TW474991B

TW474991B - Membrane protein polypeptide having function of pre-B cell proliferation and the encoded gene thereof

Info

Publication number: TW474991B
Application number: TW089127943A
Authority: TW
Inventors: Toshio Hirano; Tsuneyasu Kaisho
Original assignee: Toshio Hirano
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 2002-02-01
Also published as: WO1995010536A1; CN1239518C; EP0733643A1; HK1039623A1; EP1705185A3; PT733643E; ZA948016B; EP0733643B1; EP0733643A4; US20020161190A1; HK1017364A1; ES2176260T3; DE69431068T2; KR100260873B1; US5914252A; ATE221082T1; EP1862474A1; ATE326483T1; AU7863894A; CN1203921A

Description

474991 A 7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關一種基因，及以該基因可編碼之新穎蛋白質，更詳而言有關可編碼具有前B細胞增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽的基因，含該基因之載體，藉該載體轉形之轉形體，使用該基因製造具有前B細胞增殖支持活性的新穎膜蛋白質多肽的方法者。本發明更爲有關可識別具有前B細胞增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽的單株抗體。本發明之基因係可以編碼對於慢性關節風濕病（R A )病人滑膜細胞上前B細胞具有亢進增殖支持活性之新穎膜蛋白質者。將本發明之基因插入適當之載體後，轉形常用之宿主細胞，藉此即可製造大量且具有均一之前B細胞增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽。由此，藉由本發明可以作成鑑定慢性關節風濕病（R A )及此等在臨床上診斷此等病用試藥。慢性關節風濕（R A )病人之滑膜或滑膜液中之發炎細胞係來自末梢血者，此等細胞轉移至滑膜等之機構並未完全被解明，惟仍可以推測，賦予細胞之化學訊息與細胞膜上蛋白質（粘著分子）間有複雜之互相作用相關連。曾有許多有關此等膜蛋白質對關節炎之重要性的研究。例如已獲知慢性關節風濕（R A )病人之滑膜內層上，或滑膜血管上有T細胞表面分子L FA - 1之配位體，與血管壁上之細胞粘著或游出雙方相關之細胞間粘著分子-1 j 以下稱 I C A Μ — 1 )表現〔Hale 等；Arthritis Rheum·， 32 : 22 (1989)、及 Haynes 等；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、1T 經濟部智慈財產局R工消費合作社印製 -4 - 474991 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) Springer Semin. Iramunop athol., 1 1 : 1 6 3 ( 1 9 8 9 )〕。同樣還顯示表現於T淋巴球（尤其記億細胞）或單核球上之integrin VLA — 4之配位體的血管細胞粘著分子一 1 (以下稱V C A Μ - 1 )係表現於慢性關節風濕（ R A )或變型性關節炎等之滑膜或擬纖維母細胞滑膜細胞上〔m〇ra 1es-Ducret等；J. Immunol., 1 4 9 : 1 4 2 4 (1992)〕，另外顯示被稱爲VAP—1之膜蛋白質會表現於滑膜之高內皮性小靜脈，此蛋白有可能做爲白血球之特異性識別構造而作用〔Salmi等；Science，2 5 7 ，1 4 0 7 ( 1 9 9 2 )〕。本發明人係爲探究使此等B細胞功能異常的疾病中骨髓微小環境之病理上意義爲目的進行研究，發現慢性關節風濕（R A )及多發性骨髓瘤（Μ Μ )病人係較正常人之來自骨髓基質細胞的前Β細胞增殖支持活性更爲亢進，以及此支持活性係必須前Β細胞與基質細胞直接接觸等，基於此Β細胞系化各病人之基質細胞，構築爲具有促進前Β 細胞增殖之因子的基質細胞株（RASV5 - 5， MMSV3-3)。發現此等基質細胞株的前細胞增殖支持係有已往之 Stem cell factor (SCF), ICAM-1 CD44, VCAM -1, LFA-la, LFA-ΙΘ, NCAM, ELAM-1 以外之未知粘著因子相關連〔J· Immunol. , 1 4 9 ： 4 0 8 8 ( 1 g 9 2 )〕° 另外，細胞系化慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474991 A7 B7_ 五、發明説明（3 ) 之滑膜細胞株S y n S V 6 - 1 4亦與來自慢性關節風濕 (RA)病人之骨髓的基質細胞株RASV5 — 5 —樣具有前Β細胞增殖支持活性，遂而得到與此等細胞株可反應，而與不具有前Β細胞增殖支持活性之來自人骨髓基質細胞株NF SV 1 - 1不反應之新穎單株抗體，同時亦成功於選殖可編碼其抗原膜蛋白質（B s t - 1 )之基因（特願平5—141178號）。另一方面，本發明人等係在製作可識別表現於慢性關節風濕（R A )病人由來之滑膜細胞，但對於來自正常細胞不表現之膜蛋白質的各種鼠單株抗體之過程中，獲得具有可以與Sy n SV6 - 1 4反應，但與正常骨髓間質細胞株N F S V 1 - 1不反應之性質，可標識與上述 B s t — 1不同之膜蛋白的新穎鼠單株抗體RS 3 8。繼而筛選使用此RS 3 8抗體自慢性關節風濕（RA)病人滑膜細胞株所製作之c D N A庫，成功於單離可以編碼與該R S 3 8反應之新穎膜蛋白質的純種系，遂而完成本發明。即，本發明係以提供具有前B細胞增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽，可編碼該多肽之基因，含有該基因之載體，藉該載體轉形之轉形體，及使用該基因之新穎膜蛋白質的製造方法爲目的。另外，本發明還以提供可識別具有前B細胞增殖支持活之新穎膜蛋白質的單株抗體爲其另一目的。爲達成上述目的，本發明係由以下（1 )〜（7 )所本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -6 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

