子，調製爲3 1 5 bp片段， 依組劑所附處方作成標識探針。使用3 〃 g自S y η SV6-14 ，RASV5-5 及 NFSV1 — 1 調製 之ρο1y (A)+RΝΑ，進行瓊脂膠電泳後，使用 本紙張尺度適用t國园家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (#先閱1#背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局K工消f合作社印製 83.3. 10,000 -30 A7 B7 五、發明说明（28 )

Gene Screen PlusTM (DUPONT 製）做爲雜交轉移膜（ hybridization transfer meinbrane,依 Capiary 方法予 以轉錄。雜交係使用〇. 5M N a P 〇 4 ，lmM EDTA，7%SDS ，1%BSA，pH 値 7. 0 之組 成所成 G i 1 b e r t & C h u r c h b u f f e r 於 6 5 °C 寅施一晚。雜 交完畢後，以2XSSC於室溫洗滌膜4次，再以0· 1 X S S C > 〇 1 % S D S於3 5 °C洗滌二次後，與X線 膠片重κ進行—晚之放射自顯術。結杲如圖1所示在 S y n S V 6 - 1 4被偵測出約1 . 0 k b之極顯明之 集合帶（band )。 3.藉由BALB3T3細跑之表現。 檢討導入新穎分子於B A LB 3 T 3細胞，在動物細 胞之表現。即，將含2 0"g之pRS3 8-BOS與2 eg刃新徽素敲性基因之pSV2neo 〔P. J. Souethem and P. Berg, J. Mol. Appi. Genet., 1 ： 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裳 327 (1982)〕加入 1X107 細胞/ mj?之 0. 8mi2整份部份，於冰中培育10分鐘後，使用 Gene Pulser (BioLad 製），以2 5 0V ， 2 5 0 p F靜 電容量條件轉移感染，同時導入形貢。 再於冰中培育1 0分鐘後，懸濁細胞於含2 mg / m又 G4 1 8及 1 0%FCS (Bioproducts 製）之DMEM 培養基（G丨BC0製），以2 4涧孔培養盤培養。每3天交 換一次培養液，二週後自生育極佳之新徽素耐性附著細胞 83. 3.10,000 (請先閱讀1r面之注意事項再填寫本頁) 本紙伕尺度適用中國國家標率（CNS ) Μ現格（2丨0XW7公度） -31 經濟部中夬榇準局M2；工消費合作社印^ 83. 3.10,000 n q q ' A7 B7 五、發明説明（29) 的形成有單一菌落之洞孔，得到可與上述鼠單株抗體3 8 反應之轉形細胞株BALB3T3 38 — 1 ，38 — 3 及3 8 _ 9 。又做爲對照細胞得到不與R S 3 8反應但爲 新黴素耐性之轉形細胞株BALB3T3 38-4。 4. 新穎分子之生物學上性質 使用與基質細胞相關地增殖之鼠前B細胞株D W 3 4 ，以增殖細胞數爲指標，依以下所示方法分析新穎分子之 生物學上性質。 首先在2 4洞孔培養盤中培養導入形質之細胞株 BALB3T3 38-1 ， 38-3及38-9以及對 照細胞榇B A L B 3 T 3及B A L B 3 T 3 3 8 — 4至 稍密集之程度，照射3 (3 G y之放射線後，每一洞孔添加 2X 1 03個 DW3 4 ，在含 1 〇%FCS (Bioproducts 公司製）之R Ρ Μ I — 1 6 4 0 ( GIBC0公司製）培養基 中，於3 7°C，5%C〇2條件培養4天。以錐藍染色算 出各洞孔之D \V 3 4的活細胞數，分析增殖支持活性。結 杲如圖2所示，與對照細胞株B A L B 3 T 3及 BALB3T3 3 8 — 4相比，導入形質之細胞株 BALB 3 T 3 38 — 1，38 — 3 及 38 — 9 中可 促進D W 3 4之增殖。 5. 新穎分子之物化性質 (1 ) N末端之分析 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱锖背面之·注意事項再填寫本頁)

