CN110272497A

CN110272497A - 一种高亲和力抗环瓜氨酸肽四价小分子抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110272497A
Application number: CN201910142977.XA
Authority: CN
Inventors: 李鸿斌; 王静; 任婷婷
Original assignee: Affiliated Hospital Of Inner Mongolia Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital Of Inner Mongolia Medical University
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN110272497B

Abstract

本发明涉及一种高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体。本发明证实了抗CCP抗体不仅仅是RA诊断的血清学标志，在RA的发病机制中也有重要作用，为以瓜氨酸化抗原为靶向的RA靶向治疗提供了试验依据。本发明中以CCP表位为治疗靶点和切入点，研究内容涉及CCP可能参与RA发病机制的多个水平，可以较系统、全面的揭示抗CCP抗体的在RA致病机制的作用。本发明采用的抗CCP‑ScFv抗体的肽链和P53构架的四聚体抗体都是完全人源化人源化序列，作用靶点于RA发病机制的起始和炎症慢性化过程，更具有针对性，不同于目前以拮抗RA发病机制下游下游炎症反应介质和炎症信号通路介质，靶点目标性更前缘，更为精准，具有较好技术成果转化潜力和向生物药品发展的前景。此外，本发明针对的抗CCP⁺RA与抗CCP^‑RA可能是RA两种不同的疾病亚型，可能会成为此类患者精准目标靶向治疗的新希望。

Description

一种高亲和力抗环瓜氨酸肽四价小分子抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及类风湿关节炎的诊断和治疗，具体涉及一种可用于诊断、治疗类风湿性关节炎的高亲和力抗环瓜氨酸肽四价小分子抗体。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性、进展性滑膜炎为主要病理改变的多器官系统受累的自身免疫性疾病。我国患病率0.32-0.38％，累计人口超过500万人，有较高的致残率和死亡率。80％患者在发病2年内即出现骨质破坏。抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体对于RA诊断的敏感性61.6-75.2％和特异性 94-99％，可在出现临床症状之前10年检出。近来越来越多的研究表明抗CCP抗体不仅仅是RA诊断的血清学标志，可能在RA的发病机制中也有重要作用。

在RA发病机制中,遗传－环境－免疫等多因素相互作用，是抗CCP抗体产生并向特异性自身免疫炎症过渡的重要中介缓解和免疫损伤介质。RA患者多携带HLA-DRB1*0401、*0404等等位基因型，其β链第 70-74位氨基酸存在一段共同序列，称为RA共同表位(SE)，是HLA-DRB1的抗原结合槽的主要构成序列。自身抗原可能通过分子模拟或模糊识别机制与该抗原结合槽结合，递呈给T细胞。Hill等研究证实肽链精氨酸转化为瓜氨酸后进一步增加了与HLA-DRB1SE的亲和力100倍，进而诱导T细胞成熟，辅助B细胞的分化和成熟，产生瓜氨酸蛋白抗体(Anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)。以瓜氨酸化纤维蛋白原免疫DR4-IE转基因鼠可产生关节炎。而非瓜氨酸化纤维蛋白原或免疫野生型C57BL/6则不能。HLA-DR B1基因多态性仅仅可解释约40-37％CCP+RA遗传背景，非编码HLA的基因影响更＜10％。编码参与肽翻译后瓜氨酸化修饰的酶PAD4的某些SNPs罕见基因型与RA的发生有关。2003年Suzuki等在对编码PADI的基因SNP 研究中发现，日本人染色体lp36上的NT2034367.1区域的4个PADl4基因的SNP外显子SNP(PADl4_89、 PADl4_90、PADl4_92、PADl4_104)单倍体型与RA易感性相关。在日本和韩国的后继报道中证实了上述结果。但在欧美裔人群却发现虽存在SNP多态性，却与RA易感性无关。

本研究小组前期工作也发现4个SNP外显子仅2个SNP(PADl4_89和PADl4_104)与RA易感性相关，携带 PADI4_89*G/A和PADI4_104*T/C少见等位基因者与常见基因型者相比发生RA风险率高3.37和2.67倍。与SE 相关性分析显示同时携带SE和任一个SNP少见基因型都大大增加发生RA的风险性，尤其PADl4_89和 PADl4_104(OR值分别为7.69和12.67)。这一点国内和其他亚裔报道一致，提示两者存在一定协同作用。同时我们还发现SE+、SE+/PADI4_89 G+和SE+/PADI4_90 T+等位基因型携带者血清CCP滴度显著性增高。吸烟和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)感染这两项环境因素均可造成携带SE的RA易感者初始炎症，导致含PAD4的细胞死亡或凋亡过程中钙离子内流，激活PAD4催化细胞内自身抗原瓜氨酸化并外溢，从而打破耐受。临床研究发现吸烟的RA患者骨关节破坏进展更快、更重，疾病活动性评分更高，关节外表现更常见(尤其肺受累、类风湿结节和心脑血管病风险)，对改变病情抗风湿药物(DMARDs)和肿瘤坏死因子拮抗剂(TNFi)治疗反应差，是提示预后不良的危险因素之一。这种影响在除非洲裔外的多种族研究中均证实仅见于CCP+RA，而且与HLA-DR B1 SE+。研究小组前期以噬菌体融合蛋白表达技术构建的抗人CCP单链抗体(CCP-ScFv)检测RA患者滑膜发现CCP表位在RA组与对照组表达率分别为76.9％和11.4％，有显著性差异，且和血清抗CCP抗体、HLA DRB1SE等位基因型和编码PAD的PADI4基因SNP 密切相关。由此可以形成一种推断，吸烟、感染等环境因素在特定遗传背景患者(HLADR B1等)造成局部非特异性天然免疫炎症反应，外周瓜氨酸化蛋白产生，结构和离子浓度改变，促成了自身抗原与 HLA-DRB1 SE的结合，可能是抗CCP抗体产生的导火索。

本研究小组在RA患者滑膜CCP表位的表达与滑膜病理和临床相关性研究中发现，CCP阳性表达RA组滑膜病理细胞增生、淋巴细胞聚集和弥漫性浸润更严重，与之对应病情活动性评分DAS28和炎症指标CRP 水平和血清IL-17水平更高。同时也发现血清和滑膜液中抗CCP水平也高于对照组，提示Th17细胞可能辅助活化B细胞，局部的抗原高表达会趋化更多的特异性抗体聚集，加重局部滑膜炎症。Alexei等在体外用瓜氨酸化修饰的软骨蛋白聚糖肽刺激(Cit-Agg)RA患者PBMCs，可诱导Th17活化增殖并分泌高水平的IL-17, 而使用未修饰的Agg刺激或用Cit-Agg刺激正常PBMCs则无明显应答，而且Th1/Th2相关细胞因子并无显著性变化。同时发现T细胞的增殖水平与血清抗CCP抗体滴度正相关。Fan LY等也发现与天然波形蛋白相比，瓜氨酸化的波形蛋白刺激RA滑膜成纤维细胞会产生更强的增殖反应，释放更多炎症细胞因子TNFα和 IL-17，和更高水平的表达PAD4和RANKL。Ulrike等发现抗突变型瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗体可以刺激破骨细胞增殖、释放TNFα，造成骨破坏。效应T细胞对瓜氨酸化抗原的识别也是受HLA-DRB1限制性的。

本研究小组前期研究发现滑膜CCP表位表达阳性的RA组患者外周血Th17细胞、Th17/Treg比值显著高于CCP表达阴性RA组。Th17相关细胞因子IL-6，IL-17a，IL-23，TNF-a水平也在CCP阳性表达组显著性增高，提示滑膜CCP表位的表达可能参与了Th17细胞的活化和增殖，并发现滑膜CCP表位阳性表达的RA患者血清和滑液抗体CCP水平较阴性组明显增高，至此，形成以抗CCP为免疫介质的RA发病机制环路假说：RA 遗传易感者在环境因素影响下瓜氨酸化自身抗原，使其空间构象表位发生改变，CCP是关键共同表位，与 SE的亲和力增加，递呈给自身免疫性Th17细胞，打破Th17/Treg调控平衡，不断活化局部炎症细胞、瓜氨酸自身抗原，释放更多的抗CCP抗体和炎症细胞因子，趋化更多炎症细胞，形成新的瓜氨酸自身抗原，周而复始，进而活化B细胞产生抗CCP抗体，产生免疫应答。该假说的证实有待于更直接和更多环节的研究去证实。

此外，缺乏高亲和力抗CCP抗体成为研究该抗体在RA发病机制中作用的“瓶颈”问题。

发明内容

本发明利用p53的四聚化结构域来来改造现有单价噬菌体ScFv抗体，构建四价小分子抗体(TeAb)，以增加单链抗体的分子量和抗原表位结合位点。p53原是一种肿瘤抑制基因，它编码的蛋白质是一种转录因子，在细胞的周期调控，细胞的增殖和分化中发挥了重要的作用。基因工程研究发现p53蛋白由五个功能结构域组成，分别是位于氨基端的转录活化结构域，富含脯氨酸的结构域，中间的DNA结合结构域 (DBD)，位于羧基端的四聚化结构域和一个调节结构域。其中的四聚化结构域是一段可以形成四聚体的自聚化序列，以人的IgG3铰链区部分序列为接头，连接于ScFv的羧基端，可以构建一个融合蛋白，进行原核表达，进而形成性能稳定的四链抗体，与其他多价抗体改造技术如链亲和素(Streptavidin)或亮氨酸拉链(Leucine zipper)等改造构建技术相比，其优越性所有序列都是人源化的，有利于体内治疗的应用。本发明在进行抗体的可溶性性表达和纯化后，通过大量体外和体内试验证明其能够作为封闭抗体，阻断抗CCP 抗体为免疫介质的RA发病机制环路，抑制RA的自身免疫炎症过程，为在生物制药开发奠定试验基础。

具体而言，本发明的第一目的在于提供一种高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体，所述抗体的序列选自：

TAACCATCAACCATAACATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGG ACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAG TCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCAGA CACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCATATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCCTGA ATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCCATCG GTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGTAGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCC CGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAGTGATGGA AACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTCTC TAACCGGGAGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACACAGGCCCTACA CTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGC AGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCTTTCATGCGG ATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAGATTCGCGGCCGCGAACGC TTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGGCAAAGAACCG GGCGAATtCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAC(SEQ ID NO:1)；和

CAACACACCACAACAATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCTG GATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTC ACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGA AGGGACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGA GTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCCGTGACCG CCGCAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCATATTACTATGACAGAAGTGGTTACTAC TTCCCTGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAG GGCCCATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGTAGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCA CTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCC ACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAA TTTATAAGGTCTCTAACCGGGAGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTG ATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTA GACACAGGCCCTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCGCGGCCGCAGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAA ACCTTTACCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCA GATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATG CGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAATTCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAGCTGCAC TGGCCCGAATCC(SEQ ID NO:2)。

本发明的第二目的是提供所述抗体的制备方法。该方法是将anti-CCP-ScFv-HAS-P53序列进行拼接，然后将所述拼接后的序列转入载体进行融合以及表达。具体而言，pET28(a)-anti-CCP ScFv-HAS-P53构建模式可参照图1所示，pET28(a)-anti-CCP ScFv-HAS-P53构建技术路线可参照图2所示。

