EA003998B1 - ДИМЕРНЫЕ ТРОМБОПОЭТИНОВЫЕ ПЕПТИДНЫЕ МИМЕТИКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ Mpl РЕЦЕПТОР И ИМЕЮЩИЕ ТРОМБОПОЭТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к соединениям, в особенности пептидам или полипептидам, которые обладают тромбопоэтической активностью. Такие соединения могут использоваться для увеличения числа тромбоцитов или предшественников тромбоцитов (например, мегакариоцитов) у млекопитающих.

Description

В целом, изобретение относится к соединениям, в частности, пептидам и полипептидам, которые обладают тромбопоэтической активностью. Заявленные соединения могут быть использованы для увеличения образования тромбоцитов или предшественников тромбоцитов (например, мегакариоцитов) у млекопитающих.

Сущность изобретения

Изобретение относится к соединениям, в частности, пептидам, которые способны стимулировать ίη νίίτο и ίη νίνο образование тромбоцитов и их предшественников, таких, как мегакариоциты. Прежде, чем обсуждать природу заявленных соединений, остановимся на описании двух белков, обладающих тромбопоэтической активностью: тромбопоэтина (ТРО) и фактора роста и развития мегакариоцитов (МОЭБ).

Клонирование эндогенного тромбопоэтина (ТРО) (Ьок е1 а1., КЯиге 369: 568 - 571 (1994); Вагбеу е1 а1., Се11 77: 1117-1124 (1994); КШег е1 а1., Ргос. Νί01. Асаб. Зск ИЗА 91: 11104-11108 (1994); бе Заитаде еί а1., №|Шге 369: 533-538 (1994); Кай еί а1., 1оита1 οί ВюсЬет181гу 119: 229-236 (1995); СЬапд οί а1., 1оита1 οί Вю'1одюа1 СйстЩгу 270: 511-514 (1995)) быстро расширило наши знания о мегакариопоэзе (образовании мегакариоцитов) и тромбопоэзе (образовании тромбоцитов). Эндогенный ТРО человека представляет собой гликозилированный белок размером 60 - 70 кДа, состоящий из 332 аминокислот, в первую очередь образующийся в печени и почках (Вагбеу е1 а1., Се11 77: 1117-1124 (1994); СЬапд е1 а1., 1оигпа1 οί Вю1одюа1 СЬетэзбу 270: 511 - 514 (1995)). Белок является высококонсервативным у различных видов и имеет 23% гомологии с эритропоэтином человека (Оигпеу е1 а1., В1ооб 85: 981-988 (1995)) на аминоконцевом участке (аминокислоты 1 - 172) (Вагбеу е1 а1., Се11 77: 1117-1124 (1994)). Показано, что эндогенный ТРО обладает всеми свойствами ключевого биологического регулятора тромбопоэза. Его активность ίη νίίτο включает специфическую индукцию мегакариоцитных колоний как из очищенных гематопоэтических стволовых клеток мыши (2е1д1ег е1 а1., В1ооб 84: 4045-4052 (1994)) и СЭ34' клеток человека (Ьок е1 а1., №Шге 369: 568-571 (1994); Казко е1 а1., 81ет Се11з 15: 33:42 (1997)), генерацию развития мегакариоцитов с повышенной плоидностью (Вгоибу е1 а1., В1ооб 85:402-413 (1995)) и индукцию окончательного созревания мегакариоцитов и образования тромбоцитов (2щд1ег е1 а1., В1ооб 84: 4045-4052 (1994); СЬо1 й а1., В1ооб 85: 402413 (1995)). Наоборот, синтетические антисмысловые олигодезоксинуклеотиды к рецептору ТРО (с-Мр1) значительно ингибируют колониеобразующую способность предшественников мегакариоцитов (Мебиа е1 а1., В1ооб 82: 13951401 (1993)). Более того, с-Мр1нокаутированные мыши страдают тяжелой тромбоцитопенией и дефицитны по мегакарио цитам (А1ехапбег е1 а1., В1ооб 87: 2162-2170 (1996)).

Рекомбинантный ΜΟΌΡ человека (гНиМОЭБ, Атдеп 1пс., ТЬоизапб Оакз, СА) представляет собой другой тромбопоэтический полипептид, родственный ТРО. Он получен при использовании бактерий Е. со11, трансформированных плазмидой, содержащей кДНК, кодирующей усеченный белок, соответствующий аминоконцевому связывающему рецептор домену ТРО человека (ИИсЬ е1 а1., В1ооб 86: 971976 (1995)). Полипептид экстрагируют, переукладывают и очищают; далее к аминоконцевому участку присоединяют полиэтиленгликоль (ПЭГ). Полученное в результате соединение обозначают как РЕС-гНиМСЭБ или МСЭБ для краткости.

Различные исследования на животных моделях (ЦИсЬ, Т. К. е1 а1., В1ооб 86: 871-976 (1995); Нокот, Μ. М. й а1., В1ооб 86: 4486-4492 (1995)) явным образом продемонстрировали терапевтическую эффективность ТРО и МСЭБ при трансплантации костного мозга и терапии тромбоцитопении, которая часто возникает в результате химиотерапии или радиационной терапии. Предварительные данные, полученные на людях, подтвердили полезность МСЭБ для повышения количества тромбоцитов в различных случаях. (Ваззег е1 а1., Бапсе1 348: 127981/1996); Кай е1 а1., 1оита1 οί ВюсЬетэзбу 119: 229-236 (1995); ИБсЬ й а1., В1ооб 86: 971-976 (1995)). МСЭБ может быть использован для увеличения количества донорных тромбоцитов, поскольку введение МСЭБ повышает число циркулирующих тромбоцитов примерно в 3 раза по сравнению с первоначальным у здоровых доноров тромбоцитов.

ТРО и МСЭБ проявляют свое действие посредством связывания с с-Мр1-рецептором, который преимущественно экспрессируется на поверхности некоторых гематопоэтических клеток, таких как мегакариоциты, тромбоциты, СЭ34 клетки и примитивные клетки-предшественники (ЭеЫН. Ν. е1 а1., В1ооб 85: 391-401 (1995); бе Западе, Б. 1. е1 а1., №11иге 369: 533538 (1994); Вагбеу, Т. Ό. й а1., Се11 77: 11171124 (1994); Ьок, 8. й а1., №Шге 369: 565-8 (1994)). Подобно большинству рецепторов для интерлейкинов и белковых гормонов, с-Мр1 принадлежит к классу I суперсемейства цитокиновых рецепторов (У1доп, I. е1 а1., Ргос. Νηί1. Асаб. 8с1. ИЗА 89: 5640-5644 (1992)). Активация указанного класса рецепторов включает индуцированную лигандом гомодимеризацию рецептора, которая, в свою очередь, запускает каскад передающих сигнал реакций.

В целом, взаимодействие белкового лиганда с соответствующим рецептором часто имеет место на относительно протяженной поверхности раздела. Однако, как показано в случае связывания гормона роста человека со своим рецептором, только несколько ключевых остатков на указанной поверхности действительно обеспечивают наибольший вклад в энергию связывания (С1аск§оп, Т. е! а1., 8с1епсе 267:383-386 (1995)). Указанное обстоятельство, а также тот факт, что основная часть оставшегося белкового лиганда служит только для экспонирования связывающих эпитопов в правильной топологии, позволяет обеспечить поиск активных лигандов много меньшего размера.

С указанной целью использовали фаговую систему экспонирования пептидной библиотеки, как действенную методику идентификации небольших по размеру пептидных миметиков крупных белковых лигандов (8сой, 1. К. е! а1., 8с1епсе 249: 386 (1990); Оеу1ш, 1. 1. е! а1., 8с1епсе 249: 404 (1990)). При использовании указанного подхода были обнаружены небольшие пептидные молекулы, которые действуют как агонисты с-Мр1-рецептора (СЗуййг 8. Е. е! а1., 8с1епсе 276: 1696-1699 (1997)).

В данном исследовании выборочные небольшие пептидные последовательности, экспонированные как белки слияния с белками оболочки нитчатых фагов, были аффинноэлюированы против иммобилизованного с антителами внеклеточного домена с-Мр1 и необходимые фаги были обогащены во втором раунде аффинной очистки. Связывающую селекцию и процесс повторного размножения осуществляли много раз для получения обогащенного пула белков с более высокой связывающей способностью. В результате были изначально получены два семейства с-Мр1-связывающих пептидов, неродственных друг другу по структуре. Затем создавали мутагенизированные библиотеки для дальнейшей оптимизации белков с наилучшей связывающей способностью, что привело к выделению очень активного пептида с 1С₅₀ = 2 нМ и ЕС₅₀ = 400 нМ (СЗуййг 8. Е. е! а1., 8аепсе 276: 1696-1699 (1997)). Указанный пептид из 14 аминокислотных остатков, обозначенный как ТМР (от англ. ТРО М1ше!ю Рерйбе, пептид, имитирующий ТРО), не обнаруживает явной гомологии по аминокислотной последовательности с ТРО или ΜΟΌΕ. Структура ТМР приведена ниже:

11е О1и О1у Рго Тйг Ьеи Агд О1п Тгр Ьеи А1а А1а Агд А1а (8ЕО ГО N0: 1) или

ЕЕСРТШО^кААРА (однобуквенное обозначение аминокислот).

Предварительно, в сходном исследовании миметических пептидов ЕРО с помощью той же самой технологии был обнаружен миметический пептид ЕРО (ЕМР) (^пдй!оп, N. С. е! а1., 8с1епсе 273:458-463 (1996)) и было показано, что он функционирует как димер при связывании сЕРО-рецептором (ЕР0Р). Образованный таким образом комплекс (лиганд)₂/(рецептор)₂ имеет С2 симметрию в соответствии с данными рентгеновской кристаллографии Щупай, О. е! а1., 8с1епсе 273:464-471(1996)). На основе ука занной информации о структуре был сконструирован ковалентно связанный димер ЕМР, у которго С-концевые участки двух ЕМРмономеров были перекрестно сшиты с гибким спейсером и было обнаружено, что он обладает существенно усиленной способностью к связыванию так же, как и ш ушо/ш уйго биоактивностью (XV подкоп, N. С. е! а1., №1Шге Вю!есйпо1оду 15: 1261-1265 (1997)).

Сходная стратегия димеризации Сконцевых участков была применена по отношению к ТРО миметическому пептиду (ТМР) (С’\\'й1а, 8. Е. е! а1., 8с1епсе 276: 1696-1699 (1997)). Было обнаружено, что димер ТМР, связанный по С-концевому участку (С-С связь), обладает улучшенной связывающей аффинностью 0,5 нМ и существенно увеличенной активностью ш уйго (ЕС₅₀ = 0,1 нМ) в исследовании клеточной пролиферации (С’\\зг1а, 8. Е. е! а1., 8с1епсе 276: 1696-1699 (1997)). Структура указанного С-С димера ТМР приведена ниже:

Согласно другому аспекту изобретения, тандемные димеры могут быть далее прикреплены к одной или более структурам, которые происходят из иммуноглобулиновых белков, преимущественно относящихся к Ес-участку таких иммуноглобулинов. Полученные в результате соединения представляют собой белки слияния Ес и тандемных димеров.

Ниже приведено краткое описание Есучастков антител, которое полезно для понимания некоторых аспектов заявленного изобретения.

Антитела состоят из двух функционально независимых участков, вариабельного домена, известного как Еай, который связывает антиген, и константного домена, известного как Ес, который обеспечивает эффекторные функции антител, например, связывание комплемента и фагоцитоз. Ес-участок иммуноглобулинов имеет продолжительное время полужизни в плазме крови, в то время как Еай-домен - короткое (Сароп, е! а1., Уинге 337: 525-531 (1989)).

Терапевтические белковые продукты конструируют при использовании Ес-домена для прикрепления к целевому белку с целью обеспечения более продолжительного времени полужизни целевого белка или придания такому белку функций, свойственных Ес-участку иммуноглобулинов, а именно связывания с Есрецептором, связывания с белком А, связывания комплемента и переноса через плацентарный барьер (Сароп, е! а1., №1Шге 337: 525-531 (1989)). Например, Ес-участок антитела 1дО1 был слит С'О30-а, молекулой, которая связывает СО30 рецепторы, экспрессируемые на опухолевых клетках при болезни Ходжкина, анаплазийных лимфомных клетках, Т-клетках при лейкозе и других типах клеток при злокачественных опухолях. См., например, патент США 5 480 981. 1Ь-10, антивоспалительный, препятствующий отторжению агент был слит с Есу2а мыши для увеличения его времени полужизни при циркуляции в крови, которое обычно короткое (Ζ1ιοη§. X. е1 а1., ТПе 1оитпа1 о£ 1тшипо1оду, 154: 55905600 (1995)). Также было обеспечено использование рецептора фактора некроза опухолей, связанного с Ес-участком 1д61 человека, для лечения больных с септическим шоком (Е1кйет, С. е1 а1., N. Εη§1. 1. Меб., 334: 1697-1702 (1996); Уап Ζее, К. е1 а1., Тйе 1оитпа1 о£ 1тшипо1оду, 156: 2221-2230 (1996)). Ес-участок также был слит с 604-рецептором для получения терапевтического белка с целью лечения СПИДа. См. Сароп е1 а1., №1ите, 337: 525-531 (1989). Кроме того, интерлейкин-2 был слит с Ес-участком 1д61 или 1д63 для увеличения его короткого времени полужизни и преодоления системной токсичности. См., НатуШ е1 а1., 1ттипо1есйпо1оду, 1:95105(1995).

При известности и доступности ТРО и М6ИЕ существует потребность в разработке дополнительных соединений, обладающих биологической активностью в отношении стимулирования продукции тромбоцитов (тромбопоэтическая активность) и/или клеток-предшественников тромбоцитов, в особенности, мегакариоцитов (мегакариопоэтическая активность). Настоящее изобретение относится к новым соединениям, обладающим такой активностью, и соответствующим объектам.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к группе соединений, которые способны связываться с с-Мр1-рецептором, который является тем же самым рецептором, что и рецептор, опосредующий активность эндогенного тромбопоэтина (ТРО), и за счет этого, т. е. активации указанного рецептора, запускать трансмембранный сигнал. Таким образом, заявленные соединения обладают тромбопоэтической активностью, т. е. способностью стимулировать ίη У1Уо и ίη У11то продукцию тромбоцитов, и/или мегакариоцитарной активностью, т. е. способностью стимулировать ίη угуо и ίη уйто продукцию предшественников тромбоцитов.

Согласно первому предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленные соединения имеют следующую общую структуру: ТМР1-(Ь1)_п-ТМР₂, где ТМР₁ и ТМР₂ каждый независимо друг от друга выбраны из группы соединений, имеющих коровую структуру:

Х2 - Х3- Х4 - Х5 - Х6 - Х7 - Х8 - Х9 - Х10, причем

Х₂ выбран из группы, включающей 61и, Акр, Ьук и Уа1;

Х₃ выбран из группы, включающей С1у и

А1а;

Х₄ представляет собой Рго;

Х₅ выбран из группы, включающей Т11Г и 8ет;

Х₆ выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а и Рйе;

Х₇ выбран из группы, включающей Агд и Ьук;

Х₈ выбран из группы, включающей Ο1η, Ακη и С1ц;

Х₉ выбран из группы, включающей Тгр, Туг и Рйе;

^Х10 выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а, Рйе, Ме1 и Ьук;

Ь₁ представляет собой линкер, как здесь описано, и η является 0 или 1;

заявлены также физиологически приемлемые соли указанных соединений.

В одном случае Ь₁ представляет собой (61у)_п, где η равняется 1-20 и когда η больше 1, то до половины остатков С1у могут быть замещены другими аминокислотными остатками, выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров.

Помимо коровой структуры Х₂-Х₁₀, показанной выше для ТМР! и ТМР₂, возможны также другие родственные структуры, причем один или более из указанных ниже элементов добавляется к ТМР1 и/или ТМР₂ коровой структуре: Х₁ прикрепляется к Ν-концевому участку и/или Хц, Х₁₂, Х1₃ и/или Х₁₄ прикрепляются к Сконцевому участку, причем Х_ь Х₁₂, Х₁₃ и Х₁₄ имеют следующую структуру:

X_I выбран из группы, включающей 11е, А1а, Уа1, Ьеи, 8ет и Агд;

X_II выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, Рйе, 8ет, Тйт, Ьук, Ηίκ и 61и;

Х₁₂ выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, Рйе, С1у, 8ет и Ο1η;

Х₁₃ выбран из группы, включающей Агд, Ьук, Т11Г Уа1, Акп, 61η и 61у, и

Х14 выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, Рйе, Тйт, Агд, 61и и 61у.

В другом предпочтительном случае заявленные соединения имеют общую формулу:

^(Ес)т ^{- (Ε}2⁾ς ^{- ТМР}1 ^{- (}Ь1⁾п ^{- ТМР}2 ^- (Ь₃ ⁾г (Ес)р, причем ТМР!, ТМР₂ и η описаны выше; Ь_ь Ь₂ и Ь₃ представляют собой линкерные группы, которые каждая по себе независимо друг от друга выбраны из линкерных групп, описываемых здесь; Ес представляет собой Ес-участок иммуноглобулина (как определено здесь ниже); значения т, р, с.| и г каждое по себе независимо друг от друга выбраны из группы, включающей 0 и 1, причем по крайней мере одно из значений т или р равно 1 и далее, если т равно 0, то с.| равно 0, и если р равно 0, то г равно 0; также заявлены физиологически приемлемые соли указанных соединений.

В одном случае Ц представляет собой (О1у)_п, где η равняется 1-20 и когда η больше 1, то до половины остатков С1у могут быть замещены другими аминокислотными остатками, выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров.

Производные описанных выше соединений (охарактеризованные ниже) также входят в объем изобретения.

Соединения в соответствии с настоящим изобретением преимущественно являются пептидами и могут быть получены стандартными синтетическими методами или любыми другими методами получения пептидов. Те заявленные соединения, которые относятся к пептидным веществам, могут быть синтезированы стандартными реакциями, известными из органической химии, дополнительно к обычным реакциям, известным из химии пептидов, когда это необходимо.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением соединения могут быть использованы для профилактических или терапевтических целей путем включения их в подходящие фармацевтически приемлемые материалыносители и введения в эффективном количестве индивидууму, например, человеку (или другому млекопитающему). В объем настоящего изобретения также включены другие родственные объекты.

Краткое описание фигур

Многочисленные другие аспекты и преимущества изобретения будут более понятны из детального описания, в котором приведены отсылки на следующие иллюстрации.

На фиг. 1 показаны Ре полинуклеотидная и белковая последовательность (8ЕО ΙΌ N0:3 кодирующая цепь в направлении считывания 503'; 8Е0 ΙΌ N0:4 представляет собой комплементарную цепь в направлении считывания 305'; 8Е0 ΙΌ N0:5 является кодируемой аминокислотной последовательностью) ΙβΟ1 человека, которые могут быть использованы для получения Рс-слитых соединений, заявленных в соответствии с изобретением.

На фиг. 2 приведена схема получения пэгированного пептида 19 (8Е0 ΙΌ N0:17).

На фиг. 3 приведена схема получения пэгированного пептида 20 (8Е0 ΙΌ N0:18).

На фиг. 4 показано число тромбоцитов, образовавшихся ίη νίνο у нормальных самок мышей ΒΌΡ1, обработанных в дозе 100 мкг/кгболюсной инъекцией различных соединений, представленных следующим образом: РЕОМОИР обозначает нативный ТРО человека, к N концевой аминогруппе которого путем восстановительного аминирования аминокислот 1-63 присоединен РЕО средней мол. массы около 20 кДа, экспрессированный в бактериях Е. сой (поэтому он не является гликозилированным) (см. заявку XV 0 95/26746, озаглавленную «Компози ции и способы стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов»); ТМР обозначает соединение 8Е0 ΙΌ N0:1; ТМР-ТМР обозначает соединение 8Е0 ΙΌ N0:21; РЕО-ТМР-ТМР обозначает соединение 8Е0 ΙΌ N0:18, причем группа РЕО имеет среднюю мол. массу РЕОа, прикрепленного, как показано на фиг. 3; ТМРТМР-Рс определено ниже и Рс-ТМР-ТМР обозначает то же самое, за исключением того, что Рс-группа прикреплена к ^концевому участку, а не к С-концевому участку ТМР-ТМР пептида.

На фиг. 5 показано число тромбоцитов, образовавшихся ίη νίνο у нормальных мышей ΒΌΡ1, обработанных различными соединениями, которые доставлены посредством имплантированного осмотического насоса в 7-дневный период. Соединения определены так же, как указано в описании к фиг. 4.

На фиг. 6А, 6В и 6С показаны схематические диаграммы предпочтительных соединений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. На фиг. 6А показано Рс-соединение слияния, причем Рс-участок слит с ^концевым участком ТМР-димера и представлен мономерной формой (одна цепь). На фиг. 6В показано Рс-соединение слияния, причем Рс-участок слит с ^концевым участком ТМР-димера и представлен димерной формой, а один Рс-мономер прикреплен к ТМР-димеру. На фиг. 6С показано Рс-соединение слияния, причем Рс-участок слит с ^концевым участком ТМР-димера и представлен димерной формой, а каждый Рсмономер прикреплен к ТМР-димеру.

Детальное описание предпочтительных вариантов изобретения

Для того, чтобы найти соединения небольшого размера в качестве терапевтических агентов с наиболее желаемыми свойствами, были сконструированы различные типы димеров ТМР и родственных структур, характеризующиеся тем, что С-концевые участки ТМРпептида были соединены с ^концевыми участками второго ТМР-пептида как непосредственным образом, так и посредством линкера, и далее были исследованы эффекты такой стратегии димеризации на биологическую активность полученных указанным образом димерных молекул. В некоторых случаях указанные так называемые тандемные димеры (С-И-связь) конструируют таким образом, чтобы линкеры находились между двумя мономерами, причем линкеры, предпочтительно, относятся к природным аминокислотам, так, чтобы их можно было синтезировать с помощью рекомбинантных технологий.

Настоящее изобретение основано на обнаружении группы соединений, которые обладают тромбопоэтической активностью и проявляют свою активность путем связывания с эндогенным ТРО-рецептором, а именно с-Мр1.

Соединения и их производные

Согласно первому предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленные соединения имеют следующую общую структуру:

ТМР₁-(Ь₁)_п-ТМР₂, где ТМР₁ и ТМР₂ каждый независимо друг от друга выбраны из группы соединений, имеющих коровую структуру:

Х2 - Хз- Х4 - Х5 - Хб - Х7 - Х₈ - Х9 - Х10, причем

Х₂ выбран из группы, включающей С1и, Акр, Ьук и Уа1;

Х₃ выбран из группы, включающей С1у и А1а;

Х₄ представляет собой Рго;

Х₅ выбран из группы, включающей ТЬг и 8ег;

Х_б выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а и РЬе;

Х₇ выбран из группы, включающей Агд и Ьук;

Х₈ выбран из группы, включающей С1и, Аки и С1и;

Х₉ выбран из группы, включающей Тгр, Туг и РЬе;

Х₁₀ выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а, РЬе, Ме! и Ьук;

Ь₁ представляет собой линкер, как здесь описано, и η является 0 или 1;

заявлены также физиологически приемлемые соли указанных соединений.

