JP2005523682A - 血小板新生活性を有するペプチド及び関連化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
を有する組成物を提供する。
本明細書中で使用される用語は、特定の場合に他の方法で限定されない限り以下のように定義される。
概説:本発明は、mpl受容体に結合及び/またはmpl受容体の生物活性を調節し得る化合物を提供する。より具体的には、本発明は内因性トロンボポエチン(TPO)の活性を媒介する同一受容体であるmpl受容体に結合及び/または前記受容体を介して、すなわちmpl受容体を活性化して貫膜シグナルをトリガーし得る化合物群を提供する。すなわち、本発明の化合物は血小板新生活性(すなわち、インビボ及びインビトロで血小板の産生を刺激する能力)及び/または巨核球形成活性(すなわち、インビボ及びインビトロで巨核球を含めた血小板前駆体の産生を刺激する能力)を有する。
非ペプチジル結合、例えば−CH2−カルバメート結合[−CH2−OC(O)NR−]、ホスホネート結合、−CH2−スルホンアミド[−CH2−S(O)2NR−]結合、尿素[−NHC(O)NH−]結合、−CH2−第2級アミン結合またはアルキル化ペプチジル結合[−C(O)NR6−](ここで、R6は低級アルキルである)により置換された1つ以上のペプチジル[−C(O)NR−]結合;
N末端が−NRR1−基、−NRC(O)R基、−NRC(O)OR基、−NRS(O)2R基、−NHC(O)NHR基(ここで、R及びR1の両方が水素でないという条件でR及びR1は水素または低級アルキルである)、スクシンイミド基、ベンジルオキシカルボニル−NH−(CBZ−NH−)基、またはフェニル環上に低級アルキル、低級アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される1〜3個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル−NH−基に誘導体化されているペプチド;及び
遊離C末端が−C(O)R2{式中、R2は低級アルコキシ及び−NR3R4(ここでR3及びR4は独立して水素及び低級アルキルからなる群から選択される)からなる群から選択される}に誘導体化されているペプチド。ここで、「低級」は炭素数1〜6の基を意味する。
新規ペプチドに加えて、本発明は、本発明の1つ以上のペプチドが相互に、リンカー(LN)に及び/またはベヒクル(V)に結合または他の方法で連結されている新規ペプチド化合物を提供する。TMPはタンデムに(すなわち、順次N末端−C末端に)またはパラレルに(すなわち、N末端−N末端またはC末端−C末端)連結され得る。TMPを他のTMPまたは同一TMPに対して場合によりリンカーを介して結合させてもよい。また、TMPを他のTMPまたは同一TMPに対して場合によりリンカーを介して、場合によりベヒクルを介して結合させてもよい。本発明のペプチド−リンカー−ベヒクル化合物は下記式により表され得る。
で示される化合物及びそのマルチマーが例示される。本発明の好ましいペプチド−ベヒクル分子及びペプチド−リンカー−ベヒクル分子の式を図2に示す。
別の実施態様において、本発明は別のTMPペプチドに“リンカー”基(LN1、LN2等)を介して共有結合または他の方法で連結もしくは結合している1つ以上のTMPを提供する。リンカー基は任意である。リンカー基を存在させるとき、リンカー基は主にスペーサーとして機能するのでその化学構造は重要でない。リンカーは、最終化合物の生物活性を妨害せず且つ最終化合物の免疫原性が有意に増加しないように選択されなければならない。リンカーは、好ましくはペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。よって、好ましい実施態様では、リンカーはペプチド結合により連結された1〜30個のアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は20個の天然アミノ酸から選択される。前記アミノ酸の幾つかは当業者が理解しているようにグリコシル化され得る。より好ましい実施態様では、1〜20個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。より好ましくは、リンカーは大部分が立体障害でないアミノ酸、例えばグリシン及びアラニンで構成される。よって、好ましいリンカーはポリグリシン(特に、(Gly)4、(Gly)5)、ポリ(Gly−Ala)及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は
i)TMP1−LN1−TMP2−LN2
ii)LN1−TMP1−LN2−TMP2
iii)LN1−TMP1−LN2−TMP2
iv)TMP1−LN1−TMP1−LN1−TMP1−LN1
v)LN1−TMP1−LN2−TMP2−LN3−TMP3−LN4−TMP4
(ここで、LN1〜LN4はそれぞれ独立してリンカーである)
が含まれる。
更に別の実施態様において、本発明のペプチドまたはペプチド化合物はベヒクル(V)に連結または結合され得る。ベヒクルは包括的には治療用タンパク質の分解を防止し及び/または半減期を延長、毒性を低減、免疫原性を低下または生物活性を上昇させる分子を指す。ベヒクル(V)はペプチドにN末端、C末端、ペプチド骨格または側鎖を介して結合され得る。
