TW202233663A - 多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子 - Google Patents

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TW202233663A
TW202233663A TW110141605A TW110141605A TW202233663A TW 202233663 A TW202233663 A TW 202233663A TW 110141605 A TW110141605 A TW 110141605A TW 110141605 A TW110141605 A TW 110141605A TW 202233663 A TW202233663 A TW 202233663A
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費南多 加瑟斯
祖倫 王
布拉姆 埃斯特斯
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Abstract

產生可以同時識別多個靶標的基於單一抗體的構建體的能力對於將許多治療劑候選物推向臨床係至關重要的。通常，這意味著成功程度不同的廣泛蛋白設計。在多特異性抗體的情況下，Fab區中的HC/LC配對的驅動代表了多特異性工程化領域最困難的挑戰之一。此處描述了發現一種利用VL-CL與VH-CH1結構域之間的新穎的連接子的新單鏈Fab模組，該Fab模組將進一步促進多特異性分子的生產。

Description

多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子
本發明關於生物藥劑學領域。特別地，本發明關於包含具有特別連接子的單鏈Fab（「scFab」）區的抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可為單價或多價的。
多特異性抗體和抗體樣構建體具備幾種對開發治療分子的人有吸引力的特徵。同時靶向多個靶標的多特異性抗體，例如雙特異性和三特異性抗體之臨床潛力示出用於靶向複雜疾病的巨大希望。但是，那些分子的產生存在巨大挑戰，因為在轉染到單個細胞後，由多條多肽鏈構成的新的四級結構之配對/折疊（特別是當配對抗體重鏈和輕鏈時）係具有挑戰性的。在抗體Fab區，重鏈（HC）與輕鏈（LC）之間有兩個相互作用點：在HC的可變區（VH）與在LC的可變區（VL）之間以及在Fab HC的恒定區（CH1）與LC的恒定區（CL）之間。
當多條HC和LC同時轉染到單個細胞以產生多特異性分子（即異源IgG）時為了驅動HC/LC之間的同源配對，經常使用如電荷配對突變（CPM）以操控二聚體介面或插入大體積殘基（即Trp和Tyr），即杵臼（KiH）以物理上有利於和不利於二聚體的形成的工具。但是，此類工程化的成功經常係次優的，這是由於HC/LC錯配導致了所需分子的低回收率。
此處描述了發現一種廣泛適用的模組，稱為scFab模組，該模組可以簡化可製造性、最小化錯誤配對的和折疊的種類，並且廣泛適用於大範圍的單價和二價的多特異性分子。scFab模組中包括的係將輕鏈VL-CL區連接至VH-CH1區的新穎的連接子。
儘管已經報導了超過100種雙特異性形式，該等形式經常無法滿足具體的設計目標。這種新穎的scFab模組可以應用到許多多特異性形式以降低重-輕鏈配對複雜度，而不影響功能或穩定性。此類工具對於遞送具有理想的可製造特性的治療性候選物係必需的且至關重要的。
我們要求保護：
在一方面，本發明關於抗原結合蛋白，其包含至少一種單鏈Fab，其中該單鏈Fab包含：
VH-CH1多肽和
VL-CL多肽
其中該VH-CH1多肽和該VL-CL多肽經由肽連接子連接，該肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少90%、94%、97%或100%相同的序列組成。
在一個實施方式中，該VL-CL多肽的C末端連接到該肽連接子之N末端並且該VH-CH1多肽的N末端連接到該肽連接子之C末端。
在一個實施方式中，該VH-CH1多肽在其C末端連接到絞鏈-CH2-CH3多肽的N末端。在一個實施方式中，該絞鏈-CH2-CH3多肽包含選自由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該VL-CL多肽之CL部分包含選自由SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該VH-CH1多肽之CH1部分包含SEQ ID NO: 4。
在一個實施方式中，i) 該VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含第一和第二多肽，其中
該第一多肽包含連接到第一肽連接子之N末端的第一VL-CL多肽並且該第一肽連接子之C末端連接到第一抗體重鏈的N末端，其中該第一抗體重鏈包含K/R409D和K392D突變；並且
該第二多肽包含連接到第二肽連接子之N末端的第二VL-CL多肽並且該第二肽連接子之C末端連接到第二抗體重鏈的N末端，其中該第二重鏈包含D399K和E356K突變；
其中該第一肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成；
其中該第二肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成；
其中兩條重鏈中的胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引；
其中該第一VL-CL多肽和該第一抗體重鏈結合第一抗原或表位並且該第二VL-CL多肽和該第二抗體重鏈結合第二抗原或表位。
在一個實施方式中，該第一VL-CL多肽包含S176K突變；
該第一抗體重鏈包含S183E突變；
該第二VL-CL多肽包含S176E突變；並且
該第二抗體重鏈包含S183K突變，
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該第二VL-CL多肽包含S176K突變；
該第二抗體重鏈包含S183E突變；
該第一VL-CL多肽包含S176E突變；並且
該第一抗體重鏈包含S183K突變，
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該第一抗體重鏈進一步包含K439D突變，
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含：
a) 兩條抗體輕鏈；和
b) 兩種多肽，其包含：
連接到肽連接子之N末端的VL-CL多肽，並且該肽連接子之C末端連接到抗體重鏈的N末端並且該抗體重鏈的C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端；
其中該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與VL-CL多肽締合以形成第一抗原結合位點；
其中b) 的兩種多肽中的該第二VH-CH1多肽與a) 的兩條抗體輕鏈締合以形成第二抗原結合位點；並且
其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該輕鏈包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該輕鏈包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；
iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
iv) 該輕鏈包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變；
iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
iv) 該輕鏈包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-23組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含：
a) 兩條抗體輕鏈；和
b) 兩種多肽，其包含：
抗體重鏈，其中該抗體重鏈的C末端連接到VL-CL多肽的N末端並且該VL-CL多肽的C末端連接到肽連接子之N末端並且該肽連接子之C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端；
其中b) 的兩種多肽中的該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與a) 的抗體輕鏈締和以形成第一抗原結合位點
其中該第二VH-CH1多肽，其與該VL-CL多肽締和以形成第二抗原結合位點；並且
其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該輕鏈包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該輕鏈包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；
iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
iv) 該輕鏈包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；
ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變；
iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
iv) 該輕鏈包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-30組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
本申請與電子格式的序列表一起提交。序列表以標題為A-2670-WO-PCT_SeqList_110221_ST25的文件提供，該文件創建於2021年11月2日，大小為21.06 KB。將電子格式的序列表之資訊藉由援引以其全文併入本文。 相關申請的交叉引用
本專利申請要求於2020年11月10日提交的美國臨時申請案號63/112,119之權益，將其藉由援引以其全文併入本文。
如本文所用，術語「抗原結合蛋白」係指特異性地結合至一或多個靶抗原的蛋白質。抗原結合蛋白可包括抗體及其功能片段。「功能性抗體片段」係抗體中不含全長重鏈和/或輕鏈中存在的胺基酸的至少一部分，但仍能夠特異性地結合至抗體之抗原部分。功能性抗體片段包括但不限於Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2片段、Fv片段、Fd片段、互補決定區（CDR）片段和CDR片段的組合。功能性抗體片段可以衍生自任何哺乳動物來源，例如人、小鼠、大鼠、兔或駱駝。功能性抗體片段可以與完整抗體競爭結合靶抗原並且該等片段可以藉由修飾完整抗體（例如酶或化學裂解）或使用重組DNA技術或肽合成從頭合成產生。
抗原結合蛋白還可包括包含併入單一多肽鏈中或併入多個多肽鏈中的一或多個功能性抗體片段的蛋白質。例如，抗原結合蛋白可以包括但不限於單鏈Fv（scFv）、雙抗體（diabody）（參見，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 第90卷:6444-6448, 1993）；內抗體；結構域抗體（單VL或VH結構域或者藉由肽連接子連接的兩個或更多個VH結構域；參見 Ward等人, Nature [自然], 第341卷:544-546, 1989）；大分子抗體（2個scFv與Fc區的融合物，參見Fredericks等人, Protein Engineering [蛋白質工程改造], Design & Selection [設計和選擇], 第17卷：95-106, 2004；和Powers等人, Journal of Immunological Methods [免疫法雜誌], 第251卷:123-135, 2001）；三功能抗體；四功能抗體；微抗體（minibody）（scFv與CH3結構域的融合物；參見Olafsen等人, Protein Eng Des Sel. [蛋白質工程設計與選擇], 第17卷:315-23, 2004）；肽抗體（一或多個肽附接至Fc區，參見WO 00/24782）；線性抗體（一對串聯的Fd區段（VH-CH1-VH-CH1），其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區，參見Zapata等人, Protein Eng. [蛋白質工程改造], 第8卷:1057-1062, 1995）；小模組免疫藥物（small modular immunopharmaceutical）（參見美國專利公開案號20030133939）；和免疫球蛋白融合蛋白（例如IgG-scFv、IgG-Fab、2scFv-IgG、4scFv-IgG、VH-IgG、IgG-VH和Fab-scFv-Fc）。
「多特異性」係指抗原結合蛋白能夠特異性結合兩種或更多種不同的抗原。「雙特異性」係指抗原結合蛋白能夠特異性結合兩種不同的抗原。如本文所用，當抗原結合蛋白在類似結合測定條件下對靶抗原的結合親和力明顯高於其對其他不相關蛋白質的親和力且因此能夠相區分時，該抗原結合蛋白「特異性結合至」該抗原。特異性結合抗原的抗原結合蛋白可以有平衡解離常數（K D）≤ 1 x 10 -6M。當K D≤ 1 x 10 -8M時，抗原結合蛋白以「高親和力」特異性結合抗原。
使用多種技術確定親和力，其中一個實例係親和力ELISA測定。在各種實施方式中，藉由表面電漿共振測定（例如，基於BIAcore ®的測定）確定親和力。使用此方法，可以測量締合速率常數（以M -1s -1表示的k a）和解離速率常數（以s -1表示的k d）。平衡解離常數（以M表示的K D）然後可以由動力學速率常數的比率（k d/k a）計算。在一些實施方式中，藉由動力學方法，例如Rathanaswami等人，Analytical Biochemistry [分析生物化學]，第373卷:52-60, 2008中所描述的動力學排除測定（KinExA）確定親和力。使用KinExA測定，可以測量平衡解離常數（以M表示的K D）和締合速率常數（以M -1s -1表示的k a）。解離速率常數（以s -1表示的k d）可以由該等值計算（K Dx k a）。在其他實施方式中，藉由平衡/溶液方法確定親和力。在某些實施方式中，藉由FACS結合測定確定親和力。
在一些實施方式中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白表現出所需特徵，例如藉由k d（解離速率常數）測量的約10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7、10 -8、10 -9、10 -10s -1或更低的結合親合性（更低的值表示更高的結合親合性）、和/或藉由K D（平衡解離常數）測量的約10 -9、10 -10、10 -11、10 -12、10 -13、10 -14、10 -15、10 -16M或更低的結合親和力（更低的值表示更高的結合親和力）。
如本文所用，術語「抗原結合結構域」可與「結合結構域」互換使用，係指抗原結合蛋白之區域，該區域含有與抗原相互作用並賦予抗原結合蛋白對抗原的特異性和親和力的胺基酸殘基。
如本文所用，術語「CDR」係指抗體可變序列內的互補決定區（也稱為「最小識別單元」或「高變區」）。有三個重鏈可變區CDR（CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈可變區CDR（CDRL1、CDRL2和CDRL3）。如本文所用，術語「CDR區」係指出現在單個可變區中的三個CDR之群組（即三個輕鏈CDR或三個重鏈CDR）。兩條鏈的每個中的CDR典型地藉由框架區對齊以形成與靶蛋白上的特定表位或結構域特異性結合的結構。自N末端至C末端，天然存在的輕鏈和重鏈可變區典型地遵循該等元件的以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。編號系統已經被設計為將編號指派給在該等結構域中的每一個中佔據位置的胺基酸。此編號系統定義於以下文獻中：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學感興趣的蛋白質序列]（1987和1991, 美國國家衛生研究院（NIH）, 馬里蘭州貝塞斯達）；或Chothia和Lesk, 1987, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 196:901-917；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342:878-883。給定抗體之互補決定區（CDR）和框架區（FR）可以使用此系統標識。