为了实现最佳的表达效果，本发明优选表达所述可溶性抗体所采用的载体为pMBPc载体。

本发明通过对anti-CCP-ScFv单链可溶性噬菌体抗体进行p53构建的多倍体改造，将ScFv与自聚化结构相连，通过自聚化结构形成相应的多聚体结构。p53是具有调节细胞周期和抑制肿瘤生长能力的转录因子，其C末端第319-360位氨基酸为一段可形成四聚化结构域的基因片段，可形成α螺旋和β折叠，两个单体上的四聚化结构通过反向平行的方式结合形成二聚体，二聚体再以此为基础形成四聚体，其优点在于所有序列均为人源化较少出现排斥反应。本发明通过链接蛋白序列HSA将抗CCP ScFv与p53相连，给蛋白一定的弹性，一方面利于蛋白表达，另一方面消除p53及ScFv之间的空间阻碍防止p53对ScFv与CCP结合产生影响，最终构建了anti-CCP-ScFv-HSA-p53四价单链抗体，并通过筛选最优的表达载体，即pMBPc载体，最终获得可溶表达的四价抗体。

本发明进一步通过对所述可溶性抗体的特异性进行测定、采用间接免疫荧光法对所述可溶性抗体的离体活性进行测定、采用非竞争ELISA法对所述可溶性抗体的亲和力常数进行测定，证明所述可溶性抗体具有良好的亲和力和特异性。

本发明的第三目的在于提供一系列细胞及细胞因子抑制剂。具体而言：

本发明提供一种CCP抗体分泌性B细胞抑制剂，所述抑制剂包括本发明所述的可溶性抗体。

本发明提供一种辅助性T细胞17细胞和/或其细胞因子抑制剂，所述抑制剂包括本发明所述的可溶性抗体。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)是一种能够分泌白介素17(interleukin 17,IL-17)的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。Th17细胞能够分泌产生IL-17、IL-17、IL-1、IL-6 以及α肿瘤坏死因子(tumornecrosis factorα,TNF-α)等，这些细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞，从而有效地介导了组织的炎症反应。本发明优选所述辅助性T细胞17的细胞因子为IL-6、TNF-α以及 IL-17。

本发明提供一种滑膜成纤维细胞(FLS)抑制剂，所述抑制剂包括本发明所述的可溶性抗体。本发明优选所述抑制剂用于抑制滑膜成纤维细胞的增殖、滑膜成纤维细胞的迁移能力、滑膜成纤维细胞的侵蚀能力、滑膜成纤维细胞的炎症因子细胞的表达和/或释放、以及滑膜成纤维细胞相关金属蛋白酶的表达和/或释放。

本发明提供一种破骨细胞(OC)抑制剂，所述抑制剂包括本发明所述的可溶性抗体。本发明优选所述抑制剂用于抑制破骨细胞的转化、破骨细胞的迁移能力、破骨细胞的侵袭能力、以及破骨细胞的骨吸收能力。此外，本发明优选所述抑制剂用于抑制破骨细胞分化相关RANK、瓜氨酸化酶PAD2和/或瓜氨酸化酶PAD4的表达。

本发明的第四目的在于提供所述可溶性抗体在制备类风湿性关节炎诊断试剂中的应用。

由于抗CCP抗体对于RA诊断的敏感性61.6-75.2％和特异性94-99％，可在出现临床症状之前10年检出。高滴度抗CCP抗体阳性是关节痛患者发展为RA以及影响RA预后的独立危险因素。同时RA骨侵蚀关节破坏和RA关节外器官受累的独立危险因素。以人工合成的瓜氨酸化肽链为抗原的抗CCP抗体是RA诊断的高度特异性抗体，被列入了2010年ACR/Eular的RA分类诊断标准之中。因此，本发明提供的可溶性高亲和力抗 CCP抗体在类风湿性关节炎诊断中具有极强的应用价值。

本发明的第五目的在于提供所述可溶性抗体在制备预防或治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明通过大量实验发现，本发明提供的抗体可显著缓解类风湿性关节炎的临床症状，显著改善滑膜病理病理状态，显著降低滑膜炎症标志物水平，显著降低IL-6、TNFα、IL-17a以及VEGF等前炎症细胞因子的水平，显著降低Th17/Treg细胞比率，显著提升CD19⁺CD24^hiCD38^hiBreg百分比，显著降低CCP分泌性B细胞增殖和活化水平，在预防或治疗风湿性关节炎领域具有优异的应用前景。

本发明提供的技术方案取得了显著效果，并且具有极强的科学意义以及广阔的应用前景。具体而言，本发明以多项直接证据证实了抗CCP抗体不仅仅是RA诊断的血清学标志，在RA的发病机制中也有重要作用，为以瓜氨酸化抗原为靶向的RA靶向治疗提供了试验依据。本发明中以CCP表位为治疗靶点和切入点，研究内容涉及CCP可能参与RA发病机制的多个水平，可以较系统、全面的揭示抗CCP抗体的在RA致病机制的作用，证实以抗CCP为免疫介质的RA发病机制环路的假说。本发明采用的CCP-ScFv抗体的肽链和p53 都是完全人源化人源化序列，作用靶点于RA发病机制的起始和炎症慢性化过程，更具有针对性，不同于目前以拮抗RA发病机制下游炎症反应介质(IL-1、IL-6、IL-17、TNFα)和炎症信号通路介质如JAK、MERK，靶点目标性更前缘，更为精准，具有较好技术成果转化潜力和向生物药品发展的前景。本发明针对的抗 CCP+RA与抗CCP-RA可能是RA两种不同的疾病亚型，CCP+RA关节症状更重、影像学进展更快，关节外表现更为常见，前者约占RA总数的80％，本发明提供的可溶性抗体可能会成为此类患者精准目标靶向治疗的新希望。

附图说明

图1为pET28(a)-anti-CCP ScFv-HAS-P53构建模式图。

图2为pET28(a)-anti-CCP ScFv-HAS-P53构建技术路线图。

图3为Westen-Blot法鉴定anti-CCP scFv-HSA-p53融合蛋白分子量的结果示意图。

图4为非变性4％-30％梯度凝胶电泳鉴定anti-CCP ScFv-HAS-p53融合蛋白的结果示意图。

图5为可溶性抗体的特异性测定结果示意图。

图6为可溶性抗体活性测定结果示意图。

图7为可溶性抗体的亲和力常数测定结果示意图。

图8为不同处理组PBMCs培养上清液抗CCP抗体滴度的变化。

图9为CCP分泌性B细胞的FCM检测结果示意图。

图10为不同处理组的抗CCP抗体分泌性B数量的变化结果示意图。

图11为不同处理组的Th17细胞以及Treg细胞比率变化结果示意图。

图12为T细胞相关细胞因子检测结果示意图。

图13为100μg/ml抗体对不同PBMC+FLS共培养系统的FLS增值率的影响；*P＜0.05。

图14为RA-FLS细胞划痕试验迁移能力测定结果统计图。

图15为RA-FLS细胞Transwell小室迁移能力测定结果统计图。

图16为RA-FLS细胞侵袭能力测定结果统计图。

图17为抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS分泌金属蛋白酶的变化结果示意图。

图18为抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS分泌炎症细胞因子的变化示意图。

图19为抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS炎症细胞因子、金属蛋白酶的mRNA水平表达的变化。

图20为TRAP染色结果示意图。

图21为TeAb-anti-CCP-ScFv-P53vs Control组的OC融合指数的比较结果示意图。

图22为TeAb-anti-CCP-ScFv-P53vs Control组的OC平均视野骨片吸收陷窝形成形成数比较结果示意图。

图23为TeAb-anti-CCP-ScFv-P53vs Control组的电镜下OC平均视野骨片吸收陷窝形成面积百分比的比较结果示意图。

图24为破骨细胞分化相关RANK、NFATc1、c-Fos以及瓜氨酸化酶PAD2、4的mRNA表达水平示意图。

图25为不同处理组治疗前后关节炎大体比较结果示意图。

图26为不同处理组治疗前后关节炎AI指数和足垫厚度比较示意图。

图27为不同处理组病理损伤和CCP表位的表达情况示意图。

图28为不同治疗组滑膜炎症标志物的表达比较结果示意图。

图29为基因敲除鼠RA模型18F-FDG摄取、解剖定位及图像融合示意图。

图30为治疗前后18F-FDG标记滑膜炎症组间T/NT值的比较结果示意图。

图31为治疗前后组间⁹⁹mTc-3P4-RGD2标记的滑膜血管翳T/NT值的比较结果示意图。

图32为不同处理组治疗前后血清抗体、前炎症细胞因子和软骨转化标记物水平的比较结果示意图。

图33流式细胞术检测CD19⁺CD24^hiCD38^hiBreg细胞亚群结果示意图。

图34为治疗前后不同分组间CD19⁺CD24^hiCD38^hiBreg的变化结果示意图。

图35为治疗前后组间CCP分泌性B细胞绝对计数和CCP分泌性B细胞/CD19+B细胞比值的比较结果示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体

本实施例提供了基于人p53的高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体，其序列包括如下部分：

1、Anti-CCP ScFv-序列

前期研究已经在pHEN2噬菌体表达系统构建的抗-CCP ScFv抗体基因序列，具体为：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGA CCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGA GTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCA GACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCATATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCC TGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCC ATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGTAGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTC CCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAG TGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTAT AAGGTCTCTAACCGGGAGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTC ACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACAC AGGCCCTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC TTCGCGGCCGCACATCATCAT CACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGA TCTGAATGGGGCCGCATAG(SEQ ID NO：3)

其中黑体下划线标记及其后为原有系统所带标签基因，以利于纯化及检测，不是ScFv结构域，在后续克隆中标签基因除去，纯化利用空表达载体中的His-Tag及其他相关标签的亲和能力。)

2、P53四倍体结构域

具体为：KPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGLE(SEQ ID NO：4)

合成序列信息：

AATTCGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCT TTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAGATTCGCGG CCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGG GCAAAGAACCGGGCCTCGAG(SEQ ID NO：5)

3、链接蛋白序列HSA-linker

具体为：alevdetyvpkefnaetftfhadi(SEQ ID NO：6)

本段为连接Anti-CCP-ScFv与P53序列的连接肽，给蛋白一定的弹性，利于蛋白表达以及消除P53 及ScFv之间的空间阻碍，以防止P53对ScFv与CCP结合产生影响。

P53-tetra Domain：kkkpldgeyftlqirgrerfemfrelnealelkdaqagkepgle(SEQ IDNO：7)

合成序列信息：

GAATTCGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTA CCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAGATTCGCG GCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGG CAAAGAACCGGGCCTCGAG(SEQ ID NO：8)

合成的序列中N端加入EcoRI酶切位点，C端加入XhoI酶切位点。合成后测序结果与预期一致，可以通过OverlapPCR将此片段连接并插入表达载体或将本段序列插入表达载体构建新载体后插入待表达单体片段。

4、高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体序列可以为：

TAACCATCAACCATAACATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAA TCTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCC TGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGC AGTCCCCAGGGAAGGGACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTAC AACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCT GAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCAT ATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCCTGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCC TGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCCATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGT AGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCC GGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAGTGATGGAAACACCTACTTGA ATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTCTCTAACCGGG AGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATC AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACACAGGCCCTA CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCG CGGCCGCAGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTT ACCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAG ATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGA TGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAATtCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAC (SEQ ID NO：1)；或

TAACCATCAACCATAACATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAA TCTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCC TGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGC AGTCCCCAGGGAAGGGACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTAC AACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCT GAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCAT ATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCCTGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCC TGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCCATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGT AGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCC GGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAGTGATGGAAACACCTACTTGA ATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTCTCTAACCGGG AGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATC AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACACAGGCCCTA CACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCG CGGCCGCAGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTT ACCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAG ATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGA TGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAATtCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAC

(SEQ ID NO：2)。

实施例2：高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体的制备

本实施例提供了高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体的具体制备方法， pET28(a)-anti-CCP ScFv-HAS-P53构建模式可参照图1所示，pET28(a)-anti-CCPScFv-HAS-P53构建技术路线可参照图2所示；该方法包括如下具体步骤：

