CN1275161A - 对外周血白细胞中的树突细胞表面具有特异性的单克隆抗体3－6－a - Google Patents

对外周血白细胞中的树突细胞表面具有特异性的单克隆抗体3－6－a Download PDF

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Abstract

在此公开了单克隆抗体3－6－A,它可与一种DMα的细胞外区以及杂交瘤细胞KHB－DM结合,其保藏号为KCTC－085BP,该杂交瘤细胞产生单克隆抗体3－6－A。该单克隆抗体显示了很强的结合力,而且只对外周血中的树突细胞具有特异性。

Description

对外周血白细胞中的树突细胞表面具有特异性的单克隆抗体3-6-A
技术领域
本发明涉及一种只与树突细胞起反应的单克隆抗体3-6-A。更具体而言，单克隆抗体3-6-A与只在外周血白细胞中树突细胞表面表达的DMα的细胞外区起反应。因此，本发明涉及与树突细胞特异性表面标记相符合的单克隆抗体3-6-A的可应用性。
                        背景技术
当通过胞饮或病菌感染接触外来抗原时，树突细胞(此后称为DC)吞噬抗原，降解蛋白质，并将其以结合在MHC II类分子上的肽的形式呈现在细胞表面。尽管在总PBL中DC不足1％，但DC向T细胞的抗原呈递能力比单核细胞和巨噬细胞要强的多(Pierre等人，自然(Nature)388：787(1987))。
一旦被外来抗原致敏，DC便返回淋巴结，分泌一种特异性C-C趋化因子。在淋巴结中，致敏的DC活化原初T细胞(Adema等人，自然387：713(1997)；Ingulli E等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)185：2133(1997))，诱导产生针对抗原的细胞免疫(Steinman R.M.，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)，9：271(1991))。据报道，DC在胸腺内T细胞的正、负选择方面起重要作用(Carlos A.，今日免疫学(Immunol.Today)18)。其它实验显示，DC分泌的趋化因子参与T细胞向淋巴结归巢(Adema等人，自然387：713(1997)；Ingulli等人，实验医学杂志，185：2133(1997))。
此外，DC还具有诱导IL-12、活化癌细胞特异性CTL的能力，CTL能有效地抑制癌生成和癌细胞增殖(Gabrilovich等人，细胞免疫学(CellImmunol.)170：11-9(1996)；Vezzio等人，国际免疫学(Int.Immunol)8：19963-70(1996)；Young等人，实验医学杂志183：7-11(1996))。通过利用DC的这些功能，最近对DC用于癌症免疫疗法的开发进行了深入研究(Giboa等人，癌症免疫学与免疫疗法(Cancerimmunol.immunother.)，46：82-87(1988)；Nestle等人，自然医学(Nat.Med.)，4：328(1998)；Song等人，实验医学杂志，186：1247(1997))。
此外，DC已被证实在AIDS的发病中起关键作用(Fauci，科学，262：1011(1993)；Pantaleo等人，自然，362：355(1993)；Embretson等人，自然，362：359(1993)；Haynes等人，科学(Science)，271：324(1996))。感染HIV-1病毒的病人通常经历为期3-15年的无症状期，期间在病人的血流中仅见到微量的HIV-1病毒。但在淋巴结中DC周围却可见到大量的病毒和受感染的CD4+T细胞(Pantaleo等人，自然362：355(1993))。这说明在整个临床潜伏期，即使在血液中仅显示微量病毒活动时，淋巴器官中的HIV复制是活跃的。他们对这一现象的解释是：在原发病毒血症期间，DC接触并感染了大量HIV-1，返回淋巴结，在此它们刺激原初T细胞，然后将病毒传播给这些活化的CD4+T细胞。DC-介导的HIV-1传播，引起CD4+T细胞的活动性感染以及淋巴结中T细胞短缺，随之导致血流中CD4+T细胞缺乏，直至AIDS水平(Blauvelt等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)100：2043(1997)；McCloskey等人，免疫学杂志(J.Immunol.)158：1014(1997))。有一篇文献报道，纯化的原始CD4+T细胞在缺乏抗原呈递细胞如DC或巨噬细胞时，并不受HIV-1感染，而且DC向CD4+T细胞传播HIV-1的效率要比巨噬细胞高的多(Joo等人，韩国微生物学会杂志(J.Kor.Soc.Microbiol.)，30：77(1995))。这些研究结果实例，具体证明了DC在AIDS的发展中起重要作用。
在过去的几年中，DC因上述特性和特征而受到了免疫学家和有关科学家的高度重视。然而，由于存在以下限制因素，DC研究并没有象在其它实验中期望的那样取得如此快速的进展。首先，在总的PBL中DC所占不足1％，而且在体外即使存在粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，其数量也不增长，而有报道认为GM-CSF能支持DC存活达6周(Marcowitz与Engleman，临床研究杂志85：955，1990)。第二，至今还没有发现人类DC特异性表面标记。
