JP2002519021A - 末梢血白血球の中の樹状細胞の表面に特異的なモノクローナル抗体３−６−ａ - Google Patents

末梢血白血球の中の樹状細胞の表面に特異的なモノクローナル抗体３−６−ａ

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JP2002519021A
JP2002519021A JP2000557345A JP2000557345A JP2002519021A JP 2002519021 A JP2002519021 A JP 2002519021A JP 2000557345 A JP2000557345 A JP 2000557345A JP 2000557345 A JP2000557345 A JP 2000557345A JP 2002519021 A JP2002519021 A JP 2002519021A
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antibody
dendritic cells
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バエ，ヨン，ソー
チョイ，ベオム，キュー
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バエ，ヨン，ソー
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Abstract

(57)【要約】 ＤＭαタンパク質の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体３−６−Ａ、及びモノクローナル抗体３−６−Ａを生産するハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭ（寄託番号ＫＣＴＣ−０４８５ＢＰ）が開示される。このモノクローナル抗体３−６−Ａは末梢血白血球の中の樹状細胞に対してのみ強力な結合能力および特異性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の分野） 本発明は樹状細胞とのみ反応するモノクローナル抗体３−６−Ａに関する。よ
り詳細には、モノクローナル抗体３−６−Ａは、末梢血白血球の中の樹状細胞の
表面にもっぱら発現されるＤＭαの細胞外領域と反応する。したがって、本発明
は、樹状細胞特異的表面マーカーとしてのモノクローナル抗体の有用性に関する
ものである。
【０００２】 （従来の技術） 飲作用や病原菌の感染等により外部抗原に曝されると、樹状細胞（以下、ＤＣ
と称する）は抗原を取り込み、タンパク質を分解し、それらをＭＨＣクラスII分
子に結合させたペプチドの状態でその表面に存在させる。ＤＣの数は全PBL中の
１％以下であるが、Ｔ細胞に対する抗原提示機能が単球やマクロファージよりも
ずっと強力である｛Pierreら, Nature 388：787（1997）｝。
【０００３】 外部抗原に感作されると、ＤＣは特異的Ｃ−Ｃケモカインを分泌してリンパ節
にホーミングする。リンパ節において、感作されたＤＣはナイーブＴ細胞を活性
化させて｛Ademaら, Nature 387：713（1997）；Ingulli E ら, J．Exp．Med．1
85：2133（1997）｝、抗原に対する細胞性免疫を誘導する｛Steinman R.M., Ann
u．Rev．Immunolo., 9：271（1991）｝。ＤＣは胸腺においてＴ細胞の陽性及び
陰性選択において重要な役割を果たすことが報告されている（Carlos A., Immun
ol．Today 18）。その他の実験では、Ｔ細胞のリンパ節へのホーミングにＤＣか
ら分泌されるケモカインが関与していることが示されている｛Ademaら, Nature
387：713（1997）；Ingulli Eら., Exp．Med．185：2133（1997）｝。
【０００４】 さらに、ＤＣはIL-12を誘導し、癌発生及び癌細胞増殖を抑制するのに有効な
癌細胞特異的CTLを活性化する能力を有する｛Gabrilovichら, Cell Immunol．17
0：111-9（1996）；Vezzioら, Int．Immunol．8：19963-70（1996）；Youngら,
J．Exp．Med．183：7-11（1996）｝。最近、ＤＣのこのような機能を利用するこ
とによる癌の免疫治療方法におけるＤＣの使用が集中的に研究されている｛Gilb
oaら, Cancer Immunol. Immunother., 46：82〜87（1998）；Nestleら, Nat．Me
d., 4：328（1998）；Songら, J．Exp．Med．186：1247（1997）｝。
【０００５】 さらに、ＤＣは、ＡＩＤＳの病因においても本質的な役割を果たすことが知ら
れている｛Fauci、Science、262：1011（1993）；Pantaleoら, Nature、362：35
5（1993）；Embretsonら, Nature、362：359（1993）；Haynesら, Science、271
：324（1996）｝。ＨＩＶ−１ウイルスに感染した患者は、通常、３〜１５年間
の無症候性期を経るものであり、この期間においては患者の血液内では痕跡量の
ＨＩＶ−１ウイルスしか見出されない。しかしながら、リンパ節ではＤＣ周辺に
大量のウイルスと、感染されたＣＤ４＋ Ｔ細胞が発見されると報告されている
｛Pantaleoら, Nature、362：355（1993）｝。これは、最小のウイルス活性が血
液中で示される場合でもＨＩＶ複製が臨床的潜伏期の間ずっとリンパ器官におい
て活性であることを意味するものである。このような現象に対し、一部では下記
のような説明がなされている：ＨＩＶ−１感染後一次ウイルス血症時にＤＣが大
量のウイルスに曝され、感染し、これらがリンパ節に戻ってナイーブＴ細胞を刺
激し、それらの活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞にウイルスを伝播する。ＤＣ仲介ＨＩＶ
−１伝播により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性感染およびリンパ節
におけるＴ細胞の欠乏が引き起こされ、その結果血液中のＣＤ４＋ Ｔ細胞のＡ
ＩＤＳレベルまでの破壊が生じる｛Blaubeltら, Clin．Invest．100：2043（199
7）；McCloskeyら, J．Immunol. 158：1014（1997）｝。朱らは、ＤＣまたはマ
クロファージのような抗原提示細胞の不存在下では一次ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＨＩ
Ｖ−１に感染されにくく、そしてＤＣはマクロファージよりもずっと効率的にＨ
ＩＶ−１をＣＤ４＋ Ｔ細胞に伝達するという報告が開示されている｛Jooら, J
．Kor．Soc．Microbiol., 30：77（1995）｝。これらの研究結果は、ＤＣがＡＩ
ＤＳの進行に重要であることを具体的に示す例である。
【０００６】 ここ数年、ＤＣは、上記のＤＣの特別な特性および特徴のために、免疫学者お
よびその関連の科学者から非常に注目されている。しかしながら、その他の実験
で一般的に予測されたように、下記の制限のために、ＤＣの研究はあまり進んで
いない。第１に、ＤＣは全ＰＢＬ中に１％未満でしか含まれておらず、最大６週
間までＤＣ生存をサポートすることが報告されている（Marcowitz, およびEngle