本発明の化合物は各種方法により製造され得る。多くの化合物はペプチドであるかまたはペプチドを含むので、ペプチドの合成方法が特に適切である。固相合成法が使用され得る。適当な技術が当業界で公知であり、Merrifield,Chem.Polypeptides,p.335−61,Katsoyannis及びPanayotis編(1973);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149(1963);Davisら,Biochem.Intl.,10:394−414(1985);Stewart及びYoung,Solid Phase Peptide Synthesis(1969);米国特許第3,941,763号明細書;Finnら,「タンパク質(The Proteins)」,第3版,第2巻,p.105−253(1976);及びEricksonら,「タンパク質(The Proteins)」,第3版,第2巻,p.257−527(1976)に記載されている方法が含まれる。固相合成は小ペプチドを製造する最も費用効率的な方法であるので、固相合成が各ペプチドを製造するための好ましい方法である。
本発明化合物はmpl受容体に結合及び/またはmpl受容体を活性化させる能力を有し、及び/または血小板のインビボ及びインビトロ産生を刺激する能力(血小板新生活性)及び血小板前駆体のインビボ及びインビトロ産生を刺激する能力(巨核球形成活性)を有する。前記化合物の活性を測定するために、国際特許出願公開第95/26746号パンフレット(発明の名称:巨核球増殖及び分化を刺激するための組成物及び方法)に記載されているような一般的アッセイが使用され得る。インビボアッセイは本明細書の実施例の欄に詳記されている。
本発明は、本発明の化合物の医薬組成物及び前記組成物の使用方法も提供する。前記医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺内(例えば、エーロゾル化薬物)または(長時間放出させるための蓄積投与を含めた)皮下注射により;舌下、肛門、膣を介して;または脾膜下、脳下または角膜内に埋め込むような外科移植を含めた注射、或いは経口、点鼻、経皮膚または他の投与形態で投与され得る。治療では、ある期間に亘って1回または複数回投与し得る。一般的に、有効量の本発明の化合物を医薬的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、助剤及び/または担体と一緒に含む医薬組成物が本発明に含まれる。前記組成物は、異なる緩衝剤含量、pH及びイオン強度を有する希釈剤(例えば、トリス−HCl、酢酸塩、リン酸塩);添加剤、例えば洗剤及び可溶化剤(例えば、ツイーン80、ポリソルベート80)、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメルソール、ベンジルアルコール)及び増量剤(例えば、ラクトース、マンニトール)を含み、前記物質をポリマー化合物(例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等)の粒状調製物またはリポソームへ配合させる。ヒアルロン酸も使用可能であり、これは循環中の持続時間を延長させる効果を有し得る。前記医薬組成物は、場合により他の医薬的に許容され得、医薬用ベヒクル、賦形剤または媒体として機能する液体、半固体または固体希釈剤を含み得る。その希釈剤の例には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−及びプロピル−ヒドロキシベンゾエート、スターチ、スクロース、デキストロース、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオ脂及びカカオ油が含まれるが、これらに限定されない。前記組成物は本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、援用により本明細書に含まれるとするRemington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,p.1435−1712,ペンシルバニア州イーストンに所在のMack Publishing Co.(1990年)発行を参照されたい。前記組成物は液体形態で製造されても、乾燥粉末(例えば、凍結乾燥形態)であってもよい。皮下処方物のような移植可能な徐放性処方物も意図される。
上記した状態を治療する方法に関する用量レジメは、薬物の作用を変化させる各種要因、例えば患者の年齢,状態,体重,性別及び食事、感染の重篤度、投与時期及び他の臨床要因を考慮して担当医により決定される。
1.第2ペプチドライブラリーの構築
(A) エレクトロコンピテント大腸菌細胞の作成