有限的细胞数量以及DC特异性表面标记的缺乏，使之难以应用纯化的、足够数量的DC进行进一步实验。然而，几家实验室仍坚持研究，结果DC的特征目前已被认可。到目前为止，已从PBL中纯化出DC，这一般都是通过负选择法进行的，该法在其它文献中已有描述(Freudenthal等人，国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)87：7698(1990))。在负选择法中，通过下述实验步骤，从PBL中去除其它免疫细胞如T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞，从而分离出DC：Ficoll梯度、E-玫瑰花环、黏附淘选、Fc淘选、三碘苯甲酰氨基葡萄糖梯度离心、以及抗体淘选方法。这些步骤太过费力和复杂，可能不适用于一般实验室。
最近，有些研究人员尝试通过在体外有细胞因子如GM-CSF和IL-4存在条件下，使骨髓干细胞(CD34+，CD11c+)或单核细胞分化而产生DC(Bender等人，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)196：121-135(1996))。最近大多数用于免疫疗法的DC研究都利用这种方法制备DC。然而，这种方法也有其不足，它的费用较高，而且分化需要较长的时间。此外，尽管分化的细胞在形态学上象DC，但在其生物学功能方面，它们是不是真正的DC、以及用于免疫疗法时在体内能否代替真的DC，还是有争议的。
因此，为了从实际出发研究DC，首先基本的是找到DC特异性表面标记并制备针对它的单克隆抗体。这些单克隆抗体不但在研究DC方面很有用处，而且也可用于从PBL中DC的正选择。为此，已提出了几种单克隆抗体，并将其用作DC检测抗体。然而，它们中的大多数因有其自身的限制，并不太适用于从PBL中检测和分离DC。例如，HB15分子(CD83)的单克隆抗体(mAB)就只与活化的DC起反应，而根本不与原初DC起反应。我们目前的研究已证明，与其它细胞特异性表面标记相比，CD83即使在活化的DC也没有得到充分表达。此外，针对CD83的mAB的特异性无与活化的DC反应及与活化的单核细胞/巨噬细胞反应那样高的特异性。然而，它一直被广泛用于在体外鉴定源于单核细胞的DC(Fearnley等人，血液(Blood)，89：3708(1997)；Zhou等人，免疫学杂志，154：3821(1995))。
此外，也有报道将CD11c和CD1a作为DC特异性表面标记(Gao等人，免疫学(Immunology)91：135(1997)；Lardon等人，免疫学91：553(1997)；Ruedl等人，免疫学266：1801(1996))。但它们对DC的特异性存在一个问题。CD11c不但在DC上表达，而且也在巨噬细胞、粒细胞和NK细胞表达，而CD1a也见于胸腺细胞和郎罕细胞。这些结果在我们的实验中也得到部分证实。我们发现CD11c在DC表面有大量表达，但在B细胞和单核细胞也有同等数量或较低数量的表达。而CD1a并不在原初DC表面表达。这些结果说明，CD1a、CD11c和CD83并不适合作为DC特异性表面标记。
                        发明内容
考虑到这一背景，本发明的发明者制备了DC的cDNA文库，并检查文库以寻找一种DC特异性表面标记。通过一系列实验，如斑点提取(plaque-lifting)和DNA斑点示差杂交、序列测定以及定量RT-PCR，发明者发现，HLA-DMα/b(此后称为DMα)基因只在PBL中的DC上表达(Bae等人，分子与细胞(Mol.Cells)，5：569，1995)。制备了一种针对DMα细胞外区的单克隆抗体，后来称之为3-6-A。同时检测了Mab3-6-A以及其它提出的单克隆抗体对DC的特异性。
因此，本发明的一个目的就是提供一种新的单克隆抗体，它只识别PBL中的DC。
本发明的另一个目的是提供一种杂交瘤细胞，它产生这种新的单克隆抗体。
为了制备一种针对PBL中DC上特异性表达的DMα蛋白质的单克隆抗体，尝试了让DMα蛋白质在大肠杆菌中表达，并将其接种到BALB/c小鼠进行免疫。然而，结果发现如此得到的单克隆抗体中，没有一种能够识别表达在DC或Raji细胞上的正常DMα(Kim等人，分子与细胞，6：684(1996))。DMα在人类和小鼠之间有75％以上的氨基酸序列同源性，这提示应用重组h-DMα蛋白质在BALB/c小鼠中制备抗人DMα单克隆抗体，可能是困难的。
Kim等人(分子与细胞，6：684(1996))制备的单克隆抗体之所以不能识别表达在DC上的正常DMα的原因，被认为可归咎于以下可能性。当以一种包涵体的形式表达时，因缺乏糖基化或结构破坏，重组DMα将会失去它的B细胞表位。
在本发明中，重组DMα蛋白质是从一种杆状病毒系统中获得的。这种重组DMα蛋白质被证明保持了表达在Raji细胞或DC上的正常DMα的抗原性以后，被用来制备单克隆抗体3-6-A。通过IsoStripTM试剂盒(Boehringer Mannheim)分析发现，本发明的单克隆抗体3-6-A是一种IgG1亚类，具有γ1同型κ链。