,1T -32 - A7 B7 五、發明説明（3〇) 使用D N A分析軟體G e n e h r k s ，分析所得基因之 疏水性區域與親水性西域如圖3所示。結杲在序歹U表之序 列第1號第2 1所示胺基酸Ly s至第4 8之胺基酸 A ] a爲止之2 8個胺基酸殘基所成領域疏水最高，可以 預測爲在成热蛋白質之N末端側具有貫通細胞膜功能部位 蛋白質及細胞內功能部位蛋白質的貫通細胞膜型蛋白質° 〔發明之效果〕 如以上所詳述，本發明係有關可編碼具有前B細胞增 殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽的基因，含有該基因之載 體，藉由該載體之轉形體，使用該基因製造具有前B細胞 增殖支持活性的新穎膜蛋白質之方法’本發明之基因係可 以編碼慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞上之膜蛋白質 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 主 宿 之 用 常 形 轉 ， 後 體 載 之 當 適 入 插 因 基 之 明 發 本 將 可敏 更致 1 爲 肽做 多胞 質細 白膜 蛋滑 膜人 穎病 新 } 之 A 一 R 均一 有濕 具風 造節 製關 暈性 大慢 以 自 可來 即用 胞使 細以 殍濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 此以 由 ， ， )/ 體 A 抗R 株ί 單濕 之風 肽節 多關 質性。 白慢藥 蛋定試 膜鏟用 該以斷 別可診 識明上 以發床 可本臨 造由在 製藉等 以知此 ， 可 成 原實作 抗事及 I張 紙 本 準 標 家 國 國 |中 用 適 83. 3. 10,000 -33 - 經濟部中央標隼局員工消费合作社印袈 44249 3 at Β7 五、發明説明（31 ) 序列表 序列號碼：1 序列長度：1 8 0 序列型：胺基酸 局部解剖學：直鐽狀 序列種類：肽 序列

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro ^et Clu Asp Gly 5 10 15

Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly [le Gly He Leu Val Leu Leu 20 25 30 [le lie Val [le Leu Gly Val Pro Leu ile lie Phe Thr lie Lys Ala 35 40 45

Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60

Asn Val Thr His Leu Leu Gin Gin Glu Leu Thr Clu Ala Gin Lys Gly 65 70 75 80

Phe Gin Asp Val Glu Ala Gin Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95

Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Cln Gly Gin Lys Lys 100 105 110

Vai Glu Glu Leu Glu Gly Glu [le Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gin 115 120 125

Asp A!a Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gin Val Leu 130 135 140

Ser Val Arg He Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gin Asp Ser 145 150 155 160 本紙伕尺度適用中國圉家標準（cns ) Ad坑格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 (請先閱靖背面之注意事項再填寫本頁)

—ϋ、1ΤII ^ -34 - 4 42 4 9 3 五、發明説明（32)

Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gin Leu Leu He Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 Π0 175