、1T 經濟部智葸財產局員工消費合作社印製 474991 A7 B7 __ 五、發明説明（4 ) 成。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 ) 一種具有序列表之第1號序列所示胺基酸或其一部份之可表現於風濕病人滑膜上的新穎蛋白質多肽。 (2 ) —種可編碼具有序列表第1號序列所示胺基酸或其一部份之多肽的DNA。 (3) 如上述（2)之DNA，其爲具有序列表第2 號序列所示之鹼序列，或可雜交於其一部份被取代，欠缺或附加之鹼序列的鹼序列者。 (4) 一種含有如上述（2)〜（3)之任一 DNA 的重組載體。 (5 ) —種藉由上述（4 )之重組載體被轉形之原核或真核宿主細胞。 (6 ) —種具有第1號序列所示胺基酸或其一部分之多肽的製造方法，其特徵爲培養上述（5 )之宿主細胞所成。 (7 ) —種單株抗體，其爲可識別具有序列表之第1 號序列所示胺基酸序列或其一部份之多肽者。經濟部智慈財產局員工消費合作社印製繼而詳細說明本發明。基本上，本發明之單株抗體可以如下製作。即，本發明之抗體係使用具有前B細胞增殖支持活性的來自慢性關節風濕（R A )病人之滑膜細胞做爲致敏抗原，依一般之免疫法予以免疫，依一般之細胞雜交法雜交細%，依一般之選殖法予以選殖即可製作。本發明之單株抗體的製作方法可以更具體言，以例如 •^^^_用中國國家標準（〇奶）八4規格（210'乂297公董) ' ~一 -7 - 474991 A7 B7 五、發明説明（5 ) 使用做爲培養細胞已被確立之來自慢性關節風濕（R A ) 病人滑膜之細胞株s y n sv 6 - 1 4做爲上述致敏抗原，使該致敏抗原免疫之哺乳動物的形質細胞（免疫細胞 )雜交於鼠等哺乳動物之基質細胞，使所得雜交細胞純種系化，自其中篩選可以標識本發明抗體之純種系、培養其以回收目的之抗體的方法爲較理想。製作上述單株抗體的方法中，以致敏抗原被免疫之哺乳動物並不特別被限制，但考慮其對細胞雜交時使用之基質細胞間之適合性等仍以選擇爲宜，通常可用老鼠、小鼠、倉鼠等。免疫係可藉由一般之方法，例如藉由腹腔內注射等投予上述來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜的細胞株 S y n S V 6 — 1 4的培養細胞於哺乳細胞即可以施行。更具體而言可以對動物每4〜2天投予數次P B S或以生理食鹽水等稀釋爲適當量，並予懸濁，視其需要併用一般之佐劑者爲宜。又，上述投予時還可以採用一般之載劑。免疫細胞則使用最後一次投予上述細胞株後摘出之脾細胞爲宜。與上述免疫細胞所雜交之另一母細胞的哺乳動物基質細胞可以使用已爲公知之各種細胞株，例如P 3 ( P3X63Ag8. 653) 〔J. Immunol·, 1 2 3 : 1548(1978)〕、 p3—Ul〔 Current