В одном случае Ь₁ представляет собой (С1у)_п, где η равняется 1-20 и когда η больше 1, то до половины остатков С1у могут быть замещены другими аминокислотными остатками, выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров.

Помимо коровой структуры Х₂-Х₁₀, показанной выше для ТМР1 и ТМР2, возможны также другие родственные структуры, причем один или более из указанных ниже элементов добавляется к ТМР₁ и/или ТМР₂ коровой структуре: Х₁ прикрепляется к Ν-концевому участку и/или Х11, Х12, Х13 и/или Х14 прикрепляются к Сконцевому участку, причем Х_ь Х₁₂, Х₁₃ и Х₁₄ имеют следующую структуру:

X_I выбран из группы, включающей 11е, А1а, Уа1, Ьеи, 8ег и Агд;

X_II выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе, 8ег, ТЬг, Ьук, Ηίκ и С1и;

Х12 выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе, С1у, 8ег и С1п;

Х₁₃ выбран из группы, включающей Агд, Ьук, ТЬг, Уа1, Акп, С1п и С1у, и

Х14 выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе, ТЬг, Агд, С1и и С1у.

Термин «ТМР» относится к соединению, которое включает по меньшей мере 9 субъединиц (Х₂ - Х₁₀), причем Х₂ - Х₁₀ имеют коровую структуру. Х₂ - Х₁₄ субъединицы предпочти тельно являются аминокислотами, независимым образом выбранными из 20 природных аминокислот, однако, изобретение охватывает соединения, в которых Х₂ - Х₁₄ независимым образом выбраны из группы нетипичных, неприродных аминокислот, хорошо известных из уровня техники. Специфические предпочтительные аминокислоты идентифицированы для каждого положения. Например, Х₂ может быть С1и, Акр, Ьук или Уа1. Здесь применен как трехбуквенный, так и однобуквенный код обозначения аминокислот; в каждом случае используются стандартные аббревиатуры для 20 природных аминокислот или их хорошо известных вариантов. Указанные аминокислоты могут относиться как к Ь, так и к Ό стереоизомерам (за исключением С1у, который не имеет ни Ь, ни Ό стереоизомерии), и ТМРк могут включать комбинации стереоизомеров. Однако Ь-стереоизомеры предпочтительны для всех аминокислот ТМР-цепи. Изобретение также относится к обратным (ревертированным) ТМР-молекулам, когда аминоконцевая и карбокси-концевая последовательности аминокислот ревертированы. Например, реверсия молекулы, в норме имеющей последовательность Х₁ - Х₂ - Х₃, приведет к последовательности Х₃ - Х₂ - Х₁. Изобретение также охватывает обратно ревертированные ТМР-молекулы, причем, подобно ревертированным ТМР, аминоконцевая и карбоксиконцевая последовательности аминокислот ревертированы и остатки, которые в норме являются Ь-энатиомерами в ТМР, изменены с образованием Ό-стереоизомерной формы.

Кроме того, в объем изобретения включены физиологически приемлемые соли ТМРк. «Физиологически приемлемые соли» означают любые соли, в отношении которых известно или будет обнаружено позднее, что они являются физиологически приемлемыми. Некоторые специфические предпочтительные варианты включают ацетат, трифторацетат, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, цитрат, тартрат, гликолят, оксалат.

Также подразумевается, что описанные выше ТМРк могут быть «производными» ТМРк. Такие производные ТМРк включают соединения, в которых осуществлены одна или более описанных ниже модификаций: один или более пептидил [-0(0)ΝΚ-]-мостиков (связей) замещен непептидильным мостиком, таким как -СН₂-карбаматный мостик [-ΟΗ₂-00(0)ΝΚ-]; фосфонатный мостик; -СН₂-сульфонамид [-СН₂8(0)₂ΝΚ-] мостик; мочевина [-ΝΗ^0)ΝΗ-] мостик; -СН2-вторичный амин мостик или алкилированный пептидильный мостик |-ί.'(0)ΝΒ⁶. где К⁶ представляет собой низший алкил]; пептиды, причем Ν-концевой участок дериватизирован в -ΝΚΚ¹ группу; -ΝΚΤ(0)Β группу; -ΝΚΟ(0)0Κ группу; -ΝΚ8(0)₂Β группу; -ΝΗί.’(0)ΝΗΒ группу, где К и К¹ являются водородом или низшим алкилом с условием, что К и К¹ не являются оба водородом; сукцинимидную группу; бензилоксикарбонил -ΝΗ-(ΟΒΖΝΗ-) группу; бензилоксикарбонил -ΝΗ-группу, имеющую от 1 до 3 заместителей фенилового кольца, выбранных из группы, включающей низший алкил, низший алкокси, хлор и бром; и пептиды, в которых свободные С-концевые участки дериватизированы в структуру -С(О)К², где К² выбран из группы, включающей низший алкокси и -ΝΚ³Κ⁴, где К³ и К⁴ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород и низший алкил. Под «низшим» понимается группа, имеющая от 1 до 6 атомов углерода.

Кроме того, в молекулу ТМР могут быть введены модификации индивидуальных аминокислот путем обеспечения реагирования аминокислотных остатков-мишеней пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми группами. Сказанное иллюстрируется следующим.

Лизинильные и аминоконцевые остатки могут реагировать с янтарным ангидридом и ангидридом карбоновой кислоты. Дериватизация такими агентами имеет эффект реверсии заряда лизинильных остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, О-метилизомочевину, 2,4-пентандион и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.

Аргинильные остатки могут быть модифицированы путем реакции с одним или несколькими соответствующими реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2циклогександион и нингидрин. Дериватизация аргинильных остатков требует прохождения реакции в щелочных условиях, поскольку рКа гуанидиновой функциональной группы имеет высокое значение. Более того, указанные реагенты могут взаимодействовать с лизиновыми группами так же, как и с аргинин-гуанидиновыми группами.

Специфическая модификация тирозильных остатков рег ке интенсивно изучалось, особый интерес вызвало введение спектральных меток в тирозильные остатки путем обеспечения реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. В более общих случаях Ν-ацетилимидизол и тетранитрометан могут быть использованы для формирования О-ацетил тирозильных групп и 3-нитропроизводных соответственно.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) могут быть избирательно модифицированы путем обеспечения реакции с карбодиимидами (Κ'-^ΟΝ-Κ¹), такими как 1циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпептил)карбодиимид. Более того, аспартильные или глутамильные остатки могут быть конвертированы в аспарагинильные и глутаминильные остатки путем обеспечения реакции с ионами аммония.

Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто деамидированы по сравнению с соответствующими глутамиловыми и аспартиловыми остатками. Альтернативно, указанные остатки могут быть деамидированы в среднещелочных условиях. Форма указанных остатков также включена в объем заявленного изобретения.

Дериватизация бифункциональными агентами полезна для перекрестного связывания пептидов или их функциональных производных с водонерастворимым поддерживающим матриксом или с другими макромолекулярными носителями. К обычно используемым перекрестно-связывающим агентам относятся, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры 4-азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, в том числе дисукцинимидильные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Νмалеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3[(р-азидофенил)дитио] пропиомидат, обеспечивают образование фотоактивируемых интермедиатов, способных к образованию перекрестных связей в присутствии света. Альтернативно, реакционноспособные водорорастворимые матриксы, такие как углеводы, активированные цианогенбромидом, и реакционноспособные субстраты, описанные в Патентах США 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537 и 4 339 440, могут быть использованы для иммобилизации белка.

Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериловых или треониловых остатков, оксидацию атома серы Сук, метилирование альфа-аминогрупп лизиновых, аргининовых и гистидиновых боковых цепей (СтефШои, Т. Е., Рто!ешк: 8!тис!иге апб Мо1еси1аг Рторетйек, ЭД. Η. Егеетап & Со., 8ап Етапаксо, рр. 79-86 (1983)), ацетилирование Ν-концевого амина и, в некоторых случаях, амидирование С-концевых карбоксильных групп.

Такие дериватизированные группы предпочтительно улучшают одно или более свойств заявленных соединений, в том числе тромбопоэтическую активность, растворимость, абсорбцию, биологическое время полужизни и т. д. Альтернативно, дериватизированные группы обеспечивают то, что полученные соответствующим путем соединения имеют те же самые или практически те же самые свойства, что и соединения, которые не подверглись дериватизации. Указанные группы могут также альтернативным образом элиминировать или ослаб лять какой-либо нежелательный побочный эффект заявленных соединений и тому подобное.

Кроме коровой структуры Х₂-Х₁₀, охарактеризованной выше, специальным образом раскрываются и другие структуры, в частности, те, в которых одна или более дополнительных Х групп прикреплены к коровой структуре. Таким образом, Χί и/или Х_п, Х₁₂, Х_1з и Х₁₄ могут быть прикреплены к коровой структуре. Примерами таких дополнительных структур являются сле дующие:

Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11;

Х₂-Хз-Х₄-Х5-Хб-Х7-Х₈-Х9-Х10-Х11-Х12;

Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х₈-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13;

Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х₈-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14;

Х1-Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х₈-Х9-Хю;

Х1-Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11;

Х1-Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12;

Х1-Х2-Хз-Х4-Х5-Хб-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х1з;

Х1-Х2-Хз-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х1з-Х14, где Х₁-Х₁₄ описаны выше. ТМР₁ или ТМР₂ могут быть одинаковыми или различаться по длине и/или структуре последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения ТМР1 и ТМР2 одинаковы.

Особенно предпочтительна следующая структура ТМР: 11е-С1и-С1у-Рго-Тйг-Беи-Агд-С1п-Тгр-Беи-А1аА1а-Агд-А1а (8ЕО ГО N0:1).

Используемое здесь понятие «имеющее структуру» означает, 1п(ег айа, что соединение может включать дополнительные аминокислоты на С-концевом участке или на обоих участках последовательности. Однако если имеется структура Х₂-Х₁₀, Х₁-Х₁₄ или одна из других последовательностей, приведенных в качестве примеров, остающаяся химическая структура является относительно менее важной. Безусловно, любая структура за пределами коровой структуры Х₂-Х₁₀ или Х₁-Х₁₄ не будет оказывать существенного влияния на тромбопоэтическую активность заявленных соединений. Например, Ν-концевой остаток метионина входит в объем притязаний. Кроме того, несмотря на то, что многие предпочтительные заявленные соедине ния являются тандемными димерами, поскольку содержат два компонента ТМР, другие заявлен ные соединения являются тандемными мультимерами ТМРк, т. е., например, соединениями следующей структуры:

ТМР1 - Т-ТМР2-Ь-ТМРз;

ТМР₁ -Т-ТМР₂-Т-ТМР_з-Ь-ТМР₄;

ТМР₁ -Т-ТМР₂-Т-ТМР_з-Т-ТМР₄-Ь-ТМР₅; причем ТМР1, ТМР2, ТМРз, ТМР4 и ТМР5 могут иметь одинаковую или различную структуру, а каждый из элементов ТМР и Ь определен, как указано здесь, и каждый из линкеров является факультативным. Предпочтительно заявленные соединения включают 2-5 элементов ТМР, особенно предпочтительно 2-з и более предпочтительно 2. В первом случае заявленные

60, более предпочтительно менее 40 аминокислот в целом (т. е. они являются пептидами).

Как указывалось выше, заявленные в соответствии с первым возможным вариантом осуществления изобретения соединения предпочтительно являются ТМР-димерами, которые или связаны непосредственным образом, или с помощью линкерной группы. Мономерные ТМРкомпоненты показаны в соответствующей ориентации считывания от Ν-концевого участка к С-концевому участку слева направо. Таким образом, можно видеть, что заявленные соединения все ориентированы таким образом, что Сконцевой участок ТМР₁ прикреплен непосредственно или с помощью линкера к Ν-концевому участку ТМР₂. Такая ориентация считается тандемной ориентацией и заявленные соединения могут в целом считаться тандемными димерами. Такие соединения рассматриваются как димеры даже в том случае, когда ТМР1 и ТМР2 структурно различны, т. е. в объем изобретения включены как гомодимеры, так и гетеродимеры.

Линкерная группа (Ь₁) не является обязательной. Когда она присутствует, не является критическим фактором ее химическая структура, поскольку она в первую очередь служит спейсером. Линкер должен быть выбран таким образом, чтобы не влиять на биологическую активность конечного соединения, и чтобы иммуногенность конечного соединения существенно не повышалась. Линкер предпочтительно состоит из аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкер представляет собой Υ_η, где Υ представляет собой природную аминокислоту или ее стереоизомер, а п имеет значения от 1 до 20. Таким образом, линкер может включать от 1 до 20 аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, причем аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. В более предпочтительном случае от 1 до 20 аминокислот выбраны из О1у, А1а, Рго, Акп, О1п, Сук, Бук. Более предпочтительно, линкер состоит из большей части аминокислот, которые стерически не затруднены, например, О1у, О1у01у[(01у)2], О1у-61у-О1у[(61у)з]...(61у)20, А1а, 01у-А1а, А1а-01у, А1а-А1а, и т. д. Другие специфические примеры линкеров приведены ниже:

(О1у)_зБук(О1у)₄(8Ер ГО N0:6); (01у)_зАкп О1у 8ег(С1\)_;(8ЕО ГО N0:7) (эти структуры обеспечивают сайт гликозилирования при их получении в рекомбинантных клеточных системах млекопитающих, способных осуществлять гликолизирование по указанным сайтам);

(О1у)зСук(О1у)4(8Ер ГО N0:8) и 01у Рго Акп 01у (8ЕО ГО N0:9).

Например, (О1у)_зБук(О1у)₄ означает 01уС1у-С1у-Бук-С1у-С1у-С1у-С1у. Также является предпочтительной комбинация 01у и А1а.

соединения предпочтительно содержат менее

Возможно использование непептидных линкеров. Например, могут быть использованы алкильные линкеры, такие как -ΗΝ-(0Ή_;)₃-0Ό-. 8 = 20 - 20. Указанные алкильные линкеры могут быть далее замещены стерически незатрудненной группой, такой как низший алкил (например, С1-С₆), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), ΟΝ, ΝΗ₂, фенил и т. д.

К другому типу непептидного линкера относится группа полиэтиленгликоля, например:

-ΗΝ-ΟΗ2-ΟΗ2-(Θ-ΟΗ2-ΟΗ2)η-0-ΟΗ2-ΟΘ-, причем η имеет такое значение, что общая мол. масса линкера варьирует от около 101 до около 5000, предпочтительно, от 101 до 500.

В целом, обнаружено, что линкер длиной около 0-14 субъединиц (например, аминокислот) предпочтителен для тромбопоэтических соединений первого варианта осуществления изобретения.

Пептидные линкеры могут быть изменены с образованием производных тем же самым образом, как указано выше для ТМР8.

Соединения этой первой группы могут быть линейными или циклическими. Понятие «циклический» означает, что, по меньшей мере, два отдельных, т. е. не смежных участка молекулы, соединены друг с другом. Например, амино и карбоксиконцевые участки молекулы могут быть ковалентно связаны с формированием циклической молекулы. Альтернативно, молекула может содержать два или более остатков Су8 (например, в составе линкера), которые обеспечивают циклизацию за счет образования дисульфидных связей. Далее раскрывается, что более одного тандемного пептидного димера могут быть связаны между собой с образованием димера димеров. Таким образом, например, тандемный димер, содержащий остаток Су8, способен сформировать внутримолекулярную дисульфидную связь с Су8 другого такого димера. См., например, соединение 8ЕО ГО N0:20 ниже.

Заявленные соединения могут быть также ковалентно или нековалентно связаны с молекулой-носителем, например, линейным полимером (полиэтиленгликолем, полилизином, декстраном и т. д.), полимером с разветвленной цепью (см., например, патент США 4 289 872, заявитель Оспксп\та11сг с1 а1., выданный 15.09.1981; Патент США 5 229 490, заявитель Тат, выданный 20.07.1993; заявка XV0 93/21259, заявитель Егес11е1 е! а1., опубликованная 28.10.1993), липидом, холестероловой группой (такой, как стероид) или углеводом или олигосахаридом. Другие возможные носители включают один или более водорастворимых полимеров, таких как полноксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах США 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791192 и 4179 337. К другим полезным полимерам, известным из уровня техники, относятся монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлоза или другие полимеры на основе углеводов, поли(№винилпирролидон)полиэтиленгликоль, сополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси указанных полимеров.

ПЭГ-группы, в основном, прикрепляются к заявленным соединениям посредством ацилирования, восстановительного алкилирования, добавления по Михаэлю, тиолового алкилирования или других методов хемоселективного конъюгирования/лигирования реакционноспособной группы ПЭГа (например, альдегидной, аминной, эфирной, тиоловой, α-галоацетиловой, малеимидовой или гидразиновой) с реакционноспособной группой соединения - мишени (например, альдегидной, амминной, эфирной, тиоловой, α-галоацетиловой, малеимидовой или гидразиновой).

Углеводные (олигосахаридные) группы могут быть соответствующим образом прикреплены к тем сайтам, в отношении которых известно, что они являются сайтами гликозилирования в белках. В целом, О-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам серина (Зег) или треонина (Тйт), в то время как Ν-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам аспарагина (А8п), когда они являются частью последовательности А8п-Х-8ет/Тйт, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Структуры Ν-связанных или О-связанных олигосахаридов и остатков сахара в каждом типе молекул различны. Один тип сахара, который обычно обнаруживается в обоих типах молекул, является Ν-ацетилнейраминовой кислотой (известной как сиаловая кислота). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком Νсвязанных и О-связанных олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду могут придавать кислые свойства гликозилированному соединению. Такой (такие) сайт (сайты) могут быть включены в линкер заявленных соединений и предпочтительно гликозилируются клеткой в процессе рекомбинантного получения полипептидных веществ (например, клетками млекопитающих, таких как СНО, ВНК, С08). Однако такие сайты могут быть гликозилированы с помощью синтетических или полусинтетических методов, известных из уровня техники.

Некоторые из заявленных пептидов приведены ниже. Используется однобуквенный аминокислотный код и линкеры выделены скобками для ясности. Дополнительные аббревиатуры ВгАс и РЕС означают бромацетил (ВгСН₂С(О)) и полиэтиленгликоль соответственно.

ЕСРТМ.ЦУЛ.ААКАЛЗРМС-1ЕОРТ1ЛО\УЬААКА (8ΕΟΙΟΝΟ: 10)

ЕаРИЛЦСЬААКА-бСССОСОО-ЕОРТЬКЦСЬААКА (сусИс) |__________________________________| (5Е0 ГО ΝΟ: 11) \

ЕОРТЬК0СЕААЮ\43ОООО<К?С-ЕОРТЕК.ЦСЬААКЛ (Ипеаг) (5Ε<3Π)ΝΟ: 12) (ΚΕΟΠΟΝΟ: 13) (ЗЕЦГОИО: 14)

ЕаРТЕКЦАЬААКА-ООСаОССО-ЕОРТЬКОАТААКА

ШОРТЪКО\УЬАА1и-С<ЗСКвССО-Е<5РТ1.ВД\УТААКА

ЕОР11Л<0та^АКА-С<ЮК(ВгАс)аЗС<ЬЕ6РТи10\У1ААКА (5Е<2ШИО: 15)

ЕОРТШОЗУЕЛЛКУ-СООСОООС-ШСРТЬКОЗУЬААЯА (5ЕЦ ГО ΝΟ: 16)

ЕОРТТЛОЧЕААКА-бвакСРЕОХЗССО-ШСН’ТЬВОХИЛАКА (БЕЦГОИО: 17)

ЕСРТТА0УЛ.ААКА-О(ЮС(РЕО)С<ЭСС-ЕОРТи<01И.ААКА

1ЕОРТЕК.0\УЬААКА-«5<й9О5ОС-ЕеРТЬК0\¥ЬААКА

ШСРТ1310^ААКА<ЮаССС<ЗС-ЕОРТЕК01УЪААКА

I

ЕОРТТ-К.ЦУЛ-ААКА-ССаССа<ЗО-Е<ЗРТЕКрЖ.ААКА (ЗЕЦГОИО: 18) (8Ε(}Π>ΝΟ: 19) (5ЕС) ГО ΝΟ: 20) (5Е() ГО ΝΟ: 21) ^{^}2 из из

Ш6Р1ЪЯ0\УЬААКА<ЮСС<Ю<ЗС-ЕаРТЕК0\УЬААЯА

В каждом из указанных выше соединений предполагается наличие Ν-концевого Ме! (или М при использовании однобуквенного кода). Также в объем изобретения входят мультимеры (например, тандемные и нетандемные, ковалентно связанные и нековалентно связанные) выше указанных соединений.

Во втором варианте осуществления изобретения описанные выше соединения могут быть слиты с одной или более Ре-группами, как непосредственным образом, так посредством линкерных групп. В целом, формула соединений, входящих в указанную группу, следующая: (Рс)_т - (Ь₂)_ч - ТМР| - (Ь₁)_п - ТМР₂ - (Ьз)_г - (Рс)р, причем ТМР₁, ТМР₂ и п описаны выше; Ь₁, и Ь₃ являются линкерными группами, каждая которых независимо друг от друга выбрана линкерных групп, описанных выше; Рс пред ставляет собой участок иммуноглобулина; т, р, с.| и г независимо друг от друга выбраны из группы значений, включающих 0 и 1, причем, по крайней мере, т или р равно 1 и, если т равно 0, то д равно 0, а если р равно 0, то г равно 0; также заявлены физиологически приемлемые соли указанных соединений.

Соответственно, соединения указанной второй группы имеют структурные особенности, как определено для первой группы выше, но они слиты по меньшей мере с одной Рсгруппой как непосредственным образом, так с помощью одной или более линкерных групп.

Рс-последовательность описанных выше соединений может быть выбрана из тяжелой цепи 1дС1 человека(см. ЕШкоп, IV. е1а1.. №.1с1ею Ас1бк Век. 10: 4071-4079 (1982)) или любой другой Рс-последовательности, известной из уровня техники (например, другие классы 1дС включают, но не ограничиваются 1дС2, 1дС3 и 1дС4 или другие 1д).

Хорошо известно, что Рс-участки антител состоят из мономерных полипептидных сегментов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы посредством дисульфидных связей или нековалентным взаимодействием. Число внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных Рс-молекул варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1дС, 1дА, 1дЕ) или подкласса (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1д А1, 1дА2) антител. Используемое здесь понятие «Рс» обычно для мономерных, димерных и мультимерных форм Рс-молекул. Следует отметить, что Рс-мономеры спонтанно димеризуются, когда в молекуле имеются соответствующие остатки Сук и не создадутся условия, предотвращающие димеризацию посредством дисульфидных связей. Даже если остатки Сук, которые в норме формируют дисульфидные связи в Рсдимере, удаляют или замещают другими остатками, мономерные цепи обычно димеризуются посредством нековалентных взаимодействий. Используемый здесь термин Рс означает какуюлибо из указанных форм: нативный мономер, нативный димер, нативный димер (связанный дисульфидной связью), модифицированные димеры (связанные дисульфидными связями и/или нековалентно) и модифицированные мономеры (т. е. производные).

