KR101028626B1 - 혈소판신생 활성을 갖는 펩티드 및 관련 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 혈소판신생 활성을 갖는 신규한 펩티드 및 관련 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 포유동물의 혈소판 또는 혈소판 전구체(예를 들어, 거핵세포) 생성을 증가시키는데 사용할 수 있다.
혈소판신생 활성, 트롬보포이에틴, 거핵세포, 혈소판

Description

혈소판신생 활성을 갖는 펩티드 및 관련 화합물{PEPTIDES AND RELATED COMPOUNDS HAVING THROMBOPOIETIC ACTIVITY}
본 발명은 일반적으로 혈소판신생 활성을 갖는 펩티드 및 관련 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 포유동물의 혈소판 또는 혈소판 전구체(예를 들어, 거핵세포) 생성을 증가시키는데 사용할 수 있다.
본 발명은 혈소판 및 이의 전구체 세포, 예를 들어 거핵세포의 시험관내 및 생체내에서의 생성을 자극하는 성질을 갖는 화합물, 특히 펩티드에 관한 것이다. 혈소판신생 활성을 갖는 것으로 알려진 2 가지 단백질, 즉 트롬보포이에틴(TPO) 및 거핵세포 성장 및 발생 인자(MGDF)에 관한 배경기술은 다음과 같다.
거핵세포형성(거핵세포 생성) 및 혈소판신생(혈소판 생성)에 관한 이해는 내인성 트롬보포이에틴(TPO)의 클로닝을 통해 급속하게 발전하였다[Lok 등의 Nature 369:568-571(1994); Bartley 등의 Cell 77:1117-1124(1994); Kuter 등의 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:11104-11108(1994); de Sauvage 등의 Nature 369:533- 538(1994); Kato 등의 Journal of Biochemistry 119:229-236(1995); Chang 등의 Journal of Biological Chemistry 270:511-514(1995)].
간과 신장에서 주로 생성되는 60 내지 70 kDa의 글리코실화 단백질인 내인성 인체 TPO는 332 개의 아미노산으로 이루어져 있다[Bartley 등의 Cell 77:1117-1124(1994); Chang 등의 Journal of Biological Chemistry 270:511-514(1995)]. 이 단백질은 다른 종 간 보존성이 높고, 아미노 말단(아미노산 1 내지 172)(Bartley 등의 Cell 77:1117-1124(1994))에 있어서 인체 적혈구생성인자[Gurney 등의 Blood 85:981-988(1995)]와 23 %의 상동성을 갖고 있다. 내인성 TPO는 혈소판신생의 주요 생물학적 조절인자의 특징들을 모두 갖고 있는 것으로 밝혀져 있다. 내인성 TPO의 시험관내 작용으로는 정제된 마우스의 조혈 줄기 세포(Zeigler 등의 Blood 84:4045-4052(1994)) 및 인체 CD34+ 세포[Lok 등의 Nature 369:568-571(1994); Rasko 등의 Stem Cells 15:33-42(1997)]로부터의 거핵세포 콜로니의 특이적 유도, 배수성이 증가된 거핵세포의 생성[Broudy 등의 Blood 85:402-413(1995)] 및 말기 거핵세포 성숙 및 혈소판 생성의 유도[Zeigler 등의 Blood 84:4045-4052(1994); Choi 등의 Blood 85"402-413(1995)]. 이에 반해, TPO 수용체(c-mpl)에 대한 합성 안티센스 올리고데옥시누클레오티드는 거핵세포 선조들의 콜로니 형성능을 현저하게 억제한다[Methia 등의 Blood 82:1395-1401(1993)]. 더욱이, c-mpl 녹아웃 마우스는 거핵세포 결손성이며 심한 혈소판감소증을 나타낸다[Alexander 등의 Blood 87:2162-2170(1996)].
재조합 인체 MGDF(rHuMGDF, 미국 캘리포니아주 사우전드 오크스에 소재하는 암젠 인코포레이티드 제품)는 TPO와 관련있는 다른 혈소판신생성의 폴리펩티드이다. 이것은 인체 TPO의 아미노 말단 수용체-결합 도메인을 포함하는 절두형 단백질을 암호화하는 cDNA 함유 플라스미드로 형질전환된 E.coli에 의해 생산된다[Ulich 등의 Blood 86:971-976(1995)]. 이 폴리펩티드를 추출하여 재폴딩시킨 뒤 정제한 다음, 그 아미노 말단에 폴리[에틸렌 글리콜](PEG) 성분을 공유 결합시켜, 그 결과 얻어지는 분자를 본원에서는 PEG-rHuMGDF 또는 간단히 MGDF라고 명명하였다.
이러한 TPO와 MGDF가 골수 이식 및 화학치료나 방사선치료 시 종종 나타나는 증상인 혈소판감소증의 치료에 치료적 효능이 있음은 동물 모델을 이용한 다양한 연구에서 명백하게 증명되어 있다[Ulich, T.R. 등의 Blood 86:971-976(1995); Hokom, M.M. 등의 Blood 86:4486-4492(1995)]. 인체에 대한 예비시험의 데이터를 통해서도 다양한 환경에서 혈소판 수를 상승시키는 MGDF의 유용성이 확인되었다[Basser 등의 Lancet 348:1279-81(1996); Kato 등의 Journal of Biochemistry 119:229-236(1995); Ulich 등의 Blood 86:971-976(1995)]. MGDF는 혈소판 헌혈 과정에서 MGDF의 투여 시 혈행 중의 혈소판 수치를 건강한 혈 소판 제공자 본래 수치의 약 3배까지 증가시키기 때문에 혈소판 헌혈 과정을 향상시키는데 사용해도 좋다.
TPO와 MGDF는 주로 특정 조혈 세포, 예를 들어 거핵세포, 혈소판, CD34+ 세포 및 원발성 선조 세포에서 발현되는 c-mpl 수용체에 결합된 후 작용하게 된다[Debili, N. 등의 Blood 85:533-538(1994); Bartley, T.D., 등의 Cell 77:1117-1124(1994); Lok, S. 등의 Nature 369:565-8(1994)]. 인터루킨 및 단백질 호르몬의 대부분의 수용체들과 마찬가지로 c-mpl은 제I군 사이토킨 수용체 상과에 속하는 것이다[Vigon, I. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644(1992)]. 이 군에 속하는 수용체들의 활성화는 리간드 결합에 의해 유도된 수용체 동종이량체화를 수반하고, 결과적으로 일련의 신호 도입 과정을 촉발시킨다.
일반적으로, 단백질 리간드와 이의 수용체와의 상호작용은 종종 비교적 넓은 계면에서 일어난다. 하지만, 인체 성장 호르몬이 그 수용체에 결합된 예에서 확인되듯이, 계면에 있는 단지 몇 개의 주요 잔기들만이 대부분의 결합 에너지를 제공하고 있다[Clackson, T. 등의 Science 267:383-386(1995)]. 이러한 사실과 나머지 단백질 리간드의 대부분이 결합 에피토프들을 정확한 지형에 전시하는 역할만을 한다는 사실은 더 작은 활성 리간드를 개발할 수 있다는 가능성 을 제시하는 것이다. 따라서, 단지 "펩티드" 길이(예를 들어, 2 내지 80 개의 아미노산)의 분자를 큰 단백질 리간드의 수용체 단백질에 결합시킬 수 있다. 이러한 펩티드들은 큰 단백질 리간드의 생물활성을 모방하거나, 또는 경쟁적 결합을 통해 큰 단백질 리간드의 생물활성을 억제하여, 흔히 "펩티드 유사체" 또는 "유사 펩티드"라고 불리고 있다.
파지 디스플레이 펩티드 라이브러리는 이러한 펩티드 유사체를 확인할 수 있는 강력한 기법으로 판명되었다. 예를 들어, Scott, J.K. 등의 Science 249:386(1990); Devlin, J.J. 등의 Science 249:404(1990); 미국 특허 제5,223,409호(1993.6.29); 미국 특허 제5,733,731호(1998.3.31); 미국 특허 제5,498,530호(1996.3.12.); 미국 특허 제5,432,018호(1995.7.11); 미국 특허 제5,338,665호(1994.8.16); 미국 특허 제5,922,545호(1999.7.13); WO96/40987(1996.12.19); WO98/15833(1998.4.16공개)(각 문헌은 그 전체적으로 본 발명에 참고인용된 것임) 참조. 이와 같은 라이브러리에서, 무작위(random) 펩티드 서열은 사상 파지의 외피 단백질과의 융합에 의해 발현시킨다. 일반적으로, 발현된 펩티드는 수용체의 항체 고정성 세포외 도메인을 이용하여 친화성 용출시키고, 이 때 보유된 파지를 수득하여 친화성 정제와 재증식을 연속 반복함으로써 증균시킬 수 있다. 가장 우수한 결합 펩티드를 서열결정하여 1 이상의 구조적 관련이 있는 펩티드 과에 존재하는 주요 잔기를 동정한다[예를 들어, Cwirla 등의(1997), Science 276:1696-9]. 이 펩티드 서 열들을 통해 또한 알라닌 스캐닝이나 DNA 레벨에서의 돌연변이유발에 의해 안전하게 치환될 수 있는 잔기를 추정할 수도 있다. 돌연변이유발 라이브러리는 최고 결합인자의 서열을 더욱 더 최적화시키기 위한 목적으로 제작하여 스크리닝할 수 있다. Lowman(1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:401-24 참조하라.
단백질-단백질 상호작용의 구조 분석법도 큰 단백질 리간드의 결합 활성을 모방하는 펩티드를 추정하는데 사용할 수 있다. 이 분석법에서, 결정 구조는 펩티드 디자인에 사용할 수 있는, 큰 단백질 리간드의 결정적인 잔기들의 확인 및 상대적 배향을 추정할 수 있게 해준다. 예를 들어, Takasaki 등의 (1997), Nature Biotech, 15:1266-70 참조하라. 이러한 분석 방법은 또한 파지 디스플레이법(phage display)에 의해 선별된 펩티드들과 수용체 단백질 사이의 상호작용을 조사하는 데에도 사용할 수 있으며, 이는 결합 친화력을 증가시키기 위한 펩티드의 추가 변형을 가능케할 것이다.
펩티드 연구시 파지 디스플레이법과 경쟁적 관계에 있는 다른 방법들도 있다. 펩티드 라이브러리는 lac 억제인자의 카르복시 말단에 융합시킨 뒤 E.coli에서 발현시킬 수 있다. E.coli 를 이용하는 다른 방법에서는 펩티도글리칸에 결합된 지단백질(PAL)과 융합시킴으로써 세포 외막에서 발현이 나타나도록 한다. 이와 같은 방법과 이에 관련된 방법들은 이하에서는 모두 "E.coli 디스플레이"라고 총칭해서 사용하였다. 다른 방법으로서, 리보좀이 해리되기 전에 무작위 RNA의 해독을 중지시켜, 결합된 RNA가 그대로 붙어있는 폴리펩티드의 라이브러리를 얻는 방법이 있다. 이 방법과 이에 관련된 방법들을 이하에서는 총칭해서 "리보솜 디스플레이"라고 부른다. 다른 방법으로서, RNA에 결합된 펩티드를 이용하는 방법이 있다[예를 들어, PROfusion technology, Phylos, Inc. 예를 들어, Roberts & Szostak(1997), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94:12297-303를 참조하라]. 이하, 이러한 방법과 관련 방법을 총칭해서 "RNA-펩티드 스크리닝"이라 부른다. 펩티드들이 안정한 비생물학적 재료, 예를 들어 폴리에틸렌 막대 또는 용매투과성 수지 상에 고정되어 있는 화학적으로 유도된 펩티드 라이브러리가 개발되어 있다. 또 다른 화학적으로 유도된 펩티드 라이브러리는 유리 슬라이드 상에 고정된 펩티드들을 스캔하기 위하여 사진석판술을 이용한다. 이하, 이러한 방법과 관련 방법들은 총칭해서 "화학물질-펩티드 스크리닝"이라 부른다. 화학물질-펩티드 스크리닝은 D-아미노산과 다른 비천연 유사체들 뿐만 아니라 비펩티드 인자들의 사용을 허용한다는 점에서 유리하다. 생물학적 방법 및 화학적 방법 모두 문헌[Wells 및 Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol, 3:355-62]에서 논의되고 있다. 개념적으로 볼 때, 임의의 단백질의 펩티드 유사체는 파지 디스플레이, RNA-펩티드 스크리닝 및 전술한 기타 다른 방법들을 사용하여 수득하는 것이 가능하다.
파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 기법을 사용하여 c-mpl 수용체의 작동물질로서 작용하는 작은 펩티드 분자들이 개발된 바 있다[Cwirla, S.E. 등의 Science 276:1696-1699(1997)]. 이 연구에서, 사상 파지의 외피 단백질과의 융합체로서 발현된 무작위의 작은 펩티드 서열은 c-mpl의 항체 고정화된 세포외 도메인에 대하여 친화성 용출된 뒤, 2차 친화성 정제 단계를 통해 상기 펩티드 보유 파지를 증균시키고 있다. 이러한 결합 선별과 재증식 공정을 수회 반복하여 결합인자의 보다 농축된 푸울을 수득하였다. 결과적으로, 서열이 서로 관련없는 c-mpl-결합 펩티드의 두 부류가 최초로 동정되었다. 그 다음, 최상의 결합인자를 더욱 최적화하기 위하여 돌연변이유발 라이브러리를 제작하고, 최종적으로 IC50 = 2 nM이고 EC50 = 400 nM인 매우 활성적인 펩티드가 분리되었다[Cwirla, S.E. 등의 Science 276:1696-1699(1997)]. 이러한 14 잔기의 TPO 유사 펩티드는 겉보기에는 TPO 또는 MGDF와 전혀 서열 상동성이 없었다. 이 특정 TPO 유사 펩티드(TMP) 화합물의 구조는 다음과 같다:
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala(SEQ ID NO: 1) 또는 단문자 아미노산 약어를 사용하면 IEGPTLRQWLAARA.
종래, EPO 유사 펩티드에 대한 유사 연구에서도 상기와 동일한 기법을 사용하여 EPO 유사 펩티드(EMP)를 발견하였고[Wrighton, N.C. 등의 Science, 273:458-463(1996)], 이 펩티드는 EPO 수용체(EPOR)에 결합하는데 있어서 이량체로서 작용 하는 것으로 관찰되었다. 이와 같이 형성된 (리간드)2/(수용체)2 복합체는 X선 결정학 데이터에 따르면 C2 대칭이었다[Livnah, O. 등의 Science 273:464-471(1996)]. 이러한 구조 정보를 기초로 하여, 두 EMP 단량체의 C-말단이 유연성 스페이서를 통해 가교된 EMP의 공유결합 이량체가 고안되었고 이는 시험관내/생체내 생물활성 뿐만 아니라 결합성도 크게 향상시키는 것으로 확인되었다[Wrighton, N.C. 등의 Nature Biotechnology 15:1261-1265(1997)].
TPO 유사 펩티드(TMP)에도 상기와 유사한 C-말단 이량체 전략을 적용하였다[Cwirla, S.E. 등의 Science 276:1696-1699(1997)]. 특정 TPO 유사 펩티드의 C-말단 결합 이량체(C-C 결합)도 0.5nM의 개선된 결합 친화력과 세포 증식 분석에서 증가된 시험관내 활성(EC50=0.1nM)을 나타내는 것으로 확인되었다[Cwirla, S.E. 등의 Science 276:1696-1699(1997)].
치료적 용도에 대한 재조합 단백질의 유용성은 약제로서의 이러한 단백질의 성질을 향상 또는 개선시키기 위한 단백질 변형의 진보를 거두게 하였다. 이러한 변형을 통해, 단백질분해작용을 감소시키거나 제거하여 분해를 감소시키고 향상된 단백질 보호 효과를 얻을 수 있다. 또 다른 잇점으로는 특정 환경에서 치료 단백질의 안정성, 순환 시간 및 생물학적 활성의 증가를 포함한다. 단백질 변형에 관한 검토 문헌으로는 Francis, Focus on Growth Factors 3:4- 10(May 1992)(영국 런던 메디스크립트에 의해 공개)이 있다.
단백질 치료제의 유용한 변형으로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 덱스트란과 같은 중합체 결합을 포함한다. 이러한 변형에 대해서는 문헌[발명의 명칭이 "치료제로서의 변형 펩티드("Modified Pepetides as Therapeutic Agents")인 미국 특허출원 일련번호 09/428,082호, PCT 출원번호 WO 00/24782, 본원에 그 전체내용이 참고인용됨]에 기술되어 있다.
또 다른 이와 같은 변형은 면역글로불린 분자의 Fc 영역의 사용이다. 항체는 2 개의 기능적으로 독립된 부분, 즉 항원에 결합하는 "Fab"라고 하는 가변 도메인과 보체 또는 식세포와 같은 작용인자 기들과의 결합을 제공하는 "Fc"라고 하는 불변 도메인을 포함한다. 면역글로불린의 Fc 부분은 혈장 반감기가 긴 반면, Fab는 반감기가 짧다[Capon, 등의 Nature 337, 525-531(1989)].
치료성 단백질 산물은 긴 반감기를 제공하거나 면역글로불린의 Fc 단백질에 모두 존재하는 기능들, 예를 들어 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정화 및 태반 전이 등의 기능을 포함시키기 위하여 Fc 도메인을 사용하여 제작하였다[Capon 등의 Nature 337:525-531(1989)]. 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 영역은 호지킨스병 종양 세포, 퇴화성 림프종 세포, T-세포 백혈병 세포 및 다른 악성 세포 종류에서 발현되는 CD30 수용체에 결합하는 분자인 CD30-L에 융합시켰다. 미국 특허 제5,480,981호 참조. 염증 및 거부 억제제인 IL-10은 이 사이토킨의 짧은 혈행 반감기를 늘리기 위하여 마우스의 Fc 2a에 융합시켰다[Zheng, X. 등의 The Journal of Immunology, 154: 5590-5600(1995)]. 또한, 패혈증 쇼크가 있는 환자를 치료하기 위하여 인체 IgG1의 Fc 단백질과 종양 괴사인자 수용체를 결합시켜 평가한 연구가 이루어졌다[Fisher, C. 등의 N.Engl. J. Med., 334: 1697-1702(1996); Van Zee, K. 등의 The Journal of Immunology, 156:2221-2230(1996)]. Fc는 또한 AIDS 치료를 위한 치료 단백질을 제조하기 위하여 CD4 수용체와 융합되기도 하였다[Capon 등의 Nature, 337:525-531(1989)]. 또한, 인터루킨 2의 짧은 반감기와 인터루킨 2의 전신 독성을 극복하기 위하여 인터루킨 2를 IgG1 또는 IgG3의 Fc 부분에 융합시키기도 하였다[Harvill 등의 Immunotechnology, 1:95-105(1995)].
공개 PCT 출원번호 WO 00/24770은 특정 혈소판신생 화합물, 일반적으로 직렬(즉, N-말단 대 C-말단) 배향인 펩티드 및 그 N-말단에 담체 분자, 예를 들어 선형 중합체, 올리고사카라이드 또는 Fc 기가 결합된 직렬 펩티드 이량체를 개시하고 있다.
이와 같은 다양한 연구들에도 불구하고, 당해 기술분야에는 혈소판 생성(혈소판신생 활성) 및/또는 혈소판 전구체 세포, 특히 거핵세포 생성(거핵세포형성 활성)을 자극하는 우수한 생물학적 활성이 있는 화합물이 여전히 요구되고 있다. 또한, 혈소판신생 활성을 나타내며 긴 반감기와 같은 우수한 치료적 특성도 겸비한 화합물도 필요로 하고 있다. 이와 같은 화합물은 생성, 분리, 정제, 생물학적 활성, 안정성 및 순환 시간 등에 관한 특성들이 유리한 것이어야 한다. 이에, 본 발명은 이와 같은 활성(들)과 관련 양상를 가진 신규 화합물을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 c-mpl 수용체(이하, "mpl 수용체"라 부름)에 결합하는 치료적 화합물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 내인성 트롬보포이에틴 (TPO)의 활성을 매개하는 것과 동일한 수용체인 mpl 수용체를 통해, 즉 mpl 수용체의 활성화를 통해 경막 시그널에 결합하고(또는) 경막 시그널을 자극하는 성질이 향상된 일군의 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 우수한 혈소판신생 활성, 즉 혈소판 생성을 생체내 및 시험관내에서 자극하는 성질 및/또는 거핵세포형성 활성, 즉 혈소판 전구체의 생성을 생체내 및 시험관내에서 자극하는 성질을 갖고 있다. 또한, 본 발명의 특정 화합물은 우수한 치료적 성질, 예를 들어 개선된 혈장 반감기, 개선된 생물학적 활성 및 개선된 생체내 순환 시간을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ의 서열을 포함하며 mpl 수용체에 결합하는 화합물을 제공한다:
X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18
이 식에서, X1-X4, X9-X10 및 X13-18은 각각 독립적으로 본 명세서에 기재한 바와 같은 아미노산이며, 본 화합물은 서열 I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A 보다 우수한 생물활성 및/또는 mpl 수용체에 대한 결합 친화력을 나타낸다.
다른 양상에서, 본 발명은 하기 서열을 포함하며 mpl 수용체에 결합하는 화합물이다:
X1-X2-R-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-X13-W-R-R-X17-X18
이 식에서, X1, X2, X13, X17 및 X18은 각각 독립적으로 아미노산이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 30으로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열을 포함하며, mpl 수용체에 결합하는 화합물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 30으로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열로 이루어진 화합물의 이량체 또는 다량체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 mpl 수용체에 결합하는 하기 식을 갖는 물질의 조성물을 제공한다:
(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3)n--(TMP3) c--(LN4)o--(TMP4)d
이 식에서,
TMP1, TMP2, TMP3 및 TMP4는 각각 독립적으로 본 명세서에 개시된 TMP 중에서 선택한 것이고;
LN1, LN2, LN3 및 LN4는 각각 독립적으로 링커이고;
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10 사이의 정수이며;
l, m, n 및 o는 각각 독립적으로 0 내지 20 사이의 정수이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 mpl 수용체에 결합하는 하기 화학식 Ⅱ를 갖는 물질의 조성물을 제공한다:
(V1)v--(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3) n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d--(V2)w
이 식에서, V1 및 V2는 각각 독립적으로 매개체이고, v와 w는 각각 독립적으로 0 내지 1 사이의 정수이다.
본 발명의 화합물은 표준 합성법, 재조합 DNA 기법 또는 기타 다른 펩티드 및 융합 단백질을 제조하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 비펩티드 부분을 포함하는 본 발명의 화합물은 이용가능하다면 표준 펩티드 화학 반응 외에도 표준 유기 화학 반응으로 합성할 수 있다.
본 발명의 화합물은 이를 적당한 약학적 담체 물질과 배합한 뒤, 그 유효량을 환자, 예를 들어 치료나 예방을 필요로 하는 인체(또는 기타 다른 포유동물)에게 투여함으로써 치료적 또는 예방적 목적으로 사용할 수 있다. 매개체가 결합된 펩티드는 펩티드, 여기에선 트롬보포이에틴에 의해 유사체화된 천연 리간드와 비슷하거나 또는 상기 리간드 보다 우수한 활성을 가질 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 혈소판감소증 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 거핵세포 또는 혈소판을 증가시키는 방법 및 본 명세서에 기술된 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 또한 관련된 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 물질의 조성물을 암호화하는 폴리누클레오티드, 이 폴리누클레오티드를 함유하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다양한 양상과 장점은 다음의 상세한 설명과 참고적으로 도면을 통해 분명하게 알 수 있을 것이다:
도 1은 본 발명의 펩티드 및 펩티드-링커 화합물의 예시적 구조를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 펩티드-매개체 및 펩티드-링커-매개체 화합물의 예시적 구조를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에서 바람직한 매개체로서 사용할 수 있는 인체 IgG1 Fc의 핵산 서열(SEQ ID NO: 31)과 아미노산 서열(SEQ ID NO: 32)을 도시한 것이다.
도 4는 IgG1 항체에서 유래할 수 있는 본 발명의 예시적 Fc 단량체 및 이량체 화합물을 도시한 것이다. 이 도면에서 "Fc"는 본 명세서에서 나타낸 Fc 도메인의 의미 내에서 임의의 Fc 변형체를 의미하는 것이다. "펩티드"는 본 명세서에 개시한 바와 같은 임의의 펩티드, 링커-펩티드, 펩티드-펩티드 조합물 또는 이의 임의의 조합물을 의미한다. 구체적인 이량체는 다음과 같은 것이다:
도 4A 및 도 4D는 단일 이황화 결합된 이량체를 도시한 것이다. IgG1 항체는 일반적으로 이 항체의 힌지(hinge) 영역에 2 개의 이황화 결합을 갖고 있다. 도 1A 및 도 4D에서 나타낸 Fc 도메인은 상기 2 개의 이황화 결합 부위 사이를 절단하거나 또는 시스테인 잔기를 미반응성 잔기(예를 들어, 알라닌 잔기)로 치환시킴으로써 제조할 수 있다. Fc 도메인은 도 4A에서는 펩티드의 아미노 말단에 결합되어 있고, 도 4D에서는 펩티드의 카르복시 말단에 결합되어 있다.
도 4B 및 도 4E는 이중 이황화 결합된 이량체를 도시한 것이다. 이 Fc 도메인은 Fc 도메인 사슬내의 2 개의 시스테인 잔기가 유지되도록 모 항체를 절단하여 형성시키거나 또는 상기 Fc 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 구성물로부터 발현시켜 형성시킬 수 있다. Fc 도메인은 도 4B에서는 펩티드의 아미노 말단에 결합되고, 도 4E에서는 펩티드의 카르복시 말단에 결합되어 있다.
도 4C 및 도 4F는 비공유성 이량체를 도시한 것이다. 이 Fc 도메인은 절두 또는 치환에 의해 시스테인 잔기를 제거함으로써 수득할 수 있다. 시스테인 잔기는 숙주 세포에 존재하는 다른 단백질의 시스테인 잔기와 반응하여 형성되는 불순물을 피하기 위하여 시스테인 잔기를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 도메인의 비공유 결합은 이량체를 함께 유지시키기에 충분한 것이다. 다른 종류의 항체(예를 들어, IgG2, IgM) 유래의 Fc 도메인을 사용하여 다른 이량체를 제조할 수도 있다.
도 4G 및 도 4H는 펩티드의 N-말단(도 4G) 및 펩티드의 C-말단(도 4H)에 결합된 단일 사슬 Fc 도메인을 도시한 것이다.
도 5는 Fc 도메인에 결합된 약리학적 활성 펩티드의 직렬 반복체를 특징으로 하는 본 발명의 바람직한 화합물을 예시적 구조를 도시한 것이다. 도 5A는 직렬 펩티드 이량체가 결합된 단일 사슬(또는 Fc 단량체) 분자를 나타낸 것이며, 또한 이 분자의 DNA 구성물을 나타내는 것이기도 하다. 도 5B는 링커-펩티드 부분이 Fc 이량체의 한쪽 사슬에만 존재하는 Fc 이량체를 도시한 것이다. 도 5C는 양 사슬에 펩티드 부분(여기에서는 직렬 펩티드 이량체)을 가진 Fc 이량체를 도시한 것이다. 도 5C의 이량체는 도 5A에 도시한 단일 사슬을 암호화하는 DNA 구성물의 발현시 특정 숙주 세포에서 자발적으로 형성되는 것이다. 다른 숙주 세포에서는, 이량체 형성에 유리한 조건하에 세포를 두거나 시험관내에서 이량체를 형성시킬 수도 있다. 도 5D 내지 도 5I는 또 다른 예시적 단일 사슬(Fc 단량체) 및 이중 사슬(Fc 이량체)의 바람직한 실시형태를 나타낸 것이다.
도 6은 본 명세서에의 실시예 3에 제시한 바와 같은 TMP-Fc 융합 화합물을 구성하는데 사용하기 위한 바람직한 벡터(20003180)의 핵산 서열(SEQ ID NO: 33) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO: 34)을 도시한 것이다.
도 7은 실시예 3에 제시한 바와 같은 본 발명의 바람직한 펩티드를 제조하는데 사용한 올리고누클레오티드쌍 단편을 예시한 것이다. 각각 핵산 서열과 아미노산 서열을 제시하였다(SEQ ID NO: 35 내지 93).
도 8은 C-말단 Fc 융합 화합물(즉, 펩티드의 N-말단에 Fc의 C-말단이 결합된 펩티드)을 제조하는데 사용하기 위한 핵산 서열(SEQ ID NO: 94) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO: 95)을 도시한 것이다.
도 9는 선별된 파지 클론의 ELISA 투여량-반응을 도시한 것이다.
도 10, 도 11 및 도 12는 본 발명에 따라 선별된 화합물의 생물활성을 도시한 것이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 선별 화합물을 마우스에게 1회 주사한 후 나타나는 생체내 혈소판 수를 도시한 것이다.
I. 용어 정의
본 명세서에 사용된 용어들은 특정 경우에 다르게 한정되지 않는 한 다음과 같이 정의되는 것이다.
"펩티드"라는 용어는 약 2 내지 80 개의 아미노산 분자, 바람직하게는 3 내지 40 개의 아미노산 분자를 의미한다. 예시된 펩티드들은 예를 들어, 펩티드 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리)에서 운반되는 것, 화학 적 합성법으로 제조한 것, 단백질 절단으로부터 유래하는 것 등과 같은 본 명세서에 기술된 임의의 방법으로 무작위적으로 생성되는 것일 수 있다.
펩티드 서열과 관련하여 사용된 "무작위적"이라는 용어는 완전 무작위적 서열(예를 들어, 파지 디스플레이법 또는 RNA-펩티드 스크리닝에 의해 선별된 서열) 및 천연발생 분자의 1 또는 그 이상의 잔기가 천연 발생 분자의 해당 위치에 존재하지 않는 아미노산 잔기로 치환된 서열을 의미한다. 무작위적 펩티드 서열을 제조하여 확인하는 예시적 방법으로는 파지 디스플레이, E.coli 디스플레이, 리보솜 디스플레이, RNA-펩티드 스크리닝, 화학적 스크리닝 등이 있다.
펩티드에 사용된 "이량체"라는 용어는 2 개의 펩티드 사슬이 링커의 존재 유무에 관계없이 공유 또는 비공유적으로 결합된 분자를 의미한다. 펩티드가 C-말단 대 N-말단으로 결합된 펩티드 이량체는 또한 "직렬 반복체" 또는 "직렬 이량체"라고도 부르기도 한다. 펩티드가 C-말단 대 C-말단 또는 N-말단 대 N-말단으로 결합된 펩티드 이량체는 "병렬 반복체" 또는 "병렬 이량체"라고도 부르기도 한다.
펩티드에 사용된 경우에, "다량체"라는 용어는 3 개 또는 그 이상의 펩티드 사슬이 링커의 유무에 관계없이 공유적, 비공유적 또는 공유와 비공유 상호작용 모두에 의해 결합되어 있는 분자를 의미한다.
"유도체화" 및 "유도체" 또는 "유도체화된"이란 용어는 하기와 같은 화합물의 제조방법 및 결과적으로 생성된 화합물을 포함한다: (1) 화합물에 고리 부를 제공하는 방법; 예를 들어 화합물 내에 존재하는 시스테인 잔기들 간의 가교 결합시키는 방법; (2) 화합물을 가교시키거나 화합물에 가교결합 부위를 제공하는 방법; 예를 들어 화합물에 시스테인 잔기를 제공하여 배양물이나 생체내에서 가교결합된 이량체를 형성하게 하는 방법; (3) 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 비펩티드 결합으로 치환시키는 방법; (4) N-말단을 -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 숙신이미드 기, 또는 치환 또는 비치환 벤질옥시카르보닐-NH- (여기에서, R 및 R1 및 고리 치환체는 이하에 정의되는 바와 같다)으로 치환시키는 방법; (5) C-말단을 -C(O)R2 또는 -NR3R4(여기에서, R2, R3 및 R4는 이하에 정의되는 바와 같다)으로 치환시키는 방법; (6) 선택한 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 제제로 각 아미노산 기를 처리하여 변형시킨 방법. 유도체에 대해서는 이하에 보다 상세히 설명되어질 것이다.
"트롬보포이에틴 유사 펩티드", "TPO 유사 펩티드" 또는 "TMP"라는 용어는 mpl 수용체에 결합하고(또는) 혈소판신생 활성, 즉 혈소판이나 혈소판 전구체, 예를 들어 비제한적으로 거핵세포의 생성을 생체내 또는 시험관내에서 자극하는 능력이 있는 펩티드를 의미한다.
"mpl-결합 도메인"이란 용어는 mpl 수용체에 결합하고 천연발생의 서열이나 무작위 서열을 포함하는 모든 아미노산 서열을 의미한다. mpl-결합 도메인의 예들은 파지 디스플레이 또는 본 명세서에 기술된 기타 다른 방법에 의해 확인되거나 유도될 수 있는 것이다.
"mpl 수용체 작동물질"란 용어는 mpl 수용체에 결합하고 천연 mpl 수용체 리간드인 내인성 트롬보포이에틴(eTPO)와 마찬가지로 1 이상의 분석 파라미터들을 증가 또는 감소시키는 분자를 의미한다.
"포함하는"이란 용어는 화합물이 소정 서열의 N-말단이나 C-말단 중 어느 한 말단이나 또는 양 말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있음을 의미한다. 물론, 이러한 추가 아미노산은 화합물의 활성을 거의 방해하지 않아야 한다.
또한, 본 발명의 화합물의 생리학적으로 용인가능한 염도 본 발명에 포함된다. "생리학적으로 용인가능한 염"이란 용어는 약학적으로 용인가능한 것으로 공지되거나 나중에 밝혀질 모든 염을 의미한다. 몇가지 구체적 예로는 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 염산염, 브롬화수소염과 같은 할로겐화수소염; 황산염; 구연산염; 주석산염; 글리콜산염; 및 옥살산염이 있다.