37℃において2xYT培地(1.6% バクトトリプトン、1% 酵母抽出物、85.5mM NaCl)(10ml)中で一晩大腸菌(TG1株;ニュージャージ州ピスカタウェーに所在のAmersham Pharmacia Biotech)培養物を調製した。この一晩培養物(1ml)を用いて、0.4% グルコース及び10mM Mgl2を含有する2xYT培地(1L)を接種し、この1L培養物をOD600=0.8まで37℃において振とう機において増殖させた。培養物を氷上で15分間冷却し、4℃において4000rpm(Beckman JA−10ローター)で20分間遠心した。細菌ペレットを氷冷10%グリセロール溶液(500ml)に再懸濁し、生じた混合物を4℃において4000rpmで20分間遠心した。細菌ペレットを再び氷冷10%グリセロール溶液(500ml)に再懸濁し、生じた混合物を再び4℃において4000rpmで20分間遠心した。次いで、細胞ペレットを氷冷10%グリセロール溶液(25ml)に再懸濁した。この濃縮細菌サンプルを氷冷50ml容量の円錐チューブに移し、4℃において卓上遠心機(Beckman CS−6R)を用いて3500rpmで15分間遠心した。細胞ペレットを小容量の氷冷グリセロール溶液に再懸濁し、細菌ストック(100または300μl)を直ちにエタノール/ドライアイス浴において凍結し、−80℃フリーザーで保存した。
(B) pCES1ベクターの修飾
PCR反応を、Extend Long Template PCRシステム(インディアナ州インディアナポリスに所在のRoche Diagnostics Corp.)、鋳型としてpCES1ベクター(TargetQuest Inc.)(1μg)を用いて実施した。PCR混合物の容量は100μlであり、1×PCR緩衝液、200nMずつの2つのプライマー5’−CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA−3’及び5’−GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA−3’、200nm dNTP、3U Tag DNAポリメラーゼを含んでいた。TRIO−Thermoblock(Biometra)PCRシステムを以下のプログラムを実行するために使用した:94℃×5分間;94℃×30秒間、50℃×30秒間、72℃×45秒間を1サイクルとして30サイクル;72℃×10分間;4℃に冷却。PCR産物を1% アガロースゲルに流し、QIAGEN Spinカラム(カリフォルニア州バレンシアに所在のQIAGEN Inc.)を製造業者のプロトコルに従って用いて精製した。第2回PCR反応を、5μlのPCR産物及び200nMずつの2つのプライマー、5’−CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA−3’及び5’−AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT−3’を用いて上記と同一PCR条件で実施した。
(C) ベクターDNAの作成
修飾pCES1ベクターDNA(セクション1B)(1μg)を2500V、25°F及び200オームに設定したGene Pulser IIを用いてエレクトロコンピテントTG1大腸菌(セクション1A)(100μl)に形質転換した。次いで、形質転換した細菌サンプルを直ちにSOC(2% トリプトン、0.5% 酵母抽出物、10mM NaCl、2.5mM KCl、20mM グルコース、10mM MgSO4,10mM MgCl2)(900μl)を収容したチューブに移し、この培養物を37℃において振とうさせながら1時間増殖させた。次いで、細胞を2×YTAG(100ug/ml アンピシリン及び2% グルコース含有2xYT)寒天プレート上に散布し、37℃において一晩インキュベートした。単一コロニーを用いて、37℃において2xYTAG培地(1L)に振とうさせながら一晩接種した。プラスミドベクターDNAをQIAGENプラスミドMaxiキットを製造業者のプロトコルに従って用いて精製した。
(D) ベクターDNAの消化
ベクターDNA(セクション1C)(50μg)を37℃において1×NEB緩衝液2、200U ApaLI及び200U XhoIを含む反応物(400μl中で一晩消化した。この制限消化反応物を37℃において一晩インキュベートし、予備調製した1% アガロースゲル(カリフォルニア州サンディエゴに所在のEmbi Tec.)で分析した。直線化ベクターDNAをゲルから切り出し、QIAquickゲル抽出キット(QIAGEN INC.)を製造業者の指示に従って用いて抽出した。
(E) ライブラリーオリゴヌクレオチドの作成
2つのライブラリーオリゴヌクレオチド(固定及びドープド)を設計した、固定ライブラリーオリゴヌクレオチド5’−CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKGGTCCTACTCTGMRKSARTGGCTGNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG−3’及びドープドライブラリーオリゴヌクレオチド5’−CACAGTGCAC−AGGGTNNKNNKNNKNNKggKcc−KacKctKNNKNNKtgKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCG−−3’(小文字は70%の表示塩基と10%のそれぞれ他の3つのヌクレオチドの混合物を表す)を合成した。これらの各オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用した。
(F) ライブラリーオリゴヌクレオチドの消化