在本發明之多特異性抗原結合蛋白的一些實施方式中，結合結構域包含Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、單鏈可變片段（scFv）或奈米抗體。在一個實施方式中，兩個結合結構域皆為Fab片段。在另一個實施方式中，一個結合結構域係Fab片段，而另一個結合結構域係scFv。
木瓜酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段有單抗原結合位點和含有免疫球蛋白恒定區的殘餘「Fc」片段。Fab片段包含所有可變結構域，以及輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域（CH1）。因此，「Fab片段」由一條免疫球蛋白輕鏈（輕鏈可變區（VL）和恒定區（CL））以及一條免疫球蛋白重鏈的CH1區和可變區（VH）構成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。Fc片段展示碳水化合物，並負責許多抗體效應子功能（如結合補體和細胞受體），該抗體效應子功能區分一類抗體和另一類抗體。「Fd片段」包含來自免疫球蛋白重鏈的VH和CH1結構域。Fd片段代表Fab片段的重鏈組分。
「Fab'片段」係在CH1結構域的C末端處具有一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸殘基的Fab片段。
「F(ab') 2片段」係包括兩個Fab'片段的二價片段，該兩個Fab'片段藉由在鉸鏈區之重鏈之間的二硫橋連接。
「Fv」片段係含有來自抗體的完整抗原識別和結合位點的最小片段。此片段由一個免疫球蛋白重鏈可變區（VH）和一個免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）以緊密非共價締合的二聚體組成。正是在這種組態中，每個可變區的三個CDR相互作用，以將抗原結合位點限定在VH-VL二聚體之表面上。單個輕鏈或重鏈可變區（或僅包含三個對抗原具有特異性的CDR的Fv片段的一半）具有識別和結合抗原的能力，儘管其親和力低於包含VH和VL二者的整個結合位點。
「單鏈可變抗體片段」或「scFv片段」包含抗體的VH和VL區，其中該等區存在於單個多肽鏈中，並且視需要包含VH和VL區域之間的肽連接子，該肽連接子能夠使Fv形成用於抗原結合的所需結構（參見例如，Bird等人, Science [科學], 第242卷:423-426, 1988；和Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 第85卷:5879-5883, 1988）。
特別地，在本發明之多特異性抗原結合蛋白的實施方式中，結合結構域包含特異性結合所需抗原的抗體或抗體片段之免疫球蛋白重鏈可變區（VH）和免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）。
本文中可與「可變結構域」互換使用的「可變區」（輕鏈（VL）的可變區，重鏈（VH）的可變區）係指輕和重免疫球蛋白鏈中的每一個中直接參與抗體與抗原結合的區。如上所述，可變輕鏈和可變重鏈的區具有相同的一般結構，並且每個區包含四個框架（FR）區，該等框架區的序列係廣泛保守的，由三個CDR連接。框架區呈β-折疊組態且CDR可以形成連接該β-折疊結構的環。各鏈中的CDR藉由框架區保持其三維結構，且與來自另一鏈的CDR一起形成抗原結合位點。
與靶抗原特異性結合的結合結構域可以衍生自a) 該等抗原的已知抗體，或者b) 藉由使用抗原蛋白或其片段的從頭免疫方法，藉由噬菌體展示或其他常規方法獲得的新抗體或抗體片段。衍生出多特異性抗原結合蛋白的結合結構域的抗體可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人抗體或人源化抗體。在某些實施方式中，衍生出結合結構域的抗體係單株抗體。在該等和其他實施方式中，抗體係人抗體或人源化抗體，並且可為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
如本文所用，術語「單株抗體」（或「mAb」）係指從基本上同源的抗體群獲得的一種抗體，即，構成該群體的個別抗體除以微量存在的可能天然存在的突變外係相同的。相對於典型地包括針對不同表位的不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體針對個別抗原位點或表位具有高度特異性。可使用本領域中已知的任何技術，例如藉由在完成免疫程序之後使自轉基因動物收集的脾細胞永生化來產生單株抗體。可以使用本領域中已知的任何技術，例如藉由使脾細胞與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤來使脾細胞永生化。用於產生融合瘤的融合程序的骨髓瘤細胞較佳的係非抗體產生的，具有高融合效率和酶缺陷使得它們不能在某些選擇性培養基中生長，該培養基僅支持所需融合細胞（融合瘤）的生長。適用於小鼠融合的細胞系之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用於大鼠融合的細胞系之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用於細胞融合的其他細胞系係U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
術語「相同」和「同一性」百分比在兩種或更多種核酸或多肽序列的情況下係指相同的兩個或更多個序列或子序列。「同一性百分比」意指比較的分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並且係基於比較的最小分子的大小來計算的。對於該等計算，比對中的空隙（若存在）可藉由特定數學模型或電腦程式（即，「演算法」）來解決。
在計算同一性百分比時，以實現各序列間最大匹配的方式比對所比較的序列。用於測定同一性百分比的電腦程式係GCG套裝程式，其包括GAP（Devereux等人, (1984) Nucl.Acid Res. [核酸研究] 12:387；Genetics Computer Group [遺傳學電腦小組], 威斯康辛大學, 麥迪森市, 威斯康辛州）。電腦演算法GAP係用來比對序列同一性百分比待確定的兩個多肽或多核苷酸。將序列比對以實現其各自胺基酸或核苷酸的最佳匹配（如藉由演算法確定的「匹配範圍」）。將空位開放罰分（其計算為3x 對角線平均值，其中「對角線平均值」係所使用的比較矩陣的對角線的平均值；「對角線」係由特定比較矩陣分配給每個完全胺基酸匹配的得分或數值）和空位延伸罰分（其通常是1/10×空位開放罰分）以及比較矩陣（諸如PAM 250或BLOSUM 62）與該演算法聯合使用。在某些實施方式中，該演算法還使用標準比較矩陣（關於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白質序列和結構圖譜] 5:345-352；關於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 89:10915-10919）。
用於使用GAP程式來測定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推薦參數如下：
演算法：Needleman等人, 1970, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:443-453；
比較矩陣：來自Henikoff等人, 1992, 同上的BLOSUM 62；
空位罰分：12（但是末端空位無罰分）
空位長度罰分：4
相似性閾值：0
在一些情況下，藉由用靶抗原免疫動物（例如，具有人免疫球蛋白序列的轉基因動物）來產生融合瘤細胞系；自經免疫動物收集脾細胞；使收集的脾細胞與骨髓瘤細胞系融合，由此產生融合瘤細胞；從融合瘤細胞建立融合瘤細胞系，並鑒定產生結合靶抗原的抗體的融合瘤細胞系。
由融合瘤細胞系分泌的單株抗體可以使用本領域中已知的任何技術，例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法純化。可以進一步篩選融合瘤或mAb以鑒定具有特定特性的mAb，該等特定特性係例如結合表現靶抗原的細胞的能力、阻斷或干擾靶抗原配位基與其各自受體結合的能力、或功能性地阻斷任一受體的能力，例如cAMP測定。
在一些實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白之結合結構域可衍生自人源化抗體。「人源化抗體」係指其中區（例如框架區）已被修飾以包含來自人免疫球蛋白的對應區的抗體。通常，人源化抗體可以從最初在非人動物中產生的單株抗體產生。該單株抗體中的某些胺基酸殘基，典型地來自抗體的非抗原識別部分的胺基酸殘基經修飾成與相應同種型的人類抗體中的相應殘基同源。例如，可使用各種方法，藉由將齧齒動物可變區的至少一部分取代為人類抗體的相應區域來進行人源化（參見例如美國專利案號5,585,089和5,693,762；Jones等人, Nature [自然], 第321卷:522-525, 1986；Riechmann等人, Nature [自然], 第332卷:323-27, 1988；Verhoeyen等人, Science [科學], 第239卷: 1534-1536, 1988）。在另一物種中產生的抗體之輕鏈可變區和重鏈可變區的CDR可以接枝到共有人類FR上。為了產生共有人類FR，可以比對來自幾種人類重鏈或輕鏈胺基酸序列的FR以鑒定共有胺基酸序列。
針對靶抗原產生的新抗體（從其衍生本發明之多特異性抗原結合蛋白的結合結構域）可為完全人類抗體。「完全人類抗體」係包含來源於或指示人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。提供的用於產生完全人類抗體的一種特定方式係小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人類免疫球蛋白（Ig）基因座引入內源性Ig基因失活的小鼠中係在小鼠中產生完全人類單株抗體（mAb）的一種方式，小鼠係可以免疫接種任何所需抗原的動物。使用完全人類抗體可以使免疫性和過敏性響應減到最少，該等響應有時係由向人類投與小鼠或小鼠源性mAb作為治療劑而引起。
可以藉由對在不產生內源性免疫球蛋白情況下，免疫接種能夠產生人類抗體譜系的轉基因動物（通常為小鼠）來產生完全人類抗體。用於此目的之抗原典型地具有六個或更多個連續胺基酸，且視需要與媒介物，例如半抗原結合。參見例如，Jakobovits等人, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 90:2551-2555；Jakobovits等人, 1993, Nature [自然] 362:255-258；和Bruggermann等人, 1993, Year in Immunol. [免疫學年評] 7:33。在此類方法之一個實例中，藉由使編碼小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈的內源小鼠免疫球蛋白基因座失去能力，並將含有編碼人類重鏈和輕鏈蛋白質的含人類基因組DNA的基因座之較大片段插入小鼠基因組中來產生轉基因動物。然後對具有少於人類免疫球蛋白基因座完全補體的部分修飾的動物進行雜交繁育，以獲得具有全部所需免疫系統修飾的動物。當投與免疫原時，該等轉基因動物產生對該免疫原具有免疫特異性，同時具有人類而非鼠類胺基酸序列，包括可變區的抗體。有關此類方法之進一步細節，參見例如WO 96/33735和WO 94/02602。有關用於製備人類抗體的轉基因小鼠的其他方法描述於美國專利案號5,545,807、6,713,610、6,673,986、6,162,963、5,939,598、5,545,807、6,300,129、6,255,458、5,877,397、5,874,299和5,545,806；以及PCT公開WO 91/10741、WO 90/04036、WO 94/02602、WO 96/30498、WO 98/24893；以及EP 546073 B1和EP 546073 A1中。
以上所述之轉基因小鼠在本文中稱為「HuMab」小鼠，含有編碼未重排人類重鏈（μ和γ）和κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源μ和κ鏈基因座失活的靶突變的人類免疫球蛋白基因微型基因座（Lonberg等人，1994, Nature [自然] 368:856-859）。因此，該等小鼠展現了小鼠IgM或κ表現以及對免疫的響應降低，且使引入的人類重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人類IgGκ單株抗體（Lonberg等人, 同上；Lonberg和Huszar, 1995, Intern.Rev. Immunol .[國際免疫學] 13: 65-93；Harding和 Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 764:536-546）。HuMab小鼠的製備詳細描述於以下中：Taylor等人，1992, Nucleic Acids Research [核酸研究] 20:6287-6295；Chen等人, 1993, International Immunology [國際免疫學] 5:647-656；Tuaillon等人, 1994, J. Immunol .[免疫學雜誌] 152:2912-2920；Lonberg等人, 1994, Nature [自然] 368:856-859；Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology [實驗藥理學手冊] 113:49-101；Taylor等人, 1994, International Immunology [國際免疫學] 6:579-591；Lonberg和Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol .[國際免疫學] 13:65-93；Harding和Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 764:536-546；Fishwild等人，1996, Nature Biotechnology [自然生物技術] 14:845-851；上述參考文獻出於所有目的而藉由援引以其全文特此併入。另參見美國專利案號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、和5,770,429；以及美國專利案號5,545,807；國際公開案號WO 93/1227、WO 92/22646；和WO 92/03918，所有參考文獻之揭露內容均出於所有目的而藉由援引以其全文特此併入。用於在該等轉基因小鼠中產生人類抗體的技術還揭露於WO 98/24893和Mendez等人，1997, Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156中，其藉由援引特此併入。
人類來源的抗體還可使用噬菌體展示技術產生。噬菌體展示描述於例如Dower等人，WO 91/17271；McCafferty等人，WO 92/01047；以及Caton和Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 87:6450-6454 (1990)中，其各自藉由援引以其全文併入本文。藉由噬菌體技術產生的抗體通常在細菌中係以抗原結合片段，例如Fv或Fab片段形式產生，且因此缺乏效應子功能。效應子功能可以藉由以下兩種策略之一引入：如果需要，可以將該等片段工程改造成完整抗體以在哺乳動物細胞中表現，或工程改造成具有能夠觸發效應子功能的第二結合位點的多特異性抗體片段。典型地，利用PCR分開選殖抗體的Fd片段（VH-CH1）和輕鏈（VL-CL）並在組合噬菌體展示文庫中隨機重組，然後可以針對與特定抗原的結合進行選擇。在噬菌體表面上表現該等抗體片段，並利用抗原結合，經幾輪抗原結合和再擴增來選擇Fv或Fab（且因此選擇含有編碼該抗體片段的DNA的噬菌體），此程序稱為淘選（panning）。富集且最終分離對於抗原具有特異性的抗體片段。噬菌體展示技術還可用於使齧齒動物單株抗體人源化之方法中，稱為「導向選擇」（參見Jespers, L. S.,等人，Bio/Technology [生物/技術] 12, 899-903 (1994)）。為此，可以將小鼠單株抗體的Fd片段與人類輕鏈文庫組合展示，且然後可以用抗原選出由此獲得的雜交Fab文庫。小鼠Fd片段由此提供導向選擇的模板。隨後，將所選人類輕鏈與人類Fd片段文庫組合。所得文庫的選擇獲得完全人類Fab。