"매개체"란 용어는 치료 단백질의 분해를 방지하고/방지하거나 반감기를 증가시키며 독성을 감소시키고 면역원성을 감소시키고/감소시키거나 생물학적 활성을 증가시키는 분자를 의미한다. 매개체의 예로는 Fc 도메인(바람직한 것) 뿐만 아니라 선형 중합체[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리라이신, 덱스트란 등]; 분지쇄 중합체(예를 들어 미국 특허 제4,289,872호, Denkenwalter 등의 문헌, 1981년 9월 15일에 공고; 제5,229,490호, Tam의 문헌, 1993년 7월 20일에 공고; WO93/21259, Frechet 등의 문헌, 1993년 10월 28일); 지질; 콜레스테롤 기(예를 들어, 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고사카라이드(예를 들어, 덱스트란); 샐비지 수용체에 결합하는 모든 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드; 인체 혈청 알부민(HSA)을 비롯한 알부민, 로이신 지퍼 도메인 및 기타 이러한 단백질 및 단백질 단편이 있다.
"천연 Fc"라는 용어는 단량체 또는 다량체 형태에 상관없이 전 항체의 분해로부터 수득되는 비항원결합 단편 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 의미한다. 천연 Fc의 면역글로불린 원료는 바람직하게는 인체 기원인 것으로서, 모든 면역글로불린일 수 있으나, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 천연 Fc는 단량체 폴리펩티드로 구성된 것으로서, 공유(즉, 이황화결합) 및 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 결합될 수 있다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이에 존재하는 분자간 이황화 결합의 수는 1 내지 4 개 범위이며, 클래스(예를 들어, IgG, IgA, IgE) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2)에 따라 다르다. 천연 Fc의 일 예는 IgG의 파파인 절단 시 산출되는 이황화 결합된 이량체이다(Ellison 등의 (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). 본 명세서에 사용된 "천연 Fc"라는 용어는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭적 명칭이다.
"Fc 변이체"라는 용어는 천연 Fc에서 변형된 것이지만 샐비지 수용체의 결합 부위인 FcRn은 포함하고 있는 분자 또는 서열을 의미한다. Fc 변이체의 예와, 샐비지 수용체와의 상호작용에 대해서는 본원에 그 전체내용이 참고인용되는 국제 출원 WO 97/34631(1997년 9월 25일자로 공개) 및 WO 96/32478에 기술되어 있다. 즉, "Fc 변이체"라는 용어는 비인체의 천연 Fc로부터 인체화된 분자 또는 서열을 포함한다. 또한, 천연 Fc는 본 발명의 융합 분자에는 불필요한 구조 특징이나 생물학적 활성을 제공하여 제거할 수 있는 부위를 포함한다. 따라서, "Fc 변이체"라는 용어는 (1) 이황화 결합 형성, (2) 선택한 숙주 세포와의 부적합성, (3) 선택한 숙주 세포에서 발현시 N-말단의 이종원성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지 수용체가 아닌 다른 Fc 수용체에 대한 결합성, 또는 (7) 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 등의 특성에 영향을 미치거나 상기 특성들에 관여하는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결실된 분자 또는 서열을 포함한다.