man, J. Clin. Invest. 85:955, 1990)顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因
子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下でさえin vitroではその数が増大しない。第２に、
ヒトＤＣ特異的表面マーカーが未だ同定されていない。
【０００７】 細胞数が限定されており、ＤＣ特異的表面マーカーがないことから、さらなる
実験に純粋で十分な量のＤＣを用いることは困難である。それにもかかわらず、
いくつかの研究室はそれらの調査を続けていたので、ＤＣの特別な特徴について
最新の承認が得られた。ＤＣは、従来、他の文献に記載された陰性選択法｛Freu
denthalら, Proc．Natl．Acad．Sci．87：7698（1990）｝によって一般的にＰＢ
Ｌから精製されていた。この陰性選択方法では、ＤＣは、下記の実験手法：フィ
コール濃度勾配、E-ロゼッティング（rosetting）、接着パンニング、Fcパンニ
ング、メトリザミド(Metrizamide)濃度勾配遠心分離、および抗体パンニング法
等によりＰＢＬからＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージのようなその他
の免疫細胞を除去することによって単離される。これらの操作は非常に骨が折れ
るものであり、複雑なので、一般的な研究室には適用可能ではあり得ない。
【０００８】 最近、何人かの研究者により、骨髄幹細胞（CD34+、CD11c+）または単球をin
vitroでＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４等のサイトカインの存在下で分化させるこ
とによってＤＣを作製する試みがなされている｛Benderら, J．Immunol．Method
s 196：121-135（1996）｝。最近の免疫療法についてのＤＣ研究の大部分は、こ
の方法を利用することによりＤＣを調製している。しかしながら、この方法も、
多くの費用がかかり、分化に長時間を要するというそれ自身の欠点を有している
。さらに、分化した細胞はＤＣの形態のように見えるが、それらが真正のＤＣで
あるかどうか、免疫療法で必要な場合にin vivoで本物のＤＣを生じさせること
ができるかどうかといった生物学的機能についての論議が以前として存在する。
【０００９】 したがって、今後ＤＣを研究してこれを実用化段階に発展させるためには、特
異的表面マーカーを同定し、それに対するモノクローナル抗体を作製することが
必須である。モノクローナル抗体は、ＤＣの研究のみならず、ＰＢＬからのＤＣ
の陽性選択への適用性においても非常に有用である究明するのが。
【００１０】 このような趣旨から、今まで、ＤＣ検出用抗体に関していくつかのモノクロー
ナル抗体が提案され、用いられている。しかしながら、それらの大部分は、それ
ぞれそれなりの限界があるため、ＤＣのＰＢＬからの検出および単離に用いられ
るほど十分ではない。例えば、ＨＢ１５分子（ＣＤ８３）に対するモノクローナ
ル抗体（ｍＡｂ）は活性化されたＤＣにのみ反応し、ナイーブＤＣには反応しな
い。本発明者らの研究により、ＣＤ８３は活性化ＤＣにおいてさえ十分に発現さ
れないということが示された。また、ＣＤ８３に対するｍＡｂは、活性化単球／
マクロファージならびに活性化ＤＣと反応するのであまり特異的ではない。それ
にもかかわらず、単球誘導ＤＣの同定にin vitroで広範に用いられている｛Fear
nleyら, Blood，89：3708（1997）：Zhouら, J．Immunol., 154：3821（1995）
｝。
【００１１】 この他にも、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１ａがＤＣ特異的表面マーカーとして報告
されている｛Gaoら, Immunology 91：135（1997）：Lardonら, Immunology 91：
553（1997）；Ruedlら, Immunol. 266：1801（1996）｝。しかしながら、それら
はＤＣに対する特異性において問題を有する。ＤＣ１１ｃは、ＤＣでのみならず
マクロファージ、顆粒球及びＮＫ細胞でも発現し、ＣＤ１ａは胸腺細胞及びラン
ゲルハンス細胞でも発現している。これらの結果は、本発明の実験において一部
確認されている。本発明者らは、ＣＤ１１ｃはＤＣの表面において実質的に発現
しているが、同様の量またはそれよりも低い量でＢ細胞および単球においても発
現していることを見出した。ＤＣ１ａはナイーブＤＣの表面では発現しなかった
。これらの結果は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８３はＤＣ特異的表面マー
カーには適していないということを示すものである。
【００１２】 （発明の開示） この従来技術を考慮に入れて、本発明者らは、ＤＣのｃＤＮＡライブラリーを
作製し、このライブラリーを調べてＤＣ−特異的表面マーカーを探した。本発明
者らは、ＨＬＡ−ＤＭα／ｂ（以下、ＤＭαと呼ぶ）遺伝子が、一連の実験、プ
ラーク釣り上げおよびサザンブロットディファレンシャルハイブリダイゼーショ
ン、配列決定および定量ＲＴ−ＰＣＲ｛Baeら, Mol，Cells 5：569（1995）｝に
よってＰＢＬの中のＤＣにおいてのみ発現していることを見出した。ＤＭαの細
胞外領域に対してモノクローナル抗体を作製し、これを３−６−Ａと命名した。
Ｍａｂ３−６−Ａを、その他の提案されたモノクローナル抗体とともに、ＤＣに
対する特異性について試験した。
【００１３】 従って、本発明の目的は、ＰＢＬ中のＤＣだけを認識する、新規モノクローナ
ル抗体を提供することである。
【００１４】 本発明の別の目的は、新規モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を提供することである。
【００１５】 ＰＢＬの中のＤＣにおいてのみ特異的に発現するＤＭαタンパク質に対するモ
ノクローナル抗体を得るために、ＤＭα単をE.coliにおいて発現させ、ＢＡＬＢ
／ｃマウスに免疫感作のために接種する試みがなされた。しかしながら、このよ
うにして得られたモノクローナル抗体は、そのいずれのものもＤＣまたはＲａｊ
ｉ細胞において発現する正常なＤＭαを認識することができないことが判明した
｛Kimら, Mol，Cells、6：684（1996）｝。ＤＭαは、ヒトとマウスとの間に７
５％以上のアミノ酸配列相同性を示し、このことは組換えｈ−ＤＭαタンパク質
を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて任意の抗ヒトＤＭαモノクローナル抗体を
得ることは困難であるということを示唆するものである。
【００１６】 Kimら｛Mol，Cells、6：684（1996）｝によって作製されたモノクローナル抗
体がＤＣにおいて発現された正常なＤＭαを認識することができない理由は、下
記の可能性によるものであると考えられる。組換えＤＭαは、グリコシル化の欠
如または封入体の状態で発現された場合の構造的破壊によりＢ細胞エピトープが
欠けている。
【００１７】 本発明ではバキュロウイルス系から組換えＤＭαタンパク質を得た。Ｒａｊｉ
細胞またはＤＣにおいて発現された正常なＤＭαの抗原性を維持しているのを確
認した後、この組換えＤＭαタンパク質を用いてモノクローナル抗体３−６−Ａ
を製造した。本発明のモノクローナル抗体３−６−Ａは、IsoStrip TMキット（B
oehringer Mannheim）で分析したところ、γ１アイソタイプκ鎖を有するＩｇＧ