单克隆抗体3-6-A对DC和Raji细胞中表达的正常DMα显示出很强的反应性，而且反应性具有很强的特异性，只针对原始免疫细胞中的DC。此外，还发现抗体3-6-A不但与细胞浆深染，而且也与DC的细胞表面深染。这些特性说明，PBL中只有DC在其细胞浆以及细胞表面表达相当数量的DMα。这一结果与以往的报道大不相同，这些报道认为DM蛋白质属于核内体区室，只位于细胞浆(Karlsson等人，科学，266：1569(1994)；Sanderson等人，科学，266：1566(1994))。本发明者发现，这种差别是由于实验中应用的细胞类型不同。实际上，Raji细胞只有在先固定和增加通透性后，才与3-6-A染色，如不固定则不着色，这说明在Raji细胞中DM只位于细胞浆，而不象以往报道的那样位于细胞表面。这些结果强烈提示，DM表达类型有可能是细胞类型特异的。本发明者在全世界首先发现，DM只表达在PBL中的DC表面。
最近有几项报道宣称，DM作为一种侣伴蛋白质在MHC II类-依赖抗原呈递方面起重要作用(Morris等人，自然368：551，1994；Karlsson等人，科学299：1569，1994)。Sanderson等人(免疫学4：87，1996)报道，通过免疫共沉淀实验，发现DM诱导CLIP从HLA-DR解离，促使肽与DR分子的结合。但本研究结果发现有相当数量的DM表达在DC表面，提示DM分子除了侣伴功能外，在DC中还发挥其它某些重要功能，至少是部分功能。首先，我们的结果强烈提示，DM分子可用作DC特异性表面标记。
本发明的单克隆抗体3-6-A不但可用于表达在DC表面的DM功能的研究，而且也可用来研制用于PBL中DC正选择的工具。DC在免疫反应中起关键作用。特别是，DC是研究癌免疫疗法的重要材料。因此，迫切需要研制一种纯化DC的正选择方法。正选择工具一旦用单克隆抗体3-6-A建立，在本发明中研制出来，那么在探讨DC介导的研究和癌免疫疗法方面将会提供很大帮助。本发明的完成是通过在发明者的研究结果的基础上制备了单克隆抗体3-6-A，并测试了它的特异性以及与DC的结合能力。
                     附图简述
图1中的流程图简要显示了用于单克隆抗体3-6-A制备和特征分析的步骤；
图2中的SDS-PAGE照片显示了重组DMα在转化的大肠杆菌中的表达；
图3中的照片显示了High-5细胞转染重组杆状病毒DNA后产生重组病毒体而形成的阳性噬菌斑；
图4中的蛋白质印迹照片显示了重组DMα在杆状病毒系统中的正常表达；
图5中的蛋白质印迹照片显示了小鼠抗重组DMα抗血清与Raji细胞中表达的真正DMα的反应性；
图6中的蛋白质印迹照片显示了单克隆抗体3-6-A与大肠杆菌和细胞中表达的DMα的反应性；
图7A中的荧光显微镜照片显示了DC和Raji细胞的细胞浆和表面用单克隆抗体3-6-A染色；
图7B是Raji细胞在固定前或固定后用单克隆抗体3-6-A染色的FACS直方图；
图8中的荧光显微镜照片显示了与其它商品化DC特异性单克隆抗体用于染色纯化的原始免疫细胞相比较，单克隆抗体3-6-A对DC的特异性；
图9中的斑点印迹照片比较了单克隆抗体3-6-A与商品化DC特异性单克隆抗体对纯化的DC的反应性和特异性；以及
图10中的FACS直方图显示了单克隆抗体3-6-A与各种纯化的原始免疫细胞的反应性。
                 实施本发明的最佳方式
要实现本发明的目的，首先将一个编码DMα基因细胞外区609bp的DNA片段(相应于122-731碱基序列)克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中，以产生一个重组质粒pBlueBacHis2A-DMα。这个重组质粒与杆状病毒全长DNA即Bac-N-Blue(Invitrogen)一起，共转染到High-5细胞(Invitrogen)中，导致重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα的产生，然后将其感染大量培养的High-5细胞。收获感染High-5细胞，将其提取物置于Ni+-NTA柱(Qiangen)，纯化重组DMα蛋白质。用纯化的重组DMα蛋白质免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞杂交，产生出杂交瘤细胞KHB-DM，后者产生单克隆抗体3-6-A。现在通过培养杂交瘤细胞KHB-DM，可获得单克隆抗体3-6-A。实施例1：DC及其它原始免疫细胞的纯化
按照以往报道的步骤(Bae等人，分子与细胞，5，569，1995)，从韩国红十字血库提供的淡黄色细胞层或leukopak中纯化DC及其它免疫细胞(T细胞、B细胞和单核细胞)。实施例2：DC的mRNA提取和DMα-cDNA合成
根据已知技术(Bae等人，分子与细胞，5，569，1995)，从在实施例1得到的DC中提取mRNA。将mRNA与1μg Oligo-dT引物在逆转录溶液(Rnase抑制物0.5μl，5×第一链合成反应缓冲液4μl，0.1mM DTT2μl，10mM dNTP 1μl)中37℃孵育2分钟，随后加入5个单位的AMV-逆转录酶。该溶液在37℃孵育40分钟，然后再在45℃孵育30分钟以合成cDNA。应用该cDNA作为模板以及表1所示的引物，通过PCR扩增DMα基因。