"Fc 도메인"이란 용어는 전술한 바와 같은 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자를 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc와 마찬가지로, "Fc 도메인"이란 용어는 전 항체로부터 절단된 것인지 또는 다른 수단에 의해 생성된 것인지의 여부에 관계없이 단량체 또는 다량체 형태인 분자를 포함한다.
Fc 도메인이나 또는 Fc 도메인을 함유하는 분자에 사용된 "이량체"라는 용어는 2 개의 폴리펩티드 사슬이 공유 또는 비공유결합된 분자를 의미한다.
Fc 도메인이나 또는 Fc 도메인을 함유하는 분자에 사용된 "다량체"라는 용어는 2 개 이상의 폴리펩티드 사슬이 공유 상호작용, 비공유 상호작용 또는 공유와 비공유 상호작용 모두에 의해 결합된 분자를 의미한다. IgG 분자는 일반적으로 이량체를 형성하고, IgM은 오량체, IgD는 이량체, IgA는 단량체, 이량체, 삼량체, 또는 사량체를 형성한다. 다량체는 Fc의 천연 Ig 원료의 서열과 그 서열 유래의 활성을 이용하거나 또는 상기와 같은 천연 Fc를 유도체화(본 명세서에 기술된 바와 같이)하여 제조할 수 있다.
"펩티바디(peptibody)" 및 "펩티바디류(peptibodies)"란 용어는 항체 Fc 도메인이 적어도 하나의 펩티드에 부착되어 있는 분자를 의미한다. 이와 같은 펩티바디들은 다량체 또는 이량체 또는 이의 단편들이고, 유도체화될 수도 있다.
II. 화합물의 구조
개요. 본 발명은 mpl 수용체에 결합할 수 있고/있거나 mpl 수용체의 생물활성 활성을 조정할 수 있는 화합물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 내인성 트롬보포이에틴(TPO)의 활성을 매개하는 수용체와 같은 수용체인 mpl 수용체를 통해(즉, 활성화) 경막 시그널에 결합할 수 있고/있거나 경막 시그널을 자극할 수 있는 일 군의 화합물을 제공한다. 즉, 본 발명의 화합물은 혈소판신생 활성, 즉 생체내 및 시험관내에서 혈소판 생성을 자극하는 능력 및/또는 거핵세포형성 활성, 즉 생체내 및 시험관내에서 거핵세포를 포함하는 혈소판 전구체의 생성을 자극하는 능력을 갖는 것이다.
간략히 설명하면, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 I로 표시된 서열을 갖는 하나 또는 그 이상의 펩티드를 포함한다:
화학식 I
X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18
이 식에서, X1-X4, X9-X10 및 X13-X18은 각각 독립적으로 아미노산이다.
본 발명에 따라 제조된 물질의 다른 조성물에서, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 I의 서열이 이량체 또는 다량체로서 서로 부착되거나 또는 다른 방식으로 결합된 하나 또는 그 이상의 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 물질의 다른 조성물에서, 본 발명의 화합물은 펩티드의 N-말단이나 C-말단에서 매개체에 부착되거나 또는 다른 방식으로 결합된 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 모두 직렬(즉, 연속적으로 N 대 C) 또는 병렬(즉, N- 대 N-말단이나 C- 대 C-말단끼리)로 링커 유무에 관계없이 결합될 수 있다.
펩티드. 본 발명의 화합물은 TPO 유사 펩티드 단독물 또는 다른 TMP와의 조합물을, 예를 들어 이량체 또는 다량체로서 포함한다. 본 발명의 TMP는 다음과 같은 서열을 포함한다:
화학식 I
X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18
이 식에서, X1-X4, X9-X10 및 X13-X18은 각각 독립적으로 아미노산이다. 상기 서열의 바람직한 아미노산 잔기는 하기 표 1에 보다 상세히 설명한다.
Figure 112004014255353-pct00001
본 발명의 보다 바람직한 TMP 서열은 다음과 같은 서열을 가진 것이다:
화학식 I
X1-X2-X3-X4-G-P-T-L-X9-X10-W-L-X13-X14-X15-X16-X17-X18
이 식에서, X1-X4, X9-X10, 및 X13-X18은 각각 독립적으로 아미노산이고, 이 펩티드는 mpl 수용체에 대한 결합 친화력이 있고/있거나 하기 서열의 생물활성과 동일하거나 보다 큰 생물활성을 나타낸다:
I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A(SEQ ID NO:1)
결합 친화력은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되거나 이용가능한 모든 분석법, 예를 들어 비제한적으로 비아코어 측정법, ELISA 분석법, 경쟁 분석법 등으 로 측정할 수 있다.
생물활성은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되거나 이용가능한 모든 분석법으로 생체내에서 또는 시험관내에서 측정할 수 있다. 그 예로는, 비제한적으로 세포를 기본으로 한 분석법(WO95/26747호에 보다 상세히 기술된 인체 mpl 수용체로 형질감염시킨 마우스 32D 세포의 IL-3 의존적 클론), CD34+ 분석법, CD61 세포 분석법 등이 있다. 생물활성은 또한 다양한 생체내 동물 분석법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 TMP 서열은 하기 표 2에 제시하였다.
Figure 112004014255353-pct00002
펩티드 TMP2 내지 TMP30에 대한 결합 친화력 및 생물활성 데이터는 실시예에서 보다 상세히 설명된다. 펩티드를 선별한 파지 환경과 더욱 유사하게 하고 바람직한 18 개의 아미노산 펩티드의 하전성 아미노산 말단 및 카르복시 말단 단부를 보호하기 위하여 각 펩티드의 각 단부에 2 개의 아미노산 "캡(cap)"을 첨가 하였다. 구체적으로, TMP2 내지 TMP30의 각 아미노 말단에는 글루타민(Q)과 시스테인(C)을 첨가하였다. 이와 마찬가지로, TMP2 내지 TMP30의 각 펩티드의 카르복시 말단에는 히스티딘(H)과 세린(S)과 같은 2 개의 아미노산 "캡"을 첨가하였다. 당업자라면, 이러한 캡이 단지 하전성 단부를 보호하는 것이지, 바람직한 펩티드의 결합 친화력 및/또는 생물활성에 기여하거나 또는 그 성질을 저하시키기 위한 것이 아님을 잘 알고 있을 것이다.
펩티드 친화력은 펩티드 길이와 함께 증가하는 것으로 알려져 있는 바, 기준 생물활성 펩티드(SEQ ID NO: 1)를 시험 펩티드, 즉 TMP2 내지 TMP30와 동일한 길이로 14 개의 아미노산에서 22 개의 아미노산으로 증가시켰다. (실시예 6 내지 11 참조). 당업자라면, 비교 펩티드의 생물활성 영역이 SEQ ID NO: 1로 표시하고 TMP1이라고도 한, 14 개의 코어 아미노산 서열임을 잘 알 수 있을 것이다.
시스테인 잔기를 함유하는 모든 펩티드는 다른 Cys 함유 펩티드와 가교결합될 수 있으며, 이 펩티드 중 어느 하나 또는 두 펩티드 모두에 매개체가 결합될 수 있다. 또한, 하나 이상의 Cys 잔기를 가진 모든 펩티드는 펩티드내 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이러한 모든 펩티드들은 하기 기술되는 바와 같이 유도체화될 수 있다.
본 명세서에 개시된 TMP 아미노산 서열의 보존적 및/또는 비보존적 변형으로부터 다른 유용한 펩티드 서열을 얻을 수 있다. 보존적 변형은 변형이 만들어지는 펩티드의 기능적 특징 및 화학적 특징과 유사한 기능적, 화학적 특징을 가진 펩티드를 생산한다. 이에 반해, 펩티드의 기능적 및/또는 화학적 특징의 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에 분자 주쇄의 구조, 예를 들어 시이트 또는 나선 형태, (b) 표적 부위에 있는 분자의 하전 또는 소수성, 또는 (c) 분자의 크기 등을 유지하는데 있어서 효과가 크게 다른 아미노산 서열로 치환시킴으로써 달성할 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기를 이 위치의 아미노산 잔기의 극성이나 하전에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않는 합성 잔기로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 중의 모든 천연 잔기를 종래 "알라닌 스캐닝 돌연변유발"(예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 대해 논의하고 있는 문헌[MacLennan 등의 1998, Acta Physiol.Scand.Suppl. 643:55-67; Sasaki 등의 1998, Adv. Biophys. 35:1-24] 참조)에 대해서 설명된 바와 같이 알라닌으로 치환시킬 수도 있다.
요구되는 아미노산 치환(보존적 치환 또는 비보존적 치환에 관계없이)은 치환이 필요한 경우에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 펩티드 서열의 중요한 잔기를 확인하거나, 또는 본 명세서에 기술된 펩티드 또는 매개체-펩티드 분자(이전 화학식 참조)의 친화력을 증가 또는 감소시키기 위한 목적에 사용할 수 있다. 아미노산 치환의 예는 표 3에 제시하였다.
Figure 112004014255353-pct00003
특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 포함되는 비천연발생의 아미노산 잔기를 포함한다.
천연 발생의 잔기는 서열의 변형에 유용할 수 있는 일반적인 곁사슬의 성질에 따라 클래스로 분류할 수 있다. 예를 들어, 비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스의 구성원과 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같은 치환 잔기는 비인체 오르토로그(ortholog, 서로 다른 종에 존재하는 동일 기능의 유전자)와 상동성인 펩티드 영역에 도입되거나 분자의 비상동성 영역에 도입되기도 한다. 또한, 사슬의 배향에 영향을 미치기 위한 목적으로 P 또는 G를 사용하여 변형을 일으키기도 한다.
이와 같은 변형을 제조하는데 있어서, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)를 사용할 수 있다. 각 아미노산은 소수성과 하전 특성에 따라 수치 지수가 지정되어 있으며, 각 지수는 다음과 같다: 이소로이신(+4.5); 발린(+4.2); 로이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토산(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 아미노산 수치 지수의 중요성은 당업계에 잘 알려져 있다[Kyte 등의 J.Mol.Biol., 157:105-131(1982)]. 특정 아미노산은 수치 지수 또는 스코어가 유사한 다른 아미노산으로 치환되어도 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 수치 지수에 따라 변화를 형성시킬 때, 수치 지수 범위가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 수치 지수 범위가 ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, 수치 지수 범위가 ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 보다 더 특히 바람직하다.
또한, 친수성에 근거하여 효과적으로 이루어질 수 있는 유사 아미노산의 치환도 당업계에 잘 알려져 있다. 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되듯이, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 단백질의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 성질과 상호관련이 있다.
아미노산 잔기의 친수성 수치는 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 로이신(-1.8); 이소로이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 근거하여 변화시킬 때, 친수성 값이 ±2 범위이내인 아미노산의 치환 이 바람직하고, ±1 범위이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 범위이내인 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다. 또한, 친수성에 근거하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수도 있다. 이 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"이라고도 불린다.
당업자라면 공지의 기법을 사용하여 적합한 변형체를 결정할 수 있을 것이다. 활성 파괴 없이 변화시킬 수 있는 적합한 분자 영역을 확인하기 위해 당업자는 활성에 중요하지 않은 것으로 추정되는 영역을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 동일 종이나 다른 종 유래의 유사 활성을 가진 유사 폴리펩티드가 공지된 경우에는 당업자는 한 펩티드의 아미노산 서열을 유사 펩티드들과 비교할 수 있을 것이다. 이러한 비교를 통해, 유사 폴리펩티드들 중에서 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 이러한 유사 펩티드에 상대적으로 보존되지 않는 펩티드 부분에 있어서의 변화는 펩티드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 악영향을 미칠 가능성이 적을 것으로 사료된다. 또한, 당업자라면, 비교적 보존적인 영역에서도 천연발생의 잔기 대신 화학적으로 유사한 아미노산으로 활성을 유지하면서 치환시킬 수 있음을 알고 있을 것이다(보존적 아미노산 잔기 치환). 따라서, 생물학적 활성이나 구조 측면에서 중요할 수 있는 영역이라도 펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고 또는 생물학적 활성을 파괴함이 없이 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
아미노산은 L 또는 D의 입체화학을 가지고 있다(L이나 D가 없는 Gly은 제외). 따라서 본 발명의 TMP는 입체화학의 조합을 포함할 수 있다. 하지만, L 입체화학이 TMP 사슬 내 모든 아미노산에 바람직하다. 또한, 본 발명은 아미노산의 아미노 말단 내지 카르복시 말단 서열이 역전된 역 TMP 분자도 제공한다. 예를 들어, 정상 서열이 X1-X2-X3인 분자의 역 분자는 X3-X2-X1이다. 또한, 본 발명은 역 TMP와 같이 아미노산의 아미노 말단 내지 카르복시 말단 서열이 역전되고 TMP에서 보통 "L" 에난티오머인 잔기가 "D" 입체이성질체 형태로 변화된 레트로-역(retro-reverse) TMP 분자도 제공한다.
따라서, TMP의 "유도체"가 전술한 TMP들 대신에 치환될 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 이러한 TMP 유도체는 다음과 같은 변형 중 하나 이상이 이루어진 잔기를 포함한다:
· 하나 이상의 펩티드 결합[-C(O)NR-]이 비펩티드 결합, 예를 들어 -CH2-카르바메이트 결합[-CH2-OC(O)-NR-]; 포스포네이트 결합; -CH2-설폰아미드[-CH2 -S(O)2NR-] 결합; 우레아[-NHC(O)NH-] 결합; -CH2-2차 아민 결합; 또는 알킬화된 펩티드 결합[-C(O)NR6- (여기에서 R6은 저급 알킬임)]으로 치환된 것;
· N-말단이 -NRR1 기; -NRC(O)R 기; -NRS(O)2R 기; -NHC(O)NHR 기 (여기에서 R 및 R1은 수소 또는 저급 알킬이고, 단 R 및 R1이 둘 다 수소는 아니다); 숙신이미드 기; 벤질옥시카르보닐-NH- (CBZ-NH-) 기; 또는 페닐 고리 상에 저급 알킬, 저급 알콕시, 클로로 및 브로모 중에서 선택되는 1 내지 3 개의 치환체를 가진 벤질옥시카르보닐-NH- 기로 유도체화된 펩티드; 및
· 유리 C 말단이 -C(O)R2 (여기에서 R2는 저급 알콕시 및 -NR3R4 로 구성된 군 중에서 선택되고, 상기 R3 및 R4는 독립적으로 수소 및 저급 알킬로 구성된 군 중에서 선택된다)로 유도체화된 펩티드. "저급"이란 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 기를 의미한다.
또한, 각 아미노산의 변형은 펩티드의 표적 아미노산 잔기를, 선택한 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 TMP 분자에 도입시킬 수 있다. 그 예로는 다음과 같은 것이 있다:
리신 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 무수물이나 다른 카르복실산 무수물과 반응시킬 수 있다. 이 제제로의 유도체화는 리신 잔기의 하전에 악영향을 미친다. 알파-아미노 함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 다른 시약으로 는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 트란스아미나제 촉매화된 반응을 포함한다.
아르기닌 잔기는 통상적인 하나 또는 여러 개의 시약과 반응시켜 변형시킬 수 있다. 이 시약 중에는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌하이드린이 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 값 때문에 알칼리 조건에서 반응을 실시해야만 한다. 또한, 상기 시약들은 아르기닌의 구아니디노 기 뿐만 아니라 리신 기와도 반응할 수 있다.
티로실 잔기 자체의 특이적 변형에 대해서는 연구가 광범위하게 이루어졌고, 특히 방향족 디아조늄 화합물이나 테트라니트로메탄과 반응시킴으로써 티로실 잔기에 분광학적 라벨을 도입시키는 변형에 관심이 높았다. 가장 일반적으로, O-아세틸 타이로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성시키기 위하여, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 각각 사용할 수 있다.
카르복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드(R'-N=C=N-R'), 예를 들어 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 반응시킴으로써 선택적으로 변형시 킬 수 있다. 또한, 암모늄 이온과 반응시킴으로써 아스파틸 잔기와 글루타밀 잔기를 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 변환시킬 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 탈아미드화하여 해당 글루밀 및 아스파틸 잔기로 변환된다. 또는, 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기들은 중간 산성 조건하에서 탈아미드화할 수도 있다. 이 잔기들의 어떤 형태든지 본 발명의 범위에 속하는 것이다.
이작용성 제제로의 유도체화는 펩티드 또는 이의 작용적 유도체를 불수용성 지지체 매트릭스 또는 다른 거대분자 담체에 가교결합시키는데 유용하다. 일반적으로 사용되는 가교결합제로는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 단독이작용성 이미도에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광 존재하에 가교결합을 형성할 수 있는 광활성가능한 중간체를 산출한다. 또는, 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기술된 반응성 기질 및 시아노겐 브로마이드 활성화 탄수화물과 같은 반응성 불수용성 매트릭스를 단백질 고정화에 이용할 수 있다.
다른 가능한 변형으로는 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기에 있는 히드록실 기의 인산화, Cys에 있는 황 원자의 산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬에 있는 알파-아미노기의 메틸화[Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 일부 경우에 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
이와 같이 유도체화된 잔기는 본 발명의 화합물의 하나 이상의 특징, 예를 들어 혈소판신생 활성, 용해성, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 향상시키는 것이 바람직하다. 또는, 유도체화된 잔기는 유도체화되지 않은 화합물과 동일한 특징 및/또는 성질 또는 거의 동일한 특징 및/또는 성질을 가진 화합물을 산출하는 것일 수도 있다. 또는, 이와 같은 잔기는 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 제거하거나 약화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 DNA 수준에서 변화될 수도 있다. 본 화합물의 임의의 부분에 대한 DNA 서열은 선택한 숙주 세포와 보다 상용성이 우수한 코돈으로 변화시킬 수 있다. 바람직한 숙주 세포인 E.coli의 최적화된 코돈은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 코돈은 제한 부위를 제거하거나 잠재적 제한 부위를 도입시켜 선택한 숙주 세포에서 DNA 프로세싱을 보조할 수 있도록 치환시킬 수 있다. 매개체, 링커 및 펩티드 DNA 서열은 전술한 서열의 모 든 변화를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기술한 모든 변형, 치환, 유도체화 등은 펩티드, 펩티드 이량체 및 다량체, 링커 및 매개체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 모든 양상에 동등하게 적용된다.
또한, 당업자라면 유사 펩티드들 중에서 활성이나 구조에 중요한 잔기를 동정하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있을 것이다. 이와 같은 비교를 통해, 유사 펩티드들에서 활성이나 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 펩티드 중의 아미노산 잔기들의 중요성을 예측할 수 있을 것이다. 당업자라면 이와 같이 예측한 펩티드의 중요한 아미노산 잔기 대신에 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있을 것이다.
또한, 당업자는 유사 폴리펩티드들에서 3차원 구조 및 이 구조와 관련된 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이러한 정보를 통해, 당업자는 그 3차원 구조와 관련된 펩티드의 아미노산 잔기들의 정렬을 예측할 수 있을 것이다. 또한, 당업자라면 단백질 표면에 있을 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 급격한 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있는데, 그 이유는 상기와 같은 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 또한, 당업자는 각각 바람직한 아미노산 잔기에 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 제조할 수 있을 것이다. 이러한 변이체들은 그 다음 당업자에게 공지된 활성 분석을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 이와 같은 데이터는 적합한 변이체에 대한 정보를 수집하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴적 활성, 바람직하지 않은 정도의 감소된 활성 또는 부적합한 활성을 산출하는 것을 발견했다면 그와 같은 변화를 가진 변이체는 피해야 할 것이다. 즉, 이와 같은 통상적인 실험으로부터 수집한 정보에 근거하여 당업자는 추가 치환만 피해야 하거나 다른 돌연변이와 함께 추가 치환을 피해야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
2차 구조를 예측한 다수의 과학 간행물이 있다. Moult J., Curr. Op. in Biotech, 7(4): 422-427(1996), Chou 등의 Biochemistry, 13(2): 222-245(1974); Chou 등의 Biochemistry, 113(2): 211-222(1974); Chou 등의 Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148(1978); Chou 등의 Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou 등의 Biophys. J., 26:367-384(1979). 또한, 2차 구조 예측에 도움이 되는 컴퓨터 프로그램도 현재 이용가능하다. 2차 구조를 예측하는 한가지 방법은 상동체 모델링에 근거한 방법이다. 예를 들어, 2 개의 폴리펩티드 또는 단백질이 그 서열 상동성이 30 % 이상이거나 유사성이 40 % 이상인 경우 종종 유사한 구조적 위상을 갖게 된다. 최근 단백질 구조 데이터 베이스(PDB)의 성장으로, 2차 구조는 물론 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내에 있는 접힘(fold)의 잠재적 숫자를 예측할 수 있는 가능성이 증가되었다[Holm 등의 Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247(1999)]. 소정 폴리펩티드 또는 단백질에는 일정한 수의 접힘이 있고, 상당수의 구조가 분석되면, 극적으 로 정확하게 구조 예측이 얻어지게 될 것이다.
2차 구조를 예측하는 또 다른 방법으로는 "스레딩(threading)"[Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87(1997); Sippl 등의 Structure, 4(1): 15-9(1996)], "프로필 분석"[Bowie 등의 Science, 253:164-170(1991); Gribskov 등의 Meth. Enzym., 183:146-159(1990); Gribskov 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-8(1987)] 및 "진화론적 결합"[Home, 상기 문헌설명 참조, Brenner, 상기 문헌설명 참조]이 있다.
본 발명의 바람직한 펩티드 및 펩티드-링커 분자의 화학식은 도 1에 도시하였다. 또한, TMP의 생리학적으로 용인가능한 염도 포함된다.
펩티드 화합물
신규 펩티드 외에도, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 펩티드를 서로 부착 또는 결합시키거나 링커(LN) 및/또는 매개체(V)에 부착 또는 결합시킨 신규 펩티드 화합물을 제공한다. TMP는 직렬(즉, 연속적으로, N-말단 대 C-말단)로 결합시키거나 병렬(즉, N-말단 대 N-말단 또는 C-말단 대 C-말단)로 결합시킬 수 있다. TMP는 링커의 유무에 관계없이 다른 TMP에 부착시키거나 동일한 TMP에 부착시킬 수 있다. 또한, TMP는 링커 및 매개체의 유무에 관계없이 다른 TMP에 부착시키거나 동일한 TMP에 부착시킬 수 있다. 본 발명의 펩티 드-링커-매개체 화합물은 다음과 같은 화학식 Ⅱ로 표시할 수 있다:
화학식 Ⅱ
(V1)v--(LN1)l--(TMP1)a--(LN2)m--(TMP2)b--(LN3) n--(TMP3)c--(LN4)o--(TMP4)d-
-(V2)w
이 식에서,
V1 및 V2는 매개체이고;
LN1, LN2, LN3 및 LN4는 각각 독립적으로 링커이고;
TMP1, TMP2, TMP3 및 TMP4는 각각 독립적으로 화학식 I의 펩티드 서열이고;
a, b, c 및 d와 l, m, n 및 o는 각각 독립적으로 0 내지 20 사이의 정수이며;
v와 w는 각각 독립적으로 0 내지 1 사이의 정수이다.
본 발명은 다음 식을 갖는 본 발명의 전형적인 화합물 및 이의 다량체를 제공한다:
Figure 112004014255353-pct00004

이 식에서,
V1은 매개체(바람직하게는 Fc 도메인)이고, 링커 유무에 관계없이 TMP의 C-말단에 부착되는 것이다;
Figure 112004014255353-pct00005

이 식에서,
V1은 매개체(바람직하게는 Fc 도메인)이고, 링커 유무에 관계없이 TMP의 N-말단에 부착되는 것이다.
본 발명의 바람직한 펩티드-매개체 및 펩티드-링커-매개체 분자의 식은 도 2에 제시하였다.
본 발명의 바람직한 화합물은 대부분 2 개의 TMP 성분을 포함하거나 다수의 TMP 성분을 포함하고 있다는 점에서 이량체 또는 다량체이다. TMP1 내지 TMP4 등의 각각은 동일하거나 상이한 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 2 내지 5 개의 TMP 성분을 가진 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 2 내지 3 개, 가장 바람직하게는 2 개의 성분을 가진 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물은 서로 직접 부착되거나 또는 링커 기를 통해 결합된 이량체인 것이 좋다(하기 참조). 단량체 TMP 잔기들은 좌측에서 우측을 의미하는 N-말단에서 C-말단의 통상적인 배향으로 제시되어 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 TMP1의 C-말단이 TMP2의 N-말단에 직접 부착되거나 링 커를 통해 부착되도록 배향될 수 있음을 알 수 있다(직렬 이량체). 또는, 본 발명의 화합물은 TMP1의 C-말단이 TMP2의 C-말단에 직접 부착되거나 또는 링커를 통해 부착되거나, 또는 TMP1의 N-말단이 TMP2의 N-말단에 직접 부착되거나 또는 링커를 통해 부착되도록 배향될 수도 있다(병렬 이량체). 이와 같은 화합물들은 TMP1 및 TMP2가 구조적으로 상이하지만 이량체라고 불린다. 즉, 동종이량체 및 이종이량체가 예상된다.
링커
다른 실시형태에서, 본 발명은 다른 TMP 펩티드에 "링커" 기(LN1, LN2 등)를 통해서 공유결합되거나 또는 다른 방식으로 결합 또는 부착된 1 이상의 TMP를 제공한다. 모든 링커 기는 선택적인 것이다. 링커기가 존재하는 경우, 링커기는 주로 스페이서로서 작용하는 것이기 때문에 그 화학적 구조는 중요하지 않다. 링커는 최종 화합물의 생물학적 활성을 방해하지 않고 또한 면역원성이 크게 증가되지 않도록 선택되어야 한다. 링커는 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 결합된 1 내지 30 개의 아미노산으로 구성되고, 각 아미노산은 20 개의 천연발생의 아미노산 중에서 선택되었다. 이러한 아미노산 중 일부는 당업자에게는 자명하듯이 글리코실화될 수도 있다. 보다 바람직한 실시형태에서, 1 내지 20 개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신 중에서 선택되었다. 보다 더 바람직하게 는, 링커는 입체적으로 방해되지 않는 글리신 및 알라닌과 같은 아미노산으로 대부분 구성되었다. 따라서, 바람직한 링커는 폴리글리신[특히, (Gly)4, (Gly)5], 폴리(Gly-Ala) 및 폴리알라닌이다. 링커의 다른 구체적 예는 다음과 같은 것이다:
(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 96);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 97);
(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 98); 및
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 99).
상기 용어를 설명해보면, 예를 들어 (Gly)3Lys(Gly)4은 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly을 의미한다. Gly 및 Ala의 배합 역시 바람직하다. 여기에 제시된 링커는 예시적인 것이며, 본 발명의 범위에 속하는 링커는 훨씬 더 긴 것일 수 있고 다른 잔기를 포함할 수도 있다.
비펩티드 링커 역시 가능하다. 예를 들어, 알킬 링커, 예를 들어 -NH-(CH2)s-C(O)- (여기에서, s = 2 내지 20)도 사용할 수 있다. 이러한 알킬 링커는 어떠한 입체적 장애도 일으키지 않는 기, 예를 들어 저급 알킬(예를 들어, C1 내지 C6), 저급 아실, 할로겐(예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등으로 추 가 치환될 수 있다. 비펩티드 링커의 예는 다음과 같은 PEG 링커이다:
Figure 112004014255353-pct00006

여기에서, n은 링커의 분자량이 100 내지 5000 kD, 바람직하게는 100 내지 500 kD이 되도록 하는 것이다. 펩티드 링커는 전술한 바와 동일한 방식으로 유도체 형태로 변형될 수 있다.
일반적으로, 길이가 약 0 내지 14 개의 서브유닛(예를 들어, 아미노산)인 링커가 본 발명의 혈소판신생 화합물에 바람직한 것으로 발견되었다. 이 펩티드 링커는 TMP에 대해 전술한 것과 동일한 방식으로 유도체 형태로 변형될 수 있다. 또한, 본 실시형태의 화합물은 선형이거나 고리형일 수 있다. "고리형"이란 분자의 적어도 2 개의 분리된, 즉 비인접 부분이 서로 결합되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 분자 단부의 아미노 말단과 카르복시 말단이 공유 결합하여 고리형 분자를 형성할 수 있다. 또는, 분자는 2 개 또는 그 이상의 Cys 잔기(예를 들어, 링커 내에)를 포함하여 이황화 결합 형성을 통해 고리화될 수 있다. 또한, 하나 또는 그 이상의 직렬 펩티드 이량체가 결합하여 이량체의 이량체를 형성할 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 따라서, 예를 들어 Cys 잔기를 함유하는 직렬 이량체는 이러한 다른 이량체의 Cys와 분 자간 이황화 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 펩티드-링커 화합물의 예로는 다음과 같다:
CSSGGPTLREWLQCRRMQ--GGGGG--CSSGGPTLREWLQCRRMQ (SEQ ID NO: 100);
QLGHGPTLRQWLSWYRGM--(Gly)3Lys(Gly)4--ALRDGPTLKQWLEYRRQA(SEQ ID NO:101);
RFAEGPTLREWLEQRKLV-GGG(PEG)GGG- RFAEGPTLREWLEQRKLV (SEQ ID NO: 102);
따라서, 바람직한 실시형태에서 링커는 (LN1)n을 포함하며, 여기에서 LN1은 천연발생의 아미노산이거나 이의 입체이성질체이고 "n"은 1 내지 20 중 어느 하나인 것이다. 바람직한 펩티드-링커 분자의 식은 도 1에 도시하였다. 또 다른 바람직한 펩티드-링커 분자로는 다음과 같다:
i) TMP1-LN1-TMP2-LN2
ii) LN1-TMP1-LN2-TMP2
iii) LN1-TMP1-LN2-TMP1
iv) TMP1-LN1-TMP1-LN1-TMP1-LN1
v) LN1-TMP1-LN2-TMP2-LN3-TMP3-LN4-TMP4
여기에서, LN1 내지 LN4는 각각 독립적인 링커이다.