1)提取pHEN2-anti-CCP ScFv噬菌体质粒DNA(Promega，A1330)并扩增，引入酶切位点；

2)酶切并将Anti-CCP ScFv-序列、链接蛋白序列HSA-linker以及P53四倍体结构域进行连接；

3)连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a；

4)提取菌落质粒DNA，PCR扩增并NcoI和EcoRI双酶切PAGE-SDS电泳鉴定和测序鉴定；

5)四价抗体的诱导表达和纯化，包括如下具体步骤：小量IPTG诱导优化表达条件的选择；可溶性表达定位分析；Ni²⁺-NTA-Agarose亲和柱(Qiagen)纯化融合蛋白；

6)包涵体复性；

7)anti-CCP scFv-HSA-p53-TeAb的鉴定，包括：

Westen-Blot法融合蛋白蛋白分子量鉴定：表达样品20μl进行SDS-PAGE凝胶电泳，150mA 1.5h电干转至硝酸纤维素膜，封闭后加入加入鼠抗6×His单克隆抗体4℃孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，显色并曝光，包涵体提取物在蛋白分子量40kD可见浓集条带，表明蛋白正确表达，结果如图3所示(图3中，泳道1代表可溶性anti-CCP ScFv-HAS-p53-TeAb融合蛋白，泳道2代表可溶性anti-CCP ScFv融合蛋白)；

非变性4％-30％梯度凝胶电泳鉴定anti-CCP ScFv-HAS-p53融合蛋白：结果如图4所示(图4中，泳道1、 2代表层析纯化的可溶性抗CCP ScFv-抗体，泳道3、4代表层析纯化的可溶性抗-CCP ScFv-p53-TeAb)，在分子量大小160kD处显示一条电泳浓集条带，说明复性后的蛋白可聚合形成了四聚体结构。

以上各步骤的具体操作参见本领域的常规操作方法。

本发明在对pET28(a)-anti-CCP scFv-HSA-p53-TeAb进行可溶性表达后，发现存在以下问题：1)表达量较小，包涵体提取物复性后蛋白表达量难以完成后续研究需求；2)亲和力解离常数KD仅仅0.14，低于预期要求。本发明通过大量实践和尝试后发现，将目标片段插入pMBPc载体后，可以成功融合，且胞内可溶，获得可溶最终产物，因此，本发明选择采用pMBPc-ScFv-P53系统作为工艺开发和以后放量的系统，并进行了Ni层析柱纯化。相比较而言，如将目标片段插入pET28A、pET22K、pAD22K、pETGST、pMBPp 等常见载体后，无法获得可溶的最终产品。

2、抗体的可溶性表达

本发明将拼接后的anti-CCP-ScFv-HAS-p53序列转入pMBPc载体进行融合以及表达，具体步骤包括：

1)重叠PCR，将两个片段Anti-CCP-ScFv(下简称ScFv)和HSA-p53(下简称p53)通过PCR手段体外连接后直接插入pMBPc载体中；

2)菌落PCR和测序鉴定插入结果；

3)anti-CCP-ScFv-HSA-p53四聚体分泌型表达的载体克隆的构建。

以上各步骤的具体操作参见本领域的常规操作方法。

3、可溶性抗体的特异性、活性以及亲和力测定

本发明对上述构建的可溶表达的四价抗体进行特异性、活性以及亲和力测定。

1)可溶性抗体特异性测定

本发明以CCPⅡ(Euro-Diagnostica)和对照抗原底物SSA、SSB、Sm、snRNP抗原(AESKULISA) 和RF(DIAGNOSTIC AUTOMATION，2550Z)为底物，采用ELISA法对可溶性抗体的特异性进行测定。

可溶性anti-CCP-ScFv-HSA-P53抗体的特异性结果如图5所示。

2)可溶性抗体活性测定

本发明以APF和AKA底物片为抗原、采用间接免疫荧光法对可溶性抗体的活性进行测定。

可溶性anti-CCP-ScFv-HSA-P53抗体活性结果如图6所示。可溶性抗体对人和大鼠来源的CCP表位具有亲和力，即提示构建的可溶性CCP-ScFv具有活性。

3)可溶性抗体亲和力常数测定

本发明采用非竞争ELISA法对可溶性抗体的亲和力常数进行测定。

可溶性anti-CCP-ScFv-HSA-P53抗体的亲和力常数结果如图7所示，其中，A、B、C表示CCP包被量分别是5μg/ml，2.5μg/ml和1.25μg/ml的曲线，亲和常数为Ka≌8.19×10¹¹M-1，亲和力批次间差异范围可以控制在5.39×10¹⁰-8.19×10¹¹M^-1。

实施例3：分泌性B淋巴细胞检测

本实施例对高活动疾病活动的RA患者外周血单个核细胞(PBMC)进行体外培养，从而检测实施例1提供的抗CCP抗体(SEQ ID NO:2)对CCP抗原刺激的分泌CCP抗体B淋巴细胞的数量和功能。

1、实验原料及方法

(1)实验原料：5例行关节镜滑膜切除术或手术置换手术关节滑膜的类风湿关节炎患者，均符合1987 年ACR RA分类诊断标准，DAS28评分≥3.2，压痛关节数≥8/68，肿胀关节数≥6/68，hsCRP≥10mg/dl，年龄35-55岁,平均55.40±6.06岁,均为女性,5例外伤和骨关节炎关节置换女性患者，年龄56.0±8.70岁，签署知情同意书，并于伦理委员会备案，同时留取外周血和滑膜标本。

(2)外周血单个核细胞的分离、培养和传代：取上述供者外周血10ml，ACD抗凝剂以容积比1:9抗凝处理，分入其中已经加入10ml淋巴细胞分离液(Sigma)的5支50ml离心管中，将离心管置入水平离心机中，2000rpm离心20min，取云雾状第二层细胞加入3倍体积的PBS(含10％FBS)，1000rpm离心洗涤10min×2次，加入1640培养基(含10％FBS)重悬细胞后将细胞接种于培养皿中，于37℃，5％ CO₂孵育箱培养。24小时后接种于已预包被瓜氨酸化修饰的抗原肽CCP(序列 HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，96％纯度，Invitrogen公司协助合成)的96孔培养板，接种密度为 2×10⁶/ml。

(3)刺激抗原包被96孔培养板：以D-PBS(含0.6％柠檬酸钠、0.1％BSA)溶解CCP，终浓度10μg/ml，以50μl/孔包被96孔培养板(Minipore)，4℃过夜。然后用D-PBS封闭液(2％BSA)4℃下1小时，然后用含有0.1％体积比Tween20的D-PBS洗涤。

(4)实验分组：5例RA患者和正常对照组PBMCs，根据下表1分组，均设置复孔。

表1：处理分组情况

处理	RA组	NC组
			Tre-Ab 25μg/ml	Tre-Ab 25-RA	Tre-Ab 25-NC
Tre-Ab 50μg/ml	Tre-Ab 50-RA	Tre-Ab 50-NC
			Tre-Ab 100μg/ml	Tre-Ab 100-RA	Tre-Ab 100-NC
Tre-Ab200μg/ml	Tre-Ab 200-RA	Tre-Ab 200-NC
			空白对照(等量培养基)	Control-RA	Control-NC

2、培养上清抗CCP抗体的检测

每2天更换半量培养基1次，同时按照实验分组给予加入相应终浓度的TeAb-CCP-ScFv抗体处理, 同时予以0.5μg/ml LPS(Sigma-Aldrich)刺激细胞生长。分别于d3、d5、d7、d9、d13留取上清和细胞，采用抗CCPII抗体试剂盒(EUROIMMUNO)ELISA法检查，操作按照试剂盒说明进行。

检测结果如图8所示。对照组CCP刺激及不同剂量梯度的TeAb-CCP-ScFv抗体处理并没有改变刺激PBMCs CCP抗体的产生。而在RA的PBMCs中，CCP刺激(Control-RA)，随着时间推移，上清液 CCP抗体的滴度也在增加，并在9天达到平台期。而Tre-Ab 25、50μg/ml的处理并没有显著抑制抑制抗 CCP抗体的生成，而Tre-Ab 100、200μg/ml的处理在第7天后，显著性抑制了CCP抗体的滴度，但100 和200μg/ml两个梯度组间7天后并没有显著性差异。

3、可溶性抗CCP抗体分泌性BB淋巴细胞的数量检测

(1)CCP四聚体抗原底物制备

由北京旷博生物技术公司协助合成CCP抗原四聚体，由R-藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(SA) 核心和四个相同的生物素化肽组成，参照文献(Taylor JJ,Martinez RJ,Titcombe PJ,et al.Deletion and anergy of polyclonal B cells specific forubiquitous membrane-bound self-antigen.J Exp Med.2012.209(11): 2065-77)制备四聚体。将生物素化的肽与SA-PE(Prozyme)以10:1的摩尔比孵育。使用100-kD分子量的Amicon Ultra过滤器(Millipore)纯化四聚体。通过Nanodrop(Thermo Fischer)测量PE的浓度之后，用确定的SA与PE的比率计算四聚体的摩尔浓度。将生物素化的CCP肽与预先缀合到Alexa Flour 647 (Molecular Probes，Invitrogen)的SA-PE一起孵育来制备诱饵四聚体备用。

(2)抗CCP抗体分泌性B淋巴细胞的FCM检测

不同时段和处理组的PBMCs计数后，在含有Fc封闭溶液(FcR Blocker MiltenyiBio-tec)的缓冲液中用CCP四聚体染色，通过磁化LS柱(Miltenyi Biotec)以富集四聚体结合细胞。用APC-H7标记的抗 CD3(SK7)，APC-H7标记的抗CD14APC-H7标记的抗CD16(3G8)，BV421标记的抗CD19 (HIB19)，V500-C标记的抗CD20(L27)，PE-Cy7标记的抗CD27(M-T271)和FITC标记的抗IgD(IA6-2， BD)进行FCM检测。使用含有1mM EDTA和0.5％BSA的PBS的MACS缓冲液进行所有的温育和洗涤步骤。4色激光(405nm，488nm，561nm和640nm)LSR Fortessa(BD Biosciences)进行流式细胞术，并用FlowJo软件(Tree Star)分析。使用荧光Accu Check计数珠(Invitrogen)计算柱结合和流过悬浮液中的活淋巴细胞的总数。四聚体染色的门控基于前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)淋巴细胞设门并除去双峰，然后CD3，CD14和CD16，获得聚焦于抗CCP分泌阳性的B细胞的子集，结果如图9所示。

(3)结果

不同处理组的抗CCP抗体分泌性B细胞数量的变化结果如图10所示。在正常对照组，罕见有抗CCP 抗体分泌性B细胞存在。而RA患者PBMCs受包被抗原刺激后，7-13天可到平台期(Control-RA组)。 Tre-Ab 25μg/ml、50μg/ml的处理在d11与对照组有显著性差异，但这种显著性抑制作用没有维持到d13。而Tre-Ab 100、200μg/ml的处理在第7天后，显著性抑制了CCP抗体分泌性B细胞的数量，而且100 和200μg/ml两个梯度组间在各个时间点的比较均没有显著性差异。