Top.i c s in Micro-biology and Immunology, 8 1 : 1 — ( 7 (1978) 〕、NS— 1 (Eur. J. Im_ol·，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 『裝· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8 - 474991 A7 _ B7 五、發明説明（6 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6:511 — 519(1976)〕、MPC— 11〔 Cell, 8:405—415(1976) 〕、SP2/0 〔Nature, 276:269-270(1978)〕、 F 〇〔J. Immunol. Meth·, 35 : 1—21 (1980 )〕、S 1 9 4 〔 J. Exp. Med. ， 148:313— 323(1978)〕 ^ R 2 1 0 C Nature, 277: 131 — 133 (1979)〕等。上述免疫細胞與基質紐胞之細胞雜交係可用基本上爲公知之方法，例如可依Milstein等之方法〔Methods Enzymol·, 73:3—46(1981)〕等。經濟部智慈財產局員工消費合作社印製更具體而言，上述細胞雜交係可以在例如雜交促進劑存在下，在一般之營養培養基中實施。雜交促進劑可例如使用聚乙二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，更視其需要爲提高雜交效率亦可添加二甲亞砸等補助劑。免疫細胞與基質細胞之使用比率係對基質細胞而言，使用1〜 1 0倍左右之免疫細胞爲宜，上述雜交細胞時使用之培養基則例如可用對上述基質細胞株增殖時極適宜之R P M I 一 1 6 4 0培養基，MEM培養基，其他還有對此種細胞培養所用之一般培養基，更可以併用牛胎兒血清（F C S )等血清補液。細胞雜交係在上述培養基內充分地混合所定量之上述免疫細胞與基質細胞，添加對培養基爲約3 0〜6 0 % ( WV)濃度之預先加溫爲3 7Ϊ左右之P E G溶液，例如平均分子量1 000〜6000左右之PEG，並予以本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4·規格（21〇><297公釐） -9 - 474991 A7 _B7 __ 五、發明説明（7 ) 混合即可達成。繼而逐次添加適當之培養基，重覆以離心除去上澄液之操作，藉此即可形成目的之雜交細胞。該雜交細胞可以用一般之選擇培養基，例如在HAT 培養基（令次黃嘌呤，胺基蝶呤及胸腺核苷之培養基）中培養即可以被選擇。該H A T培養基中之培養係被持續至目的之雜交細胞以外細胞（未雜交細胞）死滅爲止所需足夠之時間，通常爲數日〜數週。繼而依超稀釋法，進行篩選可以產生目的抗體之雜交細胞及並予以單一株化。如上述所製作可產生本發明單株抗體之雜交細胞係可在一般之培養基中繼代培養，亦可在液體氮中長期保存。自該雜交細胞採取本發明之單株抗體時，可以採用依常法培養該雜交細胞，以得其培養上澄液之方法，或將融合細胞投予適合之哺乳動物使其增殖，做爲其腹水獲得之方法等。前者方法係極適於獲得高純度抗體之方法，而後者係適於大量生產抗體之方法。另外，依上述方法所得之抗體可以利用鹽析法，凝膠過濾法，親和色譜法等一般之精製手段精製爲高純度者。如上述所製作之本發明單株抗體可以藉由放射免疫測定法（RIA)，酶免疫測定法（EIA)，螢光抗體法 (Immunofluorescence Analysis )等一般之免疫學上手段’可以高感度且高精度識別抗原之表現新穎膜蛋白質的慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞，並予以鑑定。 |本發明之基因係自可表現具有人前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質的慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞調製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 474991 A7 ____ B7 五、發明説明（8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) mRNA後，藉由已知方法轉變爲雙股^ DNA即可得。做爲此mRNA供給源之細胞可爲做爲雜交細胞r s 3 8 之免疫源使用之Sy n SV 6 - 1 4細胞株，惟並不限於此等細胞株’只要可表現具有人前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質的細胞即可。又，本發明中係使S y n S V 6 — 8 〇爲獲得m R N A而調製全R N A時可採用徑脈基硫氰酸酯處理後，進行氯化鉋密度梯度離心〔Chi rgw in et al·， Biochemistry, 18 : 5294 (1979)〕以得全RNA之方法，或採用在釩複合體之核糖核酸酶抑制劑存在下以界面活性劑處理，進彳了酣處理〔B e r g e r & Birkenmier, Biochemistry， 1 8 : 5 1 4 3 ( 1 9 7 9 )〕之方法，除此外還可用公知之方法。自全RNA調製mRNA時係可以採用使結合有低（ d T )之載劑，例如使用瓊脂糖或纖維素等之親和柱色譜法或分批法，自全RNA回收ρ ο 1 y (A) +RNA。還可以藉由蔗糖密度梯度離心法再精製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 P〇 1 y (A) +RNA。其他還可以不調製RNA，即直接製得ρ 〇 1 y (A)與RNA之方法，或使用市販之組劑之簡便方法。自如上述所得mRNA獲得雙股c DNA之方法可以例如使m R N A爲模板，以逆轉錄酶處理做爲引物之3 — T d 聚。低 } 之 A 鏈 N I D \)y C A ( (A y N 1 D o 之 p A 於N 輔R 相m 的於有輔具相上成，合末’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 11 474991 A7 B7 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以鹼處理m R N A，經分解，除去後，以所得單股 c D N A爲模板，以逆轉錄酶或D N A聚合酶（例如 K1 en〇w片段等）處理後，以S1核酸酶等處理，或直接以 RNa s eH及DNA聚合酶等處理亦可得雙股cDNA 〔m a n i a t i s e t a 1 . , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1 9 8 2 )，及 Gubler & Hoffman, Gene ，25 :263 (1983)〕。最近還有方便之組劑販售於市面，亦可以使用其獲得雙股 c D N A。將如上述所得之c D N A整合於適當之載體，例如 PBR322，pSClOl等EK型質體載體或Agt 10等噬菌體載體等後轉形大腸菌（X1776 ， HB101 ，DH1 ，DH5 等）等，亦可得 cDNA 庫 (例如參照上述之'Molecular cloning 〃）。另一方面，將上述方法所得雙股c DNA插入適當之表現載體，藉此可以轉形爲其他原核生物或真核生物之宿主細胞。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製欲連結雙股c D N A於載體時，可以附加適當之化學合成DNA連接子，在預先使用限制酶裂解之載體DNA 與ATP存在下，以T4噬菌體DNA連接酶處理即可進行。本發明之表現載體係包含複製起源，選擇性標記，位酸 ί甘腺聚位部合接 A N R 子啓的前之因基。現等表號訊於化本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 12 - 474991 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΚΊ Β7__五、發明説明（1〇) 哺乳動物細胞中之基因表現啓動子可以使用逆轉錄酶病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒（sv) 40等病毒啓動子或人•多肽•鏈•延伸•因子la (HEF — Ια) 等來自細胞的啓動子。例如使用S V 4 0啓動子時，依 mulligan等方法〔Nature， 2 7 7 : 1 0 8 ( 1 9 7 9 ) 〕，即可以極容易實施。複製起源可以使用來自S V 4 0多瘤病毒，腺病毒，牛乳頭狀瘤病毒（B P V )等者，選擇性標記可以使用磷酸轉移酶ΑΡΗ (3，）Π及I (neo )基因、胸腺核苷激酶（TK)基因、大腸菌黃嘌呤素——鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶（Ecogpt)基因，二氫葉酸還原酶（DHFR)基因等。使用原核細胞做爲宿主細胞以形質表現目的之基因時可以用適合於宿主之種由來的複製子，即以包含複製起源及調節序列之質粒載體轉形宿主細胞即可。又，載體係以具有對轉形細胞可賦予表現形質（表現型）選擇性之標識基因者爲宜。例如大腸菌時，可以使用以其爲宿主之載體 p BR3 2 2 予以轉形〔Boliver 等，Gene，2 : 9 5 ( 1975)〕。該PBR322係包含胺苄青黴素及四環素耐性之基因，可利用其任一之耐性即可以鑑定轉形細胞〇原核宿主細胞之基因表現所需啓動子有Θ -內醯胺酶基 ^ 之啓動子〔Chang 等，Nature, 275 :615 ( 1 9 7 8 )〕，或乳糖啓動子〔Goeddel 等，Nature，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -13 - 474991 A7 B7 五、發明説明（n ) 281:544 (1979)〕，及色胺酸啓動子〔 G 〇 e d d e 1 等，N u c 1 e i c A c i d R e s. , 8 : 4 0 5 7 ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 9 8 0 ) 〕，tac啓動子等，惟並不限定於此等。本發明表現系中使用之宿主中原核宿主細胞有例如大腸菌（Escherichia coli)，枯草桿菌（Bacillus subtilis)，嗜熱性桿菌（Bacillus thermophilus )等，惟並不限定於此等。又，真核宿主細胞係有例如酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae)等真核微生物，除此外，還可以使用C〇S細胞，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，C 1 2 7細胞，3 T 3細胞，He la細胞，Β Η K細胞， Namaruba細胞，人胎兒腎細胞（2 9 3細胞）等來自哺乳動物之細胞，惟並不限定於此等。又，本發明轉形體之培養，可以適當地選擇適於宿主細胞之培養條件進行。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製欲單離可編碼具有前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質的c D N A時則例如可以採用以前B細胞增殖支持活性爲指標，或使用抗體直接表現選殖等方法。測定前B細胞增殖支持活性時可以採用鼠前B細胞株 D W 3 4 ( Eur. J. Immunol., 1 8 : 1 7 6 7 ( 1 9 8 8 )〕。即，在2 8洞培養盤中培養可表現前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質的細胞至稍密集（ sub^confluent)(大約5 0 %密度爲宜）狀態爲止照射適量之放射線後，每一洞中加入1〜2 X 1 0 3個D W 3 4 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS )八4規格（210X：297公楚一)~ -14 - 474991 A7 _____ B7_ 五、發明説明（12 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ，在含有1 0%FCS之RPMI — 1 640培養基中，於5 % C 0 2條件下在3 7 °C培養4〜6天左右。各洞孔之DW 3 4生存細胞數係以錐蟲藍染色予以調查，即可知增殖支持活性之抗進程度。本發明中係使用可識別慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞上新穎蛋白質的單株抗體R S 3 8的FA C Scan 之流動細胞計測法（flow cytometry )，選別表現膜蛋白質之轉形體，細分化作成該轉形體時使用之質體D N A，再度作成轉形體，藉由流動細胞計測法重覆選別該轉形體，即可以選殖目的之基因。具體言，培養被導入形質之轉形體（2 9 3 T細胞）後，以含有0. 02%EDTA之PBS自培養盤中剝去，以含有2%FCS，〇. 02%NaN3之PBS所成 FA C S緩衝液洗滌細胞後，做爲一次抗體與RS 38反應。繼而以F A C S緩衝液洗滌除去未反應之一次抗體，再與二次抗體之F I TC標識抗體（F I TC標識羊抗鼠 1 g抗體）反應後，以碘化丙錠染色識別死亡細胞，以經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 F A C S can分析生存細胞，藉此選別可以與R s 3 8強烈反應之轉形體。再以鹼處理包含與抗體反應使用於製作轉形體之 cDNA的大腸菌（DH5)，選別含目的基因之質粒群，再將此等質粒群再細分爲幾個質粒群，再度形質導入於 2 $ 3 T細胞後，藉由使用上述單株抗體R S 3 8的 F A C S can解析，重覆選擇轉形體，即可得到序列表之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 15 - 474991 A7 B7 五、發明説明（13) 序列號碼2所示新穎之可編碼具有前b細胞增殖支持活性之膜蛋白多肽的完全長c DNA(pRS 3 8 — BOS)。又’將此cDNA插入於pUC19載體之Xba I 切斷部位間之含p B s t — 1的大腸菌（ε· Col i ) DH 5 α株係依布達佩斯條約於1 9 9 3年1 0月5曰以寄存波碼 F E RM Β Ρ — 4 4 3 4 將Escherichia Coli DH5«(p R S 3 8 - p U C 1 9 )寄存於日本工業技術院生命工學工業技術研究所。並於1 9 9 4年8月2 3曰以 PRS 3 8 - pU C 1 9(於大腸桿菌DH5 α中）寄存號碼9 4 0 0 1 5寄存於中華民國食品工業發展研究所。通常真核生物之基因係由人干擾素基因等爲人所知，示有多形現象〔例如Nishi等，J. Biochem.,9 7 : 153 (1985)〕者，有時會因此多形現象而有一個或一個以上之胺基酸被取代，有時亦有鹼序列之有所改變但胺基酸完全不變者。又，序列表序列號碼1號之胺基酸序列中缺少或附加一個或一個以上胺基酸的多肽，或一個或一個以上胺基酸被胺基酸所取代之多肽有時亦會具有與本發明之新穎蛋白質一樣之功能（前B細胞增殖支持活性）。例如將相當於人間白素一 2(1 L - 2)基因之半胱胺酸的鹼基序列改換爲絲胺酸之該序列所得多肽保有I L - 2活性亦已爲公知〔Wang等，Science ， 224: 1431(1984)〕。 f另外，使用適當之限制酶或連結子等連結已知蛋白的基因與序列表之序列號碼2的基因，亦可以產生結合於已本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -16 - 474991 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ Β7五、發明説明（14) 知蛋白的多肽。已知蛋白的基因有例如免疫球蛋白，代替此可變領域部份使用序列表之序列2號所示基因，與F c 部份結合即可〔（Zottlmeissl 等，DNA and Cell Biology ，9 :34 了—353(1990)〕。又，以真核細胞表現時，多數會附加糖鏈，可藉由改換1個或1個以上胺基酸而可以調節附加糖鏈。這時亦有時具有與本發明新穎膜蛋白質多肽一樣之功能。因此藉由如上述方法以人工改變可編碼本發明中膜蛋白質多肽之基因者，若所得多肽仍具有與本發明之新穎膜蛋白質多肽一樣之功能，該等基因及多肽亦全部包含於本發明中。另外，與序列表中序列2號所示基因雜交之基因，亦只要自該基因所表現之多肽可以具有與本發明之膜蛋白質多肽一樣之功能（前B細胞增殖支持活性），該等基因及多肽當然亦可被包含於本發明。這時雜交可以使用一般之雜交條件（例如參照上述"molecular cloning )進行。製造目的之具有前B細胞增殖支持活性之膜蛋白質多肽時，可以培養以可編碼該多肽之基因予以轉形之轉形體，以適當之可溶化劑使產生之多肽爲可溶化後，分離，精製，即可得具均一可溶性膜蛋白質多肽。又可溶化劑有 Nonidet P — 40 (NP — 40)，硫酸十二酯鈉（ SDS) ’Triton X— 100，Tween 20 等爲較爲適宜。 (又，可溶性膜蛋白質還可以依基因工程學上操作予作成。即，如圖3所示，根據預測R S 3 8係在N末端側具本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~~一 ~ -17 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝.