在某些實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白係抗體。如本文所用，術語「抗體」係指包含兩個輕鏈多肽（各自約25 kDa）和兩個重鏈多肽（各自約50-70 kDa）的四聚免疫球蛋白。術語「輕鏈」或「免疫球蛋白輕鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白輕鏈可變區（VL）和單一免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL）的多肽。免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL）可為kappa（κ）或lambda（λ）。術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白重鏈可變區（VH）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（CH1）、免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（CH2）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（CH3）和視需要免疫球蛋白重鏈恒定結構域4（CH4）的多肽。重鏈分類為mu（μ）、delta（Δ）、gamma（γ）、alpha（α）和epsilon（ε）鏈，並且其分別將抗體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG類別和IgA類別的抗體進一步細分為數個亞類，即分別為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗體中的重鏈具有三個結構域（CH1、CH2和CH3），而IgM和IgE抗體中的重鏈具有四個結構域（CH1、CH2、CH3和CH4）。免疫球蛋白重鏈恒定結構域可以來自任何免疫球蛋白同種型，包括亞型。抗體鏈係經由在CL結構域與CH1結構域之間（即，在輕鏈與重鏈之間）和在抗體重鏈的鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。
在特定的實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白係異二聚抗體（在本文中可與「異源免疫球蛋白」或「異源Ig」互換使用），其係指包含兩條不同輕鏈和兩條不同重鏈的抗體。
異二聚抗體可包含任何免疫球蛋白恒定區。如本文所用，術語「恒定區」係指抗體中除可變區外的所有結構域。恒定區不直接參與抗原的結合，但展現各種效應子功能。如以上所述，抗體取決於其重鏈恒定區的胺基酸序列而分為特定同種型（IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）和亞型（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）。輕鏈恒定區可以為例如見於全部五個抗體同種型中的κ型或λ型輕鏈恒定區，例如人類κ型或λ型輕鏈恒定區。
異二聚抗體的重鏈恒定區可以為例如α、Δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區，例如人類α、Δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區。在一些實施方式中，異二聚抗體包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的重鏈恒定區。在一個實施方式中，異二聚抗體包含來自人類IgG1免疫球蛋白的重鏈恒定區。在另一個實施方式中，異二聚抗體包含來自人類IgG2免疫球蛋白的重鏈恒定區。
在一個實施方式中，本揭露之多特異性抗體係Duobody TMDuoBody，其可由如以下中所述之DuoBody TM技術平臺（Genmab公司（Genmab A/S））製備：例如國際公開案號WO 2008/119353、WO 2011/131746、WO 2011/147986、和WO 2013/060867，Labrijn A F等人, PNAS [美國國家科學院院刊], 110(13): 5145-5150 (2013)，Gramer等人, mAbs [單株抗體], 5(6): 962-973 (2013)和Labrijn等人, Nature Protocols [自然實驗方案], 9(10): 2450-2463 (2014)。該技術可用於將含有兩條重鏈和兩條輕鏈的第一單特異性抗體的一半與含有兩條重鏈和兩條輕鏈的第二單特異性抗體的一半組合。所得的異二聚體包含來自第一抗體的一條重鏈和一條輕鏈與來自第二抗體的一條重鏈和一條輕鏈配對。當兩個單特異性抗體識別不同抗原上的不同表位時，所得的異二聚體即為多特異性抗體。
對於DuoBody TM平臺，單特異性抗體中的每個都包括在重鏈中具有單一點突變的重鏈恒定區。該等點突變允許產生的多特異性抗體中的重鏈之間的相互作用比沒有突變的任一單特異性抗體中的重鏈之間的相互作用更強。每個單特異性抗體中的單一點突變可以在重鏈恒定區重鏈的殘基366、368、370、399、405、407或409（EU編號）處（參見WO 2011/131746）。此外，單一點突變位於一個單特異性抗體中相對於另一個單特異性抗體的不同殘基處。例如，一個單特異性抗體可包含突變F405L（EU編號；殘基405處的苯丙胺酸到白胺酸突變），或F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W和F405Y突變之一，而另一個單特異性抗體可包含突變K409R（EU編號；殘基409處的離胺酸到精胺酸突變）。單特異性抗體的重鏈恒定區可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型（例如，人IgG1同種型），並且藉由DuoBody TM技術產生的多特異性抗體可以被修飾以改變（例如，減少）Fc介導的效應子功能和/或改善半衰期。產生Duobody TM之一種方法包括以下內容：(i) 分開地表現在重鏈中含有單個匹配點突變（即K409R和F405L（或F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W和F405Y突變之一）（EU編號））的兩個親本IgG1；(ii) 在體外允許的氧化還原條件下混合親本IgG1以使半分子能夠重組；(iii) 除去還原劑以允許鏈間二硫鍵的再氧化；和 (iv) 使用基於層析法或基於質譜（MS）之方法分析交換效率和最終產物（參見Labrijn等人, Nature Protocols [自然實驗方案], 9(10): 2450-2463 (2014)）。
另一種產生多特異性抗體之示例性方法係藉由杵-臼技術（Ridgway等人, Protein Eng. [蛋白質工程改造], 9:617-621 (1996)；WO 2006/028936）。在該技術中，藉由對形成IgG中重鏈介面的選定胺基酸進行突變，減少了Ig重鏈錯配問題，該問題係製備多特異性抗體的主要缺陷。在重鏈內兩條重鏈直接相互作用的位置，一條重鏈的序列中引入具有小側鏈的胺基酸（杵臼），另一條重鏈上的對應相互作用殘基位置引入具有大側鏈的胺基酸（杵）。在一些情況下，本揭露之抗體具有免疫球蛋白鏈，其中重鏈已經藉由對在兩個多肽之間的介面處相互作用的選定胺基酸進行突變而被修飾，以便優先形成多特異性抗體。多特異性抗體可以由同一亞類或不同亞類的免疫球蛋白鏈構成。在一種情況下，結合gp120和CD3的多特異性抗體包含「杵鏈」中的T366W（EU編號）突變和「臼鏈」中的T366S、L368A、Y407V（EU編號）突變。在某些實施方式中，藉由例如將Y349C突變引入「杵鏈」並且將E356C突變或S354C突變引入「臼鏈」，在重鏈之間引入另外的鏈間二硫橋。在某些實施方式中，在「杵鏈」中引入R409D、K370E突變，並且在「臼鏈」中引入D399K、E357K突變。在其他實施方式中，在鏈之一中引入Y349C、T366W突變，並且在對應鏈中引入E356C、T366S、L368A、Y407V突變。在一些實施方式中，在一條鏈中引入Y349C、T366W突變，並且在對應鏈中引入S354C、T366S、L368A、Y407V突變。在一些實施方式中，在一條鏈中引入Y349C、T366W突變，並且在對應鏈中引入S354C、T366S、L368A、Y407V突變。在又其他實施方式中，在一條鏈中引入Y349C、T366W突變，並且在對應鏈中引入S354C、T366S、L368A、Y407V突變（都按照EU編號）。
產生多特異性抗體之又另一種方法係CrossMab技術。CrossMab係由兩個全長抗體的一半構成的嵌合抗體。為了實現正確的鏈配對，它組合了兩種技術：(i) 有利於兩條重鏈之間正確配對的杵-臼；和 (ii) 兩個Fab之一的重鏈和輕鏈之間的交換，以引入避免輕鏈錯配的不對稱性。參見Ridgway等人, Protein Eng. [蛋白質工程改造], 9:617-621 (1996)；Schaefer等人, PNAS [美國國家科學院院刊] 108:11187-11192 (2011)。CrossMab可以組合兩個或更多個抗原結合結構域，用於靶向兩個或更多個靶標，或用於向一個靶標引入二價性，例如2 : 1形式。
在一個實施方式中，一條重鏈包含F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W、或F405Y突變；並且另一條重鏈包含K409R突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。在一個實施方式中，一條重鏈包含T366W突變；並且另一條重鏈包含T366S、L368A、Y407V突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。在一個實施方式中，一條重鏈包含K/R409D和K370E突變；並且另一條重鏈包含D399K和E357K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。在一個實施方式中，一條重鏈包含K/R409D、K439D和K370E突變；並且另一條重鏈包含D399K和E357K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在特定實施方式中，異二聚抗體包含第一重鏈和第二重鏈，該第一重鏈包含在位置392和409處的帶負電的胺基酸（例如，K392D和K409D取代），該第二重鏈包含在位置356和399處的帶正電的胺基酸（例如，E356K和D399K取代）。在其他特定實施方式中，異二聚抗體包含第一重鏈和第二重鏈，該第一重鏈包含在位置392、409和370處的帶負電的胺基酸（例如，K392D、K409D和K370D取代），該第二重鏈包含在位置356、399和357處的帶正電的胺基酸（例如，E356K、D399K和E357K取代）。
在其他實施方式中，異二聚抗體包含第一重鏈和第二重鏈，該第一重鏈包含在位置392、409和439處的帶負電的胺基酸（例如，K392D、K409D和K439D取代），該第二重鏈包含在位置356和399處的帶正電的胺基酸（例如，E356K和D399K取代）。
在一個實施方式中，一條重鏈包含Y349C突變；並且另一條重鏈包含E356C或S354C突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。在一個實施方式中，一條重鏈包含Y349C和T366W突變；並且另一條重鏈包含E356C、T366S、L368A和Y407V突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。在一個實施方式中，一條重鏈包含Y349C和T366W突變；並且另一條重鏈包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
為了促進特定重鏈與其同源輕鏈的締合，重鏈和輕鏈都可以包含互補性胺基酸取代。如本文所用，「互補性胺基酸取代」係指一條鏈中帶正電的胺基酸的取代與另一條鏈中帶負電的胺基酸的取代配對。例如，在一些實施方式中，重鏈包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，並且相應的輕鏈包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，其中引入重鏈的帶電胺基酸具有與引入輕鏈的胺基酸相反的電荷。在某些實施方式中，可以將一或多個帶正電的殘基（例如離胺酸、組胺酸或精胺酸）引入第一輕鏈（LC1）並且可以將一或多個帶負電的殘基（例如天冬胺酸或麩胺酸）引入LC1/HC1結合介面處的相伴重鏈（HC1），而可以將一或多個帶負電的殘基（例如，天冬胺酸或麩胺酸）引入第二輕鏈（LC2）中，並且可以將一或多個帶正電的殘基（例如，離胺酸、組胺酸或精胺酸）引入LC2/HC2結合介面處的相伴重鏈（HC2）中。當介面處相反的帶電殘基（極性）吸引時，靜電相互作用將引導LC1與HC1成對，LC2與HC2成對。在介面處具有相同帶電殘基（極性）的重/輕鏈對（例如LC1/HC2和LC2/HC1）將排斥，導致抑制不需要的HC/LC配對。
在該等和其他實施方式中，重鏈的CH1結構域或輕鏈的CL結構域包含與野生型IgG胺基酸序列不同的胺基酸序列，使得野生型IgG胺基酸序列中的一或多個帶正電的胺基酸被一或多個帶負電的胺基酸替換。可替代地，重鏈的CH1結構域或輕鏈的CL結構域包含與野生型IgG胺基酸序列不同的胺基酸序列，使得野生型IgG胺基酸序列中的一或多個帶負電的胺基酸被一或多個帶正電的胺基酸替換。在一些實施方式中，異二聚抗體中的第一和/或第二重鏈的CH1結構域中在選自F126、P127、L128、A141、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S183、V185和K213的EU位置處的一或多個胺基酸被帶電胺基酸替換。在某些實施方式中，用帶負電或正電的胺基酸取代的較佳的殘基係S183（EU編號系統）。在一些實施方式中，S183被帶正電的胺基酸取代。在可替代的實施方式中，S183被帶負電的胺基酸取代。例如，在一個實施方式中，S183在第一重鏈中被帶負電的胺基酸取代（例如S183E），並且S183在第二重鏈中被帶正電的胺基酸取代（例如S183K）。
在輕鏈為κ輕鏈的實施方式中，異二聚抗體中的第一和/或第二輕鏈的CL結構域中在選自F116、F118、S121、D122、E123、Q124、S131、V133、L135、N137、N138、Q160、S162、T164、S174和S176的位置（在κ輕鏈中以EU和Kabat編號）處的一或多個胺基酸被帶電胺基酸替換。在輕鏈為λ輕鏈的實施方式中，異二聚抗體中的第一和/或第二輕鏈的CL結構域中在選自T116、F118、S121、E123、E124、K129、T131、V133、L135、S137、E160、T162、S165、Q167、A174、S176和Y178的位置（在λ鏈中以Kabat編號）處的一或多個胺基酸被帶電胺基酸替換。在一些實施方式中，用帶負電或正電的胺基酸取代的較佳的殘基係κ或λ輕鏈的CL結構域的S176（EU和Kabat編號系統）。在某些實施方式中，CL結構域的S176被帶正電的胺基酸替換。在可替代的實施方式中，CL結構域的S176被帶負電的胺基酸替換。在一個實施方式中，S176在第一輕鏈中被帶正電的胺基酸取代（例如S176K），並且S176在第二輕鏈中被帶負電的胺基酸取代（例如S176E）。
除了CH1和CL結構域中的互補性胺基酸取代或作為其替代，異二聚抗體中輕鏈和重鏈的可變區可包含一或多個互補性胺基酸取代以引入帶電胺基酸。例如，在一些實施方式中，異二聚抗體的重鏈的VH區或輕鏈的VL區包含與野生型IgG胺基酸序列不同的胺基酸序列，使得野生型IgG胺基酸序列中的一或多個帶正電的胺基酸被一或多個帶負電的胺基酸替換。可替代地，重鏈的VH區或輕鏈的VL區包含與野生型IgG胺基酸序列不同的胺基酸序列，使得野生型IgG胺基酸序列中的一或多個帶負電的胺基酸被一或多個帶正電的胺基酸替換。