实施例4：T细胞及其相关因子检测

本实施例通过对Th17、Treg细胞数量检测以及相关细胞因子的检测，考察了实施例1提供的可溶性抗体(SEQ ID NO:2)对T细胞活化的抑制作用。

1、Th17、Treg细胞FCM检测

采用实施例2提供的实验原料，调节培养细胞密度5×10⁶/L备用。

(1)Th17细胞染色：取PBMC稀释液1mL于24孔板中，加入10ng/μl佛波酯5μl(终浓度50ng/mL)， 100ng/μl离子霉素10μl(终浓度1000ng/mL)，250ng/μl莫能霉素2μl(终浓度500ng/mL)，置于5％CO₂孵箱中 37℃孵育5h。刺激后细胞离心洗涤，1％FBS/PBS重悬，分为试验管和同型对照管两管，调节每管 3-5×10⁵/100μl。分别加入CD3-FITC和CD8 PerCP-Cy5.5各20μl，轻柔震荡混匀，室温避光孵育30min进行细胞表面染色；细胞打孔参照Fixation and Permeabilization试剂盒说明操作。试验管中加入PE-IL-17A 20μl，同型对照管加PE Mouse IgG1 20μl同型对照，室温避光孵育30min；洗涤沉淀细胞后2小时内上机检测。

(2)调节性T细胞Treg细胞染色：未刺激细胞分为试验管和同型对照管各5×10⁵/100μl。两支管中各加入5μlCD4-FITC和20μLCD25-PE，混匀，室温避光15-30分钟。细胞固定、打孔参照期Fixation/Permeabilization Solution Kit说明操作，试验管和同型对照管各加入2μL正常大鼠血清，避光孵育15分钟，两管分别加入5μl Foxp3-APC标记的抗体和5μl rat IgG2a同型对照，混匀放室温避光孵育60分钟，洗涤沉淀细胞后1小时内上机检测。FACS Calibur流式细胞分析仪检测，分别以CD3⁺CD8细胞和CD4⁺细胞设门，配置各荧光通道间的补偿，BD Cell Quest软件计算CD3⁺CD8^-IL17⁺T/CD3⁺CD8^-T细胞及CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺/CD4⁺细胞的比率。

(3)结果

检测如图11所示，其中图11A代表不同处理组间的CD3+CD8-IL17+T/CD3+CD8-TTh17细胞比率的变化，图11B代表不同处理组间的CD4+CD25+FoxP3+/CD4+细胞比率的变化。由图11A结果可知，R组各时段正常对照对照组间比较，CD3+CD8-IL17+T/CD3+CD8-TTh17细胞比率均明显高于正常对照组；Tre-Ab 100、200μg/ml的处理在第7天后，100和200μg/ml两个梯度组间显著性抑制了Th17细胞比率的增长，而且100 和200μg/ml两个梯度组间在各个时间点的比较均没有显著性差异。由图11B结果可知，RA组与正常对照对照组间(Control-RA vs Control-NC)，不同Tre-Ab-CCP-ScFv处理梯度组间、不同处理梯度的RA与正常对照组间，Treg细胞比率均无显著性差异。

2、Th17、Treg细胞相关细胞因子的检测

(1)上清液IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和TGF-β细胞因子水平测定：使用Luminex200多功能流式荧光点阵仪以Luminex Performance Assay，Cytokine Panel试剂盒，液相蛋白芯片集约化检测培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-17、TNFα以及TGFβ，实验步骤遵照试剂盒说明书。

对照组与TeAb-CCP组处理方法同前。先用每孔加100μL的洗涤缓冲液润湿滤板；真空吸板机吸取所有的液体，放置在干净的滤纸上完全吸去所有缓冲液；用样品稀释液按1：100稀释待测培养上清；用样品稀释液稀释标准品，并按1：3进行梯度稀释；在检测孔中分别加入微珠混合液(含有待测蛋白的单克隆抗体)、待测标准品或待测培养上清(每组5株)，每孔均做复孔；同时加三孔只含有微珠混合液者作为空白对照；用粘性锡纸将检测板封闭，水平状态摇晃孵育3h(避光、室温、500rpm)；用洗涤缓冲液洗涤滤板3次；用抗体稀释液稀释biotin标记的二抗，配成二抗混合液，每孔加入100μL，用粘性锡纸将检测板封闭，水平状态摇晃孵育1h(避光、室温、500rpm)；再用洗涤缓冲液洗涤滤板3次；加入streptavidin-PE荧光素微珠球，密闭避光后水平状态摇晃孵育(避光、室温、500rpm)30min；洗涤滤板3次后，每孔加100μL洗涤缓冲液重悬，用粘性锡纸将检测板封闭，水平状态摇晃孵育5min (避光、室温、500rpm)；使用Luminex 200多功能流式荧光点阵仪分析样品。

(2)上清液IL-23细胞因子水平测定：选用ELISA法，按照Abcam公司IL-23ELISAkit试剂盒操作说明进行。将标准品溶于2.0mL校准稀释液中，制备原液。将原液用合适的稀释液倍比稀释成8个梯度，浓度分别为1500pg/mL，750pg/mL，375pg/mL，188pg/mL，93.8pg/mL，46.9pg/mL，23.4pg/mL， 0pg/mL(为稀释液)。设8个标准品孔和其所对应的空白对照孔，每个样品设三个重复。在酶标板的每个待测样品孔中先加入50μL稀释液，然后再加入50μL的标准品、对照及待测样品，混匀。用封板膜封板后置室温孵育2小时。将25mL的洗涤液用蒸馏水稀释成625mL。弃去每孔液体后加满洗涤液400 μL，静置30秒后甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用新封板膜封住反应孔。重复孵育、洗涤操作同前。每孔加入底物溶液100μL(显色剂A和显色剂B 1:1的混合液)，室温避光显色30分钟。每孔加终止液100μL，轻轻敲击酶标板使其充分混匀，终止反应(此时蓝色立转黄色)。加终止液后30分钟以内，酶标检测仪测定波长为450nm，减去波长为570nm作为校正，测定各孔吸光度(OD值)。绘制标准曲线，计算上清液IL-23水平。

(3)结果

上清液IL-1β、IL-6、IL-17α、TNFα、TGFβ以及IL-23水平测定结果如图12所示。对以上各细胞因子水平的测定结果进行分析可知，RA与正常对照组PBMC培养细胞上清液中，Treg相关细胞因子TGFβ、 IL-23组间并没有显著性差异，不同处理组间也未发现明显变化。相反，Th17相关细胞因子，RA组显著性高于正常对照组(Control-RA vs Control-NC)，但对于TeAb-CCP-ScFv抗体的处理反应却不同，IL-1β 并没有在不同梯度TeAb-CCP-ScFv抗体的处理后出现减低。而≥50μg/ml浓度的TeAb-CCP-ScFv抗体的处理后，第7～9天后会显著性减低培养上清中的IL-6、TNFα和IL-17a的水平。

实施例5：滑膜成纤维细胞(FLS)及细胞因子检测

本实施例通过体外模拟体内免疫细胞的相互作用，以证实利用实施例1提供的可溶性抗体(SEQ ID NO:2)阻断T、B淋巴细胞、滑膜成纤维细胞表面的CCP表位后，是否可以减轻FLS的增殖、迁移、侵蚀能力、炎症因子和金属蛋白酶的释放，是否减轻其辅助活化的破骨细胞的活化和破骨功能。

1、滑膜FLS的分离培养及鉴定

关节镜及手术活检取材于5例活动性RA关节滑膜(符合1987年ACR RA分类诊断标准，DAS28 评分≥3.2，压痛关节数≥8/68，肿胀关节数≥6/68，hsCRP≥10mg/dl)，年龄35-55岁,45.9±10.8岁,均为女性, 和5例对照组来自外伤和骨关节炎关节置换患者滑膜。

(1)滑膜成纤维细胞的分离、培养

无菌获取滑膜组织，尽量剔除脂肪及纤维组织；PBS清洗2-3遍，用无菌手术剪刀反复剪切成约 1mm×1mm×1mm的碎块；用2-3倍体积0.5mg/ml的胶原酶I或胶原酶II，37℃，消化2小时；经200目纱网过滤后，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，分装于培养瓶(25cm)中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养；当FLS梭形生长≥50％或接近成片后，弃去上清液，更换新鲜培养液。待FLS≥80％或成片时，0.25％-EDTA胰酶消化传代并用于试验(3～5代细胞)。

(2)滑膜成纤维细胞的鉴定

倒置显微镜镜下暗场滤片观察所培养的FLS形态均一、呈梭形，大小相似且无其他类型的细胞；取 1-3代FLS，用0.25％-EDTA胰酶缓慢消化后，PBS洗涤2次；分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、 CD4、CD8、CD19、CD14和PE标记的小鼠抗人CD11c，避光、4℃放置20min；PBS洗涤2次后，重悬在300μlPBS缓冲液中，流式细胞仪测定所培养FLS中各类阳性细胞比例。

(3)外周血单个核细胞的培养：外周PBMC分离、培养同前。

(4)复合培养体系的构建使用复合培养板(Thermo Fisher Scientific)孔径大小为0.4μm，首先将培养好的RA滑膜成纤维细胞及正常成纤维细胞传代接种于复合培养板下层中，待成纤维细胞生长融合至70％-80％左右时进行无血清培养基处理18小时左右，分离外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞置于复合培养板上层。

2、不同浓度的TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对FLS、PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS增值率的变化

将传代培养处理后的5株滑膜成纤维细胞以相同的密度接种于96孔板，接种密度为0.5×10³/孔，并设置空白对照。将接种好的96孔板置于细胞培养箱中培养，每2d换液1次，同时按照实验分组给予实验组外周血单个核细胞培养上清相应处理，第二天后于每天固定时间选择培养板，加入MTT液 20ul，于细胞培养箱中孵育4h后，弃上清，每孔各加入150ulDMSO，酶标仪中震荡10分钟。在酶标仪操作面板上选择490nm波长测定吸光值。增殖抑制率计算公式：(1-处理组OD值/对照组OD 值)x100％＝处理后抑制率。

(1)25、50、100、200μl/ml四个浓度梯度TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对单独RAFLS、PBMC+FLS 共培养系统培养处理后，发现单独FLS培养液中给予TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体并未对增殖有明显影响，但在PBMC+FLS共培养系统中，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS增值率明显被抑制，与空白对照组促进增殖相比，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对FLS增值率，第7天有显著性的抑制作用，100、200μl/ml组显著性高于25μl/ml组、空白对照组(分别P＜0.05，P＜0.001)，但100、 200μl/ml组间并无显著性差异。因此此后试验均选择100μl/ml作为用药浓度标准。

实验分组：基于以上FLS增值率研究结果，复合培养体系中，隔日更换培养液中加入100μg/ml的 TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体或等量空白培养液，以此分为TeAb-CCP组和Control组，共同孵育培养7天后，取下层的培养上清液进行后续相关研究和评价。

(2)PBMC+FLS共培养系统的四种组合：Group A：PBMC-Con+FLS-Con；Group B：PBMC-Con+FLS-RA；Group C：PBMC-RA+FLS-Con；Group D：PBMC-RA+FLS-RA。均给予共培养系统中100μl/ml TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体处理每2天一次，同时设立空白对照组处理(Control处理组)， MMT法检测FLS细胞的增殖率。每种均设立5个复孔。

结果如图13所示。由图13结果可知，100μg/ml TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体可以显著性抑制RA患者 PBMC促进的对照组和RA患者的FLS增殖，同时也发现RA患者PBMC与RA患者FLS共培养，其增殖水平要显著性高于其他三种组合。

3、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS迁移能力的变化

划痕试验：先用marker笔在在96孔板底的背部，用直尺画横线，在96孔板内铺明胶；准备RA FLS细胞(Control组与TeAb-CCP组处理7d同前)，将细胞弃上清，用PBS洗涤，然后胰酶消化1min， 5mL DMEM重悬，将细胞接种到96孔板中，接种密度为4000/well。用10μl枪头尽量沿着孔板底部线条划痕，枪头要垂直，不能倾斜。划痕后立即换液，加入含1％FBS的DMED培养液；0h喷酒精擦掉96孔板底部线条，用倒置相差显微镜拍照划痕0h图片。放入37℃，5％CO₂培养箱，培养；24h 用倒置相差显微镜拍照划痕24h图片；将0h，24h拍照的图片，利用显微镜拍照程序测量划痕宽度，从划痕线条的上至下测量4处距离，取其平均值。利用公式计算：细胞迁移距离(d)＝划痕后24h宽度－初始0h划痕后宽度。算出0h和24h距离的差值。Control组迁移距离为375.4±9.384mm，而TaAb-CCP 处理组为216.6±23.03，差异有显著性(T＝6.39，P＜0.01)。迁移能力的变化结果如图14所示。