                   表1：DMα的引物
BamHI-DM有义引物 5’-GAT AAG GAT CCG TCC AAGCTC CTA-3’ 122-137
 HindIII-DM有义引物 5’-GTTCA AAG CTT TCA CTCCAG CAG ATC TGA GGG-3’ 732-712
PCR之进行是通过94℃/1分钟、40℃/30秒和72℃/45秒的热循环，重复5次，然后是94℃/1分钟和72℃/1分钟的热循环25次，以便产生一个编码DMα基因细胞外区(碱基序列12-732)的609bp DNA片段。实施例3：DMα在大肠杆菌的克隆与表达
在实施例2中用PCR扩增的DNA被BamHI和HindIII双重消化，插入被相同的限制酶打开的质粒pRSET/A(Invitrogen)中，产生一个重组质粒pRSET-DMα。将这个重组pRSET-DMα转化入大肠杆菌BL21(DE3)，然后将后者涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基上。将阳性菌落接种到M-9氨苄青霉素培养液(1％细菌用胰蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、2M葡萄糖、0.5％二胺、1M MgSO4、1M CaCl2)中，搅拌培养。当培养物的吸光度达到0.5，加入最终浓度为1mM的IPTG，在37℃诱导蛋白质表达，2小时。通过SDS-PAGE分析，鉴定重组DMα在转化大肠杆菌中的表达，其中可在29kDa检测到一条条带(图2)。在图2中，泳道1是一个蛋白质大小标志物，泳道1：只用pRSET/A质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)的裂解产物；泳道2：用重组DMα质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)的裂解产物；以及泳道3：一种DMα蛋白质样本，它是在Ni+-NTA树脂(Qianfen)帮助下从泳道2之重组细菌中纯化出来的。实施例4：表达DMα的重组杆状病毒的构建
在实施例2中用PCR扩增的DNA片段被BamHI和HindIII消化，插入用相同的限制酶打开的质粒pBlueBacHis2A(Invitrogen)中。将该连接物转化到大肠杆菌BL2l(DE3)中，然后按照实施例2描述的方法培养细菌，以获得重组质粒pBlueBacHis2A-DMα。与Bsu36I消化后线性化的杆状病毒全长DNA Bac-N-Blue(Invitrogen)一起，该重组质粒pBlueBacHis2A-DMα在Lifofectin(Gibco BRL)的帮助下，被转染到High-5细胞(Invitrogen)中。转染后在液体培养基中培养5-7天，收获上清液，将浓度稀释后再感染到High-5细胞中。接种后2天，用1％低熔点琼脂混合物(将50mg/ml X-gal、2×TNM-FH培养基与2％低熔点琼脂以相同体积混合而制成)覆盖细胞，再培养3-5天。选择蓝色噬菌斑为阳性克隆(图3之A组)。被选择的克隆通过重复上述培养步骤3次被进一步纯化。将它们在High-5细胞中扩增，以获得大量的重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα。实施例5：重组杆状病毒中克隆DMα的分析
从在实施例4得到的重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα中，提取基因组DNA进行PCR分析。应用表2中的引物Bac1/Bac2(包括在Bac-N-Blue转染试剂盒中，Invirtogen)，以基因组DNA作为模板进行PCR，以鉴定重组杆状病毒含有DM基因。
              表2：Bac1/Bac2引物
 Bac1引物 5’-TTT ACT GTT TTC GTA ACA GTT TTG -44～-21
 Bac2引物 5’-CAA CAA CGC ACA GAA TCT AGE-3’ +794～+77
实施例6：重组杆状病毒感染的High-5细胞中DMα的表达和纯化
用5MOI重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα感染High-5细胞，然后在湿化孵育箱内27℃下培养5天。从感染细胞内提取重组DMα蛋白质，用Ni+-NTA树脂柱(Qianfen)进行纯化。实施例7：用重组DMα免疫BALB/c小鼠
将在实施例6中获得的DMα蛋白质与等体积的弗氏佐剂(Sigma)混合，接种到5-6周龄的BALB/c小鼠，剂量为每只小鼠50μg。然后被接种的小鼠每隔3周分别接受同一抗原的第二次和第三次加强接种，剂量为每只小鼠25μg。第三次免疫后，从眼静脉给每只BALB/c小鼠放血，以分析抗血清。实施例8：抗血清与重组DMα的反应性