、1T 474991 A7 B7 五、發明説明（15) 有貫通細胞膜功能部位蛋白質及細胞內功能部位蛋白質之細胞膜貫通型蛋白質，所以可使用p c R -變異誘導法〔 M. Kamman 等，Nucl· Acids Res·， 1 5 : 5 4 0 4 ( 1989)〕將序列表序列第1號之第49的Asn製作爲N末端之可溶性R S 3 8。這時訊息序列可以用公知者，例如可爲Bst — I (特願平5 — 141 178號）及 G — C S F (特公平2 — 5 3 9 5號）之訊息序列。該膜蛋白質多肽之分離，精製手段可以應用一般蛋白質所用方法，例如使用上述單株抗體之親和色譜法等各種色譜法，超濾，鹽析，滲析等適當地選擇，組合，依一般之方法分離，精製即可以分離，精製本發明之膜蛋白質多肽。以下藉由參考例及實施例詳細說明本發明，惟本發明並不受此實施例之任何限制。參考例1 確立來自健康人之基質細胞株使用 Gene Pulser (BioLad公司製）將含有S V 4 0 之Large 丁抗原c D ΝΑ與雞点一肌動蛋白啓動子之 pAct — SVT 質體〔BBRC 186:129 — 1 3 4 ( 1 9 9 2 )〕電穿孔（electroporation )於健常人之基質細胞。即，混合1 X 1 〇 7細胞/ m又 PBS中健常人基質細胞之〇· 8mj?整份部份與1〇質體，在冰中培育10分鐘後，再以25 〇V， 2 5 0 # F靜電容量之條件施予電穿孔，再於冰中培育本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} C· 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18 - 474991 A7 __ B7 __ 五、發明説明（16) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 〇分鐘後，懸濁於含1 〇%F C S (Bioproducts製）之 RPMI — 1640 培養基（GIBCO 製），於 1 〇 c m 培養皿中培養。每三天交換一次培養液，以含浸有胰蛋白酶之小片濾紙取出大約二週後生育完成之附著細胞菌落，得到來自健常人骨髓之基質細胞株（NFSV1-1)〔 J. Immunol·,149 : 4088 (1992)〕。參考例2 確立來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞株使用 Gene Pulser (BioLad公司製）施行電穿孔法將含T抗原cDNA與雞；8 —肌動蛋白啓動子之cAc t — SVT 質體〔BBRC，186 : 129 — 134 ( 1 9 9 2 )〕導入於來自慢性關節風濕（R A )之滑膜細胞。SP，混合P B S中之來自RA病人的滑膜細胞1 X 107細胞之0· 8m$整分部份，與lOeg質經濟部智慧財產局員工消費合作社印製體，於冰中培育10分鐘後，以250V，250//F靜電容量條件進行電穿孔。再於冰中培育1 〇分鐘後，懸濁於含 1 0%F C S (Bioproducts 公司製）RPM I — 1640培養基（GIBC0公司製），於lOcrn培養皿中培養。每三天交換一次培養液，以染浸胰蛋白酶之小片濾紙取出約二週後生育良好之附著細胞的菌落，得到$ 自RA滑膜細胞株（Syn 3¥6-8及3711 S V 6 - 1 4 ) 〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474991 A7 _____B7 五、發明説明（17 ) 實施例1 製作單株抗體 (1)致敏抗原與免疫法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 做爲致敏抗原使用上述參考例2所得具有前B細胞增殖支持活性之來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞株 S y n SV6 - 1 4進行敏化抗原。細胞株係使用含有 1 0 %牛胎兒血清（F C S，Bioproduct公司製）及5 0 //M2 —氫硫基乙醇之RPM I — 1 6 4 0 (GIBC0公司製）做爲培養基，於5 % C 0 2 ，3 7 °C溫度條件，在培養器中繼代培養。細胞係經0 . 0 2 % E D T A，P B S處理後，經由經濟部智慧財產局員工消費合作社印製輕輕吸移自培養器之培養燒瓶回收。以約1 X 1 〇7個/ m义細胞數將此細胞懸濁於R ρ Μ I — 1 6 4 0培養基，使之浮遊，免疫於BALB/C系鼠（4週齢，雌，日本 S L C公司製）。初次免疫係將約1 X 1 〇 7個/ m义細胞注射於鼠腹腔內，2〜3週後再以1 X 1 07個/m义細胞追加免疫。再每間隔2〜3週以1 X 1 0 7個/ m义細胞追加免疫2〜3次。最後免疫後之第3天屠殺老鼠取出脾臟。 (2 )細胞雜交細切自一隻老鼠取出之脾臟，離心沈澱遊離之脾細胞後，懸濁於R Ρ Μ I — 1 6 4 0培養基（GIBC0公司製）中）使其浮游，充分洗滌。另一方面，於含有1 0 %牛胎