VH區內的V區介面殘基（即，介導VH和VL區組裝的胺基酸殘基）包括Kabat位置1、3、35、37、39、43、44、45、46、47、50、59、89、91和93。VH區中的該等介面殘基中的一或多個可以被帶電（帶正電或負電）胺基酸取代。在某些實施方式中，第一和/或第二重鏈的VH區中Kabat位置39處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如離胺酸）取代。在可替代的實施方式中，第一和/或第二重鏈的VH區中Kabat位置39處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如麩胺酸）取代。在一些實施方式中，第一重鏈的VH區中的Kabat位置39處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如G39E）取代，並且第二重鏈的VH區中的Kabat位置39處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如G39K）取代。在一些實施方式中，第一和/或第二重鏈的VH區中Kabat位置44處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如離胺酸）取代。在可替代的實施方式中，第一和/或第二重鏈的VH區中Kabat位置44處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如麩胺酸）取代。在某些實施方式中，第一重鏈的VH區中的Kabat位置44處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如G44E）取代，並且第二重鏈的VH區中的Kabat位置44處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如G44K）取代。
VL區內的V區介面殘基（即，介導VH和VL區組裝的胺基酸殘基）包括Kabat位置32、34、35、36、38、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、85、87、89、90、91和100。VL區中的一或多個介面殘基可以用帶電胺基酸（較佳的與引入同源重鏈的VH區中的那些具有相反電荷的胺基酸）取代。在一些實施方式中，第一和/或第二輕鏈的VL區中Kabat位置100處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如離胺酸）取代。在可替代的實施方式中，第一和/或第二輕鏈的VL區中Kabat位置100處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如麩胺酸）取代。在某些實施方式中，第一輕鏈的VL區中的Kabat位置100處的胺基酸被帶正電的胺基酸（例如G100K）取代，並且第二輕鏈的VL區中的Kabat位置100處的胺基酸被帶負電的胺基酸（例如G100E）取代。
在某些實施方式中，本發明之異二聚抗體包含第一重鏈和第二重鏈以及第一輕鏈和第二輕鏈，其中該第一重鏈在位置44（Kabat）、183（EU）、392（EU）和409（EU）處包含胺基酸取代，其中該第二重鏈在位置44（Kabat）、183（EU）、356（EU）和399（EU）處包含胺基酸取代，其中該第一和第二輕鏈在位置100（Kabat）和176（EU）處包含胺基酸取代，並且其中該胺基酸取代在所述位置處引入帶電胺基酸。在相關的實施方式中，第一重鏈的位置44（Kabat）處的甘胺酸被麩胺酸替代，第二重鏈的位置44（Kabat）處的甘胺酸被離胺酸替代，第一輕鏈的位置100（Kabat）處的甘胺酸被離胺酸替代，第二輕鏈的位置100（Kabat）處的甘胺酸被麩胺酸替代，第一輕鏈的位置176（EU）處的絲胺酸被離胺酸替代，第二輕鏈的位置176（EU）處的絲胺酸被麩胺酸替代，第一重鏈的位置183（EU）處的絲胺酸被麩胺酸替代，第一重鏈的位置392（EU）處的離胺酸被天冬胺酸替代，第一重鏈的位置409（EU）處的離胺酸被天冬胺酸替代，第二重鏈的位置183（EU）處的絲胺酸被離胺酸替代，第二重鏈的位置356（EU）處的麩胺酸被離胺酸替代，和/或第二重鏈的位置399（EU）處的天冬胺酸被離胺酸替代。
在一方面，本發明關於抗原結合蛋白，其包含至少一種單鏈Fab，其中該單鏈Fab包含：
VH-CH1多肽和
VL-CL多肽
其中該VH-CH1多肽和該VL-CL多肽經由肽連接子連接，該肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少90%、94%、97%或100%相同的序列組成。
在一個實施方式中，該VL-CL多肽的C末端連接到該肽連接子之N末端並且該VH-CH1多肽的N末端連接到該肽連接子之C末端。
在一個實施方式中，該VH-CH1多肽在其C末端連接到絞鏈-CH2-CH3多肽的N末端。在一個實施方式中，該絞鏈-CH2-CH3多肽包含選自由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該VL-CL多肽的CL部分包含選自由SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施方式中，該VH-CH1多肽的CH1部分包含SEQ ID NO: 4。
在一個實施方式中，i) 該VH-CH1多肽包含S183E突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該VH-CH1多肽包含S183K突變；並且
ii) 該VL-CL多肽包含S176E突變；
其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
如本文所用，術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈的C末端區域，其可藉由木瓜酶消化完整抗體產生。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恒定結構域，即CH2結構域和CH3結構域，且視需要包含CH4結構域。在某些實施方式中，Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含來自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3結構域。Fc區可以保持效應子功能，例如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和吞噬作用。在其他實施方式中，Fc區可以修飾成降低或消除效應子功能，如本文更詳細地描述。
在本發明之抗原結合蛋白的一些實施方式中，位於Fc區的羧基末端的結合結構域（即羧基末端結合結構域）係scFv。在某些實施方式中，scFv包含藉由肽連接子連接的重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）。可變區可以在scFv內以VH-VL或VL-VH取向定向。例如，在一個實施方式中，scFv從N末端到C末端包含VH區、肽連接子和VL區。在另一個實施方式中，scFv從N末端到C末端包含VL區、肽連接子和VH區。scFv的VH和VL區可以包含一或多個半胱胺酸取代，以允許在VH和VL區之間形成二硫鍵。這樣的半胱胺酸夾鉗穩定了抗原結合組態中的兩個可變結構域。在一個實施方式中，VH區中的位置44（Kabat編號）和VL區中的位置100（Kabat編號）各被半胱胺酸殘基取代。
在某些實施方式中，scFv在其胺基末端通過肽連接子融合或以其他方式連接到Fc區的羧基末端（例如CH3結構域的羧基末端）。因此，在一個實施方式中，scFv與Fc區融合，使得所得融合蛋白從N末端到C末端包含CH2結構域、CH3結構域、第一肽連接子、VH區、第二肽連接子和VL區。在另一個實施方式中，scFv與Fc區融合，使得所得融合蛋白從N末端到C末端包含CH2結構域、CH3結構域、第一肽連接子、VL區、第二肽連接子和VH區。「融合蛋白」係包括衍生自一種以上親本蛋白或多肽的多肽組分的蛋白。典型地，融合蛋白從融合基因表現，其中編碼來自一種蛋白的多肽序列的核苷酸序列與編碼多肽序列的核苷酸序列附在可讀框內，並且視需要藉由連接子與編碼來自不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列分開。然後可以藉由重組宿主細胞表現融合基因以產生單融合蛋白。
「肽連接子」係指將一個多肽共價連接到另一個多肽的約2至約50個胺基酸的寡肽。肽連接子可用於連接scFv內的VH和VL結構域。肽連接子還可用於將scFv、Fab片段或其他功能性抗體片段連接到Fc區的胺基末端或羧基末端，以產生本文所述之多特異性抗原結合蛋白。較佳的是，肽連接子的長度為至少5個胺基酸。在某些實施方式中，肽連接子的長度為約5個胺基酸至長度為約40個胺基酸。在其他實施方式中，肽連接子的長度為約8個胺基酸至長度為約30個胺基酸。在仍其他實施方式中，肽連接子的長度為約10個胺基酸至長度為約20個胺基酸。
請求保護的本發明之scFab肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少90%、94%、97%或100%相同的序列組成。因此，因為SEQ ID NO: 1的長度為35個胺基酸，所以請求保護的本發明之scFab肽連接子與SEQ ID NO: 1的35個胺基酸中之32個係相同的，與SEQ ID NO: 1的35個胺基酸中之33個係相同的，與SEQ ID NO: 1的35個胺基酸中之34個係相同的，或與SEQ ID NO: 1的35個胺基酸中之35個係相同的。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含第一和第二多肽，其中該第一多肽包含連接到第一肽連接子之N末端的第一VL-CL多肽並且該第一肽連接子之C末端連接到第一抗體重鏈的N末端，其中該第一抗體重鏈包含K/R409D和K392D突變；並且該第二多肽包含連接到第二肽連接子之N末端的第二VL-CL多肽並且該第二肽連接子之C末端連接到第二抗體重鏈的N末端，其中該第二重鏈包含D399K和E356K突變；其中該第一肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成；其中該第二肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成；其中兩條重鏈中的胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引；其中該第一VL-CL多肽和該第一抗體重鏈結合第一抗原或表位並且該第二VL-CL多肽和該第二抗體重鏈結合第二抗原或表位。
在一個實施方式中，該第一VL-CL多肽包含S176K突變；該第一抗體重鏈包含S183E突變；該第二VL-CL多肽包含S176E突變；並且該第二抗體重鏈包含S183K突變，其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該第二VL-CL多肽包含S176K突變；該第二抗體重鏈包含S183E突變；該第一VL-CL多肽包含S176E突變；並且該第一抗體重鏈包含S183K突變，其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該第一抗體重鏈進一步包含K439D突變，其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含：a) 兩條抗體輕鏈；和b) 兩種多肽，其包含：連接到肽連接子之N末端的VL-CL多肽，並且該肽連接子之C末端連接到抗體重鏈的N末端並且該抗體重鏈的C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端；其中該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與VL-CL多肽締合以形成第一抗原結合位點；其中b) 的兩種多肽中的該第二VH-CH1多肽與a) 的兩條抗體輕鏈締合以形成第二抗原結合位點；並且其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且ii) 該輕鏈包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且ii) 該輕鏈包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且iv) 該輕鏈包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變；iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且iv) 該輕鏈包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-23組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
在另一方面，本發明關於多特異性抗原結合蛋白，其包含：a) 兩條抗體輕鏈；和b) 兩種多肽，其包含：抗體重鏈，其中該抗體重鏈的C末端連接到VL-CL多肽的N末端並且該VL-CL多肽的C末端連接到肽連接子之N末端並且該肽連接子之C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端；其中b) 的兩種多肽中的該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與a) 的抗體輕鏈締和以形成第一抗原結合位點，其中該第二VH-CH1多肽，其與該VL-CL多肽締和以形成第二抗原結合位點；並且其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且ii) 該輕鏈包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且ii) 該輕鏈包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且iv) 該輕鏈包含S176K突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變；iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且iv) 該輕鏈包含S176E突變；其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
在一個實施方式中，該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-30組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
本文所述之多特異性抗原結合蛋白的重鏈恒定區或Fc區可包含影響抗原結合蛋白的糖基化和/或效應子功能的一或多個胺基酸取代。免疫球蛋白Fc區的功能之一係當免疫球蛋白結合其靶標時與免疫系統通信。這通常稱為「效應子功能」。通信導致抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬（ADCP）和/或補體依賴性細胞毒性（CDC）。ADCC和ADCP係經由Fc區結合至免疫系統細胞表面上的Fc受體介導。CDC係經由Fc與補體系統，例如C1q的蛋白質結合所介導。在一些實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白在恒定區中包含一或多個增強該抗原結合蛋白的效應子功能（包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性和/或清除率或半衰期）的胺基酸取代。可以增強效應子功能的示例性胺基酸取代（EU編號）包括但不限於，E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L或前述中任何的組合。
在其他實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白在恒定區中包含一或多個降低效應子功能的胺基酸取代。可以降低效應子功能的示例性胺基酸取代（EU編號）包括但不限於，C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S或前述中任何的組合。
糖基化可以促進抗體，特別是IgG1抗體的效應子功能。因此，在一些實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白包含一或多個影響結合蛋白糖基化的水平或類型的胺基酸取代。多肽的糖基化典型地係N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸）係將碳水化合物部分酶促附接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中的任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一種附接至羥基胺基酸，最常見的係絲胺酸或蘇胺酸，儘管也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