将感染重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα的High-5细胞制成匀浆，用SDS-PAGE分离获自裂解细胞的蛋白质。应用一种转移溶液(48mMTris-HCl、39mM甘氨酸、20％甲醇、1.3mM SDS)，在一个半干燥凝胶印迹装置(BioRad)中，将SDS-PAGE分离的蛋白质转移印迹到硝酸纤维素膜上。用blotto(5％(w/v)脱脂牛乳，0.02％NaN3，在PBS中)封闭印迹硝酸纤维素膜30分钟，PBS洗3次，将其置于10ml PBS中(其中含5μl在实施例7中得到的抗血清)，室温放置30分钟。用PBS洗3次，将膜浸泡在含作为第二抗体的山羊抗小鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma)的PBS溶液中，然后，加入NBT/BCIP溶液〔50mg/ml NBT(氮蓝四唑)66μl、50mg/ml BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)30μl，加入10ml AP缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl，pH9.5)〕作为酶反应底物，观察结果。当在暗处看到一条由酶反应引起的条带，即加入终止溶液(10mM Tris-Cl中含20mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0)终止反应。
该蛋白质印迹分析显示，重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα在High-5细胞中正常表达DMα，如图4所示。在图4中，泳道M是蛋白质大小标记物，泳道1是未感染的High-5细胞裂解物，泳道2是野生杆状病毒感染的High-5细胞裂解物，泳道3是重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα感染的High-5细胞裂解物，泳道4是大肠杆菌BL21(DE3)裂解物—作为阴性对照，以及泳道5是表达重组DMα的重组大肠杆菌BL21(DE3)。实施例9：抗血清与真正DMα的反应性
蛋白质印迹分析的方法与实施例8相似，使用1×106未处理的Raji细胞和1×106用浓度为100单位/mlγ-干扰素(Sigma)处理3天的Raji细胞。结果见图5。在图5中，泳道1是对照Jurkat细胞裂解物，泳道2是Raji细胞裂解物，以及泳道3是γ-干扰素处理的Raji细胞裂解物。
这一分析显示，用重组DMα免疫的BALB/c小鼠的抗血清，能很好地与Raji细胞表达的真正DMα起反应。实施例10：表达单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
用脊柱脱位法将接受重组DMα(获自实施例7中杆状病毒系统的表达)免疫的小鼠处死，切除脾脏。将1.4×107个脾细胞悬浮于10ml富含葡萄糖的DMEM培养液中，与3×106小鼠骨髓瘤细胞SP2/O(Sp2/O-Ag14 KTCC CRL1581)混合，用富含葡萄糖的DMEM培养液冲洗。在细胞沉淀中加入50％PEG-4000溶液(Gibco BRL)1ml，1分钟，以诱导细胞融合。以1ml/min的速率缓慢加入富含葡萄糖的DMEM培养液后，细胞充分混合，离心。将细胞沉淀悬浮在5ml 1×DMEM20％中，分置于多孔平板，每孔50μl，其中培养的小鼠巨噬细胞作为饲养细胞(Lane，H.D.编著，抗体实验手册(Antibody Lab.，Mannual).p220，1989)，然后培养1天。随后，在每个孔中加入等体积的2×HAT培养基。在长时间的培养过程中，融合细胞形成集落。从18个孔中选择在HAT培养基中形成集落的杂交瘤细胞。实施例11：分泌与DMα起反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞的鉴定
将在实施例10中获得的18个集落分别置于大量培养基中培养，应用ELISA、斑点免疫印迹杂交和蛋白质印迹杂交对上清液进行分析。用在实施例3和6中制备的DMα包被96孔板，最终浓度为每孔0.5μg，4℃下过夜。平板用100μl含0.05％Tween20的PBS冲洗2次。每个孔中加入1％脱脂牛乳溶液(去离子水溶解，加有0.02％NaN3)90μl，置37℃下1小时。随后，各孔中加入实施例7中的抗血清进行反应，37℃下1小时。冲洗后，加入第二抗体(山羊抗小鼠IgG-AP，1/1000稀释)，37℃孵育2小时。冲洗2次后，每个孔中加入50μl碱性磷酸酶底物(10％二乙醇胺缓冲液1ml(二乙醇胺97ml，NaN3 0.2g(0.02％)，MgCl2 6H2O100mg(0.01％)，DDW 800ml；总共1L)中含对硝基苯基磷酸1mg)，37℃孵育30分钟。反应完成后，用ELISA读出器(Molecular Devices)在405nm测量吸光度。用与实施例8相同的方法进行蛋白质印迹，斑点免疫印迹杂交则根据以往的方法(Kim等人，分子与细胞，6，684，1996)进行。