Варианты, аналоги или производные Рсучастка могут быть получены, например, путем различных замещений остатков аминокислот или последовательностей.

Варианты (или аналоги) полипептидов включают инсерционные варианты, причем один или более аминокислотных остатков добавляют к аминокислотной последовательности Рс. Инсерции могут быть локализованы на одной или обеих концевых последовательностях белка или могут генерироваться на внутренних участках аминокислотной последовательности Рс. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концевых участках могут включать, например, белки слияния или белки, содержащие аминокислотные метки или характерные структуры. Например, Рс-молекула может необязательно содержать Ν-концевой Мек особенно в тех случаях, когда молекула рекомбинантным образом экспрессируется в бактериальных клетках, например, Е. сой.

В Рс-делеционных вариантах один или более аминокислотных остатков в Рс-полипептиде удалены. Делеции могут затрагивать один или оба концевых участков полипептида Рс или же один или более аминокислотных остатков могут быть удалены в пределах аминокислотной последовательности Рс. Делеционные варианты, таким образом, включают все фрагменты Рсполипептидной последовательности.

В замещенных Рс-вариантах один или более аминокислотных остатков Рс-полипептида удалены или замещены альтернативными остатками. В одном случае замещения консервативны по своей природе, однако, изобретение отно сится и к замещениям, которые являются неконсервативными.

Например, остатки цистеина могут быть делегированы или замещены другими аминокислотами, чтобы предотвратить образование некоторых или всех дисульфидных перекрестных связей Ес-последовательностей. В частности, аминокислотные остатки в положениях 7 и 10 8ЕО ГО N0:5 являются цистеиновыми остатками. Можно удалить каждый из таких цистеиновых остатков или заместить один или более цистеиновых остатков другими аминокислотами, например А1а или 8ег. Кроме того, модификации могут быть сделаны введением аминокислотных замен для: (1) удаления сайта связывания Ес-рецептора; (2) удаления сайта связывания комплемента (С1с.|) и/или (3) удаления сайта антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС). Такие сайты известны из уровня техники и любые известные замены в Ес-последовательности могут быть осуществлены. Например, см. Мо1еси1аг 1ттиио1оду, Уо1. 29, Νο. 5, 633-639 (1992) в отношении сайтов АЭСС 1дС1.

Подобным образом один или более остатков тирозина могут быть замещены фенилаланиновыми остатками. Более того, другие варианты аминокислотных вставок, делеций (например, 1-25 аминокислот) и/или замещений входят в объем настоящего изобретения. Консервативные аминокислотные замены, в целом, предпочтительны. Более того, изменения могут быть в форме измененных аминокислот, например, пептидомиметических или Ό-аминокислот.

Ес-последовательности соединения ТМР могут быть также дериватизированы, т. е. представлять собой модификации, отличные от вставок, делеций или замещений аминокислотных остатков. Предпочтительно, модификации являются ковалентными и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими веществами. Производные в соответствии с изобретением могут быть получены для увеличения времени полужизни в циркуляции или для улучшения способности полипептида нацеливаться на нужные клетки, ткани или органы.

Возможно также использование рецепторсвязывающего домена интактной Ес-молекулы как Ес-части заявленных соединений, например, как описано в заявке XV0 96/32478, озаглавленной «Измененные полипептиды с увеличенным временем полужизни». Дополнительные члены класса молекул, обозначенных здесь как Ес, являются таковыми, описанными в заявке νθ 97/34631, озаглавленной «Иммуноглобулинподобные домены с увеличенным временем полужизни». Обе из указанных опубликованных заявок РСТ приведены здесь в качестве ссылок.

Ес-слияния могут быть сделаны на Ν- или С-концевом участке ТМР! или ТМР₂ или на обоих Ν- и С-концевых участках ТМРк. Неожи данно было обнаружено, что пептиды, в которых Ес-участок лигирован с Ν-концевым участком ТМР, обладают большей биологической активностью, чем другие модификации, и, таким образом, белки слияния, имеющие Ес-домен на Ν-концевом участке ТМР! (т. е. г и р равны 0, а т и с.| равны 1 в общей формуле) предпочтительны. Когда Ес-цепь сливают с Ν-концевым участком ТМР или линкера такое слияние обычно затрагивает С-концевой участок Ес-цепи и наоборот (уюе уегка).

Также предпочтительными соединениями являются димеры (например, тандемные и нетандемные) указанных выше соединений общей формулы, также приведенной выше. В таких случаях каждая Ес-цепь будет связана с тандемным димером ТМР пептидов. Схематический пример такого соединения показан на фиг. 6С. Предпочтительный пример указанного типа соединений основан на фиг. 6С, причем Ес является димером соединения 8Е0 ГО Ν0:5, каждый Ь₂ представляет собой (О1у)₅, ТМР₁ и ТМР₂ являются соединениями с 8Е0 ГО Ν0:1 и каждый Ь₁ представляет собой (О1у)₈. Это соединение обозначается здесь как Ес-ТМР|-Б-ТМР₂. Оно также представлено в форме димера (посредством Ес-участка) и имеет последовательность 8Е0 ΙΌ Ν0:34. Аналогичное соединение, в котором Ес-группа прикреплена посредством линкера к С-концевому участку ТМР₂-групп на фиг. 6С также включено в объем изобретения и обозначено здесь, как ТМР₁-Е-ТМР₂-Ес.

Некоторые специфические примеры соединений второй группы приведены ниже: Гс-ШОРТиад»/ЬААкА-6РИС-Е<ЗРт<<»ЛЪААКА (5Е<)ГОИО:22)

Рс-ЕбРПЛЦ^ИЛАКА-бРИС-ЕСТПКЦХИ.ААКА-Рс

1ЕСЙ>1и<рЭДАА11А«ХККЗ<3<ЮО-1Е<ЗРТЕКЦад^ОЖА-Ес

Рс4М-ЕОРТЕК0\У1_ААЮ4-СРМС-Е6РТ1Л<)\¥ЬААКЛ

Рс-ЕОРТЬКЦ\¥1ЛАКА-43ОСС<3<ЮС-ЕСТТ1ЖЦЖААКА (5Е0ГОЧО:23) (5Е() ГО ΝΟ: 24) (Ш) ГО N0:25) (5Ε0ΙΟΝΟ: 26)

Рс-ЕСРТЬКО<ХААКА-ССССС<Э<Ю-ШОРТ1КЦСЬААКА (сусбс)

I_________________________________| (5Е() П5 N0:27)

Рс-ЕОР1ТЛ0С1ЛА1и-(3<Х5<Юв<ЗО-ЕСР11К0СЬААКА (Ипеаг) ' (5Е<)ГО»О:28)

Рс-ШОРТЕКрАЬААКА-СССССССС-ЕСЯ’ТЕКрАЬАЛКА (5Е<) ГО ΝΟ: 29)

ΡοΙΕσρπ.ΚΟ«ίΕΑΑΚΑ-αθ<5Κ<3®3σ-ΙΕΟΡΤΙ.Κ<)·Μ.ΑΑΚΑ (5Е<) ГО N0: 30)

Рс-Е6РШ<0\9ЬААКА-Са<ЭСС<ЗСО-ЕСРТи<9ЧЪААКА (5Е<) ГО N0:31) Ρ£-Ε0ΡΤΈΚ0\νΐΛΑ3α-Ο<3ΟΝ036α-ΕσΡΤυ<<)\νΕΑΑΚΑ (5ЕЦ ГО ΝΟ: 32) Рс-1ЕОРТЕК0Х¥ЪААКА-СвеСаС<М-1ЕОРТЕК0\Ч.ААКА

I

Ре-1ЕаРТЕК0\УЕАЛКА<ЮОССССО-1ЕОР1ЪК0!И.ЛАКА (5Е0 ГО N0: 33)

РоС<ЮСС-ЕСРТи1р1*ЕААКА<ЮО<3<ЗС<Ю-1Е(ЗРТ1Л01»ЬААКА — (5В0ГОЫО:34)

В каждом из указанных соединений рассматривается наличие дополнительного Νконцевого Ме1 (М, как обозначается с помощью однобуквенного кода). Остаток Ме1 может быть прикреплен на Ν-концевом участке Ес-группы в тех случаях, когда имеется Ес-группа, прикрепленная к Ν-концевому участку ТМР. В тех случаях, когда Ес-группа прикреплена к Сконцевому участку ТМР, остатки Ме1 могут быть прикреплены к Ν-концевому участку ТМРгруппы.

В каждом из двух указанных выше случаев Ре, предпочтительно, представляет собой Реучасток тяжелой цепи 1дО1 человека или его биологически активный фрагмент, производное или димер. См. ЕШзоп, 1. е! а1., №с1ею АОбз Вез. 10: 4071-4079 (1982). Последовательность Рс 8ЕО ГО N0:5 является наиболее предпочтительной для Рс в составе указанных выше соединений. Также предпочтительными являются указанные выше соединения, в которых Рс представляет собой димерную форму последовательности 8Е0 ГО N0:5 и каждая Рс-цепь прикреплена к ТМР тандемному димеру.

Кроме того, несмотря на то, что многие из предпочтительных соединений второй группы включают один или более тандемных димеров, в которых имеется две связанных ТМР-группы, другие из заявленных соединений включают тандемные мультидимеры ТМРз, т. е. соединения следующей, например, структуры: Рс-ТМР₁ -Е-ТМР₂-Ь-ТМР_з; Рс-ТМР₁-Е-ТМР₂-Е-ТМР_з-Е-ТМР₄; Рс-ТМР₁-Е-ТМР₂-Е-ТМР₃-Е-ТМР₄-Е-ТМР₅; ТМР₁ -Е-ТМР₂-Е-ТМР_з-Ь-Рс;

ТМР₁ -Е-ТМР₂-Е-ТМР_з-Е-ТМР₄-Е-Рс';

ТМР₁ -Е-ТМР₂-Е-ТМР₃-Е-ТМР₄-Е-ТМР₅-Е-Рс, где ТМР₁, ТМР₂, ТМР₃, ТМР₄ и ТМР₅ могут иметь одну и ту же или различную структуру, а Рс и каждая группа ТМР и Ь определены, как указано выше, и каждый линкер является факультативным. В каждом из указанных выше случаев Рс-группа может быть мономерной или димерной и в тех случаях, когда Рс является димерной, один или более мультимеров ТМР могут быть прикреплены к каждой Рс-цепи. Также рассматриваются другие примеры, скажем, когда ТМР-димеры или мультимеры прикреплены к обоим Ν- и С-концевым участкам одной или обеих Рс-цепей, включая случай, когда ТМР-димеры или мультимеры прикреплены ко всем четырем концевым участкам Рс-цепей.

Предпочтительно, заявленные соединения второй группы имеют, в целом, около 200-400 аминокислот (т. е. они являются полипептидами).

Способы получения

Заявленные соединения могут быть получены различным образом. Поскольку многие соединения являются пептидами, или включают пептиды, способы получения пептидов имеют непосредственное отношение к заявленному изобретению. Например, могут быть использованы технологии твердофазного синтеза. Подходящие технологии хорошо известны из уровня техники и включают методы, описанные в следующих источниках информации: МетпйеИ, ίη Сйет. РоВрерббез. рр. 336-61 (Ка18оуаппщ апб Рапауобз ебз. 1973); МегпПе1б. 1. Ат. Сйет. 8ос. 85: 2149 (1963); Όπνίδ е! а1., Вюсйет. 1пП. 10: 394-414 (1985); 81е\\'аг1 апб Уонпд. 8о11б

Рйазе Рерббе ЗуЩйезЬ (1969); и.8. Ра!. №. 3,941,763; Ршп е! а1., Тйе РгсИешз. 3гб еб., уо1. 2, рр. 105-253 (1976); апб Епскзоп е! а1., Тйе Рго!ешз, 3гб еб., уо1. 2, р. 257-527 (1976). Твердофазный синтез является предпочтительной методикой синтеза индивидуальных пептидов, поскольку он наиболее эффективен и недорог при получении небольших пептидов.

Пептиды также могут быть получены в трансформированных клетках-хозяевах с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Для этого получают рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую пептид. Способы конструирования таких ДНк и/или РНК молекул хорошо известны из уровня техники. Например, последовательности, кодирующие пептиды, могут быть вырезаны из ДНК с помощью подходящих ферментов рестрикции. Соответствующие последовательности могут быть получены при использовании полимеразной цепной реакции (РСВ) с включением необходимых рестрикционных сайтов для последующего клонирования. Альтернативно, ДНК/РНК молекула может быть синтезирована с помощью методик химического синтеза, таких как фосфорамидный метод. Также может быть применена комбинация различных подходов.

Изобретение также относится к вектору, кодирующему пептиды, для экспрессии в подходящем хозяине. Вектор включает молекулу ДНК, кодирующую пептиды, оперативно связанную с подходящими последовательностями, контролирующими экспрессию. Способы такого функционального связывания как до, так и после того, как ДНК-молекула, кодирующая пептид, будет встроена в подходящий вектор, хорошо известны. К последовательностям, контролирующим экспрессию, относятся промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, стартовые сигналы, стопсигналы, сигналы кэпирования, сигналы полиаденилирования и другие сигналы, вовлеченные в контролирование транскрипции или трансляции.

Вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую пептид, используют для трансформации подходящего хозяина. Трансформация может быть осуществлена с помощью методов, хорошо известных из уровня техники.

Для целей настоящего изобретения могут быть использованы любые из многочисленных и доступных хорошо известных клеток-хозяев. Выбор определенного хозяина зависит от множества факторов, известных из уровня техники. Указанные факторы включают, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии, токсичность для клетки-хозяина пептидов, кодируемых ДНК-молекулой, способ трансформации, легкость выделения пептидов, характеристики экспрессии, биологическую безопасность и стоимость. Баланс указанных факторов соблюдается при условии, что не все клетки хозяева одинаково эффективны для экспрессии определенной ДНК-последовательности.

В целом, полезными клетками-хозяевами из числа микроорганизмов являются бактерии (например, Е. сой), дрожжи (например, 8ассйаготусс5 8р. и Р1сй1а райотщ), а также клетки насекомых, растений, млекопитающих (в том числе человека), грибов, выращенные в культуре, и другие клетки-хозяева, известные из уровня техники.

Далее, трансформированные клеткихозяева культивируют в подходящих условиях ферментации для обеспечения экспрессии нужных пептидов. Такие условия ферментации хорошо известны из уровня техники.

Наконец, пептиды очищают из ферментационной среды или из клеток-хозяев, в которых они экспрессируются. Методы очистки хорошо известны из уровня техники.

Соединения, которые содержат производные пептидов или непептидные группы, могут быть синтезированы с помощью хорошо известных методик органической химии.

Применение соединений

Заявленные соединения обладают способностью связывать и активировать рецептор сМр1 и/или обладают способностью стимулировать образование (как ίη νίνο, так и ίη νίίτο) тромбоцитов (тромбопоэтическая активность) и предшественников тромбоцитов (мегакариоцитопоэтическая активность). Для измерения активности (активностей) указанных соединений можно использовать стандартные методы, например, такие, как описаны в заявке XVО 95/26746, озаглавленной как «Композиции и способы стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов». Исследования ίη νίνο далее описано в примерах.

Состояния, для коррекции которых используются заявленные способы и композиции, в целом, представляют собой такие заболевания, при которых наблюдается недостаточность мегакариоцитов/тромбоцитов или она подразумевается или ожидается в будущем (например, в результате плановой хирургической операции или донорства тромбоцитов). Такие состояния могут быть результатом недостаточности (временной или постоянной) активного Мр1-лиганда ίη νίνο. Обычное название недостаточности тромбоцитов - тромбоцитопения и, следовательно, способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут применяться для профилактического или терапевтического лечения тромбоцитопении у больных, которые в этом нуждаются.

Всемирная организация здравоохранения классифицирует степень тромбоцитопении в зависимости от числа циркулирующих тромбоцитов в организме (М111ег, с1 а1., Санссг 47: 210211 (1981)). Например, у индивидуумов, не обнаруживающих признаков тромбоцитопении (степень 0), число тромбоцитов составляет, по крайней мере, 100000 клеток/мм³. При средней тромбоцитопении (степень 1) уровень циркулирующих тромбоцитов составляет 79000 99000/мм³. Умеренная тромбоцитопения (степень 2) характеризуется числом тромбоцитов около 50000 - 74000 клеток/мм³ и тяжелая 25000 - 49000 тромбоцитов/мм³. Угрожающая жизни или истощающая тромбоцитопения характеризуется концентрацией циркулирующих тромбоцитов менее чем 25000 клеток/мм³.

Тромбоцитопения (недостаточность тромбоцитов) может возникать по различным причинам, включая химиотерапию или терапию другого характера с использованием различных лекарств, радиационную терапию, хирургию, кровопотерю при несчастных случаях или другие специфические заболевания. Примерами таких заболеваний, для которых характерна тромбоцитопения и которые могут быть вылечены в соответствии с заявленным изобретением, являются следующие: апластическая анемия; идиопатическая или иммунная тромбоцитопения (1ТР), включая идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, ассоциированную с раком груди; ассоциированная с ВИЧ 1ТР и связанная с ВИЧ тромботическая тромбоцитопеническая пурпура; метастатические опухоли, в результате которых развивается тромбоцитопения; системный волчаночный эритематоз, в том числе неонатальный волчаночный синдром спленомегалии; синдром Фалькони; недостаточность витамина В12; недостаточность фолиевой кислоты; аномалия Мэя-Хегглина; синдром Вискотта-Элдриха; хроническое заболевание печени; миелодипластический синдром, ассоциированный с тромбоцитопенией; пароксизмальная ноктурнальная гемоглобинурия; острая глубокая тромбоцитопения вследствие терапии с помощью С7ЕЗ Еай (АЬс1х1таЬ); аллоиммунная тромбоцитопения, включая материнскую аллоиммунную тромбоцитопению; тромбоцитопения, ассоциированная с антифосфолипидными антителами и тромбозом; аутоиммунная тромбоцитопения; вызванная лекарствами иммунная тромбоцитопения, включая тромбоцитопению, обусловленную карбоплатином, гепарином; фетальная тромбоцитопения; вызванная беременностью тромбоцитопения; синдром Хьюджеса; волчаночная тромбоцитопения; кровопотеря при несчастных случаях и/или обширная кровопотеря; миелопролиферативные нарушения; тромбоцитопения у больных со злокачественными опухолями; тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, включая явную тромботическую микроангиопатию, такую, как гемолитический уремический синдром у расовых больных; аутоиммунная гемолитическая анемия; скрытая перфорация дивертикулами тощей кишки; аплазия красных кровяных клеток; аутоиммунная тромбоцитопения; эпидемическая нефропатия; острая почечная недостаточность, вызванная рифампицином; тромбо цитопения Пэриса-Троуссэ; неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения; пароксизмальная ноктурнальная гемоглобинурия; гематологические изменения при раке желудка; детский гемолитический уремический синдром; гематологические синдромы, связанные с вирусной инфекцией, включая ассоциированную с гепатитом А и инфицированием цитомегаловирусом тромбоцитопению. Также, различные виды терапии СПИДа приводят к тромбоцитопении (например, использование ΑΖΤ). В некоторых случаях заживление ран также улучшается при увеличении числа тромбоцитов.

Если рассматривать недостаточность тромбоцитов, например, обусловленную возможным хирургическим вмешательством в будущем, то заявленные соединения могут вводиться в интервале времени от нескольких дней до нескольких часов до того, как организм начнет нуждаться в тромбоцитах. Если рассматривать острые ситуации, например, несчастный случай или обширную кровопотерю, заявленные соединения могут вводиться параллельно с переливаемой кровью или очищенными тромбоцитами.

Заявленные в соответствии с изобретением соединения могут также оказаться полезными для стимулирования определенных типов клеток, отличных от мегакариоцитов, если такие клетки экспрессируют Мр1-рецептор. Заболевания, ассоциированные с такими клетками, которые экспрессируют Мр1-рецептор и отвечают на стимуляцию Мр1-лигандом, также входят в объем настоящего изобретения.

Заявленные соединения могут быть использованы в любой ситуации, когда необходимы образование тромбоцитов или предшественников тромбоцитов или стимуляция с-Мр1рецептора. Так, например, они могут быть использованы для лечения любого состояния у млекопитающих, когда существует потребность в тромбоцитах, мегакариоцитах и т. д. Такие состояния подробно описаны в следующих источниках информации: XV О 95/26746; XV О 95/21919; XVО 95/18858; XVО 95/21920 и рассматриваются здесь.

Заявленные в соответствии с изобретением соединения также могут быть полезными для поддержания жизнеспособности или сохранения тромбоцитов и/или мегакариоцитов и родственных клеток. Соответственно, может оказаться целесообразным включение эффективного количества одного или более из таких соединений в композицию, содержащую указанные клетки.

Под млекопитающим понимается любое млекопитающее, включая человека, домашних животных, в том числе собак и кошек; экзотическое животное или животное зоопарка, включая обезьян; лабораторное животное, включая мышей, крыс и морских спинок; сельскохозяйственных животных, включая лошадей, рогатый скот, овец, коз и свиней, и т. д. Предпочтительным млекопитающим является человек.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к способам получения фармацевтических композиций, содержащих заявленные соединения. Такие фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекций, а также оральным, назальным, трансдермальным или другим путем, например внутривенным, внутридермальным, внутримышечным, интраперитонеальным, интратекальным, внутриглазным, внутриоболочечным, внутрилегочным (например, аэрозольные препараты), ретробульбарным, через молочную железу или подкожной инъекцией (включая введение с образованием депо для отложенного высвобождения); подъязычным, анальным, вагинальным или в ходе хирургической имплантации, например, помещением под селезеночную капсулу, роговицу или оболочку головного мозга. Лечение может включать введение одной дозы или многих доз в течение определенного промежутка времени. В целом, изобретением охватываются фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества заявленных соединений вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, растворителями, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции включают разбавители различных буферных систем (например, Трис-НС1, ацетат, фосфат), различных рН и ионной силы; добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Твин 80, Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, Тимерзол, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннитол). Необходимые вещества могут быть включены в определенные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т. д., или в липосомы. Гиалуроновая кислота также может быть использована, что может обеспечивать эффект поддерживаемого высвобождения в циркуляцию. Фармацевтические композиции могут необязательно включать другую фармацевтически приемлемую жидкость, полутвердые или твердые разбавители, которые служат фармацевтическими переносчиками, или среду, включающую (без ограничений) полиоксиэтилен сорбитан монолаурат, стеарат магния, метил- и пропилгидроксибензоат, крахмалы, сахарозу, декстрозу, гуммиарабик, фосфат кальция, минеральное масло, масло какао и теобромное масло. Такие композиции могут влиять на физический статус, стабильность, скорость высвобождения ίη νίνο и скорость выведения ίη νίνο заявленных белков и производных. См., например, К.ешшдоп'8 Рйагшасеи1юа1 8с1епсез, 181й Еб. (1990, Маск РиЬНзЫпд Со., Еаз1оп, РА 18042), стр. 1435-1712 (в качестве ссылки). Композиции могут быть приготовлены в жид кой форме или в виде порошка, например, лиофилизированной форме. В объем изобретения также включены имплантируемые препараты с поддерживаемым высвобождением и трансдермальные препараты.