Ala Leu Leu Gin 序列號碼：2 序列長度：9 9 6 序列型：核酸 鏈數：雙股 局部解剖學：直鏈狀

序列種類：c D N A to m R N A 決定特徵之方法：E 序列 (請先wt?背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 GTGGAATTC ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC AGA GTG CCC ATG GAA 51 GAC GGC GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA CGA ATT CTG GTG 99 CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTC GGG GTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147 AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG CCA GTC ATG GAG 195 TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG ACC GAG GCC CAG 243 AAG GGC TTT CAG CAT GTC GAG GCC CAG CCC GCC ACC TGC AAC CAC ACT 291 GTG ATG CCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG AAG GCC CAA CGA CAA 339 AAG AAA CTC GAG CAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAG 387 err CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG AGA AGA CAA AAC CAG 435 GTC TTA AGC GTC AGA ATC CCC GAC AAG AAC TAC TAC CCC ACC TCC CAC 483 GAC TCC ACC TCC GCT GCC GCG CCC CAG CTG CTG ATT GTC CTG CTC GGC 531 CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGAGATCCCA GCAAGCTGGC ACATCTTGGA ,AGGTCCGTCC 589 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS )入4见格（210XM7公釐） 83. 3, L0,000 4 42 4 9 3 A7 B7 五、發明説明（33 ) TGCTCGGCTT TTCGCTTGAA CATTCCCTTG ATCTCATCAG TTCTCAGCGG GTCATGGGGC 649 AACACGCTTA GCGGGCAGAG CACGGGGTAG CCGGAGAACG GCCTCTCGAG CAGGTCTGGA 709 GGGCCCATCG GCCAGTCCTC GGTCTGCGGA CACAGTCGGG TTGACCCAGG GCTGTCTCCC 769 TCCAGACCCT CCCiCCGGAC AATGAGTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTC AGATTGGGCA 329 TGGGGTGCGG TGTGGCGGGC ATGTGCTCCC TGTTGTTATG GGTTTTTTTT GCGCGGGGGG 889 TTGCTTTTTT CTGGGGTCTT TGAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGAGCAA 949 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGAATTC CACCACA 996 圖面之簡單說明 圈I係以北方吸漬分析法分析本發明實施例所得基因 之結杲（瓊脂糖謬電泳照相圖）。 圖2係表示本發明實施例所得新頴膜蛋白質對鼠前β 細胞株D W 3 4之增殖能力。 圖3係表示使用DN Α分析軟體Gene Works分析本 發明寅施例所得基因之疏水性區域與親水性區域之結果。 (請先閱靖;!-面之注意事項再填寫本頁) 丁 ^ 經濟部中央樣準局負工消t合作.社印袋 83.3. !0»〇〇〇 _ 36 _

Claims (1)