매개체
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 화합물은 매개체(V)에 결합되거나 부착될 수 있다. 매개체는 일반적으로 치료 단백질의 분해를 방지하고/방지하거나 반감기를 증가시키거나, 독성을 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나 생물학적 활성을 증가시키는 분자를 의미한다. 매개체(V)는 N-말단, C-말단, 펩티드 주쇄 또는 곁사슬을 통해 펩티드에 부착할 수 있다.
매개체(V)는 담체 분자, 예를 들어, 선형 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리리신, 덱스트란 등), 분지쇄 중합체(예를 들어, 미국 특허 제4,289,872호, Denkenwalter 등의 1981. 9. 15 공고; 제5,229,490호, Tam, 1993. 7. 20 공고; WO 93/21259, Frechet 등의 1993. 10. 28 공개); 지질; 콜레스테롤 기(스테로이드); 또는 탄수화물 또는 올리고사카라이드 등일 수 있다. 가능한 다른 담체로는 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체 부착물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이 있다(미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 및 제4,179,337호에 기술되어 있음). 당해 기술분야에 공지된 또 다른 유용한 중합체로는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스 또는 다른 탄수화물계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올, 및 이들 중합체의 혼합물이 있다. 또한, 매개체의 예로는 다음과 같은 것이 있으며 반감기 연장 및/또는 단백질분해성 분해 또는 제거에 대한 차단성을 제공하는 것으로 당해 기술분야에 공지된 기타 다른 분자도 포함한다:
·Fc 도메인;
·샐비지 수용체에 결합할 수 있는 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드;
·인체 혈청 알부민(HSA);
·로이신 지퍼(LZ) 도메인;
·폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어 5kD, 20kD 및 30kD PEG, 및 기타 다른
중합체;
·덱스트란.
담체의 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 있다. PEG 기는 편리한 모든 분자량의 PEG일 수 있고, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. PEG의 평균분자량은 바람직하게는 약 2 kDa 내지 약 100 kDa, 보다 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 가장 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위인 것이다.
PEG 기는 일반적으로 아실화, 환원성 알킬화, 마이클 첨가반응, 티올 알킬화반응 또는 PEG 기 상의 반응성 기(예를 들어, 알데하이드, 아미노, 에스테르, 티올, -할로아세틸, 말레이미도 또는 하이드라지노 기)와 표적 화합물 상의 반응성 기(예를 들어, 알데하이드, 아미노, 에스테르, 티올, -할로아세틸, 말레이미도 또 는 히드라지노 기)와의 반응을 통한 다른 화학선택적 접합/결합 방법에 의해 본 발명의 화합물에 부착될 것이다.
탄수화물(올리고사카라이드) 기는 단백질 내 글리코실화 부위로 알려진 부위에 용이하게 부착될 수 있다. 일반적으로, O-결합된 올리고사카라이드는 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-결합된 올리고사카라이드는 아스파라긴(Asn) 잔기가 서열 Asn-X-Ser/Thr(여기에서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산일 수 있다)의 일부일 때 이 아스파라긴 잔기에 부착된다. X는 바람직하게는 프롤린을 제외한 19가지 천연발생의 아미노산 중 하나인 것이 바람직하다. N-결합 및 O-결합된 올리고사카라이드 및 각각의 종류에서 발견되는 당 잔기의 구조는 상이하다. 상기 두 올리고사카라이드에서 일반적으로 발견되는 당의 한가지 유형은 N-아세틸뉴라민산(시알산이라고도 불림)이다. 시알산은 일반적으로 말단 잔기가 N-결합된 올리고사카라이드 및 O-결합된 올리고사카라이드로서, 자신의 음의 하전으로 인해 글리코실화 화합물에 산성 성질을 부여할 수 있다. 이와 같은 부위는 본 발명의 화합물 중 링커에 함유될 수 있어, 폴리펩티드 화합물의 재조합체 생산동안 세포(예를 들어, CHO, BHK, COS와 같은 포유동물 세포)에 의해 글리코실화되는 것이 바람직하다. 하지만, 이와 같은 부위는 당해 기술분야에 공지된 합성 또는 반합성 절차에 의해 글리코실화될 수 있다.
보다 바람직한 실시형태에서, 매개체(V)는 하나 또는 그 이상의 항체 Fc 도메인을 함유할 수 있다. 따라서, 전술한 펩티드 화합물은 하나 또는 그 이상의 Fc 도메인에 직접 또는 링커를 통해 융합될 수 있다. Fc 매개체는 인체 면역글로불린 IgG-1 중쇄[Ellison, J.W. 등의 Nucleic Acids Res. 10:4071-4079(1982)] 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 다른 Fc 서열(예를 들어, 기타 다른 IgG 클래스, 예를 들어 비제한적으로 IgG-2, IgG-3 및 IgG-4, 또는 다른 면역글로불린) 중에서 선택할 수 있다.
항체의 Fc 영역은 이황화 결합 또는 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 결합될 수 있는 단량체 폴리펩티드 세그먼트로 구성된 것으로 알려져 있다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 이황화 결합의 수는 관련 항체의 클래스(예를 들어, IgG, IgA, IgE) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 내지 4 개 범위이다. 본 명세서에 사용된 "Fc"란 용어는 Fc 분자의 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다. 특이적으로, Fc 단량체는 이황화 결합 형성을 통한 이량체화를 방해하는 특정 조건이 아니라면 적당한 Cys 잔기가 존재하면 자발적으로 이량체화한다. 정상적으로 Fc 이량체에서 이황화 결합을 형성하는 Cys 잔기가 제거되거나 다른 잔기로 치환된 경우에도 단량체 사슬은 비공유적 상호작용을 통해 이량체화하는 것이 일반적이다. 본 명세서에 사용된 "Fc"라는 용어는 다음과 같은 임의의 형태를 의미하는 것이다: 천연 단량체, 천연 이량체(이황화 결합 연결), 변형 이량체(이황화 결합 및/또는 비공유 결합), 및 변형된 단량체(즉, 유도체).
Fc 부분의 변이체, 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 다양한 잔기 또는 서열의 치환을 통해 제조할 수 있다.
변이체(또는 유사체) 폴리펩티드는 하나의 Fc 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 보충하는 삽입 변이체를 포함한다. 삽입은 단백질의 어느 한 말단이나 양 말단에 위치하거나 Fc 아미노산 서열의 내부 영역에 위치할 수 있다. 어느 한 말단이나 양 말단에 추가 잔기를 가진 삽입 변이체는 예를 들어 아미노산 표식 또는 표지를 포함하는 단백질 및 융합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 분자는 경우에 따라 N-말단 Met을 함유할 수 있는데, 구체적으로 E.coli와 같은 박테리아 세포에서 분자가 재조합 발현되는 경우이다.
Fc 결실 변이체에서는 하나 이상의 아미노산 잔기가 Fc 폴리펩티드에서 제거된다. 이와 같은 결실은 Fc 폴리펩티드의 한쪽 말단이나 양 말단에서 일어날 수 있고 또는 Fc 아미노산 서열내의 하나 이상의 잔기가 제거될 수도 있다. 따라서, 결실 변이체는 Fc 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.

Fc 치환 변이체에서는 Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 다른 잔기로 치환된다. 한 양상에서, 이러한 치환은 본질적으로 보존적 치환이지만, 본 발명은 비보존적 치환도 포함한다.
예를 들어, 시스테인 잔기는 Fc 서열의 일부 또는 모든 이황화 가교의 형성을 방지하기 위하여 다른 아미노산으로 치환되거나 결실될 수 있다. 이 시스테인 잔기들은 각각 제거하거나 또는 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 다른 아미노산, 예를 들어 Ala 또는 Ser으로 치환시킬 수 있다. 다른 예로서, (1) Fc 수용체 결합 부위를 제거하고/제거하거나; (2) 보체(C1q) 결합 부위를 제거하고/제거하거나; (3) 항체 의존적 세포 매개의 세포독성(ADCC) 부위를 제거하는 아미노산 치환을 도입하기 위한 목적의 변형을 실시할 수 있다. 이와 같은 부위들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이와 같은 공지된 모든 치환들은 본 명세서에 사용된 바와 같은 Fc의 범위에 속하는 것이다. 예를 들어, IgG1의 ADCC 부위에 관해서는 문헌[Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639(1992)]을 참조할 수 있다.
이와 마찬가지로, 하나 이상의 티로신 잔기는 또한 페닐알라닌 잔기로 치환시킬 수 있다. 또한, 다른 변이체 아미노산 치환, 결실(예를 들어, 1 내지 25 개의 아미노산) 및/또는 치환도 고려될 수 있고, 이 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 또한, 변이체는 변형 아미노산, 예를 들어 펩티드유사체 또는 D-아미노산 형태일 수 있다.
본 발명의 Fc 서열은 또한 유도체화, 즉 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 다른 변형을 보유할 수 있다. 변형은 자연적으로 공유 결합성인 것이 바람직하며, 그 예로는 중합체, 지질, 다른 유기 잔기 및 무기 잔기와의 화학 결합을 포함한다. 본 발명의 유도체는 혈행중의 반감기를 증가시키기 위한 목적으로 제조되거나 또는 폴리펩티드가 목적 세포, 조직 또는 기관을 지향할 수 있도록 하는 표적능을 개선시키기 위한 목적으로 형성될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 Fc 부분으로서, 천연 Fc 분자의 샐비지 수용체 결합 도메인을 사용할 수도 있는데, 그 예에 대해서는 예를 들어 WO 96/32478["Altered Polypeptides with Increased Half-Life"]에 기술되어 있다. 본 명세서에서 Fc로 표시한 분자의 클래스에 속하는 다른 구성원들은 WO 97/34631["Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives"]에 기술되어 있다. 상기한 공개 PCT 출원들은 모두 본원에 참고인용된 것이다.
Fc 융합체는 TMP1 또는 TMP2의 N-말단이나 C-말단에 위치하거나 TMP1 또는 TMP2의 N-말단과 C-말단 모두에 위치할 수 있다. 이와 마찬가지로, Fc 융 합체는 Fc 도메인의 N-말단이나 C-말단에 위치할 수 있다.
본 발명의 바람직한 화합물로는 본 명세서에 개시된 TMP의 이량체 또는 다량체에 결합시키거나 다르게 부착시킨 IgG1 Fc 융합 이량체를 포함한다. 이러한 이량체에서, 각 Fc 도메인은 TMP 펩티드의 이량체 또는 다량체에 링커의 존재 또는 부재하에 결합될 것이다. 이와 같은 화합물의 개략적 예는 도 2에 도시하였다.
다수의 매개체가 사용될 수도 있는데, 예를 들어 각 말단에 Fc가 사용되거나 한쪽 말단에는 Fc, 다른쪽 말단이나 곁사슬에는 PEG기가 사용될 수 있다.
펩티드-매개체 화합물의 예는 하기 표 4에 제시하였다.
Figure 112010020606616-pct00047
또한, 본 발명의 바람직한 실시형태는 표 5에 기재하였다.
Figure 112010020606616-pct00048
III. 제조방법
본 발명의 화합물은 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 화합물의 대부분은 펩티드이거나 펩티드를 포함하기 때문에 펩티드를 합성하는 방법이 특히 관련이 있다. 따라서, 고체상 합성법을 사용할 수 있다. 적당한 기법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그 예로는 다음과 같은 문헌에 기술되어 있다: Merrifield, in Chem. Polypeptides, pp. 335-61(Katsoyannis 및 Panayotis eds. 1973); Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149(1963); Davis 등의 Biochem. Intl. 10:394-414(1985); Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); 미국 특허 제3,941,763호; Finn 등의 The Proteins, 3rd ed., vol.2, pp. 105-253(1976); 및 Erickson 등의 The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 257-527(1976). 고체상 합성법은 작은 펩티드를 제조하는 방법 중에서 비용면에서 가장 효율적인 방법이기 때문에 각 펩티드를 제조하는 바람직한 기법이다.
또한, 펩티드는 재조합 DNA 기법을 사용하여 형질전환된 숙주 세포를 통해 제조할 수도 있다. 이를 위해, 펩티드를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 제조한다. 이와 같은 DNA 및/또는 RNA 분자를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩티드를 암호화하는 서열을 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절단해낼 수 있다. 관련 서열을, 후속 클로닝에 유용한 제한 부위를 포함시켜 폴리머라제 연쇄반응(PCR)으로 구성할 수 있다. 또는, DNA/RNA 분자를 포스포아미다이트 방법과 같은 화학적 합성 기법을 사용하여 합성할 수도 있다. 또한, 상기 기법이나 다른 기법을 조합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 적당한 숙주에서 펩티드를 암호화하는 벡터를 포함한다. 이 벡터는 적당한 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 이러한 작동가능한 결합을, 펩티드 암호화 DNA 분자를 벡터에 삽입하기 전이나 삽입한 후에 실시하는 방법은 공지되어 있다. 발현 조절 서열로는 프로모터, 활성인자, 인핸서, 작동인자, 리보솜 결합 부위, 개시 시그널, 종결 시그널, 캡 시그널, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 또는 해독 조절과 관련된 다른 시그널이 있다.
그 결과 얻어지는 펩티드-암호화 DNA 분자를 함유하는 벡터는 적당한 숙주를 형질전환시키는데 사용한다. 이러한 형질전환은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다.
공지된 다수의 이용가능한 숙주 세포 모두가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 당해 기술분야에 알려진 다수의 요인에 따라 이루어진다. 이러한 요인으로는 예를 들어 선택한 발현 벡터와의 상용성, DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드의 숙주 세포에 대한 독성, 형질전환율, 펩티드 회수 용이성, 발현 특성, 생체안정성 및 비용 등이 있다. 하지만, 이러한 요인들의 밸런스를 맞추어도 모든 숙주가 특정 DNA 서열의 발현에 균등한 효과를 나타낼 수는 없다.
이러한 일반적 지침하에서, 유용한 미생물 숙주로는 박테리아(예를 들어, E.coli), 효모(예를 들어 사카로마이세스 종 및 피키아 파스토리스) 및 기타 다른 진균, 곤충, 식물, 포유동물(인체 포함) 세포 배양물 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 다른 숙주가 있다. 형질전환된 숙주는 목적 펩티드가 발현되도록 통상적인 발효 조건하에서 배양한다. 이와 같은 발효 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그 다음, 발효 배양물 또는 발현되는 숙주 세포로부터 펩티드를 정제한다. 정제 방법 역시 당해 기술분야에 공지되어 있다.
유도체화된 펩티드를 함유하거나 비펩티드 기를 함유하는 화합물은 공지의 유기 화학 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 고상 합성 기법을 사용할 수 있다. 적합한 기법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp.335-61(Katsoyannis 및 Panayotis eds.); Merrifield (1963), J.Am.Chem.Soc. 85: 2149; Davis 등의 (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart 및 Young(1969), Solid Phase Peptide Synthesis; 미국 특허 제3,941,763호; Finn 등의(1976), The Proteins (3rd ed.) 2:105-253; 및 Erickson 등의 (1976), The Proteins (3rd ed.) 2:257-527]에 기술된 것을 포함한다. 고체상 합성법은 작은 펩티드를 제조하는 방법 중 비용면에서 가장 효율적인 방법이기 때문에 각 펩티드를 제조하는 바람직한 기법이다.
IV. 화합물의 용도
본 발명의 화합물은 mpl 수용체에 결합하고/결합하거나 mpl 수용체를 활성화하는 능력을 갖고/갖거나 혈소판("혈소판신생 활성") 및 혈소판 전구체("거핵세포형성 활성") 생성(생체내 및 시험관내 모두)을 자극하는 능력을 갖는다. 이 화합물들의 활성을 측정하기 위한 목적으로, 표준 검정, 예를 들어 WO 95/26746 ("Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation")에 기술된 방법 등을 사용할 수 있다. 생체내 검정은 본 명세서의 실시예 부분에 상세히 기술하고 있다.
본 발명의 방법 및 조성물로 치료하고자 하는 상태는 개괄적으로 기존 거핵세포/혈소판 결핍증 또는 미래에 예상되는 거핵세포/혈소판 결핍증(예를 들어 예정된 수술이나 혈소판 기증 등으로 인해)을 포함하는 것이다. 이와 같은 상태는 활성 mpl 리간드의 생체내 결핍(일시적 또는 지속적)의 결과일 수 있다. 혈소판 결핍증의 일반적 명칭은 혈소판감소증이고, 따라서 본 발명의 방법 및 조성물은 혈소판감소증의 치료를 요하는 환자의 혈소판감소증을 예방적 또는 치료적으로 치료하는에 유용하다.
세계보건기구는 개체내 혈행 혈소판의 수에 따라 혈소판감소증의 정도를 분류하였다[Miller 등의 Cancer 47:210-211(1981)]. 예를 들어, 혈소판감소증의 징후가 없는 개체(등급 0)는 일반적으로 100,000 개/㎣ 이상의 혈소판을 갖고 있다. 가벼운 혈소판감소증(등급 1)의 혈행에 존재하는 혈소판 수준은 79,000 내지 99,000 개/㎣ 정도이다. 보통 혈소판감소증(등급 2)은 50,000 내지 74,000 개 혈소판/㎣을 나타내고, 심한 혈소판감소증은 25,000 내지 49,000 개/㎣의 혈소판을 나타낸다. 생명을 위협하거나 쇠약하게 하는 혈소판감소증은 혈소판의 혈행 농도가 25,000 개/㎣ 이하인 것을 특징으로 한다.
혈소판감소증(혈소판 결핍증)은 다양한 원인이 있을 수 있는데, 예를 들어 화학치료법 및 다른 다양한 약물, 방사선 치료, 수술과 조합된 다른 치료법, 사고에 의한 혈액 유실, 및 다른 특정 질환 상태를 포함한다. 혈소판감소증을 포함하고 본 발명에 따라 치료될 수 있는 특정 질환 상태의 예로는 다음과 같은 것이 있다: 재생불량 빈혈; 특발성 또는 면역성 혈소판감소증(ITP), 예를 들어 유방암과 관련된 특발성 혈소판감소자색반병; ITP 관련 HIV 및 HIV 관련 혈전저혈소판혈증자색반병; 혈소판감소증을 초래하는 전이암; 전신홍반루푸스, 예를 들어 신생아 루푸스 증후성 비장비대; 팬코니스 증후군; 비타민 B12 결핍증; 엽산 결핍증; 메이-헤글린 기형; 위스콧-알드리치 증후군; 만성 간질환; 혈소판감소증 관련 골수형성이상 증후군; 발작야간혈색뇨증; C7E3 Fab(Abciximab) 치료 후의 급성 최중증 혈소판감소증; 모체 동종면역혈소판감소증을 비롯한 동종면역혈소판감소증; 항인지질 항체 및 혈전증과 관련된 혈소판감소증; 자가면역 혈소판감소증; 카보플라틴 유도성 혈소판감소증, 헤파린 유도성 혈소판감소증을 비롯한 약물 유도성 면역 혈소판감소증; 태아 혈소판감소증; 임신 혈소판감소증; 휴그스 증후군; 루푸스 혈소판 감소증; 재해 및/또는 대량 혈액 상실; 골수증식성 질환; 악성암 환자의 혈소판감소증; 암환자의 혈전저혈소판혈증자색반병/용혈요독증후군으로 나타나는 혈전미세혈관병증을 비롯한 혈전미세혈관병증혈전저혈소판혈증자색반병; 자가면역 용혈빈혈; 잠재 공장게실 천공; 순적혈구무형성; 자가면역혈소판감소증; 유행 신장병증; 리팜피신 관련 급성 신부전; 파리-뚜루즈 혈소판감소증; 신생아 동종면역혈소판감소증; 발작야간혈색뇨증; 위암 혈액 변화; 아동기 용혈요독 증후군; A형 간염 바이러스를 비롯한 바이러스 감염과 관련된 혈액 징후 및 CMV 관련 혈소판감소증이 있다. 또한, AIDS의 특정 치료법도 혈소판감소증(예를 들어, AZT)을 나타내기도 한다. 또한, 특정 상처 치유 증상은 혈소판 수의 증가로부터 유리해지는 경우도 있다.
예를 들어, 장래의 수술로 인한 예견된 혈소판 결핍증과 관련하여, 본 발명의 화합물은 혈소판이 필요하기 수 일 내지 수 시간 전에 투여하는 것이 가능하다. 급작스런 상황, 예를 들어 재해 및 대량 혈액 상실의 경우에는 본 발명의 화합물은 혈액이나 정제 혈소판과 함께 투여할 수도 있다.
본 발명의 화합물은 또한 거핵세포 이외에, mpl 수용체를 발현하는 것으로 밝혀진 세포라면 어떤 종류의 세포를 자극하는 데에도 유용할 것이다. 이러한 mpl 리간드에 의한 자극에 반응성인 mpl 수용체를 발현하는 세포와 관련된 조건 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다.
본 발명의 화합물은 혈소판 또는 혈소판 전구체 세포의 생성이 필요한 모든 상황 또는 mpl 수용체의 자극이 필요한 모든 상황에서 사용될 수 있다. 따라서, 일 예로 본 발명의 화합물은 혈소판, 거핵세포 등이 요구되는 포유동물의 모든 증상을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 증상에 대해서는 본원에 참고인용되는 문헌, 예를 들어 WO95/26746, WO95/21919, WO95/18858, WO95/21920 등에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 화합물은 혈소판 및/또는 거핵세포 및 관련 세포의 생존능이나 저장수명을 유지하는데 유용할 수 있다. 따라서, 이러한 세포를 함유하는 조성물에 본 발명의 1종 이상의 화합물을 유효량으로 함유하는 것이 유용할 것이다.
"포유동물"이란 용어는 인체, 가축, 예를 들어 개와 고양이; 원숭이를 비롯한 이국 및/또는 동물원 동물; 마우스, 랫 및 기니아 피그를 비롯한 실험 동물; 말, 소, 양, 염소 및 돼지를 비롯한 농장 동물 등의 모든 포유동물을 의미한다. 바람직한 포유동물은 인체이다.
V. 약학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 함유한 약학적 조성물 및 이 약학적 조성물의 사용방법을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 주사액, 또는 경 구, 비강, 경피 또는 다른 투여 형태, 예를 들어 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 포막내, 안내, 구후, 폐내(예를 들어, 에어로졸화된 약물), 또는 피하 주사액(서방성 데포우 투여); 설하, 항문, 질내 또는 외과적 이식, 예를 들어 비장낭, 뇌 또는 각막내로의 삽입 등을 통해 투여할 수 있다. 치료는 단독 투여량 또는 소정 시간 동안의 다수의 투여량으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 본 발명에는 약학적으로 용인가능한 희석제, 보존제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 화합물의 유효량을 함유하는 약학적 조성물이 포함된다. 이러한 조성물은 각종 완충용액 함유물(예를 들어, 트리스-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석제; 계면활성제 및 용해제(예를 들어, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들어, Thimersol, 벤질 알코올) 및 증량 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함하거나; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제조물이나 리포좀내로 병입되기도 한다. 또한, 하이알우론산이 사용될 수도 있는데, 이는 혈행 중의 지속 기간을 연장시키는 효과를 가질 수 있다. 약학적 조성물은 경우에 따라 약학적 매개체, 부형제, 또는 매질로서 작용하는 기타 다른 약학적으로 용인가능한 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함할 수 있는데, 그 예로는 비제한적으로 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 스테아르산마그네슘, 메틸- 및 프로필히드록시벤조에이트, 전분, 수크로스, 덱스트로스, 아카시아검, 인산칼슘, 광유, 코코아버터 및 테오브로마 오일 등이 있다. 이와 같은 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상 태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거율에 영향을 미칠 수 있다. [예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) p.1435-1712 참조. 본원에 참고인용됨]. 이러한 조성물은 액체 형태로 제조하거나, 또는 건조 분말, 예를 들어 동결건조 형태일 수 있다. 이식성 서방성 제제 역시 경피형 제제와 마찬가지로 고려될 수 있다.
본 발명에 유용한 것으로 고려될 수 있는 것은 경구 투여용 고형 약제학적 제형이다[이의 일반적 내용은 본원에 참고인용되는 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990(Mack Publishing Co. Easton PA 18042), at Chapter 89에 기술되어 있다]. 고형 약제학적 제형으로는 정제, 캅셀, 환제, 트로키 또는 로젠지, 카세제 또는 펠릿 등이 있다. 또한, 리포좀이나 유단백질 캅셀화도 본 발명의 조성물을 조제하는데 사용할 수 있다(예를 들어, 유단백질 미소립자는 미국 특허 제4,925,673호에 보고되어 있다). 리포좀 캅셀화는 사용가능한데, 이 리포좀은 다양한 중합체로 유도체화될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,013,556호). 치료에 가능한 고체 약제학적 제형에 대해서는 본원에 참고인용되는 문헌[Marshall, K., Modern Pharmaceutics, Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10, 1979]에 제시되어 있다. 일반적으로, 제제는 본 발명의 화합물과, 위를 보호하고 생물학적 활성 물질을 장으로 방출시키기 위한 불활성 성분을 포함할 것이다.
특히 고려되어야 하는 것은, 상기 본 발명에 따른 화합물의 경구 투여용 약제학적 제형이다. 본 발명의 화합물은 필요한 경우 경구 전달의 효과를 높이기 위해 화학적으로 변형될 수도 있다. 일반적으로, 고려될 수 있는 화학적 변형은 (a) 단백질분해작용의 억제; (b) 위나 장에서부터 혈류로의 흡수를 도모하는 적어도 1종 이상의 잔기를 본 발명의 화합물 분자 자체에 부착시키는 것이다. 또한, 화합물의 전반적 안정성과 체내 잔류 혈행 시간의 증가에도 바람직하다. 이러한 잔기의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린이 있다[Abuchowski 및 Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg 및 Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp. 367-383; Newmark 등의 J.Appl.Biochem. 4:185-189(1982)]. 사용할 수 있는 다른 중합체로는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이 있다. 전술한 바와 같이 약제 용도에 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 잔기이다.
경구 투여용 약제학적 제형인 경우에는, 본 발명의 치료 화합물의 흡수를 향상시키기 위한 담체로서 변형 지방족 아미노산염, 예를 들어 N-(8-[2-히드록시벤조일 아미노)카프릴산 나트륨(SNAC)을 사용하는 것도 가능하다. SNAC를 이용한 헤파린 제제의 임상 효능은 에미스피어 테크놀로지스(Emisphere Technologies)에서 실시한 페이스 II 시험에서 입증된 바 있다(미국 특허 제5,792,451호, "경구 투여용 약물 수송 조성물 및 방법").
치료제는 입자 크기가 약 1 mm인 과립이나 펠릿 형태의 미세 다중미립자로서 제형에 함유될 수 있다. 캅셀 투여를 위한 상기 치료제의 제형도 역시 분말이나, 가볍게 압착된 플러그(plug) 형태 또는 심지어 정제 형태일 수 있다. 치료제는 압착하여 제조할 수 있다.
착색제 및 향미제 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질(또는 유도체)은 조제된 뒤(예를 들어 리포좀이나 마이크로스피어 캡슐화를 통해) 식용 제품, 예를 들어 착색제와 향미제를 함유하는 냉동 음료 등에 첨가될 수 있다.
치료제는 불활성 물질로 희석하거나 부피를 증가시킬 수 있다. 이러한 희석제로는 탄수화물, 특히 만니톨, 락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 수크로스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함한다. 특정 무기 염 또한 충전제로서 사용될 수 있는데, 그 예로는 삼인산 칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨이 있다. 몇가지 시판 희석제로는 패스트-플로(Fast-Flo), 엠덱스(Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스(Emcompress) 및 아비셀(Avicell)이 있다.