Для использования в соответствии с изобретением подходят оральные твердые дозированные формы, которые в общих чертах описаны в Ре1шд1оп'к Ркагтасеикса1 Баепсек, Ι8ΐΗ Εά. 1990 (Маск РиЬНккшд Со. Еак!оп РА 18042) в гл. 89 (работа приведена здесь в качестве ссылки). Твердые дозированные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, пастилки, лепешки, облатки и шарики. Кроме того, для получения заявленных композиций может быть использовано липосомальное или протеноидное инкапсулирование (например, протеноидные микросферы описаны в патенте США 4 925 673). Липосомы могут быть дериватизированы различными полимерами (например, как описано в патенте США 5 013 556). Описание возможных твердых дозированных форм для терапии приведено Магкка11, К., Мобегп РкагтасеиНск, Εάкеб Ьу С.8. Вапкег апб С.Т. Вкобек Скар!ег 10, 1979 (в качестве ссылки). В целом, препараты включают заявленные в соответствии с изобретением вещества и инертные ингредиенты, которые обеспечивают защиту от действия среды желудка на активное вещество и высвобождение биологически активного материала в кишечнике.

Также специальным образом оговариваются оральные дозированные формы охарактеризованных выше соединений. Если необходимо, соединения могут быть химически модифицированы, так чтобы оральная доставка была эффективной. В целом, химическая модификация подразумевает прикрепление по крайней мере одной группы к заданной молекуле, причем указанная группа обеспечивает (а) ингибирование протеолиза и (б) попадание в кровоток из желудка или кишечника. Также желательным может быть увеличение стабильности соединения и времени его циркуляции в крови. Примерами таких групп являются: полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин (АЬискотекк1 апб ОатА 8о1иЬ1е Ро1утегЕпхуте Аббис!к, Епхутек ак Пгидк, НосепЬегд апб ВоЬейк, ебк., АбеуЛШегкаепсе, №\ν Уогк, ΝΥ, (1981), рр. 367-383; №^тагск, е! а1., 1. Арр1. Вюскет, 4: 185-189 (1982)). Другие полимеры, которые могут быть использованы, включают поли-1,3-диоксалан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочтительными для фармацевтического применения, как указано выше, являются полиэтиленгликолевые группы.

Для оральных дозированных форм доставки также возможно использовать соль модифицированной алифатической аминокислоты, такую как №(8-[2-гидроксибензоил]амино)кап рилат натрия (8NАС), в качестве носителя для усиления абсорбции терапевтически активных соединений, заявленных в соответствии с изобретением. Клиническая эффективность препаратов гепарина, содержащих 8NАС, была показана в процессе испытаний Фазы II, осуществляемых Ет1кркеге Тескпо1од1ек. См. патент США 5 792 451, озаглавленный «Композиция оральной доставки лекарства и способы».

Терапевтические ингредиенты могут быть включены в состав препаратов в форме микрочастиц, а именно гранул или шариков с размером частиц около 1 мм. Материал, входящий в состав капсул, может быть в виде порошка, сжатых лепешек или даже таблеток. Терапевтические вещества могут быть получены компрессией.

В состав препаратов могут быть включены агенты, придающие запах и вкус. Например, белок (или производное) может быть введен в состав препарата (скажем, путем липосомного или микросферного инкапсулирования) и далее соединен со съедобным продуктом, например, охлажденным напитком, содержащим вещества, придающие запах и вкус.

Можно разбавить или увеличить объем терапевтического вещества инертным материалом. Такие разбавители могут включать углеводы, особенно маннитол, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Некоторые неорганические соли также могут быть использованы как наполнители, например, трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. К некоторым коммерчески доступным разбавителям относятся Еак1 Е1о, Етбех, 8ТА-Вх 1500, Етсотргекк и Ау1се11.

Дезинтеграторы могут быть включены в состав терапевтического препарата в твердой дозированной форме. Материалы, которые могут быть использованы в качестве дезинтеграторов, включают (без органичений указанными) крахмал, в том числе коммерческий дезинтегрант на основе крахмала, Ехр1о!аЬ, крахмальный гликолят натрия, Амберлит, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, кислая карбоксиметилцеллюлоза, природная губка, бентонит, апельсиновый отшелушиватель также могут быть использованы. Другой тип дезинтеграторов представляет собой нерастворимые катионообменные смолы. Порошкообразная камедь может быть использована в качестве дезинтегратора и связывающей субстанции и включать агар, Кагауа или трагакант. В качестве дезинтеграторов также могут применяться альгиновая кислота и его натриевая соль.

Связывающие агенты могут быть использованы для соединения терапевтических агентов вместе в виде таблетки и включают материалы из натуральных продуктов, таких как гуммиарабик, трагакант, крахмал и желатин. К другим относятся метилцеллюлоза (МЦ), этилцеллюлоза (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ). Для гранулирования терапевтических средств могут быть использованы спиртовые растворы поливинилпирролидона и гидроксипропилметилцеллюлозы.

Агенты, препятствующие трению, также могут быть включены в состав композиций, содержащих терапевтические агенты, для предотвращения слипания в процессе приготовления композиций. Любриканты могут составить слой между терапевтическим агентом и стенкой и включают (без ограничений указанным) стеариновую кислоту, в том числе ее кальциевую и магниевую соли, политетрафторэтилен (РТРЕ), жидкий парафин, растительные масла и воска. Могут использоваться растворимые любриканты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоли различной мол. массы, СагЬо^ах 4000 и 6000.

Вещества, облегчающие скольжение лекарственного материала, также могут быть добавлены в состав композиций для обеспечения их перераспределения в процессе сжатия. К таким веществам относится крахмал, тальк, пирогенная окись кремния и гидратированный силикоалюминат.

Для обеспечения растворения терапевтического агента в водной среде в качестве смачивающих агентов добавляют сурфактанты. К сурфактантам относятся анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктиловый сульфосукцинат натрия и диоктиловый сульфонат натрия. Могут быть использованы и катионные детергенты, к которым относятся хлорид бензалкония или хлорид бензетония. В перечень неионных детергентов, которые могут быть включены в состав композиций в качестве сурфактантов, входят лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, гидрогенированное полиоксиэтиленовое касторовое масло 10, 50 и 60, глицерол моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Указанные сурфактанты могут быть включены в состав композиций белка или его производного как сами по себе, так и в смесях различного соотношения.

Добавки, которые усиливают захват соединения, например, включают жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, линолевая кислота и линолиновая кислота.

Может оказаться желательным получение композиций с контролируемым высвобождением. Лекарство может быть заключено в инертный матрикс, который обеспечивает высвобождение лекарства как путем диффузии, так и выщелачивания, например, в камеди. Медленно распадающиеся матриксы также могут быть включены в состав композиций, например, альгинаты, полисахариды. Другой формой контролируемого высвобождения указанного терапев тического средства является способ, основанный на терапевтической системе огок (Α1ζα Согр.), т. е. лекарство заключается в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде проникать внутрь и выдавливать лекарство через небольшое отверстие за счет осмотических эффектов. Некоторые энтерические покрытия также обеспечивают отложенный эффект высвобождения.

Другие покрытия могут быть использованы для приготовления композиций. К ним относятся различные сахара, которые могут быть включены в оболочку. Терапевтический агент может быть использован в форме пленки, покрывающей таблетку, и материалы, используемые в этих случаях, делятся на 2 группы. К первой относятся неэнтерические материалы, такие как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза, провидон и полиэтиленгликоли. Ко второй группе относятся энтерические материалы, среди которых обычно используются эфиры фталиковой кислоты.

Смеси материалов могут быть использованы для получения оптимального пленочного покрытия. Такое покрытие можно нанести в специальном контейнере, на жидкой подложке или путем компрессии.

В объем изобретения также входит способ легочной доставки заявленного белка (или его производных). Белок (или его производные) доставляется в легкие млекопитающего в процессе дыхания и проникают через выстилающий легкие эпителий в кровоток. Другие сообщения на эту тему включают Αάμί е! а1., РЬагтасеи!1са1 КекеагсЬ 7: 565-569 (1990); Афе1 е! а1., йИегпаБопа1 1оита1 о£ РЬагтасеийск 63:135-144 (1990) (ацетат леупролида); Вгасще! е! а1., 1оигпа1 о£ сагйюуаксЫаг РЬагтасо1оду 13 (кирр1. 5): стр. 143-146 (эндотелии - 1); НиЬЬагб е! а1., Аппа1к о£ БиегщИ МеЬсте 3: 206-212 (1989) (α1антитрипсин); 8ιηί11ι е! а1., 1. СЬт. Ьуек! 84: 1145-1146 (1989) (а1-протеиназа); 0κ\\Όίη е! а1., Αе^οζο1^ζа!^οη о£ Рго!етк, Ргосеебшдк о£ 8утро51ит оп Кекр1га!огу Эгид ЭеЬ'егу ΙΙ, Пеу^о^, Со1огабо, МагсЬ, 1990 (рекомбинантный гормон роста человека); ИеЬк е! а1., ТЬе 1оита1 о£ Ιιηтипо1оду 140: 3482-3488 (1988) (интерферон γ и фактор некроза опухолей α) и Р1аР е! а1., патент США 5284 656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор).

В объем изобретения также входят различные механические устройства для легочной доставки терапевтических продуктов, включая (без ограничений) распылители, ингаляторы с измеренными дозами, порошковые ингаляторы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Некоторые специфические примеры коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения, включают распылитель и11тауеи1, производимый Ма111искгоб1, 1пс., 81. Ьошк, Мккошт; распылитель Леоти II, производимый Магциек! Меб1са1 Ртобиск, Епд1е\\'ооб. Со1огабо; дозированный ингалятор УетоЙ!'!, производимый С1ахо 1ис., Кекеатсй 1лаид1е Рагк, Ыобй Сагой па, и порошковый ингалятор 8ршйа1ег, производимый Ρίкоик Согр, ВебГогб, Маккасйикейк.

Все такие композиции требуют применения составов, подходящих для распределения заявленных соединений. Обычно, каждая композиция специфична по отношению к определенному типу используемого устройства и может содержать подходящий «выталкивающий» материал помимо разбавителей, адъювантов и/или носителей, полезных в терапии.

Заявленные соединения преимущественным образом могут быть приготовлены в форме частиц со средним их размером менее 10 мкм (микрон), наиболее предпочтительно, 0,5-5 мкм, для более эффективной доставки в дистальные участки легких.

Носители включают углеводы, такие как трегалоза, маннитол, ксилитол, сахароза, лактоза и сорбитол. Другие ингредиенты для использования в композициях могут включать ОРРС, ΌΘΡΕ, Ό8ΡΟ и ЭОРС. Могут быть использованы природные или синтетические сурфактанты.

Может быть использован полиэтиленгликоль (не считая того, что он применялся для получения белка или аналога). Могут быть применены декстраны, такие как циклодекстран, а также соли желчных кислот и другие родственные энхансеры. Кроме того, используют целлюлозу и производные целлюлозы, аминокислоты, например, в составе буферных растворов.

В объем изобретения также входит использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов, включения или других типов носителей.

Композиции, подходящие для использования, с помощью распылителя, как струйного, так и ультразвукового, обычно включают заявленное вещество, растворенное в воде в концентрации около 0,1-25 мг биологически активного белка на 1 мл раствора. Композиции могут также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и регулирования осмотического давления). Композиция для распылителя может также содержать сурфактант для редуцирования или предотвращения поверхностно индуцированной агрегации белка, обусловленной атомизацией раствора при формировании аэрозоля.

Композиции для использования в ингаляторном устройстве с измеренной дозой обычно содержит тонко измельченный порошок, содержащий заявленное соединение, суспендированное в выталкивающем веществе с целью под держки сурфактанта. Выталкивающее вещество может быть любым подходящим для указанных целей материалом, например, хлорфторуглеродом, гидрохлорфторуглеродом, гидрофторуглеродом или гидроуглеродом, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, а также их комбинации. Подходящие сурфактанты включают сорбитантриолеат и соевый лецитин. В качестве сурфактанта может быть использована олеиновая кислота.

Композиции для распределения из порошковых ингалирующих устройств представляют собой тонко измельченный сухой порошок заявленного соединения, а также могут содержать наполнители, например лактозу, сорбитол, сахарозу, маннитол, трегалозу или ксилитол в количествах, которые обеспечивают выброс порошка из устройства, например, 50-90% по отношению к весу композиции.

В объем изобретения также входит назальная доставка препарата. Назальная доставка обеспечивает попадание белка непосредственно в кровоток после введения терапевтически активного продукта в полость носа, без необходимости депонирования продукта в легких. Композиции для назальной доставки могут включать декстран и циклодекстран. Доставка за счет транспорта через другие слизистые оболочки также входит в объем изобретения.

Дозы

Дозовый режим в качестве составляющей способа лечения указанных выше заболеваний определяется лечащим врачом при учете различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, возраста, состояния, веса тела больного, пола и диеты, тяжести какой-либо инфекции, времени применения и других клинических факторов, в целом, доза варьирует от 0,1 до 100 мкг заявленного соединения на 1 кг веса тела в день, предпочтительно от 0,1 до 1000 мкг/кг и более предпочтительно от 0,1 до 150 мкг/кг, причем дозы могут даваться однократно в один день или эквивалентные дозы могут быть применены в более длинные или более короткие интервалы, например, каждый другой день, дважды в неделю, еженедельно, или два или три раза в день.

Заявленное соединение может вводиться в форме первоначального болюса, затем следует продолжительная инфузия для поддержания терапевтически значимых уровней лекарства в циркуляции. В другом случае заявленные соединения могут вводиться однократной дозой. Специалист в данной области способен оптимизировать эффективные дозы и режим введения препарата на основе медицинской практики и клинического состояния индивидуального больного. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров препарата и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяется специалистом в данной об ласти знаний и зависит от способа введения препарата и нужной дозы. Например, см. Кеш1пд!ои'к Рйагтасеибса1 8с1еисек, Ι81Η Еб. (1990, Маск РиЫЫиид Со., Еак!ои, РА 18042), стр. 1485-1712 (работа приведена здесь в качестве ссылки). Такие составы могут влиять на физический статус больного, скорость высвобождения препарата ίη νί\Ό и скорость клиренса ίη у|уо вводимого агента. В зависимости от способа введения подходящая доза может быть определена в соответствии с весом тела, поверхностью тела и размером органа. Дальнейшие более тонкие вычисления, необходимые для определения подходящей дозы лечения при использовании каждого указанного выше состава, легко осуществляются специалистом в данной области без дополнительных экспериментов, особенно с учетом приведенной здесь информации о дозах и исследованиях, а также фармакокинетических данных, полученных в результате клинических экспериментов, как обсуждалось выше. Соответствующие дозы могут быть установлены в результате использования известных методов определения уровней лекарства в крови в сочетании с данными доза-ответ. Конечный дозовый режим может быть установлен лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, специфической активности лекарства, тяжести заболевания и отвечаемости пациента, его возраста, состояния, веса тела, пола и диеты, тяжести какой-либо инфекции, времени введения и других клинических факторов. При осуществлении исследований может появиться другая информация, относящаяся к подходящим дозовым уровням и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.

Терапевтические методы, композиции и вещества заявленного изобретения могут быть использованы как сами по себе, так и в комбинации с другими цитокинами, растворимым Мр1-рецептором, гематопоэтическими факторами, интерлейкинами, ростовыми факторами или антителами для лечения заболеваний, для которых характерны другие симптомы помимо недостаточности тромбоцитов. Также подразумевается, что заявленные соединения будут полезны для лечения некоторых форм тромбоцитопении в сочетании с распространенными стимуляторами гематопоэза, такими как 1Ь-3 или СМС8Е. К другим факторам стимуляции мегакариоцитов относятся, в частности, тед-С8Е, фактор стволовой клетки (8СЕ), ингибирующий фактор лейкоза (Ь1Е), онкостатин М (О8М) или другие вещества, обладающие способностью стимулировать мегакариоциты, которые могут использоваться совместно с Мр1-лигандом. Дополнительные примеры цитокинов или гематопоэтических факторов для такого совместного ведения включают 1Ь-1 альфа, 1Ь-1 бета, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, ЕЬ-5, 1Ь-6, 1Ь-11, колониестимулирующий фактор-1 (С8Е-1), М-С8Е, 8СЕ, СМ

С8Е, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Е), ЕРО, интерферон-альфа (ΙΕΝальфа), консенсусный интерферон, ΙΕΝ-бета, ΙΕΝ-гамма, 1Ь-7, Ш-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-12, 1Ь-13, Ш-14, Ш-15, 1Ь-16, Ш-17, 1Ь-18, тромбопоэтин (ТРО), ангиопоэтины, например, Аид-1, Аид-2, Аид-4, Аид-Υ, ангиопоэтинподобный пептид человека, ростовый фактор эндотелия сосудов (УЕСЕ), ангиогенин, морфогенетический белок кости 1, морфогенетический белок кости 2, морфогенетический белок кости 3, морфогенетический белок кости 4, морфогенетический белок кости 5, морфогенетический белок кости 6, морфогенетический белок кости 7, морфогенетический белок кости 8, морфогенетический белок кости 9, морфогенетический белок кости 10, морфогенетический белок кости 11, морфогенетический белок кости 12, морфогенетический белок кости 13, морфогенетический белок кости 14, морфогенетический белок кости 15, рецептор 1А морфогенетического белка кости, рецептор ΙΒ морфогенетического белка кости, нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор, рецептор альфа цилиарного нейротрофического фактора, индуцируемый цитокином непрофильный хемотаксический фактор 1, индуцируемый цитокином нейтрофильный хемотаксический фактор 2 индуцируемый цитокином нейротфильный хемотаксический фактор 2 бета, ростовой фактор эндотелиальных клеток бета, эндотелии 1, эпидермический ростовой фактор, нейтрофильный аттрактант эпителиального происхождения, ростовой фактор фибробластов 4, ростовой фактор фибробластов 5, ростовой фактор фибробластов 6, ростовой фактор фибробластов 7, ростовой фактор фибробластов 8, ростовой фактор фибробластов 9, ростовой фактор фибробластов 8Ь, ростовой фактор фибробластов 8с, ростовой фактор фибробластов 9, ростовой фактор фибробластов 10, кислый ростовой фактор фибробластов, основный ростовой фактор фибробластов, рецептор 1 альфа нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, рецептор альфа 2 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, связанный с ростом белок, связанный с ростом белок альфа, связанный с ростом белок бета, связанный с ростом белок гамма, гепаринсвязывающий эпидермальный ростовой фактор, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулинподобный ростовой фактор Ι, рецептор инсулинподобного ростового фактора, инсулинподобный ростовой фактор ΙΙ, белок, связывающий инсулинподобный ростовой фактор, фактор роста кератиноцитов, фактор, ингибирующий лейкоз, рецептор альфа фактора, ингибирующего лейкоз, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейротрофин-3, нейротрофин-4, плацентарный ростовой фактор, плацентарный ростовой фактор 2, ростовой фактор эндотелиальных клеток, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор А цепи, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор АА, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор АВ, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор В-цепи, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор ВВ, происходящий из тромбоцитов, рецептор альфа ростового фактора, происходящего из тромбоцитов, рецептор бета ростового фактора, происходящего из тромбоцитов, стимулирующий фактор роста пре-В клеток, рецептор фактора стволовой клетки, ΤΝΕ, включая ΤΝΕ0, ΤΝΕ1, ΤΝΕ2, трансформирующий ростовой фактор альфа, трансформирующий ростовой фактор бета, трансформирующий ростовой фактор бета 1, трансформирующий ростовой фактор бета 1.2, трансформирующий ростовой фактор бета 2, трансформирующий ростовой фактор бета 3, трансформирующий ростовой фактор бета 5, латентный трансформирующий ростовой фактор бета 1, белок, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, белок II, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, белок III, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, рецептор типа I фактора некроза опухолей, рецептор типа II фактора некроза опухолей, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, ростовой фактор сосудистого эндотелия, а также химерные белки и их биологически или иммунологически активные фрагменты. В дальнейшем было бы полезным вводить как одновременно, так и последовательно, эффективное количество растворимого Мр1-рецептора млекопитающего, который, повидимому, побуждает мегакариоциты фрагментироваться с образованием тромбоцитов, как только мегакариоциты созреют. Таким образом, введение заявленного соединения (для увеличения числа зрелых мегакариоцитов) с последующим введением растворимого рецептора Мр1 (для инактивации лиганда и побуждения зрелых мегакариоцитов продуцировать тромбоциты), как ожидается, может быть особенно эффективным для стимулирования образования тромбоцитов. Дозы, описанные выше, должны быть скорректированы с учетом компенсации таких дополнительных компонентов в составе терапевтической композиции. Мониторинг состояния больного осуществляется с помощью подходящих средств.

В тех случаях, когда заявленные соединения добавляют в композиции тромбоцитов и/или мегакариоцитов и родственных клеток, количество включенного вещества, в целом, определяют экспериментально с помощью методик и подходов, известных из уровня техники. Примерный уровень варьирует от 0,1 мкг до 1 мг заявленного соединения на 10⁶ клеток.

Понятно, что применение заявленных в соответствии с настоящим изобретением методик для решения специфических проблем и ситуаций находится в компетенции специалиста в данной области и осуществляется в соответствии с изложенными здесь подходами. Примеры заявленных продуктов, способов их получения, применения и производства приведены ниже.

Примеры

Приведенные ниже примеры описывают способы получения соединений первой группы.

А. Материалы и методы.

Все производные аминокислот (все альфаконфигураций) и смолы, используемые для синтеза пептидов, покупают у фирмы ШуаЬюсйеш. Реагенты пептидного синтеза (ЭСС, НОВ!, е!с.) покупают в виде растворов у Аррйеб ВюууЛепъ, Шс. Два производных ПЭГа покупают у 8йеагуа!ег Ро1утегк, Шс. Все растворители (дихлорметан, Ν-метилпирролидон, метанол, ацетонитрил) покупают у ЕМ 8с1епсек. Аналитическую НРЬС осуществляют на системе Весктап для использования колонки Уубас (0,46 см х 25 см, С18 обратная фаза, 5 мм) при скорости потока 1 мл/мин и двойной УФ детекции при 220 и 280 нм. Для всех процедур НРЬС используют линейные градиенты с двумя мобильными фазами: буфер А-Н₂О (0,1%ТЕА) и буфер В-ацетонитрил (0,1 % ТЕА). Пептиды, на которые мы здесь ссылаемся, например, 17Ь, 18, 19 и 20, пронумерованы со ссылкой на табл. 1 и некоторые из них приведены на фиг. 2 и 3.