结果总结如下，见表3。在表3中，单克隆抗体与大肠杆菌和杆状病毒系统中表达的重组DMα蛋白质的反应性用ELISA和蛋白质斑点印迹测定，而其与不同细胞中表达的真正DMα的反应性，则用斑点免疫印迹和蛋白质印迹杂交测定。该实验显示，全部14种单克隆抗体都与大肠杆菌中表达的重组DMα起强烈反应，但除了单克隆抗体3-6-A外，余者都不与High-5细胞中表达的重组DMα起反应。蛋白质印迹和斑点免疫印迹杂交测定发现，单克隆抗体3-6-A与PBL中的DC起强烈反应。此外，单克隆抗体3-6-A还在蛋白质印迹杂交中与Raji细胞起强烈反应。蛋白质印迹杂交偶可在B细胞级分中检测到弱阳性反应。这种弱反应性提出了一个可能性，即活化的B细胞有可能表达DM。根据这些结果，从14种单克隆抗体中选择出了针对DMα的单克隆抗体3-6-A。表达单克隆抗体3-6-A的杂交瘤细胞被命名为KHB-DM，贮存在韩国生物科学和生物技术研究所(Koran Research Institute of Bioscience andBiotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(保藏号KCTC-0485BP)。实施例12：单克隆抗体3-6-A与在DC和Raji细胞中表达的真正DMα的反应性
在蛋白质印迹杂交中测试了单克隆抗体3-6-A对重组DMα以及在Raji细胞和DC中正常表达的真正DMα的反应性。结果见图6。如图6所示，单克隆抗体3-6-A对Raji和DC中正常表达的34 kDa DMα具有高度反应性。在图6中，泳道1是大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的阴性对照，泳道2是表达DMα的大肠杆菌裂解物，泳道3是表达DMα的High-5细胞裂解物，泳道4是Raji细胞裂解物，以及泳道5是DC裂解物。
表3：单克隆抗体与DMα的结合力
    Abs 抗原
    重组DM     细胞
大肠杆菌 High-5   PBL     T     B   MC   DC  Raji
 DMαpAb     ++++    ++++   +    -     ±   -   ++   ++
    1-1-H     ++     -   ±    -     -   -   -   -
    1-3-A     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    1-8-G     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    1-10-A     +++     +   -   -     -   -   -   -
    1-11-E     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    2-11-G     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    2-12-A     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    3-4-B     +++     -   -   -     -   -   -   -
    3-5-B     ++++     -   -   -     -   -   -   -
    3-6-A     ++++    +++   +   -     ±   -   +++  +++
    4-1-C     ++     -   -   -     -   -    -   -
    4-2-B     ++++     -   -   -     -   -    -   -
    5-3-G     +++     -   -   -     -   -    -   -
    5-5-D     ++++     -   -   -     -   -    -   -
注：结合力用ELISA、斑点免疫印迹和/或蛋白质印迹杂交测定。
-：结果与阴性对照相似
+：阳性结果，该符号的数目表示阳性信号的强度，只要405nm吸光度从基础阳性值增加0.2，该符号就逐一增加，基础阳性值是阴性对照的平均值加5SD(标准差)。++++用于表示ELISA值等于或高于4个符号的所有反应。
在蛋白质印迹和斑点免疫印迹中，只有当检测到的信号被清楚地重复时，才用‘+’这一符号。随着强度增加，该符号的数目也增加。
±：弱的或非重复性信号。实施例13：单克隆抗体3-6-A的大量生产
杂交瘤细胞KHB-DM以2×105个细胞/ml的密度接种到高葡萄糖DMEM20％培养基。4天后达到最大程度生长时，收获培养上清作为单克隆抗体3-6-A的来源。此时，单克隆抗体的浓度约达40μg/ml培养基。
为了生产大量的单克隆抗体，将杂交瘤细胞置于小鼠腹腔内培养。首先给BALB/c小鼠腹腔内注射1ml降植烷(prestane)。一周后，每只小鼠接种5×106杂交瘤细胞。7-14天后，当小鼠腹腔充分肿胀时，用18号针头连接10ml注射器抽取腹水，每只小鼠抽5-10ml，然后1,500转/分离心10分钟。获得的上清液中加入0.02％NaN3，-70℃以下贮存。腹水中的单克隆抗体浓度为5-9mg/ml。实施例14：单克隆抗体3-6-A的H和L链同种型分型
应用同种型分型试剂盒IsoStripTM(Boehringer Mannheim)检测了实施例11中杂交瘤细胞KHB-DM产生的单克隆抗体3-6-A的同种型。发现单克隆抗体3-6-A是IgG1同种型，具有κ-轻链。实施例15：单克隆抗体3-6-A染色DC的细胞浆和表面