붕해제는 치료 제형에 고형 약제학적 제형으로 첨가할 수 있다. 붕해제로서 사용된 재료로는 전분, 예를 들어 전분을 주성분으로 하는 시판 붕해제인 엑스플로탭(Explotab)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 전분 글리콜산 나트륨, 앰버라이트(Amberlite), 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 울트라아밀로펙틴, 알긴산나트륨, 젤라틴, 오렌지 껍질(orange peel), 산 카르복시메틸 셀룰로스, 천연 스폰지 및 벤토나이트 모두 사용될 수 있다. 또 다른 붕해제 형태는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말 검(gum)은 붕해제 및 결합제로서 사용할 수 있고, 분말 검으로는 아가, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸트가 있다. 알긴산 및 이의 나트륨 염 역시 붕해제로서 유용하다.
결합제는 치료제를 경질 정제로 형성 유지시키기 위해 사용할 수 있으며, 그 예로는 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 산물 유래의 물질이 포함된다. 다른 예로는 메틸셀룰로스(MC), 에틸셀룰로스(EC) 및 카르복시메틸셀룰로스(CMC)가 있다. 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC) 모두 치료제를 과립화하기 위한 알코올 용액으로서 사용할 수 있다.
윤활제는 배합 과정 동안 점착 방지를 위하여 치료제 제형에 첨가될 수 있다. 윤활제는 치료제와 다이(die) 벽 사이의 층으로서 사용될 수 있고, 그 예로는 스테아르산과, 이의 마그네슘염 및 칼슘염, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 가용성 윤활제 역시 사용될 수 있는데, 그 예로는 소듐 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜, 카르보왁스 4000 및 6000 이 있다.
배합 동안 약물의 유동성을 향상시키고 압착 동안 재배열을 돕기 위한 목적의 활택제(glidant)가 첨가될 수 있다. 활택제로는 전분, 활석, 발열 실리카 및 수화 실리코알루미네이트가 있다.
수성 환경에 치료제가 용해되는 것을 돕기 위하여, 습윤화제로서 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제로는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이틈 및 디옥틸 소듐 설포네이트와 같은 음이온성 세정제가 있다. 양이온성 세정제도 사용할 수 있으며, 그 예로는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드가 있다. 계면활성제로서 배합시 첨가될 수 있는 가능한 비이온성 세정제의 예로는 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 있다. 이러한 계면활성제는 단백질이나 유도체 단독으로 또는 여러 비율의 혼합물로서 배합 시에 첨가될 수 있다.
화합물의 흡수를 강력하게 향상시키는 첨가제로는 예를 들어 지방산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이 있다.
서방성 제형이 바람직하다. 이 때, 약물은 확산이나 여과 기작에 의해 방출을 허용하는 불활성 기질, 예를 들어 검에 첨가될 수 있다. 활성이 없는 매트릭스 또한 제제에 첨가될 수 있는데, 그 예로는 알긴산염, 다당류가 있다. 이러한 치료제의 또 다른 서방성 형태는 오로스(Oros) 치료 시스템(알자 코포레이션에서 입수)을 기초로 한 방법, 즉 물은 흡수하고 약물은 삼투압 효과에 의해 작은 단일 통로를 통해 밀어내는 반투과 막에 약물을 주입한다. 몇몇 장용 코팅제도 서방성 효과를 제공할 수 있다.
다른 코팅제도 제형에 사용할 수 있다. 그 예로는 코팅 팬에서 도포될 수 있는 다양한 당이 있다. 또한, 치료제는 필름제피정으로 제공될 수 있으며, 이러한 경우에 사용되는 물질은 2 군으로 나뉘어진다. 그 하나는 비장용 물질로서, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 다른 하나는 일반적으로 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다.

이러한 물질들의 혼합물을 사용하여 최적의 필름 코팅을 제공할 수도 있다. 필름 코팅은 팬 코팅기에서 또는 유동화 베드에서 또는 압착 코팅에 의해 실시할 수 있다.
또한, 본 발명에는 본 발명의 단백질(또는 이의 유도체)의 폐 전달이 고려되어야 한다. 본 발명의 단백질(또는 유도체)은 흡입 동안 포유동물의 폐로 전달되어 폐의 상피 내막을 통과하여 혈류로 들어간다. 이에 대한 다른 보고서로는 Adjei 등의 Pharmaceutical Research 7:565-569(1990); Adjei 등의 Pharmaceutical Research 7:565-569(1990); Adjei 등의 International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (류프롤라이드 아세테이트); Braquet 등의 Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl.5); s. 143-146(1989)(엔도텔린-1); Hubbard 등의 Annals of Internal Medicine 3:206-212(1989)(1-안티트립신); Smith 등의 J.Clin.Invest. 84:1145-1146(1989)(1-프로테이나제); Oswein 등의 "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990(재조합 인체 성장 호르몬); Debs 등의 The Journal of Immunology 140:3482-3488(1988)(인터페론 및 종양 괴사 인자) 및 Platz 등의 미국 특허 제5,284,656호(과립구 콜로니형성 자극 인자)를 포함한다.

본 발명의 실시에 사용되는 것으로서, 치료제 산물의 폐 전달을 위해 고안된 다양한 기계 장치, 예를 들어 분무기, 정량식 흡입기 및 분말 흡입기 등이 고려되어야 하며, 이들 모두는 당업자에게 익숙한 것이다.
본 발명의 실시에 적합한 몇 가지 시판 장치의 구체적 예로는 울트라벤트(Ultravent) 분무기[미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 말린크로드트(Mallinckrodt), 인코포레이티드 제품]; 아콘(Acorn) II 분무기(미국 콜로라도주 잉글우드에 소재하는 마퀘스트 메디컬 프로덕츠 제품); 벤톨린(Ventolin) 정량식 흡입기(미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 소재하는 글락소 인코포레이티드 제품; 및 스핀할러(Spinhaler) 분말 흡입기(미국 매사츄세츠주 베드포드에 소재하는 핀손스 코포레이션 제품)가 있다.
이와 같은 장치는 모두 본 발명의 화합물의 투여에 적합한 제형의 사용을 필요로 한다. 일반적으로, 각 제형은 사용되는 장치의 종류에 특이적이며 치료에 유용한 희석제, 보조제 및/또는 담체 외에 적당한 추진제의 사용을 포함할 것이다.
본 발명의 화합물은 폐 말단으로의 가장 효과적인 전달을 위해 가장 유리하게는 평균 입자 크기가 10 ㎛ (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛으로 제조되는 것이 좋다.
담체로는 탄수화물, 예를 들어 트레할로스, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 락토스 및 소르비톨이 있다. 제형에 사용되는 다른 성분으로는 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC가 있다. 천연 또는 합성 계면활성제가 사용될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다(단백질이나 유사체를 유도체화하는데 사용되는 것과는 별개로). 덱스트란, 예를 들어 사이클로덱스트란이 사용될 수 있다. 담즙염 및 다른 관련 증강인자가 사용될 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체가 사용될 수 있다. 완충용액 제형에 사용되는 것과 같이 아미노산이 사용될 수 있다.
또한, 리포좀, 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어, 내포 복합체 또는 다른 유형의 담체의 사용도 고려되어야 한다.
제트형이나 초음파형에 관계없이 분무기 사용시에 적합한 제형은 일반적으로 용액 1 ml 당 생물학적 활성 단백질 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 물에 용해시킨 본 발명의 화합물을 포함한다. 이 제형은 또한 완충용액 및 단순 당을 포함할 수도 있다(예를 들어, 단백질 안정화와 삼투압 조절 목적으로). 분무기 제형은 또한 에어로졸 형성시 용액의 분무작용에 의해 일어나는 단백질의 표면 유도 응집을 감소시키거나 예방하기 위한 계면활성제를 함유할 수도 있다.