Синтез пептидов

Все пептиды получают хорошо известным поэтапным методом твердофазного синтеза. Твердофазный синтез с Етос осуществляют с помощью АВ[ пептидного синтезатора. Обычно пептидный синтез начинают с предварительного наслаивания смолы \Уапд на 0,1 мМоль пластинку. Согласно стандартному пиперидиновому протоколу осуществляют Етос депротекцию. Связывание проводят при использовании ЭСС/НОВ1. Защитные группы боковых цепей следующие: 61и (О-!-Ви), Тйг (!-Ви), Агд (РЫ), 61п (Тг!), Тгр (!-Вос) и Сук (Тг().

Для первого пептидного предшественника для ПЭГирования с целью защиты боковой цепи Ьук на линкере используют Обе, а для конечного связывания используют Вос-Пе-ОН. Обе удаляют с помощью безводного гидразина (2% в NΜР, 3x2 мин), затем осуществляют связывание с безводным бромацетатом по действием ОСС. Для пептида 18 цистеиновую боковую цепь в линкере защищают тритиловой группой. Конечную депротекцию и расщепление всех комплексов «пептидил-смола» осуществляют при комнатной температуре в течение 4 ч при использовании трифторуксусной кислоты (ТЕА), содержащей 2,5% Н2О, 5% фенол, 2,5% триизопропилсилан и 2,5% тиоанизол. После удаления ТЕА отщепленный пептид преципитируют холодным безводным эфиром. Образование дисульфидных связей в циклическом пептиде осуществляют непосредственно на сыром материале при использовании 15% ЭМ8О в Н₂О (рН

7,5). Все сырые пептиды очищают препаративной обратнофазовой НРЬС и структуру подтверждают Е81-М8 и аминокислотным анализом.

Альтернативно, все описанные выше пептиды могут быть также получены с помощью химических процедур 1-Вое. В этом случае исходные смолы должны быть классическими смолами МегпДе1б или Рат и защитные группы боковых цепей следующие: 61и (0ΒΖ1), ТЬг (Βζ1), Агд (Ток), Тгр (Сн0), Сук (р - МеВζ1). Для конечного отщепления пептидила от смолы используют фтористоводородную кислоту (НЕ).

Все тандемные димерные пептиды, описанные в этом исследовании, которые имеют линкеры из природных аминокислот, могут также быть получены рекомбинантной ДНКтехнологией.

Пэгирование

Была разработана новая конвергентная стратегия пэгирования синтетических пептидов, которая включает объединение посредством формирования конъюгантного мостика в растворе пептида и ПЭГа, каждый из которых содержит специфическую функционально активную группу, реагирующую с другой. Предшественник пептидов может быть легко получен соответствующим твердофазным синтезом, как описано выше. Как указано ниже, пептиды преактивируют соответствующей функционально активной группой по специфическому сайту. Предшественники пептидов очищают и характеризуют до того, как осуществляют реакцию с ПЭГом. Лигирование пептида с ПЭГом обычно имеет место в водной фазе и может быть легко проконтролировано обратно-фазовой аналитической НРЬС. ПЭГированные пептиды могут быть легко очищены препаративной НРЬС и охарактеризованы с помощью аналитической НРЬС, аминокислотного анализа и массспектроскопией на основе лазерной десорбции.

Получение пептида 19

Пептид 17Ь (12 мг) и МеО-ПЭГ-8Н 5000 (30 мг, 2 экв.) растворяют в 1 мл водного буфера (рН 8). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и реакцию контролируют аналитической НРЬС, которая показывает, что полнота прохождения реакции составляет более 80%. ПЭГированный материал выделяют препаративной НРЬС.

Получение пептида 20

Пептид 18 (14 мг) и МеО-ПЭГ-малеимид (25 мг) растворяют примерно в 1,5 мл водного буфера (рН 8). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, за это время полнота трансформации составляет около 70%, что контролируют аналитической НРЬС, помещая аликвоту образца на НРЬС-колонку, ПЭГированный материал очищают препаративной НРЬС.

Исследование биоактивности

Биоисследование ТРО ίη νίίτο представляет собой митогенный анализ, использующий 1Ь-3 зависимый клон клеток мыши 32Ό, которые были трансформированы рецептором тр1 человека. Такое исследование более подробно описано в заявке А0 95/26746. Клетки поддерживают в среде МЕМ, содержащей 10% эмбрионального Клона II и 1 нг/мл М1Б-3. Перед добавлением образца приготавливают клетки, дважды отмывая их ростовой средой без М1Ь-3. Строят стандартную кривую на основе 12 значений для ТРО от 3333 до 39 пкг/мл. Четыре разведения, оцененные как попадающие на линейный участок стандартной кривой (от 1000 до 125 пкг/мл), приготавливают для каждого образца в троекратном повторении. Аликвоту объемом 100 мкл каждого разведения образца или стандарта вносят в соответствующие лунки 96луночного планшета для микротитрования, содержащие 10 000 клеток/лунку. После инкубирования в течение 44 ч при 37 С и 10% СО₂ в каждую лунку добавляют МТ8 (соединение тетразолия, которое восстанавливается в результате биологической активности клеток до формазана). Примерно через 6 ч определяют оптическую плотность на ридере планшетов при 490 нм. Строят кривую «доза-ответ» (1од концентрации ТРО против 0.Э.-Фон) и осуществляют анализ линейной регрессии точек, попадающих на линейный участок стандартной кривой. Определяют концентрации неизвестных тестобразцов с помощью результирующего линейного уравнения и коррекции для фактора разбавления.

Аббревиатуры

НРЬС: жидкостная хроматография высокого разрешения: Е81-М8: масс-спектрометрия на основе ионизации электронного распыления; МАБО1-М8: масс-спектрометрия на основе связанного с матриксом лизерного распределения ионизации; ПЭГ: полиэтиленгликоль. Все аминокислоты обозначены стандартным трехбуквенным или однобуквенным кодом. 1-Вое: третичный бутоксикарбонил; 1Ви: третичный бутил; ΒζΕ: бензил; ОСС: дициклогексилкарбозиимид; Н0В!: 1-гидроксибеизриазол; ЯМР: Νметил-2-пирролидинон; РЬЕ 2,2,4,6,7-пендаметилдигидробензофуран-5 -сульфонил; Т г!:

тритил; Обе: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксициклогексилиден)этил.

В. Результаты.

ТМР тандемные димеры с полиглициновыми линкерами. Конструирование последовательного связанных ТМР димеров основано на предположении, что димерная форма ТМР необходима для его эффективного взаимодействия с с-Мр1 (рецептор ТРО) и в зависимости от того, каким образом компоненты будут располагаться по отношению друг к другу в рецепторном комплексе, две молекулы ТМР могут быть соединены друг с другом в конфигурации от С-концевого участка к Ν-концевому участку таким об разом, чтобы не нарушать общую димерную конформацию. Ясно, что активность тандемно связанных димеров может также зависеть от подлежащего выбора длины и строения линкера, соединяющего С- и Ν-концевые участку двух последовательно выровненных ТМР мономеров. Поскольку не доступна какая-либо информация о структуре ТМР, связанного с с-Мр1, был синтезирован набор димерных пептидов с линкерами, содержащими от 0 до 10 и 14 глициновых остатков (табл. 1). Глицин был выбран из-за своей простоты и подвижности. Было высказано предположение, что подвижная полиглициновая пептидная цепь может обеспечить свободную укладку двух последовательных ТМР-повторов в необходимую конформацию, в то время как более стерически затрудненные аминокислотные последовательности способны образовать нежелательные вторичные структуры, чья жестокость может нарушить корректную укладку димерного пептида в рецепторный комплекс.

Пептиды могут быть без затруднений получены с помощью подходящих методов твердофазного синтеза пептидов (МептШеб, В.В., 1оитпа1 о£ 11ге Атепсап СБетка1 8оае1у 85: 2149 (1963)) на основе Бтос и !-Вос химических подходов. В отличие от синтеза связанного по Сконцевым участкам параллельного димера (8ЕО ΙΌ NО:2), который требует использования ортогонально защищенного лизинового остатка как начальной точки ветвления для построения двух пептидных цепей псевдосимметричным образом (С^1т1а, 8.Е. е!а1., 8с1епсе 276:1696-1699 (1997)), синтез тандемных димеров представляет собой простую поэтапную сборку непрерывных пептидных цепей от С-концевого участка к Νконцевому участку. Поскольку димеризация ТМР имеет более существенное воздействие на пролиферативную активность по сравнению со связывающей аффинностью, как показано для С-концевого димера (С^1т1а, 8. Е. е! а1., 8с1епсе 176-1696-1699 (1997)), синтетические пептиды тестировали непосредственно на биологическую активность в исследовании ТРО-зависимой клеточной пролиферации при использовании 1Ь-3 зависимого клона мышиных клеток 32Ό, трансфицированного с-Мр1 полной длины (Ра1асю8, В. е! а1., Се11 41: 727 (1985)). Как показывают результаты тестирования (см. табл. 1 ниже), все из тандемных димеров с полиглициновыми линкерами более чем в 1000 раз активны по сравнению с мономером и даже более активны, чем С-концевой димер, в исследованиях клеточной пролиферации. Абсолютная активность С-концевого димера в описанном исследовании была ниже, чем нативного белка ТРО, что отличается от предварительного сообщения, которое свидетельствует о том, что С-концевой димер так же активен, как натуральный лиганд (СМт1а, Е. Е. е! а1., 8Лепсе 276: 1696-1699 (1997)). Это может быть обусловлено различиями в условиях двух указанных экспериментов. Тем не менее, различие в активности между тандемными димерами (С-концевой участок первого мономера связан с Ν-концевым участком второго мономера) и параллельными димерами (С-концевой участок первого мономера связан с С-концевым участком второго мономера) в одном и том же исследовании явным образом демонстрирует преимущество тандемно димеризованного продукта по сравнению с параллельно димеризованным продуктом. Интересно заметить, что линкер может иметь широкий диапазон длины. Оптимальный линкер с выбранными ТМР мономерами (8ЕО ΙΌ N0:1) состоит из 8 остатков глицина.

Другие тандемные димеры

Последовательно по отношению к первой серии тандемных ТМР димеров были сконструированы отдельные другие молекулы как с различными линкерами, так и содержащие модификации в пределах самого мономера. Первая из указанных молекул, пептид 13, имеет линкер, состоящий из СРNС, последовательности, в отношении которой известна высокая способность формировать вторичную структуру по типу бета-поворота. Несмотря на все еще примерно в 100 раз большую активность, чем мономер, указанный пептид в 10 раз менее активен, чем СССС-связанный аналог. Таким образом, введение относительно жесткого бетаповорота в линкерный участок, по-видимому, вызывает слабое нарушение оптимальной конформации агониста в коротком линкере.

Тгр 9 в последовательности ТМР представляет собой высококонсервативный остаток среди активных пептидов, выделенных из случайных пептидных библиотек. Также обнаруживается высококонсервативный Тгр в консенсусной последовательности ЕРО миметических пептидов и установлено, что указанный остаток триптофана вовлечен в формирование гидрофобного ядра между двумя ЕРО миметическими пептидами (ЕМР8) и вносит вклад в гидрофобные взаимодействия с рецептором ЕРО (ЫупаЪ, О. е! а1., 8с1епсе 273: 464-471 (1996)). По аналогии считается, что остаток Тгр 9 в ТМР может иметь сходную функцию в димеризации пептидного лиганда, и в целях попытки модулировать и оценить эффекты моновалентных гидрофобных сил за счет двух индоловых колец, были получены определенные аналоги путем введения мутаций в положении Тгр. Так, в пептиде 14 остаток Тгр в каждом из двух ТМР мономеров был замещен на Су8 и внутримолекулярная дисульфидная связь сформировалась между двумя остатками цистеина путем окисления, что, как было предположено, имитирует гидрофобные взаимодействия между двумя остатками Тгр при димеризации пептидов. Пептид 15 является редуцированной формой пептида 14. В пептиде 16 два остатка Тгр замещены на А1а. Как показывают результаты исследований, все три аналога неактивны. Эти данные также показывают, что Тгр является важным остатком для обеспечения активности ТРО миметического пептида, а не только для образования димера.

Следующие два пептида (пептиды 17а и 18) содержат в составе 8-амино кислотно го линкера остаток Ьук или Сук. Указанные два соединения являются предшественниками двух ПЭГированных пептидов (пептиды 19 и 20), в которых боковая цепь Ьук или Сук модифицирована полиэтиленгликолем (ПЭГ). Было принято решение ввести молекулу ПЭГа в середину относительно длинного линкера, так чтобы объемный ПЭГ-компонент (5 кДа) достаточно далеко отстоял от важных связывающих сайтов в молекуле пептида. ПЭГ представляет собой известный биосовместимый полимер, который все чаще используется в качестве ковалентного модификатора для улучшения фармакокинетических профилей пептидных и основанных на пептидах терапевтических средств.

Для соответствующего ПЭГирования синтетических или рекомбинантных пептидов был разработан модульный метод. Данный метод основан на хорошо разработанной в настоящее время стратегии хемоселективного лигирования, которое включает специфическую реакцию между двумя взаимоподходящими реакционноспособными функциональными группами. Так, для ПЭГирования пептида 19 боковую цепь лизина преактивируют бромацетиловой группой с получением пептида 17Ь для обеспечения реакции с тиол-дериватизированным ПЭГом. Для этого ортогональная защитная группа Эбе используется для защиты ε-амина лизина. После того, как собрана целая пептидная цепь, Νконцевой амин снимают с защиты ΐ-Вос. Затем удаляют Эбе для обеспечения бромацетилирования. Указанная стратегия приводит к получению высококачественного сырого пептида, который легко очищается при использовании подходящей обратнофазовой НРЬС. Лигирование пептида с тиол-модифицированным ПЭГом проводят в водной буферной среде при рН = 8 и реакцию завершают в течение 30 мин. МА16Э1М8 анализ очищенного ПЭГированного материала выявляет характерный, напоминающий колокол спектр с приращением 44 кДа между соседними пиками. Для ПЭГ-пептида 20 остаток цистеина помещают в область линкера и его тиоловая группа боковой цепи служит сайтом прикрепления для малеимидсодержащего ПЭГ а. Сходные условия используют для ПЭГирования указанного пептида. Как показывают данные исследования, указанные два ПЭГированные пептиды имеют более высокую биоактивность ίη νίίτο по сравнению с неПЭГированными соединениями.

Пептид 21 имеет в своем 8-аминокислотном линкере возможную гликозилированную структуру N08. Поскольку приведенные в качестве примеров тандемные димеры состоят из природных аминокислот, связанных пептидными связями, экспрессия такой молекулы в подходящей эукариотической клеточной системе будет приводить к получению гликопептида с углеводной группой, добавленной на карбоксиамидную боковую цепь Аки. Гликозилирование - это обычный процесс посттрансляционной модификации, который может вносить позитивный вклад в биологическую активность данного белка путем увеличения его растворимости в воде и стабильности ίη νίνο. Как показывают данные анализа, введение указанной гликозилированной структуры в линкер поддерживает высокую биологическую активность. Синтетический предшественник возможного гликопептида имеет активность, сравнимую с таковой связанного (С1у)₈-линкером аналога. Будучи гликозилированным, этот пептид, как ожидается, имеет сходный порядок активности с ПЭГированными пептидами, поскольку ПЭГ и углеводный остаток имеют одинаковые физикохимические свойства.

Последний пептид является димером димеров. Его получают окислением пептида 18, которое формирует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя цистеиновыми остатками, локализованными в линкере. Указанный пептид конструируют для того, чтобы установить, активен ли ТМР в качестве тетрамера. Данные исследования показывают, что такой пептид не более активен, чем средний тандемный димер на такой же молярной основе, что непрямым образом поддерживает идею о том, что активной формой ТМР является действительно димер, а не димеризация тандемного димера будет обеспечивать дальнейшее влияние на биологическую активность.

Приведенная ниже табл. I суммирует относительные активности описанных выше соединений, выраженные, как ЕС50, установленные на основании исследований ίη νίίτο, описанных выше.

Таблица 1

ОтносиСоединение ЕС₅₀ тельная активность

ТРО4,0

ТМР мономер (8Е(} ГО N0:1)1,0

ТМР С-С димер (8Е<2 ГО N0:2)3,5

ТМР-(О1у)„-ТМР:

п=04.5 п=14.0

Зп = 24.0

4п = 34.0

5п = 44.0

6п = 54.0

7п = 64.0

8п = 74.0

9п = 84.5

10п = 94.0

11п=104.0

12п=144.0

ΤΜΡ-ΟΡΝΟ-ΤΜΡ (8Εζ) ГО ΝΟ. 10)3.0

ЕСРТЕКОСЬААКАЧХЮЖЗСаьЕОРПЖОСЬААКА о 5 1I ₁₄ (ЯЮГОКО. 11)

150.5

ШОРТЬКОСЬААКА-ССКККККЮ-ШСРТЬКОСЬААКА (5Ε0Π3ΝΟ. 12)

160.5

ГЕОРП.КОДЬААКА-ССС<ЗС<5СО-1ЕОРТЕКОДЕААЯА (5ΕΟΠ3ΝΟ. 13)

17а ТМР-ОООКОООО-ТМР (8Е<2 ГО ΝΟ. 14)4.0

17Ь ТМР-ОООК(ВгАс)ОООО-ТМР (8IX.) ГО\1)

ΝΟ. 15)

ТМР-ОООСОООО-ТМР (8Εζ) ГО ΝΟ. 16)4.0 тмр-ооок(рео)оооо-тмр(8Е(2 го νο. 5.о

17)

ТМР-ОООС(РЕО)ОООО-ТМР 18IX.) ГО ΝΟ. 5.0

18)

ΤΜΡ-ΟΟΟΝΟ8ΟΟ-ΤΜΡ (8Е<2 ГО ΝΟ. 19) 4.0

ТМР-СОССОССО-ТМР (5Е<2 ГО ΝΟ. 20) 4.0

ТМР-ОСЮССКЗОО-ТМР

Примечание: в табл. 1 цифры обозначают примерно 1 1од активности, так что различие в активности между «1» и «4» является примерно 1000-кратным. Приращение 0,5 является промежуточной точкой, так что различие в активности между «1» и «3,5» примерно 500-кратное. «Νϋ» означает, что значение не определено.

II. Следующие методы касаются получения некоторых соединений второй группы, описанных здесь.

А. Получение соединения Ес-слияния, показанного на фиг. 6С.

ДНК-последовательность, кодирующую Ес-участок 1дС1 человека, слитую с сохранением рамки считывания с димером ТРОмиметического пептида (§Εζ) Ш N0:34), помещают под контроль промотора 1 их Р_Р в плазмидном векторе экспрессии, как описано ниже.

Ген слияния конструируют с использованием стандартной РСЯ-технологии. Матрицами для РСЯ-реакций служат векторы слияния, содержащие Ес-последовательность и синтетический ген, кодирующий остаток соединения §Εζ) Ш N0:34. Синтетический ген конструируют на основе 4 перекрывающихся олигонуклеотидов, приведенных ниже:

1830-52 ААА СОТ СОА СОТ СОТ СОТ АТС ОАА СОТ ССО

АСТ СТО СОТ САО ТОО сто ост ост сот <зст (8Ε<2Π)ΝΟ:35)

1830-53 АСС ТСС АСС АСС АСС АСС АСС АСС САС

ССА СТО АСО САС АОТ С6О АСС (ЗЕО ГО ΝΟ: 36)

1830-54 СОТ СОТ СОА СОТ ССС ССС ОСА СОТ АТТ ОАО ООС ССА АСС СТТ ССС САА ТОО СТТ ОСА ОСА ССС ОСА (5ЕО ГО ΝΟ: 37)

1830-55 ААА ААА АОО АТС СТС ОАО АТТ АТО СОС ОТО СТО САА ОСС АТТ ООС ОАА ООО ТТС СОС ССТ САА ТАС СТС ССС ССС с (ЗЕЦГОИО: 38) олигонуклеотида отжигают с образованием дуплекса, показанного ниже:

лААзетаеАзетеатвотАтсаллостсселстсТбсстслетеестесстбстсстбст

1________ч---------ч---------ч--------ч---------ч---------ч· 60

ССЛевСТ6АвАСВСАВТСЛСС5АССвАССАЕСАСаА кбввесзввртьвоиьАлнл

6СТбетсаАеСТСаС6ССССАССТАТТ6АС50СССЛАСССТТССССААТС6СТТССАССА ---------Ч---------Ч------Ч---------Ч---------Ч---------+ 120 ССАССЛССТССАССвССвССТССМААСТСССОветТСЧМААЙСОСТТАСССААСетсет сгсоеесехЕбРТЪАСЯЬАА

ССС6СА ---------------------------14В есбСОТАТТАСАЙСТССТАЯаААААААА

КА * §Εζ) Ш N0:39 [колинеарные олигонуклеотиды 1830-52 и 1830-54] §Εζ) Ш N0:40 [колинеарные олигонуклеотиды 1830-53 и 1830-55] и §Εζ) Ш N0:41 [кодируемая аминокислотная последовательность].

Указанный дуплекс амплифицируют в РСЯ-реакции при использовании 1830-52 и 1830-55 в качестве смыслового и антисмыслового праймеров.

Ес-участок молекулы генерируют с помощью РСЯ-реакции с ДНК Ес при использовании следующих праймеров:

1216-52 ААС АТА АОТ АСС ТОТ АОО АТС О. (5Е0ГОИО:42)

1830-51 ТТСОАТАССАССАССТССАССТТТАССССОАСАСАССОАОАООСТСТТСТОС (5Е<3 ГО ΝΟ: 43)

Олигонуклеотиды 1830-51 и 1830-52 содержат перекрывающиеся 24 нуклеотида, позволяя двум генам сливаться вместе в корректной рамке считывания путем объединения указанных выше РСЯ-продуктов в третьей реакции при использовании внешних праймеров 1216-52 и 1830-55.

Конечный РСЯ-генный продукт (полноразмерный ген слияния) расщепляют рестрикционными эндонуклеазами ХЬа1 и ВаптЕП и затем лигируют в вектор рАМС21 (см. ниже), также расщепленный Х1а1 и ВаптНГ Лигированный ДНК трансформируют компетентные клетки хозяйского штамма Е. сой 2596 (6М 221, описанного ниже). Клоны скринируют на способность продуцировать рекомбинантный белковый продукт и на корректность нуклеотидной последовательности гена слияния. Уровни экспрессии белка определяют в исследовании 50мл шейкерных флаконов. Лизаты целых клеток анализируют на экспрессию гена слияния посредством окрашивания Кумасси РАСЕ-гслсй.