１サブクラスであることが分かった。
【００１８】 モノクローナル抗体３−６−ＡはＤＣ及びＲａｊｉ細胞において発現された正
常なＤＭαに対し強い反応性を示し、その反応性は、一次免疫細胞の中のＤＣに
対してのみ非常に特異的である。さらに、この抗体３−６−ＡはＤＣの細胞質の
みならずＤＣの細胞表面も非常に強く染色することが分かった。これらの特性は
、ＰＢＬの中のＤＣのみがその表面上ならびに細胞質中に実質的な量でＤＭαを
発現させるということを示すものである。このような結果はＤＭタンパク質がエ
ンドソーマルコンパートメントであり、細胞質にのみ局在化することを示す既存
の報告｛Karlssonら, Science，266：1569（1994）；Sandersonら, Science、26
6：1566（1994）｝と明らかに異なるものである。本発明者らは、この矛盾が、
実験に用いられた細胞型の相違によるものであることを見出した。実際、Ｒａｊ
ｉ細胞は、固定され、最初に浸透された場合にのみ３−６−Ａで染色され、固定
化しなかった場合には染色されなかった。このことは、以前の報告のように、Ｄ
ＭがＲａｊｉ細胞においては細胞質にのみ局在化しており、細胞表面には局在化
していないということを示すものである。これらの結果は、ＤＭ発現パターンが
細胞型特異的であると考えられるということを強く示唆するものである。本発明
者らは、世界で初めてＤＭがもっぱらＰＢＬの中のＤＣの表面で発現されるとい
うことを見出した。
【００１９】 最近、いくつかの報告により、ＤＭがＭＨＣクラスII依存性抗原提示において
シャペロンタンパク質として重要な役割と果たすということが示された（Morris
ら, Nature 368:551, 1994; Karlssonら, Science 266:1569, 1994)。Sanderson
らは、同時免疫沈降実験により、ＤＭがＨＬＡ−ＤＲからＣＬＩＰ解離を誘導し
、ＤＲ分子に対するペプチド結合を促進するということを報告した。実質的な量
のＤＭがＤＣの表面で発現されるという本発明の知見は、ＤＭ分子が少なくとも
部分的にＤＣにおいていくつかのその他の重要な機能を有し、シャペロン機能を
有するということを示唆するものである。まず第１に、本発明者らの知見は、Ｄ
Ｍ分子をＤＣ特異的表面マーカーとして用いることができるということを強く示
唆するものである。
【００２０】 本発明のモノクローナル抗体３−６−Ａは、ＤＣの表面に発現される場合のＤ
Ｍ機能の調査に対して用いることができるのみならず、ＰＢＬの中のＤＣの陽性
選択に用いられる装置の開発にも用いることができる。ＤＣは免疫応答において
本質的な役割を果たしている。特に、ＤＣは癌に対する免疫療法を研究するため
の本質的な材料である。したがって、ＤＣの精製のための陽性選択方法の開発が
何よりも急務である。本発明において開発されたモノクローナル抗体３−６−Ａ
を用いることによって確立されれば、そのような陽性選択装置は、ＤＣによる研
究および癌に対する免疫療法の研究に非常に役立つであろう。本発明は、本発明
者らの研究成果に基づいてモノクローナル抗体３−６−Ａを調製し、ＤＣに対す
るその特異性および結合能力についてアッセイすることによって完成したもので
ある。
【００２１】 （発明の実施のための最良の形態） 本発明の目的を達成するために、まず、ＤＭα遺伝子の細胞外領域（塩基配列
１２２〜７３１に対応）をコードする６０９ｂｐのＤＮＡ断片をバキュロウイル
ストランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａにクローニングして、組
換えプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ−ＤＭαを得る。この組換えプラス
ミドを、バキュロウイルス全長ＤＮＡ、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Invitrogen社）
とともに、Ｈｉｇｈ−５細胞（Invitrogen社）に同時トランスフェクトして組換
えバキュロウイルスＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ−ＤＭαを製造し、次いで大量の培養
Ｈｉｇｈ−５細胞に感染させる。感染Ｈｉｇｈ−５細胞を採取し、その抽出物を
組換えＤＭαタンパク質の精製のためにＮｉ+ −ＮＴＡカラム（Qiagen社）にか
ける。ＢＡＬＢ／ｃマウスを純粋な組換えＤＭαタンパク質で免疫感作し、脾臓
細胞（splenocyte）を切除し、これをマウス骨髄腫瘍細胞 Sp2/0細胞とハイブリ
ダイゼーションさせて、モノクローナル抗体３−６−Ａを生産するハイブリドー
マ細胞ＫＨＢ−ＤＭを産生させる。ハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭを培養する
ことにより、モノクローナル抗体３−６−Ａが得られる。
【００２２】
【実施例】
実施例１：ＤＣおよび他の一次免疫細胞の精製 韓国赤十字血液院(Korean Red Cross Blood Bank)から供給を受けたバッフィ
ーコート(buffy coat)またはロイコパック（leukopak）、ＤＣおよびその他の免
疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球）を、既存の方法（Baeら，Mol．Cells，5，
569，1995）により精製した。
【００２３】 実施例２：ＤＣからのｍＲＮＡ抽出およびＤＭα−ｃＤＮＡ合成 実施例１で得られたＤＣから公知の方法（Baeら，Mol．Cells，5，569，1995
）によりｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴプライマー１μgととも
に、逆転写反応溶液（RNaseインヒビター０.５μl、５×第1鎖合成反応緩衝液４
μl、０.１ｍＭのＤＴＴ ２μl、１０ｍＭのｄＮＴＰ １μl）中で３７℃にて２
分間インキュベートした後、ＡＭＶ−逆転写酵素５単位を添加した。溶液を３７
℃で４０分間インキュベートし、さらに４５℃で３０分間インキュベートするこ
とによりｃＤＮＡを合成した。鋳型としてそのｃＤＮＡを用い、表１に示したプ
ライマーを用いてＰＣＲによりＤＭα遺伝子を増幅した。
【００２４】
【表１】
【００２５】 ＰＣＲは、９４℃で１分間、４０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間からなる熱
サイクルを５回繰り返した後、９４℃で１分間、７２℃で１分間からなる熱サイ
クルを２５回繰り返すことにより行って、ＤＭα遺伝子の細胞外領域（塩基配列
１２−７３２）をコードする６０９ｂｐのＤＮＡ断片を産生した。
【００２６】 実施例３：E.coliにおけるＤＭαのクローニングおよび発現 実施例２においてＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII
で二重消化し、同一の制限酵素で開環したプラスミドｐＲＳＥＴ／Ａ（Invitrog
en社）に挿入して組換えプラスミドｐＲＳＥＴ−ＤＭαを製造した。この組換え
ｐＲＳＥＴ−ＤＭαをE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、アンピシリ
ンを含有するＬＢ培地に塗抹した。陽性コロニーをＭ−９アンピシリン肉汁｛１
％バクトトリプトン、Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ＫＨ2 ＰＯ3 、ＮａＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ、