显微镜载玻片用1mg/ml聚L-赖氨酸(Mw 400,000)溶液包被15分钟，用去离子蒸馏水冲洗。如实施例1分离的Raji细胞(ATCC CCL86)和DC被稀释至105细胞/ml，附着到聚L-赖氨酸包被的玻片上，然后用PBS冲洗。将在实施例13获得的单克隆抗体(培养上清液)100μl加到有细胞附着的玻片上，置CO2孵箱1小时，然后用PBS冲洗3次。与第二抗体(抗小鼠IgG-FITC)在37℃ CO2孵箱反应30分钟后，玻片用PBS冲洗2次，然后在荧光显微镜(Nikon E-600 Epi荧光显微镜)下观察。
在用单克隆抗体3-6-A染色前，先将有DC附着的玻片浸于有机溶剂(50％甲醇和50％丙酮)中固定，以便用3-6-A染色DC细胞浆。固定后，应用与上文相同的方法，使DC被单克隆抗体3-6-A和第二抗体染色，在荧光显微镜下观察。
在图7A中，a组是DC的显微镜照片，显微镜(Nikon TMS)下放大400倍，b组是DC用PE偶联的HLA-DR(Becton-Dikinson)染色作为对照的荧光显微镜照片，c组是DC分别用抗体3-6-A和FITC-偶联的第二抗体结合并染色的照片，d组是首先固定、然后应用与c组中所示相同方法染色的DC照片，e组和f组分别是用相同方法染色的未固定和固定的Raji细胞的照片。
图7B显示了用单克隆抗体3-6-A和FITC偶联的第二抗体染色的未固定和固定的Raji细胞的FACS结果。Raji细胞组分的一半用Cytofix/cytoperm  CytostainTM试剂盒(Pharmingen)固定，方法按照销售商手册。未固定和固定的Raji细胞用单克隆抗体3-6-A在4℃处理30分钟，PBS洗2次，然后在4℃用上述相同的FITC偶联的第二抗体染色30分钟。染色细胞用PBS洗2次，立即用FACStar(Becton-Dickinson)进行分析。在图7B中，a组和b组分别是未固定和固定的Raji细胞的FACS结果。
正如图7所明确显示的那样，DMα在DC表面及其细胞浆中有大量表达(图7A c组和d组)，这与以前的报道不同，以前的报道坚持认为DM只是核内体区室。而在染色前固定的Raji细胞也被3-6-A深染(图7A f组和7B b组)。然而，未固定的Raji细胞根本不被同一个抗体染色(图7A e组和7B a组)。从Raji细胞得到的结果提示，DM分子只位于Raji细胞的细胞浆，而不位于Raji细胞表面，正如以前的报道所提到的那样(Karlsson等人，科学266；科学266：1599-1573，1994；Sanderson等人，科学266：1566-1569，1994)。实施例16：单克隆抗体3-6-A对DC表面的特异性
应用与实施例1相同的方法分离T细胞、B细胞、单核细胞和DC。每种细胞均用PBS稀释至105个细胞/ml，用在实施例13获得的单克隆抗体3-6-A(培养上清液)100μl，4℃下处理30分钟。750g离心后，细胞沉淀用PBS洗2次，悬浮在200μl PBS中，用第二抗体抗小鼠IgG-FITC(Sigma)10μl(1μg)在4℃染色30分钟。离心后，细胞沉淀用PBS洗2次，附着在包被玻片上。应用实施例15中提到的荧光显微镜分析染色细胞，结果见图8。图8中，T列代表T细胞，B列代表B细胞，Mc列代表单核细胞/巨噬细胞，DC列代表DC。将标本与各种不同的商品化单克隆抗体和单克隆抗体3-6-A反应，然后用FITC偶联的第二抗体染色。
正如图8底部所显示的那样，单克隆抗体3-6-A对DC具有高度反应性，但与其它免疫细胞根本不起反应。这些资料证实，DM分子只表达在原始免疫细胞中DC的表面。相反，广泛用于DC分析的针对CD11c或CD83的抗体，对PBL中的DC就没有这么高的特异性，如图8所示。它们不但与DC起反应，而且也与B细胞和单核细胞起反应。尤其是，已知在活化DC组分中表达的CD83(Zhou L.J.，免疫学杂志149，735，1992)，它的单克隆抗体(抗-CD83：Immunotech Co.)除了对原初DC有反应性外，对单核细胞也显示了类似强度的反应性，尽管反应程度较弱。Fascin的单克隆抗体不能识别未固定的DC，而据报道称Fascin只在DC的细胞浆中表达。图8中明确显示的这些资料再次证实，本发明制备的单克隆抗体3-6-A与任何其它常规单克隆抗体相比，对DC具有更高的特异性和更强的亲和力。实施例17：单克隆3-6-A与DC的亲和力
将单克隆抗体3-6-A与DC的亲和力，与其它常规DC特异性单克隆抗体与DC的亲和力进行了比较。应用与实施例1相同的方法分离DC，用单克隆抗体3-6-A及其它商品化单克隆抗体进行斑点免疫印迹杂交(Kim等人，分子与细胞，6，684，1996)。
按实施例1的方法分离的每一DC组分中含有105个细胞，分别应用1μg的下述各个单克隆抗体染色：抗CD1a单克隆抗体(Becton-Dickinson)、抗CD11c单克隆抗体(Becton-Dickinson)、抗CD83单克隆抗体(Immunotech.Co.)、抗Fascin单克隆抗体(NIH AIDS研究和参照试剂项目惠赠)、以及单克隆抗体3-6-A，染色方法同实施例15。第一抗体处理的细胞用碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Promega)染色，方法同实施例15，然后在一个斑点印迹装置(Bio-Rad)的帮助下将其印迹到硝酸纤维素膜上。按实施例8所示方法对膜进行显色反应。