各PCR産物(セクション1E)(5μg)を37℃において1×NEB緩衝液2、200U ApaLI及び200U XhoIを含む反応物(400μl)中で一晩消化した。消化したDNAを3% アガロースゲル(Embi Tec)で分離した。各反応からの当該DNAバンドをゲルから切断し、QIAquickゲル抽出キットを用いて抽出した。
(G) ライブラリーオリゴヌクレオチドとのベクターのライゲーション
線状化したベクター(セクション1D,25μg)及び各消化PCR産物(セクション1F,5μg)を16℃において1×NEBライゲーション緩衝液及び80U T4 DNAリガーゼを含む反応物(400μl)中で一晩ライゲートした。ライゲートした産物を65℃において20分間インキュベートしてDNAリガーゼを不活性とし、更に37℃において8U NotIと2時間インキュベートしてベクターの自己ライゲーションを最小限とした。次いで、ライゲートした産物を一般的なフェノール/クロロホルム抽出(Maniatisら,「分子クローニング(Molecular CLoning)」,第3版)により精製し、H2O(30μl)中に再懸濁した。
(H) エレクトロポレーション形質転換
各ライブラリーに対して、10エレクトロポレーション反応を実施した。各形質転換につき、ライゲートしたベクターDNA(セクション1G)(3μl)及びTG1細胞(セクション1A)(300μl)を0.2cmキュベット(BIO−RAD)において混合した。生じた混合物に2500V、25uF及び200オームに設定したGene Pulser IIを用いてパルスを加えた。10エレクトロポレーション反応からの形質転換した細菌サンプルを合わせ、37℃において1時間インキュベートするためにSOC(27ml)を収容しているフラスコに移した。次いで、細胞を2xYTAG(170ml)に添加し、37℃において振とうさせながら3時間増殖させた。細胞を4℃において5000rpmで10分間遠心した。次いで、細胞ペレットを15% グリセロール/2xYT(10ml)中に再懸濁し、−80℃で保存した。これはライブラリーの初期ストックである。力価は固定ライブラリー及びドープドライブラリーのそれぞれについて1.0×109独立形質転換体及び2.4×109独立形質転換体のライブラリーザイズを示した。
(A) ライブラリーの第2ストックの作成
初期ライブラリー細胞ストック(セクション1H)を用いて、出発OD600=0.1であるように2xTAYG培地1300ml(固定ライブラリーの場合)及び2600ml(ドープドライブラリーの場合)に接種した。培養物を37℃において振とうさせながらOD600=0.5まで数時間増殖させた。固定ライブラリーの場合には120mlアリコート及びドープドライブラリーの場合には240mlアリコートを採取して、別のフラスコ中37℃において更に2時間増殖させた。これらのサブ培養物を4℃において5000rpm(Beckman JA−14ローター)を用いて10分間遠心し、−80℃での保存のために細菌ペレットを15% グリセロール/2xYT(各ライブラリーで10ml)中に再懸濁した。
(B) ファージ誘導
M13K07ヘルパーファージアリコート(Amersham Pharmacia Biotech)をOD600=0.5の残りの細胞培養物(セクション2A)に3×109pfu/mlまで添加した。ヘルパーファージを用い、37℃で振とうさせることなく30分間、ゆっくり振とうさせながら30分間細菌を感染させた。感染細胞を4℃において5000rpmで10分間遠心した。細胞ペレットを2xYTAK(100ug/ml アンピシリン及び40ug/ml カナマイシン含有2YT)1300ml(固定ライブラリー)及び2600ml(ドープドライブラリー)中に再懸濁させた。ファージミドの産生は37℃において振とうさせながら一晩で生じた。
(C) ファージの収集
細菌培養物(セクション2B)を4℃において5000rpmで10分間遠心した。上清を新しいボトルに移し、0.2容量の20% PEG/2.5M NaClを添加し、氷上で1時間インキュベートして、ファージミドを沈殿させた。沈殿したファージミドを4℃において8000rpmで20分間遠心し、冷PBS(100ml)と注意深く再懸濁させた。残りの細胞を4℃において8000rpmで10分間遠心して除去し、0.2容量の20% PEG/2.5M NaClを添加することによりファージを沈殿させることにより、ファージミド溶液を更に精製した。ファージミドを4℃において8000rpmで20分間遠心し、ファージミドペレットを冷PBS(12ml)で再懸濁した。−80℃での保存のために60% グリセロール溶液(4ml)をファージミド溶液に添加した。ファージミド力価を一般的手順(Maniatisら,「分子クローニング(Molecular CLoning)」,第3版)により測定した。
(A) ヒトMPLのビオチニル化
組換えヒトMPL(1mg)をEZ−Link Sulfo−NHS−LC−ビオチニル化キット(イリノイ州ロックフォードに所在のPIERCE)を製造業者の指示に従って用いてビオチニル化した。