在某些實施方式中，藉由向例如本文所述之多特異性抗原結合蛋白的Fc區中添加一或多個糖基化位點來增加該結合蛋白的糖基化。在抗原結合蛋白中添加糖基化位點通常可以藉由改變胺基酸序列，以使其含有上述三肽序列（對於N-連接的糖基化位點）中的一或多個來實現。還可以藉由向起始序列（對於O-連接的糖基化位點）添加或取代為一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來作出改變。為便利起見，可以通過在DNA層面上的變化，特別是藉由使編碼靶多肽的DNA在預先選擇的鹼基處突變，由此產生會翻譯成所需胺基酸的密碼子，來改變抗原結合蛋白的胺基酸序列。
本發明還涵蓋產生具有改變的碳水化合物結構而引起效應子活性改變的多特異性抗原結合蛋白分子，包括岩藻糖基化不存在或減少的展現改善的ADCC活性的抗原結合蛋白。本領域中已知各種減少或消除岩藻糖基化之方法。例如，藉由使抗體分子與FcγRIII受體結合來介導ADCC效應子活性，經顯示此取決於在CH2結構域N297殘基處N-連接的糖基化的碳水化合物結構。相較於天然、岩藻糖基化抗體，非岩藻糖基化抗體以增加的親和力結合此受體且更有效地觸發FcγRIII介導的效應子功能。例如，在α-1,6-岩藻糖基轉移酶已敲除的CHO細胞中重組產生非岩藻糖基化抗體使抗體具有100倍增加的ADCC活性（參見Yamane-Ohnuki等人, Biotechnol Bioeng. [生物技術及生物工程] 87(5):614-22, 2004）。通過降低α-1,6-岩藻糖基轉移酶或岩藻糖基化路徑中的其他酶的活性，例如通過siRNA或反義RNA處理，將細胞系工程改造以敲除一或多種酶，或與選擇性糖基化抑制劑一起培養可以實現類似作用（參見Rothman等人，Mol Immunol. [分子免疫學] 26(12):1113-23, 1989）。一些宿主細胞系，例如Lec13或大鼠融合瘤YB2/0細胞系天然地產生岩藻糖基化程度較低的抗體（參見Shields等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 277(30):26733-40, 2002以及Shinkawa等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 278(5):3466-73, 2003）。還已確定例如經由在過度表現GnTIII酶的細胞中重組產生抗體以增加等分碳水化合物的含量，可增加ADCC活性（參見Umana等人, Nat Biotechnol. [自然生物技術] 17(2):176-80, 1999）。
在其他實施方式中，藉由例如自本文所述之多特異性抗原結合蛋白的Fc區移除一或多個糖基化位點來減少或消除該結合蛋白的糖基化。消除或改變N-連接的糖基化位點的胺基酸取代可以減少或消除抗原結合蛋白的N-連接的糖基化。在某些實施方式中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含在位置N297（EU編號）處的突變，例如N297Q、N297A或N297G。在一個特定實施方式中，本發明之多特異性抗原結合蛋白包含來自人類IgG1抗體的具有N297G突變的Fc區。為了改善含N297突變的分子的穩定性，可以對分子的Fc區進行進一步工程改造。例如，在一些實施方式中，Fc區中的一或多個胺基酸經半胱胺酸取代以促進二聚體狀態下二硫鍵的形成。對應於IgG1 Fc區的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332（EU編號）的殘基因此可以經半胱胺酸取代。較佳的是，特定殘基對經半胱胺酸取代以使其優先彼此形成二硫鍵，由此限制或防止二硫鍵混亂。較佳的對包括但不限於，A287C與L306C、V259C與L306C、R292C與V302C，以及V323C與I332C。在特定實施方式中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含來自人類IgG1抗體的具有R292C和V302C突變的Fc區。在此類實施方式中，Fc區還可包含N297G突變。
還可能希望對本發明之多特異性抗原結合蛋白進行修飾以增加血清半衰期，例如藉由併入或添加補救受體結合表位（例如藉由使適當區域突變或藉由將該表位併入肽標籤中，然後使其與抗原結合蛋白在任一端或在中間融合，例如藉由DNA或肽合成；參見例如WO 96/32478）或添加例如PEG或其他水溶性聚合物的分子，包括多糖聚合物。補救受體結合表位較佳的是構成這樣一種區域，其中來自Fc區中一個或兩個環的任一或多個胺基酸殘基轉移至抗原結合蛋白中的類似位置。甚至更較佳的是，來自Fc區中一個或兩個環的三個或更多個胺基酸殘基經轉移。又更較佳的是，自Fc區（例如IgG Fc區）的CH2結構域取得表位並將其轉移至抗原結合蛋白的CH1、CH3或VH區，或超過一個此類區域。可替代地，自Fc區的CH2結構域取得表位並將其轉移至抗原結合蛋白的CL區或VL區，或這兩個區域。有關Fc變體及其與補救受體相互作用的說明，參見國際公開WO 97/34631和WO 96/32478。
本發明包括編碼本文所述之多特異性抗原結合蛋白及其組分的一或多種分離的核酸。本發明指核酸分子包括呈單股和雙股形式的DNA和RNA，以及相應互補序列。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、化學合成的DNA、藉由PCR擴增的DNA及其組合。本發明之核酸分子包括全長基因或cDNA分子，以及其片段組合。本發明之核酸優先衍生自人源，但本發明也包括衍生自非人物種的核酸。
來自免疫球蛋白或其區域（例如可變區、Fc區等）的相關胺基酸序列或感興趣的多肽可以藉由直接蛋白質定序確定，且適合編碼核苷酸序列可以根據通用密碼子表設計。可替代地，可以使用常規方法（例如，藉由使用能夠與編碼單株抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）從產生單株抗體的細胞中分離編碼此類抗體（可從中衍生本發明之多特異性抗原結合蛋白的結合結構域）的基因組或cDNA並對其進行定序。
「分離的核酸」在本文中與「分離的多核苷酸」可互換使用，在自天然存在的來源分離核酸的情況下，係指已與分離出核酸的生物體基因組中存在的相鄰基因序列分離的核酸。在由模板酶法合成或化學合成核酸，例如PCR產物、cDNA分子或寡核苷酸的情況下，應理解，由此類方法獲得的核酸係分離的核酸。分離的核酸分子係指呈獨立片段形式或作為較大核酸構建體的一種組分的核酸分子。在一個較佳的實施方式中，核酸基本上不含污染性內源物質。核酸分子較佳的是衍生自基本上純的形式和能夠利用標準生物化學方法（例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室], 紐約州冷泉港（Cold Spring Harbor, NY）(1989)中概述的方法）鑒定、操作和回收其組分核苷酸序列的量或濃度分離至少一次的DNA或RNA。此類序列較佳的是以不含典型地存在於真核基因中的內部非翻譯序列或內含子的可讀框形式提供和/或構建。非翻譯DNA序列可以存在於可讀框的5'或3'處，其中該等序列不干擾編碼區的操作或表現。除非另外說明，否則本文所論述的任何單股多核苷酸序列的左手端係5’端；雙股多核苷酸序列的左手方向稱為5’方向。新生RNA轉錄物的5'至3'產生方向稱為轉錄方向；在具有與RNA轉錄物的序列相同序列的DNA股上作為RNA轉錄物5'端至5'端的序列區稱為「上游序列」；在具有與RNA轉錄物的序列相同序列的DNA股上作為RNA轉錄物3'端至3'端的序列區稱為「下游序列」。
如本文所概述，可以藉由使用盒式或PCR誘變，或本領域中熟知的其他技術對編碼多肽的DNA中的核苷酸進行位點特異性誘變，以產生編碼變體的DNA，且隨後在細胞培養中表現重組DNA來製備本文所述之抗原結合蛋白的變體。不過，還可使用確定的技術，藉由體外合成製備包含具有多達約100-150個殘基的變體CDR的抗原結合蛋白。該等變體典型地展現與天然存在的類似物相同的定性生物活性，例如結合至抗原。此類變體包括例如在抗原結合蛋白的胺基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或取代。進行缺失、插入和取代的任何組合以達到最終構建體，條件係最終的構建體具有所需特徵。胺基酸變化還可能改變抗原結合蛋白的翻譯後加工，例如改變糖基化位點之數目或位置。在某些實施方式中，抗原結合蛋白變體的製備意圖修飾直接參與表位結合的那些胺基酸殘基。在其他實施方式中，出於本文所論述之目的，需要對不直接參與表位結合的殘基或不以任何方式參與表位結合的殘基進行修飾。預期在任何CDR區和/或框架區內的誘變。熟悉該項技術者可以採用協方差分析設計抗原結合蛋白的胺基酸序列中的有用修飾。參見例如，Choulier等人, Proteins [蛋白質] 41:475-484, 2000；Demarest等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 335:41-48, 2004；Hugo等人, Protein Engineering [蛋白質工程改造] 16(5):381-86, 2003；Aurora等人, 美國專利公開案號2008/0318207 A1；Glaser等人, 美國專利公開案號2009/0048122 A1；Urech等人, WO 2008/110348 A1；Borras等人, WO 2009/000099 A2。由協方差分析確定的此類修飾可以改善抗原結合蛋白的效力、藥物動力學、藥效學和/或可製造性特徵。
本發明還包括載體，其包含編碼本發明之多特異性抗原結合蛋白的一或多種組分（例如可變區、輕鏈、重鏈、修飾的重鏈、和Fd片段）的一或多個核酸。術語「載體」係指用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中的任何分子或實體（例如，核酸、質體、噬菌體或病毒）。載體之實例包括但不限於質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體和表現載體（例如，重組表現載體）。如本文所用，術語「表現載體」或「表現構建體」係指含有所需編碼序列和用於在特定宿主細胞中表現可操作地連接的編碼序列所必需的適當的核酸控制序列的重組DNA分子。表現載體可包括但不限於，影響或控制轉錄、翻譯且在存在內含子時，影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。用於在原核生物中表現所必需的核酸序列包括啟動子，視需要操縱序列、核糖體結合位點和可能的其他序列。已知真核細胞利用啟動子、強化子、和終止子以及多腺苷酸化信號。分泌訊息肽序列還可以視需要由表現載體編碼，與目的編碼序列可操作地連接，使得表現的多肽可以由重組宿主細胞分泌，如果需要，以便更容易地從細胞中分離目的多肽。在某些實施方式中，訊息肽選自由以下組成之群組：MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC（SEQ ID NO: 24）、MAWALLLLTLLTQGTGSWA（SEQ ID NO: 25）、MTCSPLLLTLLIHCTGSWA（SEQ ID NO: 26）、MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 27）、MEWTWRVLFLVAAATGAHS（SEQ ID NO: 28）、METPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 29）、METPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 30）、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS（SEQ ID NO: 31）和MEWSWVFLFFLSVTTGVHS（SEQ ID NO: 32）。
典型地，用於宿主細胞中以產生本發明之多特異性抗原蛋白的表現載體將含有用於質體維持以及用於選殖和表現編碼多特異性抗原結合蛋白各組分的外源核苷酸序列的序列。在某些實施方式中，此類序列（統稱為「側接序列」）典型地將包括以下核苷酸序列中的一或多個：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、編碼用於多肽分泌的前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現的多肽的核酸的多連接子區和可選擇標記物元件。該等序列分別於下文論述。
視需要，載體可以含有「標籤」編碼序列，即，位於多肽編碼序列的5'或3'端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸標籤序列編碼聚組胺酸（例如六組胺酸）、FLAG、HA（血凝素流感病毒）、myc或現有可商購抗體所針對的另一「標籤」分子。該標籤典型地在多肽表現時與該多肽融合，且可以用作一種自宿主細胞親和純化或檢測多肽的方式。親和純化可以藉由例如柱層析法，使用針對標籤的抗體作為親和基質來實現。視需要，隨後可以藉由各種方式，例如使用某些肽酶裂解，自純化的多肽移除標籤。
側接序列可以為同源的（即，來自與宿主細胞相同的物種和/或品系）、異源的（即，來自與宿主細胞物種或品系不同的物種）、混合的（即，來自超過一種來源的側接序列的組合）、合成的或天然的。因此，側接序列的來源可以為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或非脊椎動物生物體，或任何植物，只要該側接序列在宿主細胞機器中起作用且可以經宿主細胞機器激活。
可用於本發明載體中的側接序列可以藉由本領域中熟知的幾種方法中的任一種獲得。典型地，可用於本文中的側接序列將預先藉由定位和/或藉由限制性核酸內切酶消化鑒定且因此可以使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，側接序列的全核苷酸序列可為已知的。此處，側接序列可以使用常規核酸合成或選殖方法合成。
無論已知側接序列的全部抑或僅一部分，其均可使用聚合酶鏈鎖反應（PCR）和/或藉由用合適的探針，例如來自相同或另一物種的寡核苷酸和/或側接序列片段篩選基因組文庫來獲得。若側接序列未知，則可以自可能含有例如編碼序列或甚至另外一或多個基因的較大DNA片段分離含有側接序列的DNA片段。可以藉由限制性核酸內切酶消化產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®柱層析法（加利福尼亞州查茨沃斯（Chatsworth, CA））或技術者已知的其他方法分離來實現分離。熟悉該項技術者將易於瞭解實現此目的的適合酶的選擇。
複製起點典型地係可商購的原核表現載體的一部分，且該起點有助於在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含複製起始位點，則可以基於已知序列以化學方式合成，並將其連接到載體中。例如，來自質體pBR322（麻塞諸塞州貝芙麗的新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, Beverly, MA））的複製起點適合大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒起點（例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水皰性口炎病毒（VSV），或乳頭瘤病毒，例如HPV或BPV）可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分（例如，通常僅使用SV40起點，因為其還含有病毒早期啟動子）。
轉錄終止序列典型地位於多肽編碼區3'端且用於終止轉錄。通常，原核細胞中的轉錄終止序列為富G-C片段，繼之以聚T序列。儘管該序列易於自文庫選殖或甚至作為載體的一部分商購獲得，但其還可使用核酸合成方法容易地合成。
可選擇標記物基因編碼選擇性培養基中生長的宿主細胞存活和生長所需的蛋白質。典型的選擇標記物基因編碼如下蛋白質：(a) 賦予針對抗生素或其他毒素（例如，對於原核宿主細胞，胺苄青黴素、四環素或康黴素）的抗性；(b) 補充細胞的營養缺陷；或 (c) 提供不可得自複雜培養基或限定培養基的重要營養素。特定可選擇標記物為康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因和四環素抗性基因。有利地，新黴素抗性基因還可用於在原核和真核宿主細胞中進行選擇。