２Ｍグルコース、０.５％ジアミン、１Ｍ ＭｇＳＯ4 、１Ｍ ＣａＣｌ2 ｝中に
接種し、拡販しながら培養した。培養物の吸光度が０.５になったらＩＰＴＧを
最終濃度が１ｍＭになるまで添加して３７℃で２時間タンパク質発現を誘導した
。形質転換されたE.coliにおける組換えＤＭαの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で
同定したところ、２９ｋＤａにバンドが検出された（図２）。図２において、レ
ーン１はタンパク質サイズマーカーであり、レーン１はｐＲＳＥＴ／Ａプラスミ
ドのみで形質転換されたE.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解物であり、レーン２
は組換えＤＭαプラスミドで形質転換されたE.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解
物であり、レーン３はレーン２の組換え細菌からＮｉ+ −ＮＴＡ樹脂（Qiagen社
）を用いて精製したＤＭαタンパク質試料である。
【００２７】 実施例４：ＤＭαを発現する組換えバキュロウイルスの構築 実施例２においてＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII
で消化し、同一の制限酵素で開環したプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ（
Invitrogen社）に挿入した。連結物をE.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し
、次いで実施例２に記載した方法と同じ方法で培養して組換えプラスミドｐＢｌ
ｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ−ＤＭαを得た。組換えプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉ
ｓ２Ａ−ＤＭαと、Ｂｓｕ３６Ｉ消化により線状化したバキュロウイルス全長Ｄ
ＮＡ Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Invitrogen社）を、リホフェクチン(lifofectin)(
Gibco BRL)を用いてＨｉｇｈ−５細胞（Invitrogen社）に形質転換した。トラン
スフェクション後、液体培地中で５〜７日間培養し、上澄液を取り出し、所定希
釈濃度でＨｉｇｈ−５細胞にさらに感染させた。接種の2日後、細胞を１％低融
点アガロース混合物（５０ｍg／ｍlのＸ−ｇａｌ、２×ＴＮＭ−ＦＨ 培地と２
％の低融点アガロースを同量混合したもの）で覆ってさらに３〜５日間培養した
。青色を呈するプラークを陽性クローンとして選択した｛図３のパネル（Ａ）｝
。選択したクローンを前記培養プロセスを３回繰り返してさらに精製した。それ
らをＨｉｇｈ−５細胞中で増殖させて大量の組換えバキュロウイルスＢａｃ−Ｎ
−Ｂｌｕｅ−ＤＭαを得た。
【００２８】 実施例５：組換えバキュロウイルスにおけるクローンＤＭαの分析 実施例４において得た組換えバキュロウイルスＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ−ＤＭα
から、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ分析のために抽出した。ＰＣＲを下記表２のプライ
マーＢａｃ１／Ｂａｃ２（Invitrogen社：Bac-N-Blueトランスフェクションキッ
トに含まれる）を用い、鋳型として作用するゲノムＤＮＡを用いて行って組換え
バキュロウイルスがＤＭ遺伝子を含有していることを確認した。
【００２９】
【表２】
【００３０】 実施例６：組換えバキュロウイルス感染Ｈｉｇｈ−５細胞からのＤＭαの発現
および精製 組換えバキュロウイルスＢａｃ-Ｎ-Ｂｌｕｅ−ＤＭαを５ＭＯＩでＨｉｇｈ−
５細胞に感染させ、恒湿インキュベーターで２７℃にて５日間培養した。組換え
ＤＭαタンパク質を感染細胞から抽出し、Ｎｉ+ −ＮＴＡ樹脂カラム（Qiagen社
）を利用して精製した。
【００３１】 実施例７：組換えＤＭαによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作 実施例６において得たＤＭαタンパク質を同量のフロイントアジュバント（Si
gma社）と混合して、５〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１匹当り５０μgの用量
で接種した。次いで、接種されたマウスに、３週間間隔で１匹当り２５μgの用
量で同じ抗原を接種することにより２次および３次追加抗原投与した。３次免疫
感作の後、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの眼球静脈から血液を取り出して抗血清を分析
した。
【００３２】 実施例８：抗血清の組換えＤＭαとの反応性確認 組換えバキュロウイルスＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ−ＤＭαを感染させたＨｉｇｈ
−５細胞をホモジナイズし、破壊された細胞から得られたタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を、半乾燥ゲルブ
ロッター(Bio-Rad)中で、転移溶液｛４８ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、３９ｍＭグリ
シン、２０％メタノール、１.３ｍＭ ＳＤＳ｝を用いてニトロセルロース膜にト
ランスブロットした。このブロットしたニトロセルロース膜をブロット｛５％（
ｗ／ｖ）脱脂乳、０.０２％ ＮａＮ3 ＰＢＳ溶液｝で３０分間ブロッキングし、
ＰＢＳで３回洗浄した後、実施例７で得た抗血清５μlを含むＰＢＳ１０ｍl中で
室温にて30分間反応させた。ＰＢＳで3回洗浄し、第２抗体としてヤギ抗マウス
ＩｇＧアルカリホスファターゼ(Sigma)を含むＰＢＳ溶液中に浸し、次いで酵素
反応の基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（５０ｍｇ／ｍｌのＮＢＴ（ニトロブル
ーテトラゾリウム(Nitro blue tetrazolium)６６μlと５０ｍg／ｍlのＢＣＩＰ
（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート）３０μlをＡＰ緩衝液（１０
０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９
.５）１０ｍlに混合したもの）を加えることにより視覚化した。暗所で酵素反応
さ、バンドが現れた場合、停止溶液（２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ中、ｐＨ８.０）を添加して反応を終結させた。
【００３３】 このウェスタンブロット分析により、組換えバキュロウイルス Ｂａｃ−Ｎ−
Ｂｌｕｅ−ＤＭαがＨｉｇｈ−５細胞でＤＭαを正常に発現していることを確認
した（図４）。図４において、レーンＭはタンパク質サイズマーカー、レーン１
は感染されていないＨｉｇｈ−５細胞溶解物、レーン２は野生型バキュロウイル
ス感染Ｈｉｇｈ−５細胞溶解物、レーン３は組換えバキュロウイルスＢａｃ−Ｎ
−Ｂｌｕｅ−ＤＭαを感染させたＨｉｇｈ−５細胞溶解物、レーン４は陰性対照
群のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）溶解物、レーン５は組換えＤＭαを発現
する組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解物である。
【００３４】 実施例９：抗血清の真正ＤＭαに対する反応性 １×１０6 の非処理Ｒａｊｉ細胞と、３日間γ−インタフェロン（Sigma社）
１００単位／ｍlで処理した１×１０6 のＲａｊｉ細胞を用いて、実施例８と同
様の方法によりウェスタンブロットを実施した。結果を図５に示す。図５におい
て、レーン１は対照群のＪｕｒｋａｔ細胞溶解物、レーン２はＲａｊｉ細胞溶解
物、レーン３はγ−インタフェロンで処理したＲａｊｉ細胞の溶解物である。
【００３５】 前記の分析は、組換えＤＭαで免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスから得た抗
血清は、Ｒａｊｉ細胞において発現された真正のＤＭαとよく反応するというこ
とを示すものである。
【００３６】 実施例１０：モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞の産生 実施例７においてバキュロウイルス系で発現させて得た組換えＤＭαで免疫感
作したマウスを脊椎脱骨で安楽死させた後、脾臓を摘出した。脾臓細胞１.４×
１０7 細胞をグルコース富化ＤＭＥＭ培地１０ｍlに懸濁し、マウス骨髄腫瘍細
胞ＳＰ２／０細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４ ＫＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）３×１０ 6 細胞と混合し、グルコース富化ＤＭＥＭ培地で洗浄した。その細胞ペレットに
、５０％ＰＥＧ−４０００溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）１ｍlを１分間かけて徐々
に添加して細胞融合を誘導した。グルコース富化ＤＭＥＭ培地を１分間当たり１
ｍlの速度で徐々に添加した後、細胞を十分に混合し、遠心分離した。細胞ペレ
ットを１×ＤＭＥＭ（２０％）５ｍlに懸濁し、支持細胞としてマウスマクロフ
ァージ｛Antibody Lab．Manual ed．H．D．Lane、p220、1989｝が培養されてい
るマルチウェルプレートにウェル当り５０μlずつ加えて、1日間培養した。その
後、各ウェルに２×ＨＡＴ培地を同量添加した。長期間培養中、融合された細胞
がコロニー形成した。ＨＡＴ培地中でコロニー形成したハイブリドーマ細胞を１
８ウェルから選択した。
【００３７】 実施例１１：ＤＭαと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
細胞の同定 実施例１０において採取した１８個のコロニーをそれぞれ多量の培地位置で培
養し、上澄液をＥＬＩＳＡ法、ドット免疫ブロットハイブリダイゼーション法及
びウェスタンブロットハイブリダイゼーション法により分析した。実施例３及び
６で製造したＤＭαタンパク質を９６−ウェルプレートの各ウェルに最終濃度０
.５μgになるように入れ、４℃で一晩放置してプレートをＤＭαタンパク質でコ
ーティングした。プレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液１０
０μlで２回洗浄した。１％脱脂乳溶液（０.０２％ＮａＮ3 が添加された脱イオ
ン水に溶かしたもの）を９０μl／ウェルの量で加えて３７℃で１時間放置した
。その後、ウェル中で実施例７の抗血清と３７℃にて１時間反応させた。洗浄し
た後、第２抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ １／１０００希釈液）を添加し、
３７℃で２時間インキュベートした。２回洗浄した後、各ウェルにアルカリ性ホ
スファターゼ基質溶液｛ｐ−ニトロフェニルホスフェート １ｍgを１０％ジエタ
ノールアミン緩衝液（ジエタノールアミン９７ｍl、ＮａＮ3 ０.２ｇ（０.０２
％）、ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １００ｍg（０.０１％）をＤＤＷ ８００ｍlに溶
かしたもの、合計１リットル）１ｍlに混合したもの｝５０μlを入れ、３７℃で
３０分間反応させた。
【００３８】 反応完了後、ＥＬＩＳＡリーダー（Molecular Devices社）で４０５ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ウェスタンブロットは実施例８と同様の方法で実施し、
ドット免疫ブロットハイブリダイゼーションはＫｉｍら（Kimら, Mol，Cells、6
，684 1996）の方法で行った。
【００３９】 前記の実験結果をまとめて下記の表３に示した。表３において、モノクローナ
ル抗体の、大腸菌及びバキュロウイルス系で発現した組換えＤＭαタンパク質に
対する反応性はＥＬＩＳＡ法及びウェスタンブロットハイブリダイゼーション法
により測定し、その他の種々の細胞で発現した真のＤＭαに対する反応性はドッ
ト免疫ブロット法及びウェスタンブロットハイブリダイゼーション法により調べ
た。前記の実験結果によると、１４個のモノクローナル抗体は全て大腸菌から発
現した組換えＤＭαと強い反応性を示したが、Ｈｉｇｈ−５細胞から発現した組
換えＤＭαには、モノクローナル抗体３−６−Ａを除いて、どれも反応しなかっ
た。モノクローナル抗体３−６−Ａは、ウェスタンブロット及びドット免疫ブロ
ットハイブリダイゼーションで調べたとき、ＰＢＬのうちＤＣと強く反応するこ
とが分かった。また、モノクローナル抗体３−６−Ａは、ウェスタンブロットハ
イブリダイゼーションにおいてはＲａｊｉ細胞と強い反応性を示した。ウェスタ
ンブロットハイブリダイゼーションにおいてＢ細胞画分で時々弱い陽性反応を検
出する場合もあったが、これは活性化されたＢ細胞がＤＭを発現するためである
と考えられる。このような結果を総合して、１４個のモノクローナル抗体のうち
３−６−ＡをＤＭαに対するモノクローナル抗体として選択し、モノクローナル
抗体３−６−Ａを発現するハイブリドーマ細胞をＫＨＢ−ＤＭと命名し、韓国生
命工学研究所遺伝子銀行に受託番号ＫＣＴＣ−０４８５ＢＰとして寄託した。
【００４０】 実施例１２：モノクローナル抗体３−６−Ａの、ＤＣ及びＲａｊｉ細胞におい
て発現する真のＤＭαに対する反応性 モノクローナル抗体３−６−Ａを、組換えＤＭα並びにＲａｊｉ細胞及びＤＣ
から正常に発現する真のＤＭαに対するその反応性についてウェスタンブロット
ハイブリダイゼーションで試験した。結果を図６に示してある。図６から明らか
なように、モノクローナル抗体３−６−ＡはＲａｊｉ細胞及びＤＣから正常に発
現する３４ｋＤａのＤＭαと良好に反応する。図６において、レーン１は大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）溶解物の陰性対照であり、レーン２はＤＭαを発現する大腸
菌の溶解物であり、レーン３はＤＭαを発現するＨｉｇｈ−５細胞の溶解物、レ
ーン４はＲａｊｉ細胞の溶解物、そしてレーン５はＤＣの溶解物である。
【００４１】
【表３】
【００４２】 （注）結合能は、ELISA法、ドット免疫ブロット法及びウェスタンブロット法に
より測定した。 −：陰性対照群と同様の結果。 ＋：陽性の結果、この符号の数は陽性シグナルの強さを示し、陰性対照の平均値
＋５ＳＤ（標準偏差）となる基礎陽性値から、４０５ｎｍにおける吸光度が０.