I 兒血清（FCS, FILTR0N公司製）之DMEM (GIBC0公司製）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐) 474991 A7 B7 五、發明説明（18) 培養基培養鼠骨髓細胞瘤細胞株p 3 X 6 3 A g 8. 653 [J.Immunol. J 123 : 1548 ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1979)〕，與上述一樣以上述DMEM培養基洗滌所得細胞後，將1 X 1 〇7個該細胞與1 X 1 〇8個上述脾細胞放入離心管中混合，依常法〔Clin. Exp. Immunol., 42 : 458 — 462 (1980)〕藉由聚乙二醇 1 5 0 0 (Boehringer公司製）進行細胞雜交。將所得雜交細胞分別注入含1 0 % F C S之D Μ E Μ 培養基的9 6個洞孔培養盤，於5 % C 0 2恆溫器中，在 3 7 °C培養。自第二天開始慢慢地以H A Τ選擇培養基（含1. 0x10—4M次黃嘌呤4· 0X10 _7M胺基蝶呤，1. 6x10 一 5M胸腺核旮之完全RPMI — 1640 培養基中，加入10%FCS及50#M2 —氫硫基乙醇之培養基）予以替換繼續培養。開始培養後以每週二次分別以新之H A T培養基取代上澄液之一半，繼續培養，維持其增殖。使用極限稀釋法選殖上述所得雜交細胞。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製即，利用上述雜交細胞之培養上澄液中的抗體，調查其與致敏性抗原之結合性，依常法使用極限稀釋法僅將其中與致敏性抗原具有強烈結合性之純種系形成爲純種系。純種系之形成係調整使其含所定量之上述融合瘤及 B A L B / C系鼠脾細胞，使每1洞孔可爲1〜1 〇個融合Ί，將其播種於9 6孔洞之培養盤，於5 % C 0 2恆溫器中在3 7 °C培養。依一般之極限稀釋法，對增殖之雜交本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）一 -21 - 474991 A7 B7 五、發明説明（19) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 瘤施予同樣選殖之操作，操作至理論上可成爲單一之純種系爲止。可產生目的之抗體的純種系係使用上述致敏性抗原進行篩選。 (3 )篩選雜交細胞（融合瘤）之篩選係使用流動細胞計測儀（ Flow cytometer)依間接螢光抗體法施行。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可產生目的抗體的純種系之篩選係做爲靶細胞使用（ a) Syn SV 6 - 14 (致敏性抗原）（b)來自正常人骨髓基質細胞株N F S V 1 — 1等。即，使具有前B 細胞增殖支持活性的來自R A病人滑膜之細胞株（S y η SV6—14)免疫於BALB/C系鼠，藉此以可以與 Syn SV6 - 14反應，與不具前B細胞增殖支持活性之正常人骨髓由來之基質細胞株（NF S V 1 - 1 )不反應做爲指標進行篩選單株抗體。最初之篩選係使用致敏性抗原之Sny SV6 — 1 4做爲反應細胞進行。首先爲選出與S n y SV6 — 1 4反應之雜交細胞純種系，選別與該Sy n SV6-1 4反應之培養上澄液，進行一次篩選。艮Ρ，將細胞懸濁於反應緩衝液〔含2%F C S ， 0. 002%NaN3之PBS〕，使其浮遊於20//义之融合瘤培養上澄液中（約5X105個/ 20//$)，於1°C反應2 0分鐘。藉該緩衝液洗滌二次後，加入F I T C識別羊抗鼠本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格(210X297公釐） -22 - 474991 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（20 ) I g抗體（Cappel公司製）培養2 0分鐘。洗滌三次後，以流動細胞計測儀（FACScan, Becton Dickinson公司製 )予以分析。其次，使用來自正常人骨髓基質細胞株NF SV 1 -1做爲反應細胞，如上述藉由流動細胞計測儀予以分析。藉此得到產生出對Syn SV6-14可更強烈反應之融合瘤。如上述分離出可產生與Sy n SV6 - 1 4反應，但與來自正常人骨髓基質細胞株N F S V 1 - 1不反應之抗體的融合瘤（R S 3 8 )。此融合瘤產生之抗體係 I g Μ，k 型。又，可產生上述單株抗體R S 3 8之該融合瘤係以 B A L B/C系鼠脾細胞與鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653做爲母細胞被製作之新穎雜交細胞，依據布達佩斯特條約，於 1 9 9 3 年10月5日以^1〇1136-!^〇11361171)]：1(1〇1118 1?338，寄存號碼FERM BP-4433被國際寄存於日本的公設微生物寄存機關之工業技術院生命工學工業技術研究所。並於 1 9 94年8月1 5日以鼠一鼠融合瘤細胞RS38寄存號碼9 6 0 0 0 6寄存於中華民國食品工業發展研究所。 (4 )精製抗體依常法培養上述（2 )製作之雜交細胞，依常法分離，精製培養上澄液中所產生之抗體。 ,即，自各洞孔中，從上述致敏性抗原之抗體價最高的 ( 洞孔採取融合瘤，取其中一個確認有細胞增殖的洞孔，將本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210乂297公釐1 ~ -23 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474991 A7 B7 五、發明説明（21 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所得培養細胞展開於5 % C 0 2組織培養燒瓶，於3 7 °C 繼代培養，使其增殖。在投予十八碳烷之B A L B / C系鼠（6週齡，雌，日本SLC公司製）之腹腔注入所得細胞。10〜14日後採取所產生之腹水，以50%硫酸銨鹽析，以PB S透析後，於QAE柱精製。抗體係再予鹽析，充分透析，得約6 mg / m j?精製品。實施例2 單株抗體之性質 (1 )細胞株之分佈經濟部智慧財產局貞工消費合作社印製使用F A C S can分析在各種細胞株（如表1所示各細胞系）中之RS38抗原分佈。即，在10/zg/m又做爲一次抗體實施例1中所得鼠單株抗體R S 3 8存在下，將各種細胞株懸濁於含2 % F C S，0 . 〇 2 % NaN3 2PBS所成FACS緩衝液中，於冰中培養 20分鐘。以FACS緩衝液洗滌二次後，使用FITC 標識羊抗鼠I g抗體（Cappel製）做爲二次抗體，再於冰中培養1 5分鐘。添加碘化丙錠（propidium Iodide, PI )使其最後濃度爲1/zg/mj?，再於冰中培養5分鐘。以F A C S緩衝液洗淨3次後，以前方散射光識別細胞之生死，以 F A C Scan (Becton Dickinson )僅分析活細胞。又，使用鼠單株抗體SG2及RF3 (特願平5-141 178號）做爲對象。結果示於表1。由表1可知，RS 3 8抗原之分佈係與SG2及RF 3不同。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） -24 - 474991 A7 B7 五、發明説明（22) 表1 以FACS分析細胞系之結果經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Or i gen Cell Line SG2/RF3 RS38 T cell line MOLT-4 一 + / — JURKAT + — B cell line Ra ji 一一 Paud i — 一 CL4 一 + + Ramos 一一 Myeloid U937 + + K562 — + HL60 — + / — M07 — + Miscellaneous ( HepG2 — + / — T24 一 + / — SKWG-4(P122) 一 + / — He 1 a 一 + / — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