其他可選擇基因可用於擴增將表現的基因。擴增為如下的過程：其中使產生對生長或細胞存活非常重要的蛋白質所需的基因在重組細胞連續世代的染色體內串聯重複。適用於哺乳動物細胞的可選擇標記物之實例包括二氫葉酸還原酶（DHFR）和無啟動子胸苷激酶基因。使哺乳動物細胞轉化株處於選擇壓力下，其中由於載體中存在可選擇基因，故僅轉化株唯一適於存活。選擇壓力係藉由在連續地增加培養基中選擇劑的濃度的條件下培養經轉化細胞，由此使可選擇基因和編碼另一基因，例如本文所述之多特異性抗原結合蛋白的一或多種組分的DNA擴增來施加。因此，由擴增的DNA合成增加的量的多肽。
核糖體結合位點對於mRNA翻譯起始而言通常為必需的且以Shine-Dalgarno序列（原核生物）或Kozak序列（真核生物）為特徵。該元件典型地位於啟動子的3'端且在待表現的多肽編碼序列的5'端。在某些實施方式中，一或多個編碼區可以可操作地連接到內部核糖體結合位點（IRES），由此允許自單一RNA轉錄物翻譯兩個可讀框。
在一些情況下，例如在真核宿主細胞表現系統中需要糖基化的情況下，可以操作各種前序列或原序列以改善糖基化或產量。舉例而言，可改變特定訊息肽的肽酶裂解位點，或添加還可影響糖基化的前序列。最終蛋白質產物可以在位置-1（相對於成熟蛋白質的第一個胺基酸）具有一或多個易於表現的另外的胺基酸，該等胺基酸可能未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一或兩個與胺基末端附接的在肽酶裂解位點發現的胺基酸殘基。可替代地，當酶在成熟多肽內的此類區域切割時，使用一些酶裂解位點可能產生所需多肽的略微截短的形式。
本發明之表現和選殖載體典型地將含有由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼多肽的分子的啟動子。如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個核酸序列以使得產生能夠引導給定基因的轉錄和/或所需蛋白質分子的合成的核酸分子的方式連接。例如，載體中與蛋白質編碼序列「可操作地連接」的控制序列這樣與其連接，使得在與該等控制序列的轉錄活性相容的條件下表現蛋白質編碼序列。更具體地，如果啟動子和/或強化子序列（包括順式作用轉錄控制元件的任何組合）在適當的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子和/或強化子序列與該編碼序列可操作地連接。
啟動子為位於控制結構基因轉錄的結構基因起始密碼子（一般在約100至1000 bp內）上游（即，5’）的非轉錄序列。啟動子通常分組為兩種類別：誘導型啟動子和組成型啟動子。誘導型啟動子起始處於其控制下的DNA響應於培養條件的某種變化（諸如營養素的存在或不存在，或者溫度變化）以提高的水平轉錄。另一方面，組成型啟動子一致地轉錄其可操作地連接的基因，即，對基因表現具有極小控制或無控制。許多由多種潛在宿主細胞識別的啟動子係眾所周知的。藉由限制性酶消化從源DNA移除啟動子，並將所需啟動子序列插入載體中，將適合啟動子可操作地連接至編碼例如本發明之多特異性抗原結合蛋白之重鏈、輕鏈、修飾的重鏈或其他組分的DNA。
用於酵母宿主的適合啟動子在本領域中亦為眾所周知的。酵母強化子有利地與酵母啟動子一起使用。用於哺乳動物宿主細胞的適合啟動子係眾所周知的，且包括但不限於獲自病毒基因組的那些啟動子，該等病毒為諸如多瘤病毒、傳染性上皮瘤病毒、腺病毒（諸如腺病毒2）、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒，以及最較佳的是猿猴病毒40（SV40）。其他合適的哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。
可能有意義的其他啟動子包括但不限於：SV40早期啟動子（Benoist和Chambon, 1981, Nature [自然] 290:304-310）；CMV啟動子（Thornsen等人, 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.[美國國家科學院院刊] 81:659-663）；勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）的3'長末端重複序列中所含的啟動子（Yamamoto等人, 1980, Cell [細胞] 22:787-797）；皰疹胸苷激酶啟動子（Wagner等人, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 78: 1444-1445）；來自金屬硫蛋白基因的啟動子和調節序列（Prinster等人, 1982, Nature [自然] 296:39-42）；和原核啟動子，例如β-內醯胺酶啟動子（Villa-Kamaroff等人, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 75:3727-3731）；或tac啟動子（DeBoer等人, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 80:21-25）。有意義的還有以下動物轉錄控制區，它們表現出組織特異性並已用於轉基因動物中：在胰臟腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區（Swift等人, 1984, Cell [細胞] 38:639-646；Ornitz等人, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. [冷泉港定量生物學研討會] 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology [肝臟病學] 7:425-515）；在胰臟β細胞中具有活性的胰島素基因控制區（Hanahan, 1985, Nature [自然] 315: 115-122）；在淋巴樣細胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區（Grosschedl等人, 1984, Cell [細胞] 38:647-658；Adames等人, 1985, Nature [自然] 318:533-538；Alexander等人, 1987, Mol. Cell.Biol. [分子細胞生物學] 7: 1436-1444）；在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中具有活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區（Leder等人, 1986, Cell [細胞] 45:485-495）；在肝中具有活性的白蛋白基因控制區（Pinkert等人, 1987, Genes and Devel. [基因與發育] 1:268-276）；在肝中具有活性的α-胎蛋白基因控制區（Krumlauf等人, 1985, Mol. Cell. Biol. [分子細胞生物學] 5: 1639-1648；Hammer等人，1987, Science [科學] 253:53-58）；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區（Kelsey等人, 1987, Genes and Devel. [基因與發育]1: 161-171）；在骨髓細胞中具有活性的β-球蛋白基因控制區（Mogram等人, 1985, Nature [自然] 315:338-340；Kollias等人, 1986, Cell [細胞] 46:89-94）；在腦中的寡樹突細胞中具有活性的髓磷脂鹼性蛋白基因控制區（Readhead等人, 1987, Cell [細胞] 48:703-712）；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區（Sani, 1985, Nature [自然] 314:283-286）；和在下視丘中具有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區（Mason等人, 1986, Science [科學] 234: 1372-1378）。
可以將強化子序列插入載體中以增加高等真核細胞中編碼多特異性抗原結合蛋白的組分（例如，輕鏈、重鏈、修飾的重鏈、Fd片段）的DNA的轉錄。強化子為DNA的順式作用元件，長度通常為約10-300 bp，作用於啟動子以增加轉錄。強化子在取向和位置方面為相對獨立的，已見於轉錄單元的5'和3'位置。已知可得自哺乳動物基因的幾種強化子序列（例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素）。然而，典型地使用來自於病毒的強化子。本領域中已知的SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子和腺病毒強化子係用於激活真核啟動子的例示性強化元件。儘管強化子可以定位於載體中編碼序列的5'或3'，但其典型地位於啟動子5'的位點處。可將編碼適當天然或異源訊息序列（前導序列或訊息肽）的序列併入表現載體中，以促進抗體的細胞外分泌。訊息肽或前導序列的選擇取決於待產生抗體的宿主細胞的類型，且異源訊息序列可替換天然訊息序列。訊息肽之實例在上文有描述。在哺乳動物宿主細胞中起作用的其他訊息肽包括美國專利案號4,965,195中所述之介白素-7（IL-7）的訊息序列；Cosman等人, 1984, Nature [自然] 312:768中所述之介白素-2受體的訊息序列；歐洲專利案號0367 566中所描述的介白素-4受體訊息肽；美國專利案號4,968,607中所述之I型介白素-1受體訊息肽；歐洲專利案號0 460 846中所描述之II型介白素-1受體訊息肽。
可由起始載體（例如可商購載體）構建所提供的表現載體。該等載體可含有或可不含所有所需側接序列。在載體中不存在一或多個本文所述之側接序列的情況下，其可以獨立地獲得且連接到載體中。用於獲得各側接序列之方法係熟悉該項技術者熟知的。可以將表現載體引入宿主細胞中，由此產生由如本文所述之核酸所編碼的蛋白質，包括融合蛋白。
在某些實施方式中，可以將編碼本發明之多特異性抗原結合蛋白的不同組分的核酸插入相同表現載體中。在此類實施方式中，該兩個核酸可以由內部核糖體進入位點（IRES）隔開且處於單一啟動子控制下，由此使輕鏈和重鏈由相同mRNA轉錄物表現。可替代地，該兩個核酸可以處於兩個獨立啟動子控制下，由此使輕鏈和重鏈由兩個獨立的mRNA轉錄物表現。
類似地，對於IgG-scFv多特異性抗原結合蛋白，可以將編碼輕鏈的核酸選殖到與編碼修飾的重鏈的核酸相同的表現載體中（包含重鏈和scFv的融合蛋白），其中兩個核酸受單個啟動子控制並被IRES分開，或者其中兩個核酸受兩個單獨的啟動子控制。對於IgG-Fab多特異性抗原結合蛋白，編碼三個組分中每一個的核酸可被選殖到相同的表現載體中。在一些實施方式中，編碼IgG-Fab分子的輕鏈的核酸和編碼第二多肽（包含C末端Fab結構域的另一半）的核酸被選殖到一個表現載體中，而編碼修飾的重鏈（包含重鏈和Fab結構域的一半的融合蛋白）的核酸被選殖到第二表現載體中。在某些實施方式中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白的所有組分都從相同的宿主細胞群表現。例如，即使將一或多種組分選殖到單獨的表現載體中，宿主細胞也用兩種表現載體共轉染，使得一個細胞產生多特異性抗原結合蛋白的所有組分。
在已經構建出載體並將編碼本文所述之多特異性抗原結合蛋白各組分的一或多個核酸分子插入一或多個載體的一或多個適當位點中之後，可以將一或多個完整載體插入適當宿主細胞中以進行擴增和/或多肽表現。因此，本發明包括分離的宿主細胞，其包含一或多個編碼多特異性抗原結合蛋白組分的表現載體。如本文所用，術語「宿主細胞」係指已經用核酸轉化或能夠用核酸轉化並且由此表現目的基因的細胞。該術語包括親本細胞的後代，無論後代與原始親本細胞在形態或遺傳構成方面是否相同，只要存在目的基因即可。包含本發明之分離核酸較佳的是可操作地連接到至少一個表現控制序列（例如啟動子或強化子）的宿主細胞細「重組宿主細胞」。
可以藉由熟知方法，包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或其他已知技術將抗原結合蛋白的表現載體轉化至所選宿主細胞中。所選擇的方法將部分隨待使用的宿主細胞類型而變化。該等方法和其他適合的方法對於技術者係熟知的，並且闡述於例如Sambrook等人, 2001, 同上中。
宿主細胞當在適當條件下培養時合成抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白隨後可以自培養基收集（若宿主細胞將其分泌至培養基中）或直接由產生該抗原結合蛋白的宿主細胞收集（若其並非分泌的）。適當的宿主細胞的選擇將取決於多種因素，諸如所需表現水平、活性所需或必需的多肽修飾（諸如糖基化或磷酸化）和折疊成生物活性分子的容易性。
示例性宿主細胞包括原核生物細胞、酵母或高等真核細胞。原核宿主細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科（ Enterobacteriaceae）如大腸桿菌屬（ Escherichia），例如大腸桿菌（ E. coli）、腸桿菌屬（ Enterobacter）、伊文氏桿菌屬（ Erwinia）、克留氏菌屬（ Klebsiella）、變形桿菌屬（ Proteus）、沙門氏菌屬（ Salmonella），例如鼠傷寒沙氏桿菌（ Salmonella typhimurium）、鋸桿菌屬（ Serratia），例如黏質沙雷氏菌（ Serratia marcescans）、和志賀桿菌屬（ Shigella）、以及芽孢桿菌屬（ Bacillus），例如枯草桿菌（ B. subtilis）和地衣芽孢桿菌（ B. licheniformis）、假單胞菌屬（ Pseudomonas）、和鏈黴菌屬（ Streptomyces）。真核微生物（如絲狀真菌或酵母）係用於重組多肽的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。不過，多種其他屬、種和菌株係常用的且可用於本文中，例如畢赤酵母屬（ Pichia），例如巴斯德畢赤酵母（ P. pastoris）、裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）；克魯維酵母屬（ Kluyveromyces），耶氏酵母屬（ Yarrowia）；念珠菌屬（ Candida）；瑞氏木黴（ Trichoderma reesia）；紅麵包黴菌（ Neurospora crassa）；許旺酵母屬（ Schwanniomyces），例如西方許旺酵母（ Schwanniomyces occidentalis）；和絲狀真菌，例如像紅黴菌屬（ Neurospora）、青黴菌屬（ Penicillium）、木黴菌屬（ Tolypocladium）和麯黴屬（ Aspergillus）宿主，例如構巢麯黴（ A. nidulans）和黑麯黴（ A. niger）。
用於表現糖基化抗原結合蛋白的宿主細胞可以來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及來自以下宿主的相應的許可性昆蟲宿主細胞，例如草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）（毛蟲），埃及伊蚊（ Aedes aegypti）（蚊子），白紋伊蚊（ Aedes albopictus）（蚊子），黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）（果蠅）和家蠶（ Bombyx mori）。用於轉染此類細胞的多種病毒株係公開可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾（ Autographa californica）NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株。