ビオチニル化MPL(セクション3A)をDynabead M−280ストレプトアビジン(ニューヨーク州レークサクセスに所在のDYNAL)上に製造業者からのビーズストック100μlあたり1μgのMPLの濃度で固定化した。磁石を用いてチューブの片面にビーズを引き寄せ、ピペットで排液した後、ビーズをリン酸緩衝食塩液(PBS)で2回洗浄し、PBS中に再懸濁した。ビオチニル化MPLタンパク質を洗浄ビーズに上記濃度で添加し、室温において回転させながら1時間インキュベートした。次いで、MPL被覆ビーズを、BSAを2%最終濃度まで添加し、4℃において回転させながら一晩インキュベートすることによりブロックした。次いで、生じたMPL被覆ビーズをPBST(0.05% ツイーン20含有PBS)で2回洗浄した後、選択手順にかけた。
約100倍ライブラリー等価ファージミド(セクション2C;固定ライブラリーでは1×1011cfu、ドープドライブラリーでは2.4×1011cfu)を2% BSA含有PBS(1ml)を用いて1時間ブロックした。ブロックしたファージミドサンプルをブランクビーズ(セクション3Bと同じビーズであるがMPLで被覆されていない)に添加してネガティブ選択ステップにかけ、この混合物を室温において回転させながら1時間インキュベートした。ファージミド含有上清を磁気を用いて引き抜き、MPL被覆ビーズ(セクション3B)を収容した新しいチューブに移し、この混合物を室温において回転させながら1時間インキュベートした。上清を捨てた後、ファージミド結合ビーズをPBSTで10回、PBSで10回洗浄した。次いで、ファージミドをローターを用いて100mM トリエチルアミン溶液(ミズーリ州セントルイスに所在のSigma)(1ml)に10分間溶離させた。ファージミド含有溶液のpHを1M トリス−HCl(pH7.5)(0.5ml)を添加して中和した。生じたファージミドを用いて、新しく成長させたTG1細菌(OD600=0.5)(5ml)を37℃において振とうさせることなく30分間、ゆっくり振とうさせながら30分間感染させた。全ての感染TG1細胞を大きな2xYTAGプレートで平板培養し、30℃において一晩インキュベートした。
2xYTAG培地の10mlアリコートをプレート(セクション3C)に添加して、TG1細胞を再懸濁した。全てのTG1細胞をチューブに集め、前記細胞の250μlアリコートを2xYTAG(25ml)に添加し、OD600=0.5まで37℃において増殖させた。M13K07ヘルパーファージを3×109cfu/mlの最終濃度まで添加し、37℃において振とうせずに30分間、ゆっくり振とうさせながら30分間インキュベートした。細胞を4℃において5000rpmで10分間遠心し、2xYTAK(25ml)中に再懸濁した。これらの細菌を振とうさせながら30℃において一晩培養した。誘導したファージミドを収集し、セクション2Cに記載したように精製した。
以下の点を除きセクション3B及び3Cに概説したように第2回選択を実施した。セクション3Dからのファージミド溶液の約0.5mlアリコートを入力ファージミドとして用いた。ビオチニル化MPL(セクション3A)の0.1μgのみを用いてDynabead M−280ストレプトアビジンを被覆した。ファージ結合ビーズをPBSTで16回洗浄し、最終洗浄にはPBST中室温において30分間のインキュベーションを含めた。ビーズをPBSで10回以上洗浄した。
(A) マスタープレートの作成
第2回選択からの単一コロニーを選択し、120μl/ウェルの2xYTAGを収容している96ウェルプレートに接種した。96ウェルプレートを30℃振とう装置を用いて一晩インキュベートした。−80℃での保存用に60% グリセロール(40μl/ウエル)を添加した。
マスタープレート(セクション4A)からの細胞の約3μlアリコートを120μl/ウェルの2xYTAGを収容している新しい96ウェルプレートに接種し、この新しいプレートの細胞を約OD600=0.5まで37℃において増殖させた。各ウェルに2xYTAG含有M13K07ヘルパーファージ(1.2×1010cfu/ml)(40μl)を添加し、96ウェルプレートを37℃において振とうせずに30分間、ゆっくり振とうさせながら更に30分間インキュベートした。プレートを4℃において2000rpmで(Beckman CS−6R卓上遠心機)10分間遠心した。上清をウェルから除去し、各細胞ペレットを2xYTAG(160μl/ウェル)を用いて再懸濁した。プレートをファージ発現のために30℃において一晩インキュベートした。
PCR反応を、鋳型としてマスタープレート(セクション4A)の各ウェルからの細菌(1μl)を用いて実施した。各PCR混合物の容量は20μlであり、1×PCR緩衝液、300nMずつの2つのプライマー5’−GTTAGCTCACTCATTAGGCAC−3’及び5’−GTACCGTAACACTGAGTTTCG−3’、200nM dNTP、2mM CaCl2及び5U taq DNAポリメラーゼ(Roche Molecular Biochemicals)を含んでいた。GeneAmp PCRシステム9700(Applied Biosystem)を用いて以下のプログラムを実行した:94℃×5分間;94℃×45秒間、55℃×45秒間及び72℃×90秒間を1サイクルとして40サイクル;72℃×10分間;4℃に冷却。PCR産物をQIAquick 96 PCR精製キット(QIAGEN Inc.)を製造業者の指示に従って用いて精製した。全ての精製PCR産物をABI 3770シーケンサー(Perkin Elmer)を製造業者の指示に従って用いてプライマー5’−CGGATAACAATTTCACACAGG−3’で配列決定した。