Аминокислотная последовательность белка слияния показана ниже под соответствующей нуклеотидной последовательностью:

ХЬа1

I

ТСТАетСТТТетТТТААС»АГЕМЛа5АС®А1ААСММОСЖСААААСТСАСА£А1СТС

А^ОТиииСААААТГСЭСТТЛМТТССТССТТАТТСТАХАССТСТТТТОАСТетСТАСАС; мпктнтср

САССТТетССАССТСС6Са«СТССТ6СС6ССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААС

СССТСССАССССССАТССАСААААССАТСТССАААВССАААвбССАССССССАСААССАС

361---------1-------—|——-----+---------4.---------к+ 420

1.РАР1ЕКТ13КАКС0РЯЕР0

АеСТСТАСЛСССТССССССЛТСССвССАТСАССТСАССААеААССАСетСАСССТСЛССТ

421---------1----------1---------*---------+---------++ 480 тсаА»гстажсб®кяяЕАасвссстАстссАстветтсттсетссАвтсбсАСтссА УУТЬРРЗЯЕЕЬТККОУЗ Ь Т С

СССТСетСАААв(КТТСТМСССАССбМа1ССССетбаСТС<5аАСАвСААТС®ЗСА6С

481---------+---------+---------+---------►--------►+ 540

СбСАССАСТТГССбААвАТМвСТСбСТСТЛССббСАССТСАСССТСТССТТАСССетСС

ЬУКСГУРЗ П1АУВ1ГЕЗМСаР

СКЭШААСААСТАСЛАСАССАССКСТССССТОСТССаСТСССДССССТССТТСГТССТСТ ^Е ХКТТРРУЬОЗПСЗРГЬУ

АСАССААССТСАССвТввАСААОАССАССТбССАССАСбССААССТСТТСТСАТССТССО ТСТССТГССАСТСССЛССТСТТСГССТССАСССТСбТССССТТСаАаААСАСТАССАССС ЗКЕТУОКЗЯЭГООвМУРЗСЗУ ί т(атбСАГбашбстствама«с»стласбСАСАА1азсстстссстетстссс(эетА 661---------4---------1---------+--------1— ------Ь---------+ 720

МНЕАЬННН¥Т0К5Ь5Ь5₽ СК

ААеСТбвАССТОСТаСТАХССААСетсССАСТСТаСбТСАСТСССТСССТССТСВТССТС

721---------1--------4---------4-------►--------►---------4· 780

ТТССАССТССАССАССА1АССТТССАв<ЗСТвМаС6САСТСАССеЛ£ССАС6АССАС6АС ССССС1ЖСРТЬЯ0<ЬАААА6 еттеТССАвСТОбСС6С6САветАТТ»СС6СССААСССТТССССААТ0вСТТССАССАС 781---------4---------4·---------4---------+---------+---------+ 840

САССАССТССАСССССбССТССАХААСТСССССетТСССААССССТТАСССААСетсетС СССССССХЕСРТЬКаМЬААВ

ВмпНТ

I

ССОСАТААТСТССАССЛТССС

841 ---------4---------4- 861

ССССТАТТАСАССТССТАССС

А

ЗЕО ГО N0:44 [одноцепочечное считывание 5'^3' выше]

ЗЕО ГО N0:45 [одноцепочечное считывание 3'^5' выше] и

ЗЕО ГО N0:46 [кодируемая аминокислотная последовательность].

ρΛΝ021

Плазмида экспрессии рАМО621 доступна из АТСС под регистрационным номером 98113, под которым она была депонирована 24 июля 1996 г.

ОМ221 (Атдеп хозяйский штамм # 2596)

Хозяйский штамм Атдеп # 2596 представляет собой штамм Е. сой К-12, который был модифицирован с тем, чтобы содержать температурочувствительный лямбда репрессор с 1857з7 в раннем участке еЬд и 1ас10 репрессор в позднем участке еЬд (68 мин). Наличие двух указанных репрессорных генов позволяет использование такого хозяина с различными системами экспрессии, однако, оба репрессора иррелевантны по отношению к экспрессии с 1ихР_К. Нетрансформированный хозяин не имеет устойчивости к антибиотикам.

Сайт связывания с рибосомой гена с 1857з7 модифицирован с включением усиленного КВЗ. Он был встроен в еЬд оперон между нуклеотидным положением 1170 и 1411, как пронумеровано в соответствии с регистрационным номером ОепЬапк М644415Ь_Ва, в делецией встроенной еЬд-последовательности.

Конструкцию доставляют в хромосому при использовании рекомбинантного фага, обозначенного ММеЬд- с 1857з7 (усиленный КВЗ # 4), клеток Б' ί&ί/393. После рекомбинации только хромосомная вставка, описанная выше, остается в клетке. Ее переобозначают Б '1е1/СМ 101.

Б' 1е1/СМ 101 затем модифицируют доставкой 1ас I' конструкта в еЬд-оперон между нуклеотидами в положении 2493 и 2937, как пронумеровано в соответствии с регистрационным номером ОепЬапк М64441СЬ-Ва, с делецией встроенной еЬд-последовательности.

Конструкцию доставляют в хромосому при использовании рекомбинантного фага, обозначенного А0еЬд-Ьас1р # 5, в клетки Б' 1е1/СМ 101. После рекомбинации только хромосомная вставка, описанная выше, сохраняется в клетке. Ее переобозначают Б' 1е1/СМ 221. Б' ^ί эписому выделяют из штамма при окрашивании акридиновым оранжевым в концентрации 25 мкг/мл в ЬВ. Штамм идентифицируют как устойчивый к тетрациклину и хранят как ОМ221.

Конструкцию слияния Бс, содержащуюся в плазмиде рАМО21 (здесь на нее ссылаются как на рАМО21-Бс-ТМР-ТМР), которая, в свою очередь, содержится в хозяйском штамме ОМ221, депонируют в АТСС под регистрационным номером 98 957 22.10.1998 г.

Экспрессия

Культуры Е. сой ОМ 221 с рАМС21-БсТМР-ТМР инкубируют в бульоне Лурии, содержащем 50 мкг/мл канамицина при 37°С до индукции. Индукцию генного продукта экспрессии Бс-ТМР-ТМР с 1ихРК промотора обеспечивают добавлением синтетического аутоиндуктора N-(3 -оксохексаноил)ГОЬ-гомосеринлактона в культуральную среду до конечной концентрации 20 нг/мл и культуры инкубируют при 37°С 3 ч. Через 3 ч бактериальные культуры исследуют под микроскопом на наличие телец включения и затем собирают центрифугированием. Преломляющие свет тельца включения наблюдают в индуцированных культурах, что свидетельствует о том, что Бс-ТМР-ТМР наиболее вероятным образом продуцируется в нерастворимой фракции Е. сой. Осадки клеток лизируют непосредственным образом путем ресуспендирования в буфере для образцов Лэммли, содержащем 10% бета-меркаптоэтанола, и анализируют в ЗОЗ-РАСЕ. В ЗЭЗ-РАСЕ геле обнаруживают интенсивно окрашенную Кумасси полосу размером около 30 кДа. Ожидаемый генный продукт имеет 269 аминокислот и мол. массу около 29,5 кДа. Ферментацию осуществляют в стандартных условиях периодического процесса в объеме 10 л, что приводит к сходным уровням экспрессии Бс-ТМР-ТМР, наблюдаемым при мелкомасштабном производстве.

Очистка Бс-ТМР-ТМР

Клетки разрушают в воде (1/10) путем гомогенизации под высоким давлением (2 сеанса при 14 000 РЗ1) и тельца включения собирают центрифугированием (4200 КРМ в К6В в течение 1 ч). Тельца включения солюбилизируют в 6М гуанидине, 50 мМ трисе, 8 мМ ОТТ, рН 8,7, в течение 1 ч при соотношении 1/10. Солюбилизированную смесь разводят в 20 раз 2М мочевиной, 50 мМ трисом, 160 мМ аргинином, 3 мМ цистеином, рН 8,5. Смесь перемешивают в течение ночи на холоду. В этот момент процедуры Бс-ТМР-ТМР мономерные субъединицы диме47 ризуются с образованием связанного дисульфидными мостиками соединения, имеющего структуру, показанную на фиг. 6С. Затем препарат концентрируют ультрафильтрацией примерно в 10 раз. Далее его разводят в 3 раза 10 мМ трисом, 1,5 М мочевиной, рН 9. РН смеси доводят до 5,0 уксусной кислотой. Преципитат удаляют центрифугированием и супернатант наслаивают на колонку Рак! Р1оте с 8РСефарозой, уравновешенную 20 мМ ЫаАс, 100 мМ ЫаС1, рН5 (10 мг/мл наслаиваемый белок, комнатная температура). Белок элюируют при использовании градиента в 20 объемах колонки тем же самым буфером с содержанием ЫаС1 от 100 до 500 мМ. Пул фракций, собранных с колонки, разводят в 3 раза и наслаивают на колонку с 8Р-Сефарозой НР в 20 мМ ЫаАс, 150 мМ №С1. рН 5 (10 мг/мл наслаиваемый белок, комнатная температура). Белок элюируют при использовании градиента в 20 объемах колонки тем же самым буфером с содержанием ЫаС1 от 150 до 400 мМ. Пики объединяют и фильтруют.

III. Ниже приведены суммарные данные испытаний ίη νίνο на мышах различных заявленных соединений.

Мыши. Здоровые самки ΒΌΕ1 примерно 10-12-недельного возраста.

Схема забора крови. Десять мышей в расчете на группу обрабатывают в день 0, две группы из 20 мышей обрабатывают через 4 дня. У 5 мышей забирают кровь в каждую точку отсчета, в целом у животных забирают кровь минимум три раза в неделю. Мышей анестезируют изофлураном и общий объем 140-160 мкл крови получают пункцией орбитального синуса. Кровь исследуют в специальном анализаторе Тесйшсоп Н1Е, оснащенном специальной программой для анализа крови мыши. Оценивают такие параметры, как лейкоциты, эритроциты, гематокрит, гемоглобин, тромбоциты, нейтрофилы.

Обработка. Мышей инъецируют подкожно болюсным введением препарата или имплантируют им микроосмотические насосы для постоянной доставки лекарства в течение 7 дней. Подкожные инъекции осуществляют в объеме 0,2 мл. Осмотические насосы встраивают подкожно, делая разрез между лопатками у анестезированных мышей. Соединения разводят в РВ8 0,1% В8А. Во все эксперименты включают одну контрольную группу, помеченную «носитель». Животным этой группы вводят только разбавитель. Концентрацию тестируемых соединений в насосах доводят таким образом, что откалиброванная скорость потока препаратов из насоса обеспечивала уровни обработки, указанного в диаграммах.

Соединения. Титрованные дозы препаратов доставлялись мышам в течение 7 дней с помощью микро-осмотических насосов. Мышам вводили различные соединения однократными дозами 100 мкг/кг. Некоторые из соединений затем вводили мышам однократной болюсной инъекцией.

Результаты тестирования активности. Результаты экспериментов по тестированию активности приведены на фиг. 4 и 5. В исследованиях типа доза-ответ с 7-дневными микроосмотическими насосами (данные не показаны) максимальный эффект наблюдался при тестировании соединения 8Е0 ГО ЫО:18 в дозе 100 мкг/кг/день. Доза 10 мкг/кг/день была примерно на 50% менее активной по сравнению с максимальной, а доза 1 мкг/кг/день была наименьшей, при которой активность еще выявлялась в данной системе анализа. Соединение в дозе 10 мкг/кг/день было примерно таким же активным, как и неПЭГированное соединение гНи-МСЭЕ в дозе 100 мкг/кг/день в том же самом эксперименте.

IV. Обсуждение.

Хорошо известно, что МООР действует сходным образом с гормоном роста человека (ЙОН), т. е. одна молекула белкового лиганда связывает две молекулы рецептора для активации последнего (^е11к, I. А. е! а1., Апп. Иеу. Βίοсйеш. 65: 609-634 (1996)). Это взаимодействие имитируется действием существенно меньших по размеру пептидов ТМР. Однако настоящие исследования позволяют предположить, что такая имитация требует согласованного действия двух ТМР-молекул, поскольку ковалентная димеризация ТМР как в С-С параллельной, так и в С-Ν последовательной ориентации увеличивает биологический потенциал ш νίίτο первоначального мономера более чем в 103 раз. Относительно низкий биологический потенциал мономера, возможно, обусловлен неэффективным образованием нековалентного димера. Предобразованный ковалентный димер обладает способностью элиминировать энтропийный барьер для формирования нековалентного димера, которое исключительным образом направляется слабыми, нековалентными взаимодействиями между двумя молекулами небольшого, состоящего из 14 аминокислотных остатков пептида.

Интересно отметить, что большая часть тандемных димеров более активна, чем Сконцевые параллельные димеры. Тандемная димеризация, по-видимому, приводит к формированию молекулы с лучше подогнанной конформацией, чем это обеспечивает С-С параллельная димеризация. Кажущиеся несимметричные свойства тандемного димера, должно быть, делают его ближе к природному лиганду, который, как несимметричная молекула, имеет два различных сайта для связывания двух идентичных рецепторных молекул.

Введение молекулы ПЭГа усиливает активность 1п νίνο модифицированного пептида, обеспечивая его защиту от протеолитической деградации и замедляя его выведение посредством почечной фильтрации. Неожиданным оказалось то, что ПЭГирование способно далее увеличивать биологическую активность тандемно димеризованного ТМР пептида, как определяется в исследовании клеточной пролиферации.

V. Ниже приведены суммированные данные исследований ш νίνο, проведенных на обезьянах с различными заявленными соединениями.

Для оценки гематологических параметров самок обезьян, ассоциированных с введением АМР2 посредством подкожной инъекции, был разработан и использован следующий протокол. Формировали 5 групп, состоящих из трех обезьян каждая. Группа 1 была контрольной, животные этой группы получали ацетатный буфер (20 мМ ацетата натрия, 0,25 М хлорида натрия, рН 5), не содержащий ни АМР2, ни ПЭГированный рекомбинантный МОБЕ (ПЭГ-гНиМСБЕ) человека. Группа 2 получала одну или более доз АМР2 с интервалами, описанными ниже. Группа з получала 1000 мкг/кг АМР2 с интервалами, описанными ниже. Группа 4 получала 5000 мкг/кг АМР2 с интервалами, описанными ниже, и группа 5 получала 100 мкг/кг ПЭГ-г НиМСБЕ с интервалами, описанными ниже.

День, в который была введена первая однократная доза, был обозначен как День 0 Цикла 1. В Цикле 2 дозы вводились в День 21, 2з, 25, 28, з0 и з2. Во время Цикла з однократную дозу вводили в День 84, а во время Цикла 4 - в День 12з. Животных наблюдали с целью выявления клинических симптомов один раз в день во время периода адаптации, три раза в день (до введения дозы, через з0 мин после введения дозы и через 2-з ч после введения дозы) в дни введения препарата и один раз в день, когда препарат не вводили. Потребление пищи каждым животным рассчитывали каждый день на основе числа кусочков пищи, которые получали животные и которые оставались, начиная с 7 дней до начала периода введения доз и до самого конца восстановительного периода. Вес тела каждого животного определяли дважды до начала сведения доз и дважды в течение периода дозирования и периода восстановления. Образцы крови для гематологического исследования получали до начала дозирования и в Дни 1, з, 5, 7, 9, 11, 1з, 15, 20, 22, 24, 26, 29, з1, зз, з5, з7, з9, 41, 4з, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 8з, 85, 87, 89, 91, 9з, 95, 97, 99, 101, 10з, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 1з0, 1з2, 1з4, 1з6, 1з8, 140, 142, 144, 150. Для фармакокинетического анализа 0,5 мл сыворотки собирали до начала дозирования и через 1,4 и 24 ч после введения доз. Образцы собирали в Дни 0, 21, з2, 84 и 124 и хранили примерно при -70°С до начала исследований. Для выявления антител отбирали 2 мл образца крови за неделю до введения однократной дозы и в Дни 0 (до начала дозирования), 6, 1з, 20, 27, з4, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 8з, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 126, 14з и 150. Образцы хранили при -70°С до исследований.

Результаты исследований показывают, что уровни тромбоцитов увеличиваются во всех обработанных группах, причем наибольшее увеличение наблюдается при введении ПЭГгНиМСБЕ и высоких доз АМР2. В Цикле 1 пик числа тромбоцитов увеличивается примерно в з,з раза и з,1 раза в группах, которым вводили ПЭГ-гНиМСБЕ (День 9) и 5000 мкг/кг АМР2 (День 9) соответственно, по сравнению со средним пиковым значением в контрольной группе. При низкой дозе АМР2 число тромбоцитов увеличивается примерно в 1,5 раз по сравнению с контрольным в те же самые дни исследований. Сходные ответы регистрируются во всех других циклах.

Однако в Цикле 4 группа, обработанная ПЭГ-гНиМСБЕ, не обнаруживала такого большого увеличения числа тромбоцитов, как в предыдущих циклах. В группе ПЭГ-гНиМСБЕ число тромбоцитов увеличилось примерно в 2 раза по сравнению с контрольной группой через 9 дней после введения дозы в этом цикле. Для сравнения среднее число тромбоцитов при наивысшей дозе препарата в группе АМР2 Цикла 4 было в з,з раза больше, чем в контрольной группе. Кроме того, у животных, получавших ПЭГ-гНиМСБЕ, среднее количество тромбоцитов было на 5з% ниже, чем в контрольной группе в начале Цикла 4 (на дозу), а среднее число тромбоцитов в группе в конце цикла 4 (27 дней после введения дозы) было на 79% ниже, чем в контрольной группе. Для всех АМР2 животных среднее число тромбоцитов в начале и конце Цикла 4 составляло ±15% от количества тромбоцитов в контрольной группе.

В Цикле 1 и 2 тенденция к уменьшению числа эритроцитов (КВ С) наблюдалась во всех обработанных группах по сравнению с контролем. Уменьшение было наиболее очевидным к Дню 41-4з и наибольшее уменьшение числа КВС наблюдалось в группе ПЭГ-гНиМСБЕ. Число КВС начинало возвращаться к нормальным уровням (по сравнению с контролем) к Дню 47. Количество лейкоцитов (^ВС) во время Циклов 1 и 2 существенно увеличивалось (в 2,6 раза) по сравнению с контролем к Дню зз. Значения приближались к нормальным (контрольным), начиная с Дня з7. Сходный ответ наблюдался в Цикле з с отсутствием явных изменений числа \УВС в Цикле 4 в какой-либо из обработанных групп.

Во время цикла з число КВС незначительно уменьшалось к Дню 1з (за однократной дозой Цикла з) во всех обработанных группах за исключением группы, получавшей 500 мкг/кг АМР2. Уровни КВС начинали возвращаться к нормальным (по сравнению с контролем) к Дню 17.

В Цикле 4 количество КВС увеличивалось во всех трех обработанных группах по сравнению с контрольной, за исключением группы, получавшей 500 мкг/кг АМР2. В отличие от других циклов, в Цикле 4 наблюдалась более чем одно, резкое падение значений. Эти уменьшения появлялись в Дни 1-9 после введения дозы и начинали восстанавливаться к Дню 11.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение числа тромбоцитов по сравнению с контрольными животными может быть выявлено через 7-9 дней после введения препаратов у всех животных во всех циклах. Повидимому, повторные дозы вызывают более высокий ответ с точки зрения образования тромбоцитов по сравнению с однократными дозами. Начиная с Цикла 4, тромбоцитарный ответ в группе ПЭГ-тНиМСИР был ниже по сравнению с предыдущими циклами и по сравнению с ответом при высокой дозе АМР2. Уменьшение числа ВВС наблюдалось в Циклах 1, 2, 3 и 4 в наиболее интенсивно обработанных группах в определенной точке каждого цикла, однако, все гематологические параметры возвращались к нормальным уровням (по сравнению с контролем) после прекращения введения препарата.

Более того, приведенные результаты свидетельствуют о том, что обработка АМР2 хорошо переносится обезьянами резус, а АМР2 приводит к увеличению числа тромбоцитов после различных циклов обработки. Не выявлялось, что показано на основе результирующего учета числа тромбоцитов, что существует биологический значительный иммунно-опосредованный ответ на АМР2. В противоположность указанному, введение в различных циклах ПЭГтНиМСИР ингибирует тромбоцитарный ответ в Цикле 4, позволяя предположить, что антитела к ПЭГ-тНиМСИР образуются в организме и такие анти-МСИР антитела могут перекрестно реагировать с эндогенным ТРО обезьян резус.

Несмотря на подробное описание изобретения, специалисту в данной области ясно, что могут быть сделаны его различные изменения и модификации, которые не выходят за рамки сущности и объема изобретения.

Перечень последовательностей <110> Ци, СЬиап-Га

Еехде, Ш.г1сН СЬеейЬат, Запе£ С.