脊椎動物宿主細胞亦為合適的宿主，且由此類細胞重組產生抗原結合蛋白已成為常規程序。可用作表現的宿主的哺乳動物細胞系係本領域熟知的，並且包括但不限於可從美國典型培養物保藏中心（ATCC）獲得的永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，包括CHOK1細胞（ATCC CCL61）、DXB-11、DG-44和中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77: 4216, 1980）；由SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚胎腎系（293細胞或亞選殖用於在懸浮培養中生長的293細胞（Graham等人, J. Gen Virol. [普通病毒學雜誌] 36: 59, 1977）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；小鼠塞托利細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. [生殖生物學] 23: 243-251, 1980）；猴腎細胞（CV1、ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝癌細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562, ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等人, Annals N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 383: 44-68, 1982）；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞，以及許多其他的細胞系。在另一實施方式中，可以自B細胞譜系選擇不產生自身抗體但能夠製備並分泌異源抗體的細胞系。在一些實施方式中，CHO細胞係用於表現本發明之多特異性抗原結合蛋白的較佳的宿主細胞。
宿主細胞用上述核酸或載體轉化或轉染以產生多特異性抗原結合蛋白且在經適當改善的常規營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉化株或擴增編碼所需序列的基因。此外，具有由選擇性標記物隔開的多個轉錄單元拷貝的新穎載體和經轉染細胞系特別適用於表現抗原結合蛋白。因此，本發明還提供了製備本文所述之多特異性抗原結合蛋白之方法，該方法包括在允許由本文所述之一或多種表現載體編碼的多特異性抗原結合蛋白表現的條件下，在培養基中培養包含該一或多種表現載體的宿主細胞；並且從該培養基中回收該多特異性抗原結合蛋白。
用於產生本發明之抗原結合蛋白的宿主細胞可以在多種培養基中培養。諸如Ham's F10（西格瑪公司（Sigma））、最小必需培養基（（MEM），（西格瑪公司））、RPMI-1640（西格瑪公司）和杜爾貝科改良型伊戈爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（（DMEM），西格瑪公司））等可商購培養基適用於培養宿主細胞。另外，在Ham等人, Meth. Enz. [酶學方法] 58: 44, 1979；Barnes等人, Anal. Biochem. [分析生物化學] 102: 255, 1980；美國專利案號4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、或5,122,469、WO 90103430、WO 87/00195、或美國專利註冊案號30,985中描述的任何培養基可以用作宿主細胞的培養基。必要時，該等培養基中的任一種可以補充有激素和/或其他生長因子（例如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩衝液（例如HEPES）、核苷酸（例如腺苷和胸苷）、抗生素（例如健他黴素（Gentamycin™）藥物）、微量元素（定義為通常以在微莫耳濃度範圍內的最終濃度存在的無機化合物）和葡萄糖或等效能量來源。還可以按熟悉該項技術者已知的適當濃度包含任何其他必需的補充劑。培養條件，例如溫度、pH等，係先前與選擇用於表現的宿主細胞一起使用的條件，並且對於通技術者來說係顯而易見的。
在培養宿主細胞後，多特異性抗原結合蛋白可以在細胞內、在周質空間中產生，也可以直接分泌到培養基中。若在細胞內產生抗原結合蛋白，則作為第一個步驟，例如藉由離心或超濾來除去宿主細胞或溶解片段的顆粒狀碎片。雙特異性抗原結合蛋白可以使用例如羥磷石灰層析法、陽離子或陰離子交換層析法、或較佳的是親和層析法、使用一或多種目的抗原或蛋白A或蛋白G作為親和配位基來純化。蛋白A可用於純化包括基於人γ1、γ2或γ4重鏈的多肽的蛋白質（Lindmark等人, J. Immunol. Meth. [免疫學方法雜誌] 62: 1-13, 1983）。對於所有小鼠同種型和對於人γ3推薦蛋白G（Guss等人, EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌] 5: 15671575, 1986）。親和配位基所連接的基質最常為瓊脂糖，但其他基質亦為可用的。在機械上穩定的基質如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許比用瓊脂糖可以實現的更快的流速和更短的處理時間。在蛋白質包含CH3結構域的情況下，將Bakerbond ABX™樹脂（吉提貝可公司（J. T. Baker），新澤西州菲力浦斯堡（Phillipsburg, N.J.））用於純化。根據要回收的特定多特異性抗原結合蛋白，其他用於蛋白質純化的技術例如乙醇沈澱、逆相HPLC、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱亦為可能的。 實例
這種用於多特異性組裝的新穎模組利用了將輕鏈（LC）的C末端連接至其同源的重鏈（HC）的N末端的連接子。單鏈Fab（scFab）模組顯示了優於傳統的多特異性開發的幾個優點。例如，藉由將輕鏈與重鏈共價地連接，這個模組有效地減少多特異性組裝所需的多肽鏈的總數。另外，與Fab轉化為scFv相反，多數Fab可以在不降低穩定性或靶標結合的條件下被轉化為scFab。
此外，可以進一步結合電荷對突變（CPM）的使用以驅動正確的組裝和在單個細胞內的最大化整體表現。因此，scFab模組提供通用的可以根據治療項目的特定需求定制的「隨插即用（plug and play）」工具。
在不同的上下文中含有scFab模組的分子在HEK293細胞中表現，隨後係兩步驟（two-step）ProA/CEX蛋白純化以達到 ＞ 90%的純度。
為了產生單價雙特異性分子，將探索的具有不同長度的G 4Q和G 4S重複的柔性連接子引入到異源IgG支架（「scFab-異源Fc」）中，這將多肽鏈的總數從四條減少到兩條（圖1和圖2）。
當在scFab-異源-Fc分子中每條輕鏈共價連接到其同源的重鏈上時，使用CPM以進一步驅動正確的重-輕鏈配對未改善產量。當在HEK 293-6E細胞中表現且藉由ProA和離子交換純化時，該等分子產生了高達45 mg/L的產量（圖3）。
為了產生二價雙特異性，我們探索了在N末端和C末端二者都具有多個重複的柔性G4Q連接子，其將IgG-Fab支架的鏈從三條不同的多肽鏈（總共6條）減少到兩條不同的鏈（總共4條）。（圖1和圖4）。
但是，與以上所述之scFab-異源-Fc形式不同，在這個scFab-Fc-Fab形式中單獨的scFab模組不足以防止重鏈-輕鏈錯配。因此，當溶液中存在游離輕鏈時CPM需要防止錯配驅動的聚集（圖5）。但是，CPM不是必須在C末端Fab臂上。當在HEK 293 6E細胞中表現且藉由ProA和離子交換純化時，單獨將CPM併入scFab模組產生高達80 mg/L的總產量（圖5）。無論多特異性抗原結合蛋白結合哪兩種抗原，這個結果都成立。
在單價雙特異性scFab-異源Fc形式的情況下，scFab模組未顯著影響併入分子的Tm或2Wk40C穩定性（圖6和圖8）。
然後測試該等分子與每個候選物靶標的結合。具有(G4Q)7連接子的scFab模組或C末端Fab都未減少與任何測試的靶抗原的結合（圖7）。 序列表 (G 4Q) 7（SEQ ID NO: 1） GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ κCL （SEQ ID NO: 2）RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC λCL （SEQ ID NO: 3）GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 共有的CH1 （SEQ ID NO: 4）ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 共有的鉸鏈-CH2-CH3 （SEQ ID NO: 5）EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 共有的鉸鏈-CH2-CH3（K590G） （SEQ ID NO: 6）EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG 共有的CH1-鉸鏈-CH2-CH3 （SEQ ID NO: 7）ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 共有的CH1-鉸鏈-CH2-CH3（K590G） （SEQ ID NO: 8）ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG （SEQ ID NO: 9） GGSGGGGS （SEQ ID NO: 10） GGSGGGS （SEQ ID NO: 11） GGGSGGGS （SEQ ID NO: 12） GGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 13） GGGSGGGSGGGS （SEQ ID NO: 14） GGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 15） GGGSGGGSGGGSGGGS （SEQ ID NO: 16） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 17） GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS （SEQ ID NO: 18） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 19） GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS （SEQ ID NO: 20） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 21） GGGGQGGGGQ （SEQ ID NO: 22） GGGGQGGGGQGGGGQ （SEQ ID NO: 23） GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ （SEQ ID NO: 24） MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC （SEQ ID NO: 25） MAWALLLLTLLTQGTGSWA （SEQ ID NO: 26） MTCSPLLLTLLIHCTGSWA （SEQ ID NO: 27） MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG （SEQ ID NO: 28） MEWTWRVLFLVAAATGAHS （SEQ ID NO: 29） METPAQLLFLLLLWLPDTTG （SEQ ID NO: 30） METPAQLLFLLLLWLPDTTG （SEQ ID NO: 31） MKHLWFFLLLVAAPRWVLS （SEQ ID NO: 32） MEWSWVFLFFLSVTTGVHS （SEQ ID NO: 33） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 34） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS （SEQ ID NO: 35） GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ （SEQ ID NO: 36） GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ
無
[圖1]描繪了異源IgG和IgG-Fab分子以及使用scFab以產生單價和二價雙特異性分子之示意圖。
[圖2]描繪了scFab模組產生5種單價雙特異性形式之各種實施方式。「v103」係指重電荷對突變（在一條重鏈上K392D、K409D和K439D取代，在另一條重鏈上E356K和D399K取代）。「v503」係指與重鏈/輕鏈電荷配對突變（對於一個HC/LC對，HC1 S183K/LC1 S176E，而對於另一個HC/LC對，HC2 S183E/LC2 S176K）組合的v103突變。考慮v503的另一個方式係將v103與v1組合。
[圖3]描繪了將3個雙特異性程式轉化為(G 4Q) 7scFab-異源Fc形式產生了範圍從5-45 mg/L的最終產量。對於(G 4Q) 7scFab-異源Fc（v103），最終產量（淺藍色）有輕微的益處。
[圖4]描繪了scFab模組產生6種二價雙特異性形式之各種實施方式。「v1」係指重鏈/輕鏈電荷配對突變（對於一個HC/LC對，HC1 S183K/LC1 S176E，而對於另一個HC/LC對，HC2 S183E/LC2 S176K）。
[圖5]描繪了將6個雙特異性程式轉化為(G 4Q) 7scFab-Fc-Fab證明二價雙特異性(G 4Q) 7scFab-Fc-Fab形式需要CPM。在所有的Fab臂中使用CPM有一些益處，但是當scFab模組含有CPM且Fab臂不含有CPM時對總產量有最大益處。
[圖6]描繪了各種連接子不影響scFab模組的Tm，但是更長的連接子（＞(G 4Q) 7）可能對在scFab-異源Fc單價雙特異性分子中的2Wk40C穩定性產生負面影響。
[圖7]描繪了將兩個mAb組合成二價雙特異性IgG-Fab或scFab_v1-Fc-Fab_v1 (G 4Q) 7不影響與各自靶標的結合親和力。
[圖8]描繪了構建體在40°C下兩週後之穩定性數據。
無
 

          <![CDATA[<110>  美商安進公司（AMGEN INC.）]]>
          <![CDATA[<120>  多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子]]>
          <![CDATA[<130>  A-2670-WO-PCT]]>
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          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly 
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          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
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          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
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          Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 
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              50                  55                  60                  
          Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 
                          85                  90                  95      
          Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
                      100                 105     
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          <![CDATA[<211>  98]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
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          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 