정량식 흡입 장치에 사용하기 위한 제형은 일반적으로 계면활성제의 보조하에 추진제에 현탁시킨 본 발명의 화합물을 함유하는 미분형 분말을 함유할 것이다. 추진제는 본 목적에 통상적으로 이용되는 물질, 예를 들어 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 이의 조합을 포함하는 탄화수소 등일 수 있다. 적합한 계면활성제로는 소르비탄 트리올레이트 및 대두 레시틴이 있다. 올레산은 또한 계면활성제로서 유용할 수 있다.
분말 흡입장치에서 분배되는 제형은 본 발명의 화합물을 함유하는 미분성 건조 분말을 포함하며, 추가로 증량제, 예를 들어 락토스, 소르비톨, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 자일리톨을, 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양, 예를 들어 제형의 50 내지 90 중량 %로 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물의 비강 투여 역시 고려되어야 한다. 비강 투여는 치료제 산물이 폐에 침착될 필요없이 치료제 산물이 코로 투여된 후 즉시 단백질을 혈류로 전달하게 한다. 비강 투여용 제형은 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 함유한 것을 포함한다. 다른 점막을 통한 수송 전달 역시 고려되어야 한다.
투여량
전술한 증상을 치료하는 방법에 수반되는 투여량 섭생은 담당 의사에 의해 약물의 작용을 변화시키는 다양한 요인, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이 습관, 임의의 감염의 정도, 투여 횟수 및 다른 임상 요인들을 고려하여 결정될 것이다.
본 발명의 화합물은 최초 환괴에 이어 약물 산물의 치료 혈행 농도를 유지하기 위한 연속 주입을 통해 투여할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 투여량으로 투여할 수 있다. 당업자라면, 양호한 의료 시술과 각 환자의 임상 상태를 통해 확인되는 바와 같이 효과적인 투여량과 투여 섭생을 용이하게 최대한 활용할 수 있을 것이다. 투여 횟수는 제제의 약물동력학적 파라미터와 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 최적의 약학적 제형은 당업자라면 투여 경로와 바람직한 투여량에 따라 결정할 수 있을 것이다. 본원에 참고인용되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) p.1435-1712]을 참조할 수 있다. 이와 같은 제형은 신체 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 투여 제제의 생체내 제거율에 영향을 받을 수 있다. 투여 경로에 따라 적합한 투여량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산될 수 있다. 전술한 각 제형을 포함하는 치료에 있어서 적당한 투여량을 결정하는데 필요한 더욱 세밀한 계산은 특히 본 명세서에 개시된 분석법과 투여량 정보는 물론 전술한 인체 임상 시험에서 관찰 된 약물동력학적 데이터에 비추어 지나친 실험없이 당업자에 의해 통상적으로 이루어질 수 있다. 적당한 투여량은 적당한 투여량-반응 데이터와 함께 혈액내 투여량 농도를 측정하는 소정의 분석법을 사용함으로써 확인할 수 있다. 최종 투여량 섭생은 약물의 작용을 변화시키는 다양한 요인, 예를 들어 약물의 특이적 활성, 손상 정도 및 환자의 응답반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이습관, 모든 감염의 정도, 투여 회수 및 다른 임상 요인 등을 고려하여 담당의가 결정할 수 있다. 연구가 진행됨에 따라, 다양한 질환과 증상에 적당한 투여량 농도와 치료 기간등에 관한 추가 정보가 나타날 것이다.
본 발명에 따른 치료 방법, 조성물 및 화합물은 또한 단독으로 또는 다른 사이토킨, 가용성 mpl 수용체, 조혈 인자, 인터루킨, 성장 인자 또는 항체와 함께, 혈소판 결핍증 뿐만 아니라 다른 증상을 특징으로 하는 질환 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 IL-3 또는 GM-CSF와 같은 조혈작용의 일반적인 자극인자와 함께 몇몇 형태의 혈소판감소증을 치료하는데 유용한 것으로 입증될 것으로 예상한다. 다른 거핵세포 자극 인자, 즉 meg-CSF, 줄기세포인자(SCF), 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM) 또는 거핵세포 자극 활성이 있는 다른 분자 역시 mpl 리간드로 이용될 수 있다. 이와 같은 공동-투여에서의 사이토킨이나 조혈 인자의 또 다른 예로는 IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 콜로니형성 자극 인자-1(CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 콜로니형성 자극 인자(G-CSF), EPO, 인터페론-알파(IFN-알파), 칸센서 스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 트롬보포이에틴(TPO), 혈관형성인자, 예를 들어 Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-γ, 인체 혈관형성인자-유사 폴리펩티드, 혈관 내피 성장인자(VEGF), 안지오제닌, 골(骨) 형태발생성 단백질-1, 골 형태발생성 단백질-2, 골 형태발생성 단백질-3, 골 형태발생성 단백질-4, 골 형태발생성 단백질-5, 골 형태발생성 단백질-6, 골 형태발생성 단백질-7, 골 형태발생성 단백질-8, 골 형태발생성 단백질-9, 골 형태발생성 단백질-10, 골 형태발생성 단백질-11, 골 형태발생성 단백질-12, 골 형태발생성 단백질-13, 골 형태발생성 단백질-14, 골 형태발생성 단백질-15, 골 형태발생성 단백질 수용체 IA, 골 형태발생성 단백질 수용체 IB, 뇌 유래 향신경 인자, 섬모 호중구 인자, 섬모 호중구 인자 수용체, 사이토킨 유도 호중구 화학주성 인자 1, 사이토킨 유도 호중구 화학주성 인자 2, 내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 표피 성장 인자, 표피 유래 호중구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장인자 5, 섬유아세포 성장인자 6, 섬유아세포 성장인자 7, 섬유아세포 성장인자 8, 섬유아세포 성장인자 9, 섬유아세포 성장인자 10, 섬유아세포 성장인자 산성, 섬유아세포 성장인자 염기성, 아교 세포주 유래 호중구 인자 수용체 1, 아교 세포주 유래 호중구 인자 수용체 2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장인자 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 I, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 II, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질, 각질세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 백혈병 억제 인자 수용체, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B쇄, 혈소판 유래 성장인자 BB, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 전구B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자 수용체, TNF(TNF0, TNF1, TNF2 포함), 형질전환 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 형질전환 성장 인자 1, 형질전환 성장 인자 1.2, 형절전환 성장 인자 2, 형질전환 성장 인자 2, 형질전환 성장 인자 3, 형질전환 성장인자 5, 잠재성 형질전환 성장 인자 1, 형질전환 성장 인자 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 결합 단백질 III, 제 1 형 종양 괴사 인자 수용체 , 제 2 형 종양 괴사 인자 수용체, 유로키네이즈형 플라스미노겐 활성인자 수용체, 혈관 내피세포 성장 인자, 및 이의 키메라형 단백질 및 생물학적 또는 면역학적 활성 단편이 있다. 또한, 거핵세포가 성숙 형태에 이르자마자 거핵세포를 혈소판으로 단편화하는 효과가 있는 것으로 보이는 가용성 포유동물 mpl 수용체의 유효량을 동시에 또는 후속적으로 투여하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물(성숙 거핵세포의 수를 증가시킴)의 투여 후 가용성 mpl 수용체의 투여(리간드를 불활성화시키고 성숙 거핵세포를 혈소판으로 형성시킴)는 혈소판 생산을 자극하는 특히 효과적인 수단인 것으로 예상된다. 전술한 투여량은 치료 조성물내 이와 같은 추가 성분에 대해 보정하기 위하여 조정될 수 있다. 치료받는 환자의 진행 상태는 통상적인 방법에 따라 모니터할 수 있다.
본 발명의 화합물이 혈소판 및/또는 거핵세포와 관련 세포의 조성물에 첨가되는 경우에, 첨가되는 양은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 기법 및 분석법에 따라 실험적으로 확인할 수 있다. 예시적인 함량 범위는 세포 106 당 본 발명의 화합물 0.1 ㎍ 내지 1 mg 범위이다.
본 발명의 기술이 특정 문제나 상황에 적용되는 것은 본 명세서에 기술된 기술에 비추어 당업자의 능력범위이내에서 이루어질 수 있다는 것은 자명한 것이다. 본 발명의 산물, 그것의 분리, 사용 및 제조에 대한 대표 공정은 다음에 제시한다.
이하 실시예는 본 명세서에 개시된 일부 화합물의 제조 방법과 특성을 예시적으로 설명한 것이다.
실시예 1
1. 2차 펩티드 라이브러리의 구성
A. 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) E.coli 세포의 제조
E.coli 세포(TG1 균주; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수) 배양물을 2xYT 배지(1.6 % 박토 트립톤, 1 % 효모추출물, 85.5 mM NaCl) 10 ml에서 37 ℃하에 하룻밤 배양하였다. 이 배양물 1 ml 를 0.4 % 글루코스 및 10 mM MgCl2를 함유하는 2xYT 배지 1 L에 접종하고, 이 1 L 배양물을 37 ℃ 진탕기에서 OD600=0.8이 될 때까지 증식시켰다. 이 배양물을 15 분 동안 얼음에서 냉각시키고 4000 rpm, 4 ℃하에 20 분 동안 원심분리(베크만 JA-10 로터)하였다. 이 박테리아 펠릿을 빙냉(cold)된 10 % 글리세롤 용액 500 ml에 재현탁시키고, 이 혼합물을 4000 rpm, 4 ℃하에 20 분 동안 원심분리하였다. 이 박테리아 펠릿을 다시 빙냉된 10 % 글리세롤 용액 500 ml에 재현탁시키고, 이 혼합물을 4000 rpm, 4 ℃하에 20 분 동안 원심분리하였다. 이 세포 펠릿을 다시 빙냉된 10 % 글리세롤 용액 25 ml에 재현탁시켰다. 이와 같이 농축된 박테리아 샘플을 빙냉한 50 ml 원추형관에 넣고 탁상용 원심분리기(베크만 CS-6R)에서 3500 rpm, 4 ℃하에 15 분 동안 원심분리하였다. 그 결과 얻어지는 세포 펠릿을 소량의 빙냉 글리세롤 용액에 재현탁시키고, 그 결과 얻어지는 박테리아 스톡(stock)을 100 ㎕씩 또는 300 ㎕씩 즉시 에탄올/드라이아이스조에서 동결시키고 -80 ℃ 냉동고에 보관하였다.
B. pCES1 벡터의 변형
PCR 반응은 익스텐드 롱 템플레이트 PCR 시스템(Extend Long Template PCR Systems, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 디아그노스틱스 코포레이션에서 입수)을 사용하고 주형으로서 pCES1 벡터(타겟퀘스트 인코포레이티드에서 입수) 1 ㎍을 사용하여 실시하였다. PCR 혼합물의 부피는 1 x PCR 완충용 액, 각각 200 nM인 두 프라이머 5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' 및 5'-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3', 200 nM dNTP, 3 U의 표식 DNA 폴리머라제를 함유하는 혼합물 100 ㎕이다. TRIO-Thermoblock(바이오메트라에서 입수) PCR 시스템을 사용하여 다음과 같은 프로그램을 진행시켰다: 94 ℃, 5 분; [94 ℃ 30 초, 50 ℃ 30 초, 72 ℃ 45 초] 30 회; 72 ℃, 10 분; 4 ℃로 냉각. 그 결과 얻어지는 PCR 산물을 1 % 아가로스 겔을 통해 분리하여 퀴아젠 스핀(QIAGEN Spin) 컬럼(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인코포레이티드에서 입수)을 통해 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 2차 PCR 반응은 상기 PCR 산물 5 ㎕와 각각 200 nM인 두 프라이머 5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' 및 5'-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3'를 사용하여 전술한 바와 동일한 PCR 조건하에 실시하였다.
그 결과 얻어지는 PCR 산물과 본래의 pCES1 벡터를 1xNEB2 완충용액, 60 U의 ApaLI(미국 매사츄세츠주 베버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수), 60 U의 BamHI(뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수)을 함유하는 100 ㎕ 반응액에서 37 ℃하에 1 시간 동안 각각 절단시켰다. 각각 절단된 DNA를 퀴아젠 스핀 컬럼으로 정제하고 1x 결합 완충용액 및 40 U의 T4 DNA 리가아제(뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수)를 함유하는 40 ㎕ 반응액에서 실온하에 하룻밤 동안 결합시켰다.
그 결과 얻어지는 벡터를 E.coli에 트랜스펙션시키고 37 ℃에서 하룻밤 동안 항온배양하였다. 분리된 단독 콜로니를 선택하여, 이로부터 퀴아젠 스핀 컬럼을 사용하여 플라스미드를 정제하였다. DNA 서열결정을 통해 정확한 삽입체를 확인하였다.
C. 벡터 DNA의 제조
변형된 pCES1 벡터 DNA(섹션 1B) 1 ㎍으로 일렉트로컴피턴트 TG1 E.coli(아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수, 섹션 1A) 100 ㎕를 진 펄서 II(미국 캘리포니아주 허큘레스 소재의 바이오-래드에서 입수)(2500V, 25℉ 및 200Ω으로 세팅됨)를 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 샘플을 그 다음 즉시 SOC(2 % 트립톤, 0.5 % 효모추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM 글루코스, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2) 900 ㎕를 함유하는 시험관에 옮기고, 이 배양물을 37 ℃에서 1시간 동안 진탕하에 증식시켰다. 그 다음, 세포를 2x YTAG(100 ㎍ 암피실린 및 2 % 글루코스를 함유하는 2x YT) 아가 평판 상에 도말하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 항온배양하였다. 단독 콜로니를 2x YTAG 배지 1L에 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였다. 그 결과 얻어지는 플라스미드 벡터 DNA를 퀴아젠 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다.
D. 벡터 DNA의 절단
벡터 DNA(섹션 1C) 50㎍을 1x NEB 완충용액2, 200U의 ApaLI 및 200U의 XhoI를 함유하는 반응액 400 ㎕에서 37 ℃하에 하룻밤동안 절단하였다. 이 제한 절단 반응액을 37 ℃에서 하룻밤동안 배양하고 미리제조한 1 % 아가로스 겔(미국 캘리포니아주 산디에고 소재의 엠비 테크에서 입수)을 통해 분석하였다. 선형화된 벡터 DNA를 겔에서 떼어내어 퀴아퀵 겔 추출 키트(퀴아젠 인코포레이티드에서 입수)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 추출하였다.
E. 라이브러리 올리고누클레오티드의 제조
2가지 라이브러리 올리고누클레오티드[고정형(fixed) 및 첨가형(doped)]를 고안하였다. 고정형 라이브러리 올리고누클레오티드 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKGGTCCTACTCTGMRKSARTGGCTGNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG-3' 및 첨가형 라이브러리 올리고누클레오티드 5'-CACAGTGCAC-AGGGTNNKNNKNNKNNKggKcc-KacKctKNNKNNKtgKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG-3' (소문자는 제시된 염기 70 %와 나머지 3 종의 누클레오티드 각 10 %씩의 혼합물을 나타낸다)를 합성하였다. 이 올리고누클레오티드 각각을 폴리머라제 연쇄 반응의 주형으로 사용하였다.
PCR 반응에는 PCR 시스템 키트(Expand High Fidelity PCR 시스템 키트, 로슈 디아그노스틱스 코포레이션에서 입수)를 사용하였다. 각 PCR 반응액은 부 피가 100 ㎕이고, 10 nM의 라이브러리 올리고누클레오티드, 1X PCR 완충용액, 300 nM의 각 프라이머 5'-CACAGTGCACAGGGT-3' 및 5'-TGATCTCGAGAGAATG-3', 200 nM dNTP, 2 mM CaCl2 및 5 U의 연장(Expand) 폴리머라제를 함유하고 있다. 써모사이클러(GeneAmp PCR 시스템 9700, 어플라이드 바이오시스템즈에서 입수)를 사용하여 다음과 같은 프로그램으로 진행시켰다: 94 ℃ 5 분; [94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 45 초] 30 회; 72 ℃, 7 분; 4 ℃로 냉각. 유리 누클레오티드는 퀴아퀵 누클레오티드 제거 키트(퀴아젠 인코포레이티드에서 입수)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 제거하였다.
F. 라이브러리 올리고누클레오티드의 절단
각 PCR 산물(섹션 1E) 5 ㎍을 1x NEB 완충용액2, 200 U의 ApaLI 및 200 U의 XhoI를 함유하는 400 ㎕ 반응액에서 37 ℃하에 하룻밤 동안 절단하였다. 절단된 DNA를 3 % 아가로스 겔(엠비 테크에서 입수) 상에서 분리하였다. 각 반응액으로부터 목적 DNA 밴드를 겔에서 절단해내고 퀴아퀵 겔 추출 키트를 사용하여 추출하였다.
G. 라이브러리 올리고누클레오티드와 벡터의 결합
선형화된 벡터(섹션 1D, 25 ㎍) 및 각각의 절단된 PCR 산물(섹션 1F, 5 ㎍)을, 1x NEB 결합 완충용액 및 80 U의 T4 DNA 리가제를 함유하는 400 ㎕ 반응액에서 16 ℃하에 하룻밤동안 결합시켰다. 결합된 산물은 DNA 리가제를 불활성화시키기 위하여 65 ℃에서 20 분 동안 항온배양하고 8 U NotI와 37 ℃에서 2 시간 동안 추가 항온배양하여 벡터의 자가결합을 최소화하였다. 그 다음, 결합된 산물은 표준 페놀/클로로포름 추출법(Molecular Cloning, Maniatis 등의 3rd Edition)으로 정제하고 H2O 30 ㎕에 재현탁시켰다.
H. 일렉트로포레이션 형질전환
각 라이브러리마다 10회의 일렉트로포레이션 반응을 실시하였다. 각 형질전환을 위해, 결합된 벡터 DNA(섹션 1G) 3 ㎕ 및 TG1 세포(아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수, 섹션 1A) 300 ㎕를 0.2 cm 큐벳(바이오-래드에서 입수)에서 혼합하였다. 그 결과 얻어지는 혼합물에 2500V, 25uF 및 200Ω으로 세팅된 진 펄서 II를 사용하여 펄스를 보냈다. 10 개의 일렉트로포레이션 반응액으로부터 형질전환된 박테리아 샘플을 합하여, SOC 27 ml을 함유하는 플라스크로 옮겨 37 ℃에서 1 시간 동안 항온배양하였다. 이 세포를 그 다음 170 ml 2x YTAG에 첨가하고 진탕하면서 37 ℃에서 3 시간 동안 증식시켰다. 세포를 5000 rpm 하에 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 그 다음 15 % 글리세롤/2x YT 10 ml에 재현탁시켜 -80 ℃에 보관하였다. 이것을 라이브러리의 1차 스톡으로 사용하였다. 적정 결과, 고정형 라이브러리 및 첨가형 라이브러리 각각에 대하여 라이브러리 크기가 1.0 x 109인 독립 형질전환체 및 2.4x109인 독립 형질전환체가 확인되었다.
2. 라이브러리의 증폭
A. 라이브러리의 2차 스톡(stock) 제조
1차 라이브러리 세포 스톡(섹션 1H)을 1300 ml (고정형 라이브러리용) 및 2600 ml (첨가형 라이브러리용)의 2x YTAG 배지에 초기 OD600=0.1 이 되도록 접종하였다. 배양액을 진탕하에 수 시간 동안 37 ℃에서 OD600=0.5가 될 때까지 증식시켰다. 고정형 라이브러리 120 ml 일정량 및 첨가형 라이브러리 240 ml 일정량을 취하여 각각의 플라스크에서 추가로 2 시간 동안 37 ℃에서 증식시켰다. 이 2차 배양물을 4 ℃하에 5000 rpm(베크만 JA-14 로터)으로 10 분 동안 원심분리하고 얻어지는 박테리아 펠릿을 10 ml의 15 % 글리세롤/2x YT(각 라이브러리마다)에 재현탁시킨 뒤 -80 ℃에 보관하였다.
B. 파지 유도
OD600=0.5인 나머지 박테리아 배양액(섹션 2A)에 M13K07 헬퍼 파지 일정량(아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수)을 최종 농도가 3x 109 pfu/ml이 될 때까지 첨가하였다. 헬퍼 파지를 사용하여 37 ℃하에 진탕없이 30 분 동안, 그리고 느린 진탕하에 30 분 동안 박테리아를 감염시켰다. 감염 세포는 4 ℃, 5000 rpm하에 10 분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 2x YTAK(100㎍/ml 암피실린 및 40 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 2YT) 1300 ml(고정형 라이브러리) 및 2600 ml(첨가형 라이브러리)로 재현탁시켰다. 진탕하에 하룻밤동안 37 ℃에서 파지를 생성시켰다.
C. 파지 수득
박테리아 배양액(섹션 2B)을 5000 rpm에서 4 ℃하에 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새 병에 담고, 20 % PEG/2.5 M NaCl 0.2 부피를 첨가한 뒤 얼음상에서 1 시간 동안 항온배양하여 파지미드를 침전시켰다. 침전된 파지미드를 4 ℃에서 8000 rpm 으로 20 분 동안 원심분리하고 빙냉 PBS 100 ml에 조심스럽게 재현탁시켰다. 파지미드 용액은 4 ℃에서 8000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리하여 정제하고, 얻어지는 파지미드에 0.2 부피의 20 % PEG/2.5 M NaCl을 첨가하여 침전시켰다. 파지미드는 4 ℃에서 8000 rpm 으로 20 분 동안 원심분리시키고, 얻어지는 파지미드 펠릿을 빙냉 PBS 12 ml에 재현탁시켰다. 60 % 글리세롤 용액 4 ml을 파지미드 용액에 첨가하여 -80 ℃에 보관하였다. 이 파지미드의 적정농도는 표준 절차에 따라 측정하였다(Molecular Cloning, Maniatis 등의 3rd Edition).
3. 인체 MPL 결합 파지의 선별
A. 인체 MPL의 비오틴화
재조합 인체 MPL(암젠 인코포레이티드에서 입수하였으며, 암젠은 상기 재조합 인체 MPL을 CHO 세포주에서 합성시켰다) 1 mg을 비오틴화 키트(EZ-링크 설포-NHS-LC-비오틴화 키트, 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스에서 입수)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 비오틴화하였다.
B. 마그네틱 비드 상의 MPL의 고정화
비오틴화된 MPL(섹션 3A)을 다이나비드 M-280 스트렙타비딘(미국 뉴욕주 레이크 석세스 소재의 다이날에서 입수) 상에 제조자에게서 입수한 비드 스톡 100 ㎕당 1 ㎍ MPL 농도로 고정화시켰다. 이 비드를 자석을 사용하여 시험관의 한 면으로 유인한 후 액체를 피펫으로 제거한 다음, 비드를 인산염완충 식염수(PBS)로 2 회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 세척된 비드에 비오틴화된 MPL 단백질을 전술한 농도로 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 진탕 배양시켰다. BSA를 2 % 최종 농도로 첨가하여 4 ℃에서 진탕하에 하룻밤동안 항온배양하여 MPL 코팅된 비드를 차단시켰다. 그 결과 얻어지는 MPL 코팅 비드를 그 다음 선별 절차에 앞서 PBST(0.05 % 트윈-20 함유 PBS)로 2 회 세척하였다.
C. MPL 코팅 비드를 사용한 선별
약 100 배 라이브러리 당량의 파지미드(섹션 2C, 고정형 라이브러리의 경우 1x1011cfu, 첨가형 라이브러리의 경우 2.4x1011cfu)를 2 % BSA를 함유하는 PBS 1 ml로 1 시간 동안 차단시켰다. 차단된 파지미드 샘플을 블랭크 비드(MPL 코팅시키지 않은 섹션 3B와 동일한 비드)에 첨가하여 음성 선별 단계를 실시한 다음, 이 혼합물을 진탕하에 1 시간 동안 실온에서 항온배양하였다. 파지미드 함유 상청액을 자석을 이용하여 유인하여 MPL 코팅 비드(섹션 3B)를 함유하는 새 시험관으로 옮긴 다음, 이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 진탕 배양하였다. 상청액을 제거한 뒤 파지미드 결합된 비드를 PBST로 10 회, PBS로 10 회 세척하였다. 그 결과 얻어지는 파지미드를 회전기 상에서 10 분 동안 100 mM 트리에틸아민 용액(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마에서 입수) 1 ml로 용출시켰다. 파지미드 함유 용액의 pH는 1 M 트리스-HCl(pH 7.5) 0.5 ml을 첨가하여 중화시켰다. 그 결과 얻어지는 파지미드를 사용하여 5 ml의 새로 증식시킨 TG1 박테리아(아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수, OD600 약 0.5)를 37 ℃에서 30 분 동안 비진탕하에 배양하고 그 다음 느린 진탕하에 30 분 동안 배양하여 감염시켰다. 감염된 TG1 세포 모두를 큰 2xYTAG 평판에 도말하고 30 ℃에서 하룻밤동안 항온배양하였다.
D. 파지 유도 및 수득
상기 평판(섹션 3C)에 2x YTAG 배지 10 ml 일정량을 첨가하여 TG1 세포를 재현탁시켰다. 모든 TG1 세포를 시험관에 수집한 뒤, 이 세포 250 ㎕ 일정 량을 2x YTAG 25 ml에 첨가하고 OD600=0.5가 될 때까지 37 ℃에서 증식시켰다. M13KO7 헬퍼 파지를 3x109 cfu/ml의 최종 농도로 첨가하고 37 ℃에서 진탕없이 30 분, 그 다음 느린 진탕하에 30 분간 배양하였다. 이 세포를 5000 rpm 으로 4 ℃에서 10 분간 원심분리하고 2x YTAK 25 ml에 재현탁시켰다. 이 박테리아를 진탕하에 30 ℃에서 하룻밤 동안 증식시켰다. 유도된 파지미드를 수거하여 섹션 2C에서와 같이 정제하였다.
E. 2차 선별
다음을 제외하고는 섹션 3B 내지 3C에 개략한 바와 같이 2차 선별을 실시하였다. 섹션 3D에서 수득한 파지미드 용액 약 0.5 ml 일정량을 원료 파지미드로 사용하였다. 단지 0.1 ㎍의 비오틴화된 MPL(섹션 3A)을 다이나비드 M-280 스트렙타비딘 상에 코팅하였다. 파지 결합된 비드를 PBST로 16회 세척하고, 마지막 세척에는 PBST에서 실온하에 30 분 동안 항온배양하였다. 이 비드를 PBS로 10회 더 세척하였다.
4. 클론 분석
A. 마스터플레이트의 제조
2차 선별 후 얻은 단독 콜로니를 채취하여 웰 당 120 ㎕의 2xYTAG를 함유하는 96웰 평판에 접종하였다. 96웰 평판을 30 ℃ 진탕기에서 하룻밤 동안 항온배양하였다. 각 웰에 60 % 글리세롤 40 ㎕를 첨가하고 -80 ℃에 보관하였다.
B. 파지미드 ELISA
마스터플레이트(섹션 4A) 유래의 세포 약 3 ㎕ 일정량을, 각 웰 당 2xYTAG 120 ㎕를 함유하는 새로운 96웰 평판에 접종하고, 이 새 평판의 세포를 37 ℃에서 OD600= 약 0.5가 될 때까지 증식시켰다. M13K07 헬퍼 파지(1.2x 1010cfu/ml)를 함유하는 2x YTAG 40 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 96웰 평판을 37 ℃에서 진탕없이 30분 동안 항온배양하고 느린 진탕하에 추가 30분 동안 항온배양하였다. 상기 평판을 2000 rpm (베크만 CS-6R 탁상용 원심분리기)에서 10분 동안 4 ℃하에 원심분리하였다. 웰에서 상청액을 제거하고 각 세포 펠릿을 웰 당 2x YTAK 160 ㎕를 사용하여 재현탁시켰다. 파지미드 발현을 위해 평판을 30 ℃에서 하룻밤동안 항온배양하였다.
재조합 인체 MPL을 0.1 M 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 5 ㎍/ml의 농도로 사용하여 96웰 맥시소프 플레이트(눈크에서 입수) 상에 4 ℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 대조군으로서, BSA(시그마에서 입수)를 별도의 맥시소프 플레이트에 5 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다.
다음날, 하룻밤 세포 배양물을 4 ℃에서 2000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 각 웰로부터 상청액 20 ㎕를, 웰당 2 % BSA/PBS 용액 180 ㎕를 함유하는 새로운 96웰 평판으로 옮겼다. 그 결과 얻어지는 혼합물을 진탕하에 실온에서 1시간 동안 항온배양하여 파지미드를 차단시켰다. 한편, MPL 코팅 평판은 웰 당 2 % BSA/PBS 용액 200 ㎕로 진탕하에 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. BSA 용액을 제거하고, 각 웰을 PBST 용액으로 3 회 세척하였다. 마지막 세척 단계 후, 차단된 파지미드 용액 50 ㎕를 MPL 코팅 평판은 물론 대조군 평판의 각 웰에 첨가하고 진탕하에 실온에서 1 시간 동안 항온배양하였다. 액체를 제거하고, 각 웰을 PBST 용액으로 3 회 세척하였다. 1:15,000 희석율의 HRP 접합된 항-M13 mAb(아메샴 파마시아 바이오테크에서 입수) 50 ㎕를 MPL 코팅 평판 및 대조군 평판의 각 웰에 첨가하고, 이 평판을 진탕하에 실온에서 1 시간 동안 항온배양하였다. 다시 액체를 제거하고 각 웰을 PBST 용액으로 3 회 세척하였다. LumiGLO 화학발광 기질(미국 메릴랜드 게더스버그소재의 키르케가아드 앤드 페리 라보라토리스에서 입수)을 상기 웰에 첨가하고 각 웰을 루미노스칸 아센트(Luminoskan Ascent) DLRearly 기기(미국 매사츄세츠주 프랭클린 소재의 랩시스템즈에서 입수)로 판독하였다.
C. 파지 클론의 서열결정
주형으로서 마스터플레이트(섹션 4A)의 각 웰 유래의 박테리아 1 ㎕를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 각 PCR 혼합물의 부피는 1x PCR 완충용액, 각각 300 nM의 두 프라이머 5'-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3' 및 5'-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3', 200 nM dNTP, 2 mM CaCl2, 및 5 U taq DNA 폴리머라제(로슈 모리큘라 바이오케미컬스에서 입수)를 함유하는 혼합물 20 ㎕였다. GeneAmp PCR 시스템 9700 (어플라이드 바이오시스템즈에서 입수)을 다음과 같은 프로그램에 따라 진행시켰다: 94 ℃ 5 분; [94 ℃ 45 초, 55 ℃ 45 초, 72 ℃ 90 초] 40 회; 72 ℃, 10 분; 4 ℃로 냉각. 그 결과 얻어지는 PCR 산물은 퀴아퀵 96 PCR 정제 키트(퀴아젠 인코포레이티드에서 입수)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 정제하였다. 정제된 모든 PCR 산물은 ABI 3770 서열결정기(퍼킨 엘머에서 입수)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 프라이머 5'-CGGATAACAATTTCACACAGG-3'로 서열결정하였다.
5. 서열 등급화
전술한 누클레오티드 서열로부터 번역된 펩티드 서열을 ELISA 데이터와 상호관련시켰다. MPL 코팅 웰에서 높은 OD 판독값을 나타내는 클론과 BSA 코팅 웰에서 낮은 OD 판독값을 나타내는 클론을 추가 연구의 후보로 고려하였다. 또한, 다발적으로 나타나는 서열을 추가 연구를 위한 후보로 고려하였다. 이러한 기준에 근거하여 선별한 파지 클론을 ELISA 적정 실험을 통해 특성화하였다. 도 9를 참조하라(선별된 파지 클론의 ELISA 투여량-응답 반응).
실시예 2
펩티드 제조
확립된 단계별 고체상 합성법을 사용하여 모든 펩티드를 제조하였다[Merrifield(1963), J.Am.Chem.Soc. 85:2149; Steward 및 Young(1969), 고체상 펩티드 합성]. 빌딩 블록(building block)으로서 Fmoc 보호된 아미노산을 사용하고, ABI 또는 심포니(Symphony) 펩티드 합성기를 사용하여 펩티드 사슬을 제조하였다. 일반적으로, 펩티드 합성은 C-말단에 유리 카르복실산을 갖는 펩티드를 형성시키기 위한 예비로딩된 Wang 수지를 가지고 시작한다(또는, Rink 수지를 사용하여 C-말단 아미드 작용기를 갖는 펩티드를 형성시킬 수도 있다). 그 다음, 표준 피페리딘 프로토콜에 따라 Fmoc를 제거하였다. 우로늄(예를 들어, HBTU) 또는 카르보디이미드(예를 들어, DCC/HOBt) 화학을 사용하여 결합을 실시하였다. 곁사슬 보호기는 다음과 같다: Glu(O-t-Bu), Asp(O-t-Bu), Ser(t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Asn(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Lys(t-Boc), Trp(t-Boc) 및 Cys(Trt). 모든 펩티딜 수지의 마지막 보호기제거 및 절단은 2.5 % H2O, 5 % 페놀, 2.5 % 트리이소프로필실란 및 2.5 % 티오아니솔 또는 머캅토에탄올을 함유하는 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 RT에서 4 시간 동안 실시하였다. TFA 제거 후, 절단된 펩티드를 저온 무수 에테르로 침전시켰다. 이황화 결합을 함유하는 펩티드의 경우, 고리 산물의 형성은 H2O에 용해된 15 % DMSO(pH 7.5)를 사용하여 미정제 물질 상에 직접 실시하였 다. 모든 미정제 펩티드를 역상 HPLC로 정제하고, 정제된 펩티드의 구조는 ESI-MS 및 아미노산 분석으로 확인하였다.
실시예 3
TMP-Fc 펩티바디 화합물의 제조
펩티드-Fc 융합체(즉, 펩티드의 C-말단에 Fc가 부착된 것)(C-말단 융합체)로서 발현시키기 위한 몇가지 펩티드를 선택하였다. 먼저, 각 TPO-유사 펩티드에 프레임에 맞게 융합된 인체 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 DNA 서열이 다음과 같이 luxPR 프로모터의 조절하에 플라스미드 발현 벡터 pAMG21(ATCC 기탁번호 제 98113 호)내에 위치하도록 배치하였다.
TMP1-Fc를 암호화하는 플라스미드(암젠 인코포레이티드에서 입수한 암젠 균주 #3788)를, 어닐링된 올리고누클레오티드 유래의 짧은 펩티드를 용이하게 클로닝시키기 위한 ApaLI 부위 및 XhoI 부위를 함유하도록 변형시켰다. ApaLI 및 XhoI 제한효소 부위를 첨가하기 위하여 프라이머 2396-69를 사용하였다. 3788 DNA 주형에 대하여 2396-69와 일반적인 3' 프라이머 191-24를 사용하여 익스팬드 롱(Expand Long) 폴리머라제로 PCR을 실시하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:
Figure 112004014255353-pct00009