<120> ТЬготЬорохеСхс Согароипйз <130> 01017/36263 <140>

<141>

<150> 60/105,348 <151> 1998-10-23 <160> 46 <170> РайепМп Уег. 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> РИГ <213> АгС1£±с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 0езсг1рЫоп о£ Аг£1£1с±а1 Зедиепсе: ρβρίΐάβ <400> 1

Не 61и 61 у Рго ТЬг Ьеи Агд С1п Тгр Ьеи А1а А1а Агд А1а

5 .10 <210> 2 <211> 14 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <22 0>

<223> Ье5сг1рС1оп о£ АгЬ1£1с1а1 Зедиепсе: рерСШе <22 0>

<223> РерЬШе 1з а зиЬип1Ъ о£ а ЬопкхНтег: ЗиЬипЬЕз ±п РЬе сНтег асе соуа1епР1у Ьопйес! аЪ еасЬ сагЬоху Репп±пиз рЬгоидЬ рерЫйе Нпкаде н!ЬЬ №12-СН2-СН2-СН2-СИ2-СН (СОЫН2)-ЫН-СО-СН2-СН2-КН2 <400> 2

11е 61и 61у Рго ТЬг Ьеи Агд 61 п Тгр Ьеи А1а А1а Агд А1а 15 10 <210> 3 <211> 684 <212> ΌΝΑ <213> АгР1£±сха1 Зедиепсе <220>

<223> 0езсг1р€1оп о£ АгМ£1сха1 Зедиепсе: о11допис1еоРхйе <400> 3 асддасаааа сссасасайд СссассСйде ссадссссдд аасСсссддд дддассдсса 60 дпсеессСсС Сссссссааа асесааддас ассспсапда СсСсссддас сссПдаддСс 120 асаПдсдПдд СддПддасдХ дадсеасдаа дассспдадд Ссаадспсаа срддрасдсд 180 дасддсдйдд аддсдсасаа Рдссаадаса аадседеддд аддадсадПа саасадсаед 240 Сассдпдйдд ссадсдСссС сассдПссПд сассаддаеС ддеСдааСдд сааддадсас 300 аадСдсаадд ЪсСссаасаа адсссРссса дсссссапсд адаааасеаЪ сСссааадсс 360 ааадддсадс сссдадаасе асаддЬдСас асссСдсссс саСсссддда СдадсСдасс 420 аадаассадд СсадесРдас сСдссПддСс аааддсПСеП айсссадсда саХсдссдХд 490 дадХдддада дсааСдддса дссддадаас аасСасаада ссасдссСсс сдгдсбддас 540 йссдасддсе ссСЪсРРссС сСасадсаад сСсассдПдд асаададсад дСддсадсад 600 дддаасдссС СсСсаПдсСс сдСдайдсас даддсСсСдс асаассасСа сасдсадаад 660 адесссСссс сдЪсЪссддд Сааа 694 <210> 4 <211> 684 <212> ϋΝΑ <213> АхС1£±с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 0езсг1р£1оп о£ Аг£1£1с±а1 Зедиепсе: о11допис1ео814е <400> 4

ХассСдСППЪ дадПдПдПас аддЪддааса ддЪсдаддсс ЗДдаддассс сссЪддсадП 60 садааддада аддддддЪЬЪ СдддСПссСд ЬдддадПасе ададддссСд дддасСссад 120 едСасдсасс ассассрдеа сСсддСдсЬС есдддасссс адССсаадСС дассаСдсас 180 сПдссдсасс ЬссасдСаПС асддСПсСдС ССсддсдесс СссСсдСеаС дСЬдЬсдСдс 240 аЬддсасасс адСсдсадда дСддсаддас дГддПссПда ссдасССасс дегссСсаРд 300 СЪсасдПСсс ададдСРдСС Ьсдддадддй едддддйадс еспеъсддСа даддпсссдд 360 ССЪсссдСсд дддсРсЬСдд СдсссаеаСд Сдддасдддд дсадддсссР асСсдасСдд 420 йСсЬСддЪсс адПсддасЪд дасддассад СССссдаада СадддСсдсе драдсддсас 480 сПсасссесС сдССасссдС сддссПсССд ССдаЪдССсС ддгдсддадд дсасдассПд 540 аддсЪдссда ддаадаадда даЪдСсдРРс дадЪддсасс ЪдСЬсСсдЬс сассдСсдЪс 600 сссССдсада ададЪасдад дсасПасдЪа сЪссдадасд ЪдкСддГдаЕ дЪдсдПсЬСс 660 Ссддададдд асададдссс βϊΐΐ 684 <210> 5 <211> 229 <212> РАТ <213> АгС1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Цезсг1рС1оп о£ АхЫ£±с±а1 Зедиепсе: ρβρϊϊάβ <400> 5

МеС

Азр

Ьуз

ТЬг

Нхз

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

61у

С1у

Рго

Зех

ν»ι

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

20

25

30

МеС

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

<31и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

35

40

45

Н1з

б!и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

61и

50

55

60

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуя

Рго

Агд

61и

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

65

70

75

80

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

90 95

61 у

Ьуз

61и

Тух

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зех

Азп

Ьуз

АХа

Ьеи

Рго

АХа

Рго

100

105

110

Не

61и

Ьуз

ТЬх

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

61у

61п

Рхо

Ахд

СХи

Рхо

6Хп

115

120

125

Уа1

Туг

ТЬх

Ьеи

Рго

Рхо

Зех

Агд

Азр

51и

Ьеи

ТЬх

Ьуз

Азп

СХп

Уа1

130

135

140

Зег

Ьеи

ТЬх

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61 у

РЬе

Тух

Рго

Зех

Азр

Не

АХа

УаХ

145

150

155

160

б1и

Тхр

б!и

Зех

Азп

61у

61п

Рго

61и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬх

ТЬх

Рго

165

170

175

Рхо

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

61у

Зех

РЬе

РЬе

Ьеи

Тух

Зех

Ьуз

Ьеи

ТЬх

180

185

190

Уа1

Азр

Ьуз

Зех

Ахд

Тхр

61п

СХп

61у

Азп

УаХ

РЬе

Зег

Суз

Зех

УаХ

195

200

205

Мех

Н1а

61и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Тух

ТЬг

СХп

Ьуз

Зех

Ьеи

Зех

Ьеи

210 215 220

Зег Рго С1у Ьуз

225 <210> 12 <211> 36 <212> РКТ <213> АхСх£хсха1 Зедиепсе <22 0>

<223> ОезсгхрЪхоп о£ Ах£Х£Хс1а1 Зедиепсе: ρβρίίάβ <400> 12

11е 61 и 61у Рго ТЬх Ьеи Агд 61п Суз Ьеи А1а А1а Агд А1а 61 у С1у 15 10 15

61у 61 у 61у 61 у 61у 61 у Не 61и 61 у Рго ТЬх Агд Ьеи 61п Суз Ьеи 20 25 30

А1а АХа Агд АХа <210> 13 <211> 36 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ОезсххрСХоп о£ АгЫ£1с1а1 Зедиепсе: рерЫйе <400> 13 <210> б <211> 8 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> 0езсх1рЫоп о£ АгС1£1с1а1 Зедиепсе: рерЫйе <400> б

61у <51у <51у Ьуз 61у 61у 61у 61у

5 <210> 7 <211> Θ <212> РКТ <213> АгС1£1сха1 Зедиепсе <220>

<223> 0езсг1р£1оп о£ Аг£1£1сХа1 Зедиепсе: рерСХЬе <400> 7

61у <31у 61у Азп <31у Зег 61у 61у

5 <210> 8 <211> 8 <212> РКТ <213> АхЪ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> йезсгЬрйЬоп о£ АхЪх£Хс1а1 Зедиепсе: рерЫНе <400> 8

61у 61у 61у Суз 61у 61у 61у 61у

5 <210> 9 <211> 4 <212> РКТ <213> АгС1£хсха1 Зедиепсе <220>

<223> ПезсгхрИхоп о£ АхХ1£1с±а1 Зедиепсе: рерСХде <400> 9

61у Рго Азп 61у <210> 10 <211> 32 <212> РКТ <213> АхЫ£1с±а1 Зедиепсе <220>

<223> йезсгЬрЪЬоп о£ АхЪ1£1с1а1 Зедиепсе: рерЫйе <400> 10

Не 61и 61 у Рго ТЬг Ьеи Агд 61п Тгр Ьеи А1а АХа Агд А1а 61 у Рго 15 10 15

Азп С1у 11е 61и 61у Рго ТЬг Ьеи Ахд 61п Тгр Ьеи А1а А1а Ахд А1а 20 25 30

Не

С1и

СХу

Рхо

ТЬх

Ьеи

Ахд

61п

АХа

Ьеи

АХа

АХа

Агд

АХа

СХу

6Ху

1

5

10

15

СХу

61 у

СХу

61у

6Ху

6Ху

Не

СХи

6Ху

Рго

ТЬх

Ьеи

Ахд

61п

АХа

Ьеи

20

25

30

АХа А1а Ахд АХа <210> 14 <211> 36 <212> РКТ <213> Ах€1£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЬезсгхрСхоп о£ Аг£1£хсха1 Зедиепсе: рерЫйе <400> 14

Не 61и 61у Рго ТЬх Ьеи Агд 61п Тхр Ьеи А1а А1а Агд А1а 61 у 61у 15 10 15

61у Ьуз 61 у 61у 61у 61у Не 61и 61у Рхо ТЬх Ьеи Агд 61п Тгр Ьеи 20 25 30

А1а АХа Ахд А1а <210> 15 <211> 36 <212> РКТ <213> Ах£х£хсХа1 Зедиепсе <220>

<223> Ьуз гезхйие аС роз1ЬХоп 18 хз Вхотоасе£у1а£е4 <220>

<223> ОезсхХрЫоп о£ АхС1£1с1а1 Зедиепсе: άβΓίνβίΙζβύ рерЫйе <400> 15

Не 6Хи 61у	Рхо	ТЬх Ьеи Ахд	61п	Тхр Ьеи А1а	А1а Ахд	А1а	61 у	61 у
1		5		10			15
бХу Ьуз 61у	61у	61 у СХу Не	61и	61у Рхо ТЬх	Ьеи Ахд	61п	Тхр	Ьеи
	20			25		30
АХа АХа Ахд	А1а
35
<210> 16 <211> 36 <212> РКТ
<213> АгЫ£ХсХаХ Зедиепсе
<220>
<223> 0езсх1рЫоп о£ Ах£1£±с1а1	Зедиепсе: рерЫЬе
<400> 16 Не 61и 61у	Рхо	ТЬх Ьеи Ахд	61п	Тхр Ьеи А1а	А1а Ахд	А1а	61у	61у
1		5		10			15
С1у Суз 61у	61 у	61у б!у Не	61и	61у Рхо ТЬх	Ьеи Ахд	Е1п	Тхр	Ьеи
	20			25		30

А1а А1а Ахд А1а <210> 11 <211> 36 <212> РКТ <213> АгХх£хсха1 Зедиепсе <220>

<223> Пезсх1р€1оп о£ АхЫ£1сХа1 Зедиепсе: рерЫйе <220>

<223> Сус1хс рерЫЬе; Зесопйагу зЪгисЪиге 1з шахпЕахпес! Ьу <1хзи1£хЬе ЬопЬ ЬеЬыееп хпСгашоХесиХаг Суз хезхвиез аЬ розЬЫопз 9 ап4 31

<400> 11

Не

СХи

61 у

Рхо

ТЬх

Ьеи

Ахд

6Хп

Суз

Ьеи А1а

АХа Ахд

АХа

61 у

СХу

1

5

10

15

СХу

61 у

СХу

61 у

61у

СХу

Не

С1и

61 у

Рхо ТЬх

Ьеи Агд

61п

Суз

Ьеи

20

25

30

АХа

АХа

Агд

АХа

35

<210> 17 <211> 36 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Ьуз а£ розхХхоп 18 ±з редуХаСеН <22 0>

<223> ОезсгХрХхоп о£ АгЪ±£±с1а1 Зедиепсе: άβΓχνβΧίζβά рерС±с!е <400> 17

11е 61и 61у Рго ТЬх Ьеи Ахд 61п Тхр Ьеи АХа АХа Ахд АХа 61у 61 у

5 10-15

61у Ьуз 61у 61у 61у 61у 11е 61и 61у Рго ТЬх Ьеи Ахд 61п Тгр Ьеи

25 30

А1а А1а Ахд А1а <210> 18 <211> 36

РерЫйе ίδ соруа!епЕ1у Βοηάβά аС СЬе сахЬоху

Сехтхпиз Со ап 1япипод1оЬи11п Ес гед!оп <212> РЯГ <213> АгС1£1с1а1 5«чиепсе <22 0>

<223> Суз аС розхЫоп 16 1з реду1а€е4 <220>

<223> 0езсг1рС1оп о£ АхС1£1с1а1 Зедиепсе; «Ιβχίνβίΐζβά рерСхде <400> 16 <210> <211> <212> <213>

<22 0> <223>

РКТ

АхС1£хсха1 Зедиепсе

11е

О1и

61у

Рхо

ТЬг

Беи

Ахд

61п Тхр

Беи

А1а

А1а Агд

А1а

01 у

61 у

1

5

10

15

61у

Суз

61у

01у

С1у

61у

Не

01и С1у

Рхо

ТЬх

Беи Агд

01п

Тхр

Беи

20

25

30

А1а

А1а

Ахд

А1а

<220> <223>

<400>

Не

0еасг1рС1оп о£ АгН£1с1а1

Зечиепсе: рерМсбе <210> 19 <211> 36 <212> РКТ <213> АгЫ£1сха1 Зедиепсе <22 0>

<223> Резсх1рЫоп о£ АхС1£1с1а1 Зедиепсе: ρβρΧίάβ <400> 19

61у

А1а

61и

61у

Рго

ТЬх

Беи

Агд

61п

Тхр

Беи

А1а

А1а Ахд

А1а

61у

5

10

15

61 у

61у

61у

61у

61у

Не

61и

61у

Рхо

ТЬг

Беи Агд

61п

Тхр

20

25

30

А1а

Ахд

А1а

35

у

Беи <210> <211> <212> <213>

РКТ

АхС1£1с1а1 Зечиепсе

Не

61и

61у

Рхо

ТЬх

Беи

Ахд

61п Тхр

Беи

А1а А1а Ахд

А1а

61у

61у

1

5

10

15

61 у

Азп

61у

Зех

О1у

61у

11 е

61и С1у

Рхо

ТЬх Беи Ахд

61п

Тхр

Беи

20

25

30

А1а

А1а

Агд

А1а

<220> <223>

<220>

<223>

РерЫйе 1з соуа1епЫу Со ап 1лпаипод1оЬиНп Рс гедхоп

Ьопйес! аС СЬе ага1по

Резсх1рС1оп о£ АхЕ1£1с1а1

Сепахпиз

Зедиепсе: рерЫбе <210> 20 <211> 36 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> Мопотег1с зиЬип1С о£ а ЬогаосИтег; ЗиЬипдХз ίη СЬе ЬотосЯтех аге ЬопвеН Ьу а еИзи1£1<пе Ьопв ЬеСыееп Суз гез1с!иез аС роз1Ыоп 18 оп еасЬ зиЬип1С <220>

<223> 0езсх1рЫоп о£ Ах£1£1с1а1 Зедиепсе: рерЫ4е _ <400> 20

Не 61и 01у Рго ТЬг Ьей Агд 61п Тгр Ьей А1а А1а Агд А1а С1у 61у 15 10 15

О1у Суз 61у <51у 61у 61у Не С1и 61у Рго ТЬх Ьей Агд 61п Тгр Ьей 20 25 30

А1а А1а Агд А1а <210> 21 <211> 36 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зедиепсе <400> С1у

61у

Агд

61у Не С1и

Рго Азп 01 у

А1а <210> <211> <212>

<213>

<220>

<223>

61у Рхо ТЬх

11е С1и 01 у

РКТ

АгЫ£1с1а1 Зедиепсе

Беи

Ахд

61п Тхр Беи

А1а

А1а Ахд А1а

Рхо

ТЬг

Беи Агд 61п

Тгр

Беи А1а А1а <220>

<223> 0езсх1рЫоп о£ АгЫ£1с1а1 Зечиепсе: рерЫНе

<400> 21

Не

61и

61у

Рхо

ТЬх

Беи

Ахд

61п

Тгр

Беи

А1а

А1а Ахд

А1а

01 у

61 у

1

5

10

15

01 у

61 у

61у

61у

61у

61у

11е

61и

61у

Рхо

ТЬх

Беи Агд

61п

Тхр

Беи

20

25

30

А1а

А1а

Агд

А1а

35

<210> 22 <211> 32 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зечиепсе <220>

<223> РерС14е 1з άβχΙνβΗζβά аС ЕНе ат1по Сет1пиз нхЕЬ а соуа!епЫу Ьопе1ей 1вапипод1оЬи11п Гс гед1оп <220>

<223> 0езсг1рЫоп о£ АгЫ£1с1а1 Зечиепсе: рерЫйе <400> 22

Не 61и <31у Рхо ТЬг Ьей Ахд 61п Тгр Ьей А1а А1а Агд А1а 01 у Рго 15 10 15

Азп 61у Не 61и С1у Рго ТЬг Беи Агд С1п Тгр Ьей А1а А1а Ахд А1а 20 25 30 <210> 23 <211> 32 <212> РКТ <213> АхЫ£1с1а1 Зечиепсе <22 0>

<223> Ρβρΐΐάβ 1з соуаХепЫу Βοηάεά аЕ СЬе апхшо апа сахЬоху Сехт1п1 Со ап 1лтипод1оЬиНп Гс хед!оп <220>

<223> ОезсгхрЫоп о£ АгЫ£1с1а1 Зедиепсе: рерЫбе <400> 23

Не 61и 01 у Рхо ТЬх Беи Агд О1п Тгр Беи А1а А1а Ахд А1а С1у Рхо 15 10 15

Азп 61у Не 61и С1у Рхо ТЬх Беи Ахд С1п Тхр Ьей А1а А1а Агд А1а 20 25 30

РерЕхве 1з соуа1епС1у Со ап 1шпипод1оЬи11п Гс хедхоп

Ьопйе4 аС СЬе адН пр

Сехпйпиз <220>

<223> ЦезсгхрСхоп о£ АгМ£хсха1 5едиепсе: рерСШе

61п	Тгр	Беи 10	А1а	А1а	Агд	А1а
61и	61у 25	Рхо	ТЬх	Беи	Агд	61п 30

11е 1	61и О1у Рхо ТЬх Беи Ахд 61п Суз Беи А1а А1а Ахд А1а 61у
5	10	15
61у	61у 61у 01 у 61у 61у Не 61и	61у Рго	ТЬх Беи Ахд 61п Суз
	20	25	30

<210> 29 <2Ы> 36 <212> РКТ <213> АхС1£1сЬа1 Зечиепее <220>

<223> ОезсгЬрСЬоп οί АгСЬ£ЬсЬаЬ Зечиепее: ρβρύϊάβ <220>

<223> РерСхйе 1з соуа1епХ1у Ьопйес! ае РЬе атЬпо РегтЬпиз ро ап хтпшподЬоЬиЬЬп Гс хедЬоп <400> 29

Не

СЬи

СЬу

Рго

ТЬх

Ьеи

Ахд

СЬп АЬа

Ьеи АЬа

АЬа Ахд

АЬа

СЬу

СЬу

1

5

10

15

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

Не

СЬи СЬу

Рхо ТЬх

Ьеи Агд

СЬп

АЬа

Ьеи

20

25

30

АЬа

АЬа

Ахд

АЬа

35

<210> 30 <211> 36 <212> РНТ <213> АгРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее <220>

<223> РерРЬде Ьз соуаЬепРЬу Ьоп4е<1 аР РЬе ат: по Рехтхпиз Ро ап ЬпппиподЬоЬиЫп Гс хедЬоп <22 0>

<223> ОезсхЬрРЬоп о£ АхРЬ£ЬсЬа1 Зедиепсе: ρβρΡχάβ <400> 30

Не СЬи СЬу Рхо ТЬх Ьеи Ахд СЬп Тгр Ьеи А1а АЬа Агд АЬа СЬу СЬу 15 10 15

СЬу Ьуз СЬу СЬу СЬу СЬу 11е С1и СЬу Рхо ТЬх Ьеи Агд СЬп Тгр Ьеи 20 25 30

АЬа АЬа Ахд АЬа <210> 31 <211> 36 <212> РАТ <213> АгРхЬЬсЬаЬ Зедиепсе <220>

<223> РерРЬде Ьз соуаЬепР1у Ьоп4е4 аР РЬе атЬпо РехпЬпиз Ро ап ЬштиподЬоЬиЬЬп Гс хедЬоп <220>

<223> ОезсгЬрРхоп о£ АгРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее: ρβρΡΙάβ <4О0> 31

Не СЬи СЬу Рхо ТЬг Ьеи Ахд С1п Тхр Ьеи АЬа АЬа Ахд АЬа СЬу СЬу 1 5 10 15

СЬу Суз СЬу СЬу СЬу СЬу Не 61и СЬу Рго ТЬх Ьеи Ахд СЬп Тхр Ьеи 20 25 30

АЬа АЬа Ахд АЬа <210> 32 <211> 36 <212> РЯТ <213> АгРЬ£хсха1 Зечиепее <220>

<223> ОезсххрРЬоп о£ АгРЬ£Ьс1а1 Зечиепее: рерЫйе <22 0>

<223> РерРЬ<1е 1з соуаЬепРЬу Ьоп4ес1 аР РЬе атЬпо Регли, пиз Со ап ЬпшгиподЬоЬиЬЬп Гс хедхоп <400> 32

11е СЬи СЬу Рго ТЬх Ьеи Ахд СЬп Тхр Ьеи АЬа АЬа Агд АЬа СЬу СЬу 15 10 15

С1у Азп С1у Зег СЬу СЬу 11е СЬи СЬу Рхо ТЬх Ьеи Ахд СЬп Тхр Ьеи 20 25 30

АЬа АЬа Ахд АЬа <210> 33 <211> 36 <212> РКТ <213> АхЫ£1е1а1 Зечиепее <220>

<223> ОезсгЬрРхоп о£ АгРЬ£ЬсЬаЬ Зечиепее: рерРЬс1е <220>

<223> РерРЬде хз а зиЬипЬР о£ а ЬотосИтех; ЗиЬипЬРз Ьп сЬе ЬолюсШпех аге соЬиапРЬу Ьопёес! РЬгоидЬ а 0ЬзиЬ£Ь<±е Ьопс1 ЬеРмееп Суз гезЬ4иез аР розЬРЬоп 18 о£ еасЬ зиЬипЬР <22 0>

<223> РерСх^е Ьз соуаЬепРЬу Ьопс1е4 аР РЬе атхпо РехтЬпиз Ро ап хттиподЬоЬиЫп Гс хедЬоп <400> 33

Не

СЬи СЬу

Рхо

ТЬг

Ьеи

Агд

СЬп

Тгр

Ьеи

АЬа

АЬа Ахд

АЬа

СЬу

1

5

10

15

С1у

Суа СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

Не

СЬи

СЬу

Рго

ТЬх

Ьеи Ахд

СЬп

Тгр

20

25

30

АЬа

АЬа Агд

АЬа

35

<210> 34

<211> 41

<212> РЯТ

<213> АгРх£ЬсЬа1 Зечиепее <220>

<223> ОезсххрРЬоп о£ АгРх£Ьсха1 Зечиепее: рерРЬйе <220>

<223> РерРЬйе Ьз οονηΙβηΡίγ Ьопдей аР РЬе атхпо Рехшхпиз Со ап ЬлтиподЬоЬиЬЬп Гс хедЬоп <400> 34

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

Не

СЬи

СЬу

Рго

ТЬг

Ьеи

Ахд

СЬп Тгр

Ьеи АЬа

1

5

10

15

АЬа

Ахд

АЬа

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

Не

СЬи СЬу

Рго ТЬх

20

25

30

Ьеи

Ахд

СЬп

Тхр

Ьеи

АЬа

АЬа

Агд

АЬа

35

40

<210> 35 <211> 60 <212> 0ΝΆ <213> АгРЬ£ЬсЬа1 Зедиепсе <220>

<223> ОезсхЬрРхоп о£ АхРЬ£ЬсЬа1 Зедиепсе: оЬЬдописЬеоРЬде <400> 35 аааддРддад дрддрддсар сдааддрссд аерсрдсдрс адРддсСддс РдсесдРдсР 60 <210> 36 <211> 48 <212> ОНА <213> АхРЬ£хсЬаЬ Зечиепее <220>

<223> ОезсгЬрРЬоп о£ АгРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее: о1хдопис1еоРЬ<1е <400> 36 ассРссасса ссадсасдад садссадсса сРдасдсада дРсддасс 48 <210> 37 <211> 66 <212> ΟΝΆ <213> АгРЬ£ЬсЬаЬ Зечиепее <220>

<223> ОезсхЬрРЬоп о£ АхРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее: оЬЬдописЬеоРЬНе <400> 37 ддрддрддад дрддеддедд аддРаРРдад ддсссаассс РРсдссааРд дсррдсадса 60 сдсдса 66 <210> 38 <211> 76 <212> 1ЖА <213> АхЬх£Ьсха1 Зедиепсе <220>

<223> ОезсгЬрРЬоп о£ АхРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее: оЬЬдописЬеоРЬйе <400> 38 ааааааадда РссРсдадаР РаРдсдсдрд срдсаадсса ррддсдаадд дррдддссср 60 сааРассРсс деедсс 76 <210> 39 <211> 126 <212> ΟΝΑ <213> АхРЬ£Ьсха1 Зечиепее <220>