              130                 135                 140                 
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
                          165                 170                 175     
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  6]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 
              130                 135                 140                 
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
                          165                 170                 175     
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 
          225                 230         
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          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
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          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  8]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          gggsgggsgg gsgggsgggs gggs                                              24
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Gln 
                      20  
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Gly Ala Arg Cys 
                      20          
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Trp Ala 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Met Thr Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile His Cys Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Trp Ala 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Thr Thr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Met Glu Trp Thr Trp Arg Val Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala His Ser 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Thr Thr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Thr Thr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 
          1               5                   10                  15      
          Val Leu Ser 
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  35]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser 
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          <![CDATA[<400>  34]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
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          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly 
                      20                  25                  30          
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          Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 
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          Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 
                      20                  25                  30
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Claims (31)

  1. 一種抗原結合蛋白，其包含至少一種單鏈Fab，其中該單鏈Fab包含： VH-CH1多肽和 VL-CL多肽 其中該VH-CH1多肽和該VL-CL多肽經由肽連接子連接，該肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少90%相同的序列組成。
  2. 如請求項1所述之抗原結合蛋白，其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少94%相同的序列組成。
  3. 如請求項1所述之抗原結合蛋白，其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1至少97%相同的序列組成。
  4. 如請求項1所述之抗原結合蛋白，其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 100%相同的序列組成。
  5. 如任一前述請求項所述之抗原結合蛋白，其中該VL-CL多肽的C末端連接到該肽連接子之N末端並且該VH-CH1多肽的N末端連接到該肽連接子之C末端。
  6. 如任一前述請求項所述之抗原結合蛋白，其中該VH-CH1多肽在其C末端連接到絞鏈-CH2-CH3多肽的N末端。
  7. 如請求項6所述之抗原結合蛋白，其中該絞鏈-CH2-CH3多肽包含選自由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6組成之群組的胺基酸序列。
  8. 如任一前述請求項所述之抗原結合蛋白，其中該VL-CL多肽的CL部分包含選自由SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成之群組的胺基酸序列。
  9. 如任一前述請求項所述之抗原結合蛋白，其中該VH-CH1多肽的CH1部分包含SEQ ID NO: 4。
  10. 如請求項1-4中任一項所述之抗原結合蛋白，其中 i) 該VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  11. 如請求項1-4中任一項所述之抗原結合蛋白，其中 i) 該VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 ii) 該VL-CL多肽包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  12. 一種多特異性抗原結合蛋白，其包含第一和第二多肽，其中 該第一多肽包含連接到第一肽連接子之N末端的第一VL-CL多肽並且該第一肽連接子之C末端連接到第一抗體重鏈的N末端，其中該第一抗體重鏈包含K/R409D和K392D突變；並且 該第二多肽包含連接到第二肽連接子之N末端的第二VL-CL多肽並且該第二肽連接子之C末端連接到第二抗體重鏈的N末端，其中該第二重鏈包含D399K和E356K突變； 其中該第一肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成； 其中該第二肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成； 其中兩條重鏈中的胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引； 其中該第一VL-CL多肽和該第一抗體重鏈結合第一抗原或表位並且該第二VL-CL多肽和該第二抗體重鏈結合第二抗原或表位。
  13. 如請求項12所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 該第一VL-CL多肽包含S176K突變； 該第一抗體重鏈包含S183E突變； 該第二VL-CL多肽包含S176E突變；並且 該第二抗體重鏈包含S183K突變， 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  14. 如請求項12所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 該第二VL-CL多肽包含S176K突變； 該第二抗體重鏈包含S183E突變； 該第一VL-CL多肽包含S176E突變；並且 該第一抗體重鏈包含S183K突變， 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  15. 如請求項12-14中任一項所述之多特異性抗原結合蛋白，其中該第一抗體重鏈進一步包含K439D突變， 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  16. 一種多特異性抗原結合蛋白，其包含： a) 兩條抗體輕鏈；和 b) 兩種多肽，其包含： 連接到肽連接子之N末端的VL-CL多肽，並且該肽連接子之C末端連接到抗體重鏈的N末端並且該抗體重鏈的C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端； 其中該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與VL-CL多肽締合以形成第一抗原結合位點； 其中b) 的兩種多肽中的該第二VH-CH1多肽與a) 的兩條抗體輕鏈締合以形成第二抗原結合位點；並且 其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
  17. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  18. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  19. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 ii) 該輕鏈包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  20. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 ii) 該輕鏈包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  21. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變； ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變； iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 iv) 該輕鏈包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  22. 如請求項16所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變； ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變； iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 iv) 該輕鏈包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  23. 如請求項16-22中任一項所述之多特異性抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-23組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
  24. 一種多特異性抗原結合蛋白，其包含： a) 兩條抗體輕鏈；和 b) 兩種多肽，其包含： 抗體重鏈，其中該抗體重鏈的C末端連接到VL-CL多肽的N末端並且該VL-CL多肽的C末端連接到肽連接子之N末端並且該肽連接子之C末端連接到第二VH-CH1多肽的N末端； 其中b) 的兩種多肽中的該抗體重鏈包含第一VH-CH1多肽，其與a) 的抗體輕鏈締和以形成第一抗原結合位點 其中該第二VH-CH1多肽，其與該VL-CL多肽締和以形成第二抗原結合位點；並且 其中該肽連接子由與SEQ ID NO: 1 90%、94%、97%或100%相同的胺基酸序列組成。
  25. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 ii) 該VL-CL多肽包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  26. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  27. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 ii) 該輕鏈包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  28. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 ii) 該輕鏈包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  29. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183K突變； ii) 該第一VL-CL多肽包含S176E突變； iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183E突變；並且 iv) 該輕鏈包含S176K突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  30. 如請求項24所述之多特異性抗原結合蛋白，其中 i) 該第一VH-CH1多肽包含S183E突變； ii) 該第一VL-CL多肽包含S176K突變； iii) 該第二VH-CH1多肽包含S183K突變；並且 iv) 該輕鏈包含S176E突變； 其中胺基酸殘基的編號係根據Kabat中列出的EU索引。
  31. 如請求項24-22中任一項所述之多特異性抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈的C末端經由選自由SEQ ID NO: 9-30組成之群組的第二肽連接子連接到該第二VH-CH1多肽的N末端。
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