4、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS侵袭能力的变化

Transwell试验：胰酶消化生长状态良好的细胞(Control组与TeAb-CCP组处理7d同前)；离心去除上清，用无血清培养基重悬细胞(尽量将上清吸干净)；混匀细胞悬液，取少量悬液进行计数；24孔培养板中，每孔添加500uL培养基(含血清)；将聚碳酸酯微孔滤膜(polycarbonate membrane，微孔直径8μm)的Transwell小室放入24孔培养板中，形成上下两室，上室接种用无血清培养基重悬的细胞，接种数目一般为2×10⁴/well，下室已添加含血清的500uL培养基；放入细胞培养箱中培养；24小时后，取出Transwell小室，将小室转入空的24孔培养板中，形成上下两室，下室先加入500uL PBS(1 次)；吸去上小室内细胞悬液，用棉签擦去上层未迁移的细胞(棉签需拧松)；PBS(2次)洗1分钟 (下室内加500uLPBS，上室内加100uLPBS)；吸去PBS，用4％多聚甲醛固定15-20分钟，(下室内加500uL，上室内加100uL 4％多聚甲醛)；吸去多聚甲醛，PBS洗1分钟；吸去PBS，将小室倒置(膜朝上)，用0.1％结晶酯染色1分钟；自来水洗去染料，最后于倒置100倍显微镜下随机选取5个视野，拍照，计数，统计作图。

本研究中对空白治疗组(Control)与实验组(TeAb-CCP)100μg/ml TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体 qod×7d处理后的共孵育系统中的RA FLS细胞进行Transwell小室实验，每个组均为5个细胞株，24h后取随机5个视野，计数100倍视野下穿过基底膜的细胞数。结果如图15所示。Control组穿透细胞数878.6 ±27.32,而TeAb-CCP组240.2±34.89，差异有统计学意义(T＝14.41，P＜0.001)。

侵袭试验：Matrigal胶(BD)，在-20℃冰箱保存，使用前提前一天拿出放入4℃冰箱过夜解冻。用预冷的(4℃)无菌无血清DMDM将Matrigel稀释成3.75mg/ml,冰上操作。聚碳酸酯微孔滤膜 (polycarbonate membrane，微孔直径8μm)的Transwell小室(Transwell小室,8.0μm孔径，6.5mm直径,BD司)放入24孔培养板中，形成上下两室,用预冷的枪头小心的将稀释好的Matrigel铺在上小室内，每孔加100uL，尽量避免气泡的生成，冰上操作；37℃培养箱，放置1小时，使其呈凝胶状；1小时之后，吸掉上清，上室接种用无血清培养基重悬的RA FLS细胞(Control组与TeAb-CCP组处理7d同前)，接种数目一般为2×10⁴/孔，下室每孔添加500uL培养基(含血清)；将细胞放置在37℃、5％的CO2 培养箱中继续培养48h；48小时后，取出Transwell小室，将小室转入空的24孔板中，形成上下两室，下室中先加入500uLPBS(1次)；吸去上小室内细胞悬液，用棉签擦去上层未迁移的细胞(棉签需拧松)；PBS(2次)洗1分钟(下室内加500uLPBS，上室内加100uLPBS)；吸去PBS，用4％多聚甲醛固定15-20分钟，(下室内加500uL，上室内加100uL4％多聚甲醛)；吸去多聚甲醛，PBS洗1分钟；吸去PBS，将小室倒置(膜朝上)，用0.1％结晶酯染色1分钟；自来水洗去染料，最后于倒置100倍显微镜下随机选取5个视野，拍照，计数，统计作图。48h后取随机5个视野，计数100倍视野下穿过人工基底膜的细胞数。结果如图16所示。Control组322.4±37.7，而TeAb-CCP组穿过人工基底膜的平均细胞数为140.4±19.83，两者有显著性差异(T＝4.272，P＜0.001)。

5、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS分泌金属蛋白酶的变化

使用Luminex 200多功能流式荧光点阵仪以Luminex Performance Assay，MMPPanel试剂盒，液相蛋白芯片集约化检测培养上清液中MMP-1,MMP-3,TIMP-2。实验步骤遵照试剂盒说明书。

结果如图17所示。由结果可知，Control组上清液MMP-1和MMP-3水平显著性高于TeAb-CCP组(分别为3189.1±206.25vs 2211.52±217.65pg/ml；5489.12±261.07vs4550.48±282.23)，差异均有统计学意义(分别T＝3.26，P＜0.,01；T＝2.44，P＝0.03)，而Control组上清液TIMP-2水平则显著低于TeAb-CCP组(433.7±27.88 vs 558.1±38.11)，差异有显著性(T＝＝2.64，P＝0.02)。提示TeAb-CCP抗体的处理显著地上调了TIMP-2水平，并抑制了基质金属蛋白酶的活化。

6、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS分泌炎症细胞因子的变化

使用Luminex 200多功能流式荧光点阵仪以Luminex Performance Assay，Cytokine Panel试剂盒，液相蛋白芯片集约化检测培养上清液中IL-1α,IL-6,IL-10,IL-17,TNFα,VEGF,FGF,TGFβ,CXCL8/IL8。实验步骤遵照试剂盒说明书。Control组与TeAb-CCP组处理方法同前。

培养上清液细胞外肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(extracellular peptidylargininedeiminase4，PAD4)、 RANKL水平测定，选用ELISA法，按照人PAD4ELISA试剂盒(LifeSpanBioSciences，LS-F7962-1)、人PAD2ELISA试剂盒(LifeSpan BioSciences，LS-F9601)、人RANKL ELISA试剂盒(Bosterbio，EK0842)、抗人环瓜氨酸肽II抗体试剂盒(Euro Immuno)操作说明进行检测。

结果图18所示。与空白处理Control组相比，共孵育系统上清液中，IL-6水平(168.7±17.6pg/ml vs 320.9 ±24.1pg/ml，T＝5.10P＜0.01)、CXXL-8/IL-8水平(332.4±35.0pg/ml vs 644.8±50.6pg/ml，T＝5.08P＜ 0.01)、RANKL水平(2.12±0.22μg/ml vs3.17±0.27μg/ml，T＝2.99P＜0.01)、PAD4水平(4.05±0.41μg/ml vs 5.42±0.36μg/ml，T＝2.51P＝0.02)、PAD2水平(24.70±2.53μg/ml vs 32.82±2.43μg/ml，T＝2.31P＝0.03)、抗CCPII抗体滴度(24.76±2.33IU/ml vs 33.54±2.15IU/ml，T＝2.77P＝0.013)、明显减低，而TGF-β水平显著性升高(70.88±8.70pg/ml vs 112.70±8.39pg/ml，T＝3.46P＜0.01)。

7、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS炎症细胞因子、金属蛋白酶的mRNA水平表达的变化

根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本的待测基因(Gene x)的相对表达量：

Gene X(％)＝2^{(Gene X Ct–GAPDH x Ct)-(Gene control Ct–GAPDH control Ct)}。

结果如图19所示所示。与空白处理Control组相比，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS细胞，在mRNA水平，IL-6、MMP-1、MMP-3、RANKL和PAD4水平被明显减低(分别0.68±0.11vs 1.00±0.02T＝8.076P<0.0001；0.65±0.33vs1.00±0.01T＝2.71P＝0.0143；0.74±0.22vs 0.95±0.15 T＝2.49P＝0.023；0.65±0.23vs 0.95±0.16T＝3.39P＜0.001；0.88±0.14vs 0.98±0.05T＝2.13P＝0.048)，而TGFβ 表达水平明显提高(1.23±0.09vs 1.00±0.03T＝8.08P<0.0001)。

实施例6：破骨细胞(OC)转化率和功能的检测

本实施例考察实施例1提供的抗体(SEQ ID NO:2)对PBMC+FLS共培养系统培养处理后对破骨细胞 (OC)诱导转化率和功能(迁移、侵袭、骨吸收)的影响。RA FLS和PBMCs共培养系培养条件和研究分组同前。共培养系第7-12天后的下层培养液上清0.5ml，与DMEM培养液混合，每两日更换一次上述破骨细胞诱导转化试验和骨片吸收陷窝试验的培养液，观察和比较两者的差异，判断 TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体是否产生了对RA PBMC-FLS-OC相互作用的影响。

1、破骨细胞诱导培养

(1)CD14阳性细胞分选：抽取抗CCP高滴度阳性RA供者外周血20mL(n＝5名)，ACD抗凝剂以容积比1:9抗凝处理，常规密度梯度离心分离PBMC，获得PBMC用D-Hanks液洗涤2次，细胞团以 10％胎牛血清的DMEM培养液(Dulbecco's Modified Eagle's medium，Sigma-Aldrich，D5546)吹打均匀，计数细胞。300g离心×10min，按照每10⁷细胞80μl CD14微磁珠分离试剂盒缓冲液重悬(Miltenyi Biotec no.130-091-376，挪威)，并添加20μl抗人CD14微磁珠(Miltenyi Biotec no.130-050-201，挪威)。4℃ 孵育15min，每10⁷细胞加2ml缓冲液，300g离心10min，吸取全部上清液。按每10⁸细胞/500μl缓冲液重悬细胞。MiniMACSTM分离机使用MS MACS分离柱(Miltenyi Biotec no.130-050-201，挪威)进行细胞分选，用DNase将结合在阳性选择细胞上的磁珠去除。取分选后重悬细胞，加入10μl CD14-FITC(Miltenyi Biotec，130-080-701),4℃暗场孵育10min后FCM检测验证。

(2)破骨细胞(Osteoclast，OC)诱导培养：每10⁶CD14阳性细胞以含25ng/ml重组人M-CSF(Peprotech 300-25)和5ng/ml RANKL(R&B 6449-TEC-010)的2.5ml DMEM培DMEM培养液6 孔板培养37℃，5％C0₂培养箱孵育。每48h一次置换培养基，每次更换一半培养基。

2、破骨细胞诱导转化率和活性鉴定

(1)抗酒石酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色鉴定OC诱导培养第12天倒去培养瓶中的上清液，不含胎牛血清的DMEM液反复冲洗，去除非黏附细胞。倒去培养瓶中的上清液，不含胎牛血清的DMEM液反复冲洗，去除非黏附细胞。0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA(上海博升)消化培养瓶内的细胞10min，倒置相差显微镜观察，待细胞变圆后，含10％胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶的作用,将消化下的细胞置入离心管洗涤。取出细胞爬片，置于37℃烘箱中烘烤5min。用2.5％戊二醛4℃固定10min后加入孵育液(六偶氮副品红0.2ml，0.1mol/L醋酸钠缓冲液38ml、奈酚AS-BI磷酸盐溶液2ml、酒石酸钾钠0.388g，pH5.0)37℃孵育40min。双蒸水洗涤3次，二甲苯透明，光镜观察。对每张玻片6个随机视野中的TRAP染色阳性OC(胞核需>3)进行计数。多核破骨细胞数与单核破骨细胞数的比值为融合指数R，破骨细胞融合指数抑制率为(R_control-R_TeAb-CCP)/R_control×100％。

(3)骨片吸收陷窝试验(Resorption pit assay，RPA)