1. r：- ;A8 Βδ C8 D8 六、申請專利範圍 附件la:第83109496號專利申請案 中文申請專利範園修正本 請 先 闓 讀 .背 面 之 ；ί 意 事 項 再 填 % 本 頁 民國89年12月修正 —種具有序列表序列號碼1所示之胺基酸序列之 多肽 Met Λία Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys_ Arg Val Pro ifet Clu Asp Cly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly lie Gly lie Leu Val Leu Leu 20 25 30 [le [le Val tie Leu GLy Val Pro leu lie lie Phe Thr He Lys Ala 35 40 45 Asm Ser Clu Ala Cys Arg Asp Cly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr llis Leu Leu Gin Cln Clu Leu Thr Clu Ala Gin lys Gly 65 70 75 80 Phe Cln Asp Val Clu Ala Gin Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Aia Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Cln Gly Gin Lys Lys 100 105 no Vai Clu Glu Leu Clu Cly Clu !le Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Cln 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Clu Val Clu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Cln Val Leu 130 135 Se「Vai A「g He Ala Asp Lys LyS Ty「Ty「p「〇 Ser Ser Gin Asp Ser 1，15 150 丨 55 160 夂饮:¾这用* S S家悻主（CNS)A4規格 (210 * 297 Αδ BS C8 DB 六、申請專利範圍 Ser Ser Ala Ala A[a Pro G[n Uu Uu [le Val Uu Leu Giy Uu Ser . 165 170 175 Ala Leu Leu Cln )〇 2.—種具有序列表序列號碼l所示胺基酸序列的多 肽，其具有前B細胞增殖支持活性者· Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys_Arg Val Pro Met Clu Asp Cly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly [le Cly lie Leu Vat Leu Leu 20 25 30 Me He Vai He Leu Gly Yal Pro Leu [le ile Phe Thr fie Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Clu Ma Cys Arg Asp Cly Leu Arg Ala Val Met Clu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Tlir Ilis Leu Leu Gin Cln Clu Leu Thr Clu Ala Gin Lys Cly '65 70 75 80 Ph6 Cln Asp Val Glu Ais Gin Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met g5 90 95 AU Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Clu Lys Ala Cln Gly Cln Lys Lys 100 105 110 Val Clu Glu leu Glu Cly Glu He Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gin 1 !5 120 · 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Clu Arg Leu Arg Arg Clu Asn Cln Val teu 130 135 ^L40 Ser Val Arg lie Ala Asp Us Lys Ty「Tyr P「〇 Se「Ser Gin Asp Se「 hi5 150 155 160 ___________ --5^1 ® 3 S Λ (CNS)A4 (210 * 297 ) 請 先 Μ it 背 面 之 ；ί 意 事 項 再 填 % 本 •S k 訂 - 2 - 六、申請專利範圍 Ser Ser Ala A!a Ala Fro Cln Leu Leu tie Vai Leu Leu Cly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Cln i 3. —種可編碼具有序列表序列號碼1所示胺基酸序 列的多肽之DNA。 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Cly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys teu Leu Leu Cly He Cly [le Leu Val Leu Leu 20 25 30 lie lie Val [le-Leu Cly Val Pro Leu [le [le Phe Thr lie Lys Ala • 35 40 45 Asn Ser Giu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val liiet Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Vai Thr His Leu Leu Gin Cln Clu Leu Thr Glu Ala Cln- Lys Cly 65 70 75 80 Phe Gin Asp Val Clu Ala Cln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Clu Lys Ala Cln GLy Cln tys Lys 100 105 Π0 Val Clu Clu Leu Clu Gly Clu ile Thr Thr Leu Asn Kis Lys leu Cln 115 120 125 Asp Aia Ser Aia Clu Val Clu Arg Leu Arg Clu Asn Gin Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg lie Ala Asp lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gin Asp Ser 145 150 155 160 水呔用中aa家標玉（CNS)A4規格（210 X 29了公餐） 請 先 Μ 讀 .背 面 之 ;主 意 事 項 再 填 罵 頁 訂 -3 - 4 42 49 3 A8 Βδ C8 D8 六、申請專利範圍 Ser Se「 Ala Ala A[a Pro Gin Leu Leu [le Val Leu Leu Gly Leu See 165 170 175 Ala Leu Leu Gin 4 · 一種可編碼具有序列表序列號碼1所示胺基酸序 列之DNA，其可編碼具有前B細胞增殖支持活性之多肽 者· Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys -Arg Val Pro Met Glu Asp Gly . 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Ciy ile Cly ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 [le ile Val (le Leu Gly Val Pro Leu Ile tie Phe Thr lie Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Ciu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Clu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gin Gin Clu Leu Thr Clu Ala Gin Lys Gly 65 70 75 80 Phe CIn Asp Va! Clu Ala Gtn Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Clu Lys Ala Gin Cly Gin Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Clu Cly Clu ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gin Π5 120 125 Asp Ala Ser Ala Clu Val Clu Arg Leu Arg Arg Clu Asn Cln Val Leu 130 135 i40 孓疼在（CNS)A4 規格（210* 297 公复） 請 先 閱 it 背 面 之 意 事 項 再 填 寫 本 •頁 k IT 線 4 4249 3 as B8 C8 ___ D8 六、申請專利範圍 Ser Val Arg He Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Cln Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Ala Pro Cln