、1T 474991 A7 B7 五、發明説明（23 ) 實施例3 1.製作cDNA庫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1) 調製多聚腺苷酸（P〇 1 y (A) ) +RNA 自來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞株S y η SV6-4細胞調製Ρ〇1y (A)+RNA時係使用 Fast Track™ mRNA ISOL ation kit version 3.2( Invitrogen公司製）予以實施。即，使2 0個1 0 c m培養皿所需量之S y n S V 6 - 8細胞勻質化，依組劑所附處方調製全R N A。另外，使用組劑所附之低聚 d ( T )纖維素，依組劑所附處方，精製 P〇ly(A)+RNA。 (2) 構築cDNA庫經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以上記p〇 1 y (A) + RNA做爲材料使用 c D N A 合成組劑 Time SaverTM cDNA Synthesis Kit ( Pharmacia公司製）依組劑之處方合成爲雙股c D N A，使用D N A 1 igat ion Kit (寶酒造公司製）依組劑所附處方連接B s f X I連接子。使用組劑所附之S i ze Sep 4 0 0 Spin Column，依組劑所附處方除去遊離之 Bs tXI連接子，得約100//^附加連接子之雙股 c D Ν Α ° 在第1次之連接反應反應中使用所製作約1 0 0 // i? 附力P連接子雙股c D N A中之2 // ，使用預先以限制酶 B s t X I及鹼性磷酸酯酶（寶酒造公司製）處理之氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 474991 A7 B7 五、發明説明（24 ) PEF — B〇S 載體〔Nuc.AcidRes·， 18:5322 (1 9 9 0)〕與 DNA ligation Kit (寶酒造公司製 )連接，構築爲c DNA庫。構築c DNA庫係被形質轉形於大腸菌細胞株DH5 (Toyobo公司製），全體之尺寸係被推定爲約2 X 1 05之獨立純種系。將導入形質之大腸菌2 0 0 0〜4 0 0 0純種系所成庫作成5 〇庫，使用於以下實驗。 2 .以直接表現法予以選殖 (1)轉移感染於293T細胞以含有5 0 // g/mj?安匹西林之L B培養基〔 Molecular Cloing: A Laboratory Manual, Sambrook^ , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕培養上述庫之大腸菌以擴大c DNA，藉由鹼式法〔 Molecular Cloing: A Laboratory Manual, Sambrook 6 , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 9 8 9 )] 自大腸菌回收質體DNA。可藉由氯化鉋/溴化乙錠密度梯度重覆二次超離心提高所得質體DNA之精製度，藉由磷酸鈣法轉移感染於2 9 3T細胞〔在2 9 3細胞（ Transformed primary embryonal kidney, human ATCC CRL 1 573)中導入 SV40 Large T 抗原 cDNA 之細胞株〕。 I即，將2 // g精製之質粒DNA溶解於含1 mM Tri s—HCl 0. 1 m M EDTA 之 100// 又本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -27 - 474991 A7 ___ _ _ 五、發明説明（25 )