斑点免疫印迹杂交结果见图9。在图9中，斑点印迹信号1、2、3、和4分别是DC用作为对照的抗CD1a、抗CD11c、抗CD83、和抗Fascin单克隆抗体染色的实验结果。而斑点印迹信号5显示的是用单克隆抗体3-6-A染色的DC组分。在所测试的单克隆抗体中，单克隆抗体3-6-A对DC的亲和力最强(图9之印迹5)，这与实施例16所显示的结果是一致的。仅次于单克隆抗体3-6-A，对DC亲和力最强的是抗CD11c抗体(图9之印迹2)，但它也与单核细胞和B细胞组分起反应(图8)。针对CD83或Fascin的抗体与原初DC不起反应。实施例18：应用单克隆抗体3-6-A对原始免疫细胞进行FACS分析
应用单克隆抗体3-6-A处理在实施例1中分离的原始免疫细胞，其中包括T细胞、B细胞、单核细胞和DC在内，4℃下30分钟。用PBS洗2次后，细胞用第二抗体山羊抗小鼠IgG-FITC(Sigma)处理，4℃下30分钟。染色细胞用PBS冲洗2次，然后立即用FACStar plus(Becton-Dickinson)分析。
FACS分析结果见图10。在图10中，A组显示了采用与实施例1相同方法纯化的免疫细胞的FACS图，而B组显示的是从分离前先在RPMI10％培养基中培养1周的PBL中纯化的免疫细胞的FACS图。T细胞的FACS图位于第1列，单核细胞第2列，B细胞第3列，DC第4列。如第1和第2列所示，无论是原始分离的还是从培养的PBL中分离的T细胞或单核细胞/巨噬细胞，都不与单克隆抗体3-6-A起反应。至于B细胞，如为原始分离的，根本不与单克隆抗体3-6-A起反应。相反，如果是从培养1周的PBL中分离的，则有少量的B细胞组分被单克隆抗体3-6-A染色(图10之第3列)。而分离的DC组分中60％以上被单克隆抗体3-6-A深染。原始分离和培养1周后分离的细胞之间的FACS结果没有大的差异(图10之第4列)。这些FACS资料也证实，单克隆抗体3-6-A特异性地与原始免疫细胞中的DC起反应。实施例19：应用抗血清检测在大肠杆菌和杆状病毒系统中表达的DMα之间的抗原性
重复实施例7的同一步骤，从接受重组DMα蛋白质免疫的小鼠中获取抗血清(抗DMα多克隆抗体)，这种重组DMα蛋白质是实施例3中的大肠杆菌和实施例6中的杆状病毒系统产生的。应用该多克隆抗体对重组DMα和Raji细胞中表达的真正DMα进行蛋白质印迹杂交。
从用大肠杆菌中表达的重组DMα免疫的小鼠中获得的抗血清，能很好地识别大肠杆菌表达中的重组DMα，但不能识别Raji细胞中表达的真正DMα。相反，从用杆状病毒系统表达的DMα免疫的小鼠中获得的抗血清，不但与Raji细胞中表达的真正DMα起反应，而且也与重组DMα起反应。这一结果提示，大肠杆菌中表达的重组DMα在抗原性上有可能与正常DMα蛋白质不同。有人认为，如果用大肠杆菌中表达的DMα免疫小鼠，这种差异可能会导致以前的技术不能制备能够与正常DMα起反应的单克隆抗体(Kim等人，分子与细胞，6，684，1996)。
                      工业可应用性
正如此前所描述的那样，本发明的单克隆抗体3-6-A对DC和Raji细胞中正常表达的真正DMα显示了强烈的反应性。尤其值得注意的是，单克隆抗体3-6-A对PBL中的DC具有很高的特异性和很强的结合力。单克隆抗体3-6-A不但在细胞浆而且也在细胞表面染色DC。由于在研究DM分子的功能方面是非常有用的，因此，本发明的单克隆抗体可用作DC特异性表面标记，看来其强度足以允许从PBL中对DC进行正选择。本发明在生物医学工业中将是非常有用的，将推动针对癌症或其它慢性疾病免疫疗法的研究进展。

Claims (7)

1.一种在杂交瘤细胞KHB-DM(KCTC-0485BP)中产生的单克隆抗体3-6-A，它对外周血白细胞中的树突细胞表面具有高度特异性。
2.一种杂交瘤细胞KHB-DM，其保藏号为KCTC-0485BP，它产生权利要求1的单克隆抗体3-6-A。
3.一种重组质粒pBlueBacHis2A-DMα，其包括一个609bp的DNA片段，该片段编码DMα基因的细胞外区，该细胞外区相应于覆盖122和732之间的碱基序列。
4.一种重组杆状病毒Bac-N-Blue-DMα，它是通过将权利要求3的重组质粒pBlueBacHis2A-DMα与一种杆状病毒全长DNA Bac-N-Blue共同转染到High-5细胞而制备的。
5.一种从标本中探测树突细胞的方法，包括以下步骤：
使一种抗体与标本中树突细胞表面表达的DMα蛋白质结合，该抗体只与外周血白细胞中的树突细胞特异性地起反应，该标本含有或预期含有树突细胞；以及标记与树突细胞表面表达的DMα结合的抗体，以检测用该抗体染色的细胞。
6.权利要求5所示的方法，其中所述抗体是权利要求1的单克隆抗体3-6-A。
7.权利要求5所示的方法，其中所述标记步骤是这样进行的：用一种偶联荧光异硫氰酸(FITC)的第二抗体染色有抗体附着的DMα蛋白质或抗体包被的细胞，以及观察细胞或以任何方式与树突细胞相连的DMα蛋白质。
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