上記したヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をELISAデーターと相関させた。MPL被覆ウェルで高いOD測定値及びBSA被覆ウェルで低いOD測定値を示したクローンは更なる研究のための候補物と見做された。複数回現れる配列も更なる研究のための候補物と見做された。これらの基準に基づいて選択したファージクローンをELISA測定実験において更に特性づけた。図9(特定ファージクローンのELISA用量−応答)参照。
ペプチドの作成
全てのペプチドを十分に確立されている段階的固相合成法により作成した。Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149(1963);Steward及びYoung,Solid Phase Peptide Synthesis(1969)参照。Fmoc−保護アミノ酸をビルディングブロックとして使用し、ペプチド鎖をABIまたはSymphonyペプチド合成装置を用いて構築した。典型的には、ペプチド合成を予備充填Wang樹脂を用いて開始して、C末端に遊離カルボン酸を有するペプチドを作成した(或いは、C末端アミド官能基を有するペプチドを作成するためにRink樹脂を使用することができる)。一般的なピペリジンプロトコルを用いてFmocを除去した。カップリングはウロニウム(例えば、HBTU)またはカルボジイミド(例えば、DCC/HOBt)化学を用いて実施した。側鎖保護基はGlu(O−t−Bu)、Asp(O−t−Bu)、Ser(t−Bu)、Thr(t−Bu)、Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(t−Boc)、Trp(T−Boc)及びCys(Trt)であった。全てのペプチジル樹脂の最終脱保護及び開裂は2.5% H2O、5% フェノール、2.5% トリイソプロピルシラン及び2.5% チオアニソールまたはメルカプトエタノールを含むトリフルオロ酢酸(TFA)を用いて室温において4時間実施した。TFAを除去後、開裂ペプチドを冷無水エーテルを用いて沈殿させた。ジスルフィド結合を含むペプチドの場合、H2O中15% DMSO(pH7.5)を用いることにより粗物質に対して環状産物の直接形成を実施した。全ての粗ペプチドを逆相HPLCにより精製し、精製したペプチドの構造をESI−MS及びアミノ酸分析により確認した。
TMP−Fcペプチ体化合物の作成
数種のペプチドをペプチド−Fc融合物(すなわち、FcがペプチドのC末端に結合)(C末端融合物)として発現させるために選択した。各TPO−模擬ペプチドにインフレームで融合したヒトIgG1のFc領域をコードするDNA配列を次のようにプラスミド発現ベクターpAMG21中にLuxPRプロモーターの制御下に置いた。
Fc−TMPペプチ体化合物の作成
数種のペプチドをFc−ペプチド融合物(すなわち、FcがペプチドのN末端に結合)(N末端融合物)として発現させた。Fc−TMP1をコードするプラスミド(Amgen株#3728)を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドから短ペプチドを容易にクローニングするためにApaLI部位及びXhoI部位を含むように改変した。プライマー2396−70をApaLI及びXhoI制限酵素部位を付加するように設計した。PCRをExpand Longポリメラーゼを用い、2396−70及び3788DNA鋳型上のユニバーサル5’プライマー1209−85で実施した。プライマー配列は以下の通りである:
各ライゲーションをエレクトロポレーションにより下記する宿主株GM211に形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、適正なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を有する能力についてクローンをスクリーニングにかけた。
発現プラスミドpAMG21はATCCに1996年7月24日に寄託され、寄託番号98113でATCCから入手可能である。
Amgen宿主株#2596は、初期edg領域に温度感受性ラムダリプレッサーcI857s7及び後期edg領域(68分)にlacIQリプレッサーを含むように修飾した大腸菌K−12株である。2つのリプレッサー遺伝子を存在させたことにより、この宿主を各種発現系で使用することができるが、これらのリプレッサーはluxPRからの発現に無関係である。非形質転換宿主は抗生物質耐性を有していない。
各融合タンパク質を発現するGM221の培養物を37℃においてLuria Broth培地で増殖させた。合成オート誘導物質N−(3−オキソヘキサノイル)−DL−ホモセリンラクトンを20ng/mlの最終濃度まで培地に添加し、37℃で更に3時間インキュベートした後、luxPRプロモーターからの遺伝子産物発現を誘導した。3時間後、細菌培養物を封入体の存在について顕微鏡で検査した後、遠心により集めた。屈性折封入体が誘導培養物中で観察され、このことから融合タンパク質が大腸菌において不溶性分画中に産生された可能性が高いことが示された。細胞ペレットを、10% β−メルカプトエタノール含有Laemmliサンプル緩衝液中に再懸濁して直接溶解し、SDS−PAGEにより分析した。適当なサイズ(約30kDa)を有する強いクーマシー染色バンドが各タンパク質について観察された。