그 결과 얻어지는 PCR 단편을 NdeI 및 BsrGI로 절단하고 겔 정제한 뒤 삽입체로서 사용하였다. 또한, 균주 #3788 유래의 플라스미드를 NdeI 및 BsrGI으로 절단하고 겔 정제한 뒤 벡터로서 사용하였다. 벡터 및 삽입체를 함께 결합시키고 그 결과 얻어지는 결합 혼합물을 GM221 세포에 일렉트로포레이션시켰다(하기 참조). 단일 콜로니를 채취하여 플라스미드 DNA를 제조하고 DNA 서열결정하였다. 그 결과 얻어지는 하나의 플라스미드 200003180은 정확한 DNA 서열을 가진 것으로 확인되어 TMP-Fc 융합체를 구성하기 위한 벡터로서 사용하였다. 이 벡터는 도 6에 제시하였다.
플라스미드 200003180을 ApaLI 및 XhoI으로 절단하고 벡터로서 사용하였다. 올리고누클레오티드의 각 쌍(도 7 참조)을 어닐링하여 ApaLI 및 XhoI 점착성 말단을 가진 이중 사슬를 형성시켰다. 당해의 융합 단백질을 생성하도록, 이 분자들을 상기 벡터에 결합시켰다. 각각의 상응하는 올리고누클레오티드 쌍에 대한 ApaLI 내지 XhoI 단편을 도 7에 제시하였다.
C-말단 융합체로서 TMP 1-23, 25, 26 및 28을 발현시켰다.
실시예 4
Fc-TMP 펩티바디 화합물의 제조
Fc-펩티드 융합체(즉, 펩티드의 N-말단에 Fc가 부착된 것)(N-말단 융합체)로서 몇가지 펩티드를 발현시켰다. 먼저, Fc-TMP1를 암호화하는 플라스미드(암젠 인코포레이티드에서 입수한 암젠 균주 #3728)를, 어닐링된 올리고누클레오티드 유래의 짧은 펩티드를 용이하게 클로닝시키기 위한 ApaLI 부위 및 XhoI 부위를 함유하도록 변형시켰다. ApaLI 및 XhoI 제한효소 부위를 첨가하기 위하여 프라이머 2396-70을 사용하였다. 3728 DNA 주형에 대하여 2396-70과 일반적인 5' 프라이머 1209-85를 사용하여 익스팬드 롱 폴리머라제로 PCR을 실시하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:
Figure 112004014255353-pct00010

그 결과 얻어지는 PCR 단편을 BsrGI 및 BamHI으로 절단하고 겔 정제한 뒤 삽입체로서 사용하였다. 또한, 균주 #3728 유래의 플라스미드를 BsrGI 및 BamHI으로 절단하고 겔 정제한 뒤 벡터로서 사용하였다. 벡터 및 삽입체를 함께 결합시키고 그 결과 얻어지는 결합 혼합물을 GM221 세포에 일렉트로포레이션시켰 다. 단일 콜로니를 채취하여 플라스미드 DNA를 제조하고 DNA 서열결정하였다. 그 결과 얻어지는 하나의 플라스미드 200003182(도 8 참조)는 정확한 DNA 서열을 가진 것으로 확인되어 Fc-TMP 융합체를 구성하기 위한 벡터로서 사용하였다.
200003182 플라스미드를 ApaLI 및 XhoI으로 절단하고 벡터로서 사용하였다. 이 벡터에 ApaLI 및 XhoI 점착성 말단을 가진 어닐링된 올리고를 결합시켜 당해의 융합체를 제조하였다.
이와 같은 방식으로 N-말단 융합체로서 TMP20, TMP24, TMP27, TMP29 및 TMP30을 수득하였다.
형질전환
전술한 각각의 결합물은 하기 기술되는 숙주 균주 GM221에 일렉트로포레이션시켜 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생성하고 정확한 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합체를 보유하는 성질을 가진 클론을 선별하였다.
pAMG21
발현 플라스미드 pAMG21은 1996년 7월 24일자로 기탁된 ATCC 기탁번호 제 98113 호로서 ATCC로부터 입수용이하다.
GM221(암젠 숙주 균주 #2596)
암젠 숙주 균주 #2596(ATCC 기탁번호 제 98957 호)은 초기 ebg 영역의 온도-민감성 람다 억제인자 cI857s7 및 후기 ebg 영역(68분)의 lacIQ 억제인자를 함유하도록 변형시킨 E.coli K-12 균주(ATCC 기탁번호 제 29425 호)이다. 이 두 억제인자 유전자의 존재는 상기 숙주를 다양한 발현 시스템과 함께 사용할 수 있도록 해주지만 이 억제인자들이 luxPR 발현과 무관하다. 이에 반해, 형질전환되지 않은 숙주는 항생제 내성이 없다.
cI857s7 유전자의 리보솜 결합 부위는 향상된 RBS를 포함하도록 변형시켰다. 그 다음, 중재성 ebg 서열이 결실된 진뱅크 기탁번호 M64441Gb_Ba에서 번호매겨진 누클레오티드 위치 1170 내지 1411 사이의 ebg 오페론에 삽입시켰다.
이 구성물을, RBS #4를 향상시킨 MMebg-cI857s7이라고 명명된 재조합 파지를 사용하여 F'tet/393 내 염색체로 운반하였다. 재조합 및 분해 후 전술한 염색체 삽입물만이 세포에서 유지되었다. 이를 F'tet/GM101이라 재명명하였다.
그런 다음 중재성 ebg 서열이 결실된 진뱅크 기탁번호 M64441Gb_Ba에서 번호매겨진 누클레오티드 위치 2493 및 2937 사이의 ebg 오페론으로 lacIQ 구성물을 운 반하여 F'tet/GM101을 변형시켰다. 이 구성물을 AGebg-LacIQ#5라고 하는 재조합 파지를 사용하여 F'tet/GM101의 염색체로 운반하였다. 재조합 및 분해 후 전술한 염색체 삽입체만이 세포내에 유지되었다. 이를 F'tet/GM221이라 재명명하였다. 이 균주로부터 25 ㎍/ml의 LB내 농도로 아크리딘 오렌지를 사용하여 F'tet 에피좀을 큐어링(curing)시켰다. 큐어링된 균주는 테트라사이클린 감수성으로 확인되었고 GM221로 보관하였다.
발현
각 융합 단백질을 발현하는 GM221 배양물을 루리아 브로스 배지에서 37 ℃하에 증식시켰다. luxPR 프로모터로부터 유전자 산물의 발현 유도는 배양 배지에 합성 자가유도인자 N-(3-옥소헥사노일)-DL-호모세린 락톤을 최종 농도가 20 ng/ml가 되게 첨가하고 37 ℃에서 추가 3시간 동안 배양한 후 실시하였다. 3 시간 후, 박테리아 배양액을 봉입체의 존재에 대하여 현미경 조사하고, 그 다음 원심분리하여 수거하였다. 유도된 배양액에서는 광굴정성 봉입체가 관찰되었고, 이는 융합 단백질이 E.coli에서 불용성 분획으로 생산될 가능성이 매우 크다는 것을 시사하는 것이다. 세포 펠릿을 10 % β-머캅토에탄올을 함유하는 램리 샘플 완충용액에 재현탁시켜 직접 용균시킨 뒤 SDS-PAGE로 분석하였다. 각 단백질마다 정확한 크기(약 30 kDa)의 진한 쿠마시 염색 밴드가 관찰되었다.

실시예 5
펩티바디 화합물의 정제
고압 균질화(14,000 PSI에서 2 회)를 통해 세포를 물(1/10)에서 파쇄한 뒤, 봉입체를 원심분리(J-6B에서 4200 RPM으로 1시간)하여 수거하였다. 봉입체를 6 M 구아니딘, 50 mM 트리스, 8 mM DTT, pH 8.7에 1/10 비율로 1 시간 동안 용해시켰다. 용해된 혼합물을 2 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 nM 아르기닌, 3 mM 시스테인(pH 8.5)에 20 배로 희석시켰다. 이 혼합물을 저온에서 하룻밤동안 교반하였다. 그 다음 한외여과하여 약 10 배로 농축시켰다. 그 다음, 10 mM 트리스, 1.5 M 우레아(pH 9)로 3 배 희석시켰다. 그 다음, 이 혼합물의 pH를 아세트산으로 pH 5로 조정하였다. 침전물은 원심분리하여 제거하고 상청액은 20 mM NaAc, 100 mM NaCl(pH 5)로 평형화시킨 SP-세파로스 패스트 플로우(Fast Flow) 컬럼 상에 로딩하였다(10mg/ml 단백질 로딩, 실온). 이 단백질을 100 mM NaCl 내지 500 mM NaCl 범위의 동일 완충용액으로 20 배 컬럼 부피 구배를 사용하여 용출시켰다. 컬럼으로부터의 풀을 3 배 희석시키고, 20 mM NaAc, 150 mM NaCl(pH 5)내에 SP-세파로스 HP 컬럼에 로딩시켰다(10 mg/ml 단백질 로딩, 실온). 이 단백질을 150 mM NaCl 내지 400 mM NaCl 범위의 동일 완충용액으로 20 배 컬럼 부피 구배를 사용하여 용출시켰다. 피크를 수집하여 여과하였다.

실시예 6
펩티드 결합 친화력 연구
몇가지 TMP 펩티드(TMP1 내지 TMP23)에 대한 결합 친화력을 측정하기 위하여 실온에서 비아코어 3000 을 사용하여 실험을 실시하였다. Hu-mpl을 아민 결합 절차(NHS/EDC로 활성화시킨 뒤 에탄올아민으로 차단)를 사용하여 센서 칩(CM5) 표면 상에 고정화시켰다. 0.78 nM 내지 100 nM의 TMP 펩티드를 hu-mpl 표면 상에 주입하였다. 비아코어 진행 완충용액으로는 0.005 % 계면활성제 P20을 첨가한 PBS를 사용하였다. 대조군으로 블랭크 표면 상에 샘플을 주입하였다. 실험 데이터는 BIAEVALUATION 3.1 소프트웨어 팩키지를 사용하여 분석하였다.
전술한 바와 같이, 펩티드를 선별한 파지 환경을 보다 잘 모방하고, 바람직한 18 개의 아미노산 펩티드(TMP2 내지 TMP30)의 하전성 아미노 말단 및 카르복시 말단을 수용체로부터 은닉시키기 위하여, 각 펩티드의 카르복시 말단 및 아미노 말단 각각에 2 개의 아미노산 "캡", 즉 아미노 말단에 글루타민-시스테인(QC)과 카르복시 말단에 히스타딘-세린(HS)을 첨가하여 각 펩티드의 길이를 22 개의 아미노산으로 만들었다. 펩티드 길이에 따라 펩티드 친화력이 증가하는 것으로 알려져 있기 때문에, 기준이 되는 생물활성의 14 개의 아미노산 펩티드 서열(SEQ ID NO: 1)도 역시 총 22 개의 아미노산으로 증가시켰다. 하지만, 각 펩티드의 생물활성 영역은 그대로 유지되며 하기에 진하게 표시하였다.
Figure 112004014255353-pct00011

실시예 7
펩티드 생물활성 연구
세포-기저 검정을 사용하여 펩티드 TMP1 내지 TMP23의 생물활성을 측정하였다.
마우스 32D 세포 증식 검정은 인체 mpl 수용체로 형질감염시킨 마우스 32D 세포의 사용을 수반한다. 그 결과는 TMP1에 대한 상대값으로서 하기에 기재하였다.
CD61 세포 검정은 펩티드 TMP1 내지 TMP23의 존재하에 수일 동안 배양시킨 원시 인체 CD34+ 세포의 사용을 수반한다. 그런 다음 이 세포를 분류하여 세포 표면 상에 거핵세포 특이 마커(CD61)를 발현하는 세포 비율을 측정하였다. 활성 화합물은 상기 혈소판 전구체 세포의 출현을 투여량-의존 방식으로 자극한 반면, 적혈구 전구체(CD36+) 및 호중구 전구체(CD15+)의 마커는 기준값으로 유지되었다. 상이한 3가지 농도의 평균값을 나타내는 CD61 세포 검정의 정성적 결과는 다음과 같다.
Figure 112004014255353-pct00012

실시예 8
펩티바디 결합 연구
몇가지 TMP 펩티바디의 hu-MPL에 대한 결합 활성을 비아코어 상에서의 직접 결합 분석을 통해 시험하였다. 비아코어 2000(비아코어 인코포레이티드에서 입수)을 25 ℃에서 사용하여 실험을 실시했다. 전개 완충용액으로는 0.005 % 계면활성제 P20을 함유한 PBS를 사용하였다. 재조합 G 단백질(피어스 21193ZZ)을 표준 아민 결합 절차(NHS/EDC로 활성화한 후 에탄올아민으로 차단)에 따라 CM5 칩 상에 고정화시켜 약 400 RU 정도의 TMP 펩티바디를 포획하였다. 재조합 hu-MPL(Lot 27315-53)은 샘플 완충용액(0.005 % 계면활성제 P20과 100 ㎍/ml BSA를 함유한 PBS)으로 1μM 내지 0.15 nM 농도로 연속 희석한 뒤, 포획된 펩티바디 표면상에 50 ㎕/분 농도로 3 분 동안 주입하였다. rhu-MPL 샘플은 또한 임의의 비특이적 결합 배경을 감소시키기 위하여 블랭크 G 단백질 표면 상에도 주입하였다. G 단백질 표면을 100 ㎕의 이뮤노퓨어(ImmunoPure) IgG 용출 완충용액(피어스 21009ZZ, pH 2)과 100 ㎕의 8 mM 글리신(pH 1.5)을 연속 주입하고 2 회 순환하는 중간에 50 ㎕/분의 1 M NaCl을 주입하여 재생시켰다. rhu-MPL에 대한 펩티바디의 결합 친화력(KD)은 BIAevaluation 3.1(비아코어 인코포레이티드에서 입수)을 사용하여 데이터의 비선형 회귀 분석으로 측정했다. 그 결과를 다음과 같이 요약하였다:
Figure 112004014255353-pct00013

실시예 9
펩티바디 활성 검정
원시 인체 CD34+세포를 몇가지 TMP-Fc 융합 단백질의 존재 하에 수일 동안 배양하였다. 세포 표면 상에 거핵세포 특이 마커(CD61)를 발현하는 세포 비율 측정을 위해 이 세포를 분류하였다. 활성 화합물은 상기 혈소판 전구체 세포의 발현을 투여량-의존 방식으로 자극하는 반면, 적혈구 전구체 마커(CD36+)(도시안됨) 및 호중구 전구체(CD15+)(도시안됨)는 기준값으로 유지되었다. 도 10, 도 11 및 도 12를 참조하라(CD61 세포 검정).
실시예 10
생체내 활성
약 10 내지 12주 가량된 정상 BDF1 암컷 마우스를 생체내 활성 연구에 사용하였다.
마우스에게 환괴 치료를 위해 피하 주사하였다. 피하 주사는 0.2 ml 투여량을 투여하였다. 화합물을 0.1 % BSA 함유 PBS로 희석했다. 모든 실험에는 이 희석제로만 처리한 "담체"라고 표지된 하나의 대조군을 포함시켰다.