骨片制备：将新鲜牛股骨中部洗净后用锯式切片机将皮质骨切成4mm×4mm大小的骨片，磨成厚度约50μm的薄片，将骨磨片浸入蒸馏水中，超声清洗3次，自然晾干，浸泡于75％的酒精2h，继之浸泡于含青霉素1000μg/ml、链霉索1000μg/ml的D-Hanks液中过夜，取出骨片，紫外灯下照射正反面各2h，最后置DMEM培养液中浸泡,置4℃冰箱备用。

骨片吸收陷窝试验：OC诱导培养第7天后在OC诱导培养空中加入骨片，于诱导28天后去除骨片， PBS洗去未贴壁细胞，2.5％戊二醛固定10min，0.25mol/L NH₄OH中超声清洗2min×3次，三蒸水中超声清洗2min，梯度酒精脱水，1％甲苯胺蓝染液室温染色20s，光镜(×100)下每张骨片随机选择6个视野，观察并记录平均视野骨吸收陷窝数目，同时计算抑制率，方法同前。

骨吸收陷窝面积的测定：骨吸收陷窝计数结束后，将破骨细胞爬片于0.25mmol/L氢氧化铵中再次超声清洗5min×3次，再以2.5％戊二醛固定，酒精梯度脱水(30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)，醋酸异戊酯置换酒精，二氧化碳临界点干燥，镀金，扫描电镜观察吸收陷窝形成情况，用Image pro plus5.0 计算机图像分析系统分析吸收陷窝面积占总面积的百分比，反映破骨细胞的骨吸收活性，同时计算抑制率，方法同前。

(3)结果

结果如图20所示。在OC诱导分化试验中，单个核细胞接种于培养基后3-4小时贴壁。隔日半量置换培养液(前述共培养系第7-12天后的下层培养液上清0.5ml，与DMEM培养液混合)。培养7天后，空白治疗 Control组圆形高透光性单个核细胞逐渐聚集在一起，聚集细胞密度2-10个不等，部分发生融合形成多核巨细胞。而TeAb-CCP组细胞融合慢而且明显减少，可散见圆形高透光性2-3单个核细胞逐渐聚集在一起，但细胞膜完整，未发生融合。

与空白处理Control组相比，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS细胞的共培养系统上清液，对OC分化有明显的抑制作用(TeAb-CCP vsControl组OC形成细胞融合指数0.36± 0.04vs 0.51±0.04，T＝2.54P＝0.021)，抑制率R＝29.11％，统计结果如图21所示。

与空白处理Control组相比，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后FLS细胞的共培养系统上清液，对OC侵蚀能力有明显的抑制作用，TeAb-CCPvs Control组的平均视野骨片吸收陷窝形成形成数分别为3.2±0.44vs 5.3±0.45，T＝3.33P＜0.01)，抑制率R＝39.62％，统计结果如图22所示。

电镜下TeAb-CCP vs Control组与空白治疗Control组的平均视野骨片吸收陷窝形成面积百分比分别为 23.56±1.73vs 31.63±2.46，T＝2.68P＝0.0153)，抑制率R＝25.51％，统计结果如图23所示。

3、TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后上清液对破骨细胞分化相关RANK、NFATc1、c-Fos以及瓜氨酸化酶PAD2、4的mRNA表达水平的影响

破骨细胞的分化依赖成骨细胞产生的细胞核因子kB受体活化因子配基(ReceptorActivator of Nuclear factor Kappa B Ligands,RANKL)与破骨细胞前体细胞膜上的细胞核因子kB受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B,RANK)相互作用活化的多种转录因子和信号通路调节。RANKL促进破骨细胞前体分化需要先后表达核因子-kB(Nuclear factor KappaB,NF-kB)、c-Fos、活化T细胞核因子 cl(Nuclear factorof activated T-cells,NFATcl),c-fos是NFATcl的上游调节因子,其与NFATcl共同调控破骨细胞的分化。为探讨TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后上清液对破骨细胞分化的可能机制和信号通路。引物设计使用Applied Biosystems的PrimeExoress软件，由Invigen 公司协助合成。RNA抽提、实时荧光定量RT-PCR检测方法同前。

结果如图24所示。与空白对照Control组相比，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体对PBMC+FLS共培养系统培养处理后的上清液对破骨细胞分化相关RANK的表达水平明显下调(0.75±0.089vs 1.02±0.047，T＝2.69， P＝0.015)，瓜氨酸化酶PAD2、PAD4的mRNA表达水平也均明显下调(0.90±0.03vs 1.04±0.02,T＝3.53，P＝0.002；0.89±0.028vs 0.98±0.013，,T＝2.89，P＝0.01)，而NFATc1、c-Fos mRNA表达水平的组间并无显著性差异。

实施例7：抗体对DNaseII^-/-IFN-IR^-/-双基因敲除RA鼠模型的治疗作用

本实施例考察了实施例1提供的抗体(SEQ ID NO:2)对DNaseII^-/-IFN-IR^-/-双基因敲除RA鼠模型的治疗作用。

在Cyagen公司技术平台的支持下，以CRISPR-Pro技术构建了Spragne-Dewley大鼠为基础鼠的 DNaseII^-/-IFN-IR^-/-双基因敲除RA鼠模型。

将6对DNaseII^-/-IFN-IR^-/-基因敲除鼠RA模型6周龄，体重180.75±8.96g(168-192g)，雌雄各自随机后分入可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体封闭组8只(BLK组)和空白对照组各4只(ConA组)，同时将4只无关节症状基础鼠也同时列入对照组观察(ConB)。BLK组：TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体剂量参照预实验予以1mg/50g，-20℃冷藏下TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体冻干粉剂平均生物活性半衰期为30.63+2.18天，目前尚没有进行TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体的血浆T1/2的测定，因此综合预实验结果予以首剂加倍2mg/50g，注射用水配置TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体浓度10mg/ml，每5天腹部皮下注射。对照鼠ConA组和ConB组予以同剂量注射用水，共5次注射。

基线和21d后，进行53四价功能域架构抗环瓜氨酸肽小分子抗体(CCP-TeAb)在体试验验证。具体检测项目及结果如下：

1、大体比较

(1)关节炎指数评分：根据关节红肿程度、范围及关节肿胀变形情况：关节炎症积分(Arthritis index,AI) 可分为：0分：无关节炎；1分：趾关节或踝关节或单个足垫局部红斑或轻微肿胀；2分：红斑及轻度肿胀从踝关节扩展到趾关节，足爪、足垫或踝关节两个区域以上的炎症；3分：红斑与中度肿胀从踝关节延伸至末端趾关节，轻度功能障碍；4分：整个足部包括踝关节及趾的严重红肿且不能负重，功能障碍。实验中主要观察双后足，关节炎指数积分越高，关节炎症状越重。

(2)足垫厚度测定：采用游标卡尺随机测量大鼠后足足垫的3个部位，每7天测量一次，取均值作为最终的足垫厚度。

(3)结果

不同处理组治疗前后关节炎大体比较结果如图25所示；其中，BLK：DNaseII-/-IFN-IR-/-基因敲除鼠RA 模型予以可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体封闭组；ConA：DNaseII-/-IFN-IR-/-基因敲除鼠RA模型予以予以同剂量无菌生理盐水的对照组组；ConB：无关节症状非基因敲除鼠予以同剂量无菌生理盐水组。

不同处理组治疗前后关节炎AI指数和足垫厚度比较结果如图26所示；其中，图26A为关节炎AI指数比较结果，图26B为足垫厚度比较结果。

由以上结果可知，治疗组在TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体治疗后21天，BLK组模型鼠关节肿胀均有一定程度缓解，AI指数和足垫厚度均有减低。

2、组织病理学比较

(1)关节病理损伤评分：切片常规HE染色，由两名病理科医生参照文献(Rooney M,Condell D, Quinlan W,et al.Analysis of the histologic variation of synovitisin rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum.1988. 31(8):956-63)的方法分别进行评分取均值计入相应评分项目。具体评分方法如表2所示。

表2：RA滑膜病理评分法

备注：*滑膜细胞增生：最大滑膜衬里层细胞深度；§纤维化：滑膜层纤维化的百分比；#滑膜血管翳：每高倍视野中血管的数量；血管周淋巴细胞浸润：淋巴细胞浸润的血管数目百分比同时要兼顾浸润程度。如果视野中无血管评分0，浸润程度分为3级：轻度血管周2-4细胞、中度血管周5-7细胞和重度血管周8-10细胞。浸润程度中度评分不变，若浸润程度为轻度和重度，分别下调和上调一级评分。▲局灶淋巴细胞聚集：在血管套袖区域淋巴细胞聚集浸润灶的淋巴细胞数目。Δ弥漫性淋巴细胞浸润：每个HPF下弥漫性淋巴细胞浸润百分比

(2)CCP表位表达情况：方法同前。仅将2抗改为1.0μg/ml HRP标记的IgG型兔抗6XHis-tag (Abcam，ab1187)，省去第3抗体，直接滑膜组织常规脱水、石蜡包埋、3μm连续切片。

具体包括如下步骤：脱蜡和水化，微波热修复抗原；3％H₂O₂滴加在组织切片上，室温静置10min； PBS洗涤5min×3次；滴加兔血清封闭液，室温20min；滴加抗CCP-ScFv单抗(本实验室自制)50μl， 37℃2h；PBS洗涤5min×3次；滴加1.0μg/ml HRP标记的IgG型兔抗6XHis-tag(Abcam，ab1187)50μl， 37℃1h；PBS洗涤5min×3次；滴加DAB显色液10min，PBS冲洗10min；苏木精复染2min，盐酸酒精分化；自来水冲洗10min；脱水、透明、封片、镜检。

(3)结果

BLK组与ConA组滑膜炎病理评分的比较结果如表3所示。

表3：BLK组与ConA组滑膜炎病理评分的比较

滑膜病理评分	ConA组	BLK组	T值	P值
					滑膜细胞增生	6.16±1.39	3.44±1.33	5.19	＜0.05
纤维化	3.46±1.38	3.78±1.30	0.60	＞0.05
					滑膜血管翳	6.27±1.51	5.67±1.50	1.05	＞0.05
血管周淋巴细胞浸润	3.86±1.53	4.78±1.86	1.50	＞0.05
					淋巴细胞聚集	5.50±1.70	3.78±1.09	2.86	＜0.05
弥漫性淋巴细胞浸润	7.37±1.83	3.33±1.66	5.92	＜0.05

不同处理组病理损伤和CCP表位的表达情况如图27所示。

由以上结果可知，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体治疗组(BLK)较空白治疗组滑膜病理有显著改善。两组间CCP抗原表位表达并无明显差异。

3、不同治疗组滑膜炎症标志物的表达比较

(1)滑膜组织炎症因子TNFα、软骨骨转化标记物CTX-I的表达水平的免疫组化检测

具体方法为：脱蜡和水化，脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟， (软骨骨转化标记物CTX-I的表达水平检测切片不经过脱钙，由Leica硬组织切片机直接切片)；a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟，无水乙醇中浸泡五分钟，95％乙醇中浸泡五分钟，75％乙醇中浸泡五分钟；没消化法进行抗原修复，0.1％胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟；免疫组化染色SP法：脱蜡、水化，PBS洗2-3次各5分钟，3％H2O2(80％甲醇)滴加在TMA 上，室温静置10分钟，PBS洗2-3次各5分钟，抗原修复，PBS洗2-3次各5分钟，滴加正常兔血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时(兔抗鼠 TNFαIgGH/L型单抗Abcam ab6671/兔抗鼠CYP27A1IgG型单抗Abcam ab126785)，4℃过夜后需在37℃复温45分钟，PBS洗3次每次2分钟，滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时(HRP标记的羊抗兔Abcam ab6721)，Ⅱ抗中加入0.05％的tween-20，PBS洗3次各5分钟，DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗10分钟，苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15分钟，脱水、透明、封片、镜检。