２増加する毎に符号が１つずつ増加する。ＥＬＩＳＡ値の符号が４個以上の反応
はすべて＋＋＋＋を使用する。 ウェスタンブロット法及び免疫ブロット法では、検出可能なシグナルが明確に
繰り返される場合にのみ符号“＋”を用いた。相対的な強度の増加に応じて符号
の数を追加した。 ±：弱いか、非反復的なシグナル。
【００４３】 実施例１３：モノクローナル抗体３−６−Ａの大量生産 ハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭを２×１０5 細胞／ｍlでグルコース富化Ｄ
ＭＥＭ２０％培地に培養し、４日後に細胞が最大に増殖したとき、培養物の上澄
液をモノクローナル抗体３−６−Ａの供給源として回収した。この時のモノクロ
ーナル抗体の濃度は、培地１ｍl当り約４０μgに達した。
【００４４】 大量にモノクローナル抗体を生産するために、ハイブリドーマ細胞をマウス腹
腔内で培養した。まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔にプリスタン（pristane）１
ｍlを注射し、１週間後にマウス当りハイブリドーマ細胞５×１０6個を注入した
。７〜１４日後に腹水がたまって腹腔が膨満したとき、１０ｍｌ注射器に取りつ
けた１８ゲージ針で腹水を採取して（１匹当り５〜１０ｍl程）、１,５００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離した。得られた上澄液に０.０２％ＮａＮ3を添加した後、
−７０℃またはそれ以下で保管した。モノクローナル抗体の濃度は腹水１ｍｌ当
たり５〜９ｍg／ｍlであった。
【００４５】 実施例１４：モノクローナル抗体３−６−ＡからＨ鎖とＬ鎖のアイソタイプ確
認 実施例１１においてハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭにより生産されたモノク
ローナル抗体３−６−Ａのアイソタイプを、アイソタイピングキットＩｓｏＳｔ
ｒｉｐTM （Boehringer Mannheim社）を利用して調べた。モノクローナル抗体３
−６−ＡはκＬ鎖を有するＩｇＧ１アイソタイプであることが分かった。
【００４６】 実施例１５：モノクローナル抗体３−６−ＡはＤＣの細胞質及び細胞表面を染
色する 顕微鏡用スライドガラスを１ｍg／ｍlのポリ−Ｌ−リシン（ＭＷ 40,000）溶
液で１５分間コーティングし、脱イオン蒸留水で洗浄した。Ｒａｊｉ細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ８６）と実施例１の方法により分離したＤＣをそれぞれ１０5 細胞
／ｍlに希釈して、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたスライドに付着させ、
リン酸緩衝液で洗浄した。次いで、実施例１３で得たモノクローナル抗体（培養
上澄液）１００μlを細胞付着スライドに添加し、ＣＯ2 インキュベーター中に
１時間放置した後、リン酸緩衝液で３回洗浄した。第２抗体（抗マウスＩｇＧ−
ＦＩＴＣ）を添加してＣＯ2 インキュベーター中で３７℃にて３０分間反応させ
、スライドをリン酸緩衝液で２回洗浄した後、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅ−６
００ Ｅｐｉ−蛍光顕微鏡）で観察した。
【００４７】 また、ＤＣの細胞質を３−６−Ａで染色するために、ＤＣ付着スライドを有機
溶媒（５０％メタノール＋５０％アセトン）に浸して細胞を固定させ、その後、
前記と同様の方法によりモノクローナル抗体３−６−Ａ及び第２抗体でＤＣを染
色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４８】 図７Ａにおいて、パネルａはＤＣを顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ）で４００倍
で撮影した顕微鏡写真であり、パネルｂは対照としてＰＥ結合ＨＬＡ−ＤＲモノ
クローナル抗体（Becton-Dikinson社）で染色したＤＣの蛍光顕微鏡写真であり
、パネルｃはＤＣに抗体３−６−Ａを付着した後、ＦＩＴＣ結合第２抗体で染色
して観察したものであり、パネルｄはＤＣを最初に固定させた後、パネルｃと同
様にして染色したＤＣの写真であり、パネルｅおよびｆはそれぞれ固定させなか
ったＲａｊｉ細胞と固定させたＲａｊｉ細胞を同様の方法により染色して観察し
た写真である。
【００４９】 図７Ｂは、モノクローナル抗体３−６−ＡとＦＩＴＣ結合第２抗体で染色した
未固定及び固定Ｒａｊｉ細胞のＦＡＣＳ結果を示す。Ｒａｊｉ細胞画分の半分を
、Cytofix/cytoperm CytostainTMキット(Pharmingen社)で販売人のマニュアルに
従って固定した。未固定および固定Ｒａｊｉ細胞をモノクローナル抗体３−６−
Ａで４℃で３０分間処理し、リン酸緩衝溶液で２回洗浄し、次いで前記のＦＩＴ
Ｃ結合第２抗体を添加してさらに４℃で３０分間染色した。染色した細胞をリン
酸緩衝溶液で２回洗浄した後、直ちにＦＡＣＳｔａｒ（Becton-Dikinson社）に
より分析した。図７Ｂにおいて、パネルａおよびｂはそれぞれ未固定および固定
Ｒａｊｉ細胞のＦＡＣＳ結果である。
【００５０】 図７から明らかなように、ＤＭがエンドソームコンパートメントであるとの既
存の発表とは異なり、ＤＭαはＤＣでは細胞内部のみならず、表面にも多量に発
現していることが示されている（図７Ａのパネルｃ及びｄ）。また、Ｒａｊｉ細
胞も、染色前に固定した場合は３−６−Ａで深く染色された（図７Ａのパネルｆ
及び７Ｂのパネルｂ）。しかし、固定しなかったＲａｊｉ細胞は同一の抗体でま
ったく染色されなかった（図７Ａのパネルｅ及び７Ｂのパネルａ）。このような
結果は、Ｒａｊｉ細胞においてＤＭ分子が細胞質内にのみ局在しており、細胞表
面には存在しないことを示しており、これは既存の研究発表と一致する（Karlss
onら, Science 266：1569-1573、1994；Sandersonら, Science 266：1566-1569
、1994）。
【００５１】 実施例１６：モノクローナル抗体３−６−ＡのＤＣ表面に対する特異性 実施例１の方法によりＴ細胞、Ｂ細胞、単球及びＤＣを分離した。それぞれの
細胞を１０5 個／ｍlでリン酸緩衝液で希釈し、実施例１３で得たモノクローナ
ル抗体３−６−Ａ（培養上澄液）１００μlを添加して４℃で３０分間反応させ
た。７５０gで遠心分離した後、細胞ペレットをリン酸緩衝液で２回洗浄してリ
ン酸緩衝液２００μlに再懸濁し、第２抗体の抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma
社）１０μl（１μg）を添加して４℃で３０分間染色した。遠心分離後、細胞ペ
レットをリン酸緩衝液で２回洗浄し、コーティングスライドに付着させた。実施