그룹 당 10 마리의 마우스는 0 일째 처리하고, 그룹 당 총 20 마리 마우스는 4 일 간격으로 처리하였다. 각 시점마다 5 마리 마우스에게서 혈액을 채취하고, 1 주에 최소 3 회 채혈하였다. 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 안와강을 천공하여 총 140 내지 160 ㎕의 혈액을 채취하였다. 혈액 분석기 작동 소프트웨어(Technicon H1E)를 사용하여 마우스 혈액을 계수하였다. 측정 파라미터는 백혈구, 적혈구, 적혈구용적률, 헤모글로빈, 혈소판, 호중구이다. 도 13과 도 14를 참조하라.
이상 본 발명을 상세히 설명하였으며, 당업자에게는 전술한 본 발명의 범위와 취지를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형과 수정을 실시할 수 있음이 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> Peptides and Related Compounds Having Thrombopoietic Activity <130> A-750A PCT <140> PCT/US 02/32552 <141> 2002-10-11 <150> 10/269,806 <151> 2002-10-10 <150> 60/328,666 <151> 2001-10-11 <160> 199 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 1 Gln Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Glu <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 2 Gly Ala Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Glu Trp Val Arg 1 5 10 15 Val Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 3 Arg Asp Leu Asp Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Pro Leu Pro Ser 1 5 10 15 Val Gln <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 4 Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 5 Ala Arg Gln Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Phe Trp Val Arg 1 5 10 15 Met Gly <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 6 Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gln <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 7 Met Ala Arg Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Arg Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Met Met <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 8 Trp Met Pro Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Phe His Gly Arg 1 5 10 15 Gly Gln <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 9 His Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Val Ala Leu Arg 1 5 10 15 Met Val <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 10 Gln Leu Gly His Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ser Trp Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Met <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 11 Glu Leu Arg Gln Gly Pro Thr Leu His Glu Trp Leu Gln His Leu Ala 1 5 10 15 Ser Lys <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 12 Val Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Gln Arg Leu 1 5 10 15 Asn Pro <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 13 Trp Ser Arg Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Ala 1 5 10 15 Val Gly <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 14 Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Leu Trp Arg Arg 1 5 10 15 Cys Ala <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 15 Arg Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Ala Gln Arg Arg 1 5 10 15 Gly Phe <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 16 Arg Phe Ala Glu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Glu Gln Arg Lys 1 5 10 15 Leu Val <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 17 Asp Arg Phe Gln Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Ala Ile Arg 1 5 10 15 Ser Val <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 18 Ala Gly Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Asn Met Arg Val 1 5 10 15 Trp Gln <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 19 Ala Leu Gln Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Gly Trp Gly Gln 1 5 10 15 Trp Gly <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 20 Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln <210> 21 <211> 18 <212> PRT 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<400> 26 Cys Arg Gly Gly Gly Pro Thr Leu His Gln Trp Leu Ser Cys Phe Arg 1 5 10 15 Trp Gln <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 27 Cys Arg Asp Gly Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Cys Leu Gln 1 5 10 15 Gln Lys <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 28 Glu Leu Arg Ser Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Val Trp Arg Leu 1 5 10 15 Ala Gln <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 29 Gly Cys Arg Ser Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Cys Arg Glu 1 5 10 15 Val Gln <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 30 Thr Cys Glu Gln Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Leu Cys Arg Gln 1 5 10 15 Gly Arg <210> 31 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <400> 31 atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 96 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 144 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa 684 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 32 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 32 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 33 <211> 835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (60)..(791) <400> 33 tagtcgatta atcgatttga ttctagattt gttttaacta attaaaggag gaataacat 59 atg ggt gca cag aaa gcg gcc gca aaa aaa ctc gag ggt gga ggc ggt 107 Met Gly Ala Gln Lys Ala Ala Ala Lys Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 ggg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgc cca gca cct gaa ctc ctg 155 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 20 25 30 ggg gga ccg tca gtt ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 203 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 35 40 45 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 251 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 50 55 60 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 299 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 65 70 75 80 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 347 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 85 90 95 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 395 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 100 105 110 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 443 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 115 120 125 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 491 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 130 135 140 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 539 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 145 150 155 160 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 587 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 165 170 175 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 635 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 180 185 190 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 683 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 195 200 205 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 731 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 210 215 220 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 779 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 225 230 235 240 tct ccg ggt aaa taatggatcc gcggaaagaa gaagaagaag aagaaagccc gaaa 835 Ser Pro Gly Lys <210> 34 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 34 Met Gly Ala Gln Lys Ala Ala Ala Lys Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 20 25 30 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 35 40 45 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 50 55 60 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 65 70 75 80 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 85 90 95 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 100 105 110 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 115 120 125 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 130 135 140 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 145 150 155 160 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 165 170 175 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 180 185 190 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 195 200 205 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 210 215 220 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 225 230 235 240 Ser Pro Gly Lys <210> 35 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> 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Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala 1 5 10 15 Cys Ala Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys 50 55 60 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 39 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 39 gt gca caa ggt gga gca cgt gaa gga cca act ctt cgt caa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Gly Ala Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 gaa tgg gtt cgt gtt ggt cat tct ctc gag 77 Glu Trp Val Arg Val Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 40 Ala Gln Gly Gly Ala Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Glu 1 5 10 15 Trp Val Arg Val Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 41 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 41 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Thr 1 5 10 15 Cys Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys 35 40 45 Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 42 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 42 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys 50 55 60 Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 43 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 43 gt gca caa gga cgt gat ctt gat ggt cca act ctt cgt caa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Arg Asp Leu Asp Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 cca ctt cca tct gtt caa cat tct ctc gag 77 Pro Leu Pro Ser Val Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 44 Ala Gln Gly Arg Asp Leu Asp Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Pro 1 5 10 15 Leu Pro Ser Val Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 45 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 45 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala 1 5 10 15 Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Ala 35 40 45 Ala Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys 65 70 <210> 46 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 46 Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Thr Cys Thr Ala Ala 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Gly 50 55 60 Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 47 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 47 gt gca caa gga gct tta cgt gat ggt cca act ctt aaa caa tgg tta 47 Ala Gln Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu 1 5 10 15 gaa tat cgt cgt caa gct cat tca ctc gag 77 Glu Tyr Arg Arg Gln Ala His Ser Leu Glu 20 25 <210> 48 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 48 Ala Gln Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu 1 5 10 15 Tyr Arg Arg Gln Ala His Ser Leu Glu 20 25 <210> 49 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 49 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr 1 5 10 15 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr 35 40 45 Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys 65 70 <210> 50 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 50 Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Ala Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly 50 55 60 Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 51 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 51 gt gca caa gga gca cgt caa gaa gga cca act ctt aaa gaa tgg tta 47 Ala Gln Gly Ala Arg Gln Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu 1 5 10 15 ttt tgg gtt cgt atg ggt cat tca ctc gag 77 Phe Trp Val Arg Met Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 52 Ala Gln Gly Ala Arg Gln Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Phe 1 5 10 15 Trp Val Arg Met Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 53 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 53 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr 1 5 10 15 Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr 20 25 30 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 54 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 54 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly 1 5 10 15 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr 50 55 60 Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 55 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 55 gt gca caa gga gaa gct tta tta ggt cca act tta cgt gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct tgg cgt cgt gca caa cat tct ctc gag 77 Ala Trp Arg Arg Ala Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 56 Ala Gln Gly Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala 1 5 10 15 Trp Arg Arg Ala Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 57 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 57 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala 1 5 10 15 Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly 35 40 45 Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 58 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 58 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala 1 5 10 15 Thr Ala Cys Gly Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala 50 55 60 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 59 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 59 gt gca caa ggt atg gca cgt gat ggt cca act ctt cgt gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Met Ala Arg Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 cgt act tat cgt atg atg cat tct ctc gag 77 Arg Thr Tyr Arg Met Met His Ser Leu Glu 20 25 <210> 60 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 60 Ala Gln Gly Met Ala Arg Asp 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Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 63 gt gca caa gga tgg atg cca gaa gga cca aca tta aaa caa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Trp Met Pro Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu 1 5 10 15 ttt cat ggt cgt ggt caa cat tct ctc gag 77 Phe His Gly Arg Gly Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 64 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 64 Ala Gln Gly Trp Met Pro Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Phe 1 5 10 15 His Gly Arg Gly Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 65 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 65 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr 1 5 10 15 Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr 20 25 30 Thr Ala Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Thr 35 40 45 Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 66 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 66 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Thr Ala Thr 50 55 60 Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 67 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 67 gt gca caa gga cat att cgt gaa ggt cca aca tta cgt caa tgg ctt 47 Ala Gln Gly His Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 gtt gct ctt cgt atg gtt cat tct ctc gag 77 Val Ala Leu Arg Met Val His Ser Leu Glu 20 25 <210> 68 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 68 Ala Gln Gly His Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Arg Met Val His Ser Leu Glu 20 25 <210> 69 <211> 71 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tta gga cat ggt cca act ctt cgt caa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Gln Leu Gly His Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 tct tgg tat cgt ggt atg cat tct ctc gag 77 Ser Trp Tyr Arg Gly Met His Ser Leu Glu 20 25 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 72 Ala Gln Gly Gln Leu Gly His Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ser 1 5 10 15 Trp Tyr Arg Gly Met His Ser Leu Glu 20 25 <210> 73 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 73 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ala 1 5 10 15 Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala 35 40 45 Ala Cys Ala Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 74 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 74 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys 1 5 10 15 Thr Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Thr 50 55 60 Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 75 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 75 gt gca caa gga gaa tta cgt caa gga cca act ctt cat gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Glu Leu Arg Gln Gly Pro Thr Leu His Glu Trp Leu 1 5 10 15 caa cat tta gca agc aaa cat tct ctc gag 77 Gln His Leu Ala Ser Lys His Ser Leu Glu 20 25 <210> 76 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 76 Ala Gln Gly Glu Leu Arg Gln Gly Pro Thr Leu His Glu Trp Leu Gln 1 5 10 15 His Leu Ala Ser Lys His Ser Leu Glu 20 25 <210> 77 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 77 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr 1 5 10 15 Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr 20 25 30 Thr Ala Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 78 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 78 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr 1 5 10 15 Thr Ala Ala Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Ala Ala 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Thr Ala Cys Cys Thr Ala 50 55 60 Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 79 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 79 gt gca caa gga gta ggt att gaa ggt cca aca tta cgt caa tgg tta 47 Ala Gln Gly Val Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 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Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys 50 55 60 Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 83 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 83 gt gca caa gga tgg tca cgt gat ggt cca aca ctt cgt gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Trp Ser Arg Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct tgg cgt gct gtt gga cat agt ctc gag 77 Ala Trp Arg Ala Val Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 84 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 84 Ala Gln Gly Trp Ser Arg Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala 1 5 10 15 Trp Arg Ala Val Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 85 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 85 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr 1 5 10 15 Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 88 Ala Gln Gly Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Leu 1 5 10 15 Trp Arg Arg Cys Ala His Ser Leu Glu 20 25 <210> 89 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 89 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr Thr 1 5 10 15 Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Cys 35 40 45 Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Ala Gly Thr Cys 65 70 <210> 90 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 90 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys 1 5 10 15 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys 50 55 60 Gly Ala Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 91 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 91 gt gca caa ggt cgt att cgt gaa ggt cca act ctt aaa gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Arg Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct caa cgt cgt ggt ttt cat agt ctc gag 77 Ala Gln Arg Arg Gly Phe His Ser Leu Glu 20 25 <210> 92 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 92 Ala Gln Gly Arg Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Ala 1 5 10 15 Gln Arg Arg Gly Phe His Ser Leu Glu 20 25 <210> 93 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 93 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Thr Thr Thr Cys 1 5 10 15 Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys 20 25 30 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Ala 35 40 45 Ala Cys Ala Ala Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Ala Gly Thr Cys 65 70 <210> 94 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 94 Thr Cys Gly Ala Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala 1 5 10 15 Gly Thr Thr Thr Ala Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala Ala 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys 50 55 60 Gly Ala Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 95 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 95 gt gca caa ggt cgt ttc gct gaa ggt cca aca ctt cgt gaa tgg tta 47 Ala Gln Gly Arg Phe Ala Glu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gaa caa cgt aaa ctt gtt cat agt ctc gag 77 Glu Gln Arg Lys Leu Val His Ser Leu Glu 20 25 <210> 96 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 96 Ala Gln Gly Arg Phe Ala Glu 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Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 99 gt gca caa ggt gat cgt ttc caa ggt cca act ctt cgt gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Asp Arg Phe Gln Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct gca atc cgt agc gta cat agt ctc gag 77 Ala Ala Ile Arg Ser Val His Ser Leu Glu 20 25 <210> 100 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 100 Ala Gln Gly Asp Arg Phe Gln Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Arg Ser Val His Ser Leu Glu 20 25 <210> 101 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 101 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr 1 5 10 15 Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Ala Ala 35 40 45 Thr Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 102 <211> 71 <212> PRT 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caa gga gct tta caa gaa gga cca aca tta cgt caa tgg tta 47 Ala Gln Gly Ala Leu Gln Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 gga tgg ggt caa tgg gga cac tct ctc gag 77 Gly Trp Gly Gln Trp Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 108 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 108 Ala Gln Gly Ala Leu Gln Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Gly 1 5 10 15 Trp Gly Gln Trp Gly His Ser Leu Glu 20 25 <210> 109 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 109 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr 35 40 45 Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala 50 55 60 Cys Ala Thr Ala Gly Thr Cys 65 70 <210> 110 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 110 Thr Cys Gly Ala Gly 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Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr 50 55 60 Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys 65 70 <210> 122 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 122 Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys 1 5 10 15 Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys 35 40 45 Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ala Cys 50 55 60 Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 123 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 123 gt gca caa gga tgt caa tta ggt ggt ccg act ctt cgt gaa tgg ctt 47 Ala Gln Gly Cys Gln Leu Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct tgt cgt ctt ggt gct cat tca ctc gag 77 Ala Cys Arg Leu 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Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 143 gt gca caa gga gga tgt aga tct ggt cca aca ctt cgt gaa tgg tta 47 Ala Gln Gly Gly Cys Arg Ser Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 gct tgt aga gag gtt caa cac tct ctc gag 77 Ala Cys Arg Glu Val Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 144 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 144 Ala Gln Gly Gly Cys Arg Ser Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala 1 5 10 15 Cys Arg Glu Val Gln His Ser Leu Glu 20 25 <210> 145 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 145 Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys 1 5 10 15 Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys 20 25 30 Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr 35 40 45 Ala Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala 50 55 60 Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys 65 70 <210> 146 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 146 Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys 1 5 10 15 Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Gly Thr Ala Gly 20 25 30 Cys Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Gly Cys Ala Thr Gly 50 55 60 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly 65 70 <210> 147 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 147 gt gca caa ggt aca tgc gaa caa gga cca act cta aga caa tgg cta 47 Ala Gln Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu 1 5 10 15 cta tgt aga caa gga aga cac tca ctc gag 77 Leu Cys Arg Gln Gly Arg His Ser Leu Glu 20 25 <210> 148 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 148 Ala Gln Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Leu 1 5 10 15 Cys Arg Gln Gly Arg His Ser Leu Glu 20 25 <210> 149 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (3)..(77) <400> 149 gt gca cag ggt tgg tgt aag gag ggt cct act ctg cgt gag tgg ctg 47 Ala Gln Gly Trp Cys Lys Glu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu 1 5 10 15 cgg tgg ggt ttt ctg tgt cat tct ctc gag 77 Arg Trp Gly Phe Leu Cys His Ser Leu Glu 20 25 <210> 150 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 150 Ala Gln Gly Trp Cys Lys Glu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Arg 1 5 10 15 Trp Gly Phe Leu Cys His Ser Leu Glu 20 25 <210> 151 <211> 837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> CDS <222> (57)..(785) <400> 151 tcgattaatc gatttgattc tagatttgtt ttaactaatt aaaggaggaa taacat atg 59 Met 1 gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg ggg 107 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 5 10 15 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 155 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 203 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 251 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 65 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 299 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 70 75 80 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 347 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 395 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 443 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 491 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 145 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 539 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 150 155 160 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 587 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 635 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 683 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 731 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 225 ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt gca cag aaa gcg gcc gca aaa aaa 779 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Ala Ala Ala Lys Lys 230 235 240 ctc gag taatggatcc gcggaaagaa gaagaagaag aagaaagccc gaaaggaagc tg 837 Leu Glu <210> 152 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 152 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Lys Ala Ala Ala Lys 225 230 235 240 Lys Leu Glu <210> 153 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> At Position 22, PEG linker <400> 153 His Ile Arg Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Val Ala Leu Arg 1 5 10 15 Met Val Gly Gly Gly Pro Glu Gly Gly Gly Gly His Ile Arg Glu Gly 20 25 30 Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Val Ala Leu Arg Met Val 35 40 45 <210> 154 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At Position 1, Fc at N-terminus <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> At position 43, Fc on C-terminus <400> 154 Thr Cys Glu Gln Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Leu Cys Arg Gln 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Thr 20 25 30 Leu Arg Gln Trp Leu Leu Cys Arg Gln Gly Arg 35 40 <210> 155 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 155 Gln Leu Gly His Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ser Trp Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Met Gly Pro Asn Gly Glu Leu Arg Ser Gly Pro Thr Leu Lys Glu 20 25 30 Trp Leu Val Trp Arg Leu Ala Gln 35 40 <210> 156 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> At position 19, Fc at C-terminus <400> 156 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys <210> 157 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 157 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys 1 5 10 15 Gln Trp Leu Leu Trp Arg Arg Cys Ala 20 25 <210> 158 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, PEG group attached <400> 158 Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg 1 5 10 15 Met Gln <210> 159 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 159 Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu 20 25 30 Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln 35 40 45 <210> 160 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (76)..(76) <223> At position 76, Fc at C-terminus <400> 160 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr 20 25 30 Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Ala Gly 35 40 45 Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys 50 55 60 Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 65 70 75 <210> 161 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> At position 44, PEG group at C-terminus <400> 161 Val Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Gln Arg Leu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Val Gly Ile Glu Gly Pro Thr 20 25 30 Leu Arg Gln Trp Leu Ala Gln Arg Leu Asn Pro 35 40 <210> 162 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 162 Glu Leu Arg Ser Gly Pro Thr Leu Lys Glu Trp Leu Val Trp Arg Leu 1 5 10 15 Ala Gln Gly Gly Gly Gly Glu Leu Arg Ser Gly Pro Thr Leu Lys Glu 20 25 30 Trp Leu Val Trp Arg Leu Ala Gln 35 40 <210> 163 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> At position 44, Fc at C-terminus <400> 163 Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg 1 5 10 15 Gln Ala Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr 20 25 30 Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg Gln Ala 35 40 <210> 164 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 164 Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg 1 5 10 15 Gln Ala Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr 20 25 30 Arg Arg Gln Ala 35 <210> 165 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 165 Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gln Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp 20 25 30 Arg Arg Ala Gln 35 <210> 166 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 166 Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Leu Trp Arg Arg 1 5 10 15 Cys Ala Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Leu Trp 20 25 30 Arg Arg Cys Ala 35 <210> 167 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 167 Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys 20 25 30 Leu Gly Leu Gln 35 <210> 168 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 168 Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg 1 5 10 15 Met Gln Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys 20 25 30 Arg Arg Met Gln 35 <210> 169 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 169 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 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41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 173 Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln 35 40 <210> 174 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 174 Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg 1 5 10 15 Met Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg 20 25 30 Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg Met Gln 35 40 <210> 175 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <400> 175 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys 35 40 <210> 176 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 176 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Glu Tyr Arg Arg Gln Ala 20 <210> 177 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 177 Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp 1 5 10 15 Leu Ala Trp Arg Arg Ala Gln 20 <210> 178 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 178 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Leu Trp Arg Arg Cys Ala 20 <210> 179 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 179 Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln 20 <210> 180 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 180 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp 1 5 10 15 Leu Gln Cys Arg Arg Met Gln 20 <210> 181 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 181 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys 20 <210> 182 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 182 Gly Gly Gly Gly Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Glu Tyr Arg Arg Gln Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Leu Arg Asp 20 25 30 Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg Gln Ala 35 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Gly Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu 20 25 30 Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln 35 40 45 <210> 186 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 186 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp 1 5 10 15 Leu Gln Cys Arg Arg Met Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg Met Gln 35 40 45 <210> 187 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> At position 1, Fc at N-terminus <400> 187 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp 1 5 10 15 Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly 20 25 30 Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys 35 40 45 <210> 188 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 188 Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg 1 5 10 15 Gln Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg Gln Ala Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 189 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 189 Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg 20 25 30 Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 190 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 190 Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Leu Trp Arg Arg 1 5 10 15 Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Val Pro Gln Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Leu Trp Arg Arg Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 191 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 191 Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 192 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 192 Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg 1 5 10 15 Met Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg 20 25 30 Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg Met Gln Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 193 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> At position 47, Fc at C-terminus <400> 193 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys 20 25 30 Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 <210> 194 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 194 Ala Leu Arg Asp Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Arg 1 5 10 15 Gln Ala Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 195 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 195 Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 196 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 196 Glu Ala Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Ala Trp Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 197 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 197 Tyr Cys Asp Glu Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Val Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 198 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 198 Cys Ser Ser Gly Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Gln Cys Arg Arg 1 5 10 15 Met Gln Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 199 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Peptide Sequence <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> At position 24, Fc at C-terminus <400> 199 Cys Ser Trp Gly Gly Pro Thr Leu Lys Gln Trp Leu Gln Cys Val Arg 1 5 10 15 Ala Lys Gly Gly Gly Gly Gly 20

Claims (25)

  1. 서열 Q-G-I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A-L-E 보다 mpl 수용체에 대해 우수한 결합 친화력을 갖는, 다음 표에서 선택한 서열로 구성되며 mpl 수용체에 결합하는 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 이의 염.
    Figure 112010020606616-pct00049
  2. 서열 Q-G-I-E-G-P-T-L-R-Q-W-L-A-A-R-A-L-E 보다 우수한 생물활성을 갖는, 다음 표에서 선택한 서열로 구성되며 mpl 수용체에 결합하는 화합물 및 생리학적으로 용인가능한 이의 염.
    Figure 112010020606616-pct00050
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 하기 표에 기재되어 있는 SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 내지 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 27 내지 SEQ ID NO: 30 중에서 선택한 서열로 구성되며 mpl 수용체에 결합하는 화합물.
    Figure 112010020606616-pct00051
  7. 제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 고리형임을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 D 형태임을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 아미노산 잔기가 D 형태임을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물의 이량체 또는 다량체.
  11. 삭제
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