<223> ОезсхЬрРЬоп о£ АгРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее: о1Ьдопис1еоРЬс1е <400> 39 аааддРддад дрддрддрар сдааддрссд асРсРдсдРс адрддсрддс РдсРсдрдсР 60 дд±ддСддад дрддеддедд аддРаРРдад ддсссаассс РРсдссааРд дсррдсадса 120 сдсдса 126 <210> 40 <211> 124 <212> ОНА <213> АхРЬ£ЬсЬа1 Зечиепее <220>

<223> ОезсхЬрЫоп о£ АгЫ£Ьс1а1 Зечиепее: оЬЬдопиоЬеоЫйе <400> 40 ссаддсЬдад асдсадЬсас сдассдасда дсасдассас сассЬссасс дссдссЬсса 60

СаасЬсссдд дЪЬдддаадс ддЬСассдаа сдЪсдЬдсдс дЬаЬРададс ЬссСаддааа 120 аааа 124 <210> 41 <211> 42 <212> РВТ <213> АгС1£1сЬа1 Зечиепее <220>

<223> ЬезсхЬрСЬоп о£ АхЫ£1с1а1 Зедиепсе: реркШе <400> 41

Ьуз

СЬу

С1у

СЬу

СЬу

СЬу

Не

СЬи

СЬу

Рхо

ТЬх

Ьеи

Агд

СЬп

Тхр Ьеи

1

5

10

15

АЬа

АЬа

Ахд

АЬа

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

СЬу

С1у

СЬу

СЬу

Не

СЬи

СЬу Рго

20

25

30

ТЬх

Ьеи

Ахд

СЬп

Тгр

Ьеи

АЬа

АЬа

Агд

АЬа

40 <210> 42 <211> 22 <212> РИА <213> Аг±Ь£ЬсЬа1 Зечиепее <220>

<223> РезсхЬрСхоп о£ Ах±х£Ьсха1 Зедиепсе:

о11допис1еоЕ14е

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ <400> 42 аасаЕаадЕа ссЕдЕаддаЕ сд 22 <210> 43 <211> 52 <212> βΜΑ <213> АгЕ1£1с±а1 Зедиепсе <220>

   <223> Оезсг1рЕ1оп о£ АхЕ1£1с±а1 Зедиепсе: о11допис1еоЕ±с!е <400> 43

   ЕЕсдаЕасса ссассЕссас сЕЕЕасссдд адасадддад аддсЕсЕЕсЕ дс 52 <210> 44 <211> 861 <212> ΟΝΑ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

   <223> 0езсг1рЕ±оп οί АгЕ1£±с1а1 Зедиепсе: οΐί допис1 еоЕШе <400> 44

   ЕсЕадаЕЕЕд ЕЕЕЕаасЕаа ЕЕаааддадд ааЕаасаЕаЕ ддасаааасЕ сасасаЕдЕс 60 сассЕЕдЕсс адсЕссддаа сЕссЕддддд дассдЕсадЕ сЕЕссЕсЕЕс сссссаааас 120 ссааддасас ссЕсаЕдаЕс Есссддассс сЕдаддЕсас аЕдсдЕддЕд дЕддасдЕда 180 дссасдаада сссЕдаддЕс аадЕЕсаасЕ ддЕасдЕдда сддсдЕддад дЕдсаЕааЕд 240 ссаадасааа дссдсдддад дадсадЕаса асадсасдЕа ссдЕдЕддЕс адсдЕссСса 300 ссдЕссЕдса ссаддасЕдд сЕдааЕддса аддадЕасаа дЕдсааддЕс Ессаасааад 360 сссЕсссадс ссссаЕсдад аааассаЕсЕ ссааадссаа адддсадссс сдадаассас 420 аддЕдЕасас ссЕдссссса ЕсссдддаЕд адсЕдассаа даассаддЕс адссЕдассЕ 480 дссЕддЕсаа аддсЕЕсЕаЕ сссадсдаса ЕсдссдЕдда дЕдддададс ааЕдддсадс 540 сддадаасаа сЕасаадасс аедссЕсссд ЕдсЕддасЕс сдасддсЕсс ЕЕсЕЕссЕсЕ 600 асадсаадсЕ сассдЕддас аададсаддЕ ддсадсаддд даасдЕсЕЕс ЕсаЕдсЕссд 660 ЕдаЕдсаЕда ддсЕсЕдсас аассасЕаса сдсадаадад ссЕсЕсссЕд ЕсЕссдддЕа 720 ааддЕддадд ЕддЕддЕаЕс дааддЕссда сЕсЕдсдЕса дЕддсЕддсЕ дсЕсдЕдсЕд 780 дЕддЕддадд Еддсддсдда ддЕаЕЕдадд дсссаасссС ЕсдссааЕдд сЕЕдсадсас 840 дсдсаЕааЕс ЕсдаддаЕсс д 861 <210> 45 <211> 861 <212> ΒΝΑ <213> АхЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

   <223> ЦезсгхрЫоп о£ АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе: о11допис1еоЕ1с!е <400> 45 адаЕсЕааас ааааЕЕдаЕЕ ааЕЕЕссЕсс ЕЕаЕЕдЕаЕа ссЕдЕЕЕЕда дЕдЕдЕасад 60 дЕддаасадд ЕсдаддссЕЕ даддассссс сЕддсадЕса дааддадаад дддддЕЕЕЕд 120 ддЕЕссЕдЕд ддадЕасЕад адддссЕддд дасЕссадЕд Еасдсассас сассЕдсасЕ 180 сддЕдсЕЕсЕ дддасЕссад ЕЕсаадЕЕда ссаЕдсассЕ дссдсассЕс сасдЕаЕЕас 240 ддЕЕсЕдЕЕЕ сддсдсссЕс сЕсдЕсаЕдЕ ЕдЕсдЕдсаЕ ддсасассад ЕсдсаддадЕ 300 ддсаддасдЕ ддЕссЕдасс дасЕЕассдЕ ЕссЕсаЕдЕЕ сасдЕЕссад аддЕЕдЕЕЕс 360 дддадддЕсд ддддЕадсЕс ЕЕЕЕддЕада ддЕЕСсддЕЕ ЕсссдЕсддд дсЕсЕЕддЕд 420 ЕссасаЕдЕд ддасдддддЕ адддсесЕас ЕсдасЕддЕЕ сЕЕддЕссад ЕсддасЕдда 480 сддассадЕЕ ЕссдаадаЕа дддЕсдсЕдЕ адсддсассЕ сасссЕсЕсд ЕЕасссдЕсд 540 дссЕсЕЕдЕЕ ЕдЕсдЕЕсда асЕасдЕасЕ ЕЕссассЕес сассассЕсс сдсдЕаЕЕад даЕдЕЕсЕдд дЕддсассЕд ссдадасдЕд ассасеаЕад ассдссдссЕ адсЕссЕадд

   Едсддадддс ЕЕсЕсдЕсса ЕЕддЕдаЕдЕ сЕЕееаддсЕ ссаЕаасЕсс асдассЕдад дсЕдссдадд аадааддада 600 ссдЕсдЕссс сЕЕдсадаад адЕасдаддс 660 дсдЕсЕЕсЕс ддададддас ададдссеаЕ 720 дадасдсадЕ сассдассда сдадсасдас 780 сдддЕЕддда адсддЕЕасс даасдЕсдЕд 840 861 <210> 46 <211> 269 <212> РЙТ <213> АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе <220>

   <223> ϋββσχΙρΕίοη о£ АгЕ1£1с1а1 Зедиепсе: ρβρΕίάβ <400> 46

   МеЕ Азр Ьуз ТЬх Н1з ТЬх Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 1 5 10 15 б1у С1у Рго Зех 20 Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 25 Рго Ьуз Рхо Ьуз Азр 30 ТЬх Ьеи МеЕ Не Зег 35 Ахд ТЬх Рго С1и Уа1 40 ТЬг Суз ν<ι Уа1 Уа1 45 Азр Уа1 Зех Н1з С1и 50 Азр РХО С1и Уа1 Ьуз 55 РЬе Азп Тгр Туг Уа1 60 Азр 61у Уа1 С1и Уа1 65 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬх 70 Ьуз Рхо Агд С1и С1и 75 61п Туг Азп Зех ТЬх 80 Тух Ахд Уа1 Уа1 Зег 85 Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 90 Е±з 61п Азр Тхр Ьеи 95 Азп 61у Ьуз б1и Туг 100 Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег 105 Азп ьуз А1а Ьеи РГО но А1а Рхо Не 61и Ьуз 115 ТЬх 11е Зег Ьуз А1а 120 Ьуз С1у С1п Рго Ахд 125 С1и Рхо 61п Уа1 Туг 130 ТЬх Ьеи Рхо Рхо Зег 135 Агд Азр С1и Ьеи ТЬх 140 Ьуз Азп С1п Уа1 Зег 145 Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 150 Ьуз б1у РЬе Тух Рго 155 Зег Азр Не А1а Уа1 160 61и Тгр С1и Зег Азп 165 61у С1п Рго С1и Азп 170 Азп Тух Ьуз ТЬх ТЬх 175 Рго Рго Уа1 Ьеи Азр 180 Зег Азр С1у Зег РЬе 185 РЬе Ьеи Туг Зех ьуз 190 Ьеи ТЬх Уа1 Азр Ьуз 195 Зех Агд Тгр <31п С1п 200 С1у Азп Уа1 РЬе Зех 205 Суз Зех Уа1 МеЕ Н1з 210 61и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп 215 Н1з Туг ТЬх С1п Ьуз 220 Зех Ьеи Зег Ьеи Зех 225 Рхо <51у Ьуз <31 у С1у 230 61у 61у 61у 11е <31и 235 61у Рхо ТЬх Ьеи Ахд 240 61п Тгр Ьеи А1а А1а Ахд 245 А1а 61у б1у 61у 61у <51у 250 <51у (31у <51у Не 255

   С1и 61у Рхо ТЬг Ьеи Агд <51п Тгр Ьеи А1а А1а Агд А1а

   260 265

   1. Соединение, которое связывается с рецептором тр1, имеющее структуру ^ТМР1 (Ь1 ⁾и^-ТМР 2^, где ТМР₁ и ТМР₂, каждый независимо друг от друга, выбран из группы коровых соединений, имеющих структуру

   Х2 - Х₃ - Х4 - Х5 - Х6 - Х7 - Х8 - Х9 - Х10, причем

   Х₂ выбран из группы, включающей С1и, Акр, Ьук и Уа1;

   Х3 выбран из группы, включающей С1у и

   А1а;

   Х₄ представляет собой Рго;

   Х₅ выбран из группы, включающей ТЬг и 8ег;

   Х₆ выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а и РЬе;

   X- выбран из группы, включающей Агд и Ьук;

   Х8 выбран из группы, включающей С1и,

   Аки и С1и;

   Х₉ выбран из группы, включающей Тгр, Туг и РЬе;

   Х₁₀ выбран из группы, включающей Ьеи, 11е, Уа1, А1а, РЬе, Ме! и Ьук;

   Ь₁ представляет собой линкер, а и = 0 или

   1, а также его физиологически приемлемые соли.
2. 2. Соединение по п.1, причем ТМР1 и ТМР2 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей

   Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11; Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12; Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13;

   Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14; Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10;

   Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11; Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12; Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13;

   Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14;

   где Х2-Х10 описаны выше;

   X_I выбран из группы, включающей 11е, А1а, Уа1, Ьеи, 8ег и Агд;

   XII выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, Рйе, 8ег, Тйг, Ьук, Шк и С1и;

   Х₁₂ выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе, С1у, 8ег и С1и;

   Х₁₃ выбран из группы, включающей Агд, Ьук, Т11Г, Уа1, Аки, С1и и С1у, и

   Х14 выбран из группы, включающей А1а, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе, ТЬг, Агд, С1и и С1у.
3. 3. Соединение по п.1, в котором ТМР1 и/или ТМР₂ дериватизированы одним или более из указанных ниже способов:

   один или более пептидил |-ί.'(Ό)ΝΒ-|мостиков (связей) замещены непептидильным мостиком, таким как -СН₂-карбаматный мостик [-СН₂-ОС(О)ИК-]; фосфонатный мостик; СН₂сульфонамид [-СН₂-8(О)₂ИК-] мостик; мочевина [-ХНС(0)ХН-] мостик; -СН₂-вторичный амин мостик или алкилированный пептидил мостик [-С(0)ХК⁶, где К⁶- низший алкил];

   Ν-концевой участок представляет собой -ЫКК? группу; -ΝΡί.’(0)Ρ группу; -ΝΡί.’(0)0Ρ группу; -ΝΕ8(0₂)Ε группу; -ННС(0)ННК группу, где К и К¹ являются водородом или низшим алкилом с тем предположением, что К и К¹ не являются оба водородом; сукцинимидную группу; бензилоксикарбонил -NΗ-(СВΖ-NΗ-) группу или бензилоксикарбонил -ИН-группу, имеющую от 1 до 3 заместителей на фенильном кольце, выбранных из группы, включающей низший алкил, низший алкокси, хлор или бром;

   С-концевой участок представляет собой -С(0)К², где К² выбран из группы, включающей низший алкокси и -ΝΗ^⁴, где К³ и К⁴ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород или низший алкил.
4. 4. Соединение по п.1, в котором все аминокислоты имеют Ό-конфигурацию.
5. 5. Соединение по п.1, в котором по крайней мере одна из аминокислот имеет Όконфигурацию.
6. 6. Соединение по п.1, которое является циклическим.
7. 7. Соединение по п.1, в котором каждый из ТМР₁ и ТМР₂ представляет собой

   11е - 61и - 61у - Рго - ТЬг - Ьеи - Агд - Тгр - Ьеи А1а - А1а - Агд - А1а (8ЕС) ΙΌ Ν0: 1).
8. 8. Соединение по п.1, в котором Ь₁ представляет собой пептид.
9. 9. Соединение по п.8, в котором Ь₁ представляет собой Υ_η, где Υ является природной аминокислотой или ее стереоизомером, а η имеет интервал значений от 1 до 20.
10. 10. Соединение по п.8, в котором Ь₁ представляет собой (61у)_т где η имеет интервал значений от 1 до 20 и когда η больше 1, то до половины остатков С1у могут быть замещены другой аминокислотой, выбранной из оставшихся 19 природных аминокислот или их стереоизомеров.
11. 11. Соединение по п.8, в котором Ь₁ выбран из группы, включающей (61у)3Ьук(61у)4 (8ЕС) ГО Ν0:6), (61у)₃Акп 61у 8ег(61у)₂ (8ЕС) ГО Ν0:7); (61у)₃Сук(61у)₄ (8ЕС) ГО Ν0:8) и 61у Рго Акп 61у (8ЕС) ГО Ν0:9).
12. 12. Соединение по п.8, в котором Ь₁ содержит остаток цистеина (Сук).
13. 13. Соединение по п.1, в котором Ь₁ представляет собой (СН₂)_п, где η имеет интервал значений от 1 до 20.
14. 14. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей

    1ЕОРПЯ9ШААКА-ОРИО-1ЕОТТЕК.рХИААКА (8Е<2. Ш N0: 9)

    Еат.КОСЬААКА-аЮССбОТ-ВЕОР'ГЬК.рСЕААКА (сусИс) |_________________________________| (5ЕЦ. ГО N0:10)

    ШСРТЬКрСЕААКА-СССССССС-ЕСРТЬКОСЕААВА (Нпеаг) (5Е<?. ГОИО: 11)

    ШСРТГКЦАЬААКА-ССС<ЮС<Ю-ШаРТиЩА1.ААКА (5ЕЦ. ГО N0:12) ЕОРТЪКр1¥ЬААКА-ОС<ЗКа<КЮ-ШОТ1Л0иЪААКА (8Е<). ГОИО: 13)

    ЕОРТЪКрЖАА1и-СС<Ж(ВгАс)СОСО-1ЕОРТЕВ.р1¥ЕААКА (5Е<}. ГО N0: 14)

    ШСРТи<р1УЕАА1и-<КЗ<ЮОСС<^ЕОР1ЪК01УЕААКА (ΪΕς .ГО N0: 15)

    ШОРТЪКр\¥ЬААКА-О<ЮК(РЕа)СС<Ю-ЕСРТЕК0УЛ.ААКА (5ЕЦ. ГОИО: 16)

    1ЕОРТЬКр\>Л-ААКА-С<К1С(РЕО)О<ЭСа-ЕаРТЬК01УЕААКА (ЗЕЦ. ГОИО. 17)

    ЕСРТЫЮЗЛЛ-ААКА-бОХйЮЗОО-ШСРТЕКрСУЪААКА (8ЕЦ. ГО N0: 18)

    ШСРТЪКрУЛ.ААкА-ОСЖСОСЮ-ШаРТЕВДУ/ЕААКА

    I ШОРТ1.КЦ1И.А7и<А-ООССОаСО-1ЕОРТЕК.р\У1ААКА (5Е0. ГО N0: 19);

    ШОРТгКЦ\УЕАА1<А-О®ЗСС<ЭСО-1ЕаРТЕКр\УЕААКА (5ЕЦ. ГО N0: 20).
15. 15. Соединение по любому из п.1 или 2, имеющее формулу (Ес)т - (Ь2)я - ТМР1 - (Ь1)п - ТМР2 - (Ь3)_г - (Ес)р, причем Ь_ь Ь₂ и Ь₃ являются линкерными группами, каждая из которых независимо друг от друга выбраны из следующих линкерных групп:

    Υη, где Υ представляет собой природную аминокислоту или ее стереоизомер, а η имеет интервал значений от 1 до 20;

    (С1у)_п, где η имеет интервал значений от 1 до 20 и когда η больше 1, то до половины остатков С1у могут быть замещены другой аминокислотой, выбранной из оставшихся 19 природных аминокислот или их стереоизомеров;

    (61у)₃ Ьук (С1у)₄ (8ЕС) ГО Ν0:6);

    (61у)3 Акп 01у 8ег (01у)₂ (8ЕС) ГО Ν0:7);

    (61у)₃ Сук (01у)₄ (8ЕС) ГО Ν0:8);

    61у Рго Акп 61у (8ЕС) ГО Ν0:9);

    остатка цистеина (Сук) и (СН₂)_п, где п имеет интервал значений от 1 до 20;

    Ес представляет собой Ес-участок иммуноглобулина; т, р, ср и г независимо друг от друга выбраны из группы значений, представляющих собой 0 и 1, причем по крайней мере одно из значений т или р представляет собой 1 и далее, когда т = 0, то с.| = 0, а если р = 0, то г = 0;

    и его физиологически приемлемые соли.
16. 16. Соединение по п.15, в котором Ь₁, Ь₂ и Ь₃ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Υ_η, где Υ представляет собой природную аминокислоту или ее стереоизомер, а η имеет интервал значений от 1 до 20.
17. 17. Соединение по п.16, в котором Ь представляет собой (61у)_п, где η имеет интервал значений от 1 до 20 и когда η больше 1, то до поло вины остатков С1у может быть замещено другой аминокислотой, выбранной из оставшихся 19 природных аминокислот или их стереоизомеров.
18. 18. Соединение по п.17, в котором Ь_ь Ь₂ и Ь₃ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей (С1у)₃ Ьу8 (С1у)4 (8ЕС) ΙΌ N0:6);

    (С1у)₃ А8п С1у 8ег (С1у)₂ (8ЕО ΙΌ N0:7);

    (С1у)₃ Су8 (С1у)4 (8ЕС) ΙΌ N0:8) и С1у Рго А8п С1у (8ЕО ΙΌ N0:9);
19. 19. Соединение по п.15, в котором Ь_ь Ь₂ или Ь₃ представляют собой остаток цистеина.
20. 20. Соединение по п.15, в котором Ь₂ или Ь₃ представляют собой (СН₂)_п, где п имеет интервал значений от 1 до 20.
21. 21. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей

    Ес-ЕСТПКОГУЬААКА-ОРНб-ЕаРТЬКО^ЬААКА (8ЕЦ. ГО N0: 21)

    Ес-ЕаРТЪЙ.01УЬААКА-СРМО-1ЕСРТЕКр\У1ЛАКА-Ес (5Е<). ГО N0: 22) (8Ες>.Π>ΝΟ:23) РоСО-Е6Р'П.В.р\¥ЬААКА«ЗРМО-ЕаР'П.К0¹ЛТ.ААКА (5Е<). ГО N0: 24)

    Рс-Е<ЗРТЕКрЖЛАКА-С<Зв<ЗСС<ЗО-1ЕСЭ>Т1Кр\ИЛАКА (8Е<3. ГО ΝΟ: 25)

    Рс-ЕСРТЬКОСЬААКАЧККККХКХЗ-ЕСРТЕКОСЬААКА (сусВс)

    I__________________________________I (8Е0. ГО N0: 26)

    Рс-ЕОРТЕК0СЬААКА-О<ЗС<3<3<ЗСО-1ЕСРТЕК0СЕААкА (1шыг) (8Е<). Π5Ν0: 27)

    Рс-ЕОРТЪВДА1>АКА-ОСеСОСС<5-ЕСРТЕКрАЕААКА (5Е<). ГО ΝΟ: 28)

    Ρ(>ΕΟΡΤΙΛρναΛΑΚΑ-α<3<Κ6<Κ3α-ΙΕ(Η^,ΤΕΚρ\νΕΑΑΚΑ (5Е<). ГО N0:29) Рс-ЕОРТЪКОЖ^^^ВЛ-ОаОСОССО-ШОРТЕКО'АТ.ААКА (8Е<). ГО ΝΟ: 30)

    Рс-ЕОРПЗ<0«ЕААКА-О6ШО8СО-1ЕОРТ1Л0ЧЕААКА (8Е<). ГО ΝΟ: 31)

    Рс-ШОР1ЪКЧ\И.ААКА-ОСССОООО-ШаРТЕР01УЕААКА

    I

    Рс-ШСРП.КО'ЛЪААКАЧЗОССООСО-ШОРТЕКОМЛ.ААКА (8Е(). ГО N0: 32) Рс-СЮССС-ЕОРТЬК0\УЬААКА-а<3<КЮО<Ю-ШвР7ЪКр\УЕААКА (5Е0. ГО N0:33).
22. 22. Димер соединения по п.12.
23. 23. Димер по п.13, имеющий следующую структуру:

    ТМР1 - С1у3 - Су8 - С1у4 - ТМР2

    ТМР1 - С1у3 - Су8 - С1у4 - ТМР2.
24. 24. Димер соединения по п.19.
25. 25. Способ увеличения числа мегакариоцитов или тромбоцитов у больного, который в этом нуждается, включающий введение указанному больному эффективного количества соединения по п.1.
26. 26. Способ по п.25, согласно которому указанное количество составляет от 1 мкг/кг до 100 мг/кг.
27. 27. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.1 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
28. 28. Полинуклеотид, кодирующий соединение по п.8.
29. 29. Полинуклеотид, кодирующий соединение по п.16.
30. 30. Полинуклеотид, кодирующий соединение по п.22.
31. 31. Полинуклеотид, кодирующий соединение по п.24.
32. 32. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.28-31.
33. 33. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.32.
34. 34. Способ получения соединения по любому из пп.8, 16, 22 или 24, включающий выращивание клетки-хозяина по п.33 в подходящей питательной среде и выделение указанного соединения из указанной клетки или питательной среды.