Leu Leu Ue Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Cln 5，如申請專利範圍第3項之DNA，其具有序列表· 序列號碼2所示之鹹序列者 CTCCAATTC ATG GCA TCT ACT TCG TAT CAC TAT TCC ACA CTG CCC ATG CAA 51 CAC CCC CAT AAC CGC TGT AAC CTT CTG CTG GGG ATA CGA ATT CTG GIG 99 CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GCG CTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147 AAC GCC AAC ACC GAG GCC TCC CGC CAC CCC CTT CCC CCA GIG ATG GAG 1S5 TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTC CAA CAA GAC CTG ACC CAC CCC CAC 243 AAG GCC TTT CAG CAT CTG CAC CCC CAG GCC CCC ACC TGC AAC CAC ACT 291 GTC ATC CCC CIA ATG GCT TCC CTG CAT CCA GAC AAG CCC CAA CGA CAA 333 AAC AAA GTG GAC GAC CTT GAC CGA' CAC ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAC 387 CTT CAG GAC GCG TCT CCA CAG CTC CAC CCA CTG AGA ACA CAA AAC CAG 435 CTC TTA ACC CTG ACA ATC CCG CAC AAC AAC TAC TAC CCC ACC TCC CAC 483 GAC ICC ACC TCC GCT GCC GCC CCC CAC CTG CTC ATT CTC CTG CTC CCC 531 CTC ACC GCT CTC CTC CAC TGACATCCCA GGAACCTCCC ACATCTTCCA AGCTCKTCC 589 TGCTCCGCTT TTCGCTTCAA CATTCCCTTC ATCTCATCAC TTCTCACCCC CTCATCCGGC 649 AACACGCTT.A CCCGCCAGAC CACGGGCTAC CCGGAGAACC CCCTCTCCAC CACCTCTGCA 709 CGGCCCATCC CCCACTCCTC CCTCTGCCCA CACACTCGCG TTCACCCACG CCTCTCTCCC 7S9 TCCACACCCT CCCTCCGGAC AATCACTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTC ACATTCCCCA 82S TCCGGTGCGG TCTCGCCCCC ATCTCCTCCC TCTTCTTATG CGTTTTTTTT CCCCGCCCCC 889 甲中 SS冢愫主 tCNS)A·}規格（2J0*297 ) -----1--------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之沒意事項再填寫本異> 4 42493 A8 BS C8 D8 經洚部智慧財產局員工消费合泎社 六、申請專利範圍 TTCCTTnTT CTCCCCTCTT TCAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGACCAA 949 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAACAATTC CACCACA 9M 6. —種具有前B細胞增殖活性之多肽之製法，其特 徵爲由下列步驟所成： 製成含有申請專利範圍第3 ，4或5項之DNA的重組載 體；藉該重組載體轉形原核或真核宿主細胞，以製成原核 或真核宿主細胞；及培養該宿主細胞，以製造對應於該 D A N之多肽，如此所構成。 7. —種單株抗體，其特徵爲可識別具有申請專利範 圍第1項之序列表序列號碼1所示胺基酸序列之多肽者'ϊ Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro iiet Clu Asp Cly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Cly [le Gly [le Leu Val Lsu Leu 20 25 30 tie (le Val He Leu Cly Val Pro Leu lie (le Phe Thr tie Lys Ata 35 40 45 Asn Ser Clu Ala Cys Arg Asp Cly leu Arg Ala Val Met Clu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu leu Cln Gin Glu Leu Thr Glu Ala Gin Lys Cly 65 TO 75 30 Phe Cln A.^p Val Clu Ala Cln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Vai ^fet 85 90 95 Ala Lsu iUet AU Ser Leu Asp Ala Clu Lys Ata Cln^Cly Cln Lys Lys 100 105 110 私紙張又度適闬由國國家標連（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --I --II - - ---I, t -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -S1· -6 - 4^2493 Α〇 ’ · B8 CS D8 、申請專利範圍 .Val Olu GLu Leu Glu Gly G[u [le Thr Tfir Leu Asn His Lys Leu Gtn 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Clu Val Clu Arg Leu Arg Ars Clu Asn Gin Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg tie Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Cln Asp Ser M3 150 I5S 160 Ser' Ser Ala Ala Ala Pro Cln Leu Leu He Vai Leu Leu- Cly Leu Ser 165 170 ' 175 Ala Leu Leu Gin 8 . —種單株抗體，其特徵爲可識別申請專利範圍第 2項，具前B細胞增殖支持活性之多肽者β Met ASa Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp GLy 5 10 15 Asp lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Cly ['Le-GIy He Leu Val Leu Leu 20 25 3.0 [[e lie Val He Leu Cly Vai Pro Leu He [le Phe Thr Πέ Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Clu Ala Cys Arg Asp Cly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Liiu Leu Gin Cln Clu Leu Thr Clu Ala Cln lys Ciy 65 70 75 80 Phe Gin Asp Val Glu Ala Cln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 9〇 95 Ala Leu Met Aii Se「 Leu Asp Ala GLu Lys Ala ΰίπ Gly Gin Lys Lys 100 105 Π0 吞纸張尺度適用申國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公芨） ------------- * 1-----* [訂-------11^ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局_工"费合作'吐，--'.- 7 4424 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Vai Gtu Glu teu Glu Gly Clu tie T'nr Thr Leu Asn His Lys Leu Gin 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Clu Vai Ciu Arg Leu A-rg Arg Glu Asn rfin. Val Leu 130 135 140 Ser Vai Arg ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Cln Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Ala Pro Cln Leu Leu He Vai Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Cln ------I 丨 I!,裳------ - 訂 ------1-¾ (請先閱讀背面之泫意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局|工消費合泎-'*--:" 夂纸張尺度遇用申S國家標車（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） -8 -