緩衝液中，添加1 4 // j?之2 M C a C 1 2後，慢慢混合於50mM HEPES(pH7.1) ，280mM N a C 1 ，1 . 5 m M磷酸鈉所成緩衝液，於室溫培育 3 0分鐘’在2 4洞孔培養盤中添加2 9 3 T細胞。 2 9 3T細胞係在含1 〇%牛胎兒血清（PCS， Bioproducts公司製）之D MEM (GIBC0公司製）培養基，於3 7 °C，5 % C〇2之條件下培養二天。 (2)藉由FACS分析以含有0. 02%EDTA之PBS自24洞孔剝去形質導入過之2 9 3 丁細胞，以含有2%F C S ， 0. 02%NaN3之PBS所成FACS緩衝液洗淨二次細胞後，在做爲一次抗體之1 上述單株抗體RS38存在下，懸濁於20//$ FACS緩衝液，於水中培育2 0分鐘。以F A C S緩衝液洗滌二次後，使用做爲二次抗體的F I TC標記羊抗鼠I g抗體（Cappel 公司製），再於冰中培育1 5分鐘。加入碘化丙錠（P I )使其最終濃度爲1 # g/mi?，再於冰中培育5分鐘後 ’以F A C S緩衝液洗滌三次，以前方散射光識別細胞之生死，僅以活細胞進行F A C S can (Becton Dickinson 公司製）之分析。 (：|)選殖cDNA庫以2 0 0 0〜4 0 0 0純種系之大腸菌做爲一個庫，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 474991 A7 B7 五、發明説明（26 ) 依上述方法將鹼方法所回收之質體D N A轉移感染於 2 9 3 T細胞，藉由上述F A C S分析進行篩選。在表現第2 5庫之2 9 3 T細胞確認藉由鼠單株抗體r 3 8強烈地被染色的巔峰。再將該質體D N A形質導入大腸菌 Ό U 5 a (GIBCO BRL公司製），接種於含50 β g/m$安匹西林之L B瓊脂培養盤。在培養盤底面將形成菌落之2 0 〇〇個純種系分割爲網狀，在可以知道接種之純種系位置的瓊脂培養盤上，逐一接種使其成爲每個培養盤1 0 0純種，作成同樣之二個。以1 0 0個純種系做爲一庫，製作2 0庫，於含5 0 // g / m ^安匹西林之L B培養基培養大腸菌。以驗方法回收質體DNA，藉由磷酸鈣法轉移感染於2 9 3 T細胞，與上述一樣進行F A C S can分析。F A C S can分析之結果，自確認爲陽性之一個庫逐一單離1 0 0純種系大腸菌，分別培養各純種系，以鹼法回收質體DNA。以磷酸鈣方法轉移感染各質體DNA於2 9 3 T細胞，與上述一樣進行F A C S can分析，得到單一之陽性純種系，命名爲pRS38 — B〇S。使用 A u t 〇 R e a d s e q u e n c i n g k i t ( P h a r in a c i a 公司製 )及 ί/ Auto Cycle sequencing kit (Pharmacia 公司製 )，依該組劑處方進行該純種系之序列反應’以A . L · F · TM D N A序列儀（Pharmacia公司製）決定鹼序列。結果爲被定可編自最長之開放密碼（open reading f ram )至第1 8 0胺基酸殘基之全長9 9 6 b p (序列表之序列號

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公H (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、tr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 474991 A7 B7 五、發明説明（27) 碼2 )的基因，使用基因分析軟體Genet ex，藉由檢索軟體SWISS PLOT及NBRL進行同種性檢索，結果獲知爲新穎基因。 (4 )藉由北方吸漬分析法（Northorn Blotting analysis)檢討其表現。使用 Fast TrackTM mRNA ISOLATION KIT version 3. 2 (Invitrogen製）自RA病人由來之滑膜細胞株 S y n S V 6 — 1 4 ，R Α病人由來骨髓間質細胞株 RASV5 — 5 ，及來自正常人骨髓間質細胞NFSV1 —1調製P〇 1 y (A) + RNA，進行北方吸漬分析（ Molecular Cloing; A Laboratory Manual, Sambrook等 ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press ， 1989) 即，分別回收以1 0個1 0 c m培養皿所培養之細胞株，、經勻質化後，依組劑之處方調製全R N A。再以組劑所附之低聚d ( T )纖維素，依組劑所附處方精製 poly(A)+RNAo 探針之標識係使用Multiprime DNA labelling sysytem (Amersham製）進行。即，藉由限制酶H i n d HI消化被插入於pEF - BOS之B s t XI部位被推測可以編碼R S 3 8之插入子，調製爲3 1 5 b p片段，依組劑所附處方作成標識探針。使用3 // g自S y η jV6 — 14，RASV5 — 5 及 NFSV1 — 1 調製之p ο 1 y ( A ) + R N A，進行瓊脂膠電泳後，使用本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 474991 Α7 Β7 五、發明説明（28 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gene Screen PlusTM (DUPONT 製）做爲雜交轉移膜（ h y b r i d i z a t i ο η 1: r a n s f e r m e m b r a n e，依 C a p 1 a r y 方法予以轉錄。雜交係使用0.5M NaP04，lmM EDTA，7%SDS，1%BSA，pH 值 7. 0 之組成所成 Gilbert & Church buffer於 6 5。(3 實施一晚。雜交完畢後，以2XSSC於室溫洗滌膜4次，再以0. 1 X S S C > 0 . 1%SDS於55°C洗滌二次後，與X線膠片重疊進行一晚之放射自顯術。結果如圖1所示在 S y n S V 6 — 1 4被偵測出約1 . 0 k b之極顯明之集合帶（band) 〇 3.藉由BALB3T3細胞之表現。檢討導入新穎分子於BALB 3 T3細胞，在動物細胞之表現。即，將含20//g之PRS38 — B〇S與2 #2©新黴素耐性基因之？3¥2 116〇〔？· J. Souethem and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1 : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 327 (1982)〕加入 lxlO7 細胞/ mi?之 0. 8m$整份部份，於冰中培育10分鐘後，使用