ペプチ体の精製
細胞を高圧ホモジナイゼーション(14,000PSIで2回通す)により水(1/10)中で破壊し、封入体を遠心(J−6Bにおいて4200rpmで1時間)して収集した。封入体を6M グアニジン、50mM トリス、8mM DTT(pH8.7)中1/10比で可溶化した。可溶化混合物を2M 尿素、50mM トリス、160mM アルギニン、3mM システイン(pH8.5)に20倍希釈した。混合物を冷所で一晩撹拌した。次いで、混合物を限外濾過により約10倍濃縮した、次いで、10mM トリス、1.5M 尿素(pH9)で3倍希釈した。次いで、この混合物のpHを酢酸を用いてpH5に調節した。遠心により沈殿を除去し、上清を20mM NaAc、100mM NaCl(pH5)で平衡化したSP−Sepharose Fast Flowカラムに充填した(10mg/mlのタンパク質充填、室温)。タンパク質を同一緩衝液中100mM NaClから500mM NaClの範囲の濃度勾配で20カラム容量を用いて溶離させた。前記カラムからのプールを3倍希釈し、20mM NaAc、150mM NaCl(pH5)で平衡化したSP−Sepharose HPカラムに充填した(10mg/mlのタンパク質充填、室温)。タンパク質を同一緩衝液中150mM NaClから400mM NaClの範囲の濃度勾配で20カラム容量を用いて溶離させた。ピークをプールし、濾過した。
ペプチドアフィニティー結合調査
数種のTMPペプチド(TMP1〜TMP23)について結合アフィニティーを調べるために実験をBIACORE 3000を用いて室温において実施した。Hu−mplをアミンカップリング法(NHS/EDCにより活性化及びエタノールアミンによりブロッキング)を用いてセンサーチップ(CM5)表面上に固定化した。0.78〜100nMのTMPペプチドをhu−mpl表面に注入した。BIACOREランニング緩衝液は0.005% Surfactant P20を含むPBSであった。サンプルをコントロール用のブランク表面に注入した。実験データーをBIAEVALUATION 3.1ソフトウェアパッケージを用いて分析した。
ペプチド生物活性調査
ペプチドTMP1〜TMP23の生物活性を調べるために細胞ベースアッセイを用いた。
ペプチ体調査
数種のTMPペプチ体を、BIAcoreでの直接結合分析においてそのhu−MPLに対する結合活性について試験した。実験をBIAcore 2000(BIACORE Inc.)を用いて25℃において実施した。ランニング緩衝液は0.005% Surfactant P20を含むPBSであった。組換えプロテインG(Pierce 21193ZZ)を標準アミンカップリング手順(NHS/EDCによる活性化及びエタノールアミンによるブロッキング)に従ってCM5チップ上に固定化して、TMPペプチ体を約400RUまで捕捉した。組換えhu−MPL(ロット27315−53)を同一緩衝液(0.005% Surfactant P20及び100ug/ml BSA含有PBS)で1uMから0.15nMに連続希釈した後捕捉したペプチ体表面上に50ul/分で3分間注入した。非特異的結合バックグラウンドを減じるためにrhu−MPLサンプルもブランクのプロテインG表面に注入した。プロテインG表面をImmunoPure IgG溶離緩衝液(Pierce 21009ZZ,pH2)(100ul)及び8mM グリシン(pH1.5)(100ul)を逐次注入し、2サイクルの間に1M NaClを50ul/分注入して再生した。ペプチ体のrhu−MPLに対する結合アフィニティー(KD)を、BIAevaluation 3.1(BIACORE Inc)を用いてデーターを非線形回帰分析して求めた。結果を以下に要約する。
ペプチ体活性アッセイ
一次ヒトCD34+細胞を数種のTMP−Fc融合タンパク質の存在下で数日間培養した。次いで、前記細胞を選別して、細胞表面上で巨核球特異的マーカー(CD61)を発現する細胞の%を調べた。活性化合物は用量依存的に血小板前駆体細胞の出現を刺激したのに対して、赤血球前駆体(CD36+)(示さず)及び好中球(CD15+)(示さず)に対するマーカーはベースラインに留まった。図10、11及び12(CD61細胞アッセイ)を参照。
インビボ活性
約10〜12週令の正常雌BDF1マウスをインビボ活性研究のために用いた。
Claims (25)
- mpl受容体に結合し、配列:
X1−X2−X3−X4−G−P−T−L−X9−X10−W−L−X13−X14−X15−X16−X17−X18
(式中、X1〜X4、X9〜X10及びX13〜X18はそれぞれ独立してアミノ酸である)
を含み、配列:
X19−X20−I−E−G−P−T−L−R−Q−W−L−A−A−R−A−X21−X22
(式中、X19〜X20及びX21〜X22はそれぞれ独立してアミノ酸である)
を有する化合物よりも高いmpl受容体に対する結合アフィニティーを有する化合物及びその医薬的に許容され得る塩。 - mpl受容体に結合し、配列:
X1−X2−X3−X4−G−P−T−L−X9−X10−W−L−X13−X14−X15−X16−X17−X18
(式中、X1〜X4、X9〜X10及びX13〜X18はそれぞれ独立してアミノ酸である)
を含み、配列:
X19−X20−I−E−G−P−T−L−R−Q−W−L−A−A−R−A−X21−X22