(2)滑膜组织血管滑膜翳新生标记物(VEGF、HIF-α)、破骨细胞活化标记物(RANKL、CD115/ CSF1R)的表达水平的间接免疫荧光法检测

具体方法为：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度；滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS稀释的I抗体(稀释比例参照试剂盒说明兔抗鼠VEGF IgG抗体Abam ab52917/兔抗鼠HIF-1IgG抗体Abcam ab16066/兔抗鼠RANKLIgG抗体Abcam ab9957/兔抗鼠CD115/ CSF1R IgG抗体Lifespan LS-B1070-50)，覆盖抗原标本片，将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃30min；取出玻片，置于玻片架上，先用0.01moL/L,pH7.4的PBs冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS 三缸浸泡，每缸5min，不时振荡；取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，摘加一滴一定稀释度的荧光标记的II抗体(分别为DyLight-488-标记的驴抗兔IgG二抗双染试剂盒、Alexa488-标记的羊抗兔IgG二抗双染试剂盒；BioLegend Alexa594标记的羊抗兔IgG二抗、FIFC标记的的羊抗兔IgG 二抗)；将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温3omin；6)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01moL/L,pH7. 4的PBs冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡；取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲廿油，再覆以盖玻片；荧光显微镜高倍视野下观察，波长参见相应二抗体说明书。

(3)结果

不同治疗组滑膜炎症标志物的表达比较结果如图28所示；其中，BLK：DNaseII-/-IFN-IR-/-基因敲除鼠RA模型予以可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体封闭组；ConA：DNaseII-/-IFN-IR-/-基因敲除鼠 RA模型予以予以同剂量无菌生理盐水的对照组组；ConB：无关节症状非基因敲除鼠予以同剂量无菌生理盐水组。

由图28结果可知，TeAb-anti-CCP-ScFv单抗可以有效地减少滑膜滑膜组织炎症因子TNFα、软骨骨转化标记物CTX-I的表达水平以及滑膜组织血管滑膜翳新生标记物(VEGF、HIF-α)、破骨细胞活化标记物(RANKL、CD115/CSF1R)的表达水平。

4、影像学-SPECT显像检测

(1)SPECT 18F-FDG标记滑膜炎症显像：三组动物治疗基线和治疗3周完毕后，行PET-CT扫描。由耳缘静脉“弹丸式”注射18F-FDG 2mci，40-60分钟后按上述方式麻醉，动物仰卧位固定于塑料架上，首先进行右后爪关节CT透射扫描，140KV，80mA，CT扫描结束后立即进行PET发射扫描，一个床位采集 5min，矩阵512×512，断层面为42层，扫描结束后，PET图象采用迭代重建即有序子集最大期望值法重建图像(OSEM)，采集后的图象传入Xelerit工作站，利用CT透射扫描数据对PET图像进行衰减校正 (CTAC)，较正后PET与CT图像融合，分别得到横断面、矢状面和冠状面的PET、CT及PET-CT图像，在后足关节处圈出80像素感兴趣区(ROI)，定量测定相应部位的PET放射性核素平均计数率。

(2)SPECT 99mTc-3P4-RGD2标记滑膜血管翳显像：三组动物于治疗前后均行SPECT99mTc-3P4-RGD2标记滑膜血管翳显像。由尾静脉“弹丸式”注射99mTc-MDP 2mci，4-6小时后经尾缘脉氯胺酮0.1ml麻醉，待动物肌力与肌张力减低，角膜反射不敏感时，四肢伸展固定于仰卧位于SPECT扫描探头下，在static标准方式下，以1帧/5min采集一幅静态图象，能峰140KeV，窗宽20％，矩阵256×256，缩放2.0，采用T/NT进行半定量法分析测定并计算右后爪关节部位放射性摄取/肝脏放射性摄取(T/NT)。显像所用仪器：美国GE公司生产的Millennium MG型SPECT，双探头平行孔准直器。图像处理：采用 xeleris后处理系统工作站进行图像处理。

(3)结果

本发明使用18F-FDG来标测DNaseII^-/-IFN-IR^-/-基因敲除鼠RA模型左后足的滑膜炎症情况，18F-FDG 摄取、解剖定位及图像融合见图29，图像融合示意图CT透射扫描数据对PET图像进行衰减校正后图像融合，得到冠状面的PET-CT图像，左后足关节处圈出80像素ROI。由结果可知，BLK组和ConA组左后足治疗前两组间无显著性差异，TeAb-anti-CCP-ScFv治疗20天后BLK组18F-FDG标记滑膜炎症靶本比(T/NT)从1.27±0.08降低至0.99±0.10，差异有统计学意义(T值5.89P＜0.001)。

放射性核素显像刘为18F-FDG，其化学名称为2-氟-2-脱氧-D葡萄糖，是2-脱氧葡萄糖的氟代衍生物，是正电子发射型放射性同位素氟-18标记的的2-脱氧-D葡萄糖，向动物体内注入18F-FDG后，PET扫描仪可以构建出反映18F-FDG体内分布情况的图像。作为一种葡萄糖类似物，18F-FDG将被葡萄糖高利用率的细胞所摄取，如代谢活跃脏器脑肝肾脏、肿瘤细胞以及增生活跃的炎症滑膜细胞细胞等，细胞内的磷酸化过程将会阻止葡萄糖以原有的完整形式从细胞中释放出来。葡萄糖中的2位氧是后续糖酵解所必需的，因而18F-FDG与2-脱氧-D葡萄糖相同，在细胞内无法继续代谢；在放射性衰变之前，所形成的磷酸将不会发生糖酵解，结果18F-FDG的分布情况就很好地反映体内细胞对葡萄糖的摄取和磷酸化的分布情况，代谢旺盛的局部，在PET-CT图像上表现为放射性核素浓聚。

治疗前后18F-FDG标记滑膜炎症组间T/NT值的比较结果如图30所示，治疗前后组间¹⁸F-FDG标记滑膜炎症PET-CT N/NT的比较如表4所示。

表4：治疗前后组间¹⁸F-FDG标记滑膜炎症PET-CT N/NT的比较

	D0	D21	T	P
					BLK	1.27±0.08*※	0.97±0.10*	6.35	＜0.001
ConA	1.25±0.08※	1.22±0.14※	0.33	0.75
					ConB	0.89±0.33*	0.84±0.11*	0.95	0.37

*与同一时间ConA比较差异有显著性※与同一时间ConB比较差异有显著性

99mTc-标记的显像剂3P4-RGD2是Arg-Gly-Asp的三氨基酸残基，它表达于玻连蛋白和纤连蛋白。而整合素V3能够与玻连蛋白和纤连蛋白相互作用，共同促进关节肿胀和破坏。整合素αvβ3也被称为 RGD依赖的整合素。用放射性核素99mTc标记后，并未改变这类小分子多肽的内部空间结构，并且此显像剂与整合素V3受体结合具有亲和力与选择性，整合素αvβ3则主要通过和细胞外基质(ECM)中的一些含RGD三肽序列的配体结合来发挥作用。它们表达于血管内皮细胞表面，在正常细胞表达极少或缺乏。因此可以特异性显现新生的血管滑膜翳。由图31可见，治疗组左后肢足关节治疗前摄取浓集，治疗后21天重复扫描摄取较前有所减低。T/NT半定量评价也有改善。而空白治疗和对照组无明显变化。治疗前后组间⁹⁹mTc-3P4-RGD2标记的滑膜血管翳T/NT值的比较如表5所示。

表5：治疗前后组间⁹⁹mTc-3P4-RGD2标记的滑膜血管翳T/NT值的比较

	D0	D21	T	P
					BLK	11.02±1.34※	4.70±0.95*	12.08	＜0.001
ConA	10.85±1.17※	9.83±0.90※	1.39	0.21
					ConB	5.01±0.69*	4.85±0.89*	0.38	0.72

5、血清学抗体和前炎症细胞因子的检测

(1)血清CCP抗体测定

心脏采血1ml，室温静置1小时，2000rpm×离心15min，取上清。抗CCP抗体试剂盒购自 Euro-Diagnostica，Bio-Rad680酶标仪检测，检测方法参见说明书。仅将二抗(也即说明书中“联结液”) 换为1:200稀释的HRP标记的抗鼠IgG单克隆抗体(BD Pharmingen，559626)100μl。

(2)血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β和Th17前炎症细胞因子、软骨转化标记物CTX-II水平测定

心脏采血1ml，室温静置1小时，2000rpm×离心15min，取上清。IL-1β(Cat.DY401)、IL-6(Cat.DY406)、 TNF-α(Cat.DY410)、TGF-β(Cat.DY1679)和IL-17(Cat.DY421)、VEGF(RRV0)等细胞因子ELISA 检测选用R&D DuoSet系列试剂盒，CTX-II试剂盒(E-EL-R2554c，EIABscience)，严格按说明书操作。

(3)结果

不同处理组治疗前后血清抗体、前炎症细胞因子和软骨转化标记物水平的比较结果如图32所示。由结果可知，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体治疗组(BLK)d21与基线比较IL-6、TNFα、IL-17a和VEGF 水平有显著性减低。

6、Treg/Th17细胞比值测定

肝素钠抗凝静脉血4ml，大鼠淋巴细胞分离液(Sigma)分离PBMCs。2ml含10％胎牛血清(FBS) 1640培养液重悬细胞并洗涤1次，调整细胞浓度为4-5×10⁶/ml备用。①Th17细胞标记取500μl PBMC 稀释液中加入刺激剂佛波酯(50ng/ml,Sigma)、离子霉素(1μg/m1,Sigma)及阻断细胞因子分泌的莫能菌素 (1μg/ml，Sigma)，5％CO₂孵箱中37℃孵育5h。②Th17细胞染色：刺激后细胞离心洗涤，1％FBS/PBS 重悬，分入2个流式管(对照和试验)，调节每管3-5×10⁵/100μl。分别加入5μl多甲藻叶绿素蛋白(PerCP) 标记抗大鼠CD3(BD，347344)和5μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠CD8单克隆荧光抗体(BD， 560960)，4℃避光孵育15min进行细胞表面染色；细胞打孔参照Cytofix/Cytoperm^TM试剂盒(BD，555028)说明操作。试验管中加入5μl藻红蛋白(PE)标记的抗大鼠IL-17a单克隆荧光抗体(eBioscience, 12-7179-42)，同型对照管加5μl鼠IgG1PE荧光抗体(eBioscience，12-4714-41)，4℃避光孵育30min。洗涤固定后上机检测。③调节性T细胞Treg细胞染色：未刺激细胞分为试验管和同型对照管各 3-5×10⁵/100μl。试验管分别加入10μl抗大鼠CD4-FITC(eBioscience,11-0048-42)和10μl别藻青蛋白(APC) 标记的抗大鼠CD25单克隆荧光抗体(eBioscience，17-0259-42)，4℃避光孵育15min进行细胞表面染色；细胞固定、打孔参照Cytofix/Cytoperm^TM试剂盒说明操作。试验管加10μl抗大鼠PE-Foxp3单克隆荧光抗体(eBioscience，12-4774-42)，同型对照管加10μl小鼠IgG1PE荧光抗体(eBioscience，12-4714-41)， 4℃避光30rnin，洗涤固定后上机检测。④FACS Calibur流式细胞分析仪(BD)检测，分别以CD3⁺CD8^-细胞和CD4⁺细胞设门，配置各荧光通道间的补偿，BD Cell Quest软件计算CD3⁺CD8^-IL 17⁺/CD8^-细胞及 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺/CD4的比率。