GenePulser(BioLad 製），以 250V，250//F 靜電容量條件轉移感染，同時導入形質。再於冰中培育1 〇分鐘後，懸濁細胞於含2 mg / m又 G418 及 10%FCS ( Bioproducts 製）之 D Μ E Μ 培^基（616(：0製），以2 4洞孔培養盤培養。每3天交換一次培養液，二週後自生育極佳之新黴素耐性附著細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -31 - 474991 A7 B7 五、發明説明（29) 的形成有單一菌落之洞孔，得到可與上述鼠單株抗體3 8 反應之轉形細胞株BALB3 丁 3 38 — 1 ’ 38 - 3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 及3 8 — 9。又做爲對照細胞得到不與RS 3 8反應但爲新黴素耐性之轉形細胞株B ALB 3T3 3 8 — 4。 4.新穎分子之生物學上性質使用與基質細胞相關地增殖之鼠前B細胞株DW 3 4 ，以增殖細胞數爲指標，依以下所示方法分析新穎分子之生物學上性質。經濟部智慈財產局員工消費合作社印製首先在2 4洞孔培養盤中培養導入形質之細胞株 BALB3T3 38 — 1 ，38 — 3 及 38 — 9 以及對照細胞株BALB3T3及BALB3T3 38 — 4至稍密集之程度，照射3 0 G y之放射線後，每一洞孔添加 2 X 1 03 個 DW3 4，在含 1 0%F C S (Bioproducts 公司製）之RPMI — 1 640 (GIBC0公司製）培養基中，於3 7 °C，5 % C 0 2條件培養4天。以錐藍染色算出各洞孔之D W 3 4的活細胞數，分析增殖支持活性。結果如圖2所示，與對照細胞株BALB 3T3及 B A L B 3 T 3 38 — 4相比，導入形質之細胞株 BALB 3 T 3 38 — 1，38 — 3 及 38 — 9 中可促進DW34之增殖。 5」新穎分子之物化性質 (1 ) N末端之分析本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -32 - 474991 A7 _ B7 _ 五、發明説明（3〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用D ΝΑ分析軟體Gene Works ，分析所得基因之疏水性區域與親水性區域如圖3所示。結果在序列表之序列第1號第2 1所示胺基酸L y s至第4 8之胺基酸 A 1 a爲止之2 8個胺基酸殘基所成領域疏水最高，可以預測爲在成熟蛋白質之N末端側具有貫通細胞膜功能部位蛋白質及細胞內功能部位蛋白質的貫通細胞膜型蛋白質。〔發明之效果〕如以上所詳述，.本發明係有關可編碼具有前B細胞增殖支持活性之新穎膜蛋白質多肽的基因，含有該基因之載體，藉由該載體之轉形體，使用該基因製造具有前B細胞增殖支持活性的新穎膜蛋白質之方法，本發明之基因係可以編碼慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞上之膜蛋白質〇經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製將本發明之基因插入適當之載體後，轉形常用之宿主細胞即可以大量製造具有均一之新穎膜蛋白質多肽，更可以使用來自慢性關節風濕（R A )病人滑膜細胞做爲致敏抗原，以製造可以識別該膜蛋白質多肽之單株抗體，由此事實可知藉由本發明可以鑑定慢性關節風濕（R A )，以及作成此等在臨床上診斷用試藥。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33 - 474991 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（31) 序列表序列號碼：1 序列長度：1 8 0 序列型：胺基酸局部解剖學：直鏈狀序列種類：肽序列 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly He Gly lie Leu Val Leu Leu 20 25 30 lie lie Val lie Leu Gly Val Pro Leu lie lie Phe Thr lie Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gin Gin Glu Leu Thr Glu Ala Gin Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gin Asp Val Glu Ala Gin Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gin Gly Gin Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu He Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gin 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gin Val Leu 130 135 140 Serj Val Arg lie Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gin Asp Ser 145 150 155 160 -- - —.一— ....... ........-........... ................ ..........- - * .......' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -34 - 474991 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 A7 _ B7 ______ 五、發明説明（32 ) Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gin Leu Leu lie Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Gin 序列號碼：2 序列長度：9 9 6 序列型：核酸鏈數：雙股局部解剖學：直鏈狀序列種類：cDNA to m R N A 決定特徵之方法：E 序列 GTGGAATTC ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC.AGA GTG CCC ATG GAA 51 GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA GGA ATT CTG GTG 99 CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147 AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG GCA GTG ATG GAG 195 TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG ACC GAG GCC CAG 243 AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC ACC TGC AAC CAC ACT 291 GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG AAG GCC CAA GGA CAA 339 AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAG 387 CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG AGA AGA GAA AAC CAG 435 GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC TAC CCC AGC TCC CAG 483 GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG ATT GTG CTG CTC GGC 531 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 、\吕 ·線本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） -35 - 474991 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33) CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGAGATCCCA GGAAGCTGGC ACATCTTGGA AGGTCCGTCC 589 TGCTCGGCTT TTCGCTTGAA CATTCCCTTG ATCTCATCAG TTCTGAGCGG GTCATGGGGC 649 AACACGGTTA GCGGGGAGAG CACGGGGTAG CCGGAGAAGG GCCTCTGGAG CAGGTCTGGA 709 GGGGCCATGG GGCAGTCCTG GGTGTGGGGA CACAGTCGGG TTGACCCAGG GCTGTCTCCC 769 TCCAGAGCCT CCCTCCGGAC AATGAGTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTG AGATTGGGCA 829 TGGGGTGCGG TGTGGGGGGC ATGTGCTGCC TGTTGTTATG GGTTTTTTTT GCGGGGGGGG 889 TTGCTTTTTT CTGGGGTCTT TGAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGAGCAA 949 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGAATTC CACCACA 996 圖面之簡單說明圖1係以北方吸漬分析法分析本發明實施例所得基因之結果（瓊脂糖膠電泳照相圖）。圖2係表示本發明實施例所得新穎膜蛋白質對鼠前B 細胞株DW3 4之增殖能力。圖3係表示使用DN A分析軟體Gene Works分析本發明實施例所得基因之疏水性區域與親水性區域之結果。本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

Claims

474991 I公 /1.1 A8 Βδ C8 D8 六、申請專利範圍 1 . 一種DMA，其特徵爲如序列號碼2、所示之鹼基序列，於室溫下以2 X S S C洗淨4次，再以0 · 1 X SSC，〇 · 1%SDS於55°C下洗淨2次之條件下進行雜交，且編碼具有前B細胞增殖支持活性之多肽者· 序列號碼2 GTCCAATTC ATC CCA TCT ACT ICG TAT CAC TAT ICC ACA CTC CCC ATC CAA 51 CAC CCC CAT AAG CCC TGT AAC CTT CTC CTC .CCG ATA CCA ATT CTC CTG 99 CTC CTC ATC ATC CTC ATT CTG CGC CTC CCC TTC ATT ATC TTC ACC ATC 147 AAG CCC AAC ACC GAG CCC TCC CCG CAC CCC CTT CCC CCA CTC ATG CAC 195 TCT CCC AAT CTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA CAC CTC ACC CAC CCC CAC 24^ AAC CCC ITT CAG CAT CTG CAC CCC CAC CCC CCC ACC TCC AAC CAC ACT 29 i GIG ATC CCC CTA ATG GCT TCC CTG CAT GCA CAC AAG CCC CAA CCA CAA 339 AAC AAA CTC CAG GAG CTT CAC CGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAC 387 CTT CAC CAC CCC TCT CCA CAC GTC CAC CCA CTG ACA ACA CAA AAC CAG 435 CTC TTA ACC CTC ACA ATC GCG CAC AAC AAG TAC TAC CCC ACC TCC· CAC 483 CAC TCC ACC TCC CCT CCG CCC CCC CAC CTC CTC ATT'CTG CTC CTC CGC 531 * 爭 CTC ACC CCT CTC CTC CAC TCACATCCCA CCAACCTC&C ACATCTTCCA ACCJCCCTCC 589 TGCTCGCCTT TTCCCTTGAA CATTCCCTTC ATCTCATCAC TTCTCACCCG CTCATCCCCC 649 AACACCCTTA CCCCCCAGAC CACCGGCTAG CCCGACAAGG GCCTCTCGAC CAGCTCTCGA 709 CCCCCCATCC CCCACTCCTC GCTGTCCCCA CACACTCCGG TTCACCCACC CCTGTCTCCC 769 TCCACACCCT CCCTCCGCAC AATGACTCCC CCCTCTTCTC TCCCACCCTC ACATTCCCCA 829 TCCCCTCCCC TCTCCCCCCC ATCTCCTCCC TCTTCTTATC CCTTTTTTTT CCCCCCCCCG 889 TTCCTTTTTT CTCCGCTCTT TCACCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTCA CCCACACCAA 949^ AAAAAAAAAA ΑΛΛΑΑΛΑΑΑΑ ΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAACAATTC CACCACA 996 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中囷國家榡準（CMS ) A4現格（210X297公釐）