(式中、X19〜X20及びX21〜X22はそれぞれ独立してアミノ酸である)
を有する化合物よりも高い生物活性を有する化合物及びその医薬的に許容され得る塩。 - X1はA、V、W、M、G、Y、C、Q、E、R及びHからなる群から選択され、
X2はA、V、L、I、G、S及びCからなる群から選択され、
X3はL、I、P、W、G、S、D、K及びRからなる群から選択され、
X4はL、G、Q、D、E及びHからなる群から選択され、
X9はK及びRからなる群から選択され、
X10はQ及びEからなる群から選択され、
X13はA、V、L、S、Q、E及びRからなる群から選択され、
X14はA、W、T、Y、C及びQからなる群から選択され、
X15はV、L、G、Y及びRからなる群から選択され、
X16はA、L、F、G及びRからなる群から選択され、
X17はA、V、L、M、G、C、Q及びNからなる群から選択され、
X18はA、V、P、M、F、G、C、Q及びKからなる群から選択される
請求の範囲第1項に記載の化合物。 - X1はA、V、W、M、G、C、E及びRからなる群から選択され、
X2はA、V、L、M、F、G、S、C、D及びRからなる群から選択され、
X3はA、L、I、P、W、Q、K及びRからなる群から選択され、
X4はL、G、Q、D及びEからなる群から選択され、
X9はK、R及びHからなる群から選択され、
X10はQ及びEからなる群から選択され、
X13はA、L、P、F、G、Q、N、E及びRからなる群から選択され、
X14はL、W、M、C、Q及びHからなる群から選択され、
X15はV、L、P、G、Y及びRからなる群から選択され、
X16はA、V、L、F、S、Q、K及びRからなる群から選択され、
X17はA、V、L、W、M、G、S、C及びNからなる群から選択され、
X18はA、V、P、M、G、C、Q及びKからなる群から選択される
請求の範囲第2項に記載の化合物。 - mpl受容体に結合し、配列:
X1−X2−R−E−G−P−T−L−R−Q−W−L−X13−W−R−R−X17−X18
(式中、X1、X2、X13、X17及びX18はそれぞれ独立してアミノ酸である)
を含む化合物。 - 環状である請求の範囲第1項、第2項または第6項に記載の化合物。
- アミノ酸残基の少なくとも1つがD立体配置を有する請求の範囲第1項、第2項または第6項に記載の化合物。
- 全てのアミノ酸残基がD立体配置を有する請求の範囲第1項、第2項または第6項に記載の化合物。
- 請求の範囲第1項、第2項または第6項に記載の化合物のダイマーまたはマルチマー。
- mpl受容体に結合し、式:
(LN1)l−(TMP1)a−(LN2)m−(TMP2)b−(LN3)n−(TMP3)c−(LN4)o−(TMP4)d
(式中、TMP1、TMP2、TMP3及びTMP4はそれぞれ独立して請求の範囲第1項、第2項及び第6項に記載の化合物からなる群から選択され、LN1、LN2、LN3及びLN4はそれぞれ独立してリンカーであり、a、b、c及びdはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、l、m、n及びoはそれぞれ独立して0〜20の整数である)
を含む組成物。 - 更にベヒクルを含み、式:
(V1)v−(LN1)l−(TMP1)a−(LN2)m−(TMP2)b−(LN3)n−(TMP3)c−(LN4)o−(TMP4)d−(V2)w
(式中、V1及びV2はそれぞれ独立してベヒクルであり、v及びwはそれぞれ独立して0〜1の整数である)
を有する請求の範囲第11項に記載の組成物。 - LN1、LN2、LN3及びLN4はペプチドからなる請求の範囲第12項に記載の組成物。
- V1及び/またはV2はFcドメインからなる請求の範囲第12項に記載の組成物。
- V1及び/またはV2はIgG1 Fcドメインからなる請求の範囲第12項に記載の組成物。
- 請求の範囲第12項に記載の組成物からなる群から選択される組成物をコードするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第12項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求の範囲第12項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 細胞が大腸菌細胞である請求の範囲第12項に記載の宿主細胞。
- 細胞が原核細胞である請求の範囲第12項に記載の宿主細胞。
- 細胞が真核細胞である請求の範囲第12項に記載の宿主細胞。
- 有効量の請求の範囲第12項に記載の組成物をその医薬的に許容され得る担体と共に含む医薬組成物。
- 治療有効量の請求の範囲第12項に記載の組成物を投与することを含む哺乳動物における血小板減少症の治療方法。
- 治療有効量の請求の範囲第12項に記載の組成物を投与することを含む治療を要する患者における巨核球または血小板の増加方法。
- mpl受容体に結合し、式:
(V1)v−(TMP1)a−(V2)w
(式中、V1及びV2はそれぞれIgG1 Fcドメインであり、vが1のときwは0であり、vが0のときwは1であり、TMP1は配列番号2〜30のペプチドであり、aは1〜20の整数である)
からなる化合物。
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