例１５で用いた蛍光顕微鏡で染色細胞を分析した。その結果を図８示してある。
図８において、カラムＴはＴ細胞、カラムＢはＢ細胞、カラムＭｃは単球／マク
ロファージ、そしてカラムＤＣはＤＣを示す。サンプルを市販されている種々の
モノクローナル抗体及びモノクローナル抗体３−６−Ａと反応させた後、ＦＩＴ
Ｃ結合第２抗体を加えて染色した。
【００５２】 図８の最下の写真に見られるとおり、モノクローナル抗体３−６−ＡはＤＣに
のみ非常に強く反応する反面、他の免疫細胞とは全く反応しないことが分かった
。これらのデータは、ＤＭ分子が１次免疫細胞のうちＤＣにおいてのみ表面に特
異的に発現することを実証している。これとは異なり、ＤＣ分析に広く使用され
るＣＤ１１ｃやＣＤ８３に対する抗体は、図８に示すように、ＰＢＬの中のＤＣ
にそれほど特異的でない。それらはＤＣのみならずＢ細胞や単球とも強く反応す
る。特に、活性化されたＤＣ画分に発現することが知られているＣＤ８３の場合
（Zhou L．J., Immunol．149、735、1992）、これに対するモノクローナル抗体
（抗−ＣＤ８３；Immunotech Co.）がナイーブＤＣのみならず単球とも弱いけれ
ども類似の程度の反応をみせた。ＤＣの細胞質にのみ発現することが報告された
Fascinに対するモノクローナル抗体は、固定されなかったＤＣを認識することが
できなかった。このような結果から、図８に示すように、本発明のモノクローナ
ル抗体３−６−Ａは、既存のいずれのモノクローナル抗体よりもＤＣに対して特
異性が高く親和力が強いことが確認された。
【００５３】 実施例１７：モノクローナル抗体３−６−ＡのＤＣに対する親和性 モノクローナル抗体３−６−ＡのＤＣに対する親和性を、既存の他のＤＣ特異
的モノクローナル抗体と比較した。実施例１の方法によりＤＣを単離し、従来の
商品化されたモノクローナル抗体と本発明のモノクローナル抗体３−６−Ａを用
いてドット免疫ブロットハイブリダイゼーション（Kimら, Mol，Cells、6、648
、1996）を実施した。
【００５４】 実施例１の方法により分離した１０5 個の細胞を含むＤＣの各画分を、抗ＣＤ
１ａモノクローナル抗体（Becton-Dickinson社）、抗ＣＤ１１ｃモノクローナル
抗体（Becton-Dickinson社）、抗ＣＤ８３モノクローナル抗体（Immunotech．Co
.）、抗Fascinモノクローナル抗体（NIH AIDS Research and Reference Reagent
Program から供給を受ける）、及びモノクローナル抗体３−６−Ａをそれぞれ
１μgずつ用いて、実施例１５の方法により染色した。第１抗体で処理した細胞
を、アルカリ性ホスファターゼで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Progema社）
で実施例１５と同様に染色した後、細胞をニトロセルロース膜にドットブロッタ
ー（Bio-Rad社）を用いて移した。この膜を実施例８に示すような色素原反応に
かけた。
【００５５】 ドット免疫ブロットハイブリダイゼーションの結果を図９に示す。図９におい
て、ブロットシグナル１、２、３及び４は、対照群としてそれぞれＣＤ１ａ、Ｃ
Ｄ１１ｃ、ＣＤ８３、Ｆａｓｃｉｎに対するモノクローナル抗体を用いたＤＣ染
色の実験からのものである。ドットブロットシグナル５は、モノクローナル抗体
３−６−Ａで染色したＤＣ画分を示す。実施例１６に示した結果と一致して、モ
ノクローナル抗体３−６−Ａは試験したモノクローナル抗体の中でＤＣに対して
最も強い親和性を示す（図９のブロット５）。モノクローナル抗体３−６−Ａに
次いで、抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体がＤＣと強く反応した（図９のブロッ
ト２）が、単球やＢ細胞画分とも反応性であった（図８）。ＣＤ８３またはＦａ
ｓｃｉｎに対する抗体は、ナイーブＤＣとは殆ど反応しないことが示された。
【００５６】 実施例１８：モノクローナル抗体３−６−Ａを用いた１次免疫細胞のＦＡＣＳ
分析 実施例１の方法により分離した１次免疫細胞：Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球及びＤＣ
を、モノクローナル抗体３−６−Ａで４℃にて３０分間処理した。リン酸緩衝液
で２回洗浄した後、細胞に第２抗体のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma社
）を添加して４℃で３０分間反応させた。染色細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し
た後、直ちにＦＡＣＳｔａｒプラス（Becton-Dickinson）を用いて分析した。
【００５７】 ＦＡＣＳ分析の結果を図１０に示す。図１０のパネルＡは実施例１の方法によ
り純化した免疫細胞のＦＡＣＳ図であり、パネルＢは単離前にＰＢＬをＲＰＭＩ
１０％培地で１週間培養した後、純化した免疫細胞のＦＡＣＳ図である。カラム
１、２、３、４はそれぞれＴ細胞、単球、Ｂ細胞及びＤＣについてのＦＡＣＳ図
を示す。カラム１及び２に示すように、Ｔ細胞と単球／マクロファージは、１次
分離しようと培養ＰＢＬから分離しようと、モノクローナル抗体３−６−Ａと反
応しなかった。Ｂ細胞は１次分離した場合にはモノクローナル抗体３−６−Ａと
反応しなかったが、１週間培養したＰＢＬから分離した場合には少量のＢ細胞画
分がモノクローナル抗体３−６−Ａで染色した（図１０のカラム３）。分離した
ＤＣ画分は６０％以上の細胞がモノクローナル抗体３−６−Ａと強く反応した。
１次分離した場合と１週間培養した後に分離した場合とのＦＡＣＳ結果に大した
差異がなかった（図１０のカラム４）。これらのＦＡＣＳデータにより、本発明
のモノクローナル抗体３−６−Ａが１次免疫細胞のうちＤＣに特異的に反応する
ことが更に確認された。
【００５８】 実施例１９：大腸菌及びバキュロウイルス系から発現したＤＭαタンパク質の
抗血清を用いた抗原性の試験 実施例７の方法を繰り返して、実施例３により大腸菌から、また実施例６によ
りバキュロウイルス系から生産した組換えＤＭαタンパク質を用いて免疫したマ
ウスから抗血清（抗ＤＭαポリクローナル抗体）を得た。ポリクローナル抗体を
用いて、組換えＤＭαとＲａｊｉ細胞から発現する真のＤＭαをウェスタンブロ
ットハイブリダイゼーション法により調べた。
【００５９】 大腸菌から発現した組換えＤＭαで免疫したマウスから得た抗血清は、大腸菌
から発現した組換えＤＭαを良好に認識したが、Ｒａｊｉ細胞から発現する真の
ＤＭαタンパク質を認識しなかった。反面、バキュロウイルス系で発現したＤＭ
αで免疫したマウスから得た抗血清は、組換えＤＭαのみならずＲａｊｉ細胞か
ら発現する真のＤＭαとも良好に反応した。このような結果は、大腸菌から発現
する組換えＤＭαは正常なＤＭαと抗原性において差異があるらしいことを示唆