治疗前后不同组间Th17/Treg细胞比率的变化比较如表6所示。

表6：治疗前后不同组间Th17/Treg细胞比率的变化比较

备注：*：与ConB比较，差异有统计学意义P＜0.05；﹟：与ConA比较，差异有统计学意义P＜0.05

由上表所见，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体治疗组(BLK)d21与基线的Th17/Treg细胞比率的变化值与对照组比较，有显著性的减低。

7、Breg细胞比值测定

本实施例采用流式细胞术检测CD19⁺CD24^hiCD38^hi Breg细胞亚群。主要操作步骤包括：样品上机分析后，首先在FSC，SSC条件下圈出淋巴细胞，然后选择CD19的通道，纵坐标选择histogram，根据图形设置阳性门，然后将设置后的们应用于整个组。对于CD24⁺B细胞，在选中的CD19阳性细胞群里，同样选择CD24荧光通道，纵坐标选histogram，根据图形设置CD24阳性门，然后将设置后的门应用于整个CD19⁺细胞群组，CD38+B细胞的操作方法相同。每个样品取1×10⁶个淋巴细胞至1.5mL Eppendorf 管中，并同时设CD19-FITC、CD24-PerCP/Cy5.5、CD38-PE三个单染对照管，阴性对照管及同型对照管。 600×g离心5min，弃去上清液。参照抗体试剂说明，每个样品管中同时加入适量的兔抗大鼠 CD19-FITC、CD24-PerCP/Cy5.5及CD38-PE单克隆抗体，反应体系为每管50uL。4℃冰浴30min，注意避光。PBS洗涤2次，每次3min，600×g离心3min，弃去上清液用400mL含0.1％BSA的PBS 溶液重悬细胞，200目铜网过滤。4h内上FACSCalibur(BD)流式细胞仪检测，收集20 000个细胞用于数据分析。使用FLOWJO(Tree star)7.6.3流式分析软件进行数据的统计和作图。

检测结果如图33所示；图33中，A、B、C分别为正常对照组首先分选淋巴细胞、在淋巴细胞中分选CD19⁺细胞以及在CD19⁺中分选CD24^hiCD38^hi细胞；D、E、F分别为SLE患者治疗前首先分选淋巴细胞，在淋巴细胞中分选CD19⁺细胞以及在CD19⁺中分选CD24^hiCD38^hi细胞。治疗前后不同分组间 CD19⁺CD24^hiCD38^hiBreg的变化如图34所示。由以上结果可知，TeAb-anti-CCP-ScFv-P53抗体治疗组 (BLK)d21与基线相比，CD19⁺CD24^hiCD38^hiBreg百分比有显著性的上升。

8、CCP分泌性B细胞的FCM检测

前序CCP抗原四聚体合成和生物素化荧光标记步骤同前，三个不同处理组于治疗前及治疗21天后鼠尾采血5ml，常规分离PBMCs，在预包被以50μl/孔CCP抗原肽的96孔培养板(Minipore)，4℃过夜。后每24小时更换培养板和培养基，培养72小时后，计数并调整PBMCs数量为1.5-2.0×10⁶/ml,检测大鼠 PBMC中CCP四聚体阳性B细胞荧光抗体染色剂设门检测同前，不同之处在于荧光抗体换为抗大鼠的相应抗体：APC标记的抗大鼠CD3(Cat17-0030-82，US Invitrogen)，APC/Cy7标记的抗鼠CD14 (BioLegend Cat.123317)，APC-H7标记的抗大鼠CD16(ABIN1826865)，BV421标记的抗大鼠CD19 (BioLegend Cat.115549)，FITC标记的抗大鼠CD20(Biobyt，Cat.orb15284)，PE-Cy7标记的抗大鼠 CD27(BioLegendCat.124215)和Texas Red标记的抗大鼠IgD(Bio-Rad Cat.301007)。计算柱结合和流过悬浮液中的活CCP分泌性B淋巴细胞的绝对计数，为排除B细胞数量对⁺CCP分泌性B细胞计数的影响，同时计算CCP分泌性B细胞/CD19⁺B的比值。

检测结果见下表7、表8以及图35。

表7：治疗前后组间CCP分泌性B细胞绝对计数的比较(n/10⁵)

	D0	D21	T	P
					BLK	30.63±11.45<sup>※</sup>	24.13±10.75*<sup>※</sup>	1.17	0.26
ConA	33.50±9.11<sup>※</sup>	53.01±11.86<sup>※</sup>	-2.61	0.04
					ConB	6.50±4.65	5.50±3.00*	0.36	0.73

表8：治疗前后组间CCP分泌性B细胞/CD19+B比值的比较

	D0	D21	T	P
					BLK	9.60±3.67<sup>※</sup>	7.76±3.29*<sup>※</sup>	1.05	0.31
ConA	10.56±3.38<sup>※</sup>	20.56±4.87<sup>※</sup>	-3.37	0.02
					ConB	2.19±1.69	1.89±0.78*	0.33	0.76

由以上结果可知，治疗前BLK组与ConA组组间CCP分泌性B细胞绝对计数和CCP分泌性B细胞 /CD19⁺B比值无显著性差异，与CCP抗原肽孵育刺激后ConA组治疗前CCP分泌性B细胞绝对计数和 CCP分泌性B细胞/CD19⁺B比值分别由33.50±9.11/10⁵上升至53.01±11.86/10⁵，10.56±3.38上升至 20.56±4.87差异均有显著性。而使用TeAb-anti-CCP-ScFv-P53的BLK组治疗前后虽然CCP分泌性B细胞绝对计数和CCP分泌性B细胞/CD19⁺B比值均有下降，但差异无显著性。而治疗21天后，BLK组与ConA组间CCP分泌性B细胞绝对计数(24.13±10.75/10⁵vs 53.01±11.86/10⁵，T值＝-4.25P＝0.002)和CCP 分泌性B细胞/CD19⁺B比值(7.76±3.29vs 20.56±4.87，T值＝-5.45P＜0.001)。提示TeAb-anti-CCP-ScFv-P53 可能拮抗CCP刺激后的CCP分泌性B细胞增殖和活化作用。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古医科大学附属医院

<120> 一种高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体及其制备方法与应用

<130> RYP1910253.3

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1121

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 1

taaccatcaa ccataacata acaacctggg tatcgatact actgaggaaa acctgtactt 60

ccaatctgga tcccaggtgc agctgcagga gtcgggccca ggagtggtga agccttcgga 120

gaccctgtcc ctcacctgcg ctgtctctgg tggctccatg actaattatt actgggactg 180

gattcggcag tccccaggga agggaccgga gtggattggg tatatctatt acagtgggaa 240

caccaagtac aacccctccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa 300

ccagttctcc ctgaggctga cctccgtgac cgccgcagac acggccgtgt attattgtgc 360

gagacataat gcatattact atgacagaag tggttactac ttccctgaat acttccgaca 420

ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctcggcatcc accaagggcc catcggtcac 480

ttcgagtggt ggaggcggta gtgcacagga tgttgtgatg actcagtctc cactctccct 540

gcccgtcacc cctggagagc cggcctccat ctcctgccgg tctagtcaaa gcctcgtcca 600

cagtgatgga aacacctact tgaattggtt tcagcagagg ccaggccaat ctccaaggcg 660

cctaatttat aaggtctcta accgggagtc tggggtccca gacagattca gtggcagtgg 720

gtcaggcact gatttcacac tgaaaatcag cagggtggag gctgaggatg ttggggttta 780

ttactgcatg caaggtagac acaggcccta cacttttggc caggggacca aggtggagat 840

caaacgaact gtggctgcac catctgtctt cgcggccgca gcgctggaag tggatgaaac 900

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gggcgaattc agcgctagcc accatcatca tcatcattaa c 1121

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<211> 1137

<212> DNA

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<220>

<223> Artificial Sequence

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<212> PRT

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<220>

<223> Artificial Sequence

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Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

1 5 10 15

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

20 25 30

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Leu Glu

35 40

<210> 5

<211> 215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 5

aattcgcgct ggaagtggat gaaacctatg tgccgaaaga atttaacgcg gaaaccttta 60

cctttcatgc ggatattaag cttaaaaaaa aaccgctgga tggcgaatat tttaccctgc 120

agattcgcgg ccgcgaacgc tttgaaatgt ttcgcgaact gaacgaagcg ctggaactga 180

aagatgcgca ggcgggcaaa gaaccgggcc tcgag 215

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 6

Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu

1 5 10 15

Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile

20

<210> 7

<211> 44

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 7

Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly

1 5 10 15

Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

20 25 30

Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Leu Glu

35 40

<210> 8

<211> 216

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 8

gaattcgcgc tggaagtgga tgaaacctat gtgccgaaag aatttaacgc ggaaaccttt 60

acctttcatg cggatattaa gcttaaaaaa aaaccgctgg atggcgaata ttttaccctg 120

cagattcgcg gccgcgaacg ctttgaaatg tttcgcgaac tgaacgaagc gctggaactg 180

aaagatgcgc aggcgggcaa agaaccgggc ctcgag 216

Claims

1.一种高亲和力抗环瓜氨酸肽单链可变区四价小分子抗体，其特征在于，以p53的四聚化结构域改造单价抗环瓜氨酸肽单链抗体，增加亲和力和抗原结合位点，其序列选自：

TAACCATCAACCATAACATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCATATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCCTGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCCATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGTAGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTCTCTAACCGGGAGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACACAGGCCCTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCAGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAGATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAATtCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAC(SEQ ID NO:1)；和

CAACACACCACAACAATAACAACCTGGGTATCGATACTACTGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCTGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAGTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATGACTAATTATTACTGGGACTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACCGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAACACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGACCTCCGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGACATAATGCATATTACTATGACAGAAGTGGTTACTACTTCCCTGAATACTTCCGACACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCATCCACCAAGGGCCCATCGGTCACTTCGAGTGGTGGAGGCGGTAGTGCACAGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCCACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTCTCTAACCGGGAGTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTAGACACAGGCCCTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCGGCCGCAGCGCTGGAAGTGGATGAAACCTATGTGCCGAAAGAATTTAACGCGGAAACCTTTACCTTTCATGCGGATATTAAGCTTAAAAAAAAACCGCTGGATGGCGAATATTTTACCCTGCAGATTCGCGGCCGCGAACGCTTTGAAATGTTTCGCGAACTGAACGAAGCGCTGGAACTGAAAGATGCGCAGGCGGGCAAAGAACCGGGCGAATTCAGCGCTAGCCACCATCATCATCATCATTAAGCTGCACTGGCCCGAATCC(SEQ ID NO:2)。

2.权利要求1所述抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将anti-CCP-ScFv-HAS-P53序列进行拼接，将所述拼接后的序列转入载体进行融合以及表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体为pMBPc载体。

4.一种CCP抗体分泌性B细胞抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1所述的抗体。

5.一种辅助性T细胞17细胞及其细胞因子抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1所述的抗体；

所述辅助性T细胞17的细胞因子优选为IL-6、TNF-α、IL-17中的一种或多种。

6.一种滑膜成纤维细胞抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1所述的抗体；

优选地，所述抑制剂抑制滑膜成纤维细胞的增殖、迁移能力、侵蚀能力、炎症因子细胞的表达和/或释放以及金属蛋白酶的表达和/或释放。

7.一种破骨细胞抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1所述的抗体；

优选地，所述抑制剂抑制破骨细胞的转化、迁移能力、侵袭能力和/或骨吸收能力，和/或抑制破骨细胞分化相关RANK、瓜氨酸化酶PAD2和/或瓜氨酸化酶PAD4的表达。

8.权利要求1所述抗体在制备类风湿性关节炎诊断试剂中的应用。

9.权利要求1所述抗体在制备预防或治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述治疗类风湿性关节炎的患者中，环瓜氨酸肽呈阳性表达。