する。この差異により、以前の研究が、大腸菌から発現させたＤＭαでマウスを
免疫した場合に、正常なＤＭαと反応する能力があるモノクローナル抗体を生産
しえなかったものと判断される（Kimら, Mol，Cells、6、648、1996）。
【００６０】 （発明の効果） 以上のように、本発明のモノクローナル抗体３−６−ＡはＤＣ及びＲａｊｉ細
胞から正常に発現する真のＤＭαに対し強い反応性を示す。特に、ＰＢＬのうち
ＤＣに非常に特異的に反応し、かつ非常に強く結合することは注目に値する。モ
ノクローナル抗体３−６−Ａはその表面でも細胞質てもＤＣを染色する。従って
、本発明のモノクローナル抗体３−６−Ａは、ＤＭ分子の機能を研究するにあっ
て非常に有用で、ＤＣ特異的表面マーカーとして使用することができ、このマー
カーはＰＢＬからＤＣを陽性選択するに足る強さであるようである。そのため、
本発明は、今後、生物医学産業において非常に有用であり、癌や他の慢性疾患の
免疫療法研究の進展に大いに貢献するだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、モノクローナル抗体３−６−Ａの作製および特性付けに用いた手順を
簡略的に示すフロー図である。
【図２】 図２は、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＤＭαの発現を示すＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動分析写真図である。
【図３】 図３は、組換えバキュロウイルスＤＮＡでトランスフェクトされた場合にＨｉ
ｇｈ-５細胞における組換えビリオンの産生の結果形成された陽性プラークを示
す写真図である。
【図４】 図４は、組換えＤＭαのバキュロウイルス系における正常な発現を示すウェス
タンブロット写真図である。
【図５】 図５は、Ｒａｊｉ細胞において発現された真正ＤＭαに対するマウス抗組換え
ＤＭα抗血清の反応性を示すウェスタンブロット写真図である。
【図６】 図６は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび細胞において発現されたＤＭαに対するモノクロ
ーナル抗体３−６−Ａの反応性を示すウェスタンブロット写真図である。
【図７】 図７の（Ａ）は、モノクローナル抗体３−６−Ａで染色されたＤＣおよびＲａ
ｊｉ細胞の細胞質および表面を示す蛍光顕微鏡写真図である。図７の（Ｂ）は、
固定化前または固定化後にモノクローナル抗体３−６−Ａで染色した場合のＲａ
ｊｉ細胞のＦＡＣＳヒストグラム図である。
【図８】 図８は、精製一次免疫細胞の染色に用いた場合の、ＤＣに対するモノクローナ
ル抗体３−６−Ａの特異性と、その他の市販のＤＣ特異的モノクローナル抗体の
特異性との比較を示す蛍光顕微鏡写真図である。
【図９】 図９は、精製ＤＣに対する、モノクローナル抗体３−６−Ａと市販のＤＣ特異
的モノクローナル抗体の反応性および特異性を比較したドット免疫ブロット写真
図である。
【図１０】 図１０は、それぞれ、精製一次免疫細胞に対するモノクローナル抗体３−６−
Ａの反応性を示すＦＡＣＳヒストグラム図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 BA46 CA04 CA07 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 GA03 GA09 GA11 GA13 GA18 GA19 GA27 HA03 HA11 HA15 4B063 QA01 QQ08 QQ79 QR56 QS33 QX02 4B064 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CD30 CE12 DA13 4B065 AA26X AA90X AA91X AA94Y AA95X AB01 AC14 BA02 BA05 BB01 BB40 BD14 CA24 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA50 FA72 FA74 GA26

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭ（ＫＣＴＣ−０４８５ＢＰ
    ）において産生される、末梢血白血球の中の樹状細胞の表面に高度に特異的なモ
    ノクローナル抗体３−６−Ａ。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のモノクローナル抗体３−６−Ａを生産する
    ハイブリドーマ細胞ＫＨＢ−ＤＭ（寄託番号ＫＣＴＣ−０４８５ＢＰ）。
  3. 【請求項３】 ＤＭα遺伝子の細胞外領域（この細胞外領域は塩基配列１２
    ２〜７３２に対応する）をコードする６０９ｂｐのＤＮＡ断片を含有する、組換
    えプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ−ＤＭα。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換えプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ
    ２Ａ−ＤＭαおよびバキュロウイルス全長ＤＮＡ Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅをＨｉ
    ｇｈ−５細胞に同時トランスフェクトすることによって調製した組換えバキュロ
    ウイルスＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ−ＤＭα。
  5. 【請求項５】 抗体を、試料中の樹状細胞の表面に発現されたＤＭαタンパ
    ク質に結合させる工程であって、前記抗体が末梢血白血球の中の樹状細胞とのみ
    特異的に反応し、前記試料が樹状細胞を含むか、含むものと予測されるものであ
    る前記工程、および 樹状細胞の表面に発現したＤＭαに結合した抗体をマーキングすることにより
    、抗体で染色された細胞を検出する工程 を含む、試料から樹状細胞を検出する方法。
  6. 【請求項６】 前記抗体が請求項１に記載のモノクローナル抗体３−６−Ａ
    である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記マーキング工程が、抗体結合ＤＭαタンパク質または抗
    体被覆細胞を、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した第２抗体で染色
    し、樹状細胞と何らかの関連のある細胞またはＤＭαタンパク質を視覚化するこ
    とによって行われる、請求項５に記載の方法。
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